BG60566B1 - Method for the preparation of proteolytic enzymes - Google Patents

Description

Изобретението се отнася до метод за получаване на нови протеолитични ензими, които се прилагат в съставка на детергенти.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА.

Известна е употребата на ензимни добавки, по-специално на протеолитични ензими в детергентни състави, за да бъдат в състояние да отстраняват замърсявания на базата на протеин, описани в публикациите ЕР А 0220921 и ЕР А 0232269; US 4 480 037 и USR е 30602 и статията “Production of Microbial Enzymes”, Microbial Technology, vol. 1 (1979) 281-311, Academic Press.

Детергентните съставки могат да бъдат във вид на прах течност или паста. Те съдържат едно или повече анионни, нейонни, катионни, амфионни или амфотерни съединения като детергентен активен материал. Такива съединения са описани в литературата “Surface Active Agents”, Vol. II by Schwartz,Perry and Berch, Interscience Publishers (1958). Освен това, те могат да включват образуващи комплексно съединение агенти, стабилизиращи съединения, ароматизиращи съединения и в някои случаи окисляващи агенти, обикновено наричани избелители. Детергентни състави се използват за трудно почистващи се повърхности, почистване на тоалетни, за измиване на съдове (автоматично или ръчно) и за пране с пералня.

Перилните детергенти обикновено се разделят на два главни типа, течни и прахове. Течните перилни детергенти имат висока концентрация на повърхностно активни вещества, неутрално до умерено алкално pH и обикновено не съдържат избелващите средства. Повечето детергенти във вид на прах имат висока алкалност /рН 9-11/, съдържат компелксообразуващи агенти като натриев триполифосфат и в зависимост от навиците за пране в страните, в които се продават, те могат да съдържат или да не съдържат избелващи агенти.

Обикновено използваните ензими в детергентните състави се прибавят в течна суспензия, золна или гранулна форма. Например, в детергентите във вид на прахове протеоли тичните ензими обикновено се намират в капсулирана форма, като бисерка /напр на Maxatase* Maxacal^R /или гранулата/ напр. на Savinase” и Alcalase’/.Maxatase и Maxacai се продават от International Bio-synthetics B.V./Rijswilk, Холандия, Savinase и Alcalase се продават от NOVO Industri A/S/Bagsvaerd, Дания/. В течни перилни детергенти ензимите присъстват главно във вид на разтвор.

Обикновено е трудно протеолитичните ензими да се комбинират с детергентни състави. Те трябва да бъдат стабилни и активни през време на приложението, например при отстраняване на петна с белтъчен произход от текстил по време на пране при температура от 10°С до над 60°С. Освен това, те трябва да бъдат стабилни за продължителни периоди от време при съхранението на детергентния продукт. И още, ензимите трябва да бъдат стабилни и функционални в присъствието на комплексообразуващи агенти, повърхностно активни вещества, на висока алкалност, в някои случай на избелващи агенти и висока температура. Тъй като не съществуват нито универсални перилни детергенти, нито универсални перилни условия /pH, температура, концентрация на сапунена пяна, твърдост на водата/, търсенето на ензими може да варира на базата на типа детергент, в който те се използват и в зависимост от перилните условия.

Условията, влияещи на стабилността на ензимите в прахови детергентиц обикновено не са оптимални. Например, по време на съхранението на ензимните препарати в прахови детергенти, въпреки явното физическо разделяне на ензима от детергентната маса чрез капсулиране на ензима, окисляващите агенти от детергента влияят на проте0зата и намаляват нейната активност. Друг случай на нестабилност на ензима в праховите детергенти по време на съхраните е авторазлагането, особено при висока относителна влажност.

Освен това, окисляващите агенти, които често се намират в праховите детергенти, имат съществен недостатък по отношение на ефикасността на отстраняване на петната по време на приложение в перални чрез фиксиране на петната с белтъчен произход към тъканта. Допълнително тези окисляващи агенти и другите детергентни съединения например комплексообразуващите агенти, намаля ват ефективността на протеазата при отстраняване на петна, също и по време на перилния процес.

В течните детергенти съществува доказан на практика важен проблем, състоящ се в бързо дезактивиране на ензимите, особено при високи температури. Тъй като ензимите се намират в детергентния продукт в разтвор, това дезактивиране вече се извършва в детергентния продукт по време на нормалните условия на съхранение и значително намалява активността на ензимитец преди продуктът да е използван на практика. При дадени аниионни повърхностно активни вещества, такива като алкилеулфати, в комбинации с вода и пълнители, имат склонност да денатурират ензимната необратимост и го правят неактивен или податлив на протеолитично разлагане.

Открити са парциални разтвори във връзка с проблемите на стабилизиране на ензимите в течни детергенти, при адаптация на течните детергенти форми като използване на стабилизиращи агенти, намаляващи дезактивирането на ензимите в описано в ЕР-А-0126505, ЕР-А0199405, Patent US No 4,318,818 US, Patent Applicetion No 2178055A.

Описана е и друга възможност за осигуряване на стабилността на ензимите в течните детергенти ЕР-А-0238216, където физическото разделяне между ензимните молекули и първичната течна детергентна маса се постига чрез технологията на формуване. В прахови детергенти се предлагат алтернативни форми на капсулиране е ЕР-А-0170360.

На базата на посоченото по-горе са обобщени условията, на които протеолитичните детергентни ензими трябва да отговарят постигане на оптимално действие и се посочват ограниченията за намиращите се на пазара ензими за употреба в детергентни състави. Независимо от усилията за осигуряване на ензимна стабилност в детергентни състави, все още се среща значителна загуба на активност при нормалните условия на съхранение и приложение.

Идентифициране и изолиране на нови ензими за определено желано приложение, например употреба в детергентни, може да се осъществи по няколко начина. Един начин включва скрининг /отбиране/ на организми или микроорганизми, които проявяват желаната ензимна активност, изолиране и пречис тване на ензима от /микро/организма или от културалната супернатната на дадения /микро/организъм, определяне на неговите биохимични свойства и проверка дали тези биохимични свойства отговарят на изискванията за приложение. Ако идентифицирания ензим не може да бъде получен от естествено продуциращият го организъм, могат да се използват рекомбинантни ДНК техники за изолиране на гена, кодиращ ензима, експресиране на гена в друг организъм, изолиране и пречистване на експресирания ензим и тестуване дали той е подходящ за желаното приложение.

Друг начин за получаване на нови ензими за определено приложените се състои в модифициране на съществуващи ензими. Това може да се постигне чрез методите на химическата модификация, (виж I.Svendsen, Carlsberg Res.Commun. 44 (1976), 237-291). Обикновено тези методи са твърде неспецифични, поради това, че модифицират всички достъпни остатъци с общи странични вериги или че зависят от присъствието на подходящи аминокиселини, които трябва да бъдат модифицирани, а същите често не са в състояние да модифицират трудно подаващи се на модифициране аминокиселини, освен като ензимната молекула не е нагъната. Следователно, методът на ензимно модифициране чрез мутагенеза на кодиращия ген се счита за по-добър.

Мутагенезата може да се постигне или чрез случайна мутагенеза или чрез сайт-насочена мутагенеза. Случайната мутагенеза чрез третиране на целия микроорганизъм с химически мутаген или с мутагенна радиация може да доведе до получаването на модифицирани ензими. В този случай трябва да има на разположение строги селекционни протоколи, за да се проучат изключително редките мутанти, имащи желаните свойства. По-голяма вероятност за изолиране на мутантни ензими чрез случайна мутагенеза може да се постигне чрез клониране на кодиращия ген и пораждане на мутации в него in vitro или in vivo и експресиране на кодирания ензим чрез повторно клониране на мутантния ген в подходяща клетка гостоприемник. Също и в този случай трябва да има на разположение подходящи биологични селекционни протоколи, за да се подберат желаните мутантни ензими виж W0 87/05050. Тези биологични селекционни протоколи на селекциониране специфично ензими, подходящи за приложение в детергенти.

Най-специфичният начин за получаване на модифицирани ензими е чрез сайт-насочена мутагенеза, създаващ възможност за специфично заместване на една или повече аминокиселини с която и да е друга желана аминокиселина. В ЕР-А- 0130756 се описва употребата на тази техника за получаване на мутантни гени на протеази, които могат да бъдат експресирани за получаване на модифицирани протеолитични ензими.

Демострирани са възможностите на олигонуклеотид-медиираната сайт-насочена мутагеназа чрез използване на мутагенни олигонуклеотиди, синтезирани така, че да съдържат смеси на бази при няколко позиции вътре желаната в последователност. Това позволява редица различни мутации да бъдат въведени в една специфична част от ДНК последователността чрез използване на един единствен синтетичен олигонуклеотиден препарат, както е описано в Hui et al., EMBO J. 3(1984) 623-629, Mattencci etal., Nucl. Acids Res. 11(1983) 31133121, Murphy et al., Nucl. Acids Res. 11 (1983) 7695-7700, Wells et al., Gene 34 (1985) 315-323, Hutchinson et al., Proc. Natl.Aved Sei. USA 83 (1986) 710-714 ahd F.M. Ausubel, Current РгоЮсдвя in Molecular Biology 1987-1988, Greene Publishers Association and Wiley, Interscience, 1987. B Stanffer et al., J.Biol,. Chem.244 (1969) 5333-5338 е установено, че метионинът при позиция 22 в субтилизин Карлсберг се окислява от Н₂О₂ до метионин сулфоксид и е отговорен за силното намаляване на активността.

В резултат на метода на случайната мутагенеза, както и на метода на сайт-насочената мутагенеза за получаване на модифицирани ензими, са изолирани и охарактеризирани мутанти, произлезли от сериновата протеаза на Bacillus amyloliquefaciens, наречена също “субтилизин BPN”. В WO 87/05050 се описва мутантен субтилизин BPN’ с повишена устойчивост на топлина. В ЕР-А-0130756 се описва, че сайт-насочената мутагенеза на метоинин при позиция 222 в субтилизин ВР№посредством всичките 19 възможни аминокиселини, като се използва така нареченият метод на касетна мутагенеза, може да доведе до получаване на ензими, които са устойчиви спрямо окисляване с Н₂0₂. В последния случай обаче, повечето мутанти имат ниска протеолитична активност. Най-добрите изолирани мутанти са М222А и

M222S, които имат специфични активности съответно 53% и 35% в сравнение с естествения субтилизин BPN’ (виж Estell at al., J.Biol.Chem 260 (1985)6518-16521.

