KR100200166B1 - 알칼리성 단백질 가수분해효소 및 그것의 제조방법 - Google Patents
알칼리성 단백질 가수분해효소 및 그것의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100200166B1 KR100200166B1 KR1019910700414A KR910700414A KR100200166B1 KR 100200166 B1 KR100200166 B1 KR 100200166B1 KR 1019910700414 A KR1019910700414 A KR 1019910700414A KR 910700414 A KR910700414 A KR 910700414A KR 100200166 B1 KR100200166 B1 KR 100200166B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- bacillus
- atcc
- plasmid
- host cell
- dna
- Prior art date
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 152
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 99
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 92
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 75
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 54
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 52
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 claims description 47
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 6
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 abstract description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 125
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 107
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 61
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 44
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 43
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 37
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 18
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 9
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 6
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CWGJBBRZFIPXNZ-UHFFFAOYSA-N [C-]#N.Br Chemical group [C-]#N.Br CWGJBBRZFIPXNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 alkyl benzenesulfonates Chemical class 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 2
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 2
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GLFONBITBIYJPS-KRWDZBQOSA-N (4-nitrophenyl) (2s)-3-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)butanoate Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)OC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 GLFONBITBIYJPS-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241001595482 Columbicola bacillus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 1
- 241000702192 Escherichia virus P2 Species 0.000 description 1
- 206010073306 Exposure to radiation Diseases 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000343235 Maso Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 101100223934 Yersinia pestis dkgA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010051873 alkaline protease Proteins 0.000 description 1
- 150000008051 alkyl sulfates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- HALQELOKLVRWRI-VDBOFHIQSA-N doxycycline hyclate Chemical compound O.[Cl-].[Cl-].CCO.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H]([NH+](C)C)[C@@H]1[C@H]2O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H]([NH+](C)C)[C@@H]1[C@H]2O HALQELOKLVRWRI-VDBOFHIQSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- UKDDGQIUZRWRIK-UHFFFAOYSA-N ethyl n-[4-[benzyl(2-phenylethyl)amino]-2-(4-methoxyphenyl)-1h-imidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]carbamate Chemical compound N=1C(NC(=O)OCC)=CC=2NC(C=3C=CC(OC)=CC=3)=NC=2C=1N(CC=1C=CC=CC=1)CCC1=CC=CC=C1 UKDDGQIUZRWRIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003890 succinate salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
소망하는 단백질 가수분해 효소를 코드하는 DNA 서열로 구성된 다중복사 플라스미드에 의해 형질전환된 바실루스 리케니포르미스 숙주 균주를 발효시킴으로써 생성되는, 수용액중에서 전형적인 세탁조건하에 증가된 pH 및 산화안정성을 가지고 있는 세제 제형에 사용하기 위한 단백질 가수분해 효소.
Description
[발명의 명칭]
알칼리성 단백질 가수분해 효소 및 그것의 제조방법
[발명의 분야]
본 발명은 알칼리성 단백질 가수분해 효소, 유전학적으로 변형된 바실루스(Bacillus) 균주의 배양에 의한 상기 효소의 제조방법, 및 알칼리성 단백질 가수분해 효소를 코딩하는 상기 바실루스 균주 내의 유전자 구성물에 관한 것이다.
[관련기술의 설명]
단백질 가수분해 효소는 의류 등의 물품으로부터 단백직-기저 얼룩을 제거하기 위하여 가정용 세탁 세제 제형에 광범위하게 사용된다. 이 효소는 펩티드 결합의 절단을 촉매하는 효소인 세린 프로테아제로서 알려져 있는 종류의 일원이다. 세제 수용액에서 유용하기 위해서, 이 효소는 7 내지 10 의 pH 범위에서 활성이어야 한다. 또한 이 효소는 세제 사용시 유용하도록 산화와 효소적 및 비효소적 가수분해에 대해 안정해야 한다. 다양한 바실루스 균주가 적당한 호기성 발효 조건하에서 세린 프로테아제를 생성한다. 그러나, 야생형 균주에 의해 만들어지는 프로테아제의 양과 그 프로테아제의 생성률은 통상 상업적으로 사용하기에는 불충분하다. 프로테아제 수율을 증가시키는 한가지 방법은 방사선 또는 화학적 돌연변이 유발원에 노출시켜 돌연변이 균주를 생성시키는 것이다. 그러나, 이러한 통상적인 돌연변이 방법에는 이들 방법이 소정 돌연변이의 단지 통계학적 분포를 결과하고/결과하거나 상당수의 집단이 야생형으로 되돌아간다는 결점이 있다. 최근에 이르러, 이들 문제점을 극복하기 위한 노력은 박테리아 균주의 유도된 유전적 변형에 모아지고 있다. 이러한 유전적 변형은 숙주 세포가 재조합 DNA를 증가된 복사수로 복제할 수 있도록 보장해주는 환경하에서 숙주세포에 재조합 DNA를 도입함으로써 이루어진다. 또한, 외래 DNA에 의해 운반된 유전자는 발현될 수 있어야 한다. 유전공학적으로 제조된 생물체는 통상적으로 돌연변이된 박테리아가 종종 나타내는 결점이 없기 때문에, 상업적 효소 제조에 자주 유용하게 쓰인다.
재조합 DNA 기법을 사용하여 프로테아제를 제조하는 방법들은 공지 되어 있다. 예를 들어, 유럽특허 EP 130756A호에는 카르보닐 가수분해 효소(프로테아제)의 제조방법이 개시되어 있고, 미합중국 특허 제4,760,025호에는 천연적으로 존재하는 균주에 의해 생성된 것보다 더 많이 변형된 아미노산 서열을 가지고 있는 서브틸리신이 기재되어 있다. 독일특허 DE2925427호에는 킬레이트제 및 계면활성제에 대하여 매우 안정하고, 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)균주의 발효에 의해 생성되는 바실루스 알칼리성 프로테아제가 개시되어 있다. 바실루스 리케니포르미스의 배양에 의한 알칼리성 단백질 가수분해 효소의 생성은 영국특허 제 1,263,765호 ; 독일특허 제1,940,488호 ; 소련특허 제 400,116호 ; 미합중국 특허 제 3,623,956호 및 3,623,957호에 기재되어 있다.
[발명의 요약]
본 발명의 목적은, 수용액중에서 pH7 내지 10의 조건 및 10 내지 60의 온도에서 프로테아제의 양과 산화 안정성이 증가된 세제 제형에 사용하기 위한 단백질 가수분해 효소를 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한 세제 제형에 유용한 단백질 가수분해 효소의 상업적 생산에 사용하기 위한 돌연변이 바실루스속 균즈를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 숙주인 바실루스의 세포를 형질전환하기 위하여 소망되는 단백질 가수분해 효소를 코드화하는 서열을 함유하는 발현 벡터를 제공하는 것이다. 이들 목적은 실질적으로 제1도에 도시된 아미노산 서열을 가지고 있는 성숙한 단백질 가수분해 효소를 제공함으로써 이루어진다. 성숙한 단백질 가수분해 효소는 아미노산 잔기번호 약 112로부터 아미노산 잔기번호 약 380으로 연장되는 아미노산 서열을 갖는다. 이 단백질 가수분해 효소는 전사되는 순서대로 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 프로모터, 리보솜 결합부위, 및 프레-프로(pre-pro)영역에 작동가능하게 연결된 개시 코돈을 포함하는 조절영역을 전사 방향으로 포함하고 있는 DNA 서열을 갖는 플라스미드에 의해 형질전환된 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 균주를 배양함으로써 수득되며, 상기 프레-프로 영역은 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 알칼리성 프로테아제 효소를 코드화하는 성숙한 영역에 작동가능하게 연결되어 있다.
바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 균주는 이하 ATCC 53926으로 언급된다. 바실루스 리케니포르미스 DSM 641 균주는 이하 DSM 641로 언급된다. 미합중국 특허 제4,683,195호와 제4,683,202호에 기재된 중합효소 연쇄 반응은 이하 PCR로 언급된다. 제27도에 도시된 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자는 이하 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자로 언급된다. 바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제는 이하 BLAP로 언급하기로 한다. 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 프로모터는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자로부터 유래하는 프로모터이며, 이하 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 프로모터로 언급된다. 약어 kb는 1000개의 염기쌍 대신에 사용한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 BLAP 단백질의 프레, 프로, 및 성숙 영역에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
제2도는 BLAP 유전자를 포함하는 바실루스 렌투스로부터의 3.4kb Hindlll단편에 대한 DNA 서열을 도시한다.
제3도는 플라스미드 pGM15의 절단지도를 도시한다.
제4도는 플라스미드 pCB11C의 절단지도를 도시한다.
제5도는 플라스미드 pCB1N의 절단지도를 도시한다.
제6도는 플라스미드 pCB13C의 절단지도를 도시한다.
제7도는 플라스미드 pCB2N의 절단지도를 도시한다.
제8도는 올리고뉴클레오티드 1 내지 3을 도시한다. 위치는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자내에 있는 뉴클레오티드 서열의 위치에 해당한다. 부정합(mismatch) 위치는 소문자를 사용하여 표시한다. 절단 부위는 밑줄로 표시한다.
제9도는 플라스미드 pCB15C에 대한 절단지도를 도시한다.
제10도는 플라스미드 pCB4N에 대한 절단지도를 도시한다.
제11도는 플라스미드 pCB1N의 제조에 대한 개략도이다.
제12도는 플라스미드 pCB11C의 제조에 대한 개략도이다.
제13도는 플라스미드 pCB55C에 대한 절단지도를 도시한다.
제14도는 플라스미드 pCB56C에 대한 절단지도를 도시한다.
제15도는 플라스미드 pCB58C에 대한 절단지도를 도시한다.
제16도는 플라스미드 pCB75C에 대한 절단지도를 도시한다.
제17도는 플라스미드 pCB78C에 대한 절단지도를 도시한다.
제18도는 플라스미드 pCB50N에 대한 절단지도를 도시한다.
제19도는 플라스미드 pCB51N에 대한 절단지도를 도시한다.
제20도는 플라스미드 pCB53N에 대한 절단지도를 도시한다.
제21도는 플라스미드 pCB70N에 대한 절단지도를 도시한다.
제22도는 플라스미드 pCB73N에 대한 절단지도를 도시한다.
제23도는 대장균과 바실루스균에서 Clal 융합 플라스미드 구성물을 제조하기 위한 개략도를 도시한다.
제24도는 사비나아제 오릴고뉴클레오티드 프로브의 개략도이다. 이 프로브는 바실루스 렌투스 유전자 뱅크(bank)를 프로빙하고 PCR반응에서 프라이머로서 작용하는 공지의 사비나아제 아미노산 서열을 토대로 고안되었다.
제25도는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머의 구체적인 서열을 도시한다.
제26도는 플라스미드 pMG108.2에 대한 절단지도를 도시한다.
제27도는 및 제27a도는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자를 코드화하는 유전자로의 절단 부위의 도입을 도시한다.
제28도는 ATCC 53926 생성 균주에서 상이한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 구성물의 상대적인 프로테아제 수율을 비교한 것을 도시한다.
제29도는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP Ncol 유전자 융합 구성물로부터 제조된 성숙한 프로테아제의 아미노산 서열을 도시한다.
[바람직한 구체예의 설명]
pH 7 내지 10의 수용액 중에서 및 10 내지 60의 온도에서 프로테아제 및 산화 안정성이 증가된, 바실루스 렌투스에 의해 생성된 단백질 가수분해 효소(BLAP)가 제공된다. 성숙한 BLAP 효소는 아미노산 잔기가 269개이고, 분자량이 26,823 달톤이며 계산된 등전점이 9.7인 폴리펩티드이다. 이것은 먼저 토양 샘플로부터 분리되며 하기 표 1에 열거된 특성을 갖는 생물체인 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터 수득하였다.
제1도에 도시된 아미노산 서열은 표준 아미노산 서열화 기법에 의하여 부분적으로 결정되었고, 나머지 서열은 핵산 서열로부터 추론되었다.
BLAP 효소를 제조하기 위해서는, 전사되는 순서대로 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 프로모터, 리보솜 결합부위, 및 BLAP 효소를 코드화하는 성숙한 영역에 작동가능하게 연견된 프레-프로(pre-pro) 영역에 작동가능하게 연결된 개시 코돈으로 이루어지는 조절영역을 전사방향으로 포함하는, BLAP 효소를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 하이브리드 플라스미드를 함유하는 바실루스 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 BLAP 효소의 제조방법이 제공된다. 상기의 모든 것은 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 유래의 카르복시 말단(C-말단) DNA 서열에 연결될 수 있다. C-말단 DNA 서열은 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 대략 Sall과 대략 Sstl 절단 부위 사이의 DNA 서열이다. 이것은 공동 계류중인 미합중국 특허출원에 개시된 바와 같이, 염색체상에 코드화된 프로테아제를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 모든 바실루스 균주가 BLAP 효소를 제조하기 위해서 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 바실루스 리케니포르미스가 바람직한 균주이며, ATCC 53926이 가장 바람직한 균주이다. ATCC 53926은 바실루스 리케티포르미스 DSM 641의 전형적인 돌연변이에 의하여 수득되는 돌연변이 균주이며, 하기 표 2에 열거된 특성을 갖는다.
BLAP 효소를 코딩하는 유전자는, 바실루스 렌투스 균주 DSM 5483으로부터 염색체 DNA를 분리하는 단계, 바실루스 렌투스 프로테아제의 영역을 코드화하는 추정 DNA 서열과 상동성을 갖는 DNA 프로브를 구성하는 단계, 분리된 염색체 DNA 로부터 게놈 라이브러리를 제조하는 단계, 및 프로브와 하이브리드를 형성시킴으로써 관심있는 유전자에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 단계에 의해 수득될수 있다. 게놈 리이브러리는 클로닝 벡터로서 플라스미드 pBR322, 박테리오파지 람다 EMBL3 및 EMBL4, 및 코스미드 pCP13을 사용하여 대장균 내에서 구성될 수 있다. 바람직하게는, 바실루스렌투스 DSM 5483 염색체 DNA의 유전자 뱅크가 코스미드 pCP13에 의해 대장균 내에 구성된다.
사비나아제(Savinase) 유전자(노보 인더스트리 아크티에 셀스카브에 의해 시판되는 세린 프로테아제인 사비나아제를 코드화하는 유전자)의 DNA서열과 유사한 DNA 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브가 사비나아제-유사 유전자를 프로빙하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는 BLAP 서열이 사용될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 대장균 HB101, 바실루스 서브틸리스 DB104, 바실루스 리케니포르미스, 및 바실루스 렌투스 균주로부터 유래되고, 제한효소로 절단된 염색체 DNA의 서던 블롯을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 제24도 및 제25도에 도시된 N-말단 및 내부 올리고뉴클레오티드는 또한 성숙한 알칼리성 프로테아제의 N-말단으로부터 C-말단 브롬화시안 단편의 N-말단까지 연장된 바실루스 렌투스 염색체 DNA의 영역을 증폭시키기 위해 PCR에서 프라이머로서 활용될 수 있다.
알칼리성 프로테아제 유전자의 성숙한 영역의 일부분은, 바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제에 특이적인 보다 큰 이중 스트랜드의 DNA 프로브를 PCR을 이용하여 구성함으로써 분리될 수 있다. 사비나아제 프로테아제 유래의 C-말단 브롬화시안 단편에 대한 아미노산 서열을 기초로 한 분석은, 이 서열이 다른 서브틸리신계 세린 프로테아제 뿐만 아니라, 사비나아제의 활성부위인 세린 주변의 아미노산 서열과 상동성을 가지고 있음을 보여준다. 증폭된 단편은 길이가 대략 650 염기쌍(bp)이며, 이것은 다른 바실루스 알칼리성 프로테아제에 대해 입수가능한 서열 데이터로부터 산전한 예상크기와 일치한다. 650bp의 PCR 단편은 성숙한 프로테아제의 N-말단 바로 다음에서 출발하여 단백질 코딩 영역으로 계속되는 알칼리성 프로테아제를 코드화하는 유전자의 일부분을 나타낸다.
650bp 단편은 게놈 라이브러리에서 BLAP 유전자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 정제 후, 650bp 단편은 예컨대 닉 번역에 의해 표지화되어, 코스미드 pCP13 및 EMBL 람다 벡터를 사용함으로써 구성될 수 있는 바실루스 렌투스 DSM 5483 DNA의 유전자 뱅크를 프로빙하기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음, 650bp PCR 단편 및 선택적인 올리고뉴클레오티드 프로브와 상동성을 갖는 DNA를 함유하는 여러 가지 코스미드 클론이 확인될 수 있다. 이러한 코스미드 중의 하나인 pHSH44의 플라스미드 DNA가 정제되어, 제한효소 분석에 의해 특성 확인되었다. 서던 분석으로부터의 결과는 약 3.4kb의 바실루스 렌투스 DSM 5483 Hindlll 단편이 방사성 표지된 프로브인 650bp의 PCR 단편과 하이브리드를 형성할 수 있음을 보여준다. 하이브리드형성, 제한 분석 및 DNA 서열(제2도)은 650 bp의 PCR 단편과 상동성을 갖는 3.4kb Hindlll 단편이 BLAP 유전자를 코드화함을 나타낸다.
ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 일부와 BLAP 유전자의 일부를 포함하는 유전자 융합체를 기초로 한 발현 카세트를 함유하는 ATCC 53926 의 발효가 대규모로 BLAP를 제조하는 바람직한 방법에서 이용된다. 이러한 카세트는 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 대응 유전자의 효율적인 전사 및 번역을 초래하는 개시 코돈으로 구성되는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 유래의 조절영역으로 이루어진다. 조절영역 다음에는 신호(프레) 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 있고, 이 서열 다음에는 프로-펩티드 및 성숙한 프로테아제를 코드화하는 서열이 있다. 프로모터로부터 DNA 서열이 전사된 후에, 메신저 RNA(m-RNA)는 신호 펩티드, 프로 펩티드 및 성숙한 프로테아제로 구성되는 프레-프로-성숙 프로테아제로 번역된다. 신호 서열은 미성숙한 프로테아제가 세포질막을 통과하도록 유도하고, 여기에서 신호 펩티드는 신호 펩티다아제에 의하여 효소적으로 분해된다. 프로 서열은 세포질막 및 세포벽을 가로질러 전좌되는 동안에 또는 전좌된 후에 프로-프로테아제의 정확한 폴딩 및 프로세싱을 보장하는 것으로 보이며, 이렇게 하여 성숙한 프로테아제가 방출된다 (참고문헌:Power,S.D.et al.(1986) PNAS(USA), 83, 3096 ; lkemura, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 7859 ; lkemura, H. et al. (1988) J.Biol.Chem.263,12959).
ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자와 BLAP 유전자의 상이한 부분을 함께 결합시키기 위해 사용된 제한효소 부위에 의해 확인된 2가지 타입의 융합체가, ATCC 53926을 형질전환시키기 위해 사용되는 경우 상업적 규모로 BLAP 효소를 생산하는 전술한 발현 카세트를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 카세트는 Clal 및 Ncol 융합체로부터 제조된다.
Clal 융합체는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 프로모터 및 프레 서열을 프로 및 성숙한 BLAP 서열을 코드화하는 DNA 단편과 결합 시킨다. Clal 절단 부위는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 프레 및 프로서열의 접합부로부터 수 개 코돈 위에 있는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 내로 도입될 수 있다. BLAP 유전자는 이 위치에서 자연발생적인 Clal 부위를 함유한다. ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 프로모터 및 대부분의 프레 영역(Aval/Clal DNA 단편)은, 일부의 프레영역 및 모든 프로 및 성숙한 BLAP 서열을 함유하는 BLAP 유전자의 (Clal/Sstl)단편에 융합될 수 있다. Ncol 및 Clal 융합체는 대장균에서 제조될수 있으며, Aval/Sstl DNA 단편으로 2개의 상이한 바실루스 벡터 내에 서브클로닝될 수 있다.
Ncol 융합체는 BLAP와 약간 상이한 성숙한 프로테아제를 생성시킨다. Ncol 융합체로부터 제조된 단백질은 성숙한 프로테아제의 N-말단으로부터 위치 3에 트레오닌을 함유하는 반면에, BLAP는 동일한 위치에 세린을 함유한다(제29도). Ncol 융합체는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 프로모터, 프레 및 프로 서열을 BLAP 유전자의 성숙한 서열과 결합시킴으로써 구성될 수 있다. Ncol 절단 부위는 프로 및 성숙한 서열의 접합부로부터 수 개 코돈 아래에 위치한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자내에 도입될 수 있다. 자연발생적인 Ncol 부위가 BLAP 유전자 내의 유사한 위치에 존재한다. 그런 다음, 성숙한 ATCC 53926 서열의 프로모터, 프레, 프로 및 4개의 코돈(Aval/Ncol DNA 단편)이 최초 4개의 코돈이 결핍된 성숙한 BLAP 서열(Ncol/Sstl DNA 단편)에 융합될 수 있다. Ncol와 Clal 융합체는 대장균 내에서 제조될 수 있으며, Aval/Sstl DNA 단편으로서 2개의 상이한 바실루스 벡터 내에 서브클로닝될 수 있다.
효소 제조를 더 증가시키기 위하여, Clal 및 Ncol 융합체는 164bp의 DNA 단편인 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 전사 터미네이터 카세트, 또는 하기에 더욱 상세하게 설명되는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 유래의 608bp C-말단 단편과 함께 클로닝될 수 있다.
ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자는, BLAP 유전자를 함유하고 있는 3.4 kb Hindlll/Kpnl 단편을 함유하는 pTZ19R 유도체인 대장균 벡터 pGM15 (제3도)내에서 구성된 후, 바실루스 벡터인 pBC16과 pUB110 내에 서브클로닝될 수 있다. 바실루스 융합 유전자 벡터 pCB1N(제5도)은 제11도에 도시된 바와 같이 구성된다. 바실루스 융합 유전자 벡터 pCB11C (제4도)는 제12도에 도시된 바와 같이 구성될 수 있다. (a)BLAP 프로테아제 유전자의 보다 효율적인 발현을 제공하고, (b) 염색체상에 코드화된 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 발현의 억제를 보증하기 위하여 , 전술한 각각의 유전자 융합체의 변이체가 제조될 수 있다. BLAP 프로테아제 유전자의 전사의 효율적인 종결을 제공하기 위하여, ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 전사 터미네이터가 전술한 각각의 유전자 융합체 내에서 BLAP 터미네이터의 아래에 164bp DNA 단편으로서 클로닝될 수 있다. 플라스미드 pCB11C와 pCB1N에서 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자의 전사에 대하여 동일한 배향으로 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 전사 터미네이터 카세트를 함유하고 있는 구성물은 각각 pCB13C 와 pCB2N(제6도 및 제7도)으로 표시된다. 염색체상에 코드화된 ATCC 53926 프로테아제 유전자의 발현을 억제하기 위해서, ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 C-말단 단편을 함유하고 있는 2개의 추가의 바실루스 BLAP 융합 유전자 벡터가, 주형으로서 플라스미드 pC51을 사용하여 PCR에 의해 합성된 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 608bp 단편을 연결시킴으로써, 플라스미드 pCB11C 및 pCB1N 내에서 구성될 수 있다. 608bp DNA 단편은 벡터 pCB11C 및 pCB1N 상에 존재하는 단일 Kpnl 부위에 연결될 수 있고, pCB11C 및 pCB1N에서 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자의 전사 방향에 대하여 동일한 배향으로 608bp의 ATCC 53926 C-말단 단편을 함유하고 있는 새로운 구성물은 각각 pCB15C 및 pCB4N으로 표시된다. 이들 플라스미드의 절단지지도는 각각 제9도 및 10도에 제시되어 있다.
