JPH0695940B2

JPH0695940B2 - 枯草菌およびその形成方法

Info

Publication number: JPH0695940B2
Application number: JP60278842A
Authority: JP
Inventors: グランデイ・グイド; メレ・アントニオ
Original assignee: エニリチエルチエ・エス・ピ−・エ−
Priority date: 1984-12-11
Filing date: 1985-12-11
Publication date: 1994-11-30
Anticipated expiration: 2009-11-30
Also published as: US5585260A; IT8423992A1; JPS61199783A; JP2567199B2; DE3577726D1; EP0186631A1; ATE52805T1; IT8423992A0; EP0186631B1; IT1177378B; JPH06277069A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は分子生物学に関し、より具体的には枯草菌（Ba
cilus subtilis）中において異種蛋白の発現を可能とす
る枯草菌のプラスミッドベクターの作成に係る。

〔従来の技術〕

必要とされる蛋白やポリペプチドのための遺伝子コード
を含むプラスミドをもったバクテリアの培養により、酵
素やホルモンのようなポリペプチド及び蛋白を製造する
ことが知られている。

また、通常は宿主とは異なる微生物で生産される遺伝的
生産物を得るための望ましい遺伝子を含んだ上記プラス
ミドを有する培養バクテリアの組換えDNA技術によっ
て、雑種組換えプラスミドを作成することについても知
られている。

雑種プラスミドの作成においては、例えば宿主バクテリ
ア内で複製され得るプラスミドのようなクローニングベ
クターが、望ましい生産物コードに対応した遺伝子また
は遺伝子群を含む異種DNAフラグメントと結合される。
米国特許明細書第4237224号によれば、組換えDNAの調製
は次の段階からなる。

・適当な制限酵素を用いることにより、異種DNAを切断
する。

・得られたフラグメントを、リガーゼ酵素を用いること
によりベクター内に挿入する。

・得られた雑種分子を宿主細胞内に移す。

・得られたクローンが目的とする特定の蛋白またはポリ
ペプチドに対応するコードを含んでいることを確認する
ために、これらを分離（スクリーニング）する。

組換えDNA技術に使用されるベクターは、クローニング
に用いられる一または二以上の制限酵素によって認識さ
れる部位を含んだ環状のDNA分子からなっている。

従って、ベクターを選択的な制限酵素で処理することに
より、線状のDNA分子が得られる。

その分子を、予め同じ制限酵素で切断した異種DNA試料
とリガーゼ酵素の存在下で混合したとすれば、生成物は
プラスミドベクターと異種DNAフラグメントからなる雑
種分子となる。

その分子（「組換え雑種プラスミド」と呼ばれる）は、
転換機構（conversion mechanisum）により宿主細胞中
に移される。組換えDNA技術に用いられるプラスミドベ
クターは、自然界に見られる微生物中に存在する天然の
ベクターでもよく、また遺伝子工学により作成される合
成ベクターであってもよいが、宿主細胞中で自己複製で
きるものでなければならない。

更に、特定の異種蛋白は宿主細胞中で合成されるから、
そのDNAはRNAポリメラーゼがDNAをmRNAに転写し、且つ
関連するリボゾーム及び酵素がmRNAを蛋白に転化するこ
とを可能とする特定のシーケンスを含んでいる必要があ
る。

これらの認識シーケンスは、微生物によって相違するか
もしれない。結局、与えられた宿主細胞中で異種蛋白が
発現するためには、蛋白の構造遺伝子を宿主細胞に特異
的な認識シーケンスの制御下に置く必要がある。組換え
DNAについての殆どの研究は、大腸菌細胞を、異種蛋白
を生産するための宿主細胞に用いて行なわれて来た。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながらこの微生物の病原性の故に、得られた生産
物を食品や薬剤の分野で使用するには危険を伴ない、従
って工業的応用には不適当である。

従って、上記の欠点をもたない微生物中において、異種
遺伝子を発現させるのが有利であると考えられていた。

このような微生物のなかで、枯草菌は特に興味あるもの
である。

その遺伝子工学における使用は、その非病原性、工業的
醗酵プロセスで慣用的に用いられていること、及び合成
された蛋白の幾つかを培養媒質中に放出する能力の故に
特に魅力的である。

