SE453513B - Forfarande for effektivisering av produktionen av eggviteemne - Google Patents

Forfarande for effektivisering av produktionen av eggviteemne

Info

Publication number
SE453513B
SE453513B SE8702885A SE8702885A SE453513B SE 453513 B SE453513 B SE 453513B SE 8702885 A SE8702885 A SE 8702885A SE 8702885 A SE8702885 A SE 8702885A SE 453513 B SE453513 B SE 453513B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
plasmid
gene
recombinant dna
bacteria
dna
Prior art date
Application number
SE8702885A
Other languages
English (en)
Other versions
SE8702885L (sv
SE8702885D0 (sv
Inventor
I Palva
Original Assignee
Alko Ab Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alko Ab Oy filed Critical Alko Ab Oy
Publication of SE8702885L publication Critical patent/SE8702885L/sv
Publication of SE8702885D0 publication Critical patent/SE8702885D0/sv
Publication of SE453513B publication Critical patent/SE453513B/sv

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

15 20 25 30 35 2 replicerade plasmid- eller virus-DNA-molekyler, har man först nu börjat använda bakterier av Bacillus- -släktet (Cryczan et al., Molecular General Genet 177, 459-467 (l979); Keggins et al., Proc. Natl. Acad.
Sci (US) 75, 1423-1427 (l978); Yoneda et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun, 91, 1556-1564 (1979). Likväl hänför sig inget av de hittills offentliggjorda förfa- randena till en ökning av produktionen av exoenzym av en bakterie av Bacillus-släktet på ett sätt, där den exoenzym kodande genen är replicerad genom att koppla den till en plasmid som är närvarande i ett flertal kopior i en bakterie av Bacillus-släktet, och inget av de publicerade förfarandena avser ett sätt att producera protein, varvid reglerings-och utsöndringssignalerna av genen av enzymet som utsöndras ur bakterier av Bacillus-släktet är kopplad till genen för det protein man önskar producera. Som ett exempel på ökning av produktionen av ett exoenzym av bakterier av Bacillus-släktet genom att öka antalet gener av det önskade exoenzymet i cellen, beskrivs överföring av Bacillus-a-amylasgenen.
Figur l visar ett schema för ovan angivna utfö- ringssätt. Från den u-amylas producerande bakterien av Bacillus-släktet isoleras hela bakteriens genom, som spjälkas med ett restriktionsenzym. DNA-sekven- ser av önskad storlek sammankopplas med den öppnade plasmidmolekylen medelst ett restriktionsenzym. En- ligt denna uppfinning kan bakteriens genom spjälkas med restriktionsenzymet MboI och som plasmid kan an- vändas pUB1l0, som kan öppnas med restriktionsenzymet BamH l. Det är att märka, att motsvarande rekombinant DNA-molekyl kan framställas även med användning av andra restriktionsenzymer eller plasmider, och en fackman kan välja olika restriktionsenzym-plasmid-kom- binationer utan att avvika från ramen för denna upp- finning. 10 15 20 25 30 35 i 453 513 3 Efter sammankopplingen av DNA-längderna och plas- midmolekylerna överförs de bildade rekombinant DNA-mole- kylerna in i värdbakterien och från dessa sållas de bakterieceller, som har erhållit en till plasmiden kopplad u-amylas kodande gen. Sållningen är baserad pá den av den transformerade cellen erhållna förmågan att producera a-amylas.
Som värdbakterie i uppfinningen används en B. sub- tilis-stam. Då nämnda rekombinant DNA-molekyl över- förts till stammen, förekommer den a-amylas kodande genen i stammen i cirka 50 kopior. Detta ökar stammens a-amylasproduktion cirka 500-falt jämfört med en normal B. subtilis-stam. Den 500-faldiga ökningen av u-amylas- -produktionen härrör delvis från regleringsdelen av Q-amylasgenen i den som utgàngsstam använda B. amylo- liquefaciens-stammen, vilken regleringsdel är cirka 10 gånger effektivare än B. subtilis d-amylasgenens regleringsdel, och delvis från den 50-faldiga ökningen av antalet a-amylasgener. Under laboratorieförhàllanden producerar en B. subtilis-stam som innehåller en rekombi- nant-DNA-molekyl cirka 3-5 gånger mer a-amylas än den vid isolering av genen använda B. amyloliquefaciens-stammen.
Rekombinant DNA-molekylen isoleras från B. sub- tilis-stammen och karaktäriseras med hjälp av restrik- tionsenzymer och definition av basordningen. I Figur 2 visas den erhållna rekombinant DNA-molekylens pKTHl0, de i d-amylasgenen eller dess regleringsdel belägna unika kapningsställena för restriktionsenzymerna och rekombinant DNA-molekylens allmänna struktur. I Figur 3 visas en del av a-amylasgenens basordning begynnande med restriktionsenzymets EcoR I kapningsställe.
