DE68929484T2

DE68929484T2 - Proteolytische Enzyme und ihre Verwendung in Waschmitteln

Info

Publication number: DE68929484T2
Application number: DE68929484T
Authority: DE
Inventors: Christiaan Albertus Gerardus Van Eekelen; Leonardus Johannes Sofie Marie Mulleners; Johannes Cornelis Van Der Laan; Onno Misset; Roelck Anneke Cuperus; Johan Herman Albert Lensink
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1988-02-11
Filing date: 1989-02-13
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2009-02-14
Also published as: PT89702B; DK501289D0; AU3050189A; EP0571049B2; KR900700597A; LV10652B; EP0571049A1; DK501289A; PT89702A; KR970005249B1; DK175813B1; LV10652A; BG60566B1; EP0571049B1; JPH02503986A; AU629814B2; CN1056187C; CN1036602A; DE68929484T3; US5336611A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft neue proteolytische Enzyme mit verbesserten Eigenschaften zur Verwendung in Reinigungsmitteln. Diese Eigenschaften umfassen verbesserte Fleckentfernungsfähigkeiten von Waschmittelzusammensetzungen, verbesserte Stabilität von Waschmitteln bei Lagerung und verbesserte Stabilität von aus den Reinigungsmitteln hergestellten Seifenlaugen.
Hintergrund der Erfindung
Die Verwendung enzymatischer Additive, vor allem proteolytischer Enzyme, in Reinigungsmittelzusammensetzungen, um die Entfernung von Verschmutzungen auf Eiweißbasis zu ermöglichen, wurde schon umfassend dokumentiert. Siehe beispielsweise die veröffentlichten europäischen Patentanmeldungen EP-A-0.220.921 und EP-A-0.232.269, die US-Patente Nr. 4.480.037 und Re 30.602 und den Artikel "Production of Microbial Enzymes", Microbial Technology, Bd. 1, 281–311, Academic Press (1979).
Reinigungsmittelzusammensetzungen können in Pulver-, Flüssigkeits- oder Pastenform vorliegen. Sie enthalten eine oder mehrere anionische, nichtionische, kationische, zwitterionische oder amphotere Verbindungen als aktives Reinigungsmittelmaterial. Solche Verbindungen wurde in Schwartz, Perry und Berch, "Surface Active Agents", Bd. II, Interscience Publishers (1958), ausführlich beschrieben. Außerdem können sie Maskierungsmittel, Stabilisierungsverbindungen, Aromaverbindungen und in manchen Fällen auch Oxidationsmittel, die üblicherweise als Bleichmittel bezeichnet werden, umfassen. Reinigungsmittelzusammensetzungen werden zur Reinigung von harten Oberflächen, zur Reinigung von Toiletten, zum Geschirrspülen (entweder automatisch oder per Hand) und zur Reinigung von Wäsche verwendet.
Waschmittel werden im Allgemeinen in zwei Hauptgruppen unterteilt: Flüssigwaschmittel und Pulver. Flüssigwaschmittel weisen hohe Konzentrationen von Tensiden mit ei nem neutralen bis mäßig basischen pH auf und enthalten normalerweise keine Bleichmittel. Pulverwaschmittel weisen meistens hohe Basizität auf (Laugen-pH 9–11); sie enthalten Maskierungsmittel, wie beispielsweise Natriumtripolyphosphat, und je nach Waschgewohnheiten des jeweiligen Landes, in dem sie verkauft werden, können sie Bleichmittel enthalten oder auch nicht.
Enzyme, die derzeit in Reinigungsmittelzusammensetzungen verwendet werden, werden in Form von flüssigen Suspensionen, Solen oder Granulaten zugesetzt. In Pulverwaschmitteln sind die proteolytischen Enzyme im Allgemeinen beispielsweise in eingekapselter Form vorhanden, wie z. B. als Sprühkondensat („prill") (z. B. MAXATASE^® und MAXACAL^®) oder Granulate (z. B. SAVINASE^® und ALCALASE^®). MAXATASE und MAXACAL werden von International Bio-Synthetics B. V. (Rijswijk, Niederlande) vertrieben, SAVINASE und ALCALASE von Novo Industri A/S (Bagsvaerd, Dänemark). In Flüssigwaschmitteln sind Enzyme meistens in gelöster Form vorhanden.
Proteolytische Enzyme sind im Allgemeinen schwer mit Waschmittelzusammensetzungen zu kombinieren. Sie müssen während der Anwendung stabil und aktiv sein, beispielsweise bei der Entfernung von eiweißhaltigen Flecken auf Stoffen während eines Waschvorgangs bei Temperaturen im Bereich von etwa 10°C bis über 60°C. Außerdem müssen sie während der Lagerung längere Zeit im Waschmittel stabil bleiben. Folglich müssen Enzyme in Gegenwart von Maskierungsmitteln, Tensiden, hoher Basizität, in machen Fällen Bleichmitteln und hohen Temperaturen stabil und funktionsfähig sein. Da es weder universelle Waschmittel noch universelle Waschbedingungen (pH, Temperatur, Laugenkonzentration, Wasserhärte) gibt, die überall auf der Welt gleich sind, können die Anforderungen an Enzyme je nach Art des Waschmittels, in dem sie verwendet werden, und den Waschbedingungen variieren.
Die Bedingungen, welche die Stabilität von Enzymen in Pulverwaschmitteln bestimmen, sind im Allgemeinen nicht optimal. Beispielsweise wirken während der Lagerung von Enzympräparaten in Pulverwaschmitteln trotz der scheinbaren physikalischen Tren nung des Enzyms von der Reinigungsmatrix durch Einkapselung des Enzyms Oxidationsmittel vom Waschmittel auf die Protease und verringern ihre Aktivität. Eine weitere Ursache für die Instabilität des Enzyms in Pulverwaschmitteln während der Lagerung ist Autolyse, vor allem bei hoher relativer Feuchtigkeit.
Darüber hinaus bringen Oxidationsmittel, die oft in Pulverwaschmitteln vorkommen, bei Verwendung als Waschmittel einen großen Nachteil in Bezug auf die Fleckenentfernungseffizienz mit sich, da sie eiweißhaltige Flecken auf dem Stoff fixieren. Außerdem verringern diese Oxidationsmittel und andere Waschmittelkomponenten, wie beispielsweise Maskierungsmittel, auch während des Waschvorgangs die Wirksamkeit der Protease bei der Fleckenentfernung.
Bei Flüssigwaschmitteln besteht ein bedeutendes Problem in der raschen Inaktivierung von Enzymen, vor allem bei erhöhten Temperaturen. Da die Enzyme in dem Waschmittelprodukt in gelöster Form vorhanden sind, findet diese Inaktivierung schon bei normalen Lagerbedingungen im Waschmittelprodukt statt und verringert so die Aktivität der Enzyme schon beträchtlich, bevor dieses eigentlich verwendet wird. Vor allem anionische Tenside, wie beispielsweise Alkylsulfate, in Kombination mit Wasser und Buildern tendieren dazu, das Enzym irreversibel zu denaturieren und es inaktiv oder für proteolytischen Abbau anfällig zu machen.
Teillösungen für Stabilitätsprobleme in Zusammenhang mit Enzymen in Flüssigwaschmitteln sind in Anpassungen der Flüssigwaschmittelformulierung zu finden, wie beispielsweise die Verwendung von Stabilisatoren, um die Inaktivierung der Enzyme zu reduzieren. Siehe EP-A-0.126.505 und EP-A-0.199.405, US-Patent Nr. 4.318.818 und UK-Patentanmeldung Nr. 2.178.055 A.
Ein weiterer Ansatz, um Stabilität von Enzymen in Flüssigwaschmitteln zu garantieren, ist in der EP-A-0238216 beschrieben, wobei durch Formulierungstechnik eine physikalische Trennung zwischen den Enzymmolekülen und der feindlichen Flüssigwaschmittel matrix erreicht wird. Für Pulverwaschmittel wurden alternative Einkapselungen vorgeschlagen, siehe beispielsweise die EP-A-0.170.360.
Weiter oben wurden die Bedingungen zusammengefasst, die proteolytische Waschmittelenzyme erfüllen müssen, um optimal zu funktionieren, sowie auch die Einschränkungen der derzeit zur Verwendung in Waschmittelzusammensetzungen erhältlichen Enzyme. Trotz der Anstrengungen, Enzymstabilität in Waschmittelzusammensetzungen zu gewährleisten, tritt unter normalen Lager- und Anwendungsbedingungen immer noch wesentlicher Aktivitätsverlust auf.
Eine Identifizierung und Isolierung neuer Enzyme für eine bestimmte Anwendung, wie beispielsweise zur Verwendung in Reinigungsmitteln, kann auf mehrere Weisen erfolgen. Ein Weg besteht darin, nach Organismen oder Mikroorganismen zu suchen, welche die gewünschte enzymatische Aktivität aufweisen, das Enzym aus dem (Mikro-)Organismus oder aus einem Kulturüberstand des (Mikro-)Organismus zu isolieren und zu reinigen, seine biochemischen Eigenschaften zu bestimmen und zu überprüfen, ob diese biochemischen Eigenschaften den Anforderungen der Anwendung entsprechen. Wenn das identifizierte Enzym nicht aus dem Organismus, der es auf natürliche Weise erzeugt, erhalten werden kann, können DNA-Rekombinationstechniken eingesetzt werden, um das für das Enzym kodierende Gen zu isolieren, das Gen in einem anderen Organismus zu exprimieren, das exprimierte Enzym zu isolieren und zu reinigen und zu testen, ob es für die gewünschte Anwendung geeignet ist.
Ein weiterer Weg, neue Enzyme für eine gewünschte Anwendung zu erhalten, besteht in der Modifizierung von vorhandenen Enzymen. Das kann unter anderem durch chemische Modifizierungsverfahren erreicht werden (siehe I. Svendsen, Carlsberg Res. Commun. 44, 237–291 (1976)). Im Allgemeinen sind diese Verfahren zu unspezifisch, dass sie alle zugänglichen Reste mit gewöhnlichen Seitenketten modifizieren, oder sie hängen von der Gegenwart von geeigneten zu modifizierenden Aminosäuren ab, und oft können die schwer erreichbaren Aminosäuren nicht modifiziert werden, wenn das En zymmolekül nicht entfaltet ist. Daher wird angenommen, dass das Enzymmodifizierungsverfahren durch Mutagenese des Kodierungsgens besser ist. Mutagenese kann entweder durch zufallsbestimmte Mutagenese oder durch ortsgerichtete Mutagenese erzielt werden. Zufallsbestimmte Mutagenese durch Behandlung eines ganzen Mikroorganismus mit einem chemischen Mutagen oder mit mutagenisierender Strahlung kann natürlich zu modifizierten Enzymen führen. In diesem Fall müssen starke Selektionsprotokolle verfügbar sein, um nach den extrem seltenen Mutanten mit den gewünschten Eigenschaften zu suchen. Eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass Enzym-Mutanten durch zufallsbestimmte Mutagenese isoliert werden, kann erreicht werden, indem nach Klonierung des Kodierungsgens dieses in vitro oder in vivo mutagenisiert und das kodierte Enzym durch Reklonierung des mutierten Gens in eine geeignete Wirtszelle exprimiert wird. Auch in diesem Fall müssen geeignete biologische Selektionsprotokolle verfügbar sein, um die gewünschten Enzym-Mutanten auswählen zu können, wie beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 87/05050 beschrieben ist. Diese biologischen Selektionsprotokolle wählen nicht spezifisch Enzyme zur Verwendung in Reinigungsmitteln aus.
Die spezifischste Weise zum Erhalt von modifizierten Enzymen ist ortsgerichtete Mutagenese, welche eine spezifische Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren durch eine beliebige andere Aminosäure ermöglicht. Die EP-A-0130756 beschreibt beispielsweise die Verwendung dieses Verfahrens zur Bildung von mutierten Protease-Genen, die exprimiert werden können, um modifizierte proteolytische Enzyme zu erhalten.
