JPH0372876A - 新規アルカリ性プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なアルカリ性プロテアーゼに間し、ざらに
詳繍には、バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロ
テアーゼの特定のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて
、優れに特性を有する新規アルカリ性プロテアーゼに間
するものである。

これらの新規アルカリ性プロテアーゼは、洗剤に配合す
る洗浄補助剤およびコンタクトレンズの蛋白除去剤など
として有用である。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］ プロテアーゼは洗剤の洗浄補助剤やコンタクトレンズの
蛋白除去剤なとの有効成分として利用されているが、こ
れらのプロテアーゼは自然界に存在する天然のプロテア
ーゼの中から使用目的に適した特性を持つ酵素を選んで
使用されている。たとえば、洗浄補助剤としてはバチル
ス属細菌の生産するプロテアーゼなどが使用されており
、コンタクトレンズの蛋白除去剤にはパパインやバチル
ス属’ＲＩＭのアルカリ性プロテアーゼなどが使用され
ている。

プロテアーゼを、ｋとえば、洗浄補助剤として使用する
場合には、アルカリ性（ｐＨ１ｏ−１１）で高活性を示
すことの他に、界面活性剤やビルダーなどの洗剤成分に
対する安定性、広い範囲でのｐＨ安定性、漂白剤などに
対する安定性および広い基質特異性など多くの特性が要
求される。しかし、従来のプロテアーゼは洗剤の主成分
である界面活性剤や漂白剤に対して十分な耐性を持って
いないため、造粒法を工夫するなどしてこれらの成分に
よる不活化を防ぐ必要がある。また、液体洗剤ではこの
ような安定化を図ることができないため酵素を添加する
ことが困難である。

また、酸素系漂白剤などの酸化剤に対して耐性を有する
アルカリ性プロテアーゼも有用であるが、天然のアルカ
リ性プロテアーゼは、酸化剤に対して耐性がなく用途が
限定されるという問題があった。

天然のアルカリ性プロテアーゼが酸化剤に対して耐性が
ないのは、　２２２位のメチオニンが酸化剤により酸化
されてメチオニンスルホキサイドになるためであること
が知られており　［Ｃ，Ｅ、５ｔａｕｆｆｅｒ、Ｄｏｎ
　Ｅｔｓｏｎ：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４４．５
３３３　（１９６９）］、アルカリ性プロテアーゼの２
２２位のメチオニンを、酸化を受けない他のアミノ酸に
置換すれば、酸化剤の影響を受けない変異酵素が得られ
ると予想される。このような背景のもとに、バチルス・
アミロリキエファシエンスのアルカリ性プロテアーゼの
２２２位のメチオニンを他の１９種類のアミノ酸に置換
した変異酵素を作成した例が報告されている［Ｄ、Ａ、
Ｅｓｔｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、２６０．６５１８（１９８５）、米国特許４，７６
０，０２５］。

しかしながら、天然の酵素のアミノ酸を他のアミノ酸に
置換すれば、立体構造の変化なとのために、比活性が野
生型より低下する場合が多く、前記の場合の最も比活性
の高いアラニン置換体でも、比活性は野生型の５３％で
あり、十分なものではない、アミノ酸の置換により酸化
剤剛性が付与されても比活性が野生型より低くなってし
まうと、酸化剤を使用しない用途にも使用するにはむし
ろ野性があり、かつ比活性が野生型酵素に近いかあるい
はより大きいものが実用上必要とされる。

［問題点を解決するための手段、作用コ従来より洗剤用
として実用されているアルカリ性プロテアーゼの代表的
なものには、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ア
ミロリキエファシエンスおよびバチルス・ズブチリスな
どのバチルス属細菌によって生産されるアルカリ性プロ
テアーゼがある。これらのバチルス属細菌のアルカリ性
プロテアーゼは、前記のような欠点はあるが、他のアル
カリ性プロテアーゼに比較すれば種々の性質が洗剤用と
して優れている。そこでこれらのバチルス属′ａＭのア
ルカリ性プロテアーゼをもとにして欠点が改良された変
異酵素を作製することによって前記の問題点を解決し、
洗剤用酵素として実用可能な酵素を得るために鋭意研讃
を重ねた。

本発明者らが鋭意検討した結果、バチルス・リケニホル
ミスのアルカリ性プロテアーゼの１０５位のグリシンを
アスパラギン酸に置換すると界面活性剤に対する耐性が
増強されることを見い出した。

また、バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼの２２２位のアミノ酸はメチオニンではなくアラニ
ンであったが、このプロテアーゼには２２１位にメチオ
ニンが存在し、このメチオニンを他のアミノ酸に置換し
た変異酵素を解析した結果、　２２１位のメチオニンを
グルタミンに置換した変異アルカリ性プロテアーゼが野
生型とほぼ同等の比活性を有し、しかも、酸化剤に対し
て安定になることを見い出した。

また、　２２ｉ位のメチオニンをグルタミンに置換した
のみの変異酵素は酸化剤に対して安定になったのに反し
て、界面活性剤に対する安定性が野生型酵素より劣ると
いう性質が現れるが、　２２１位のメチオニンをグルタ
ミンに置換するとともに１０５位のグリシンをアスパラ
ギン酸に置換することにより、界面活性剤に刻する安定
性が回復することを見い出した。

これらの新知見に基づいて、本発明者らは本発明に到達
した。すなわち、本発明はバチルス・リケニホルミスの
アルカリ性プロテアーゼにおいて、１０５位のグリシン
がアスパラギン酸に、および／または２２１位のメチオ
ニンがグルタミンに置換されたことを特徴とする新規ア
ルカリ性プロテアーゼである。

なお、本発明で１０５位のアミノ酸、２２１位のアミノ
酸などというのは、アルカリ性プロテアーゼの成熟蛋白
のＮ末端のアミノ酸から数えて、それぞれ１０５番目、
２２１番目などに位置するアミノ酸を意味する。

