LT3963B - Enzymatic product containing mutant proteolytic enzyme, process for selecting proteolytic enzyme, mutant gene, expression vector, procariotic host-strain, process for preparing mutant proteolytic enzyme, detergent composition - Google Patents

Enzymatic product containing mutant proteolytic enzyme, process for selecting proteolytic enzyme, mutant gene, expression vector, procariotic host-strain, process for preparing mutant proteolytic enzyme, detergent composition Download PDF

Info

Publication number
LT3963B
LT3963B LTIP1650A LTIP1650A LT3963B LT 3963 B LT3963 B LT 3963B LT IP1650 A LTIP1650 A LT IP1650A LT IP1650 A LTIP1650 A LT IP1650A LT 3963 B LT3963 B LT 3963B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
protease
amino acid
mutant
enzyme
enzymatic product
Prior art date
Application number
LTIP1650A
Other languages
English (en)
Inventor
Christiaan Albertus Vaneekelen
Leonardus Johannes S Mulleners
Johannes Cornelis Vanderlaan
Onno Misset
Roelck Anneke Cuperus
Johan Herman Albert Lensink
Original Assignee
Gist Brocades Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8199752&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT3963(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gist Brocades Nv filed Critical Gist Brocades Nv
Publication of LTIP1650A publication Critical patent/LTIP1650A/xx
Publication of LT3963B publication Critical patent/LT3963B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

