DK175813B1 - Mutantprotease til anvendelse i vaskemidler, DNA-sekvens, som koder for denne, ekspressionsvektor med en sådan sekvens - Google Patents

Description

DK 175813 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår nye proteoly-tiske ciizyiTicL lutsu furbedrede egenskaber til anvendelse i vaskemidler. Disse egenskaber omfatter forbedret evne til i tøjvaskemiddelvaskeblandinger at fjerne misfarv-5 ninger, forbedret stabilitet i tøjvaskemidler under opbevaring og forbedret stabilitet i vaskeblandinger fremstillet ud fra vaskemidlerne.

Anvendelse af enzymadditiver, især proteolytiske enzymer, i vaskemidler for at muliggøre fjernelse af 10 proteinbaseret snavs er rigeligt beskrevet. Se f.eks. de offentliggjorte europæiske patentansøgninger EP-A-0220921 og EP-A-0232269, US patentskrift nr. 4.480.037 og nr. Re 30.602 og artiklen "Production of Microbial Enzymes", Microbial Technology, vol. 1 (1979) 281-311, 15 Academic Press.

Vaskemidler kan foreligge i pulverform, flydende form eller pastaform. De indeholder en eller flere anioniske, ikke-ioniske, kationiske, zwitterioniske eller amfotere forbindelser som aktivt detergensmateria-20 le. Sådanne forbindelser er beskrevet omfattende i "Surface Active Agents", Vol. II af Schwartz, Perry og Berch, Interscience Publishers (1958). Endvidere kan de indeholde sekvestreringsmidler, stabiliserende forbindelser, duftstoffer og i nogle tilfælde oxidationsmid-25 ler, der sædvanligvis kaldes blegemidler. Vaskemidler anvendes til rengøring af faste overflader, toiletrengøring, opvask (enten pr. maskine eller håndkraft) og tøjvask.

Tøjvaskemidler inddeles sædvanligvis i to hoved-30 typer, flydende og pulverformige. Flydende tøjvaskemidler har høje koncentrationer af overfladeaktive midler, neutral til moderat alkalisk pH-værdi og indeholder i almindelighed ikke blegemidler. Vaskepulver har

I DK 175813 B1 I

I I

I oftest høj alkalinitet (vaskeopløsnings pH 9-11), de I

I indeholder sekvestreringsmidler, såsom natriumtripoly- I

I phosphat, og de kan, afhængigt af vaskevanerne i de I

lande, hvor de forhandles, indeholde blegemidler eller I

5 ikke indeholde blegemidler. I

Enzymer, der i dag anvendes i vaskemidler, til- I

I sættes i form af flydende suspension, sol eller granu- I

I lat. I vaskepulvere er de proteolytiske enzymer f.eks. I

I i almindelighed til stede i en indkapslet form, såsom I

I 10 i prillform (f.eks. af Maxatas^ og Maxaca]®) eller i I

I granulatform (f.eks. af Savinas^ og Alcalas^^ . Maxa- I

I tase og Maxacal forhandles af International Bio-Synthe- I

tics B.V. (Rijswijk, Holland), og Savinase og Alkalase I

I forhandles af HOVO Industri A/S (Bagsværd, Danmark). I

15 i flydende vaskemidler er enzymerne oftest til stede i I

form af opløsning. I

I Proteolytiske enzymer er i almindelighed van- I

I skelige at kombinere med vaskemidler. De skal være sta- I

I bile og aktive under anvendelse, f.eks. til fjernelse I

20 af proteinholdige farvestoffer fra tekstiler under vask I

H O 0 I

ved temperaturer i området fra ca. 10 C til over 60 C.

De skal endvidere være stabile i lang tid i vaskemidlet I

under dettes opbevaring. Følgelig skal enzymerne være I

H stabile og virksomme i tilstedeværelse af sekvestre- I

25 ringsmidler, overfladeaktive midler og i nogle tilfælde I

blegemidler og ved høj alkalinitet og temperatur. Idet I

I der hverken findes universalvaskemidler eller univer- I

; seile vaskebetingelser (pH-værdi, temperatur, koncen- I

tration i vaskeblanding, hårdhed af vandet), som kan I

30 anvendes over hele verden, kan kravene til enzymer va- I

riere på basis af typen af vaskemidlet, hvori de skal I

anvendes, og af vaskebetingelserne. I

De betingelser, der er afgørende for stabilite- I

ten af enzymer i vaskepulvere er i almindelighed ikke I

I DK 175813 B1 optimale. Under tilstedeværelse af enzympræparater i vaskepulvere han cxidaticnsmidler fra vaskemidlet I f.eks., på trods af den tilsyneladende fysiske adskil lelse af enzymet fra vaskemiddelmaterialet, påvirke 5 proteasen og reducere dens aktivitet. En anden årsag til ustabilitet af enzymet i vaskepulvere under opbevaring er autodigestion, især ved høje relative fugtighe der.

Endvidere har oxidationsmidler, der ofte findes 10 i vaskepulvere en vigtig ulempe med hensyn til effektiviteten af fjernelse af farvestof under anvendelse ved tøjvask eller -rensning på grund af fiksering af proteinholdige farvestoffer til tekstilmaterialet. Desuden reducerer disse oxidationsmidler og andre vaske-15 middelkomponenter, såsom sekvestreringsmidler, også effektiviteten af proteasen til fjernelse af farvestof under vaskeprocessen.

I flydende vaskemidler har man erfaret hurtig enzyminaktivering som et vigtigt problem, især ved høje 20 temperaturer. Idet enzymerne findes i opløsning i vaskemiddelproduktet, sker denne inaktivering allerede i vaskemidlet under normale opbevaringsbetingelser og reducerer enzymernes aktivitet væsentligt inden produktet anvendes. Især anioniske, overfladeaktive midler, såsom 25 alkylsulfater, i kombination med vand og buildere har tendens til at denaturere enzymet irreversibelt og gøre det inaktivt eller følsomt overfor proteolytisk nedbrydning.

Delvise løsninger af ståbilitetsproblemer i for-30 bindelse med enzymer i flydende vaskemidler er fundet ved tilpasninger af de flydende vaskemiddelformuleringer, som f.eks. ved anvendelse af stabiliseringsmidler til reduktion af inaktiveringen af enzymerne. Se EP-A-

I DK 175813 B1 I

I I

I 0126505 og EP-A-0199405, US patentskrift nr. 4.318.818 I

I og GB patentansøgning nr. 2178055A. I

I En anden metode til sikring af stabilitet af en- I

I zymer i flydende vaskemidler er beskrevet i ep-a- I

I 5 0238216, hvor fysisk adskillelse af enzymmolekylerne og I

det angribende vaskemiddelmateriale opnås ved hjælp af I

I formuleringsteknologi. I vaskepulvere har alternative I

I indkapslingsmetoder været foreslået, se f.eks. EP-A- I

i 0170360. I

10 I det foregående sammenfattes betingelserne, som I

proteolytiske vaskemiddelenzymer skal opfylde for at I

I virke optimalt og begrænsningerne ved de enzymer, der i I

I dag er til rådighed til anvendelse i vaskemidler. Uan- I

set anstrengelserne, der er gjort for at sikre enzym- I

15 stabilitet i vaskemidler, må man stadig regne med et I

væsentligt tab af aktivitet under normale opbevarings- I

og anvendelsesbetingelser. I

Identifikation og isolation af nye enzymer til I

en bestemt tiltænkt anvendelse, såsom anvendelse i va- I

20 skemidler, kan udføres på mange forskellige måder. En I

måde er screening for organismer eller mikroorganismer, I

der udviser den ønskede, enzymatiske aktivitet, isola- I

tion og oprensning af enzymet fra (mikro)organismen el- I

ler fra en kultursupernatant af denne (mikro)organisme, I

25 bestemmelse af dens biokemiske egenskaber og undersø- I

Hi gelse af, om disse biokemiske egenskaber opfylder kra- I

I j vene ved anvendelsen. Hvis det identificerede enzym ik- I

H ke kan opnås ud fra den organisme, der naturligt danner I

H det, kan rekombinant-DNA-metoder anvendes til isola- I

H 30 tion af genet, der koder for enzymet, ekspression af I

genet i en anden organisme, isolation og oprensning af I

det eksprimerede enzym og testning af, om det er egnet I

H til den tiltænkte anvendelse. I

I DK 175813 B1

En anden fremgangsmåde til opnåelse af nye enzymer tn en tiltænkt anvendelse er modifikation af eksisterende enzymer. Dette kan f.eks. opnås ved kemiske modifikationsmetoder (se I. Svendsen, Carlsberg 5 Res. commun. 44 (1976), 237-291). I almindelighed er disse fremgangsmåder for uspecifikke, idet alle tilgængelige rester med samme sidekæder modificeres, eller idet de er afhængige af tilstedeværelsen af passende aminosyrer, der skal modificeres, og de er ofte uegne-.10 de til modifikation af aminosyrer, der er vanskelige at nå, hvis ikke enzymmolekylet er ufoldet. Enzymmodifikationsmetoden med mutagenese af det kodende gen formodes derfor at være bedre.

Mutagenese kan opnås enten ved tilfældig muta-15 genese eller ved stedsdirigeret mutagenese. Tilfældig mutagenese ved behandling af en hel mikroorganisme med et kemisk mutagen eller ved muterende bestråling kan selvfølgelig resultere i modificerede enzymer. I dette tilfælde må strenge selektionsforskrifter foreligge til 20 udvælgelse af overordentligt sjældne mutanter med de ønskede egenskaber. En større sandsynlighed for isolation af mutantenzymer ved tilfældig mutagenese kan efter kloning af det kodende gen ved mutagenese in vitro eller in vivo og ekspression af enzymet, som det koder 25 for, opnås ved rekloning af det muterede gen ind i en egnet værtscelle. Også i dette tilfælde må passende biologiske selektionsforskrifter være til rådighed til selektion af de ønskede mutantenzymer, se international patentansøgning WO 87/05050. Disse biologiske .selek- 3.0 tionsforskrifter giver ikke specifik selektion af enzymer egnet til anvendelse i vaskemidler.

Den mest specifikke fremgangsmåde til opnåelse af modificerede enzymer er stedsdirrigeret mutagense, i i ! i

I DK 175813 B1 I

I I

I der muliggør specifik substitution af en eller flere I

I aminosyrer med en vilkårlig anden ønsket aminosyre. I

I EP-A-0130756 gives eksempler på anvendelse af denne I

I metode til dannelse af mutantproteasegener, der kan I

5 eksprimeres til opnåelse aaf modificerede proteoly- I

I tiske enzymer. I

Por nylig har mulighederne for oligonucleotid- I

I medieret, stedsdirigeret mutagenese været vist ved I

I anvendelse af mutagene oligonucleotider syntetiseret I

I 10 til at indeholde blandinger af baser ved adskilllige I

I positioner i en målsekvens. Dette muliggør indføring af I

I en række forskellige mutationer ved en specifik del af I

en DNA-sekvens ved anvendelse af et enkelt, syntetisk I

oligonucleotidpræparat som eksemplificeret af (Hui et I

15 al., EMBo J, 2 (1984) 623-629, Matteucci et al., Nucl. I

I Acids Res. 11 (1983) 3113-3121, Murphy et al., Nucl. I

I Acids Res 11 (1983) 7695-7700, Wells et al., Gene 34 I

(1985) 315-323, Hutchingson et al., Prpc. Natl. Acad. I

I : Sci. USA 82 (1986) 710-714 og F.M. Ausubel, Current I

20 Protocols in Molecular Biology 1987-1988, Greene I

H Publishers Associatin og Wiley, Interscience, 1987). I

Staiiffer et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) I

H 5333-5338, har allerede fundet, at methioninet ved I

position 221 i Carlsberg subtilisin oxideres af Η202 I

H 2^ til methioninsulfoxid og er ansvarligt for et voldsomt I

fald i aktiviteten. I

H Som et resultat af både metoden med tilfældig og I

H med stedsdirrigeret mutagnese til dannelse af modifice- I

rede enzymer er mutanter opnået ud fra serinproteasen I

H 30 fra Bacillus amylollquefaciens, også betegnet "subti- I

H lisin BPN'" isoleret og karakteriseret. I international I

patentansøgning med offentliggørelsesnummeret I

WO 87/05050 beskrives et mutant subtilisin BPN' med I

i H ' 11 I DK 175813 B1 forbedret termisk stabilitet. I EP-A-0130756 beskrives i »t «tedsdirrigcrct rrrztzgzzzzz sf mathicuiin veu posi- | tion 222 i subtilisin BPN' med alle de 19 mulige amino syrer under anvendelse af den såkaldte "kasettemuta-5 genesemetode", kan resultere i enzymer, der er resi-; stente mod oxidation med Η202· I det sidste tilfælde havde de fleste mutanter imidlertid lav proteolytisk aktivitet. De bedste, fundne mutanter var M222A og M222S, der havde specifikke aktiviteter på henholds-10 vis 53% og 35% i forhold til det naturlige subtilisin BPN', se Estell et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 6518-6521.

