DK175855B1 - Mutantprotease og protease til anvendelse i vaskemidler, DNA-sekvens, der koder for en sådan protease, ekspressionsvektor, der omfatter denne DNA-sekvens, prokaryotisk værtsstamme transformeret med en sådan vektor, fremgangsmåde til..... - Google Patents

Description

i DK 175855 B1

Den foreliggende opfindelse angår nye proteoly-tiske enzymer med forbedrede egenskaber til anvendelse i vaskemidler. Disse egenskaber omfatter forbedret evne til i tøjvaskemiddelvaskeblandinger at fjerne mis- 5 farvninger, forbedret stabilitet i tøjvaskemidler under opbevaring og forbedret stabilitet i vaskeblandinger fremstillet ud fra vaskemidlerne.

Anvendelse af enzymadditiver, især proteolytiske enzymer, i vaskemidler for at muliggøre fjernelse af 10 proteinbaseret snavs er rigeligt beskrevet. Se f.eks. de offentliggjorte europæiske patentansøgninger EP-A-0220921 og EP-A-0232269, US patentskrift nr. 4.480.037 og nr. Re 30.602 og artiklen "Production of Microbial Enzymes”, Microbial Technology, vol. 1 (1979) 281-311, 15 Academic Press.

Vaskemidler kan foreligge i pulverform, flydende form eller pastaform. De indeholder en eller flere anioniske, ikke-ioniske, kationiske, zwitterioniske eller amfotere forbindelser som aktivt detergensmateria-20 le. Sådanne forbindelser er beskrevet omfattende i "Surface Active Agents", Vol. II af Schwartz, Perry og Berch, interscience Publishers (1958). Endvidere kan de indeholde sekvestreringsmidler, stabiliserende forbindelser, duftstoffer og i nogle tilfælde oxidationsmid-25 ler, der sædvanligvis kaldes blegemidler. Vaskemidler anvendes til rengøring af faste overflader, toiletrengøring, opvask (enten pr. maskine eller håndkraft) og tøjvask.

Tøjvaskemidler inddeles sædvanligvis i to hoved-30 typer, flydende og pulverformige. Flydende tøjvaskemidler har høje koncentrationer af overfladeaktive midler, neutral til moderat alkalisk pH-værdi og indeholder i almindelighed ikke blegemidler. Vaskepulver har

I DK 175855 B1 I

I 2 I

I oftest høj alkallnitet (vaskeopløsnings pH 9-11), de I

I indeholder sekvestreringsmidler, såsom natriumtripoly- I

I phosphat, og de kan, afhængigt af vaskevanerne i de I

I lande, hvor de forhandles, indeholde blegemidler eller I

I 5 ikke indeholder blegemidler. I

I Enzymer, der i dag anvendes i vaskemidler, til- I

I sættes i form af flydende suspension, sol eller granu- .* I

I lat. I vaskepulvere er de proteolytiske enzymer f.eks. I

I i almindelighed til stede i en indkapslet form, såsom I

I 1° i prillform (f.eks. af Maxatas^® og MaxacaJ^ eller i I

I granulatform (f.eks. af Savinas^ og Alcalas^). Maxa- I

I tase og Maxacal forhandles af International Bio-Synthe- I

I tics B.v. (Rijswijk, Holland), og Savinase og Alkalase I

I forhandles af NOVO Industri A/S (Bagsværd, Danmark). I

I ^ i flydende vaskemidler er enzymerne oftest til stede i I

I form af opløsning. I

I Proteolytiske enzymer er i almindelighed van- I

I skelige at kombinere med vaskemidler. De skal være sta- I

I bile og aktive under anvendelse, f.eks. til fjernelse I

20 af proteinholdige farvestoffer fra tekstiler under vask I

H I

ved temperaturer i området fra ca. 10 C til over 60 C. I

De skal endvidere være stabile i lang tid i vaskemidlet I

under dettes opbevaring. Følgelig skal enzymerne være I

stabile og virksomme i tilstedeværelse af sekvestre- I

25 ringsmidler, overfladeaktive midler og i nogle tilfælde I

I blegemidler og ved høj alkallnitet og temperatur. Idet I

der hverken findes universalvaskemidler eller univer- I

seile vaskebetingelser (pH-værdi, temperatur, koncen- I

tration i vaskeblanding, hårdhed af vandet), som kan I

30 anvendes over hele verden, kan kravene til enzymer va- I

riere på basis af typen af vaskemidlet, hvori de skal I

H anvendes, og af vaskebetingelserne. I

De betingelser, der er afgørende for stabilite- I

H ten af enzymer i vaskepulvere er i almindelighed ikke I

3 DK 175855 B1 optimale. Under tilstedeværelse af enzympræparater i vaskepulvere kan oxidationsmidler fra vaskemidlet f.eks., på trods af den tilsyneladende fysiske adskillelse af enzymet fra vaskemiddelmaterialet, påvirke 5 proteasen og reducere dens aktivitet. En anden årsag til ustabilitet af enzymet i vaskepulvere under opbevaring er autodigestion, især ved høje relative fugtigheder.

Endvidere har oxidationsmidler, der ofte findes i vaskepulvere en vigtig ulempe med hensyn til effektiviteten af fjernelse af farvestof under anvendelse ved tøjvask eller -rensning på grund af fiksering af proteinholdige farvestoffer til tekstilmaterialet. Desuden reducerer disse oxidationsmidler og andre vaske-15 middelkomponenter, såsom sekvestreringsmidler, også effektiviteten af proteasen til fjernelse af farvestof under vaskeprocessen.

I flydende vaskemidler har man erfaret hurtig enzyminaktivering som et vigtigt problem, især ved høje 20 temperaturer. Idet enzymerne findes i opløsning i va- | skemiddelproduktet, sker denne inaktivering allerede i vaskemidlet under normale opbevaringsbetingelser og reducerer enzymernes aktivitet væsentligt inden produktet anvendes. Især anioniske, overfladeaktive midler, såsom 25 alkylsulfater, i kombination med vand og buildere har tendens til at denaturere enzymet irreversibelt og gøre det inaktivt eller følsomt overfor proteolytisk nedbrydning .

Delvise løsninger af stabilitetsproblemer i for-3° bindelse med enzymer i flydende vaskemidler er fundet ved tilpasninger af de flydende vaskemiddelformuleringer, som f.eks. ved anvendelse af stabiliseringsmidler til reduktion af inaktiveringen af enzymerne. Se EP-A-

DK 175855 B1 ! I

Η

0126505 og EP-A-0199405, US patentskrift nr. 4.318.818 I

og gb patentansøgning nr. 2178055A. I

En anden metode til sikring af stabilitet af en- I

zymer i flydende vaskemidler er beskrevet i EP-A- I

5 0238216, hvor fysisk adskillelse af enzymmolekylerne og I

det angribende vaskemiddelmateriale opnås ved hjælp af I

formuleringsteknologi. I vaskepulvere har alternative I

indkapslingsmetoder været foreslået, se f.eks. EP-A- I

0170360. I

10 I det foregående sammenfattes betingelserne, som I

proteolytiske vaskemiddelenzymer skal opfylde for at I

virke optimalt og begrænsningerne ved de enzymer, der i I

dag er til rådighed til anvendelse i vaskemidler. Uan- I

set anstrengelserne, der er gjort for at sikre enzym- I

15 stabilitet i vaskemidler, må man stadig regne med et I

H

væsentligt, tab af aktivitet under normale opbevarings-

og anvendelsesbetingelser. I

Identifikation og isolation af nye enzymer til I

en bestemt tiltænkt anvendelse, såsom anvendelse i va- I

20 skemidler, kan udføres på mange forskellige måder. En I

måde er screening for organismer eller mikroorganismer, I

der udviser den ønskede, enzymatiske aktivitet, isola- I

tion og oprensning af enzymet fra (mikro)organismen el- I

ler fra en kultursupernatant af denne (mikro)organisme, I

25 bestemmelse af dens biokemiske egenskaber og undersø- I

I gelse af, om disse biokemiske egenskaber opfylder kra- I

I vene ved anvendelsen. Hvis det identificerede enzym ik- I

I ke kan opnås ud fra den organisme, der naturligt danner I

I det, kan rekombinant-DNA-metoder anvendes til isola- I

I 30 tion af genet, der koder for enzymet, ekspression af I

I genet i en anden organisme, isolation og oprensning af I

I det eksprimerede enzym og testning af, om det er egnet I

I til den tiltænkte anvendelse. I

5 DK 175855 B1 j

En anden fremgangsmåde til opnåelse af nye enzymer til en tiltænkt anvendelse er modifikation af eksisterende enzymer. Dette kan f.eks. opnås ved kemiske modifikationsmetoder (se I. Svendsen, Carlsberg J 5 Res. Commun. 44 (1976), 237-291). I almindelighed er disse fremgangsmåder for uspecifikke, idet alle tilgængelige rester med samme sidekæder modificeres, eller idet de er afhængige af tilstedeværelsen af passende aminosyrer, der skal modificeres, og de er ofte uegne-10 de til modifikation af aminosyrer, der er vanskelige at nå, hvis ikke enzymmolekylet er ufoldet. Enzymmodifikationsmetoden med mutagenese af det kodende gen formodes derfor at være bedre.

Mutagenese kan opnås enten ved tilfældig muta-15 genese eller ved stedsdirigeret mutagenese. Tilfældig mutagenese. ved behandling af en hel mikroorganisme med et kemisk mutagen eller ved imiterende bestråling kan selvfølgelig resultere i modificerede enzymer. I dette tilfælde må strenge selektionsforskrifter foreligge til 20 udvælgelse af overordentligt sjældne mutanter med de ønskede egenskaber. En større sandsynlighed for isolation af mutantenzymer ved tilfældig mutagenese kan efter kloning af det kodende gen ved mutagenese in vitro eller in vivo og ekspression af enzymet, som det koder 25 for, opnås ved rekloning af det muterede gen ind i en I

egnet værtscelle. Også i dette tilfælde må passende biologiske selektionsforskrifter være til rådighed til selektion af de ønskede mutantenzymer, se international patentansøgning WO 87/05050. Disse biologiske selek-30 tionsforskrifter giver ikke specifik selektion af enzymer egnet til anvendelse i vaskemidler.

Den mest specifikke fremgangsmåde til opnåelse af modificerede enzymer er stedsdirrigeret mutagense,

I DK 175855 B1 I

I I

I der muliggør specifik substitution af en eller flere 1 I

I aminosyrer med en vilkårlig anden ønsket aminosyre. i I

I I EP-A-0130756 gives eksempler på anvendelse af denne I

I metode til dannelse af mutantproteasegener, der kan I

I 5 eksprimeres til opnåelse aaf modificerede proteoly- I

I tiske enzymer. I

I For nylig har mulighederne for oligonucleotid- I

I medieret, stedsdirigeret mutagenese været vist ved I

I anvendelse af mutagene oligonucleotider syntetiseret I

I 10 til at indeholde blandinger af baser ved adskilllige I

I positioner i en målsekvens. Dette muliggør indføring af I

I en række forskellige mutationer ved en specifik del af I

en DNA-sekvens ved anvendelse af et enkelt, syntetisk I

I oligonucleotidpræparat som eksemplificeret af (Hui et I

I 15 al., EMBo J, 2 (1984) 623-629, Matteucci et al., Nucl. I

Acids Res.. 11 (1983) 3113-3121, Murphy et al., Nucl. I

I Acids Res 11 (1983) 7695-7700, Wells et al., Gene 34 I

I (1985) 315-323, Hutchingson et al., Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 83 (1986) 710-714 og F.M. Ausubel, Current I

I 20 protocols in Molecular Biology 1987-1988, Greene I

I Publishers Associatin og Wiley, Interscience, 1987). I

I Stauffer et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) I

5333-5338, har allerede fundet, at methioninet ved I

I position 221 i Carlsberg subtilisin oxideres af Η202 I

I 25 til methioninsulfoxid og er ansvarligt for et voldsomt I

fald i aktiviteten. I

I Som et resultat af både metoden med tilfældig og I

I med stedsdirrigeret mutagnese til dannelse af modifice- I

I rede enzymer er mutanter opnået ud fra serinproteasen I

30 fra Bacillus amylollquefaclens, også betegnet "subti- I

I lisin BPN'" isoleret og karakteriseret. I international I

patentansøgning med offentliggørelsesnummeret I

I wo 87/05050 beskrives et mutant subtilisin BPN* med I

7 DK 175855 B1 forbedret termisk stabilitet. I EP-A-0130756 beskrives at stedsdirrigeret mutagenese af methionin ved position 222 i subtilisin BPN' med alle de 19 mulige aminosyrer under anvendelse af den såkaldte "kasettemuta-5 genesemetoden, kan resultere i enzymer, der er resistente mod oxidation med 1 det sidste tilfælde havde de fleste mutanter imidlertid lav proteolytisk aktivitet. De bedste, fundne mutanter var Μ222Ά og M222S, der havde specifikke aktiviteter på henholds-10 vis 53% og 35% i forhold til det naturlige subtilisin BPN', se Estell et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 6518-6521.

