FI102969B - Lämpö- ja pH-stabiileja Bacillus-subtilisiinianalogeja, menetelmä niid en valmistamiseksi ja niitä sisältävä pesuainekoostumus - Google Patents
Lämpö- ja pH-stabiileja Bacillus-subtilisiinianalogeja, menetelmä niid en valmistamiseksi ja niitä sisältävä pesuainekoostumus Download PDFInfo
- Publication number
- FI102969B FI102969B FI873980A FI873980A FI102969B FI 102969 B FI102969 B FI 102969B FI 873980 A FI873980 A FI 873980A FI 873980 A FI873980 A FI 873980A FI 102969 B FI102969 B FI 102969B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- amino acid
- subtilisin
- group
- gly
- bacillus
- Prior art date
Links
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 title claims description 100
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims description 55
- 239000003599 detergent Substances 0.000 title claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 101150117169 aprA gene Proteins 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 35
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 34
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 29
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical group NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 24
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 23
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 claims description 18
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 claims description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- -1 aliphatic amino acid Chemical class 0.000 claims description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000001942 asparaginyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 65
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 65
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 65
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 54
- 239000000047 product Substances 0.000 description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 229940059720 apra Drugs 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 18
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 16
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 12
- 101100204301 Bacillus subtilis (strain 168) aprE gene Proteins 0.000 description 11
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 10
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 8
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 101100163944 Necator americanus apr-2 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 6
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- ZYLDQHILNOZKIF-DHLUJLSBSA-N (6r,7r)-7-azaniumyl-8-oxo-3-[(e)-prop-1-enyl]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound S1CC(/C=C/C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 ZYLDQHILNOZKIF-DHLUJLSBSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150074257 xylE gene Proteins 0.000 description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- 241000205585 Aquilegia canadensis Species 0.000 description 2
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 2
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- NVNPWELENFJOHH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)N NVNPWELENFJOHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000010945 base-catalyzed hydrolysis reactiony Methods 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 2
- 239000004247 glycine and its sodium salt Substances 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 229940029258 sodium glycinate Drugs 0.000 description 2
- WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetate Chemical compound [Na+].NCC([O-])=O WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- WUHJHHGYVVJMQE-BJDJZHNGSA-N Ala-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WUHJHHGYVVJMQE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KQESEZXHYOUIIM-CQDKDKBSSA-N Ala-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KQESEZXHYOUIIM-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- AWNAEZICPNGAJK-FXQIFTODSA-N Ala-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AWNAEZICPNGAJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PEEYDECOOVQKRZ-DLOVCJGASA-N Ala-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PEEYDECOOVQKRZ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- ALZVPLKYDKJKQU-XVKPBYJWSA-N Ala-Tyr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ALZVPLKYDKJKQU-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- AOAKQKVICDWCLB-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N AOAKQKVICDWCLB-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- 101710184263 Alkaline serine protease Proteins 0.000 description 1
- XVLLUZMFSAYKJV-GUBZILKMSA-N Arg-Asp-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XVLLUZMFSAYKJV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JOTRDIXZHNQYGP-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N JOTRDIXZHNQYGP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KXFCBAHYSLJCCY-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KXFCBAHYSLJCCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- GNKVBRYFXYWXAB-WDSKDSINSA-N Asn-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O GNKVBRYFXYWXAB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MDDXKBHIMYYJLW-FXQIFTODSA-N Asn-Met-Asp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MDDXKBHIMYYJLW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 101100498939 Bacillus subtilis (strain 168) degS gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010080972 Catechol 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 235000009842 Cucumis melo Nutrition 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N Dehydroalanine Chemical group NC(=C)C(O)=O UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004099 Deoxyribonuclease (Pyrimidine Dimer) Human genes 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HVKAAUOFFTUSAA-XDTLVQLUSA-N Glu-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVKAAUOFFTUSAA-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- XCLCVBYNGXEVDU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XCLCVBYNGXEVDU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N Gly-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- YLEIWGJJBFBFHC-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 YLEIWGJJBFBFHC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N Gly-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N Gly-Thr-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N Gly-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)CN)C(=O)O LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 1
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000459819 Gymnodinium cucumis Species 0.000 description 1
- OWYIDJCNRWRSJY-QTKMDUPCSA-N His-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OWYIDJCNRWRSJY-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKVZTQVGUNLLQW-JBDRJPRFSA-N Ile-Ala-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N NKVZTQVGUNLLQW-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- YPWHUFAAMNHMGS-QSFUFRPTSA-N Ile-Ala-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N YPWHUFAAMNHMGS-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- IPYVXYDYLHVWHU-GMOBBJLQSA-N Ile-Asn-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N IPYVXYDYLHVWHU-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- SVBAHOMTJRFSIC-SXTJYALSSA-N Ile-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N SVBAHOMTJRFSIC-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- UIEZQYNXCYHMQS-BJDJZHNGSA-N Ile-Lys-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N UIEZQYNXCYHMQS-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N Ile-Phe-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- ZNOBVZFCHNHKHA-KBIXCLLPSA-N Ile-Ser-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N ZNOBVZFCHNHKHA-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- USLNHQZCDQJBOV-ZPFDUUQYSA-N Leu-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O USLNHQZCDQJBOV-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N Leu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N Leu-Phe-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- RIHIGSWBLHSGLV-CQDKDKBSSA-N Leu-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RIHIGSWBLHSGLV-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- PFZWARWVRNTPBR-IHPCNDPISA-N Lys-Leu-Trp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PFZWARWVRNTPBR-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- ALGGDNMLQNFVIZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N ALGGDNMLQNFVIZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IMDJSVBFQKDDEQ-MGHWNKPDSA-N Lys-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IMDJSVBFQKDDEQ-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N Met-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- ULNXMMYXQKGNPG-LPEHRKFASA-N Met-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N ULNXMMYXQKGNPG-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N Met-Ala-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- VCUFZILGIRCDQQ-KRWDZBQOSA-N N-[[(5S)-2-oxo-3-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)-1,3-oxazolidin-5-yl]methyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1O[C@H](CN1C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F VCUFZILGIRCDQQ-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001523956 Parengyodontium album Species 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Tyr Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N Pro-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N Ser-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WTUJZHKANPDPIN-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N WTUJZHKANPDPIN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- COAHUSQNSVFYBW-FXQIFTODSA-N Ser-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O COAHUSQNSVFYBW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MQUZANJDFOQOBX-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MQUZANJDFOQOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710174704 Subtilisin-like serine protease Proteins 0.000 description 1
- WFWLQNSHRPWKFK-UHFFFAOYSA-N Tegafur Chemical compound O=C1NC(=O)C(F)=CN1C1OCCC1 WFWLQNSHRPWKFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N Thr-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N Thr-Asn-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 1
- HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N Thr-Gly-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N Thr-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- WRUWXBBEFUTJOU-XGEHTFHBSA-N Thr-Met-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O WRUWXBBEFUTJOU-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N Thr-Tyr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- MJBBMTOGSOSAKJ-HJXMPXNTSA-N Trp-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MJBBMTOGSOSAKJ-HJXMPXNTSA-N 0.000 description 1
- HHPSUFUXXBOFQY-AQZXSJQPSA-N Trp-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O HHPSUFUXXBOFQY-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N Tyr-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- PLVVHGFEMSDRET-IHPCNDPISA-N Tyr-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N PLVVHGFEMSDRET-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010069490 alanyl-glycyl-seryl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150082462 arpA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003164 beta-aspartyl group Chemical group 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000010435 extracellular transport Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 101150025049 leuB gene Proteins 0.000 description 1
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002073 methionyl group Chemical group 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
102969 Lämpö- ja pH-stabiileja Bacillus-subtilisiinianalogeja, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niitä sisältävä pesu-ainekoostumus 5 Keksinnön tausta
Keksintö koskee Bacillus-subtilisiinin analogia, sitä koodittavaa nukleiinihappoa ja järjestelmää sen tuottamiseksi. Keksintö koskee edelleen menetelmää Bacillus-subtilisiinin lämpö- ja pH-stabiilisuuden parantamiseksi 10 sekä Bacillus-subtilisiinin analogia sisältävää pesu- ainekoostumusta .
Termillä subtilisiini tarkoitetaan ryhmää eri Bacil-lus-lajien tuottamia solunulkoisia emäksisiä seriiniprote-aaseja. Näitä entsyymejä kutsutaan myös Bacillusseriinipro-15 teaaseiksi, Bacillus-subtilisiineiksi tai emäksisiksi bak- teeriproteaaseiksi.
Bacillus-subtilisiinimolekyylit koostuvat yksittäisestä joko 274 ryhmän (Bacillus licheniformiksen tuottama subtilisiinityyppi Carlsberg ja Bacillus subtilis-kannan DY 20 tuottama subtilisiini) tai 275 ryhmän (Bacillus amyloli-quefaciensin tuottama subtilisiinityyppi BPN' ja Bacillus subtiliksen aprA-geenituote) polypeptidiket justa. Verratta-: : essa eri Bacillus-kantojen subtilisiinien aminohapposek- venssejä käytetään standardina subtilisiinin BPN' sekvenssi'. 25 siä. Esimerkiksi sekvenssien suuntaamisen nojalla, joka antaa korkeimman homologia-asteen Carlsberg-subtilisiinin • · I. ’ ja BPN'-subtilisiinin välille, edellisen aktiivisen keskuk- • · · *. . sen seriiniin viitataan seriininä 221, vaikka se sijaitsee • · · *·*·* aminohapposekvenssissä kohdassa 220. Samalla perusteella 30 Carlsberg-subtilisiinin aminohapposekvenssin aseman 220 ·»· ·.* * voidaan sanoa "vastaavan" BPN'subtilisiinin asemaa 221.
• · # · Katso esim. Nedkov et ai., Hoppe-Seyler' s Z. Physiol. Chem.
364 (1983) 1537-1540.
BPN'-subtilisiinin rakenteen röntgensädeanalyysi 35 [Wright et.ai. Nature 221 (1969) 2357] paljasti, että sub- 2 102969 tilisiinin Asp32:n, His64:n ja Ser221:n käsittävän katalyyttisen keskuksen geometria on miltei identtinen nisäkässe-riiniproteaasien (esim. kymotrypsiini) ryhmät Asp102, His57 ja Ser195 käsittävän aktiivisen keskuksen geometriaan näh-5 den. Yleiset eroavaisuudet Bacillusseriiniproteaasien ja nisäkässeriiniproteaasien välillä osoittavat kuitenkin, että nämä ovat kaksi proteolyyttisten entsyymien ryhmää, jotka eivät ole sukua keskenään.
Bacillus-subtilisiinien ryhmässä neljälle subtili- 10 siinille on saatavilla täydelliset aminohapposekvenssit:
Carlsbergille [Smith et.ai , J. Biol. Chem. 243 (1968) 2184-2191] BPN':lle [Markland et.ai., J. Biol. Chem. 242 (1967) 5198-5211] aprA-geenituotteelle [Stahl et.ai. J.
Bacteriol. 158 (1948) 411-418] ja DY:lle (Nedkov et supra).
15 Carlsberg-subtilisiini ja BPN'-subtilisiini (jota joskus kutsutaan Novo-subtilisiiniksi) eroavat toisistaan 84 aminohapon ja yhden BPN':n sisältämän ylimääräisen ryhmän osalta (Carlsberg-subtilisiinista puuttuu BPN'-subtilisii- nin ryhmää 56 vastaava aminohapporyhmä). Smith et.ai., sup- 20 ra. DY-subtilisiini on 274 aminohappoa pitkä ja eroaa
Carlsberg-subtilisiinista 32 aminohappoasemassa ja BPN'-subtilisiinista 82 aminohappokorvaantumisen ja yhden : : puuttumisen (DY-subtilisiinilta puuttuu BPN'-subtilisiinin jäännöstä 56 vastaava aminohappo jäännös) osalta. Nedkov 25 et.ai., supra. AprA-geenituotteen aminohapposekvenssi on j·.·. 85-%:isesti homologinen BPN'-subtilisiinin aminohapposek- • · I./ venssiin nähden. Stahl et.ai., supra. Täten vaikuttaa sil- • ♦ · *. . tä, että eri Bacillus-kantojen seriiniproteaasien aminohap- • « · * * posekvenssien välillä on olemassa laajamittaista homolo- 30 giaa. Tämä homologia on täydellinen molekyylin tietyillä • · · *.* * alueilla, ja erityisesti niillä, jotka ottavat osaa kata- • « · ’.·· lyysimekanismiin ja substraatin sitoutumiseen. Esimerkkejä tällaisista muuttumattomista sekvensseistä ovat substraatin sitoutumisen primaarinen ja sekundaarinen keskus, 3 5 Ser125-Leu126-Gly127-Gly128 ja vastaavasti Tyr104, ja reaktiivis- 3 102969 ta seriiniä (221) ympäröivä sekvenssi Asn218-Gly219-Thr220-Ser221-Met222-Ala223 .
Subtilisiinimolekyyleillä on eräitä ainutlaatuisia stabiilisuusominaisuuksia. Ne eivät ole täysin stabiileja 5 millään pH-arvolla, vaikka ovatkin verraten vastustuskykyisiä urea- ja guanidiiniliuosdenaturaatiolle ja säilyttävät entsymaattisen aktiivisuutensa jonkin aikaa jopa 8M ureali-uoksessa. Liuoksissa, joiden pH on alle 4, subtilisiini menettää proteolyyttisen aktiivisuutensa nopeasti ja irre-10 versiibelisti. Gounaris et ai., Compt. Rend. Trav. Lab.
Carlsberg 35 (1965) 37, osoittivat, ettei subtilisiinin inaktivoituminen happamissa olosuhteissa johdu yleisestä varausvaikutuksesta, ja arvelivat sen johtuvan muista muutoksista molekyylissä, kuten histidiiniryhmien protonoitu-15 misesta molekyylin hydrofobisisissa sisäosissa. Liuoksessa, jonka pH on yli 5, Bacillus-seriiniproteaasit inaktivoitu-vat asteittain irreversiibelisti nopeudella, joka kasvaa lämpötilan ja pH:n mukana. Tämän inaktivoitumisen mekanismeja ei täysin tunneta, mutta on todisteita, jotka viittaa-20 vat siihen, että autodigestio on ainakin osittain vastuussa entsyymin epästabiilisuudesta tällä pH-alueella.
Proteaasien käyttö proteiinien hydrolyysiä vaativissa teollisissa prosesseissa on ollut rajoittunutta johtuen entsyymien epästabiilisuudesta käyttöolosuhteissa. Täten 25 esimerkiksi trypsiinin sisällyttäminen pyykinpesuaineisiin (esim. Bio-38, Schnyder, Sveitsi) proteiinipitoisten tahro- • · jen poiston helpottamiseksi saavutti erittäin rajoittuneen • · · *. . suosion epäilemättä tuloksena entsyymin epästabiilisuudesta • · · • · « ** pesuolosuhteissa. Vasta noin v. 1960, pesuaineiden kanssa 30 proteaaseja paremmin yhteensopivien emäksisten bakteeripro- ·.* * teaasien käyttöön oton jälkeen, proteaasit tulivat laajalti «·» *.· · käyttöön pesuaineteollisuudessa.