Tidligere arbejde til udvikling af modificerede proteaser viser, at subtilisin BPN'-mutanter med ændret 15 stabilitetsegenskaber og ændrede kinetiske egenskaber kan opnås. Se litteraturen nævnt ovenfor og andre referencer, f.eks. Rao et al., Nature 328 (1987) 551-554,

Bryan et al., Proteins 1 (1986) 326-334, Cunningham og Wells, Protein Engineering 1 (1987) 319-325, Russell et 20 al., J. Mol Biol. 193 (1987) 803-819, Katz og Kossia-koff, J. Biol. Chem. 261 (1986) 15480-15485, og, oversigterne af Shaw, Biochem. J. 246 (1987) 1-17 og Gait et al., Protein Engineering 1^ (1987) 267-274. Ingen af i disse referencer har imidlertid ført til industriel 25 produktion af proteolytiske enzymer med forbedrede vaskeegenskaber og stabilitet i vaskemidler. Ingen af de modificerede proteaser har hidtil vist sig at have kommerciel værdi og være bedre end de i dag anvendte vaskemiddelenzymer under de relevante anvendelsesbe-30 tingelser.

Endelig omtales i den ikke forud offentliggjorte patentansøgning WO 89/06279 visse mutanter af pro-teaserne, der betegnes "Subtilisin 147" og "Subtilisin

I DK 175813 B1 I

I I

309". Der vises fire mutanter af "Subtilisin 309", I

I hvori methioninen ved stilling 222 er erstattet af ala- I

I nin eller cystein. Disse [M222A], [M222C], [G195E, I

I M222A] og [G195E, M222C] mutanter synes at have udtalt I

I ; I

lavere aktivitet end stamenzymet, men det hævdes, at I

som følge af deres forbedrede stabilitet mod oxidation I

I er deres anvendelse i vaskemidler, som indeholder oxi- I

dationsmidler, ikke udelukket. I

Det skal bemærkes, at "Subtilisin 309" afviger I

10 for så vidt angår en aminosyre fra den kraftigt alka- I

I liske protease MaxacalR, der i følgende også betegnes I

I PB92 protease (fra Bacillus nov. spec. PB92). Amino- I

syresekvensen af PB92 proteasen, der er vist i Figur 4, I

I findes i EP-A-0283075 og EP-A-0284126. "Subtilisin I

I 15 309", også kendt som Savinas^^ og PB92 er forskellige I

I ved stilling 87, hvor "Subtilisin 309" har en serin (S) I

og PB92 en asparagin (N). I

Ifølge et aspekt af den foreliggende opfindelse I

I tilvejebringes en mutantprotease til anvendelse i vas- I

20 kemidler, hvilken protease er ejendommelig ved det i I

krav 1 anførte. I

Et andet aspekt af opfindelsen vedrører en DNA- I

sekvens, som koder for en sådan mutantprotease. I

Et tredje aspekt for opfindelsen vedrører en I

25 ekspressionsvektor med en sådan DNA-sekvens. I

Et yderligere aspekt ved opfindelsen relaterer I

sig til en prokaryotisk værtsstamme, der er transforme- I

ret med en sådan ekspressionsvektor. I

Ved et yderligere aspekt for opfindelsen tilve- I

30 jebringes en fremgangsmåde til fremstilling af en mu- I

tantprotease som defineret ovenfor, hvilken fremgangs- I

måde er ejendommelig ved, at man dyrker en værtsstamme I

H af en mikroorganisme, som er transformeret med en I

DK 175813 B1 9 ekspj.easiuiiisvektor, som omfatter en DNA-seJcvens, der koder for en mutantprotease, hvorved nævnte mutantpro-tease frembringes, og man efterfølgende udvinder mu-tantproteasen.

5 Et yderligere aspekt ved opfindelsen er tilveje bringelse af et vaskemiddel, som indeholder en eller flere af de definerede mutantproteaser.

Endelig er det et aspekt ved opfindelsen at anvende en eller flere af mutantproteaserne i et vaske-middel eller i en vaskeproces.

En foretrukken udførelsesform ifølge opfindelsen udgøres af mutanter af PB92 serinprotease.

Disse og andre aspekter af opfindelsen vil blive beskrevet nærmere i den følgende, detaljerede beskri-I5 velse.

I DK 175813 B1 I

I 10 I

I Kort beskrivelse af tegningerne: I

I Fig. 1A viser konstruktionen af mutationsvek- I

I toren indeholdende PB92 proteasegen. I

I 5 Fig. IB viser skematisk den anvendte mutagenese- - I

I metode. I

Fig. 1C viser konstruktionen af en ekspression- I

I vektor indeholdende et mutanet PB92 proteasegen. I

Fig. 2A, 2B og 3 viser vaskeevnen som funktion I

I 10 af specifik, proteolytisk aktivitet for forskellige I

I PB92 proteasemutanter under forskellige vaskebetingel- I

I ser. I

I Fig. 4 viser nucleotidsekvensen af PB92 protea- I

segenet og aminosyresekvensen af precursoren2ymet, som I

15 det koder for. I

Med udtrykket "med forbedrede egenskaber", som I

det anvendes i nærværende beskrivelse i forbindelse med I

"proteolytiske mutantenzymer", menes proteolytiske en- I

zymer med forbedret vaskeevne eller forbedret stabili- I

20 tet med bevaret vaskeevne i forhold til den tilsvarende I

vildtypeprotease. I

Udtrykket "vaskeevne" af proteolytiske mutant- I

enzymer defineres i nærværende beskrivelse som det pro-. I

teolytiske mutantenzyms bidrag til tøj rensningen udover I

25 virkningen af vaskemidlet uden enzymet under relevante I

vaskebetingelser. I

Udtrykket "relevante vaskebetingelser" anvendes I

til betegnelse af de betingelser, især med hensyn til I

H vasketemperatur, tid, mekaniske forhold, koncentration I

30 af vaskemiddel i vaskevandet, arten af vaskemidlet og I

H vandets hårdhed, der faktisk anvendes i husholdningen i I

et markedsområde for vaskemidlet. I

H Udtrykket "forbedret vaskeevne"' anvendes til I

H at vise, at et bedre slutresultat opnås med hensyn til I

fjernelse af farvestof under "relevante vaskebetingel- I

ser", eller at en mindre mængde proteolytisk mutant- I

I DK 175813 B1 enzym på vægtbasis er nødvendig til opnåelse af det seutune resultat som med det tilsvarende vild typeenzym.

Udtrykket "bevaret vaskeevne" anvendes til angivelse af, at vaskeevnen af et proteolytisk mutantenzym 5 på vægtbasis er mindst 80% af vaskeevnen af den tilsvarende vildtypeprotease under "relevante vaskebetingelser".

Udtrykket "forbedret stabilitet" anvendes til angivelse af bedre stabilitet af proteolytiske mutant-10 enzymer i vaskemidler under opbevaring og/eller bedre stabilitet i vaskeblandingen, hvilket omfatter stabilitet mod oxidationsmidler, sekvestreringsmidler, autolyse, overfladeaktive midler og høj alkalinitet, end hvad man finder hos det tilsvarende vildtypeenzym.

15 Biokemiske egenskaber bestemt under veldefinere de laboratoriebetingelser er ikke pålidelige parametre til forudsigelse af egenskaberne af en bestemt vaske-middelprotease under de ønskede og specificerede anvendelsesbetingelser. Disse parametre omfatter kinetiske 20 data målt på veldefinerede substrater, såsom proteiner som f.eks. casein, dimethylcasein og hæmoglobin, eller substituerede oligopeptidsubstrater, som f.eks.

sAAPFpNA (succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-propyl-L-phenyl- I alanyl-paranitroahilid). Det er klart, at andre træk 25 ved proteaserne bestemmer deres effektivitet ved tøjvask eller -rens.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den opdagelse, at forudsigelse af virkningen af specifikke mutationer under faktiske anvendelsesbetingelser stadig 30 er meget vanskelig eller endog umulig, skønt metoder til indføring af aminosyreændringer, ved hvilke man kan fremkalde væsentlige ændringer af deres biokemiske egenskaber, er til rådighed.

Ifølge opfindelsen har man nu efter vidtgående 35 forskning og forsøg fundet en fremgangsmåde, ved hvilken fremstillingen af mutantproteaser kombineres med en

I DK 175813 B1 I

I 12 I

I effektiv selektionsmetode på basis af disse proteasers I

egenskaber. Det er overraskende, at relativt store an- I

tal enzymer kan screenes effektivt for deres styrke på I

denne måde. I

5 Testmetoden ifølge opfindelsen er baseret på I

fjernelsen af proteasefølsomme stammer fra testprøver i I

I et launderometer eller tergotometer, hvori de relevante I

vaskebetingelser efterlignes. Egnede testprøver er I

f.eks. de kommercielt tilgængelige prøver fra EMPA I

I 10 (EidgenGssische Material Priifungs und Versuch Anstalt, I

St. Gallen, Schweiz), hvilke er tilsmudset kunstigt med I

proteinholdige farvestoffer. Relevante farvestoffer på 1

prøver til testning af protease omfatter blod, græs, I

chokolade, farvestoffer og andre proteinholdige farve- I

15 stoffer. I

Ved denne testmetode kan man desuden kontrollere I

andre relevante faktorer, såsom vaskemiddelsammensæt- I

ning, koncentration i vaskeblanding, vandets hårdhed, I

mekaniske forhold under vaskningen, tid, pH-værdi og I

20 temperatur, på en sådan måde, at man efterligner de be- I

tingelser, der er typiske for husholdningsanvendelse på I

et. givet markedsområde. I

H Proteasers vaskeevne måles sædvanligvis ved de- I

H res evne til at fjerne visse repræsentative farvestof- I

H 25 fer under passende testbetingelser. Denne evne kan hen- I

H sigtsmæssigt bestemmes ved reflektansmålinger på test- I

H klæder efter vask med og uden enzymer i et launderome- I

ter eller tergotometer. Testen ifølge opfindelsen til I

H anvendelse i laboratoriet er, når den anvendes på pro- I

H 30 teolytiske enzymer modificeret ved DNA-mutagenese, I

H repræsentativ for husholdningsanvendelse. I

Følgelig muliggør opfindelsen testning af mæng- I

der af forskellige enzymer og selektion af de enzymer, I

som er særligt egnede til anvendelse i en specifik type I

35 vaskemiddel. På denne måde kan skræddersyede enzymer I

til specifikke anvendélsesbetingelser let udvælges. I

i DK 175813 B1 13

Nogle bakterielle seririproteaser betegnes sub-tiiisiner. subtiiisiner omfatter serinproteaser fra Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens ("subti-lisin BPN'") og Bacillus licheniformis ("subtilisin 5 Carlsberg"). Se oversigtsartiklen af Markland og Smith (1971) i "The Enzymes" (Boyer, red.) vol 3, 561-608,

Academic Press, New York. Bacillus stammer, såsom al-kalofile Bacillus-stammer, danner andre proteaser.