Tidligere arbejde til udvikling af modificerede proteaser viser, at subtilisin BPN'-mutanter med ændret 15 stabilitetsegenskaber og ændrede kinetiske egenskaber kan opnås.. Se litteraturen nævnt ovenfor og andre referencer, f.eks. Rao et al., Nature 328 (1987) 551-554,

Bryan et al., Proteins 1 (1986) 326-334, Cunningham og Wells, Protein Engineering .1 (1987) 319-325, Russell et 20 al., J. Mol Biol. 193 (1987) 803-819, Katz og Kossia-koff, J. Biol. Chem. 261 (1986) 15480-15485, og oversigterne af Shaw, Biochem. J. 246 (1987) 1-17 og Gait et al., Protein Engineering 1 (1987) 267-274. Ingen af disse referencer har imidlertid ført til industriel 25 produktion af proteolytiske enzymer med forbedrede vaskeegenskaber og stabilitet i vaskemidler. Ingen af de modificerede proteaser har hidtil vist sig at have kommerciel værdi og være bedre end de i dag anvendte vaskemiddelenzymer under de relevante anvendelsesbe-30 tingelser.

Ifølge et aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes en mutantprotease som defineret i krav 1. Disse mutantenzymer udviser forbedrede egenskaber til anvendelse i vaskemidler, især tøjvaskemidler.

I DK 175855 B1 I

I I

I Nævnte substitutioner i mutantproteasen kan hen-

I sigtsmæssigt svare til [N212D, S160G]. I

I Ved en foretrukken udførelsesform er enzymet en I

I PB92 proteasemutant. I

I 5 1 et yderligere aspekt angår opfindelsen en pro- I

I tease til anvendelse i vaskemidler og med den i krav 4

I anførte sekvens. I

I Ifølge et yderligere aspekt angår opfindelsen en I

I DNA-sekvens, som koder for en protease som defineret I

I 10 ovenfor. I

I Opfindelsen vedrører også en ekspressionsvektor, I

I som omfatter nævnte DNA-sekvens. I

I I et yderligere aspekt omfatter opfindelsen en I

I prokaryotisk værtsstamme transformeret med nævnte vek- I

I 15 tor. I

I Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til I

fremstilling af en protease som defineret ovenfor. I

I Endelig angår opfindelsen et vaskemiddel, som I

I omfatter en eller flere af proteaserne samt anvendelse I

I 20 af en eller flere af proteaserne i et vaskemiddel eller I

I i en vaskeproces. I

I Disse og andre aspekter af opfindelsen vil blive I

I beskrevet nærmere i den følgende, detaljerede beskri- I

I velse. I

I I

Kort beskrivelse af tegningerne: I

Fig. 1A viser konstruktionen af mutationsvek- I

I toren indeholdende PB92 proteasegen. I

I 30 Fig. IB viser skematisk den anvendte mutagenese- I

metode. I

I Fig. 1C viser konstruktionen af en ekspression- I

vektor indeholdende et mutanet PB92 proteasegen. I

9 DK 175855 B1

Pig. 2A, 2B og 3 viser vaskeevnen som funktion af specifik, proteolytisk aktivitet for forskellige PB92 proteasemutanter under forskellige vaskebetingelser.

5 Fig. 4 viser nucleotidsekvensen af PB92 protea- segenet og aminosyresekvensen af precursorenzymet, som det koder for.

Med udtrykket "med forbedrede egenskaber”, som det anvendes i nærværende beskrivelse 1 forbindelse med 10 "proteolytiske mutantenzymer", menes proteolytiske enzymer med forbedret vaskeevne eller forbedret stabilitet med bevaret vaskeevne i forhold til den tilsvarende vildtypeprotease.

Udtrykket ' vaskeevne” af proteolytiske mutant-15 enzymer defineres i nærværende beskrivelse som det proteolytiske. mutantenzyms bidrag til tøj rensningen udover virkningen af vaskemidlet uden enzymet under relevante vaskebetingelser.

Udtrykket “relevante vaskebetingelser“ anvendes 20 til betegnelse af de betingelser, især med hensyn til vasketemperatur, tid, mekaniske forhold, koncentration af vaskemiddel i vaskevandet, arten af vaskemidlet og vandets hårdhed, der faktisk anvendes i husholdningen i et markedsområde for vaskemidlet.

2 ^ Udtrykket "forbedret vaskeevne" anvendes til at vise, at et bedre slutresultat opnås med hensyn til fjernelse af farvestof under "relevante vaskebetingelser", eller at en mindre mængde proteolytisk mutantenzym på vægtbasis er nødvendig til opnåelse af det ^ samme resultat som med det tilsvarende vildtypeenzym.

Udtrykket "bevaret vaskeevne" anvendes til angivelse af, at vaskeevnen af et proteolytisk mutantenzym på vægtbasis er mindst 80% af vaskeevnen af den til-

I DK 175855 B1 I

I 10 I

svarende vildtypeprotease under "relevante vaskebe- I

I tingelser". I

I Udtrykket "forbedret stabilitet" anvendes til I

I angivelse af bedre stabilitet af proteolytlske mutant-

I 5 enzymer 1 vaskemidler under opbevaring og/eller bedre I

I stabilitet 1 vaskeblandingen, hvilket omfatter stabili- I

I tet mod oxidationsmidler, sekvestrerlngsmldler, auto- I

I lyse, overfladeaktive midler og høj alkallnltet, end I

I hvad man finder hos det tilsvarende vildtypeenzym. I

I 10 Biokemiske egenskaber bestemt under veldefinere- I

I de laboratoriebetingelser er Ikke pålidelige parametre I

I til forudsigelse af egenskaberne af en bestemt vaske- I

I middelprotease under de ønskede og specificerede anven- I

I delsesbetingelser. Disse parametre omfatter kinetiske I

I 15 data målt på veldefinerede substrater, såsom proteiner I

I som f.eks.. casein, dimethylcasein og haemoglobin, eller

I substituerede oligopeptidsubstrater, som f.eks. I

I sAAPFpNA (succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-propyl-L-phenyl- I

I alanyl-paranitroanilid). Det er klart, at andre træk I

I 20 ved proteaserne bestemmer deres effektivitet ved tøj- I

I vask eller -rens. I

I Den foreliggende opfindelse er baseret på den I

I opdagelse, at forudsigelse af virkningen af specifikke I

I mutationer under faktiske anvendelsesbetingelser stadig I

I 25 er meget vanskelig eller endog umulig, skønt metoder I

I til Indføring af aminosyreændringer, ved hvilke man kan I

I fremkalde væsentlige ændringer af deres biokemiske I

I egenskaber, er til rådighed. I

Ifølge opfindelsen har man nu efter vidtgående I

I 30 forskning og forsøg fundet en fremgangsmåde, ved hvil- I

I ken fremstillingen af mutantproteaser kombineres med en I

H effektiv selektionsmetode på basis af disse proteasers I

I egenskaber. Det er overraskende, at relativt store an- I

11 DK 175855 B1 tal enzymer kan screenes effektivt for deres styrke på denne måde.

Denne testmetode er baseret på fjernelsen af proteasefølsomme stammer fra testprøver 1 et laundero-5 meter eller tergotometer, hvori de relevante vaskebetingelser efterlignes. Egnede testprøver er f.eks. de kommercielt tilgængelige prøver fra EMPA (EidgenCssis-che Material Prtifungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, !

Schweiz), hvilke er tilsmudset kunstigt med proteinhol-10 dige farvestoffer. Relevante farvestoffer på prøver til testning af protease omfatter blod, græs, chokolade, farvestoffer og andre proteinholdige farvestoffer.

Ved denne testmetode kan man desuden kontrollere andre relevante faktorer, såsom vaskemiddelsammensæt-15 ning, koncentration i vaskeblanding, vandets hårdhed, mekaniske .forhold under vaskningen, tid, pH-værdi og temperatur, på en sådan måde, at man efterligner de betingelser, der er typiske for husholdningsanvendelse på et givet markedsområde.

20 Proteasers vaskeevne måles sædvanligvis ved de res evne til at fjerne visse repræsentative farvestoffer under passende testbetingelser. Denne evne kan hensigtsmæssigt bestemmes ved reflektansmålinger på testklæder efter vask med og uden enzymer i et launderome- i 25 ter eller tergotometer. Testen ifølge opfindelsen til anvendelse i laboratoriet er, når den anvendes på pro-teolytiske enzymer modificeret ved DNA-mutagenese, repræsentativ for husholdningsanvendelse.

Følgelig muliggør opfindelsen testning af mæng-30 der af forskellige enzymer og selektion af de enzymer, som er særligt egnede til anvendelse i en specifik type vaskemiddel. På denne måde kan skræddersyede enzymer til specifikke anvendelsesbetingelser let udvælges.

I DK 175855 B1 I

I 12 I

I Nogle bakterielle serinproteaser betegnes sub- I

I tillsiner. Subtilisiner omfatter serinproteaser fra I

I Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaclens ("subti- I

I lisin EPN"*) og Bacillus llchenlformls ("subtilisin I

I 5 Carlsberg"). Se oversigtsartiklen af Markland og Smith I

I (1971) i "The Enzymes" (Boyer, red.) vol 3, 561-608, I

I Academic Press, New York. Bacillus stammer, såsom al- I

I kalofile Bacillus-stammer, danner andre proteaser. I

I Eksempler på den sidstnævnte kategori er serinprotea- I

I 10 serne i MaxacalR, i det følgende også betegnet PB92 I

I protease) fra Bacillus nov. spec. PB92), og i Savina- I

I seR, som nævnt tidligere. I

I Aminosyresekvensen af PB92 proteasen er vist i I

I fig. 4. Den modne protease består af 269 aminosyrer,

I 15 der repræsenterer en molekylvægt på ca. 27000 D, og har I

I et isoelektrisk punkt i det stærkt alkaliske område. I

I Aktiviteten af PB92 protease på proteinsubstrat udtryk- I

I kes i Alkaline Delft Units (ADU). Aktiviteten i ADU be- I

I stemmes efter metoden beskrevet i britisk patentskrift I

I 20 nr. 1.353.317, bortset fra at pH-værdien ændres fra I

I 8,5 til 10,0. Renset PB92 protease har en aktivitet på I

I 21.000 ADU pr. mg. Turnover number (kcaf) målt på casein I

I er 90 sekunder**1. I

I Den specifikke aktivitet af rensede præparater I

I 25 af subtilisin Carlsberg (Delange og Smith, J. Biol. I

I Chem. 243 (1968) 2184) beløber sig til 10.000 ADU/mg og I

I af subtilisin BPN1 (Matsubara et al., J. Biol. chem. I

I 240 (1965) 1125) til 7.000 ADU/mg. Foruden de ovennævn- I

I te parametre, såsom specifik aktivitet og turnover num- I

I 30 ber (kcat), adskiller PB92 protease sig fra proteaser, I

I såsom Carlsberg subtilisin, subtilisin BPN' og andre I

I proteaser formuleret i vaskemidler (f.eks. MaxataseR og I

I AlcalaseR) ved at have en høj positiv ladning, der kan I

13 DK 175855 B1 visualiseres ved gelelektroforese af det naturlige protein som beskrevet senere i forsøgsafsnittet under punkt 4.

Idet PB92 protease er aktiv til fjernelse af 5 farvestof ved alkaliske pH-værdier, anvendes det almindeligt som et vaskemiddeladditiv sammen med vaskemid-delbestanddele, såsom overfladeaktive midler, buildere og oxidationsmidler. De sidstnævnte midler foreligger oftest i pulverform. PB92 protease har en høj effekti-10 vitet til fjernelse af farvestof i sammenligning med andre proteaser, såsom de førnævnte subtilisiner. Dette betyder, at en mindre mængde PB92 protease kræves til opnåelse af den samme vaskeevne.