Досегашната работа по отношение образуването на модифицирани протеази показва, че мутанти на субтилизин BPN’ с променени свойства за стабилност и с променени кинетични свойства могат да бъдат получени, както се вижда от посочената по-горе литература и други източници, например Rao et al., Nture 328 (1987) 551-554, Bryan et al., Proteins 1(1986) 326-334, Cunningham and Wells, Protein Ingineering 1(1987) 319-325, Russell et al., J.Mol. Biol. 193 (1987)803-819, Katz and Kossiakoll. J.Biol. Chrm.261 (1986) 15480-15485, и публикацията на Shaw, Biochem.J.246 (1987) 1-17 and Geit et al., Protein Engineering 1 (1987) 267-274. Нищо от публикуваното в литературни източници обаче не се прилага в промишленото производство на протеолитични ензими с подобрени перилни свойства и стабилност в перилни детергенти. Нито една от модифицираните протеази не е показала, че има търговска стойност досега и че е по-добра за употреба като детергентен ензим при показателни условия на приложение.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Задачата на изобретението е да осигури метод за получаване на нови протеолитични ензими с подобрена стабилност в перилни детергентни и с подобрена способност за отстраняване на петна върху тъкани при перилни условия с детергентни състави.

Съгласно изобретението е създаден метод за получаване на нови мутантни протеолитични ензими, който включва експресия на гени, кодиращи споменатите ензими с аминокиселинни последователности, които се различават най-малко в една аминокиселина от съответните ензими от див тип. Тези мутантни ензими проявяват подобрени свойства за приложение в детергенти, по-специално в перилни детергенти. Предпочитаният вариант на изобретението се състои от мутанти на РВ92 серинова протеаза.

В друг аспект изобретението осигурява нови ензимни детергентни, съдържащи протеолитичен ензимен продукт, който съдържа най-малко един от посочените нови мутантни протеолитични ензими.

Съгласно изобретението е създадена и тестова система, която създава възможност за ефикасна селекция на мутантни протеолитични ензими с подобрени свойства за приложение в перилни детергентни измежду редица ензими. Такива ензими се получават чрез експресия на мутагенни протеазни гени.

Терминът “имащи подобрени свойства” както е използван във връзка с “мутантни протеолитични ензими”, означава протеолитични ензими с подобрени перилни свойства или подобрена стабилност със запазени перилни свойства, в сравнение със съответната протеаза от див тип.

Терминът “перилно свойство” на мутантните протеолитични ензими е определен в това описание като принос на мутантния протеолитичен ензим към перилното изчистване, допълнително към ефекта на детергентния състав без ензим при съответни перилни условия.

Терминът “съответни перилни условия” е използван за означаване на условията, поспециално температурите на пране, време, перални машини, концентрация на сапунена пяна, типа детергент и твърдост на водата .действително използвани в домакинствата.

Терминът “подобрени перилни свойства” е използвани, за да означи, че се получава по-добър краен резултат в отстраняване на петна при “съответните перилни условия” или че е необходимо по-малко количество мутантен протеолитичен ензим за получаване на същия краен резултат, в сравнение със съответния ензим от див тип.

Терминът “запазени перилни свойства” е използван за означаване на това, че перилното свойство на мутантен протеолитичен ензим на базата на тегло е най-малко 80% в сравнение с протеазата от див тип при “съответните перилни условия”.

Терминът “подобрена стабилност” е използван за означаване на по-добра стабилност на мутантните протеолитични ензими в перилни детергентни по време на съхранение и/или тяхната стабилност в сапунената пяна, което включва стабилност спрямо окисляващи агенти, комплексообразуващи агенти, автолиза, повърхностно активни вещества и висока алкалност, в сравнение със съответния енизм от див тип.

Биохимичните свойства, определени при добре определени лабораторни условия, не са сигурни параметри, за да предскажат проявяването на дадена детергентна протеаза при желани и определени условия на приложение. Тези параметри включват кинетични данни, измерени по отношение на добре определени субстрати, такива като протеини, като каезин, диметилказеин и хемоглобин или заместени олигопептидни субстрати, като SAAPFpNA /сукцинил-Ь-аланил-Ь-аланил-Ь-пролил-Ь-фенилиаланил-паранитроанилид/. Очевидно други характерни особености на протеазите определят тяхната ефикасност в перилното почистване.

Изобретението се базира на факта, че въпреки че наличието на методите за въвеждане на аминокиселинни промени в протеините, които могат да засегнат главните промени в техните биохимични характеристики, предсказването на ефекта от специфични мутации при действителните условия на приложения е все още много слабо или дори невъзможно.

Съгласно изобретението е създаден метод, който обединява получаването на мутантни протеази с ефикасна селкционна процедура по отношение на проявяването на тези протеази. Установено е, че сравнително голям брой ензими могат да бъдат резултатно подбрани по този начин.

Тестовата система съгласно изобретението се базира върху отстраняването на петна, податливи на протеаза, от тествувани тъкани в лаундерометър или терготометър, имитирайки съответни перилни условия. Подходящи за тестуване тъкани са например намиращите се на пазара EMPA /Eidgenossische Naterial Prufungs und Versuch Anstalt, St Gallen, Швейцария/ тъкани, изкуствено замърсени с протеинови петна. Показателни петна върху тъканите за тестуване на протеазите са петната от кръв, трева, шоколадови петна и други протеинови петна.

В тази тестова система обаче други релевентни фактори, като детергентен състав, концентрация на сапунена пяна, твърдост на водата, перални машини, време, pH и температура могат да бъдат контролирани по такъв начин, че могат да бъдат имитирани условия, типични за домакински приложения.

Перилните свойства на протеазите са измерени чрез тяхната способност да отстраняват дадени примерни петна при подходящи тес тови условия. Тази способност може да бъде подходящо определена чрез измервания върху тестовите тъкани след пране със и без ензими в лаундерометьр или в треготометър. Тестовата система с лабораторно приложение е примерна за домакинско приложение, когато се използва по отношение на протеолитични ензими, модифицирани чрез ДНК мутагеназа.

Съответно, изобретението създава възможност за тестуване на големи количества различни ензими и избирането на тези ензими, които са особено подходящи за даден специфичен тип на детергентно приложение. По този начин “прекроените” ензими за специфични условия на приложение могат да бъдат лесно селекционирани.

Някои бактериални серинови протеази са цитирани като субтилизини. Субтилизините включват сериновите протеази от Bacillus subtilis, Bacillus amyloligafaciens /субтилизиран BPN7, и Bacillus lichenifirmis /’’субтилизин на Карлсберс”/ виж Markland and Smith (1971) in “The Enzymes” (Boyer, ed.) vol 3, 561-608, Academic Press, New York. Щамовете Bacillus, такива като алкалофилните щамове Bacillus, продуцират други протеази. Примери на последната категория са сериновите протеази в Maxacai, понататък наричани също РВ92 протеаза /от Bacillus nov.spec. РВ92) и в Savinase, споменат погоре.

Аминокиселинната последователност на РВ92 протеазата е показана на фигура 4. Зрялата протеаза съдържа 269 аминокиселини с молекулно тегло около 27000 D и има изо-електричиа точка в силно алкалната граница. Активността по отношение на протеинов субстрат на РВ92 протеаза е изразена в Алкални Defft единици /ADU/. Активността в ADU се определя съгласно метода, описан в UK Spesification № 1,353,317, с изключение на това, че pH е променено от 8.5 на 10.0. Пречистената РВ92 протеаза има активност 21,000 ADU за mg. Измереното /к за казеин е 90

Специфичната активност на пречистените препарати на субтилизин на Карлсберг (Delange and Smith,J.Bio.Chem.243 (1968)2184)възлиза на 10,000 ADU/mg, а на субтилизин BPN’ /възлиза на 7,000 ADU/mg. Освен посочените параметри като специфична активност и числото /к_и(/, РВ92 протеазата се отличава от протеазите, подобни на субтлизина на Карлсбер, субтилизин BPN’ и други протеази, формувани в детергенти /например Maxatase и Alcalase/ по това, че има силно положителен заряд, който може да бъде определен визуално чрез гелна електрофореза на нативния протеин, както е описано по-нататък в раздел 4 “Примери за конкретно изпълнение”.

Тъй като РВ92 протеазата е активна при отстраняване на петна при алкални pH стойности, същата обикновено се използва като детергентна добавка заедно с детергентни ингредиенти, като повърхностноактивни вещества, пълнители и окисляващи агенти. Последните агенти обикновено се използват във вид на прах. РВ92 протеазата има висока ефикасност при отстраняване на петна, в сравнение с други протеази, такива като посочените субтилизини. Това означава, че е необходимо по-малко количество РВ92 протеаза за постигане на същия перилен ефект.

Чувствителността към окисляване е съществен недостатък на РН92 протеазата и всички други известни серинови протеази, използвани за приложение в детергенти (виж също Stauffer of al., J.Biol. Chem 244 (1969) 5 3335338; Estell et al., J.Biol.Chem 263 (1985)65186521). Окисляването на PB92 протеазата от Н₂0₂ или от други прекисни киселини чрез активаторната система, съдържаща перборат-тетрахидрат и ТЕАДц създава ензим, който има специфична активност 50% и 10%, съответно в ADU/mg., в сравнение с неокислената РВ92 протеаза /виж примери за конкретно изпълнение - пример 1/.