しかし、枯草菌を組換え遺伝子技術による蛋白合成のた
めの可能な宿主として使用することには、例えば異種遺
伝子が発現する効率限界等、未だ数多くの問題が存在す
る。その原因の一部は、適当なベクターがないことによ
るものである。

従って、本発明は組換えDNA技術に用いられ、枯草菌中
において高効率で異種蛋白遺伝子の発現が可能な新規プ
ラスミドベクターに関するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

この目的のために、本発明によれば以下の段階からなる
プロセスにより、pSM23プラスミドからpSM112プラスミ
ドベクターを調製する。

ａ）特異的制限酵素でpSM23プラスミドを線状化する。

ｂ）リガーゼ酵素でプラスミドDNAを環化し、pSM29プラ
スミドを分離する。

ｃ）pE194複製起源を含むpSM29のEcoRI-BamHIフラグメ
ントを分離する。

ｄ）pUB110の複製起源を含む大きなEcoRI-BamHIフラグ
メントを環状化する。

ｅ）pSM112プラスミドベクターを分離する。

本発明において、pSM23プラスミドは、イタリア特許出
願第23166・A/82号に記載された方法（本願出願日（優
先日）において公知）により得られる。この方法では、
バチルス・ゲネティック・ストック・センター（BGSC）
に寄託されたpE194プラスミド（BGSC 1E7）を、下記の
（ａ）〜（ｈ）に従って、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ATCC）に寄託されたpBR322プラス
ミド（ATCC 37017）及びプラスミドpUB110（ATCC 3701
5）と引き続き結合させることによって、pSM23プラスミ
ドを得る。即ち、（ａ）プラスミドpE194およびプラスミドpBR322を、Pst
Iで消化した後に、T4リガーゼの存在下で連結すること
により、プラスミドpSM2を得る。

（ｂ）該プラスミドpSM2をEcoRIで消化し、プラスミドp
BR322由来のEcoRI部位を除去することにより、プラスミ
ドpSM3を得る。

（ｃ）該プラスミドpSM3をHpaI制限酵素およびSstI制限
酵素で開裂することにより、HpaI-SstIフラグメントを
単離する。

（ｄ）該HpaI-SstIフラグメントの鈍端（平滑末端）にE
coRIリンカーを結合する。

（ｅ）前記フラグメントに、プラスミドpE194から単離
されたメチラーゼ遺伝子のプロモータ及びシャイン・ダ
ルガノ配列を含むDNAフラグメントを結合して、プラス
ミドpSM7を得る。

（ｆ）該プラスミドpSM7をPstI制限酵素で消化して、大
小のPstIフラグメントを得る。

（ｇ）プラスミドpE194に対応する該小フラグメント
を、T4・DNAリガーゼを用いてアニールする。

（ｈ）該プラスミドpE194（ステップ（ｇ））とプラス
ミドpUB110とを、XbaIで消化した後に連結することによ
り、プラスミドpSM23を得る。該プラスミドにおいて、p
UB110部分は、プラスミドpE194から単離されたメチラー
ゼ遺伝子のプロモータ／シャイン・ダルガノ配列（ステ
ップ（ｅ））に近接したBamHI部位を有するように配向
される。

なお、上記のpE194プラスミドは、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）第150巻
第２号第804〜814頁（1982年５月）および同第137巻第
１号第635〜643頁（1979年１月）に記載されており、既
に充分に特徴付けられている。プラスミドpSM23（その
制限地図を第１図に示す）は、リボゾーム認識部位（RB
S）のすぐ後に露出した単一のEcoRI部位と、枯草菌中で
作用する二つの複製起源、即ちプラスミドpUB110起源お
よびプラスミドpE194起源とを有している。

更に特徴的には、pUB110に対応したフラグメントは、そ
のBamHI制限部位がpE194のプロモータ−RES領域近くに
位置するように配向されている。

これら二つの領域の存在は、特に機能的複製起源を含む
別のDNAフラグメントが挿入されるときには不安定な現
象を引起す原因となると思われるから、プラスミドpSM2
3はpE194の複製起源が除去されてpUB110の複製起源だけ
が保持されるように修飾されている。この場合にも、高
温（51℃）において作用するという利点を有している。

この目的のために、中間体プラスミドpSM29が作製され
ている。その制限地図（第２図図示）において、pE194
に関するpUB110の配置はプラスミドpSM23の場合と反対
になっている。