界面活性剤耐性の改良された変異酵素は、前記のバチル
ス属細菌よりアルカリ性プロテアーゼ遺伝子をクローニ
ングし、クローン化された遺伝子を変異誘起剤で処理し
、天然の酵素と一部のアミノ酸が異なる酵素をコードす
る変異酵素遺伝子を作製し、この変異酵素遺伝子を保有
する形質転換体を培養して産生されたアルカリ性プロテ
アーゼの中から、界面活性剤耐性の改良されたものをス
クリーニングすることにより得られる。この性質の改良
された酵素と天然の酵素との構造の相違は、変異酵素遺
伝子の塩基配列を調べることにより明らかになる。

ま九、酸化剤耐性で、かつ、高比活性の変異酵素は、ア
ルカリ性プロテアーゼ遺伝子の部位指定変異によって酸
化剤により酸化を受けるメチオニンを他のアミノ酸に置
換した変異酵素の中から、酸化剤耐性をもち、かつ、高
比活性の酵素をスクリーニングすることにより得られる
。

以下、これらについてさらに詳細に説明する。

バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子は、たとえば特開昭６３−２１４１８７に開示され
た方法によって単離することができる。すなわち、バチ
ルス・ズブチリスのプロテアーゼ低生産株を宿主とする
ショットガンクローニング、あるいは、アルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子と相同性のあるＤＮＡをプローブとする
コロニーハイブリダイゼーションなどの常法によって単
離される。

すなわち、ショットガンクローニングにおいては、バチ
ルス・リケニホルミスの染色体ＤＮＡを制限酵素で切断
した断片を、バチルス属細菌で保持されるベクターＤＮ
Ａ、　　たとえば、ｐｕｅｕｏ、ｐＥ１９４などのプラ
スミド、あるいはバチルス属細菌と大Ｉ＆！菌の両方で
保持されるシャトルベクターたとえば、ｐＨＹ３００Ｐ
Ｌになどに連結して、バチルス・ズブチリスのプロテア
ーゼ低生産株を形質転換してプロテアーゼ生産能が高く
なった形質転換体を選択することによってアルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子保有株を得る。

組換えＤＮＡによるバチルス・ズブチリスの形質転換は
、リゾチーム処理によりプロトプラストを形成させてポ
リエチレングリコール存在下でＤＮＡを取り込ませるプ
ロトプラスト法［Ｓ、Ｃｈａｎｇ。

Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ：Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
、、　１６８．ｌｉｔ　（１９７９）］あるいはグルコ
ース最小培地で生育させることによりＤＮＡを受は入れ
やすくなったコンピテントセルを用いる方法［Ｄ、Ｄｕ
ｂｎａｕ、Ｒ，Ｄ、Ａｂｅｌｓｏｎ：Ｊ、Ｍｏｌ　。

Ｂｉｏｌ、、５６，２０９　（１９７１）］などによッ
テ行すｈ　ｈ　ル。

また、コロニーハイブリダイゼーションを行なう場合に
おいては、たとえば、次のようなりＮＡがプローブとし
て用いられる。

すなわち、バチルス◆リケニホルミスのアルカリ性プロ
テアーゼについては、アミノ酸配列が既に明らかになっ
ている［Ｍ、０ｔｔｅｎｓｅｎ、　ｌ　、５ｖｅｎｄｓ
ｅｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｉｎ　　Ｅｎ２ｙ−０１０ｇ
ｙ＋ｌｌ＋１９９．ＡＣａｄｅ１ｗｉＣＰｒｅｓｓ＋Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９）］ので、このアミノｍ配列
のうち任意の位置の連続する５〜６個程度のアミノ酸の
配列に対応する塩基配列をもつ、通常１４〜１８塩基程
度の一本鎖のオリゴヌクレオチド、たとえば、Ｎ末端か
ら　１３４番目から　１３８番目までのアミノ酸配列（
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ）に対応する
　ｒＡＴＧＡＡ　（Ｘ）ＣＡ　（Ｙ）ＱＣ（Ｚ）ＣＴ　
　（Ｘ、Ｙ：互いに同一もしくは異なってＡまたはＧ、
　　Ｚ：Ｔ、Ｃ，ＡまたはＧ）Ｊなる塩基配列を持つ１
６種の１４塩基のオリゴヌクレオチドの混合物を用いる
ことができる。

また、目的のアルカリ性プロテアーゼと相同性のある遺
伝子が得られている場合には、この遺伝子をプローブと
して・も良い。

前記のショットガンクローニングの場合と同様にして染
色体ＤＮＡ断片を大腸菌プラスミド、たとえば、ｐＢＲ
３２２などに連結して、予め、たとえばＭｎＣｌ２−　
ＣａＣｌ２処理によりＤＮＡを取り込みやすくした大腸
菌のコンピテントセルを形質転換したのち、前記の相同
ＤＮＡを３２ｐで標識したものをプローブとしてコロニ
ーハイブリダイゼーション［ｈ、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、
Ｊ、ｌ／ａｌｌｓ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、６８．３７９．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｎｅｗ　’１０ｒｋ（＋９７９）］を行ない、
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株を選択する。

このようにして得られたアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
をバチルス・ズブチリスで保持されるプラスミドにリク
ローニングしてバチルス・ズブチノスを形質転換するこ
とにより、アルカリ性プロテアーゼを生産する組換え体
が得られる。

このようにして得られたアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
の塩基配列を第１図に示す、アルカリ性プロテアーゼの
成熟蛋白は第１図の遺伝子の５３９番目から１３６０３
６０番目コードされている。また、この塩基配列から導
かれるアルカリ性プロテアーゼの成熟蛋白のアミノ酸配
列は第２図の通りである。なお、この遺伝子は、バチル
ス・リケニホルミスＩＰ１９６１１株（ｖｌｌ工研菌寄
第９１７７号）ヨリ得うしたものである。

変異アルカリ性プロテアーゼは、たとえば次のようにし
てアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を変異させることによ
り得ることができる。

アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含む断片を一本鎖ＤＮ
Ａファージ、たとえば、ＭＩ３Ｂ＋８やＭＩ３ｗｐ１９
などの複製型ＤＮＡ　（ＲＦ−ＤＮＡ）に連結して、大
腸菌（たとえば、エシェリヒア・３９３Ｍ１０９）を形
質転換し、Ｘ−ｇａｌ　　（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＨ寒天
平板［１ｗｔＸポリペプトン、０．８ｗｔ＄塩化ナトリ
ウム、１．２ｗｔ＄寒天コに重層法でまき、無色プラー
クを与えるファージを取り、これらのファージを大腸菌
に感染させ、感染大１１ｉ菌からＲＦ−ＤＮＡを抽出し
て、所定の長さのＤＮＡを保有する）７−ジを選択する
。このようにして選択されたファージを前記と同様にし
て大腸菌に感染させ、培養上溝のファージ粒子から一本
鎖ＤＮＡをＦＡｉ！する。

次いで、この−本鎖フ７−ジＤＮＡを亜硝酸ナトリウム
、亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミンなどの変異誘
起剤で処理した後、ＭＩ３ファージＤＮＡに相補的な配
列をもつユニバーサルブライマーを加えて６０〜７０℃
で２０〜６０分間保持した後、室温で２０〜６０分程度
放置し、ブライマーをファージＤＮＡにアニーリングさ
せる。

変異誘起剤による処理条件はアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子内に１箇所以上の塩基置換を誘起する条件が好まし
く、たとえば亜硝酸ナトリウムを用いる場合には、ＩＭ
径程度高濃度亜硝酸ナトリウムでは室温で２〜５分、ま
た７５１ｗＭ程度の低濃度では室温で２０〜４０分程度
が適当である。

次いで、４種のヌクレオチド、すなわちｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰＳｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ　（それぞれ最終濃度０．１
〜０．３ｍＭ）とクレノーフラグメント（１〜５ユニッ
ト／μｇＤＮＡ）を加えて３０〜３７℃で６０〜１２０
分間保ち、ＤＮＡの伸長反応を行なう。

次いで、このＤＮＡを制限酵素で処理してアルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子の全長を含む断片を切り出して、枯草
菌プラスミドに連結して枯草菌を形質転換するか、ある
いは、アルカリ性プロテアーゼの成熟蛋白領域の一部ま
たは全部を含む断片を切り出して、アルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子が挿入された組換えプラスミドの相当する領
域に連結して枯草菌を形質転換−する、得られた形質転
換体を１％程度のカゼインを含むニュートリエンドブロ
ス寒天平板［１ｗｔＸペプトン、０．５ｗｔ＄肉エキス
、０．５ｗｔ＄塩化ナトリウム、ｐＨ７，４、１，２ｗ
ｔＸ寒天コに接種して３７℃で一晩培養し、ハローを形
成する形質転換体を選択する。

界面活性剤耐性プロテアーゼを生産する株を選択する場
合は、これらのハロー形成株を培養して、培養上溝のプ
ロテアーゼ活性を界面活性剤存在下と界面活性剤不存在
下で測定し、界面活性剤不存在下での活性に対する界面
活性剤存在下での活性の割合が野生型より大きいものを
選択する、　変異アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の変異
部位は、たとえば、常法であるダイデオキシ法などによ
り塩基配列を決定し同定される。

また、　２２１位のメチオニンがグルタミンに置換され
たアルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子を得るに
は、たとえば、　２２１位のアミノ酸を中心として前後
３〜６個程度のアミノ酸の配列に刻応する塩基配列を持
ち、　２２１位のメチオニンのコドンのみがグルタミン
のコドンに置換された２０〜４０塩基程度のオリゴヌク
レオチドを化学合成し、これをブライマーとして部位指
定変異を行なえばよい０部位指定変異は、市販のキット
、たとえば「ミュータジエン」（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社！り
などを用いて次のようにして行なわれる。

アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含む断片を一本！１Ｄ
ＮＡファージ、たとえば、Ｍ１３ａ＋ｐ１８やＭＩ３ｍ
ｐ１９などの複製型ＤＮＡ　（ＲＦ−ＤＮＡ）に連結し
て、大腸菌（たとえば、エシェリヒア・コリｊＭＩ０９
）を形質転換し、Ｘ　−ｇａｆ　　を含むＨ寒天平板に
重層法でまき、無色プラークを与えるファージを取り、
これらのファージを大１１ｉＷに感染させ、感染大ｍＷ
からＲＦ−ＤＮＡを抽出して、所定の長さのＤＮＡを保
有するファージを選択する。このようにして選択された
ファージをエシェリヒア・コリ　ＣＪ２３６に感染させ
、培養上清の７７一ジ粒子からウラシル含有−末鎖ファ
ージＤ　ＮＡｆｌ−調製する。

この−末鎖ファージＤＮＡに、５′末端がリン酸化され
た前記の合成オリゴヌクレオチドを７ニーリングさせ、
次いで、４種のヌクレオチド、すなわちｄＡ丁Ｐ、　ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ　（それぞれ最終濃度０．
２〜１ｍＭ）と７４ＤＮＡポリメラーゼ（ｌ〜５ユニッ
ト／μｇＤＮＡ）を加えて３０〜３７℃で６０〜１２０
分間保ち、ＤＮＡの伸長反応を行なう。

次いで、この反応液を用いてエシェリヒア・コリＭＶＩ
　１９０を、常法のＣａ法により形質転換し、ファージ
のプラークを得る。このプラークより任意に１０個程度
を選び、−末鎖ＤＮＡを調製して、ダイデオキシ法によ
り変異導入部位の塩基配列を決定し、用いた合成オリゴ
ヌクレオチドと同じ配列になっているものを選択する。