Šis išradimas susijęs su naujų proteolitinių fermentų, naudojamų plovikliuose, savybių pagerinimu. Šios savybės apima geresni nešvarumų šalinimą skalbimo kompozicijose, padidintą stabilumą laikant skalbimo milteliuose ir padidintą stabilumą paruoštose ploviklių muilo putose.
Fermentinių priedų, konkrečiai proteolitinių fermentų, panaudojimas ploviklių kompozicijose, padaręs Įmanomą baltyminių nešvarumų šalinimą, yra pakankamai dokumentuotas. Pavyzdžiui, žr. publikuotas Europos patentų paraiškas (EP-A-) 0220921 ir 0232269, JAV patentus Nr. Nr. 4 480 037 ir Re 30 602, straipsni Production of Microbial Enzymes (Mikrobinių fermentų gamyba), Microbial Technology, 1 (1979) 281-311, Academic Press.
Ploviklių mišiniai gali būti miltelių, skysčio ir pastos pavidalu. Jų aktyviąja medžiaga gali būti vienas ar daugelis anijoninių, nejoninių, katijoninių, cviterjoninių ar amfoterinių junginių. Tokie junginiai yra plačiai aprašyti Schwartz, Perry ir Berch Surface Active Agents, 11, Interscience Publishers (1958). Be to, juose gali būti granuliuojančių, stabilizuojančių, aromatizuojančių junginių ir atskirais atvejais oksidantų, paprastai vadinamų balinimo medžiagomis. Ploviklių mišiniai yra naudojami kietų paviršių valymui, tualetų tvarkymui, indų plovimui (rankomis ir automatuose) ir skalbimui.
Skalbimui naudojami plovikliai dažniausiai yra dviejų pagrindinių tipų, skysti ar milteliai. Skystuose plovikliuose gana didelė paviršiaus aktyvių medžiagų koncentracija, neutralus arba šiek tiek šarminis pH, dažniausiai be balinimo medžiagų. Miltelių pavidalo plovikliai dažniausiai yra stipriai šarmiški (putų pH 9-11), juose yra inhibitorių, tokių kaip natrio trifosfatas ir, priklausomai nuo taikomo skalbimo būdo tose šalyse, kur jie parduodami, gali būti su balinimo priemonėmis ar be jų.
Šiuo metu į skalbimo kompozicijas fermentai dedami skystų suspensijų, žolių arba granulių pavidalu. Pavyzdžiui, miltelių tipo detergentųose proteolitiniai fermentai paprastai yra kapsulių (granulių) formoje (pavyzdžiui, Maxatase ir Maxacal ) arba granuliatų formoje (pvz., Savinase ir Alcalase ). Maksatazę ir Maksakolį išleidžia firma International Bio- Synthetic
B.V. Rijswijk, Olandija), Savinazę ir Alkalazę - firma NOVO Industry A/S (Bagsvaerd, Danija). Skystuose plovikliuose fermentai dažniausiai yra ištirpę.
Proteolitiniai fermentai, kaip taisyklė, blogai derinasi su skalbimo kompozicijomis. Fermentai turi būti stabilūs ir neprarasti aktyvumo skalbiant, pavyzdžiui, šalinant baltymų dėmes 10 -60°C intervale ir aukštesnėje temperatūroje. Be to jie turi likti stabilūs skalbimo produkte ilgai juos laikant. Atitinkamai, fermentai turi būti stabilūs ir funkcionalūs ir tuo atveju, kai didelis šarmingumas, o kai kada, esant balinimo priemonėms ir aukštoje temperatūroje.
Kadangi nėra universalių ploviklių, kaip nėra ir universalių skalbimo sąlygų (pH, temperatūra, tirpalo koncentracija, vandens kietumas) visame pasaulyje, reikalavimai fermentams skiriasi, priklausomai nuo ploviklio, su kuriuo jie panaudojami, ir skalbimo sąlygų.
Sąlygos, turinčios įtakos fermentų stabilumui miltelių pavidalo plovikliuose, kaip taisyklė, nėra optimalios. Pavyzdžiui, laikant miltelių ploviklius, kuriuose yra fermento, nežiūrint tariamo fermento ir ploviklio komponentų fizinio atsiribojimo fermento kapsulinės formos dėka, ploviklio oksidantai veikia proteazę, mžindami jos aktyvumą. Kita fermento nestabilumo ploviklio milLT 3963 B teliuose priežastis ta, kad fermentas laikant hidrolizuoja pats save, ypač esant didelei drėgmei. .
Dar daugiau, ploviklio milteliuose esančių oksidintojų trūkumas, kuris turi įtakos dėmių pašalinimo efektyvumui skalbiant skalbyklose, yra tas, kad baltymų dėmės fiksuojamos audiniuose. Be oksidintojų ir kiti ploviklio komponentai, inhibitoriai, sumažina proteazės efektyvumą, šalinant dėmes.
Skystų ploviklių atveju, susiduriame su tokia svarbia problema, kaip sparti fermento inaktyvacij a, ypač aukštose temperatūrose. Kadangi fermentai tokiuose plovikliuose tirpioje būklėje, dezaktyvacija vyksta jau laikant, to pasėkoje fermento aktyvumas žymiai krenta dar iki ploviklio panaudojimo. Anijoninės paviršiaus aktyvios medžiagos, tokios kaip alkilsulfatai kartu su vandeniu ir kitais komponentais ypač linkę negrįžtamai denatūruoti fermentą, padarydami jį neaktyvų ir netinkamą atlikti proteolotinį skaldymą.
Iš dalies fermento stabilumo skystuose mišiniuose problemą išsprendžia mišinio modifikavimas, pavyzdžiui, stabilizatorių, mžianančių fermento inaktyvavimą, priedai. Žr. Europos patentų paraiškas Nr. 0126505 ir 0199405, JAV patentą Nr. 4318818 ir Didžiosios Britanijos patento paraišką Nr. 2178055A.
Kitas būdas stabilizuoti fermentą skystuose plovikliuose pateiktas Europos patento 0238216 paraiškoje, kurioje fermento molekulės ir skysta agresyvi ploviklio matrica atskiriamos ypatingos mišinio paruošimo technologijos dėka. Ploviklių milteliams gaminti siūlomi alternatyvūs kapsuliavimo variantai (pvz., žr. Europos patento paraišką Nr. 0170360).
Tuo, kas pasakyta, susumuotos sąlygos, kurias reikia sukurti, norint, kad proteolitinis fermentas optimaliai funkcionuotų ploviklyje, taip pat susumuoti apribojimai šiuo metu skalbimo kompozicijose naudojamiems fermentams. Nežiūrint visų pastangų apsaugoti fermentą skalbimo kompozicijose, vis tiek daug jo aktyvumo prarandama laikant ir naudojant įprastose sąlygose.
Naujų fermentų identifikavimas ir skyrimas, norint juos panaudoti apibrėžtose srityse, pavyzdžiui ploviklių gamybai, turi būti vykdomi keliais būdais. Vienas šių būdų - tai parinkimas organizmų ar mikroorganizmų, pasižyminčių norimu fermentiniu aktyvumu, (mikro)organizmo arba skystos (mikro)organizmo kultūros paruošimas, fermento skyrimas ir gryninimas, o taip pat fermento biocheminių savybių nustatymas ir tikrinimas, ar šios biocheminės savybės atitiks panaudojimo reikalavimus. Kai tokio fermento ar jį produkuojančio mikroorganizmo neįmanoma išskirti, gali būti taikoma genų inžinerijos technologija, fermentą koduojančio geno skyrimas, geno ekspresija kitame organizme, išryškinto fermento išskyrimas ir gryninimas ir jo tinkamumo numatytoje srityje tyrimas.
Kitas būdas gauti naujiems fermentams, tinkamiems panaudoti numatytoje srityje - tai egzistuojančių fermentų modifikavimas, kas tarp kitų, gali būti pasiekta cheminiais metodais (žr. I.Svendsen, Carsberg Res. Comm. 44, (1976) 237-291) . Kaip taisyklė, tokie metodai visai nespecifiški, tai išryškėja modifikuojant visas prieinamas liekanas įprastose šoninėse grandinėse arba tada, kai modifikacija priklauso nuo modifikacijai tinkamų aminorūgščių buvimo, be to dažnai neįmanoma modifikuoti sunkiai prieinamų aminorūgščių, neišskleidus fermento molekulės. Tokiu būdu, reikia manyti, kad fermento modifikacijos būdas, taikant koduojančio geno mutagenezę yra perspektyvesnis.
Mutagenezė gali būti atsitiktinė arba sait-specifinė. Atsitiktinė mutagenezė, veikiant visą mikrooęganizmą cheminiu mutagenu arba mutagenezę iššaukiančiu spinduliavimu, savaime suprantama, gali modifikuoti ir fermentą. Tuo atveju reikia turėti labai efektyvų atrankos metodą, įgalinantį išryškinti nepaprastai retus mutantus su pasirinktomis savybėmis. Didelis mutantinių fermentų išskyrimo patikimumas atsitiktinės mutagenezės būdu gali būti pasiektas, klonuojant koduojantį geną, atliekant jo mutagenezę in vitro arba in vivo ir koduoto fermento ekspresiją, pakartotinai klonuojant koduojantį geną tinkamoje ląstelėje-šeimininke. Ir šiuo atveju turi būti taikomi efektyvūs biologinės atrankos būdai, turint tikslą atrinkti reikalingus mutantinius fermentus (žr. Tarptautinę patento paraišką WO 87/05050), šiais biologinės atrankos būdais nebūtinai bus gauti fermentai, tinkami naudoti plovikliuose.
Specifiškesnis modifikuotų fermentų gavimo būdas yra sait-specifinė mutagenezė, leidžianti specifiškai pakeisti vieną ar kelias aminorūgštis bet kuria kita amino rūgštimi. Europos patento Nr. 0130756 paraiškoje pateiktas tokios technologijos pavyzdys, kai ekspresavus mutantinės protezės genus, vėliau buvo gauti modifikuoti proteolitiniai fermentai.
Neseniai sait-specifinės mutagenezės galimybės buvo pademonstruotos, panaudojant mutageninius oligonukleotidus, susintetintus iš įvairių bazių keliose norimose padėtyse. Tuo pasiekiama eilė įvairių mutacijų, kurios įterpiamos į specifinę DNR sekos dalį, pritaikant vieną sintetinį oligonukleotido preparatą, tai parodyta šiuose darbuose: Hui ir kiti, EMBO J. 3 (1984) 623-629; Matteucci ir kt., Nucl. Acids. Res., 11, (1983) 31133121; Murphy ir kt., Nukl. Acids. Res. 11 (1983) 76957700); Wells ir kt., Gene, 34 (1985) 315-323; Hutchinson ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986)
710-714 ir F.M. Ausubel, Current Protocols in Molecular
Biology 1987-1988. Greene Publichers Association and
Willey, Interscience, 1987.
Jau Stauffer su bendr., (J.Biol. Chem. 244 (1969) 53335338) aptiko, kad veikiant vandenilio peroksidu, Carlsberg subtilizino metioninas 221 padėtyje oksiduojasi į sulfoksidimetioniną ir yra atsakingas už žymų aktyvumo suma žė j imą.
Dviejų būdų mutagenezės, atsitiktinės ir sait-specifinės, rezultate, iš Bacillus amyloliquefaciens serino protezės, kuri dar vadinama ”BPN' subtilizinu, buvo išskirti ir charakterizuoti modifikuoti mutantiniai fermentai. Patente WO 87/05050 aprašytas termostabilesnis BPN' subtilizino mutantas. Europos patento paraiškoje Nr. 0150756 pasakyta, kad sait-specifinė visų 19kos BPN' subtilizino aminorūgščių mutagenezė metionino 222 padėtyje, panaudojant kasetins mutagenezės metodą, gali duoti fermentus, atsparius vandenilio peroksidui. Tačiau pastaruoju atveju daugumos mutantų proteolitinis aktyvumas yra žemas. Rasta, kad geriausi mutantai yra M222A ir M222S, kurių specifinis aktyvumas buvo atitinkamai 53% ir 35% palyginus su natyvaus BPN subtilizino aktyvumu (žr. Estell ir kt. J. Biol. Chem. 260, (1985) 6518-6521) .
Ankstesniame darbe, kuriant modifikuotas proteazes, parodyta, kad galima gauti BPN' subtilizino mutantus su pakitusiu stabilumu ir pakitusiomis kinetinėmis charakteristikomis (žr. ankstesnes nuorodas, ir kitas, pvz., Rao ir kt. , Nature, 328 (1987) 551-554. Bryan ir kt. Proteins, 1 (1986) 326-334. Cunningham ir Wells. Protein Engineering, 1 (1987) 319-325. Russel ir kt. J. Mol. Biol. 193 (1987) 803-819. Katz ir Kossiakoff. J. Biol. Chem. 261 (1986) 15480-15485, o taip pat apžvalgas Shaw, Biochem. J. 246 (1987) 1-17 ir Gait ir kt. Protein Engineering, 1 (1987) 267-274. Tačiau nė vienas iš šių šaltinių nepaskatino geresnių ir.plovikliuose stabilesnių proteolitinių fermentų pramoninės gamybos. Nė vienu iš proteazių modifikavimo atvejų neįvertinti jų komercinė reikšmė kai ir pranašumas prieš šiuo metu plovikliams apibrėžtose sąlygose panaudojamus fermentus.
Vienas iš šio išradimo objektų yra nauji mutantiniai proteolitiniai fermentai, gauti ekspresuoj ant genus, koduojančius šių fermentų aminorūgščių sekas, besiskiriančias mažiausiai viena aminorūgštimi nuo atitinkamo laukinio tipo fermentų. Šie mutantiniai fermentai pasižymi geresnėmis savybėmis, naudojant juos plovikliuose, ypač skalbimo detergentuose. rekomenduojama išradimą realizuoti PB92 serino proteazėse.
Kitas išradimo objektas yra nauji fermentiniai plovikliai su proteolitiniu fermentiniu produktu, kuriame yra mažiausiai vienas iš tokių naujų mutantinių proteolitinių fermentų.
Dar vienas šio išradimo objektas yra efektyvus mutantinių proteolitinių fermentų atrankos būdas, iš viso tuzino fermentų atrenkant labiausiai tinkamus naudoti plovikliuose. Tokie fermentai gaunami mutagenizuotos proteazės genų ekspresijos būdu.
TRUMPAS FIGŪRŲ APRAŠYMAS
Fig.1 A pavaizduota mutacijos vektoriaus, turinčio PB92 proteazės geną, konstrukcija.
Fig.1 B schematiškai pavaizduota naudojama mutacijos procedūra.
Fig.1 C parodyta ekspresijos vektoriaus, turinčio mutantinį PB92 proteazės geną konstrukciją.
Fig.2 A, 2 B ir 3 pavaizduota skalbimo efektyvumo priklausomybė nuo įvairių PB92 proteazės mutantų specifinio proteolitinio aktyvumo įvairiose skalbimo sąlygose.
Fig. 4 parodyta PB92 proteazės geno nukleotidų seka ir koduoto fermento pirmtako aminorūgščių seka.
DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
Išsireiškimas pasižymintis geresnėmis savybėmis, kuris šiame aprašyme vartojamas aptariant, mutantinius proteolitinius fermentus , suprantamas, kaip proteolitiniai fermentai, kurių plovimo galia arba stabilumas, išsaugant plovimo galią, yra padidinti, lyginant juos su atitinkama laukinio tipo proteaze.
Šiame aprašyme terminas mutantinio proteolitinio fermento plovimo galia suprantamas, kaip mutantinio proteolitinio fermento papildomas indėlis į skalbimo procesą, lyginant su plovimo kompozicijos veikimu be fermento, atitinkamose skalbimo sąlygose.
Išsireiškimas atitinkamos skalbimo sąlygos vartojamas pažymėti sąlygoms, kaip antai: skalbimo temperatūra, trukmė, skalbimo mechanizmai, tirpalo koncentracija, ploviklio tipas ir vandens kietumas, kurie realiai būna namų sąlygomis naudojant pramoninius ploviklius (detergentus).