Eksempler på den sidstnævnte kategori er serinprotea-10 serne i Maxacal®, i det følgende også betegnet PB92 protease) fra Bacillus nov. spec. PB92), og i Savina-sÅ om nævnt tidligere. I

Aminosyresekvensen af PB92 proteasen er vist i fig. 4. Den modne protease består af 269 aminosyrer, I

15 der repræsenterer en molekylvægt på ca. 27000 D, og har et isoelektrisk punkt i det stærkt alkaliske område.

Aktiviteten af PB92 protease på proteinsubstrat udtrykkes i Alkaline Delft Units (ADU). Aktiviteten i ADU be-1 stemmes efter metoden beskrevet i britisk patentskrift 20 nr. 1.353.317, bortset fra at pH-værdien ændres fra 8,5 til 10,0. Renset PB92 protease har en aktivitet på 21.000 ADU pr. mg. Turnover number (kca^) målt på casein er 90 sekunder-1.

Den specifikke aktivitet af rensede præparater 25 af subtilisin Carlsberg (Delange og Smith, J. Biol.

Chem. 243 (1968) 2184) beløber sig til 10.000 ADU/mg og af subtilisin BPN' (Matsubara et al., J. Biol. Chem.

240 (1965) 1125) til 7.000 ADU/mg. Foruden de ovennævnte parametre, såsom specifik aktivitet og turnover num-30 ber (kcat), adskiller PB92 protease sig fra proteaser, såsom Carlsberg subtilisin, subtilisin BPN' og andre proteaser formuleret i vaskemidler (f.eks. Maxatas^ og Alcalasi^) ved at have en høj positiv ladning, der kan visualiseres ved gelelektroforese af det naturlige pro-35 tein som beskrevet senere i forsøgsafsnittet under punkt 4.

I DK 175813 B1 I

I I

I Idet PB92 protease er aktiv til fjernelse af I

I farvestof ved alkaliske ρΗ-værdier, anvendes det almin- I

deligt som et vaskemiddeladditiv sammen med vaskemid- I

delbestanddele, såsom overfladeaktive midler, buildere I

I 5 og oxidationsmidler. De sidstnævnte midler foreligger I

I oftest i pulverform. PB92 protease har en høj effekti- I

I vitet til fjernelse af farvestof i sammenligning med I

andre proteaser, såsom de førnævnte subtilisiner. Dette I

I betyder, at en mindre mængde PB92 protease kræves til I

10 opnåelse af den samme vaskeevne. I

I Følsomheden for oxidation er en vigtig ulempe I

I ved PB92 proteasen og alle andre kendte serinprotea- I

H ser, der anvendes i vaskemidler (se også Stauffer et I

I al., J. Biol. Chem. 244 (1969 ) 5333-5338; Estell et I

I 15 al., J. Biol. Chem. 263'(1985) 6518-6521). Oxidation af I

PB92 protease med enten H202 eller persyrer, der ud- I

vikles af aktivatorsystemet indeholdende perborat-te- I

trahydrat og TAED, giver et enzym med en specifik ak- I

tivitet på henholdsvis 50 og 10% i ADU/mg af den spe- I

20 cifikke aktivitet af den ikke oxiderede PB92 protease I

(se forsøgsafsnittet punkt 7 og eksempel 1). I

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er meget vel- I

egnet til fremstilling, screening og selektion af pro- I

teolytiske mutantenzymer, som er opnået ud fra natur- I

25 ligt fremstillede bakterielle serinproteaser. Sådanne I

mutanter er f.eks. de mutanter, der kodes af et gen op- I

nået ud fra et vildtypegen af en alkalofil Bacillus I

H 1 stamme, fortrinsvis PB92. Også mutanter opnået ud fra I

den alkalofile Bacillus-serinprotease Savinase er egne- I

30 de. Fremgangsmåden kan desuden hensigtsmæssigt anvendes I

til selektion af modificerede proteaser opnået ud fra I

andre proteaser end serinproteaser fra alkalofile I

H Bacillus stammer PB92. F.eks. er generne, der koder for I

serinproteaserne af Bacillus subtilis. Bacillus amylo- I

35 liquefaciens og Bacillus licheniformis kendte, og de I

H kan anvendes som mål for mutagense. Det er klart, at I

15 DK 175813 B1 enten oligonucleotid-steddirigeret mutagenese eller regiondirigerer turæidig mutagenese eller en vilkårlig i andet egnet fremgangsmåde til effektiv udvikling af mu tationer i proteasegenet kan anvendes.

5 Fremgangsmåden til udvælgelse af proteolytiske mutantenzymer ifølge den foreliggende opfindelse (hvilken omfatter fremstilling og screening) omfatter de følgende trin: mutagense af et klonet gen, der koder . for et proteolytisk enzym af interesse eller et frag-10 ment deraf; isolation af det opnåede mutantproteasegen eller de opnåede mutantproteasegener; indføring af dette eller disse mutantproteasegen(er), fortrinsvis på en egnet vektor, i en passende værtsstamme til ekspression og produktion; udvinding af den fremstillede mutant-15 protease og identifikation af de mutantproteaser, der har forbedrede egenskaber til anvendelse i vaskemidler.

Egnede værtsstammer til fremstilling af mutantproteaser omfatter transformerbare mikroorganismer, hvori ekspression af proteasen kan opnås. Specifikke 20 værtsstammer af samme art eller slægt, som proteasen er opnået ud fra, er egnede, såsom en Bacillus stamme, fortrinsvis en alkalofil Bacillus stamme, helst Bacillus nov. spec. PB92 eller en mutant deraf med i det væsentlige de samme egenskaber. Også B^ subtilis, b.

25 licheniformis og B^ amylolicruefaciens-stammer er blandt de foretrukne stammer. Andre egnede og foretrukne stammer omfatter de stammer, som inden transformationen med et mutantgen i det væsentlige er ude af stand til at danne ekstracellulære, proteolytiske enzymer. Af særlig 30 interesse er proteasedeficiente Bacillus værtsstammer, såsom et proteasedeficient derivat af Bacillus nov. spec. PB92. Ekspressionsignaler omfatter DNA-sekvenser, der regulerer transkription og translation af protease-generne. De rette vektorer er i stand til at replikere 35 med tilstrækkeligt høje kopiantal i de valgte værtsstammer eller at muliggøre stabil bevarelse af proteasegenet i værtsstammen ved kromosomal integration.

I DK 175813 B1 I

I I

I De proteolytiske mutantenzymer ifølge opfindel- I

I sen fremstilles ved dyrkning under passende fermente- I

I ringsbetingelser af en transformeret værtsstamme om- I

I fattende det ønskede proteolytiske mutantgen eller de I

I 5 ønskede, proteolytiske mutantgener og udvinding af de I

I dannede enzymer. I

I Proteaser, der eksprimeres, udskilles fortrins- I

I vis i kulturmediet, hvilket letter deres opsamling, el- I

ler, for gramnegative, bakterielle værtsstammer, i pe- I

10 riplasmarummet. Til udskillelse anvendes en passende I

aminoterminal signalsekvens, fortrinsvis signalsekven- I

I sen kodet af det oprindelige gen, hvis dette er funk- I

I tionelt i den valgte værtsstamme. I

I Ifølge et aspekt af opfindelsen kan man udvikle I

15 passende tests for vaskeevne, hvilke er repræsentative I

H for alle markedets relevante husholdningsvaskebetingel- I

ser. F.eks. udvikledes en egnet test til det meget I

krævende, europæiske vaskepulvermarked, hvor man anven- I

H der pulverformigt formulerede vaskemidler, som kan in- I

20 deholde blegemidler eller ej, i vaskeopløsningskoncen- I

trationer fra 1-10 g vaskemiddel/1 ved 10-20°GH (tysk I

H u

hårdhed) og ved temperaturer på mellem 25 og 80 C. Mere I

specifikt anvendtes et pulverformigt formuleret vaske- I

middel indeholdende TAED og perborat i en vaskeopløs- I

H 25 ningskoncentration på 4, 7 eller 10 g vaskemiddel/1 I

H ved 15eGH ved 40°C. I

H Der tilvejebringes også tests, som er repræsen- I

H tative for vask med flydende vaskemidler. Egnede vaske- I

H evnetests kan udvikles til andre betingelser, som man I

H 30 møder på markedet. Testemner tilsmudset med protease- I

H følsomme farvestoffer, især emner tilsmudset med blod-, I

H græs- og chokoladefarve og andre proteinholdige farve- I

H stoffer, nærmere betegnet EMPA-testemnerne 116 og 117, I

H anvendes ved repræsentative vaskeevnetests. I

H 35 Egenskaberne af de naturligt forekommende eller I

naturligt muterede vaskemiddelproteaser kan forbedres I

I DK 175813 B1 ved indføring af forskellige mutationer i enzymet. I de fleste tilfælde vil imaLaliuuerue være substitutioner, enten konservative eller ikke-konservative, men deletioner og indføjelser kan også finde anvendelse.

5 Til konservative substitutioner kan følgende ta bel anvendes:

Alifatisk neutral

10 Upolær G, A, P

L, I, v polær C, M, S, T,

N, Q

ladet

15 anionisk D, E

kationisk K, R Aromatisk F, H, W, Y

hvor enhver aminosyre kan substitueres med en vilkårlig 20 anden aminosyre i samme kategori, især på samme linie.

Desuden kan de polære aminosyrer N, Q erstatte eller erstattes med de ladede aminosyrer. I forbindelse med den foreliggende opfindelse er substitutioner, der resulterer i øget anionisk karakter af proteasen, især 25 ved steder, der ikke er direkte involveret i det aktive sted, af særlig interesse.

Regioner af særlig interesse for mutationer er de aminosyrer, der ligger indenfor en afstand på 4 Å fra inhibitormolekylet Eglin C, når Eglin C er bundet 30 til det aktive sted.