Käytännön syistä monet teolliset prosessit suoritetaan lämpötiloissa, jotka ylittävät useimpien entsyymien 35 stabiilisuusalueen. Tämän vuoksi on perusteltua olettaa, 4 102969 että erittäin lämpöstabiilit proteaasit eivät ole edullisia ainoastaan tietyillä teollisuuden aloilla kuten pesuaineja vuodankalttausteollisuudessa, jotka jo vaativat stabiileja proteaaseja, vaan voivat olla hyödyllisiä teollisuuden 5 aloilla, joilla käytetään kemiallisia proteiinien hydroly-sointimenetelmiä, esim. kasvi- ja eläinproteiinien hydro-lyysi liemitiivisteiden tuotannossa.
Tulee kuitenkin korostaa, että vaikka lämpöinakti-vaatio saattaakin olla entsyymi-inaktivaation tärkein tie, 10 muilla tekijöillä kuin lämmöllä, kuten äärialueiden pH-ar-voilla, hapella ja denaturoivilla aineilla, voi olla ratkaiseva vaikutus proteaasien käyttörajoituksiin teollisissa prosesseissa. Tämän vuoksi on toivottavaa saada käyttöön proteaaseja, joille on tunnusomaista parantunut stabiili-15 suus eri teollisuuden aloilla käytetyissä käyttöolosuhteissa. Tällainen päämäärä voidaan saavuttaa joko etsimällä uusia stabiilimpia villityyppientsyymejä tai stabiloimalla jo tunnettuja, olemassa olevia proteaaseja.
Vaikka Bacillus-peräiset emäksiset proteaasit sopi-20 vat paremmin yhteen pesuainekoostumusten kanssa kuin haima-proteaasit, ne eivät vielä ole kaikissa suhteissa ihanteellisia .
Usean viime vuoden aikana pesuainekoostumusten osalta on tapahtunut merkittäviä muutoksia, erityisesti korvat-25 taessa fosfaatit vaihtoehtoisilla ainesosilla ja kehitet-täessä nestemäisiä pyykinpesuaineita, jotka täyttävät ympä- • · ristönsuojelulliset ja kuluttajien vaatimukset. Nämä muu- • · * *. . tokset synnyttävät tarpeen muutoksiin perinteisissä pesuai- • · · *·'** neentsyymeissä. Tarkemmin sanottuna on tullut toivottavaksi 30 käyttää proteolyyttisiä entsyymejä, jotka omaavat paremman • · · *.· * varastointikestävyyden nestemäisissä pesuainekoostumuksissa • · · · ja jotka ovat stabiileja ja säilyttävät aktiivisuutensa laajemmalla pH- ja lämpötila-alueella.
Eräs lähestymistapa tuottaa modifioituja subti-35 lisiineja käytettäviksi pesuainekoostumuksissa on esitetty 5 102969 EP-patenttihakemuksessa 130 756, jonka mukaan on havaittu, että mutaatiot Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefa-ciens) subtilisiinin asemissa Tyr'1, Asp32, Asn155, Tyr104,
Met222, Gly166, His64, Gly169, Ph189, Ser33, Ser221, Tyr217, Glu156 5 ja/tai Ala152 tuottavaa stabiilisuuden muutoksia, muuttuneen konformaation tai aiheuttavat muutoksia entsyymin "prosessoinnissa". Tässä yhteydessä Met222 :n mutaatio Ala-.ksi, Cys:ksi (jolla mutant ilia myös on terävämpi pH-op-timi kuin villityypillä) tai Ser-.ksi aivan varmasti tuottaa 10 parantuneen stabiilisuuden hapetusta vastaan. Gly166:n korvaaminen Ala :11a, Asp:llä, Glu:11a, Phe:llä, Hys:llä, Lys:llä, Asn:llä, Arg:llä tai Vai :11a vaikuttaa muuttavan entsyymin kineettisiä parametrejä. Kuitenkaan minkään näistä mutaatioista ei ilmoiteta tuottavan analogeja, joiden 15 stabiilisuus korkeissa lämpötiloissa on parempi tai jotka ovat stabiileja laajemmalla pH-alueella kuin villityyp-pientsyymi.
Toisen lähestymistavan mukaisesti vaikuttaa siltä, että subtilisiinin pH-riippuvuutta voidaan muuttaa, kuten 20 ovat esittäneet Thomas et ai., Nature 318 (1985) 375-376, muuttamalla Asp Ser:ksi BPN' subtilisiinin Asp99-Gly100-se- kvenssissä. Tämä muutos edustaa muutosta pintavarauksessa : 14-15 Ängströmin päässä aktiivisesta keskuksesta. Kuiten- kaan Thomasin et ai. lähestymistapa ei osoita merkkejä pa- 25 rannuksesta, kun muutosta pintavarauksessa ei tapahdu, mikä j·.·. on tilanne silloin, kun ryhmä, jolla ei ole varausta, kor- • · I. * vataan toisella.
» ♦ • ♦ · *. . Keksinnön yhteenveto • · · *·*· Keksintö koskee siten Bacillus-seriiniproteaasituot- 30 teiden analogeja, joilla on parantunut pH- ja lämpöstabii- ··· ·.· * lisuus, mikä tek.ee niistä erityisen käyttökelpoisia pesu- • · · · ainekoostumuksissa sekä muissa proteaasien käyttöä vaati vissa prosesseissa. Keksintö koskee myös näitä analogeja koodittavaa nukleiinihappoa ja järjestelmää analogien tuot-V 35 tamiseksi. Keksintö tarjoaa siten myös teollisesti toteut- 6 102969 tamiskelpoisen geeniteknisen menetelmän tuotteiden valmistamiseksi vapaina muista proteaaseista.
Keksinnön mukaisille Bacillus subtilisiinin analogeille on tunnusomaista, että villikanta Bacillus -subti-5 lisiinin aminohapposekvenssissä esiintyvän Asn-Gly-sekvens sin ryhmistä toinen tai molemmat on poistettu tai korvattu varauksettomalla alifaattisella aminohapolla.
Tulee panna merkille, että tässä käytettynä termiä subtilisiini käytetään viittaamaan entsyymin täysin kehit-10 tyneeseen, erittyvään muotoon, jolta puuttuu valmiista entsyymistä ennen erittymistä tai sen yhteydessä poislohkeavat johtosekvenssit.
Keksinnön mukaan tällä hetkellä edulliset Bacil-lus-subtilisiinianalogit omaavat aminohapposekvenssin, jos-15 sa Bacillus-subtilisiinissa Asn-Gly-sekvenssin käsittävät asemat eivät analogissa käsitä Asn-Gly-sekvenssiä ja jossa erityisesti on vähemmän Asn-Gly-sekvenssejä kuin Bacillus-subtilisiinissa. Edullisimmin asemaa 218 taulukossa 1 esitetyssä aminohapposekvenssissä vastaava asema ei käsitä 20 asparaginyyliryhmää, vaan käsittää mieluummin muun amino-happoryhmän, edullisesti seriinistä, valiinista, treo-niinista, kysteiinistä, glutamiinista ja isoleusiinista valitun aminohapporyhmän. Sikäli kun asparagiinin korvaami-nen tietyillä aminohapoilla voi aiheuttaa häiriöitä aktii-25 visen keskuksen konformaatiossa (esim. johtuen aromaattisen aminohapon läsnäolon mahdollisesti aiheuttamista steerisis- • * tä esteistä tai tertiäärisen rakenteen muutoksista, jollai- • · · *. . siä voi aiheuttaa proliinin läsnäolo), katsottaisiin kor- • · * ’·’* vaaminen tällaisilla aminohapoilla yleensä vähemmän edulli- 30 seksi. Samoin sikäli kun asparagiinin korvaaminen muilla • · · *.· * aminohapoilla saattaa tuoda varauksen omaavan ryhmän (esim.
• · · · asparagiinihapon) aktiivisen keskuksen läheisyyteen, pidet- täisiin tällaista substituutiota vähemmän edullisena. Va-.··. laiseva esimerkki keksinnön mukaisen analogin tällä hetkel- 35 lä edullisena pidetystä muodosta on aprA-geenituotteen 102969 7 [Ser218] -analogi. Vaihtoehtoisia analogimuotoja keksinnön piiristä ovat ne, joissa BPN'-subtilisiinin tai aprA-geeni-tuotteen Asn109 on korvattu, edullisesti seriinillä, ja joissa glysiiniryhmät asemissa 110 ja/tai 219 on korvattu 5 muilla aminohapporyhmillä. Muissa subtilisiineissa myös Carlsberg- tai DY-subtilisiinin Asn:n substituutio asemassa 62 tai Gly:n asemassa 63 kuuluvat kyseisen keksinnön piiriin .
Keksinnön mukaiselle nukleiinihapolle on tun-10 nusomaista, että se koodaa Bacillus-subtilisiinin analogia, jossa villikanta Bacillus -subtilisiinin aminohapposekvenssissä esiintyvän Asn-Gly-sekvenssin toista tai molempia ryhmiä koodaavat kodonit on poistettu tai korvattu kodo-neilla, jotka koodaavat varauksetonta alifaattista 15 aminohappoa.
Keksinnön mukaiselle järjestelmälle Bacillus-subtilisiinin analogin tuottamiseksi on tunnusomaista, että se käsittää bakteeri-isäntäsolun ja bakteeri-isäntäsolussa nukleiinihapon, joka koodaa Bacillus-subtilisiinianalogia, 20 jonka aminohapposekvenssissä ryhmä asemaa 218 taulukossa 1 esitetyssä aminohapposekvenssissä vastaavassa asemassa on poistettu tai korvattu varauksettomalla alifaattisella : : aminohapolla. Subtilisiinianalogia koodaava nukleiinihappo :Y: voi olla kromosomissa tai kromosomin ulkopuolinen. Isän- 25 täsolu valitaan edullisesti kannasta, jolta puuttuvat erit-tyvät proteaasit, mikä sallii analogien helpon eristämisen.
• · JY Keksinnön mukaiselle Bacillus-subtilisiinin analogia • · · *. . sisältävälle pesuainekoostumukselle, jonka Bacillus-subti- • · · *·’*’ lisiinin aminohapposekvenssissä on Asn-Gly-sekvenssi, on 30 tunnusomaista, että Asn-Gly-sekvenssin ryhmistä toinen tai ··· * molemmat on poistettu tai korvattu varauksettomalla ali- • · · ' faattisella aminohapolla.
....: Keksinnön mukaiselle menetelmälle Bacillus-subti- 4 · /··. lisiinin lämpö- ja pH-stabiilisuuden parantamiseksi on tun- 35 nusomaista, että vähintään yhden Bacillus-subtilisiinissa β 102969 olevan Asn-Gly-parin ryhmistä vähintään toinen poistetaan tai korvataan geeniteknisesti varauksettomalla alifaatti-sella aminohapporyhmällä.
Lyhyt kuvaus piirroksista 5 Kuvio 1 esittää kaaviona Asn-Gly-ryhmien, kuten nii den, jotka löytyvät subtilisiinin asemista 218 ja 219 kuten esitetty taulukossa 1, syklisoitumisen muodostamaan anhyd-roaspartyyliglysiini ja kuvaa myös sen emäskatalysoitua hydrolyysiä.
10 Kuvio 2 on Bacillus subtilis (B. subtilis) -kannan QB127 aprA-geenin sisältävän EcoRI-Kpnl-geenitragmentin osittainen restriktiokartta ja sisältää aprA-geenin ja sivuavien sekvenssien osittaisen restriktiokartan.
Kuvio 3 on plasmidin pAMBll osittainen restriktio- 15 kartta.
Kuvio 4 on B. subtilis -isäntäsoluissa [Ser218]-sub-tilisiinin synteesiä ohjaavan plasmidin pAMB113 rakentamisen vaiheita kuvaava kaaviokuva.
Kuvio 5 on plasmidin pAMB30 osittainen restriktio- 20 kartta.
Yksityiskohtainen kuvaus
Bacillus-seriiniproteaaseissa tapahtuu vesiliuoksis-sa irreversiibeli inaktivointi nopeudella, joka suuressa määrin riippuu lämpötilasta ja pH:sta. pH-arvoilla alle 4 25 tai yli 11 inaktivaationopeus on hyvin suuri, kun taas • · · ·Ιρ·. pH-arvoilla 4,5-10,5 nopeus, vaikkakin paljon hitaampi, • · *. kasvaa liuoksen muuttuessa emäksisemmäksi. Yleensä ottaen • · \ . millä tahansa pH-arvolla, mitä korkeampi lämpötila, sitä • · · ’·*·* suurempi subtilisiinin inaktivaationopeus.
30 Säilyvä sekvenssi, Asn-Gly, Bacillus-subtilisiinien • · · : asemissa 109-110 ja erityisesti asemissa 218-219 tunniste- ϊ taan tässä näiden yhdisteiden pH-epästabiilisuudesta vas- tuulliseksi päätekijäksi. Proteiinien ja peptidien Asn-Gly-sekvenssi syklisoituu helposti eri olosuhteissa muodos- 35 taen syklisen imidin anhydroaspartyyliglysiinin [Bornstein • · · « · « • · 9 102969 et ai., Methods in Enzymol. 47 (1977) 132-145] kuten on esitetty kuviossa 1. Tämä syklinen imidi on altis emäksen katalysoimalle hydrolyysille, joka ensisijaisesti tuottaa luontaisesti esiintymättömän β-aspartyylipeptidisidoksen. 5 Lisäksi Asn-Gly:stä peräisin oleva syklinen imidi voi toimia subtilisiinin spesifisen pilkkomisen pilkkomiskohtana. Itse asiassa proteiinien spesifisestä pilkkomisesta Asn-Gly-sidoksien kohdalla emäksisellä hydroksyyliamiinilla on tullut tavanomainen käytäntö valmistettaessa proteiini-10 fragmentteja aminohapposekvenssointia varten. (Bornstein et.ai., supra) .
Syklisen imidin ja/tai β-aspartyyliglysyylipeptidin muodostumisen subtilisiinin asemissa Asn218-Gly219 voidaan ennustaa aiheuttavan entsyymin irreversiibelin inaktivoitumi-15 sen. Tämä ennustus perustuu epästabiilin Asn-Gly-yksikön sijaintiin asemassa 221 sijaitsevan reaktiivisen seriinin välittömässä läheisyydessä. Proteiinirakenteiden atk-ana-lyysi johti siihen käsitykseen, että Asn218-Gly219-sekvenssin uudelleenjärjestäytyminen joko anhydroaspartyyliglysyyliksi 20 tai β-aspartyyliglysyyliksi tuottaa tuloksena Ser221:n sivu-ketjun siirtymän pois asemasta, jossa sen on oltava, jotta entsyymi olisi aktiivinen.