Rekombinant DNA-molekylen som är föremål för uppfinningen består av reglerings- och utsöndrings- signalerna av d-amylasgenen av Bacillus-mikroorganismen och av i Bacillus-mikroorganismen i flera kopior före- kommande plasmid-molekyler så, att genen av vilket som helst protein kan kopplas till änden av a-amylas- 10 15 20 25 30 35 453 513 4 genens utsöndringssignal, varvid det önskade proteinet kan produceras i Bacillus-mikroorganismen. Framställ-' ningen av denna rekombinant DNA-molekyl visas i Figur 4.
Från den a-amylasgenen innehållande rekombinant DNA- -molekylen avlägsnas först den största delen av a-amyla- sens strukturgen medelst EcoR I-restriktionsenzymbehand- ling. Den så erhållna DNA-molekylen öppnas med restrik- tionsenzymet och avkortas för avlägsnande av a-amylasgc- nens återstående strukturdel med exonukleas-III och Sl- -nukleas, varefter med ett reverstranskriptsenzym säker- ställs, att molekylens ändar har två strängar. Här- efter kopplas en DNA-linkermolekyl som innehåller EcoR I-kapningsstället till den öppnade och avkortade molekylen. Positionen för linkermolekylen i rekombi- nant DNA-molekylen bestäms genom undersökning av DNA- -basordningen pá kopplingsstället. De sista nukleo- tiderna i a-amylasens strukturgen avlägsnas medelst DNA-polymeras-I-behandling och den nya linkermolekylen kopplas till slutet av utsöndringssignalen. Till detta öppningsställe för restriktionsenzymet i linkermole- kylen kan kopplas strukturgenen av vilket som helst annat protein, t ex B-laktamasgenen av E. coli, eller den aminosyror kodande DNA-sekvensen eller en del därav av vilket som helst a-, B- eller Y-interferon.
Det av den kopplade genen kodade proteinet produceras nu i bakterien av Bacillus-släktet medelst a-amylas- genens reglerings- och utsöndringssignaler.
Detaljerad beskrivning av utförandet av isolering, rening och spjälkning av genomen ur bakterier av Bacillus-släktet Såsom bakteriestam användes en B. amylolique- faciens-stam. Stammen odlades över natten i en rik näringsvätska, cellerna uppsamlades och tvättades med en 0,00l5M natriumcitrat-0,0l5M NaCl-buffert.
De tvättade cellerna suspenderades (2-1011 celler, dvs en odling av 200 ml) i 2 ml av en 20% w/v sacka- ros-50 mM Tris-HCl-lösning (pH 8,0). Härefter tillsattes 10 15 20 25 30 35 453 513 5 . (19 20 mg lysozym, 20 mg pronas och 2 ml 1% w/v Sarkosyl -0,1 M EDTA-lösning (pH 8,0), och den erhållna lös- ningen inkuberades 15 h vid 37°C. Till det erhållna lysatet tillsattes 6,5 ml H20 och fast CsCl i en sådan mängd, att lysatet fick ett refraktionsindex av 1,4100, varefter lysatet centrifugerades; Beckman Ti 50-rotor, 36000 rpm 48 h 10°C. Det centrifugerade lysatet upp- delades i fraktioner, och de fraktioner som pá basen av viskositeten antogs innehålla bakteriens genom uppsamlades och dialyserades under en tid av 30 h mot en 10 mM Tris-HCl-1 mM EDTA-0,l M NaCl-buffert (pH 8,0) vid 4°C.
Det så erhållna genompreparatet extraherades tre gånger med fenol, och fenolen avlägsnades medelst eterextraktion. DNA renades genom centrifugering i en linjär 15 -> 30% w/v sackaros-0,1 M NaCl-50 mM Tris-HCl-l mM EDTA, 0,l% nariumlaurylsulfat (pH 8,0)- -gradient; Beckman SW27-rotor, 22000 rpm 16 h 22°C, varefter gradienten fraktionerades, och de fraktioner i vilka DNA-längderna hade en storlek av 2 l5-106 dalton uppsamlades, och DNA utfälldes med etanol.
Det så isolerade B. amyloliquefaciens-genomprepa- ratet spjälktes ofullständigt med restriktionsenzymet Mbol, och de spjälktes DNA-längderna sorterades efter sin storlek i den ovan beskrivna sackarosgradienten, Beckman SW27-rotor 22000 rpm 16 h 22°C. De fraktioner i vilka DNA-längderna hade en storlek av 1,5-5-10 dalton uppsamlades och DNA utfälldes med etanol.
Isolering och spjälkning av överföringsvektorn med ett restriktionsenzym Som överföringsvektor användes plasmiden pUBllO.
Plasmiden isolerades och renades från Bacillus subti- lis-stammen SB202, såsom tidigare beskrivits (Cryczan et al., J. Bacteriol. 134, 318-329, 1978). Det renade plasmidpreparatet spjälktes med restriktionsenzymet Bamfl I, som har endast ett kapningsställe i plasmid- molekylen. Plasmidmolekylens linearitet kontrollerades medelstngelelektrofores. lO 15 20 25 30 35 453 513 6 Förening av B. amyloliquefaciens-genombitarna med en överföringsvektor De med Mbo I-enzymet spjälktes och efter storleken utvalda längdern av B. amyloliquefaciens-genomet blan- dades med den med BamH I-enzymet öppnade pUBll0 plas- miden i en 10 mM Tris HCl-1 mM EDTA buffert (pH 8,0) i ett DNA-koncentrationsförhållande av 1:3, varvid totalvolymen var lzu pl och den totala DNA-koncentra- tionen var 180 pg/ml. Blandningen uppvärmdes 5 min vid 65°C och till den kylda blandningen tillsattes 13 H1 se mm Tris Hcl-6,6 mm Mgclz-10 mm diáiotrei- tol-l mM ATP-buffert (pH 7,8) och 5 pl T4-DNA-ligas (20 Weiss-enheter). Denna blandning inkuberades 3 h vid 23°C, och ligationsresultatet kontrollerades medelst gelelektrofores. Överföring av rekombinant DNA-molekyl till värdbakterien Som värdbakteric användes B. subtilis lAl97-stammen med genotypen sacA321, met35, arol 907, amy_. Stammen erhölls från Bacillus Genetic Stock Center (Ohio State University, USA) och Amy--fenotypen i densamma kart- lades medelst bakteriogenetiska förfaranden som muta- tioner i strukturgenen av det a-amylas kodande enzymet.