Vor kurzem wurde das Potenzial von Oligonucleotid-vermittelter ortsgerichteter Mutagenese durch die Verwendung von mutagenen Oligonucleotiden demonstriert, die so synthetisiert wurden, dass sie an verschiedenen Positionen in einer Zielsequenz Gemische von Basen enthielten. So kann eine Reihe von unterschiedlichen Mutationen an einer spezifischen Stelle einer DNA-Sequenz eingeführt werden, indem eine einzelne synthetische Oligonucleotidpräparation verwendet wird, wie sie etwa von Hui et al., EMBO J. 3, 623–629 (1984), Matteucci et al., Nucl. Acids Res. 11, 3113–3121 (1983), Murphy et al., Nucl. Acids Res. 11, 7695–7700 (1983), Wells et al., Gene 34, 315–323 (1985), Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 710–714 (1986) und F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987–1988, Greene Publishers Association and Wiley, Interscience (1987), angeführt wurden.
Stauffer et al., J. Biol. Chem. 244, 5333–5338 (1969), hat schon herausgefunden, dass das Methionin an Position 221 in Carlsberg-Subtilisin durch H₂O₂ zu Methioninsulfoxid oxidiert wird und für einen dramatischen Aktivitätsabnahme verantwortlich ist.
Als Ergebnis beider Verfahren, der zufallsbestimmten und der ortsgerichteten Mutagenese, zur Bildung modifizierter Enzyme, wurden von Serin-Protease von Bacillus amyloliquefaciens, auch "Subtilisin-BPN'" genannt, abgeleitete Mutanten isoliert und charakterisiert. In der WO 87/05050 ist eine Subtilisin-BPN'-Mutante mit erhöhter Thermostabilität offenbart. In der EP-A-0130756 ist beschrieben, dass ortsgerichtete Mutagenese von Methionin an Position 222 in Subtilisin-BPN' durch alle 19 möglichen Aminosäuren, unter Verwendung des so genannten "Kassettenmutagenese"-Verfahrens, zu Enzymen führen kann, die gegenüber Oxidation durch H₂O₂ resistent sind. Im letzteren Fall weisen die meisten Mutanten jedoch geringe proteolytische Aktivität auf. Die besten Mutanten, die gefunden wurden, waren M222A und M222S, welche im Vergleich zum nativen Subtilisin-BPN' eine spezifische Aktivität von 53% bzw. 35% aufwiesen, wie in Estell et al., J. Biol. Chem. 260, 6518–6521 (1985), beschrieben wurde.
Frühere Arbeiten über die Bildung modifizierter Proteasen zeigen, dass Subtilisin-BPN'-Mutanten mit veränderten Stabilitätseigenschaften und veränderten kinetischen Eigenschaften erhalten werden können; siehe die oben genannte Literatur und andere Literaturhinweise, beispielsweise Rao et al., Nature 328, 551–554 (1987), Bryan et al., Proteins 1, 326–334 (1986), Cunningham und Wells, Protein Engineering 1, 319–325 (1987), Russell et al., J. Mol. Biol. 193, 803–819 (1987), Katz und Kossiakoff, J. Biol. Chem. 261, 15480–15485 (1986) und die Übersichtsartikel von Shaw, Biochem. J. 246, 1–17 (1987), und Gait et al., Protein Engineering 1, 267–274 (1987). Keiner dieser Literaturhinweise hat jedoch zur industriellen Produktion von proteolytischen Enzymen mit verbesserter Waschleistung und Stabilität in Waschmitteln geführt. Keine der modifizierten Proteasen war unter relevanten Anwendungsbedingungen vom selben oder von höherem kommerziellem Wert als derzeit verwendete Reinigungsmittelenzyme.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Protease-Mutante zur Verwendung in Reinigungsmitteln, vor allem Waschmitteln, bereit. Diese neue Enzym-Mutante weist zumindest 70%ige Homologie mit der Aminosäuresequenz von PB92-Serin-Protease mit folgender Aminosäuresequenz auf:
die sich um zumindest eine Aminosäuresubstitution an einer ausgewählten Stelle, die Position 212 in der PB92-Serin-Protease entspricht, von Asparagin zu Asparaginsäure oder Glutaminsäure unterscheidet; und die in Bezug auf PB92-Protease verbesserte Waschleistung und/oder verbesserte Stabilität aufweist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein neues enzymatisches Reinigungsmittel bereit, das ein proteolytisches Enzymprodukt umfasst, das zumindest eine dieser neuen proteolytischen Enzym-Mutanten enthält.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Testsystem bereit, das eine effiziente Auswahl von proteolytischen Enzym-Mutanten mit verbesserten Eigenschaften zur Verwendung in Waschmitteln aus Dutzenden von Enzymen ermöglicht. Solche Enzyme werden durch Expression von mutagenisierten Protease-Genen hergestellt.
Im der folgenden detaillierten Beschreibung werden diese und andere Aspekte der Erfindung genauer erläutert.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1A zeigt den Aufbau des Mutationsvektors, der das PB92-Protease-Gen enthält.
1B ist eine schematische Darstellung des verwendeten Mutationsverfahrens.
1C zeigt den Aufbau eines Expressionsvektors, der eine PB92-Protease-Gen-Mutante enthält.
2A, 2B und 3 zeigen die Waschleistung in Gegenüberstellung zur spezifischen proteolytischen Aktivität von verschiedenen PB92-Protease-Mutanten unter unterschiedlichen Waschbedingungen.
4 zeigt die Nucleotidsequenz des PB92-Protease-Gens und die Aminosäuresequenz des kodierten Vorläuferenzyms.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Begriff "mit verbesserten Eigenschaften", der in dieser Beschreibung in Zusammenhang mit "proteolytischen Enzym-Mutanten" verwendet wird, bezeichnet proteolytische Enzyme mit verbesserter Waschleistung oder verbesserter Stabilität bei gleichbleibender Waschleistung in Bezug auf die entsprechende Protease vom Wildtyp.
Der Begriff "Waschleistung" von proteolytischen Enzym-Mutanten ist in dieser Beschreibung als Beitrag einer proteolytischen Enzym-Mutante zur Reinigung von Wäsche zusätzlich zur Wirkung der Reinigungsmittelzusammensetzung ohne Enzym unter relevanten Waschbedingungen definiert.
Der Begriff "relevante Waschbedingungen" wird verwendet, um die Bedingungen zu bezeichnen, die in Haushalten in einem Waschmittel-Marktsegment wirklich vorherrschen, vor allem die Waschtemperatur, Zeit, Waschtechnik, Laugenkonzentration, Waschmittelart und Wasserhärte.
Der Begriff "verbesserte Waschleistung" wird verwendet, um anzugeben, dass bei der Fleckenentfernung unter "relevanten Waschbedingungen" ein besseres Endresultat erzielt wird oder dass – bezogen auf das Gewicht – weniger der proteolytischen Enzym-Mutante notwendig ist, um dasselbe Endresultat wie beim entsprechenden Enzym vom Wildtyp zu erhalten.
Der Begriff "gleichbleibende Waschleistung" wird verwendet, um anzugeben, dass die Waschleistung einer proteolytischen Enzym-Mutante unter "relevanten Waschbedingungen" – bezogen auf das Gewicht – zumindest 80% jener der entsprechenden Protease vom Wildtyp beträgt.
Der Begriff "verbesserte Stabilität" wird verwendet, um im Vergleich zum entsprechenden Enzym vom Wildtyp bessere Stabilität von proteolytischen Enzym-Mutanten in Waschmitteln während der Lagerung und/oder ihre Stabilität in der Lauge zu bezeichnen, was Stabilität gegenüber Oxidationsmitteln, Maskierungsmitteln, Autolyse, Tensiden und hoher Basizität umfasst.
Biochemische Eigenschaften, die unter klar definierten Laborbedingungen bestimmt werden, sind keine verlässlichen Parameter zur Vorhersage der Leistung einer bestimmen Waschmittel-Protease unter gewünschten und spezifischen Anwendungsbedingungen. Diese Parameter umfassen kinetische Daten, die auf klar definierten Substraten, wie beispielsweise Proteinen, wie z. B. Casein, Dimethylcasein und Hämoglobin, oder substituierten Oligopeptidsubstraten, wie z. B. sAAPFpNA (Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-propyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid), gemessen werden. Scheinbar bestimmen andere Merkmale der Proteasen ihre Wirksamkeit bei der Reinigung von Wäsche.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass, obwohl Verfahren zur Einführung von Aminosäureveränderung in Proteine vorhanden sind, die zu bedeutenden Veränderungen ihrer biochemischen Merkmale führen können, eine Vorhersage der Wirkung spezifischer Mutationen unter tatsächlichen Anwendungsbedingungen noch immer sehr ungenau oder sogar unmöglich ist.
Gemäß vorliegender Erfindung wurde nun durch umfassende Forschung und Versuche ein Verfahren entwickelt, das die Herstellung von Protease-Mutanten mit einem effektiven Selektionsverfahren der Leistung dieser Proteasen kombiniert. Überraschenderweise kann auf diese Art eine relativ große Anzahl an Enzymen effizient auf ihre Leistung gescreent werden.
Das Testsystem gemäß vorliegender Erfindung basiert auf der Entfernung von Protease-empfindlichen Flecken aus Stoffproben in einem Launderometer oder Tergotometer, die relevante Waschbedingungen imitieren. Geeignete Teststoffproben sind beispielsweise die im Handel erhältlichen EMPA- (Eidgenössische Materialprüfungs- und Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz) Stoffproben, die künstlich mit eiweißhaltigen Flecken verun reinigt wurden. Relevante Flecken auf Stoffproben zum Testen von Proteasen umfassen Blut-, Gras-, Schokolade- und andere eiweißhaltige Flecken.
Außerdem können in diesem Testsystem andere relevante Faktoren, wie beispielsweise die Waschmittelzusammensetzung, Laugenkonzentration, Wasserhärte, Waschtechnik, Zeit, der pH und die Temperatur, so geregelt werden, dass für Haushaltsanwendungen in einem bestimmten Marktsegment typische Bedingungen imitiert werden können.
Die Waschleistung von Proteasen wird am besten durch ihre Fähigkeit, bestimmte repräsentative Flecken unter geeigneten Testbedingungen zu entfernen, gemessen. Diese Fähigkeit kann durch Reflexionsmessungen auf den Teststoffen bestimmt werden, nachdem dieser mit und ohne Enzyme in einem Launderometer oder Tergotometer gewaschen wurde. Das Labor-Anwendungstestsystem gemäß vorliegender Erfindung ist repräsentativ für Haushaltsanwendungen, wenn es für proteolytische Enzyme, die durch DNA-Mutagenese modifiziert wurden, angewandt wird.
Demgemäß ermöglicht die Erfindung das Testen von großen Mengen unterschiedlicher Enzyme und die Auswahl jener Enzyme, die besonders für eine spezifische Art von Waschmittelanwendung geeignet sind. Auf diese Art können leicht "maßgeschneiderte" Enzyme für spezifische Anwendungsbedingungen ausgewählt werden.
Einige bakterielle Serin-Proteasen werden als Subtilisine bezeichnet. Subtilisine umfassen die Serin-Proteasen des Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens ("Subtilisin BPN'") und Bacillus licheniformis ("Subtilisin Carlsberg"). Siehe die Übersichtsartikel von Markland und Smith in "The Enzymes", Boyer, Hrsg., Bd. 3, 561–608, Academic Press, New York (1971). Bacillus-Stämme, wie beispielsweise alkalophile Bacillus-Stämme, produzieren andere Proteasen. Beispiele für die letztere Kategorie sind die Serin-Proteasen in MAXACAL^®, hierin im Folgenden auch als PB92-Protease bezeichnet (von Bacillus nov. spec. PB92), und in SAVINASE^®, die schon weiter oben erwähnt wurden.