Terminas padidinta plovimo galia vartojamas, norint pažymėti geresnį galinį rezultatą, šalinant dėmes atitinkamose skalbimo sąlygose, arba kad sunaudojama mažiau mutantinio proteolitinio fermento masės, tam paLT 3963 B čiam rezultatui gauti, negu naudojant laukinio tipo fermentą.
Išsireiškimas išsaugota plovimo galia vartojamas, nurodant, mutantinio proteolitinio fermento plovimo galią, paskaičiuotą jo masei, kuri sudaro ne mažiau 80% laukinio tipo proteazės plovimo galios atitinkamose skalbimo sąlygose.
Terminas padidintas stabilumas pavartotas, nurodant didesnį mutantiniu proteolitinių fermentų stabilumą plovikliuose ir juos laikant, ir/arba jų stabilumą putose, ir ši sąvoka apima atsparumą oksidantų, inhibitorių poveikiui, autolizei, paviršiaus aktyvių medžiagų ir šarminės aplinkos veikimui, lyginant su atitinkamu laukinio tipo fermentu.
Biocheminės savybės, nustatytos aprobuotose labaratorinėse sąlygose, nėra labai patikimi rodikliai, norint atspėti konkrečios ploviklio proteazės elgesį užsiduotose sąlygose. Šios pastabos taikomos ir kinetiniams rodikliams, gautiems panaudojant griežtai apibrėžtus baltyminius substratus, tokius kaip kazeinas, dimetilkazeinas ir hemoglobinas arba oligonukleotidiniai substratai, pavyzdžiui, SAAPFpNA (sukcinil- L-alanilL-alanil- L-prolil- L-fenilalanil- para-nitroanalidas). Be abejo, kiti proteazių požymiai apsprendžia jų, kaip skalbimo detergentų, efektyvumą.
Šis išradimas paremtas išsiaiškinimu to, kad, nežiūrint egzistuojančių baltymų aminorugščių modifikacijos metodų, kurie gali sukelti esminius jų biocheminių rodiklių pakitimus, vis dar labai menkai galima numatyti specifinės mutacijos įtaką realiose taikymo sąlygose, jeigu tai aplamai įmanoma.
io
Sutinkamai su šiuo išradimu, po intensyvių tyrimų ir eksperimentavimo buvo rastas mutantinių proteazių gavimo būdas, kuriame mutantinių proteazių paruošimas suderintas su efektyvia proteazių atrankos pagal jų veikimą metodika. Visai netikėta buvo tai, kad šiuo būdu pagal jų veikimą gali būti atrinktas palyginti didelis fermentų skaičius.
Išradimo test-sistema paremta proteazėms jautrių dėmių pašalinimu iš audinių pavyzdžių, panaudojant prietaisą, kuriuo nustatomas audinio atsparumas skalbimo arba temperatūros poveikiui, imituojant atitinkamas skalbimo sąlygas. Kai tinkami testai gali būti panaudoti firmos EMPA (Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Šveicarija) komercinių audinių gabalėliai dirbtinai sutepti baltyminėmis dėmėmis. Kitos dėmės, kuriomis buvo suteršti audinių pavyzdžiai proteazėms tirti - tai kraujas, žolė, šokoladas ir kt.
Be to, tokioje test-sistemoj e kiti atitinkami faktoriai, tokie kaip: ploviklio sudėtis, putų koncentracija, vandens kietumas, skalbimo mechanizmai, trukmė, pH ir temperatūra turi būti reguliuojami taip, kad pakartotų tipiškas namų ūkio arba tam tikros rinkos sferos sąlygas.
Proteazių plovimo galią paprastai nustato pagal jų gebėjimą pašalinti tam tikras charakteringas dėmes atitinkamose tyrimo sąlygose. Šis sugebėjimas gali būti nustatytas atspindžio matavimais, audinio gabalėlius išskalbus su fermentu ar be jo, prietaise audinių atsparumui matuoti arba tergotometre. Laboratorinė išradimo test-sistema turi pliusų imituotose namų ūkio sąlygose tiriant DNR mutagenezės būdu modifikuotų proteolitinių fermentų panaudojimą.
u
Atitinkamai išradimas leidžia testuoti daugelį įvairių fermentų ir atrinkti tuos iš jų tuos, kurie, labiau tinka naudojamo ploviklio tipui. Tokiu keliu gali būti atrinkti pagaminti pagal užsakymą fermentai, skirti panaudoti ypatingose sąlygose.
Kai kurias bakterines serino proteazes vadina subtilizinais. Subtilizinai - tai Bacillus subtilis, Bacillus amyloliąuefaciens (BPN1 subtilizinai) ir Bacillus licneni f orinis (Carisberg'o subtilizinas) . Žr. apžvalgą Markland ir Smith (1971) The Enzymes (Bayer ed.), 3t., 561-608, Academic Press, New-York. Kai kurie alkalofiliniai Bacillus kamienai produkuoja kitokias proteazes. Pastarųjų pavyzdžiu gali būti Maksakalio serino proteazės, toliau žymimos kaip PB92 proteazės (iš naujos rūšies PB92 Baccilus genties) ir anksčiau minėta Savinazė.
PB92 proteazės aminorūgščių seka parodyta Fig. 4. Pilna proteazė susideda iš 269 amino rūgščių, jos molekulinė masė apie 27000 D, jos izoelektrinis taškas sutampa su aukšto šarmingumo reikšmėmis. Proteazės PB92 aktyvumas baltyminio substrato atžvilgiu išreiškiamas šarmingumo Delta vienetais (ŠDV). Aktyvumas ŠDV nustatomas pagal metodiką, pateiktą Didžiosios Britanijos patente Nr.1353317, išskyrus tai, kad vietoje pH 8,5, matuojama prie pH 10. Grynintos PB92 proteazės aktyvumas 21000 ŠDV. Katalitinė konstanta (kcat) , matuojant su kazeinu, yra 90 sek'1.
Gryninto Karlsbergo subtilizino specifinis aktyvumas (Delange ir Smith. J. Biol. Chem. 243 (1968) 2184) yra 10000 ŠDV/mg. BPN' subtilizino (Matsubora ir kt., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1125) - iki 7000 SDV/mg. Be tokių rodiklių, kaip specifinis aktyvumas ir KcatPB proteazė skiriasi nuo Karlsbergo subtilizino, BPN' subtilizino ir kitų tipų proteazių, panaudojamų plovikliuose (pvz., Maksatazėje ir Alkalazėje), tuo, kad turi didelį teigiamą krūvį, kas gali būti vizualiai nustatyta, atliekant natūralaus baltymo gel-elektroforezę (žr. eksperimentinę dalį 4) .
Kadangi PB92 proteazė aktyviai šalina dėmes šarminėje aplinkoje, ją paprastai naudoja kaip priedą plovikliuose kartu su kitais jų komponentais, tokiais kaip: paviršiaus aktyvios medžiagos, struktūrikliai ir oksidantai. Pastarieji komponentai dažniausiai naudojami miltelių pavidalu. Šalinant dėmes, PB92 proteazė pasižymi didesniu aktyvumu, negu kiti anksčiau minėti subtilizinai. Tai reiškia, kad PB92 proteazės reikės mažiau, norint gauti tą patį skalbimo efektą.
PB92 proteazės, kaip ir kitų žinomų plovikliuose naudojamų serino proteazių, didelis trūkumas yra polinkis oksiduotis (žr. Stauffer ir kt.., J. Biol. Chem., 244 (1969) 5333-5338; Estell ir kt. J. Biol. Chem. 263 (1985) 6518-6521). PB92 proteazės oksidacija vandenilio peroksidu arba perrūgštimis, susidarančiomis aktyvatoriaus sistemoje, kurioje yra perborato tetrahidratas, sumažina fermento aktyvumą atitinkamai iki 50% ir 10% (ŠDV), palyginus su neoksiduota PB92 proteaze (žr. Eksperimentinę dalį, 1 ir 7 pavyzdžius).
Šio išradimo būdu labai sėkmingai gali būti gaunami ir atrenkami mutantiniai proteolitiniai fermentai, kilę iš natūraliomis sąlygomis bakterijų produkuojamų serino proteazių. Tokių mutantų pavyzdžiu gali būti mutantai, koduojami geno, gauto iš laukinio tipo alkalofilinio Bacillus kamieno, geriausiai PB92, geno. Taip pat tinka ir mutantai, gauti iš šarminės serino proteazės Savinazės (Bacillus} . Be to šis būdas gali būti sėkmingai panaudotas atrenkant modifikuotas proteazes iš proteazių, besiskiriančių nuo alkalofilinių Bacillus PB92 kamienų serino proteazių. Pavyzdžiui, yra žinomi genai, koduojantys Bacillus suotilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis serino proteazes, ir jie gali būti panaudoti kaip mutagenezės objektai. Akivaizdu, kad norint įvykdyti efektyvią proteazes geno mutaciją, gali būti panaudota tiek sait-specifinė mutagenezė, dalyvaujant oligonukleotidui, tiek ir nukreipta į visą sritį atsitiktinė mutagenezė, arba bet kuri kita mutagenezės rūšis.
Mutantinių proteolitinių fermentų atrankos būdas (apimantis mutantų gavimą ir atskyrimą) susideda iš šių stadijų; mutagenezė klonuoto geno, koduojančio norimą gauti proteolitinį fermentą ar jo fragmentą; gauto mutantinio proteazes geno ar genų išskyrimas; mutantinio proteazes geno ar genų įvedimas į atitinkamą kamienąšeimininką, geriausiai pasinaudojant tinkamu vektoriumi, ekspresijai ir fermento gaminimui; gautos mutantinės proteazes išskyrimas ir pagerintų savybių mutantinės proteazes, tinkamos panaudoti plovikliuose, identifikacija.
Mutantinių proteazių produkavimui tinkami kamienai-šeimininkai - tai linkę trnsformuotis mikroorganizmai, kuriuose gali būti gauta proteazių ekspresija. Ypač tam tinka tos pačios genties ir rūšies kamienai-šeiminikai, iš kurių proteazes yra išskirtos, tarp jų yra ir Bacillus kamienai, bet labiausiai pageidaujamas nauja Bacillus PB92 rūšis ir jos mutantai, turintys iš esmės tas pačias savybes. Rekomenduojami taip pat kamienai iš
B. subtilis, B. licheniformis ir B.amyloliquefaciens. Kiti tinkami ir rekomenduojami kamienai-šeimininkai, tai tie kamienai, kurie iš esmės nesugebėjo produkuoti neląstelinių proteolitinių fermentų prieš transformaciją mutantinių genu. Ypatingai dėmesio verti Bacillus kamienai-šeiminikai, pasižymintys proteazes deficitu, tokie kaip nauja Bacillus PB92 rūšis. Proteazes ekspresija pasiekiama panaudojant ekspresijos signalus, iš14 ryškėjančius pasirinkatame kamiene-šeiminike. Ekspresijos signalai įjungia DNR sekas, reguliuojančias proteazės genų transkripciją ir transliaciją. Tinkami vektoriai sugeba replikuotis, sudarydami pakankamai didelį kopijų skaičių pasirinktame kamiene-šeimininke, arba proteazės genas patvariai įsitvirtina kamiene-šeimininke, įvykus chromosominei integracijai.
Pagal šį išradimą mutantiniai proteolitiniai fermentai gali būti gauti, kultivuojant atitinkamose fermentacijos sąlygose transformuotą kamieną-šeimininką, turintį pageidaujamą mutantinį proteolitinį geną arba genus, vėliau išskiriant gautus fermentus.
Rekomenduojama, kad ekspresuotos proteazės būtų sekretuojamos į kultūrinę terpę, kas palengvintų jų išskyrimą, arba gram-teigiamų bakterijų kamienų-šeimininkų atveju, susikauptų periplazmoje. Sekretavimui naudojama aminorugščių signalinė seka, geriausiai tam tinka signalinė seka, koduojama inicijuojančio geno, jeigu jis funkcionalus pasirinktame kamiene-šeimininke.
Sutinkamai su vienu iš išradimo aspektų, gali būti sukurti plovimo galios tyrimo metodai, kai pakartojamos bet kokios namų skalbimo sąlygos, atitinkančios rinkos siūlymus. Pavyzdžiui, sukurtas metodas tirti Europos rinkos padiktuotomis griežtomis sąlygomis naudojamus skalbimo miltelius, kuriuose panaudojami miltelių komponentai su balinimo medžiagomis arba be jų, kai ploviklio koncentracija tirpale 1-10 g/l, vandens kietumas 10-20°KL (kietumo laipsniai) ir temperatūra 25-80°C. Konkrečiau, ploviklis susideda iš miltelių komponentų, jame taip pat yra TAED ir perboratas, ploviklio koncentracija tirpale 4,7 ar 10g/l, temperatūra 15°C ir 4 0°C.
Be to, pateikiami bandymo metodai, imituojantys skalbimą skystais plovikliais. Tokių ploviklių koncentracija paprastai būna 1,5-5 g/1 tirpalo, esant 5-10°KL, temperatūros intervalas 15-40°C. Konkrečiau, panaudojamos skystos skalbimo kompozicijos be balinimo priemonių, esant ploviklio koncentracijai 1,5 g/1 tirpalo, 5°KL ir 25-40°C, kas atitinka sąlygas, taikomas Europoje skystiems plovikliams.
Gali būti sukurti ir kiti plovimo galios išbandymo būdai, atitinką kitas rinkos diktuojamas sąlygas. Tiriant kokią specialią skalbimo yptybę, panaudojami audinių pavyzdžiai. Konkrečiai, pavyzdžiai iš EMPA 116 ir 117, ištepti dėmėmis, kurias gali veikti proteazė, iš dalies audiniai, ištepti krauju, žole, šokoladu arba baltyminiais produktais.
Gamtoje randamų arba patyrusių natūralią mutaciją proteazių savybė gali būti sustiprintos, sukialiant fermente eilę mutacijų. Dažniausiai mutacijos yra pavaduojamo pobūdžio, kaip konservatyvaus, taip ir nekonservatyvaus tipo, tačiau taip pat gali būti delecijos ir intarpai.
Konservatyviems lentele: pakeitimams
Alifatinės Neutralios nepoliarinės G,A,P
poliarinės L, I, C, M,
Turinčios krūvi, anijoninės D, E
katijoninės K, R
Aromatinės F, H,
V
S, T, N, Q
W, Y gauti galima pasinaudoti kur bet kuri aminorūgštis gali būti pakeista kita tos pačios kategorijos aminorūgštimi, tarp jų ir .esančia toje pačioje eilutėje. Be to, poliarinės aminorūgštys N, Q gali pakeisti arba būti pakeistos turinčiomis krūvį aminorūgštimis. Šio išradimo tikslams ypatingai įdomūs pakeitimai, sustiprinantys proteazės anijoninę prigimti, ypač su aktyviais centrais nesusijusiose vietose .
Mutacijoms ypač svarbios tos aminorūgštys, kurios lokalizuotos srityje, per 4A nutolusioje nuo inhibitoriaus molekulės Eglin C, kai Eglin C susirišęs su aktyviu saitu.
Žemiau pateikta numeracija, pasiremiant PB92 proteazės struktūra, tačiau tie samprotavimai tinka ir kitoms homologiškoms serino proteazėms, iš dalies proteazėms, kurių homologiškumas viršija 70%, o ypač, kai viršija 90%. Šios padėtys - tai: 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198, 203-216, ir pagrindinė nurodytų padėčių dalis turi būti prieinama betarpiškam kontaktui su baltyminiu substratu. Paprastai, 32, 62, 153 ir 215 padėtyse nesiekiama daryti pakeitimų, kadangi mutacijos šiuose saituose sumažina plovimo galią.
Ypatingą reikšmę pakeitimio prasme turi šios padėtys: 60, 62, 94, 97, 102, 105, 116, 123-128, 150, 152, 153, 160, 183, 203, 211, 212 ir 213-216·. Kai kuriose padėtys turės tendenciją pakeisti neatsparią oksidinimui aminorūgšti, pavyzdžiui metioniną, atsparesne, pavyzdžiui treoninu, tuo pačiu išsaugant šioje padėtyje bendrą konformaciją ir aminorūgšties tūrį. Kaip buvo pastebėta kitose situacijose, gamtinės aminorūgšties pakeitimas bet kuria kita aminorūgštimi gali pagerinti rezultatus, ypač, pakeičiant hidroksilintas aminorūgštis S ir T poliarine, nepoliarine arba netgi aromatine aminorūgštimi.
Ypatingo susidomėjimo verti šie pakeitimai:
G116 I,V,L
S126 bet kuri aminorūgštis
P127 bet kuri aminorūgštis
S128 bet kuri aminorūgštis
S160 anijoninė ar neutrali aminorūgštis, arba R A166 turinti krūvi,, ypač anijoninė aminorūgštis M169 neutrali alifatinė, geriau nepoliarine aminorūgštis N122 anijoninė aminorūgštis
M216 alifatinė poliarinė, ypač S, T, N, Q
Netikėta buvo tai, kad tuo metu, kai daugelis mutacijų sumažina specifini, proteazės aktyvumą įprastų substratų atžvilgiu, jų plovimo galia lieka tokia pat arba padidėja, palyginus su natyviais fermentais, daugeliu atvejų padidėja stabilumas laikant.
Kai kurių PB92 proteazės mutantų plovimo galia, išreiškus ją kaip atvirkščią dydį santykiniam fermento kiekiui, kuris būtinas norint pasiekti tą patį efektą kaip ir natyvinių proteazių atveju, padidėja iki 120%, kai kuriais atvejais - iki 180%.
Dar vienas išradimo aspektas - tai, kad gaunami PB92 proteazės mutantai, kurie, palyginus su natyvia PB92 proteaze, yra stabilesni, laikant miltelių pavidalo skalbimo kompozicijoje su balinimo priemone, o jų plovimo galia nepakinta. Tokių mutantų pavyzdžiu gali būti M216S ir M216Q, kurie turi ne mažiau vienos iš nurodytųjų mutacijų šalia mutacijų kituose saituose.
Dar vienas išradimo aspektas yra tas, kad netikėtai pastebėta, kad skystoje skalbimo kompozicij oj e . (be oksidintojo) PB92 proteazės mutantai M216S, M216Q, S160D ir N212D išsaugo savo aktyvumą geriau negu PB92 proteazė. Iš paminėtų mutantų M216S ir M216Q išsaugo plovimo galią, o S16OD ir N212D ją dar pagerina. Laikant nurodytame skystame ploviklyje, stabilumas ypač padidėja turint S160D ir M216Q mutantus. Taip pat galima derinti kelias mutacijas, didinant proteazės stabilumą skalbimo kompozicijose. Kelios mutacijos, teigiamai veikiančios vienos ir tos pačios proteazės plovimo galią, gali susijungti viename mutavusios proteazės gene, tuo atveju gali būti gautos dar geresnės proteazės, pavyzdžiui [ S126M, P127A, S128G, S160D] ir [ G116V, S126N, P127S, S128A, S160D] . Nauji proteazės mutantai gali būti gauti, derinant gerą jų plovimo galią, pavyzdžiui, dėka N212D ir S160D mutacijų, su geresniu stabilumu dėl M216S ir M216Q mutacijų. Pavyzdžiui, mutantai [S160D, M216S] pasižymi stipresne plovimo galia ir didesniu stabilumu laikant.
Vertingi mutantai gali būti gauti, derinant bet kurią mutaciją su eile šiame skyriuje aprašytų mutacijų. Be to galima derinti aprašytas mutacijas su mutacijomis kituose saituose, rezultate jos gali iš esmės pakeisti fermento savybes arba jų nepakeisti.
Rekomenduojami šio išradimo realizacijos variantai PB92 proteazėje gali būti tokie: [ M216S] ; [ M216Q] ; [ N212D] ; [ S160D] ; [ S160G, N212D] ; [ S160D, M216Q] ; [ S160D,
M216S] ; [ A166D, M169I] ; [ G116V, S126V, P127E, S128K] ;
[ G116V, S126G, P127Q, S128I] ; [ G116V, S126L, P127N,
S128V] ; [ G116V, S126L, P127Q, S128A] ; [ G116V, S126V,
P127M] ; [ G116V, S126H, Pi27Y] ; [ G116V, S126R, P127S,
S128P] ; [ G116V, S126F, P127Q] ; [ G116V, S126F, P127L,
S128T] ; [ S126M, P127A, S128G] ; [ S126M, P127A, S128G,
S160D] ir [ G116V , S126N, P127S, S128A, S160D] .
Norint pailiustruoti šiame išradime panaudoto naujų plovikliams tinkamų proteazių gavimo būdo svarbą, t.y. išbandymą tipiškose skalbimo sąlygose, naudojant kaip pirminės atrankos kriterijų, PB92 proteazės mutantų plovimo galios tyrimo rezultatai buvo lyginami su biocheminiais rodikliais, dažniausiai nustatomais biocheminiuose ir enzimologiniuose baltymų tyrimuose. Palyginimo rezultatai leidžia padaryti išvadą apie tai, kad nėra jokio ryšio tarp plovimo galios ir rodiklių, lemiančių giminingumą pasirinktiems substratams bei proteolitinių reakcijų kinetiką (žr. 1 lentelę, 1 pavyzdyje) .
Tokiu būdu, savaime aišku, galima apjungti du ar daugiau mutantus su skirtingomis savybėmis viename fermentiniame produkte arba tame pačiame skalbimo procese. Toks derinimas gali turėti arba neturėti sinergetinio poveikio.
Išradimas taip pat apima vieno ar kelių proteolitinių mutantinių fermentų panaudojimą skalbimo kompozicijoje arba skalbimo procese.
Ir pagaliau aišku, kad delecija arba aminorūgščių intarpai proteazės polipeptidų grandinėje, įterpti dirbtiniu būdu mutagenezės pagalba arba atsiradę natūraliai proteazėse, homologiškose PB92 proteazei, gali pakeisti aminorūgščių numeraciją. Tačiau būtina paaiškinti, kad padėtys, homologiškos padėtims PB92 proteazėje, taip pat įeina į teisių turinį.
Išradimo iliustravimui siūlome šiuos pavyzdžius, tačiau be išradimo apribojimų.
EKSPERIMENTINĖ DALIS
Medžiagos ir metodai
1. PB92 proteazes mutantų konstravimas
Bazinė konstrukcija, nuo kurios pradedama mutagenezė, pažymėta kaip pM58 ir detaliai aprašyta Europos patento paraiškoje Nr.0283075.
Konstravimo strategiją sudaro sekančios trys fazės:
1. a. Mutagenezės vektoriaus M13M1 konstravimas.
1. b. Mutacijos atlikimas.
1. c. Vektoriaus pM58 Eco konstravimas ir mutacinio DNR fragmento subklonavimas šiame vektoriuje.
1. a. Mutagenezės vektoriaus M13M1 konstravimas.
Bazinė konstrukcija pM58 surenkama restrikcijos fermentų Hpal ir Bali pagalba. Fragmentas iš 1400 bazių porų, turintis PB92 proteazes geną, gryninamas žemos lydymosi temperatūros agarozėje (Maniatis, Molecular cloning. Laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1982).
Vektorius M13MP11 (Messing ir kt., Nukl. Acids Res. 9, (1981)303-321) sukonstruojamas, panaudojant Smal. Anksčiau gautas DNR fragmentas iš 1400 bazių porų įstatomas į šį vektorių ir transformuojamas į E. coli JM101 pagal metodiką, aprašytą Cohen su bendr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, (1972) 2110-2114.
Po faginio padauginimo E. coli JM101, išskiriamas ssDNR fragmentas, (Heidecker ir kt., Gene 10, (1980) 69-73., intarpas ir jo orientacija kontroliuojami DNR sekvenaLT 3963 B vimu (Sanger ir kt. Proc. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 74 (1977) 6463.
Rezultate gaunamas mutagenezei atlikti tinkamas vektorius, kuris pažymėtas M13M1. Aprašyta procedūra schematiškai pavaizduota Fig.lA.
1. b. Mutacijos atlikimas.
Mutagenezė atliekama panaudojant M13M1, su šio vektoriaus ssDNR ir M13mpl9 su dsDNR (Messing ir kt., Nucleic Acids Res. 9, (1988)303-321), po to pastarasis vektorius pritaikomas restrikcijos fermentais EcoRI ir Hind III, vėliau išgryninat didįjį fragmentą žemos lydymosi temperatūros agarozėje.
Mutagenezė atliekama pagal Kramer ir kt. metodiką: Nucl. Acids Res., 12 (1984) 9441-9456, pakeitus joje tai, kad mutantų atrankai vietoje E. coli WK 30-3 panaudojama E. coli JM105.
Specifinių mutacijų sukūrimui naudojami oligonukleotidai susideda iš 22 nukleotidų. Specifinės mutacijos sritis, kuri panaudojama kelių mutacijų sukūrimui vienu metu specifinėje DNR sekoje, gaunama, panaudojant 40 nukleotidų preparatą turintį visus keturis nukleotidus netvarkingai įterptus į saitus, atitinkančius pasirinktą mutacijai aminorūgštį ar rūgštis.
Po mutagenezės kiekviena potencialių mutantų mutacija buvo tikrinama, sekvenuojant didezoksi metodu (Sanger, žr. aukščiau). Visas vienos grandinės fragmentas (žr. Fig.l B buvo sekvenuojamas, norint patikrinti, ar nėra antrinių mutacijų. Metodika schematiškai parodyta Fig.l B.
Išdėstyta procedūra gali būti panaudota, norint sukurti DNR fragmentus su mutacijomis proteazės geno .3' gale (aminorūgštys 154-269).
Norint sukurti DNR fragmentus su mutacija proteazės geno 5' gale Bacillus vektoriuje, gali būti panaudoti alternatyvūs restrikcijos fermentai ir gali būti sukonstruoti modifikuoti PB92 proteazės genai pagal metodiką, analogišką metodikai, parodytai Fig.1 A.
1. c. Vektoriaus pM585Eco konstravimas ir mutacinių DNR fragmentų subklonavimas šiame vektoriuje (Fig. 1 C).
Norint sukonstruoti pM58 δ Eco, pM58 buvo skaldomas restrikcijos fermentu Eco RI ir praskiedimo sąlygose liguojamas su T4 ligaze. Gautas ligavimo mišinys buvo panaudotas B. subtilis 1-A40 (Bacillus genetinių kamienų centras, Ohio) transformacijai pagal Spizizen ir kt., J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746.
Ląstelės iš transformacijos mišinio buvo perkeltos į minimalias lėkšteles su 20 ųg/ml neomicino, kaip aprašyta Europos patento Nr.0283075 1 pavyzdyje.
Plazmidinės DNR transformantai išskiriami pagal Birnboim ir Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523, ir charakterizuoti analizuojant restrikcijos fermentais. Tokiu būdu buvo išskirtas pM58δ Eco (žr. Fig.1 c).
Norint gauti mutantinį fermentą, DNR fragmentai M13M1, turintys pageidaujamas mutacijas, sukauptas, kaip aprašyta 1 b skyriuje, buvo subklonuoti į ρΜ58δΕοο. M13M1 dsDNR (aprašyta aukščiau) buvo skaldoma su EcoRI ir liguojama į pM58 Eco saitą EcoRI. Ligavimo mišinys panaudojamas transformuoti B. subtilis DB104, Doi, J. Bacteriol. (1984) 160, 442-444, panaudota Spizizen ir kt. metodą (žr. aukščiau).
Ląstelės iš transformacijos mišinio perkeliamos į minimalias lėkšteles su 20 ųg/ml neomicino ir 0,4%_kazeino (Europos patentas Nr. 0283075). Proteazės, produkuojančios transformantus, DNR buvo išskirta pagal metodą, aprašytą Birnboim ir Doly, (žr. aukščiau) ir charakterizuota, analizuojant restrikcijos fermentų pagalba.
2. Mutantinių proteazių gavimas.
Transformantais DB104, kuriuose aptiktas vektorius su mutaciniu proteazės genu, užsėjama 10 ml triptono sojos buljono (TSB) , į kuri, pridėta 20 ml ųg/ml neomicino, ir inkubuojama 24 vai. 37°C temperatūroje. Kultūros mėginiais (0,1 ml) užsėjamos 500 ml tūrio kratyklinės kolbos su 100 ml terpės proteazei gaminti: 12,5 g/1 mielių ekstrakto (Difco) , 0,97 g/1 CaCl2.6HO, 2,25 g/1
MgCl2.6H2O, 20 mg/1 MnSO4.4H2O, lmg/1 CoC12.6H20, 0,5 g/1 citrato, 0,5 ml/1 putų gesintojo 5693, 6% (svor./tūr.) maltozės, 0,2 M fosfatinio buferio pH 6,8 su 20 μ/ml neomicino.
Po 65 vai. inkubavimo, pastoviai maišant, matuojamas proteazės aktyvumas pagal Lin ir bendr. metodiką, (J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793) su substratu dimetilkazeinu. Norint gauti didelius kiekius laukinio tipo PB92 proteazės ir mutantinės PB92 proteazės, tuos pačius kamienus augina 37°C temperatūroje aeruojamuose 10 1 talpos ir didesniuose fermentatoriuose su tokia pat terpe, kaip ir kratyklinėse kolbose.
Gauti kultūriniai skysčiai naudojami proteazei išskirti.
3. PB92 laukinio tipo proteazės ir jos mutantų gryninimas ir koncentravimas
Mutantinė ar natyvi pB92 proteazė, gauta iš Bacillus subtilis DB104 kratyklinėse kolbose arba 10 1 talpos fermentatoriuose, gryninama katijonų mainų chromatografijos būdu, panudojant diskus Zeta-PrepR arba .PS tipo (LKB) patronus. Fermentacijos mišinys centrifuguojamas (3000 x g, 10 min.), skystis atskiriamas ir 10 kartų praskiedžiamas lOmM natrio fosfato buferiu (pH 5,5) po to perkialiamas į kolonėlę su sorbentu. Patronas plaunamas keliais tūriais fosfatinio buferio, proteazė eliuojama 0,4 m NaCI. Aktyvios frakcijos koncentruojamos ultrafiltracijos būdu Amicon aparate, filtras PM-10. Natrio chlorido koncentracija sumažinama iki 50 mM praskiedžiant proteazės tirpalą fosfatiniu buferiu ir sukoncentruojant. Laikoma -30°C temperatūroje esant baltymo koncentracijai 1-10 mg/ml.
Arba PB92 proteazės mutantai iš didelių suspensijos tūrių išskiriami, pridedant CaCl (1% sv./sv.) į acetoną (30% sv./sv.) po filtracijos ląstelių masė atskiriama, proteazė išsodinama iš gauto filtrato, pridedant 0,2-2% (sv./sv.%) CaCl2.2H2O ir dar pridedant acetono iki jo galinės koncentracijos > 60,0% (sv.%). Nuosėdas filtruoja, apšlaksto acetonu ir išdžiovinę gauna pradinio fermento miltelius (PFM).
4. Proteazių grynumo kontrolė.
Proteazės laikomos grynos, jeigu elektrforezėje arba HPLC chromatografijos metodais gaunama viena juosta arba pikas.
Elektroforezė poliakrilamido gelyje (PAGE) su natrio dodecilsulfatu (NaDS) atliekama pagal Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685. Norint išvengti fermento denatūravimosi NaDS, 100°c temperatūroje ir jo autodegradavimo, reikia proteazę inaktyvuoti, inkubuojant ją su fenilmetilsulfonilfluoridu (FMSF) (1 mM, 30 min. kambario temperatūroje) arba išsodinti trichloracto rūgštimi (TChA, 8%, 30 min., lede). PAGE atliekama prie pH 7,45 (gelio buferis, susideda iš 20 mM histidino (His) ir 50 mM
3-/N-morfolino/propansulforūgšties (MOPS) 5% poliakrilamido gelyje (akrilamido: bioakrilamido santykis 20:1). Baltymo pavyzdžiai užnešami viršutinėje gelio plokštelės dalyje ir elektroforeze nukreipiami katodo link. Tas pats His/MOPS buferis naudojamas atliekant elektroforezę rezervuare, tačiau prie pH 6,3. Po elektroforezės 1,5-2 vai., 350 V) baltymai fiksuojami gelyje 8% acto rūgštimi, nudažomi Coomassie brilliant mėlynuoju R250 ir išplaunami pagal standartinę metodiką.
Grynumas tikrinamas HPLC chromatografija katijonitų kolonėlėse (MonoS-Pharmacia Fine Chemicals) ir gel-filtracija kolonėlėse (TSK 2000 SW-LKB). Chromatografijai naudojamas 10 mM natrio fosfato buferis pH 5,5, proteazės eliucija atliekama linijiniu 10-300 mM natrio fosfato buferio (pH 5,5) gradientu. Gel filtracijos kolonėlėse naudojamas 0,25 M natrio acetatas (pH 5,5).
5. Proteazės koncentracijos nustatymas.
Baltymo koncentracija gryninto fermento tirpale nustatoma :
1. matuojant absorbciją ties 280 nm, pasinaudojant paskaičiuotu ekstinkcijos koeficientu (eM) ir
2. aktyvaus saito titravimu.