以上のようにして部位指定変異で得られた変異アルカリ
性プロテアーゼ遺伝子を用いて変異アルカリ性プロテア
ーゼを生産するには、たとえば、前記のファージを感染
させた大ｌａＭからＲＦ−ＤＮＡをｖ４ｕｔ、、制限酵
素で処理してアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全長を含
む断片を切り出して、枯草菌プラスミドに連結して枯草
菌を形質転換するか、あるいはアルカリ性プロテアーゼ
の成熟蛋白領域の一部または全部を含む断片を切り出し
て、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子が挿入された組換え
プラスミドの相当する領域に連結して枯草菌を形質転換
し、形質転換体を通常の方法で培養すれば良い。

本発明の界面活性剤耐性のアルカリ性プロテアーゼのア
ミノ酸配列は第３図の通りであり、また酸化剤耐性で、
かつ、高比活性のアルカリ性プロテアーゼのアミノ酸配
列は第４図の通りであり、これらは第２図に示される天
然のアルカリ性プロテアーゼとは、それぞれ１０５位、
２２１位のアミノ酸が異なるのみである。

また、本発明の界面活性剤耐性のアルカリ性プロテアー
ゼは、たとえば、０．１２ｗｔ％ＬＡＳ　（直鎖アルキ
ルベンゼンスルホン酸塩）存在下でもＬＡＳが存在しな
い場合の４５％の活性を示し、天然のアルカリ性プロテ
アーゼの３６％に比べて耐性が増強されｋものである。

この変異酵素の比活性は、カゼインを基質とした場合７
８６０ユニット／ｍｇ蛋白である。

本発明のもうひとつの変異酵素である酸化剤耐性で、か
つ高比活性のアルカリ性プロテアーゼの比活性は？＋７
０ユニット／闘蛋白であり、天然のアルカリ性プロテア
ーゼの比活性７６８０ユニツ）／ｍｇ蛋白とほぼ同じで
ある。一方、ＩＭの過酸化水素で処理した時の残存活性
（過酸化水素耐性度）は天然のアルカリ性プロテアーゼ
が１４％であるのに対して、本発明の酸化剤耐性を有す
るアルカリ性プロテアーゼは９４％である。

界面活性剤耐性、酸化剤耐性の両方の性質を持つプロテ
アーゼを取得するには、それぞれの変異プロテアーゼ遺
伝子の組換えにより両方の変異部位を持つ遺伝子を作製
するか、あるいは、いずれかの変異遺伝子を鋳型として
前記のように部位指定変異により両方の変異を持つ遺伝
子を作製して、以下前記と同様に形質転換体を培養すれ
ば良い。

界面活性剤耐性・酸化剤耐性アルカリ性プロテアーゼの
比活性は６２００ユニット／ｌｓｇ蛋白であり、過酸化
水素剛性度は９４％である。また、たとえば、ＬＡＳ存
在下での活性は、ＬＡＳ不存在下での活性の２８％であ
る。

［実施例〕 以下、実施例によりさらに具体的に本発明を説明するが
、本発明はこれらに限定されるべきものではない。

なお、本発明で使用する制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
およびクレノーフラグメントなどの酵素はすべて市販品
を使用でき、たとえば、宝酒造株式会社、東洋紡績株式
会社などから購入することができる。これらの酵素によ
るＤＮＡの処理は、酵素の販売業者により頒布されてい
るカタログに記載されている条件で行なわれる。また、
ベクターＤＮＡも市販品を使用することができるが、こ
のＤＮＡを保有するバチルス・ズブチリスあるいは大腸
菌などから常法により抽出、精製されたものも使用する
ことができる。

実施例１　界面活性剤耐性アルカリ性プロテアーゼ遺伝
子の取得 バチルス・リケニホルミスＨＰ１９６１１株（Ｗｉ工研
菌寄第９１７７号）のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（
第１図番１１ｉりがベクターｐＨＹ３００ＰＬにに連結
された組換えプラスミドｐＨＬＰ３５２　（第５図参照
）５μｇを各１０ユニツトのＳｍａ　ＩとＢｇＩ　ＩＩ
で切断し、生じた断片をアガロースゲル電気泳動で分画
して、　２、Ｏｋｂの断片約　１．４μ８を得た。　一
方、Ｍ１３１１１ｐ＋９のＲＦ−ＤＮＡ　　１μｇを各
２ユニツトのＳ＋ａ　Ｉと８μｍＨＩで切断し、６５℃
、１０分間の加熱処理を行なった後、エタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収した。

両ＤＮＡを混合し、２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを
作用させて連結した。この連結ＤＮＡ０．１２μｇを用
いてエシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９を形質転換して、
　Ｘ−ｇａｌを含むＨ寒天平板上で無色のプラークを形
成する組換えファージを１個得た。この組換えファージ
をＭＩ３ＬＰＩと命名した。　　Ｍ１３ＬＰＩＤＮＡの
制限酵素地図を第６図に示した。

エシェリヒア・コリ　ＪＭＩ０９を２ＸＴＹ培地［ｌ。

６ｗｔ＄バクトドリプトン、１ｗｔＸ酵母エキス、０．
５νｔＸ塩化ナトリウム、ｐＨ７，４］中で３７℃で一
晩培養した前培養液５０μｌを、５Ｉｉの２ＸＴＹ培地
に植苗したものに、前記の組換えファージＭ　１３ＬＰ
１のプラークを移植して３７℃で５時間培養し、種フ７
−ジ液とした０次いで、２００ｍ１の２ＸＴＹ培地に、
前記の前培養液２Ｉｉと種ファージ液２ｍＡを加え３７
℃で５時間培養後、遠心分離してファージ粒子を含む上
溝１８５ｍｆを得た。

この上清に２０ｗｔＸポリエチレングリコール６０００
−２．５８　ＮａＣ１を３７−１加えて１５分間放置し
てファージを沈澱させた。遠心分離により沈澱を回収し
、１　ｖｈｌ　（７）Ｔ　ＥｌｌｆｆｉＷ　（ＩＯＩＩ
Ｍ　ト’Ｊ　：１．−塩酸＠衝１ｐＨ８，０，１ｍＭ　
ＥＤＴＡ）に懸濁後、１Ｉｉのフェノール（Ｔ　Ｅｌｆ
衝液飽和）を加えてよく混合してＤＮＡを抽出した。遠
心分離により水層を採取し、エタノール沈澱により約２
００μｇの一末鎖ファージＤＮＡを得た。