Die Aminosäuresequenz der PB92-Protease ist in 4 dargestellt. Die reife Protease besteht aus 269 Aminosäuren, die ein Molekulargewicht von etwa 27.000 D ausmachen, und weist einen isoelektrischen Punkt im hohen basischen Bereich auf. Die Aktivität der PB92-Protease auf ein Proteinsubstrat wird in Alkaline Delft Units (ADU) angegeben. Die Aktivität in ADU wird nach dem Verfahren bestimmt, das in der britischen Patentbeschreibung Nr. 1.353.317 beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass der pH von 8,5 auf 10,0 geändert wurde. Gereinigte PB92-Protease weist eine Aktivität von 21.000 ADU pro mg auf. Der auf Casein gemessene Umsatz (k_cat) beträgt 90 s^–1mol^–1.
Die spezifische Aktivität von gereinigten Präparaten aus Subtilisin Carlsberg (Delange und Smith, J. Biol. Chem. 243, 2184 (1968)) beträgt 10.000 ADU/mg und die von Subtilisin BPN' (Matsubara et al., J. Biol. Chem. 240, 1125 (1965)) 7.000 ADU/mg. Außer in den oben genannten Parametern, wie beispielsweise spezifische Aktivität und Umsatz (k_cat), unterscheidet sich PB92-Protease von Proteasen, wie beispielsweise Carlsberg-Subtilisin, Subtilisin BPN' und anderen Proteasen, die in Waschmitteln formuliert werden (z. B. MAXATASE^® und ALCALASE^®), dadurch, dass sie eine hohe positive Ladung besitzt, die durch Gelelektrophorese des nativen Proteins sichtbar gemacht werden kann, wie weiter unten im experimentellen Teil, Abschnitt 4, beschrieben ist.
Da die PB92-Protease bei basischen pH-Werten aktiv zur Fleckenentfernung beiträgt, wird sie im Allgemeinen als Waschmitteladditiv verwendet, zusammen mit Waschmittelbestandteilen, wie beispielsweise Tensiden, Buildern und Oxidationsmitteln. Letztere Bestandteile werden meistens in Pulverform verwendet. PB92-Protease weist im Vergleich zu anderen Proteasen, wie beispielsweise den oben erwähnten Subtilisinen, eine hohe Fleckenentfernungseffizienz auf. Das bedeutet, dass weniger PB92-Protease erforderlich ist, um dieselbe Waschleistung zu erbringen. Empfindlichkeit gegenüber Oxidation ist ein bedeutender Nachteil der PB92-Protease und aller anderen bekannten Serin-Proteasen, die in Waschmitteln verwendet werden (siehe auch Stauffer et al., J. Biol. Chem. 244, 5333–5338 (1969); Estell et al., J. Biol. Chem. 263, 6518–6521 (1985)). Die Oxidation der PB92-Protease durch entweder H₂O₂ oder Persäuren, die durch die Akti vatorsysteme gebildet werden, die Perborattetrahydrat und TAED enthalten, schafft im Vergleich zu nicht oxidierter PB92-Protease ein Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 50% bzw. 10%, in ADU/mg (siehe experimenteller Teil, Abschnitt 7, und Beispiel 1).
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ist äußerst gut geeignet für die Herstellung, das Screenen und die Auswahl von proteolytischen Enzym-Mutanten, die von natürlich produzierten bakteriellen Serin-Proteasen stammen. Solche Mutanten sind beispielsweise jene, für die ein Gen kodiert, das von einem Wildtyp-Gen eines alkalophilen Bacillus-Stammes stammt, und vorzugsweise PB92. Auch Mutanten die von der alkalophilen Bacillus-Serin-Protease Savinase stammen, sind geeignet. Das Verfahren ist außerdem vorteilhaft für die Auswahl von modifizierten Proteasen, die von anderen Proteasen stammen als die Serin-Proteasen von alkalophilen Bacillus-Stämmen PB92. Bekannt sind beispielsweise die Gene, die für die Serin-Proteasen von Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus licheniformis kodieren, und diese können als Ziel für Mutagenese verwendet werden. Natürlich kann entweder Oligonucleotid-gestützte ortsgerichtete Mutagenese oder regionsgerichtete zufallsbestimmte Mutagenese sowie jedes andere geeignete Verfahren zur effizienten Herbeiführung von Mutationen im Proteasen-Gen eingesetzt werden.
Das Verfahren zur Auswahl von proteolytischen Enzym-Mutanten gemäß vorliegender Erfindung (welches ihre Herstellung und ihr Screenen umfasst) weist die folgenden Schritte auf: Mutagenisierung eines klonierten Gens, das für ein proteolytisches Enzym von Interesse oder für ein Fragment davon kodiert; Isolierung der erhaltenen Mutanten des Proteasen-Gens oder der Proteasen-Gene; Einführung der besagten Mutante(n) eines Proteasen-Gens oder von Proteasen-Genen, vorzugsweise auf einem geeigneten Vektor, in einen geeigneten Wirtsstamm zur Expression und Produktion; Gewinnen des produzierten Protease-Mutante; und Identifizierung der Protease-Mutanten mit verbesserten Eigenschaften zur Anwendung in Waschmitteln.
Geeignete Wirtsstämme zur Herstellung von Protease-Mutanten umfassen transformierbare Mikroorganismen, in denen die Expression der Protease erzielt werden kann. Vor allem Wirtsstämme derselben Spezies oder Art, von der die Protease abstammt, sind geeignet, wie beispielsweise ein Bacillus-Stamm, vorzugsweise ein alkalophiler Bacillus-Stamm, insbesondere Bacillus nov. spec. PB92 oder eine Mutante davon mit im Wesentlichen denselben Eigenschaften. Auch B.-subtilis-, B.-licheniformis- und B.-amyloliquefaciens-Stämme gehören zu den bevorzugten Stämmen. Andere geeignete und bevorzugte Wirtsstämme umfassen jene Stämme, die im Wesentlichen zur Produktion extrazellulärer proteolytischer Enzyme vor der Transformation mit einer Gen-Mutante unfähig sind. Von besonderem Interesse sind Protease-defiziente Bacillus-Wirtsstäme, wie beispielsweise ein Protease-defizientes Derivat von Bacillus nov. spec. PB92. Die Proteasen können exprimiert werden, indem Expressionssignale verwendet werden, die im gewählten Wirtsorganismus funktionieren. Expressionssignale umfassen Sequenzen von DNA, die die Transkription und Translation der Proteasen-Gene regulieren. Geeignete Vektoren können sich in ausreichend hoher Zahl in einem Wirtsstamm nach Wahl replizieren oder eine stabile Aufrechterhaltung des Protease-Gens im Wirtsstamm durch chromosomale Integration ermöglichen.
Die proteolytischen Enzym-Mutanten gemäß vorliegender Erfindung werden durch Kultivierung eines transformierten Wirtsstamms, der die gewünschte(n) Mutante(n) des/der proteolytischen Gens oder Gene umfasst, unter geeigneten Fermentationsbedingungen und Gewinnung der produzierten Enzyme hergestellt.
Vorzugsweise werden die zu exprimierenden Proteasen in das Kulturmedium, was ihre Gewinnung erleichtert, oder im Fall von gramnegativen bakteriellen Wirtsstämmen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Zur Sekretion wird eine geeignete aminoterminale Signalsequenz eingesetzt, vorzugsweise die Signalsequenz, für die das ursprüngliche Gen kodiert, wenn dieses im gewählten Wirtsstamm funktionsfähig ist.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können geeignete Waschleistungstests entwickelt werden, die für Waschbedingungen in jedem beliebigen Haushalt des Marktes repräsentativ sind. Beispielsweise wurde ein geeigneter Test für den europäischen Hochleistungs-Pulverwaschmittelmarkt entwickelt, bei dem Pulverwaschmittel, die Bleichmittel enthalten können oder auch nicht, bei Laugenkonzentrationen von 1–10 g Waschmittel/l bei 10–20°d (Deutscher Härte) und bei Temperaturen von 25–80°C verwendet werden. Genauer gesagt wurde ein Pulverwaschmittel, das TAED und Perborat enthielt, bei einer Laugenkonzentration von 4, 7 oder 10 g Waschmittel/l bei 15°d bei 40°C verwendet.
Außerdem wurden Tests bereitgestellt, die für Waschvorgänge mit Flüssigwaschmitteln repräsentativ sind. Diese Waschmittel werden im Allgemeinen bei Laugenkonzentrationen von 1,5–5 g Waschmittel/l bei 5–15°d bei Temperaturen zwischen 15 und 40°C eingesetzt. Genauer gesagt wurden nichtbleichende Flüssigwaschmittelzusammensetzungen bei einer Laugenkonzentration von 1,5 g Waschmittel/l, 5°d, bei 25°C und 40 °C, was die Flüssigwaschmittelbedingungen der USA repräsentiert, sowie bei einer Laugenkonzentration von 5 g Waschmittel/l, 15°d, bei 40°C, was europäische Flüssigwaschmittelbedingungen repräsentiert, verwendet.
Geeignete Leistungstests können auch für andere Bedingungen, die auf dem Markt vorkommen, entwickelt werden. Stoffproben, die mit proteaseempfindlichen Flecken beschmutzt wurden, insbesondere Stoffproben mit Blut-, Gras-, Schokolade- oder anderen eiweißhaltigen Flecken, genauer gesagt die EMPA-Stoffproben 116 und 117, werden in repräsentativen Waschleistungstests verwendet.
Die Eigenschaften der natürlich vorkommenden oder natürlich mutierten Waschmittel-Proteasen können verbessert werden, indem eine Reihe von Mutationen in das Enzym eingeführt werden. Größtenteils sind die Mutationen Substitutionen, entweder konservative oder nichtkonservative, aber auch Deletionen und Insertionen sind geeignet.
Für konservative Substitutionen kann die folgende Tabelle verwendet werden:
worin jede Aminosäure durch eine andere Aminosäure in derselben Kategorie, insbesondere auf derselben Linie, substituiert werden kann. Außerdem können die polaren Aminosäuren N, Q die geladenen Aminosäuren substituieren oder durch sie substituiert werden. Zum Zweck der vorliegenden Erfindung sind vor allem Substitutionen von Interesse, die zu einem erhöhen anionischen Charakter der Protease führen, insbesondere an Stellen, die nicht direkt mit der aktiven Stelle zusammenhängen.
Regionen von besonderem Interesse in Bezug auf Mutationen sind jene Aminosäuren innerhalb einer Entfernung von 4 Å vom Hemmmolekül Eglin C, wenn Eglin C an die aktive Stelle gebunden ist.
Die folgende Nummerierung basiert auf einer PB92-Protease, aber die Überlegungen sind auch für andere Serin-Proteasen mit einer im Wesentlichen homologen Struktur von Interesse, vor allem für jene mit einer Homologie von über etwa 70%, insbesondere jene mit einer Homologie von über etwa 90%. Diese Positionen sind 32, 33, 48–54, 58–62, 94–107, 116, 123–133, 150, 152–156, 158–161, 164, 169, 175–186, 197, 198, 203–216, wobei die meisten dieser Positionen für direkte Wechselwirkung mit einem proteinhaltigen Substrat verfügbar sind. Normalerweise werden die Positionen 32, 62, 153 und 215 nicht substituiert, da Mutationen an diesen Stellen meist die Waschleistung verschlechtern.
Positionen für Substitutionen, die von besonderem Interesse sind, umfassen 60, 94, 97– 102, 105, 116, 123–128, 150, 152, 160, 183, 203, 211, 212, 213, 214 und 216. An manchen Positionen wird versucht, eine instabile Aminosäure, beispielsweise Methionin, in eine oxidativ stabilere Aminosäure, beispielsweise Threonin, zu verwandeln, während gleichzeitig die allgemeine Struktur und das Volumen der Aminosäure an dieser Stelle beibehalten werden. In anderen Situationen zeigte sich, dass durch den Ersatz der natürlichen Aminosäure durch fast jede andere Aminosäure bessere Ergebnisse erzielt werden können, vor allem durch den Ersatz der hydroxylierten Aminosäuren, S, T, durch eine polare oder nicht-polare Aminosäure oder sogar eine aromatische Aminosäure.