Stammen gjordes kompetent dvs kapabel att mottaga DNA genom ett tidigare beskrivet förfarande (Anagno- stopoulos et al., J. Bacteriol. 81 741-746, 1961).
De i föregående avsnitt medelst ligation framställda rekombinant DNA-molekylerna blandades med de kompetenta värdbakterierna och blandningen hölls 30 min vid 37°C.
Härefter applicerades blandningen på bakterieskàlar med kanamycin-antiobiotikum för att förhindra tillväxten av alla de bakterier som inte mottagit plasmiden.
Skálarna hölls 30 h vid 37°C, varvid värdbakterierna som erhållit en plasmid eller en med densamma kopplad längd av B. amyloliquefaciens-genomen växte till små kolonier. 10 15 20 25 30 35 .453 513 7 Detektion av värdbakterier i vilka den d-amylas kodande B. amyloliquefaciens-genen är kopplad till plasmiden pUBll0 De i det föregående avsnittet beskrivna bakterie- kolonierna replicerades på nya näringsämnesskålar, som odlades 30 h vid 37°C§ De erhållna bakteriekulturer- na behandlades med en I-KI-lösning enligt ett tidi- gare beskrivet förfarande (J. Bacteriol. ll9, 4l6-424, l974), varvid en vit ring bildades omkring sådana bakteriekolonier som hade erhållit en rekombinant DNA-molekyl innehållande en d-amylas kodande gen.
Den en sådan koloni motsvarande grundkolonin utplocka- plockades från den ursprungliga bakterieskàlen och de i densamma ingående bakterierna utsattes för ett flertal successiva reningsodlingar.
Isolering och karaktärisering av rekombinant DNA-mole- kylen Rekombinant DNA-molekylen isolerades och renades från värdbakterien medelst ett tidigare beskrivet förfarande (Cryczan et al., J. Bacteriol. 134, 318-329, 1978). Molekylen karaktäriserades medelst olika restrik- tionsenzymer, och positionen för den a-amylas kodande genen bestämdes preliminärt genom att observera genens inaktivering vid koppling av ytterligare DNA-längder till olika ställen i DNA-molekylen. Härefter bestäm- des basordningen för den a-amylas kodande genen medelst ett tidigare beskrivet förfarande (Maxim, A och Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 560-564, 1977).
Bestämning av a-amylasaktiviteten Den modifierade värdbakterien B. subtilis IHO 6064 (sacA32l, metB5) med en a-amylas kodande gen i plasmiden pUBll0 odlades i ett vätskeformigt närings- medium (Luria-buljong) under luftning vid 37°C. Från kulturblandningen togs med 2 h mellanrum prov, vilkas a-amylas-aktivitet bestämdes med användning av Phade- bas -tabletter. 10 15 20 25 30 35 453 513 8 Detaljerad beskrivning av utförandet av avlägsnande av EcoR I-fragmentet ur plasmiden pKTH10 Plasmiden pKTHlO öppnades vid kapningsstället EcoR I (Figur 2). De erhållna DNA-längderna (cirka 1 pg) ligerades på nytt tillsammans i 66 mM Tris-HCl- -6,6 mM MgCl2-10 mM ditiotreitol-l mM ATP-buffert (pH 7,8), till vilken tillsattes 0,5 ul T4-DNA-ligas (2 Weiss-enheter). Ligationsblandningen inkuberades 3 h vid 23°C, varefter den kompetenta B. subtilis IHO 6064-stammen transformerades därmed på ovan beskri- vet sätt. Cellerna applicerades på kanamycin-innehàl- lande bakterieskålar och odlades under en natt vid 37°C. Från de erhållna transformanterna sållades medelst I-KI-förfarandet med användning av stärkelseskålar pà ovan beskrivet sätt en a-amylasnegativ koloni, från vilken en plasmid isolerades på tidigare beskri- vet sätt (Cryczan et al., J. Bacteriol. 134, 318-329, 1978). Avsaknaden av EcoR I-Kpn I-Hind III-EcoR I- -fragmentet i det erhållna plasmidpreparatet (Figur 4) kontrollerades medelst gelelektrofores.
Avkortning av plasmiden pKTH29 med exonukleasbehandling Plasmiden pKTH29 (100 pl, 500 pg/ml) öppnades med EcoR I restriktionsenzym. Efter denna behandling tillsattes lösningen 0,5 ul lM ditiotreitol och l0 ul exonukleas III (0,25 enheter, Biolabs). Lösningen inkuberades l-3 min vid 37°C och reaktionen avbröts i ett 70°C vattenbad. DNA utfälldes ur lösningen med etanol och upplöstes i 0,3M NaCl-0,03M natriumace- tat-3 mM ZnCl2-buffert (pH 4,5). 10 ul S1-nukleas (25 enheter/ml, Boehringer Mannheim) tillsattes, och lösningen inkuberades 30 min vid 37°C och 10 min vid 4°C. Efter inkuberingarna extraherades preparatet med fenol, fenolen avlägsnades med eterextraktion och DNA utfälldes med etanol. Den torkade DNA upplöstes i 40 ul 10 mM Tris-HC1-1 mM EDTA-buffert (PH 8,0), 10 pl 150 mM Tris-180 mM KCl-40 mM MgCl2-3,0 mM di- tiotreitol-buffert (pH 8,3), 5 ul dNTP-blandning, 10 15 20 25 30 35 453 513 9 i vilken med varje nukleotidtrifosfat blandades 10 mM av lösningen i ekvimolärt förhållande och 2 pl revers- transkriptasenzym (Beard, 13 enheter/pl)- Lösningen inkuberades 30 min vid 65°C. DNA renades medelst prepa- rativ agaroselektrofores (LTG, Low Gelling Temperature) och de med etidiumbromid färgade plasmidzonerna skars av från gelen. DNA extraherades från agaros med fenol vid 65°C, fenolextraktionen upprepades vid 20°C, och fenolen avlägsnades med eterextraktion. DNA utfälldes med etanol och fälningen tvättades med 70% etanol och torkades.