この−末鎖ファージＤＮＡ１００μｇを５００μ見の０
．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，２）に溶解し、５００
μｌの２Ｍ亜硝酸ナトリウムを加えて、２０℃で５分間
保持してＤＮＡに変異を誘発させた後、エタノール沈渥
によりＤＮＡを回収して、ＴＥ緩衝液ｌ−に溶解した。

この変異ＤＮＡ溶液にＭ１３ダイデオキシ法の１５壇基
のユニバーサルブライマー７２ｐｍｏｌを加えて、６０
℃で２０分間加熱したのち、室温で２０分間放置してア
ニーリングさせた。その後、４Ｈのデオキシヌクレオチ
ド（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）各１８
２ρｌｌ０１とクレノーフラグメント　１２６ユニツト
を加えて３０℃で９０分間伸長反応を行なっに、６５℃
で１０分間加熱して反応を停止し、フェノール抽出を行
なったのち、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

このＤＮＡを各５０ＯＬニツトのＳｍａ　ＩとＸｂａ　
Ｔで切断し、アガロースゲル電気泳動で分画し、２ｋｂ
（７）断片をりｌ！！した。　　一方、１２５μｇノｐ
ＵＢｌｌｏヲ各２５０ユニットのＰｖｕ　ＩＩとＸｂａ
　Ｉで切断し、同様に分画し、４ｋｂの断片を調製した
０両ＤＮＡを混合し、５０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガー
ゼを作用させて連結しに、なお、対照として用いるため
に、未変異のＭ１３ＬＰ１の　２　ｋｂ　Ｓａｇａ　Ｉ
　−Ｘｂａ　Ｉ断片とｐＵＢｌｌｏの４ｋｂ　Ｐｖｕ！
Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片とを前記と同様に連結し、野生型
遺伝子保有プラスミド　ｐＵＬ、Ｐ２Ｓ５　（第７図参
＠）を作製した。

この連結ＤＮＡを用いて以下のようにしてブロテアーゼ
低生産株バチルス・ズブチリス　ＰＷＩＯ（微工研Ｍ寄
第９１７６号）を形質転換した。

バチルス・ズブチリスＰＷＩＯをニュートリエンドブロ
ス［１ｗｔ＄ペプトン、０．５ｗｔＸ肉エキス、０．５
ｗｔＸ塩化ナトリウム、ｐＨ７，４］　　５　ｍｌに接
種して一晩培養した前培養液０．３■ｌを３０ＩＩｌの
ニュートリエンドブロスに接種して３７℃で　１．５時
間培養後、遠心分離によって自体を集め２．５ｍｌのＳ
ＭＭＰ　［２ＸＳＭＭと４倍濃度のＰｅｎａｓｓａｙ　
ｂｒｏｔｈ　（Ｄｉｆｃ。

社！りをｌ：　１で混合したもの、２ＸＳＭＭは！阿シ
ュクロース、０．０４Ｍマレイン酸、０．０４Ｍ　Ｍｇ
Ｃｂ、ｐＨ６，５］　　に懸濁し、５ｍｇのりゾチーム
を加えて３７℃で２時間保持してプロトプラスト！！濁
液を得た。

このプロトプラスト懸濁液１．５ｍｆｔに前記で得られ
た連結ＤＮＡ溶液２μｇと２ＸＳＭＭに溶解した４０％
ポリエチレングリコール４０００４．５ｔａ１を加えて
、静かに混合しながら２分間保った０次に、これに１５
ＩＩｆＬのＳＭＭＰを加えて混合したあと遠心分離によ
りプロトプラストを集め、３ｍｆｆ１のＳＭＭＰに懸濁
して３０℃で　１．５時間保持した。

このプロトプラスト液を２００μｇ／ｍ４のカナマイシ
ンを含むＤＭ３再生培地［０，５Ｍコハク酸ナトリウム
　ｐ　ＩＩ　７　、３．０．５ｗｔ＄グルコース、０．
５ｗｔＸカザミノ酸、０．５ｗＬＸ酵母エキス、０．０
１ｗｔ１牛血清アルブミン、０．３５ｗｔＸリン酸二カ
リウム、０．＋５ｖｔＸリン酸−カリウム、２０ｍＭ　
ＭｇＣｌ２．０．８ｗｔＸ　寒天］上ｔｍｌｏＯμｌず
つ塗布し、３７℃で２日間保持してコロニーを形成させ
た。

このような形質転換を１３回行ない、カナマイシン耐性
の形質転換体を　１４０９９４０９９株得らの形質転換
体を２０μｇ／ｎ１のカナマイシンを含むカゼインプレ
ート（１ｗｔＸカゼインを含むニュートリエンドブロス
寒天平板）にレプリカして３７℃で１６時間培養してハ
ロー形成株を４６４４株得た。これらのハロー形成株を
ニュートリエンドブロス寒天平板２枚にレプリカし、３
７℃で１６時間培養した後、コロニーをはがし、１枚に
は　１ｖｔＸカゼインを含むニュートリエンドブロス寒
天を、もう１枚には１ｖｔｚカゼインとＱ、１２ｗｔ＄
　Ｌ　Ａ　Ｓを含むニュートリエンドブロス寒天を重層
した。３７℃で１時間培養後、これら２枚の寒天培地に
おけるハローの形成状況を野生型遺伝子保有株（Ｈ４）
の場合と比較して、ＬＡＳ含有培地でも大きなハローを
形成するものを選択し、　２６１株を得た。

これらの株についてニュートリエンドブロスで４０時間
培養し、培養上清を適当な濃度に希釈した希釈液につい
て以下のようにＬＡＳ存在下の活性とＬＡＳ不存在下の
活性を測定した。