従って、本発明によるとカナマイシン耐性のための遺伝
子コード(km^R)を含んだプラスミドpSM23は、XbaI制限酵
素を用いた公知の手段により、大きさの異なる二つのフ
ラグメントに切断される。一つはpUB110の複製起源を含
む約4650塩基対（bp）のフラグメントであり、他の一つ
はpE194の複製起源を含む約3000bpのフラグメントであ
る。

そのフラグメントは、引続きT₄リガーゼ酵素の存在下で
結合され、得られたリガーゼの混合物は枯草菌BGCS 1A2
46の細胞を公知の方法で適当な状態に転化するために用
いられる。その転化された細胞は、５μg/mlのカナマイ
シンを含む適当な培地上でプラークした後に分離する。

この方法によれば、km^R遺伝子をもつプラスミドを含ん
だ細胞のみが得られる。これらの中から、BamHI部位を
もったプラスミドを含み、且つ該プラスミド中でBamHI
部位がEcoRI部位から所定の距離をおいて位置している
コロニーが選択される。

本発明によると、pSM29プラスミドはDNA分子を単一の部
位で切断するBamHI制限酵素で処理され、続いて特異的
コンバータに結合される。ここで「コンバータ」とは、
制限酵素によって生じた結合性末端を他の酵素の結合性
末端に転化するための合成DNA分子である。この場合に
用いられるコンバータは、下記のアミノ酸配列を有する
BamHI−EcoRIである。

５′GATCCGAATTCG3′ ＧCTTAAGCCTAG EcoRI 次いで、得られたDNA分子はEcoRI制限酵素で二つのフラ
グメントに切断される。一方のフラグメントは3.2×10⁶
Ｄの分子量（MW）を有し、pE194の複製起源を含む他方
のフラグメントは1.5×10⁶ＤのMWを有している。これら
のフラグメントは、引続きリガーゼT₄酵素で環化され
る。

リガーゼの混合物は、５μg/mlのカナマイシンを含む適
当な培地上でプラークすることにより選択された枯草菌
BGSC 1A246の細胞を転化するために用いられる。

得られたコロニーの中から、pUB110の複製起源を含むフ
ラグメントに対応した4950bpのフラグメントからなるプ
ラスミドを含んでいるものが選択される。

記号pSM112で表示されるプラスミドは、ERMRBS認識部位
の近くに露出したEcoRI部位およびBamHI部位を有し、こ
れら部位が枯草菌にカナマイシン耐性を与え、また複製
能を与える。

得られたプラスミドを制限酵素EcoRI、BamHI、SstI、Xb
aI、HpaII、BgIIIで切断した後、寒天ゲル上での電気泳
動により生じたバンドの分析によって、プラスミドpSM1
12について第３図に示す制限が確認された。

第３図は、またEcoRIおよびBamHI部位ならびにリボゾー
ム認識部位の近傍領域におけるシーケンスを与えてい
る。

EcoRIおよびBamHI部位において、制限酵素で切断した
後、異種DNAから得られたDNAフラグメントをクローニン
グすることが可能である。

枯草菌BGSC 1A246（PSM112）はイリノイ州ペオリアの北
中央部（North Central Rerion of Peoria,Illinois）
にある農業研究教育センター（Agricultural Research
Culture Centre）に寄託されている。

本発明により枯草菌中で異種遺伝子を発現させ得るpSM1
12の能力の一例として、大腸菌ATCC37017のプラスミドp
BR322中に存在するβ−ラクタマーゼ遺伝子のクローニ
ングについて説明する。pSM112を記号pSM119で特定され
るβ−ラクタマーゼ遺伝子と融合させて誘導されたプラ
スミドが、公知の方法により適当な状態にされた枯草菌
1A246中に挿入される。

このクローニング方法の興味ある特徴は、枯草菌の転化
細胞を適当な培地で培養すると、β−ラクタマーゼを合
成するだけでなく、これを高効率で培地肉汁中に分秘
し、従って同定および精製が容易なことである。

よく知られているように、蛋白の排出は「リーダーペプ
チド」、即ち、蛋白の末端が未だ細胞の中に存在してい
るときその末端NH₂に位置するアミノ酸シーケンスの存
在に依存する。分子レベルでの機構は未だ少ししか知ら
れていないが、「リーダーペプチド」が細胞膜に対して
内部的に結合し、蛋白の残部が細胞膜を透過して移送さ
れるのを容易にすることは明白である。