Fosforylering av EcoR I-linkermolekylen och förening av densamma med en plasmid Till 10 pl av ECOR I linkermolekyllösningen (EcoR I linker, Collaborative Research, 50 pg/ml) tillsat- tes so_p1 32P Y ATP (10 mci/ml, aooo cl/mmol), 1,7 pi 660 mM Tris-HCl-66 mM MgCl2-100 mM ditiotreito1-buf- fert (pH 8,0) och 0,5 pl T4-polynukleotidkinas. Lös- ningen inkuberades 30 min vid 37°C, varefter 5 pl 10 mM ATP tillsattes och inkuberingen fortsattes 30 min vid 37°C. Det ovan beskrivna torkade exonukleasbehand- lade pKTH29-preparatet upplöstes i 5 pl av den ovan beskrivna lösningen innehållande fosforylerad EcoR I linkermolekyl. Till lösningen tillsattes 0,5 pl 10 mM ATP, 0,5 pl 1 mM spermidin och 0,5 pl T4-DNA-ligas (2 Weiss-enheter). Lösningen inkuberades Bfšhvid 23°C, varefter den utspäddes till 20 pl med 40 mM Tris-HCl- -100 mM NaCl-10 mM MgCl2-buffert (pH 7,6). 15 enheter EcoR I enzym (Biolabs) tillsattes och lösningen in- kuberades 12 h vid 37°C. Reaktionen avbröts genom inkubering 10 min vid 65°C. Det EcoR I-behandlade preparatet gelfiltrerades genom en 1 ml Sepharose 4B-kolonn. Vid filtreringen användes som eluerings- buffert 2 mM Tris-HCl-0,1 mM EDTA-buffert (pH 7,5).
Filtratet uppsamlades i 35 pl fraktioner och de plas- mid-innehållande fraktionerna identifierades på basis av radioaktiviteten, uppsamlades och torkades. Den torkade DNA:n upplöstes i 20 pl 66 mM Tris-HCl-6,6 mM, 10 15 20 25 30 35 453 513 10 MgCl2-lO mM ditiotreitol-buffert (pH 8,0) och 1,5 pl 10 mM ATP och 0,3 pl T4-DNA-ligas tillsattes. Lösningen inkuberades 3 h vid 23°C, varefter den kompetenta B. subtilis IHO6064-stammen transformerades med plas- midpreparatet och cellerna odlades i kanamycin-inne- hållande bakterieskàlar.
Plasmiderna isolerades från transformanterna medelst ett tidigare beskrivet förfarande (Cryczan et al., J. 134, 318-329, 1978) och plasmi- derna karaktäriserades först medelst gelelektrofores, varefter deras DNA-basordning bestämdes på båda sidor- na av EcoR I linkermolekylen. På så sätt erhölls från plasmiden pKTH 29 plasmiden pKTH 38, i vilken EcoR I- -linkermolekylen ligger 90 nukleotidpar efter utsöndrings- Bacteriol. signalens kapningsställe inom området av a-amylasens strukturgen. För att införa linkermolekylen på kopp- lingsstället för utsöndringssignalen eller i omedelbar närhet därav öppnades plasmiden pKTH 38 med EcoR I.
Tre satser på 10 pg av den öppnade plasmiden suspende- rades var och en i 115 pl 20 mM Tris, 600 mM NaCl, 12 mM MgC12, 12 mM CaCl2, 1 mM EDTA-buffert (pH 8,1).
Till varje plasmidsats tillsattes 10 pl BAL-31 enzym (BRL, 40 U, ml) och tuberna inkuberades 5, 6 och 7 min i ett 30°C vattenbad. Reaktionen avbröts genom till- sats av 0,5 M EDTA, pH 8,0 så, att slutkoncentrationen blev 12 mM. De med BAL-31 behandlade DNA-satserna kombinerades, extraherades två gånger med fenol och utfälldes med etanol. Etanolfällningen suspenderades i 75 pl 63 mM Tris, 6,3 mM MgCl2-buffert (PH 8,0), och till lösningen tillsattes 5 pl l mM dATP, 1 mM dGTP, l mM dCTP, och 1 mM dTTP samt till slut 5 pl T4-polymeras (PL-Biochemicals, 5 U/pl). Lösningen inkuberades 80 min vid ll°C. Reaktionen avbröts med 0,5 M EDTA såsom ovan, och blandningen extraherades med fenol och DNA utfälldes med etanol. Etanolfäll- ningen upplöstes i 250 pl 10 mM Tris, l mM EDTA-buffert (pH 8,0). Härav togs 55 pl, vartill tillsattes 50 pl LI? 10 15 453 513 ll fosforylerad Hind III-linkermolekyl (BRL, 75 pmol), 5 pl mM Tris, 100 mM MgCl2, 50 mM ditiotreitol-buffert (pH 7,5) och 10 pl T4 DNA-ligas (BRL 2 U/ul). Bland- ningen inkuherades 15 h vid l5°C och 10 min vid 65°C.
DNA utfälldes med isopropanol, DNA-fällningen tvätta- des med 70% etanol och suspenderades efter vakuum- torkning i 100 pl 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl, 5 mM ditiotreitol-buffert (pH 8,0). Till suspensionen tillsattes 3 pl Hind III-restriktionsenzvm (10 U/pl, BRL) och den inkuberades 4 h vid 37°C och 10 min vid 65°C. DNA renades medelst elektrofores med användning av en 0,8% LGT-agarosgel (Marine Colloids Inc), 30 V, 15 h. Den lineära plasmidzonen skars av från gelen, DNA extraherades vid 65°C med fenol och utfälldes med etanol. Etanolfällningen upplöstes i 35 pl 66 mM Tris, 10 mM MgCl, 5 mM ditiotreitol-buffert (pH 7,5), till vilken tillsattes 1,5 pl l0 mM rATP och 1,5 ul T4-DNA-ligas (Bethesda Research Laboratories, 2 U/pl.