Substitutionen von besonderem Interesse umfassen:

G116	I, V, L
S126	beliebige Aminosäure
P127	beliebige Aminosäure
S128	beliebige Aminosäure
S160	anionisch oder neutral aliphatisch oder R
A166	geladen, insbesondere anionisch
M169	neutral aliphatisch, insbesondere apolar
N212	anionisch
M216	aliphatisch polar, insbesondere S, T, N, Q

Überraschenderweise ist, obwohl die meisten Mutationen zu geringerer spezifischer Aktivität der Protease mit herkömmlichen Substraten führen, die Waschleistung mit dem natürlichen Enzym vergleichbar oder sogar besser als diese, und in vielen Fällen ist auch die Lagerstabiltät besser.
Die Waschleistung einiger der PB92-Protease-Mutanten nimmt, wenn sie als Inverse der relativen Menge eines Enzyms, die zur Erreichung derselben Wirkung wie mit nativen Proteasen × 100% erforderlich ist, exprimiert werden, auf mehr als 120%, in bestimmten Fällen sogar auf mehr als 180%, zu.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden PB92-Protease-Mutanten bereitgestellt, die bessere Lagerstabilität in einer Bleichmittel enthaltenden Pulverwaschmittelzusammensetzung aufweisen als die native PB92-Protease und gleichzeitig ihre Waschleistung beibehalten. Beispiele für solche Mutanten sind M216S und M216Q sowie Mutanten mit zumindest einer dieser Mutationen neben anderen Mutationen an anderen Stellen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise herausgefunden, dass ein einer Flüssigwaschmittelzusammensetzung (die keine Oxidationsmittel enthält) die PB92-Protease-Mutanten M216S, M216Q, S160D und N212D ihre Aktivität besser aufrecht erhalten können als eine PB92-Protease. Von diesen Mutanten weisen M216S und M216Q gleichbleibende Waschleistung und S160D und N212D verbesserte Waschleistung auf. Die Verbesserung der Lagerstabilität bei den getesteten Flüssigwaschmitteln ist bei den Mutanten S160D und M216Q am stärksten ausgeprägt.
Es ist auch möglich, verschiedene Mutationen zu kombinieren, welche die Stabilität einer Protease in Waschmittelzusammensetzungen erhöhen. Verschiedene Mutationen, welche die Waschleistung desselben Proteins positiv beeinflussen, können zu einer einzelnen Protease-Gen-Mutante kombiniert werden, welche die Produktion von möglicherweise noch besseren Proteasen ermöglicht, beispielsweise [S126M, P127A, S128G, S160D] und [G116V, S126N, P127S, S128A, S160D]. Neue Protease-Mutanten können gebildet werden, indem die guten Waschleistungseigenschaften von beispielsweise N212D und S160D mit den Stabilitätseigenschaften von beispielsweise M216S oder M216Q kombiniert werden. Die [S160D, M216S]-Mutante weist beispielsweise verbesserte Waschleistung und bessere Lagerstabilität auf.
Nützliche Mutanten können auch hergestellt werden, indem beliebige Mutationen oder Mutationsgruppen, die in dieser Beschreibung angeführt wurden, kombiniert werden. Außerdem ist es möglich, hierin offenbarte nützliche Mutationen mit Mutationen an anderen Stellen zu kombinieren, die zu einer wesentlichen Veränderung der Eigenschaften des Enzyms führen können oder auch nicht.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die folgenden PB92-Protease-Mutanten: [N212D] und [S160G, N212D].
Um die Bedeutung des Ansatzes dieser Erfindung zur Erhaltung neuer Proteasen, die zur Anwendung in Waschmitteln geeignet sind, aufzuzeigen, d. h. durch repräsentative Anwendungstests für Wäsche als primäres Auswahlkriterium, wurden die Ergebnisse der Waschleistungstests der PB92-Protease-Mutanten mit biochemischen Parametern verglichen, die üblicherweise in biochemischer und enzymologischer Proteinforschung bestimmt werden. Diese Ergebnisse führen zu der Schlussfolgerung, dass jede Beziehung zwischen Parametern, die Affinität zu definierten Substrate bestimmten, und der Kinetik der proteolytischen Reaktion und Waschleistung fehlt (siehe Tabelle 1 von Beispiel 1).
Daher ist es natürlich auch möglich, zwei oder mehr Mutanten mit unterschiedlichen Eigenschaften in einem Enzym-Produkt oder im selben Waschvorgang zu kombinieren. Solch eine Kombination kann synergistische Wirkung haben oder auch nicht.
Die Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer oder mehrerer proteolytischer Enzym-Mutanten, wie sie hierin weiter oben definiert wurden, in einer Waschmittelzusammensetzungen oder ein einem Waschvorgang.
Schließlich ist offensichtlich, dass sich durch Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren in der Protease-Polypeptidkette, die entweder künstlich durch Mutagenese geschaffen wurde oder natürlich in zur PB92-Protease homologen Proteasen vorkommt, die Nummerierung der Aminosäuren verändern kann. Es versteht sich jedoch, dass Positionen, die homolog zu Aminosäurepositionen einer PB92-Protease sind, innerhalb des Schutzumfangs der Ansprüche liegen.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
EXPERIMENTELLER TEIL
Materialien und Verfahren
Herstellung von PB92-Protease-Mutanten
Das Grundkonstrukt, von dem die Mutagenesearbeit ausgeht, wird als pM58 bezeichnet und ist in der EP-A-0283075 im Detail beschrieben.
Die Strategie umfasst folgende drei Phasen:

a) Bildung eines Mutagenese-Vektors M13M1
b) Mutationsvorgang
c) Bildung von pM58δEco und Subklonierung der DNA-Fragmentmutante in diesen Vektor.