Følsomheden for oxidation er en vigtig ulempe 15 ved PB92 proteasen og alle andre kendte serinprotea-ser, der anvendes i vaskemidler (se også Stauffer et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) 5333-5338; Estell et al., J. Biol. Chem. 263 (1985) 6518-6521). Oxidation af PB92 protease med enten H202 eller persyrer, der ud-20 vikles af aktivatorsystemet indeholdende perborat-te-trahydrat og TAED, giver et enzym med en specifik aktivitet på henholdsvis 50 og 10% i ADU/mg af den specifikke aktivitet af den ikke oxiderede PB92 protease (se forsøgsafsnittet punkt 7 og eksempel 1).

25 Fremgangsmåden er meget velegnet til fremstil ling, screening og selektion af proteolytiske mutantenzymer, som er opnået ud fra naturligt fremstillede bakterielle serinproteaser. Sådanne mutanter er f.eks. de mutanter, der kodes af et gen opnået ud fra et vild-

Of) u typegen af en alkalofil Bacillus stamme, fortrinsvis PB92. Også mutanter opnået ud fra den alkalofile Baclllus-serlnprotease Savinase er egnede. Fremgangsmåden kan desuden hensigtsmæssigt anvendes til selek-

I DK 175855 B1 I

I 14 I

I tion af modificerede proteaser opnået ud fra andre I

I proteaser end serinproteaser fra alkalofile Bacillus I

stammer PB92. F.eks. er generne, der koder for serin- I

proteaserne af Bacillus subtills, Bacillus amylollque- I

I 5 faclens og Bacillus licheniformls kendte, og de kan an- I

vendes som mål for mutagense. Det er klart, at enten I

I oligonucleotid-steddirigeret mutagenese eller regiondi- I

I rigeret tilfældig mutagenese eller en vilkårlig andet I

I egnet fremgangsmåde til effektiv udvikling af mutatio- I

10 ner i proteasegenet kan anvendes. I

I Fremgangsmåden til udvælgelse af proteolytiske I

I mutantenzymer omfatter de følgende trin: mutagense af I

I et klonet gen, der koder for et proteolytisk enzym af I

interesse eller et fragment deraf; isolation af det op- I

13 nåede mutantproteasegen eller de opnåede mutantprotea- I

I segener; indføring af dette eller disse mutantprotease- I

gen(er), fortrinsvis på en egnet vektor, i en passende I

I værtsstamme til ekspression og produktion; udvinding af I

den fremstillede mutantprotease og identifikation af de

I 20 mutantproteaser, der har forbedrede egenskaber til an- I

I vendelse i vaskemidler. I

I Egnede værtsstammer til fremstilling af mutant-

I proteaser omfatter transformerbare mikroorganismer, I

I hvori ekspression af proteasen kan opnås. Specifikke

I 25 værtsstammer af samme art eller slægt; som proteasen I

I er opnået ud fra, er egnede, såsom en Bacillus stamme, I

I fortrinsvis en alkalofil Bacillus stamme, helst Bacll- I

I lus nov. spec. PB92 eller en mutant deraf med i det væ- I

I sentlige de samme egenskaber. Også subtilis, B^ I

I 30 licheniformls og amylollquefaclens-stammer er blandt I

I de foretrukne stammer. Andre egnede og foretrukne stam- I

I mer omfatter de stammer, som inden transformationen med I

I et mutantgen i det væsentlige er ude af stand til at I

DK 175855 B1 15 danne ekstracellulære, proteolytiske enzymer. Af særlig interesse er proteasedeflciente Bacillus værtsstammer, såsom et proteasedeficient derivat af Bacillus nov. spec. PB92. Ekspressionsignaler omfatter DNA-sekvenser, 5 der regulerer transkription og translation af protease-generne. De rette vektorer er i stand til at replikere med tilstrækkeligt høje kopiantal i de valgte værtsstammer eller at muliggøre stabil bevarelse af pro-teasegenet i værtsstammen ved kromosomal integration.

10 De proteolytiske mutantenzymer ifølge opfindel sen fremstilles ved dyrkning under passende fermenteringsbetingelser af en transformeret værtsstamme omfattende det ønskede proteolytiske mutantgen eller de ønskede, proteolytiske mutantgener og udvinding af de 15 dannede enzymer.

Proteaser, der eksprimeres, udskilles fortrins-vis i kulturmediet, hvilket letter deres opsamling, eller, for gramnegative, bakterielle værtsstammer, i pe-riplasmarummet. Til udskillelse anvendes en passende 20 aminoterminal signalsekvens, fortrinsvis signalsekvensen kodet af det oprindelige gen, hvis dette er funktionelt i den valgte værtsstamme.

Ifølge et aspekt af opfindelsen kan man udvikle passende tests for vaskeevne, hvilke er repræsentative 25 for alle markedets relevante husholdningsvaskebetingel-ser. F.eks. udvikledes en egnet test til det meget krævende, europæiske vaskepulvermarked, hvor man anvender pulverformigt formulerede vaskemidler, som kan indeholde blegemidler eller ej, i vaskeopløsningskoncen- trationer fra 1-10 g vaskemiddel/1 ved 10-20°GH (tysk 0 hårdhed) og ved temperaturer på mellem 25 og 80 C. Mere specifikt anvendtes et pulverformigt formuleret vaske middel indeholdende TAED og perborat i en vaskeopløs-

I DK 175855 B1 I

I 16 I

ningskoncentratlon på 4, 7 eller 10 g vaskemiddel/1 I

I ved 15°GH ved 40°C. I

I Der tilvejebringes også tests, som er repræsen- I

I tatlve for vask med flydende vaskemidler. Egnede vaske- I

I 5 evnetests kan udvikles til andre betingelser, som man

I møder på markedet. Testemner tilsmudset med protease- I

følsomme farvestoffer, især emner tilsmudset med blod-, I

I græs- og chokoladefarve og andre proteinholdige farve- I

I stoffer, nærmere betegnet EMPA-testemnerne 116 og 117, I

10 anvendes ved repræsentative vaskeevnetests. I

I Egenskaberne af de naturligt forekommende eller

I naturligt muterede vaskemiddelproteaser kan forbedres I

I ved indføring af forskellige mutationer i enzymet. I de I

I fleste tilfælde vil mutationerne være substitutioner, I

I 15 enten konservative eller ikke-konservative, men dele- I

I tioner og indføjelser kan også finde anvendelse. I

I Til konservative substitutioner kan følgende ta- I

bel anvendes: I

I 20 Allfatisk I

I neutral I

I Upolær G, A, P I

I L, I, V I

polær C, M, S, T, I

I 25 N, Q I

I ladet I

anionisk D, E I

I kationisk K, R I

I Aromatisk F, H, W, Y I

I 30 I

I hvor enhver aminosyre kan substitueres med en vilkårlig

I anden aminosyre i samme kategori, især på samme linie. I

I Desuden kan de polære aminosyrer N, Q erstatte eller I

i DK 175855 B1 i i i 17 ! erstattes med de ladede aminosyrer. I forbindelse med

* I

den foreliggende opfindelse er substitutioner, der resulterer i øget anionisk karakter af proteasen, især ved steder, der ikke er direkte Involveret i det aktive 5 sted, af særlig interesse.

Regioner af særlig interesse for mutationer er de aminosyrer, der ligger indenfor en afstand på 4 Å fra inhibitormolekylet Eglin C, når Eglin C er bundet til det aktive sted.

10 Den følgende nummerering er baseret på PB92 pro tease, men betragtningerne er relevante for andre se-rinproteaser med en i det væsentlige homolog struktur, især de proteaser, der har mere end ca. 70% homolog!, især mere end 90% homologi. Disse positioner vil være 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198 og 203-216, idet de fleste af disse positioner er tilgængelige for direkte vekselvirkning med et proteinsubstrat. Positionerne 32, 62, 153 og 215 vil sædvanligvis ikke være 20 substituerede, idet mutationer ved disse steder har tendens til at forringe vaskeevne.

Substitutionssteder af særlig interesse omfatter positionerne 60, 62, 94, 97-102, 105, 116, 123-128, 150, 152, 153, 160, 183, 203, 211, 212 og 213-216. Ved 25 nogle positioner vil der være et ønske om at ændre en ustabil aminosyre, f.eks. methionin, til en oxidations-mæssigt mere stabil aminosyre, f.eks. threonin, under bevarelse af aminosyrens almene konformation og volumen på dette sted. I andre situationer viser det sig, at 30 forbedrede resultater kan opnås ved udskiftning af den naturlige aminosyre med næsten en hvilken som helst anden aminosyre, dette gælder især udskiftning af de hydroxylerede aminosyrer, S, T, med polære eller ikke-polære aminosyrer eller endog aromatiske aminosyrer.

DK 175855 B1 I

i

Substitutioner af særlig interesse omfatte:

G116 I, V, L I

S126 en vilkårlig aminosyre I

P127 en vilkårlig aminosyre

5 S128 en vilkrålig aminosyre I

S160 anionisk eller neutral alifatisk eller R I

Al66 ladet, især anionisk I

M169 neutral, alifatisk, fortrinsvis upolær I

N212 anionisk

10 M216 alifatisk polær, især S, T, N, Q I

Mens mange af mutationer resulterer i en lavere, I

specifik aktivitet af proteasen med almindelige sub- I

s trater, er vaskeevnen overraskende sammenlignelig el-

ler bedre end for det naturlige enzym, og i mange til- I

15 fælde forbedres lagerstabiliteten. I

Vaskeevnen af nogle af PB92 mutantproteaserne, I

når den udtrykkes som den reciprokke værdi af den rela- I

tive mængde af enzymet, der er nødvendig til opnåelse I

af samme virkning som med den naturlige protease x I

20 100%, øges til mere end 120% og i visse tilfælde til I

mere end 180%. I

Ifølge et andet aspekt af opfindelsen tilveje- I

bringes PB92 proteasemutanter, som har en bedre opbe- I

varingsstabilitet i et pulverformigt vaskemiddel inde- I

25 holdende blegemiddel end den naturlige PB92 protease, I

mens de bevarer vaskeevnen. Eksempler på sådanne mutan- I

ter er M216S og M216Q og mutanter med mindst én af dis- I

se mutationer foruden mutationer andre steder. I

Ifølge et yderligere aspekt af opfindelsen viste I

30 det sig overraskende, at mutant PB9-proteaserne M216S, I

M216Q, S160D og N212D bevarer deres aktivitet bedre end I

PB92 protease i et flydende tøjvaskemiddel (der ikke I

indeholder oxidationsmidler). Af disse mutanter bevarer I

19 DK 175855 B1 H216S og M216Q vaskeevnen, og S160D og N212D har forbedret vaskeevne. Forbedringen med hensyn til opbevaringsstabilitet i det testede, flydende vaskemiddel er mest udtalt for S160D- og M216Q-mutanterne.

5 Det er også muligt at kombinere en række for skellige mutationer, der øger stabiliteten af en protease i vaskemidler. Adskillige mutationer, der påvirker vaskeevnen af samme protease positivt kan kombineres til et enkelt mutantproteasegen, der muliggør frem-10 stilling af eventuelt endnu mere forbedrede proteaser, f.eks. [S126M, P127A, S120G, S160D] og [G116V, S126N, P127S, S128A, S160D]. Nye proteasemutanter. kan dannes ved kombination af de gode egenskaber med hensyn til vaskeevne af f.eks. N212D og S160D med stabilitets-15 egenskaberne af f.eks. M216S eller M216Q. [S160D, M216S]-mutanten har f.eks. forbedret vaskeevne og bedre stabilitet ved opbevaring.

Nyttige mutanter kan også opnås ved kombination af vilkårlige af mutationerne eller sættene af mu-20 tationer beskrevet i nærværende beskrivelse. Desuden er det muligt at kombinere nyttige mutationer som beskrevet heri med mutationer ved andre steder, som kan eller ikke kan forårsage en væsentlig ændring af enzymets egenskaber.

25 Foretrukne udførelsesformer af den foreliggende opfindelse er de følgende PB92 proteasemutanter: [N212D] og [S160G, N212D].