Blandningen inkuberades 3 h vid 22°C och transformerades till den kompetenta B. subtilis IHO 6135-stammen, och cellerna odlades i näringsmediumskålar som innehöll kanamycin. Plasmiderna isolerades från transformanterna pà tidigare beskrivet sätt och positionen av Hind III- -linkermolekylen i plasmiderna bestämdes medelst DNA-sek- vensering. På så sätt erhölls en serie plasmider, i vilka Hind III-linkermolekylen är belägen omedelbart efter utsöndringssignalen eller i olika ställningar efter utsöndringssignalens kapningsställe på området för a-amylasens strukturgen: 453 515 _... 001 Uuh»UQ< mmmwmmmmmmmgu Hp? ~<~ u mmmmmmmmwmmwhu QU< _UQ~HQQ< _uU»Huu< 12 uu»»uu< uuu uuu uuu uuo uuu uuu uuu vad »<< »aa ~<< P44 w<1 h<< <»u_uuU _ <~Q_UUu _ <~Q_UQQ _ <»u_UU@ _ <~u_UUQ _UU~hUo< _UU»»UU< _uo»»uu< u<< uuu uud ha» ou» < cwq cum un* ~>» QHH »HQ mflm .>» :uu um; :m4 Hnk >Hw cm< H~>_mH< H.. H- ._ du» Quw auh au» Hmm HL» ß' < ddu »w< »P4 wh< w»< ww< w~< »h< »w< »P4 w~< ~»< »gm uwa u»< uw< uk: uw< o»< Uh: o»< uhc uw< uwa um: ann mm mm ßn mm mm en mm Nm fin om ofi Ihxa zkxn zhxß Ihxn zhxa IPXQ xkxa xhxn IPXQ Ihxa Ikxa 10 15 20 25 30 35 455 515 13 Till dessa av Hind III-linkermolekylerna bildade kapningsställen kan kopplas en aminosyror kodande DNA-sekvens av vilket som helst önskat protein, varvid, såsom av ovanstående exempel framgår, en bakterie av Bacillus-släktet kan bringas att på sitt växtun- derlag producera och utsöndra ifrågavarande protein.
EXEMPEL 1 Bz9ê9E§i9n_ë!_E;_§9li_ê:läE§êm맧Qëz@_¿_§9_â맿ll9§ subtilis-stam Plasmiden pKTH 50 öppnades med Hind III enzym och till öppningsstället kopplades en B-laktamas kodan- de gen av E. coli, ur vilken promotorn och utsönd- ringssignalområdena avlägsnats. Den erhållna hybrid- plasmiden transformerades till en kompetent B. subtilis IHO 6140-stam genom att på basis av kanamycinresistens välja ut de celler som erhållit plasmiden, och celler- na odlades i näringsämnesskálar som innehöll kanamycin.
Transformanterna sållades med avseende på laktamas- produktionen genom att suspendera varje koloni i 100 ul, 0,1 mM nitrocefin, 0,l M K-fosfat-lösning (pH 7,0).
Av kolonierna, som gav ett positivt resultat i nitro- cefintesten (lösningens färg förändrades till röd), gjordes vätskekulturer för bestämning av B-laktamas- enzymets aktivitet. Som kontroll användes en IHO 6140- B. subtilis stam, som hade transformerats med plasmiden pKTH 50. Stammarna odlades i SMS-lösning (Spizizen minimal salts), till vilken satts 0,5% glycerol, 1% löslig stärkelse och 5 pg/ml kanamycin. Kulturerna odlades under omskakning vid 37°C. Cirka 5 h efter den logaritmiska växtperioden (Klett67 "~“250) Centri- fugerades blandningarna (10 000 g, 5 min) och super- natanten uppsamlades. Cellerna suspenderades i 0,1 M kalium-fosfat-buffert (pH 7,0) till sin ursprungliga odlingsvolym. Av cell- och supernatantfraktionerna bestämdes B-laktamasaktiviteten genom att spektrome- triskt observera sönderdelningen av nitrocefin. Följande resultat erhölls från bestämningen. 10 l5 20 25 30 35 B-laktamasaktivitet (U/mlx) celler supernatant B. subšilis Ino s14o/pxwn so- 8-laktamas 60 3000 B. subtilis IHO 6140/pKTH 50 x) lU B-laktamas sönderdelar l umol penicillin G under l min vid 37°C.
EXEMPEL 2 Plasmiden pKTH 53 öppnades med Hind III-enzym och till öppningsstället kopplades en leukocytinter- feron (Q-2) kodande DNA-sekvens, från vilken den ut- söndringssignalen kodande delen hade avlägsnats. Den erhållna hybridplasmiden transformerades till en kompe- tent IHO 6140-B. subtilis-stam genom att pà basis av kanamycinresistensen välja ut de celler som erhållit plasmiden. Transformanterna sàllades medelst ett koloni- hybridisationsförfarande (Grünstein, M. och Hogness, D.S., Proc. Natl. Acad. Sci. (US) 72, 3961-3965, 1975) med användning av interferon kodande med 1?5J märkt DNA. Bakteriekolonier innehållande interferon-DNA odlades i Luria-buljong, till vilken tillsats 2% löslig stärkelse och 5 ug/ml kanamycin, under omskakning vid 37°C. Kulturen centrifugerades 4 h efter den loga- ritmiska växtperioden (Klett67 ^^~300) 10 000 g, 5 min.
Supernatanten uppsamlades och cellerna suspenderades till sin ursprungliga växtvolym i 0,9% NaCl-lösning.
Interferonaktiviteten i cell- och supernatantfrak- tionerna bestämdes. Som kontroll i bestämningarna användes B. subtilis IHO ol40/pKTH 53-stammen.
Följande resultat erhölls av bestämningarna: B. subtilis IHO 6140/ 5 pxTH 53-IF B-subtilis IHO 6140/ pxrn 53 10 15 Interferon-aktivitet (I.U./ml) celler ! supernatant 3000 ¿ zoo ooo <2O <20