Методът съгласно изобретението е много подходящ за производство, скининг и селекция на мутантни протеолитични ензими, които са произлезли от естествено продуцирани бактериални серинови протеази. Такива мутанти са например тези, кодирани от ген, получен от ген от див тип алкалофилен щам на Bacillus и за предпочитане РВ92. Подходящи са също така и мутанти, произлезли от алкалофилна серинова протеаза Савиназа от Bacillus. Освен това, методът може да бъде благоприятен при селекция на модифицирани протеази, произлезли от протеази, различни от сериновите протеази от алкалофилни щамове РВ92 на Bacillus. Известни са гени, кодиращи сериновите протеази на Bacillus subtilis, Bacillus amyloliguefaciens и Bacillus lichenifromis, които могат да бъдат използвани като обект на мутагеназа. Ясно е, че могат да бъдат из ползвани както сайт- насочената мутагеназа на оликонкуклеотида, така и насочената към определена област случайна мутагеназа или който и да е друг подходящ метод за ефективно предизвикване на мутации в протеазния ген.

Методът за селекция на мутантни протеолитични ензими, съгласно изобретението, който включва получаване и скрининг, обхваща следните етапи. Мутагеназа на клониран ген, кодиращ протеолитичен ензим, представляващ интерес, или негов фрагмент. Изолиране на получения мутантен протеазен ген или гени. Въвеждане на посочения мутантен протеазен ген или гени, за предпочитане в подходящ вектор, в подходящ щам гостоприемник за експресия и производство. Извличане на продуцираната мутантна протеаза и идентифициране на тези мутантни протеази, имащи подобрени свойства за приложение в детергенти.

Подходящи щамове гостоприемници за производството на мутантни протеази включват поддаващи се на трансформация микроорганизми, в които може да се постигне експресия на протеазата. Специфични щамове гостоприемници от същите видове или род, от който се получава протеаза, са подходящи, такива като щамове Bacillus, за предпочитане алкалофилен щам Bacillus, а най-много се предпочита Bacillus nov. spec. РВ92 или негов мутант, имащ по същество същите свойства. От предпочитаните щамове са също така Bacillus subtilus, Bacillus licheniformis u Bacillus amyloliquefaciens. Други подходящи и предпочитани щамове гостоприемници включват тези щамове, които по същество са неспособни да продуцират извънклетъчно протеолитични ензими, преди да бъдат трансформирани с мутантен ген. От особен интерес са щамове гостоприемници Bacillus, които произвеждат недостатъчно протеаза, например Bacillus nov. spec. РВ92. Експресия на протеазите се осъществява чрез използване на експресионни сигнали, които действат в избрания организъм гостоприемник. Експресионните сигнали включват ДНК последователности, регулираща транскрипцията и транслацията на протеазните гени. Подходящи вектори са в състояние да реплицират в достатъчно голям брой копия в щама гостоприемник, който е избран, или могат стабилно да поддържат протеазния ген в щама гостоприемник чрез хромозомна интеграция.

Мутантните протеолитични ензими съгласно изобретението се получават чрез култивиране при подходящи ферментационни условия, на трансформиран щам гостоприемник, съдържащ желания мутантен протеолитичен ген или гени, а получените ензими се извличат. За предпочитане, експресираните протеази се секретират в културалната среда, което улеснява тяхното извличане или в случай на грам отрицателни щамове гостоприемници секретирането става в периплазмичното пространство. За секретирането се използва подходяща аминотерминална сигнална последователност, за предпочитане сигнална последователност, кодираща от изходния ген, ако действа в избрания щам костоприемник.

Съгласно един аспект на изобретението могат да бъдат разработени, подходящи перилни тестове, наподобяващи условията при домашно пране. Например, разработен е подходящ тест за детергент във вид на прах, в който детергентните съставки са разпратени и който може да съдържа или да не съдържа избелващите агенти при концентрации на сапунена пяна в границата от 1-10 g детергент /1 при 10-20° GH /German Hardness, използван при температури 25-80°С. По-специално използван детергент с разпратени съставки, съдържащи ТАЕД и перборат при концентрация на сапунена пяна 4,7 или 10 g детергент/ 1 при 15 G Н при температура 40°С.

Осигурени са също така тестове, които са примерни за пране с течни детергенти. Тези детергенти се използват обикновено при концентрации на пяна в границите от 1,5 - 5 g детергент/1 при 5-15 GH при температури 15 и 40°С.По-специфично, неизбелващи течни детергентни състави се използват при концентрация на пяната от 1.5 g детергент/1, 5° GH при 25°С и при 40°С, представляващи условията в САЩ за течни детергентни състави и концентрация на сапунена пяна 5 g детрегент/ 1, 15 GH при 40°С, представляващи европейските условия за течни детергентни състави.

Подходящи опити могат да се разработят и за други условия. Тестови тъкани, замърсени с чувствителни към протеаза петна, по-специално тъкани, замърсени с кръв, трева и петна от шоколад, както и други протеинови петна, по-специфично ЕМРА тестови тъкани 116и117се използват в примерните тестове за осъществяване на пране.

Свойствата на естествено срещащите се или естествено матиралите детергентни протеази могат да бъдат засилени чрез въвеждане на различни мутации в ензима. За голямата част мутациите ще бъдат замествания, консервативни или неконсервантивни, по също така могат да се използват делции или инсерции.

За консервативни замествания може да се използва следната таблица.

Алифатни нутрални неполярни G,A,P

L,I,V полярни С, М, S, Т N, Q, със заряд анионна D,E катионни K,R ароматни F,H,W,Y като която и да е аминокиселина може да бъде заместена с която и да е друга аминокиселина в същата категория, особено от същия ред. В допълнение полярните аминокиселини N,Q могат да заместят или да бъдат заместени от аминокиселини със заряд. За целите на изобретението замествания, водещи до повишаване на анионния характер на протеазата, особено при места, непряко включени в активния център, са от особен интерес.

Области от особен интерес за мутация са тези аминокиселини, на разстояние до 4 А от инхибиторна молекула Eglin С, като Eglin С е свързана към активния център.

Следващите цифрови означения се базират на РВ92 протеаза, но съображенията се отнасят и до други серинови протеази, имащи хомоложна структура, особено тези с над 70% хомогенност, по-специално с над 90% хомоложност. Тези позиции са 32, 33, 48-54, 5862, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158161, 164, 169, 175-186, 197, 198, 203-216, като повечето от тези позиции са достъпни за директно взаимодействие с протеиновия субстрат. Обикновено позициите 32, 62, 153 и 215 не се заместват, тъй като мутациите при тези места водят до понижаване на перилните свойства.

Позициите за заместване от особен интерес включват 60, 62, 94, 97-102, 105, 116, 123-128, 150, 152, 153, 160,183, 203, 211, 212, и 213-216. При някои позиции има стремеж за замяна на нестабилните аминокиселини, нап ример метионин с по-стабилна на окисление аминокиселина, напр. треонин, докато в същото време се запазва общата конформация и обемът на аминокиселината при този сайт. В други случаи е установено, че заместването на естествената аминокиселина почти с която и да е друга аминокиселина може да доведе до подобряване на резултатите, особено чрез заместване на хидроксилирани аминокиселини, S, Т, с полярни или с неполярни аминокиселини или дори с ароматна аминокиселина.

Заместванията от особен инертен са следните.

G 116 I, V, L

S 126 която и да е аминокиселина Р 127 която и да е аминокиселина S 128 която и да е аминокиселина

S 160 анионна или неутрална алифатна или R

А 166 със заряд, особено анионна

М 169 неутрална алифатна, за предпочитане неполярна

N 212 анионна

М 216 алифатна полярна, особено S, Т, N, Q.

Докато много от мутациите водят до получаване на по-ниска специфична активност на протеазата с общи субстрати, перилните свойства са сравними или повишени по отношение на естествения ензим и в много случаи се подобрява стабилността при съхранение.

Перилните свойства на някои от РВ92 мутантните протеази, когато се изразят като инверсия на относително количество на ензима, необходимо за постигане на същия ефект, както с естествените протеази х 100% се увеличават повече от 120%, в някои случаи дори повече от 180%.

Съгласно друг аспект на изобретението РВ92 протеазните мутанти показват по-добра стабилност при съхранение в прахов детергентен състав, съдържащ избелващи агенти, отколкото естествената РВ92 протеаза, като в същото време се запазват техните перилни свойства. Примери на такива мутанти са М 216ShM216Qh мутанти най-малко с една от тези мутации, освен мутациите на други сайтове.

Съгласно друг аспект на изобретението,е установено, че в течен перилен детрегентен състав, несъдържащ окисляващи агенти, мутантните РВ92-протеази M216S, M216Q,

S160D и N212D запазват тяхната активност по-добре, отколкото РВ92 протеазата. От тези мутанти, M216S и М 216D, запазват перилните свойства, a S160D и N212D имат подобрени перилни свойства. Подобрението в стабилността при съхранение в тестувания течен детергент е най-силно изявено при S160D M216Q мутантите.

Възможно е също така да се комбинират няколко мутации, които повишават стабилността на протеазата в детергентните състави. Няколко мутации, които положително влияят на перилните свойства на протеазата, могат да бъдат обединени в единичен протеазен мутантен ген, което създава възможност да се получат даже допълнително подобрени протеази, например /S126M, Р127А, S128G, S1601 /и/ G116V, S126N, Р 127S, S128A, S160D/. Нови протеазни мутанти могат да бъдат получени чрез обединяване на добрите перилни свойства например на N212D и S160D със свойствата за стабилност например на M216S или M216Q. Например, /S160D, M216S/ мутантът показва подобрено перилно свойство и по-добра стабилност при съхранение.

Полезни мутанти могат да бъдат получени също така чрез обединяване на които и да са мутации или серии от мутации, описани в настоящото описание. Освен това, възможно е да се комбинират полезните мутации, както е описано тук, с мутации при други сайтове, които могат или не могат да причинят значителна промяна в свойствата на ензима.