Den følgende nummerering er baseret på PB92 protease, men betragtningerne er relevante for andre se-rinproteaser med en i det væsentlige homolog struktur, især de proteaser, der har mere end ca. 7 0% homologi, 35 især mere end 90% homologi. Disse positioner vil være 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-

I DK 175813 B1 I

i 18 I

I 156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198 og 203-216, I

I idet de fleste af disse positioner er tilgængelige for I

I direkte vekselvirkning med et proteinsubstrat. Posi- I

tionerne 32, 62, 153 og 215 vil sædvanligvis ikke være I

I 5 substituerede, idet mutationer ved disse steder har I

I tendens til at forringe vaskeevne. I

I Substitutionssteder af særlig interesse omfatter I

I positionerne 60, 62, 94, 97-102, 105, 116, 123-128, I

I 150, 152, 153, 160, 183, 203, 211, 212 og 213-216. Ved I

I 10 nogle positioner vil der være et ønske om at ændre en I

B ustabil aminosyre, f.eks. methionin, til en oxidations- I

B mæssigt mere stabil aminosyre, f.eks. threonin, under I

B bevarelse af aminosyrens almene konformation og volumen I

B på dette sted. I andre situationer viser det sig, at I

B 15 forbedrede resultater kan opnås ved udskiftning af den I

B naturlige aminosyre med næsten en hvilken som helst an- I

B den aminosyre, dette gælder især udskiftning af de I

B hydroxylerede aminosyrer, S, T, med polære eller ikke- I

B polære aminosyrer eller endog aromatiske aminosyrer. I

B 20 Substitutioner af særlig interesse omfatte: I

B G116 I, v, L I

B S126 en vilkårlig aminosyre I

P127 en vilkårlig aminosyre I

S128 en vilkrålig aminosyre I

25 S160 anionisk eller neutral alifatisk eller R I

A166 ladet, især anionisk I

M169 neutral, alifatisk, fortrinsvis upolær I

N212 anionisk I

Η M216 alifatisk polær, især S, T, N, Q I

H 30 Mens mange af mutationer resulterer i en lavere, I

H specifik aktivitet af proteasen med almindelige sub- I

strater, er vaskeevnen overraskende sammenlignelig el- I

ler bedre end for det naturlige enzym, og i mange til- I

H fælde forbedres lagerstabiliteten. I

35 Vaskeevnen af nogle af PB92 mutantproteaserne, I

når den udtrykkes som den reciprokke værdi af den rela- I

I DK 175813 B1 tive mængde af enzymet, der er nødvendig til opnåelse af samme virkning som med den naturlige protease x 100%, øges til mere end 120% og i visse tilfælde til mere end 180%.

5 Ifølge et andet aspekt af opfindelsen tilveje bringes PB92 proteasemutanter, som har en bedre opbevaringsstabilitet i et pulverformigt vaskemiddel indeholdende blegemiddel end den naturlige PB92 protease, mens de bevarer vaskeevnen. Eksempler på sådanne mutan-10 ter er M216S og M216Q og mutanter med mindst én af disse mutationer foruden mutationer andre steder.

Ifølge et yderligere aspekt af opfindelsen viste det sig overraskende, at mutant PB9-proteaserne M216S, M216Q, S160D og N212D bevarer deres aktivitet bedre end 15 PB92 protease i et flydende tøjvaskemiddel (der ikke indeholder oxidationsmidler). Af disse mutanter bevarer M216S og M216Q vaskeevnen, og S160D og N212D har forbedret vaskeevne. Forbedringen med hensyn til opbevaringsstabilitet i det testede, flydende vaskemiddel er 20 mest udtalt for S160D- og M2i6Q-mutanterne.

Det er også muligt at kombinere en række for-1 skellige mutationer, der øger stabiliteten af en pro tease i vaskemidler. Adskillige mutationer, der påvirker vaskeevnen af samme protease positivt kan kombine-25 res til et enkelt mutantproteasegen, der muliggør fremstilling af eventuelt endnu mere forbedrede proteaser, f.ekS. [S126M, P127A, S128G, S160D] og [G116V, S126N, P127S, S128A, S160D]. Nye proteasemutanter kan dannes ved kombination af de gode egenskaber med hensyn til 30 vaskeevne af f.eks. N212D og S160D med stabilitetsegenskaberne af f.eks. M216S eller M216Q. [S160D, M216S]-mutanten har f.eks. forbedret vaskeevne og bedre stabilitet ved opbevaring.

Nyttige mutanter kan også opnås ved kombina-35 tion af vilkårlige af mutationerne eller sættene af mutationer beskrevet i nærværende beskrivelse. Desuden er

I DK 175813 B1 I

I 20 I

I det muligt at kombinere nyttige mutationer som beskre- I

I vet heri med mutationer ved andre steder, som kan eller I

I ikke kan forårsage en væsentlig ændring af enzymets I

I egenskaber. I

I 5 Foretrukne udførelsesformer af den foreliggende I

I opfindelse er de følgende PB92 proteasemutanter: I

I [M216S]; [M216Q]; [N212D]; S160D, M216Q] og [S160D, I

I M216S], I

I Til illustration af betydningen af fremgangsmå- I

den anvendt ifølge nærværende opfindelse til opnåelse I

H af nye proteaser egnet til anvendelse i tøjvaskemidler, I

dvs. ved anvendelse af repræsentativ tøjvasketestning I

som primært selektionskriterium, er resultaterne af va- I

skeevnetestene af mutant PB92 proteaser sammenlignet I

med de biokemiske parametre, som sædvanligvis bestemmes I

ved biokemiske og enzymologiske proteinundersøgelser. I

Disse resultater tillader den konklusion, at der ikke I

findes nogen relation mellem parametre, der bestemmer I

affiniteten for definerede substrater og kinetikket af I

den proteolytiske reaktion, og vaskeevnen (se tabel li I

eksempel 1). I

Derfor er det selvfølgelig også muligt at kom- I

binere to eller flere mutanter med forskellige egen- I

skaber i ét enzymprodukt eller ved den samme vaskepro- I

ces. En sådan kombination kan give en synergistisk I

virkning eller ej. I

Opfindelsen omfatter også anvendelsen af et el- I

ler flere proteolytiske mutantenzymer som defineret i I

det foregående i vaskemidler eller under vaskeproces- I

ser. I

I DK 175813 B1

Endelig er det klart, at nummereringen af amino-5yi.cj.ius kan ændres ved deletioner eller indføjelser af aminosyrer i proteasepolypeptidkæden, hvadenten de er skabt kunstigt eller ved mutagenese eller forekommer 5 naturligt i proteaser, der er homologe med PB9 2 protease. Det må imidlertid forstås, at positioner, der er homologe med aminosyrepositionerne af PB92 protease vil falder under kravenes rammer.

De følgende eksempler gives til nærmere belys-10 ning og ikke til begrænsning af opfindelsen.

Forsøgsafsnit

Materialer og fremgangsmåder 15

Konstruktion af PB92 proteasemutanter

Den grundliggende konstruktion ud fra hvilken mutagenearbejdet startede betegnes pM58 og er beskrevet 20 i detaljer i EP-A-0283075.

Den fulgte strategi omfattede tre faser: a. Konstruktion af mutagenesevektor M13M1 b. Mutering c. Konstruktion af pMS86Eco og subkloning af det mute-25 rede DNA-fragment ind i denne vektor.

1.a. Konstruktion af mutagenesevektor M13M1.

Den grundliggende konstruktion, pM58, digeste-30 redes med restriktionsenzymerne Hpal og Ball. Det 1400 bp fragment indeholdende PB92 proteasegenet oprensedes på lavtsmeltede agarose (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratoroty Manual, Cold Spring Harbor, 1982).

Vektoren M13MP11 (Messing et al., Nucl. Acid.

35 Res. 9, (1981) 303-321) digesteredes med Smal. Det re levante 1400 bp DNA-fragment ligeredes ind i denne

ΪϋΚ 175813 B1 I

JM101 efter frem- I

Prop. Natl. Acad. I

JM101, isoleredes I

80} 69-73), inser- I

søgtes ved DNA- I

gangsmåden beskre- I

ci. USA 74 (1977 ) I

tagenese, opnåedes I

beskrevet ovenfor I

nder anvendelse af I

[13mpl9 (Messing et I

03-321), idet den I

restriktionsenzy- I

store fragment op- I

evet af Kramer et I

9441-9456 med den I

ldtes i stedet for I

interne. I

er, der anvendtes I

itationer, var 22 I

anvendt til dan- I

ngen i en specifik I

se af et oligonu- I

lucleotider med al- I

fældigt i stederne I

yrerne, der skulle I

potentielle mutan- I

ikvensanalyse under i I

i I

I I

! I j I

DK 175813 B1 23 anvendelse af dideoxymetoden ifølge Sanger, se ovenfor.

Hele dot enkelt strengede; sLykke (ae figur IB j sekvense-redes til kontrol af fraværelsen af sekundære mutationer. Fremgangsmåden er vist skematisk i figur IB.

5 Den beskrevne fremgangsmåde er nyttig til dan nelse af DNA-fragmenter med mutationer i 3' delen af proteasegenet (aminosyrerne 154-269).

Det er klart for fagfolk, at alternative restriktionsenzymer kan anvendes til dannelse af DNA-10 fragmenter med mutationer i 5'-delen af proteasegenet i en Bacillus vektor, og at modificerede PB92 proteasege-ner kan konstrueres ved en fremgangsmåde analog til fremgangsmåden vist i figur 1A.

15 l.c. Konstruktion af pM586Eco og subkloning af DNA- fragmenter indeholdende mutationerne i denne vektor.

Til konstruktion af pM586Eco digesteredes pM58 20 med restriktionsenzymet EcoRI og ligeredes med T4 ligase under fortyndede betingelser. Ligationsblandingen anvendtes til transformation af B. subtilis 1-A40 (Bacillus Genetic stock Centre, Ohio) efter fremgangs-I måden ifølge Spizizen et al., J. Bacteriol. 81 (1961) 25 741-746.

Celler fra transformationsblandingen udpladedes på minimalplader indeholdende 20 pg/ml neomycin, som beskrevet i eksempel 1 af EP-A-0283075.

Plasmid DNA af transformanterne isoleredes efter 30 fremgangsmåden beskrevet af Birnboim og Doly, Nucleic j Acids Res. 7 (1979) 1513-1523, og karakteriseredes ved restriktionsenzymanalyse. På denne måde isoleredes pM586Eco (se figur lc).

Til fremstilling af mutantenzym subklonedes DNA-35 fragmenterne af M13M1 indeholdende den ønskede mutation, opnået som beskrevet i afsnit l.b. ind i

I DK 175813 B1 I

I 24 I

I pM486Eco. dsDNA af M13M1 (beskrevet ovenfor) digestere- I

des med EcoRI og ligeredes ind i EcoRI-stedet af I

I pM586Eco. Ligationsblandingen anvendtes til transforma- I

I tion af B. subtilis DB104, Doi, J. Bacteriol. (1984) I

I 5 160, 442-444, under anvendelse af fremgangsmåden ifølge I

I Spizizen at al., se ovenfor. I

I Celler fra transformationsblandingen udpladedes I

på minimalplader indeholdende 20 pg/ml neomycin og 0,4% I

I casein (EP-A-0283075). DNA af proteasedannende trans- I

H 10 formenter isoleredes efter fremgangsmåden beskrevet af I

I Birnboim og Doly, (se ovenfor) og karakteriseredes ved I

restriktionsenzymanalyse. I

I 2. Fremstilling af mutantproteaser. I

I 15 I

Transformanter af DB104, som man havde bestemt I

indeholdt vektoren med det muterede proteasegen, inoku- I

leredes i 10 ml Trypton Soya Broth (TSB) indeholdende I

20 yg/ml neomycin og inkuberedes i 24 timer ved 37°c. I

20 Prøver af kulturen (0,1 ml) inokuleredes i 500 ml ry- I

steflasker indeholdende 100 ml proteaseproduktionsmedi- I

um: 12,5 g/1 gærekstrakt (Difco), 0,97 g/1 CaCl2x6H20, I

I 2,25 g/1 MgCl2x6H20, 20 mg/1 MnS04x4H20, 1 mg/1 I

I CoCl2x6H20, 0,5 g/1 citrat, 0,5 ml/1 antifoam 5693, 6% I

25 w/v maltose, 0,2 M phosphatpuffer pH 6,8 og 20 pg/ml I

H neomycin. I

Efter inkubation i 65 timer under konstant be- I

luftning testedes proteaseaktiviteten af kulturerne un- I

der anvendelse af dimethylcasein som substrat og under I

30 anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Lin et al., I

J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. Til fremstilling af I

større repræsentative mængder af wild-type PB92 og mu- I

tant PB92 proteaser dyrkedes disse stammer også ved I

37°C i beluftede fermentorer med et volumen på 10 1 og I

H 35 under anvendelse af i det væsentlige samme produktions- I

medium som anvendt i rysteflaskerne. I

DK 175813 B1 25

De opnåede, flydende medier anvendtes til pro-Leaseoprensning.