전술하고 하기에 열거되는 6개의 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자는 바실루스 벡터 내로 서브클로닝되어, 바실루스 서브틸리스 DB104 내로 형질전환될 수 있다. ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자는, ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자를 함유하고 있는 대장균 벡터(pCB1N, pCB11C, pCB2N, pCB13C, pCB4N 및 pCB15C)를 Aval 및 Sstl으로 절단시키고, 이것을 Aval, Sstl, Pstl 및 Sstl로 절단기켜 놓은 바실루스 플라스미드 pC51 및 pH70에 연결시킴으로써, Aval/Sstl DNA 단편으로서 pBC16 및 pUB110 유도체 내로 서브클로닝될 수 있다. 플라스미드 pC51 및 pH70은 Aval/Sstl으로 절단되어, 필요한 복제원과 선별을 위한 항생물질 내성 유전자(pC51에서는 테트라사이클린 내성, pH70에서는 카나마이신 내성)를 함유하고 있는 커다란 Aval/Sstl 벡터 단편이 수득된다. Sall 과 Pstl은 pC51 및 pH70 상에 존재하는 저체 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자를 함유하는 작은 Aval/Sstl 단편을 3개의 보다 작은 DNA 단편으로 절단하기 위하여 사용될 수 있다. 이것은 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자가 바실루스 벡터 내로 재연결될 가능성을 감소시킨다.
Clal 과 Ncol 융합체 유래된, 전술한 바와 같이 구성된 전체 10개의 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 유전자 융합 플라스미드는 ATCC 53926에서 실현될 수 있다. 6개의 Clal 융합체 유래된 5개의 바실루스 플라스미드 구성물은 ATCC 53926 균주 내로 형질전환될 수 있다. 이들 바실루스 플라스미드는 pCB55C, pCB56C, pCB58C, pCB75C, 및 pCB78C(각각 제13도, 제14도, 제15도, 제16도 및 제17도)이다. 6개의 Ncol 융합체로부터 유도된 5개의 바실루스 플라스미드 구성물은 ATCC 53926 균주 내로 형질전환될 수 있다. 이들 바실루스 플라스미드는 pCB50N, pCB51N, pCB53N, pCB70N, 및 pCB73N(각각 제18도, 제19도, 제20도, 제21도 및 제22도)이다.
최고 프로테아제 수율을 얻기 위해서는, pC51 유도체에 삽입된 Clal 융합 구성물(제23도)을 함유하는 ATCC 53926 균주가 바람직하다. ATCC 53926 균주 내의 구성물 pCB58 (제15도)이 최고 프로테아제 수율을 얻기 위한 가장 바람직한 구체예이다.
발효는 당업계의 숙련자에게 일반적으로 공지된 복합 영양 배지에서 수행될수 있다. 이러한 배지는 글루코오스, 수크로오스, 및/또는 옥수수 전분과 같은 탄소공급원을 함유할 수 있다. 배지는 또한 대두가루, 목화씨가루, 카제인 및 감자 추출물과 같은 질소공급원도 함유할 수 있다. 그 밖의 성장 촉진 성분으로는 양조찌꺼기 및 옥수수 침지액과, 무기 인산염같은 무기물질이 있다. 배지는 또한 소포제를 함유하기도 한다.
ATCC 53926 생산 균주 내의 상이한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 구성물의 상대적인 프로테아제 수율의 비교가 제28도에 도시되어 있다. 이러한 발효는 0.5% 질소를 함유하는 복합 생산 배지를 사용하여 항생물질로 선별하면서 수행하였다. ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 구성물의 프로테아제 수율은 플라스미드 pAM2.3을 함유하는 ATCC 53926과 비교하여 도시되어 있다. 이 플라스미드는 플라스미드 pC51의 Stul/Sall 부위 사이에 삽입된 Nrul/Sall 절단 단편 상에 천연 BLAP 프로모터 및 구조 유전자를 함유한다.
ATCC 53926 생산 균주에서 상이한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 구성물을 배양함으로써 수득한 발효 배양액은 통상적으로 다른 단백질 가수분해 효소를 함유한다. 그러나, ATCC 53926 생산 균주에서 상이한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 구성물을 발효시켜 수득한 발효 배양액에서 BLAP 프로테아제는 배양액 중의 주요 단백질 가수분해 효소이다. 이러한 발효 배양액은 바실루스 렌투스 DSM 5483를 배양함으로써 수득한 배양액에는 존재하지 않는 단백질 가수분해 효소를 함유한다. 구체적으로, ATCC 53926 생산 균주에서 상이한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 구성물의 발효에 의해 수득되는 발효 배양액은 BLAP 프로테아제 및 ATCC 53926 균주에 의해 생성된 하나 이상의 그 밖의 단백질 가수분해 효소를 생산한다. 바람직하게는, BLAP 효소는 실질적으로 제1도에 도시된 아미노산 잔기 약 112 내지 아미노산 잔기 약 380의 아미노산 서열을 갖는, 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 성숙한 알칼리성 단백질 가수분해 효소인 BLAP 효소 및 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 유래의 하나 이상의 그 밖의 단백질 가수분해 효소를 포함하는 조성물로서 수득된다.
다양한 재조합 플라스미드를 함유하는 ATCC 53926 균주를 배양함으로써 생산된 프로테아제는 세제 제형에 특히 유용하다. 이러한 프로테아제는 세제 및 세척 조성물, 특히 세탁용 세제 조성물 분야에서 공지된 방법에 따라 계면활성제와 함께 제형화될 수 있다. 계면활성제는 물의 표면 자유에너지를 감소시키는 물질로서, 비누, 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 및 양이온성 계면활성제가 있다. 세탁용 세제 제형의 경우에, 효소는 선형 알킬 벤젠술폰산염, 에톡실화 선형 알코올, 에톡실화 알킬 황산염, 또는 황산화 선형 알코올과 같은 적당한 계면활성제와 배합될 수 있다. 제형은 또한 빌더, 형광광택제, 표백제, 및 당업계에서 일반적으로 사용되는 기타 성분들도 함유할 수 있다.
[미생물의 기탁]
ATCC 53926과, ATCC 68032로 지정된 ATCC 53926 중의 플라스미드 pCB58C의 살아있는 배양물은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에서, 미합중국 20852 메릴랜드주, 록빌, 파크로운 드라이브 12301에 소재하는 아메라칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁되었다. 바실루스 렌투스 DSM 5483의 살아있는 배양물은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에서, 독일연방공화국 3400 괴팅겐그리세바흐슈트라쎄 8에 소재하는 도이취 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘(DSM)에 기탁되었다.
다음의 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라, 본 발명을 예시하기 위한 것이다.
[실시예 1]
[바실루스 렌투스 DSM 5483 유전자 뱅크의 구성]
A. 코스미드 클로닝 벡터 pCP13을 사용하는 방법
바실루스 렌투스 DSM 5483 DNA로부터 게놈 라이브러리를 구성하기 위하여 코스미드 클로닝 벡터 pCP13을 선택하였다. 플라스미드 pLAFR1(참고문헌: Friedman et al. Gene (1982) 18,289)에서 유래된 숙주 범위가 넒은 이러한 벡터는 미합중국 메사츄세츠주 보스턴시 소재의 메사츄세츠 제네랄 호스피탈의 분자생물학부에 있는 에프.아우수벨로부터 얻었다. 플라스미드 pCP13은 크기가 23kb이며, 테트라사이클린 내성(Tc )과 카나마이신 내성(Km ) 둘 모두를 코드화하고, 다수의 독특한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하며, 이동가능하지만 자체-전달성은 아니다. pCP13에 있는 BamHl부위 내로의 클로닝은 Km 내성 결정기의 삽입성 비활성화를 유도하고, 이는 재조합체가 Tc , Km 표현형에 의해 확인되도록 한다. 벡터는 또한 시판되는 패키징 시스템을 사용하여 람다 파지 입자로 코스미드의 콘카티머 형태가 패키징되도록 하는 람다 코스 부위를 함유한다. 크기가 12 내지 30kb인 삽입체가 pCP13에 클로닝될 수 있는데, 이에 의해 클로닝 벡터가 유전자 뱅크의 구성을 위해 매우 매력적으로 된다. 정제된 pCP13 DNA(20)를 BamHl로 (3 유니트(U)/)절단시킨 다음, 재원형화를 방지하기 위해 탈인산화시켰다. 바실루스 렌투스 균주 DSM 5483 유래의 정제된 염색체 DNA(410)을 50에서 60분동안 Bcll(0.0625U/DNA)으로 부분 절단시킨 다음, BamHl으로 절단시킨 pCP13 DNA에 연결시켰다. 연결 반응액은 30의 최종 부피 중에 150/의 pCP13 벡터 및 50/의 DSM 5483 염색체 DNA를 함유하였다. 연결 반은은 14에서 9시간동안 유지시켰다. 콘카티머 pCP13-바실루스 렌투스 게놈 DNA 단편을 함유한는 연결 혼합물을, 미합중국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가 (Promega)사로부터 구입한 팩키진 람다(Packagene Lamda) DNA 패키징 시스템을 사용하여 람다 파지 헤드(head)내로 패키징시켰다. 파지 입자 내로 패키징된 재조합 코스미드 분자를 사용하여 대장균 HB101을 감염시켰다. 대장균 HB101은 10의 트립톤 배양액 또는 TB(1리터당 10g의 트립톤, 5g의 NaCI, 2g의 말토오스 및 2.46g의 MgSO를 함유하며, 오토클레이빙에 의해 멸균시킴) 중에서 175rpm의 회전식 진탕기에서 30로 밤새 증식시켰다. 세포를 펠릿화한 다음, 10mM의 MgSO중에 재현탁시켰다. 패키징 환합물과 세포(각각 50및 100)를 함께 혼합하여 37에서 20분간 배양하였다. 그런 다음, 1의 루리아(Luria) 배양액(1리터당 10g의 박토트립톤, 10g NaCL, 5g의 효모 추출물)을 첨가하고, 튜브를 150rpm의 뉴 브룬스윅(New Brunswick) G24회전식 진탕기에서 37로 60분간 배양하였다. 감염된 HB101 세포를 실온에서 5분간 윈심분리(13000 x g)하여 펠릿화시키고, 루리아 배양액 중에 재현탁시킨 다음, 15/의 Tc를 함유하는 루리아 한천 상에 플레이팅하였다. 1400개의 Tc Km HB101 재조합 클론을 수득하였다. 평균 삽입체 크기를 측정하기 위하여, 무작위로 선택된 14개의 잠재성 클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, EcoRl으로 절단시킨 다음, 아가로오스 겔 전기영동법에 의하여 분석하였다. 14개의 클론 중 11개가 평균 삽입체 크기가 25.9kb(21.7내지 32,7kb)인 삽입체를 함유하였다. 이러한 커다란 평균 삽입체 크기 및 바실루스 렌투스 게놈이 대장균 게놈과 크기가 거의 동일하다는 가정을 기초로 하여, 이론적 계산에 의해 768개의 코스미드 클론을 스크리닝함으로써 사비나아제-유사 유전자를 검출할 가능성이 99%임을 예측할 수 있었다.
B. 파지 클로닝 벡터 EMBL3 및 EMBL4를 사용하는 방법
큰 조각의 게놈 DNA(10kb)를 클로닝하는 또 다른 방법은 박테리오 파지 람다 클로닝 벡터를 사용하는 것이다. 이 삽입 벡터는 9kb 내지 23kb의 이종 DNA를 수용할 수 있다. 이종 DNA 및 람다 DNA는 재조합 DNA를 후에 대장균 숙주 내에서 증식될 수 있는 파지 헤드 내로 패키징시키는데에 필요하다. EMBL3 및 EMBL4 파지 벡터는 미합중국 캘리포니아주 라 욜라에 있는 스트라타진(Stratagene)으로부터 구입하였다. 이들 클로닝 벡터는 복제에는 필요하지 않은 내부 스터퍼(stuffer) DNA를 플랭킹하는 폴리링커영역을 사용하여 구성하였다. 람다 DNA가 적절한 효소로 절단되는 경우, 복제에 필요한, 좌측 및 우측 아암이라 명명되는 나머지 2개의 DNA 단편이 이종 DNA에 연결될 수 있다. 재조합 DNA를 파지 헤드 내로 효율적으로 패키징시키기 위해서, 연결은 높은 DNA농도에서 수행하여 콘카티머의 형성을 유리하게 하고, 이종 삽입체는 크기가 9kb 내지 23 kb이어야 한다. 이 후자의 요건은 패키징될 수 있는 DNA의 길이가 야생형 람다 게놈의 크기의 70% 내지 105%라는 관찰을 기초로 한다. 아울러, 2가지 EMBL 시스템은 모두 spi 선별(박테리오파지 P2 억제에 민감)을 이용한다. 스터퍼 단편에 연결되고 파지 헤드 내로 패키징된 EMBL 아암은 P2 라이소겐 (lysogen)을 함유하는 숙주 균주에서는 증식할 수 없다. 이러한 시스템에서는, 스터퍼 단편과 EMBL 아암이 재연결되지 않는 것 같다. 재연결이 일어난다면, 이들파지는 적절한 대장균 숙주 상에 플레이팅되었을 때, 복제되지 않을 것이다.
EMBL3 또는 EMBL4 벡터 내에서 DSM 5483 DNA의 게놈 라이브러리를 제조하기 위해서, DSM 5483 DNA를 EcoRl 또는 Bcll으로 부분 절단시켰다(Bcll에 의해 생성된 5' 점착성 말단은 BamHl으로 절단된 벡터의 말단과 상보적임). 각각의 경우에, 게놈 DNA를 1당 1유니트 미만의 효소로 60분간 절단시켰다. 최적 패키징 효율은 콘카티머인 람다 DNA를 사용할 때 수득된다. 따라서, 연결 반응은 콘카티머의 형성에 유리한 200/의 DNA농도를 얻도록 설정되었다. 표준 5연결 반응액의 경우에는, 1의 벡터아암을 200 내지 400ng의 게놈 DNA와 혼합하였다. 1시간동안 실온에서 연결시킨 후, 4에서 배양하였다. 연결 반응액으로부터의 콘카티머 DNA를, 스트라타진(La Jolla, California)으로부터 구입한 지가팩 플러스(GigaPack Plus)시험관내 패키징 추출물 및 추출물이 제공된 프로토콜을 사용하여 파지 헤드로 패키징시켰다. 패키징 후, 0.5의 파지 희석 완충액을 패키징 반응액(리터당 5.0g의 NaCI, 2g의 MaSOㆍ7HO, 50의 1M Tris HCI, pH 7.5 및 5의 2% 절라틴) 및 20의 클로로포름에 첨가하였다. 패키징 반응액을 적정하고, 스트라타진이 제공한 프로토콜에 따라 폭시켰다. 각각의 파지 라이브러리로부터 5 x 10 개의 재조합 파지를 수득하였다. 유사한 실험을 상업용 클로닝 키트가 제공된 시험 삽입체로 수행한 경우, 3 x 10 개의 재조합 파지를 수득하였다. 대조 삽입체에 의해 생성된 5% 미만의 플라크는 백그라운드(background)파지에 의한 것이다. 재조합 파지는 평균 삽입체 크가가 12 내지 14kb였고, 파지 중 약 70%가 실제로 삽입체를 나타냈다. 파지 라이브러리를당 10 개 파지의 역가로 증폭시키고, 4에서 클로로포름 상에 보관하였다. -70에서 보다 장기간 보관시키기 위해 다른 원액(stock)을 제조하였다.
EMBL 라이브러리의 특성을 확인하고, 사비나아제 유사 유전자를 발견하기 위하여, 하기의 방법을 수행하였다. 플라크의 그룹을 EMBL3 또는 EMBL4 라이브러리로부터 분리하고, 이들의 DNA를 파지 소규모 제조 방법(참고문헌: Maniatis et al.,(1982), A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York)에 의하여 분리하였다. EMBL3 및 EMBL4 라이브러리에 존재하는 삽입체 게놈 DNA를 각각 Sall 또는 EcoRl으로 절단시키고, 아가로오스 겔 전기영동을 행한 다음, DNA 단편을 진 스크린 플러스 (Gene Screen Plus)에 옮겼다. 전체 DSM 5483 게놈 DNA를 닉 번역하여, EMBL 라이브러리에 존재하는 삽입체가 실제로 DSM 5483 DNA임을 증명하기 위하여 하이브리드형성 프로브로서 사용하였다. 예상했던 대로, 클로닝된 삽입체는 표지된 DSM 5483 DNA 와 하이브리드를 형성하였다. 제2실험에서는 ,게놈 DSM 5483 DNA를 EcoRl 또는 Bcll으로 절단시키고, 아가로오스 겔에서 전기영동시킨 다음, 진 스크린에 옮겼다. EMBL3 또는 EMBL4 라이브러리로부터의 재조합 파지의 그룹으로부터 분리한 DNA를 닉 번역하여, 하이브리드형성 프로브로서 사용하였다. 예상했던대로, DSM 5483 게놈 DNA와의 하이브리드형성은 일어난 반면에, 다른 바실루스 종으로부터의 DNA와의 하이브리드형성은 거의 또는 전형 검출되지 않았다. 이러한 결과는 람다 EMBL 클로닝 벡터를 사용한 바실루스 렌투스 DSM 5483 염색체 DNA의 유전자 라이브러리의 형성을 입증하였다.
[실시예 2]
[바실루스 렌투스 DSM 5483에 존재하는 사비나아제 유사 프로테아제 유전자에 특이적인 DNA 프로브의 구성]
A. 올리고뉴클레오티드 프로브
코스미드 pCP13을 이용하여 대장균 내에 구성된 DSM 5483 염색체 DNA의 유전자 뱅크를 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 스크리닝하였다. 축퇴(degeneracy)가 다른 일련의 프로브를 바이오서치(Biosearch)DNA합성기를 사용하여 합성하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 서열은 사비나아제 프로테아제의 N-말단 및 브롬화시안 절단에 의해 유도된 사비나아제의 C-말단 단편으로부터 수득한 아미노산 서열 데이타로부터 추론하였다. 사비나아제 프로테아제에 대한 이들 프로브의 서열 및 위치는 제24도 및 제25도에 도시되어 있다. 프로브의 NO2 및 NO4 시리즈 둘 모두를 N-말단 아미노산 서열 데이터로부터 고안하였다. NO2시리즈는 길이가 23 염기이며 이중 14염기가 상동성이 있고 16배의 축퇴를 가진 반면에, NO4 시리즈는 길이가 17염기이고 48배의 축퇴를 가졌다. 프로브의 NO4.1-4 시리즈는 바실루스 서브틸리스에 대한 가장 가능한 코돈 용법을 이용하여 고안하였다. 올리고뉴클레오티드의 CO3 시리즈는 모두 길이가 17염기이고, 32배의 축퇴를 가졌다. 이러한 후자의 프로브는 사비나아제의 C-말단 브롬화시안 단편 유래된 아미노산 서열로부터 고안하였다. 이들 프로브를 정제하고, 방사성 표지하고, 절단시킨 DSM 5483으로부터의 염색체 DNA 와 하이브리드를 형성시키고, 아가로오스 겔 상에서 전기영동시킨 다음, 서던 방법을 이용하여 니트로셀룰로오스 상에 블롯팅하였다. 사용한 제한효소는EcoRl, Hindlll, Taql, Sau3A, Sstl, Xbal 및 Xhol 이었다. 가장 강력한 하이브리드형성 신호는 올리고뉴클레오티드 NO2.2, NO4.2, 및 CO3.3에 의해 수득되었다(제25도). 후자의 3개의 표지된 올리고뉴클레오티드가 대장균 HB101, 바실루스 서브틸리스 DB104, 바실루스 리케니포르미스, 및 바실루스렌투스 균주 유래의 절단된 염색체 DNA의 서던 블롯을 스크링하기 위하여 사용되었고, 오로지 바실루스 렌투스 균주 유래의 DNA단편과 하이브리드를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과로 이들 3개의 올리고뉴클레오티드가 사비나아제-유사 프로테아제를 코드화하는 DNA에 특이적임이 확인되었다.
B. 일부의 알칼리성 프로테아제 유전자 성열의 증폭
전술한 3개의 올리고뉴클레오티드 프로브가 DSM 5483 염색체 DNA에 특이적이라도, 사비나아제-유사 알칼리성 프로테아제에 특이적인 보다 큰 이중 스트랜드 DNA 프로브를 분리하기 위해 또 다른 방법을 수행하였다. 전술한 N-말단 및 내부 올리고뉴클레오티드를, 성숙한 알칼리성 프로테아제의 N-말단 및 내부 올리고뉴클레오티드를 성숙한 알칼리성 프로테아제의 N-말단으로부터 아미노산 잔기 222까지의 DSM 5483 염색체 DNA 영역을 증폭시키기 위하여 PCR에서 프라이머로서 사용하였다(제24도). 사비나아제 유래의 C-말단 브롬화시안 단편으로부터 수득한 아미노산 서열은 다른 세린 프로테아제의 활성 부위 영역 주변의 아미노산 서열과 상동성을 가졌다. 사비나아제의 N-말단으로부터 활성 부위 영역까지의 거리가 다른 세린프로테아제와 유사한 경우, 증폭된 단편의 예상 크기는 약 650bp이다.