Предпочитани варианти на изобретението са следните РВ92 протеазни мутанти: [M216S1; [M216Q1; [N212DJ; [S160DJ; [S160G, N212D]; [S160D, M216Q]; [S160D, M216SJ; [A166D, M169IJ; [G116V, S126V, Р127Е, S128KJ; [G116V, S126G, P127Q, S128I]; [G116V, S126L, P127N, S128V]; [G116V, S126G, P127Q, S128I]; [G116V, S126L, Р127М]; [G116V, S126H, P127R]; [G116V, S126R, P127S, S 128Р]; [G116V, S 126F, P127QJ; [G116V, S126F, P127L, S128T]; [S126M, Р127А, S 128G]; {S126M, Р127А, S128G, S160D] и [G116V, S126N, P127S, S128D, S160D],

За поясняване значението на постижението, използвано в изобретението за получаване на нови протеази, подходящи за прило жение в перилни детергентни, т.е. чрез използване на примерни тестове за перилни приложения като главен селекционен критерий, резултатите от перилните тестове на мутантни РВ92 протеазите се сравняват с биохимичните параметри .както обикновено се определя в протеиновите биофимични и ензимологични изследвания. Тези резултати дават възможност да се направи заключението, че липсва каквото и да е отношение между параметрите, определящи афинитета към определени субстрати и кинетики на протеолитичната реакция и перилните свойства /виж таблица 1 на пример 1/.

Следователно, възможно е също така да се обединят два или повече мутанти с различни свойства в един ензимен продукт или в същия перилен процес. Такава комбинация може да има или да няма синергетичен ефект.

Изобретението се включва също така употребата на един или повече протеолитични ензими, както е определено по-горе, в детергентен състав или в перилен процес.

Чрез делеции или инсерции на аминокиселини в протеазната полипептидна верига, изкуствено е създадена чрез мутагенеза или естествено срещаща се в протеазните хомолози на РВ92 протеаза, може да се променят номерата на аминокиселините. Съгласно изобретението позициите, хомоложни на аминокиселинните позиции на РВ92 протеазата попадат в обхвата на патентните претенции.

ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1А показва конструкцията на мутационния вектор, съдържащ РВ92 протеазен ген.

Фигура 1В показва схематично мутационната процедура, която е използвана.

Фигура 1С показва конструкцията на експресионния вектор, съдържащ мутантен РВ92 протеазен ген.

Фигура 2А, 2В и 3 показват осъществяване на пране спрямо специфична протеолитична активност на различни РВ92 протеазни мутанти при различни перилни условия.

Фигура 4 показва неклуотидната последователност на РВ92 протеазния ген и аминокиселинната последователност на кодирания прекурсорен /изходен/ ензим.

ПРИМЕРИ ЗА КОНКРЕТНО ИЗПЪЛНЕНИЕ

Материали и методи

Конструиране на РВ92 протеазни мутанти

Основната конструкция, от която започва мутагеназната работа, се цитира като рМ58, описана в ЕР-А-0283075.

Подходът включва следните три фази.

а. Конструиране на мутагенен вектор М13М1.

б. Мутационна процедура.

в. Конструиране на рМ58 δ Есо и субклониране на мутирания ДНК фрагмент в този вектор.

1.а. Конструиране на мутаген вектор М13М1.

Основната конструкция рМ58 се смила с рестрикционни ензими Hpal Ball. 1400 bp фрагментът, съдържащ рВ92 протеазния ген, се пречиства върху агароза с ниска точка на топене /Maniatis, Molecular cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). Вектор М13МР11/ Messing et al., Nucl. Acid.Res. 9 /1981/ 303-321/ се смила c Smal. 1400 bp посоченият ДНК фрагмент се лигира към този вектор и се трансфектира в E.coli JM101 съгласно процедурата, описана от Cohen et al., Pros. Natl.Acad. Sci. USA 69 /1972/ 2110-2114.

След размножаването на фага в E.coli JM101, ЗБДНК се изолира /Heidecker et al., Gene 10, /1980/ 69-73/, инсъртьт и неговата ориентация се проверяват чрез ДНК секвениране, както се използва методът, описан от Sanger, Proc. Natl.Acad Sci. USA 74 /1977/ 6463.

Получава се векторът, подходящ за мутагенеза, и се означава като М13М1. Описаната по-горе процедура е представена схематично на фигура 1 А.

1.6. Мутационни процедури.

Мутагеназата се осъществява върху М13М1, като се използва ssflHK на този вектор и М13шр19/ Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, /1988/ 303-321/, като векторът се смила c рестрикционните ензими EcoRI и HindHI c последващо пречистване на големя фрагмент върху агароза с ниска точка на топене.

Мутагеназата се осъществява, както е описано от Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12, /1984/ 9441-9456 със следната модификация, че се използва E.coli JM105, вместо Е.коли

WK30-3, за селекция за мутанти.

Дължината на олигонуклеотидите, използвани за създаване на специфичните мутация, е 22 нуклеотида. Осъществява се специфична за дадена област мутации, използвана за създаване на няколко мутации едновременно в една специфична ДНК последователност, като се използва олигонуклеотиден препарат с дължина 40 нуклеотида, като всичките четири нуклеотида са случайно инкопорирани в сайтове, съответстващи на аминокиселините, които трябва да бъдат мутирани.

След мутагенезата се проверяват потенциалните мутанти дали имат релевантна мутация чрез последователни анализи, като се използва дидеокси методът на Sanger, посочен по-горе. Целият едноверижен отвор /виж фигура 1В/ се секвенира, за да се провери липсата на вторична мутация. Процедурата е описана схематично на фигура 1В.

Описаната процедура е от полза за образуване на ДНК фрагменти с мутации в 3' края на протеазния ген /аминокиселини 154269/.

За специалистите в областта е ясно, че за да се образуват ДНК фрагменти с мутации при 5' края на протеазния ген в Bacillus вектор, могат да бъдат използвани алтернативни рестрикционни ензими и могат да бъдат конструирани модифицирани РВ92 протеазни гени, аналогично на метода от фигура 1А.

.в. Конструиране на рМ58 δ Есо и субклониране на ДНК фрагменти, съдържащи мутациите в този вектор /фигура 1С/.

За да се конструира рМ58 δ Есо, рМ58 се смила с рестрикционен ензим EcoRI и се лигира с Т4 лигаза при условия на разреждане. Сместа за лигиране се използва за трансформиране на B.subtilis 1-А40 (Nacillus Genetic Stack Center, Ohio), съгласно метода на Spizzen et al., J.Bacteriol 81, /1961/ 741-746.

Клетките от трансформационната смес се поставят в минимални по размери плочки, съдържащи 20 mg/ml неомицин, както е описано в пример 1 на E3-A-0283075.

Плазмидната ДНК на трансформантите се изолира съгласно метода, описан от Байрпбойм и Доли. Проучвания върху нуклеинови киселини 7 /1979/ 1513-1523 и се охарактеризират чрез рестрикционен ензимен анализ. По този начин се изолира рМ58 δ Есо /виж фигура 1С/.

За да се продуцира мутантен ензим, ДНК фрагментите на М13М1, съдържащи желаните мутации и размножени, както е описано в раздел 1.6, се субклонират в рМ58 δ Есо. ds ДНК на М13М1, описана по-горе, се смила с EcoRI и се лигира при EcoRI сайта на рМ58 δ Есо. Сместа за лигиране се използва за трансформиране на В. subtilis DB104, Doi J.Bacteriol /1984/ 160, 442-444, като се използва методът на Spizizen et al. виж по-горе.

Клетки от трансформационната смес се поставят върху минимални блюда, съдържащи 20 gg/ml неомицин и 0,4% казеин /ЕР-А0283075/. ДНК на трансформантите, продуциращи протеаза, се изолира съгласно метода, описан от Bimboin and Doly, /виж по-горе/ и се охарактеризира чрез рестрикционен ензимен анализ.

2. Получаване на мутантни протеази. Трансформанти на DB104, при които е определено, че съдържат вектора с мутантния протеазен ген, се инокулират в 10 ml хранителна среда Триптон-соя /ТСХ/, съдържаща 20 pg/ ml неомицин, и се инкубират в продължение на 24 часа при температура 37°С. Проби от културата се инокулират в колби по 500 ml на клатачка, съдържащи по 100 ml среда за производство на протеаза: 12.5 g/l дрождев екстракт /Difco/, 0,97 g/l СаС1₂.6Н₂0, 2,25 g/l MgCI₂,6H₂0, 20 mg/1 MnS0₄.4H₂0, 1 mg/1 CoCI₂.6H₂0, 0,5 g/l цитрат, 0,5 ml/1 антипенител 5693, 6% тегло/обем малтоза, 0,2 М фосфатен буфер pH 6,8 и 20 mg/ml неомицин.

След инкубиране в продължение на 65 ч при постоянна аерация протеазната активност на културите се анализира, като се използва диметилказеин като субстрат при използване на метода, описан от Lin et al., J.Biol.Chem 244 /1969/ 789-793. За да се продуцират по-големи количества протеази от див тип РВ92 и от мутантен РВ92, тези щамове също се отглеждат при температура 37°С в аерирани ферментатори с обем 101 или повече, като се използва по същество същата производствена среда, каквато е използвана за колбите на клатачка.

Получените хранителни среди се използват за пречистване на протеазата.

3. Пречистване и концентриране на протеаза от РВ92 див тип и нейните мутанти. Мутантната и дивия тип РВ92 протеаза, продицурана от Bacillus subtilis DB104 в колби на клатачка или в 10-литрови ферментатори се пре чиства чрез катийнно-обменна хроматография, като се използват Zeta-Prep^R дискове или гилзи /PS-тип, LKB/. Ферментационната среда се центрофугира /3000 х g, 10 минути/ и супернатантата ес разрежда 10 пъти с 10 тМ буфер на натриев фосфат с pH 5,5, след което се подава в катийонообменника. След промиване с няколко обема на гилзта фосфатен буфер протеазата се извлича чрез включване на 0,4М NaCl във фосфатния буфер. Фракциите, съдържащи протеазна активност, се обединяват и концентрират чрез ултрафилтриране, като се използва Amicon клетъчна бъркачка, снабдена с РМ-10 филтър. Концентрацията на NaCl се намалява до около 50 тМ чрез разреждане, а протеазният разтвор се концентрира с фосфатен буфер, след което разтворът се съхранява при температура -80°С при концентрация на протеин между 1-10 mg/ml.