Til illustration af betydningen af fremgangsmåden anvendt ifølge nærværende opfindelse til opnåelse 30 af nye proteaser egnet til anvendelse i tøjvaskemidler, dvs. ved anvendelse af repræsentativ tøjvasketestning \ som primært selektionskriterium, er resultaterne af va-skeevnetestene af mutant PB92 proteaser sammenlignet

DK 175855 B1 I

med de biokemiske parametre, som sædvanligvis bestemmes H

ved biokemiske og enzymologiske proteinundersøgelser. H

Disse resultater tillader den konklusion, at der ikke H

findes nogen relation mellem parametre, der bestemmer H

5 affiniteten for definerede substrater og kinetikket af I

den proteolytiske reaktion, og vaskeevnen (se tabel li H

eksempel 1).

Derfor er det selvfølgelig også muligt at kom-

hinere to eller flere mutanter med forskellige egen- H

10 skaber i ét enzymprodukt eller ved den samme vaskepro- H

ces. En sådan kombination kan give en synergistisk I

virkning eller ej . I

Opfindelsen omfatter også anvendelsen af et el- H

ler flere proteolytiske mutantenzymer som defineret i H

15 det foregående i vaskemidler eller under vaskeproces- H

ser.

Endelig er det klart, at nummereringen af amino- H

syrerne kan ændres ved deletioner eller indføjelser af H

aminosyrer i proteasepolypeptidkæden, hvadenten de er H

20 skabt kunstigt eller ved mutagenese eller forekommer I

naturligt i proteaser, der er homologe med PB92 pro- H

tease. Det må imidlertid forstås, at positioner, der er H

homologe med aminosyrepositionerne af PB92 protease vil H

falder under kravenes rammer. H

25 De følgende eksempler gives til nærmere belys- H

ning og ikke til begrænsning af opfindelsen. I

DK 175855 B1 21

Forsøgsafsnit

Materialer og fremgangsmåder 5 Konstruktion af PB92 proteasemutanter j, Den grundliggende konstruktion ud fra hvilken , mutagenearbejdet startede betegnes pM58 og er beskrevet j i detaljer i EP-A-0283075.

I 10 Den fulgte strategi omfattede tre faser: a. Konstruktion af mutagenesevektor M13M1 b. Mutering c. Konstruktion af pM586Eco og subkloning af det muterede DNA-fragment ind i denne vektor.

15 l.a. Konstruktion af mutagenesevektor M13M1.

Den grundliggende konstruktion, pM58, digeste-redes med restriktionsenzymerne Hpal og Ball. Det 1400 20 bp fragment indeholdende PB92 proteasegenet oprensedes på lavtsmeltede agarose (Manlatis, Molecular Cloning, A Laboratoroty Manual, Cold Spring Harbor, 1982).

vektoren M13MP11 (Messing et al., Nucl. Acid.

Res. 9, (1981) 303-321) digesteredes med Smal. Det re-25 levante 1400 bp DNA-fragment ligeredes ind i denne vektor og transficeredes til E. coll JM101 efter fremgangsmåden beskrevet af Cohen et al., Prop. Natl. Acad.

SCi. USA 69, (1972) 2110-2114.

Efter fagpropagation i E. coll JM101, isoleredes 30 ssDNA (Heidecker et al., Gene 10, (1980) 69-73), inser-tet og dets orientering undersøgtes ved DNA-sekvensering under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 6463.

I DK 175855 B1 I

I 22 I

Vektoren, der er egnet til mutagenese, opnåedes I

og betegnedes M13M1. Fremgangsmåden beskrevet ovenfor

I er afbildet skematisk i figur ΙΑ. I

I 5 i.b. Muterinq. I

I Mutagenese udførtes på M13M1 under anvendelse af I

ssDNAet af denne vektor og dsDNA af M13mpl9 (Messing et I

I al. Nucleic Acids Res. 9, (1988) 303-321), idet den I

10 sidstnævnte vektor digesteredes med restriktionsenzy- I

merne EcoRI og Hinlll, hvorefter det store fragment op- I

I rensedes på et lavtsmeltende agarose. I

Mutagenese udførtes som beskrevet af Kramer et I

I al., Nucleic Acids Res. 12, (1984) 9441-9456 med den I

I 15 modifikation, at E. coll JM105 anvendtes i stedet for I

I 5· coli WK-30-3 til selektion for mutanterne. I

Længden af de oligonucleotider, der anvendtes I

til dannelse af de specifikke mutationer, var 22 I

I nucleotider. Regionspecifik mutation anvendt til dan- I

20 nelse af adskillige mutationer ad gangen i en specifik I

I DNA-sekvens udførtes under anvendelse af et ollgonu- I

I cleotidpræparat med en længde på 40 nucleotider med al- I

I le fire nucleotider inkorporeret tilfældigt i stederne I

I svarende til aminosyren eller aminosyrerne, der skulle I

I 25 muteres. I

I Efter mutagenesen undersøgtes potentielle mutan- I

I ter for den relevante mutation ved sekvensanalyse under I

I anvendelse af dideoxymetoden ifølge Sanger, se ovenfor. I

I Hele det enkeltstrengede stykke (se figur IB) sekvense- I

I 30 redes til kontrol af fraværelsen af sekundære mutatio- I

I ner. Fremgangsmåden er vist skematisk i figur IB. I

I Den beskrevne fremgangsmåde er nyttig til dan- I

I nelse af DNA-fragmenter med mutationer i 3' delen af I

I proteasegenet (aminosyrerne 154-269). I

23 DK 175855 B1

Det er klart for fagfolk, at alternative restriktionsenzymer kan anvendes til dannelse af DNA-fragmenter med mutationer i 5'-delen af proteasegenet i en Bacillus vektor, og at modificerede PB92 proteasege-5 ner kan konstrueres ved en fremgangsmåde analog til fremgangsmåden vist i figur 1A.

l.c. Konstruktion af pM58SEco og subkloninq af DNA- fraqmenter indeholdende mutationerne 1 denne vek-10 tor.

Til konstruktion af pM586Eco digesteredes pM58 med restriktionsenzymet EcoRI og ligeredes med T4 ligase under fortyndede betingelser. Ligationsblandingen 15 anvendtes til transformation af B. subtilis 1-A40 (Bacillus Cenetic stock Centre, Ohio) efter fremgangsmåden ifølge Spizizen et al., J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746.

Celler fra transformationsblandingen udpladedes 20 på minimalplader indeholdende 20 pg/ml neomycin, som beskrevet i eksempel 1 af EP-A-0283075.

Plasmid DNA af transformanterne isoleredes efter fremgangsmåden beskrevet af Birnboim og Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523, og karakteriseredes ved 25 restriktionsenzymanalyse. På denne måde isoleredes pM585Eco (se figur lc).

Til fremstilling af mutantenzym subklonedes DNA-fragmenterne af M13M1 indeholdende den ønskede mutation, opnået som beskrevet i afsnit l.b. ind i 30 pM486Eco. dsDNA af M13M1 (beskrevet ovenfor) digesteredes med EcoRI og ligeredes ind i EcoRI-stedet af pM586Eco. Ligationsblandingen anvendtes til transformation af B. subtilis DBl04, Doi, J. Bacteriol. (1984)

I DK 175855 B1 I

I I

160, 442-444, under anvendelse af fremgangsmåden ifølge I

Spizizen at al., se ovenfor. I

I Celler fra transformationsblandingen udpladedes I

I på minimalplader indeholdende 20 yg/ml neomycin og o,4% I

I 5 casein (EP-A-0283075). DNA af proteasedannende trans- I

I formanter isoleredes efter fremgangsmåden beskrevet af I

I Birnboim og Doly, (se ovenfor) og karakteriseredes ved I

I restriktionsenzymanalyse. I

10 2. Fremstilling af mutantproteaser. I

I Transformanter af DB104, som man havde bestemt I

I indeholdt vektoren med det muterede proteasegen, inoku- I

I leredes i 10 ml Trypton Soya Broth (TSB) indeholdende I

H

15 20 yg/ml neomycin og inkuberedes i 24 timer ved 37 C,

Prøver af-kulturen (0,1 ml) inokuleredes i 500 ml ry- I

I steflasker indeholdende 100 ml proteaseproduktionsmedi- I

I um: 12,5 g/1 gærekstrakt (Difco), 0,97 g/1 CaCl2x6H20, I

I 2,25 g/1 MgCl2X6H20, 20 mg/1 MnS04x4H20, 1 mg/1 I

I 20 CoCl2x6H20, 0,5 g/1 citrat, 0,5 ml/1 antifoam 5693, 6% I

I w/v maltose, 0,2 M phosphatpuffer pH 6,8 og 20 yg/ml I

I neomycin. I

I Efter inkubation i 65 timer under konstant be- I

luftning testedes proteaseaktiviteten af kulturerne un- I

25 cler anvendelse af dimethylcasein som substrat og under I

I anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Lin et al., I

I J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. Til fremstilling af I

I større repræsentative mængder af wild-type PB92 og mu- I

I tant PB92 proteaser dyrkedes disse stammer også ved I

I I

30 37 C i beluftede fermentorer med et volumen på 10 1 og

I linder anvendelse af i det væsentlige samme produktions- I

I medium som anvendt i rysteflaskerne. I

I De opnåede, flydende medier anvendtes til pro- I

I teaseoprensning. I

25 DK 175855 B1 3. Oprensning og koncentrering af vildtype PB92 protease og mutanter deraf.

Mutant- og vildtype PB92 proteaserne fremstillet 5 med Bacillus subtills DB104 i rysteflasker eller 10 1 fermentorer oprensedes ved kationbytterchromatografi under anvendelse af Zeta-PrepR plader eller moduler (PS-type, LKB). Flydende fermenteringsmedier centrifugeredes (3000 x g, 10 min), og supernatanten fortynde-10 des 10 gange med 10 mM natriumphosphatpuffer, pH 5,5, og overførtes dernæst til kationbytteren. Bfter vask med adskillige modulvolumener og phosphatpuffere elue-redes proteasen ved tilsætning af 0,4 M NaCl til phos-phatpufferen. Portioner indeholdende proteaseaktivitet 15 forenedes og koncentreredes ved ultrafiltrering under anvendelse· af en omrørt Amicon-celle, udstyret med et PM-10-filter. NaCl-koncentrationen reduceredes til ca.

50 mM ved fortynding og koncentrering af proteaseopløs-ningen med phosphatpuffer, hvorefter den opbevaredes 20 ved -80 C ved en proteinkoncentration på mellem l og 10 mg/ml.

Til opsamling af PB92-proteasemutanter fra det flydende medium fra storskalafermenteringsmedier tilsattes alternativt CaCl2 (1 vægt%) og acetone (30 25 vægt%). Efter filtrering til fjernelse af alt cellemasse, fældedes proteasen fra det opnåede filtrat ved tilsætning af 0,2-2 vægt% CaS04x2H20 og ved yderligere tilsætning af acetone til en slutkoncentration på >60 vægt%. Bundfaldet skiltes fra ved filtrering og blev 30 skyllet med acetone, hvorefter det tørredes til opnåelse af et råenzympulver (CEP).