従って、成熟した蛋白からの「リーダーペプチド」の切
断および分離にはメンブランプロテアーゼの関与が含ま
れており、分離された蛋白は細胞外に放出される。

グラム陰性のバクテリアから排出される蛋白中のリーダ
ーペプチドの大きさは、グラム陽性のバクテリアから排
出される蛋白のそれよりも小さいことが認められてい
る。

前者の場合のリーダーペプチドの長さはアミノ酸の数で
平均で21〜24であるのに対し、後者の場合の長さはアミ
ノ酸の数で27〜37である。

従って、組換えDNA技術によってグラム陽性のバクテリ
ア、より特定的に言えば枯草菌から異種蛋白を分泌させ
るためには、その蛋白遺伝子をグラム陽性のバクテリア
に特異的なリーダーペプチドの制御下に置く必要がある
と思われる。

英国特許出願番号2091268号には、成熟β−ラクタマー
ゼに対応するDNA暗号シーケンスを、発現を制御する部
分を含んだDNA領域およびバチルスアミロリケファチエ
ンス（Bacilus Amyloliquefaciens.）のαアミラーゼの
排出を指令するリーダーペプチドと融合させることによ
って、pBR322のβ−ラクタマーゼが枯草菌中で発現さ
れ、且つ分秘されることが記載されている。

本発明によると、E.coliのβ−ラクタマーゼが、蛋白自
体のリーダーペプチドを用いることにより、B.サブチリ
スから高効率に排出されることがわかった。

本発明によると、pSM112から小さなEcoRI-BamHIフラグ
メントを除去した後に、pSM112プラスミドベクターにE.
coliのβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むDNAフラグメント
を挿入することにより、公知の方法でpSM119ハイブリッ
ドプラスミドが得られる。

β−ラクタマーゼ遺伝子を含むフラグメントは、β−ラ
クタマーゼ部位を位置決めし、Nucleic Acids Research
10（1982）6487-6500（M.J.Zoller et al）に記載され
た試験管内突然変異技術を用い、pBR322のPvuII部位をB
amHI部位と置換した後、pBR322から単離される。

β−ラクタマーゼ遺伝子は、pBR322をEcoRIおよびBamHI
制限酵素により消化した後、この方法により容易に単離
される。

第５図に示す方法により得た、pSM115と呼ばれる突然変
異プラスミドは、一連のβ−ラクタマーゼの前駆体およ
びpBR322の複製源を含んでいる。前述のpSM115プラスミ
ドは、E.coliにアンピリシンへの耐性を与え、またβ−
ラクタマーゼ遺伝子のAGTの直前のEcoRI部位を有してい
る。

このプラスミドは、EcoRIおよびBamHI制限酵素により切
断され、異なったサイズの２つのフラグメントを発生
し、大きなEcoRI-BamHIフラグメント（約2150Bp）はpSM
112ベクターに挿入されてpSM119と呼ばれるハイブリッ
ドプラスミドを形成する。

ハイブリッドプラスミドpSM119は次に適切に製造された
B.サブチリスBGSC 1A246の細胞に挿入され、変換された
細胞は５μg/mlのカナマイシンを含む培地にプラークさ
せることにより単離される。

この方法は、カナマイシンに対する耐性を与える遺伝子
を有するハイブリッドプラスミドpSM119を含むクローン
を単離するために用いられる。

微生物B.サブチリスBGSC 1A246（pSM119）は、米国イリ
ノイ州のアグリカルチュラルリサーチカルチャーセンタ
ーに寄託されている。

クローン遺伝子が自らを発現し得るものであるならば、
基本的条件は、変換開始列とリボゾーム認識部位との間
の５〜10の塩基の間隔を維持するように、そのATGを、
ベクターに挿入されたフラグメントの末端５′の非常に
近くに位置せしめることである。特に、ここに記載され
たpSM119の構成では、その距離は６つの塩基である。

第７図は、pSM119の制限マップとβ−ラクタマーゼ遺伝
子のATGの最も近い列を示す。本発明によると、B.サブ
チリスBGSC 1A246（pSM119）の細胞が、炭素、窒素およ
び微量元素を含む液体培地内で培養され、β−ラクタマ
ーゼの製造は培地と細胞抽出物の培養肉汁内に行なわれ
た。