PCR은 퍼어킨-엘머 세투스 인스트루멘츠 (Perkin-Elmer Cetus Instruments) 로부터 구입한 시판 진앰프(GeneAmp)키트를 사용하여 수행하였다. PCR에서,증폭시키고자 하는 DNA 단편은 길이가 수백 bp 내지 5kb 이상일 수 있고, 플라스미드 또는 염색체 DNA 주형 상에 함유되어 있다. 증폭은 DNA 단편의 어느 한쪽 말단에 있는 반대방향 DNA 스트랜드와 상동성을 가지도록 고안된, 길이가 약 15 내지 25 염기인 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 합성을 필요로 한다. DNA 합성은 5'에서 3' 방향으로 일어나기 때문에, 각각의 프라이머는 대응하는 5'3' 스트랜드를 모방하도록 고안되어 있다. 초기 실험에서는, CO3와 NO2 시리즈 프로브의 모든 가능한 조합과, 주형으로서 DSM 5483 염색체 DNA를 사용하여 16가지의 상이한 PCR을 수행하였다. 주형 및 프라이머의 농도는 키트에 규정된 바와 같았다. PCR은 94,37및 72에서 고정된 시간동안 사이클링되는, 에펜도르프 튜브 중에서 주형, 과량의 프라이머, dNTP, 열안정성 DNA 중합효소, 및 반응 완충액을 혼합함으로써 개시하였다. 각각의 사이클에서, 이중 스트랜드 DNA 주형을 94로 가열함으로써 변성시킨 후, 37로 냉각하여 프라이머가 단일 스트랜드 주형 상의 적절한 DNA 서열에 어닐링되도록 하였다. 그런 다음, 튜브를 72로 시프팅시키면, 상보적인 DNA 스트랜드가 열안정성 DNA 중합효소(Taq 중합효소)에 의한 어닐링된 프라이머의 신장을 통해 합성되었다. 이 과정을 25회 반복하였고, 증폭된 DNA의 양은 매 사이클 후 2배였다. PCR 중의 하나(올리고뉴클레오티드 쌍 NO2.2 및 CO3.3)는 길이가 약 650bp인 단일 DNA 단편을 증폭시켰다. 약 3의 650bp 단편이 PCR에 의해 생성되었는데, 이는 약 5 x 10 배의 증폭을 나타낸다. PCR을 NO4 및 CO3 시리즈 프로브의 모든 조합을 사용하여 반복하였다. 이전의 결과를 기초로 하여 NO4.2와 CO3.3의 조합이 증폭된 650bp 단편을 생성할 것 으로 예상하였고, 실제로 그러했다.
[실시예 3]
[바실루스 렌투스로부터의 사비나아제 유사 알칼리성 프로테아제 유전자를 함유하는 코스미드 클론의 확인]
사비나아제-유사 유전자를 스크리닝하기 위하여, 1400 Tc Km HB101 클론을 각각 100 내지 150 클론으로 구성된 13개의 푸울로 나누었다. 각각의 푸울, 및 전체 유전자 뱅크를 함유하고 있는 배양액으로부터의 플라스미드 DNA를 정제하여 EcoRl으로 절단시켰다. 절단 단편을 아가로오스 겔 전기영동법에 의하여 분리하여, 제조업자에 의해 제시된 방법에 의하여 진 스크린 플러스 하이브리드형성 멤브레인 (DuPont, Wilmington, Delaware)에 옮겼다. 코스미드 유전자 뱅크 내에 있는 사비나아제-유사 유전자를 검출하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 프로브의 예상 서열은 사비나아제 프로테아제에 대하여 이미 획득한 아미노산 서열 데이타를 기초로 하였다. 이들 프로브도 PCR을 사용하여 BLAP 유전자의 650bp 부분을 합성하기 위한 프라이머로서 작용하였다.(상기 참조). 650bp PCR 단편을 닉 번역 반응에서 P로 표지하고(프로토콜은 넨(NEN, Wilmington, Delaware)으로부터 수득) 하이브리드형성 프로브로서 사용하였다. 이 단편은 내부 EcoRl 부위를 함유하는 것으로 나타났다. 따라서, 완전한 바실루스 렌투스 사비나아제-유사 프로테아제 유전자가 EcoRl에 의해 절단된 코스미드 푸울 내에 존재하는 경우, 2개의 하이브리드형성 밴드가 검출될 것이다. DSM 5483 DNA의 전체 유전자 뱅크로부터 분리된 코스미드 DNA가 EcoRl으로 절단시켰을 때, 6.35 및 2.64kb의 2개의 단편이 표지된 650bp의 PCR 프로브와 하이브리드를 형성하는 것으로 나타났다. 6개의 재조합 코스미드 푸울(#3, #4, #8, #11, #12 및 #13)에서, 이러한 동일한 하이브리드형성 밴드가 검출되었는데, 이는 사비나아제-유사 유전자가 이러한 각각의 6개의 푸울 내에 함유된 하나 이상의 코스미드 클론에 존재함을 나타낸다. 150개의 대장균 형질전환체를 갖는 푸울 #13은 각각 12개 또는 13개의 형질전환체로 이루어진 12개의 서브푸울로 세분하였다. 각각의 서브푸울로부터의 플라스미드 DNA를 분리하고, EcoRl으로 절단시키고, 겔 전기영동법에 의하여 DNA 단편을 분리하였다. 진 스크린 플러스 멤브레인에 옮긴 후, 필터를 표지된 650bp PCR 단편과 하이브리드를 형성시켰다. 2개의 서브푸울(#7 및 #9)이 푸울 #13에서 초기에 검출된 밴드와 동일한 하이브리드 형성 밴드를 함유하는 것으로 나타났다. 플라스미드 DNA를 서브푸울 #7 및 #9 중의 각각의 개별적인 형질전환체로부터 분리하고, 플라스미드 DNA를 별도의 반응에서 EcoRl 또는 Hmdlll로 절단시켰다. 아가로오스 겔 전기 영동을 수행하고 진 그크린 플러스에 옮긴 후, 하이브리드형성 과정을 반복하였다. 서브푸울 #9 클론에 #5로부터의 코스미드 DNA는 사비나아제 유사프로테아제 유전자를 함유한 클론에 대해 예상된 것과 동일한 하이브리드형성 패턴을 나타냈다. 클론 #5로부터의 코스미드 DNA와 DSM 5483 염색체 DNA를 Hindlll으로 절단하고 650bp PCR 단편으로 프로빙한 경우에, 두 DNA 모두에 대하여 동일한 하이브리드형성 밴드가 검출되었다. 3.4kb의 단편 크기는 공지된 분자량 표준에 대한 하이브리드형성 밴드의 위치로부터 계산하였다. 서브푸울 #9 클론 #5로부터의 코스미드는 pHSH44로 표시하였다.
코스미드 pHSH44의 대규모 제조물을 CsCl-브롬화에티듐 구배 원심분리에 의해 제조하고, 투석 후 Hindlll으로 절단하였다. Hindlll 단편을 아가로오스 겔 전기영동법에 으하여 분리하고, 650bp PCR 단편과 하이브리드를 형성하는 3.4kb Hindlll 단편을 정제한 다음, 이것을 제한 분석 및 바실루스벡터 내로 추가로 서브클로닝시키기 위해 통상 사용되는 대장균 벡터 pUC19 및 pBR322에 서브클로닝시켰다.
[실시예 4]
[바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제 유전자의 유전적 특성확인]
A. 바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제 유전자를 함유하는 절단 단편의 서브클로닝 및 특성확인
정제 후에, 650bp 단편을 닉 번역에 의해 표지하고, 코스미드 pCP13 및 EMBL 람다 벡터를 사용하여 구성한 DSM 5483 DNA의 유전자 뱅크를 프로빙하기 위해 사용하였다. 2가지 모두의 경우에, 매우 엄격한 하이브리드형성 조건을 사용하여 양성 클론을 확인하였다. 하이브리드형성 데이타로부터, 650bp PCR 단편 및 선택적 올리고뉴클레오티드 프로브와 상동성을 갖는 DNA를 함유하는 수개의 코스미드 클론을 확인하였다. 이들 코스미드 중의 하나인 pHSH44의 플라스미드 DNA를 정제하고 제한 분석에 의하여 특성확인하였다. 서던 블롯으로부터의 결과는 약 3 내지 5kb의 DSM 5483 Hindlll 단편이 650bp PCR 단편으로부터 제조된 방사성 프로브와 하이브리드를 형성함을 나타냈다. 코스미드 pHSH44는 3.4kb, 4.0kb, 및 4.8kb의 3개의 Hindlll 절단 단편을 함유하였다. 먼저 이들 단편을 모두 아가로오스겔 전기영동법에 의하여 정제하고, pUC19 및 pBR322 모두에 클로닝시켰다. 모든 경우에 연결 반응액은 20의 부피 주에 100ng의 탈인산화된 벡터 DNA 및 약 1000ng의 대응하는 Hindlll 단편을 함유하였다. 이러한 연결 혼합물을 대장균 DH5(pUC19용) 및 대장균 HB101 (pBR322용)중 어느 하나의 수용능력있는(competent) 세포에 형질전환시켰다. 암피실린 내성 형질전환체를 선별하고, 정확한 플라스미드 구성물에 대해 스크리닝하였다. 모든 Hindlll 단편을 두 벡터에 클로닝시켰다. pUC19 및 pBR322에서의 정확한 구성물을 각각 pMG102.2 및 pMG105.9로 표시하였다. 하이브리드형성 및 제한 분석으로부터의 결과에 의해 3.4kb Hindlll 단편(플라스미드 pMG102.2 및 pMG105.9에 존재)이 650bp PCR 단편고 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 플라스미드 pMG102.2를 정제하고, 26개의 상이한 효소를 사용하여 제한 분석함으로써 특성을 확인하였다. 3.4Kb Hindlll 단편의 완전한 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위하여 단편의 일부를 pTZ 서열화 벡터에 서브클로닝시킬 필요가 있었다. 모든 서브클론을 겔 전기영동 후 저융점 아가로오스로부터 정제된 pMG102.2의 DNA 단편을 사용하여 제조하였다. 절단된 DNA 단편을 적절한 부위에서 제한효소에 의해 절단시킨 벡터 DNA에 연결 시키고, 이를 대장균 DH5세포 내로 형질전환시켰다. 암피실린 내성 형질전환체를 선별하고, 제한 분석에 의하여 정확한 클론을 확인하였다. 정확한 구성물로부터의 플라스미드 DNA를 DH5균주로부터 정제하여 대장균 NM522 내로 형질전환시킴으로써 DNA 서열화에 필요한 단일 스트랜드 주형을 수득하였다.
B. 바실루스 렌투스의 알칼리성 프로테아제 유전자를 함유하고 있는 3.4kb Hindlll 단편의 서열화
650bp PCR 단편을 또한 대장균 플라스미드 pUC19에 클로닝시켰다. PCR 단편을 Smal으로 미리 절단시켜 놓은 pUC19에 평체 랄단 연결시키고, 이것을 베테스다 리서치 랩스(Bethesda Research Labs, BRL)에서 제시한 방법을 이용하여 BRL 로부터 구입한 대장균 DH5에 형질전환시켰다. 50/의 암피실린을 함유하고있는 X-gal 플레이트 상에서 형질전환체를 선별하였다(참고문헌: Maniatis, et al.,상기 동일함). 650bp 단편의 Smal 부위로의 클로닝은 lacZ 상보성을 파괴하여, X-gal 플레이트 상에 백색 콜로니를 생성시킬 것으로 예상되었다. X-gal 플레이트 상의 10000 콜로니 중의 약 200 콜로니가 백색이었다. 플라스미드 DNA를 200개의 형질전환체 중의 12개로부터 제조하고, 이것을 650 bp 단편의 존재에 대하여 분석하였다. 12개중 7개가 동일한 배향으로 pUC19에 클로닝된 PCR단편을 함유하였다. 이 플라스미드를 pMG100.13 으로 표시하였다. DNA서열화를 위하여, BamHl과 Kpnl으로 이중 절단시킴으로써 pMG100.13으로부터 650bp 단편을 분리 하였다. 이들 효소에 대한 인식 부위는 본래 pUC19로부터의 폴리링커 서열내에는 함유되어 있지만, 650 bp PCR 단편의 DNA 서열 내에서는 발견되지 않는다. BamHl/Kpnl PCR 단편을 시판중인 (Pharmacia)서열화 벡터인 pTZ18R 및 pTZ19R과 연결시키고, 동일한 효소로 절단시켜서 대장균에 형질전환시켰다. 정확한 구성물을 함유하고 있는 형질전화체를 플라스미드 DNA 의 분리 및 제한 분석에 의하여 확인하였다. 2개의 새로운 구성물은 pTZ 벡터 상에 위치한 서열화 프라이머 부위에 대하여 PCR 단편의 두 배향을 나타냈다. DNA 서열화는 디데옥시 방법 및 M-13 시스템으로부터의 시판되는 서열화 프라이머를 사용하여 수행하였다. 초기 서열화 데이터는 각 스트랜드에 대하여 약 220 염기로 구성되었고, 어느 한쪽 말단에서 출발하여 650bp PCR 단편까지였다. 이 초기의 서열은 다음과 같은 것들을 확인시켜 주었다 : 650 bp PCR 단편은 평체 말단 단편으로서 pUC19 의 Smal 부위 내에 클로닝되었다 ; pTZ18 클론에서 Smal 부위 바로 다음의 DNA서열은 NO2.2 프라이머와 일치한다 ; pTZ19 클론(pTZ18과 반대 배향)에서 Smal 부위 바로 다음의 17bp의 DNA 서열은 CO3.3프라이머와 일치한다;그리고 NO2.2와 CO3.3프라이머 영역내에 있는 DNA서열 및 두 프라이머로 영역으로부터 확장되어 나온 DNA 서열로부터 추론된 아미노산 서열은 사비나아제로부터 결정된N-말단 및 내부 아미노산 서열과 일치하였다. 상기 결과를 토대로 하여, 바실루스 렌투스 DSM 5483 DNA로부터 증폭된 650pb CPR 단편이, 성숙한 프로테아제의 N-말단 바로 다음에서 출발하여 단백질 코딩 영역으로 계속되는, 알칼리성 프로테아제를 코드화하는 유전자의 일부를 나타내는 것으로 결론질 수 있다. 650bp PCR 단편의 서열화를 완료하기 위하여 2가지 방법을 수행하였다. 먼저, 650bp PCR 단편을 함유하는 pTZ19R벡터를 EcoRl으로 절단시켜 PCR 단편의 일부를 분리시키고, 재연결시켜 대장균에 형질전환시켰다. PCR 단편의 예비 제한 분석으로 내부 EcoRl 부위가 밝혀졌고, 벡터의 폴리링커 영역에 제2EcoRl 부위가 존재함이 밝혀졌다. 이 실험으로부터 분리된 정확한 서므클론은 DNA 서열화를 위한 프라이밍 부위에 인접한 위치에 EcoRl 부위를 함유하였고, 이는 PCR 단편의 추가적 내부 DNA 서열의 결정을 가능하게 하였다. 동시에, pTZ19R PCR 구성물로부터 분리된 작은 EcoRl 단편을 pTZ18R에 반대 배향으로 클로닝시켜, EcoRl 부위로부터 반대 방향에 있는 DNA 서열을 결정 할 수 있었다.
C. 바실루스 렌투스 5483 알칼리성 프로테아제 유전자에 대한 전사개시 부위의 결정
클로닝된 BLAP 유전자의 유전자 조작에 필요한 단계는 전사 개시 부위의 결정이다. 이러한 부위를 확인하기 위하여, 프라이머 신장 프로토콜을 이용하였다(참고문헌 : Arnosti Chamberlain (1989), PNAS (USA), 86 .830). 이 방법에서는, 전사의 추정 개시 부위에 대해 3'쪽으로 200 내지300bp에 위치한 주형 DNA 서열과 상동성을 갖는 프라이머(길이가 20 내지 30 염기)를 합성하였다. 프라이머를 엄격한 조건하에서 메신저 RNA 전사체와 하이브리드를 형성시킨 후, 프라이머를 효소인 역전사효소를 사용하여 신장시켰다. 역전사체의 크기는 변성시키는 폴리아크릴아미드 겔에서 측정하였다. 전사 개시의 정확한 염기를 서열화 겔로부터 판독할 수 있도록 신장된 프라이머도 서열화하였다. 전체 RNA를 DSM 5483 또는 플라스미드 pJW5를 함유하는 바실루스 서브틸리스 균주 DB104로부터, 아르노스티와 챔벌린(상동)에 의해 기재된 바와 같이 분리하였다. 플라스미드 pJW5는 3.4kb BLAP Hindlll 단편을 플라스미드 pC194의 Hindlll 부위 내에 클로닝시킴으로써 형성시켰다. 바실루스 세포를 파괴하기 위하여, 라이소자임으로 처리한 후 초음파처리를 행하였다. 오염성 뉴클레아제로부터 RNA를 정제하기 위하여 페놀 추출을 4 내지 5회 이상 수행하엿다. BLAP유전자 전사체의 크기는 토마스(Thomas)에 의해 기재된 프로토콜(참고문헌 : (1983), Methods in Enzymology 100, 255)을 이용하여 노던 분석에 의해 결정하였다. 이 실험에서는, 전체 바실루스 RNA를 변성시킨 후 변성 농도의 포름알데히드를 함유하는 아가로오스 겔을 통한 전기영동법에 의하여 분석하였다(참고문헌: BRL Focus 9 : 3,14). 그런 다음, RNA를 겔로부터 니트로셀룰로오스 필터에 옮기고, 이 필터를 60에서 2시간동안 베이킹하였다. 플라스미드 pMG109.3(pUC19 + BLAP 유전자 함유 3.4kb Hindlll 단편)을 닉 번역하여, 노던 블롯을 프로빙하기위해 사용하였다. BLAP 유전자에 의해 생성된 전사체는 길이가 대략 1200 내지 1400 염기였다. BLAP 뉴클레오티드 서열을 토대로 하여 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안하였다. 이들 프라이머는 Ncol과 Hpal 부위 사이의 BLAP서열 및 성숙한 프로테아제 펩티드를 코드화하는 서열의 5'쪽과 상동성이었다. 프라이머 A는 염기 2056과 2033 사이의 제2도에 포함된 BLAP 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 있고, 프라이머 B는 염기 2242 내지 2222에서 발견된다. 플라스미드 pJW5를 함유하는 바실루스 서브틸리스 DB104 또는 바실루스 렌투스 DSM 5483로부터 제조된 메신저 RNA와 프라이머를 사용하는 프라이머 신장 실험의 결과는 동일하였다. 2가지 모두의 경우에, 전사 개시 부위는 BLAP 서열 중의 위치 1924에 있는 아데닌 잔기인 것으로 결정되었다. 이 아데닌은 BLAP 신호 펩티드의 시작 부위에 있는 ATG 번역 개시 코돈으로부터 42bp위에 위치한다. 이 결과를 기초로, BLAP 메시지의 길이는 1210 염기이다.
[실시예 5]
[바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 및 바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제 유전자(BLAP)의 융합체의 구성]
A. 실험방법
BLAP의 대규모 제조를 위하여, 일부의 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 및 일부의 BLAP 유전자를 포함하는 유전자 융합체를 기초로 하는 발현 시스템을 고안하였다. BLAP유전자의 천연 프로모터는 DSM 5483에서 뿐만 아니라 바실루스 서브틸리스 DB104에서의 BLAP의 효율적인 제조를 위해 불충분한 것으로 입증되었다. 발효 결과로부터 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 프로모터가 ATCC 53926에서의 칼스버그(Carlsberg)-타입 프로테아제의 대규모 제조에 대해 만족스럽게 작용하는 것을 알 수 있다. 따라서 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 프로모터와 BLAP의 구조유전자의 융합체는 ATCC 53926에서의 시판된는 세린 프로테아제와 유사한 프로테아제를 위한 효율적인 발현시스템을 잠재적으로 제공할 것이다. ATCC 53926 및 BLAP 와 같은 알칼리성 프로테아제를 코딩하는 유전자는 통상적으로 효소의 프레-프로 형태도 코드화한다. 이들 유전자는 모두 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 개시 코돈으로 이루어진 조절영역으로 시작하며, 이 조절영역은 대응하는 유전자의 효율적인 전사 및 번역에 기여한다. 조절영역 다음에는 신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 위치한다. 프로테아제를 세포 밖으로 분비하는데 필요한 신호 서열 다음에는 프로-펩티드 및 성숙한 프로테아제에 대한 코딩 영역이 위치한다. 프로모터로부터 아래에 위치한 DNA 서열의 전사 후에, 메신저 RNA (mRNA)는 최종유전자 생성물로 번역된다. 프레-프로-성숙 프로테아제는 신호 펩티드, 프로펩티드 및 성숙한 프로테아제로 구성되어 있다. 신호 서열은 미성숙한 프로 테아제가 세포질막을 통과하도록 유도하는데, 여기에서 신호 서열은 신호 펩티다아제에 의하여 효소적으로 분해된다. 프로 서열은 세포질막 및 세포벽을 가로지르는 전좌 동안 또는 전좌 후의 프로-프로테아제의 정확한 폴딩 및 프로세싱에 필수적인 것으로 보인다. BLAP 와 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 사이의 아미노산 서열 비교는, 프레 영역에서 49%의 상동성, 프로 영역에서 38%의 상동성, 및 성숙한 영역에서 75%의 상동성을 나타냈다. 프로테아제의 정확한 분비 및 성숙을 얻기 위해 필요한 프레 및 프로영역 사이의 상호작용이 완전히 이해되지 않기 때문에, 일부의 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자 및 일부의 BLAP 유전자 사이의 상이한 2개의 융합체를 구성하였다. 2개의 기본 융합체는 ATCC 53926 및 BLAP 유전자의 상이한 일부를 함께 결합시키기 위해 사용된 제한효소 부위에 의해 확인하였다.
1. Clal 융합체
ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP Clal 유전자 융합체를 구성하기 위하여, 추가의 Clal 절단 부위를 ATCC 53926 프레 및 프로 서열의 접합점 다음의 위치 376에서 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자에 도입시켜야 했다(제27도 및 제27a도). 염기쌍 2032에서 BLAP 유전자는 대응 위치에 자연발생적인 Clal 부위를 이미 함유하고 있었다. Clal 부위를 PCR을 사용하여 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자에 도입하였다. 전술한 플라스미드 pGM15를 dam 대장균 균주인 NM522로부터 분리하고, Aval, Clal 및 Mlul으로 절단함으로써 4330bp, 1296bp,382bp 및 147bp의 4개의 DNA 단편을 수득하였다. BLAP 서열 중의 위치 1206 및 2032에 있는 Clal 부위(제2도)는 중복하는 GATC 서열에서의 dam-메틸화로 인하여 절단 되지 않았다. 1825bp Aval/Clal 단편 중에서 3개의 DNA 단편을 생성시키고, 이들 단편이 4330bp Aval/Clal 단편에 재연결 및 재클로닝되는 것을 방지하기 위하여, Mlul에 의한 절단을 사용하였다. pGM15 Aval/Call/Mlul 절단으로부터의 DNA 단편을, PCR을 사용하여 합성한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 프로모터 및 프레 서열을 함유하는 DNA 단편에 연결시켰다. 이러한 292bp단편은 각각 5' 및 3' 말단에서 Aval 및 Clal 절단 부위에 의해 플랭킹시키고, 프라이머 #1 및 #3과 함께 주형으로서 플라스미드 pC51을 사용하여 합성하였다(제8도). PCR 단편은 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 프로모터 및 대부분의 ATCC 53926 프로 서열(염기쌍 84에 있는 Aval으로부터 염기쌍 376에 있는 새로이 형성된 Clal 부위까지)을 포함하는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 N-말단 부분으로부터의 서열 정부를 함유하였다. 상기 연결물을 대장균 NM522 에 형질전환시키고, 암피실린 내성 형질전환체를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 제조하고, 제한 분석으로 특성확인하였다. 정확한 구성물을 확인하여 pCB10C(제12도)로 표시하였다. 플라스미드 pCB10C는 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 프로모터 및 위치 2941에 있는 천연 Clal 부위로부터 아래에 위치한 BLAP 서열에 융합된 대부분의 ATCC 53926 프레서열을 함유하였다. 플라스미드 pCB10C를 사용하여 Clal으로 그것을 선형화시키고, 위치 2032 및 위치 2941에 있는 Clal 부위 사이의 서열을 함유하는 BLAP 유전자로부터의 909bp Clal단편을 삽입시킴으로써 최종 Clal-융합 유전자를 생성시켰다. 909bp Clal 단편은 플라스미드 pMG 108.2(제26도)를 Clal으로 가수분해시킴으로써 제조하였다. 인식 테트라뉴클레오티드 GATC 중의 아데닌 잔기에서 dam 메틸화를 방지하기 위해, 플라스미드 pMG108.2를 대장균 GM33(dam)으로부터 분리하였다. 909bp DNA 단편을 전제용 아가로오스 겔로부터 분리하고, 미리 Clal으로 절단시켜 놓은 플라스미드 pCB10C 내에 연결시킨 다음, 박테이라 알칼리성 포스파타아제로 탈인산화시겼다. 연결 혼합물을 대장균 NM522에 형질전환시켰다. 암피실린 내성 형질전환체를 스크리닝하고, 정확한 구성물(pCB11C)을 확인하였다. pCB11C의 절단지도는 제4도에 도시되어 있고, 그것의 구성을 위한 개략도는 제12도에 도시되어 있다. 플라스미드 pCB11C에 존재하는 ATCC 53926 및 BLAP 유전자의 융합체에 대한 DNA 서열의 분석은 예상했던 DNA 및 아미노산 서열을 확인시켜 주었다.