Claims (3)

10 15 20 25 '2,xk ä n n e t e c k n a d 16 PATENTKRAV
1. Förfarande för effektivisering av produktionen av äggviteämne i bakterier av släktet Bacillus, genom att foga en gen för ett extracellulärt äggviteämne i en bakterie av släktet Bacillus med hjälp av re- kombinant DNA-teknik till en i bakterier av släktet Bacillus uppträdande plasmidmolekyl, genom att trans- formera en värdbakterie av släktet Bacillus, såsom Bacillus subtilis, med den erhållna rekombinant DNA- -molekylen, och genom att odla de transformerade bak- terierna för producerande av extracellulärt äggvite- ämne, k ä n n e t e c k n a t därav, att den till plasmiden fogade genen för extracellulärt äggviteämne är u-amylas-genen hos Bacillus amyloliquefaciens, och att plasmiden är en i bakterier av släktet Bacillus i flera kopior uppträdande plasmid, såsom pUB 110.
2. Rekombinant DNA-molekyl, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den har erhållits genom att foga a-amylas-genen hos Bacillus amyloliquefaciens med rekombinant DNA-teknik till en i bakterier av släktet Bacillus i flera kopior uppträdande plasmidmolekyl, såsom plasmiden pUB ll0. _
3. Rekombinant DNA-molekyl enligt patentkravet därav, att den innehåller nedanstående basordning, eller en del därav: AÅGCCCCGCA TTCGGGGCGT . GGCTGAAGAA CCGACTTCTT TCATCAGACA AGTAGTCTGT AÅGGGGGGTT TTCCCCCCAA GGAGAGGAAA CCTCTCCTTT §CACGCTGTT CGTGCGACÄA TGCAGTÅTTT ACGTCÅTAÅÅ ATGCGGAACA TACGCCTTGT GATTGAGCCÅ CTAACTCGGT ÅGCÄAAAAGG TCGTTTTTCC CÅTACGAAAA GTATGCTTTT GTGGATCGAT CACCTAGCTA GGGTATTTTT CCCATAAAAA GTTATTATTT CAATAATAAA CATGATTCAA GTACTAAGTT ATTTGTCAGT TAAACAGTCA TGAATGGTAT ÅCTTACCATA TTTATCGGAT AÄATAGCCTA ATCCGATAAC TAGGCTATTG GACGGTCAGÅ CTGCCAGTCT 17 GACTGGCTGÅ CTGACCGACT TGTTTGÅGAA ACAAACTCTT TATGCTGTCC ATACGACAGG TACTGATATG ATGACTATAC AAACGAAAGC TTTGCTTTCG TTGCCGATTA AACGGCTAAT ACGCCGAACG TGCGGCTTGC ATCGGAATCA TAGCCTTAGT GGATACGGAC CCTATGCCTG ACGAÅATACG Tccrrwawcc AAACATTGAG TTTGTAACTC AAGAAGAAGA TTCTTCTTCT AGACTGTCCG TCTGACAGGC TAAAATATAA ATTTTATATT GGACAGTTTC CCTGTCAAAG CAAAAACATC GTTTTTGTAG ACGGCCAGCA TGCCGGTCGT CTGCCGTCTG GACGGCÅGAC CTTATGATTT GAATACTÅAA GCAÉAA ccrcrr 453 515 CCTTTGATGA GGAAACTACT CCATAAAAAT GGTATTTTTA CTGTGTAAAA GACÄCÄTTTT TTTGTATAAG AAACATATTC GTTCAGACTT CAAGTCTGAA AGCCGTAAÅT TCGGCATTTA TTGGAAACGA AACCTTTGCT GATTCCTCCC CTAAGGAGGG GTATGATTTA CATÅCTAAAT CTGATGATTT GACTACTAAA ACCTTGTCTG TGGAACAGAC ATAAGGAATA TATTCCTTAT AAAATGAGAG TTTTACTCTC GTGCTTATGT CÄCGAATACA GGCACGCTGAA CCGTGCGACT TTGCAGAATG ÄÅCGTCTTAC GCATACAAAG CGTATGTTTC GGAGAATTCC CCTCTTAAGG där pilen visar begynnelsekodonen för a-amylasgenens signalsekvens, och där den härpà följande för en a- -amylasgen kodande sekvensen har understreckats.
SE8702885A 1980-12-31 1987-07-16 Forfarande for effektivisering av produktionen av eggviteemne SE453513B (sv)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI804081A FI64813C (fi) 1980-12-31 1980-12-31 Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE8702885L SE8702885L (sv) 1987-07-16
SE8702885D0 SE8702885D0 (sv) 1987-07-16
SE453513B true SE453513B (sv) 1988-02-08