: Epästabiilin yksikön, Asn218-Gly219, eliminoimiseksi subtilisiinimolekyylistä voidaan joko korvata Asn218 millä 25 tahansa muulla aminohapolla paitsi asparagiinilla ja/tai ··.·. vaihtaa Gly219 miksi tahansa muuksi aminohapoksi paitsi gly- » · siiniksi. Vastaavalla tavalla odotetaan epästabiilin Asn- • · · *,. Gly-yksikön asemissa 109-110 modifioinnin olevan edullista • · · ***** keksinnön analogien stabiilisuudelle .
30 Gly219:n havaittu muuttumattomuus subtilisiineissa ja «t · *.* * subtilisiinien kaltaisissa entsyymeissä [esim. kukumisiini »·· V : melonista Cucumis Melo L. var. Prince, Kaneda et.ai., J.
Biochem. 95 (1984) 825-829, ja proteinaasi K, subtilisiinin • · kaltainen seriiniproteaasi sienestä Tritirachium album, 35 Janyet.al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 (1985)485-492] ja • · 10 102969 olettamus, että mtkäli Gly219 olisi mikä tahansa muu ryhmä kuin glysiini, sen sivuketju saattaisi häiritä substraatin sitoutumista entsyymiin, tekevät Gly219:n vaihtamisesta, verrattuna Asn218:n, huomattavasti edullisemman vaihtoehdon 5 epästabiilin Asn218-Gly219-sekvenssin poistamiseksi.
Teoreettisten näkökohtien ja sekvenssointitietojen kerääntymisen ja analysoinnin perusteella asparagiini asemassa 218 korvattiin seriinillä kyseisen keksinnön tällä hetkellä edullisessa muodossa, jota kuvataan seuraavissa 10 havainnollistavissa esimerkeissä. Tämä valinta perustui osittain havaintoon, että kukumisiinin, melonihedelmästä saatu subtilisiinin kaltainen entsyymi, reaktiivista serii-niä ympäröivällä aminohapposekvenssillä on sekvenssi Ser-Gly-Thr-Ser-Met (Kaneda et.ai., supra). Proteiinaasi K:lla 15 on aktiivisen keskuksen ympärillä sama sekvenssi. Jany et.ai., supra. On kuitenkin korostettava, ettei seriinin valinta korvaamaan Asn218: aa estä saman päämäärän saavuttamista, eli epästabiilin yksikön Asn218-Gly219 eliminoimista, korvaamalla asparagiini asemassa 218 muulla aminohapolla. 20 On edullista, että Asn216 korvataan alifaattisella aminohapolla, jolla ei ole varausta, kuten valiinilla, treoniinil-la, kysteiinillä, glutamiinilla tai isoleusiinilla.
Bacillus-mikro-organismit edustavat edullista isän-;V. tää keksinnön mukaisen [Ser218]-subtilisiinin geeniteknistä 25 tuotantoa varten johtuen niiden kyvystä erittää huomattavia t i t proteiinimääriä ja siitä, että niitä nykyään käytetään pe- • · *. * suaineproteaasien valmistuksessa. Koska useimmat Bacillus- * * * . lajit erittävät emäksisiä ja neutraaleja proteaaseja, on • ♦ · ’·*·* edullista tuottaa mutaatioita B. subtiliksen endogeenisten 30 emäksisten ja neutraalien proteaasien geeneihin, niin että ··* ·.· * B. subtilis voi tuottaa ja erittää mutatoitua subtilisiinia • * · ί.ί · muista proteaaseista vapaaseen kasvualustaan. Täten keksin- tö tarjoaa myös mutatoituja B. subtilis -kantoja, jotka
« I
ovat salvattuja endogeenisten proteaasien syntetisoitumi- 4 4 11 102969 seen nähden, mutta joilla on tallella kyky syntetisoida ja erittää subtilisiinianalogeja kuten [Ser218]-subtilisiinia.
Kuten jatkossa yksityiskohtaisemmin kuvataan todettiin että [Ser218]-aprA-geenituotesubtilisiinin pH ja läm-5 pöstabiilisuus ja stabiilisuus pesuainekoostumuksissa on paljon parempi kuin villityypin arpA-geenituotesubtilisii-nin.
Keksinnön mukaisen stabiilin subtilisiinianalogin tuotanto käsitti seuraavat menettelyt: 10 1. Subtilisiinia edustavan aprA-geenin eristys B.
subtiliksesta.
2. AprA-geenin kloonaus oligonukleotidin paikkaoh-jautuvan mutageneesin käyttämisen sallivaan vektoriin haluttujen modifikaatioiden synnyttämiseksi.
15 3. Paikkaohjautuva mutageneesi ja tuloksena saadun DNA:n sekvenssointi halutun mutaation läsnäolon varmistamiseksi .
4 . Ilmaisuvektorin rakentaminen mutatoidun entsyymin synteesin ohjaamiseksi B. subtiliksessa.
20 5. Mutatoitujen B. subtilis -kantojen rakentaminen, jotka eivät syntetisoi subtilisiinia ja neutraalia proteaa-sia.
6. Entsyymin eristys solunulkoisesta kasvualustasta ja sen puhdistus.
' 25 7. Eristetyn tuotteen stabiilisuus- ja aktiivisuus- • · · • .· ominaisuuksien määrittäminen.
• · • *·· 8. Menettelyjen käyttäminen parannettua entsyymiä :V: koodaavan geenin insertoimiseksi aiemmin endogeenisten proteaasien synteesin salpaamiseksi mutatoidun B. subtilis 3 0 -kannan kromosomiin.
• · ·
Esimerkissä 1 subtilisiinia koodaava aprA-geeni • · · eristetään B. subtilis -qenomista. Esimerkissä 2 aprA-qee- *' ‘ niin kohdistetaan paikkaohjautuva mutageneesi. Esimerkissä 3 rakennetaan mutatoidun aprA-geenin sisältävä ilmaisuvek-.·. : 35 tori. Esimerkissä 4 rakennetaan kaksi mutatoitua B. subti- 12 102969 lis -kantaa, jotka eivät tuota havaittavia määriä solunul-koisia proteaaseja. Esimerkissä 5 kuvataan menettelyjä mu-tatoidun aprA-geenin insertoimiseksi B. subtiliksen kromosomiin. Esimerkissä 6 eristetään ja puhdistetaan villi-5 tyypin subtilisiinia ja mut-atoitua aprA-subtilisiinia. Esimerkeissä 7-10 verrataan [Ser218] -subtilisiinin lämpösta-biilisuutta villityypin aprA-geenituotteen ja kaupallisen BPN'-tuotteen lämpöstabiilisuuteen.
Esimerkki 1 10 B. subtilis -kanta QB127 (trpC2 leuA8 sacUh 200) [Lepesant et.ai., Molec. Gen. Genet. 118 (1982) 135-160] saatiin Bacillus-kantakeskuksesta, the Bacillus Genetic Stock Center, the Ohio State University, Columbus, Ohio. Tällä kannalla on solunulkoisen seriinin ja metallipro-15 teaasien, a-amylaasin ja levaanisukraasin ylituotantoa suhteessa isogeenisiin sacU* -kantoihin johtuen sa-cUh200-mutaatiossa ilmenevästä saman geenin vaikutuksesta useaan ominaisuuteen (Lepesant et ai., kirjassa Microbiology, toim. Schlessinger, D. , American Society for Micro-20 biology, Washington, D.C., 1976, s. 65). Kanta QB127 nähtiin täten sopivaksi DNA-lähteeksi subtilisiinia koodaavan aprA-geenin eristämiseksi.
’···’ Genomi-DNA eristettiin B. subtilis -kannan QB127 so- luista julkaistulla menettelyllä [Saito et.ai., Biochim.
: 25 Biophys. Acta 72 (1963) 619-629] . Puhdistettu kromosomi-DNA
• · · j hajotettiin täydellisesti EcoRI-restriktioendonukleaasilla.
·*·.. DNA-fragment it erotettiin elektroforeesilla alhaisen • ;*j*; sulamispisteen omaavalla agaroosigeelillä ja 4,4-8,0 kb:n • · fragmentit erotettiin tavarantoimittajan Bethesda Research t·;·. 30 Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) suosittelemalla V * · I..# DNA: n vakioeristysmenettelyllä. Fragmentit ligatoitiin *. pCFM936:een, talletettu talletusnumerolla ATCC 53 413 tai- * letuslaitokseen the American Type Culture Collection, 12301 : ' : Parklawn Drive, Rockville, Maryland 13. tammikuuta 1986, .] : 35 joka on "harhaileva", korkeissa lämpötiloissa korkeita ko- 13 102969 piolukuja omaava ja kanamysiiniresistenssin mukanaan tuova Escherichia coli (E. coli)-plasmidi.
Vektori hajotettiin EcoRIrlla ja siitä poistettiin fosfori emäksisellä vasikansuolifosfataasilla ennen liga-5 tointia.
Ligatoinnin tuotteet vietiin E. coli C600:aan (saatavana talletusnumerolla ATCC 23724 talletuslaitoksesta the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) ja valikoitiin kanamysiiniresistentit 10 isäntäsolut yön yli kestäneen inkuboinnin jälkeen 10 μg:lla/ml kanamysiiniä täydennetyllä L-agar-agarilla. Plas-midiDNA:ta monistettiin inkuboimalla isäntäsoluja 42°C:ssa 4 tunnin ajan. Pesäkkeet siirrettiin sitten nitrosellu-loosasuodattimille ja niitä käsiteltiin pesäkehybridisaa-15 tiona tunnetulla julkaistulla menettelyllä [Grunstein et.ai. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 72 (1975) 3961].
Käytettiin koetinta subtilisiinigeenin pCFM936:ssa omaavien pesäkkeiden esiin seulomiseksi. Koettimen (syntetisoitu Beaucagen et ai., Tetrahedron Letters 22 (1981) 20 1859-1862, fosfiittikemiamenetelmällä) nukleotidisekvenssi oli (1) 5' GCGCAATCTGTTCCTTATGGC 3’ joka vastaa aprA-geenituotteen aminopäätä [Wong et.ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81 (1984) 1184-1188, Stahl ' 25 et.ai., J. Bacteriol. 158 (1984) 411-418]. Käytettiin 55 °C:n hybridisaatiolämpötilaa ja 400 kpl:n kokonaismää-: rästä tunnistettiin 5 positiivista pesäkettä. Yhden posi- tiivisen pesäkkeen plasmidi-DNA nimettiin pCFM936 apr2 :ksi.
• ·
Plasmidia pCFM936 apr2 hajotettiin pelkästään Eco-30 Rl :11a, pelkästään HindIII:llä ja EcoRI:n ja HindIII:n yh- • · « distelmällä. Subtilisiinigeenin EcoRI-fragmenttien koot • · · olivat samoja kuin Stahlin et ai. artikkelissa kuvatut, '·" supra, mutta useita muutoin maininnoitta jääneitä Hindlll- keskuksia löydettiin. Kuten on kuvattu esimerkissä 3, käy- 14 102969 tettiin kahta näistä Hindlll-keskuksista subtilisiinigeenin geenimanipulaatioissa.
Määritettiin B. subtilis QB127:n genomi-DNA:n suuren 6,5 kb:n EcoRI-fragmentin sisältävän aprA-geenin, sen sää-5 telysekvenssit ja siihen liittymättömiä sivuavia sekvenssejä vahvistamalla, että restriktioentsyymin hajotustuotteet olivat Stahlin et ai., supra, ilmoittamien tulosten mukaisia. Tämä varmistettiin DNA-sekvenssoinnilla käyttämällä dideoksiketjunlopetusmenetelmää (Sanger et ai., J. Mol. 10 Biol. 143 (1980) 161-178). Todettiin myös, että 6,5 kb:n
EcoRI-fragmentin 3,0 kb:n EcoRI-Kpnl-alafragmentti sisälsi aprA-geenin, kuten on esitetty kuviossa 2, sen säätelysek-venssit sekä siihen liittymättömiä sivuavia sekvenssejä. Vaikka Stahlin et ai. artikkelissa ja sen kuvion 1 kuva-15 tekstissä ilmoitetaan Kpnl-EcoRIfragmentin olevan pituudeltaan 2,5 kb:tä, kuvion 1 mittakaavan ja siinä esitetyn fragmentin mittakaavakuvauksen vertailu paljasti, että myös Stahlin et ai. artikkelissa KpnlEcoRI-fragmentti on huomattavasti suurempi kuin 2,5 kb:tä.
20 Plasmidi pAMBll, Bacillus-isäntäjärjestelmien kloo- nausvektori, rakennettiin seuraavasti. Plasmidi pTG402 ,,, (Northern Regional Research Laboratories, United States ;·; Department of Agriculture, Peoria, Illinois, kanta numero ·'·' NRRL B-15264) hajotettiin osittain Rsal-restriktioendonuk- V ’ 25 leaasilla. Fragmentit ligatoitiin M13 mpl8:aan (saatavana • · • *.· Bethesdan tutkimuslaboratoriosta, Bethesda Research Labora- • · : tories, Gaithersburg, Maryland, kataloginumerolla 8227SA), jota oli aiemmin hajotettu HindIII:lla. Ligatointituotteet vietiin E. coli JM103:een (saatavana Pharmacialta, Piscata-30 way, New Jersey, kataloginumerolla 271545-01) transformaa- » · · tiolla [Mandel et.ai., J. Mol. Biol. 53 (1970) 154]. Bakte- • · « riofagiplakit sumutettiin 0,5M katekolilla (valmistettu tislattuun veteen) pTG402:sta peräisin olevan xylE-geenin toiminnallisen ilmaisun havaitsemiseksi. xylE-geeni koodaa , ; 35 katekoli-2,3-dioksigenaasia ja se on käyttökelpoinen pro- 15 102969 moottorien havaitsemiseen lukuisissa organismeissa. Zu-kowski et.ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 80 (1983) 1101-1105.
xylE-geeni siirrettiin sitten 1,0 kb:n EcoRI Pstl-5 fragmenttina E. coli/B. subtilis -plasmidiin pHV33 (saatavana talletuslaitoksesta the American Type Culture Collection talletusnumerolla ATCC 39217) [Primrose et.ai., Plasmid 6 (1981) 193-201], joka saatiin R. Dedonderilta (Pas-teur-instituutti, Pariisi, Ranska). Plasmidia pHV33 oli 10 ensin hajotettu EcoRI :11a ja Pstl-.llä, niin että ligatoita-essa se tälle alueelle xylE:n sisältävä fragmentti inakti-voisi ampisilliiniresistenssin geenin. Tuloksena saatu plasmidi, pAMB21, sisältää E. coli -isäntäsoluissa toiminnallisen xylE-geenin, mutta vaatii xylE:n promoottorin li-15 säämisen tullakseen ilmaistuksi B. subtilis -isäntäsoluissa. pAMB21:n sisältävät E. coli -solut ovat resistenttejä tetrasykliinille (15 μg/ml) ja kloramfenikolille (20 /;g/ml) , kun taas pAMB21:n sisältävät B. subtilis -solut ovat resistenttejä vain kloramfenikolille (5 μg/ml).