DK 175855 B1 I

4. Analysemetoder til undersøgelse af renheden af op- I

rensede proteaser. I

Proteaser betragtedes som rene, når ét bånd el- I

5 ler én top fandtes ved henholdsvis elektroforese og H

højtydelsesgelelektroforese (HPLC). I

Polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) udførtes i I

tilstedeværelse af natriumdodecylsulfat (SDS) efter H

fremgangsmåden Ifølge Laemmli, Nature, 227 (1970) I

10 680-685. Denaturering af proteinprøverne ved SDS ved H

H

100 C må Imidlertid ske på forhånd ved Inaktivering af

proteaseaktlvlteten til hindring af selvnedbrydning. I

Dette kan udføres ved emulsion med phenylmethylsulfo- I

nylfluorid (PMSF) (1 mM, 30 min, stuetemperatur) eller I

15 ved fældning med trichloreddikesyre (TCA, 8%, 30 min. I

på is). Naturlige PAGE udførtes ved pH 7,45 (gelpuffer I

bestående af 20 mM histidin (His) og 50 mM 3-[N-morpho- I

lino]propansulfonsyre (MOPS) i 5% polyacrylamidgeler I

(forholdet mellem acrylamid og bisacrylamid 20:1). Pro- I

20 teinprøver anbragtes på toppen af gelskiver og underka- I

stedes elektroforese mod katoden. Den samme His/MOPS- I

puffer anvendtes som elektroforese (tank) puffer, men I

ved pH 6,3. Efter elektroforese (ltø-2 timer ved 350 V), I

udblødtes gelen i 8% eddikesyre til fiksering af pro- I

25 teinerne i gelen, hvorefter den farvedes med Coomassie I

Brilliant blå R250 og affarvedes efter standardmetoder. H

Renhedsundersøgelsen ved HPLC udførtes under an- H

vendelse af en kationbytterkolonne (MonoS-Pharmacia Fi- I

ne Chemicals) og en gelfiltreringskolonne (TSK 2000 I

30 sw-LKB). Den førstnævnte kørtes med 10 mM natriumphosp- I

hatpuffer, pH 5,5, og eluering af den bundne protease I

opnåedes ved hjælp af en lineær gradient fra 10-300 mM I

af natriumphosphat, pH 5,5. Gelfiltreringskolonnen kør- I

27 DK 175855 B1 tes i 0,25M natriumacetat, pH 5,5.

5. Bestemmelse af proteasekoncentratlonen.

5 TU bedømmelsen af proteinkoncentrationen i en renset proteaseopløsning anvendtes i) ekstinktionsmålinger ved 280 nm under anvendelse af den beregnede ekstinktionskoefficient (εΜ), og *0 ii) titrering af aktivt sted.

Ekstinktionskoefficienten ved 280 nm beregnedes ud fra antallet af tryptofanenheder (εΜ = 5.600 M_1xcm"1) og tyrosinenheder (εΜ = 1.330 M-1xcm_1) pr.

15 enzymmolekyle. For PB92 protease anvendtes εΜ 26.100 M”1xcm"1 (3 Trp-, 7 Tyr-rester) svarende til E ved 280 nm = 9,7 (Mr = 26.729 Da). For mutanter med ændrede antal Trp- og Tyr-rester udførtes tilsvarende korrektioner.

20 En bestemmelse af antallet af aktive enzymmole kyler opnåedes ved titrering af aktivt sted, idet den vidt udbredt anvendte fremgangsmåde med N-transcinna-moylimidazol (M.L. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, (1966) 5890-5931) viste sig ikke at virke tilfredsstil- 25 lende for PB92 protease udvikledes en fremgangsmåde under anvendelse af PMSF i stedet, ved denne blandedes en proteaseopløsning med en beregnet koncentration (ud fra absorptionen ved 280 nm) med henholdsvis 0,25, 0,50, 0,75, 1,00 og 1,25 ækvivalenter af PMSF, og man lod 30 blandingen reagere i en time ved stuetemperatur i 10 mM natriumphosphat, pH 6,5. Enzymkoncentrationen skal være mindst 50 yM.

Restaktiviteten måltes spektrofotometrisk under anvendelse af succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-propyl-L-

I DK 175855 B1 I

I I

I phenyl-alanyl-paranitroanilid (SAAPFpNA) som substrat I

I (se nedenfor). Renheden (og således koncentrationen) af I

I PMSF bestemtes ved NMR-spektroskopi, og stamoplysninger I

fremstilledes 1 isopropanol. Resultatet af titreringen I

5 af det aktive sted viste sig at stemme overens med re- I

I sultaterne af renhedsundersøgelsen ved HPLC. I

I 6. Bestemmelse af kinetiske parametre af vild-type- og I

I mutant-proteaser. I

I 10 I

I l. Aktivitet på proteinsubstrater (casein) mål- I

tes ved pH 10,0 som beskrevet 1 GB patentskrift nr. I

I 1.353.317 (udtrykt i ADU-enheder = Alkaline Delft I

I Units). I

I 15 2. Turnover number med casein som substrat mål- I

tes i en' pH-stat. Reaktionskammeret af pH-staten I

I (Radiometer, København) indeholdt 10 ml 0,1M KC1 med 50 I

I mg casein (Hammerstein, Merck). Protoner, frigivet ved I

I hydrolyse af casein med PB92 protease titreredes med 10 I

I 20 ιπμ NaOH, mens pH-værdien holdtes på 10,0 (ved 40"c og I

I under en nitrogengasstrøm). I

3. Aktivitet på syntetiske peptider måltes under I

I anvendelse af sAAPFpNA. Det dannede (gule) paranitroa- I

I nilid (pNA) analyseredes spektrofotometrisk ved 410 nm: I

I 25 eM e M“1xcm“1, (E.G. Delmar et al.. Anal. I

I Biochem. 94 (1979) 316-320) med et UVIKON 860 (KONTRON) I

I spektrofotometer udstyret med en thermostateret seks- I

I positions celleomskifter. De kinetiske parametre, kcat I

I og Km, opnåedes ud fra målinger af starthastigheden for I

30 forskellige substratkoncentrationer (for PB92 protease I

I fra 0,1-6,0 mM) tilpasning af dataene til en hyperbolsk I

I funktion under anvendelse af ikke-lineær regression med I

I multivariant-sekant-iterationsmetoden. Specificitets- I

29 DK 175855 B1 konstanten kCat^Km beregnedes. Målingerne udførtes ved 25 °C i et slutvolumen på 1 ml indeholdende 0,1M TRIS-HC1 + 0,1M NaCl, pH 8,6. Natriumchloridet var nødvendigt, idet PB92 protease i fraværelse deraf gav ikke-5 lineære Lineleder-Burk-afbildninger, hvilket kunne skyldes substratinhibering. Substratet opløstes først i DMSO til en koncentration på 200 mM og fortyndedes dernæst med 0,1M tris-HCI, pH 8,6 til opnåelse af en stam-opløsning med 20 mM (bestemt spektrofotometrisk ved 315 10 nm; εΜ = 14.000 M~1xcm*'1). Der udførtes ingen korrektioner for de varierende koncentrationer af DMSO (0,05-3,0 vol%).

7. Oxidation af PB92 protease.

15 Følsomheden af PB92 proteaserne mod oxidation med H202 testedes efter fremgangsmåden beskrevet af Estell et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 6518-6521, med den afvigelse, at: 20 i) 20 mM H202 anvendtes i stedet for 10 mM, og il) 20 mM natriumperborat kombineret med 10 mM TAED anvendtes som ekstraoxidant.

8. Vaskeevnetest 25 PB92 proteasemutanter testedes ved en specielt udviklet vasketest med anvendelse af bomulds- og poly-ester/bomuldsprøver tilsmudset med mælk, blod og blæk (5,0 x 5,0 cm, opnået fra EMPA, St. Gallen, Schweiz og 30 betegnet med numerene 116 og 117).

Vasketestene udførtes i et Atlas Launderometer LEF-FC, udstyret med rustfri ståltestbeholdere, der hver indeholdt et defineret vaskemiddel og proteasen,

I DK 175855 B1 I

· 30 I

I der skulle testes (PB92 proteasemutanter eller PB92 I

I protease). Undtagen hvor andet er angivet, udførtes te- I

stene 1 30 minutter ved en ønsket temperatur. Efter I

vask lufttørres prøverne, og reflektansen af testklæ- I

I 5 derne måltes ved 680 nm med et Photovolt-fotometer I

I (model 577) udstyret med et grønt filter. Reflektans- I

I data opnået ved måling på testprøverne vasket med va- I

I skemidler indeholdende de respektive PB92 proteasemu- I

I tanter sammenlignedes med reflektansdata for en til- I

I 10 svarende serie af målinger med vaskemidler indeholdende I

I PB92 protease. Vaskeevneværdier for mutantproteaserne I

I beregnedes ved division af mængden af PB92 protease- I

I protein (mg) med den mængde mutantproteaseprotein (mg), I

I der er nødvendig til opnåelse af samme reflektans, x I

I 15 100%. I

I Eksempel 1 I

A. Vaskeevnen af forskellige PB92 proteasemu- I

20 tanter i europæiske vaskepulvere bestemtes efter frem- I

I gangsmåden beskrevet ovenfor. I

I I testbeholdere af rustfrit stål, der hver inde- I

I holdt en angivet mængde vaskepulver IEC opløst i 250 ml I

I

vand med en hårdhed på 15 GH, fyldtes to bomulds- og

I 25 to polyester/bomuldsprøver. Sammensætningen af vaske- I

I pulveret IEC var som følger: I

31 DK 175855 B1

Komponent væqt%

Lineær natriumalkylbenzen-sulfonat (middelkædelængde af alkankæde Cll,5) 6,4 5 Ethoxyleret talgalkohol (14 EO) 2,3

Natriumsæbe 2,8

Natriumtripolyphosphat (STPP) 35,0 Natriumsilicat 6,0

Magnesiumsilicat 1,5

Carboxymethylcellulose l,0

Natriumsulfat 16,8

Natriumperborat-tetrahydrat 18,5 TAED 1,5

Forskelligt + vand til 100

Til hver beholder sattes en udvalgt, renset PB92 proteasemutant i en koncentration på melem 0 og 1,74 mg (renset) protease pr. liter vaskevand. En be- ^ holder anvendtes til testning af PB92 protease på samme 0 made til sammenligning. Vasketestene udførtes ved 40 C. Resultaterne er vist i tabel 1.

i

32 I

DK 175855 B1 I

--p--

j= g I

+ \ g NOllAnOrlNrllCIB Ot I

djjj. O r> Η H CM CO H

Vi ιβ W H

+j u\ QJ X r- e — <0 (0 PU -V> ~

m o) S\. iftor-mr^ra^'O'^o to I

^ ^ OH r*> Η H CM O <*) ΙΠ

φ tQ ^ Η H

Ό *H

-μ

Vi C)

0J C

4-» -H

g « «0

jj cg OHnr-CMCMCMOlCNP* Η H

3 v H

g 3 HHHHHHHOHHH I

rH

tP

O---->- C V» Ό * Λί 0) rH (M Q) σ> ·Η 4-> O Ot 03 O H-l -Η Λ pQ R)

(U O -W o 04 S* loooh-tor^nioovoiAin I

ω QI 4J tw rH 0^ oio^nn^p'^-or-æw « Di Λ -η μ ri 1-4 >- 0) CO (0 -H +J Qi

P

H O

<U Vi -Ω Oi--- Ό ft N - σ> <m>

CQ w 4J

CV O

Ό J. T3 H

tuH’TFic'vooooiniflin n O dl c m tr o co ot η cm in r*>

Λ 01 0) > H H

v vi id o Q) r»

0) O Q) C M M

Λ u-ι +i o (0 « O X rfl Μ H Vi H >

W (¾ (U

C O Ό -H

0) C (N Ό

& > Ot H C

W 0) CQ g O

tu a ni ή h oooooHineoooeon

-¾ ^ \ ΟΟΟΟΗΙΠΝΗΟίΝΓ'Γ-Η H

® H Dl |J ni HH CM H CM H H

(d ·η 14 Vi > 4-1 > -Μ -0·

Φ Ό H

(0 0) IC N Cl

0) *H CM

Q) 4) fl H

03 O H CM

Id X S5 oi a o >

4-1 ICOCHUKOUQOCOM

o CMtøtOtOvOOOOCMOcMM'

Vi CPHHHHSOVOVOHtOHO

B OfMfMCMCMHHHCMHCMH

assssww coswaw 33 DK 175855 B1 η o « n h co o n.

CO V> W 01 CO HH

H

«COOOOI^W HO <J

vo vo σ\ o in «· o O

CO <M CO CO n N }Q

»te

ΟΓ^ΟΗΗΗΟ CO O S

te »s K K ^ K S K

OHn^incoro nn — H o te \o - - ...------ te

CO

^ 55 +j . **

tf dP

ΜθίθΡ*Ρ'\θηΗΝ<Λΐη^,<ΛΐηηΗ in g h •PoHHrOH^COlOlOH^flOHt^CO ON ir £ V-l Η H cH ·03

>2 £ ΐ B

---jj : H > > <u r, Ti ° J3 inoooininoooininot^ininoo y ti u tf cnr~r~®oioomoo»r^Hcor^oiH» P’S 53 H HHCOCOCO hhh u gå a 1¾ g vooincoHoinoooooonotnino ^01 (nr»<tfioioin\ooino cocoo\Hc*)cor«in S - r>

Η H Γ0 H CO CO Γ0 HHCO H > § · J

___fe s| 4

. Η H O I

Ό JJ 4J < H -H ω i

O c S M

Z > < JM fU H ÉO .C Hl

co co æ coco co cocoj <w p -M

co co ro roes ro ro ro Bi ,¾ 9 S

HHH HH H HH Η Ό«* H

t/1 V) 10 to to W W w M · TJ ffi te te te, te te te tete MQ/ ^ « ζ σ s o uKxwoia^ -h 3 r· r- c* c* co f~ r~ r- r^ r» m u _u m ro ro ro ro ro ro ro ro ro -ro ro ro SSe..