すなわち、基質液（０，７５ｍＭのＮ−５ｕｃｃｉｎｙ
ｌ−、−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−１Ｐｒｏ−ヒＰｈｅ−ｐ
−ｎｉｔｒｏａｎｉ　ｌ　ｉｄｅを含む５０ＩＩＭグリ
シンー水酸化ナトリウムＩＩ衝液ｐＨｌＯ１！＋＋＋Ｍ
　ＣａＣｆ２）　４００μｊ、　　および前記の基質液
に０．Ｉ８ｗｔＸのＬＡＳを含有させた基質液４００μ
℃のそれぞれに前記の希釈液２００μ党を加え、３７℃
で２０分間反応させて、これに反応停止液（０，３５Ｍ
　）リクロロ酢酸、１．０５Ｍ酢酸、０．７Ｍ酢酸ナト
リウム）　１００μｌを加えよく混合して反応を停止さ
せた後、この反応液の４１０ｒｖの吸光度を測定した。

ＬＡＳ不存在下で反応させた反応液の吸光度に対するＬ
ＡＳ存在下で反応させた反応液の吸光度の割合（ＬＡＳ
耐性度）を２６１株全部について求めた。

これらの結果において、野生型遺伝子保有株（Ｈ４）の
ＬＡＳ耐性度が３６％であったのに対して、変異株のう
ちの１株（７５−Ｌｌ）　　のＬＡＳ耐性度は４５％と
野生型より大きな値を示した。

なお、　７５−Ｌｌの保有するプラスミドｐＤＴＧ７５
の制限酵素地図はｐＵＬＰ３５５のそれと同じであった
。

実施例２　界面活性剤耐性アルカリ性プロテアーゼ遺伝
子の変異部位の同定 実施例１で得られた７５−Ｌｌからプラスミドを抽出し
、Ｘｂａ　ＩとＢｇｌ　ＩＩで切断後アガロースゲル電
気泳動で分画して、　３．３ｋｂの断片を調製した。−
方、ｐＵｃ１９をＸｂａ　ＩとＢａｍＨｒで切断し、前
記３．３ｋｂの断片と連結した。この連結ＤＮＡでエシ
ェリヒア・コリ　ＬＥ３９２を形質転換し、アンピシリ
ン耐性株を取り、この形質転換株よりプラスミドを調製
した。このプラスミドについてダイデオキシ法で塩基配
列を決定したところ、アルカリ性プロテアーゼの１０５
位のグリシン（Ｃ；ＧＣコドン）がアスバラギン酸（Ｃ
；ＡＣコドン）に置換されるのに相当する塩基の置換（
Ｇ→Ａ）が認められた。

実施例３　アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の部位指定変
異 第８図に示す３３塩基の合成オリゴヌクレオチドを用い
て、　２２１位のメチオニンをグルタミンに置換する変
異を導入した。変異処理にはＢｉｏ−Ｒａｄ社製のイン
ビトロミュータジエネシスキット「ミュータジエン」を
用いた。

バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子（第１図参照）がベクターｐｕＢ１１０に連結され
た組換えプラスミドｐＵＬＰ３５５　（第７図参照）４
．５μ、ｇを各１４ユニツトのＫｐｎ　ＩとＥｃｏＲＩ
で切断し、生じた断片をアガロースゲルＮ、ス泳動で分
画して、０．９７ｋｂの断片約０．７μｇを得た。　一
方、Ｍ１３＊ｐ１９のＲＦ−ＤＮＡ　（複製型ＤＮＡ）
２μｓを各５ユニツトのＫｐｎ　ｒとＥｃｏＲＩで切断
し、６５℃１０分間の加熱処理を行なった後、エタノー
ル沈澱によりＤＮＡを回収した０両ＤＮＡを混合し、４
ユニツトのＴ４ＤＮ入りガーゼを作用させて連結した。

この連結ＤＮＡ、０．３７℃ｇを用いてエシェリヒア・
コリＪＭＩ０９を形質転換して、無色のプラークを形成
する組換えファージを３個得た。エシェリヒア・コリ　
ＪＭ１０９を２ＸＴＹ培地中で３７℃で一晩培養した前
培養液５０μｌを５ｍｊ！の２ＸＴＹ培地に植菌したも
のに、前記の組換えファージ３個のうちの１＠のプラー
クを移植して３７℃で５時間培養し、２回遠心分離して
、その上清を種ファージ液とした。エシェリヒア・コリ
ＣＪ２３６を２ＸＴＹ培地中で３７℃で一晩培養した前
培養液１０μｌを２０＋ｗｌの２ＸＴＹ培地に植菌し、
３７℃で６時間培養したものに、前記の種ファージ液１
００μｍを加え、３７℃で！２時間培養した。この培養
液を遠心分離してファージ粒子を含む上清１８ｍ１を得
た。この上清に２０ｖｔｒポリエチレングリコール６０
００−２．５Ｍ　ＮａＣ１を３．６１Ｊ２加えて水中で
３０分放置し、ファージを沈澱させた。遠心分離により
沈澱を回収し、　２００μｌのＴＥ緩衝液（ＩＯｍＭ）
リス−塩酸緩衝液ｐＨ８，０、ｌ相Ｍ　ＥＤＴＡ）に懸
濁後、水中で３０分間静置した。遠心分離により上清を
回収し、　２００μｌのフェノール（ＴＥｗｉ衝液飽相
液飽和えてよく混合してＤＮＡを抽出した。遠心分離に
より水層を採取し、エタノール沈澱により、約１５μｇ
のウラシル含有−本ｍＤＮＡを得た。

このウラシル含有−末鎖ファージＤ　Ｎ　Ａ　Ｏ，ｌｐ
ｍｏｌ　（２７１ｎｇ）に５”末端をリン酸化した変異
導入用合成オリゴヌクレオチド（第８図参照）　３μｍ
ｏｉと１０×アニーリングバツフアー（２００−門トリ
スー塩酸ｌｌｌ衝液ｐＨ７，４，２０ＩＩＭＭｇＣ１２
，５００ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　：　ｒミュータジエン」付属
品）Ｉａｌを加え、滅菌蒸留純水で容量を　１０μｌ　
にした、７０℃で５分間加熱した後、室温で４０分放置
してアニーリングさせた。