Ekctinkcijos koeficientas skaičiuojamas, remiantis triptofanų (eM = 5600 M-1, cm’1 2) ir tirozinų (eM = 1330 M’1, cm’1) skaičiais, tenkančiais proteazės molekulei. PB92 proteazei eH = 26100 M’1cm'1. (3 Trp, 7 Tyr liekanų), kas ekvivalentiška koeficientui E*cm, išmatuotam ties 280 nm =
9,7 (Mr = 26729 Da) . Turint mutantus su skirtingu Tyr ir Trp kiekiu, padaromos atitinkamos pataisos.
Aktyvių fermento molekulių skaičius nustatomas, titruojant aktyvų saitą. Kadangi plačiai naudojamas N-transcinamoiloimidazolo metodas (M.L. Bendor ir kt., J. Am. Chem. Soc. 88 (1966) 5890-5931 neduoda patenkinamų rezultatų PB92 proteazės atveju, mes sukūrėme metodą su FMSF. Pagal šį metodą žinomos koncentracijos (matuojant absorbciją 280 nm) proteazės tirpalas sumaišomas atitinkamai su 0,25, 0,5, 0,75, 1,0 arba 1,25 ekvivalentais FMSF ir paliekama 1 vai. kambario temperatūroje 10 mM natrio fosfate (pH 6,5). Fermento koncentracija turi būti ne mažiau 50 μΜ.
Liekamasis aktyvumas išmatuojamas spektrofotometru, kaip substratą panaudojanti sukcinil- L-alanil- L alanilL-prolil- L-fenil-alanil-paranitroanilidą (sAAPFpNA), (žr. žemiau).
FMFS grynumas, o (tuo pačiu ir koncentracija) nustatoma BMR-spektroskopijos pagalba, tiriamieji tirpalai ruošiami izopropanolyje. Rezultatai, gauti titruojant aktyvią fermento zoną, sutampa su HPLC rezultatais.
6. Laukinio tipo ir mutantiniu proteazių kinetinių parametrų nustatymas
1°. Aktyvumai su baltyminiais substratais (kazeinu) matuojami prie pH 10 pagal Didžiosios Britanijos patentą Nr. 1353317 (išreiškiamas šarminiais Delfta vienetais, ŠDV) .
2°. Efektyvumas, matuojant su kazeino substratu, nustatomas pH-statu. Į reakcijos kamerą (Radiometer, Kopenhaga) įpilama 10 ml 0,1 M KCL, kuriame ištirpinta 50 mg kazeino (Hammerstein) Merck). Protonai, išsiskyrę po kazeino hidrolizės proteaze, titruojami 10 mM NaOH, palaikant pH 10 (40°C azoto dujų srovėje).
3°. Aktyvumai sintetinių peptidų atžvilgiu matuojami, panaudojant sAAPFpNA. Susidaręs (geltonas) parenitroanilidas (pNA) matuojamas spektrofometru UVIKON 860 (KONTRON) ties 410 nm: eM = 8480 M-1.cm’1 (E.G. Delmar ir kt. Anai. Biochem. 94 (1979) 316-320) šešių kiuvečių termostatuotoje kasetėje. Kinetinės konstantos kcat ir K,,, gaunamos, matuojant pradini reakcijos greitį įvairiose substrato koncentracijose (PB92 proteazei 0,1-6,0 mM) , priartindami gautus duomenis prie hiperbolinės funkcijos nelinijinės regresijos būdu. Paskaičiuojamos specifiškumo konstantos (k^/K,,,) . Matuojama 25°C temperatūroje 1 ml tūryje, kuriame yra 0,1 m Tris-HCl + 0,1 M NaCl, pH 8,6. Natrio chloridas būtinas, kadangi be jo PB92 proteazei negaunama Linweaver-Burck'o kreivių linijinės priklausomybės dėl inhibicijos substratu. Substratas pradžioje gaminamas 200 mM koncentracijos, po to praskiedžiamas iki 20 mM 0,1 M Tris-HCl (pH 8,6) buferiu (matuojama spektrofotometru ties 315 nm; eM = 14000 M’1.cm’1). Jokios korekcijos dėl kintančios tirpiklio koncentracijos (0,05-3% t./t.) nereikia.
7. PB92 proteazės oksidinimas
PB92 proteazės jautrumas oksidacijai H2O2 tiriamas Estell metodika (J. Biol. Chem. 260 (1985) 6518-652) išskyrus tai, kad:
1) vietoje 100 mM H2O2 imamas 20 mM tirpalas ir
2) kaip papildomas oksidintojas naudojamas 20 mM natrio perborato tirpalas su 10 mm TAED.
8. Plovimo galios tyrimas
PB92 proteazės mutantai tiriami specialiai sukurtame skalbimo eksperimente panaudojant medvilnės arba poliesterio-medvilnės gabalėlius, išteptus pienu, krauju ir rašalu (pažymėti 116 ir 117 numeriais, 5,0x5,0 cm, gauti iš EMPA, St. Gallen, Šveicarija).
Bandymai atliekami firmos Atlas prietaisu LEF-FC, kuriuo matuojamas audinių atsparumas skalbimui. Prietaiso komplekte skalbimo indai iš nerūdijančio plieno, kiekvienas iš jų užpildomas nurodyta skalbimo kompozicija, pridedant tiriamą proteazę (PB92 proteazės mutantai arba PB92 proteazė) . Jeigu nėra atskirų nurodymų, bandymas trunka 30 min užsiduotoje temperatūroje. Po skalbimo audinių pavyzdžiai džiovinami oru ir Photovolt fotometru (modelis 577) su žaliu filtru, 680 nm matuojama bandomų audinių atspindžio galia. Duomenys, gauti audinio gabaliukus išskalbus plovikliais, kuriuose yra atitinkami PB92 proteazės mutantai, palyginami su serija matavimų, kai panaudoti plovikliai su PB92 proteaze. Mutantinių proteazių plovimo galia apskaičiuojama dalijant PB92 proteazės baltymo kieki, (mg) iš mutantinės PB92 proteazės baltymo kiekio (mg), kurio prireikė tai pačiai atspindžio galiai pasiekti, x 100%.
PAVYZDYS
A. Įvairių PB92 proteazės mutantų plovimo galia Europos skalbimo milteliuose nustatoma aukščiau išdėstytu metodu .
Į bandymui naudojamus nerūdijančio plieno indus, su nurodytu kiekiu skalbimo miltelių IES, ištirpintų 250 ml vandens (KL 15°), Įmerkiama po du medvilnės ir poliesterio/medvilnės audinio pavyzdžius. Skalbimo miltelių IEC sudėtis:
Komponentas masės%
Linijinis natrio alkilbenzensulfonatas (vidutinis alkano grandinės ilgis Cll.5) 6,4
Etoksilintas aukštesnysis alkoholis (14 EO) 2,3
Natrio muilas 2,8
Natrio tripolifosfatas (NaTPF) 35,0
Natrio silikatas 6,0
Magnio silikatas 1,5
Karboksimetil/celiuliozė 1,0
Natrio sulfatas 16,8
Natrio perborato tetrahidratas 18,5
TAED 1,5
Įvairūs + vanduo iki 100.
Į - kiekvieną indą pridedamas pasirinktas grynas PB92 proteazės mutantas koncentracijos intervale 0-1,74 mg (grynos) proteazės litrui pamuilių su priedais. Viename inde kontrolinė PB92 proteazė. Skalbiama 40°C tempera^ tūroje. Rezultatai pateikti 1 lentelėje.
CM n
•Φ
Λ <0 m
<3 •P
0)
O
3* •rl
M λ;
•rl m
Λ!
M •rl •Φ I—I Φ •P β Φ r-l r-l w
Φ
N rt
Φ
P
O
M
CU
CM
O)
Ή rt)
M
4-1
0) e
ro n
<o
CU
-H rt)
o si
Si r-l
CM
O O) LT) o
r-l rco o
co
CM r-t LD*-----CO
CM 00 r-l <y>
KT r— n
o
CM ’j’ o
o
CO
LD m
m rt) CM E cn ? ca
D ε
>
+J
Si m n) to to P « -h c -ω c o) N •h c rt) ^4 -H φ >, Cn p 4-1 >1 O C r-l kl rt) CU co dfi
O O
LD T
Γ— LD co co rKT
CO r00 5 LD U0 Lf) rr / r ω oi
CU Oj ooo co cn cn
Lf)
CM
Lf)
Lf)
Lf)
Γ-
Lf) CO o O
o CM [-
CM 1—1 CM r-f
ΟΟ
-Φ
N rt)
Φ
4-1
O ki
CU rt) •0) 4->
N O fū 3
O Ό
4-1 -H o w k4 λ;
Cu o
Q
CM
CJ
Z
1 ω O O
CM kO LD kO kO O
σ\ t-H ,—l t—f ,—1 LD
CQ CM CM CM CM i—f
CU S 2 2 2 co
o o o o co
o o CM o CM
LD LD i-f kO T—l co
r-l r—f CM i—1 CM 1-f
ω co Z ω 2 w
m >1 c
•rl
0)
Φ·
-P •Φ r4
Φ •P c
Φ •H kl +J
Φ g
nj ki m
•H •H
C •H
-U
Φ
C
Ή
W P <Ū CM £ g cn p 5 tn > £ tn >
>1 i) £ 1 rt w * tn R w -i c -Φ S rt n -h c rt a: ·η φ >i tn 4-1 4J >i O C Ή 54 rt a OT
4-5
G rt c
-H cn >1 rt -H i—I rt tP o
e
-rd >
o i—I A !#>
Φ
N rt
Φ
4-1 o
A
CN cn cn cn w
rt
-r~i
Ή
U rt
4-1 c
Φ □
C
O a;
o •H r—I Ai •rl > 0 r—I CM
-Φ
N rt
Φ
4-5
O cn
CM 00 kO
LD kO
ΓΙΟ
OO cn o
oo
U <0 υ
cA°
Φ ·—I Φ Oi 54 -H 4-5
O ε
-H
X!
'—i rt a; m
Cn ri—i
Cn
Ν’
CN r~-
o O o Γ- kO
CD kO OA Ο m
CN CM CN CM cn
cn rO «—I cn r- vd n CN 00 Ν’ ld O O ro r-' r-~ cn
LO CM CM cn cn CD CD id i—I 1—I
LO to o O o
O kO o LO o
»—1 i—1 CN CM CN
kO to 00 kO I O ld O O O
cn r~ f”1 CD ld CD o ld O
i—1 cH CN i—1 CN CN CN
Ν’ cn Ν’ CD ld
CTi ld
ΓLd
ΟΟ o oo oo cn
00 CN rH cn > 00 CN rH cn 00 CN r-1 cn Al oo CN t—1 cn l-l co CM t—1 ω
»K K
ω X OI o X
Γ' r- r~ 2 o r- r-
CN CM CN r- 00 CM CM
t—l i—1 Γ—1 CN CN r—1 t—1
cn cn cn t—1 j—1 Cb 04
cn cn
•k K. <.
l—1 σ ω O ω > A A >H X
cn kO kO kO kO CD CD CD > < ω kO kO
kO r—1 t-1 ι—1 CN CN CN CD Ι- kO CM CM
i—1 CM CM CM CM t—1 »—1 t—1 CN ΟΝ I-1 c—1 r—1
2 2 S 2 S cn cn cn cH t—1 CN ω ω
K K K K K K K K K K K
Q Q Q Al »-q > > > > 2 l-l > >
kO O O Γ- E— kO kO kO kO CD ΟΊ kO kO
kO CD kO i—1 i—1 t—1 t—1 r-1 t—1 ON kO c—1 1
<—I <—t i—1 i—1 t—1 i—1 r-1 ι—1 r-1 <—t i—1 i—1 «—1
c cn cn 2 2 o o o o ω 2 u O
(0 >« c
•rl (0 ar +J •0)
A
0)
-P c
ai
CM
K m
o o
CM
O cu l-l galia, lyginant Santykinis aktyvumas
CM cn m
o.
E >
CO (Ū
P CO C -Φ (0 N C (ti •H Φ CP P >, O i—I Ll
CL o\° nj
φ
N <Ū
Φ
P o
Ll
CL m i-ι to r- oo σ
ΓΟΟ
Lf) ro co m o Lf) i-ι m cm i—I i—I CM
Lf) ro if) 1—I
CL 00 CM <—1 cn M CO CM i—1 ω H co CM rH cn
cn Oi a A
r- r- r- r— r~
CM CM CM CM CM
i—1 i—1 I—1 1—|
CL CL CL CL CL
K *»
X os (j-l o A
LD LO kO LO LO
CM CM CM CM CM
i—1 r-H i—l i—l i—1
cn cn ω ω cn
*»
> > > > >
kO kO kO kO kO
(D P I—I •H e
o e
♦H
Λ i—i fti A CO m
Ll >1 tu e
(0
-H
Ll
A (U
P
I d
CL
H (ti
O o
O rt*
Φ •H
Ll
CL
O
P (0
P
C0
C ar •H r—I (0 cn o £ •H > o <—1 CL
Ό
O
P
Φ £
>
Q
XZ>
co (ti
P o
P fti £
co (ti £
>
>1
P λ:
<
o\° O O c—I
CL
-H (ti λ:
φ
P £
•H
-H
Ll
CL
CO (ti £
>
P (ti
C0
-Φ
N (0
Φ
P
O
Ll
CL
CM σ
CQ
CL co •H c
•H ^i
P
C (ti cn u
o m
CM
U (ti
S o
•
LO
E
CL
U
X
I co •H
Ll
H
S o
I co •H
P
Φ
P _Q co
I co (Ū
P (0
P
P co co co o
Cn i—I (ti CO £
Ή >
(ti
P (ti
A
O
OOOO x +
B. Plovimo galios tyrimų matavimai pakartojami 25°C temperatūroje su tais pačiais plovikliais ir su tais pačiais PB92 proteazės mutantais. Kontrolei naudojama ta pati PB92 proteazė. Kitos tyrimo sąlygos tos pačios, kaip aprašyta. Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
lentelė
PB92 proteazės mutantų plovimo galia 25°C tempera10 tūroje, skalbimo milteliai su NaTPF, lyginant su PB92 proteaze (%)
Proteazė Plovimo galia /%/ Ploviklio koncentracija skalbimo tirpale
4 g/1 7 g/1
M216S 90 80
M216Q 95 80
N212D 250 135
S160D 185 120
C. Proteazės plovimo galia taip pat buvo nustatyta
Europos skalbimo milteliams su befosfatine balinimo priemone.
Bandymus atlieka prietaisu audinių atsparumui tirti, skalbiant 25° ir 40° temperatūroje. Ir šiuo atveju palyginimui naudoja PB92 proteazę. Kitos bandymo sąlygos atitinka anksčiau aprašytąsias. Gauti rezultatai parodyti 3 lentelėje.
lentelė
PB92 proteazes mutantų plovimo galia 25° ir 40°C temperatūroje su befosfatine balinimo priemone Europos skalbimo milteliuose, lyginant su PB92 proteaze (%).
Plovimo galia (%)
Proteazė Ploviklio koncentracija skalbimo tirpale
4g/l temperatūra 7g/l 25°C 4g/l temperatūra 7g/l 40°C
M216S 80 85 100 100
M216Q 80 80 120 100
N212D 170 105 200 75
S160D 170 105 230 165
PAVYZDYS
Buvo tiriamas PB92 proteazes mutanto stabilumas, laikant skalbimo milteliuose IEC, kaip ir 1 pavyzdyje. Stabilumas laikant tiriamas klimatiniuose stenduose 30°C temperatūroje, santykinis drėgnumas (SD) 80%. Proteazė šiems bandymams buvo kapsuliuojama tokiu būdu:
paruošiamas mišinys, kuriame (sv./sv.): 2% grynintos proteazes, 50% nejoninio (etoksilinto C14-C18 alkoholio su 50-80 E.O. vienetų), 5% TiO2, 3-10% CaSO4.2H2O, Na2SO iki 100%. Mišinys šildomas iki 65-90°C ir ataušinamas iki kambario temperatūros. Gautos 0,5-1 mm dalelės atskiriamos sijojant ir panaudojamos tirti stabilumui plovikliuose.
Skalbimo milteliai IEC (3,5 g), į kuriuos pridėtas
6140 ŠDV/g skalbimo miltelių mutantas M216S, buvo laikomi 18 ml talpos kolbutėse. Palyginimui tose pačiose sąlygose buvo laikoma PB92 proteazė. Po 2, 4, 5 ir 6 saLT 3963 B vaičių buvo nustatomas išlikęs proteazės aktyvumas. Gauti rezultatai parodyti 4 lentelėje.
lentelė
PB92 proteazės ir jos mutantų liekamasis aktyvumas, laikant (savaites) 30°C temperatūroje ir esant 80% SD, skalbimo milteliuose.
Proteazė Liekamasis aktyvumas (%)
0 sav. 2 sav. 4 sav. 5 sav. 6 sav.
PB92 proteazė 100 25 5 3 2
M216S 100 68 31 20 11
PAVYZDYS
Buvo tiriamas PB92 proteazės ir įvairių jos mutantų stabilumas, laikant skalbimo milteliuose. Stabilumo ty15 rimuose buvo naudojama kapsuliuota proteazė.
Proteazės produktai buvo gaminami, sumaišant šiuos komponentus 80°C temperatūroje:
Komponentas % masė
AE* 50
TiO2 2 proteazė (CPF) 7
PVP** 1,5
BHT*** 1
Na2SO4 iki 100 * AE = C14-C18 polietoksilintas alkoholis. Alkoholis buvo etoksilintas 50-80 etileno oksido (EO) grupėmis.
** PVP = polivinilpirolidonas K17 *** BHT = 2,6-bis (t-butil)-4-metilfenolis.
Gautas mišinys kapsuliuojamas granuliuojant sukietinimo būdu, kaip aprašyta Didžiosios Britanijos patente Nr. 1603640. Dalelių frakcija tarp 0,3 ir 0,8 mm panaudojama nustatyti proteazių stabilumui laikant. Kapsuliuota proteazė (140 mg) buvo sumaišyta su ALL baze (6,4 g) ir natrio perborato tetrahidratu (0,6 g). /ALL užregistruotas firmos Unilever N.V. prekinis ženklas/. ALL bazėje nėra fermentų ir balinimo priemonių.
Fermento-ploviklio-natrio perborato tetrahidrato miltelių mišinys inkubuojamas 30°C temperatūroje, esant 80% SD.
5-je lentelėje pateiktas liekamasis aktyvumas, išlaikius nurodytą periodą.
lentelė
PB92 proteazės ir kai kurių jos mutantų liekamasis aktyvumas, 30°C temperatūroje, esant 80% SD, ploviklyje su balinimo priemone.
Proteazė 0 sav. Liekamasis aktyvumas% 5 sav.
1 sav. 3 sav.
PB92 proteazė 100 51 25 15
M216Q 100 94 84 52
M216S 100 89 83 50
S160D 100 47 20 9
N212D 100 59 31 19
PAVYZDYS
PB92 proteazė ir įvairūs jos mutantai buvo kapsuliuojami tuo pačiu metodu, kaip 3 pavyzdyje. Tačiau šiame pavyzdyje apie 70 mg kapsuliuotos proteazės, kurios dalelių dydis 0,3-0,9 mm, buvo sumaišomos su 3,2 g ALL ir 0,3 g natrio perborato tetrahidrato. Pavyzdžiai buvo laikomi 30°C temperatūroje 18 ml kolbutėse vakuum eksikatoriuje. Pirmas tris dienas buvo palaikomas 25 mm Hg vakuumas.
Vakuume vandens garų pernešimo greitis didėja ,todėl 80% SD pusiausvyra tokioje sistemoje buvo pasiekiama greičiau, negu sistemoje be vakuumo. 80% SD buvo palaikoma prisotintu kalio bromido tirpalu.
lentelėje parodytas liekamasis aktyvumas, praėjus nurodytam laikui (savaitės) lentelė
PB92 proteazės ir kai kurių jos mutantų liekamasis aktyvumas 30°C temperatūroje ir esant 80% SD, ploviklyje su balinimo priemone.