2. Ncol 융합체
ATCC 53926-BLAP Ncol 유전자 융합체를 구성하기 위하여, 추가의 Ncol 절단 부위를 ATCC 53926 프로 및 성숙한 서열의 접합부 근처의 위치638에서 ATCC 53926 알카리성 프로테아제 유전자에 도입시켜야 하였다(제27도 및 제 27a도). BLAP 유전자는 위치 2311에 자연발생적 Ncol 부위를 함유하였다. Ncol 부위는 PCR을 사용하여 ATCC 53926 서열에 도입되었다. 주형으로서 플라스미드 pC51을 사용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 #1 및 #2(제8도)를 사용하여 554bp의 PCR DNA 단편을 합성하였다. 고안된 프라이머는 각각 단편의 5'와 3' 말단에 Aval 및 Ncol 부위를 도입시켰다. 554bp 단편은 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 프로모터, 프레 및 프로서열과, 성숙한 ATCC 53926 프로테아제 유전자의 처음 4개의 아미노산에 대한 서열 정보를 함유하였다. Aval/Ncol으로 절단한 후 PCR 단편을 플라스미드 pGM15로부터의 4958bp Aval/Ncol DNA 단편에 연결시켰다. 플라스미드 pGM15 (제3도)를 Aval,Ncol 및 Mlul으로 절단하여, 4958bp, 668bp, 382bp 및 147bp의 4개의 DNA 단편을 수득하였다. Mlul은 1197bp Aval/Ncol 단편의 4958bp의 Aval/Ncol 단편에의 재연결을 방지하기 위해 1197bp 단편으로부터 3개의 단편을 생성시키기 위해 사용하였다. 연결 혼합물을 대장균 NM522로 형질전환시켰다. 암피실린 내성 형질전환체를 스크리닝하여 정확한 구성물(pCBIN)(제5도)을 확인하엿다. 플라스미드 pCB1N의 Ncol 부위에 대한 DNA 서열의 분석결과 예상했던 DNA 및 아미노산 서열을 확인하였다. Ncol 융합 알칼리성 프로테아제 유전자는 ATCC 53926의 전체 프로머터, 프레- 및 프로 서열 및 성숙한 BLAP 서열의 아미노산 잔기 3 위치에서 세린이 트레오닌으로 치환된 단일 아미노산 치환을 가지는 성숙한 BLAP의 전체 서열을 함유하였다.
[실시예 6]
[바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926-BLAP 융합 유전자의 바실루스 벡터로의 서브클로닝 및 ATCC 53926 생산 균주로의 형질전환]
전술한 바와 같이 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자를 대장균 벡터에 클로닝 시킨 후, 이것을 바실루스 벡터에 서브클로닝시키고 바실루스 서브틸리스 DB104에 형질전환시켰다. ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자를 Aval/Sstl DNA 단편으로서 pBC16 및 pUB110 유도체에 서브클로닝시켰는데, 이것은 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 유전자 함유 대장균 벡터(pCB1N, pCB11C, pCB2N, pCB13C, pCB4N 및 pCB15C)를 Aval과 Sstl으로 절단시키고, 이것을 Aval, Sstl, Pstl 및 Sall으로 절단시킨 바실루스 플라스미드 pC51 및 pH70 에 연결시킴으로써 수행하였다. 플라스미드 pC51 및 pH70을 Aval/Sstl으로 절단하여, 필요한 복제원 및 선별을 위한 항생물질 내성 유전자(pC51에서는 테트라사이클린 내성, pH70에서는 카나마이신 내성)를 함유하고 있는 커다란 Aval/Sstl 벡터 단편을 수득하였다. pC51 및 pH70상에 존재하는 전체 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자를 함유하고 있는 작은 Aval/Sstl 단편 3개의 보다 작은 DNA 단편으로 가수분해하기 위하여 Sall 과 Pstl으로 절단시켰다. 이것은 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 바실루스 벡터로의 재연결 가능성을 감소시켰다. 수용체로서 바실루스 서브틸리스 DB104를 사용하여 바실루스에의 초기 클로닝 실험을 수행하였다. DB104는 프로테아제 생산량이 감소된 균주이기 때문에, 그것으로 BLAP 유전자의 존재 및 발현에 대한 직접적인 스크리닝을 할 수 있다. pH70과 pC51을 대장균의 각각으로부터의 Aval/Sstl 단편의 수용체로서 사용하는 경우, 상술한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 플라스미드는 총 12개의 잠재적인 바실루스 플라스미드 구성물을 생성하였다. 제23도는 대장균 플라스미드 pCB11C, pCB13C, 및 pCB15C에 존재하는 3개의 Clal 융합체로부터 유도된 6개의 ATCC 53926-BLAP 플라스미드를 도시한다. ATCC 53926 생산 균주에 형질전환가능한 플라스미드, 플라스미드 pCB55C, pCB56C, pCB58C, pCB75C, 및 pCB78C의 상세한 절단지도는 각각 제13도, 제14도, 제15도, 제16도, 및 제17도에 도시외어 있다. 이들 구성물 5개를 모두 바실루스 서브틸리스 DB104 및 ATCC 53926 생산 균주에 형질전환시켰다. 유사한 방식으로, pCB1N, pCB2N, 및 pCB4N으로부터의 Ncol ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP융합체를 pH70 및 pC51에 클로닝시켰다.
이 클로닝으로부터의 6개의 플라스미드중 5개(pCB50N, pCB51N, pCB 53N, pCB70N, 및 pCB73N)를 바실루스 서브틸리스 DB104 및 ATCC 53926 생산균주에 형질전환시켰다. 이들 구성물의 절단지도는 각각 제18도, 제19도, 제20도, 제21도, 및 제22도에 도시되어 있다.
[실시예 7]
[진탕 플라스크 배양으로 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 균주에 의한 바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제(BLAP)의 생산을 위한 프로토콜]
상이한 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 플라스미드를 함유하는 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 의 유도체를 비교하기 위하여, 3단계 진탕 플라스크 방법을 사용하였다. 이 실험에서는 항생물질 테트라사이클린 또는 카나마이신을 소망하는 플라스미드의 선별을 위하여 항상 배지(아래에서 설명함)에 첨가하였다. 첫 번째 예비배양 플라스크를 실온에서 해동시킨 냉동 원액 바이얼로부터 접종하였다. 39및 200rpm에서 7시간동안 배양시킨 후 1.0%(v/v)의 배양액을 새로운 (제2의)예비배양 플라스크로 옮겨서 배양을 계속하였다. 13시간 내지 15시간 사이에 주 배양 플라스크를 2벌로 하기 위하여 1%를 옮겼다. 프로테아제 활성의 측정을 위해서 27시간 내지 50시간 사이에 주 배양 플라스크로부터 주기적으로 배양 샘플을 얻었다. 진탕 플라스크 실험은 미생물에 대해 동화가능한 탄소 및 질소원 뿐만 아니라 다른 유기물질 및 무기염을 함유한 복합배지를 사용하였다. 주요성분은 가수분해된 옥수수 전분, 카제인산 나트륨, 대두분, 양조 찌꺼기, 및 옥수수 침지액이었다. 소량의 소포제, 무기염 및 비타민 B1 및 B6 가 또한 포함되었다. 배플이 구비된 삼각 플라스크에 배지를 옮긴 후, 15psi 에서 121로 가열함으로써 멸균시켰다.
[실시예 8]
[BLAP를 생산하는 ATCC 53926 유도체의 소규모 발효를 위한 프로토콜]
발효는 2단계는 수행하였는데, 유기체를 먼저 내인성 플라스미드 DNA를 선별하기 위하여 항생물질이 첨가된 복합 배지를 함유하는 진탕 플라스크에서 증식시켰다. 세포밀도가 높아진 후 플라스크 배양액의 일부를, 연속 증식 및 프로테아제의 생산을 위한 주 발효용기에 옮겼다. 용기는 비, 브라운 인코포레이티드 제품인 바이오스태트(Biostat) E 또는 ES 였다. 모든 발효는 10리터 미만의 배양액을 함유하였고, BL1(바이오세이프티 레벨 원)포괄 예방조치와 재조합 DNA 분자를 포함한 연구에 관한 내셔날 인스티뉴트 오브 헬스 가이드라인 (NIH Guidelines, May 7, 1986)에 구체화된 바와 같은 우수한 실험실례를 사용하여 수행하였다.
진탕 플라스크와 발효기 배지는, 프로테아제의 생산 뿐만 아니라 미생물의 활발한 성장을 가능하게 하는 동화가능한 탄소원, 동화가능한 질소원, 유기 양분 및 무기염이 첨가된 매우 유사한 복합 배지였다. 배지의 주된 성분은 탈이온수, 옥수수 전분, 대두, 카제인산 나트륨, 양조 찌꺼기, 및 옥수수 침지액이었다. 소량 성분은 (NH)HPO와 NaHPO이었다. 시판 소포제도 또한 발효기 배지에 첨가되었다. 배지를 15psi에서 121로 가열함으로써 멸균하였다. 2용량의 배플이 구비된 플라스크에 담긴 상술한 배지를 실온에서 해동시킨 1.0의 냉동 배양액-글리세롤 원액(원액 제조 참조) 1.0로 접종시켰다. 테트라사이클린 또는 카나마이신 항생물질 중 어느 하나를 진탕 플라스크 배양액에 첨가하여 소망하는 플라스미드를 포함하는 세포를 선별하였다. 진탕 플라스크를 배양물이 성장하도록 서서히 진탕시키면서 39에서 배양하였다. 마지막으로 발효기 배지를 1.5%(v/v)의 진탕플라스크 배양액을 옮김으로서 접종하였다. 발효기 배지에도 항생물질이 존재하였다. 교반속도와 공기유속은 각각 1,300rpm과 1vvm(리터/분)으로 유지하였다. 수회의 실험에서 교반 및 공기 유속을 배양액중의 산소분압(pO)이 20%가 넘게 유지되도록 하기 위하여 로그상 성장기간동안 단시간내에 증가시켜야 했다.
생산 균주를 배양시키는 동안, 배양 pH와 온도를 특정시간에서 변화시켰다. 특히, 배양 pH의 조절은 프로테아제의 생산에 상당한 영향을 미치는 것으로 발견되었다. 배양 pH를 0-13.5시간동안 6.8로 조절한 후, 18 내지 35시간동안에는 7.5로 조절하였다. KOH 와 HSO의 멸균용액을 pH를 조절하기 위해 필요할 때마다 배지에 첨가하였다. 발효의 시작부터 배양온도는 39였고, 배양한지 14.5시간 후에 34로 강하하였다.
[실시예 9]
[바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제에 대한 검정]
진탕 플라스크 또는 발효 후의 샘플의 검정을 위해, 원심분리에 의해 세포 및 배지 파편으로부터 프로테아제를 분리하였다. 상기 미정제 제제중의 프로테아제를 아래와 같이 정량하였다.
HPE(헨켈 프로테아제 아인하이트)방법은 카제인의 프로테아제 절단물로부터 산-가용성 단편의 방출에 대한 불연속 측정을 토대로 한 것이다. 약 50의 프로테아제 용액을, 해마르스텐(Hammarsten)카제인을 pH8.5의 트리폴리포스 페이트-트리스 완충용액에서 가열함으로써 제조한 카제인 용액 750와 혼합하였다. 2.2에펜도르프 튜브에 담아 50에서 15분동안 배양한 후에 600의 0.44M 트리클로로아세트산 용액을 첨가하였다. 혼합물을 얼음 위에서 15분동안 냉각시킨 후 원심분리에 의해 침전물을 제거하였다. 산-가용성 펩티드를 분광광도계를 이용하여 290nm에서 측정하였다. 2개의 HPE 유니트를 290nm에서 0.500 OD의 흡광도 변화와 동일한 것으로 규정하였다.
EPE(에스테르 가수분해성 프로테아제 아인하이트) 방법은 주로 ATCC 53926 생산 균주로부터의 활성 측정에 유용하였다. 반응속도법 검정을 100의 샘플 또는 공지의 표준 시판 프로테아제(Maxatase, Novo A/S)를 CBZ-발린-p-니트로페닐 에스테르 함유 아세톤 완충액에 혼합함으로써 시작하였다. p-니트로폐놀이 CBZ 에스테르의 에스테르 가수분해성 절단에 의해 방출되는 비율을 분광광도계로 A에서 모니터링하고 선형 회귀 분석에 의해 결정하였다. 샘플에 대한 EPE 활성의 유니트는 막사타아제(Maxatase) 표준의 반응 속도에 대한 샘플의 반응속도를 비교함으로써 결정하였다.
[실시예 10]
[겔 전기영동법에 의한 BLAP와 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 프로테아제의구별]
ATCC 53926 알칼리성 프로테아제-BLAP 융합 균주로부터 생산된 바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제는, pH6.0의 완충액을 사용하여 균일한 변성(천연)12.5% 폴리아크릴아미드(PA) 겔에서 전기영동법에 의해 ATCC 53926의 천연 세포외 단백질가수분해 효소와 구별될 수 있다. 발효 배양액의 원심분리에 의해 얻은 미정제 샘플을 파마시아 인코포레이티드에 의해 제조된 파스트시스템(PhastSystem) 장치 상에서 이러한 방법에 의해 분리하였다. 단백질 종은 쿠마시에 블루로 PA겔을 염색함으로써 가시화하였다.
[실시예 11]
[바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926의 제조]
균주 바실루스 리케니포르미스 DSM 641을 함유하고 있는 한천 사면으로부터의 세포 물질을 루프에 의해 5의 배지 A(배지 A : 제조업자의 지시에 따라 제조한 Merck 사로부터의 Naehrbouillion)에 옮겨 현탁시켰다. 바이브록스(Vibrox)에서 격렬하게 교반시킨 후에 그 현탁액을 회전 진탕기에 넣어 30에서 교반하였다(150RPM, 2.5의 진폭 ; 24시간). 24시간 후, 1의 현탁액(흡광 = 640nm에서 1)을 500의 삼각 진탕 플라스크에 담겨있는 100의 배지 A에 넣고 다시 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 6500rpm에서 원심분리하였다. 원심분리물을 NaCl 등장액으로 2회 세정한 후, 충분한 염수에 넣어 세포를 계수한 결과 대락 10 /이었다.
약 8의 현탁액을 9직경의 페트리 접시에 옮긴 다음, 100rpm으로 교반하면서 U.V. 램프(Schutt/Gottingen)로부터 27거리에서 자외선조사 하였다(5 내지 60분). 세포의 침전을 방지하기 위해 조사중에 교반을 계속 하였다. 소정의 조사시간, 바람직하게는 6분이 경과된 후, 희석액 시리즈를 만들고 이들 희석액을 항생물질이 존재 및 부재하는 배지-A 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 항생물질의 존재 및 부재하에 돌연변이 유발처리 전 및 후의 CFU(콜로니 형성 유니트)의 측정으로부터, 돌연변이 형성에 대한 척도로 활용되는 전환율의 변화 뿐만 아니라 사망률을 측정할 수 있다. DSM 641 의 경우에는 95%보다 큰 사망률이 특히 바람직한 것으로 간주되었다.
복사평판법을 이용하여 콜로니를 Ca-카제인산염-한천에 옮겼다. 플레이트를 39에서 72시간동안 배양하였다. 그런 다음, 24, 48, 및 72시간 경과 후에 콜로니 주변에서의 투명한 영역(zone)의 형성을 측정하였다. 콜로니와 투명 영역의 측정 후에, 콜로니의 직경과 비교하여 커다란 용균 영역을 나타내는 균주를 선별하였다. 그런 다음, 이들 콜로니의 개개의 배양액을 표준 미생물학 방법(코흐의 한천평판법, 린드너의 소적법, 다중 도말법)을 이용하여 제조하였다. 이들의 분리균으로 진탕 플라스크 실험을 수행하여 프로테아제 생산성을 측정하였다.
[실시예 12]
[DSM 641 및 ATCC 53926 에 의한 프로테아제 생산량 비교]
균주를 500삼각 플라스크에 담겨 있는 50의 배지 B(표 III의 각주 1참조)로 진탕 플라스크에서 96시간동안 39및 150 RPM(진폭은 5)에서 배양하였다. 매 24시간마다 프로테아제 활성을 측정하였다. 상대적인 프로테아제 생산량은 하기의 표3에 요약되어 있다.
최종 부피의 ⅓로 현탁시킨 감자전분은 효소적으로 가수분해하였다. 별도로, 카제인은 KOH 용액을 첨가하여 75의 물에 용해시켰다(총 총피의 약 ⅓). 이들 두 용액을 염과 혼합하고 총 부피를 물로 조절하였다. pH를 7.2로 조절한 후 용액을 멸균하였다.
2. 중복 발효가 수행됨.
3. 숫자 72 와 96은 인큐베이션 시간을 의미한다.
표3은 균주 ATCC 53926이 균주 DSM 641 과 비교하여 약 30% 더 많은 프로테아제를 생산함을 보여준다.
기타 잡다한 실험 조작
1. 플라스미드 DNA 의 제조
플라스미드 제조(소규모 제조 및 CsCl/브롬화에티듐 밀도 구배 정제), 아가로오스 및 아크릴아미드 겔 전기영동범, 완충액(TE-Tris EDTA, TAE-Tris 아세테이트 EDTA, TBE-트리스 붕산염 EDTA) 및 배지 제조는 본질적으로 매니아티스 등 (Maniatis, et al., 상기 동일)에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. 폐놀 p.a. 는 lBl로부터 구입하여 사용하기 전에 TE-완충액으로 평형시켰다. 아가로오스(Seakem GTG) 및 겔화온도가 낮은 아가로오스(SeaPlaque)는 록랜드(ME)에 소재한 FMC 코포레이션으로부터 구입하였다.
2. 절단 단편의 정제
절단 단편은 정제용 아가로오스 겔상에서 샘플을 이동시킴으로써 분리하였다. DNA는 브롬화 에티디움으로 염색함으로써 가시화하고 회수하고자 하는 DNA단편을 함유하고 있는 밴드는 면도칼로 절단하였다. DNA를 lBl 엘렉트로엘루터(electroeluter)를 사용하여 전기용리시키고 1회 폐놀처리한 후 에탄올로 침전시켰다.
3. 중합효소 연쇄반응
제조업자(Cetus Corproration, Emeryville, California)에 의해 설명된 것과 똑같이 PCR을 수행하였다. PCR에 의해 생성된 DNA를 함유하고 있는 용액을 폐놀로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 후 적절한 완충액에 재현탁 하여 제한효소로 가수분해하였다. 적절한 제한효소로 가수분해한 후 용액을 페놀로 추출하고 DNA를 에탄올로 침전시켰다. 이 방법으로 제조한 DNA는 연결에 적당하였다. 이 보고서에서 PCR로 생성된 모든 DNA 단편의 예상했던 길이는 적절한 제한효소로 절단한 후 관찰된 DNA단편의 크기에 해당하였다.
4. 제한 분석
제한효소,T4 DNA 리가아제 및 박테리아 알칼리성 프로테아제를 제조업자(NEB,BRL, lBl, Boehringer)가 설명하는 바와 같이 사용하였다.