Алтернативно за извличане на РВ92 протеазни мутанти от културалната среда на ферментации от голям мащаб се прибавя СаС1₂ / 1% тегло/тегло и ацетон/ 30% тегло/тегло. След филтриране за отстраняване на клетъчната маза, протеазата се утаява от получения филтрат чрез прибавяне на 0,2-2% /тегло/тегло/ CaSO₄.2H₂0 и чрез допълнително прибавяне на ацетон до постигане на крайна концентрация >60% тегло/тегло. Утайката се отделя чрез филтриране и се размива в ацетон, последвано от сушене до получаване на суров ензимен прах /СЕП/.

4. Аналитична техника за проверка на чистотата на пречистените протеази. Протеазите се считат за чисти, когато се установи една зона или пик чрез електрофореза и високоефективна гелна електрофореза /HPLC/, съответно. Извършва се електрофореза на полиакриламиден гел /PAGE/ в присъствието на натриев додецилсулфат съгласно метода на Laemli, Nature, 227 /1970/ 680-685. Денатурирането на протеиновите проби върху SDS при 100°С трябва да бъде предшествано от инактивиарне на протеазната активност, за да се предотврати авторазлагането. Това може да бъде направено чрез инкубиране с фенилметилсулфонил флуорид /ФМСФ/ /1 тМ, 30 минути при стайна температура/ или утаяване с трихлороцетна киселина/ ТОК, 8%, 30 мин, върху лед/. Нативната PAGE се извършва при pH 7,45 гелов буфер, съдържащ 20 тМ хистидин /His/ и 50 ml 3-/Н-морфолино/пропансулфо нова киселина в 5% полиакриламидни гелове при съотношение на акриламид към бисакриламид 20:1. Протеиновите проби се нанасят към върха на гелови плочки и се подлагат на електрофореза към катода. Същият буфер от хистидин/3-/N-морфолино/пропансулфонова киселина се използва като електрофорезен буфер, но при pH 6,3. След електрофорезата /1^1/2 - 2 часа при 350V/ гелът се накисва в 8%-на оцетна киселина, за да се фиксират протеините в гела, и след това се оцветява с Coomassie Boillant Blue R250, след което се обработва съгласно стандартните процедури.

Извършва се проверка за чистота чрез високоефективна течна хроматография чрез използване на йонообменна колона /MonosPharmdcia Fin Chemicals/ и гелфилтрираща колона/ TSK 2000 SW-LKB/. Първата хроматография се елюира с 10 тМ натриев фосфатен буфер pH 5,5 и се получава елюиране на свързаната протеаза чрез линеен градиент с 10300 мМ натриев фосфат, pH 5,5. През гелфилтрационната колона се пропуска 0,25 М натриев ацетат с pH 5,5.

5. Определяне концентрацията на протеазата.

За определяне концентрацията на протеазата в пречистен протеазен разтвор се извършва следното.

1/ Екстинкционни измервания при 280 пт, като се използва изчислен екстинкционен коефициент /Σ_Μ и

2/ титруване на активния център.

Екстинкционният коефициент при 280 mm се изчислява от броя на триптофановите остатъци Σ_Μ = 5,600 М '.cm¹/ и на триозиновите остатъци ΣΜ = 1,330М ’.cm¹/ за ензимна молекула. За РВ92 протеаза, ΣΜ е 2 26,100Мl.cnr¹/ 3 триптофанови, 7 тирозинови остатъка, което е еквивалентно на Е/^ , измерено при 280 пт = 9,7 /М_г = 26,729Da/. В случай на мутанти с променен брой триптофанови и тирозинови остатъци се правят съответни колекции.

Броят на активните ензимни молекули се установява през титруване на активният център. Тъй като широко използваният метод с N-транссинамоилимидазол /M.L.Bender et al., J.Am. chem.Sac 88, /1966/ 5890-5931/ не осигурява задоволителна работа за РВ92 протеазата, е разработен метод, при който се използва ФМСФ / фенилметилсулфонилфлуорид/. Протеазен раз твор с установена концентрация /280 пш абсорбция/ се смесва с 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 и 1,25 еквиваленти на ФМСФ, съответно и се оставя да взаимодейства за един час при стайна температура в 10 тМ натриев фосфат с pH 6,5. Концентрацията на ензима трябва да бъде най-малко 50 М.

Остатъчната активност се измерва спектрофотометрично, като се използва сукцинил1ъ-аланил-Е-аланил-Е-пропил-Е-фенил-аланил-паранитроанилид /SAAPFPNA/ като субстрат /виж по-нататък. Чистотата /и следователно концентрацията/ на ФМСФ се определя чрез ЯМР-спектроскопия и се правят изходни разтвори в изопропанол. Установи се, че резултатите от титруването на активния център са в съответствие с резултатите от проверката на чистотата с високоефективна течна хроматография.

6. Определяне на кинетичните параметри на див тип и мутантни протеази.

1/Активността по отношение на протеинови субстрати /казеин/ се измерва при pH 10.0, както е описано в патент на GB № 1, 353,317, изразена като ADU = алкални Делфт единици/.

2/ Поредният казеинов субстрат се измерва на pH-метър. Реакционната камера на pH метода /Radiometer, Copenhagen/съдържа 10 ml 0.1 М KCI c 50 mg казеин /Hammerstein, Merck/. Протони, освободени при хидролизата на казеина от РВ92 протеаза, се титруват с 10 mM NaON, като през това време pH се поддържа при 10,0 /при 40°С под поток от азотен газ/.

3/ Активността по отношение на синтетични пептиди се измерва, като се използва SAAPFpNA. Паранитроанилидът /рНА//жълт/, който се образува, се измерва спектрофотометрично при 410 пт. Σ_Μ = 8,480 М¹ ст-1, / E.G.Delmar et.al., Anal.Biochem 94/1979/ 316320/ с UVIKON 860 /KONTRON/ спектрофотометър, снабден с термостатичен шестпозиционен клетъчен обменник. Кинетичните параметри К^.и К_я се получават от първоначална норма на измервания при различни концентрации на субстрата /за рВ92 протеаза от 0.1 - 6.0 тМ/, пасвайки данните към хиперболична функция, като се използва нелинейна регресия с многовариантен пресичащ променлив метод. Специфичната константа К^/К* се изчислява. Измерванията се извършват при

25°С в краен обем 1 л, съдържащ 0.1М ТРИСНС1 + 0.1 М NaCl,pH 8.6. Натриевият хлорид е необходим, тъй като в негово отсъствие РВ92 протеазата показва нелинейни графики на Lineweaver-Burk, което би могло да бъде причинено от субстратна инхибиция. Субстратът най-напред се разтваря в ДМСО до концентрация 200 шМ и след това се разрежда с 0,1 М ТРИС-НС1 pH 8,6, за да се получи основен разтвор от 20 мМ /определено спектрофотометрично при 315 nm; Σ_Μ = 14,000М’‘ cm¹/. He е направена никаква корекция за различните концентрации на ДМСО /0,05 - 3,0% обем/ обем/.

7. Окисляване на РВ92 протеази. Чувствителността на РВ92 протеазите към окисляване с Н₂О₂ се тества чрез метода, описан от Estell et al., J.Biol. Chem. 260 /1985/ 6518-6521, c изключение на следното.

1/ Използват се 20 мМ Н₂О₂, вместо 100 шМ.

2/ Като допълнително окисляващо средство се използва 20 тМ натриев преборят, смесен с 10 mM TAED.

8. Перилен тест. рВ92 протеазните мутанти се тестуват в специално разработен перилен тест, като се използват памучни и полиестер/ памук тъкани с петна от мляко, кръв и мастило /5,0 х 5.0 cm/, получени от ЕМРА, St.Gallen, Швейцария и обозначени с номера 116 и 117.

Перилните тестове се осъществяват в Atlas Лаундерометър LEF-FC, снабден с тестови съдове от неръждаема стомана, всеки от които съдържа детергентен състав плюс протеазата, която трябва да бъде изследвана /РВ92 протеазни мутанти или РВ92 протеаза/. Освен ако не е посочено нещо друго, тестовете се извършват за 30 мин при желана температура. След прането тъканите се сушат на въздух и отражението на тестуваните тъкани се измерва при 680 nm с фотоволтфотометър /Модел 577/, който е съоръжен със зелен филтър. Измерените данни по отношение на тестуваните тъкани, изпрани с детергенти, съдържащи съответните РВ92 протеазни мутанти, се сравняват с данните на сравнителни серии от измервания с детергенти, съдържащи РВ92 протеаза. Стойностите от пране с мутантните протеази се изчисляват чрез разделяне количеството на протеина на РВ92 протеазата/mg/ с количеството на протеина на мутантната протеаза /mg/, което е необходимо за постигане на същия резултат, х 100%.

Пример 1. А. Прането с различни РВ92 протеазни мутанти в Европейски прахови детергенти се определя по метода, описан по-горе. Тестови съдове от неръждаема стомана, всеки от които съдържащ определено количество от прахов детергент IEC, разтворено в 250 ml вода при 150° GH /твърдост на водата/, се зареждат с по две памучни и по две полиестер/ памук материи. Съставът на праховия детер гент IEC е следния.

Компонент Т егл. %

Линеен натриев алкилбензолсулфонат /средна дължина на алкалната верига С11.5/6,4

Етоксилиран мастен алкохол /14 ЕО/2,3

Натриев сапун2,8

Натриев триполифосфат /STPP/35,0

Натриев силикат6,0

Магнезиев силикат1,5

Карбоксиметилцелулоза1,0

Натриев сулфат16,8

Натриев перборат тетрахидрат 18,5 TAED1,5 други + вода до100

Към всеки съд се прибавя избран пречистен РВ92 протеазен мутант в концентрация, варираща между 0 и 1,74 mg /пречистена/ протеаза за литър пяна. За сравнение един съд се използва за тестуване на РВ92 протеаза по същия начин. Перилните тестове се извършват при температура 40°С. Резултатите са показани в таблица 1.