その後、氷冷しながら　ｌμ克のＩＯＸシンセシスバッ
ファー（各５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、　ｌｏｉＭＡＴＰ、　１００ｍＭ）リス−塩酸
緩衝液ｐＨ７，４，５０ｇＭ　ＭｇＣＪｈ、２０ｍＭ　
ＤＴＴ：　ｒミュータジエン」付属品）、２゜５ユニツ
トの７４ＤＮＡリガーゼ、Ｉユニットの７４ＤＮＡポリ
メラーゼ、０．５μｇのＴ４遺伝子３２産物を加え、さ
らに水中で５分間置いに後、２５℃で５分保温し、続い
て３７℃で９０分保温して伸長反応を行なった。９０１
１１のＴＥ緩衝液を加え−２０”Ｃで凍結させ、反応を
停止させた。この反応液０．５μｌを用いて、エシェリ
ヒア・コリＭＶＩＩ９０を通常のＣａ法によって形質転
換し、Ｈ寒天平板にプラークを形成させた。プラークを
任意に１０個選んで一本鎖ＤＮＡを調製し、ダイデオキ
シ法により変異導入部位の塩基配列を決定し、所定の変
異が起こっているものを選択し、グルタミン置換体をコ
ードする変異アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を得た。

実施例４　酸化剤耐性アルカリ性プロテアーゼの発現と
過酸化水素剛性度の測定 エシェリヒア・コリＭＶ１１９０を２ＸＴＹ培地中で３
７℃で一晩培養した前培養液３０μｍを３ｖｈｌの２Ｘ
ＴＹ培地に植菌したものに、前記で選択したプラークを
移植して３７℃で５時間培養後、遠心分離して沈澱を回
収し、通常のアルカリ−５ＤＳ法によってＲＦ−ＤＮＡ
を２０℃ｇ得た。ＲＦ−ＤＮＡ、　５　μ、　ｇを各５
０ユニツトのＴｔｈｌｌｌ　ＩとＫｐｎ　Ｉで切断し、
アガロースゲル電気泳動で分画して、変異部分を含ム０
．７４ｋｂ　断片ｔｔ　Ｏ，４μｇ得た。一方、１０％
ｇのｐｌＪＬＰ３５ｓを各５０ユニツトのＴｔｈｌｌｌ
　Ｉとにｐｎｌで切断し、同様にして５．３ｋｂ断片を
調製した。この５．３ｋｂ断片０．２５μｇと変異部分
を含む０．７４ｋｂ断片０．０７μｇを混合し、　１ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて連結した。こ
の連ｖ１ＤＮＡを用いて実施例１と同様にしてバチルス
・ズブチリス　ｐｖ＋ｏを形質転換した。

得られた形質転換体を２０％ｇ／ｖａ１のカナマイシン
を含むカゼインプレートにレプリカして、３７℃で１０
〜１８時間培養してハロー形成株を得た。ハロー形成株
のうち１株をニュートリエンドブロス中で４０時間培養
し、培養上清中のプロテアーゼに対する過酸化水素の影
響を次のようにして試験した。

すなわち、適当な濃度に希釈した培養土清を条件Ａ　　
Ｏ，１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐ）！９．４
、 条件Ｂ　　Ｏ，１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液１
Ｍ過酸化水素、ｐＨ９，４ の緩衝液中で３７℃で５分間保温後、直ちに基質液（最
終濃度で０．５ｍＭのＮ−９ｕＣＣｉｎ７１−ｔ−＾１
ａ−１＾１ａ−５−Ｐｒｏ−，−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉ　ｔ
ｒｏａｎｉ　ｌ　ｉｄｅを含むＯ，ＩＭ　）リスー塩酸
緩衝液ｐ）１８．０．　５＋ｗＭ　ＣａＣ１２）を加え
、３７℃で２０分間反応させた０反応停止液（０，３５
Ｍ　）リフの吸光度を測定し、条件Ｂでの吸光度の、条
件Ａでの吸光度に対する割合を算出し、その値を過酸化
水素耐性度とした。その結果、野生型酵素では、１４％
の過酸化水素耐性度であったのに対し、酸化剤耐性酵素
（ＯＸＹ３２Ｑ）では９４％であった。

実施例５　変異アルカリ性プロテアーゼの比活性測定 実施例１で得られた界面活性剤耐性アルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子を保有するバチルス・ズブチノスＰｌ／１０
　（７５・１１株）および実施例４で得られた酸化剤耐
性アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を保有するバチルス・
ズブチリスＰＷＩＯをそれぞれニュートリエンドブロス
２０ｍ１に接種し、３７℃で４０時間培養し、遠心分離
により培養土清な得た。これらの培養土清に８．３ｇの
硫酸アンモニウムを加え、４℃で１時間放置後遠心分離
により沈澱を回収した。沈渥をト一の緩衝液（１０ｉＭ
リン酸緩衝液、ｐＨ５，５、ＩＢＭ　ＣａＣ１２）に溶
解し、同緩衝液に対して透析した。これらの透析内液を
回収し、陽イオン交換樹脂カラム（セパビーズＦＰ−Ｃ
Ｍ＋３、樹脂容量０．６■ｉ）に吸着させ、同Ｗ！衝液
３ｙａｌで洗浄後、８０ｍＨのＮａＣ１を含む同！１衝
液２ｖｉでアルカリ性プロテアーゼを溶出させた。

これらの溶出液のプロテアーゼ活性と蛋白量を測定し、
界面活性剤耐性アルカリ性プロテアーゼプロテアーゼ活
性は、カゼインを基質として用いるｔＪｅｈａｒａらの
方法［Ｈ，Ｕｅｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、：Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｏｆ　、　、虹、８２（１９７４）コに従い、３７
℃でｐＨ１ｏの活性を測定し、１分間に　ｌμｇのチロ
シンを遊離する酵素量を１ユニツトとした。