1.a) Bildung eines Mutagenese-Vektors M13M1
Das Grundkonstrukt pM58 wurde mit den Restriktionsenzymen HpaI und BalI verdaut. Das 1.400 bp lange Fragment, welches das PB92-Protease-Gen enthielt, wurde auf niedrigschmelzender Agarose (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1982)) gereinigt.
Ein Vektor M13MP11 (Messing et al., Nucl. Acids Res. 9, 303–321 (1981)) wurde mit Smal verdaut. Das betreffende 1.400 bp lange Fragment wurde in diesen Vektor ligiert und nach den von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110–2114 (1972), beschriebenen Verfahren in E. coli JM101 transfiziert.
Nach einer Phagenvermehrung in E. coli JM101 wurde ssDNA isoliert (Heidecker et al., Gene 10, 69–73 (1980), und das Insert und seine Ausrichtung wurden durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des von Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 6463 (1977), beschriebenen Verfahrens überprüft.
Der für eine Mutagenese geeignete Vektor wurde erhalten und M13M1 benannt. Das oben beschriebene Verfahren ist in 1A schematisch dargestellt.
1.b) Mutationsverfahren
Eine Mutagenese wurde unter Verwendung von ssDNA dieses Vektors und dsDNA von M13mp19 an M13M1 durchgeführt (Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 303–321 (1988)), wobei letzterer Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HINDIII verdaut wurde, wonach das große Fragment auf niedrigschmelzender Agarose gereinigt wurde.
Eine Mutagenese wurde wie von Kramen et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441–9456 (1984), beschrieben, jedoch mit der Modifikation, dass E. coli JM105 anstelle von E. coli WK30-3 zur Auswahl von Mutanten verwendet wurde, durchgeführt.
Die Länge der Oligonucleotide, die zur Schaffung der spezifischen Mutationen verwendet wurden, war 22 Nucleotide. Eine regionsspezifische Mutation, die zur Schaffung verschiedener Mutationen in einer spezifischen DNA-Sequenz zu dem Zeitpunkt verwendet wurde, wurde unter Einsatz eines Oligonucleotid-Präparats mit einer Länge von 40 Nucleotiden, wobei alle vier Nucleotide zufällig in die Stellen aufgenommen wurden, die der/den zu mutierenden Aminosäure(n) entsprachen, durchgeführt.
Nach der Mutagenese wurden potentielle Mutanten durch Sequenzanalyse unter Verwendung des Dideoxy-Verfahrens von Sanger, s. o., auf die relevante Mutation untersucht. Die gesamte Einzelstrangspalte (siehe 1B) wurde sequenziert, um das Fehlen von sekundären Mutationen zu bestätigen. Das Verfahren ist in 1B schematisch dargestellt.
Das beschriebene Verfahren ist zur Schaffung von DNA-Fragmenten mit Mutationen in 3'-Teil des Proteasen-Gens (Aminosäuren 154–269) geeignet.
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden erkennen, dass zur Bildung von DNA-Fragmenten mit Mutationen im 5'-Teil des Protease-Gens in einem Bacillus-Vektor auch andere Restriktionsenzyme verwendet werden können und modifizierte PB92-Protease-Gene analog zum Verfahren von 1A gebildet werden können.
1.c) Bildung von pM58δEco und Subklonierung von DNA-Fragmenten, welche die Mutationen in diesem Vektor enthalten (1C)
Um pM58δEco herzustellen, wurde mP58 mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und mit T4-Ligase unter verdünnten Bedingungen ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um B. subtilis 1-A40 (Bacillus Genetic Stock Centre, Ohio, USA) gemäß dem Verfahren von Spizizen et al., J. Bacteriol. 81, 741–746 (1961), zu transformieren.
Zellen aus dem Transformationsgemisch wurden auf Minimalplatten, die 20 μg/ml Neomycin enthielten, plattiert, wie es in Beispiel 1 der EP-A-0283075 beschrieben ist.
Plasmid-DNA von Transformanten wurde gemäß dem Verfahren nach Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513–1523 (1979), isoliert und durch Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Auf diese Weise wurde pM58δEco isoliert (siehe 1C).
Um eine Enzym-Mutante herzustellen, wurden die DNA-Fragmente von M13M1, welche die gewünschten Mutationen aufwiesen und wie in Abschnitt 1.b. beschrieben gebildet wurden, in pM58δEco subkloniert. dsDNA von M13M1 (siehe oben) wurde mit EcoRI verdaut und in die EcoRI-Stelle von pM58δEco ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um B. subtilis DB104 zu transformieren, Dio, J. Bacteriol. 160, 442–444 (1984), wobei das Verfahren nach Spizizen et al., s. o., verwendet wurde.
Zellen aus dem Transformationsgemisch wurden auf Minimalplatten, die 20 μg/ml Neocym und 0,4% Casein enthielten, plattiert (EP-A-0283075). DNA von Transformanten produzierender Protease wurde nach dem von Birnboim und Doly, s. o., beschriebenen Verfahren isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse charakterisiert.
2. Herstellung von Protease-Mutanten
Transformanten von DB104, die erwiesenerweise den Vektor mit der Protease-Gen-Mutante enthielten, wurden in 10 ml Trypton-Soja-Kulturlösung (TSB), das 10 μg/ml Neomycin enthielt, inokuliert und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Proben der Kultur (0,1 ml) wurden in 500 ml fassende Schüttelkolben inokuliert, die 100 ml Proteaseproduktionsmedium enthielten: 12,5 g/l Hefeextrakt (Difco), 0,97 g/l CaCl₂·6H₂O, 2,25 g/l MgCl₂·6H₂O, 20 mg/l MnSO₄·4H₂O, 1 mg/l CoCl₂·6H₂O, 0,5 g/l Citrat, 0,5 ml/l Schaumverhütungsmittel 5693, 6% (Gew./Vol.) Maltose, 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,8 und 20 μg/ml Neomycin.
Nach 65-stündiger Inkubation unter konstanter Belüftung wurde die Proteasenaktivität der Kulturen unter Verwendung von Dimethylcasein als Substrat und mithilfe des von Lin et al., J. Biol. Chem. 244, 789–793 (1969), beschriebenen Verfahrens getestet. Um größere repräsentative Menge von PB92 vom Wildtyp und PB92-Protease-Mutanten herzustellen, wurden diese Stämme auch bei 37°C in belüfteten Fermentern mit einem Volumen von 10 l oder mehr gezüchtet, wobei im Wesentlichen dasselbe Produktionsmedium verwendet wurde wie für die Schüttelkolben.
Die erhaltenen Kulturlösungen wurden zur Proteasen-Reinigung verwendet.
3. Reinigung und Konzentration einer PB92-Protease vom Wildtyp und ihrer Mutanten
Die PB92-Protease vom Wildtyp und ihre Mutante, die in Schüttelkolben oder 10 l fassenden Fermentern aus Bacillus subtilis DB104 hergestellt wurden, wurden durch Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von Zeta-Prep^®-Scheiben oder -Patronen (PS-Typ, LKB) gereinigt. Die Fermentations-Kulturlösung wurde zentrifugiert (3.000 × g, 10 min), und der Überstand wurde 10fach mit 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 5,5 verdünnt und dann auf den Kationenaustauscher aufgebracht. Nach dem Waschen mit mehreren Patronenvolumen Phosphatpuffer wurde die Protease eluiert, indem 0,4 M NaCl in den Phosphatpuffer gegeben wurden. Fraktionen, welche Proteasenaktivität aufwiesen, wurden gepoolt und durch Ultrafiltration mithilfe einer Amicon-Rührzelle, die mit einem PM-10-Filter ausgestattet war, konzentriert. Die NaCl-Konzentration wurde durch Verdünnen und Konzentrieren der Proteaselösung mit Phosphatpuffer auf etwa 50 mM verringert, wonach sie bei –80°C bei einer Proteinkonzentration von 1–10 mg/ml gelagert wurde.
Alternativ dazu wurden zum Erhalt der PB92-Protease-Mutanten aus den Kulturlösungen von Fermentationen in größerem Umfang CaCl₂ (1 Gew.-%) und Aceton (30 Gew.-%) zugesetzt. Nachdem die Zellmasse abfiltriert worden war, wurde die Protease aus dem erhaltenen Filtrat ausgefällt, indem 0,2–2 Gew.-% CaSO₄·2H₂O und weiteres Aceton bis zu einer Endkonzentration von > 60 Gew.-% zugesetzt wurden. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Aceton besprüht, gefolgt von einer Trocknung, wodurch rohes Enzympulver (CEP) erhalten wurde.
4. Analysetechniken zur Überprüfung der Reinheit von gereinigten Proteasen
Proteasen wurden als rein bezeichnet, wenn durch Elektrophorese und Hochleistungs-Gelelektrophorese (HPLC) eine einzelne Bande bzw. ein einzelner Peak gefunden wurde.
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde nach Laemmli, Nature 227, 680–685 (1970), durchgeführt. Einer Denaturierung der Proteinproben durch SDS bei 100°C muss jedoch eine Inaktivierung der Proteasenaktivität vorausgehen, um eine Autodegradation zu vermeiden. Das kann durch Inkubation mit Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (1 mM, 30 min, Raumtemperatur) oder Fällung mit Trichloressigsäure (TCA, 8%, 30 min, auf Eis) erreicht werden. Native PAGE wurde bei pH 7,45 (Gelpuffer aus 20 mM Histidin (His) und 50 mM 3-[N-Morpholin]propansulfonsäure (MOPS)) in 5% Polyacrylamidgelen (Verhältnis zwischen Acrylamid und Bisacrylamid 20 : 1) durchgeführt. Proteinproben wurden auf Slab-Gele aufgetragen und in Richtung der Kathode elektrophoresiert. Derselbe His/MOPS-Puffer wurde als Elektrophorese-(Tank-)Puffer verwendet, jedoch bei pH 6,3. Nach der Elektrophorese (1½ bis 2 Std. bei 350 V) wurde das Gel mit 8% Essigsäure durchtränkt, um die Proteine im Gel zu fixieren, und dann mit Coomassie-Brillantblau R250 eingefärbt und laut Standardverfahren entfärbt.
Die Reinheitsüberprüfung durch HPLC wurde mithilfe einer Kationenaustauschsäule (MonoS-Pharmacia Fine Chemicals) und einer Gelfiltrationssäule (TSK 2000 SW-LKB) durchgeführt. Erstere wurde in einem 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 5,5 betrieben, und eine Elution der gebundenen Protease wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10–300 mM Natriumphosphat pH 5,5 erhalten. Die Gelfiltrationssäule wurde in 0,25 M Natriumacetat pH 5,5 laufen gelassen.
5. Bestimmung der Proteasekonzentration
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer gereinigten Proteaselösung wurden

i) Extinktionsmessungen bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten (ε_M) und
ii) Wirkstellen-Titration eingesetzt.