HHHHH HHHHHHH _p r; >p h

0< P< O* fe l/> fe PU fe fe fe fe fe H 4J B

te te te te te te te te te te te te «m (D (Q 03 ho waw>pp><coxzsoifc.o6. « {2 « ^ o>io«eiovoio«oioior^icu>ioiovovoioio c iH Si.

UJHHHHrororororoHrororororororo g J3 .μ g

HrorororoHHHHHroHHHHHHH £ O QJ -H

ESSSESWWWW&iEWWWWWWW I ^+J +j

Q a a p p > > > > S- H > > > > > > > I ro-5 S

ιοοορ>Γ^ιοιοιοιο\οσιιονονονοιοιονο ω on U tn lOVOlOHHHHHHCOVOHHHHHHH nj S) ΐ Q)

HHHHHHHHHHHHHHHHHH ^ M s H

<WWSSUOOOWXOOOUOOU

ft * +

DK 175855 B1 I

B. vaskeevnetesten gentoges ved 25 C med samme vaske- H

middel indeholdende nogle af PB92 proteasemutanterne. I

PB92 protease anvendtes igen som reference. De øvrige

testbetingelser var de samme som beskrevet ovenfor. H

5 Resultaterne er vist i tabel 2. H

Tabel 2 I

^B

Vaskeevne af PB92 proteasemutanter ved 25 C i STPP-hol-

10 digt vaskepulver i forhold til vaskeevnen af PB92 pro- H

tease (%).

Protease Vaskeevne (%) H

Vaskemiddelkoncentration i vaskevandet H

15 _;_4 q/1_7 q/1_ B

M216S 90 80 B

M216Q 95 80 B

N212D 250 135 B

S160D_185_120_ B

B

C. Vaskeevnen af proteaserne bestemtes også i et B

europæisk vaskepulver, der indeholdt phosphatblege- B

middel i et Launderometer ved 25°C og 40°C. PB92 pro- B

tease anvendtes igen som reference. De øvrige testbe- B

25 tingelser var de samme som beskrevet ovenfor. Resul- B

taterne er vist i tabel 3. B

DK 175855 B1 35

Tabel 3

P O

Vaskeevne af PB92 proteasemutanter ved 25 C og 40 C i et europæisk vaskepulver, der Ikke Indeholder phosphat-5 blegemiddel, 1 forhold til vaskeevnen af PB92 protease (%)._

Protease Vaskeevne (%)

Vaskemiddelkoncentration i vaskevandet 4 g/1 7 g/1 4 g/1 7 g/1

0 O

10 _temperatur 25 C_temperatur 40 C

M216S 80 85 100 90 M216Q 80 80 120 100 N212D 170 105 200 75 S160D_Γ70_105_230_165 15

Eksempel 2 PB92 proteasemutanten M216S testedes med hensyn til stabilitet under opbevaring i det pulverformige va-20 skemiddel IEC beskrevet i eksempel 1. Stabiliteten ved opbevaring undersøgtes i klimaborde ved 30°C og 80% relativ fugtighed (RH). Proteasen til dette forsøg ind-kapsledes som følger:

Der fremstilledes en blanding indeholdende (i 25 vægt/vægt%): 2% renset protease, 50% ikke-ionisk overfladeaktivt middel (ethoxyleret C14-C18-alkohol ved 50-80 E.0.-enheder), 5% Ti02, 3-10% CaS04.2H20 og

Na2S04 til 100%. Blandingen opvarmedes til 65-90 C og afkøledes til stuetemperatur. Den opnåede faste blan-30 ding formaledes til partikler. Partikler med en diameter på 0,5 til 1 mm sigtedes fra og anvendtes til opbevaringstestene i vaskemidler.

3,5 g af vaskepulveret IEC indeholdende mutant M216S i en koncentration på 6140 ADU/g vaskemiddel op-

DK 175855 B1 I

bevaredes i 18 ml's hætteglas. Til sammenligning opbe- I

varedes PB92 protease under samme betingelser. Efter 2,

4, 5 og 6 uger måltes proteasernes restaktivitet. Re- I

sultaterne er vist i tabel 4. . I

Tabel 4

Restaktivitet af PB92 protease og dens mutant M216S, I

efter opbevaring (i uger) ved 30 C og 80% RH i vaske-

10 pulver__ I

Protease Restaktivitet {%) I

_0 uger 2 uger 4 uger 5 uger 6 uger I

PB92 protease 100 25 5 3 2 I

M216S_100 68_31_20_11 I

Eksempel 3 I

PB92 protease og forskellige PB92 proteasemu- I

tanter testede med hensyn til opbevaringsstabilitet i I

20 et vaskepulver, ved testen for stabilitet under opbe-

varing anvendtes proteaserne 1 en indkapslet form. H

Proteaseprodukterne fremstilledes ved blanding H

af de følgende komponenter ved 80 C.

37 DK 175855 B1

Komponent Væqt% AE1 50

Ti02 2 protease (CEP) 7 5 PVPa 1,5 BHT* 1

Na2S04 resten 1 AE = C14-C18 alkoholpolyethoxylat. Alkoholen var ethoxyleret med 50-80 ethylenoxid (EO)-gruppér.

* PVP = polyvinylpyrrolidon K17 * BHT = 2,6-bis(t-butyl)-4-methylphenol.

Denne blanding indkapsledes ved prilling, Idet 15 væsentlige som beskrevet i britisk patentskrift nr.

1.603.640. Partikelfraktionen med en partikelstørrelse på mellem 0,3 og 0,8 mm anvendtes til bestemmelse af opbevaringsstabilitet af proteaserne. Den indkapslede protease (140 mg) blandedes med ALLR-base (6,4 g) og 20 natriumperborat-tetrahydrat (0,6 g). [ALL er et registreret varemærket fra Unilever N.V.]. Det anvendte ALL-basepulver indeholdt ikke enzymer eller blegemidler.

Enzym/vaskemiddel/natriumperborat-tetrahydrat-25 blandingen inkuberedes ved 30°C og 80% relativ fugtighed (RH). I tabel 5 gives restaktiviteten efter opbevaring i det angivne tidsrum.

i

I DK 175855 B1 I

I

I Tabel 5 I

H Restaktivitet af PB92 protease og nogle mutanter deraf I

I efter opbevaring (i uger) ved 30"c og 80% RH 1 et ble- I

I 5 gemlddelholdlqt vaskepulver_ I

I Protease Restaktivitet (%) I

I _0 uger 1 uge 3 uger 5 uger I

PB92 protease 100 51 25 15 I

I M216Q 100 94 84 52 I

I 10 M216S 100 89 83 50 I

I S160D 100 47 20 9 I

I N212D_100 59_31_19 I

I Eksempel 4 I

I 15 · I

I PB92 protease og forskellige PB92 proteasemu- I

I tanter indkapsledes efter fremgangsmåden beskrevet i I

eksempel 3. I nærværende eksempel blandedes 70 mg ind- I

I kapslet protease med en partikelstørrelse på mellem I

I 20 0,3 og 0,9 mm imidlertid med 3,2 g af ALL og 0,3 g na- I

I triumperborat-tetrahydrat. Prøverne opbevaredes ved I

lo I

30 C i 18 ml hætteglas i en vakuumeksikator. vakuum

I påførtes (25 mm Hg) i de første 3 dage af opbevarings- I

I perioden. I

I 25 Ved påføring af vakuum øgedes transporthastig- I

I heden for vanddamp, således at systemet nåede dets I

I ligevægt ved 80% RH hurtigere end systemet gør uden I

I påføring af vakuum. Den relative fugtighed på 80% I

I etableredes med en mættet kaliumbromidopløsning. I

I 30 i tabel 6 gives restaktiviteterne efter den an- I

I givne opbevaringsperiode (i uger). I

DK 175855 B1 39

Tabel 6

Restaktivitet af PB92 protease og nogle mutanter deraf efter opbevaring ved 30*C og 80% RH i et blegemiddel- 5 holdlqt vaskemiddel_

Protease Reataktivltet (%) _0 uger 1 uge 2 uger 3 uger PB92 protease 100 27 22 14 M216Q 100 63 53 44 10 M216S 100 55 49 31 S160D_100_23_18_13

Eksempel 5 15 Det. følgende flydende vaskemiddel fremstilledes:

Komponent Væqt% lineær C1Q-C13-alkylbenzen-sulfonsyre 12 C13-alkohol-polyethoxylat, 8 EO 13 20 laurinsyre 8 oliesyre 4 triethanolamin 6 1,2-propandiol 6 ethanol 5 25 natriumcitrat 4 diethylentriamin-pentaeddikesyre 0,3 calciumformiat 0,12 natriumformiat 1 borax 1,9 30 NaOH, 25% vægt/vægt% opløsning til pH 11,2 vand resten PB92 protease og forskellige PB92 proteasemu-tanter sattes til denne blanding i en mængde til op-

DK 175855 B1 I

nåelse af en startproteasekoncentration på 0,13 vægt/ H

vægt%.

Proteasestabiliteten (1 % restaktivitet) be- H

stemtes efter opbevaring af den proteaseholdige bian- H

5 ding ved 37°C i det angivne antal dage. Resultaterne er I

vist 1 tabel 7. I

Tabel 7 I

10 Restaktivitet af PB92 protease og nogle mutanter deraf H

efter opbevaring ved 37*C 1 et flydende vaskemiddel

Protease Restaktivitet (%) H

_0 dage 1 dag li dage 15 dage 21 dage H

PB92 protease 100 23 10 5 3 H

15 S160D 100 57 30 14 8 H

M216Q 100 59 32 18 9 B

M216S 100 45 18 10 5 H

N212D_100 38_14_9_4 I

20 Eksempel 6 H

PB92 protease og nogle mutanter deraf formule- H

redes som følger. Med hver protease fremstilledes en H

blanding af følgende komponenter: ! H

DK 175855 B1 41

Komponent væqt%

Amylogum CLS 45

Sucrose 23 5 Sorbitol 17

Glycerol 4 paraffinolie 3

NaH2P04 0,5

Protease (CEP) 5,0 10 PVP K17 1,5

Ti02 1

Ud fra disse blandinger fremstilledes granulater, i det væsentlige efter fremgangsmåden beskrevet i 15 eksempel 5 og US patentskrift nr. 4.242.219, bortset fra at: 1). blandingen beskrevet i dette eksempel udskiftes med den ovennævnte blanding; 2) der blev anvendt åbninger med en diameter på 0,7 mm 1 stedet 1,0 mm; 3) granulerne var ikke overtrukne.

20 Disse granuler (140 mg) blandedes med ALL-base (6,4 g) og natriumperborat-tetrahydrat (0,6 g) og anbragtes i 36 ml's hætteglas.

Proteasestabiliteten (i % restaktivitet) bestemtes dernæst efter opbevaring af hætteglassene ved 25 30°C og 80% RH i de angivne antal i uger. Resultaterne er vist i tabel 8.