3. Oprensning og koncentrering af vildtype PB92 protea-5 se og mutanter deraf.

Mutant- og vildtype PB92 proteaserne fremstillet med Bacillus subtilis DB104 i rysteflasker eller 10 1 fermentorer oprensedes ved kationbytterchromatografi 10 under anvendelse af Zeta-PrepR plader eller moduler (PS-type, LKB). Flydende fermenteringsmedier centrifu-geredes (3000 x g, 10 min), og supernatanten fortyndedes 10 gange med 10 mM natriumphosphatpuffer, pH 5,5, og overførtes dernæst til . kationbytteren. Efter vask 15 med adskillige modulvolumener og phosphatpuffere elue-• redes proteasen ved tilsætning af 0,4 m NaCl til phos- phatpufferen. Portioner indeholdende proteaseaktivitet forenedes og koncentreredes ved ultrafiltrering under anvendelse af en omrørt Amicon-celle, udstyret med et 20 PM-10-filter. NaCl-koncentrationen reduceredes til ca.

50 mM ved fortynding og koncentrering af proteaseopløs- ningen med phosphatpuffer, hvorefter den opbevaredes 0 ved -80 C ved en proteinkoncentration på mellem 1 og 10 mg/ml.

25 Til opsamling af PB92-proteasemutanter fra det flydende medium fra storskalafermenteringsmedier tilsattes alternativt CaCl2 (1 vægt%) og acetone (30 vægt%). Efter filtrering til fjernelse af alt cellemasse, fældedes proteasen fra det opnåede filtrat ved til-30 sætning af 0,2-2 vægt% CaS04x2H20 og ved yderligere tilsætning af acetone til en slutkoncentration på >60 vægt%. Bundfaldet skiltes fra ved filtrering og blev skyllet med acetone, hvorefter det tørredes til opnåelse af et råenzympulver (CEP).

I DK 175813 B1 I

I 26 I

I 4. Analysemetoder til undersøgelse af renheden af op- I

I rensede proteaser. I

I Proteaser betragtedes som rene, når ét bånd el- I

I 5 ler én top fandtes ved henholdsvis elektroforese og I

I højtydelsesgelelektroforese (HPLC). I

I Polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) udførtes i I

I tilstedeværelse af natriumdodecylsulfat (SDS) efter I

fremgangsmåden ifølge Laemmli, Nature, 227 (1970) I

I 10 680-685. Denaturering af proteinprøverne ved SDS ved I

I 100°C må imidlertid ske på forhånd ved inaktivering af I

I proteaseaktiviteten til hindring af selvnedbrydning. I

Dette kan udføres ved emulsion med phenylmethylsulfo- I

I nylfluorid (PMSF) (1 mM, 30 min, stuetemperatur) eller I

I 15 ved fældning med trichloreddikesyre (TCA, 8%, 30 min. I

på is). Naturlige PAGE udførtes ved pH 7,45 (gelpuffer I

bestående af 20 mM histidin (His) og 50 mM 3-(N-morpho- I

lino]propansulfonsyre (MOPS) i 5% polyacrylamidgeler I

(forholdet mellem acrylamid og bisacrylamid 20:1). Pro- I

20 teinprøver anbragtes på toppen af gelskiver og underka- I

stedes elektroforese mod katoden. Den samme His/MOPS- I

puffer anvendtes som elektroforese (tank) puffer, men I

ved pH 6,3. Efter elektroforese (l%-2 timer ved 350 V), I

udblødtes gelen i 8% eddikesyre til fiksering af pro- I

25 teinerne i gelen, hvorefter den farvedes med Coomassie I

Brilliant blå R250 og affarvedes efter standardmetoder. I

Renhedsundersøgelsen ved HPLC udførtes under an- I

vendelse af en kationbytterkolonne (MonoS-Pharmacia Fi- I

ne Chemicals) og en gelfiltreringskolonne (TSK 2000 I

H 30 SW-LKB). Den førstnævnte kørtes med 10 mM natriumphosp- I

H hatpuffer, pH 5,5, og eluering af den bundne protease I

H opnåedes ved hjælp af en lineær gradient fra 10-300 mM I

af natriumphosphat, pH 5,5. Gelfiltreringskolonnen kør- I

tes i 0,25M natriumacetat, pH 5,5. I

I DK 175813 B1 5. Bestemmelse af proteasekoncentrationen.

Til bedømmelsen af proteinkoncentrationen i en renset proteaseopløsning anvendtes 5 i) ekstinktionsmålinger ved 280 nm under anvendelse af den beregnede ekstinktionskoefficient (εΜ), og ii) titrering af aktivt sted.

10 Ekstinktionskoefficienten ved 280 nm beregnedes ud fra antallet af tryptofanenheder (cM = 5.600 M-1xcm-1·) og tyrosinenheder (εΜ = 1.330 pr.

enzymmolekyle. For PB92 protease anvendtes εΜ 26.100 M-1xcm-1 (3 Trp-, 7 Tyr-rester) svarende til e!* 15 ved 280 nm = 9,7 <Mr = 26.729 Da). For mutanter med ændrede antal Trp- og Tyr-rester udførtes tilsvarende korrektioner.

En bestemmelse af antallet af aktive enzymmolekyler opnåedes ved titrering af aktivt sted, idet den 20 vidt udbredt anvendte fremgangsmåde med N-transcinna-moylimidazol (M.L. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, (1966) 5890-5931) viste sig ikke at virke tilfredsstillende for PB92 protease udvikledes en fremgangsmåde under anvendelse af PMSF i stedet. Ved denne blandedes en 25 proteaseopløsning med en beregnet koncentration (ud fra absorptionen ved 280 nm) med henholdsvis 0,25, 0,50, 0,75, 1,00 og 1,25 ækvivalenter af PMSF, og man lod blandingen reagere i en time ved stuetemperatur i 10 mM natriumphosphat, pH 6,5. Enzymkoncentrationen skal være 30 mindst 50 μΜ.

Restaktiviteten måltes spektrofotometrisk under anvendelse af succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-propyl-L-phenyl-alanyl-paranitroanilid (sAAPFpNA) som substrat (se nedenfor). Renheden (og således koncentrationen) af i 35 PMSF bestemtes ved NMR-spektroskopi, og stamopløsninger fremstilledes i isopropanol. Resultatet af titreringen !

I DK 175813 B1 I

I 28 I

af det aktive sted viste sig at stemme overens med re- I

sultaterne af renhedsundersøgelsen ved HPLC. I

6. Bestemmelse af kinetiske parametre af vild-type- og I

I 5 mutant-proteaser. I

I l. Aktivitet på proteinsubstrater (casein) mål- I

I tes ved pH 10,0 som beskrevet i GB patentskrift nr. I

I 1.353.317 (udtrykt i ADU-enheder = Alkaline Delft I

I 10 Units). I

I 2. Turnover number med casein som substrat mål- I

tes i en pH-stat. Reaktionskammeret af pH-staten I

(Radiometer, København) indeholdt 10 ml 0,1M KCl med 50 I

mg casein (Hammerstein, Merck). Protoner, frigivet ved I

15 hydrolyse af casein med PB92 protease titreredes med 10 I

H mM NaOH, mens pH-værdien holdtes på 10,0 (ved 40°C og I

under en nitrogengasstrøm). I

3. Aktivitet på syntetiske peptider måltes under I

anvendelse af sAAPFpNA. Det dannede (gule) paranitroa- I

20 nilid (pNA) analyseredes spektrofotometrisk ved 410 nm: I

Η εΜ = 8.480 M-1xcm_1, (E.G. Delmar et al., Anal. I

I Biochem. 94 (1979) 316-320) med et UVIKON 860 (KONTRON) I

H spektrofotometer udstyret med en thermostateret seks- I

! positions celleomskifter. De kinetiske parametre, kcaj. I

25 og Km, opnåedes ud fra målinger af starthastigheden for I

forskellige substratkoncentrationer (for PB92 protease I

H fra 0,1-6,0 mM) tilpasning af dataene til en hyperbolsk I

H funktion under anvendelse af ikke-lineær regression med I

H multivariant-sekant-iterationsmetoden. Specificitets- I

30 konstanten kca^./Km beregnedes. Målingerne udførtes ved I

25°C i et slutvolumen på 1 ml indeholdende 0,1M TRIS- I

HC1 + 0,1M NaCl, pH 8,6. Natriumchloridet var nødven- I

H digt, idet PB92 protease i fraværelse deraf gav ikke- I

H lineære Lineleder-Burk-afbildninger, hvilket kunne I

35 skyldes substratinhibering. Substratet opløstes først i I

DMSO til en koncentration på 200 mM og fortyndedes der- I

I DK 175813 B1 næst med 0,1M TRIS-HCl, pH 8,6 til opnåelse af en stamoplysning iTicu 20 mri (bestemt spektroiotometrisk ved 315 nm; εΜ = 14.000 M_1xcm_1). Der udførtes ingen korrektioner for de varierende koncentrationer af DMSO 5 (0,05-3,0 vol%).

.7. Oxidation af PB92 protease.

Følsomheden af PB92 proteaserne mod oxidation 10 med H202 testedes efter fremgangsmåden beskrevet af Estell et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 6518-6521, med den afvigelse, at: i) 20 mM H202 anvendtes i stedet for 10 mM, og ii) 20 mM natriumperborat kombineret med 10 mM TAED an-15 vendtes som ekstraoxidant.

8. Vaskeevnetest PB92 proteasemutanter testedes ved en specielt 20 udviklet vasketest med anvendelse af bomulds- og poly-ester/bomuldsprøver tilsmudset med mælk, blod og blæk (5,0 x 5,0 cm, opnået fra EMPA, St. Gallen, Schweiz og betegnet med numerene 116 og 117), vasketestene udførtes i et Atlas Launderometer 25 LEF-FC, udstyret med rustfri ståltestbeholdere, der hver indeholdt et defineret vaskemiddel og proteasen, der skulle testes (PB92 proteasemutanter eller PB92 protease). Undtagen hvor andet er angivet, udførtes testene i 30 minutter ved en ønsket temperatur. Efter 30 vask lufttørres prøverne, og reflektansen af testklæderne måltes ved 680 nm med et Photovolt-fotometer (model 577) udstyret med et grønt filter. Reflektans-data opnået ved måling på testprøverne vasket med vaskemidler indeholdende de respektive PB92 proteasemu-35 tanter sammenlignedes med reflektansdata for en tilsvarende serie af målinger med vaskemidler indeholdende

SDK 175813 B1 I

intproteaserne I

B92 protease- I

iprotein (mg), I

reflektans, x I

2 proteasemu- I

s efter frem- I

ler hver inde- I

»lost i 250 ml I

3 bomulds- og I

jen af vaske- I

;gt% I

i,4 I

l, 3 I

>,8 I

i,o I

>,o I

.,5 I

L ,0 I

>,8 I

i,5 I

1,5 , I

LOO I

/algt, renset I

>å melem 0 og I

evand. En be- I

31 DK 175813 B1 holder anvendtes til testning af PB92 protease på samme måde til sammenligning. vasjeetestene udførtes ved 40 C. Resultaterne er vist i tabel i.