20 Bakteriofagi lambdan toop-transkription lopetusse- kvenssi siirrettiin sitten plasmidista pCFM936 (400 emäs-... parin Pstl-Bglll-fragmentissa) pAMB21:n yksittäiseen Pstl-
;·; keskukseen. Rakennettiin synteettinen sekvenssin 5 ' GATCTGCA
'·’·* 3' omaava nukleotidi yhdistämään toop-fragmentin Bglll-pää ‘ 25 vektorin pAMB21 PstI-keskukseen. Tuloksena saatu plasmidi • · · • V nimettiin pAMB22:ksi, ja sen ominaisuudet olivat pAMB21:een • · • *.· nähden identtiset lukuunottamatta transkription lopetusse- kvenssin mukaanottoa. Plasmidi pAMB22 on käyttökelpoinen « · toteamaan vahvoja, B. subtiliksessa toiminnallisia promoot-30 toreita.
» · · xylE:n ja toop-.in sisältävä pAMB22:n DNA:n 1,4 kb:n ♦ · ·
EcoRI - Bglll-fragmentti eristettiin restriktiofragmenttien elektroforeesin jälkeen alhaisen sulamispisteen omaavasta agaroosigeelistä. 1,4 kb:n DNA-palanen ligatoitiin plasmi-.·. : 35 diin pBD64 (saatavana Bacillus-kantakeskuksesta, Bacillus 16 102969
Genetic Stock Center, numerolla 1E22), jota oli aiemmin hajotettu EcoRI:11a ja BamHI:llä. Tuloksena saatu 5,3 kb:n plasmidi, pAMBll, sisältää Ml3mpl8 :n moniliittäjäsekvenssin (EcoRI, SstI, Xmal, Sma, BamHI ja Xbal), ylävirtaan xylE--5 geenistä, jota seuraa toop, kuten on esitetty kuviossa 3. Plasmidi pAMBll kykenee replikoitumaan B. subtiliksessa ja tuottaa isäntäsoluille kloramfenikoli(5 /ig/ml)-ja/tai kana-mysiini (5 μg/ml)-resistenssin.
Kuten on esitetty kuviossa 4, kloonattiin puhdistet-10 tu aprA:n sisältävä EcoRI - Kpnl-fragmentti kloonattiin pAMBll:een, jolloin muodostui pAMBlll. Ligatointituotteet vietiin B. subtilis MI112:een (arg-15 leuB thr5 recE4) (saatavana Bacillus-kantakeskuksesta, Bacillus Genetic Stock Center, numerolla 1A423) protoplastitransformaa-15 tiomenetelmällä [Chang et al., Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115]. Plasmidi-DNA:ta sisältämätön B. subtilis MI112 on proteaasituottokykyinen (Prt*-fenotyyppi) , mutta erittyneet subtilisiinitasot ovat verraten alhaisia. Kloramfenikoli-resistentit (Cmr) transformantit siirrettiin 1,5 %:11a (w/v) 20 kuorittua maitoa ja 5 ^g:lla/ml kloramfenikolia täydennettyihin L-agar-agar-maljoihin, ja niitä inkuboitiin sitten 37 °C:ssa.
Yön yli (noin 16 tuntia) jatkuneen inkuboinnin jäl- keen 37 °C:ssa uuden rekombinanttiplasmidin (nimetty *.* * 25 pAMBlllrksi) sisältävät MI112-pesäkkeet tuottivat kutakin • · · • *.· pesäkettä ympäröivän selvän kehän. Kehät muodostuivat sub- • *.· tilisiinin proteolyyttisestä vaikutuksesta kasvualustaa täydentävän kuoritun maidon sisältämään kaseiiniin. Pelkäs-tään vektorin pAMBll sisältävälle MI112:lle ei ollut muo-30 dostunut havaittavaa kehää 16 tunnin aikana, vaikkakin haa- • · · lea kehä lopulta muodostui 40 tunnin 37 °C:ssa kuluttua.
• · ♦ pAMBlll.-n sisältävät solut erottuivat selvästi pAMBll :n si-: sältävistä soluista kehän kokoeron perusteella. AprAgeenin kloonauksen täysin toiminnallisessa muodossa oli täten 17 102969 osoitettu johtaneen B. subtiliksen subtilisiinin tuotannon ja erityksen korkeaan tasoon.
Esimerkki 2
Kuten edelleen on esitetty kuviossa 4, hajotettiin 5 3,0 kb:n EcoRI - Kpnl -genomifragmenttia, jonka eristystä on kuvattu esimerkissä 1, Hindllltlla, jolloin muodostui kolme fragmenttia: (1) 1,1 kb:n EcoRI - HindiII -fragmentti, joka sisälsi aprA-geenin ilmaisun geneettiset säätely-sekvenssit, geenin "pre-pro" -alueen, joka vaaditaan subti-10 lisiinin kuljetukseen solun ulkopuolelle, ja valmiin subtilisiinin 49 ensimmäistä aminohappoa koodaavan DNAsek-venssin, (2) 1,1 kb:n Hindlll - Hindlll -fragmentin, joka sisälsi subtilisiinin aminohappoja 50-275 (karboksyylipää) koodaavat DNA-sekvenssit sekä transkription lopetussekvens-15 sin ja 3' ei-koodaavia sekvenssejä, ja (3) 0,8 kb:n
Hindlll - Kpnl -fragmentin, joka sisälsi 31-ei-koodaavia sekvenssejä.
Hindlll-keskuksien sivuama 1,1 kb:n fragmentti kloonattiin bakteriofagi M13 mpl8:n yksittäiseen Hindlllkeskuk-20 seen DNA-sekvenssointia ja paikkaohjautuvaa mutageneesiä varten. Yksi rekombinanteista, joka nimettiin M13 mpl8 apr2:ksi, tuotti yksisäikeisen templaatti-DNA:n, joka tarvitaan aprA- geenin paikkaohjautuvaan mutageneesiin.
AprA-geenin koodausalue sekvenssoitiin ja sekvens-' 25 sointitulokset on esitetty alla taulukossa 1. Tulee huoma- • · · • *.’ ta, että aprA-geenin sekvenssointi-informaation johtoalueen • · • *·· 5 ensimmäisen kodonin nimenomainen identiteetti on peräisin :V: Stahlin et ai., supra, ja Wongin et ai., supra, julkaisuis ta ja että kodonisekvenssieroavaisuuksia Stahliin et ai., 30 supra, nähden löytyy aminohappoasemista 84 ja 85 eroavai-suuksien saattaessa johtua sekvenssointivirheestä Stahl et • · · ai. julkaisun kirjoittajien puolelta tai saattaessa olla tulos käytettyjen kantojen nukleotidisekvenssieroicta. Eri- 18 102969 tyisesti Stahl et al., supra, ilmoittavat kodonin GTT (koo-daa valiinia) aminohappoasemaan 84, kun taas taulukossa 1 esiintyy kodoni GTA (koodaa myös valiinia). Stahl et ai., supra, ilmoittavat niin ikään kodonin AGC (koodaa seriiniä) 5 aminohappoasemaan 85, mitä vastoin taulukossa 1 esiintyy kodoni GCG (koodaa alaniinia).
• · · • · · • * • · • · • · • «· • · • · · • · · • · • · ♦ i » » • · · ·· · • · · • · · « « -105
Taulukko 1 19 102969
fMet Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala GTG AGA AGC AAA AAA TTG TGG ATC AGC TTG TTG TTT GCG
5 Leu Thr Leu Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala
TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCG TTC AGC AAC ATG TCT GCG
Gin Ala Ala Gly Lys Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Vai
CAG GCT GCC GGA AAA AGC AGT ACA GAA AAG AAA TAC ATT GTC
10 Gly Phe Lys Gin Thr Met Ser Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys
GGA TTT AAA CAG ACA ATG AGT GCC ATG AGT TCC GCC AAG AAA
Lys Asp Vai Ile Ser Glu Lys Gly Gly Lys Vai Gin Lys Gin
AAG GAT GTT ATT TCT GAA AAA GGC GGA AAG GTT CAA AAG CAA
15 Phe Lys Tyr Vai Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu Asp Glu Lys
TTT AAG TÄT GTT AAC GCG GCC GCA GCA ACA TTG GAT GAA AAA
Ala Vai Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Vai Ala Tyr Vai
GCT GTA AAA GAA TTG AAA AAA GAT CCG AGC GTT GCA TAT GTG
-1 +1 :20 Glu Glu Asp Kis Ile Ala His Glu Tyr Ala Gin Ser Vai Pro
GAA GAA GAT CAT ATT GCA CAT GAA TAT GCG CAA TCT GTT CCT
1° . Tyr Gly Ile Ser Gin Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gin
TAT GGC ATT TCT CAA ATT AAA GCG CCG GCT CTT CAC TCT CAA
• · : *“ 20 30
Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Vai Lys Vai Ala Vai Ile Asp Ser
GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA AAA GTA GCT GTT ATC GAC AGC
40
Gly Ile Asd Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Vai Arg Gly Gly
GGA ATT GAC TCT TCT CAT CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA
• ·:··: 50 60 30 Ala Ser Phe Vai Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gin Asp Gly
GCA AGC TTC GTA CCT TCT GAA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC
• · 70
Ser Ser His Gly Thr His Vai Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu
AGT TCT CAC GGT ACG CAT GTA GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT
102969
Taulukko 1 (jatkoa) 80
Asn Asn Ser Ile Gly Vai Leu Gly Vai Ala Pro Ser Ala Ser 5 AAT AAC TCA ATC GGT GTT CTG GGC GTA GCG CCA AGC GCA TCA
90 100
Leu Tyr Ala Vai Lys Vai Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gin
TTA TAT GCA GTA AAA GTG CTT GAT TCA ACA GGA AGC GGC CAA
110 10 Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn
TAT AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCC ATT TCC AAC
120 130
Asn Met Asp Vai Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly
AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT ACT GGT
140 15 Ser Thr Ala Leu Lys Thr Vai Vai Asp Lys Ala Vai Ser Ser
TCT ACA GCG CTG AAA ACA GTC GTT GAC AAA GCC GTT TCC AGC
150
Gly Ile Vai Vai Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser
GGT ATC GTC GTT GCT GCC GCA GCC GGA AAC GAA GGT TCA TCC
160 170 20 Gly Ser Thr Ser Thr Vai Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser
GGA AGC ACA AGC ACA GTC GGC TAC CCT GCA AAA TAT CCT TCT
180
Thr Ile Ala Vai Gly Ala Vai Asn Ser Ser Asn Gin Arg Ala :,V ACT ATT GCA GTA GGT GCG GTA AAC AGC AGC AAC CAA AGA GCT
190 200 i *.! 25 Ser Phe Ser Ser Ala Gly Ser Glu Leu Aso Vai Met Ala Pro
I·.’ TCA TTC TCC AGC GCA GGT TCT GAG CTT GAT GTG ATG GCT CCT
• # · 210
Gly Vai Ser Ile Gin Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly
GGC GTG TCC ATC CAA AGC ACA CTT CCT GGA GGC ACT TAC GGC
• · · • · · 220 30 Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Vai Ala Gly
GCT TAT AAC GGA ACG TCC ATG GCG ACT CCT CAC GTT GCC C-GA
« · · · 230 240
Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn / . GCA GCA GCG TTA ATT CTT TCT AAG CAC CCG ACT TGG ACA AAC
250 35 Ala Gin Vai Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu
GCG CAA GTC CGT GAT CGT TTA GAA AGC ACT GCA ACA TAT CTT
102969
Taulukko 1 (jatkoa) 21 260 270
Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Vai Gin c GGA AAC TCT TTC TAC TAT GGA AAA GGG TTA ATC AAC GTA CAA
275
Ala Ala Ala Gin OC
GCA GCT GCA CAA TAA TAGTAAAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCT TCTTTTTATTTGTCAGCATCCTGATGTTCCGGCGCATTCTC
10 Paikkaohjautuva mutageneesi suoritettiin va- kiomenetelmällä. Norrander et ai. , Gene 26 (1983) 101-106. M13mpl8 apr2:sta peräisin oleva yksisäikeinen DNA liitettiin lämmöllä mutageeniseen alukkeeseen (2) 5' GGCGCTTATAGCGGAAC 3' 15 joka syntetisoitiin fosfiittikemiamenetelmällä (Beaucage et ai., supra). Synteettinen aluke oli homologinen subti-lisiinin aminohappojen 216-220 kodonien kanssa paitsi yhden emäsmuutoksen osalta aminohapon 218 kodonissa (AGC AAC:n asemasta). Tämä muutos salli mutatointireaktion korvata 20 aseman 218 alkuperäinen asparagiinikodoni seriinikodonil-la.
,···, Synteettinen aluke liitettiin M13 mpl8 apr2 DNArhan lämmöllä 65 °C:ssa, ennen kuin se jäähdytettiin hitaasti M huoneen lämpötilaan (noin 22 °C) . Seurasi polymerointi 2 25 tunnin ajan 15 °C:ssa reaktioseoksessa, joka koostui 12,5 • · ·
! ·* μl:sta lämpökäsiteltyä DNA-liuosta, 2,5 ^l:sta 10 mM
« · : *·* dATPrtä, dGTP:tä, dCTP:tä ja dGTPrtä kutakin, 2,0 μΐ-.sta 12 » · mM ATP:tä, 0,1 μl:sta Klenowin DNA-polymeraasia, 0,1 μl:sta T4 DNA-ligaasia ja 13 μl:sta steriiliä tislattua vettä.
;*·*: 30 Tuloksena saatu kaksisäikeinen, kovalenttisesti sulkeutunut ♦ renkaanmuotoinen DNA vietiin E. coli JM103:een transfektion • · ♦ ♦ • avulla.
Bakteriofagiplakit siirrettiin sitten Gene Screen™" (New England Nuclear, Beverley, Massachusetts) hybridisaa-;*·,· 35 tio-kalvoille. Halutun emäsmuutoksen omaavaa DNA:ta sisäl- « * 22 102969 tavat plakit identifioitiin hybridisoimalla radioaktiivisesta leimattuun (γ-32ρ) synteettiseen oligonukleotidiin (2), jota oli käytetty edellä kuvatussa mutatoinnin aluke-reaktiossa. Hybridisaatio suoritettiin rajoittavassa lämpö-5 tilassa (52 °C) , niin että vain Ser218-mutaation omaava DNA hybridisoituisi synteettiseen oligonukleotidiin. Ser218-mu-taation läsnäolo yksittäisestä puhdistetusta plakista, joka nimettiin M13 mpl8 apr2 [Ser218] :ksi, peräisin olevan DNA:n aprA-geenissä varmistettiin DNA-sekvenssoinnilla Sangerin 10 et ai. menetelmällä, supra.