Family

ID=8514019

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8107812A SE452632B (sv) 1980-12-31 1981-12-29 Rekombinantplasmidvektor samt forfarande for framstellning av proteiner medelst dna-teknik varvid anvendes bl a regleringsdelen av genen for bacillus amyloliquefaciens-alfa-amylas
SE8702885A SE453513B (sv) 1980-12-31 1987-07-16 Forfarande for effektivisering av produktionen av eggviteemne

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8107812A SE452632B (sv) 1980-12-31 1981-12-29 Rekombinantplasmidvektor samt forfarande for framstellning av proteiner medelst dna-teknik varvid anvendes bl a regleringsdelen av genen for bacillus amyloliquefaciens-alfa-amylas

Country Status (11)

Country Link
US (2) US5010015A (sv)
JP (2) JPS57132895A (sv)
AT (1) AT380695B (sv)
BE (1) BE891659A (sv)
CA (1) CA1211726A (sv)
CH (2) CH668080A5 (sv)
DE (2) DE3153403C2 (sv)
FI (1) FI64813C (sv)
FR (2) FR2501230B1 (sv)
GB (2) GB2091268B (sv)
SE (2) SE452632B (sv)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH651308A5 (de) * 1980-07-01 1985-09-13 Hoffmann La Roche Interferone und deren herstellung.
US5380653A (en) * 1980-12-31 1995-01-10 The Finnish National Public Health Institute Expression vectors and methods for intracellular protein production in bascillus
EP0063953A3 (en) * 1981-04-29 1983-10-19 Biogen N.V. Bacillus cloning vectors, recombinant dna molecules, bacillus hosts transformed with them and methods for expressing foreign dna sequences and producing polypeptides coded thereby
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US5582824A (en) * 1981-10-19 1996-12-10 Genentech, Inc. Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
AU582112B2 (en) * 1982-02-17 1989-03-16 Lawrence E. D'antonio Purification of parasite protective antigen factors
FR2524487B1 (fr) * 1982-04-05 1985-11-22 Pasteur Institut Fragments d'adn codant pour des polypeptides contenant au moins un determinant antigenique des papillomavirus, notamment du type hpv 1a et polypeptides correspondants
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
SE8204811L (sv) * 1982-08-23 1984-02-24 Sven Lofdahl Dna-fragment innefattande en signalsekvens
JPS5939899A (ja) * 1982-08-27 1984-03-05 Gakuzo Tamura 新規ベクタ−
IT1156317B (it) * 1982-09-08 1987-02-04 Anic Spa Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione
FR2537602B2 (fr) * 1982-09-24 1986-10-24 Centre Nat Rech Scient Nouvel adn recombinant perfectionne utile dans la preparation d'a-amylase par bacillus subtilis
DE3330003A1 (de) * 1982-10-21 1984-10-31 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig Dna-sequenz und dna-strukturen und sie verwendendes verfahren zur herstellung von penicillin-acylase
NO170594C (no) * 1982-11-01 1992-11-04 Solvay Enzymes Inc Fremgangsmaate for heterolog kloning av gen i bacillus mikroorganisme
DE3382547D1 (de) * 1983-01-12 1992-05-27 Chiron Corp Sekretorische expression in eukaryoten.
AU569722B2 (en) * 1983-01-28 1988-02-18 Saramane Pty Ltd Expression of plasmodium falciparum polypeptides from cloned cdna
NO840200L (no) * 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
SE8300693L (sv) * 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta
EP0316023B1 (en) * 1983-03-08 1993-06-09 Rikagaku Kenkyusho Plasmids, methods for their construction, microorganisms carrying them and methods for the extracellular production of xylanase by cultivation of the microorganisms
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
JPS59196092A (ja) * 1983-04-25 1984-11-07 Sanraku Inc 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法
US5310675A (en) * 1983-06-24 1994-05-10 Genencor, Inc. Procaryotic carbonyl hydrolases
JPS609487A (ja) * 1983-06-29 1985-01-18 Kunio Yamane 組換ｄｎａ分子
US4554250A (en) * 1983-06-30 1985-11-19 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method of increased production of penicillin acylase and plasmid employed therein
EP0134048B2 (en) * 1983-07-06 1996-08-14 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression in industrial microorganism species
CA1311429C (en) * 1983-07-06 1992-12-15 Vasantha Nagarajan Vector for polypeptides in bacilli
JPS6091980A (ja) * 1983-07-06 1985-05-23 ジェネックス・コーポレイション プロテア−ゼ酵素の発現のための徴生物を製造する方法
US5624829A (en) * 1984-07-03 1997-04-29 Gist-Brocades, B.V. Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them
US4536477A (en) * 1983-08-17 1985-08-20 Cpc International Inc. Thermostable glucoamylase and method for its production
JPS6058074A (ja) * 1983-09-09 1985-04-04 Juzo Udaka バチルス・ブレビスを形質転換する方法
AU561372B2 (en) * 1983-10-10 1987-05-07 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The Streptokinase-coding recombinant vectors
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
DD250546A1 (de) * 1983-12-16 1987-10-14 Adw Ddr Verfahren zur fermentativen herstellung einer streptokinase
US4784949A (en) * 1984-04-19 1988-11-15 Cetus Corporation Universal dominant selectable marker cassette
JPS60188070A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Kunio Yamane シグナルペプチドをコードするｄｎａ
JPS60188093A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Teruhiko Beppu 枯草菌に於ける形質発現プラスミド
GB8414271D0 (en) * 1984-06-05 1984-07-11 Cpc International Inc Recombinant dna
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US6022950A (en) * 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US4801537A (en) * 1984-06-08 1989-01-31 Genex Corporation Vector for expression of polypeptides in bacilli
JPH062074B2 (ja) * 1984-07-27 1994-01-12 國男 山根 オリゴペプチドの製法
JP2524693B2 (ja) * 1984-07-30 1996-08-14 湧永製薬株式会社 蛋白質の製造法
US5691181A (en) * 1984-08-21 1997-11-25 Celltech Limited DNA encoding lipase from human gastric mucosal tissue
GB8421210D0 (en) * 1984-08-21 1984-09-26 Celltech Ltd Polypeptide and polypeptide composition
US5126264A (en) * 1984-09-11 1992-06-30 The Walter & Eliza Hall Institute Of Medical Research The RESA and FIRA antigens of plasmodium falciparum
JPS61268183A (ja) * 1985-05-24 1986-11-27 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物
US4963495A (en) * 1984-10-05 1990-10-16 Genentech, Inc. Secretion of heterologous proteins
IT1177378B (it) * 1984-12-11 1987-08-26 Anic Spa Vettore plasmidico psm112 ad espressione in bacillus subtilis
JPH0817702B2 (ja) * 1984-12-28 1996-02-28 理化学研究所 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物
JP2500311B2 (ja) * 1985-03-19 1996-05-29 工業技術院長 蛋白製造法
JPS61177996A (ja) * 1985-02-02 1986-08-09 Green Cross Corp:The インタ−フエロン−γの製造法
US4783415A (en) * 1985-03-28 1988-11-08 Meiji Seika Kabushiki Kaisha Gene coding for signal peptides and utilization thereof
EP0221923A4 (en) * 1985-03-29 1990-03-22 Bioteknika International SECRETION VECTOR.
SE459503B (sv) * 1985-05-03 1989-07-10 Excorim Kommanditbolag Hybrid-dna-molekyl innefattande dna-sekvens som kodar foer protein g samt foerfarande foer framstaellning av protein g
JPS623796A (ja) * 1985-06-28 1987-01-09 Ajinomoto Co Inc インタ−ロイキン２の製造法
JP2620852B2 (ja) * 1985-07-30 1997-06-18 理化学研究所 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物
FR2586428B1 (fr) * 1985-08-26 1988-11-25 Pasteur Institut Polypeptides et anticorps, caracteristiques du papillomavirus et leurs applications au diagnostic in vitro, a la prevention et/ou la lutte contre des infections a papillomavirus
US5024943A (en) * 1985-11-07 1991-06-18 Gist-Brocades Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
JPH0669377B2 (ja) * 1985-11-25 1994-09-07 工業技術院長 Ｄｎａ塩基配列およびベクタ−
US5278059A (en) * 1985-12-04 1994-01-11 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaki Kenkyujo Polypeptide possessing cyclomaltodextrin glucanotransferase activity
GB2191491B (en) * 1986-04-25 1990-12-05 Labofina Sa Dna segment coding for a specific lipase, vectors for the expression thereof, microorganisms transformed by these vectors and use of these microorganisms for
US5486473A (en) * 1986-05-06 1996-01-23 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University A DNA coding for a Flavivirus antigen
US5200509A (en) * 1987-04-06 1993-04-06 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Human somatomedin carrier protein subunits and process for producing them; recombinant DNA molecules, hosts, processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides
US5885770A (en) * 1987-04-22 1999-03-23 Institut Pasteur Polypeptides and antibodies characteristic of papillomavirus, and diagnostic procedures and vaccines making use of them
AU5027890A (en) * 1989-02-10 1990-09-05 Genesit Oy A method for producing pertussis toxin subunits
ES2120409T3 (es) * 1989-02-10 1998-11-01 Spectrum Medical Sciences Ltd Nuevos vectores de expresion y metodos para la produccion de proteinas intracelulares.
US5162207A (en) * 1989-07-07 1992-11-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sucrose inducible expression vectors for bacillus sp.
DK16490D0 (da) * 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
NL9001388A (nl) 1990-06-19 1992-01-16 Unilever Nv Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
US5705362A (en) * 1992-05-25 1998-01-06 Gist-Brocades, N.V. Modified signal sequences
US5712118A (en) * 1993-09-29 1998-01-27 Research Foundation Of State University Of New York Vaccine for branhamella catarrhalis
US6121427A (en) * 1994-10-24 2000-09-19 Connaught Laboratories Limited Major outer membrane protein CD of branhamella
US20160367620A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Harry B. Demopoulos Glutathione
CN111378646A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 北京贝瑞和康生物技术有限公司 一种快速单反应管提取长片段基因组dna的方法和试剂盒