<

I DK 175813 B1 I

I 32 I

---— I

I E — I

+ C c f\){nwr»Ot-<ciH»eeo> QJ+J · O η Η H CM 00 H ·«*

I hen H I

4J U \ 0) X — E — (0 ro

Dj 4J

I (u 2 \ inor^inr'M^rO'fO <o I

5 * or-t nHHoionin tu w ή H ~ u Ό -w

4J

u ω

(D C

H +-> -H

I 5 ^ eo I

?5 g Q OHnr^cMMcswf'ir" h -5 “a ·.·.».*.«.·«.*.*»·>*» v

g * C- HHHHHHHOrtHH

Η I

r-4 O' c +j 'd * ,¾ d) H CM d) σ' -h +j o σ> in j O iw -w £ « (0

I m u -Η o α SdP ί ooor'hor^oeoovoinm I

S S ί -2 η οί oin^nn.rr-^ot-æo' I

· m O. .* -h u ^ ” - o w η m +i o.

-p I

i—i O I

(U >-l _=_ I

A CU ------

Η I

E-ι cm —

Η σ> dp I

PQ -P

ch ΰ) I

w η λ i'cvi o o o o into in I

M ro O <D C ro σ' O co σ' O' <M if> Γ*·

£ n 0) > H H

h h e u d) f~ I

Η ω o d> c a I

X) u-4 +j o ω I

<0 o X <d I

χ -η u .h > I

Η ω Q. 0)

Cd) Ό -w d) c cm Ό

σ' > σ\ ·η c I

H w d) cq ε o I

d) Ci d) ή h oooooHincooocon I

m Ai-P\ oæo»Htfi<M*-iOfMr~p'H I

inHtnraa>HHH cm h cm *-< I

ro -η ro μ

> +) > +) I

Η d> ό I

rød) I

(ΟΝ Ο I

ΰ) ή η

0) 4-> Ό Η I

CM I

Η ro £3 I

^· ro Di Ο I

Η 4J icnautfOOQOw« I

Ο CM\Dl0\0\0OOOtNOCM^r I

O'rHHHHO'OOHVOrHP') I

Q. CQfMlNCMCMHr-lr-tCNr-tCMiH I

H : cuszsswwwzwzw I

_ ____I

33 DK 175813 B1 ojcovoint^coo m <j\ co vo tn en co η «η

H

«»coooor^vo ho U

votoototn o O

N N N N n O) *Q

iH

2 0\n*Oi-CHHO NO ;g

k K Ih %· kk ·» ·· *h K

O Η (Ί Λ N (Ί OH *-

^ O

k.

VD

— — --- — -----— *

CD

^ 3= Λ (0 df> v wonit-'f'tooHfMOiin^fcninnH tn g jr}

4JOHHf')O^J,C010VOH^*,tOHr''CO 0\ ~ W

^ «“* H rH · m

o O »ffl -H

£ °0 ^ £ "ϋ s - rp $ -H *— iH > > a> ή o X! tnooointnoooininot^ininoo y -H .

ri rir't^coovooinotnt^i-icor^aii-too M'S S

&"· Η H tM CM (N Η Η H u-l U M UJ <D -H 3 > U-l Q. f-H ·Η o ϋ 8* & g tootncOfHOtnoooooonotntno tn a,

nt^'TvovotnOOinoeoeoo'Hnnp'in 2 - rJ

H H CM H CM CM CM Η H CM M > §.| c -μ c cj t . cr> o tj <

—--- *h m 0 L

T3 4J Jj <

r-H M m I

«>< J Η Λ ME-t ^-hTW

æ æ co co co co coco i tM m +> CM CM CM (M CM <M CM CM ΛίΦΟΛ

Η Η H HH H HH g H

u te u coco en en en g · h to wzaso osxencxcxkj -h a > 3 t^p't^r^co r-' r- r~ r-~ CM CM CM (M CM CM CM CM CM CM CM CM ni S C ..

HHHHH HHHHHHH 4J .C S M

Di Di B( h U Di Di Di Di Di Di Di h -P(l) - ~ ^ ^ - v » v s wflajeflin

HaMC*en>JiJ><M>-2SP!fcoiii £ w ø h oivovovovovovovotor^vovovoiokovovovo ccn^rn

VOHHHHCMCMCMCMCMHCMfMCNCMCMCNfM mjjjJC

hcmcmcmcmhhhhhcmhhhhhhh c o <d -h ESSEEtnencncnOiEwencntnenentn > μ-μ +> > v . . . . tu Oi'H ω QQOJJ>>>>Sh>>>>>>> S ,μ > 5 VDOOr^r^VD\D'DVOVDOt\DV£>VDVOVO\Dv£> cn σ\ JJ tn iTJCQ^* d) ^^»Η^γΗιΗι-ΗγΗγΗγΗιΗγΗγΗγΗιΗγΗγΗιΗ J> CL| (¾ ewcossoooowsaoooouu ____* * +

I DK 175813 B1 I

I I

I ° I

B. Vaskeevnetesten gentoges ved 25 C med samme vaske-

I middel indeholdende nogle af PB92 proteasemutanterne. I

I PB92 protease anvendtes igen som reference. De øvrige I

I testbetingelser var de samme som beskrevet ovenfor. I

I 5 Resultaterne er vist i tabel 2. I

Tabel 2 I

I

Vaskeevne af PB92 proteasemutanter ved 25 C i STPP-hol-

I 10 digt vaskepulver i forhold til vaskeevnen af PB92 pro- I

I tease (%). I

I Protease Vaskeevne (%) I

Vaskemiddelkoncentration i vaskevandet I

I 15 _4 q/1_ 7 q/1_ I

I M216S 90 80 I

I M216Q 95 80 I

I N212D 250 135 I

I S160D_185_120_ I

I 20 I

C. Vaskeevnen af proteaserne bestemtes også i et I

europæisk vaskepulver, der indeholdt phosphatblege- I

middel i et Launderometer ved 25 C og 40 C. PB92 pro-

tease anvendtes igen som reference. De øvrige testbe- I

25 tingelser var de samme som beskrevet ovenfor. Resul- I

taterne er vist i tabel 3. I

I DK 175813 B1

Tabel 3

Vaskeevne af PB92 proteasemutanter ved 25°C og 40°C i et europæisk vaskepulver, der ikke indeholder phosphat-5 blegemiddel, i forhold til vaskeevnen af PB92 protease (%)._

Protease Vaskeevne (%)

Vaskemiddelkoncentration i vaskevandet 4 g/1 7 g/1 4 g/1 7 g/1 0 0

10 _temperatur 25 C_temperatur 40 C

M216S 80 85 100 90 M216Q 80 80 120 100 N212D 170 105 200 75 S160D_170 105_230_165 15

Eksempel 2 PB92 proteasemutanten M216S testedes med hensyn til stabilitet under opbevaring i det pulverformige va-20 skemiddel IEC beskrevet i eksempel 1. Stabiliteten ved

O

opbevaring undersøgtes i klimaborde ved 30 C og 80% relativ fugtighed (RH). Proteasen til dette forsøg ind-kapsledes som følger:

Der fremstilledes en blanding indeholdende (i 25 vægt/vægt%): 2% renset protease, 50% ikke-ionisk overfladeaktivt middel (ethoxyleret C-^-C^g-alkohol ved 50-80 E.O.-enheder), 5% Ti02, 3-10% CaS04.2H20 og

Na2S04 til 100%. Blandingen opvarmedes til 65-90 C og afkøledes til stuetemperatur. Den opnåede faste blan-• 30 ding formaledes til partikler. Partikler med en diame ter på 0,5 til 1 mm sigtedes fra og anvendtes til opbevaringstestene i vaskemidler.

3,5 g af vaskepulveret IEC indeholdende mutant M216S i en koncentration på 6140 ADU/g vaskemiddel op-35 bevaredes i 18 ml1 s hætteglas. Til sammenligning opbevaredes PB92 protease under samme betingelser. Efter 2,

I DK 175813 B1 I

I 36 I

I 4, 5 og 6 uger måltes proteasernes restaktivitet. Re- I

I sultaterne er vist i tabel 4. I

Tabel 4 I

I I

I

Restaktivitet af PB92 protease og dens mutant M216S, I

H

efter opbevaring (i uger) ved 30 C og 80% RH i vaske- I

pulver_ I

I Protease Restaktivitet (%) I

10 _0 uger 2 uger 4 uger 5 uger 6 uger I

I PB92 protease 100 25 5 3 2 I

I M216S_100 68_31_20_11 I

I Eksempel 3 I

I

PB9.2 protease og forskellige PB92 proteasemu- I

tanter testede med hensyn til opbevaringsstabilitet i I

et vaskepulver. Ved testen for stabilitet under opbe- I

varing anvendtes proteaserne i en indkapslet form. I

20 Proteaseprodukterne fremstilledes ved blanding I

af de følgende komponenter ved 80 C. I

Komponent Væqt% I

AE1 50 I

25 Ti02 2 I

i

H protease (CEP) 7 I

PVP2 1,5 I

BHT3 1 I

H Na2S04 resten I

30 ' AE = C14-C18 alkoholpolyethoxylat. Alkoholen I

H var ethoxyleret med 50-80 ethylenoxid (EO)- I

H grupper. i I

H 2 PVP = polyvinylpyrrolidon Kl7 I

H * BHT = 2,6-bis(t-butyl)-4-methylphenol. I

H 35 I

Denne blanding indkapsledes ved prilling, idet I

væsentlige som beskrevet i britisk patentskrift nr. I

DK 175813 B1 37 1.603.640. Partikelfraktionen med en partikelstørrelse på mellem u,j og 0,8 mm anvendtes til bestemmelse af opbevaringsstabilitet af proteaserne. Den indkapslede protease (140 mg) blandedes med ALLR-base (6,4 g) og 5 natriumperborat-tetrahydrat (0,6 g). [ALL er et registreret varemærket fra Unilever N.V.]. Det anvendte ALL-basepulver indeholdt ikke enzymer eller blegemidler.

Enzym/vaskemiddel/natriumperborat-tetrahydrat- 0 10 blandingen inkuberedes ved 30 C og 80% relativ fugtighed (RH). I tabel 5 gives restaktiviteten efter opbevaring i det angivne tidsrum.

Tabel 5 15

Restaktivitet af PB92 protease og nogle mutanter deraf p efter opbevaring (i uger) ved 30 C og 80% RH i et ble- gemiddelholdigt vaskepulver_

Protease Restaktivitet (%) 20 _0 uger 1 uge 3 uger 5 uger PB92 protease 100 51 25 15 M216Q 100 94 84 52 M216S 100 89 83 50 S160D 100 47 20 9 25 N212D_100 59_31_19

Eksempel 4 1 PB92 protease og forskellige PB92 proteasemu- 30 tanter indkapsledes efter fremgangsmåden beskrevet i eksempel 3. I nærværende eksempel blandedes 70 mg indkapslet protease med en partikelstørrelse på mellem 0,3 og 0,9 mm imidlertid med 3,2 g af ALL og 0,3 g natriumperborat-tetrahydrat. Prøverne opbevaredes ved 0 35 30 C i 18 ml hætteglas i en vakuumeksikator. Vakuum påførtes (25 mm Hg) i de første 3 dage af opbevaringsperioden.