Der Extinktionskoeffizient bei 280 nm wurde aus der Anzahl von Tryptophanen (ε_M= 5.600 M^–1·cm^–1) und Tyrosinen (ε_M = 1.330 M^–1·cm^–1) pro Enzymmolekül berechnet. Für die PB92-Protease wurde ε_M= 26.100 M^–1·cm^–1 (3 Trp-, 7 Tyr-Reste), was E¹ ₁ ^% _cm = 9,7 (M_r = 26.729 Da), gemessen bei 280 nm, entsprach, verwendet. Im Falle von Mutanten mit einer veränderten Anzahl von Trp und Tyr wurden entsprechende Korrekturen vorgenommen.
Eine Schätzung der Anzahl an aktiven Enzymmolekülen wurde mithilfe einer Wirkstellen-Titration erhalten. Da das weit verbreitete Verfahren mit N-Transcinnamoylimidazol (M. L. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 5890–5931 (1966)) für PB92-Protease nicht zufrieden stellend funktionierte, entwickelten die Erfinder stattdessen ein Verfahren mit PMSF. Dazu wurde eine Proteaselösung mit einer geschätzten Enzymkonzentration (von der 280-nm-Absorption) mit 0,25, 0,50, 0,75, 1,00 und 1,25 Äquivalenten von PMSF gemischt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 10 mM Natriumphosphat pH 6,5 reagieren gelassen. Die Enzymkonzentration muss zumindest 50 μM betragen.
Restaktivität wurde spektralphotometrisch unter Verwendung von Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid (sAAPFpNA) als Substrat gemessen (siehe unten). Die Reinheit (und damit die Konzentration) von PMSF wurde durch NMR-Spektroskopie bestimmt, und Stammlösungen wurden in Isopropanol hergestellt. Die Ergebnisse der Wirkstellen-Titration stimmten mit den Ergebnissen der Reinheitsüberprüfung durch HPLC überein.
6. Bestimmung von kinetischen Parametern von Proteasen vom Wildtyp und Protease-Mutanten

1°. Die Aktivität auf Proteinsubstraten (Casein) wurde, wie in der britischen Patentbeschreibung 1.353.317 beschrieben, bei pH 10,0 gemessen (ausgedrückt in ADU = Alkaline Delft Units).
2°. Der Umsatz mit Casein als Substrat wurde in einem pH-Stat gemessen. Die Reaktionskammer des pH-Stats (Radiometer, Kopenhagen) enthielt 10 ml 0,1 M KCl mit 50 mg Casein (Hammerstein, Merck). Protonen, die durch eine Hydrolyse von Casein durch PB92-Protease freigesetzt wurden, wurden mit 10 mM NaOH titriert, während der pH bei 10,0 gehalten wurde (bei 40°C und unter einem Stickstoffgasstrom).
3°. Die Aktivität auf synthetischen Peptiden wurde unter Verwendung von sAAPFpNA gemessen. Das gebildete (gelbe) Paranitroanilid (pNA) wurde spektralphotometrisch bei 410 nm gemessen: ε_M= 8.480 M^–1·cm^–1 (E. G. Delmar et al., Anal. Biochem. 94, 316–320 (1979), mit einem Spektrometer UVIKON 860 (KONTRON), das mit einem Thermostat-kontrollierten Zellentauscher mit sechs Positionen ausgerüstet war. Die kinetischen Parameter k_cat und K_m wurden aus den anfänglichen Verhältnismessungen bei verschiedenen Substratkonzentrationen (für PB92-Protease von 0,1–6,0 mM) und Einpassen der Daten in eine Hyperbelfunktion durch nichtlineare Regression unter Verwendung des multivariaten Sekanteniterationsverfahrens erhalten. Die Spezifitätskonstante k_cat/K_m wurde dann berechnet. Messungen wurden bei 25 °C in einem Endvolumen von 1 ml, das 0,1 M TRIS-HCl + 0,1 M NaCl pH 8,6 enthielt, durchgeführt. Das Natriumchlorid war notwendig, weil in seiner Abwesenheit PB92-Protease keine nichtlineare Lineweaver-Burk-Diagramme aufwies, was durch Substrathemmung verursacht hätte sein können. Das Substrat wurde zuerst in DMSO auf eine Konzentration von 200 mM gelöst und dann mit 0,1 M TRIS-HCl pH 8,6 verdünnt, was eine Stammlösung von 20 mM ergab (spektralphotometrisch bei 315 nm bestimmt; ε_M= 14.000 M^–1·cm^–1). Für die variierenden Konzentrationen von DMSO (0,05–3,0 Vol.-%) wurden keine Korrekturen vorgenommen.

7. Oxidation von PB92-Proteasen
Die Empfindlichkeit von PB92-Proteasen gegenüber Oxidation durch H₂O₂ wurde laut dem von Estell et al., J. Biol. Chem. 260, 6518–6521 (1985), beschriebenen Verfahren getestet, mit der Ausnahme, dass:

i) 20 mM H₂O₂ anstelle von 100 mM verwendet wurden und
ii) 20 mM mit 10 mM TAED vereinigtes Natriumperborat als zusätzliches Oxidationsmittel eingesetzt wurden.

8. Waschleistungstest
PB92-Protease-Mutanten wurden in einem speziell entwickelten Waschtest untersucht, bei dem Baumwolle- und Polyester/Baumwolle-Stoffproben (5,0 × 5,0 cm, von EMPA, St. Gallen, Schweiz, Nr. 116 und 117), die mit Milch, Blut und Tinte beschmutzt waren, verwendet wurden.
Die Waschtests wurden in einem Atlas-Launderometer LEF-FC durchgeführt, das mit Edelstahl-Testbehältern ausgestattet war, die jeweils eine definierte Waschmittelzusammensetzungen plus der zu testenden Protease (PB92-Protease-Mutanten oder PB92-Protease) enthielten. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Tests 30 Minuten lang bei einer gewünschten Temperatur durchgeführt. Nach dem Waschen wurden die Stoffproben luftgetrocknet, und das Reflexionsvermögen der Stoffproben wurde bei 680 nm mit einem Photovolt-Photometer (Modell 577), das mit einem grünen Filter ausgestattet war, gemessen. Reflexionsdaten, die auf den mit Waschmitteln, welche die jeweiligen PB92-Protease-Mutanten enthielten, gewaschenen Stoffproben gemessen wurden, wurden mit Reflexionsdaten einer vergleichbaren Messreihe mit Waschmitteln, die PB92-Protease enthielten, verglichen. Die Waschleistungswerte der Protease-Mutanten wurden berechnet, indem die Proteinmenge von PB92-Protease (mg) durch die Proteinmenge einer Protease-Mutante (mg), die zum Erreichen desselben Reflexionsvermögens erforderlich war, dividiert wurde, × 100%.
BEISPIEL 1
A. Die Waschleistung verschiedener PB92-Protease-Mutanten in europäischen Pulverwaschmitteln wurden laut dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt.

Edelstahl-Testbehälter, die jeweils eine gegebene Menge Pulverwaschmittel IEC enthielt, das in 250 ml Wasser mit 15°d gelöst war, wurden jeweils mit zwei Baumwolle- und zwei Polyester/Baumwolle-Stoffproben beladen. Die Zusammensetzung des Pulverwaschmittels IEC war wie folgt:

Komponente	Gew.-%
Unverzweigtes Natriumalkylbenzolsulfonat (mittlere Kettenlänge der Alkankette C11,5)	6,4
Ethoxylierter Talgalkohol (14 EO)	2,3
Kernseife	2,8
Natriumtripolyphosphat (STPP)	35,0
Natriumsilicat	6,0
Magnesiumsilicat	1,5
Carboxylmethylcellulose	1,0
Natriumsulfat	16,8
Natriumperborattetrahydrat	18,5
TAED	1,5
Verschiedenes + Wasser	auf 100

Zu jedem Behälter wurde eine ausgewählte gereinigte PB92-Protease-Mutante in einer Konzentration von 0 bis 1,74 mg (gereinigter) Protease pro Liter Lauge zugesetzt. Ein Behälter wurde zum Testen von PB92-Protease auf dieselbe Weise als Vergleich verwendet. Die Waschtests wurden bei 40°C durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
B. Der Waschleistungstest wurde bei 25°C mit demselben Waschmittel, das einige der PB92-Protease-Mutanten enthielt, wiederholt. Die PB92-Protease wurde wieder als Bezug verwendet. Sonstige Testbedingungen waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2 Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten bei 25°C in Pulverwaschmittel enthaltendem STPP, bezogen auf PB92-Protease (%)
C. Die Waschleistung der Proteasen wurden auch in einem europäischen Pulverwaschmittel mit Nicht-Phosphatbleichmittel in einem Launderometer bei 25°C und 40°C bestimmt. Eine PB92-Protease wurde wieder als Bezug verwendet. Sonstige Testbedingungen waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3 Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten bei 25°C und 40°C in einem europäischen Pulverwaschmittel mit Nicht-Phosphatbleichmittel, bezogen auf PB92-Protease (%)
BEISPIEL 2
Die PB92-Protease-Mutante M216S wurde auf ihre Lagerstabilität im in Beispiel 1 beschriebenen Pulverwaschmittel IEC getestet. Die Lagerstabilität wurde in Klima-Boards bei 30°C und 80 relativer Feuchte (r. F.) untersucht. Die Protease für diesen Versuch wurde wie folgt eingekapselt:
Ein Gemisch aus folgenden Bestandteilen wurde hergestellt (in Gew.-%): 2% gereinigte Protease, 50% nichtionisches Tensid (ethoxylierter C₁₄-C₁₈-Alkohol mit 50–80 EO-Einheiten), 5% TiO₂, 3–10% CaSO₄·2H₂O und Na₂SO₄ auf 100%. Das Gemisch wurde auf 65–90°C erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Das erhaltene verfestigte Gemisch wurde zu Körnchen gemahlen. Körnchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1 mm wurden herausgesiebt und für Lagerungstests in Waschmitteln verwendet.
3,5 g des Pulverwaschmittels IEC, das eine M216S-Mutante in einer Konzentration von 6140 ADU/g Waschmittel enthielt, wurde in 18 ml fassenden Phiolen gelagert. Zum Vergleich wurde PB92-Protease unter denselben Bedingungen gelagert. Nach 2, 4, 5 und 6 Wochen wurde die Restaktivität der Proteasen gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4 Restaktivität von PB92-Protease und ihrer Mutante M216S nach Lagerung (in Wochen) bei 30°C und 80% r. F. in einem Pulverwaschmittel
BEISPIEL 3
Eine PB92-Protease und verschiedene PB92-Protease-Mutanten wurden auf ihre Lagerstabilität in Pulverwaschmittel getestet. Beim Lagerstabilitätstest wurden die Proteasen in eingekapselter Form verwendet.
Die Protease-Produkte wurden durch Vermischen der folgenden Komponenten bei 80 °C hergestellt:

Komponente Gew.-%

AE 50

TiO₂ 2

Protease (CEP) 7

PVP 1,5

BHT 1

Na₂SO₄ Rest
Dieses Gemisch wurde durch Sprühkristallisation eingekapselt, wie sie im Wesentlichen in der britischen Patentbeschreibung Nr. 1.603.640 beschrieben ist. Der Körnchenanteil mit einer Teilchengröße von 0,3 bis 0,8 mm wurde verwendet, um die Lagerstabilität der Proteasen zu bestimmen. Die verkapselte Protease (140 mg) wurde mit ALL^®-Base (6,4 g) und Natriumperborattetrahydrat (0,6 g) vermischt. [ALL ist ein eingetragenes Warenzeichen von Unilever N. V.) Das verwendete ALL-Basenpulver enthielt keine Enzyme oder Bleichmittel.
Das Enzym/Waschmittel/Natriumperborattetrahydrat-Gemisch wurde bei 30°C und 80 r. F. inkubiert. In Tabelle 5 ist die Restaktivität nach einer Lagerung für den angegebenen Zeitraum angegeben.
Tabelle 5 Restaktivität von PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten nach Lagerung (in Wochen) bei 30°C und 80% r. F. in einem Bleichmittel enthaltendem Pulverwaschmittel
BEISPIEL 4
Eine PB92-Protease und verschiedene PB92-Protease-Mutanten wurden durch das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren eingekapselt. In diesem Beispiel wurden jedoch 70 mg eingekapselte Protease mit einer Korngröße von 0,3 bis 0,9 mm mit 3,2 g ALL und 0,3 g Natriumperborattetrahydrat vermischt. Die Proben wurden bei 30°C in 18 ml fassenden Phiolen in einem Vakuumexsikkator gelagert. Während der ersten drei Tage der Lagerungsperiode wurde Vakuum angelegt (25 mmHg).
Durch Anlegen von Vakuum wurde die Wasserdampf-Transportgeschwindigkeit erhöht, so dass das System sein Gleichgewicht bei 80% r. F. schneller erreichte als in Systemen ohne Vakuum. Die r. F. von 80% wurde durch eine gesättigte Lösung von Kaliumbromid hergestellt.
In Tabelle 6 sind die Restaktivitäten nach der angegebenen Lagerungsperiode (in Wochen) angegeben.
Tabelle 6 Restaktivität einer PB92-Protease und einiger ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 80% r. F. in einem Bleichmittel enthaltendem Waschmittel
BEISPIEL 5

Die folgende Flüssigwaschmittelzusammensetzung wurde hergestellt:

Komponente	Gew.-%
unverzweigte C₁₀-C₁₃-Alkylbenzolsulfonsäure	12
C₁₃-Alkoholpolyethoxylat, 8 EO	13
Laurinsäure	8
Ölsäure	4
Triethanolamin	6
1,2-Propandiol	6
Ethanol	5
Natriumcitrat	4
Diethylentriaminpentaessigsäure	0,3
Calciumformiat	0,12
Natriumformiat	1
Borax	1,9
NaOH, 25 Gew.-% Lösung	auf pH 11,2
Wasser	Rest

Eine PB92-Protease und verschiedene PB92-Protease-Mutanten wurden zu dieser Zusammensetzung in einer Menge zugesetzt, um eine anfängliche Proteasenkonzentration von 0,13 Gew.-% bereitzustellen.
Die Proteasenstabilität (in % der Restaktivität) wurde nach Lagerung der Protease enthaltenden Zusammensetzung bei 37°C für die angegebene Anzahl von Tagen bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tabelle 7 Restaktivität einer PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten nach Lagerung bei 37°C in einer Flüssigwaschmittelzusammensetzung
BEISPIEL 6
PB92-Protease und einige ihrer Mutanten wurden wie folgt formuliert. Mit jeder Protease wurde ein Gemisch aus den folgenden Komponenten hergestellt:

Komponente Gew.-%

Amylogum CLS 45

Saccharose 23

Sorbitol 17

Glycerin 4

Paraffinöl 3

NaH₂PO₄ 0,5

Protease (CEP) 5,0

PVP K17 1,5

TiO₂ 1
Aus diesen Gemischen wurden Granulate hergestellt, im Wesentlichen nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren laut dem US-Patent Nr. 4.242.219, mit den folgen den Ausnahmen: 1. Das in diesem Beispiel beschriebene Gemisch wurde durch das oben genannte Gemisch ersetzt; 2. Öffnungen mit einem Durchmesser von 0,7 mm anstelle von 1,0 mm wurden verwendet; 3. die Körnchen wurden nicht beschichtet.
Diese Granalien (140 mg) wurden mit ALL-Base (6,4 g) und Natriumperborattetrahydrat (0,6 g) vermischt und in 36 ml fassende Phiolen gegeben.
Die Proteasenstabilität (in % der Restaktivität) wurde nach Lagerung der Protease enthaltenden Zusammensetzung bei 30°C und 80% r. F. für die angegebene Anzahl von Wochen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
Tabelle 8 Restaktivität von Granulaten einer PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 80% r. F. in einem Waschmittel
BEISPIEL 7
Sprühkristallisationsprodukte aus PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten wurden hergestellt und mit Waschmittel und Bleichmittel wie in Beispiel 3 beschrieben vermischt.
Die Lagerstabilität dieser Proben (in % der Restaktivität) wurde bei 30°C und 60/80 r. F. (abwechselnd 12 Stunden lang 50% r. F. und 12 Stunden lang 80% r. F.) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
Tabelle 9 Restaktivität von Sprühkristallisationsprodukten aus PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 60/80% r. F.
BEISPIEL 8
Granalien, die PB92-Protease und einige ihrer Mutanten enthielten, wurden hergestellt und mit Waschmittel und Bleichmittel wie in Beispiel 6 beschrieben vermischt.
Die Lagerstabilität dieser Proben (in % der Restaktivität) wurde nach Inkubation für den angegebenen Zeitraum bei 30°C und einer r. F., die abwechselnd 12 Stunden lang 50 r. F. und 12 Stunden lang 80% r. F. gehalten wurde, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefasst.
Tabelle 10 Restaktivität von Sprühkristallisationsprodukten aus PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 60/80% r. F.
BEISPIEL 9
PB92-Protease und einige ihrer Mutanten wurden auf ihre Lagerstabilität in einem Bleichmittel enthaltendem Pulverwaschmittel bei 30°C und 80% r. F. getestet. Für diesen Versuch wurden die Proteasen in eingekapselter Form verwendet. Jede Protease wurde wie folgt eingekapselt:
Bei 80°C wurde ein Gemisch der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Komponente Gew.-%

Nichtionisches Tensid 45

TiO₂ 2

Protease (CEP) 10

Na₂SO₄ Rest
Das oben genannte Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Das verfestigte Gemisch wurde zu kleineren Körnchen gemahlen. Körnchen mit einem Durchmesser von 0,3 bis 0,8 mm wurden herausgesiebt und für den Lagerungsversuch verwendet.
Für den Lagerungsversuch wurden 140 mg jeder verkapselten Protease mit 6,4 g ALL-Basen-Pulverwaschmittel und 0,6 g Natriumperborattetrahydrat vermischt. Das ALL-Basenpulver enthielt weder Enzyme noch Natriumperborat. Die ALL-Base/Protease/Natriumperborattetrahydrat-Gemische wurden bei 30°C und 80% r. F. inkubiert.
Nach Lagerung für 0, 1, 2 oder 4 Wochen wurde die Proteasenstabilität, als % der Restaktivität, für jede Protease bestimmte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefasst.
Tabelle 11 Restaktivität einer PB92-Protease und einiger ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 80% r. F. in einem Bleichmittel enthaltendem Pulverwaschmittel
BEISPIEL 10

PB92-Protease-Mutanten wurden in einem Waschtest unter im Wesentlichen denselben Bedingungen getestet, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, mit der Ausnahme, dass im Launderometer-Behälter 0,357 g Flüssigwaschmittel der folgenden Zusammensetzung zu 250 ml Wasser mit 5 °d zugesetzt wurden:

Komponente	Gew.-%
Laurinsäure	8
Ölsäure	4
unverzweigte C₁₀C₁₃-Alkylbenzolsulfonsäure	12
C₁₃-Alkoholpolyethoxyat, 8 EO	13
Triethanolamin	6
1,2-Propandiol	6
Ethanol	5
Natriumhydroxid, 45 Gew.-%	4
Natriumcitrat	4
Wasser	bis 100
(pH der Lauge 7,2)

Die Waschleistung der verschiedenen Proteasen in diesem Flüssigwaschmittel wurde in einem Launderometer bei 25°C 30 Minuten lang getestet. Nach dem Waschen wurde das Reflexionsvermögen der Stoffproben wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Die Waschleistung der Protease-Mutanten wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Tabelle 12 Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten bei 25°C in einem Flüssigwaschmittel

0: 100% ± 20% Waschleistung, bezogen auf PB92-Protease (gleichbleibende Waschleistung).
+: > 120% Waschleistung, bezogen auf PB92-Protease.
–: < 80% Waschleistung, bezogen auf PB92-Protease.