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1521032A (en) * 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
DE2712615A1 (de) * 1977-03-18 1978-09-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von filamentoesen phagen als vektor fuer synthetische rekombinate
AT373279B (de) * 1977-11-08 1984-01-10 Genentech Inc Verfahren zur herstellung eines rekombinationsclonbildungstraegers
DE2759053A1 (de) * 1977-12-30 1979-07-12 Uhlin Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
IL58308A (en) * 1978-10-23 1983-10-31 Upjohn Co Process for preparing glucose isomerase using a recombinant plasmid
GB2048894A (en) * 1979-05-11 1980-12-17 Gist Brocades Nv Plasmid
IL61982A (en) * 1980-02-15 1984-01-31 Cpc International Inc Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes
AU545912B2 (en) * 1980-03-10 1985-08-08 Cetus Corporation Cloned heterologous jive products in bacillies
ES8205432A1 (es) * 1980-03-17 1982-06-01 Harvard College Un metodo de determinar la cantidad de un polipeptido enca- riotico o procariotico producido por un microorganismo
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
JP2718033B2 (ja) * 1987-08-13 1998-02-25 日産自動車株式会社 自律走行車両制御装置

Also Published As

Publication number Publication date
AT380695B (de) 1986-06-25
SE452632B (sv) 1987-12-07
US5010015A (en) 1991-04-23
SE8107812L (sv) 1982-07-01
JPH03206889A (ja) 1991-09-10
JPS57132895A (en) 1982-08-17
FI64813C (fi) 1984-01-10
DE3152001C2 (sv) 1992-05-21
SE8702885L (sv) 1987-07-16
CH668080A5 (de) 1988-11-30
GB2091268A (en) 1982-07-28
GB2133408A (en) 1984-07-25
ATA560181A (de) 1985-11-15
US5010000A (en) 1991-04-23
SE8702885D0 (sv) 1987-07-16
GB2133408B (en) 1985-01-30
BE891659A (fr) 1982-04-16
FR2501230A1 (fr) 1982-09-10
GB8332576D0 (en) 1984-01-11
DE3153403C2 (sv) 1992-01-02
FI64813B (fi) 1983-09-30
CH659480A5 (de) 1987-01-30
FR2501230B1 (fr) 1985-09-13
DE3152001A1 (de) 1982-07-29
FI804081L (fi) 1982-07-01
GB2091268B (en) 1984-12-05
FR2526040A1 (fr) 1983-11-04
FR2526040B1 (fr) 1985-08-30
CA1211726A (en) 1986-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE453513B (sv) Forfarande for effektivisering av produktionen av eggviteemne
Churchward et al. A pSC101-derived plasmid which shows no sequence homology to other commonly used cloning vectors
Ortlepp et al. Molecular cloning in Bacillus subtilis of a Bacillus licheniformis gene encoding a thermostable alpha amylase
US20210123081A1 (en) Recombinant strain expressing phospholipase d and application thereof
JPH09511643A (ja) バチルス・ステアロサーモフィルス由来の精製ｄｎａポリメラーゼ
KR100312456B1 (ko) 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자
CN112301012B (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法
EP0057976B1 (en) a process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis
US5024943A (en) Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
Hall Experimental evolution of a new enzymatic function. Kinetic analysis of the ancestral (ebgo) and evolved (ebg+) enzymes
CN111304233A (zh) 一种蚯蚓抗菌肽的表达方法
CN112226437B (zh) 梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合及应用
Schoelz et al. Properties of an unusual strain of cauliflower mosaic virus.
EP0133321B1 (en) Dna gene, process for production thereof and plasmid containing the same
CA1198069A (en) Temperature sensitive multicopy plasmids
CN114230644A (zh) 一种gp32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用
EP0124076A2 (en) Method for preparation of recombinant plasmids, microorganisms transformed by said plasmids and thermo-stable alpha-amylase
US4585739A (en) Plasmid for foreign gene expression in B. subtilis
EP1038964A1 (en) A thermophilic alkaline phosphoesterase and its expression
Boidol et al. Properties of hybrid plasmids, consisting of parts of the mini-R1 factor Rsc 11 and Col E1
CN112210544B (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用
WO2020122429A1 (ko) 히알루론산 합성효소 변이 단백질 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법
WO2022146110A1 (ko) 히스티딘에 의한 피드백 억제가 감소된 atp-prt 변이체 및 이를 발현하는 히스티딘 생산 균주
WO2022145589A1 (ko) 히스티딘에 의한 피드백 억제가 감소된 atp-prt 변이체 및 이를 발현하는 히스티딘 생산 균주
WO2022145586A1 (ko) 히스티딘에 의한 피드백 억제가 감소된 atp-prt 변이체 및 이를 발현하는 히스티딘 생산 균주

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed

Ref document number: 8702885-8

Effective date: 19940710

Format of ref document f/p: F