Esimerkki 3 [Ser218] -subtilisiinin ilmaisemiseksi B. subtilikses-sa rakennettiin sopiva plasmidivektori hajottamalla pAMBlll:tä HindIII:lla. Suurimman osan aprA-geenistä sisäl-15 tävä 1,1 kb:n segmentti poistettiin uudelleenligatoimalla pAMB111:n Hind-111-hajotuksen tuotteet noin ^g:n/ml pitoisuutena. Tämän tuloksena muodostui pAMBHO, kuten on esitetty kuviossa 4. Plasmidi pAMBHO sisältää subti-lisiinigeenin ilmaisun geneettiset säätelysekvenssit, sub-20 tilisiinin eritykseen vaadittavan "pre-pro" -alueen ja valmiin subtilisiinin 3'-ei-koodaavaa aluetta sekä valmiin subtilisiinin 4 9 ensimmäistä aminohappoa koodaavan DNA-sek-venssin. Koska pAMB110:lta puuttuu aminohappoja 50-275 koo-; daava DNA, se ei syntetisoi subtilisiinia B. subtilis '·* 25 -isäntäsoluihin vietäessä . Subtilisiinia syntetisoituu vas- • « «
• * * · I I I I I I
: ta, kun on insertoitu loput subtilisunigeenistä, joko na- • · • ’· tiivi-DNA-sekvenssi tai analogin koodaussekvenssi, kuten • · :/·/· [Ser218]-subtilisiinia koodaava sekvenssi.
M13 mpl8 apr2 [Ser218]:sta peräisin olevaa kaksi-30 säikeistä DNA: ta hajotettiin Hindlll: 11a . [Ser218]-mutaation käsittävän aprA-geeni segment in sisältävä 1,1 kb:n fragment- i · · • < ti ligatoitiin sitten pAMB110:aan, jota oli aiemmin hajo- • ‘ tettu HindIII:lla. Ligatointituotteet vietiin B. subtilik- • · · ·...’ seen transformaation avulla kuten esimerkissä 1 edellä. 1,1 35 kb:n Hindlll-fragmentin ligatointi oikeansuuntaisesti suun- *
Ml·· I · 23 1 0 2 9 6 9 nattuna (mikä vahvistettiin DNA-sekvenssoinnilla Sangerin et ai. menetelmällä, supra) mutatoidun geenin ilmaisemiseksi tuotti plasmidin pAMB113, joka ohjasi [Ser218] -subti-lisiinin synteesiä ja eritystä B. subtilis -isäntäsoluissa.
5 Esimerkki 4
Koska useimmat Bacillus-lajit erittävät ympäröivään kasvualustaan emäksisiä ja/tai neutraaleja proteaaseja, on edullista tuottaa mutaatioita B. subtiliksen endogeenisten emäksisten ja neutraalien proteaasien geeneihin ko. prote-10 aasien synteesin salpaamiseksi, niin että mutanttisoluun vietäessä mutatoidut subtilisiinigeenit voivat tuottaa mu-tatoituja subtilisiineja, jotka sitten erittyvät muista proteaaseista, jotka todennäköisesti häiritsisivät natii-vien subtilisiinianalogien eristystä, vapaaseen kasvualus-15 taan. Kaksi B. subtilis -mutanttikantaa, BZ24 ja BZ25, jotka eivät tuota havaittavia määriä solunulkoisia proteaaseja, rakennettiin seuraavalla tavalla.
Ensin rakennettiin plasmidivektori, joka kykenee replikoitumaan E. colissa mutta ei B. subtiliksessa, ellei 20 sitä ole liitetty B. subtilis -kromosomiin homologisella rekombinaatiolla, seuraavasti. Plasmidi pBD64 (Bacillus- ^ kantakeskus, Bacillus Genetic Stock Center, numero 1E22) . ! hajotettiin täydellisesti HpaII:lla, jolloin saatiin kolme •' fragmenttia, jotka olivat kooltaan 2,95 kb:tä, 1,0 kb:tä ja ’·’ " 25 0,75 kb: tä. Nämä fragmentit ligatoitiin sitten seoksena 5 .* plasmidiin pBR322 (A.T.C.C. 37017), jota oli aiemmin hajo- • · • '·· tettu Clal:llä. Ligatoinnin tuotteet vietiin E. coli • · C600:aan (saatavana talletuslaitoksesta the American Type
Culture Collection talletusnumerolla ATCC. 23724) transfor- ·'·*; 30 maation avulla [Mandel et ai., J. Mol. Biol. 53 (1970) 154] . Valikointi suoritettiin kloramfenikoli (20 ^g/ml)- ja ampisilliini(50 μg/ml) -resistenttien solujen suhteen.
' * Plasmidi- DNA 12 transformantista valmistettiin emäksisellä • · · uuttomenettelyllä [Birnboim et ai., Nucleic Acids Res. 7 35 (1979) 1513-1523] , minkä jälkeen sitä hajotettiin Hindlllm % 1 24 102969 ja EcoRI:n yhdistelmällä insertoituneen/-eiden fragmen-tin/-ttien läsnäolon vahvistamiseksi. Yhden tällaisen plas-midin, joka nimettiin pAMB30:ksi, todettiin sisältävän pBD64:n 1,0 kb:n ja 0,75 kb:n Hpall-fragmentit pBR322:n 5 Clal-keskuksessa. Nämä fragmentit sisältävät kloramfeniko- liasetyylitransferaasi(cat)-geenin, joka on toiminnallinen E. colissa ja B. subtiliksessa. Hajotukset BglII:lla ja erikseen Sau3A:lla varmistavat cat-geenin identiteetin ja suuntautumisen pAMB30:ssä, kuten on esitetty kuviossa 5.
10 Koska pAMB30 : Itä puuttuu B. subtiliksessa toiminnal linen replikaation aloituskohta -sekvenssi, se ei kykene replikoitumaan riippumattomana replikonina B. subtilis-isäntäsoluissa. Toisaalta pAMB30 sisältää pBR322:sta peräisin olevan, E. colissa toiminnallisen replikaation aloitus-15 kohdan, joten plasmidia voidaan lisäännyttää E. coli -isän-täsoluissa. Plasmidi pAMB30 on käyttökelpoinen ainakin kahdella tavalla. Ensinnäkin voidaan havaita B. subtiliksessa toiminnallisen replikaation aloituskohdan sisältävä DNA-fragmentti kloonattaessa se pAMB30:een, niin että plasmidi 20 replikoituu riippumattomasti kromosomin ulkopuolisessa tilassa. Toiseksi plasmidi pAMB30 voi integroitua B. subtilis -genomiin kromosomin ja pAMB30:een kloonatun B. subtilis !'! -DNA:n väliseen homologiseen kohtaan. Tämä tapahtuma on • ’ toistuvasti osoitettu aiemmin [Haldenwang et ai., J. Bacte- « « « '·' ' 25 riol. 142 (1980) 90-98, Young, J. Gen. Microbiol. 129 • · · i .* (1983) 1497-1512] käyttämällä pAMB30:een nähden samankal- • · • *·· täisiä, mutta ei sen kanssa identtisiä, plasmidivektoreita.
• ·
Plasmidia pAMB21 (jota kuvattiin esimerkissä 1) hajotettiin EcoRI:lla ja Pstl:llä 1,0 kb:n fragmentissa ole-.*·*· 30 van xylE-geenin eristämiseksi. Fragmentti ligatoitiin pAMB30:een, jota oli aiemmin hajotettu EcoRI.-lla ja PstI:llä. Ligatointituotteet vietiin E. coli C600:aan transformaation avulla. Valikointi tapahtui kloramfenikoli- « · · resistenttien (20 μg/ml) isäntäsolujen suhteen, jotka oli-: 35 vat ampisilliiniherkkiä (50 μg/ml) johtuen pAMB21:n xylE- • t 25 1 0 2 9 6 9 fragmentin insertoimisesta pAMB30:n ampisilliiniresistens-sin rakennegeeniin. Tuloksena saadun plasmidin, pAMB30/21:n, ominaisuudet ovat identtiset pAMB30:een nähden, mutta se sisältää lisäksi toiminnallisen xylE-geenin. 5 Plasmidia pAMBHO, joka sisältää valmiin subtilisii- nin jälkimmäisiä 226 aminohappoa koodaavalta alueelta poistetun aprA-geenin, hajotettiin EcoRI:lla ja Kpnl:llä.
B. subtilis DNA:n 1,9 kb:n fragmentti, joka sisälsi AprA-geenin ilmaisun geneettiset säätelysekvenssit, "pre-pro" 10 -alueen, valmiin subtilisiin 49 ensimmäistä aminohappoa koodaavan DNA-sek-venssin ja 3'-ei-koodaavia sekvenssejä, ligatoitiin pAMB30/21:een, jota oli aiemmin hajotettu EcoRI:lla ja Kpnl:llä. Ligatointituotteet vietiin E. coli C600:aan transformaation avulla. Plasmidi-DNA useista 15 transformanteista eristettiin Birnboimin et ai., supra, emäksisellä uuttomenettelyllä, ja insertoidun 1,9 kb:n fragmentin läsnäolo vahvistettiin moninkertaisilla restrik-tioendonukleaasihajotuksilla. Yksi tällainen plasmidi, joka nimettiin pAMB301:ksi, otettiin talteen myöhempää käyttöä 20 varten.
B. subtilis -kannalla BGSC1A274 (Bacillus Genetic
Stock Center) on mutaatio npr-keskuksessa, eikä se kykene '! tuottamaan solunulkoisia neutraaleja proteaaseja. Plasmidi ; ; pAMB3 01 integroitiin B. subtilis BGSClA274:n genomiin 25 transformoimalla transformoitumiskelpoisia soluja [Spizi- :V zen, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 44 (1958) 1072-1078].
• · : *·* Valikointi suoritettiin kloramfenikoliresistenttien (5 • · μg/ml) isäntäsolujen suhteen, jotka siirrettiin sitten steriilien hammastikkujen avulla 1,5 %:lla (w/v) rasvatonta :*·*: 30 maitojauhetta ja kloramfenikolilla (5 μg/ml) täydennetylle L-agaragarille. Niiltä soluilta, jotka eivät onnistuneet • # tuottamaan selvää pesäkettä ympäröivää kehää, puuttui kyky tuottaa solunulkoisia neutraaleja proteaaseja ja seriinip- ( 4 » roteaaseja johtuen npr-mutaation ja vastikään tuotetun ap- i 35 rA-mutaation yhdistelmästä. AprA-mutaatio eli valmiin sub- • 4 « I « « 4 « 26 102969 tilisiinin jälkimmäisten 226 aminohapon poisto johtuen vil-lityypin aprAgeenin korvaamisesta pAMB301:n sisältämällä poiston sisältävällä muodolla. Yhdellä tällaisella kannalla, joka nimettiin BZ24:ksi, on Npr" Apr' Cmr-fenotyyppi, 5 joten se ei tuota havaittavia määriä solunulkoisia neutraaleja proteaaseja eikä solunulkoisia emäksisiä proteaaseja ja on resistentti kloramfenikoli pitoisuudelle 5 μ9/ιη1. Southernin blot -määritystä [Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517] käytettiin varmistamaan aprA-geenin poisto 10 B. subtilis BZ24:n kromosomista. B. subtilis BZ24:n viljely antibioottia sisältävässä kasvualustassa nro 3 (Penassay Broth, Difco, Detroit, Michigan) ilman valikointia eri antibioottien suhteen noin 32 sukupolven ajan johti BZ24-joh-dannaiskannan eristykseen, jossa isäntäsoluille kloram-15 fenikoliresistenssin tuottava cat-geeni oli hävinnyt johtuen sen epästabilisuudesta BZ24-kromosomissa. Tällainen ilmiö on havaittu aiemmin samankaltaisissa kokeissa [Stahl et ai., J. Bacteriol. 158 (1984) 411-418]. Kloramfenikolil-le herkkä BZ24-johdannainen nimettiin BZ25:ksi. B. subtilis 20 BZ25:llä on NprApr" -fenotyyppi, joten se ei tuota havaittavia määriä solunulkoisia neutraaleja proteaaseja eikä solunulkoisia emäksisiä proteaaseja. Southernin blot -määri-
• I
*··' tystä käytettiin varmistamaan aprA-geenin tuhoutuminen B. subtilis BZ25 :n kromosomista.
: 25 Koska B. subtilis BZ25 ei tuota havaittavia solunul- : koisia neutraaleja proteaaseja eikä subtilisiima, se on ·*·.. käyttökelpoinen isäntäkanta, johon viedä plasmidi DNA:ta • kuten pAMB1113 DNArta tuotettaessa mutatoituja subti- • · lisiineja, jotka voivat erittyä ympäröivään, muista prote-3 0 aaseista vapaaseen kasvualustaan.
• · · I.. B. subtilis BZ25 ei tuota havaittavia solunulkoisia • · « * · ♦ *. proteaaseja analysoitaessa viljelmäsupernatantte^a kuten alla on kuvattu. B. subtilis BZ25/pAMB113, joka on plasmi-: : din pAMB113 sisältävä (vietynä Changin et ai., supra, pro- ; 35 toplastitransformaatiomenetelmällä) BZ25, tuottaa huomatta- 27 102969 via määriä [Ser21B]-subtilisiinia analysoitaessa viljelmä-supernatantteja kuten on kuvattu.
Esimerkki 5 [Ser218]-subtilisiinigeenin integroimisen B. subti-5 liksen kromosomiin uskottiin tarjoavan tehokkaan tavan lisätä tämän mutanttigeenin geneettistä stabiilisuutta. Tämä lähestymistapa myöskin rajoittaa kloramfenikolin läsnäolon vaatimusta fermentointialustassa, mitä muutoin tarvitaan valikoivan paineen synnyttämiseen plasmidi-DNA:n pitämisek-10 si kromosomin ulkoisessa tilassa. Tämän vuoksi Ser218]-sub-tilisiinigeeni eristettiin geneettisten säätelysekvenssien-sä ja sivuavaan B. subtilis -kromosomiin nähden homologisen DNA ohella alhaisen sulamispisteen omaavasta agaroosigee-listä, kun oli ensin suoritettu EcoRI:n ja Pstl-.n yhdistel-15 mällä hajotetun pAMB113:n elektroforeesi. 4,0 kb:n
EcoRI - PstI -fragmentti (esitetty kuviossa 4) ligatoitiin sitten pAMB30:een (esitetty kuviossa 5) , jota oli hajotettu EcoRI:n ja PstI:n yhdistelmällä. Ligatointituotteet vietiin E. coli HBl01:een (ATCC 33694) transformaation avulla. Va-20 likointi tapahtui kloramfenikoliresistenttien (20 μg/ml) solujen suhteen. Neljän edellä esitetyn valintaperusteen täyttävän transformantin plasmidi-DNA eristettiin Birnboi-min et ai., supra, emäksisellä uuttomenettelyllä, ja hajotettiin sitä sitten EcoRI:n ja Pstl:n yhdistelmällä. Kaikki : 25 neljä plasmidia sisälsivät 4,0 kb:n insertoidun fragmentin • · · : \· ja pAMB30:n 5,6 kb:n loppuosan. Yksi tällainen plasmidi, joka nimettiin pAMB302:ksi, puhdistettiin ja säilytettiin • myöhempää käyttöä varten.