Таблица 1

Свойства на РВ92 протеаза и някои нейни мутанти

Протеаза	Пране,свързано c PB92 протеаза* / %/	Специфична активност на РВ92 протеаза/ % /**	Кинематични параметри	к , /к cat щ (1/s.mM)
Концентр.на детергент в пяната	Кш /тМ/	(1/s)
4 g/1	7 g/1
РВ92	100	100	100	1,0	105	102
М216-окислена	80	80	50	1,1	10	9
M216S	100	90	40	1,3	7	5
M216Q	110	90	37	1,7	5	3
М216С	50		36	1,2	37	30
S160K	21	25	47	1,2	12	11
S160D	215	155	73	1,2	14	12
S160C	108		48	0,98	20	21
N212D	220	75	100	1,2	104	86
S160C,N212D	170		76	1,7	30	18
N212D	78		8S
Е134К	13		95	1.1	56	49
A166D,M169I	136		100
S160D.M216Q	70	35	12
S160D.M216S	145	70	17
M117L,M216Q	68	70	27	0,9	4	2
M117L,M216S	61	80	36	1,7	8	8
G116V.S126V,
P127E,S128K	250	105	43	3,0	260	86
G116V,S126L,
P127N.S128V	165	165	81	4,1	260	65
G116V,S126L,
P127Q.S128A	200	200	62	5,1	290	57
G116V,S126V,P127M	250	250	69	2,1	207	98
S126M,P127A,S128G	200	200	115	2,0	356	180
M169I,M216S	80	95	44
G116V,S126Y,
P127G.S128L	80	75	69
G116V,S126N,
P127H.S128I	90	110	115
G116V,S126H,P127Y	113	87	73
GU6V.S126R,
P127S.S128P	130	175	81
G116V,S126F,P127Q	225	95
G116V,S126G,
P127Q,S128I	75	110	95	3,2	41	13
G116V,S126F,P127L,
S128T	150	80		11,0	200	19

Бележки към Таблица 1 + Осъществяването на прането се измерва в STPP, съдържащ прахов детергент 1ЕС при 40°С.

++ По определение РВ92 протеазата има 100% специфична активност.

Активността е определена по ADU метода. +++ Опитни условия: субстрат S-A-A-P-F-pNA; буфер 0.1М ТрисНО, pH 8.6; 0.1М NaCl; 25°С.

Б. Извършва се перилен тест, който се повтаря при 25°С със същия детергент, съдържащ някои Рв92 протеазни мутанти. РВ92 протеазата отново се използва за сравнение. Другите тестови условия са същите като описаните погоре. Резултатите са показани в таблица 2.

Таблица 2.

Перилен процес с РВ92 протеазни мутанти при 25°С в STPP, съдържащ прахов детергент, спрямо РВ92 протеаза /%/.

Протеаза	Перилен процес /%/ Концентрация на детергент в пяната
4 g/1	7 g/1
M216S	90	80
M216Q	95	80
M212D	250	135
S160D	185	120

В. Извършеното пране с протеазите също се определя в нефосфатно избелващо средство? съдържащо европейски детергентен прах в Лаундерометър при 25°С и 40°С. РВ92 протеаза отново се използва за сравнение. Другите тестови условия са същите, както описаните по-горе. Резултатите са показани в таблица 3.

Перилен процес с РВ92 протеазни му20 танти при 25°С и 40°С в нефосфатно избелващо средство, съдържащо европейски прахов детергент, отнесено към РВ92 протеаза /%/.

Таблица 3

Протеаза	Перилен процес / % / Концентрация на детергент в пяната
4 g/1 Температура 25°С	7 g/1	4 g/1 Температура 40°С	7 g/1
M216S	80	85	100	90
M216Q	80	80	120	100
M212D	170	105	200	75
S160D	170	105	230	165

Пример 2.

Тестува се РВ92 протеазен мутант М216 по отношение стабилността при съхранение в праховия детергент IEC, описан в пример 1. Стабилността при съхранение се изследва в климатични кутии при 30°С и 80% относителна влажност /RH/. Протеазата за този експеримент се капсулира по следния начин.

Приготвя се смес, съдържаща /в тегло/ тегло/: 2% пречистена протеаза, 50% нейонно вещество /етоксилиран C₁₄-C_lg алкохол с 50-80 Е.О. единици/, 5% ТЮ₂, 3-10% CaSO₄.2H₂0 и Na₂S0₄ ад. 100%. Сместа се наг рява до 65-90°С и се охлажда до стайна температура. Получената втвърдена смес се смила на частички. Частичките с размери 0,5 до 1 mm в диаметър се отсяват и се използват за теста за съхранение в детергенти.

3,5 g от праховия детергент IEC, съдържащ мутанта M216S при концентрация 6140 ADU/g детергент, се съхранява в 18 ml ампули. За сравнение РВ92 протеаза се съхранява при същите условия. След 2,4,5 и 6 седмици се измерва остатъчната активност на протеазата Резултатите са показани в таблица 4.

Таблица 4.

Протеаза	Остатъчна активност, в /%/
0 седмици	2 седмици	4 седмици	5 седмици	6 седмици
РВ92 протеаза	100	25	5	3	2
M216S	100	68	31	20	11

Пример 3. РВ92 протеаза и различни РВ92 протеазни мутанти се тестуват по отношение стабилност при съхранение в прахов 15 детергент. При теста за изследване стабилност та при съхранение протеазите се използват в капсулирана форма.

Протеазните продукти се приготвят чрез смесване на следните компоненти при 80°С.

Компонент Тегл.%

АЕ⁺50

ТЮ₂2 протеаза (СЕР)7

PVP⁴*1,5

ВНТ^1

Na₂SO₄ баланс ⁺АЕ = С_]4-С_|8 алкохол полиетоксилат. Алкохолът е етоксилиран с 50-80 етиленокисни /ЕО/ групи.

*+рур = поливинилпиролидон К17 *+⁺ ВНТ = 2,6-бис/т.-бутил/-4метилфенол.

Сместа се капсулира чрез втвърдяване на капки, по същество, както е описано в патент на GB № 1,603,640. Фракцията на частички с размер между 0,3 и 0,8 mm се използва за определяне стабилността при съхранение на протеазите. Капсулираната протеаза / 140 mg/ се смесва с АИЛоснова /6,4 g/ и натриев перборат тетрахидрат /0,6 g/. /ALL е регистрирана търговска марка на Unilever N.V./. Прахът на ALL основа, който се използва, не съдържа ензими или избелващи средства.

Сместа от ензим /детергент/ натриев перборат тетрахидрат се инкубира при 30°С и 80% RH. В таблица 5 е дадена остатъчната активност след съхранение за посочения период от време.

Таблица 5.

Остатъчна активност на РВ92 протеаза и някои негови мутанти след съхранение /седмици/ при 30°С и 80% RH в прахов детрегент, съдържащ избелващо средство.

Протеаза	Остатъчна активност, в%
0 седмица	1 седмица	3 седмица	5 седмица
РВ92 протеаза	100	51	25	15
M216Q	100	94	84	52
M216S	100	89	83	50
S160D	100	47	20	9
M212D	100	59	31	19

Пример 4. РВ92 протеаза и различни РВ92 протеазни мутанти се капсулира, като се следва метода, описан в пример 3. В този пример, 70 mg капсулирана протеаза с размер на частиците между 0,3 и 0,9 mm се смесва с 3,2 g ALL и 0,3 g натриев перборат тетрахидрат. Пробите се съхраняват при температура 30°С в 18 ml ампули във вакуумен десикатор. Прилага се вакуум / 25 mm Hg/ по време на първите три дена от периода на съхранение.

Чрез прилагане на вакуум степента на пренос на водна пара се увеличава, като по този начин системата достига своето равновесие при 80% RH по-бързо, отколкото в 5 системи, при които не е приложен вакуум.RH от 80% се създава чрез наситен разтвор на калиев бромид.

В таблица 6 е отразена остатъчната активност след посочения период на съхране10 ние /в седмици/.

Таблица 6.

Остатъчна активност на РВ92 протеаза и някои нейни мутанти след съхранение при температура 30° и 80% RH в детергент, съдържащ избелващо средство.

Протеаза	Остатъчна активност
0 седмица	1 седмица	2 седмица	3 седмица
РВ92 протеаза	100	27	22	14
M212Q	100	63	53	44
M216S	100	55	49	31
S160D	100	23	18	13

Пример 5.

Получава се следният течен детергентен състав.

Компонент	Тегл.%
С,0-С,3 линейна алкилбензол-сулфонова киселина	12	35
С13 алкохол полиетоксилат, 8 ЕО	13
Лауринова киселина	8
Олеинова киселина	4	40
Триетаноламин	6
1,2-пропандиол	6
Етанол	5
Натриев цитрат	4
Диетилентриамин-пента оцетна киселина	0,3	45

Калциев формиат	0,12
Натриев формиат	1
Боракс	1,9
NaOH, 25% тегло/тегло
разтвор	ДорН 11,2
Вода	баланс

РВ92 протеаза и различни РВ92 протеазни мутанти се прибавят към този състав в количество, което да осигури първоначална концентрация на протеаза 0,13% тегло/тегло.

Стабилността на протеазата /в % остатъчна активност/ се определя след съхранение на състава, съдържащ протеаза при температура 37°С за определен брой дни. Резултатите са показани в таблица 7.

Таблица 7.

Остатъчна активност РВ92 протеаза и някои нейни мутанти след съхранение при 37°С в течен детергентен състав.

Протеаза	Остатъчна активност / %/
0 дни	5 дни	11 дни	15 дни	21 дни
РВ92 протеаза	100	23	10	5	3
S160D	100	57	30	14	8
M216Q	100	59	32	18	9
M216S	100	45	18	10	5
M212D	100	38	14	9	4

Пример 6. РВ92 протеаза и някои нейни мутанти се формуват, както следва. С всяка протеаза се прави смес, съдържаща следните компоненти.

		25
Компонент	Тегл.%
Амилосмола CLS	45
Захароза	23
Сорбитан	17	30
Глицерин	4
Парафиново масло	3
NaH2PO4	0,5
Протеаза /СЕР/	5,0
PVP К17	1,5
тю2	1	35

От тези смеси се приготвят гранули, като по същество се следва процедурата, описана в пример 5 от патент на US № 4,242,219, с изкл.на следното. Описаната смес в този пример се заменя с горната смес. Използват се дюзи с диаметър 0,7 mm, вместо, 1,0 mm. Гранулите са без покритие.