I DK 175813 B1 I

I

I Ved påføring af vakuum øgedes transporthastig- I

I heden for vanddamp, således at systemet nåede dets I

I ligevægt ved 80% RH hurtigere end systemet gør uden I

I påføring af vakuum. Den relative fugtighed på 80% I

I 5 etableredes med en mættet kaliumbromidopløsning. I

I I tabel 6 gives restaktiviteterne efter den an-

givne opbevaringsperiode (i uger). I

I Tabel 6 I

I 10 I

I Restaktivitet af PB92 protease og nogle mutanter deraf I

Η I

efter opbevaring ved 30 C og 80% RH i et blegemiddel-

holdlqt vaskemiddel_ I

Protease Restaktivitet {%) I

15 _0 uger 1 uge 2 uger 3 uger I

PB92 protease 100 27 22 14 I

M216Q 100 63 53 44 I

M216S 100 55 49 31 I

SI 6 OD_100_23_18_13 I

I 20 I

H Eksempel 5 I

Det følgende flydende vaskemiddel fremstilledes: I

I DK 175813 B1

Komponent Væqt% lineær c^Q-c^-aiKyiDenzen- I sulfonsyre 12 I C13-alkohol-polyethoxylat, 8 EO 13 I 5 laurinsyre 8 I oliesyre 4 I triethanolamin 6 I 1,2-propandiol 6 I ethanol 5 I 10 natriumcitrat 4 I diethylentriamin-pentaeddikesyre 0,3 I calciumformiat 0,12 I natriumformiat 1 I borax 1,9 I 15 NaOH, 25% vægt/vægt% opløsning til pH 11,2 I vand resten PB92 - protease og forskellige PB92 proteasemu- tanter sattes til denne blanding i en mængde til op- 20 nåelse af en startproteasekoncentration på 0,13 vægt/ vægt%.

Proteasestabiliteten (i % restaktivitet) bestemtes efter opbevaring af den proteaseholdige bian-0 ding ved 37 C i det angivne antal dage. Resultaterne er 25 vist i tabel 7.

I DK 175813 B1 I 40

I Tabel 7 I

I Restaktivitet af PB92 protease og nogle mutanter deraf I

I efter opbevaring ved 37°C i et flydende vaskemiddel I

5 Protease Restaktivitet (%) I

I _0 dage l dag il dage 15 dage 21 dage I

I PB92 protease 100 23 10 5 3 I

I S160D 100 57 30 14 8 I

I M216Q 100 59 32 18 9 I

I 10 M216S 100 45 18 10 5 I

I N212D_100 38_14_9_4 I

I i Eksempel 6 I

15 PB92 protease og nogle mutanter deraf formule- I

redes som. følger. Med hver protease fremstilledes en I

blanding af følgende komponenter: I

Komponent vaqt% I

Amylogum CLS 45 I

20 Sucrose 23 I

Sorbitol 17 I

Glycerol 4 I

paraffinolie 3 I

NaH2P04 0,5 I

25 Protease (CEP) 5,0 I

H PVP K17 1,5 I

I Ti02 1

H Ud fra disse blandinger fremstilledes granula- I

30 ter, i det væsentlige efter fremgangsmåden beskrevet i I

H eksempel 5 og US patentskrift nr. 4.242.219, bortset I

H fra at: 1) blandingen beskrevet i dette eksempel ud- I

H skiftes med den ovennævnte blanding; 2) der blev an- I

H vendt åbninger med en diameter på 0,7 mm i stedet 1,0 I

H 35 mm; 3) granulerne var ikke overtrukne. I

Disse granuler (140 mg) blandedes med ALL-base I

H (6,4 g) og natriumperborat-tetrahydrat (0,6 g) og an- I

H bragtes i 36 ml's hætteglas. I

I DK 175813 B1

Proteasestabiliteten (i % restaktivitet) bestemtes dcrr.xot efter Opbevar iuy af naettegiassene ved ; I

j 30°C og 80% RH i de angivne antal i uger. Resultaterne I

er vist i tabel 8. I

5 I

Tabel 8 I

Restaktivitet af granulater af PB92 og nogle mutanter I

0 I

deraf efter opbevaring ved 30 C og 80% RH i et blege- I

10 mlddelholdlqt vaskemiddel_ I

Protease Restaktivitet (%) I

_0 uger 1 uge 3 uger 5 uger I

PB92 protease 100 45 29 17 I

M216Q 100 93 66 45 I

15 M216S_100_90_70_41 I

Eksempel 7 I

Prillede produkter af PB92 protease og nogle mu- I

20 tanter deraf fremstilledes og blandedes med vaskesmid- I

del og blegemiddel som beskrevet i eksempel 3. , I

Opbevaringsstabiliteten af disse prøver (i % I

restaktivitet) bestemtes ved 30°C og 60/80% RH (skif- I

tevis 60% RH i 12 timer og 80% RH i 12 timer). Disse I

25 resultater er vist i tabel 9. I

I DK 175813 B1 I

I 42 I

I Tabel 9 I

I Restaktivitet af prillede produkter af PB92 protease og I

I nogle mutanter deraf efter opbevaring ved 30°C og I

5 60/80% RH____ I

I Protease Restaktivitet (%) I

_0 uger 1 uge 3 uger 5 uger I

PB92 protease 100 70 34 15 I

I M216Q 100 98 88 67 I

I 10 M216S 100 93 87 48 I

I S160D 100 67 35 10 I

I N212D_100_75_S3_26 I

Eksempel 8 I

I

Granulater indeholdende PB92 protease og nogle I

mutanter deraf fremstilledes og blandedes med vaske- I

middel og blegemiddel som beskrevet i eksempel 6. I

Opbevaringsstabiliteten af disse prøver (i % I

20 restaktivitet) bestemtes efter inkubation i de angivne I

tidsrum ved 30°C og en RH, der holdtes skiftevis på 60% I

i 12 timer og på 80% i 12 timer. Resultaterne er vist i I

tabel 10. I

25 Tabel 10 I

Restaktivitet af granulater af PB92 og nogle mutanter I

deraf efter opbevaring ved 30 C og 60/80% RH_ I

H Protease Restaktivitet (%) I

30 __0 uger 1 uge_3 uger 5 uger I

PB92 protease 100 54 39 28 I

H M216Q 100 93 81 67 I

H M216S_100_99_87_72 I

I DK 175813 B1

Eksempel 9 PB92 protease og nogle mutanter deraf testede med hensyn til opbevaringsstabilitet i et blegemiddel-5 holdigt vaskepulver ved 30°C og 80% RH. Til dette forsøg anvendtes proteaserne i en indkapslet form. Hver protease indkapsledes som følger:

O

Ved 80 C fremstilledes en blanding med den følgende sammensætning: 10

Komponent væqt%

Ikke-ionisk overfladeaktivt middel* 45 Ti02 2

Protease (CEP) 10 15 Na2S04 rest * Ikke-ionisk overfladeaktivt middel = C14-C18 alkohol-polyethoxylat (50-80 EO grupper)

Man lod den ovennævnte blanding afkøle til * 20 stuetemperatur. Den størknede blanding formaledes til mindre partikler. Partikler på 0,3 til 0,8 mm sigtedes ud og anvendtes til opbevaringsforsøget.

Til opbevaringsforsøget blandedes 140 mg af hver indkapslet protease ed 6,4 g ALL-base-vaskepulver og 25 0,6 g natriumperborat-tetrahydrat. ALL-base-pulveret indeholdt hverken enzym eller natriumperborat. ALL-ba-se/protease/natriumperborat/tetrahydratblandingerne in-

O

kuberedes ved 30 C og 80% RH.

Efter opbevaring i 0, 1, 2 og 4 uger bestemtes 30 proteasestabiliteten som procentvis restaktivitet for hver protease. Resultaterne er vist i tabel 11.

I DK 175813 B1 I

I 44 I

I Tabel 11 I

I Restaktivitet af PB92 protease og nogle mutanter deraf I

I efter opbevaring ved 30°C og 80% RH i et blegemiddel-1· I

I 5 holdiqt vaskepulver_ I

I Protease Restaktivitet (%) I

I _0 uger 1 uge 2 uger 4 uger I

I PB92 protease 100 61 36 12 I

; [S160D, M216Q] 100 78 58 35 I

I 10 ΓS160D, M216S) 100_86_68_39 I

I Eksempel 10 I

PB92 proteasemutanter testedes ved en vasketest I

15 under i det væsentlige de samme betingelser som beskre- I

vet i eksempel 1, bortset fra at 0,37 5 g flydende va- I

skepulver med den følgende sammensætning sattes til 250 I

Η I

ml vand med 5 GH i Launderometerbeholderen.

H 20 Komponent vægt% I

H Laurinsyre 8 I

Oliesyre 4 I

Lineær C-LQ-C^-alkylbenzen- I

sulfonsyre 12 I

25 C13-alkoholpolyethoxylat, 8 EO 13 I

Triethanolamin 6 I

1,2-propandiol 6 I

Ethanol 5 I

Natriumhydroxid, 45% vægt/vægt% 4 I

30 Natriumcitrat 4 I

H Vand til 100 I

(pH i vaskevandet 7,2) I

Vaskeevnen af de forskellige proteaser i dette I

H 35 flydende vaskemiddel bestemtes i en Launderometer ved I

H 25 C i 30 minutter. Efter vask måltes reflektansen I

__ _^ DK 175813 B1 45 af testklæderne som beskrevet i eksempel 1. Vaskeevnen af iTiuLåiiLpLuieaseiriie bestemtes som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne er vist i tabel 12.

5 Tabel 12

Vaskeevne af PB92 proteasemutanter ved 25°C i et fly- dende vaskemiddel______

Protease Vaskeevne Specifik aktivitet 10 i forhold til PB92 __protease (%)_ 212D + 100 160D + 73 S160G, N212D + 76 15 M216S 0 40 M216Q_0_37_ 0: 100% ± 20% vaskeevne i forhold til PB92 protease {bevaret vaskeevne).

20 +: >120% vaskeevne i forhold til PB92 protease.

<80% vaskeevne i forhold tli PB92 prptease.

Vaskeevnen af de forskellige proteaser bestemtes i de kommercielt tilgængelige, flydende vaskemidler, 25 TideR, WiskR og ArielR. De rustfri stålbeholdere indeholdt enten 0,375 g Tide i 250 ml vand med 5°GH, 0,375 g Wisk i 250 ml vand med 5°GH eller i,25 g Ariel i 250 0 0 ml vand med 15 GH. Vaskeevnen bestemtes ved 25 C eller o 40 C. De øvrige betingelser var de samme som beskrevet 30 i eksempel 1. Resultaterne er vist i tabel 13.

I DK 175813 B1 I

I 46 I

I Tabel 13 I

I Vaskeevne af PB92 proteasemutanter i Tide, Wisk og I

I

Ariel ved 25 C oq 40 C_

5 ____ I

I Protease Tide Wisk Ariel I

I 25*C 40*C 25*C 40*C 40*C I

N212D + + + + 0 I

10 S160D + + + + + I

M216Q 0 + 0 + + I

I M216S ND 0 0 0 0 I

S160Q - - - - I

I S160H 0 I

15 S160K - - _ _ I

I S160A I

S160D, M216Q + + + + + I

I S160D, M216S 0 - + + 0 I

I M117L, M216Q ND - ND 0 I

20 M117L, M216S ND - ND - I

ND = Ikke bestemt I

0: 100% ± 20% vaskeevne i forhold til PB92 protease. I

25 +: >120% vaskeevne i forhold til PB92 protease. I

<80% vaskeevne i forhold tli PB92 prptease. I

Eksempel 11 I

30 Vaskeevnen af PB92 proteasemutanter bestemtes I

ved en statistisk fuldskalavaskemaskinetest ved TNO, I

Delft, Holland {Cleaning Techniques Research Insti- I

H tute). Vaskeevnen af disse mutanter sammenlignedes med I

vaskeevnen af PB92 protease. I

H 35 Alle proteaserne doseredes i IEC-vaskemiddel på I

basis af proteinvægt (0,007 vægt/vægt%). På basis af I

aktivitet gav disse doser: I

I DK 175813 B1 PB92 protease 1460 ADU/g vaskemiddel H216S b/9 ADU/g vaskemiddel M216Q 479 ADU/g vaskemiddel SI6OD 1080 ADU/g vaskemiddel 5 N212D 1455 ADU/g vaskemiddel

For hver vaskemiddel-proteaseblanding udførtes 8 0 tests ved 40 C i identiske AEG Turnamat twinup-vaske-maskiner. I hver vaskemaskine anvendtes 170 g vaskemiddel. Under testene anvendtes de undersøgte vaske-10 midler på en sådan måde, at hvert pulver undergik samme antal vaskecyklusser i hver maskine.