Die Waschleistung der verschiedenen Proteasen wurde in den im Handel erhältlichen Flüssigwaschmitteln TIDE^®, WISK^® und ARIEL^® bestimmt. Die Edelstahlbehälter enthielten entweder 0,375 g TIDE in 250 ml Wasser mit 5°d, 0,375 g WISK in 250 ml Wasser mit 5°d oder 1,25 g ARIEL in 250 ml Wasser mit 15°d. Die Waschleistung wurde bei 25°C oder 40°C bestimmt. Sonstige Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Tabelle 13 Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten in TIDE, WISK und ARIEL bei 25°C und 40°C

NB: nicht bestimmt
0: 100 ± 20% Waschleistung, bezogen auf PB92-Protease.
+: > 120% Waschleistung, bezogen auf PB92-Protease.
–: < 80% Waschleistung, bezogen auf PB92-Protease.

BEISPIEL 11
Die Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten wurde in einem statistischen Waschmaschinentest im Realmaßstab von TNO, Delft, Niederlande (Cleaning Techniques Research Institute) bestimmt. Die Waschleistung dieser Mutanten wurde mit jener von PB92-Protease verglichen.
Alle Proteasen wurden basierend auf dem Proteingewicht (0,007 Gew.-%) in IEC-Waschmittel dosiert. Ausgehend von der Aktivität lieferten diese Dosierungen:

PB92-Protease 1460 ADU/g Waschmittel

M216S 679 ADU/g Waschmittel

M216Q 479 ADU/g Waschmittel

S160D 1080 ADU/g Waschmittel

N212D 1455 ADU/g Waschmittel
Mit jeder Waschmittel-Proteasenzusammensetzung wurden 8 Waschtests bei 40°C in identischen AEG-Turnamat-Twinup-Waschmaschinen durchgeführt. In jeder Waschmaschine wurden 170 g Waschmittel verwendet. Während der Tests wurden die untersuchten Waschmittel so verwendet, dass jedes Pulver dieselbe Anzahl an Waschzyklen in allen Maschinen durchlief.
Während der Tests wurde normales Leitungswasser aus der Stadt Delft mit folgenden Merkmalen verwendet:

Basizität (M) 2,2 mmol/l

Härte (H) 1,6 mmol/l (9°d)

Temperatur 20°C
Schmutz- und Fleckenentfernung aus Stoffproben
Bei jedem Testdurchlauf wurden 6 Stoffproben mit drei Arten von EMPA-Verschmutzungen auf Baumwolle (Nr. 111, 116 und 117) zusammen mit der verschmutzten Wäsche gewaschen.
Die Schmutz- und Fleckenentfernung aus den künstlich verschmutzten Stoffproben wurden dann bewertet, indem blaues Dreibereichslicht orthogonal zur Stoffprobe gesandt wurde. Die Lichtmenge, die von der Stoffprobe wieder in einem Winkel von 45° abgegeben wurde, wurde gemessen. Laut der IEC-Veröffentlichung 456 wurde der Reemis sionswert von Magnesiumoxid mit 100 festgelegt. Je höher der Reemissionswert, desto besser ist der Waschvorgang für eine bestimmte Art von Verschmutzung.
Beladung der Waschmaschine
Die Waschmaschinen wurden mit einer Beladung von 4,75 kg, die aus Stoffproben und durch normalen Haushaltsgebrauch verschmutzter Wäsche bestand.
Die Wäsche umfasste:
6 Stück Geschirrtücher
4 Stück Unterwäsche
4 Betttücher
4 Kissenbezüge.
Wenn erforderlich wurden saubere Betttücher und Kissenbezüge dazugegeben, um die erforderliche Beladungsmenge zu erreichen.
Bei jedem Waschvorgang wurde die Wäsche sorgfältig ausgewählt. Jedes Stoffstück, das für eine der Maschinen ausgewählt wurde, wies ein gleich schmutziges Gegenstück auf, das in einer der anderen Waschmaschinen gewaschen wurde. Auf diese Weise war die Verschmutzung bei jedem Vorgang gleich.
Parameter des Waschvorgangs
Die Mittelwerte der Reemission (V) und des Verhältnisses (R) wurden nach 8 Waschtests bestimmt. Die Ergebnisse der beiden unabhängigen Versuche sind in den Tabellen 14A und 14B zusammengefasst.
Tabelle 14A Entfernung von künstlichen Verschmutzungen
Tabelle 14B Entfernung von künstlichen Verschmutzungen
In Tabelle 15 wurden die Verhältnisse (R), die in statistischen Waschmaschinentests im Realmaßstab erhalten wurden, durch das entsprechende Verhältnis (R'), das aus Waschleistungswerten in Bezug auf PB92-Protease, die in Launderometer-Waschtests unter ähnlichen Bedingungen (10 g/l IEC, Stoffproben EMPA 116 und 117, Waschdauer 30 min, Temperatur 40°C) berechnet wurde, dividiert.
Tabelle 15 Korrelation zwischen einem Waschmaschinentest im Realmaßstab und einem Launderometer-Waschtest
R/R'-Werte für eine Protease-Mutante, die nahe bei 1,00 liegen, weisen auf eine Korrelation zwischen Maschinentests im Realmaßstab und Launderometer-Tests hin.
BEISPIEL 12

2A und 2B zeigen die Waschleistung von verschiedenen PB92-Protease-Mutanten in 4 g IEC/l laut den in Beispiel 1 beschriebenen Tests und in Bezug auf eine native PB92-Protease als Funktion ihrer spezifischen Aktivität. Die Figuren im Diagramm beziehen sich auf die folgenden Protease-Mutanten:

1 PB92-Protease	11 M216P
2 M216A	12 M216T
3 M216C	13 M216W
4 M216S	14 M216I
5 M216L	15 M216G
6 M216E	16 M117L, H118D
7 M216K	17 M117L, M216Q
8 M216H	18 M117L, H118D, M216Q
9 M216N	19 M117L, M216S
10 M216Q	20 M117L, H118D, M216S

21 M169S	31 S259K
22 M216Y	32 W235R
23 M169I, M216S	33 H243R
24 M216-ox	34 H243R, S259K
25 N212S	35 D175N
26 N212D	36 E134K
27 S160G, N212D	37 W235R, S259K
28 L211Y	38 W235R, H243R
29 L211Y, N212S	39 S259K
30 A166D, M169I	40 T207K

41 S160N	51 S160I
42 S160G	52 S160G, M216S
43 S160P	53 S160G, M216Q
44 S160T	54 S160L
45 S160C	55 S160Y
46 S160Q	56 S160D, M216S
47 S160D	57 G116V, S126V, P127E, S128K
48 S160K	58 G116V, S126L, P127N, S128V
49 S160R	59 G116V, S126L, P127Q, S128A
50 S160A	60 G116V, S126V, P127M

61 S126M, P127A, S128G
62 G116V, S126Y, P127G, S128L
63 G116V, S126N, P127H, S128I
64 G116V, S126H, P127Y
65 G116V, S126R, P127S, S128P
66 G116V, S126F, P127Q
67 G116V, S126G, P127Q, S128I
68 G116V, S126F, P127L, S128T
69 G116V, S126Q, P127D

3 zeigt die Waschleistung von verschiedenen PB92-Protease-Mutanten in 7 g IEC/l laut den in Beispiel 1 beschriebenen Tests und in Bezug auf eine native PB92-Protease als Funktion ihrer spezifischen Aktivität. Die Figuren im Diagramm beziehen sich auf dieselben Protease-Mutanten wie in 2A und 2B.
Alle Veröffentlichungen (einschließlich Patentanmeldungen), die in dieser Beschreibung erwähnt wurden, geben Informationen über das Können von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung, auf das sich diese Erfindung bezieht.
Obwohl die Erfindung hierin zur Veranschaulichung in gewissem Detail erläutert und Beispiele zum besseren Verständnis angeführt wurden, wird für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein, dass zahlreiche Veränderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche abzuweichen.

Claims

Proteasen-Mutante zur Verwendung in Waschmitteln, die zumindest 70%ige Homologie mit der Aminosäuresequenz von PB92-Serin-Protease mit folgender Sequenz aufweist:
die sich um zumindest eine Aminosäuresubstitution an einer ausgewählten Stelle, die Position 212 in der PB92-Protease entspricht, von Asparagin zu Asparaginsäure oder Glutaminsäure unterscheidet, mit in Bezug auf PB92-Protease verbesserter Waschleistung und/oder verbesserter Stabilität.
Proteasen-Mutante nach Anspruch 1, worin die Substitutionen [N212D, S160G] entsprechen.
Proteasen-Mutante nach Anspruch 1, worin das Enzym eine PB92-Proteasen-Mutante ist.
Protease zur Verwendung in Waschmitteln, welche die Sequenz:
aufweist.
DNA-Sequenz, die für eine in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierte Protease kodiert.
Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 5 umfasst.
Prokaryotischer Wirtsstamm, der mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert ist.
Transformierter prokaryotischer Wirtsstamm nach Anspruch 7, worin der Wirtsstamm ein Bacillus ist.
Transformierter prokaryotischer Wirtsstamm nach Anspruch 8, worin der Bacillus ein alkalophiler Bacillus ist.
Transformierter prokaryotischer Wirtsstamm nach Anspruch 9, worin der alkalophile Bacillus Bacillus nov. spec. PB92 oder eine Mutante davon ist.
Transformierter prokaryotischer Wirtsstamm nach Anspruch 10, worin vor der Transformation der Wirtsstamm zumindest im Wesentlichen unfähig war, extrazelluläre Proteasen zu produzieren.
Verfahren zur Herstellung einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches Folgendes umfasst: das Züchten eines Mikroorganismus-Wirtsstamms, der mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine für die Protease kodierende DNA-Sequenz umfasst, wodurch die Protease produziert wird; und das Gewinnen der Protease.
Waschmittelzusammensetzung, die eine oder mehrere in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierte Proteasen umfasst.
Verwendung einer oder mehrerer in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierter Proteasen in einer Waschmittelzusammensetzung.
Verwendung einer oder mehrerer in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierter Proteasen in einem Waschvorgang.