I DK 175855 B1 I

I 42 I

I Tabel 8 I

I Restaktivitet af granulater af PB92 og nogle mutanter I

I deraf efter opbevaring ved 30*C og 80% RH 1 et blege- I

I middelholdlqt vaskemiddel____ I

I Protease Restaktivitet (%) I

I _0 uger 1 uge 3 uger 5 uger I

I PB92 protease 100 45 29 17 I

I M216Q 100 93 66 45 I

I 10 M216S_100_90_70_41 I

Eksempel 7 I

Prillede produkter af PB92 protease og nogle mu- I

I 15 tanter deraf fremstilledes og blandedes med vaskesmid- I

I del og blegemiddel som beskrevet i eksempel 3. I

I Opbevaringsstabiliteten af disse prøver (i % I

I restaktivitet) bestemtes ved 30*C og 60/80% RH (skif- I

I tevis 60% RH i 12 timer og 80% RH i 12 timer). Disse I

I 20 resultater er vist i tabel 9. I

DK 175855 B1 43

Tabel 9

Restaktivitet af prlllede produkter af PB92 protease og nogle mutanter deraf efter opbevaring ved 30 C og 5 60/80% RH_

Protease Restaktivitet (%) _0 uger 1 uge 3 uger 5 uger PB92 protease 100 70 34 15 M216Q 100 98 88 67 10 M216S 100 93 87 48 SI6OO 100 67 35 10 N212D_100_75_53_26

Eksempel 8 15

Granulater indeholdende PB92 protease og nogle mutanter deraf fremstilledes og blandedes med vaskemiddel og blegemiddel som beskrevet i eksempel 6.

Opbevaringsstabiliteten af disse prever (i % 20 restaktivitet) bestemtes efter inkubation i de angivne tidsrum ved 30 C og en RH, der holdtes skiftevis på 60% i 12 timer og på 80% i 12 timer. Resultaterne er vist i tabel 10.

DK 175855 B1 I

H 44 I

Tabel 10 I

Restaktivitet af granulater af PB92 og nogle mutanter I

Η I

deraf efter opbevaring ved 30 C og 60/80% RH_

H 5 Protease Restaktivitet (%) I

I _0 uger 1 uge 3 uger 5 uger I

I PB92 protease 100 54 39 28 I

M216Q 100 93 81 67 I

M216S_100_99_87_72 I

I 10 I

Eksempel 9 I

I PB92 protease og nogle mutanter deraf testede I

med hensyn til opbevaringsstabilitet i et blegemiddel- I

I 15 holdigt vaskepulver ved 30°C og 80% RH. Til dette for- I

I søg anvendtes proteaserne i en indkapslet form. Hver I

I protease indkapsledes som følger: I

I Ved 80°C fremstilledes en blanding med den føl-

I gende sammensætning: I

I 20 I

I Komponent væqt% I

I Ikke-ionlsk overfladeaktivt middel1 45 I

I Ti02 2 I

I Protease (CEP) 10 I

I 23 Na2S04 rest I

I 1 Ikke-ionisk overfladeaktivt middel = C^4-C^ø alkohol- I

I polyethoxylat (50-80 EO grupper) I

Man lod den ovennævnte blanding afkøle til I

I 30 stuetemperatur. Den størknede blanding formaledes til I

I mindre partikler. Partikler på 0/3 til 0,8 mm sigtedes I

I ud og anvendtes til opbevaringsforsøget. I

I Til opbevaringsforsøget blandedes 140 mg af hver H

I Indkapslet protease ed 6,4 g ALL-base-vaskepulver og H

DK 175855 B1 45 1 0,6 g natriumperborat-tetrahydrat. ALL-base-pulveret indeholdt hverken enzym eller natriumperborat. ALL-ba-se/protease/natriumperborat/tetrahydratblandingerne inkuberedes ved 30°C og 80% RH.

5 Efter opbevaring i 0, 1, 2 og 4 uger bestemtes proteasestabiliteten som procentvis restaktivitet for hver protease. Resultaterne er vist i tabel 11.

Tabel 11 10

Restaktivitet af PB92 protease og nogle mutanter deraf efter opbevaring ved 30°C og 80% RH i et blegemiddel- holdiqt vaskepulver_

Protease Restaktivitet (%) 15 _._0 uger 1 uge 2 uger 4 uger PB92 protease 100 61 36 12 [S160D, M216Q] 100 78 58 35 rS160D, M216S1 100_86_68_39 20 Eksempel 10 PB92 proteasemutanter testedes ved en vasketest under i det væsentlige de samme betingelser som beskrevet i eksempel 1, bortset fra at 0,375 g flydende va-^ skepulver med den følgende sammensætning sattes til 250 ml vand med 5°GH i Launderometerbeholderen.

DK 175855 B1 I

46 I

Komponent vagt% I

Laurinsyre 8 I

Oliesyre 4 I

Lineær C1Q-C13~alkylbenzen- I

5 sulfonsyre 12

C13-alkoholpolyethoxylat, 8 EO 13 I

Triethanolamin 6 I

1,2-propandiol 6 I

Ethanol 5 I

10 Natriumhydroxid, 45% vægt/vægt% 4 I

Natriumcitrat ' 4 I

Vand til 100 I

(pH i vaskevandet 7,2)

15 Vaskeevnen af de forskellige proteaser i dette I

flydende vaskemiddel bestemtes i en Launderometer ved I

25*C i 30 minutter. Efter vask måltes reflektansen

af testklæderne som beskrevet i eksempel 1. Vaskeevnen I

af mutantproteaserne bestemtes som beskrevet i eksempel I

20 i. Resultaterne er vist i tabel 12. I

---- — - -η DK 175855 B1 47

Tabel 12

Vaskeevne af PB92 proteasemutanter ved 25°C i et fly- dende vaskemiddel_ 5 Protease Vaskeevne Specifik aktivitet i forhold til PB92 _protease (%)_ 212D + 100 160D + 73 10 S160G, N212D + 76 M216S 0 40 M216Q_0_37_ 0: 100% ± 20% vaskeevne i forhold til PB92 protease 15 (bevaret vaskeevne).

+: >120% vaskeevne i forhold til PB92 protease.

<80% vaskeevne i forhold tli PB92 prptease.

Vaskeevnen af de forskellige proteaser bestemtes 20 i de kommercielt tilgængelige, flydende vaskemidler,

TideR, WiskR og ArielR. De rustfri stålbeholdere inde- 0 holdt enten 0,375 g Tide i 250 ml vand med 5 GH, 0,375 g Wisk i 250 ml vand med 5°GH eller 1,25 g Ariel i 250 0 0 ml vand med 15 GH. Vaskeevnen bestemtes ved 25 C eller 25 40*C. De øvrige betingelser var de samme som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne er vist i tabel 13.

DK 175855 Bl| I

Tabel 13 j I

Vaskeevne af PB92 proteasemutanter i Tide, Wisk og H

Ariel ved 25 *C og 40°C_ I

5 ______ I

Protease Tide Wisk Ariel Η

25 'C 40*C 25*C 40*C 40*C I

N212D + + +· + 0 I

10 S160D + + + + +

M216Q 0 + 0 + + I

M216S ND 0 0 0 0 I

S160Q ....

S160N - - - . 0 15 S160K .... _

S160A .... I

S160D, M216Q + + + + + H

S160D, H216S 0 - + + 0 I

M117L, M216Q ND - ND - 0 I

20 M117L, M216S ND - ND - I

ND s ikke bestemt H

0: 100% ± 20% vaskeevne i forhold til PB92 protease. I

25 +: >120% vaskeevne 1 forhold til PB92 protease. I

<80% vaskeevne i forhold tli PB92 prptease. H

Eksempel 11 H

30 Vaskeevnen af PB92 proteasemutanter bestemtes H

ved en statistisk fuldskalavaskemaskinetest ved TNO, H

Delft, Holland (Cleaning Techniques Research Insti-

tute). Vaskeevnen af disse mutanter sammenlignedes med H

vaskeevnen af PB92 protease. H

---- DK 175855 B1 ' i t i

Alle proteaserne doseredes 1 IEC-vaskemiddel på | basis af proteinvægt (0,007 vægt/vægt%). På basis af { aktivitet gav disse doser: PB92 protease 1460 ADU/g vaskemiddel 5 M216S 679 ADU/g vaskemiddel M216Q 479 ADU/g vaskemiddel S160D 1080 ADU/g vaskemiddel N212D 1455 ADU/g vaskemiddel

For hver vaskemiddel-proteaseblanding udførtes 8 10 tests ved 40*C i identiske AEG Turnamat twinup-vaske-maskiner. I hver vaskemaskine anvendtes 170 g vaskemiddel. Under testene anvendtes de undersøgte vaskemidler på en sådan måde, at hvert pulver undergik samme antal vaskecyklusser i hver maskine.

15 Under testene anvendtes normalt ledningsvand som det fås i byen Delft med følgende middelspecifikationer: alkalinitet (M): 2,2 mmol/1 hårdhed (H) : 1,6 mmol/1 (9°GH)

2° temperatur : 20*C

Fjernelse af smuds og farvestof fra testtøjet

Under hvert testforløb vaskedes 6 prøver af tre 25 typer af EMPA-smuds på bomuld (nr. 111, 116 og 117) sammen med det tilsmudsede vasketøj. Fjernelsen af smuds og farvestof fra det kunstigt tilsmudsede testklæde bestemtes ved at sende tristimulus blåt lys vinkelret på testklædet. Mængden af lys, der tilbagesend-30 tes fra testtøjet i en mængde på 45 måltes, i overensstemmelse med I EC publikation 456 sattes reemissions-værdien for magnesiumoxid til 100. Des højere reemis-sionsværdi jo bedre vaskeproces for en bestemt slags

DK 175855 B1 I

smuds. I

Belastning af vaskemaskinen I

5 Vaskemaskinerne fyldtes til en belastning på

4,75 kg bestående af testklæder og vasketøj, der var I

blevet snavset ved normal brug.

vasketøjet bestod af: I

6 viskestykker I

4 stykker undertøj I

4 lagner I

4 pudebetræk. I

Om nødvendigt suppleredes med rene lagner og I

pudebetræk til opnåelse af den krævede belastning. I

15 Vasketøjet udvalgtes omhyggeligt til hver vaske-

proces. Hvert stykke tøj, der udvalgtes til en af ma- I

skinerne havde en ligeså snavset modpart, der vaskedes I

i en af de andre vaskemaskiner. På denne måde var I

smudsbelastningen den samme under hver proces. I

20 I

Parametre ved vaskeprocessen I

Program_40 C_

25 vandmængde under hovedvask 19 1 I

Tid til opnåelse af den højeste temperatur 13 min I

Den højeste temperatur 43 C I

Vasketid 45 min I

Vandindtag 71 I

30 Temperatur efter fortynding af vaskevand 30 C I

Afløb 17 1 I

5 Skylninger med ca. 17 liter koldt vand hver 51 DK 175855 B1

Middelværdierne for reemissionen (V) og forholdet (R)‘ bestemtes efter 8 vasketests. Resultatet af to uafhængige forsøg er vist i tabel 14A og 14B.

5 Tabel 14A

Fjernelse af kunstigt smuds

Protease EMPA prøveemne nr. Total _in · 116_117_

_V RVRVRV R

PB92 protease 49 1,00 44 1,00 56 1,00 149 1,00 M216S_49 1,00 46 1,05 58 1,04 153 1,03

15 Tabel 14B

Fjernelse af kunstigt smuds

Protease EMPA prøveemne nr. Total 20 _111_116_U/7_

_V RVRVRV R

PB92 protease 41 1,00 35 1,00 46 1,00 123 1,00 M216S 40 0,96 33 0,94 42 0,91 115 0,93 M216Q_42 1,01 35 0,99 43 0,94 120 0,98 25 I tabel 15 divideredes forholdene (R) opnået ud fra de statistiske fuldskalavaskemaskinetests med det tilsvarende forhold (R') beregnet ud fra vaskeevnevær-dierne i forhold til PB92 protease opnået ud fra Laun-derometervasketesten under samme betingelser (10 g/1 IEC, testklæderne EMPA 116 og 117, vasketid 30 minut-

O

ter, temperatur 40 C).