Under testene anvendtes normalt ledningsvand som det fås i byen Delft med følgende middelspecifikationer: 15 alkalinitet (M): 2,2 mmol/1 hårdhed (H) : 1,6 mmol/1 (9 GH)

temperatur : 20°C

Fjernelse af smuds og farvestof fra testtøjet 20

Under hvert testforløb vaskedes 6 prøver af tre typer af EMPA-smuds på bomuld (nr. 111, 116 og 117) sammen med det tilsmudsede vasketøj. Fjernelsen af smuds og farvestof fra det kunstigt tilsmudsede test-25 klæde bestemtes ved at sende tristimulus blåt lys vinkelret på testklædet. Mængden af lys, der tilbagesend- 0 tes fra testtøjet i en mængde på 45 maltes, i overensstemmelse med I EC publikation 456 sattes reemissions-værdien for magnesiumoxid til 100. Des højere reemis-30 sionsværdi jo bedre vaskeproces for en bestemt slags smuds.

I DK 175813 B1 I

I 48 I

I Belastning af vaskemaskinen I

I Vaskemaskinerne fyldtes til en belastning på I

I 4,75 kg bestående af testklæder og vasketøj, der var I

I 5 blevet snavset ved normal brug. I

Vasketøjet bestod af: I

I 6 viskestykker I

I 4 stykker undertøj I

I 4 lagner I

I 10 4 pudebetræk. I

Om nødvendigt suppleredes med rene lagner og I

pudebetræk til opnåelse af den krævede belastning. I

H Vasketøjet udvalgtes omhyggeligt til hver vaske- I

I proces. Hvert stykke tøj, der udvalgtes til en af ma- I

I 15 skinerne havde en ligeså snavset modpart, der vaskedes I

i en af de andre vaskemaskiner. På denne måde var I

smudsbelastningen den samme under hver proces. I

Parametre ved vaskeprocessen I

I 20 I

Η I

Program__40 C_ I

vandmængde under hovedvask 19 1 I

Tid til opnåelse af den højeste temperatur 13 min I

25 Den højeste temperatur 43 C I

Vasketid 45 min I

I Vandindtag 7 1 I

Η I

Temperatur efter fortynding af vaskevand 30 C I

I Afløb 17 1 I

30 5 Skylninger med ca. 17 liter koldt vand hver I

Middelværdierne for reemissionen (V) og forhol- I

det (R) bestemtes efter 8 vasketests. Resultatet af to I

H uafhængige forsøg er vist i tabel 14A og 14B. I

DK 175813 B1 49

Tabel 14A

Fjernelse af kunstigt smuds 5 Protease EMPA prøveemne nr. Total _m_116_y7_

_V RVRVRV R

PB92 protease 49 1,00 44 1,00 56 1,00 149 1,00 M216S_49 1,00 46 1,05 58 1,04 153 1,03 10

Tabel 14B

Fjernelse af kunstigt smuds 15 Protease EMPA prøveemne nr. Total ._m_Π6_m_

_V RVRVRV R

PB92 protease 41 1,00 35 1,00 46 1,00 123 1,00 M216S 40 0,96 33 0,94 42 0,91 115 0,93 20 M216Q_42 1,01 35 0,99 43 0,94 120 0,98 1 tabel 15 divideredes forholdene (R) opnået ud fra de statistiske fuldskalavaskemaskinetests med det tilsvarende forhold (R' ) beregnet ud fra vaskeevnevær- 25 dierne i forhold til PB92 protease opnået ud fra Laun- derometervasketesten under samme betingelser (10 g/1 I EC, testklæderne EMPA 116 og 117, vasketid 30 minut- 0 ter, temperatur 40 C).

I DK 175813 B1 I

I 50 I

I Tabel 15 I

I Korrelation mellem fuldskalavaskemaskinetest og Launde- I

I rometervasketest _ I

I 5 Protease_R/R1_ I

PB92 protease 1,00‘ I

M216S 1,18 ' I

I M216Q 1,10 I

I S160D 1,02 I

I 10 N212D_. _0,98_ I

‘pr. definition I

Værdierne for R/R' for mutantprotease nærved I

1,0 viser korrelation mellem fuldskalamaskintests og I

15 Launderometertests. I

Eksempel 12 I

Fig. 2A og 2B viser vaskeevnen i 4 g IEC/1 af I

20 forskellige PB92 proteasemutanter i overensstemmelse I

H i med testene beskrevet i eksempel 1 i forhold til na- I

H turligt PB92 protease som en funktion af deres speci- I

fikke aktivitet. Tallene i figurerne henviser til de I

H følgende mutantproteaser: I

I 25 I

1 PB92 protease 11 M216P I

I 2 M216A 12 M216T I

I 3 M216C 13 M216W I

I 4 M216S 14 M216I I

I 30 5 M216L 15 M216G I

6 M216E 16 M117L, H118D I

I 7 M216K 17 M117L, M216Q I

8 M216H 18 M117L, H118D, M216Q I

g M216N 18 M117L, M216S I

I 35 10 M216Q 20 M117L, H118D, M216S I

DK 175813 B1 I

121 M169S 31 S259K I

22 M216Y 32 W235R I

23 M169I, M216S 33 H243R I

24 M216-OX 34 H243R, S259K I

5 25 N212S 35 D175N I

26 N212D 36 E134K I

27 S160G, K212D 37 W235R, S259K I

28 L211Y 38 W235R, H243R I

29 L211Y, N212S 39 S259K I

1030 A166D, M169I 40 T207K I

41 S160N 51 S160I I

42 S160G 52 S160G, M216S I

43 S160P 53 S160G, M216Q I

15 44 S160T 54 S160L I

45 S160C 55 S160Y I

46 S160Q 56 S160D, M216S I

47 S160D 57 G116V, S126V, P127E, S128K I

48 S160K 58 S126L, P127N, S128V I

20 49 S160R 59 G116V, S126L, P127Q,' S128A I

50 S160A 50 G116V, S126V, P127M I

61 S126M, P127A, S128G I

62 G116V, S126Y, P127G, S128L I

25 63 G116V, S126N, P127H, S128I I

64 G116V, S126H, P127Y I

65 G116V, S126R, P127S,. S128P I

66 G116V, S126P, P127Q

67 G116V, S126G, P127Q, S128I

30 68 G116V, S126F, P127L, S128T

69 G116V, S126Q, P127D

Fig. 3 viser vaskeevnen i 7 g IEC/I for forskellige PB92 proteasemutanter ved testene beskrevet i eks-35 empel 1 i forhold til naturlig PB92 protease som en funktion af deres specifikke aktivitet. Tallene i figu- H DK 175813 B1 ren henviser til de samme mutantproteaser som tallene i figurerne 2A og 2B.

Alle publikationer (herunder patentansøgninger) nævnt i nærværende beskrivelse angiver den kendte tek-5 nik, som den nærværende opfindelse bygger på. Alle pub-likationer er inkorporeret heri ved henvisning i samme H omfang, som hvis hver enkelt publikation specifikt og H individuelt var angivet som værende inkorporeret heri H ved henvisning.

H 10 Skønt opfindelsen i det foregående er beskrevet med hensyn til nogle detaljer ved hjælp af eksemplifi- cering for at gøre den klarede og lettere at forstå, | er det klart for fagmanden, at mange ændringer og modi- fikationer kan udføres uden, at man går uden for opfin- H 15 delsen idé og rammer.

li

Claims (13)

1. Mutantprotease til anvendelse i vaskemidler, I kendetegnet ved, at den tilsvarende vild- I typeprotease har mindst 70%'s homologi med aminosyre- I 5 sekvensen i PB92 serin-proteasen, som har følgende I aminosyresekvens: I HjN-A-Q-S-V-P- I W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-SH3-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H- I P-D-L-N-I-R-C-G-A-S-F-V-P-d-E-P-S-T-S-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A- I A-L-N-N-S-I-G-V-L-G—V-A-P-H-A-E-L-Y-A-V-R-V-L—G-A-S-G-S-G-S-V-S-S- I

2. Mutantprotease ifølge krav l, kendetegnet ved, at enzymet er PB92 serin-protease-mutant [M216Q]; [M216S]; [S160D, M216 Q] eller [S160D, M216S].

3. DNA-Sekvens, som koder for en mutantprotease som defineret i krav 1 eller 2,

4. Ekspressionsvektor, som har en DNA-sekvens som defineret i krav 3.

5. Prokaryotisk værtsstamme transformeret med en 30 ekspressionsvektor ifølge krav 4.

6. Transformeret prokaryotisk værtsstamme ifølge krav 5, hvori nævnte værtsstamme er en Bacillus. H DK 175813 B1 I

7. Transformeret prokaryotisk værtsstamme ifølge I krav 6, hvori nævnte Bacillus er en alkalofil Bacil- I lus I

8. Transformeret prokaryotisk værtsstamme ifølge I 5 krav 7, hvori den alkalofile Bacillus er Bacillus I nov. spec. PB92 eller en mutant deraf. I

9. Transformeret prokaryotisk værtsstamme ifølge I H krav 8, hvor nævnte værtsstamme forud for transforme- I H ringen var i det mindste i det væsentlige ude af I H 10 stand til at danne ekstracellulære proteaser. I

10. Fremgangsmåde til fremstilling af en mutant- I protease som defineret i krav 1 eller 2,kende- I tegnet ved, at man dyrker en værtsstamme- I mikroorganiske transformeret med en ekspressionsvek- I 15 tor, som har en DNA-sekvens, der koder for en mutant- I protease, hvorved nævnte mutantprotease frembringes; I og man udvinder nævnte mutantprotease. I

10 I-A—Q-G - L- E-W-A-G -N-N-G-M-H-V-A-N-L-S -L-G-S -P-S-P-S-A-T-L-E -Q-A-V- I N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A- I ν-α-Α-Τ-Ο-Ο-Κ-Κ-Ν-ΙΙ-Α-ε-Ρ-β-Ο-Υ-β-Α-Ο-Ιί-Ο-Ι-ν-Α-Ρ-σ-ν-Ν-ν-Ο-β-Τ-Υ- I P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S -Μ-A-T - P-H-V-A-G -A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S -W-S - I N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R- I COOH; I 15 idet den afviger ved i det mindste en aminosyre- I Isubstition på et udvalgt sted svarende til stilling I 216. nævnte PB92 serin-protese fra methionin til se- I rin eller glutamin; og med forbedret stabilitet og I bevaret vaskeevne i forhold til den tilsvarende vild- I 20 typeprotease.

11. Vaskemiddelsammensætning omfattende en eller I flere mutantproteaser som defineret i krav 1 eller 2. I

12. Anvendelse af en eller flere mutantproteaser I I som defineret i krav l eller 2 i et vaskemiddel. I

13. Anvendelse af en eller flere mutantproteaser I som defineret i krav l eller 2 i en vaskeproces. I