Тези гранули /140 mg/ се смесват с ALL основа /6,4 g/ и натриев перборат тетрахидрат /0,6 g/ и се поставят в 36 ml ампули.

Стабилността на протеазата /в % остатъчна активност/ след това се определя след съхранение на ампулите при 30°С и 80% RH за посочения брой седмици. Резултатите са показани в таблица 8.

Таблица 8.

Остатъчна активност на гарнули с РВ92 протеаза и някои нейни мутанти след съхранение при 30°С и 80% RH в детергент.

Протеаза	Остатъчна активност
0 седмица	1 седмица	3 седмица	5 седмица
РВ92 протеаза	100	45	29	17
M216Q	100	93	66	45
M216S	100	90	70	41

Пример 7. Втвърдени продукти на РВ92 протеаза и някои от нейните мутанти се приготвят и смесват с детергент и избелващо средство, както е описано в пример 3.

Стабилността при съхранение на тези проби /в % остатъчна активност/ се определя при 30°С и 60/80% RH/ с редуване 60% RH за 12 часа и 80% RH за 12 часа/. Резултатите са показани в таблица 9.

Таблица 9.

Остатъчна активност на втвърдени продукти на РВ92 протеаза и някои нейни мутанти след съхранение при 30°С и 60/80% RH.

Протеаза	Остатъчна активност,в %
0 седмица	1 седмица	3 седмица	5 седмица
РВ92 протеаза	100	70	34	15
M216Q	100	98	88	67
M216S	100	93	87	48
S160D	100	67	35	10
N212D	100	75	53	26

Пример 8. Приготвят се гранули, съдържащи РВ92 протеаза и някои нейни мутанти, и се смесват с детергент и избелващо средство, както е описано в пример 6.

Стабилността при съхранение на тези проби /в % остатъчна активност/ се определя след инкубация за посочените периоди от време при 30°С и RH, който се поддържа при 60% за 12 часа и при 80% за 12 часа, с редуване. Резултатите са показани в таблица 10.

Таблица 10.

Остатъчна активност на гранули с РВ92 и някои нейни мутанти след съхранение при 30° и 60/80% RH.

Протеаза	Остатъчна активност, в %
0 седмици	1 седмица	3 седмица	5 седмица
РВ92 протеаза	100	54	39	28
M216Q	100	93	81	67
M216S	100	99	87	72

Пример 9. РВ92 протеазата и някои нейни мутанти се изследват по отношение стабилност при съхранение в прахов детергент, съдържащ избелващо средство при 30°С и 80% RH. За този експеримент протеазите се използват в капсулирана форма. Всяка протеаза се капсулира по следния начин.

При 80°С се приготвя смес, съдържаща следния състав.

Компонент Тегл.%

Нейонно вещество*45

Ti0₂2 протеаза /СЕР/10

Na₂S0^ баланс + нейонно вещество= С₁₄-С₁₈ алкохол полиетоксилат /5О-80ЕО групи/.

Описаната смес се оставя да се охлади до стайна температура. Втвърдената смес се смила на малки частици. Частиците с размер 0,3 до 0,8 mm се оставят и се използват за експеримента по отношение на стабилност при съхранение.

За експеримента за стабилност при съхранение 140 mg от всяка капсулирана проте5 аза се смесва с 6,4 g ALL основа прахов детергент и 0,6 g натриев перборат тетрахидрат. Прахът от All основа не съдържа нито ензим, нито натриев перборат. Смесите ALL основа /протеаза/ натриев перборат тетрахидрат се 10 инкубират при 30° и 80% RH.

След срок на съхранение от 0,1, 2 или 4 седмици се определя стабилността на протеазата, изразена в % остатъчна активност. Резултатите са показани в таблица 11.

Таблица 11·

Остатъчна активност на РВ92 протеаза и някои нейни мутанти след съхранение при 30° и 80% RH в прахов детергент, съдържащ избелващо средство.

Протеаза	Остатъчна активност, в %
0 седмици	1 седмица	2 седмица	4 седмица
РВ92 протеаза	100	61	36	12
/S160D, M216Q/	100	78	58	35
/S160D, M216S/	100	86	68	39

Пример 10.

РВ92 протеазни мутанти се тестуват в перилен тест при по същество същите условия като описаните в пример 1, с изкл. на това, че 0,375 g течен детергент с описания по-нататък състав се прибавя към 250 ml вода при 5° GH в 4θ

Лаундерометьрен съд.

Компонент Тегл. %

Лауринова киселина8

Олеинова киселина4

С₁₀-С_1} линейна алкил-45 бензол сулфонова киселина 12

С_|3 алкохол полиетоксилат,

ЕО13

Триетаноламин6

1,2-пропандиол6

Етанол5

Натриев хидроокис,

45% тегло/тегло4

Натриев цитрат4

Вода до100 /рН на пяната 7,2/

Осъществяването на прането с различните протеази в този течен детергент се определя в Лаундерометър при 25° С за 30 мин. След пране отразяването на тестуваните тъкани се измерва, както е описано в пример 1. Ефектът от прането с мутантните протеази се определя, както е описано в пример 1. Резултатите са показани в таблица 12.

Таблица 12.

Пране с РВ92 протеазни мутанти при 25°С в течен детергент.

Протеаза	Ефект от пране	Специфична активност по отношение на РВ92 протеаза, в /%/
212D	+	100
160D	+	73
S160G, N212D	+	76
M216S	0	40
M216Q	0	37

0: 100% ± 20% ефект от прането спрямо РВ92 протеаза /стабилизирано парне/ + : > 120% пране, спрямо РВ92 протеаза

- : < 80% пране спрямо РВ92 протеаза.

Ефектът от прането с различни протеази се определя в намиращите се в търговията течни детергенти Tide’, Wisk^R и Ariel®. Съдове от неръждаема стомана, всеки от които съдържа 0,375 g Tide в 250 ml вода с 5°GH, 0,375 g Wisk в 250 ml вода с 5°GH или 1,25 g Ariel в

250 ml вода с 15° GH, съответно.

Перилният ефект се определя при 25°С или при 40°С. Другите условия са като описаните в пример 1. Резултатите са показани в таблица 13.

Таблица 13.

Перилен ефект с РВ92 протеазни мутанти в Tide, Wisk и Ariel при 25°С и при 40°С

Протеаза	Tide	Wisk	Ariel
25°С	40°С	25°С	40°С	40°С
N212D	+	+	+	+	0
S160D	+	+	+	+	+
M216Q	0	+	0	+	+
M216S	ND	0	0	0	0
S160Q	-	-	-	-	-
S160N	-	-	-	-	0
S160K	-	-	-	-	-
S160A	-	-	-	-	-
S160D,
M212Q	+	+	+	+	+
S160D,
M216S	0	-	+	+	0
M117DL,
M216Q	ND	-	ND	-	0

Таблица 13 (продължение)

M117L,
M216S	ND	-	ND	-	-

ND - означава, че не е определено

О - означава 100 20% перилен ефект спрямо РВ92 протеаза. + означава >120% перилен ефект спрямо РВ92 протеаза.

- означава < 80% перилен ефект спрямо РВ92 протеаза.

Пример 11. Перилният ефект на РВ92 протеазните мутанти се определя в тест с перална машина с отчитаща скала чрез TNO, Delft, Холандия /Cleaning Techniques Research Institute/. Перилният ефект на тези мутанти се сравнява с РВ92 протеаза.

Всички протеази са дозирани в IEC детергент на базата на теглото на протеин / 0,007% тегло/тегло/. На базата на активността тези дозировки дават следното.

РВ92 протеаза 1460 ADU/g детергент M216S 679 ADU/g детергент

M216Q 479 ADU/ g детергент

S160D 1080 ADU/g детергент

N212D 1455 ADU/g детергент

С всеки детергентен протеазен състав се извършват 8 перилни теста при 40°С в идентични AEG перални машини. Във всяка перална машина се използва 170 g детергент. По време на тестовете се използват изследваните детергенти по такъв начин, че за всеки прахов състав се извършва същият брой перилни цик ли във всяка машина.

През време на тестовете се прилага нормална питейна вода, както е подавана в град Делфт, като са използвани следните средни спецификации.

алкалност /М/ 2,2 mmol/1 твърдост /Н/ 1,6 mmol/1 /9° GH/ температура 20°С.

Отстраняване на замърсявания и петна от тестувани тъкани.

Във всеки тест се изпират 6 тъкани от три типа с ЕМРА замърсявания върху памук / № 111, 116 и 117/ заедно със замърсено пране.Отстраняването на замърсяване и петна от изкуствено замърсени тестувани тъкани след то ва се изследва чрез осветяване с тристимолово синьо, перпендикулярно на тестуваната тъкан. Измерва се количеството светилна, излъчена отново от тестуваната тъкан при ъгъл 45°. Съгласно IEC публикация 456 омекотяващата стойност на магнезиевия окис е нагласена на сто. Колкото е по-висока омекотяващата стойност, толкова е по-добър перилният процес за даден вид замърсяване.

Зареждане на перална машина

Пералните машини се напълват с 4,5 kg тестувани тъкани и дрехи за пране, замърсени при нормалната домашна употреба.

Зареждането с пране се състои от 6 хавлиени кърпи, 6 броя долно бельо, 4 спални чаршафи 4 броя калъфки.

Ако е необходимо, чисти спални чаршафи и калъфки се прибавят за достигане на необходимото количество товар.

За всеки перилен процес бельото за парне се подбира внимателно. Всяка тъкан, която се избира за поставяне в една машина, има еднакво замърсяване, което се изпира в една от другите перални машини. По този начин замърсеното пране в един процес е еднакво.

Параметри на перилния процес

Програма	40°С
Вода в главното парне	19 1
Време за най-висока
температура	15 минути
Най-висока температура	43°С
Време на пране	45 минути
Постъпване на вода	71
Температура след
разреждане на пяната	30°С
Отводняване	171

изплаквания с около 17 литра студе22 на вода всяко.