培養基内で高効率（75％）で酵素が分泌されるが、この
ことはβ−ラクタマーゼの前駆体のリーダーペプチドが
認識され、B.サブチリス分泌メカニズムにより用いられ
ることを示している。

以下の実施例は、本発明を例示するものであって、何ら
限定するものではない。

実施例１プラスミドpSM29の構成 0.3μｇのプラスミドpSM23を、pH7.4の6mMのトリス（ヒ
ドロキシメチル）塩酸塩（トリス−HCl）、100mMのNaCl
および6mMのMgCl₂を含む20μｌの溶液に懸濁させ、XbaI
（BRL）制限酵素の0.3ユニットにより切断した。この混
合物を37℃で１時間インキュベートした。等量のフェノ
ールを加えることにより反応をストップさせ、その後エ
ーテルにより水相から抽出した。

1/10容量の3M酢酸ナトリウムと2.5容量の95％エタノー
ル中に懸濁させた後−20℃で１晩放置して線状プラスミ
ドDNAを析出させた。

11000rpmで10分間遠心分離することにより、反応混合物
から析出DNAを分離した。析出物を50mMのトリス−HCl
（pH7.5）、10mMのMgCl₂、1Mのジチオトレイトールおよ
び0.5Mのアデノシントリホスフェート（ATP）を含む溶
液10μｌ中に再懸濁させ、0.5ユニットのT₄DNAリガーゼ
（BRL）酵素により常温（20〜25℃）で４時間環化し
た。

次に、全リガーゼ混合物を用いて、J.MoL.Biol.56（197
1）209-221,D.Dubnau et al.に示す方法によって、製造
されたバチラスサブチリスBGSC 1A246の細胞を変換し
た。

変換された細胞を、５μg/mlのカナマイシンを含むDIFC
Oトリプトーゼ血液寒天培地にブラークさせることによ
り選択した。

このように操作することにより、耐カナマイシン遺伝子
を有するプラスミドを含むB.サブチリス細胞が唯一の生
成物として得られた。

Recombinamt DNA techniques,pp.164-165（1983）（Rod
riguez et al）に記載された急速抽出法により、10km^R
コロニーからプラスミドを抽出、精製した。

10種の試験されたプラスミドの２種は、EcoRIおよびBam
HI制限酵素による処理の後、より小さなフラグメントXb
aI（pE194）がpSM23から反対方向に挿入されるという事
実に従って、それぞれ約2740および4890の２つのバンド
を有していた。２種のプラスミドのうちの１つが精製さ
れ、pSM29（第２図）と命名された。

実施例２ pE194の複製起点を有するフラグメントの切出し、およ
びプラスミドpSM112の構築実施例１と同様にして得たプラスミドpSM29 1μｇを、6
mMのトリス塩酸（pH7.9）、150mMのNaClおよび6mMのMgC
l₂を含有する溶液50μｌに懸濁させ、37℃の温度で１時
間BamHI（BRL）制限酵素1Uで処理した。

この処理の終点で等量のフェノールを加えることによっ
て反応を停止し、水相からエーテルで抽出した。

この溶液を−70℃で10分間保持し、3Mの酢酸ナトリウム
1/10容および95％エタノール2.5容を加えると、プラス
ミドDNAが沈殿した。

沈殿物を遠心によって溶液から回収し、70％エタノール
で洗浄し、減圧乾燥した。

得られたプラスミドDNAを、60mMのトリス塩酸（pH7.
6）、10mMのMgCl₂、15mMのジチオトレイトール、1mMの
スペルミジンおよび1mMのATPを含有する溶液10μｌに再
懸濁させ、上と同様の組成を有し、かつ供給会社の指示
に従ってキナーゼT₄（バイオラブズ）酵素12Uによって3
7℃で１時間および65℃で５分間前処理したBamHI-EcoRI
（ワーシントン）コンバーター160mgを含有する溶液10
μｌと混合した。

得られた混合物にT₄DNAリガーゼ酵素0.5Uを加えた後、1
4℃で一夜反応させた。反応時間の終点で、温度を65℃
で５分間保持することによって反応を停止した。水35μ
ｌ、5MのNaClO₄５μｌおよびイソプロパノール50μｌを
加えた後、溶液を、高分子量DNAが完全に沈殿するまで3
7℃に保持した。

沈殿したDNAを10000rpmで10分間の遠心により溶液から
分離し、70％エタノールで洗浄し、減圧乾燥した後、10
0mMのトリス塩酸（pH7.5）、50mMのNaClおよび5mMのMgC
l₂を含有する溶液20μｌ中に懸濁させた。

EcoRI制限酵素20Uを加えた後、溶液を37℃で２時間、つ
いで65℃で５分間反応させた。

DNAを、上に述べたようにして溶液から沈殿させ、分離
および水洗した後、50mMのトリス塩酸（pH7.5）、10mM
のMgCl₂、1mMのジチオトレイトール、1mMのATPおよびT₄
DNAリガーゼ0.5Uを含有する溶液10μｌに懸濁させた。

反応を14℃で一夜おこなった。

上で得たリガーゼ混合物５μｌをB.サブチリスBGSC 1A2
46の細胞の転換に用いた。

コンバーターは、カナマイシンを５μg/mlの割合で含む
TBAB培地のプラーク上で選別した。

高速抽出法により10km^Rコロニーからプラスミドを選別
した。これらプラスミドのうち５つが、アガロースゲル
上での分析により、約4940bpのバンドからなることが見
出された。EcoRI、BamHI、SstI、XbaI、HpaIIおよびBgl
IIの各酵素で切断した後、得られたバンドをアガロース
ゲル上で分析したところ、プラスミドpSM112に対し第３
図に示す制限酵素切断地図を確認した。

実施例３ β−ラクタマーゼのATGの前へのEcoRI部位の形成、およ
びpBR322からのβ−ラクタマーゼ遺伝子の分離大腸菌JM83（BRL）の細胞を下記組成のYT媒基10ml、（組成）量（g/l）トリプトン 10.0 イースト抽出液 5.0 NaCl 5.0 グリコール 1.0 H₂O 1.1 およびM13mp9ファージ溶液1ml中（なお、これにpBR322
の小さなEcoRI PstI断片を公知の方法により予め導入し
た）で、37℃で18時間培養した。この混合物はYT1を
感染させるのに用いた。

37℃で７時間培養させたのち、細胞を遠心分離し、上澄
液中のファージを、室温でポリエチレングリコール（PE
G）の20％溶液および2.5MNaClを含む溶液250mlを加え20
分間析出させた。

この析出物を遠心分離し、10mMのトリス−HCl（pH＝8.
0）および1mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む
溶液10ml中に再懸濁させた。

この混合物を等量のフェノール／クロロホルムで（1:
1）で３回、さらに等量のクロロホルムで３回処理し
た。

さらに、3M酢酸ナトリウム1/10容および95％エタノール
2.5容を加えたのち、−20℃でファージDNAを析出させ
た。ついで10,000rpmの遠心分離を20分間おこない懸濁
液からファージDNAを分離した。次にこれを真空乾燥さ
せたのち、最終濃度が１μg/mlの10mMトリス−HCl（pH
7.5）および1mM EDTAの溶液中に再懸濁させた。

ファージDNA2.5μｇおよび末端５′でホスホリル化した
合成オリゴヌクレオチド（第５図の配列を有する）0.2
μｇを、20mMのトリス−HCl（pH:7.5）、10mMのMgCl₂お
よび50mMのNaClを含む溶液10μｌ中に懸濁させ、65℃で
５分間、14℃で30分間培養した。

次に、20mMのトリス−HCl（pH:7.5）、10mMのMgCl₂、10
mMのジチオスレイトール、1mMのATP、1mMのデオキシシ
トシントリホスフェート（CTP）、1mMのデオキシチミジ
ントリホスフェート（TTP）、1mMのデオキシグアノシン
トリホスフェート（GTP）および1mMのデオキシアデノシ
ントリホスフェート（ATP）を含む溶液10μｌを上記反
応混合物中に添加し、さらにT₄リガーゼ３単位（Ｕ）お
よび大腸菌DNAポリメラーゼ（Klenow断片）2.5（Ｕ）の
存在下で14℃で22時間培養した。そののち、反応混合物
を臭化エチルを0.6μg/ml含む0.8％アガロースゲル0.8
％と接触させ、電位差100Vを加えて分離した。

３時間後、紫外線で可視の共有結合により閉じたDNA（c
ccDNA）を上記ゲルから電気的に溶出させ、これを用
い、Mandel et al（J.Mol.Biol.53（1979）159-162）の
方法により適応させた大腸菌JM17/18（BRL）を変換させ
た。

一重らせんDNAを公知の方法により94転換プラーク（溶
菌斑）から分離し、最終濃度、50μg/μｌで10mMのトリ
ス−HCl（pH7.7）および1mMのEDTAを含む溶液中に懸濁
させた。この懸濁液１μｌをニトロセルロースフィルタ
により吸収させ、６×SSC（１×SSC＝0.15MNaCl,0.015M
くえん酸ナトリウム、1mMEDTA、pH7.2）、10×Deubardt
溶液（0.2％ウシアルブミン、0.2％ポリビニルピロリド
ン、0.2％フイコール）、ウシ胸線DNA（音波処理したも
の）を含む溶液10ml中に23℃で３時間浸漬させ、ついで
キナーゼ標識付オリゴヌクレオチド１×10⁶cpmおよびAT
P32pの存在下で変性させた。ついで６×SSCで46℃で３
回洗滌したのち、フィルタを放射線撮影した。

その結果、９個のサンプルはDNA断片で強く交雑化され
ていた。

そのDNA分子の一つの配列を分析した結果、所望の突然
変異が見られ、β−ラクタマーゼ遺伝子のATGの前にEco
RI部位が存在していた。

次にM.Zoller et al（Nucleic Research10（1982）6487
-6500）による方法で突然変異させた再組換えファージD
NAの二重らせん形を精製し、ついでEcoRIおよびPstI制
限酵素で二重消化をおこなった。

この消化により３つの断片が得られ、その一つは200bp
で当初のEcoRI部位と突然変異化によって得られた部位
との距離に相当し、他の一つの断片は550bpでβ−ラク
タマーゼ遺伝子中の新しいEcoRI部位および新しいPstI
部位によって区画され、残りの一つは7500bpでファージ
分子全体（第５図）に相当するものであった。

アクリルアミドゲルから550bpEcoRIPstI断片を電気的に
溶出させ、T₄DNAリガーゼ酵素を用いpBR322の大きいEco
RI-PstI断片中に挿入した。

このリガーゼ混合物を用い、テトラシクリン抵抗を有す
る大腸菌HB101（BRL）の細胞を変換させた。

プラスミドpSM110をこの転換クローンの一つから分離し
た。第５図に示すその制限図はテトラシクリンおよびア
ンピシリンに対し抵抗を示す予期した構造のものであ
る。

実施例４ pSM110におけるPvuII部位のBamHIによる置換 6mMのトリス−HCl（pH7.4）、100mMのNaCl、6mMのMgCl₂
を含む溶液30μｌ中にpSM110を0.1μｇ懸濁させ、PvuII
（BRL）制限酵素0.1単位で切断した。

得られたプラスミドDNAをホスホリル化BamHI（Biolab
s）連結剤にモル比1:500で連結させた。

リガーゼ反応は14℃で18時間おこなった。反応終点時
に、DNAをメーカー（Biolabs）の処方規定に沿ってBamH
I制限酵素で処理し、ついで酢酸ナトリウム（3M）1/10
容量部とエタノール2.5容量部を添加して析出させた。

析出したDNAを10000rpmの遠心分離により回収し、66mM
のトリス−HCl（pH7.4）、6mMのMgCl₂、10mMのジチオス
レイトール、1mMのATPを含む溶液に１μh/mlの濃度で懸
濁させたのちT₄リガーゼ酵素で連結させた。

このリガーゼ混合物をついでアンピシリンに抵抗を示す
大腸菌HB101の適当な細胞を変換させるために使用し
た。

公知の手法により変換コロニーからpSM115を分離した。
約2580bpのこのプラスミドを、BamHI連結剤をPvuII末端
に連結したのちpSM110の大きいBamHI-PvuII断片を閉じ
ることにより得た。

実施例５ pSM112へのβ−ラクタマーゼ遺伝子の挿入 pSM112 1μｇとpSM115 1μｇをそれぞれ制限酵素BamHI
およびEscoRIを用い供給者（BRL）によって与えられた
方法で消化した。

このDNAを3Mの酢酸ナトリウム1/10容と95％エタノール
2.5容を加えて析出させた。

得られたプラスミドDNAを50mMのトリス−HCl（pH:7.
5）、10mMのMgCl₂、1mMのジチオスレイトールを含む溶
液10μｌ中に、T₄DNAリガーゼ酵素0.1Uの存在下で懸濁
させた。

この混合物５μｌを用い、カナマイシン５μg/mlを含む
トリプトースブラッドアガールベース（TBAB）（DIFCO
製）のプラークによりカナマイシンに対し抵抗を有する
枯草菌BGSC 1A246を変換させた。

この転換コロニーの一つは都合よく分離された。これは
プラスミドpSM119を含み、β−ラクタマーゼ遺伝子を有
するpSM115のEcoRI-BamHI断片とpSM112の大きいEcoRI-B
amHI断片からなっていた。

実施例６枯草菌BGSC 1A246（pSM119）からのβ−ラクタマーゼの
製造雑種pSM119プラスミドを含む枯草菌のコロニーを、0.5g
のグルコース、50μg/mlのトリプトファンを混合したSM
S媒体（Spizien鉱物塩）25mlを入れた250mlのErlenmaye
rフラスコ中に接種した。この媒体は予め120℃で15分間
滅菌した。

この接種したフラスコを静かに攪拌しながら37℃で培養
した。

細胞中および上澄液中で種々の間隔を以ってβ−ラクタ
マーゼ酵素の生成をＯ′Callaghan et al（Antimicrobi
al Agents and Chemotherapy 1（1972）283-288）に記
載の方法により測定した。β−ラクタマーゼの1Uは37℃
で１分当りニトロセフィナのナノモルを加水分解するの
に必要な酵素の量として定義された。

サンプルを10000rpmで５分間遠心分離し、上澄液を回収
した。

細胞を0.1Mりん酸塩緩衝液（pH:7.0）25ml中に懸濁さ
せ、音波処理により分解させた。

第６図は枯草菌BGSG 1A246（pSM119）培養の上澄液およ
び細胞中でのβ−ラクタマーゼ活性の測定結果を示す。

下記表Ｉは枯草菌BGSG 1A246（pSM119）中のβ−ラクタ
マーゼの形成を示している。

表Ｉ菌種 β−ラクタマーゼ活性枯草菌BGSG 1A24 0.1U/ml 枯草菌BGSG 1A426 380U/ml （pSM119）（細胞中での測定）

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpSM23の制限マップ、第２図はプラ
スミドpSM29の制限マップ、第３図はプラスミドpSM112
の制限マップ、第４図はプラスミドpSM112を得るための
トランスフォーメーション、第５図は合成オリゴヌクレ
オチドおよび試験管内突然変異、第６図はB.サブチリス
1A246（pSM119）の培地の上澄および細胞において測定
したβ−ラクタマーゼ活性、および第７図はプラスミド
pSM119の制限マップおよびβ−ラクタマーゼのATGへの
最も近いシーケンスをそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プラスミドpSM112を有する枯草菌。
【請求項２】下記の制限酵素地図によって特徴付けられ
るプラスミドpSM112。
【請求項３】プラスミドpSM23からpSM112を構築する方
法であって、ａ）プラスミドpSM23を制限酵素XbaIで線形化する工程
と、ｂ）このプラスミドDNAをT₄リガーゼ酵素で環化し、プ
ラスミドpSM29を単離する工程と、ｃ）pE194の複製起点を含むpSM29のEcoRI-BamHI断片を
除去する工程と、ｄ）pUB110の複製起点を含むpSM29の大きいEcoRI-BamHI
断片を環化する工程と、ｅ）プラスミドpSM112を単離する工程とを具備したこと
を特徴とする方法。
【請求項４】特許請求の範囲第３項記載の方法であっ
て、前記プラスミドpSM23が、リボゾーム認識部位の直
後に単一のEcoRI制限部位を有する方法。
【請求項５】特許請求の範囲第３項に記載の方法であっ
て、前記プラスミドpSM23が、前記プラスミドpUB110及
び前記プラスミドpE194の二つの複製起点を有する方
法。
【請求項６】特許請求の範囲第３項〜第５項の何れか１
項に記載の方法であって、前記プラスミドpSM23が、下
記の制限酵素地図によって示されるものである方法。
【請求項７】特許請求の範囲第３項に記載の方法であっ
て、前記プラスミドpSM29における、前記pUB110の複製
起点を含む断片の前記pE194の複製起点を含む断片に対
する配向が、前記プラスミドpSM23における配向とは反
対方向である方法。
【請求項８】特許請求の範囲第３項に記載の方法であっ
て、前記プラスミドpSM29が下記の制限酵素地図により
示されるものである方法。