5. 원형질체 형질전환
원래 바실루스 서브틸리스에 대해가장 적합한 원형질체 형질전환법을 다른 바실루스종에 적용하였다.(Chang Cohen (1979) Mol. Gen. Genetics 168 111). 바실루스 서브틸리스, 바실루스 렌투스, 또는 바실루스 리케니포르미스의 콜로니를 30의 416배지(416 배지 : 20% 박토트립톤, 1% 효모추출물, 1% NaCl, 오토클레이빙에 의해 멸균)에 접종시키고, 뉴 브룬스윅 G24테이블탑 진탕기에 넣어 37로 225rpm에서 밤새 증식시켰다. 다음날 아침, 각 배양액의 적절한 부피를 사용하여 멸균한 250의 삼각 플라스크중의 40의 416 배양액(예비 가온)에 접종하였다. OD650이 0.4와 0.5 사이에 도달할 때까지 37에서 진탕하면서 배양을 계속하였다. 그런 다음, 세포를 멸균 35폴리프로필렌 오오크리지형 (Oakridge type)튜브에서 3000rpm로 4에서 10분동안 펠릿화하였다. 상층액은 따라 버리고, 세포 펠릿을 역위에 의해 5의 SMMP중에 서서히 재현탁시켰다. SMMP는 동일한 부피의 2 x SMM 과 4 x PAB를 혼합함으로써 항상 새롭게 제조하였다(2 x SMM은 1.0M 수크로오스, 0.04M 말레산, 0.04M MgCl2ㆍ6H2O,pH6.5(10% NaOH로 조절)를 함유하고, 오토클레이빙에 의해 멸균됨 ; 4 x PAB 는 1의 탈이온수에 용해된 70g의 디프코 항생물질 배지 #3을 함유하고, 오토클레이빙에 의해 멸균됨). 세포 현탁액을 16 x 125크기의 멸균 둥근 바닥형 스크류-캡 배양 튜브(Corning #25760)에 따라 옮겼다. SMMP에 10/로 용해된 라이소자임 용액을 새롭게 제조하여, 그중 200를 세포현탁액에 첨가하였다. 튜브를 G24 뉴 브룬스윅 진탕기의 플랫폼에 놓고 아주 천천히 진탕시키면서(25-30rpm) 37에서 배양하였다. 원형질체 형성에는 일반적으로 바실루스 니케니포르미스에 대해서는 40-60분, 바실루스렌투스 및 바실루스 서브틸리스에 대해서는 20 내지 40분이 소요되었다. 원형질체 형성 정도를 측정하기 위하여 세포현탁액의 샘플을 상 대조 현미경을 이용하여 검사하였다. 라이소자임 처리 후, 10의 SMMP를 원형질체 현탁액에 첨가하고, 원형질체를 2000rpm에서 10분동안 실온에서 원심분리에 의하여 펠릿화하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 SMMP중에 재현탁시켰다(초기 세포 배양액 각 40에 대하여 3의 SMMP 사용). 각각의 형질전환 반응에서, 0.5의 원형질체화된 세포를 16 x 125크기의 멸균 플라스틱제 둥근바닥 배양 튜브(Corning #256760)에 옮긴 후, 1 내지 4 마이크로그램의 DNA를 60이하의 부피로 첨가하고, 1.5의 40% 폴리에틸렌 글리콜(PEG, Sigma Chemical Company 제품 #P-3640)을 첨가하였다. 역위에 의해 튜브를 서서히 혼합한 후, 실온에서 3내지 4분동안 방치한 다음, PEG를 5의 SMMP + 2% BSA(우혈청 알부민)을 첨가함으로써 희석하였다. 역위에 의해 혼합한 후, 2000rpm에서 10분동안 실온에서 원심분리에 의해 원형질체를 펠릿화하고, 상층액을 조심스럽게 따라 버린 후, 펠릿을 1.0의 SMMP + BSA 중에 재현탁하였다. 그런 다음, 세포를 37에서 90분동안 진탕하면서(뉴 브룬스윅 G24 테이블 탑 진탕기, 150rpm)배양하여, 플라스미드 코드화된 유전자의 발현과 세포벽의 부분적인 재생을 유도하였다. 선택 재생 배지는 적절한 항생물질을 첨가하여 제조하였다. CR5 재생배지를 모든 바실루스 균주에 대해 KmR을 코드화하는 플라스미드 함유 형질전환체 선별에 사용하였다 (Puyet et al.(1987)FEMS Microbiology Letters 40,1). DM3 재생 배지는 본래 TcR을 코드화하는 플라스미드에 의해 형질 전환된 모든 바실루스 균주를 선별하기 위하여 사용하였다(참고문헌 : Chang Cohen,상기 동일). 그러나, 바실루스 렌투스 원형질체는 이러한 숙신산염 기저 배지상에서 비효율적으로 재생하는 것으로 발견되었다. 따라서, 삼투압 안정제로서 만니톨을 사용한 #451 재생 배지가 시험되었다(참고문헌:Bourne Dancer (1986) J. of Gen. Micro. 132, 251). 모든 바실루스 균주가 각각의 균주에 대해 필요한 테트라사이클린의 수준이 상이함에도 불구하고, 만니톨 배지상에서 만족스럽게 재생하는 것으로 밝혀졌다. 바실루스 서브틸리스, 바실루스 렌투스, ATCC 53926에 대한 테트라사이클린의 선택 수준은 각각 65/, 15/, 및 25/이었다. 각각의 형질전환 반응액을 5개의 재생 플레이트 상에 플레이팅시키고, 37에서 1 내지 2일간 배양하였다. 잠재적인 형질전환체를 적절한 항생물질, 및 필요에 따라 프로테아제 활성을 검출하기 위한 1% 탈지유를 함유한 루리아 한천 상에서 선별하였다. 균주 동일성을 검사하기 위하여 정당한 영양 보조제가 첨가 및 첨가되지 않은 스피치첸(Spizizens)의 최소 염 배지를 사용하였다.
6. 박테리아 균주
대장균 균주 :
1. 대장균 NM522는 hsd5,(lac-pro), [F', pro+, laclｑZM15]이다. NM522는 제한 및 변형 마이너스 균주이다(Pharmacia, Piscataway, N.J.).
2. 대장균 GM33(dam 3)은 dam-메틸라아제 마이너스 균주이다(참고문헌: Marinus, M.G. Morris, N.R.,(1974)J.Mol.Biol.85,309).
3. 대장균 DH5는 F-80dlacZM15,(lacZYA-argF)U169, recA1, endA1, hsdR17(rk -,mk +),supE44, lamda-,thi-1,gyrA, relA1(수용능력있는 동결 세포, BRL, Gaithersburg, MD) 이다.
4. 대장균 HB101은 F,hsdS20(rB -,mB -),supE44, ara14, glaK2, lacYi, proA2, rpsL20(strR), xyl15, leu, mtll, lamda-, recA13 이다.
7. 바실루스 균주 :
1. 바실루스 서브틸리스 DB104는 his, nprR2, nprE18, 및 aprA3의 유전자형을 갖는다. 이 균주는 라이센싱 협정에 의해 데이비스 소재의 캘리포니아대학에 있는 로이 도이(Roy Doi)박사로부터 수득하여, 오로지 연구목적에만 사용하였다. 이 균주는 중성 및 알칼리성 프로테아제의 생성에는 불충분하다.
2. 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 은 독일연방공화국 뒤셀도르프 소재의 헨켈사(Henkel KGaA)에 의해 개발된 산업용 생산 균주이다.
3. 바실루스 렌투스 DSM 5483은 독일에서 채취한 토양샘플의 천연 분리균이다.
8. 클로닝 벡터
1. pUC19 : pUC19는 pBR322와 M13mp19의 일부분씩을 함유하고 있는 작은 대장균 플라스미드(2686bp)이다. 이것은 13개의 상이한 절단 엔도뉴클레아제에 대한 인식부위와 함께 54bp의 다중 클로닝 부위를 함유한다. 이 플라스미드는 씨. 야니쉬-페론(C.Yanisch-Perron)등[(1985),Gene 33, 103]에 의해 제조되었고, 미합중국 메사츄세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오 랩스 인코포레이티드로부터 구입가능하다.
2. pTZ18R : pTZ18R(참고문헌 : Mead, D.A. et al (1986) Protein Engineering, 1,67)은 다기능 파지 플라스미드(파스미드)벡터이다. 이 플라스미드는 대장균 벡터 pBR322와 대장균 파지 f1의 복제원을 함유하고, 단일 스트랜드의 DNA가 생성되도록 한다. 이것은 플라스미드 pUC18의 다중 클로닝 부위를 함유한다. 이 플라스미드는 미합중국 뉴저어지주 피스카타웨이 소재의 파마시아 엘케이비 바이오테크놀로지 인코포레이티드로부터 구입가능하다.
3. pTZ19R : pTZ19R은 pTZ18R과 상동성이지만 플라스미드 pUC19의 다중 클로닝 부위를 함유한다.
4. pCP13 : pCP13은 이미 특성확인되어 있는 플라스미드 pLAFR1 (Friedman, et al., (1982) Gene 18, 289) 으로부터 유도된 광역 숙주범위를 는 코스미드 벡터이다. 플라스미드 pCP13은 크기가 23kb이며, 테트라사이클린과 카나마이신에 대한 내성을 코드화한다. 이것은 클로닝에 적당한 독특한 절단 부위를 다수 가지고, 이동가능하지만 자체-전달성은 없다.
5. pC50 : pC50은 바실루스 플라스미드 pBC16의 유도체이다. 이것은 pBC16의 BamHl 부위에 클로닝된 DSM 641 프로테아제를 코드화하는 2kb DNA 단편을 함유한다.
6. pC51 : pC51은 플라스미드 pC50의 제2세대 유도체이다. ATCC 53926 알칼리성 프로테아제를 코드화하는 pC50으로부터의 1540bp의 Aval/Sstl 단편을 먼저 대장균 플라스미드 pUC19의 Xmal과 Sstl 부위 사이에 클로닝시켜서 플라스미드 pH9를 만든 다음, pH9로부터 EcoRl/BamHl 단편상에서 ATCC 53926 프로테아제 유전자를 제거하여 플라스미드 pBC16의 EcoRl과 BamHl 부위 사이에 클로닝시켜 플라스미드 pC51을 제조하였다.
7. pUB110 : pUB110은 본래 알.더블유.라시(R.W.Lacey)[(1974), J.Med. Microbiol.,7,285]에 의해 황색포도상구균(Staphyolcoccus aureus)로부터 분리된 카나마이신에 대한 내성을 코드화하는 4548bp의 플라스미드이다.
8. pK0110 : pK0110은 788bp의 EcoRl/BamHl 단편이 제거되고 폴리링커영역을 함유하고 있는 pUC19로부터의 단편에 의해 대치된, pUB110의 유도체이다.
9. pBC16 : pBC16은 크기가 대략 4250bp이고, 테트라사이클린에 대한 내성을 코드화한다. 이 플라스미드는 본래 바실루스 세레우스로부터 분리하여 바실루스 서브틸리스에 형질전환시켰다(참고문헌 : Bernhard, K., et al (1978) J.Bacteriol.133: 897).
10. pC194 : pC194는 황색포도상구균으로부터 분리하여 바실루스 서브틸리스에 형질전환시킨, 클로르암페니콜에 대한 내성을 코드화하는 2910 염기쌍의 플라스미드이다(참고문헌 : lordanescu, S., et al., (1978) Plasmid 1 : 468 ; Erlich, S.D. (1977) PNAS USA 74 : 1680).
11. pH70 : pH70은 플라스미드 pUB110의 유도체이다. 플라스미드 pH9의 EcoRl/BamHl DNA 단편상으로부터 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자를 분리하고 (플라스미드 pC51 참조), 플라스미드 pUB110의 EcoRl/BamHl부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 pH70을 제조하였다.
Claims (48)
- 제1도에 도시된 아미노산 잔기 112부터 아미노산 잔기 380가지의 아미노산 서열을 가지고 있는 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 성숙한 알칼리성 단백질 가수분해 효소 및 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 으로부터의 하나 이상의 다른 단백질 가수분해 효소를 포함하는 조성물.
- 전사되는 순서대로 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926알칼리성 프로테아제 프로모터, 리보솜 결합부위, 및 제1항의 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 단백질 가수분해 효소를 코드화하는 성숙한 영역에 작동가능하게 연결된 프레-프로 영역에 작동가능하게 연결된 개시 코돈을 포함하는 조절 영역을 전사방향으로 포함하고 있는 DNA 서열을 함유하는, 바실루스에서 복제가능한 하이브리드 플라스미드.
- 제2항에 있어서, 제1항 바실루스 렌투스 DSM 5483 으로부터의 단백질 가수분해 효소를 코드화하는 성숙한 영역에 작동가능하게 연결된 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 전사 테미네이터를 추가로 포함하는 하이브리드 플라스미드.
- 제2항에 있어서, 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 카르복시 말단부분, 및 제1항의 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 단백질 가수분해 효소를 코드화하는 성숙한 영역에 작동가능하게 연결된 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 전사 터미네이터를 추가로 포함하는 하이브리드 플라스미드.
- 제13도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB55C.
- 제14도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB56C.
- 제15도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB58C.
- 제16도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB75C.
- 제17도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB78C.
- 제18도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB50N.
- 제19도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB51N.
- 제20도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB53N.
- 제21도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB70N.
- 제22도에 도시된 절단지도를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pCB73N.
- 제5항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제6항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제7항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제8항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제9항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제10항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제11항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제12항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제13항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제14항의 하이브리드 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제15항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제16항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제17항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제18항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제19항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제20항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제21항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제22항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제23항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 제24항에 있어서, 상기 숙주세포가 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실루스 숙주세포.
- 바실루스 렌투스 알탈리성 단백질 가수분해 효소를 코드화하는 유전자를 가지고 있는 플라스미드에 의해 형질전환된 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 균주를 영양 배지에서 배양하는 단계 및 상기 효소를 회수하는 단계를 포함하는, 바실루스 렌투스 알칼리성 단백질 가수분해 효소의 제조방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB55C인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB56C인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB58C인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB75C인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB78C인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB50N인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB51N인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB53N인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB70N인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 플라스미드가 pCB73N인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29도에 도시된 아미노산 서열을 가지고 있는 성숙한 알칼리성 단백질 가수분해 효소 및 바실루스 리케니포르미스 ATCC 53926 으로부터의 하나 이상의 다른 단백질 가수분해 효소를 포함하는 조성물.
- 기탁번호 ATCC 53926하에 기탁된 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis).
- 기탁번호 DSM 5483하에 기탁된 바실루스 렌투스(Bacillus lentus).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39885489A | 1989-08-25 | 1989-08-25 | |
| US7/398,854 | 1989-08-25 | ||
| US398854 | 1989-08-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR920701425A KR920701425A (ko) | 1992-08-11 |
| KR100200166B1 true KR100200166B1 (ko) | 1999-06-15 |
Family
ID=23577057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019910700414A KR100200166B1 (ko) | 1989-08-25 | 1991-04-25 | 알칼리성 단백질 가수분해효소 및 그것의 제조방법 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5352604A (ko) |
| EP (1) | EP0493398B1 (ko) |
| JP (1) | JP3220137B2 (ko) |
| KR (1) | KR100200166B1 (ko) |
| AT (1) | ATE187490T1 (ko) |
| DE (1) | DE69033388T2 (ko) |
| DK (1) | DK0493398T3 (ko) |
| ES (1) | ES2144990T3 (ko) |
| WO (1) | WO1991002792A1 (ko) |
Families Citing this family (634)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6287841B1 (en) * | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| US5340735A (en) * | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
| WO1993010248A1 (en) * | 1991-11-14 | 1993-05-27 | Novo Nordisk A/S | A PROCESS FOR EXPRESSING GENES IN $i(BACILLUS LICHENIFORMIS) |
| EP0571014B1 (en) * | 1992-05-18 | 2004-03-31 | Genencor International, Inc. | Bacteria producing alkaline proteases, and production of these alkaline proteases |
| US5621089A (en) * | 1992-05-27 | 1997-04-15 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Nucleic acid constructs for the production of a Bacillus alkaline protease |
| GB2279955B (en) | 1993-07-15 | 1998-02-18 | Solvay | Xylanase derived from a Bacillus species, expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof |
| DE4329463A1 (de) * | 1993-09-01 | 1995-03-02 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulate |
| DE4344215A1 (de) * | 1993-12-23 | 1995-06-29 | Cognis Bio Umwelt | Silberkorrosionsschutzmittelhaltige Enzymzubereitung |
| US5691295A (en) * | 1995-01-17 | 1997-11-25 | Cognis Gesellschaft Fuer Biotechnologie Mbh | Detergent compositions |
| ATE512226T1 (de) | 1994-02-24 | 2011-06-15 | Henkel Ag & Co Kgaa | Verbesserte enzyme und detergentien damit |
| ES2364774T3 (es) * | 1994-02-24 | 2011-09-14 | HENKEL AG & CO. KGAA | Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen. |
| DE4411223A1 (de) * | 1994-03-31 | 1995-10-05 | Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg | Verwendung alkalischer Proteasen in gewerblichen Textilwaschverfahren |
| DE4420730A1 (de) * | 1994-06-15 | 1995-12-21 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Desodorierung und Stabilisierung biotechnologisch gewonnener Wertstoffe und ihrer wäßrigen Zubereitungen |
| DE4422433A1 (de) * | 1994-06-28 | 1996-01-04 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulat |
| US5646044A (en) * | 1995-03-02 | 1997-07-08 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Expression systems for the production of target proteins in bacillus |
| US5888800A (en) * | 1995-08-10 | 1999-03-30 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Expression systems for commercial production of cellulase and xylanase in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis |
| DE19530816A1 (de) | 1995-08-23 | 1997-02-27 | Cognis Bio Umwelt | Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten |
| DE19535082A1 (de) | 1995-09-21 | 1997-03-27 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| DE19615776A1 (de) | 1996-04-20 | 1997-10-23 | Henkel Kgaa | Löslichkeitsverbessertes Enzymgranulat |
| DE19636035A1 (de) | 1996-09-05 | 1998-03-12 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| DE69723855T2 (de) * | 1996-11-18 | 2004-06-03 | Novozymes Biotech, Inc., Davis | Verfahren zur herstellung von polypeptiden in surfaktinmutanten von bacillus zellen |
| US5958728A (en) * | 1996-11-18 | 1999-09-28 | Novo Nordiskbiotech, Inc. | Methods for producing polypeptides in mutants of bacillus cells |
| DE19651446A1 (de) | 1996-12-11 | 1998-06-18 | Henkel Kgaa | Umhüllte Enzymzubereitung mit verbesserter Löslichkeit |
| DE19700327A1 (de) * | 1997-01-08 | 1998-07-09 | Henkel Kgaa | Protease- und amylasehaltiges Waschmittel |
| DE19703364A1 (de) | 1997-01-30 | 1998-08-06 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| US5955431A (en) * | 1997-02-05 | 1999-09-21 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Mast cell protease peptide inhibitors |
| DE19725508A1 (de) | 1997-06-17 | 1998-12-24 | Clariant Gmbh | Wasch- und Reinigungsmittel |
| DE19732749A1 (de) | 1997-07-30 | 1999-02-04 | Henkel Kgaa | Glucanasehaltiges Waschmittel |
| DE19732750A1 (de) | 1997-07-30 | 1999-02-04 | Henkel Kgaa | Glucanasehaltiges Reinigungsmittel für harte Oberflächen |
| DE19732751A1 (de) | 1997-07-30 | 1999-02-04 | Henkel Kgaa | Neue Beta-Glucanase aus Bacillus |
| DE19819187A1 (de) | 1998-04-30 | 1999-11-11 | Henkel Kgaa | Festes maschinelles Geschirrspülmittel mit Phosphat und kristallinen schichtförmigen Silikaten |
| DE19857687A1 (de) | 1998-12-15 | 2000-06-21 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Waschmittel |
| US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| KR20030037267A (ko) | 2000-07-28 | 2003-05-12 | 헨켈 코만디트게젤샤프트 아우프 악티엔 | 바실러스속 ａ ７－７ (ｄｓｍ １２３６８) 에서 추출한신규한 아밀분해 효소 및 상기 신규한 아밀분해 효소를함유하는 세척 및 세정제 |
| PL361363A1 (en) | 2000-11-28 | 2004-10-04 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Novel cyclodextrin glucanotransferase (cgtase), obtained from bacillus agaradherens (dsm 9948) and detergents and cleaning agents containing said novel cyclodextrin glucanotransferase |
| DE10121463A1 (de) * | 2001-05-02 | 2003-02-27 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten |
| DE10142124A1 (de) | 2001-08-30 | 2003-03-27 | Henkel Kgaa | Umhüllte Wirkstoffzubereitung für den Einsatz in teilchenförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln |
| DE10153792A1 (de) * | 2001-10-31 | 2003-05-22 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten |
| DE10162728A1 (de) * | 2001-12-20 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| DE10163748A1 (de) | 2001-12-21 | 2003-07-17 | Henkel Kgaa | Neue Glykosylhydrolasen |
| DE10163884A1 (de) | 2001-12-22 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| DE10163883A1 (de) * | 2001-12-22 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| WO2003062380A2 (en) * | 2002-01-16 | 2003-07-31 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
| DE10257387A1 (de) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Henkel Kgaa | Mehrkomponenten-Flüssigwaschmittel |
| DE10260903A1 (de) | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Henkel Kgaa | Neue Perhydrolasen |
| WO2004058931A1 (de) | 2002-12-20 | 2004-07-15 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Bleichmittelhaltige wasch- oder reinigungsmittel |
| DE10360805A1 (de) | 2003-12-23 | 2005-07-28 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| DE102004019751A1 (de) | 2004-04-23 | 2005-11-17 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Alkalischen Proteasen |
| DE102004048591A1 (de) * | 2004-04-27 | 2005-11-24 | Henkel Kgaa | Reinigungsmittel mit Klarspültensid und einer speziellen α-Amylase |
| DE102004047777B4 (de) | 2004-10-01 | 2018-05-09 | Basf Se | Alpha-Amylase-Varianten mit erhöhter Lösungsmittelstabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung |
| DE102004047776B4 (de) | 2004-10-01 | 2018-05-09 | Basf Se | Gegen Di- und/oder Multimerisierung stabilisierte Alpha-Amylase-Varianten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung |
| DE102005037659A1 (de) | 2005-08-05 | 2007-02-22 | Henkel Kgaa | Verwendung von Esterasen zur Spaltung von Kunststoffen |
| DE102005053529A1 (de) | 2005-11-08 | 2007-06-21 | Henkel Kgaa | System zur enzymatischen Generierung von Wasserstoffperoxid |
| DE102006038448A1 (de) | 2005-12-28 | 2008-02-21 | Henkel Kgaa | Enzym-haltiges Reinigungsmittel |
| DE102006055669A1 (de) | 2006-11-23 | 2008-07-17 | Henkel Kgaa | Enzymzubereitung mit trägergebundenen Antioxidationsmitteln |
| DE102007003143A1 (de) | 2007-01-16 | 2008-07-17 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| DE102007008655A1 (de) | 2007-02-20 | 2008-08-21 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Siderophor-Metall-Komplexe als Bleichkatalysatoren |
| DE102007010785A1 (de) | 2007-03-02 | 2008-09-04 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verwendung von Superoxid-Dismutasen in Wasch- und Reinigungsmitteln |
| DE102007011236A1 (de) | 2007-03-06 | 2008-09-11 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Carboxylgruppen tragende Benzophenon-oderBenzoesäureanilid-Derivate als Enzymstabilisatoren |
| DE102007017654A1 (de) | 2007-04-12 | 2008-10-16 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Bis(hydroxychinolin)-Metallkomplexe als Bleichkatalysatoren |
| DE102007017656A1 (de) | 2007-04-12 | 2008-10-16 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Biheteroaryl-Metallkomplexe als Bleichkatalysatoren |
| DE102007017657A1 (de) | 2007-04-12 | 2008-10-16 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Tris/heterocyclyl)-Metallkomplexe als Bleichkatalysatoren |
| DE102007032111B4 (de) | 2007-07-09 | 2017-07-20 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen |
| DE102007033104A1 (de) | 2007-07-13 | 2009-01-15 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Mittel enthaltend Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia |
| DE102007036756A1 (de) | 2007-08-03 | 2009-02-05 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Proteasen |
| DE102007038031A1 (de) | 2007-08-10 | 2009-06-04 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Mittel enthaltend Proteasen |
| DE102007040326A1 (de) | 2007-08-24 | 2009-02-26 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wäschevorbehandlungsmittel und -verfahren |
| DE102007044415A1 (de) | 2007-09-17 | 2009-03-19 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Leistungsverbesserte Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen |
| DE102007049830A1 (de) | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Neue Proteinvarianten durch zirkulare Permutation |
| DE102007051092A1 (de) | 2007-10-24 | 2009-04-30 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Subtilisin aus Becillus pumilus und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend dieses neue Subtilisin |
| DE102007053615A1 (de) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verbesserung der Duftwirkung von Riechstoff-Estern |
| DE102007057583A1 (de) | 2007-11-28 | 2009-06-04 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Waschmittel mit stabilisierten Enzymen |
| EP2100948A1 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-16 | The Procter and Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
| EP2100947A1 (en) | 2008-03-14 | 2009-09-16 | The Procter and Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
| DE102008017103A1 (de) | 2008-04-02 | 2009-10-08 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend Proteasen aus Xanthomonas |
| DE102008027375A1 (de) | 2008-06-09 | 2009-12-10 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Bacitracin-Metall-Komplexe als Bleichkatalysatoren |
| DE102008052529A1 (de) | 2008-10-21 | 2010-04-22 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Expressionsverstärkte Nukleinsäuren |
| DE102008062772A1 (de) | 2008-12-18 | 2010-06-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Desinfektion von Viren an Textilien und harten Oberflächen |
| EP2451923A1 (en) | 2009-07-09 | 2012-05-16 | The Procter & Gamble Company | Method of laundering fabric using a liquid laundry detergent composition |
| CN102471738B (zh) | 2009-07-09 | 2015-11-25 | 宝洁公司 | 包含苯二甲酰亚氨基过氧己酸的轻度碱性低复配固体织物处理洗涤剂组合物 |
| EP2451922A1 (en) | 2009-07-09 | 2012-05-16 | The Procter & Gamble Company | Method of laundering fabric using a compacted liquid laundry detergent composition |
| EP2451919A1 (en) | 2009-07-09 | 2012-05-16 | The Procter & Gamble Company | Method of laundering fabric using a liquid laundry detergent composition |
| DE102009033248A1 (de) | 2009-07-14 | 2010-05-06 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Waschmittel für die Niedrigtemperaturwäsche von hochfunktionellen Materialien |
| DE102009045064A1 (de) * | 2009-09-28 | 2011-03-31 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Stabilisierte enzymatische Zusammensetzung |
| MX2012006616A (es) | 2009-12-09 | 2012-06-21 | Procter & Gamble | Productos para el cuidado de las telas y el hogar. |
| DK2510094T3 (en) | 2009-12-09 | 2017-03-13 | Danisco Us Inc | COMPOSITIONS AND METHODS OF COMPREHENSIVE PROTEASE VARIETIES |
| ES2548772T3 (es) | 2009-12-10 | 2015-10-20 | The Procter & Gamble Company | Producto para lavavajillas y uso del mismo |
| ES2399311T5 (es) | 2009-12-10 | 2020-06-19 | Procter & Gamble | Composición detergente |
| EP2333041B1 (en) | 2009-12-10 | 2013-05-15 | The Procter & Gamble Company | Method and use of a dishwasher composition |
| ES2423580T5 (es) | 2009-12-10 | 2021-06-17 | Procter & Gamble | Método y uso de una composición para lavado de vajillas |
| EP2357220A1 (en) | 2010-02-10 | 2011-08-17 | The Procter & Gamble Company | Cleaning composition comprising amylase variants with high stability in the presence of a chelating agent |
| US9896673B2 (en) | 2010-02-10 | 2018-02-20 | Novozymes A/S | Compositions of high stability alpha amylase variants |
| DE102010002196A1 (de) | 2010-02-22 | 2011-11-17 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Kartusche für ein wasserführendes Haushaltsgerät |
| ES2401126T3 (es) | 2010-02-25 | 2013-04-17 | The Procter & Gamble Company | Composición detergente |
| EP2363456A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-07 | The Procter & Gamble Company | Solid laundry detergent composition comprising brightener in micronized particulate form |
| EP2380957A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-26 | The Procter & Gamble Company | Solid laundry detergent composition having a dynamic in-wash ph profile |