Proteazė Liekamasis aktyvumas%
0 sav. 1 sav. 2 sav. 3 sav.
PB92 proteazė 100 27 22 14
M216Q 100 63 53 44
M216S 100 55 49 31
S160D 100 23 18 13
PAVYZDYS
Buvo paruoštas tokios sudėties skystas ploviklis:
Komponentas linijinė C10-C13 alkilbenzensulforūgštis C13 alkoholio polietoksiliatas, 8 EO laurino rūgštis oleino rūgštis trietanolaminas
1,2 propandiolis etanolis natrio citratas dietilentriamino pentaacto rūgštis kalcio formiatas natrio formiatas boraksas
NaOH,25% m/m tirpalas vanduo
Svoris %
0, 3
0,1
1,9 iki pH 11,2 iki 100
Į nurodytą kompoziciją prideda tokį kiekį PB92 proteazės ir įvairių jos mutantų, kad pradinė proteazės koncentracija būtų 0,13 % (sv.sv.).
Proteazės stabilumas (liekamasis aktyvumas, %) buvo nustatomas, išlaikius ją kompozicijoje 37°C temperatūroje nurodytą dienų skaičių. Gauti rezultatai parodyti 7 lentelėje.
lentelė
PB992 proteazės ir kai kurių jos mutantų liekamasis aktyvumas, išlaikius 37°C temperatūroje skystoje skal5 bimo kompozicijoje
Proteazė Liekamasis aktyvumas (%)
0 d. 5 d. 1 1 d. 15 d. 21 d.
PB92 proteazė 100 23 10 5 3
S160D 100 57 30 14 8
M216Q 100 59 32 18 9
M216S 100 45 18 10 5
N212D 100 38 14 9 4
6 PAVVYZDYS
Su PB92 proteaze ; ir kai kuriais jos mutantais buvo
gaminami tokios sudėties mišiniai:
Komponentas Masės %
Amylogum CLS 45 sacharozė 23 sorbitas 17 glicerinas 4 parafino aliejus 3
NaH2PO4 0,5 proteazė (CEP) 1,5
PVP K17 1,5
TiO2
Iš šio mišinio gaminami granuliatai naudojanti metodika, kaip 5 pavyzdyje pagal JAV patentą Nr.4242219, išskyrus tai, kad:
1° - pavyzdyje nurodytas mišinys pakeičiamas aukščiau pateiktuoju;
2° - naudoja ne 1 mm diametro angas, bet 0,7 mm;
3° - granulės nepadengiamos apvalkalu.
Gautos granulės (140 mg) sumaišomos su ALL baze (6,4 g) ir natrio perborato tetrahidratu (0,6 g), po to supilamos Į 36 ml talpos kolbutes.
Matuojamas proteazės stabilumas (liekamojo aktyvumo %), išlaikius šias kolbutes 30°C temperatūroje, esant 80% SD, nustatytą savaičių skaičių. Gauti rezultatai parodyti 8 lentelėje.
lentelė
Granuliuotos PB92 proteazės ir kai kurių jos mutantų liekamasis aktyvumas, išlaikius 30°C temperatūroje, esant 80% SD ploviklyje.
Proteazė Liekamasis aktyvumas (%)
0 sav. 1 sav. 3 sav. 5 sav.
PB92 proteazė 100 45 29 17
M216Q 100 93 66 45
M216S 100 90 70 41
PAVYZDYS
Pagaminamos PB92 proteazės ir kai kurių jos mutantų granulės ir sumaišomos su plovikliu ir balinimo priemone, kaip aprašyta 3 pavyzdyje.
Šių pavyzdžių stabilumas laikant (liekamojo aktyvumo %) buvo nustatomas 30°C temperatūroje, esant 60/80% SD (pakaitom 60% SD 12 valnadų ir 80% SD 12 valandų) . Rezultatai pateikti 9 lentelėje.
lentelė
PB92 proteazės ir kai kurių jos mutantų liekamasis ak-
tyvumas, išlaikius 30°C temperatūroje, esant 60/80% SD
Proteazė Liekamasis aktyvumas (%)
0 sav. 1 sav. 3 sav. 5 sav.
PB92 proteazė 100 70 35 15
M216Q 100 98 88 67
M216S 100 93 ! 7 48
S160D 100 67 35 10
N212D 100 75 53 26
PAVYZDYS
Pagaminamos granulės su PB92 proteaze arba kai kuriais jos mutanatais ir sumaišomas su plovikliu ir balinimo priemone, kaip aprašyta 6 pavyzdyje.
Šių pavyzdžių stabilumas laikant (% liekamojo aktyvumo) buvo matuojamas po inkubacijos nustatytą laiką 30°C temperatūroje ir esant 60/80% SD, kuris pakaitom 12 vai buvo palaikomas 60% ir 12 vai. 80%. Rezultatai pateikti 10 lentelėje.
lentelė
PB92 proteazes ir kai kurių jos mutantų granuliatų lie-
karnasis aktyvumas, 60/80% SD. išlaikius 30°C temperatūroje, esant
Proteazė Liekamasis aktyvumas (%)
0 sav. 1 sav. 3 sav. 5 sav.
PB92 proteazė 100 54 39 28
M216Q 100 93 81 67
M216S 100 99 87 72
PAVYZDYS
Buvo tiriamas PB92 proteazes ir kai kurių jos mutantų stabilumas laikant skalbimo milteliuose su balinimo priemone 30°C temperatūroje, esant 80% SD. Šiame eksperimente buvo naudojamos kapsuliuotos proteazes. Kiekviena proteazė kapsuliuojama tokiu būdu:
80°C temperatūroje buvo pagamintas tokios sudėties mi20 šinys:
Komponentas svoris%
Nejoninis* 45
TiO2 2 proteazė (CEP) 10
Na2SO4 iki 100
Nejoninis = C14-C18 alkoholpolietoksilatas (50-80 EO grupės) EO grupės-etoksi-grupės.
Gautas mišinys aušinamas iki kambario temperatūros. Sukietėjusi masė susmulkinama į smulkias daleles..Išsijojamos dalelės 0,3-0,8 mm ir panaudojamos stabilumo eksperimentams .
Stabilumo bandymuose 140 mg kiekvienos kapsuliuotos proteazės buvo sumaišoma su 6,4 g bazinių ALL skalbimo miltelių ir 0,6 g natrio perborato tetrahidrato. Pagrindiniuose ALL milteliuose nėra nei fermento nei natrio perborato. ALL-proteazės-natrio perborato tetrahidrato mišinys buvo inkubuoj amas 30°C temperatūroje, esant 80% SD.
Išlaikius 0, 1, 2 ar 4 savaites, nustatomas kiekvienos proteazės stabilumas (liekamasis aktyvumas, %) . Rezultatai pateikti 11 lentelėje.
lentelė
PB92 proteazės ir kai kurių jos mutantų liekamasis aktyvumas, 30°C temperatūroje, esant 80% SD, skalbimo milteliuose su balinimo priemone
Proteazė Liekamasis aktyvumas (%) 2 sav. 4 sav.
0 sav. 1 sav.
PB92 proteazė 100 61 36 12
[ S160D, M216Q] 100 78 58 35
[ S160D, M216S] 100 86 68 39
PAVYZDYS
PB92 proteazės mutantai buvo tiriami iš esmės tokiose pačiose kaip 1 pavyzdyje sąlygose, išskyrus tai, kad
Launderometre (prietaise audinių atsparumui tirti) i,
250 ml vandens 5°KL, buvo dedama 0,375 g skysto ploviklio, kurio sudėtis:
Komponentas svoris, % laurino rūgštis 8 oleino rūgštis 4
C10-C13 linijinė alkilbenzensulforūgštis 12
C13 polietoksilintas alkoholis, 8 EO 13 trietanolaminas 6
1,2 propandiolis 6 etanolis 5 natrio hidroksidas, 45% sv./sv. 4 natrio citratas 4 vanduo (mišinio pH 7,2) iki 100
Įvairių proteazių plovimo galia šiame skystame ploviklyje buvo nustatoma 25°C temperatūroje, skalbiant 30 min. prietaise audinių atsparumui tirti. Po skalbimo 1 pavyzdyje nurodytu metodu nustatomas tiriamų audinių atspindėjimas. Mutantiniu proteazių plovimo galia nu10 statyta taip, kaip aprašyta 1 pavyzdyje. Gauti rezultatai pateikti 12 lentelėje.
lentelė
PB92 proteazės mutantų plovimo galia 25°C temperatūroje skystame ploviklyje
Proteazė
Plovimo galia
Specifinis aktyvumas nuo PB92 proteazės %
212D
160D
100 lentelė (tęsinys)
Proteazė Plovimo galia Specifinis aktyvumas nuo PB92 proteazės %
S160G,N212D + 76
M216S 0 40
M216Q 0 37
0: 100% ± 20% nuo PB92 proteazės skalbimo galios (išlikusi plovimo galia) +: > 120% nuo PB92 proteazės plovimo galios
-: < 80% nuo PB92 proteazės skalbimo galios.
Įvairių proteazių plovimo galia nustatyta komerciniuose R R R — skystuose plovikliuose: Tide , Wisk ir Ariel . Nerūdijančio plieno induose kiekviename buvo: 0,375 g Tide 250 ml vandens 5° kietumo laipsnio (KL) arba 0,375 g Wisk 250 ml vandens 5° KL arba 1,25 g Ariel 250 ml vandens 15°, atitinkamai. Plovimo galia buvo nustatoma 25°C arba 40°C temperatūroje. Gauti rezultatai pateikti 13 lentelėje.
lentelė
PB92 proteazės mutantų plovimo galia Tide, Hisk ir Ariel plovikliuose 25°C ir 40°C temperatūroje.
Proteazė Tide Wisk Ariel
25°C 40°C 25°C 40°C 25°C 40°C
N212D + + + + 0
S160D + + + + +
lentelė (tęsinys)
Proteazė Tide Wisk Ariel 25°C 40°C
25°C 40°C 25°C 40°C
M216Q 0 + 0 + +
M216S NN 0 0 0 0
S160Q - - - - -
S160N - - - - 0
S160K - - - - -
S160A - - - - -
S160D, M216Q + + + + +
S160D, M216S 0 - + + 0
M117L, M216Q ND - ND - 0
M117L, M216S ND - ND - -
ND - nebuvo nenustatoma
0: 100 ± 20% nuo PB92 proteazės plovimo galios +: > 120% nuo PB92 proteazės plovimo galios < 80% nuo PB92 proteazės plovimo galios
PAVYZDYS
PB92 proteazės mutantų plovimo galia buvo nustatoma statistiniuose tyrimuose įprastoje skalbimo mšinoje TNO, Delft, Olandija (Švaros palaikymo technikos tyrimo institutas). Mutantų plovimo galia buvo lyginama su PB92 proteaze.
Visos proteazės buvo dozuojamos į IEC ploviklį, remiantis baltymo kiekiu (0,007% sv./sv.). Šios_ dozės, išreiškus aktyvumu:
PB92 proteazė 1460 SDV/g ploviklio
M216S 679 SDV/g ploviklio
M216Q 479 SDV/g ploviklio
S160D 1080 SDV/g ploviklio
N212D 1455 SDV/g ploviklio
Su kiekviena proteazės-ploviklio kompozicija buvo atliekami 8 skalbimo eksperimentai 40°C temmperatūroje identiškose 2 režimų AEG Turnamat skalbimo mašinose. Kiekvienoje skalbimo mašinoje buvo sunaudojama 170 g. ploviklio. Bandymo eigoje tiriamas ploviklis buvo panaudojamas tokiu būdu, kad kiekvieni milteliai patyrė tokį patį skalbimo ciklų skaičių kiekvienoje mašinoje.
Visuose bandymuose buvo naudojamas normalus Delfto miesto vandentiekio vanduo, kurio rodikliai:
šarmingumas (M): kietumas (H): temperatūra:
Purvo pašalinimas
2,2 mmol/1
1,6 mmol/1 (9°KL)
20°C iš tiriamų audinių
Kiekvienoje bandymų serijoje 6 gabaliukai trijų tipų EMPA medvilnės audinio (no. 111, 116 ir 117), buvo skalbiami kartu su nešvariais skalbiniais.
Dėmių ir purvo pašalinimo aktyvumas iš suteptų testuojamų gabaliukų buvo nustatomas praleidžiant trikomponentinę mėlyną šviesą statmenai audinio gabalėliui.
Matuojamas šviesos kiekis atspindėtas nuo testuojamo gabalėlio 45°C kampu. Sutinkamai su IEC publikacija 456, magnio oksido remisijos dydis prilyginamas 100. Kuo didesnė remisija, tuo labiau tinkamas skalbimo procesas konkrečiai užterštumo rūšiai.
Skalbimo mašinos užpildymas
Į skalbimo mašiną buvo sukrauta 4,75 kg tiriamų audinių ir kitokių skalbinių, kurie susiteršė, vartojant namuose .
Skalbiniai susidėjo iš:
virtuvės rankšluosčių apatinių baltinių paklodžių užvalkalų.
Jeigu trūksta svorio, pridedama švarių paklodžių ar užvalkalų.
Kiekvienam skalbimui skalbiniai rūpestingai parenkami. Kiekvienas audinio gabalas skirtas vienai mašinai, turi savo analogą, skalbiamą kitoje mašinoje. Rezultate nešvarumų kiekis mašinose buvo vienodas.
Skalbimo proceso parametrai programa 40°C vanduo pagrindiniame skalbime 19 1 aukščiausios temperatūros trukmė 15 min aukščiausia temperatūra 43°C skalbimo trukmė min papildomas vandens kiekis 7 1 temperatūra po pamuilių praskiedimo 30°C drenažas 17 1 skalavimai, keikvienas po 17 1 šalto vandens
Vidutinė remisijos reikšmė (V) ir santykis (R) buvo nustatomi po 8 skalbimo testų. Dviejų nepriklausomų eksperimentų rezultatai pateikti 14 A ir 14 B lentelėse.
A lentelė
Dirbtinių nešvarumų pašalinimas
EMPA audinio pavyzdžiai, nr. Bendras
Proteazė lll 116 117
V R V R V R V R
PB92 proteazė 49 1.00 44 1,00 56 1,00 149 1,00
M216S 19 1,00 46 1.05 58 1,04 153 1,03
B lentelė
Dirbtinių nešvarumų pašalinimas
Proteazė EMPA audinio pavyzdžiai lll 116 117 Bendras
V R V R V R V R
PB92 proteazė 41 1,00 35 1,00 46 1,00 123 1,00
M216S 40 0.96 33 0, 94 42 0, 91 115 0, 93
M216Q 42 1.01 35 0, 99 43 0, 94 120 0, 98
15 lentelėje santykiniai dydžiai (R) , kurie buvo gauti
statistiniuose testuose įprastose skalbimo maši-
nose, dalijami iš atitinkamo santykinio dydžio (R'), paskaičiuoto iš plovimo galios reikšmių, gautų PB92 proteazei prietaise audinių atsparumui tirti analogiškose sąlygose (10g/l IEC, EMPA audinio gabalėliai 116 ir 117, skalbimo trukmė 30 min, temperatūra 40°C).
lentelė
Koreliacija tarp testų įprastose skalbimo mašinose ir prietaise audinių atsparumui tirti
Proteazė R/R'
PB92 proteazė 1,00*
M216S 1.18
M216Q 1, 10
S160D 1,02
N212D 0, 98
* - pagal apibrėžimą
Mutantinių proteazių R/R' reikšmės, artimos 1,00, parodo, kad yra koreliacija tarp bandymų įprasto tipo skalbimo mašinose ir prietaisuose audinių atsparumui tirti (Launderometro testų).
PAVYZDYS
Fig. 2A ir Fig.2B pavaizduota įvairių PB92 proteazės mutantų, esančių 4 g IEC/1, plovimo galia, gauta tyrimuose, aprašytuose 1 pavyzdyje, lyginant su natyvia PB92 proteaze, kaip jų specifinio aktyvumo funkcija. Skaičiai diagramoje atitinka šias proteazes:
1 PB92 proteazė 11 M216P
2 M216A 12 M216T
3 M216C 13 M216W
4 M216S 14 M216I
5 M216L 15 M216G
6 M216E 16 M117L, H118D
7 M216K 17 M117L, M216Q
8 M216H 18 M117L, H118D
9 M216N 19 M117L, M216S
10 M216Q 20 M117L, H118D
21 M169S 31 S259K
22 M216Y 32 W235R
23 M169I, M216S 33 H243R
24 M216-ox 34 H243R, S259K
25 N212S 35 D175N
26 N212D 36 E134K
27 S160G, N212D 37 W235R, S259K
28 L211Y 38 W235R, H243K
29 L211Y, N212S 39 S259K
30 A166D, M169I 40 T207K
M216Q
M216S
41 S160N 51 S160I
42 S160G 52 S160G, M216S
43 S160P 53 S160G, M216Q
44 S160T 54 S160L
45 S160C 55 S160Y
46 S160Q 56 S160D, M216S
47 S160D 57 G116V, S126V, P127E, S128K
48 S160K 58 G116V, S126L, P127N, S128V
49 S160R 59 G116V, S126L, P127Q, S128A
50 S160A 60 G116V, S126V, P127M
61 S126M, P127A, S128G
62 G116V, S126Y, P127G, S128L
63 G116V, S126N, P127H, S128I
64 G116V, S126H, P127Y,
65 G116V, S126R, P127S, S128P
66 G116V, S126F, P127Q,
67 G116V, S126G, P127Q, S128I
68 G116V, S126F, P127L, S128T
69 G116V, S126Q, P127D,
Fig. 3 pavaizduota įvairių PB92 proteazės mutantų, 5 esančių 7 g IEC/1, plovimo galia, nustatyta, kaip aprašyta 1 pavyzdyje, lyginant su natyvia PB92 proteaze, kaip jos specifinio aktyvumo funkcija. Skaičiai diagramoje atitinka tas pačias mutantines proteazes, kaip ir Fig. 2A ir 2B.
Visos publikacijos (taip pat ir patentinės paraiškos), paminėtos šiame aprašyme, informatyvios tik paruoštam specialistui tos srities, kuriai skirtas šis išradimas. Visos publikacijos pateiktos nuorodų pavidalu tokiu bū15 du, lyg kiekviena iš jų būtų specialiai duodama kaip nuoroda.
Nors šis išradimas pakankamai iliustruotas ir pateikti pavyzdžiai jam paaiškinti, specialistui akivaizdu, kad čia galimi įvairūs pakeitimai ir modifikacijos, nenutolstant nuo išradimo apibrėžties dvasios ir turinio.