蛋白量は常法であるＬｏｗｒｙ法により測定し、ズブチ
リシン・カールスベルグ換算値で表した。

その結果、ＤＴＧ７５の比活性は７８６０ユニット／Ｉ
Ｉｇ蛋白であり、０ＸＹ３２Ｑの比活性は７１７０ユニ
ット／ｍｇ蛋白であった。同様に測定した野生型酵素の
比活性は７６８０ユニット／Ｉ１ｇ蛋白であった。

実施例６　界面活性剤耐性・酸化剤耐性アルカリ性プロ
テアーゼの作製 界面活性剤耐性酵素遺伝子を保有するプラスミド　ｐＤ
ＴＧ７５５１１　ｇを５０ユニツトの　Ｋｐｎ　Ｉと６
０ユニツトの７ｔｈｌｌｌ　Ｉで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動で分画して、界面活性剤耐性変異部分を含む
５．３ｋｂ断片を約３．５μｓ得た。一方、実施例３に
おけるグルタミン置換体をコードするアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子を持つ組換えファージのＲＦ−ＤＮＡ　２
．５μｇを４０〜５０ユニツトのにｐｎｌとＴｔｈｌｌ
ｌ　Ｉで切断し、前記と同様にして酸化剤耐性変異部分
を含む０．７４ｋｂ断片約０．２μｇを得た。この０．
７４ｋｂ断片ｏ、ｏ７μｇと　ｐＤＴＧ７５の　５．３
ｋｂ　Ｔｔｈｌｌｌ　Ｉ　−Ｋｐｎ　ｒ断片０．２５μ
ｇを混合し、１ユニツトの７４ＤＮＡリガーゼを作用さ
せて連結した。この連結ＤＮＡを用いて、実施例１と同
様にして、バチルス・ズブチリスＰＩ／１０を形質転換
した。得られた形質転換体を２０％ｇｌｌＩｌｌのカナ
マイシンを含むカゼインプレートにレプリカして、３７
℃で１０〜１８時間培養してハロー形成株を得た。ハロ
ー形成株５株をニュートリエンドブロスで４０時間培養
し、培養土溝中のプロテアーゼの界面活性剤耐性、過酸
化水素耐性を、それぞれ実施例１、実施例４のようにし
て測定した。その結果、酸化剤耐性変異と界面活性剤耐
性変異の両方を持つアルカリ性プロテアーゼ（ＯＤ３２
Ｑ）の過酸化水素剛性度は実施例４における０ＸＹ３２
Ｑと同じ９４％であった。また０Ｄ３２Ｑ（７）ＬＡＳ
耐性度は、２８％（ＯＸＹ３２ＱのＬＡＳ耐性度は２２
％）であった。

また、実施例５と同様にして測定した０Ｄ３２Ｑの比活
性は６２００ユニット／ｒａｇ蛋白であった。

［発明の効果］ 本発明による界面活性剤耐性アルカリ性プロテアーゼは
、従来のアルカリ性プロテアーゼよりも界面活性剤耐性
が大きく、しかも高い比活性を保持しているので、洗剤
中でも高い活性を発揮することができ、洗浄補助剤とし
てより好適に使用される。

また、酸化剤耐性で、かつ、高比活性の変異アルカリ性
プロテアーゼは、酸化剤が存在しても従来のアルカリ性
プロテアーゼに比べて著しく高い活性を発揮することが
できるので、酸素系漂白剤・殺菌剤を含む洗剤に配合し
て洗浄補助剤として用いる場合や過酸化水素を用いるコ
ンタクトレンズ殺菌剤と併用する蛋白除去剤として用い
る場合などに、より好適に使用される。さらに、比活性
が天然の酵素と同程度であるために従来より少ない量で
も従来のアルカリ性プロテアーゼと同等の効果を発揮さ
せることが可能となるとともに、酸化剤を使用しない用
途にも従来の酵素と同様の使用量で同じ効果が得られる
。

界面活性剤耐性および酸化剤耐性の両方の変異を合わせ
持つ変異アルカリ性プロテアーゼは、酸化剤および界面
活性剤を併用する洗剤などへの配合に好適である。

【図面の簡単な説明】

第１図はバチルス・リケニホルミスＨＰＩ９６１１株の
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を含むＤＮＡの
塩基配列を示す図、第２図、第３図および第４図は野生
型アルカリ性プロテアーゼ、界面活性剤耐性が付与され
たアルカリ性プロテアーゼおよび酸化剤耐性が付与され
たアルカリ性プロテアーゼのそれぞれのアミノ酸配列を
示す図、第５図は組換えプラスミドｐＨＬＰ３５２の制
限酵素地図、＄６図は組換えファージＭ１３ＬＰ１の制
限酵素地図、第７図は組換えプラスミドｐＵＬＰ３５５
の制限酵素地図、第８図は２２１位のメチオニンをグル
タミンに置換するためのブライマーの塩基配列を示す図
である。 なお、第２図から第４図において、Ｃ１ｙはグリシンを
、Ａｌａはアラニンを、Ｖａｔはバリンを、ＬｅＵはロ
イシンを、ｌｉｅはイソロイシンを、Ｓｅｒはセリンを
、Ｔｈｒはスレオニンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、
Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ａｓｎはアスパラギンを、Ｇ
ｌｎはグルタミンを、Ｌｙｓはリジンを、Ａｒｇはアル
ギニンを、Ｎｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルア
ラニンを、Ｔｙｒはチロシンを、Ｔｒｐはトリプトファ
ンを、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ｐｒ。 はプロリンを表す略号である。 また、第５図から第７図において、細線部分はベクター
プラスミドの領域、太線部分は染色体ＤＮＡに由来する
領域、矢印はベクタープラスミド上の薬剤耐性遺伝子の
存在する領域を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ
   において、１０５位のグリシンがアスパラギン酸に、お
   よび／または２２１位のメチオニンがグルタミンに置換
   されたことを特徴とする新規アルカリ性プロテアーゼ