• ·
Toistuvat yritykset integroida plasmidi pAMB302 t·;·, 3 0 B. subtilis BZ25:n kromosomiin kompetenssimenetelmällä • · · (Spizizen, supra) epäonnistuivat. Tämä saattoi johtua sii- • · · • · · *. tä, ettei BZ25-soluista tullut transformoitumiskelpolsia käytetyllä menetelmällä. Tämän vuoksi pAMB302 vietiin B. subtilis BZ25 -soluihin Changin et.ai., supra, protoplasti-. 35 transformaatiomenetelmällä. Tämän uskotaan olevan ensimmäi- i * * I I M · 28 102969 nen näyttö siitä, että protoplastitransformaatiomenetel-mällä onnistutaan saamaan aikaan heterologisen DNA:n integroituminen Bacilluksessa. Tämä tulos on erityisen merkityksellinen sikäli, että tutkimuskannat, joissa integroitumi-5 nen on aikaansaatu, valittiin sen perusteella miten transformoituminen kompetenssimenetelmällä onnistui. Kannat, jotka mahdollisesti ovat kykenemättömiä muuttumaan kompetenteiksi, ja erityisesti teolliset kannat, joita ei ole valittu transkompetenssimenetelmän perusteella, saattavat 10 todennäköisemmin olla kykenemättömiä muuttumaan kompetenteiksi .
Valikointi tapahtui kloramfenikoliresistenttien (5 μg/ml) solujen suhteen, jotka siirrettiin sitten steriilien hammastikkujen avulla 1,5 %:lla (w/v) kuorittua maitoa ja 15 5 μg:lla/ml kloramfenikolia täydennetylle L-agar-agarille.
Soluja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa. Eri halkaisijan omaa- via selviä kehiä havaittiin Cmr-pesäkkeiden ympärillä. Tämä osoittaa näiden solujen tuottaneen ja erittäneen subti- lisiinia. Yritettiin eristää plasmidi-DNA:ta kahdeksasta 20 pesäkkeestä emäksisellä uuttomenetelmällä. Plasmidi-DNA:ta ei todettu agaroosigeeleistä, jotka oli värjätty etidibro- midilla (1 mg/ml) DNA:n näkyväksi tekemiseksi elektroforee- ,sin jälkeen. Kromosomin ulkoisen plasmidiDNA:n puuttuminen v.: subtilisiinia tuottaneista Cmr-soluista oli vahva osoitus : 25 siitä, että pAMB302 oli integroitunut B. subtiliksen kro- ·*·’: mosomiin.
• · V." Tämän kokeen tuloksena saaduista pesäkkeistä eris- tettiin useita ja ne nimettiin BZ29:ksi, BZ30:ksi, • · · BZ31:ksi, BZ32:ksi ja BZ33:ksi. Kutakin kantaa viljeltiin ... 30 yön yli 37 °C:ssa voimakkaasti sekoittaen aivo-sydänin- • · · fuusiokasvualustassa (BHI, Difco) , jota oli täydennetty 5 • · · *·' ’ μg: lla/ml kloramf enikolia. Vil jelmäsupernatanteista ana- ·:" lysoitiin subtilisiiniaktiivisuus . B. subtil is-kannat BZ28 , BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 ja BZ33 tuottivat kaikki subtilisii-35 nia ja erittivät sitä ympäröivään kasvualustaan joidenkin 29 102969 kantoien tuottaessa enemmän kuin muut. Nestemäisestä vil-jelmäliemestä todetut subtilisiinin määrät olivat suoraan verrannollisia kuorittua maitoa sisältävissä L-agar-agar--maljoissa havaittujen kehien kokoon. Koska näiden solujen 5 erittämät subtilisiinimäärät vaihtelivat, oletettiin joko monikertaisten pAMB302-kopioiden integroituneen kromosomiin tai geeniamplifikaation tapahtuneen [Young, J. Gen. Microbiol. 129 (1983) 1497-1512, Albertini et.ai., J. Bacteriol. 162 (1985) 1203-1211].
10 Esimerkki 6
Villityypin subtilisiinia BZ25/pAMBlll:stä ja [Ser 21S] -subtilisiinia BZ25/pAMB113 : sta eristettiin ja puhdistettiin seuraavasti. Kutakin viljelmälientä sentrifugoi-tiin 15 000 g:ssä 30 minuutin ajan ja kirkkaan supernatan-15 tin sisältämä proteiini saostettiin (NH4) 2S04:llä (350 g/1) .
Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla ja hieronnan 75 %:lla asetonilla jälkeen se suodatettiin ja kuivattiin va-kuumissa.
Entsyymin edelleenpuhdistamiseksi kuivattu sakka 20 liuotettiin veteen, liuos suodatettiin ja dialysoitiin sitten 0,02M natriumfosfaattipuskuria, pH 6,3, vastaan. Dialysoitu liuos kaadettiin karboksimetyyliselluloosakolon-niin (2,5 x 15 cm) nopeudella 2 ml minuutissa. Kun kolonni oli pesty 0,02M natriumfosfaatilla (pH 6,3), entsyymi 25 eluoitiin käyttäen samaa puskuria, joka sisälsi 0,15M NaCl.
• · · : Huippufraktiot yhdistettiin ja entsyymiä sisältävien frak- tioiden, identifioituna fraktiosta otetun näytteen värin • muutoksesta sekoitettaessa se sukkinyyli-Lalanyyli-L-ala- • · nyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-p-nitroanilidiin (Vega 30 Biochemicals) , proteiini saostettiin lisäämällä 2,5 tila- 9 9 9 vuutta asetonia. Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla ja • · · *. liuotettiin sitten 0,005M kalsiumasetaattiin (noin 1 ml/ 10 mg). Tuloksena saatua liuosta dialysoitiin 4 °C:ssa vet-: : tä vastaan ja kylmäkuivattiin sitten.
30 1 0 2 9 6 9
Esimerkki 7
Koska keksintö koskee myös Bacillus-subtilisiinin stabiloimista suoritettiin entsyymin stabiilisuuden analyysi sekä sen kvantitointi.
5 Useimpien entsyymien biologinen aktiivisuus, eli ke miallisten reaktioiden katalysointi, ilmenee vain kapealla pH- ja lämpötila-alueella. Lisäksi jopa optimiolosuhteissa entsyymi säilyttää aktiivisuutensa ainoastaan, jos sen po-lypeptidiketju on poimuuntunut tavalla, joka muodostaa niin 10 sanotun natiivin konformaation. Entsyymin natiivimuoto on termodynaamisesti keskimäärin 10-15 kilokaloriaa moolia kohden stabiilimpi kuin denaturoitunut tai oiennut muoto. Natiivin rakenteen oikominen tapahtuu usein entsyymin joutuessa alttiiksi hyvin korkeille tai alhaisille pH-arvoille 15 tai lämpötiloille tai kemikaalien kuten pesuaineiden, urean ja orgaanisten liuottimien tietyille pitoisuuksille. Näiden denaturoituvien tekijöiden poistamisen seurauksena peptidi-ketju usein spontaanisti poimuuntuu takaisin natiivimuotoon ja alkuperäinen entsyymiaktiivisuus palautuu.
20 Entsyymiaktiivisuuden irreversiibeli menetys voi ta pahtua polypeptidiketjun pilkkoutumisen johdosta tai tiettyjen aminohapposivuketjuj en modifioitumisen johdosta, eri-'···" tyisesti jos nämä modifikaatiot muuttavat entsyymin aktii- visen keskuksen rakennetta. Esimerkkejä tällaisista modifi-· 25 kaatioista ovat asparaginyyli- ja glutaminyyliryhmien dea- • midaatio, metionyyliryhmien hapettuminen ja kysteiinin hyd-rolyyttinen pilkkoutuminen, jolloin muodostuu tiokyste-Uniryhmä ja dehydroalaniiniryhmä. Keksintö tarjoaa lisä- # · esimerkin Asn-Gly-sekvenssien syklisoitumisen aiheuttaman 30 irreversiibelin inaktivoitumisen muodossa.
• · ·
Entsyymivalmisteen sisältäessä useita entsyymimuoto- • 4 · ja, jotka inaktivoituvat eri nopeuksilla, ja/tai inaktivoi-tumisprosessin tapahtuessa useilla eri mekanismeilla inaktivoitumisen kinetiikka on monimutkainen. Kuitenkin useim-35 pien entsyymivalmisteiden osalta sopivalla pH- ja lämpöti- 31 102969 la-alueella lämpöinaktivoituminen noudattaa ensimmäisen asteen kinetiikkaa eli jäännösentsyymiaktiivisuus vähenee ajan funktiona seuraten eksponentiaalista vähenemiskäYrää. Näissä olosuhteissa entsyymin puoliintumisaika (T1/2) on 5 riippumaton alkuperäisestä entsyymipitoisuudesta ja voidaan laskea seuraavan kaavan mukaan: T1/2 = (t2 -t1)ln2 lnAx - lnA2 10 jossa Ax ja A2 ovat entsyymiaktiivisuudet ajankohtina t1 ja vastaavasti t2.
Yleisesti ottaen, muiden tekijöiden pysyessä muuttumattomina, liuoksessa olevan entsyymin puoliintumisaika on lyhyempi korkeammissa lämpötiloissa.
15 [Ser218] -aprA -geenituotesubtilisiinin lämpöstabiili- suuden vertaamiseksi villityypin aprA-geenituotesubtilisii-nin ja BPN1-subtilisiinin (Sigma) lämpöstabiilisuuksiin valmistettiin näiden entsyymien liuoksia (1 mg/ml) 0,1M natriumglysinaattipuskuriin, pH 10,0. Liuoksia inkuboitiin 20 52°C:ssa ja vaihtelevan pituisten ajanjaksojen jälkeen otettiin näytteitä (20 μΐ), jotka sekoitettiin 900 lul:aan 0,2 %:sta kaseiiniliuosta 0,1M Tris-puskurissa, pH 8,30. Kontrollinäytteenä inkuboitiin substraatti (kaseiini) liu-osta 20 μΐ:ssa entsyymipuskuria. Kaseiinin hydrolyysi py- 25 säytettiin huoneen lämpötilassa 15 minuutin kuluttua lisää- • · · • mällä 200 μΐ 10 % trikloorietikkahappoa. Hydrolysaatti ero-tettiin saostuneesta proteiinista sentrifugoimalla ja sen ultravioletti (UV) -absorbanssi aallonpituudella 280 nm • · kontrollinäytteeseen verrattuna mitattiin Hewlett Packar-30 dilta saatavana olevalla 8451A Diode Array -spektrofotomet- • · · rillä. Substraatin pitoisuus oli sellainen, että entsyy- • · · miaktiivisuudet olivat suoraan verrannollisia UV-absorbans- 0 seihin aallonpituudella 280nm, jotka on esitetty taulukossa : /· 2. Tässä taulukossa sulkuihin merkityt arvot edustavat pro- ; 3 5 senttejä alkuperäisistä entsyymiaktiivisuuksista. Taulukon « I · 32 102969 2 viimeisessä sarakkeessa esitetään näille kolmelle entsyymille lasketut puoliintumisajat, ja voidaan nähdä, että mutatoidun [Ser218] -aprA -geenituotteen puoliintumisaika on yli kolme kertaa pitempi kuin luontaisen aprA-geenituotteen 5 ja BPN1-subtilisiinin tutkituissa olosuhteissa.
Taulukko 2 /Ser218JaprA-geenituotteen lämpöstabiilisuus verrattuna vil-lityypin aprA-geenituotteeseen ja BPN'-subtilisiiniin 0,1M natriumglysinaatissa, pH 10,0
Entsyymiaktiivisuus inkuboinnin 52°C:ssa jälkeen 10 inkubointiajan ollessa: Entsyymin puo-
Proteaasi 0 tuntia 1 tunti 2 tuntia 3 tuntia liintumlsaika ^er2l8JaprA 0,993 (100 %) 0,887 (89 *) 0,738 (74 *) 0,620 (62 %) 4,35 tuntia villityypin aprA 1,132 (100 i) 0,702 (62 %) 0,437 (38 %) 0,252 (22 %) 1,37 tuntia BPN'-subtilisiini 0,998 (100 %) 0,596 (60 %) 0,360 (36 %) 0,192 (19 %) 1,25 tuntia 15 Esimerkki 8
Subtilisiinien lämpöstabiilisuuden määrittämiseksi pesuaineiden läsnäollessa käytettiin nestemäistä pyykinpesuainetta ERA Plu^ (Procter & Gamble), kun tätä oli laimennettu vedellä (1:9) ja alkuperäinen proteaasiaktiivisuus 20 oli täydellisesti inaktivoitu lämmittämällä 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tuloksena saadun pesuaineliuoksen pH oli ...( 7,5. Käyttäen kaseiinimääritystä ja esimerkissä 7 kuvattua menettelyä tutkittiin [Ser218] aprA-geenituotteen, villityy- pin aprA-geenituotteen ja BPN'-subtilisiinin (Sigma) sta- V ' 25 biilisuutta pesuaineessa 45 °C:ssa. Tulokset on esitetty • · · ί *.· taulukossa 3, jossa entsyymiaktiivisuudet on ilmaistu pro- • · • ’·· sentteinä alkuperäisistä entsyymiaktiivisuuksista. Jälleen : subtilisiinianalogin puoliintumisaika oli suuruusluokkaa kolme kertaa suurempi kuin luontaisten tuotteiden käyte- 30 tyissä koeolosuhteissa.