Средните стойности на омекотяването /V/ и съотношението /R/ се определят след 8 перилни теста. Резултатите от два независими експерименти са показани в таблици 14А и 14В.

Таблица 14А

Отстраняване на изкуствени замърсявания

Протеаза	ЕМРА тъкани №	Общо
111	116	117
V	R	V	R	V	R	V	R
РВ92 протеаза	49	1,00	44	1,00	56	1,00	149	1,00
M216S	49	1,00	46	1,05	58	1,04	153	1,03

Таблица 14В

Отстраняване на изкуствено замърсяване

Протеаза	ЕМРА тъкани №	Общо
111	116	117
V	R	V	R	V	R	V	R
РВ92 протеаза	41	1,00	35	1,00	46	1,00	123	1,00
M216S	40	0,96	33	0,94	42	0,91	115	0,93
M216Q	42	1,01	35	0,99	43	0,94	120	0,98

В таблица 15 съотношенията R, получени от перални машини с отчитаща скала, се разделят на съответното съотношение R’, изчислено от стойностите на перилния ефект спрямо РВ92 протеаза, получени от Лаундерометьр перилен тест при подобни условия /10 g/1 IEC, тестувани тъкани ЕМРА 116 и 117, време на пране 30 мин, температура 40°С.

Таблица 15

Съотношение между тест с перална машина с отчитаща скала и перилен тест с Лаундерометър

Протеаза	R/R’
РВ92 протеаза	1,00’
M216S	1,18

Таблица 15 (продължение)

M216Q	1,10
S160D	1,02
N212D	0,98

* по дефиниция

Стойности на R/R’ за мутантна протеаза, близки до 1,00, показват корелация на тестовете с перални машини със скала за отчитане и тестовете с Лаундерометър.

Пример 12. На фигурите 2А и 2В е показан ефектът от пране в 4 g IEC/1 с различни

РВ92 мутанти съгласно тестовете, описани в пример 1, по отношение на нативната РВ92 протеаза, като функция на тяхната специфична активност. Фигурите в диаграмата се отнасят до следните мутантни протеази.

Таблица

1 РВ92 протеаза	11 М216Р
2 М216А	12 М216Т
3 М216С	13 M216W
4 M216S	14 M216I
5 M216L	15 M216G
6 М216Е	16 M117L, H118D
7 М216К	17 M117L, M216Q
8 М216Н	18 M117L, H118D, M216Q
9 M216N	19 M117L, M216S
10 M216Q	20 M117L, H118D, M216S
21 M169S	31 S259K
22 М216У	32 W235R
23 M169I, M216S	33 H243R
24 М216-ОХ	34 H243R, S259K
25 N212S	35 D175N
26 N212D	36 Е134К
27 S160G, N212D	37 W235R, S259K
28 L211Y	38 W235R, H243R
29 L211Y, N212S	39 S259K
30 A166D, M169I	40 Т207К
41 S160N	51 S160I
42 S160G	52 S160G, M216S
43 S160P	53 S160G, M216Q
44 S160T	54 S160L
45 S160C	55 S160Y
46 S160Q	56 S160D, M216S
47 S160D	57 G116V, S126V, Р127Е, S128K
48 S160K	58 G116V, S126L, P127N, S128V
49 S160R	59 G116V, S126L, P127Q, S128A
50 S160A	60 G116V, S126V, Р127М
61 S126M, Р127А, S128G 62 GU6V, S126Y, P127G, S128L 63 G116V, S126N, Р127Н, S128I

Таблица (продължение)

G116V, S126H, P127Y

G116V, S126R, P127S, S128P

G116V, S126F, P127Q

G116V, S126G, P127Q, S128I

G116V, S126F, P127L, S128T

G116V, S126Q, P127D

На фигура 3 е показан ефектът от пране на 7 g IEC/1 с различни РВ92 протеазни мутанти съгласно тестовете, описани в пример 1, по отношение на нативната РВ92 протеаза, като функция на тяхната специфична активност. Фигурите в диаграмата цитират същите мутантни протеази, както във фигури 2А и 2В.

Всички публикации, вкл.патентни заявки, посочени в описанието, са за указание на специалистите от областта, към която принадлежи изобретението. Всички публикации са включени тук чрез цитиране до еднаква степен, както ако всяка отделна публикация е специфично и поотделно посочена да бъде включена чрез цитиране.

Описанието на изобретение е пояснено по-подробно с фигури и примери, с които не го ограничават при възможност за много изменения и модификации, без да се излиза от смисъла или обхвата на патентните претенции, приложени към описанието.

Claims (28)

1. Патентни претенции

   1. Мутантен протеолитичен ензим за детергенти с киселинна последователност, която се отличава най-малко по една аминокиселина от протеолитичния ензим от див тип, произлизащ от алкалофилен щам Bacillus.
2. 2. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има мутация най-малко на един аминокиселинен остатък в избрано място, съответстващо на аминокиселините 32, 33, 48-54, 5862, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158161, 164, 169, 175-186, 197, 198 и 203-216 в протеаза от див тип, получена от РВ 92 серинова протеаза.
3. 3. Мутантен протеолитичен ензим съг- ласно претенция 2, характеризиращ се с това, 15 че протеолитичният ензим от див тип има аминокиселинна последователност, която показва най-малко 70% хомоложност с аминокиселинната последователност на РВ92 сериновата протеаза.
4. 4. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенции 2 или 3, характеризиращ се с това, че протеолитичният ензим от див тип има по същество следната аминокиселинна последователност.

   H₂N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-AA-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-AV-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-GA-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-NG-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-IG-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-GL-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-LS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-SA-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-NS-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-AV-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-SQ-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-ST-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-KN-P-S-W-S-N-V-Q-1-R-N-H-L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-NA-E-A-A-T-R-COOH.
5. 5. Мутантен протеолитичен ензим за детергенти, характеризиращ се с това, че има аминокиселинната последователност на РВ92 протеазата, съдържаща най-малко една мутация.
6. 6. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че мутацията е при аминокиселина 116 и е от глицин до неполярна алифатна аминокиселина с по-високо молекулно тегло.
7. 7. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че мутациите са при аминокиселина 126, от серин до която и да е друга нехидроксилирана аминокиселина, при аминокиселина 127 до която и да е друга аминокиселина и при аминокиселина 128 до която и да е друга аминокиселина.
8. 8. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че мутацията е при аминокиселина 216 и е от метионин до несъдържаща сяра аминокиселина.
9. 9. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че мутацията е при аминокиселина 160 и е до глицин или до анионна аминокиселина.
10. 10. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претен ция 5, характеризиращ се с това, че мутацията е при аминокиселина 166 и е до анионна аминокиселина.
11. 11. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че мутацията е при аминокиселина 169 и е до неполярна алифатна аминокиселина.
12. 12. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че мутацията е при аминокиселина 212 и е до анионна аминокиселина.
13. 13. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че мутацията е от неутрална аминокиселина до анионна аминокиселина.
14. 14. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че мутацията е при аминокиселина 116 и е от глицин до валин, изолевцин или левцин.
15. 15. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че ензимът съдържа допълнително мутация при най-малко една от аминокиселините 126, 127 или 128.
16. 16. Мутантен протеолитичен ензим съгласно претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че ензимът е РВ92 серинов протеазен мутант, избран от групата, състояща се от [M216SJ; [M216QJ; [N212D]; [S160D]; [S160G, N212D]; [S160D, M216Q]; [S160D, M216S]; [A166D, M169I]; [G116V, S126V, Р127Е, S128K], [G116V, S126G, P127Q, S1281]; [G116V, S126L, P127N, S128V]; [G116V, S126L, P127Q, S128A]; [G116V, S126V, Р127М]; [G116V, S126H, P127Y]; [G116V, S126R, P127S, S128P]; [G116V.S126F, P127Q];

    [G116V, S126F, P127L, S128Т]; [S126M, Р127А, S128GJ; [S126M, Р127А, S128G, S160D]; и [G116V, S126N, P127S, S128A, S160D].
17. 17. Метод за получаване на мутантна протеаза за детергенти, характеризираща се с това, че се осъществява мутагенеза и клониране на ген, кодиращ желания протеолитичен ензим или негов фрагмент, с получения мутантен протеазен ген се трансформира щам гостоприемник, в който се експресира мутантният ген и който продуцира при подходящи условия на култивиране мутантна протеаза, която се идентифицира.
18. 18. ДНК последователност, кодираща мутантен протеолитичен ензим, както е дефинирано в която и да е от претенциите от 1 до 16.
19. 19. Експресионен вектор, характеризиращ се с това, че съдържа ДНК последователност съгласно претенция 18.
20. 20. Прокариотен щам гостоприемник, характеризиращ се с това, че е трансформиран с експресионен вектор съгласно претенция 19.
21. 21. Трансформиран прокариотен щам гостоприемник съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че щам гостоприемникът е Bacillus.
22. 22. Трансформиран прокариотен щам гостоприемник съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че Bacillus е по-специално алкалофилен Bacillus.
23. 23. Трансформиран прокариотен щам гостоприемник съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че алкалофилният Bacillus е Bacillus nov.spec. РВ92 или негов мутант.
24. 24. Трансформиран прокариотен щам гостоприемник съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че преди трансформацията е по същество неспособен да продуцира извънклетъчни протеолитични ензими.
25. 25. Метод за получаване на мутантен протеолитичен ензим съгласно всяка една от претенции от 1 до 16, характеризиращ се с това, че се култивира микроорганизъм гостоприемник, трансформиран с експресионен вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща мутантен протеолитичен ензим, продуциращ мутантния протеолитичен ензим, който след това се извлича.
26. 26. Детергентен състав, характеризиращ се с това, че съдържа един или повече ензимни продукти, съгласно всяка една от претенциите от 1 до 16.
27. 27. Употреба на един или повече мутантни протеолитични ензими съгласно претен- 5 циите от 1 до 16 в детергент_ен състав.
28. 28. Употреба на един или повече мутан тни протеолитични ензими съгласно претен циите от 1 до 16 в перилен процес.