DK 175855 B1 I

Tabel 15 I

Korrelation mellem fuldskalavaskemaskinetest og Launde- I

rometervasketest_ I

5 Protease____R/R1_ I

PB92 protease 1,001 I

M216S 1,18 I

M216Q 1,10 I

S160D 1,02 I

10 N212D_0,98_ I

*pr. definition I

Værdierne for R/R1 for mutantprotease nærved I

1,0 viser korrelation mellem fuldskalamaskintests og H

15 Launderometertests. I

Eksempel 12 I

Fig. 2A og 2B viser vaskeevnen i 4 g IEC/1 af I

20 forskellige PB92 proteasemutanter i overensstemmelse I

med testene beskrevet i eksempel 1 i forhold til na- I

turligt PB92 protease som en funktion af deres sped- I

fikke aktivitet. Tallene i figurerne henviser til de I

følgende mutantproteaser: I

- ^ DK 175855 B1 53

1 PB92 protease 11 K216P

2 H216A 12 M216T

3 M216C 13 M216W

4 K216S 14 M2161 5 5 M216L 15 M2166

6 M216E 16 M117L, H118D

7 M216K 17 M117L, M216Q

8 M216H 18 M117L, H118D, M216Q

9 M216N ' 19 M117L, M216S

10 101,2160 31S2S9K

21 M169S 32 W235R

22 M216Y 33 H243R

23 M169I, M216S 34 H243R, S259K

15 24 M216-OX' 35 D175N

25 N212S 36 E134K

26 N212D 37 W235R, S259K

27 S160G, N2120 38 W235R, H243R

28 L211Y 38 S259K

20 29 L211Y, N212S 40 T207K

30 A166D, M169I

51 S160I

41 S160N 52 S160G, M216S j 42 S160G 53 S160G, M216Q !

25 43 S160P 54 S160L

44 S160T 55 S160Y

45 S160C 56 S160D, M216S

46 S160Q 57 G116V, S126V, P127E, S128K

47 S160D 58 G116V* S126L, P127N, S12BV

30 59 G116V, S126L, P127Q, S128A

48 S160K

60 G116V, S126V, P127K

49 S160R

50 S160A

----- - -- _j

I DK 175855 B1 I

I I

I 61 S126M, P127A, S128G I

I 62 G116V, S126Y, P127G, S128L I

I 63 G116V, S126N, P127H, S128I I

I 64 G116V, S126H, P127Y I

I 5 65 G116Vr S126R, P127S, S128P I

I 66 G116V, S126F, P127Q I

I 67 G116V, S126G, P127Q, S1281 I

I 68 G116V, S126F, P127L, S128T I

I 69 G116V, S126Q, P127D I

I 10 Pig. 3 viser vaskeevnen i 7 g IEC/1 for forskel- I

lige PB92 proteasemutanter ved testene beskrevet i eks- I

I empel 1 i forhold til naturlig PB92 protease som en

I funktion af deres specifikke aktivitet. Tallene i figu- I

I ren henviser til de samme mutantproteaser som tallene i I 15 figurerne 2A og 2B.

I Alle publikationer (herunder patentansøgninger) I

I nævnt i nærværende beskrivelse angiver den kendte tek- I

I nik, som den nærværende opfindelse bygger på. Alle pub- I

I likationer er inkorporeret heri ved henvisning i samme

I 20 omfang, som hvis hver enkelt publikation specifikt og j I

I individuelt var angivet som værende inkorporeret heri I

I ved henvisning. I

Skønt opfindelsen i det foregående er beskrevet I

I med hensyn til nogle detaljer ved hjælp af eksemplifi-

I 25 cering for at gøre den klarede og lettere at forstå, I

I er det klart for fagmanden, at mange ændringer og modi- I

fikationer kan udføres uden, at man går uden for opfin- I

delsen idé og rammer. I

H

Claims (8)

1. Mutantprotease til anvendelse i vaskemidler og med mindst 70%'s homologi med aminosyresekvensen af PB92 serinprotease med sekvensen 5 H*1J-A-Q-S-V-P-H-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N~R-G-L-T-G-S-G—V-K-. V-A-V-L-D-T-G-I-StT-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S~F-V-P~G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G—H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E—L-Y— A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-5-G-N~S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-OrN-N-N-R-A-S- f-s-q-y-g-a-g-l-d-i-v-a-p-g-v-n-v-o-s-t-y-p-g-s-t-y-a-s-l-n-g- T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-10 K-N-r-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-6-L-V-H-A-E-A-A-T-R-COOH • \ der afviger ved i det mindste en aminosyresubstituti-on på et 'udvalgt sted svarende til stilling 212 i j 15 nævnte PB92 protease fra asparagin til asparaginsyre eller glutaminsyre; og med forbedret vaskeydelse i og/eller forbedret stabilitet i forhold til PB92 protease.

2. Mutantprotease ifølge krav 1, hvori nævnte 20 substitutioner svarer til [N212D, S160G].

3. Mutantprotease ifølge krav 1, hvori nævnte enzym er en PB92 proteasemutant.

4. Protease til anvendelse i detergenter og med sekvensen 25 fkN-A-Q-S-V-P-W—G—I-S-R-V—Q—A-P-A-A-H-N-R-G—L-T-G-5—G-V—K— V-A-V-L-D—T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G—G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T—Q—D— g-n-g-h-g-t-h-v-a-g-t-i-a-a-l-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p-k-a-e-l-y- A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-l-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S— G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-f-s-q-y-g-a-g-l-d-i-v-a-p-g-v-n-v-q-s-t-y-p-g-s-t-y-a-s-l-d-g-T-S-M-A-T—P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K—O—K-N-P-S-H-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-3 0 . _K-N-T-A-T-S-I.-G-S-r-K-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. "*' 1 _______ ___J -I DK 175855 B1 I

5. DNA-sekvens, som koder for en protease som H defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 4. H

6. Ekspressionsvektor, som omfatter DNA- H sekvensen defineret i krav 5. H

7. Prokaryotisk værtsstamme transformeret med en H ekspressionsvektor ifølge krav 6. H

8. Transformeret prokaryotisk værtsstamme ifølge H krav 7, hvori nævnte værtsstamme er Bacillus. H

9. Transformeret prokaryotisk værtsstamme ifølge H 10 krav 8, hvori nævnte Bacillus er en alkalofil Bacil- H lus. H

10. Transformeret prokaryotisk værtscelle ifølge H krav 9, hvori nævnte alkalofile Bacillus er Bacillus H nov. spec." PB92 eller en mutant deraf. H

11. Transformeret prokaryotisk værtscelle ifølge H krav 10, hvor nævnte værtsstamme forud for transfor-meringen var i det mindste i det væsentlige ude af stand til at frembringe ekstracellulære proteaser.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af en protea- H 20 se som defineret i et hvilket som helst af kravene 1 H til 4, kendetegnet ved, at man dyrker en H mikroorganisme eller en værtsstamme transformeret med en ekspressionsvektor omfattende en DNA-sekvens, som koder for nævnte protease, hvorved nævnte protease H 25 dannes samt ved, at man udvinder nævnte protease. H

13. Vaskemiddel omfattende en eller flere pro- H teaser som defineret i et hvilket som helst af krave- H ne 1 til 4.

14. Anvendelse af en eller flere proteaser som H 30 defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 4 i et vaskemiddel. H 57 DK 175855 B1

15. Anvendelse af en eller flere proteaser som defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 4 i en vaskeproces. ------j I DK 175855 B1 I I FIGUR 1A I i—i , H ar I o o s uj I ® \ I i CC I I U \ CO I I LLI-// \m I f Q> 00 -Q I / co in i co I is s'? tei » I I \ \*-« Q. CO /-1- CO _ I \\° / x ° ω 2 I v^> / 5 -S ° - _ I I / ω 2 E/lj^-------\ I *3 o § / Λ I I x “ Lii 2 // \ I I S · H ^3 “i[S 15 I I o « i "e “ife .”®. I I o E c o \ \o S00 / Φ; W / I a B I - 1 *2 I rt - c EJ ^ X I co E x co c H I ω I X) I E I < I ► I ---^ DK 175855 B1 FIGUR IB i * Θ EcoRl ^y/proteaseS^ EcoR] Hlndm^// ~ Y I M13M1 I l 8,6kb J x EcoRI/HIndlll ds DNA ss DNA I__1 ^ Annealing ♦ ollgonucleotld {—*—) EcoRl - Hindmvy^^Toteas^X^EcoRI I ( gap-duplex I I _I polymerase. T4-li gase f EcoRl _ __ Hin din ------- EcoRl EcoRl __mutation / / protease'^s^\^' '^^/protease^i^k^ II II I M13M1mut I Il il l 8,6kb J ^»^xTransfektlon — ---^ til E.coll BMH7 1-1 BmutL and JM105 ____j DK 175855 B1 I FIGUR 1C EcoRI I /^5roteasem\ I / X^EcoRI I / pM58 V I 1 6'3kb I I \\NE° / \\, °^l// x EcoRI I ligation V EcoRI I EcoRI m srs I I. pM5.8^.Eh° I I M13M1 1 I U 4'6kb I l 8,6kb I x EcoRI .. x EcoRI I , _ligation_, transformation af B. subtllisT I DB 104. selektion på fEcoRl I neoR, prot® ___ . ,. I ^^^^mutation /^proteas^^w EcoRI I I pM58m \ I It 5r2kb I \Wo ori// I DK 175855 B1 - — FIGUR 2A A K 5 »i-:-η i »- 2. a N * 200- 0 3 ,β)' 27 4J S 10- !... 1 ia- * \ * * 100- 4 1 * - 00- ... 23 24 25 ' i S " »S I 60 - 20 19 32 I 28 2 3 31 «- O 21 35 31 a- / 5 15 1J11 M-1-J-J-J I j j I j J ] 0 20 40 60 80 100 120 SPECIFIK AKTIVITET i forhold til PB92-protease {%) ______ _____i I DK 175855 B1 I I FIGUR 2B I I Λ I I k I I β 260 -1---I li I I · 240 - 57 60 I I I i ^ 66 I II®- 47 I I * 200 - 59 61 I I h 180- -H I 2 58 I I 3 160 - I Æ M I O tf w m - 1A 90 I .H ’40- I In 65 I 0 I S 120- I M I \ 45 I «100-55 41 42 ; s * 6249 s51 0 I I I 60 - 45 I I 44 I I > 40- I I 20 - 37 « 54 40 I I 36 1 I β_ I 0“i-1-1-1-1-1 I I I I I I I 0 20 40 60 80 100 120 I I SPECIFIK AKTIVITET i forhold til PB92-protease (*) H ------ DK 175855 B1 FIGUR 3 Λ R \ 260 n- » • 2«- [ I 22. i (4 i * 200- 59 61 I 0 1 1 1 3 1S>- e i 1i0' 47 «2 .η · 140-0 a. 120- \ 57 67 0 p 100- 1 K 66 23 i ^ 104 I

8. O 19 a „ h 56 17 ° 5026 i (ΟΙ 46 I ·* 55 20- * 0-|-1-1-1-1--1-1-1-1-1-1-1 0 20 40 60 80 100 120 SPECIFIK AKTIVITET i forhold til PB92-protease (%) ______ _i I DK 175855 B1 I I FIGUR 4 I i-Præ I I -100 I I ...........................ATGAAGAAACCGTTGGCCAAAATTCTCGCAAGC I KKKPLGKIVAS I i-Pro I -90 I ACCGCACTACrcATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCA I TALLISVAFSSSIASAAE E.A I I AAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAA I KEKYLIGFNEQEAVSEFVEQ I "50 I GTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTG VEANDEVAILSEEEEVEIEL I I CTTCAIXIAATTTtlAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGACnTAAGCCCAGAAGArGTGGAC I LHEFETIPVLSVELSPEDVD I -10 I I GCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATG I ALELDPAISY1EEDAEVTTN I I-Modent H 1+1 10 20 I GCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGA H I AQSVPWGISRVQAPAAHNRG I 30 40 I I TTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGITGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGAC H I LTGSGVKVAVLDTGISTHPD H I 30 60 I I TTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAAT I LNIRGGASFVPGEPSTQDGN I 70 80 GGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTT H I GHGTHVAGTIAAL N N S I G V L -----------1 DK 175855 B1 FIGUR' 4 (fortsat) 90 100 GGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCIGfrTAAAGTATTAGGGGCGAGCGCTTCAGGT GVAPNAELYAVKVLGASGSG 110 120 TCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCT SVSSIAQGLEWAGNNGHHVA 130 1*10 AATTTGACTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCG NLSLGSP SPSATLEQAVNSA ISO 160 ACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGC TSRG.VLVVAASGNSGAGSIS 170 180 TATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGC « YPARYANAMAVGATDQNHNR 1 I9O 200 GCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAG ASFSQYCAGLDIVAPGVNVQ 210 220 AGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCAT STYPOSTYASLNGTSMATPH 23Ο 2l»0 GTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATC VAGAAALVKQKNPSWSNVQI ψ 25Ο 260 CGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTGGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGA RNHLKNTATSLGSTNLYGSG 270 CTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAA LVNAEAATR End ___ Å