• · · * • · · • · · I t · t « I < ·
Taulukko 3 33 1 0 2 9 6 9 " Jio /Ser °7aprA-geenituotteen lämpöstabiilisuus verrattuna vil-lityypin aprA-geenituotteeseen ja BPN1-subtilisiiniin pesuaineessa pH:ssa 7,5 5 Entsyymiaktiivisuus inkuboinnin 45 °C:ssa jälkeen inkubointiajan. ollessa: Entsyymin .eaasi 0 tuntia 0.5 tunti 1.5 tuntia 3 tuntia puoliintumisaika -?aPrA 100 % 93 % 82 % 71 % 6,0 tuntia ityypin aprA 100 % 80 % 54 % 30 % 1,73 tuntia -subtilisiini 100 % 84 % 62 % 38 S 2,15 tuntia 10
Edellä taulukoidut tulokset osoittavat, että aprA--geenituotteen [Ser218] -analogi osoittaa parempaa stabiili-suutta kuin villityypin aprA-geenituote tai BPN' subtilisiini pesuaineessa ERA Plu^ jota, sen pH:n ollessa 7,5, voi-15 daan kuvata kationisesta neutraaliin olevaksi pesuaineeksi ja joka mitä todennäköisimmin on formuloitu soveltuvaksi sisältämään pesuaine-entsyymejä. Nämä tulokset eivät kuitenkaan vakuuta siitä, että [Ser218] -aprAgeenituote olisi soveltuva yhdistettäväksi kaikkiin tämän hetkisiin kaupal-20 lisiin pesuainekoostumuksiin, esim. niihin, jotka on formuloitu pesuaine-entsyymien poissulkemista silmälläpitäen. Esimerkiksi alustavissa kokeissa 2-%:isella (w/v) Tid^-;·; liuoksella, jota voidaan kuvata anionisesta neutraaliin *1·1 luonteiseksi pesuaineeksi jonka pH on korkeampi kuin 8,5 • · · ·.· ’ 25 ja jonka koostumus ei sisällä pesuaine-entsyymejä, • · · • 1.· BPN'-subtilisiini osoitti suurempaa stabiilisuutta kuin j1’·· villi tyyppi- ja [Ser218] -aprA-geenituote. Samassa kokeessa [Ser218] -aprA-geenituote osoitti kuitenkin parempaa stabii- · lisuutta kuin villityypin aprA-geenituote. Vaikka 30 [Ser218]-aprA-geenituotteen ja BPN'-subtilisiinin erilaiset • · · suoritukset ERA Plu^ -pesuaineessa ja Tid^S1 -pesuaineessa ovat toistaiseksi vailla selitystä, koetulokset viittaavat "·"· siihen, että pesuainekoostumusten oikea formulointi on edellytys tällaisiin koostumuksiin sisällytettyjen entsyy-.·. : 35 mien optimaaliselle suoritukselle. Selvästi on sen sijaan 34 102969 osoitettu, että [Ser218] -aprA-geenituote omaa johdonmukaisesti edullisempia ominaisuuksia kuin villityypin aprA-geenituote, ja uskotaan, että kyseisen keksinnön mukaiset Carlsberg- ja BPN'-subtilisiinianalogit tulevat myös omaa-5 maan paremman stabiilisuuden kuin vastaava villityypin entsyymi .
Esimerkki 9 Käyttäen sukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-prolyy-li-L-fenyylialanyyli-p-nitroanilidia (Vega Biochemicals) 10 substraattina ja p-nitroanilidin vapautumisesta johtuvaa absorbanssin aallonpituudella 405 nm kasvunopeutta entsyymiaktiivisuuden mittaukseen [Del Mar et ai., Anal. Biochem. 99 (1979) 316-320] määritettiin [Ser218] aprA:n, villityypin aprA:n ja BPN'-subtilisiinin (Sigma) lämpöstabiilisuudet 15 0,1M natriumfosfaattipuskurissa, pH 7,5,seuraavasti.
Noin 0,5 Anson-yksikköä litraa kohden sisältäviä entsyymiliuoksia inkuboitiin 40 °C:ssa ja 50 °C:ssa, ja eri ajankohtina otettiin nestenäytteitä (20 μΐ), jotka laimennettiin 180 μΐ^θί jääkylmällä 0,1M natriumfosfaattipusku-20 rilla, pH 7,5. 10 μΐ täten laimennettua näytettä sekoitettiin 890 ul:aan ImM sukkinyyli-L-alanyyli-L-alanyy-li-L-prolyyliL-fenyyli-alanyyli-p-nitroanilidia 0,1M Tris-
a I
HCl:ssä, pH 8,2, ja mitattiin absorbanssit aallonpituudella 405 nm 15 sekunnin välein 5 minuutin ajan Hewlett Packardin V : 25 845IA Diode Array -spektrof otometrillä . Jäännösentsyymiak- | tiivisuudet vaihtelevan pituisten inkubointiaikojen jälkeen on esitetty taulukossa 4 ja prosentteina vastaavista alku-peräisistä aktiivisuuksista taulukossa 5. Menettely tois- • · tettiin sitten 0, IM natriumfosfaattipuskurissa pH:n ollessa 30 9,0, ja tulokset on esitetty taulukoissa 6 ja 7.
• · · 1 • * * · · • · · 35 102969
Taulukko 4
- 21S
/Ser JaprA-geenituotteen lämpöstabillisuus verrattuna vil-lityypin aprA-geenituotteeseen ja BPN'-subtilisiiniin 0,1M natriumfosfaattipuskurissa pH:ssa 7,5
Entsyymiaktiivisuus inkuboinnin 40°C:ssa jälkeen 5 inkubointiaian ollessa: Entsyymin
Proteaasi 0 min 90 min 180 min 270 min puoliintumisaika '218 —.
/Ser _7aprA 100 % 92 % 87 % 81 % 13,0 tuntia villityypin aprA 100 % 69 % 48 % 33 % 2,8 tuntia BPN’-subtilisiini 100 % 48 % 26 % 14 % 1,60 tuntia 10 Taulukko 5 - 218 /Ser vaprA-geenituotteen lämpöstabillisuus verrattuna villityypin aprA-geenituotteeseen ja BPN'-subtilisiiniin 0,1M natriumfosfaattipuskurissa pH:ssa 7,5
Entsyymiaktiivisuus inkuboinnin 50°C:ssa jälkeen inkubointiajan ollessa: Entsyymin 1 5 Proteaasi 0 min min 90 niin 135 niin puoliintumisaika /Ser .7aprA 100 % 89 % 81 % 71 % 4,30 tuntia villityypin aprA 100 % 59 * 35 % 21 % 1,0 tuntia BPN’-subtilisiini 100 * 34 % 11 % 4 % 0.47 tuntia
Taulukko 6 2Q /Ser ,7aprA-geenituotteen lämpöstabillisuus verrattuna vil- lityypin aprA-geenituotteeseen ja BPN'-subtilisiiniin 0,1 M natriumfosfaattipuskurissa pH:ssa9,0
Entsyymiaktiivisuus inkuboinnin 40°c!ssa jälkeen inkubointiajan ollessa: Entsyymin
Proteaasi 0 min ,45 min 90 min 135 min puoliintumisaika .1 . ^er -^aprA 100 % 96 % —91% 87 % 11,5 tuntia • V 25 villityypin aprA i00 % 79 % 61% 49 % 2,18 tuntia BPN'-subtilisiini 100 % 68 % 44% 29 % Ί ,25 tuntia •
Taulukko 7 • · · - - " • · /3er21^7aprA-geenituotteen lämpöstabillisuus verrattuna villi-
... tyypin aprA-geenituotteeseen ja BPN'-subtilisiiniin 0,1M
• · · * natriumfosfaattipuskurissa pH:ssa 9,0 ·*·*; Entsyymiaktiivisuus inkuboinnin 50°C:ssa jälkeen 30 inkubointiajan ollessa: Entsyymin *;·': Proteaasi 0 min 20 min 40 min 60 min 80 min puoliintumisaika .... Zser218JaprA 100 % 92 % 85 % 76 % 69 % 2,5 tuntia *.··* villityypin aprA 100 % 61 % 36 % 23 % 14 % 0,47 tuntia ·* · BPN'-subtilisiini 100 % 54 % 31 % 17 % 9 » 0,37 tuntia • ♦ · • * ♦ | « I l I • · 36 102969
Esimerkki 10 [Ser218] -analogin pH-stabiilisuuden tutkimiseksi suoritettiin esimerkin 7 menettely pHrssa 4,8 huoneen lämpötilassa. Tulokset on esitetty taulukossa 8.
5 Taulukko 8 [Ser213] aprA-geenituotteen stabiilisuus verrattuna villityypin aprA-geenituotteeseen 0, IM natriumfosfaattipus-kurissa pH:ssa 4,8
Entsyymin puoliin- 10 Proteaasi 0 tuntia 4 päivää tumisaika (päivää) ^Ser2187aprA 100 95 % 44,0 villityypin aprA 100 47 % 3,7
Keksinnön tultua kuvattua edullisten muotojensa va-15 lossa on selvää, että alan ammattimiesten mieleen tulee modifikaatioita ja parannuksia. Esimerkiksi sekvenssi Asn-Gly esiintyy subtilisiinien muissa kohdissa, kuten aprA-qeeni-tuotteen ja BPN'-subtilisiinin ryhmissä 109 ja 110 sekä Carlsberg- ja DY-subtilisiinien ryhmissä 62 ja 63. Täten on 20 odotettavissa, että muiden ryhmien kuin Asn.-n ja Gly:n korvaaminen näissä nimenomaisissa asemissa saattaa myös paran-,,, taa stabiilisuutta. Tällaisilla korvaamisilla odotetaan saatavan samankaltaisia parannuksia stabiilisuudessa tehtäessä niitä muissa AsnGly-sekvenssin sisältävissä entsyy-' 25 meissä ja muissa tämän sekvenssin käsittävissä proteiineis- M » : V sa. Lisäksi oletetaan, että keksinnön mukaisella subti- • · • *·· lisiinianalogilla on villityyppien subtilisiineja edulli- sempia ominaisuuksia pesuainekoostumuksissa kuten niissä, • · jotka on esitetty US-patentissa 3 732 170, US-patentissa 30 3 749 671 ja US-patentissa 3 790 482, jotka kaikki sisäl- lytetään tähän viitteinä.
• « ·
Lisäksi käytännön syistä monet teolliset prosessit '***’ suoritetaan lämpötiloissa, jotka ylittävät useimpien ent- syymien stabiilisuusalueen. Tämän vuoksi, vaikka tässä on ,·. : 35 korostettu pesuainesovellutuksia, uskotaan, että keksinnön • * * « 4 37 102969 mukaiset lämpöstabiilit proteaasit eivät ole hyödyllisiä ainoastaan tietyillä, jo nyt stabiileja proteaaseja vaativilla teollisuuden aloilla, kuten pesuaine- ja vuodankalt-tausteollisuudessa, vaan saattavat olla käyttökelpoisia 5 myös teollisuuden aloilla, joilla käytetään proteiinien hydrolysointiin kemiallisia menetelmiä, esimerkkinä kasvi-ja eläinproteiinien hydrolyysi valmistettaessa liemitiivis-teitä.
Tämän vuoksi tarkoitus on, että keksintöön katsotaan 10 sisällYtetYiksi kaikki sellaiset modifikaatiot ja parannukset, jotka sisältyvät vaatimuksissa määritellyn keksinnön piiriin.
i
Claims (25)
1. Bacillus-subtilisiinin analogi, tunnettu siitä, että villikanta Bacillus -subtilisiinin aminohap- 5 posekvenssissä esiintyvän Asn-Gly-sekvenssin ryhmistä toinen tai molemmat on poistettu tai korvattu varauksettomalla alifaattisella aminohapolla.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen Bacillus-subtilisiinin analogi, tunnettu siitä, että sen amino- 10 happosekvenssissä on vähemmän Asn-Gly-sekvenssejä kuin Bacillus-subtilisiinin sekvenssissä.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, tunnettu siitä, että Asn-Gly-sekvenssin asparaginyyli-ryhmä on korvattu toisella aminohapporyhmällä.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, tun nettu siitä, että Asn-Gly-sekvenssin asparaginyyli-ryhmä on korvattu seriini-, väliini-, treoniini-, kysteii-ni-, glutamiini- tai isoleusiiniryhmällä.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen analogi, t u n - 20. e t t u siitä, että Asn-Gly-sekvenssin asparaginyyli- ryhmä on korvattu seriinillä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, tunnettu siitä, että aminohapposekvenssissä asemaa 218 taulukossa 1 esitetyssä aminohapposekvenssissä vastaavassa 25 asemassa luonnossa esiintyvä asparaginyyliryhmä on korvat tu toisella aminohapporyhmällä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analogi, tunnettu siitä, että sen aminohapposekvenssissä asemaa 218 taulukossa 1 esitetyssä aminohapposekvenssissä vastaa- 30 vassa asemassa luonnossa esiintyvä asparaginyyliryhmä on korvattu seriini- väliini-, treoniini-, kysteiini-, glutamiini- tai isoleusiiniryhmällä.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen analogi, tunnettu siitä, että asparaginyyliryhmä on korvattu se- 35 riinillä. 39 102969
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analogi, tunnettu siitä, että se on luonnossa esiintyvän Bacil-lus-kannan subtilisiinin analogi, joka subtilisiini on Carlsberg-subtilisiini, DY-subtilisiini, BPN'-subtilisiini 5 tai aprA-geenin tuote.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen analogi, tunnettu siitä, että asemassa 218 olevaa ryhmää lukuunottamatta kaikki ryhmät vastaavat taulukossa 1 esitettyjä aminohapporyhmiä.
11. Nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se koodaa Bacillus-subtilisiinin analogia, jossa villikan-ta Bacillus -subtilisiinin aminohapposekvenssissä esiintyvän Asn-Gly-sekvenssin toista tai molempia ryhmiä koodaa-vat kodonit on poistettu tai korvattu kodoneilla, jotka 15 koodaavat varauksetonta alifaattista aminohappoa.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidiä, jossa asemaa 218 taulukossa 1 esitetyssä aminohapposekvenssissä vastaavassa asemassa oleva asparaginyyliryhmä on korvattu 20 jollain muulla aminohapporyhmällä.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että em. muu aminohappo on serii-ni, väliini, treoniini, kysteiini, glutamiini tai isoleu-siini.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että em. muu aminohappo on serii-ni.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidiä, joka 30 vastaa taulukossa 1 esitettyä aminohapposekvenssiä asemas sa 218 olevaa ryhmää lukuunottamatta.
16. Järjestelmä Bacillus-subtilisiinin analogin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää bakteeri-isäntäsolun ja bakteeri-isäntäsolussa nukleiini- 35 hapon, joka koodaa Bacillus-subtilisiinianalogia, jonka 40 102969 aminohapposekvenssissä ryhmä asemaa 218 taulukossa 1 esitetyssä aminohapposekvenssissä vastaavassa asemassa on poistettu tai korvattu varauksettomalla alifaattisella aminohapolla.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että em. asemassa oleva ryhmä on seriini-, väliini-, treoniini-, kysteiini-, glutamiini-tai isoleusiiniryhmä.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen järjestelmä, 10 tunnettu siitä, että em. asemassa oleva ryhmä on seriini.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että aminohapposekvenssi vastaa taulukossa 1 esitettyä aminohapposekvenssiä asemassa 218 15 olevaa ryhmää lukuunottamatta.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on vajavainen muiden eristettyjen proteaasien kuin subtilisiinin osalta.
21. Patenttivaatimuksen 16 mukainen järjestelmä, 20 tunnettu siitä, että nukleiinihappo sijaitsee kro mosomin ulkopuolella.