Claims (10)

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
1. Fermentinis produktas, besiskirianti tuo, kad susideda iš mutantinio proteolitinio fermento, gauto ekspresuojant geną, koduojantį šį fermentą su aminorūgščių seka, besiskiriančia bent viena aminorūgštimi nuo laukinio tipo fermento, be to, šis mutantinis fermentas pasižymi tuo, kad jo savybės daro jį labiau tinkamą panaudoti plovikliuose.
2. Fermentinis produktas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutantinis proteolitinis fermentas pasižymi didesne plovimo galia skalbimo detergentuose.
3. Fermentinis produktas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutantinis proteolitinis fermentas pasižymi didesniu stabilumu laikant skalbimo detergentuose, išsaugodamas plovimo galią.
4. Fermentinis produktas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo,kad mutantinis proteolitinis fermentas pasižymi didesniu stabilumu, kas pasireiškia atsparumu oksidantams.
5. Fermentinis produktas pagal bet kurį iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad mutantinis proteolitinis fermentas yra kilęs iš gamtinės bakterinės serino proteazes.
6. Fermentinis produktas pagal bet kurį iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas yra kilęs iš laukinio tipo alkalofilinio Bacillus kamieno .
7. Fermentinis produktas pagal bet kurį iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad nurodytas genas yra kilęs iš laukinio tipo geno, kamieno, atrinkto iš grupės, jungiančios B. subtilis, B. licheniformis ir B. amyloliąuefaciens.
8. Fermentinis produktas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad laukinio tipo genas koduoja aminorūgščių seką, kuri mažiausiai 70% yra homologiška PB92 serino proteazės aminorūgščių sekai.
9. Fermentinis produktas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad laukinio tipo genas iš esmės koduoja tokią aminorūgščių seką:
H^N-A-ų-S-V-P-i-G-I-S-R-V-G-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-AV-L-D-T-C-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-P-V-P-C-K-P-S-T-Q-D-G-NG-H-G-T-H-V-A-C-T-I-A-A-L-N-N-S-I-C-V-L-C-V-A-P-H-A-E-L-Y-A-VK—V—Ir-G—A—S—G—S—G—S—V—S—S—I—A—Q—G—L—E—H—A.—G—N—N—C ·Μ ·Η V—A—N—L—
S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-C-NS-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-«-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-SQ-Y-C-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-&-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-C-S-C-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
10. Fermentinis produktas pagal 9 punktą, besiski riantis tuo, kad laukinio tipo genas yra kilęs iš naujos PB92 Bacillus rūšies.
11. Fermentinis produktas, susidedantis iš mutantinio proteolitinio fermento, besiskiriantis tuo, kad pagerintos jo savybės daro jį labiau tinkamą panaudoti plovikliuose, lyginant su laukinio tipo fermentu; jo aminorūgščių seka iš esmės atitinka PB92 proteazės aminorūgščių seką, turi mažiausiai vienos iš šių aminorūgščių 116, 126,127, 128, 160, 166, 169, 212 ir 216 mutaciją.
12. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad įvykdyta mutacija 116 aminorūgšties vietoje, pakeičiant gliciną aukštesnio molekulinio svorio nepoliarine alifatinė aminorūgštimi.
13. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad 126 aminorūgšties mutacija įvykdyta, pakeičiant seriną bet kuria nehidroksilinta aminorūgštimi; 127 aminorūgšti pakeičiant bet kuria kita aminorūgštimi; 128 aminorūgštį pakeičiant bet kuria kita aminorūgštimi.
14. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad 216 aminorūgšties mutacija įvyksta, pakeičiant metioniną kita tiorūgštimi.
15. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutacija prie 160 aminorūgšties įvyksta, pakeičiant ją glicinu arba anijonine aminorūgštimi.
16. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutacija prie 166 aminorūgšties įvyksta, pakeičiant ją anijonine aminorūgštimi .
17. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mutacija prie 169 aminorūgšties įvyksta, pakeičiant ją nepoliarine alifatine aminorūgštimi.
18. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo,kad mutacija prie 212 aminorūgšties įvyksta, pakeičiant ją anijonine aminorūgštimi .
19. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mažiausiai viena mutacija, įvyksta, pakeičiant neutralią aminorūgštį anijoninė aminorūgštimi .
20. Fermentinis produktas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad mažiausiai viena mutacija Įvyksta 116 aminorūgšties vietoje, gliciną pakeičiant valinu, izoleicinu arba leicinu.
21. Fermentinis produktas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi mažiausiai vieną papildomą mutaciją 126, 127 ar 128 vietoje.
22. Mutantinis proteolitinis fermentas pagal bet kurį iš 1-21 punktų, besiskiriantis tuo, kad yra atrinktas iš grupės PB92 serino proteazės mutantų,
būtent: [ M216S] ; [ M216Q] ; [ N212D] ; [ S160D] ; [ S160G, N212D] ; [S160D, M216Q] ; [ S160D, M216S] ; [ Al66D, M169I] ; [ G116V, S126V, P127E, S128K] ; [ G116V, S126G, P127Q, S128I] ; [ G116V, S126L, P127N, S128V] ; [ G116V, S126L, P127Q, S128A] ; [ G116V, S126V, P127M] ; [ G116V, S126H, P127Y] ; [ G116V, S126R, P127S, S128P] ; [ G116V, S126F, P127Q] ; [ G116V, S126F, P127L, S128T] ; [ S126M, P127A, S128G] ; P127S, [ S126M, P127A, S128G, S160D] ir S128A, S160D] . [ G116V, S126N, 23. Proteolitinio fermento, labiau tinkamo panaudoti plovikliuose, atrankos būdas, b e s i s k tuo, kad susideda iš stadijų: iria n t i s
mutagenezė klonuoto geno, koduojančio dominantį fermentą arba jo fragmentą;
gautos mutantinės proteazės išskyrimas, ir identifikavimas mutantinių proteazių su pagerintomis savybėmis panaudojimui plovikliuose.
24. Mutantinis genas, koduojantis mutantinį proteolitini fermentą pagal 1-22 punktus.
25. Ekspresijos vektorius, turintis mutantinį geną pagal 24 punktą.
26. Prokariotinis kamienas-šeimininkas, transformuotas ekspresijos vektoriaus pagal 25 punktą pagalba.
27. Transformuotas prokariotinis kamienas-šeimininkas pagal 26 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra Bacillus.
28. Transformuotas prokariotinis kamienas-šeimininkas pagal 27 punktą, besiskiriantis tuo, kad priklauso alkalofilinei Bacillus rūšiai.
29. Transformuotas prokariotinis kamienas šeimininkas pagal 28 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra nauja Bacillus PB92 arba jos mutantas.
30. Transformuotas kamienas-šeimininkas pagal 27 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra atrinktas iš grupės B. subtilis, B. licheniformis ir B. amyloliąuefaciens.
31. Kamienas-šeimininkas pagal bet kurį iš 26-30 punktų, besiskiriantis tuo, kad iki transformacijos iš esmės nesugeba gaminti neląstelinių proteolitinių fermentų.
32. Mutantinio proteolitinio fermento pagal bet kurį iš 1-22 punktų gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima kamieno-šeimininko, transformuoto ekspresijos vektoriumi, turinčiu mutantinį proteolitinį geną, kultivavimą atitinkamose fermentacijos sąlygose ir pagaminto fermento išskyrimą.
33. Ploviklio kompozicija su fermentiniais priedais, besiskirianti tuo, kad tokiu priedu gali būti vienas ar keli fermentiniai produktai pagal 122 punktus.
34. Vieno ar kelių mutantiniu proteolitinių fermentų pagal 1-22 punktus panaudojimas ploviklių kompozicijose .
10 35. Vieno ar kelių mutantiniu proteolitinių fermentų pagal 1-22 punktus panaudojimas skalbimo procese.
LTIP1650A 1988-02-11 1993-12-21 Enzymatic product containing mutant proteolytic enzyme, process for selecting proteolytic enzyme, mutant gene, expression vector, procariotic host-strain, process for preparing mutant proteolytic enzyme, detergent composition LT3963B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP88200255 1988-02-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1650A LTIP1650A (en) 1995-07-25
LT3963B true LT3963B (en) 1996-05-27