| EP2365058A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-14 | The Procter & Gamble Company | Solid laundry detergent composition having an excellent anti-encrustation profile |
| EP2365059A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-14 | The Procter & Gamble Company | Solid laundry detergent composition comprising C.I. fluorescent brightener 260 in alpha-crystalline form |
| EP2377914B1 (en) | 2010-04-19 | 2016-11-09 | The Procter & Gamble Company | Mildly alkaline, low-built, solid fabric treatment detergent composition comprising perhydrolase |
| EP2365054A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-14 | The Procter & Gamble Company | Solid laundry detergent composition comprising secondary alcohol-based detersive surfactant |
| US20120067373A1 (en) | 2010-04-15 | 2012-03-22 | Philip Frank Souter | Automatic Dishwashing Detergent Composition |
| US20110257069A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-20 | Stephen Joseph Hodson | Detergent composition |
| US8889612B2 (en) | 2010-04-19 | 2014-11-18 | The Procter & Gamble Company | Method of laundering fabric using a compacted liquid laundry detergent composition |
| US20110257060A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-20 | Robert Richard Dykstra | Laundry detergent composition comprising bleach particles that are suspended within a continuous liquid phase |
| US20110257062A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-20 | Robert Richard Dykstra | Liquid laundry detergent composition comprising a source of peracid and having a ph profile that is controlled with respect to the pka of the source of peracid |
| TR201810936T4 (tr) | 2010-04-23 | 2018-08-27 | Industrial Chemicals Group Ltd | Deterjan bileşimi. |
| ES2533368T3 (es) | 2010-04-23 | 2015-04-09 | The Procter & Gamble Company | Producto para lavavajillas |
| ES2579217T3 (es) | 2010-04-23 | 2016-08-08 | The Procter & Gamble Company | Partícula |
| EP2383329A1 (en) | 2010-04-23 | 2011-11-02 | The Procter & Gamble Company | Particle |
| ES2565192T3 (es) | 2010-04-23 | 2016-04-01 | The Procter & Gamble Company | Método para perfumar |
| PL2566960T3 (pl) | 2010-05-06 | 2017-08-31 | The Procter And Gamble Company | Produkty konsumenckie z odmianami proteaz |
| EP2395071A1 (en) | 2010-06-10 | 2011-12-14 | The Procter & Gamble Company | Solid detergent composition comprising lipase of bacterial origin |
| EP2395070A1 (en) | 2010-06-10 | 2011-12-14 | The Procter & Gamble Company | Liquid laundry detergent composition comprising lipase of bacterial origin |
| JP5710756B2 (ja) | 2010-06-23 | 2015-04-30 | ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー | 汚れた布地の前処理及び洗濯方法並びに洗濯用製品 |
| DE102010038499A1 (de) | 2010-07-27 | 2012-02-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Stabilisierte flüssige enzymhaltige Tensidzubereitung |
| DE102010038496A1 (de) | 2010-07-27 | 2012-02-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Stabilisierte flüssige enzymhaltige Tensidzubereitung |
| DE102010038498A1 (de) | 2010-07-27 | 2012-02-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Stabilisierte flüssige enzymhaltige Tensidzubereitung |
| DE102010038497A1 (de) | 2010-07-27 | 2012-02-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Stabilisierte flüssige enzymhaltige Tensidzubereitung |
| DE102010038502A1 (de) | 2010-07-27 | 2012-02-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Stabilisierte flüssige enzymhaltige Tensidzubereitung |
| DE102010038501A1 (de) | 2010-07-27 | 2012-02-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Stabilisierte flüssige enzymhaltige Tensidzubereitung |
| DE102010043934A1 (de) | 2010-11-15 | 2012-05-16 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Stabilisierte flüssige enzymhaltige Tensidzubereitung |
| DE102011007313A1 (de) | 2011-04-13 | 2012-10-18 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Expressionsverfahren |
| TR201901382T4 (tr) | 2011-05-05 | 2019-02-21 | Danisco Inc | Serin proteaz varyantlarını içeren bileşimler ve yöntemler. |
| EP2705145B1 (en) | 2011-05-05 | 2020-06-17 | The Procter and Gamble Company | Compositions and methods comprising serine protease variants |
| DE102011118032A1 (de) | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Expressionsvektoren zur verbesserten Proteinsekretion |
| US20140371435A9 (en) | 2011-06-03 | 2014-12-18 | Eduardo Torres | Laundry Care Compositions Containing Thiophene Azo Dyes |
| EP2537918A1 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-26 | The Procter & Gamble Company | Consumer products with lipase comprising coated particles |
| US20120324655A1 (en) | 2011-06-23 | 2012-12-27 | Nalini Chawla | Product for pre-treatment and laundering of stained fabric |
| EP2540824A1 (en) | 2011-06-30 | 2013-01-02 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions comprising amylase variants reference to a sequence listing |
| EP2551335A1 (en) | 2011-07-25 | 2013-01-30 | The Procter & Gamble Company | Enzyme stabilized liquid detergent composition |
| DE102011118027A1 (de) | 2011-09-12 | 2013-03-14 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verfahren zur Anpassung eines Hydrolytischen Enzyms an eine das hydrolytische Enzym stabilisierende Komponente |
| PL2584028T3 (pl) | 2011-10-19 | 2017-10-31 | Procter & Gamble | Cząstka |
| US20140342433A1 (en) | 2011-11-25 | 2014-11-20 | Novozymes A/S | Subtilase Variants and Polynucleotides Encoding Same |
| US9528107B2 (en) * | 2012-01-31 | 2016-12-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for selection of nucleic acids |
| DE102012201297A1 (de) | 2012-01-31 | 2013-08-01 | Basf Se | Expressionsverfahren |
| DE102012201522A1 (de) * | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Basf Se | Lagerstabiles flüssiges Geschirrspülmittel enthaltend Protease und Amylase |
| PL2623586T3 (pl) | 2012-02-03 | 2018-01-31 | Procter & Gamble | Kompozycje i sposoby dla obróbki powierzchniowej za pomocą lipaz |
| EP2628785B1 (en) | 2012-02-17 | 2016-05-18 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising subtilase variants |
| CN104114698A (zh) | 2012-02-17 | 2014-10-22 | 诺维信公司 | 枯草杆菌蛋白酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
| JP6203812B2 (ja) | 2012-03-19 | 2017-09-27 | ミリケン・アンド・カンパニーＭｉｌｌｉｋｅｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ | カルボキシレート染料 |
| US9909109B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-03-06 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| CN104302753A (zh) | 2012-05-16 | 2015-01-21 | 诺维信公司 | 包括脂肪酶的组合物及其使用方法 |
| EP2674475A1 (en) | 2012-06-11 | 2013-12-18 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition |
| AU2013279440B2 (en) | 2012-06-20 | 2016-10-06 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents |
| MX2015000312A (es) | 2012-07-12 | 2015-04-10 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad lipasa y polinucleotidos que los codifican. |
| CN104619838A (zh) | 2012-08-22 | 2015-05-13 | 诺维信公司 | 来自微小杆菌属的金属蛋白酶 |
| EP2888358A1 (en) | 2012-08-22 | 2015-07-01 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising metalloproteases |
| US9315791B2 (en) | 2012-08-22 | 2016-04-19 | Novozymes A/S | Metalloproteases from alicyclobacillus |
| WO2014068083A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Novozymes A/S | Method for removal of dna |
| TR201910918T4 (tr) | 2012-12-07 | 2019-08-21 | Novozymes As | Bakterilerin yapışmasının önlenmesi. |
| CA2895328A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition with silicate coated bleach |
| US9551042B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-01-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
| WO2014106593A1 (en) | 2013-01-03 | 2014-07-10 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| JP6251296B2 (ja) | 2013-03-05 | 2017-12-20 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 混合糖組成物 |
| JP6742234B2 (ja) | 2013-03-15 | 2020-08-19 | ルブリゾル アドバンスド マテリアルズ， インコーポレイテッド | イタコン酸ポリマー |
| US9631164B2 (en) | 2013-03-21 | 2017-04-25 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| HUE043499T2 (hu) | 2013-03-28 | 2019-09-30 | Procter & Gamble | Poliéteramin-tartalmú tiszítószerek |
| MY192746A (en) | 2013-05-14 | 2022-09-06 | Novozymes As | Detergent compositions |
| CN105209613A (zh) | 2013-05-17 | 2015-12-30 | 诺维信公司 | 具有α淀粉酶活性的多肽 |
| MX2015016438A (es) | 2013-05-28 | 2016-03-01 | Procter & Gamble | Composiciones que comprenden tintes fotocromicos para el tratamiento de superficies. |
| EP3004315A2 (en) | 2013-06-06 | 2016-04-13 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3013955A1 (en) | 2013-06-27 | 2016-05-04 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| CN105874067A (zh) | 2013-06-27 | 2016-08-17 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
| US20160152925A1 (en) | 2013-07-04 | 2016-06-02 | Novozymes A/S | Polypeptides Having Anti-Redeposition Effect and Polynucleotides Encoding Same |
| CN105339492A (zh) | 2013-07-09 | 2016-02-17 | 诺维信公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 |
| WO2015014790A2 (en) | 2013-07-29 | 2015-02-05 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
| WO2015014803A1 (en) | 2013-07-29 | 2015-02-05 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
| US9834682B2 (en) | 2013-09-18 | 2017-12-05 | Milliken & Company | Laundry care composition comprising carboxylate dye |
| CA2921432A1 (en) | 2013-09-18 | 2015-03-26 | The Procter & Gamble Company | Laundry care composition comprising carboxylate dye |
| EP3047010B1 (en) | 2013-09-18 | 2018-05-09 | The Procter and Gamble Company | Laundry care compositions containing thiophene azo carboxylate dyes |
| CA2921433A1 (en) | 2013-09-18 | 2015-03-26 | The Procter & Gamble Company | Laundry care composition comprising carboxylate dye |
| WO2015042013A1 (en) | 2013-09-18 | 2015-03-26 | Lubrizol Advanced Materials, Inc. | Stable linear polymers |
| WO2015049370A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Novozymes A/S | Detergent composition and use of detergent composition |
| US10030239B2 (en) | 2013-12-20 | 2018-07-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
| WO2015112339A1 (en) | 2014-01-22 | 2015-07-30 | The Procter & Gamble Company | Fabric treatment composition |
| US10208297B2 (en) | 2014-01-22 | 2019-02-19 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same for cleaning |
| WO2015112340A1 (en) | 2014-01-22 | 2015-07-30 | The Procter & Gamble Company | Method of treating textile fabrics |
| WO2015112341A1 (en) | 2014-01-22 | 2015-07-30 | The Procter & Gamble Company | Fabric treatment composition |
| WO2015112338A1 (en) | 2014-01-22 | 2015-07-30 | The Procter & Gamble Company | Method of treating textile fabrics |
| EP3110779A1 (en) | 2014-02-25 | 2017-01-04 | The Procter & Gamble Company | A process for making renewable surfactant intermediates and surfactants from fats and oils and products thereof |
| US10752562B2 (en) | 2014-02-25 | 2020-08-25 | The Procter & Gamble Company | Process for making renewable surfactant intermediates and surfactants from fats and oils and products thereof |
| CN106232791B (zh) | 2014-02-26 | 2019-12-10 | 宝洁公司 | 包含烷氧基化的聚亚烷基亚胺、有机改性的硅氧烷和基于硅氧烷的稀释剂的清洁组合物 |
| WO2015134737A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Novozymes A/S | Compositions and methods for improving properties of cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase |
| WO2015134729A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Novozymes A/S | Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase |
| EP3117001B1 (en) | 2014-03-12 | 2019-02-20 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| CN106574018A (zh) | 2014-03-14 | 2017-04-19 | 路博润先进材料公司 | 衣康酸聚合物和共聚物 |
| US20150275143A1 (en) | 2014-03-27 | 2015-10-01 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions containing a polyetheramine |
| JP6275864B2 (ja) | 2014-03-27 | 2018-02-07 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | ポリエーテルアミンを含有する洗浄組成物 |
| EP2924105A1 (en) | 2014-03-28 | 2015-09-30 | The Procter and Gamble Company | Water soluble unit dose article |
| EP2924107A1 (en) | 2014-03-28 | 2015-09-30 | The Procter and Gamble Company | Water soluble unit dose article |
| EP3126479A1 (en) | 2014-04-01 | 2017-02-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
| DK3129457T3 (en) | 2014-04-11 | 2018-09-17 | Novozymes As | detergent |
| US10030215B2 (en) | 2014-04-15 | 2018-07-24 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| JP2017518407A (ja) | 2014-05-06 | 2017-07-06 | ミリケン・アンド・カンパニーＭｉｌｌｉｋｅｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ | ランドリーケア組成物 |
| DE102014209241A1 (de) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und Reinigungsmittel mit erhöhter Bleichleistung |
| AR100606A1 (es) | 2014-05-27 | 2016-10-19 | Novozymes As | Variantes de lipasas y polinucleótidos que las codifican |
| EP3878957A1 (en) | 2014-05-27 | 2021-09-15 | Novozymes A/S | Methods for producing lipases |
| WO2015187757A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-10 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising polyalkyleneimine polymers |
| EP3155097A1 (en) | 2014-06-12 | 2017-04-19 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| BR112017000102B1 (pt) | 2014-07-04 | 2023-11-07 | Novozymes A/S | Variantes de subtilase de uma subtilase progenitora, composição detergente, uso da mesma e método para a produção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease |
| WO2016001450A2 (en) | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| US20170283748A1 (en) | 2014-09-10 | 2017-10-05 | Basf Se | Encapsulated cleaning composition |
| US9617502B2 (en) | 2014-09-15 | 2017-04-11 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions containing salts of polyetheramines and polymeric acid |
| JP6396583B2 (ja) | 2014-09-25 | 2018-09-26 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | ポリエーテルアミンを含有する洗浄組成物 |
| US20160090552A1 (en) | 2014-09-25 | 2016-03-31 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions containing a polyetheramine and an anionic soil release polymer |
| US9388368B2 (en) | 2014-09-26 | 2016-07-12 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions containing a polyetheramine |
| JP6656245B2 (ja) | 2014-11-14 | 2020-03-04 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ | シリコーン化合物 |
| DE102014223296A1 (de) | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend mindestens zwei Proteasen |
| JP2018501331A (ja) | 2014-11-17 | 2018-01-18 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 有益剤送達組成物 |
| WO2016079110A2 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Novozymes A/S | Use of enzyme for cleaning |
| DE102014223969A1 (de) | 2014-11-25 | 2016-05-25 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verwendung von Molkenproteinisolat in enzymhaltigen Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Erhöhung der Stabilität von Enzymen |
| CN107075493B (zh) | 2014-12-04 | 2020-09-01 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
| CN116286218A (zh) | 2014-12-04 | 2023-06-23 | 诺维信公司 | 包括蛋白酶变体的液体清洁组合物 |
| EP4067485A3 (en) | 2014-12-05 | 2023-01-04 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| CN107002058A (zh) | 2014-12-15 | 2017-08-01 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体 |
| US10760036B2 (en) | 2014-12-15 | 2020-09-01 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent composition comprising subtilase variants |
| WO2016096996A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having n-acetyl glucosamine oxidase activity |
| DE102014226251A1 (de) | 2014-12-17 | 2016-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verwendung anorganischer Oxide, Hydroxide oder Oxidhydroxide in enzymhaltigen Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Erhöhung der Stabilität von Enzymen |
| ES2813727T3 (es) | 2014-12-19 | 2021-03-24 | Novozymes As | Variantes de proteasa y polinucleótidos que las codifican |
| WO2016097352A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
| EP3070155A1 (de) | 2015-03-18 | 2016-09-21 | Evonik Degussa GmbH | Zusammensetzung enthaltend peptidase und biotensid |
| US20160289600A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | The Procter & Gamble Company | Solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| EP3075831A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-05 | The Procter and Gamble Company | Solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| EP3075826B1 (en) | 2015-03-30 | 2018-01-31 | The Procter and Gamble Company | Solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| RU2668718C1 (ru) | 2015-03-30 | 2018-10-02 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Твердая композиция моющего средства для стирки из легкосыпучих частиц |
| CN107438658B (zh) | 2015-03-30 | 2020-04-21 | 宝洁公司 | 自由流动的固体颗粒状衣物洗涤剂组合物 |
| US20160289609A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | The Procter & Gamble Company | Solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| EP3075824B1 (en) | 2015-03-30 | 2018-02-21 | The Procter and Gamble Company | Solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| EP3075823A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-05 | The Procter and Gamble Company | A spray-dried laundry detergent base particle |
| PL3075827T3 (pl) | 2015-03-30 | 2018-08-31 | The Procter & Gamble Company | Stała sypka rozdrobniona kompozycja detergentowa do prania |
| RU2669797C1 (ru) | 2015-04-02 | 2018-10-16 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Твердая композиция моющего средства для стирки из легкосыпучих частиц |
| EP3075834B1 (en) | 2015-04-02 | 2018-02-07 | The Procter and Gamble Company | Solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| WO2016161219A1 (en) | 2015-04-02 | 2016-10-06 | The Procter & Gamble Company | Solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| EP3280791A1 (en) | 2015-04-10 | 2018-02-14 | Novozymes A/S | Laundry method, use of dnase and detergent composition |
| US20180105772A1 (en) | 2015-04-10 | 2018-04-19 | Novozymes A/S | Detergent composition |
| ES2682178T3 (es) | 2015-04-29 | 2018-09-19 | The Procter & Gamble Company | Composición detergente |
| DK3088503T3 (en) | 2015-04-29 | 2018-08-20 | Procter & Gamble | PROCEDURE FOR TREATING A TEXTILE SUBSTANCE |
| JP6545822B2 (ja) | 2015-04-29 | 2019-07-17 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ | 布地の処理方法 |
| WO2016176240A1 (en) | 2015-04-29 | 2016-11-03 | The Procter & Gamble Company | Method of treating a fabric |
| CN107548415A (zh) | 2015-04-29 | 2018-01-05 | 宝洁公司 | 洗涤织物的方法 |
| WO2016178668A1 (en) | 2015-05-04 | 2016-11-10 | Milliken & Company | Leuco triphenylmethane colorants as bluing agents in laundry care compositions |
| CN107835853B (zh) | 2015-05-19 | 2021-04-20 | 诺维信公司 | 气味减少 |
| BR112017025607B1 (pt) | 2015-06-02 | 2022-08-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
| ES2670044T3 (es) | 2015-06-04 | 2018-05-29 | The Procter & Gamble Company | Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano |
| EP3101108B1 (en) | 2015-06-04 | 2018-01-31 | The Procter and Gamble Company | Hand dishwashing liquid detergent composition |
| EP3101103B1 (en) | 2015-06-05 | 2019-04-24 | The Procter and Gamble Company | Compacted liquid laundry detergent composition |
| WO2016198262A1 (en) | 2015-06-11 | 2016-12-15 | Unilever Plc | Laundry detergent composition |
| US10858637B2 (en) | 2015-06-16 | 2020-12-08 | Novozymes A/S | Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same |
| US10717576B2 (en) | 2015-06-17 | 2020-07-21 | Novozymes A/S | Container for polypeptide |
| EP3106508B1 (en) | 2015-06-18 | 2019-11-20 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising subtilase variants |
| WO2016202839A2 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| CN107810260B (zh) | 2015-06-26 | 2020-07-17 | 荷兰联合利华有限公司 | 洗衣洗涤剂组合物 |
| CN107922896A (zh) | 2015-06-30 | 2018-04-17 | 诺维信公司 | 衣物洗涤剂组合物、用于洗涤的方法和组合物的用途 |
| CA3175255A1 (en) | 2015-07-01 | 2017-01-05 | Novozymes A/S | Methods of reducing odor |
| EP3320089B1 (en) | 2015-07-06 | 2021-06-16 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| AU2016323412B2 (en) | 2015-09-17 | 2021-04-01 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent compositions comprising polypeptides having xanthan degrading activity |
| CA2991114A1 (en) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| DE102015217816A1 (de) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verwendung hochkonzentrierter Enzymgranulate zur Erhöhung der Lagerstabilität von Enzymen |
| EP3153426B1 (en) | 2015-10-06 | 2018-07-18 | The Procter & Gamble Company | Flexible box bag comprising soluble unit dose detergent pouch |
| EP3153425B1 (en) | 2015-10-06 | 2018-07-04 | The Procter and Gamble Company | Flexible box bag comprising detergent powder and a scoop |
| EP3359658A2 (en) | 2015-10-07 | 2018-08-15 | Novozymes A/S | Polypeptides |
| US10675589B2 (en) | 2015-10-14 | 2020-06-09 | Novozymes A/S | Cleaning of water filtration membranes |
| WO2017064269A1 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| US20180171318A1 (en) | 2015-10-14 | 2018-06-21 | Novozymes A/S | Polypeptides Having Protease Activity and Polynucleotides Encoding Same |
| US11028346B2 (en) | 2015-10-28 | 2021-06-08 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising protease and amylase variants |
| CN108473974A (zh) | 2015-11-24 | 2018-08-31 | 诺维信公司 | 具有蛋白酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸 |
| DE102015223269A1 (de) | 2015-11-25 | 2017-06-01 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verwendung von Polyoxyalkylenaminen in enzymhaltigen Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Erhöhung der Stabilität von Enzymen |
| MX2018006475A (es) | 2015-11-26 | 2018-09-28 | Procter & Gamble | Composiciones detergentes liquidas que comprenden proteasa y lipasa encapsulada. |
| CN108431217B (zh) | 2015-12-01 | 2022-06-21 | 诺维信公司 | 用于产生脂肪酶的方法 |
| CA3003536A1 (en) | 2015-12-07 | 2017-06-15 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
| US20210171927A1 (en) | 2016-01-29 | 2021-06-10 | Novozymes A/S | Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same |
| JP6665307B2 (ja) | 2016-02-02 | 2020-03-13 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ | 組成物 |
| WO2017136370A1 (en) | 2016-02-02 | 2017-08-10 | The Procter & Gamble Company | Compositions containing antifoams |
| EP3417040B1 (en) | 2016-02-17 | 2019-09-04 | Unilever PLC | Whitening composition |
| KR20180117701A (ko) | 2016-03-09 | 2018-10-29 | 바스프 에스이 | 캡슐형 세탁용 세정 조성물 |
| BR112018068068B1 (pt) | 2016-03-21 | 2023-04-18 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição aquosa líquida de detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
| BR112018069220A2 (pt) | 2016-03-23 | 2019-01-22 | Novozymes As | uso de polipeptídeo que tem atividade de dnase para tratamento de tecidos |
| CN109312270B (zh) | 2016-04-08 | 2022-01-28 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
| BR112018070468B1 (pt) | 2016-04-08 | 2022-07-12 | Unilever Ip Holdings B.V | Composição de detergente líquida aquosa para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido |
| EP3693449A1 (en) | 2016-04-29 | 2020-08-12 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