22. Patenttivaatimuksen 19 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihappo sijaitsee kro- ; mosomissa. 2 5
23. Menetelmä Bacillus-subtilisiinin lämpö- ja pH- • · j./ stabiilisuuden parantamiseksi, tunnettu siitä, • · · *. . että vähintään yhden Bacillus-subtilisiinissa olevan Asn- • · · Gly-parin ryhmistä vähintään toinen poistetaan tai korvataan geeniteknisesti varauksettomalla alifaattisella ami- *.* ' 30 nohapporyhmällä. • · · V
· 24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että em. ryhmä vastaa taulukossa 1 esitetyn Bacillus-subtilisiinin aminohapposekvenssin asemassa 218 olevaa asparaginyyliryhmää. 4i 102969
25. Bacillus-subtilisiinin analogia sisältävä pesu-ainekoostumus, jonka Bacillus-subtilisiinin aminohapposekvenssissä on Asn-Gly-sekvenssi, tunnettu siitä, että Asn-Gly-sekvenssin ryhmistä toinen tai molemmat on 5 poistettu tai korvattu varauksettomalla alifaattisella aminohapolla. • · · • 1 · • · • · • · • · • · · ♦ • · • · · • · · • · • · · • · · • · · 4 « · · • · · • · · 42 1 0 2 9 6 9
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81924186A | 1986-01-15 | 1986-01-15 | |
| US81924186 | 1986-01-15 | ||
| PCT/US1987/000027 WO1987004461A1 (en) | 1986-01-15 | 1987-01-07 | THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF |
| US8700027 | 1987-01-07 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI873980A0 FI873980A0 (fi) | 1987-09-14 |
| FI873980A FI873980A (fi) | 1987-09-14 |
| FI102969B true FI102969B (fi) | 1999-03-31 |
| FI102969B1 FI102969B1 (fi) | 1999-03-31 |
Family
ID=25227587
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI873980A FI102969B1 (fi) | 1986-01-15 | 1987-09-14 | Lämpö- ja pH-stabiileja subtilisiinianalogeja ja menetelmä niiden valmistamiseksi |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5399283A (fi) |
| EP (1) | EP0254735B2 (fi) |
| JP (1) | JP2599946B2 (fi) |
| CA (2) | CA1341086C (fi) |
| DK (1) | DK175409B1 (fi) |
| FI (1) | FI102969B1 (fi) |
| WO (1) | WO1987004461A1 (fi) |
Families Citing this family (86)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
| US5013657A (en) * | 1988-04-12 | 1991-05-07 | Bryan Philip N | Subtilisin mutations |
| US4990452A (en) * | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
| JPS63502959A (ja) * | 1986-02-12 | 1988-11-02 | ジェネックス、コ−ポレ−ション | 突然変異誘発及びスクリ−ニング方法並びに生成物 |
| SG30639G (en) * | 1986-04-30 | 1995-09-01 | Genencor Int | Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
| HUT50877A (en) * | 1987-02-27 | 1990-03-28 | Gist Brocades Nv | Process for producing stable gene amplification in chromosomal dna of procaryote microorganisms |
| BR8805647A (pt) * | 1987-02-27 | 1989-10-31 | Gist Brocades Nv | Processo para clonagem molecular e expressao de genes que codificam para enzimas proteoliticas |
| EP0896062A3 (en) * | 1987-02-27 | 1999-04-07 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
| JPH01137972A (ja) * | 1987-08-03 | 1989-05-30 | Ajinomoto Co Inc | 新規サチライシン |
| US4865983A (en) * | 1987-12-04 | 1989-09-12 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Cleaning compositions containing protease produced by vibrio and method of use |
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
| US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| US5324653A (en) * | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
| CA1333777C (en) * | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
| US5122449A (en) * | 1988-10-07 | 1992-06-16 | Eastman Kodak Company | Use of a protease in the extraction of chlamydial, gonococcal and herpes antigens |
| JPH03505976A (ja) * | 1989-05-17 | 1991-12-26 | アムジエン・インコーポレーテツド | 多重突然変異スブチリシン |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| US5658871A (en) * | 1989-07-07 | 1997-08-19 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Microbial lipase muteins and detergent compositions comprising same |
| US6271012B1 (en) * | 1989-10-11 | 2001-08-07 | Genencor International, Inc. | Protease muteins and their use in detergents |
| US5482849A (en) * | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
| GB9027836D0 (en) * | 1990-12-21 | 1991-02-13 | Unilever Plc | Enzymes and enzymatic detergent compositions |
| US5340735A (en) | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
| US6436690B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
| US6440717B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6599730B1 (en) | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6455295B1 (en) | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| IL117350A0 (en) | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6475765B1 (en) | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| CA2270593C (en) | 1996-11-04 | 2005-06-07 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
| KR100591553B1 (ko) | 1996-11-04 | 2006-06-19 | 노보자임스 에이/에스 | 섭틸라제 변종과 조성물 |
| JP2001514846A (ja) | 1997-08-29 | 2001-09-18 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ変異体及び組成物 |
| CN1148444C (zh) | 1997-08-29 | 2004-05-05 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 蛋白酶变体及组合物 |
| US6780629B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
| EP1032655B1 (en) | 1997-11-21 | 2005-06-29 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
| US6773907B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
| CA2325568A1 (en) | 1998-03-26 | 1999-09-30 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid substitutions |
| US6908757B1 (en) | 1998-03-26 | 2005-06-21 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions |
| US6495136B1 (en) | 1998-03-26 | 2002-12-17 | The Procter & Gamble Company | Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties |
| EP1803817B1 (en) | 1998-12-18 | 2011-04-06 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the I-S1 and I-S2 sub-groups having an additional amino acid residue in an active site loop region |
| DE60040284D1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-30 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 129 und 130 |
| AU4393100A (en) | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 125 and 126 |
| AU4392900A (en) | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 127 and 128 |
| ATE407201T1 (de) | 1999-05-20 | 2008-09-15 | Novozymes As | Subtilase-enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit wenigstens einem zusätzlichen aminosäurerest zwischen positionen 126 und 127 |
| DE60040282D1 (de) | 1999-05-20 | 2008-10-30 | Novozymes As | SUBTILASE ENZYME DER I-S1 UND I-S2 UNTERGRUPPEN MIT MINDESTENS EINER ZUSäTZLICHEN AMINOSäURE ZWISCHEN POSITION 132 UND 133 |
| EP1183342B2 (en) | 1999-05-20 | 2012-06-13 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 128 and 129 |
| US6946128B1 (en) | 1999-07-22 | 2005-09-20 | The Procter & Gamble Company | Protease conjugates having sterically protected epitope regions |
| AU5928400A (en) | 1999-07-22 | 2001-02-13 | Procter & Gamble Company, The | Protease conjugates having sterically protected clip sites |
| WO2001007575A2 (en) * | 1999-07-22 | 2001-02-01 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin protease variants having amino acid deletions and substitutions in defined epitope regions |
| CA2376045A1 (en) | 1999-07-22 | 2001-02-01 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions |
| US6727085B2 (en) | 1999-12-15 | 2004-04-27 | Fanoe Tina Sejersgaard | Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains |
| US6777218B1 (en) | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| WO2002010183A1 (en) * | 2000-07-31 | 2002-02-07 | Menzel, Rolf | Compositions and methods for directed gene assembly |
| US7314745B2 (en) * | 2001-03-02 | 2008-01-01 | Seiren Kabushiki Kaisha | Protein and DNA encoding the same |
| EP1530631B1 (en) * | 2002-01-16 | 2013-08-07 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
| EP2339016B8 (en) | 2002-03-29 | 2016-01-27 | Danisco US Inc. | Enhanced production of subtilisins in Bacillus |
| AU2003275473A1 (en) | 2002-10-08 | 2004-05-04 | Genencor International, Inc. | Phenolic binding peptides |
| CA2526341C (en) | 2003-05-07 | 2013-02-19 | Novozymes A/S | Variant subtilisin enzymes (subtilases) |
| ATE516347T1 (de) | 2003-10-23 | 2011-07-15 | Novozymes As | Protease mit verbesserter stabilität in detergentien |
| EP1735339A2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-12-27 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
| KR100750659B1 (ko) | 2005-02-18 | 2007-08-20 | 인하대학교 산학협력단 | 계면활성제 및 산화제에 매우 안정한 호염, 호알카리성 단백질 분해효소 및 이를 암호화하는 유전자 |
| US20100029538A1 (en) | 2006-04-14 | 2010-02-04 | Anna-Liisa Auterinen | One-Step Treatment of Textiles |
| CN101460618A (zh) | 2006-04-20 | 2009-06-17 | 诺维信公司 | 对蛋渍具有改进的洗涤性能的洒维奈斯变体 |
| US20080090745A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Fox Bryan P | Expression of Streptomyces subtilism inhibitor (SSI) proteins in Bacillus and Streptomyces sp. |
| AU2008226792B2 (en) | 2007-03-12 | 2013-06-06 | Danisco Us Inc. | Modified proteases |
| EP2147098B1 (en) | 2007-04-30 | 2013-07-17 | Danisco US Inc. | Use of protein hydrolysates to stabilize metalloprotease detergent formulations |
| US8343735B2 (en) * | 2007-05-10 | 2013-01-01 | Danisco Us Inc. | Modified secretion system to increase expression of polypeptides in bacteria |
| SG148934A1 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Novozymes As | A process for combined biopolishing and bleach clean-up |
| JP5629584B2 (ja) | 2007-12-21 | 2014-11-19 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス内での促進されたタンパク質生成 |
| AU2009228165B2 (en) * | 2008-03-28 | 2015-08-13 | Danisco Us Inc. | Method for amplifying locus in bacterial cell |
| AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
| WO2012022777A1 (en) | 2010-08-19 | 2012-02-23 | Novozymes A/S | Induced sporulation screening method |
| CN106068273B (zh) | 2013-12-31 | 2021-01-08 | 丹尼斯科美国公司 | 增强的蛋白质表达 |
| KR102588719B1 (ko) | 2014-12-16 | 2023-10-12 | 다니스코 유에스 인크. | 향상된 단백질 발현 |
| WO2016100128A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Danisco Us Inc | Enhanced protein expression |
| EP4353828A2 (en) | 2017-02-24 | 2024-04-17 | Danisco US Inc. | Compositions and methods for increased protein production in bacillus licheniformis |
| WO2019040412A1 (en) | 2017-08-23 | 2019-02-28 | Danisco Us Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EFFICIENT GENETIC MODIFICATION OF BACILLUS LICHENIFORMIS STRAINS |
| WO2019055261A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Danisco Us Inc | MODIFIED 5 'NON-TRANSLATED REGION (UTR) SEQUENCES FOR INCREASED PROTEIN PRODUCTION IN BACILLUS |
| WO2019089898A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
| EP3735478B1 (en) | 2018-01-03 | 2023-08-16 | Danisco US Inc. | Mutant and genetically modified bacillus cells and methods thereof for increased protein production |
| WO2020099490A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising enzymes |
| CN110734903B (zh) * | 2019-11-18 | 2021-06-04 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一种生产耐高温中性蛋白酶的方法 |
| JP2023524334A (ja) | 2020-01-15 | 2023-06-12 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における強化したタンパク質産生のための組成物及び方法 |
| EP4199897A2 (en) | 2020-08-24 | 2023-06-28 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising a fructanase |
| CN117881772A (zh) | 2021-08-20 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | 编码新型核酸酶的多核苷酸、其组合物及其从蛋白质制剂中消除dna的方法 |
| CN116286565B (zh) * | 2022-07-12 | 2024-06-11 | 湖北佶凯星生物科技有限公司 | 一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1240058A (en) * | 1968-04-12 | 1971-07-21 | Procter & Gamble | Enzyme-containing detergent compositions |
| US3576719A (en) * | 1968-04-23 | 1971-04-27 | Squibb & Sons Inc | Alkaline proteinase |
| US4052262A (en) * | 1969-05-31 | 1977-10-04 | Rikagaku Kenkyusho | Preparation of an alkaline protease |
| US3770587A (en) * | 1971-02-09 | 1973-11-06 | Pfizer | Chemically modified proteolytic enzymes |
| BE785666A (fr) * | 1971-07-01 | 1973-01-02 | Procter & Gamble | Procede pour la production de compositions enzymatiques en granules |
| BE792982A (en) * | 1971-12-20 | 1973-06-19 | Procter & Gamble Europ | Proteolytic enzymes detergent - contg cationic and anionic surfactants |
| US3732170A (en) * | 1972-06-26 | 1973-05-08 | Colgate Palmolive Co | Bio-soaking performances |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| US4760025A (en) * | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| US4771003A (en) * | 1985-10-22 | 1988-09-13 | Genex Corporation | Heat stable alkaline proteases produced by a bacillus |
| US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
-
1987
- 1987-01-07 EP EP87900930A patent/EP0254735B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-07 JP JP62500857A patent/JP2599946B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-07 WO PCT/US1987/000027 patent/WO1987004461A1/en active IP Right Grant
- 1987-01-14 CA CA000616980A patent/CA1341086C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-01-14 CA CA000527350A patent/CA1340643C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-09-11 DK DK198704765A patent/DK175409B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-09-14 FI FI873980A patent/FI102969B1/fi not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-09 US US07/637,972 patent/US5399283A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2599946B2 (ja) | 1997-04-16 |
| FI873980A0 (fi) | 1987-09-14 |
| EP0254735A1 (en) | 1988-02-03 |
| FI102969B1 (fi) | 1999-03-31 |
| CA1341086C (en) | 2000-08-15 |
| AU6939887A (en) | 1987-08-14 |
| US5399283A (en) | 1995-03-21 |
| DK476587A (da) | 1987-09-11 |
| DK175409B1 (da) | 2004-09-27 |
| EP0254735A4 (en) | 1988-01-07 |
| EP0254735B2 (en) | 1998-06-17 |
| JPS63502396A (ja) | 1988-09-14 |
| FI873980A (fi) | 1987-09-14 |
| DK476587D0 (da) | 1987-09-11 |
| AU604476B2 (en) | 1990-12-20 |
| EP0254735B1 (en) | 1991-06-19 |
| WO1987004461A1 (en) | 1987-07-30 |
| CA1340643C (en) | 1999-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI102969B (fi) | Lämpö- ja pH-stabiileja Bacillus-subtilisiinianalogeja, menetelmä niid en valmistamiseksi ja niitä sisältävä pesuainekoostumus | |
| FI105695B (fi) | Subtilisiinin analogeja, menetelmä niiden valmistamiseksi, niiden käyttö ja niitä koodaava DNA-sekvenssi | |
| CA2016211C (en) | Multiply mutated subtilisins | |
| KR100200166B1 (ko) | 알칼리성 단백질 가수분해효소 및 그것의 제조방법 | |
| US6783970B2 (en) | System for expressing hyperthermostable protein | |
| JPH0372876A (ja) | 新規アルカリ性プロテアーゼ | |
| AU604476C (en) | Thermally stable and pH stable subtilisin analogs and method for production thereof | |
| IE902832A1 (en) | Dna fragment containing at least one protease gene, a¹cloning vector containing such a dna fragment, a host cell¹transformed with a cloning vector constructed in this¹manner, and also the proteases produced by, or products such¹as foodstuffs prepared with, such host cells | |
| NO176844B (no) | Enzymatisk aktive analoger av et Bacillus-subtilisin, nukleinsyre, vertscelle, fremgangsmåte for forbedring av varme- og pH-stabiliteten til et slikt subtilisin, samt vaskemiddelblanding som omfatter en slik analog |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: AMGEN INC. |
|
| MA | Patent expired |