Family

ID=8199752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1650A LT3963B (en) 1988-02-11 1993-12-21 Enzymatic product containing mutant proteolytic enzyme, process for selecting proteolytic enzyme, mutant gene, expression vector, procariotic host-strain, process for preparing mutant proteolytic enzyme, detergent composition

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5336611A (lt)
EP (3) EP0328229B2 (lt)
JP (1) JP2849141B2 (lt)
KR (1) KR970005249B1 (lt)
CN (1) CN1056187C (lt)
AT (1) ATE250669T1 (lt)
AU (1) AU629814B2 (lt)
BG (1) BG60566B1 (lt)
BR (1) BR8905580A (lt)
CA (1) CA1340366C (lt)
DE (2) DE68929484T3 (lt)
DK (1) DK175813B1 (lt)
ES (1) ES2061929T5 (lt)
FI (1) FI105481B (lt)
GR (1) GR3021934T3 (lt)
IE (2) IE63248B1 (lt)
LT (1) LT3963B (lt)
LV (1) LV10652B (lt)
PT (1) PT89702B (lt)
RU (1) RU2069695C1 (lt)
WO (1) WO1989007642A1 (lt)

Families Citing this family (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4760025A (en) * 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US5185258A (en) † 1984-05-29 1993-02-09 Genencor International, Inc. Subtilisin mutants
JP2731407B2 (ja) * 1987-04-03 1998-03-25 アムジエン・インコーポレーテツド 新規なプロテアーゼ酵素
US6287841B1 (en) 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
JPH04500385A (ja) * 1989-06-26 1992-01-23 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ 酵素洗剤組成物
US5665587A (en) * 1989-06-26 1997-09-09 Novo Nordisk A/S Modified subtilisins and detergent compositions containing same
DK0414297T3 (da) * 1989-08-11 1997-07-07 Genencor Int Effektiv fremstilling af mutantproteaser
DE4023458A1 (de) * 1989-08-31 1991-03-07 Kali Chemie Ag Neue hochalkalische proteasen
US5352603A (en) * 1989-08-31 1994-10-04 Kali-Chemie Ag Highly alkaline proteases
US6271012B1 (en) * 1989-10-11 2001-08-07 Genencor International, Inc. Protease muteins and their use in detergents
DK97190D0 (da) * 1990-04-19 1990-04-19 Novo Nordisk As Oxidationsstabile detergentenzymer
US5733473A (en) * 1990-11-14 1998-03-31 The Procter & Gamble Company Liquid detergent composition containing lipase and protease
DK271490D0 (da) * 1990-11-14 1990-11-14 Novo Nordisk As Detergentkomposition
DK0486073T3 (da) * 1990-11-14 1996-12-09 Procter & Gamble Væskeformig detergentsammensætning, der indeholder lipase og protease
GB9027836D0 (en) * 1990-12-21 1991-02-13 Unilever Plc Enzymes and enzymatic detergent compositions
US5482849A (en) * 1990-12-21 1996-01-09 Novo Nordisk A/S Subtilisin mutants
DE4106525A1 (de) * 1991-03-01 1992-09-10 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Verfahren zur verbesserung der stabilitaet von hochalkalischen proteasen
US5863783A (en) * 1991-03-27 1999-01-26 Gist-Brocades, N.V. Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
DK58391D0 (da) * 1991-04-03 1991-04-03 Novo Nordisk As Hidtil ukendte proteaser
EP0583339B1 (en) * 1991-05-01 1998-07-08 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes and detergent compositions
US5340735A (en) * 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
US5510048A (en) * 1991-05-31 1996-04-23 Colgate Palmolive Co. Nonaqueous liquid, phosphate-free, improved autoamatic dishwashing composition containing enzymes
EP0525610A3 (en) * 1991-07-27 1993-03-24 Solvay Enzymes Gmbh & Co. Kg Process for increasing the stability of enzymes and stabilized enzymes
US5792623A (en) * 1992-04-06 1998-08-11 Immuno Aktiengesellschaft Method for producing activated blood factors with a protease and a detergent
AT397390B (de) * 1992-04-06 1994-03-25 Immuno Ag Verfahren zur spaltung von proteinen
EP0571014B1 (en) * 1992-05-18 2004-03-31 Genencor International, Inc. Bacteria producing alkaline proteases, and production of these alkaline proteases
ATE376061T1 (de) * 1992-07-17 2007-11-15 Genencor Int Hochalkalische serinproteasen
DE69334295D1 (de) * 1992-07-23 2009-11-12 Novo Nordisk As MUTIERTE -g(a)-AMYLASE, WASCHMITTEL UND GESCHIRRSPÜLMITTEL
US5989887A (en) * 1992-11-25 1999-11-23 Dsm N.V. Cloning and expression of DNA molecules incoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
DE4304161A1 (de) * 1993-02-12 1994-08-25 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Verbesserte hochalkalische Proteasen
US6436690B1 (en) 1993-09-15 2002-08-20 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
US6440717B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-27 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
AU8079794A (en) * 1993-10-14 1995-05-04 Procter & Gamble Company, The Protease-containing cleaning compositions
US5932532A (en) * 1993-10-14 1999-08-03 Procter & Gamble Company Bleach compositions comprising protease enzyme
US5677272A (en) * 1993-10-14 1997-10-14 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising protease enzymes
MA23346A1 (fr) 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
ES2364776T3 (es) * 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG &amp; CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
DE4411223A1 (de) * 1994-03-31 1995-10-05 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Verwendung alkalischer Proteasen in gewerblichen Textilwaschverfahren
US6599730B1 (en) * 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
ES2180645T3 (es) * 1994-06-17 2003-02-16 Genencor Int Metodo de limpieza basado en composiciones que contienen una enzima capaz de degradar las paredes celulares de las plantas y su uso en metodos de limpieza.
US6066611A (en) * 1994-10-13 2000-05-23 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising protease enzymes
US5714373A (en) * 1995-02-27 1998-02-03 Recombinant Biocatalysis, Inc. Thermococcus AV4 and enzymes produced by the same
US6455295B1 (en) 1995-03-08 2002-09-24 The Procter & Gamble Company Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
IL117350A0 (en) * 1995-03-09 1996-07-23 Procter & Gamble Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) 1995-03-09 2002-11-05 Procter & Gamble Company Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6682924B1 (en) * 1995-05-05 2004-01-27 Novozymes A/S Protease variants and compositions
DE19530816A1 (de) * 1995-08-23 1997-02-27 Cognis Bio Umwelt Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten
EP2278001B1 (en) † 1996-11-04 2013-10-23 Novozymes A/S Protease variants and compositions
WO1998023732A2 (en) 1996-11-26 1998-06-04 Genencor International, Inc. Chemically modified enzymes
ES2368718T3 (es) 1997-10-23 2011-11-21 Danisco Us Inc. Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones.
MA25044A1 (fr) * 1997-10-23 2000-10-01 Procter & Gamble Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees.
US6395532B1 (en) 1998-01-23 2002-05-28 Genencor International, Inc. Modified enzymes and their use for peptide synthesis
US6642011B2 (en) 1998-04-15 2003-11-04 Genencor International, Inc. Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins
ATE407941T1 (de) 1998-07-02 2008-09-15 Univ Toronto Mit einer kohlenhydratgruppe chemisch modifizierte proteine
US6831053B1 (en) 1998-10-23 2004-12-14 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants
AU772427B2 (en) 1998-11-10 2004-04-29 Genencor International, Inc. Chemically modified mutant serine hydrolases show improved catalytic activity and chiral selectivity
DE69941223D1 (de) 1998-12-21 2009-09-17 Billig Fritz Chemisch modifizierte enzymen mit mehrfachgeladenen varianten
KR20000065867A (ko) * 1999-04-09 2000-11-15 손경식 세탁세제용 알칼리성 단백질 분해효소 브이에이피케이, 이를 코딩하는 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환된 균주
JP5180417B2 (ja) 1999-04-28 2013-04-10 ジェネンコー・インターナショナル・インク 特異的に標的化された触媒性アンタゴニストおよびその使用
US6627744B2 (en) 1999-07-02 2003-09-30 Genencor International, Inc. Synthesis of glycodendrimer reagents
US6727085B2 (en) * 1999-12-15 2004-04-27 Fanoe Tina Sejersgaard Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains
US6777218B1 (en) * 2000-03-14 2004-08-17 Novozymes A/S Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains
US6541234B1 (en) * 2000-09-11 2003-04-01 University Of Maryland Biotechnology Institute Calcium free subtilisin mutants
US6541235B1 (en) * 2000-09-29 2003-04-01 University Of Maryland Biotechnology Institute Calcium free subtilisin mutants
DK200101090A (da) 2001-07-12 2001-08-16 Novozymes As Subtilase variants
DE10153792A1 (de) 2001-10-31 2003-05-22 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten
DE10162728A1 (de) 2001-12-20 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
DE10162727A1 (de) 2001-12-20 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
DE10163884A1 (de) 2001-12-22 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
BR0215383A (pt) 2001-12-31 2006-11-28 Genencor Int proteases que produzem resposta imunogênica alterada e métodos de fabricação e uso das mesmas
JP4703113B2 (ja) * 2002-01-16 2011-06-15 ジェネンコー・インターナショナル・インク 複数置換プロテアーゼ変異体
CA2472723C (en) * 2002-01-16 2013-12-17 Genencor International, Inc. Multiply-substituted protease variants
EP1495128B1 (en) 2002-03-29 2014-05-07 Genencor International, Inc. Ehanced protein expression in bacillus
US7888093B2 (en) 2002-11-06 2011-02-15 Novozymes A/S Subtilase variants
DE10260903A1 (de) * 2002-12-20 2004-07-08 Henkel Kgaa Neue Perhydrolasen
EP1735339A2 (en) * 2004-04-09 2006-12-27 Genencor International, Inc. Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus
CA2643265C (en) * 2006-03-02 2014-07-29 Genencor Division Danisco Us, Inc. Surface active bleach and dynamic ph
RU2509152C2 (ru) * 2006-07-18 2014-03-10 ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН Cпособ мытья посуды
US20080090745A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Fox Bryan P Expression of Streptomyces subtilism inhibitor (SSI) proteins in Bacillus and Streptomyces sp.
CA2680563A1 (en) * 2007-03-12 2008-09-18 Danisco Us Inc. Modified proteases
EP2460823B1 (en) 2007-05-10 2014-02-26 Danisco US Inc. A modified secretion system to increase expression of polypeptides in bacteria
RU2569106C2 (ru) * 2007-06-06 2015-11-20 ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН Способы улучшения эффективности белков
EP2171057B1 (en) 2007-06-06 2015-09-30 Danisco US Inc. Methods for improving protein properties
DE102007044415A1 (de) 2007-09-17 2009-03-19 Henkel Ag & Co. Kgaa Leistungsverbesserte Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen
US20110147419A1 (en) * 2007-12-14 2011-06-23 Atsushi Tada Pressure accumulation dispenser
AU2008348270A1 (en) 2007-12-21 2009-07-30 Danisco Us Inc. Enhanced protein production in bacillus
US20090233830A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-17 Penny Sue Dirr Automatic detergent dishwashing composition
EP2100947A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
CA2719314A1 (en) * 2008-03-28 2009-10-01 Danisco Us Inc. Method for amplifying locus in bacterial cell
BRPI0921827A2 (pt) * 2008-11-11 2016-09-27 Danisco Us Inc composições e métodos compreendendo uma variante de subtilisina
US20100152088A1 (en) * 2008-11-11 2010-06-17 Estell David A Compositions and methods comprising a subtilisin variant
EP2213715A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-04 The Procter & Gamble Company Liquid hand dishwashing detergent composition
EP2216392B1 (en) * 2009-02-02 2013-11-13 The Procter and Gamble Company Liquid hand dishwashing detergent composition
WO2010088165A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 The Procter & Gamble Company Liquid hand dishwashing detergent composition
PL2213713T3 (pl) * 2009-02-02 2014-07-31 Procter & Gamble Płynna kompozycja środka czyszczącego do ręcznego mycia naczyń
EP2216391A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-11 The Procter & Gamble Company Liquid hand dishwashing detergent composition
EP2216390B1 (en) * 2009-02-02 2013-11-27 The Procter and Gamble Company Hand dishwashing method
EP2216393B1 (en) * 2009-02-09 2024-04-24 The Procter & Gamble Company Detergent composition
AR076941A1 (es) 2009-06-11 2011-07-20 Danisco Us Inc Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina
GB0915572D0 (en) 2009-09-07 2009-10-07 Reckitt Benckiser Nv Detergent composition
JP6204018B2 (ja) * 2009-09-25 2017-09-27 ノボザイムス アクティーゼルスカブ プロテアーゼ変異体の使用
CN108410585A (zh) * 2010-05-06 2018-08-17 宝洁公司 具有蛋白酶变体的消费品
DK3421595T3 (da) 2011-06-30 2020-10-26 Novozymes As Alfa-amylasevarianter
CN102277344B (zh) * 2011-08-03 2012-12-12 天津科技大学 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法
DE102013219467A1 (de) * 2013-09-26 2015-03-26 Henkel Ag & Co. Kgaa Stabilisierte Inhibitor-Proteasevarianten
JP6585602B2 (ja) 2013-12-31 2019-10-02 ダニスコ・ユーエス・インク タンパク質発現の増大
DE102014212639A1 (de) * 2014-06-30 2015-12-31 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungsmittel enthaltend Proteasen
US20180002642A1 (en) * 2014-10-27 2018-01-04 Danisco Us Inc. Serine proteases
KR102500121B1 (ko) 2014-12-16 2023-02-20 다니스코 유에스 인크. 향상된 단백질 발현
EP3234149A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 Danisco US Inc. Enhanced protein expression
AR104783A1 (es) 2015-05-08 2017-08-16 Novozymes As VARIANTES DE a-AMILASA Y POLINUCLEÓTIDOS QUE LAS CODIFICAN
US10316275B2 (en) 2015-05-08 2019-06-11 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP3380608A1 (en) * 2015-11-24 2018-10-03 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3464538A1 (en) * 2016-05-31 2019-04-10 Novozymes A/S Stabilized liquid peroxide compositions
DE102016210628A1 (de) 2016-06-15 2017-12-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Bacillus gibsonii Protease und Varianten davon
JP7231228B2 (ja) 2017-02-24 2023-03-01 ダニスコ・ユーエス・インク バチルス・リケニフォルミスにおける増加したタンパク質産生のための組成物及び方法
WO2019040412A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Danisco Us Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR EFFICIENT GENETIC MODIFICATION OF BACILLUS LICHENIFORMIS STRAINS
JP7218985B2 (ja) 2017-09-13 2023-02-07 ダニスコ・ユーエス・インク バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるタンパク質産生の増加のための改変５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）配列
WO2019089898A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Danisco Us Inc Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes
JP7280269B2 (ja) 2018-01-03 2023-05-23 ダニスコ・ユーエス・インク タンパク質の産生増加のための変異及び遺伝子改変バチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、並びにその方法
US20200032178A1 (en) * 2018-07-27 2020-01-30 The Procter & Gamble Company Water-soluble unit dose articles comprising water-soluble fibrous structures and particles
JP2023524334A (ja) 2020-01-15 2023-06-12 ダニスコ・ユーエス・インク バチルス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における強化したタンパク質産生のための組成物及び方法
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2023023644A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Danisco Us Inc. Polynucleotides encoding novel nucleases, compositions thereof and methods thereof for eliminating dna from protein preparations
WO2024186819A1 (en) * 2023-03-06 2024-09-12 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1353317A (en) 1970-03-03 1974-05-15 Koninklijke Gist Spiritus Enzyme-polymer complexes
US4318818A (en) 1979-11-09 1982-03-09 The Procter & Gamble Company Stabilized aqueous enzyme composition
US4480037A (en) 1982-02-08 1984-10-30 Showa Denko Kabushiki Kaisha Alkaline protease and preparation method thereof
EP0126505A1 (en) 1983-04-26 1984-11-28 Unilever N.V. Aqueous enzyme-containing compositions with improved stability
EP0130756A1 (en) 1983-06-24 1985-01-09 Genencor International, Inc. Procaryotic carbonyl hydrolases, methods, DNA, vectors and transformed hosts for producing them, and detergent compositions containing them
EP0170360A1 (en) 1984-05-29 1986-02-05 Novo Nordisk A/S Enzyme containing granulates suitable for use as detergent additives
EP0199405A2 (en) 1985-04-15 1986-10-29 The Procter & Gamble Company Liquid detergents containing surfactant, proteolytic enzyme and boric acid
GB2178055A (en) 1985-07-26 1987-02-04 Colgate Palmolive Co Stabilized built liquid detergent composition containing enzymes
EP0220921A2 (en) 1985-10-22 1987-05-06 Genex Corporation Heat stable alkaline proteases produced by a bacillus
EP0232269A1 (de) 1984-10-05 1987-08-19 Zahnradfabrik Friedrichshafen Servolenkung, insbesondere für kraftfahrzeuge.
WO1987005050A1 (en) 1986-02-12 1987-08-27 Genex Corporation Mutagenesis and screening method and product
EP0238216A1 (en) 1986-02-20 1987-09-23 Albright &amp; Wilson Limited Protected enzyme systems

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1240058A (en) * 1968-04-12 1971-07-21 Procter & Gamble Enzyme-containing detergent compositions
GB1519148A (en) * 1974-11-19 1978-07-26 Gist Brocades Nv Compositions of matter
US4760025A (en) * 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US4511490A (en) * 1983-06-27 1985-04-16 The Clorox Company Cooperative enzymes comprising alkaline or mixtures of alkaline and neutral proteases without stabilizers
EP0254735B2 (en) * 1986-01-15 1998-06-17 Amgen Inc. METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS
US4990452A (en) * 1986-02-12 1991-02-05 Genex Corporation Combining mutations for stabilization of subtilisin
ATE116365T1 (de) * 1986-04-30 1995-01-15 Genencor Int Mutante einer nicht menschlichen carbonyl- hydrolase, für diese kodierende dns-sequenzen und vektoren und durch diese vektoren transformierte wirte.
EP0479396B1 (en) * 1987-02-27 1999-06-09 Genencor International, Inc. Transformation of alkalophilic bacillus strains
ATE371029T1 (de) * 1987-04-06 2007-09-15 Novozymes As Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-bindungsstellen zur stabilisierung von proteinen
US4914031A (en) * 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1353317A (en) 1970-03-03 1974-05-15 Koninklijke Gist Spiritus Enzyme-polymer complexes
US4318818A (en) 1979-11-09 1982-03-09 The Procter & Gamble Company Stabilized aqueous enzyme composition
US4480037A (en) 1982-02-08 1984-10-30 Showa Denko Kabushiki Kaisha Alkaline protease and preparation method thereof
EP0126505A1 (en) 1983-04-26 1984-11-28 Unilever N.V. Aqueous enzyme-containing compositions with improved stability
EP0130756A1 (en) 1983-06-24 1985-01-09 Genencor International, Inc. Procaryotic carbonyl hydrolases, methods, DNA, vectors and transformed hosts for producing them, and detergent compositions containing them
EP0170360A1 (en) 1984-05-29 1986-02-05 Novo Nordisk A/S Enzyme containing granulates suitable for use as detergent additives
EP0232269A1 (de) 1984-10-05 1987-08-19 Zahnradfabrik Friedrichshafen Servolenkung, insbesondere für kraftfahrzeuge.
EP0199405A2 (en) 1985-04-15 1986-10-29 The Procter & Gamble Company Liquid detergents containing surfactant, proteolytic enzyme and boric acid
GB2178055A (en) 1985-07-26 1987-02-04 Colgate Palmolive Co Stabilized built liquid detergent composition containing enzymes
EP0220921A2 (en) 1985-10-22 1987-05-06 Genex Corporation Heat stable alkaline proteases produced by a bacillus
WO1987005050A1 (en) 1986-02-12 1987-08-27 Genex Corporation Mutagenesis and screening method and product
EP0238216A1 (en) 1986-02-20 1987-09-23 Albright &amp; Wilson Limited Protected enzyme systems

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. E. STAUFFER AND DON ETSON: "The Effect on Subtilisin Activity of Oxidizing a Methionine Residue", J. BIOL. CHEM., 1969, pages 5333 - 5338
HUI A. ET AL.: "Mutagenesis of the three bases preceding the start codon of the beta-galactosidase mRNA and its effect on translation in Escherichia coli.", EMBO J., 1984
LIN Y, MEANS GE, FEENEY RE: "The action of proteolytic enzymes on N,N-dimethyl proteins. Basis for a microassay for proteolytic enzymes", J. BIOL. CHEM., 1969, pages 789 - 793
ROBERT J. DELANGE AND EMIL L. SMITH: "Subtilisin Carlsberg: II. SEQUENCES OF THE TRYPTIC PEPTIDES", J. BIOL. CHEM., 1968, pages 2143 - 2164

Also Published As

Publication number Publication date
EP0328229A1 (en) 1989-08-16
DK175813B1 (da) 2005-03-07
IE890446L (en) 1989-08-11
DE68912359T2 (de) 1994-06-09
BG89942A (bg) 1993-12-24
LV10652B (en) 1995-08-20
GR3021934T3 (en) 1997-03-31
DK501289D0 (da) 1989-10-10
DE68929484T3 (de) 2009-06-25
DE68912359D1 (de) 1994-03-03
PT89702A (pt) 1989-10-04
EP0571049B1 (en) 2003-09-24
EP0328229B2 (en) 1996-10-30
IE940164L (en) 1989-08-11
WO1989007642A1 (en) 1989-08-24
ATE250669T1 (de) 2003-10-15
BR8905580A (pt) 1990-08-14
US5336611A (en) 1994-08-09
ES2061929T5 (es) 1997-03-16
EP0571049A1 (en) 1993-11-24
DE68929484T2 (de) 2004-07-22
CN1036602A (zh) 1989-10-25
EP0328229B1 (en) 1994-01-19
BG60566B1 (en) 1995-08-28
FI105481B (fi) 2000-08-31
EP1160327A2 (en) 2001-12-05
IE63248B1 (en) 1995-04-05
KR970005249B1 (ko) 1997-04-14
KR900700597A (ko) 1990-08-16
FI894799A0 (fi) 1989-10-10
AU3050189A (en) 1989-09-06
JP2849141B2 (ja) 1999-01-20
EP0571049B2 (en) 2008-09-03
DE68929484D1 (de) 2003-10-30
DE68912359T3 (de) 1998-01-08
JPH02503986A (ja) 1990-11-22
LV10652A (lv) 1995-04-20
RU2069695C1 (ru) 1996-11-27
EP1160327A3 (en) 2002-11-06
DK501289A (da) 1989-12-07
PT89702B (pt) 1994-04-29
AU629814B2 (en) 1992-10-15
LTIP1650A (en) 1995-07-25
ES2061929T3 (es) 1994-12-16
CN1056187C (zh) 2000-09-06
CA1340366C (en) 1999-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT3963B (en) Enzymatic product containing mutant proteolytic enzyme, process for selecting proteolytic enzyme, mutant gene, expression vector, procariotic host-strain, process for preparing mutant proteolytic enzyme, detergent composition
US5324653A (en) Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins
US6271012B1 (en) Protease muteins and their use in detergents
US6808913B2 (en) Useful mutations of bacterial alkaline protease
DE69839076T2 (de) Proteasevarianten und zusammensetzungen
US5801039A (en) Enzymes for detergents
DE69535736T2 (de) Verbesserte enzyme und diese enthaltene detergentien
JPH09512433A (ja) ズブチリシンｂｐｎ′変異体を含む布帛クリーニング組成物
DK175855B1 (da) Mutantprotease og protease til anvendelse i vaskemidler, DNA-sekvens, der koder for en sådan protease, ekspressionsvektor, der omfatter denne DNA-sekvens, prokaryotisk værtsstamme transformeret med en sådan vektor, fremgangsmåde til.....
MXPA99004150A (en) Subtilase variants and compositions

Legal Events

Date Code Title Description
PC9A Transfer of patents

Free format text: GENENCOR INTERNATIONAL INC., 4 CAMDRIDGE PLACE, 1870 SOUTH WINTON ROAD, ROCHESTER NY 14618,US,960826

MM9A Lapsed patents

Effective date: 19971221