| EP3556834B1 (en) | 2016-05-09 | 2020-10-14 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising a fatty acid decarboxylase |
| ES2721224T3 (es) | 2016-05-09 | 2019-07-29 | Procter & Gamble | Composición detergente que comprende una enzima transformadora de ácido oleico |
| EP3540036B1 (en) | 2016-05-09 | 2020-11-18 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising a fatty acid lipoxygenase |
| WO2017196762A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | The Procter & Gamble Company | Silicone compounds |
| EP3455284A1 (en) | 2016-05-13 | 2019-03-20 | The Procter and Gamble Company | Silicone compounds |
| CN109563450A (zh) | 2016-05-31 | 2019-04-02 | 诺维信公司 | 稳定的液体过氧化物组合物 |
| WO2017207762A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3475404A1 (en) | 2016-06-23 | 2019-05-01 | Novozymes A/S | Use of enzymes, composition and method for removing soil |
| CN117721095A (zh) | 2016-06-30 | 2024-03-19 | 诺维信公司 | 脂肪酶变体及包含表面活性剂和脂肪酶变体的组合物 |
| WO2018002261A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
| WO2018007573A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions with galactanase |
| WO2018011276A1 (en) | 2016-07-13 | 2018-01-18 | The Procter & Gamble Company | Bacillus cibi dnase variants and uses thereof |
| EP3269729B1 (en) | 2016-07-14 | 2019-08-21 | The Procter and Gamble Company | Detergent composition |
| US11326152B2 (en) | 2016-07-18 | 2022-05-10 | Novozymes A/S | Lipase variants, polynucleotides encoding same and the use thereof |
| US20190177665A1 (en) | 2016-08-08 | 2019-06-13 | Basf Se | Liquid laundry formulation |
| EP3284805B1 (en) | 2016-08-17 | 2020-02-19 | The Procter & Gamble Company | Cleaning composition comprising enzymes |
| WO2018060475A1 (en) | 2016-09-29 | 2018-04-05 | Novozymes A/S | Spore containing granule |
| WO2018060216A1 (en) | 2016-09-29 | 2018-04-05 | Novozymes A/S | Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition |
| RU2716130C9 (ru) | 2016-10-03 | 2020-05-21 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Композиция моющего средства для стирки |
| HUE046500T2 (hu) | 2016-10-03 | 2020-02-28 | Procter & Gamble | Mosószerkészítmény |
| RU2709518C1 (ru) | 2016-10-03 | 2019-12-18 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Композиция моющего средства для стирки с низким показателем ph |
| US20180094220A1 (en) | 2016-10-03 | 2018-04-05 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| PL3301157T3 (pl) | 2016-10-03 | 2020-09-07 | The Procter & Gamble Company | Kompozycja detergentu piorącego o niskim ph |
| EP3301155A1 (en) | 2016-10-03 | 2018-04-04 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| RU2715886C1 (ru) | 2016-10-03 | 2020-03-04 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Композиция моющего средства для стирки с низким показателем ph |
| CN109715774B (zh) | 2016-10-03 | 2021-10-01 | 宝洁公司 | 低pH衣物洗涤剂组合物 |
| PL3301152T3 (pl) | 2016-10-03 | 2022-06-13 | The Procter & Gamble Company | Suszona rozpyłowo cząstka detergentu nadająca niskie ph w kąpieli piorącej |
| EP3309244A1 (en) | 2016-10-11 | 2018-04-18 | Basf Se | Low temperature protease |
| WO2018069158A1 (en) | 2016-10-11 | 2018-04-19 | Basf Se | Protease resistant to natural inhibitors |
| EP3532592A1 (en) | 2016-10-25 | 2019-09-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
| US20180119070A1 (en) | 2016-11-01 | 2018-05-03 | The Procter & Gamble Company | Leuco colorants as bluing agents in laundry care compositions, packaging, kits and methods thereof |
| JP2019535857A (ja) | 2016-11-01 | 2019-12-12 | ミリケン・アンド・カンパニーＭｉｌｌｉｋｅｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ | 洗濯ケア組成物における青味剤としてのロイコ着色剤 |
| MX2019005120A (es) | 2016-11-01 | 2019-06-20 | Procter & Gamble | Colorantes leuco como agentes de azulado en composiciones para el cuidado de la ropa. |
| US11753605B2 (en) | 2016-11-01 | 2023-09-12 | Novozymes A/S | Multi-core granules |
| US20180119056A1 (en) | 2016-11-03 | 2018-05-03 | Milliken & Company | Leuco Triphenylmethane Colorants As Bluing Agents in Laundry Care Compositions |
| KR20190086540A (ko) | 2016-12-01 | 2019-07-22 | 바스프 에스이 | 조성물 중 효소의 안정화 |
| WO2018102479A1 (en) | 2016-12-02 | 2018-06-07 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions including enzymes |
| MX2019006421A (es) | 2016-12-02 | 2019-08-01 | Procter & Gamble | Composiciones de limpieza que incluyen enzimas. |
| US10550443B2 (en) | 2016-12-02 | 2020-02-04 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions including enzymes |
| EP3551740B1 (en) | 2016-12-12 | 2021-08-11 | Novozymes A/S | Use of polypeptides |
| CN110023469A (zh) | 2016-12-15 | 2019-07-16 | 荷兰联合利华有限公司 | 洗衣洗涤剂组合物 |
| EP3339417A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339407A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339416A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339414A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339413A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339419A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339415A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339422B1 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-21 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339421A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3339418A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| CA3051426C (en) | 2017-02-01 | 2023-10-17 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions comprising amylase variants |
| US11208639B2 (en) | 2017-03-31 | 2021-12-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having DNase activity |
| EP3601549A1 (en) | 2017-03-31 | 2020-02-05 | Novozymes A/S | Polypeptides having dnase activity |
| WO2018178061A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Novozymes A/S | Polypeptides having rnase activity |
| EP3607039A1 (en) | 2017-04-04 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Polypeptides |
| WO2018185181A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Glycosyl hydrolases |
| WO2018185152A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Polypeptide compositions and uses thereof |
| DK3385361T3 (da) | 2017-04-05 | 2019-06-03 | Ab Enzymes Gmbh | Detergentsammensætninger omfattende bakterielle mannanaser |
| EP3385362A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-10 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising fungal mannanases |
| BR112019020960A2 (pt) | 2017-04-06 | 2020-05-05 | Novozymes As | composições de limpeza e seus usos |
| US20200190437A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-06-18 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| EP3607042A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| US10968416B2 (en) | 2017-04-06 | 2021-04-06 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2018184818A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| EP3967756A1 (en) | 2017-04-06 | 2022-03-16 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
| EP3626809A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-03-25 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| EP3607043A1 (en) | 2017-04-06 | 2020-02-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2018202846A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Novozymes A/S | Compositions comprising lipase and sulfite |
| WO2018224544A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Novozymes A/S | Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions |
| EP3415592A1 (en) | 2017-06-15 | 2018-12-19 | The Procter & Gamble Company | Water-soluble unit dose article comprising a solid laundry detergent composition |
| WO2019002356A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Novozymes A/S | ENZYMATIC SUSPENSION COMPOSITION |
| US20200181627A1 (en) | 2017-07-21 | 2020-06-11 | Basf Se | Promoter for heterologous expression |
| EP3655528A1 (en) | 2017-07-21 | 2020-05-27 | Basf Se | Method of transforming bacterial cells |
| DE102017215015A1 (de) | 2017-08-28 | 2019-02-28 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verfahren zur verbesserten Expression von Enzymen |
| US20200277553A1 (en) | 2017-09-20 | 2020-09-03 | Novozymes A/S | Use of Enzymes for Improving Water Absorption And/Or Whiteness |
| EP3684899A1 (en) | 2017-09-22 | 2020-07-29 | Novozymes A/S | Novel polypeptides |
| CA3073362A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-04 | Novozymes A/S | Lipase variants and microcapsule compositions comprising such lipase variants |
| US11286443B2 (en) | 2017-09-27 | 2022-03-29 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising lipases |
| US11732221B2 (en) | 2017-10-02 | 2023-08-22 | Novozymes A/S | Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same |
| US11746310B2 (en) | 2017-10-02 | 2023-09-05 | Novozymes A/S | Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same |
| EP3694973A1 (en) | 2017-10-12 | 2020-08-19 | The Procter & Gamble Company | Leuco colorants as bluing agents in laundry care compositions |
| CA3074613A1 (en) | 2017-10-12 | 2019-04-18 | The Procter & Gamble Company | Leuco colorants in combination with a second whitening agent as bluing agents in laundry care compositions |
| JP6993503B2 (ja) | 2017-10-12 | 2022-01-13 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 洗濯ケア組成物中の青味剤としてのロイコ着色剤 |
| TWI715878B (zh) | 2017-10-12 | 2021-01-11 | 美商美力肯及公司 | 隱色著色劑及組成物 |
| WO2019076800A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
| EP3697881A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | Novozymes A/S | Low dusting granules |
| WO2019076834A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Novozymes A/S | PELLETS WITH LOW DUST CONTENT |
| WO2019081515A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Novozymes A/S | COMPOSITIONS COMPRISING POLYPEPTIDES HAVING MANNANASE ACTIVITY |
| US10781408B2 (en) | 2017-10-27 | 2020-09-22 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising polypeptide variants |
| US11441136B2 (en) | 2017-10-27 | 2022-09-13 | Novozymes A/S | DNase variants |
| US11053392B2 (en) | 2017-11-01 | 2021-07-06 | Milliken & Company | Leuco compounds, colorant compounds, and compositions containing the same |
| DE102017125558A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten |
| WO2019086532A1 (en) | 2017-11-01 | 2019-05-09 | Novozymes A/S | Methods for cleaning medical devices |
| CN111479919A (zh) | 2017-11-01 | 2020-07-31 | 诺维信公司 | 多肽以及包含此类多肽的组合物 |
| DE102017125560A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten |
| EP3704219B1 (en) | 2017-11-01 | 2024-01-10 | Novozymes A/S | Polypeptides and compositions comprising such polypeptides |
| DE102017125559A1 (de) | 2017-11-01 | 2019-05-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten |
| WO2019105781A1 (en) | 2017-11-29 | 2019-06-06 | Basf Se | Storage-stable enzyme preparations, their production and use |
| WO2019110462A1 (en) | 2017-12-04 | 2019-06-13 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3502245A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-26 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
| EP3502246A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-26 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
| EP3502244A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-26 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
| EP3502227A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-26 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
| WO2019147533A1 (en) | 2018-01-26 | 2019-08-01 | The Procter & Gamble Company | Water-soluble unit dose articles comprising enzyme |
| EP3749760A1 (en) | 2018-02-08 | 2020-12-16 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions thereof |
| CN111868239A (zh) | 2018-02-08 | 2020-10-30 | 诺维信公司 | 脂肪酶、脂肪酶变体及其组合物 |
| CN111801409A (zh) | 2018-02-28 | 2020-10-20 | 宝洁公司 | 清洁组合物 |
| CN111684056A (zh) | 2018-02-28 | 2020-09-18 | 宝洁公司 | 清洁方法 |
| EP3768835A1 (en) | 2018-03-23 | 2021-01-27 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
| EP3546559A1 (en) | 2018-03-28 | 2019-10-02 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3546557B1 (en) | 2018-03-28 | 2020-10-07 | The Procter & Gamble Company | Catalase inhibition during a laundering process |
| EP3546554A1 (en) | 2018-03-28 | 2019-10-02 | The Procter & Gamble Company | Spray-drying process |
| WO2019191171A1 (en) | 2018-03-28 | 2019-10-03 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3546558A1 (en) | 2018-03-28 | 2019-10-02 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP3546555A1 (en) | 2018-03-28 | 2019-10-02 | The Procter & Gamble Company | Process for preparing a spray-dried laundry detergent particle |
| EP3546556B1 (en) | 2018-03-28 | 2021-03-10 | The Procter & Gamble Company | Process for preparing a spray-dried laundry detergent particle |
| CN112262207B (zh) | 2018-04-17 | 2024-01-23 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物中包含碳水化合物结合活性的多肽及其在减少纺织品或织物中的褶皱的用途 |
| US11661592B2 (en) | 2018-04-19 | 2023-05-30 | Novozymes A/S | Stabilized endoglucanase variants |
| US11566239B2 (en) | 2018-04-19 | 2023-01-31 | Novozymes A/S | Stabilized cellulase variants |
| CN112368375A (zh) | 2018-04-26 | 2021-02-12 | 巴斯夫欧洲公司 | 脂肪酶 |
| US20210115422A1 (en) | 2018-05-03 | 2021-04-22 | Basf Se | Amylase enzymes |
| WO2019238761A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Basf Se | Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes |
| EP3810768A1 (en) | 2018-06-19 | 2021-04-28 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
| CN112204138A (zh) | 2018-06-19 | 2021-01-08 | 宝洁公司 | 自动盘碟洗涤剂组合物 |
| CA3207822A1 (en) | 2018-06-20 | 2019-12-26 | The Procter & Gamble Company | A fabric care or home care product comprising polysaccharide derivatives |
| EP3814472A1 (en) | 2018-06-28 | 2021-05-05 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
| WO2020002608A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
| WO2020002255A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
| EP3818139A1 (en) | 2018-07-02 | 2021-05-12 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2020007875A1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2020008024A1 (en) | 2018-07-06 | 2020-01-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| US20210253981A1 (en) | 2018-07-06 | 2021-08-19 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| EP3594319B1 (en) | 2018-07-12 | 2021-05-05 | The Procter & Gamble Company | A solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| US20200032178A1 (en) | 2018-07-27 | 2020-01-30 | The Procter & Gamble Company | Water-soluble unit dose articles comprising water-soluble fibrous structures and particles |
| WO2020030623A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Basf Se | Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent |
| WO2020070063A2 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Detergent compositions and uses thereof |
| WO2020070014A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity |
| EP3861110A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-08-11 | Novozymes A/S | Endonuclease 1 ribonucleases for cleaning |
| EP3861094A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-08-11 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
| WO2020070209A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning composition |
| WO2020070249A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Cleaning compositions |
| WO2020070199A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| EP3677676A1 (en) | 2019-01-03 | 2020-07-08 | Basf Se | Compounds stabilizing amylases in liquids |
| BR112021006317A2 (pt) | 2018-10-05 | 2021-07-06 | Basf Se | preparação de enzima, processo para preparar uma preparação de enzima estável, métodos para reduzir perda da atividade amiolítica, de preparação de uma formulação detergente, para remover manchas sensíveis à amilase e para aumentar a estabilidade no armazenamento de uma formulação detergente líquida, usos de um composto e da preparação de enzima, e, formulação detergente |
| MX2021003930A (es) | 2018-10-05 | 2021-06-04 | Basf Se | Compuestos estabilizadores de hidrolasas en liquidos. |
| US20210395651A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-12-23 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
| CN112996894A (zh) | 2018-10-11 | 2021-06-18 | 诺维信公司 | 清洁组合物及其用途 |
| EP3647398B1 (en) | 2018-10-31 | 2024-05-15 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions containing dispersins v |
| EP3647397A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-06 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions containing dispersins iv |
| WO2020104231A1 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Basf Se | Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme |
| US20220017844A1 (en) | 2018-12-03 | 2022-01-20 | Novozymes A/S | Low pH Powder Detergent Composition |
| US20220056379A1 (en) | 2018-12-03 | 2022-02-24 | Novozymes A/S | Powder Detergent Compositions |
| CN113366103A (zh) | 2018-12-21 | 2021-09-07 | 诺维信公司 | 具有肽聚糖降解活性的多肽以及编码其的多核苷酸 |
| EP3898919A1 (en) | 2018-12-21 | 2021-10-27 | Novozymes A/S | Detergent pouch comprising metalloproteases |
| EP3927837A1 (en) | 2019-02-20 | 2021-12-29 | Basf Se | Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed |
| US20220186234A1 (en) | 2019-02-20 | 2022-06-16 | Basf Se | Industrial Fermentation Process for Bacillus Using Defined Medium and Trace Element Feed |
| EP3702452A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Detergent compositions comprising two proteases |
| CA3127171A1 (en) | 2019-03-14 | 2020-09-17 | The Procter & Gamble Company | Method for treating cotton |
| EP3938502A1 (en) | 2019-03-14 | 2022-01-19 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions comprising enzymes |
| CN113439116B (zh) | 2019-03-14 | 2023-11-28 | 宝洁公司 | 包含酶的清洁组合物 |
| US20220235341A1 (en) | 2019-03-21 | 2022-07-28 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| MX2021011981A (es) | 2019-04-03 | 2021-11-03 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de beta-glucanasa, polinucleotidos que los codifican y usos de los mismos en composiciones de limpieza y de detergente. |
| EP3953462A1 (en) | 2019-04-10 | 2022-02-16 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| EP3953463A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-02-16 | Novozymes A/S | Stabilized glycoside hydrolase variants |
| WO2020222996A1 (en) | 2019-04-29 | 2020-11-05 | The Procter & Gamble Company | A process for making a laundry detergent composition |
| WO2020229480A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
| EP3741283A1 (en) | 2019-05-22 | 2020-11-25 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing method |
| WO2020243738A1 (en) | 2019-05-24 | 2020-12-03 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
| MX2021015364A (es) | 2019-06-13 | 2022-01-24 | Basf Se | Metodo de recuperacion de una proteina de un caldo de fermentacion mediante el uso de un cation divalente. |
| EP3754010A1 (en) | 2019-06-17 | 2020-12-23 | The Procter & Gamble Company | A solid free-flowing particulate laundry detergent composition comprises a detersive surfactant and a linear polyamine salt |
| CN114040972A (zh) | 2019-06-24 | 2022-02-11 | 宝洁公司 | 包含淀粉酶变体的清洁组合物 |
| WO2021001244A1 (en) | 2019-07-01 | 2021-01-07 | Basf Se | Peptide acetals for stabilising enzymes |
| WO2021001297A1 (en) | 2019-07-02 | 2021-01-07 | Basf Se | Method for preparing a fermentation medium |
| EP3994255A1 (en) | 2019-07-02 | 2022-05-11 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions thereof |
| WO2021004830A1 (en) | 2019-07-05 | 2021-01-14 | Basf Se | Industrial fermentation process for microbial cells using a fed-batch pre-culture |
| EP3997202A1 (en) | 2019-07-12 | 2022-05-18 | Novozymes A/S | Enzymatic emulsions for detergents |
| EP3770238A1 (de) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Henkel AG & Co. KGaA | Wasch- und reinigungsmittel mit protease und amylase |
| EP3770240A1 (de) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Henkel AG & Co. KGaA | Geschirrspülmittel mit bleichkatalysator und bacillus gibsonii protease |
| EP3770237A1 (de) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Henkel AG & Co. KGaA | Wasch- und reinigungsmittel mit verbesserter enzym-stabilität |
| WO2021037878A1 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase |
| US20220325204A1 (en) | 2019-08-27 | 2022-10-13 | Novozymes A/S | Detergent composition |
| WO2021053127A1 (en) | 2019-09-19 | 2021-03-25 | Novozymes A/S | Detergent composition |
| EP3798290B1 (en) | 2019-09-30 | 2022-08-17 | The Procter & Gamble Company | Use of an anionically-modified cellulosic polymer as a dye transfer inhibitor during a textile laundering process |
| DE102019126683A1 (de) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Copolymere zur Verbesserung der Lagerstabilität von Enzymen in Wasch- und Reinigungsmitteln |
| WO2021064068A1 (en) | 2019-10-03 | 2021-04-08 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains |
| BR112022006082A2 (pt) | 2019-10-18 | 2022-06-21 | Basf Se | Preparação enzimática, formulação de detergente, e, uso de pelo menos um diol |
| US11492571B2 (en) | 2019-10-24 | 2022-11-08 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition comprising a protease |
| US20210122998A1 (en) | 2019-10-24 | 2021-04-29 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition comprising an amylase |
| CN113891931A (zh) | 2019-11-29 | 2022-01-04 | 巴斯夫欧洲公司 | 组合物和可以用于该类组合物的聚合物 |
| EP3835396A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-16 | The Procter & Gamble Company | A detergent composition comprising a polymer |
| WO2021115912A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | Basf Se | Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes |
| WO2021123307A2 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having proteolytic activity and use thereof |
| WO2021122121A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Cleaning compositions comprising dispersins ix |
| KR20220121235A (ko) | 2019-12-20 | 2022-08-31 | 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 | 디스페르신 및 카르보히드라제를 포함하는 세정 조성물 |
| EP4077620A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-10-26 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions comprising dispersins vi |
| CN114929848A (zh) | 2019-12-20 | 2022-08-19 | 诺维信公司 | 稳定的液体无硼酶组合物 |
| BR112022015120A2 (pt) | 2020-01-29 | 2022-12-13 | Unilever Ip Holdings B V | Recipiente plástico transparente e processo de fabricação de recipiente plástico transparente |
| JP2023511739A (ja) | 2020-01-31 | 2023-03-22 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | マンナナーゼバリアント及びそれをコードするポリヌクレオチド |
| EP4097226A1 (en) | 2020-01-31 | 2022-12-07 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3862412A1 (en) | 2020-02-04 | 2021-08-11 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition |
| WO2021160818A1 (en) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | Basf Se | Mannanase variants |
| EP4114956A1 (en) | 2020-03-04 | 2023-01-11 | Basf Se | Shuttle vector for expression in e. coli and bacilli |
| WO2021175759A1 (en) | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Basf Se | Method for the production of constitutive bacterial promoters conferring low to medium expression |
| EP3892708A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-10-13 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions comprising dispersin variants |
| DE102020204505A1 (de) | 2020-04-07 | 2021-10-07 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch-/Pflegeartikel umfassend Pheromone |
| JP2023520312A (ja) | 2020-04-08 | 2023-05-17 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 炭水化物結合モジュールバリアント |
| WO2021214059A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Novozymes A/S | Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity |
| DE102020205400A1 (de) | 2020-04-29 | 2021-11-04 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Hochalkalisches Textilwaschmittel mit Protease |
| DE102020205381A1 (de) | 2020-04-29 | 2021-11-04 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Hochalkalisches Textilwaschmittel mit Protease |
| WO2021224152A1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-11 | Basf Se | Improving expression in fermentation processes |
| US20230212548A1 (en) | 2020-05-26 | 2023-07-06 | Novozymes A/S | Subtilase variants and compositions comprising same |
| WO2021247801A1 (en) | 2020-06-05 | 2021-12-09 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions containing a branched surfactant |
| US20230227834A1 (en) | 2020-06-17 | 2023-07-20 | Basf Se | Plasmid Copy Number Regulation and Integration |
| MX2022014895A (es) | 2020-06-18 | 2023-01-04 | Basf Se | Composiciones y su uso. |
| WO2021259099A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Novozymes A/S | Use of cellulases for removing dust mite from textile |
| HUE062018T2 (hu) | 2020-07-06 | 2023-09-28 | Procter & Gamble | Eljárás szemcsés mosószerkészítmény elõállítására |
| EP3936593A1 (en) | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions and uses thereof |
| EP4179053B1 (en) | 2020-07-09 | 2024-04-03 | Basf Se | Compositions and their applications |
| WO2022008732A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Basf Se | Enhancing the activity of antimicrobial preservatives |
| CA3186369A1 (en) | 2020-07-24 | 2022-01-27 | Max Fabian FELLE | Alanine racemase double deletion and transcomplementation |
| EP4189051B1 (en) | 2020-07-27 | 2024-02-28 | Unilever IP Holdings B.V. | Use of an enzyme and surfactant for inhibiting microorganisms |
| WO2022031309A1 (en) | 2020-08-04 | 2022-02-10 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing method |
| WO2022031310A1 (en) | 2020-08-04 | 2022-02-10 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing method |
| CA3187725A1 (en) | 2020-08-04 | 2022-02-10 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing method |
| WO2022031312A1 (en) | 2020-08-04 | 2022-02-10 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing method and pack |
| JP2023538740A (ja) | 2020-08-25 | 2023-09-11 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ファミリー４４キシログルカナーゼの変異体 |
| JP2023538773A (ja) | 2020-08-28 | 2023-09-11 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 改善された溶解性を有するプロテアーゼバリアント |
| EP4213641A1 (en) | 2020-09-15 | 2023-07-26 | Novozymes A/S | Animal feed comprising insects or insect meal |
| US20240052270A1 (en) | 2020-09-22 | 2024-02-15 | Basf Se | Liquid composition comprising peptide aldehyde |
| MX2023003275A (es) | 2020-09-22 | 2023-04-12 | Basf Se | Combinacion mejorada de proteasa e inhibidor de proteasa con enzima secundaria. |
| EP4225779A2 (en) | 2020-10-07 | 2023-08-16 | Basf Se | Bacillus cell with reduced lipase and/or esterase side activities |
| EP4225905A2 (en) | 2020-10-07 | 2023-08-16 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
| EP4225883A1 (en) | 2020-10-09 | 2023-08-16 | The Procter & Gamble Company | Packaged laundry detergent product |
| WO2022084303A2 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having dnase activity |
| WO2022083949A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Basf Se | Compositions and their use |
| US20230392018A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-12-07 | Milliken & Company | Compositions comprising leuco compounds and colorants |
| US20230399588A1 (en) | 2020-10-28 | 2023-12-14 | Novozymes A/S | Use of lipoxygenase |
| EP4237552A2 (en) | 2020-10-29 | 2023-09-06 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising such lipase variants |
| WO2022094588A1 (en) | 2020-10-29 | 2022-05-05 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions containing alginate lyase enzymes |
| CN116670261A (zh) | 2020-11-13 | 2023-08-29 | 诺维信公司 | 包含脂肪酶的洗涤剂组合物 |
| EP4001388A1 (en) | 2020-11-17 | 2022-05-25 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing method with amphiphilic graft polymer in the rinse |
| WO2022108766A1 (en) | 2020-11-17 | 2022-05-27 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing composition comprising amphiphilic graft polymer |
| CA3197110A1 (en) | 2020-11-17 | 2022-05-27 | Patrick Firmin August Delplancke | Automatic dishwashing method with alkaline rinse |
| WO2022106400A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Novozymes A/S | Combination of immunochemically different proteases |
| EP4006131A1 (en) | 2020-11-30 | 2022-06-01 | The Procter & Gamble Company | Method of laundering fabric |
| DE102020131794A1 (de) | 2020-12-01 | 2022-06-02 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verbesserte Reinigung durch Hydrogencarbonat im maschinellen Geschirrspülmittel |
| EP4011256A1 (de) | 2020-12-14 | 2022-06-15 | Henkel AG & Co. KGaA | Verfahren zur reinigung einer elektromotorisch betriebenen küchenmaschine |
| DE102021213462A1 (de) | 2021-11-30 | 2023-06-01 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verfahren zur Reinigung einer elektromotorisch betriebenen Küchenmaschine |
| WO2022128620A1 (de) | 2020-12-14 | 2022-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verfahren zur reinigung einer elektromotorisch betriebenen küchenmaschine |
| EP4012011A1 (de) | 2020-12-14 | 2022-06-15 | Henkel AG & Co. KGaA | Reinigungsmittel insbesondere für eine küchenmaschine |
| EP4015629A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-22 | Basf Se | Polymer mixtures for increasing stability and performance of hydrolase-containing detergents |
| DE102020134229A1 (de) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Getränktes Reinigungstuch |
| EP4267654A1 (en) | 2020-12-23 | 2023-11-01 | Basf Se | Amphiphilic alkoxylated polyamines and their uses |
| EP4032966A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-27 | Novozymes A/S | Liquid enzyme composition with sulfite scavenger |
| WO2022162043A1 (en) | 2021-01-28 | 2022-08-04 | Novozymes A/S | Lipase with low malodor generation |
| WO2022171780A2 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
| WO2022171872A1 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Novozymes A/S | Stabilized biological detergents |
| EP4305146A1 (en) | 2021-03-12 | 2024-01-17 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| US20240060061A1 (en) | 2021-03-15 | 2024-02-22 | Novozymes A/S | Dnase variants |
| CN116615536A (zh) | 2021-03-15 | 2023-08-18 | 宝洁公司 | 含有多肽变体的清洁组合物 |
| EP4060036A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-21 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| CN117083370A (zh) | 2021-03-26 | 2023-11-17 | 诺维信公司 | 聚合物含量降低的洗涤剂组合物 |
| CN117157382A (zh) | 2021-05-05 | 2023-12-01 | 宝洁公司 | 制备清洁组合物及检测污垢的方法 |
| EP4086330A1 (en) | 2021-05-06 | 2022-11-09 | The Procter & Gamble Company | Surface treatment |
| EP4108767A1 (en) | 2021-06-22 | 2022-12-28 | The Procter & Gamble Company | Cleaning or treatment compositions containing nuclease enzymes |
| DE102021116100A1 (de) | 2021-06-22 | 2022-12-22 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Blooming-Effekt durch den Einsatz von löslichen Waschtüchern |
| DE102021116096A1 (de) | 2021-06-22 | 2022-12-22 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungsmittel |
| EP4359518A1 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Novozymes A/S | Alpha-amylase polypeptides |
| EP4359423A1 (en) | 2021-06-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Bacillus licheniformis host cell for production of a compound of interest with increased purity |
| EP4359546A1 (en) | 2021-06-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Improved bacillus host cell with altered rema/remb protein |
| EP4359424A1 (en) | 2021-06-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Improved bacillus production host |
| EP4108754A1 (en) | 2021-06-25 | 2022-12-28 | The Procter & Gamble Company | A process for making a packaged laundry detergent powder |
| EP4108756A1 (en) | 2021-06-25 | 2022-12-28 | The Procter & Gamble Company | A laundry detergent powder |
| PL4123005T3 (pl) | 2021-07-19 | 2024-05-20 | The Procter & Gamble Company | Kompozycja czyszcząca zawierająca spory bakteryjne |
| EP4123006A1 (en) | 2021-07-19 | 2023-01-25 | The Procter & Gamble Company | Composition comprising spores and pro-perfume materials |
| EP4123007A1 (en) | 2021-07-19 | 2023-01-25 | The Procter & Gamble Company | Fabric treatment using bacterial spores |
| WO2023017794A1 (ja) | 2021-08-10 | 2023-02-16 | 株式会社日本触媒 | ポリアルキレンオキシド含有化合物 |
| EP4134423A1 (en) | 2021-08-12 | 2023-02-15 | Henkel AG & Co. KGaA | Sprayable laundry pre-treatment composition |
| WO2023061827A1 (en) | 2021-10-13 | 2023-04-20 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| CN118119692A (zh) | 2021-10-14 | 2024-05-31 | 宝洁公司 | 包含阳离子去垢性聚合物和脂肪酶的织物和家庭护理产品 |
| WO2023066741A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Basf Se | Phosphate-free composition and methods for their manufacture and use |
| WO2023088777A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| WO2023088761A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| WO2023088776A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| EP4194536A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | The Procter & Gamble Company | Laundry treatment cartridge |
| EP4194537A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | The Procter & Gamble Company | Laundry treatment cartridge |
| US20240166973A1 (en) | 2021-12-16 | 2024-05-23 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing composition comprising a protease |
| CA3238546A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Katarzyna Dorota BELL-RUSIEWICZ | Home care composition comprising an amylase |
| WO2023114793A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | The Procter & Gamble Company | Home care composition |
| CA3240638A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Michelle Jackson | Fabric and home care composition comprising a protease |
| WO2023110599A2 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Basf Se | Compositions and their applications |
| WO2023117970A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Basf Se | Method for improved production of intracellular proteins in bacillus |
| WO2023116569A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase and a booster |
| WO2023117950A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Basf Se | Chemical product with environmental attributes |
| EP4206309A1 (en) | 2021-12-30 | 2023-07-05 | Novozymes A/S | Protein particles with improved whiteness |
| EP4212608A1 (en) | 2022-01-14 | 2023-07-19 | The Procter & Gamble Company | A method of making a spray-dried laundry detergent particle |
| WO2023148086A1 (en) | 2022-02-04 | 2023-08-10 | Basf Se | Compositions comprising polymers, polymers, and their use |
| CN118159633A (zh) | 2022-02-08 | 2024-06-07 | 宝洁公司 | 洗涤织物的方法 |
| WO2023150905A1 (en) | 2022-02-08 | 2023-08-17 | The Procter & Gamble Company | A method of laundering fabric |
| EP4234666A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-30 | The Procter & Gamble Company | Water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet and a surfactant system |
| EP4234672A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-30 | The Procter & Gamble Company | Water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet and a hueing dye particle |
| WO2023161182A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-31 | Evonik Operations Gmbh | Bio based composition |
| EP4234664A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-30 | Evonik Operations GmbH | Composition comprising glucolipids and enzymes |
| WO2023165507A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents |
| WO2023165950A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Novozymes A/S | Dnase variants and compositions |
| DE102022107827A1 (de) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Haarentfernung durch Waschmittel/-Additive enthaltend Enzyme |
| WO2023194204A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Novozymes A/S | Hexosaminidase variants and compositions |
| WO2023198434A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Basf Se | Compositions, their manufacture and use |
| EP4273209A1 (en) | 2022-05-04 | 2023-11-08 | The Procter & Gamble Company | Machine-cleaning compositions containing enzymes |
| EP4273210A1 (en) | 2022-05-04 | 2023-11-08 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions containing enzymes |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
| EP4279570A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-22 | The Procter & Gamble Company | A process for making a particulate laundry detergent composition |
| EP4279571A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-22 | The Procter & Gamble Company | Laundry composition comprising spores |
| WO2023227356A1 (en) | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composition containing enzyme |
| DE102022205588A1 (de) | 2022-06-01 | 2023-12-07 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und reinigungsmittel mit verbesserter enzymstabilität |
| DE102022205591A1 (de) | 2022-06-01 | 2023-12-07 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und reinigungsmittel mit verbesserter enzymstabilität |
| DE102022205593A1 (de) | 2022-06-01 | 2023-12-07 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und reinigungsmittel mit verbesserter enzymstabilität |
| DE102022205594A1 (de) | 2022-06-01 | 2023-12-07 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Leistungsverbesserte und lagerstabile protease-varianten |
| WO2023233025A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Unilever Ip Holdings B.V. | Liquid detergent product |
| WO2023247348A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Mannanase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2023247664A2 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-28 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions comprising such lipase variants |
| EP4299701A1 (en) | 2022-06-27 | 2024-01-03 | The Procter & Gamble Company | A solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| EP4299702A1 (en) | 2022-06-27 | 2024-01-03 | The Procter & Gamble Company | A solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| EP4299703A1 (en) | 2022-06-27 | 2024-01-03 | The Procter & Gamble Company | A solid free-flowing particulate laundry detergent composition |
| EP4299704A1 (en) | 2022-06-27 | 2024-01-03 | The Procter & Gamble Company | A method of laundering and drying fabric |
| WO2024002738A1 (en) | 2022-06-28 | 2024-01-04 | Evonik Operations Gmbh | Composition comprising biosurfactant and persicomycin |
| WO2024012894A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Basf Se | Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations |
| EP4321604A1 (en) | 2022-08-08 | 2024-02-14 | The Procter & Gamble Company | A fabric and home care composition comprising surfactant and a polyester |
| CA3169962A1 (en) | 2022-08-11 | 2023-02-23 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition |
| EP4324900A1 (en) | 2022-08-17 | 2024-02-21 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent composition comprising enzymes |
| EP4342969A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-27 | The Procter & Gamble Company | A solid detergent cleaning composition |
| EP4342970A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-27 | Milliken & Company | Coloured fabric hueing dye agent particles |
| WO2024083589A1 (en) | 2022-10-18 | 2024-04-25 | Basf Se | Detergent compositions, polymers and methods of manufacturing the same |
| EP4364929A1 (en) | 2022-11-01 | 2024-05-08 | The Procter & Gamble Company | Sealing jaws and water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet |
| EP4364930A1 (en) | 2022-11-01 | 2024-05-08 | The Procter & Gamble Company | Sealing jaws and water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet |
| WO2024094785A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Clariant International Ltd | Polyesters |
| WO2024094802A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | The Procter & Gamble Company | Fabric and home care composition |
| WO2024094790A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Clariant International Ltd | Polyesters |
| DE102022131732A1 (de) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verbesserte Waschleistung durch den Einsatz einer Protease fusioniert mit speziellem Adhäsionsvermittlerpeptid |
| WO2024115213A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Evonik Operations Gmbh | Detergent compartment pouch comprising biosurfactants |
| WO2024115754A1 (en) | 2022-12-02 | 2024-06-06 | Basf Se | Aqueous compositions containing polyalkoxylates, polyalkoxylates, and use |
| WO2024121058A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | Novozymes A/S | A composition comprising a lipase and a peptide |
| WO2024121070A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
| WO2024119298A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | The Procter & Gamble Company | Fabric and home care composition comprising a polyalkylenecarbonate compound |
| EP4382592A1 (en) | 2022-12-06 | 2024-06-12 | The Procter & Gamble Company | Water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet and a surfactant system |
| WO2024129520A1 (en) | 2022-12-12 | 2024-06-20 | The Procter & Gamble Company | Fabric and home care composition |
| WO2024126697A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Novozymes A/S | High strength liquid protease formulations |
| WO2024126483A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Novozymes A/S | Improved lipase (gcl1) variants |
| EP4386074A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-19 | The Procter & Gamble Company | Fabric and home care composition |
| EP4388967A1 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-26 | The Procter & Gamble Company | Dishwashing method |
| EP4389864A1 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-26 | Basf Se | Cutinases |
| EP4389867A1 (en) | 2022-12-23 | 2024-06-26 | The Procter & Gamble Company | A process of making a laundry detergent article |
| EP4389866A1 (en) | 2022-12-23 | 2024-06-26 | The Procter & Gamble Company | A process of making a water-soluble detergent unit dose article |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4704362A (en) * | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
| US4366246A (en) * | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| US4563424A (en) * | 1979-11-05 | 1986-01-07 | Genentech, Inc. | Method and means for somatostatin protein conjugate expression |
| US4431739A (en) * | 1979-11-05 | 1984-02-14 | Genentech, Inc. | Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein |
| US4425437A (en) * | 1979-11-05 | 1984-01-10 | Genentech, Inc. | Microbial polypeptide expression vehicle |
| US4760025A (en) * | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| US4801537A (en) * | 1984-06-08 | 1989-01-31 | Genex Corporation | Vector for expression of polypeptides in bacilli |
| GB2171703B (en) * | 1985-01-18 | 1989-11-15 | Agency Ind Science Techn | Expression-secretion vector for gene expression and protein secretion, recombinant dna including the vector, and method of producing proteins by use of the re |
| DE3527913A1 (de) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | Henkel Kgaa | Alkalische protease, verfahren zur herstellung von hybridvektoren und genetisch transformierte mikroorganismen |
| US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
-
1990
- 1990-08-17 DK DK90912607T patent/DK0493398T3/da active
- 1990-08-17 AT AT90912607T patent/ATE187490T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-08-17 DE DE69033388T patent/DE69033388T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-17 EP EP90912607A patent/EP0493398B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-17 WO PCT/US1990/004673 patent/WO1991002792A1/en active IP Right Grant
- 1990-08-17 ES ES90912607T patent/ES2144990T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-17 JP JP51191790A patent/JP3220137B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-04-25 KR KR1019910700414A patent/KR100200166B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-03-10 US US08/033,080 patent/US5352604A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69033388D1 (de) | 2000-01-13 |
| DK0493398T3 (da) | 2000-05-22 |
| JPH04507346A (ja) | 1992-12-24 |
| ATE187490T1 (de) | 1999-12-15 |
| ES2144990T3 (es) | 2000-07-01 |
| WO1991002792A1 (en) | 1991-03-07 |
| KR920701425A (ko) | 1992-08-11 |
| US5352604A (en) | 1994-10-04 |
| EP0493398A1 (en) | 1992-07-08 |
| DE69033388T2 (de) | 2000-05-11 |
| EP0493398B1 (en) | 1999-12-08 |
| JP3220137B2 (ja) | 2001-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100200166B1 (ko) | 알칼리성 단백질 가수분해효소 및 그것의 제조방법 | |
| JP2590247B2 (ja) | スブチリシンアナログ | |
| FI102969B (fi) | Lämpö- ja pH-stabiileja Bacillus-subtilisiinianalogeja, menetelmä niid en valmistamiseksi ja niitä sisältävä pesuainekoostumus | |
| FI106726B (fi) | Korkea-alkalisia proteaaseja koodaavien geenien transformointi Bacillus-bakteereihin, ja menetelmässä käytettävät vektorit, DNA-sekvenssit ja koettimet | |
| RU2091487C1 (ru) | Способ получения штамма bacillus, содержащего две копии последовательности днк, кодирующей фермент с гидролазной активностью | |
| JP2726799B2 (ja) | 変異ズブチリシン | |
| KR970005249B1 (ko) | 신규한 단백질 분해효소 및 세제에 있어서의 사용 | |
| US4965197A (en) | Coryneform expression and secretion system | |
| EP0479396A2 (en) | Transformation of alkalophilic bacillus strains | |
| JP2001514529A (ja) | プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸 | |
| US5958728A (en) | Methods for producing polypeptides in mutants of bacillus cells | |
| AU643511B2 (en) | Bacterial vectors | |
| US5622850A (en) | Recombinant methods for the production of a bacillus alkaline protease | |
| JP2001503641A (ja) | バシラス細胞のサーファクチン突然変異株におけるポリペプチドの製造方法 | |
| RU2060276C1 (ru) | Способ получения алкалофильного штамма бацилл с пониженным уровнем внеклеточной щелочной протеазы, способ получения высокощелочной протеазы и мутантная форма высокощелочной протеазы | |
| WO1988009821A1 (en) | Coryneform expression and secretion system | |
| JP2501779B2 (ja) | アルカリプロテア―ゼの製造方法 | |
| JPH0695940B2 (ja) | 枯草菌およびその形成方法 | |
| JPH01141596A (ja) | アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| B701 | Decision to grant | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| G170 | Re-publication after modification of scope of protection [patent] | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |