DE69839076T2

DE69839076T2 - Proteasevarianten und zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69839076T2
Application number: DE69839076T
Authority: DE
Inventors: Peter Kamp Hansen; Peter Bauditz; Frank Mitkkelsen; Kim Vilbour Andersen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-19
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2018-08-20
Also published as: JP2009297038A; US7288401B2; US20090099056A1; JP5173973B2; CA2301851A1; AU8798198A; US20050239185A1; US20030176304A1; CA2301851C; JP2002515221A; US6555355B1; BR9811248A; CN1148444C; KR100720594B1; CN1548533A; EP1009815A1; CN100593036C; ATE385254T1; EP1009815B1; US20110028378A1

Description

Fachgebiet
Die Erfindung betrifft neue mutante Proteaseenzyme oder Enzymvarianten, die bei der Formulierung von Detergenzzusammensetzungen geeignet sind und die verbesserte Waschleistung in Detergenzien, Reinigungs- und Detergenzzusammensetzungen, die die Enzyme enthalten, zeigen; mutierte Gene, die die Expression der Enzyme codieren, wenn sie in eine geeignete Wirtszelle oder einen geeigneten Organismus eingeschleust werden; und solche damit transformierten Wirtszellen, die in der Lage sind, die Enzymvarianten zu exprimieren.
Hintergrund der Erfindung
In der Waschmittelindustrie werden Enzyme bereits seit mehr als 30 Jahren in Waschformulierungen eingesetzt. Enzyme, die in solchen Formulierungen verwendet werden, umfassen Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen sowie weitere Enzyme oder Gemische davon. Kommerziell besonders bedeutende Enzyme sind Proteasen.
Eine zunehmende Anzahl von kommerziell verwendeten Proteasen sind proteintechnisch hergestellte Varianten natürlich vorkommender Wildtyp-Proteasen, z. B. DURAZYM^® (Novo Nordisk A/S), RELASE^® (Novo Nordisk A/S), MAXAPEM^® (Gist-Brocades N. V.), PURAFECT^® (Genencor International, Inc.).
Weiterhin wird eine Anzahl von Proteasevarianten auf dem Fachgebiet beschrieben, wie in EP 130756 (GENENTECH) entsprechend US Reissue Patent No. 34 606 (GENENCOR)); EP 214435 (HENKEL); WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX); EP 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell, and Fersht (1985) Nature 318 375–376; Thomas, Russell, and Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193 803–813; Russel and Fersht Nature 328 496–500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S. A.); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); US 5 543 302 (SOLVAY S. A.); EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S); WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S); EP 525 610 A1 (SOLVAY); WO 94/02618 (GIST-BROCADES N. V.); und WO 96/34946 (NOVO NORDISK A/S).
Allerdings bedarf es für eine Anzahl von industriellen Anwendungen, obwohl eine Anzahl von geeigneten Proteasevarianten bereits beschrieben wurde, immer noch neuer verbesserter Proteasevarianten.
Darum besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung verbesserter proteintechnisch hergestellter Proteasevarianten, insbesondere zur Verwendung in der Waschmittelindustrie.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben zahlreiche der möglichen Kombinationen der N252-, T255- und S259-Reste von SAVINASE^® ausgiebig untersucht und eine Anzahl von Varianten mit verstärkter verbesserter Waschleistung identifiziert.
Für weitere Einzelheiten wird auf die Arbeitsbeispiele hierin (siehe nachstehend) Bezug genommen.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung eine Subtilaseenzymvariante mit verbesserter Waschleistung in Detergenzien, umfassend mindestens eine Modifikation, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:
252L + 255I
252V + 255A
252M + 255C + 259H
252S + 255E + 259C
252K + 255S + 259C.
Die Erfindung betrifft auch eine isolierte DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße 3e codiert.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor, der eine isolierte DNA-Sequenz umfasst, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante codiert.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine mikrobielle Wirtszelle, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert ist.
Bei wieder einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung der erfindungsgemäßen Subtilisinenzyme durch Insertion eines Expressionsvektors in einem geeigneten mikrobiellen Wirt, Kultivieren des Wirts, um das gewünschte Subtilaseenzym zu exprimieren, und Gewinnen des Enzymprodukts.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante umfasst.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung der mutanten Enzyme zur Verwendung in Reinigungszusammensetzungen und Reinigungszusammensetzungen, die die mutanten Enzyme umfassen, insbesondere Detergenzzusammensetzungen, die die mutanten Subtilisinenzyme umfassen.
Definitionen

Vor der Besprechung der Erfindung in weiteren Einzelheiten wird zuerst der folgende Term definiert. Nomenklatur von Aminosäuren

A	=	Ala	=	Alanin
V	=	Val	=	Valin
L	=	Leu	=	Leucin
I	=	Ile	=	Isoleucin
P	=	Pro	=	Prolin
F	=	Phe	=	Phenylalanin
W	=	Trp	=	Tryptophan
M	=	Met	=	Methionin
G	=	Gly	=	Glycin
S	=	Ser	=	Serin
T	=	Thr	=	Threonin
C	=	Cys	=	Cystein
Y	=	Tyr	=	Tyrosin
N	=	Asn	=	Asparagin
Q	=	Gln	=	Glutamin
D	=	Asp	=	Aspartamsäure
E	=	Glu	=	Glutaminsäure
K	=	Lys	=	Lysin
R	=	Arg	=	Arginin
H	=	His	=	Histidin
X	=	Xaa	=	beliebige Aminosäure

Nomenklatur von Nukleinsäuren

A	=	Adenin
G	=	Guanin
C	=	Cytosin
T	=	Thymin (nur in DNA)
U	=	Uracil (nur in RNA)

Nomenklatur von Varianten
Bei der Beschreibung der verschiedenen hergestellten oder betrachteten erfindungsgemäßen Enzymvarianten wurden die folgenden Nomenklaturen zur leichteren Bezugnahme übernommen:
Original-Aminosäure(n) Position(en) substituierte Aminosäure(n)
Demgemäß wird der Ersatz von Glycin durch Glutaminsäure in Position 195 bezeichnet als:
Gly 195 Glu oder G195E
eine Deletion von Glycin in der gleichen Position heißt:
Gly 195* oder G195*
und eine Insertion eines zusätzlichen Aminosäurerestes, wie Lysin heißt:
Gly 195 GlyLys oder G195GK
Wo eine Deletion im Vergleich mit der für die Nummerierung verwendete Sequenz angegeben ist, wird eine Insertion in einer solchen Position angegeben als:
*36 Asp oder *36D
zur Insertion einer Aspartamsäure in Position 36
Mehrere Mutationen werden durch Pluszeichen getrennt, d. h.:
Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu oder R170Y + G195E,
was Mutationen in den Positionen 170 und 195 darstellt, wobei Arginin bzw. Glycin durch Tyrosin bzw. Glutaminsäure ersetzt sind.
Proteasen
Enzyme, die die Amidverknüpfungen in Proteinsubstraten spalten, werden als Proteasen oder (austauschbar) Peptidasen klassifiziert (siehe Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman und Company, San Francisco, Kapitel 3).
Nummerierung der Aminosäurepositionen/Reste
Wenn nicht anderweitig angegeben, entspricht die hier verwendete Aminosäurenummerierung derjenigen der Subtilase-BPN(BASBPN)-Sequenz. Zur weiteren Beschreibung der BPN-Sequenz siehe Siezen et al., Protein Engng. 4(1991)719–737 und 1.
Serinproteasen
Eine Serinprotease ist ein Enzym, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert, und wobei sich ein essenzieller Serinrest an der aktiven Stelle befindet (White, Handler und Smith, 1973 "Principles of Biochemistry", 5. Ausg., McGraw-Rill Book Company, NY, S. 271–272).
Die bakteriellen Serinproteasen besitzen Molekulargewichte im Bereich von 20 000 bis 45 000 Dalton. Sie werden durch Diisopropylfluorphosphat gehemmt. Sie hydrolysieren einfache terminale Ester und entsprechen in der Aktivität eukaryotischem Chymotrypsin, ebenfalls eine Serinprotease. Ein enger gefasster Term, alkalische Protease, der eine Untergruppe abdeckt, gibt das hohe pH-Optimum von einigen der Serinproteasen wieder, von pH 9,0 bis 11,0 (zur Übersicht siehe Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711–753).
Subtilasen
Eine Untergruppe der Serinproteasen, die versuchsweise als Subtilasen bezeichnet wurden, wurde von Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719–737 vorgeschlagen. Sie sind definiert durch homologe Analyse von mehr als 40 Aminosäuresequenzen von Serinproteasen, die bisher als Subtilisin-artige Proteasen bezeichnet wurden. Ein Subtilisin wurde bisher als eine Serinprotease definiert, die durch gram-positive Bakterien oder Fungi produziert wird, und gemäß Siezen et al. nun eine Untergruppe der Subtilasen ist. Eine breite Vielzahl von Subtilasen wurde bereits identifiziert, und die Aminosäuresequenz einer Anzahl von Subtilasen wurde bereits bestimmt. Für eine ausführlichere Beschreibung solcher Subtilasen und ihrer Aminosäuresequenzen wird auf Siezen et al. und auf die 1 hierin verwiesen.
Eine Untergruppe der Subtilasen, I-S1, umfasst die "klassischen" Subtilisine, wie Subtilisin 168, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg (ALCALASE^®, NOVO NORDISK A/S) und Subtilisin DY.
Eine weitere Untergruppe der Subtilasen I-S2 wird von Siezen et al. (supra) erkannt. Die Untergruppe I-S2-Proteasen werden als hochalkalische Subtilisine beschrieben und umfassen Enzyme wie Subtilisin PB92 (MAXACAL^®, Gist-Brocades NV), Subtilisin 309 (SAVINASE^®, NOVO NORDISK A/S), Subtilisin 147 (ESPERASE^®, NOVO NORDISK A/S) und alkalische Elastase YaB.
"SAVINASE^®"
SAVINASE^® wird von der Firma NOVO NORDISK A/S auf den Markt gebracht. Es ist Subtilisin 309 aus B. Lentus und unterscheidet sich von BABP92 nur dadurch, dass es N87S aufweist (siehe 1 hierin).
Parentale Subtilase
Der Begriff "parentale Subtilase" ist eine Subtilase, die gemäß Siezen et al. (Protein Engineering 4: 719–737 (1991)) definiert ist. Für weitere Einzelheiten siehe die Beschreibung "SUBTILASEN", ummittelbar vorstehend. Eine parentale Subtilase kann auch eine aus einer natürlichen Quelle isolierte Subtilase sein, wobei eine spätere Modifikation vorgenommen wurde, während das Merkmal einer Subtilase beibehalten wurde. Alternativ kann der Begriff "parentale Subtilase" als "Wildtyp-Subtilase" bezeichnet werden.
Modifikation(en) einer Subtilasevariante
Der Begriff "Modifikation(en)", der in Verbindung mit Modifikation(en) einer Subtilasevariante, wie hierin besprochen, verwendet wird, ist so definiert, dass eine chemische Modifikation sowie eine genetische Manipulation eingeschlossen sind. Die Modifikation(en) können durch Substitution, Deletion und/oder Insertionen in oder an den Aminosäure(n) von Interesse vorgenommen werden.
Subtilasevariante
Im Zusammenhang dieser Erfindung bedeutet der Begriff Subtilasevariante oder mutierte Subtilase eine Subtilase, die durch einen Organismus produziert wurde, der ein mutantes Gen exprimiert, das sich von einem parentalen Mikroorganismus ableitet, der ein ursprüngliches oder parentales Gen besitzt und der ein entsprechendes parentales Enzym produzierte, wobei das parentale Gen mutiert wurde, um das mutante Gen zu produzieren, aus dem die mutante Subtilaseprotease produziert wird, wenn es in einem geeigneten Wirt exprimiert wird.
Homologe Subtilasesequenzen
Spezifische Aminosäurereste von SAVINASE^®-Subtilase werden hier zur Modifikation identifiziert, um eine erfindungsgemäße Subtilasevariante zu erhalten.
Allerdings ist die Erfindung nicht auf Modifikationen dieser bestimmten Subtilase beschränkt, sondern erstreckt sich auf andere parentale (Wildtyp)-Subtilasen, die eine zu derjenigen von SAVINASE^® homologe Primärstruktur aufweisen.
Um weitere homologe Subtilasen innerhalb des Umfangs der Erfindung zu identifizieren, wird ein Abgleich der Subtilase(n) mit einer Gruppe von bereits abgeglichenen Subtilasen durchgeführt, wobei der vorherige Abgleich konstant gehalten wird. Ein Vergleich mit 18 hochkonservierten Resten in Subtilasen wird durchgeführt. Die 18 hochkonservierten Reste sind in Tabelle I gezeigt (siehe Siezen et al. für weitere Einzelheiten bezüglich der konservierten Reste). Tabelle I 18 in Subtilasen hochkonservierte Reste

Position: konservierter Rest

23 G

32 D

34 G

39 H

64 H

65 G

66 T

70 G

83 G

125 S

127 G

146 G

154 G

155 N

219 G

220 T

221 S

225 P
Nach dem Abgleichen unter Berücksichtigung der zur Beibehaltung des Abgleichs notwendigen Insertionen und Deletionen werden geeignete homologe Reste identifiziert. Die homologen Reste können dann erfindungsgemäß modifiziert werden.
Unter Verwendung des CLUSTALW (Version 1.5, April 1995) Computer-Abgleichprogramms (Thompson, J. D., Higgins, D. G. und Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4 673–4 680) mit GAP open penalty of 10,0 und GAP extension penalty of 0,1 unter Verwendung der BLOSUM30-Proteingewichtsmatrix, wird ein Abgleich einer gegebenen Subtilase mit einer Gruppe von bereits abgeglichenen Subtilasen unter Verwendung der Option Profile alignements in dem Programm erreicht. Damit eine gegebene Subtilase im Umfang der Erfindung liegt, sollten vorzugsweise 100% der 18 hochkonservierten Reste konserviert sein. Allerdings ist ein Abgleich von mehr als oder gleich 17 der 18 Reste oder von so wenig wie 16 der konservierten Reste ebenfalls adäquat, um homologe Reste zu identifizieren. Die Konservierung der, in Subtilasen, katalytischen Triade Asp32/His64/Ser221 sollte beibehalten werden.
Der zuvor definierte Abgleich ist in 1 gezeigt, wobei die prozentualen Identitäten der individuellen Subtilasen in diesem Abgleich mit den 18 hochkonservierten Resten ebenfalls gezeigt sind.
Auf der Grundlage dieser Beschreibung ist es für einen Fachmann Routine, geeignete homologe Subtilasen und entsprechende homologe Reste zu identifizieren, die erfindungsgemäß modifiziert werden können. Zur Erläuterung zeigt diese Tabelle II nachstehend eine begrenzte Liste von homologen Subtilasen und entsprechenden geeigneten Resten, die erfindungsgemäß modifiziert sind.
Tabelle II

Homologe Subtilasen und entsprechende homologe Reste, die geeignet sind, um erfindungsgemäß modifiziert zu werden

Pos\Enz.	BASBPN	BYSYAB	BLS309	BLS147	TVTHER
252 + 255	N252L + T255I	N252L + T255I	N252L + T255I	Q252L + T255I	N252L + D255I
252 + 255	N252V + T255A	N252V + T255A	N252V + T255A	Q252V + T255A	N252V + D255A
252 + 255 + 259	N252M + T255C + D259H	N252M + T255C + N259H	N252M + T255C + S259H	Q252M + T255C + S259H	N252M + D255C + G259H

Es ist offensichtlich, dass eine ähnliche oder umfangreichere Tabelle, die andere homologe Subtilasen abdeckt, leicht von einem Fachmann erstellt werden kann.
Waschleistung
Die Fähigkeit eines Enzyms, den Abbau verschiedener natürlich vorkommender Substrate, die auf den zu reinigenden Gegenständen vorhanden sind, während z. B. des Waschens zu katalysieren, wird als seine Waschfähigkeit, Waschkraft, Reinigungsvermögen oder Waschleistung bezeichnet. Überall in dieser Anmeldung wird der Begriff Waschleistung so verwendet, dass diese Eigenschaft mit umfasst ist.
Isolierte DNA-Sequenz
Der Begriff "isoliert", bezeichnet, bei Anwendung auf ein DNA-Sequenzmolekül, dass die DNA-Sequenz aus ihrer natürlichen genetischen Umgebung entfernt worden ist und somit frei ist von anderen fremdartigen oder unerwünschten codierenden Sequenzen und dass sie in einer Form vorliegt, die zur Verwendung innerhalb von gentechnisch hergestellten Protein-Herstellungssystemen geeignet ist. Solche isolierten Moleküle sind diejenigen, die aus ihrer natürlichen Umgebung abgetrennt sind und die cDNA und genomische Klone umfassen. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie üblicherweise kombiniert sind, jedoch können sie natürlich vorkommende 5'- und 3'-untranslatierte Regionen einschließen, wie Promotoren und Terminatoren. Die Identifizierung von assoziierten Regionen ist einem Fachmann geläufig (siehe beispielsweise Dynan und Tijan, Nature 316: 774–78, 1985). Der Begriff "eine isolierte DNA-Sequenz" kann alternativ als "eine klonierte DNA-Sequenz" bezeichnet werden.
Isoliertes Protein
Bei Anwendung auf ein Protein gibt der Begriff "isoliert" an, dass das Protein in einem Zustand vorgefunden wird, der anders ist als seine natürliche Umgebung. Bei einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere von anderen homologen Proteinen (d. h. "homologen Verunreinigungen" (siehe nachstehend)). Es ist bevorzugt, das Protein in einer hoch aufgereinigten Form bereitzustellen, d. h. mehr als 40% rein, mehr als 60% rein, mehr als 80% rein, stärker bevorzugt mehr als 95% rein und noch stärker bevorzugt mehr als 99% rein, wir durch SDS-PAGE bestimmt.
Der Begriff "isoliertes Protein" kann alternativ als "aufgereinigtes Protein" bezeichnet werden.
Homologe Verunreinigungen
Der Begriff "homologe Verunreinigungen" bedeutet jede Verunreinigung (z. B. ein anderes Polypeptid als das erfindungsgemäße Polypeptid), das aus der homologen Zelle stammt, aus der das erfindungsgemäße Polypeptid ursprünglich erhalten wird.
Erhalten von
Der Begriff "erhalten von", wie hier im Zusammenhang mit einer speziellen mikrobiellen Quelle verwendet, bedeutet, dass das Polynukleotid und/oder Polypeptid von der speziellen Quelle oder von einer Zelle produziert wird, in die ein Gen aus der Quelle inseriert wurde.
Substrat
Der Begriff "Substrat", der im Zusammenhang mit einem Substrat für eine Protease verwendet wird, sollte in seiner breitesten Form so interpretiert werden, dass er eine Verbindung umfasst, die mindestens eine Peptidbindung enthält, die der Hydrolyse durch eine Subtilisinprotease zugänglich ist.
Produkt
Der Begriff "Produkt", der in Verbindung mit einem Produkt verwendet wird, das sich aus einer Proteaseenzymreaktion ableitet, sollte im Zusammenhang mit der Erfindung so interpretiert werden, dass er die Produkte einer Hydrolysereaktion einschließt, an der eine Subtilaseprotease beteiligt ist. Ein Produkt kann das Substrat in einer anschließenden Hydrolysereaktion sein.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt einen Abgleich einer Anzahl von homologen Subtilasen, die gegenüber 18 hochkonservierten Resten in Subtilasen abgeglichen werden. Die 18 hochkonservierten Reste sind fett gedruckt markiert. Alle gezeigten Subtilasen, mit Ausnahme von JP 170 besitzen eine 100%ige Identität in den konservierten Resten. JP 170 weist ein "N" anstelle von "G" in den konservierten Resten G146 auf.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Subtilasevarianten mit verbesserter Waschleistung:
Die vorliegenden Erfinder haben die Varianten mit verbesserter Waschleistung in BLS309 (SAVINASE^®) identifiziert.
Demgemäß betrifft eine Ausführungsform der Erfindung eine Subtilaseenzymvariante, wobei die Modifikation aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgendes umfasst:
N252L + T255I
N252V + T255A
N252M + T255C + S259H
N252S + T255E + S259C
N252K + T255S + S259C.
Zahlreiche erfindungsgemäße Subtilasevarianten werden hierin getestet und zeigen verbesserte Waschleistung in Detergenzien (siehe die Arbeitsbeispiele hierin (vide infra)).
Es ist auf dem Fachgebiet wohl bekannt, dass die Substitution einer Aminosäure durch eine ähnliche konservative Aminosäure nur eine geringfügige Änderung in dem Merkmal des Enzyms ergibt.

Tabelle III nachstehend führt Gruppen von konservativen Aminosäuren auf. Tabelle III Konservative Aminosäure-Substitutionen

basisch:	Arginin
	Lysin
	Histidin
sauer:	Glutaminsäure
	Asparaginsäure
polar:	Glutamin
	Asparagin
hydrophob:	Leucin
	Isoleucin
	Valin
aromatisch:	Phenylalanin
	Tryptophan
	Tyrosin
klein:	Glycin
	Alanin
	Serin
	Threonin
	Methionin

Demgemäß besitzen die Subtilasevarianten, wie 252L + 255I, 2521+2551 und 252V + 255I, eine ähnliche Waschleistungsverbesserung. Weiterhin besitzen Subtilasevarianten, wie N252L + T255I, N252I + T255I und N252V + T255I, ebenfalls eine ähnliche Waschleistungsverbesserung.
Auf der Grundlage der hierin offenbarten Subtilasevarianten ist es für einen Fachmann eine routinemäßige Arbeit, weitere geeignete konservative Substitutionen zu identifizieren, um eine Subtilasevariante mit verbesserter Waschleistung zu erhalten.
Die Ausführungsformen der Erfindung, die Subtilasen von Interesse, sind diejenigen, die den Untergruppen I-S1 und I-S2 angehören.
Hinsichtlich der Untergruppe I-S1 wird die bevorzugte parentale Subtilase aus der Gruppe gewählt, umfassend ABSS168, BASBPN, BSSDY und BLSCAR oder funktionelle Varianten davon mit Retention des Merkmals der Untergruppe I-S1.
Bezüglich Untergruppe I-S2 wird die bevorzugte parentale Subtilase aus der Gruppe gewählt, umfassend BLS147, BLS309, BAPB92, TVTHER und BYSYAB oder aus funktionellen Varianten davon mit Retention des Merkmals der Untergruppe I-S2.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine beliebige oder mehrere Modifikationen in den oben erwähnten Positionen in Kombination mit jeder anderen Modifikation der Aminosäuresequenz des parentalen Enzyms. Insbesondere werden Kombinationen mit anderen Modifikationen, die auf dem Fachgebiet bekanntlich verbesserte Eigenschaften für das Enzym bereitstellen, betrachtet. Die Technik beschreibt eine Anzahl von Subtilasevarianten mit unterschiedlichen verbesserten Eigenschaften, und eine Anzahl von ihnen ist in dem Abschnitt "Hintergrund der Erfindung" hierin (vide supra) erwähnt. Diese Referenzen sind hier als Referenzen offenbart, die eine Subtilasevariante identifizieren, die zweckmäßigerweise mit einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante kombiniert werden kann.
Solche Kombinationen umfassen die Positionen: 222 (verbessert die Oxidationsstabilität), 218 (verbessert die Wärmestabilität), Substitutionen in den Ca-bindenden Stellen, die das Enzym stabilisieren, z. B. Position 76, und viele andere, die aus der bisherigen Technik hervorgehen.
Bei weiteren Ausführungsformen kann eine erfindungsgemäße Subtilasevariante zweckmäßigerweise mit einer oder mehreren Modifikation(en) in einer beliebigen der Positionen kombiniert werden:
27, 36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 und 274.
Speziell werden die folgenden Varianten BLS309 und BAPB92 zur Kombination als angemessen betrachtet:
K27R, *36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167A, Y167I, R170S, R170L, R170N, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L und T274A.
Weiterhin zeigen Varianten, die eine beliebige der Varianten V104N + S101G, K27R + V104Y + N123S + T274A oder N76D + V104A oder andere Kombinanten dieser Mutationen (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) in Kombination mit einer beliebigen oder mehreren der vorstehend erwähnten Modifikation(en) umfassen, verbesserte Eigenschaften.
Noch weitere Subtilasevarianten des Hauptaspektes (der Hauptaspekte) der Erfindung werden bevorzugt mit einer oder mehreren Modifikation(en) in einer beliebigen der Positionen 129, 131, 133 und 194, vorzugsweise als Modifikationen 129K, 131H, 133P, 133D und 194P und besonders bevorzugt als Modifikationen P129K, P131H, A133P, A133D und A194P kombiniert. Jede dieser. Modifikation(en) kann ein höheres Expressionsniveau einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante ergeben.
Erzeugung von Mutationen in Subtilasegenen
Viele Verfahren zum Klonieren einer erfindungsgemäßen Subtilase und zum Einbringen von Mutationen in Gene (z. B. Subtilasegene) sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt.
Im Allgemeinen können Standardverfahrensweisen zum Klonieren von Genen und zum Einbringen von Mutationen (statistisch und/oder ortsgerichtet) in die Gene verwendet werden, um eine erfindungsgemäße Subtilasevariante zu erhalten. Zur weiteren Beschreibung von geeigneten Techniken wird auf die Arbeitsbeispiele hierin (vide infra) und auf (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. und Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990); und WO 96/34946 verwiesen.
Expressionsvektoren
Ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt umfasst, das das erfindungsgemäße Enzym codiert, kann ein beliebiger Vektor sein, der zweckmäßigerweise DNA-Rekombinationsverfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors hängt oft von der Wirtszelle ab, in die er einzuführen ist. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, der beim Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom zum Teil oder in seiner Gesamtheit integriert wird und zusammen mit dem Chromosom (den Chromosomen), in die er integriert worden ist, repliziert wird.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in dem die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym codiert, operabel mit zusätzlichen Segmenten verknüpft ist, die zur Transkription der DNA erforderlich sind. Im Allgemeinen stammt der Expressionsvektor aus einem Plasmid oder aus viraler DNA oder kann Elemente von beiden enthalten. Der Begriff "operabel verknüpft" gibt an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie konzertiert für ihre beabsichtigten Zwecke funktionieren, z. B. startet die Transkription in einem Promotor und verläuft durch die DNA-Sequenz, die das Enzym codiert.
Der Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, die in der Wirtszelle der Wahl transkriptionale Aktivität zeigt und kam sich von Genen ableiten, die Proteine codieren, die entweder zu der Wirtszelle homolog oder heterolog sind.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen umfassen den Promotor des Bacillus stearothermophilus-maltogenen Amylasegens, des Bacillus licheniformis-Alpha-Amylasegens, des Bacillus amyloliquefaciens-Alpha-Amylasegens, des Bacillus subtillis-alkalische Proteasegens oder des Bacillus pumilus-Xylosidasegens oder die Lambda-Phage-Promotoren P_R oder P_L oder die E. coli-Promotoren lac, trp oder tac.
Die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym codiert, kann auch, sofern notwendig, mit einem geeigneten Terminator operabel verknüpft sein.
Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die die Replikation des Vektors in der Wirtszelle in Frage ermöglich.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Fehler in der Wirtszelle ausgleicht, oder ein Gen, das Resistenz gegenüber Antibiotika, wie Kanamycin, Chloramphenicol, Erythromycin, Tetracyclin, Spectinomycin oder dergleichen oder Resistenz gegen Schwermetallen oder Herbiziden codiert.
Zum Lenken eines erfindungsgemäßen Enzyms auf den sekretorischen Weg der Wirtszellen kann eine sekretorische Signalsequenz (auch als Leader-Sequenz, Prepro-Sequenz oder Prä-Sequenz bekannt) in dem rekombinanten Vektor bereitgestellt sein. Die sekretorische Signalsequenz ist mit der DNA-Sequenz verknüpft, die das Enzym in dem korrekten Leseraster codiert. Sekretorische Signalsequenzen sind im Allgemeinen 5' zu der DNA-Sequenz positioniert, die das Enzym codiert. Die sekretorische Signalsequenz kann diejenige sein, die normalerweise mit dem Enzym assoziiert ist, oder kann aus einem Gen sein, das ein anderes sezerniertes Protein codiert.
Die Verfahrensweisen, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen zu ligieren, die das vorliegende Enzym, die Promotor- und gegebenenfalls die Terminator- und/oder sekretorische Signalsequenz codieren, oder um diese Sequenzen durch geeignete PCR-Amplifikationsschemata zu assemblieren und um sie in geeignete Vektoren zu inserieren, die die Information enthalten, die zur Replikation oder Integration notwendig sind, sind den Fachleuten gut bekannt (cf. beispielsweise Sambrook et al., op. cit.).
Wirtszelle
Die DNA-Sequenz, die das vorliegende Enzym codiert, das in die Wirtszelle eingebracht wird, kann entweder homolog oder heterolog zu dem Wirt in Frage sein. Falls sie zu der Wirtszelle homolog ist, d. h. durch die Wirtszelle natürlicherweise produziert wird, ist sie typischerweise mit einer anderen Promotorsequenz oder, sofern zutreffend, einer anderen sekretorischen Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz als in ihrer natürlichen Umgebung operabel verknüpft. Der Begriff "homolog" soll eine DNA-Sequenz einschließen, die ein Enzym codiert, das für den Wirtsorganismus in Frage nativ ist. Der Begriff "heterolog" soll eine DNA-Sequenz einschließen, die von der Wirtszelle nicht von Natur aus exprimiert wird. Somit kann die DNA-Sequenz aus einem anderen Organismus stammen, oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
Die Wirtszelle, in die das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt oder der erfindungsgemäße DNA-Rekombinationsvektor eingebracht wird, kann jede Zelle sein, die in der Lage ist, das vorliegende Enzym zu produzieren, und umfasst Bakterien, Hefe, Fungi und höhere eukaryotische Zellen.
Beispiele für bakterielle Wirtszellen, die bei Kultivierung in der Lage sind, das erfindungsgemäße Enzym zu produzieren, sind gram-positive Bakterien, wie Stämme von Bacillus, wie Stämme von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis oder Stämme von Streptomyces, wie S. lividans oder S. murinus, oder gram-negative Bakterien, wie Echerichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation, Elektroporation, Konjugation oder unter Verwendung kompetenter Zellen in einer an sich bekannten Weise (cf. Sambrook et al., supra) durchgeführt werden.
Bei Expression des Enzyms in Bakterien, wie E. coli, kann das Enzym in dem Zytoplasma beibehalten werden, typischerweise als unlösliche Körnchen (die als Inklusionskörper bekannt sind), oder kann auf den periplasmatischen Raum durch eine bakterielle Sekretionssequenz gerichtet werden. Im ersteren Fall werden die Zellen lysiert, und die Körnchen werden gewonnen und denaturiert, wonach das Enzym durch Verdünnen des Denaturierungsmittels wieder gefaltet wird. Im letzteren Fall kann das Enzym aus dem periplasmatischen Raum durch Aufbrechen der Zellen, z. B. durch Ultrabeschallung oder durch osmotischen Schock, um den Inhalt des periplasmatischen Raums freizusetzen, und Gewinnen des Enzyms gewonnen werden.
Bei Expression des Enzyms in gram-positiven Bakterien, wie Bacillus- oder Streptomyces-Stämme, kann das Enzym in dem Zytoplasma zurückgehalten werden oder kann auf das extrazelluläre Medium durch eine bakterielle Sekretionssequenz gerichtet werden. Im letzteren Fall kann das Enzym aus dem Medium, wie nachstehend beschrieben, gewonnen werden.
Verfahren zur Produktion von Subtilase
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion eines erfindungsgemäßen isolierten Enzyms bereit, wobei eine geeignete Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert worden ist, die das Enzym codiert, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Produktion des Enzyms erlauben, und das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
Wenn ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das Enzym codiert, in eine heterologe Wirtszelle transformiert wird, ist es möglich, die heterologe rekombinante Produktion des erfindungsgemäßen Enzyms zu ermöglichen.
Dadurch ist es möglich, eine hoch aufgereinigte Subtilase-Zusammensetzung herzustellen, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie frei ist von homologen Verunreinigungen.
In diesem Zusammenhang bedeuten homologe Verunreinigung alle beliebigen Verunreinigungen (z. B. andere Polypeptide als das erfindungsgemäße Enzym), die aus der homologen Zelle stammen, aus der das erfindungsgemäße Enzym ursprünglich erhalten wurde.
Das zur Kultivierung der transformierten Wirtszelle verwendete Medium kann jedes beliebige herkömmliche Medium sein, das zum Züchten der Zellen in Frage geeignet ist. Die exprimierten Subtilase kann zweckmäßigerweise in das Kulturmedium sezerniert werden und kann daraus durch wohl bekannte Verfahrensweisen gewonnen werden, einschließlich Abtrennen der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitation von proteinartigen Komponenten des Mediums mittels eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, und anschließende chromatographische Verfahrensweisen, wie Ionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen.
Verwendung einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante
Eine erfindungsgemäße Subtilaseproteasevariante kann für eine Anzahl von industriellen Anwendungsmöglichkeiten, insbesondere in der Waschmittelindustrie, eingesetzt werden.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Enzymzusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante umfasst.
Eine Zusammenfassung von bevorzugten industriellen Anwendungsmöglichkeiten und entsprechenden bevorzugten Enzymzusammensetzungen ist nachstehend beschrieben.
Diese Zusammenfassung ist keineswegs als eine vollständige Liste von geeigneten Anwendungsmöglichkeiten einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante gedacht. Erfindungsgemäße Subtilasevarianten können bei anderen industriellen Anwendungsmöglichkeiten, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden, und umfassen die Verwendung einer Protease, insbesondere einer Subtilase.
Detergenzzusammensetzungen, die die mutanten Enzyme umfassen
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung der erfindungsgemäßen mutanten Enzyme in Reinigungs- und Detergenzzusammensetzungen und solchen Zusammensetzungen, die die mutanten Subtilisinenzyme umfassen. Solche Reinigungs- und Detergenzzusammensetzungen sind auf dem Fachgebiet hinreichend beschrieben, und zur weiteren Beschreibung geeigneter Reinigungs- und Detergenzzusammensetzungen wird auf WO 96/34946 ; WO 97/07202 ; WO 95/30011 verwiesen.
Weiterhin wird auf das (die) Arbeitsbeispiel(e) hierin verwiesen, die die Waschleistungsverbesserungen für eine Anzahl von erfindungsgemäßen Subtilasevarianten zeigen.
Detergenz-Offenbarung und -Beispiele
Tensidsystem
Die erfindungsgemäßen Detergenzzusammensetzungen umfassen ein Tensidsystem, wobei das Tensid ausgewählt sein kann aus nicht-ionischen und/oder anionischen und/oder kationischen und/oder ampholytischen und/oder zwitterionischen und/oder semipolaren Tensiden.
Das Tensid ist typischerweise in einer Konzentration von 0,1 bis 60 Gew.-% vorhanden.
Das Tensid ist vorzugsweise formuliert, um kompatibel mit in der Zusammensetzung vorhandenen Enzymkomponenten zu sein. In flüssigen oder Gel-Zusammensetzungen ist das Tensid am stärksten bevorzugt auf eine solche Weise formuliert, dass es die Stabilität eines beliebigen Enzyms in diesen Zusammensetzungen beschleunigt oder zumindest nicht herabsetzt.
Bevorzugte erfindungsgemäß zu verwendende Systeme umfassen als ein Tensid ein oder mehrere der nicht-ionischen und/oder anionischen hier beschriebenen Tenside.
Polyethylen-, Polypropylen- und Polybutylenoxid-Kondensate von Alkylphenolen sind zur Verwendung als das nicht-ionische Tensid der erfindungsgemäßen Tensidsysteme zweckmäßig, wobei die Polyethylenoxidkondensate bevorzugt sind. Diese Verbindungen umfassen die Kondensationsprodukte von Alkylphenolen mit einer Alkylgruppe, die etwa 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatome enthält, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 14 Kohlenstoffatome enthält, in entweder einer geradkettigen oder verzweigtkettigen Konfiguration mit dem Alkylenoxid. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ehylenoxid in einer Menge entsprechend etwa 2 bis etwa 25 Mol, stärker bevorzugt von etwa 3 bis etwa 15 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkylphenol vorhanden. Im Handel erhältliche nicht-ionische Tenside dieses Typs umfassen Igepal^RM CO-630, vermarktet von der Firma GAF Corporation; und Triton^TM X-45, X-114, X-100 und X-102, die alle von der Firma Rohm & Haas Company auf dem Markt sind. Diese Tenside werden allgemein als Alkylphenolalkoxylate (z. B. Alkylphenolethoxylate) bezeichnet.
Die Kondensationsprodukte primärer und sekundärer aliphatischer Alkohole mit etwa 1 bis etwa 25 Molen Ethylenoxid sind zur Verwendung als das nicht-ionische Tensid der erfindungsgemäßen nicht-ionischen Tensidsysteme geeignet. Die Alkylkette des aliphatischen Alkohols kann entweder geradkettig oder verzweigt, primär oder sekundär sein und enthält im Allgemeinen etwa 8 bis 22 Kohlenstoffatome. Bevorzugt sind die Kondensationsprodukte von Alkoholen mit einer Alkylgruppe, die etwa 8 bis etwa 20 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatome enthält, mit etwa 2 bis etwa 10 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol. Etwa 2 bis etwa 7 Mol Ethylenoxid und besonders bevorzugt 2 bis 5 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol sind in den Kondensationsprodukten vorhanden. Beispiele für im Handel erhältliche nicht-ionische Tenside dieses Typs umfassen Tergitol^TM 15-S-9 (das Kondensationsprodukt eines linearen C₁₁-C₁₅-Alkohols mit 9 Molen Ethylenoxid), Tergitol^TM 24-L-6 NMW (das Kondensationsprodukt eines primären C₁₂-C₁₄-Alkohols mit 6 Molen Ethylenoxid mit einer engen Molekulargewichtsverteilung), beide von der Firma Union Carbide Corporation auf dem Markt; Neodol^TM 45-9 (das Kondensationsprodukt eines linearen C₁₄-C₁₅-Alkohols mit 9 Molen Ethylenoxid), Neodol^TM 23-3 (das Kondensationsprodukt eines linearen C₁₂-C₁₃-Alkohols mit 3,0 Molen Ethylenoxid), Neodol^TM 45-7 (das Kondensationsprodukt eines linearen C₁₄-C₁₅-Alkohols mit 7 Molen Ethylenoxid), Neodol^TM 45-5 (das Kondensationsprodukt eines linearen C₁₄-C₁₅-Alkohols mit 5 Molen Ethylenoxid), das von der Firma Shell Chemical Company auf dem Markt ist, Kyro^TM EOB (das Kondensationsprodukt eines C₁₃-C₁₅-Alkohols mit 9 Molen Ethylenoxid), das von der Firma The Procter & Gamble Company auf dem Markt ist, und Genapol LA 050 (das Kondensationsprodukt eines C₁₂-C₁₄-Alkohols mit 5 Molen Ethylenoxid), das von der Firma Hoechst auf dem Markt ist. Der bevorzugte HLB-Bereich in diesen Produkten beträgt 8–11 und besonders bevorzugt 8–10.
Ebenfalls geeignet als das nicht-ionische Tensid der erfindungsgemäßen Tensidsysteme sind Alkylpolysaccharide, die in der US 4 565 647 offenbart sind, mit einer hydrophoben Gruppe, die etwa 6 bis etwa 30 Kohlenstoffatome, vorzugsweise etwa 10 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, und einem Polysaccharid, z. B. ein Polyglycosid, eine hydrophile Gruppe, die etwa 1,3 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 1,3 bis etwa 3, besonders bevorzugt etwa 1,3 bis etwa 2,7 Saccharideinheiten enthält. Jedes reduzierende Saccharid, das 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält, kann verwendet werden, z. B. können die Glucosylgruppierungen durch Glucose-, Galactose- und Galactosylgruppierungen ersetzt werden (gegebenenfalls ist die hydrophobe Gruppe an die 2-, 3-, 4- etc. Positionen gebunden und ergibt somit eine Glucose oder Galactose im Gegensatz zu einem Glucosid oder Galactosid). Die Intersaccharidbindungen können z. B. zwischen der einen Position der zusätzlichen Saccharideinheiten und den 2-, 3-, 4- und/oder 6-Positionen an den vorhergehenden Saccharideinheiten vorhanden sein.
Die bevorzugten Alkylpolyglycoside besitzen die Formel R₂O(C_nH_2nO)_t(Glycosyl)_x, wobei R² aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Alkyl, Alkylphenyl, Hydroxyalkyl, Hydroxyalkylphenyl und Gemischen davon, wobei die Alkylgruppen etwa 10 bis etwa 18, vorzugsweise etwa 12 bis etwa 14 Kohlenstoffatome enthalten, n 2 oder 3, vorzugsweise 2 ist; t 0 bis etwa 10, vorzugsweise 0 ist und x etwa 1,3 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 1,3 bis etwa 3, besonders bevorzugt etwa 1,3 bis etwa 2,7 ist. Das Glycosyl stammt vorzugsweise aus Glucose. Zur Herstellung dieser Verbindungen wird zuerst der Alkohol oder der Alkylpolyethoxyalkohol gebildet und dann mit Glucose oder einer Glucosequelle umgesetzt, um das Glucosid (Verknüpfung an der 1-Position) zu bilden. Die zusätzlichen Glycosyleinheiten können dann zwischen ihrer 1-Position und den vorhergehenden Glycosyleinheiten in der 2-, 3-, 4- und/oder 6-Position, vorzugsweise überwiegend in der 2-Position, verknüpft werden.
Die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, die durch die Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol gebildet wird, sind ebenfalls zur Verwendung als die zusätzlichen nicht-ionischen Tensidsysteme der vorliegenden Erfindung geeignet. Der hydrophobe Teil dieser Verbindungen besitzt vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 1 500 bis etwa 1 800 und zeigt Wasserunlöslichkeit. Die Zugabe von Polyoxyethyleneinheiten zu diesem hydrophoben Teil neigt zur Zunahme der Wasserlöslichkeit des Moleküls als Ganzes, und der Flüssigkeitscharakter des Produkts wird bis zu dem Punkt beibehalten, an dem der Polyoxyethylengehalt etwa 50% des Gesamtgewichts des Kondensationsprodukts beträgt, was der Kondensation mit bis zu etwa 40 Molen Ethylenoxid entspricht. Beispiele für Verbindungen dieses Typs umfassen bestimmte der im Handel erhältlichen Pluronic^TM-Tenside, die von der Firma BASF vermarktet werden.
Ebenfalls geeignet zur Verwendung als das nicht-ionische Tensid des erfindungsgemäßen Tensidsystems sind die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit dem Produkt, das aus der Umsetzung von Propylenoxid und Ethylendiamin hervorgeht. Die hydrophobe Einheit dieser Produkte besteht aus dem Reaktionsprodukt von Ethylendiamin und überschüssigem Propylenoxid und besitzt im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 2 500 bis etwa 3 000. Diese hydrophobe Einheit wird mit Ethylenoxid zu dem Ausmaße kondensiert, dass das Kondensationsprodukt etwa 40 bis etwa 80 Gew.-% Polyoxyethylen enthält und ein Molekulargewicht von etwa 5 000 bis etwa 11 000 besitzt. Beispiele dieses Typs von nicht-ionischem Tensid umfassen bestimmte der im Handel erhältlichen Tetronic^TM-Verbindungen, die von der Firma BASF vermarktet werden.
Bevorzugt zur Verwendung als das nicht-ionische Tensid der erfindungsgemäßen Tensidsysteme sind Polyethylenoxidkondensate von Alkylphenolen, Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit etwa 1 bis etwa 25 Molen Ethylenoxid, Alkylpolysaccharide und Gemische davon. Besonders bevorzugt sind C₈-C₁₄-Alkylphenolethoxylate mit 3 bis 15 Ethoxygruppen und C₈-C₁₈-Alkoholethoxylate (vorzugsweise durchschnittlich C₁₀) mit 2 bis 10 Ethoxygruppen und Gemische davon.
Stark bevorzugte nicht-ionische Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamid-Tenside der Formel
wobei R¹ H ist oder R¹ C_1-4-Hydrocarbyl, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl oder ein Gemisch davon ist, R² C_5-31-Hydrocarbyl ist und Z ein Polyhydroxyhydrocarbyl mit einer linearen Hydrocarbylgruppe mit mindestens 3 Hydroxylen, die direkt an die Kette gebunden sind, oder ein alkoxyliertes Derivat davon ist. Bevorzugt ist R¹ Methyl, R² ist geradkettiges C_11-15-Alkyl oder C_16-18-Alkyl oder eine Alkenylkette, wie Kokosalkyl oder Gemische davon, und Z entstammt einem reduzierenden Zucker, wie Glucose, Fructose, Maltose oder Lactose, in einer reduktiven Aminierungsreaktion.
Stark bevorzugte anionische Tenside umfassen alkylalkoxylierte Sulfat-Tenside. Beispiele hierfür sind wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel RO(A)_mSO₃M, wobei R eine unsubstituierte C₁₀-C₂₄-Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit einer C₁₀-C₂₄-Alkylkomponente, vorzugsweise einer C₁₂-C₂₀-Alkyl- oder Hydroxyalkyl-, stärker bevorzugt einer C₁₂-C₁₈-Alkyl- oder Hydroxyalkylkomponente ist, A eine Ethoxy- oder Propoxyeinheit ist, m größer als null ist, typischerweise zwischen etwa 0,5 und etwa 6 beträgt und stärker bevorzugt zwischen etwa 0,5 und etwa 3 beträgt, und M H oder ein Kation ist, das beispielsweise ein Metallkation (z. B. Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium etc.), Ammonium oder ein substituiertes Ammoniumkation sein kann. Alkylethoxylierte Sulfate sowie alkylpropoxylierte Sulfate werden hier berücksichtigt. Spezielle Beispiele für substituierte Ammoniumkationen umfassen Methyl-, Dimethyl-, Trimethylammoniumkationen und quaternäre Ammoniumkationen, wie Tetramethylammonium- und Dimethylpiperidiniumkationen, und diejenigen, die sich von Alkylaminen ableiten, wie Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Gemischen davon und dergleichen. Beispielhafte Tenside sind C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat(1,0)-sulfat (C₁₂-C₁₈E(1,0)M, C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat(2,25)-sulfat (C₁₂-C₁₈(2,25)M) und C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat(3,0)-sulfat (C₁₂-C₁₈E(3,0)M) und C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat(4,0)-sulfat (C₁₂-C₁₈E(4,0)M), wobei M zweckmäßigerweise aus Natrium und Kalium ausgewählt ist.
Geeignete anionische Tenside, die zu verwenden sind, sind Alkylestersulfonat-Tenside, einschließlich von linearen Ester von C₈-C₂₀-Carboxylsäuren (d. h. Fettsäuren), die mit gasförmigem SO₃ gemäß "The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), S. 323–329, sulfoniert sind. Geeignete Ausgangsmaterialien würden natürliche Fettsubstanzen einschließen, wie sie sich von Tallöl, Palmöl etc. ableiten.
Das bevorzugte Alkylestersulfonat-Tensid, insbesondere für Anwendungen zum Wäschewaschen, umfasst Alkylestersulfonat-Tenside der Strukturformel
wobei R³ ein C₈-C₂₀-Hydrocarbyl, vorzugsweise ein Alkyl oder eine Kombination davon ist, R⁴ ein C₁-C₆-Hydrocarbyl, vorzugsweise ein Alkyl oder eine Kombination davon ist und M ein Kation ist, welches mit dem Alkylestersulfonat ein wasserlösliches Salz bildet. Geeignete salzbildende Kationen umfassen Metalle, wie Natrium, Kalium und Lithium, und substituierte oder unsubstituierte Ammoniumkationen, wie Monoethanolamin, Diethanolamin und Triethanolamin. Vorzugsweise ist R³ C₁₀-C₁₆-Alkyl und R⁴ ist Methyl, Ethyl oder Isopropyl. Besonders bevorzugt sind die Methylestersulfonate, wobei R³ C₁₀-C₁₆-Alkyl ist.
Weitere geeignete anionische Tenside umfassen die Alkylsulfat-Tenside, die wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel ROSO₃M sind, wobei R vorzugsweise ein C₁₀-C₂₄-Hydrocarbyl, vorzugsweise ein Alkyl oder Hydroxyalkyl mit einer C₁₀-C₂₀-Alkylkomponente, vorzugsweise einer C₁₂-C₁₈-Alkyl- oder Hydroxyalkylkomponente ist und M H oder ein Kation ist, z. B. ein Alkalimetallkation (z. B. Natrium, Kalium, Lithium) oder Ammonium oder substituiertes Ammonium (z. B. Methyl-, Dimethyl- und Trimethylammoniumkationen und quaternäre Ammoniumkationen, wie Tetramethylammonium- und Dimethylpiperidiniumkationen und quaternäre Ammoniumkationen, die sich von Alkylaminen ableiten, wie Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin und Gemische davon, und dergleichen). Typischerweise sind C₁₂-C₁₆-Alkylketten für niedrigere Waschtemperaturen (z. B. unterhalb von etwa 50°C) bevorzugt, und C₁₆-C₁₈-Alkylketten sind für höhere Waschtemperaturen (z. B. oberhalb von etwa 50°C) bevorzugt.
Weitere anionische Tenside, die für Detergenzzwecke geeignet sind, können ebenfalls in die Waschmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein. Diese können einschließen Salze (einschließlich beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium und substituierte Ammoniumsalze, wie Mono-, Di- und Triethanolaminsalze) von Seife, primäre oder sekundäre C₈-C₂₂-Alkansulfonaten, C₈-C₂₄-Olefinsulfonate, sulfonierte Polycarbonsäuren, die durch Sulfonierung des Pyrolyseprodukts von Erdalkalimetallcitraten hergestellt werden, z. B. wie in der britischen Patentbeschreibung Nr. 1 082 179 beschrieben, C₈-C₂₄-Alkylpolyglycolethersulfate (enthaltend bis zu 10 Mol Ethylenoxid); Alkylglycerolsulfonate, Fettsäureacylglycerolsulfonate, Fettsäureoleylglycerolsulfate, Alkylphenolethylenoxidethersulfate, Paraffinsulfonate, Alkylphosphate, Isethionate, wie die Acylisethionate, N-Acyltaurate, Alkylsuccinamate und Sulfosuccinate, Monoester von Sulfosuccinaten (insbesondere gesättigte und ungesättigte C₁₂-C₁₈-Monoester) und Diester von Sulfosuccinaten (insbesondere gesättigte und ungesättigte C₆-C₁₂-Diester), Acylsarcosinate, Sulfate von Alkylpolysacchariden, wie die Sulfate von Alkylpolyglucosid (die nicht-ionischen nicht-sulfatierten Verbindungen, die nachstehend beschrieben sind), verzweigte primäre Alkylsulfate und Alkylpolyethoxycarboxylate, wie diejenigen der Formel RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO-M+, wobei R ein C₈-C₂₂-Alkyl ist, k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und M ein lösliches salzbildendes Kation ist. Harzsäuren und hydrierte Harzsäuren sind ebenfalls geeignet, wie Kolophonium, hydriertes Kolophonium und Harzsäuren und hydrierte Harzsäuren, die in Tallöl vorhanden sind oder sich davon ableiten.
Alkylbenzolsulfonate sind stark bevorzugt. Besonders bevorzugt sind lineare (geradkettige) Alkylbenzolsulfonate (LAS), wobei die Alkylgruppe vorzugsweise 10 bis 18 Kohlenstoffatome enthält.
Weitere Beispiele sind in "Surface Active Agents and Detergents" (Bd. I und II von Schwartz, Perry und Berch) beschrieben. Eine Vielzahl von solchen Tensiden sind auch allgemein in der US 3 929 678 (Spalte 23, Zeile 58, bis Spalte 29, Zeile 23, hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen) offenbart.
Wenn hier mit eingeschlossen, umfassen die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise etwa 1 bis etwa 40%, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 20 Gew.-% von solchen anionischen Tensiden.
Die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch kationische, ampholytische, zwitterionische und semipolare Tenside enthalten, sowie die nicht-ionischen und/oder anionischen Tenside, die anders sind als diejenigen, die hier bereits beschrieben worden sind.
Kationische Detergenz-Tenside, die zur Verwendung in den Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind diejenigen mit einer langkettigen Hydrocarbylgruppe. Beispiele für solche kationischen Tenside umfassen die Ammoniumtenside, wie Alkyltrimethylammoniumhalogenide, und diejenigen Tenside mit der Formel: [R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R⁵N⁺X wobei R² eine Alkyl- oder Alkylbenzylgruppe mit etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette ist, R³ jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH₂CH₂-, -CH₂CH(CH₃)-, -CH₂CH(CH₂OH)-, -CH₂CH₂CH₂- und Gemischen davon; R⁴ jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Hydroxyalkyl, Benzylringstrukturen, die durch Verknüpften der beiden R⁴-Gruppen gebildet werden, -CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH, wobei R⁶ jede beliebige Hexose oder jedes Hexosepolymer mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1 000 ist und Wasserstoff ist, wenn y nicht 0 ist; R⁵ das Gleiche ist wie R⁴ oder eine Alkylkette ist, wobei die Gesamtanzahl der Kohlenstoffatome oder R² plus R⁵ nicht mehr als etwa 18 beträgt; y jeweils 0 bis etwa 10 ist und die Summe der y-Werte 0 bis etwa 15 beträgt und X jedes kompatible Anion ist.
Stark bevorzugte kationische Tenside sind die wasserlöslichen quaternären Ammoniumverbindungen, die bei der vorliegenden Zusammensetzung geeignet sind, mit der Formel R₁R₂R₃R₄N⁺X^–(i) , wobei R₁ C₈-C₁₈-Alkyl ist, R₂, R₃ und R₄ jeweils unabhängig C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Hydroxyalkyl, Benzyl und -(C₂H₄₀)_xH sind, wobei x einen Wert von 2 bis 5 besitzt und X ein Anion ist. Nicht mehr als eines von R₂, R₃ oder R₄ sollte Benzyl sein.
Die bevorzugte Alkylkettenlänge für R₁ ist C₁₂-C₁₅, insbesondere wobei die Alkylgruppe ein Gemisch von Kettenlängen ist, die sich von Kokosfett oder Palmkernfett ableiten oder synthetisch durch Olefinaufbau oder OXO-Alkoholsynthese abgeleitet ist.
Bevorzugte Gruppen für R₂R₃ und R₄ sind Methyl- und Hydroxyethylgruppen, und das Anion X kann aus Halogenid-, Methosulfat-, Acetat- und Phosphationen ausgewählt sein.
Beispiele für geeignete quaternäre Ammoniumverbindungen der Formel (i) zur Verwendung hier sind:
Kokostrimethylammoniumchlorid oder -bromid;
Kokosmethyldihydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Decyltriethylammoniumchlorid;
Decyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
C₁₂-C₁₅-Dimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Kokosdimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Myristyltrimethylammoniummethylsulfat;
Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid oder -bromid;
Lauryldirnethyl(ethenoxy)₄-ammoniumchlorid oder -bromid;
Cholinester (Verbindungen der Formel (i), wobei R₁
ist und R₂R₃R₄ Methyl sind).
Dialkylimidazoline [Verbindungen der Formel (i)].
Weitere kationische Tenside, die hier geeignet sind, sind ebenfalls in der US 4 228 044 und in der EP 000 224 beschrieben.
Wenn hier eingeschlossen, umfassen die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise etwa 0,2 bis etwa 25%, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 8 Gew.-% von solchen kationischen Tensiden.
Ampholytische Tenside sind ebenfalls zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzungen geeignet. Diese Tenside können weitgehend als aliphatische Derivate von sekundären oder tertiären Aminen oder als aliphatische Derivate von heterocyclischen sekundären und tertiären Aminen beschrieben werden, wobei der aliphatische Rest geradkettig oder verzweigt sein kann. Einer der aliphatischen Substituenten enthält mindestens etwa 8 Kohlenstoffatome, typischerweise etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatome, und mindestens einer enthält eine anionische Wasser solubilisierende Gruppe, z. B. Carboxy, Sulfonat, Sulfat. Siehe US 3 929 678 (Spalte 19, Zeilen 18–35) als Beispiele für ampholytische Tenside.
Wenn hier eingeschlossen, umfassen die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise 0,2 bis etwa 15, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% von solchen ampholytischen Tensiden.
Zwitterionische Tenside sind ebenfalls zur Verwendung in den Waschmittelzusammensetzungen geeignet. Diese Tenside können weitgehend als Derivate von sekundären und tertiären Aminen, Derivaten von heterocyclischen sekundären und tertiären Aminen oder als Derivate von quaternären Ammonium-, quaternären Phosphonium- oder tertiären Sulfoniumverbindungen beschrieben werden. Siehe US 3 929 678 (Spalte 19, Zeile 38, bis Spalte 22, Zeile 48) als Beispiele für zwitterionischen Tenside.
Wenn hierin mit umfasst, umfassen die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise 0,2 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% von solchen zwitterionischen Tensiden.
Semipolare nicht-ionische Tenside sind eine spezielle Kategorie von nicht-ionischen Tensiden, die wasserlösliche Aminoxide einschließen, die eine Alkyleinheit von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und 2 Einheiten enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen, die etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatome enthalten; wasserlösliche Phosphinoxide, die eine Alkyleinheit von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und 2 Einheiten enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen, die etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatome enthalten; und wasserlösliche Sulfoxide, die eine Alkyleinheit von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und eine Einheit enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl- und Hydroxyalkyleinheiten von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen.
Semipolare nicht-ionische Detergenz-Tenside umfassen die Aminoxid-Tenside mit der Formel:
wobei R³ eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Alkylphenylgruppe, die etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatome enthält, oder Gemische davon ist, R⁴ eine Alkylen- oder Hydroxyalkylengruppe ist, die etwa 2 bis etwa 3 Kohlenstoffatome enthält, oder Gemische davon ist; x 0 bis etwa 3 ist; und R⁵ jeweils eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe ist, die etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatome enthält, oder eine Polyethylenoxidgruppe ist, die etwa 1 bis etwa 3 Ethylenoxidgruppen enthält. Die R⁵-Gruppen können aneinander gebunden sein, z. B. über ein Sauerstoff- oder ein Stickstoffatom, um eine Ringstruktur zu bilden.
Diese Aminoxid-Tenside umfassen insbesondere C₁₀-C₁₈-Alkyldimethylaminoxide und C₈-C₁₂-Alkoxyethyldihydroxyethylaminoxide.
Wenn hierin mit umfasst, umfassen die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise 0,2 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% von solchen semipolaren nicht-ionischen Tensiden.
Buildersysteme
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können weiterhin ein Buildersystem einschließen. Jedes herkömmliche Buildersystem ist zur Verwendung hierin geeignet, das Aluminosilicatmaterialien, Silikate, Polycarboxylate und Fettsäuren einschließt, Materialien wie Ethylendiamintetraacetat, Metallionensequestranten, wie Aminopolyphosphonate, insbesondere Ethylendiamintetramethylenphosphonsäure und Diethylentriaminpentamethylenphosphonsäure. Obwohl aus offensichtlichen umweltbedingten Gründen weniger bevorzugt, können hier auch Phosphatbuilder verwendet werden.
Geeignete Builder können anorganische Ionenaustauschermaterialien sein, die allgemein ein anorganisches hydriertes Aluminosilicatmaterial, stärker bevorzugt ein hydrierter synthetischer Zeolith, wie hydrierter Zeolith A, X, B, HS oder MAP, sind.
Ein weiteres geeignetes anorganisches Buildermaterial ist Schichtsilicat, z. B. SKS-6 (Hoechst). SKS-6 ist ein kristallines Schichtsilicat, das aus Natriumsilicat (Na₂Si₂O₅) besteht.
Geeignete Polycarboxylate, die eine Carboxygruppe enthalten, umfassen Milchsäure, Glycolsäure und Etherderivate davon, wie in den belgischen Patentschriften Nrn. 831 368 , 821 369 und 821 370 offenbart. Polycarboxylate, die zwei Carboxygruppen enthalten, umfassen die wasserlöslichen Salze von Succinsäure, Malonsäure, (Ethylendioxy)diessigsäure, Maleinsäure, Diglycolinsäure, Weinsäure, Tartronsäure und Fumarsäure sowie die Ethercarboxylate, die in der deutschen Offenlegungsschrift 2 446 686 und 2 446 487 , in der US 3 935 257 offenbart sind, und die Sulfinylcarboxylate, die in der belgischen Patentschrift Nr. 840 623 beschrieben sind. Polycarboxylate, die drei Carboxygruppen enthalten, umfassen insbesondere wasserlösliche Citrate, Aconitrate und Citraconate, sowie Succinatderivate, wie die Carboxymethyloxysuccinate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1 379 241 beschrieben sind, Lactooxysuccinate, die in der niederländischen Anmeldung 7205873 beschrieben sind, und die Oxypolycarboxylatmaterialien, wie 2-Oxa-1,1,3-propantricarboxylate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1 387 447 beschrieben sind.
Polycarboxylate, die vier Carboxygruppen enthalten, umfassen Oxydisuccinate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1 261 829 beschrieben sind, 1,1,2,2-Ethantetracarboxylate, 1,1,3,3-Propantetracarboxylate, die Sulfosubstituenten enthalten, umfassen die Sulfosuccinat-Derivate, die in den britischen Patentschriften Nrn. 1 398 421 und 1 398 422 und in der US 3 936 448 beschrieben sind, und die sulfonierten pyrolysierten Citrate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1 082 179 beschrieben sind, während Polycarboxylate, die Phosphonsubstituenten enthalten, in der britischen Patentschrift Nr. 1 439 000 beschrieben sind.
Alicyclische und heterocyclische Polycarboxylate umfassen Cyclopentan-cis,cis,cis-tetracarboxylate, Cyclopentadienidpentacarboxylate, 2,3,4,5-Tetrahydrofuran-cis,cis,cis-tetracarboxylate, 2,5-Tetrahydrofuran-cis-dicarboxylate, 2,2,5,5-Tetrahydrofurantetracarboxylate, 1,2,3,4,5,6-Hexan-hexacarboxylate und Carboxymethylderivate von mehrwertigen Alkoholen, wie Sorbit, Mannit und Xylit. Aromatische Polycarboxylate umfassen Mellithsäure, Pyromellithsäure und die Phthalsäurederivate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1 425 343 beschrieben sind.
Von den obigen sind die bevorzugten Polycarboxylate Hydroxycarboxylate, die bis zu drei Carboxygruppen pro Molekül enthalten, insbesondere Citrate.
Bevorzugte Buildersysteme zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen umfassen cm Gemisch eines wasserunlöslichen Aluminosilicatbuilders, wie Zeolith A oder ein Schichtsilicat (SKS-6) und einen wasserlöslichen Carboxylatchelatbuildner, wie Citronensäure.
Ein geeignetes Chelat zum Einschluss in die erfindungsgemäßen Detergenzzusammensetzungen ist Ethylendiamin-N,N'-disuccinsäure (EDDS) oder das Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Ammonium- oder das substituierte Ammoniumsalz davon oder Gemische davon. Bevorzugte EDDS-Verbindungen sind die freie Fettsäureform und das Natrium- oder Magnesiumsalz davon. Beispiele für solche bevorzugten Natriumsalze von EDDS umfassen Na₂EDDS und Na₄EDDS. Beispiele für solche bevorzugten Magnesiumsalze von EDDS umfassen MgEDDS und Mg₂EDDS. Die Magnesiumsalze sind die am stärksten bevorzugten zum Einschluss in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen.
Bevorzugte Buildersysteme umfassen ein Gemisch eines wasserunlöslichen Aluminosilicatbuilders, wie Zeolith A, und eines wasserlöslichen Carboxylatchelatbildners, wie Citronensäure.
Weitere Buildermaterialien, die Teil des Buildersystems zur Verwendung in granulären Zusammensetzungen bilden können, umfassen anorganische Materialien, wie Alkalimetallcarbonate, Bicarbonate, Silicate und organische Materialien, wie die organischen Phosphonate, Aminopolyalkylenphosphonate und Aminopolycarboxylate.
Weitere geeignete wasserlösliche organische Salze sind die homo- oder copolymeren Säuren oder ihre Salze, wobei die Polycarboxylsäure mindestens zwei Carboxylreste einschließt, die voneinander um nicht mehr als zwei Kohlenstoffatome getrennt sind.
Polymere von diesem Typ sind in der GB-A-1 596 756 offenbart. Beispiele für solche Salze sind Polyacrylate mit MW 2 000–5 000 und ihre Copolymere mit Maleinsäureanhydrid, wie Copolymere mit einem Molekulargewicht von 20 000 bis 70 000, insbesondere etwa 40 000.
Detergenz-Buildersalze sind normalerweise in Mengen von 5 bis 80 Gew.-% der Zusammensetzung eingeschlossen. Bevorzugte Konzentrationen an Builder für Flüssigdetergenzien sind 5 bis 30%.
Enzyme
Bevorzugte Detergenzzusammensetzungen umfassen zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Enzympräparation weitere Enzym(e), die die Reinigungsleistung und/oder Textilstoffpflegevorteile bereitstellen.
Solche Enzyme umfassen weitere Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Amylasen, Cellulasen, Peroxidasen, Oxidasen (z. B. Laccasen).
Proteasen: Jede andere Protease, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Proteasen umfassen diejenige von tierischem, pflanzlichem oder mikrobiellem Ursprung. Der mikrobielle Ursprung ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Die Protease kann eine Serinprotease, vorzugsweise eine alkalische mikrobielle Protease oder eine trypsinartige Protease sein. Beispiele für alkalische Proteasen sind Subtilisine, insbesondere diejenigen, die sich von Bacillus ableiten, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279 ). Beispiele für trypsinartige Proteasen sind Trypsin (z. B. aus Schweinen oder Rindern) und die Fusarium-Protease, die in WO 89/06270 beschrieben ist.
Bevorzugte im Handel erhältliche Proteaseenzyme umfassen diejenigen, die unter den Warennamen Alcalase, Savinase, Primase, Durazym verkauft werden, und Esperase von Novo Nordisk A/S (Dänemark), und diejenigen, die unter den Warennamen Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect und Purafect OXP von Genencor International verkauft werden, und diejenigen, die unter den Warennamen Opticlean und Optimase von Solvay Enzymes verkauft werden. Proteaseenzyme können in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer Konzentration von 0,00001 Gew.-% bis 2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 bis 1 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 Gew.-% bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung eingearbeitet sein.
Lipasen: Jede Lipase, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann eingesetzt werden. Geeignete Lipasen umfassen diejenigen bakteriellen oder fungalen Ursprungs. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Beispiele für geeignete Lipasen umfassen Humicola lanuginosa-Lipase, z. B. wie beschrieben in EP 258 068 und EP 305 216 , eine Rhizomucor miehei-Lipase, z. B. wie beschrieben in EP 238 023 , eine Candida-Lipase, wie C. antarctica-Lipase, z. B. die C. antarctica-Lipase A oder B, die in der EP 214 761 beschrieben ist, eine Pseudomonas-Lipase, wie P. alcaligenes und P. pseudoalcaligenes-Lipase, z. B. wie in der EP 218 272 beschrieben, eine P. cepacia-Lipase, z. B. wie in der EP 331 376 beschrieben, eine P. stutzeri-Lipase, z. B. wie in der GB 1 372 034 offenbart, eine P. fluorescens-Lipase, eine Bacillus-Lipase, z. B. eine B. subtilis-Lipase (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253–260), eine B. stearothermophilus-Lipase ( JP 64/744992 ) und eine B. pumilus-Lipase ( WO 91/16422 ).
Weiterhin kann eine Anzahl von klonierten Lipasen geeignet sein, einschließlich Penicillium camembertii-Lipase, die von Yamaguchi et al. (1991), Gene 103, 61–67 beschrieben ist, Geotricum candidum-Lipase (Schimada, Y. et al. (1989), J. Biochem., 106, 383–388) und verschiedene Rhizopus-Lipasen, wie R. delemar-Lipase (Hass, J. J. et al. (1991), Gene 109, 117–113), eine R. niveus-Lipase (Kugimiya et al. (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716–719) und eine R. oryzae-Lipase.
Weitere Typen von lipolytischen Enzymen, wie Cutinasen, können ebenfalls geeignet sein, z. B. eine Cutinase, die sich von Pseudomonas mendocina ableitet, wie in WO 88/09367 beschrieben, oder eine Cutinase, die sich von Fusarium solani pisi ableitet (z. B. beschrieben in WO 90/09446 ).
Geeignete Lipasen sind Lipasen, wie M1 Lipase^TM, Luma fast^TM und Lipomax^TM (Genencor), Lipolase^TM und Lipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S) und Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Die Lipasen werden normalerweise in die Detergenzzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 Gew.-% bis 2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 Gew.-% bis 0,5% Enzymprotein der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung eingearbeitet.
Amylasen: Jede Amylase (α und/oder β), die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Amylasen umfassen diejenigen bakteriellen oder fungalen Ursprungs. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Amylasen umfassen beispielsweise α-Amylasen, die aus einem speziellen Stamm von B. licheniformis erhalten werden, ausfÜhrlicher beschrieben in GB 1 296 839 . Im Handel erhältliche Amylasen sind Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM und BAN^TM (erhältlich von Novo Nordisk A/S) und Rapidase^TM und Maxamyl P^TM (erhältlich von Genencor).
Die Amylasen werden normalerweise in die Detergenzzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 Gew.-% bis 2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 Gew.-% bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung eingearbeitet.
Cellulasen: Jede Cellulase, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Cellulasen umfassen diejenigen bakteriellen oder fungalen Ursprungs. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen sind in US 4 435 307 offenbart, die fungale Cellulasen offenbaren, die von Humicola insolens produziert werden. Besonders geeignete Cellulasen sind die Cellulasen mit Farbpflegevorteilen. Beispiele für solche Cellulasen sind Cellulasen, die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 495 257 beschrieben sind.
Im Handel erhältliche Cellulasen umfassen Celluzyme^TM, hergestellt von einem Stamm von Humicola insolens (Novo Nordisk A/S) und KAC-500(B)^TM (Kao Corporation).
Cellulasen werden normalerweise in die Detergenzzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 Gew.- bis 2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 Gew.-% bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung eingearbeitet.
Peroxidasen/Oxidasen: Peroxidaseenzyme werden in Kombination mit Wasserstoffperoxid oder einer Quelle davon (z. B. Percarbonat, Perborat oder Persulfat) verwendet. Oxidaseenyzme werden in Kombination mit Sauerstoff verwendet. Beide Typen von Enzymen werden zum "Lösungsbleichen" verwendet, d. h. um eine Übertragung eines Textilfarbstoffes aus einem gefärbten Textilstoff auf einen anderen Textilstoff zu verhindern, wenn die Textilstoffe miteinander in einer Waschlauge gewaschen werden, vorzugsweise zusammen mit einem Verstärkungsmittel, wie in WO 94/12621 und WO 95/01426 beschrieben. Geeignete Peroxidasen/Oxidasen umfassen diejenigen aus pflanzlichem, bakteriellem oder fungalem Ursprung. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Peroxidase- und/oder Oxidaseenzyme werden normalerweise in die Detergenzzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 Gew.- bis 2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 Gew.-% bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung eingearbeitet.
Gemische der oben erwähnten Enzyme sind hier mit umfasst, insbesondere ein Gemisch einer Protease, einer Amylase, einer Lipase und/oder einer Cellulase.
Das erfindungsgemäße Enzym oder jedes andere in die Detergenzzusammensetzung eingearbeitete Enzym wird normalerweise in die Detergenzzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 Gew.- bis 2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 Gew.-% bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung eingearbeitet.
Bleichmittel: Zusätzliche fakultative Detergenzbestandteile, die in die erfindungsgemäßen Detergenzzusammensetzungen eingeschlossen sein können, umfassen Bleichmittel, wie PB1, PB4 und Percarbonat mit einer Teilchengröße von 400–800 Mikron. Diese Bleichmittelkomponenten können ein oder mehrere Sauerstoffbleichmittel, und in Abhängigkeit von dem gewählten Bleichmittel, einen oder mehrere Bleichaktivatoren einschließen. Sind Sauerstoffbleichverbindungen vorhanden, sind sie typischerweise in Konzentrationen von etwa 1% bis etwa 25% vorhanden. Im Allgemeinen sind Bleichverbindungen fakultative zugesetzte Komponenten in nicht-flüssigen Formulierungen, z. B. in granulären Detergenzien.
Die Bleichmittelkomponente zur Verwendung hierin, kann eines der Bleichmittel sein, die für Detergenzzusammensetzungen geeignet sind, einschließlich von Sauerstoffbleichen, sowie anderen auf dem Fachgebiet bekannten Bleichen.
Das Bleichmittel, das für die vorliegende Erfindung geeignet ist, kann ein aktiviertes oder nicht-aktiviertes Bleichmittel sein.
Eine Kategorie von Sauerstoffbleichmittel, die verwendet werden kann, umfasst Percarbonsäurebleichmittel und Salze davon. Geeignete Beispiele für diese Klasse von Mitteln umfassen Magnesiummonoperoxyphthalathexahydrat, das Magnesiumsalz von Metachlorperbenzoesäure, 4-Nonylamino-4-oxoperoxybuttersäure und Diperoxydodecandionsäure. Solche Bleichmittel sind in der US 4 483 781 , US 740 446 , EP 0 133 354 und US 4 412 934 offenbart. Stark bevorzugte Bleichmittel umfassen auch 6-Nonylamino-o-oxoperoxycapronsäure, wie in der US 4 634 551 beschrieben.
Eine weitere Kategorie von Bleichmitteln, die verwendet werden kann, umfasst die Halogenbleichmittel. Beispiele für Hypohalogenit-Bleichmittel beispielsweise umfassen Trichlorisocyanursäure, Natrium- und Kaliumdichlorisocyanurate und N-Chlor- und N-Bromalkansulfonamide. Solche Materialien werden normalerweise bei 0,5–10 Gew.-% des fertigen Produkts, vorzugsweise bei 1–5 Gew.-% zugesetzt.
Die Wasserstoffperoxid-freisetzenden Mittel können in Kombination mit Bleichaktivatoren verwendet werden, wie Tetraacetylethylendiamin (TAED), Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS, beschrieben in US 4 412 934 ), 3,5-Trimethylhexasanoloxybenzolsulfonat (ISONOBS, beschrieben in EP 120 591 ) oder Pentaacetylglucose (PAG), die unter Bildung einer Persäure als die aktiven bleichenden Spezies perhydrolysiert werden, was zu einer verbesserten Bleichwirkung führt. Zusätzlich sind die Bleichaktivatoren C8 (6-Octanamidocaproyl)oxybenzol-sulfoant, C9 (6-Nonanamidocaproyl)oxybenzolsulfonat und C10 (6-Decanamidocaproyl)oxybenzolsulfonat oder Gemische davon sehr geeignet. Ebenfalls geeignete Aktivatoren sind acylierte Citratester, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 91870207.7 offenbart.
Geeignete Bleichmittel, einschließlich von Peroxysäuren und Bleichsystemen, die Bleichaktivatoren und Persauerstoffbleichverbindungen einschließen, zur Verwendung in erfindungsgemäßen Reinigungszusammensetzungen, sind in der Anmeldung USSN 08/136 626 beschrieben.
Das Wasserstoffperoxid kann auch durch Zugabe eines enzymatischen Systems (z. B. ein Enzym und ein Substrat dafür) vorhanden sein, das in der Lage ist, Wasserstoffperoxid zu Beginn oder während des Wasch- und/oder des Spülvorgangs zu erzeugen. Solche enzymatischen Systeme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0 537 381 offenbart.
Bleichmittel, die anders sind als Sauerstoffbleichmittel, sind ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt und können hier verwendet werden. Ein Typ von Nicht-Sauerstoffbleichmittel von besonderem Interesse umfasst photoaktivierte Bleichmittel, wie sulfonierte Zink- und/oder Aluminiumphthalocyanine. Diese Materialien können auf dem Substrat während des Waschvorgangs abgeschieden werden. Bei Bestrahlung mit Licht in Gegenwart von Sauerstoff, wie durch Aufhängen der Kleider zum Trocknen im Tageslicht, wird das sulfonierte Zinkphthalocyanin aktiviert, und folglich wird das Substrat gebleicht. Bevorzugtes Zinkphthalocyanin und ein photoaktiviertes Bleichverfahren sind in der US 4 033 718 beschrieben. Typischerweise enthält die Detergenzzusammensetzung etwa 0,025 Gew.-% bis etwa 1,25 Gew.-% sulfoniertes Zinkphthalocyanin.
Bleichmittel können auch einen Mangankatalysator umfassen. Der Mangankatalysator kann z. B. eine der Verbindungen sein, die in "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639, beschrieben sind.
Schaumunterdrücker: Ein weiterer fakultativer Bestandteil ist ein Schaumunterdrücker, beispielsweise Silikone und Siliciumdioxid-Silikongemische. Silikone können im Allgemeinen durch alkylierte Polysiloxanmaterialien dargestellt werden, während Siliciumdioxid normalerweise in fein zerteilten Formen beispielsweise durch Silicaaerogele und Xerogele und hydrophobe Kieselsäuren verschiedener Typen dargestellt wird. Diese Materialien können als teilchenförmige Stoffe eingearbeitet werden, wobei der Schaumunterdrücker zweckmäßigerweise in einen wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren im Wesentlichen Nicht-Tensid-Detergenz-undurchdringlichen Träger freisetzbar eingearbeitet ist. Alternativ kann der Schaumunterdrücker in einem flüssigen Träger gelöst oder dispergiert sein und durch Aufsprühen auf eine oder mehrere der anderen Komponenten aufgebracht werden.
Ein bevorzugtes Silikon-Schaumkontrollmittel ist in der US 3 933 672 offenbart. Weitere besonders geeignete Schaumunterdrücker sind die selbst emulgierenden Silikonschaumunterdrücker, die in der deutschen Patentanmeldung DTOS 2 646 126 beschrieben sind. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist DC-544, das von der Firma Dow Corning im Handel ist, das ein Siloxan-Glycol-Copolymer ist. Besonders bevorzugte Schaumkontrollmittel sind das Schaumunterdrückersystem, das ein Gemisch von Silikonölen und 2-Alkylalkanolen umfasst. Geeignete 2-Alkylalkanole sind 2-Butyloctanol, das unter dem Warennamen Isofol 12 R im Handel erhältlich ist.
Solche Schaumunterdrückersysteme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0 593 841 beschrieben.
Besonders bevorzugte Silikonschaumkontrollmittel sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 92201649.8 beschrieben. Die Zusammensetzungen können ein Silikon/Siliciumdioxidgemisch in Kombination mit nicht-porösem Quarzstaub, wie Aerosil^R, einschließen.
Die vorstehend beschriebenen Schaumunterdrücker werden normalerweise in Konzentrationen von 0,001 Gew.-% bis 2 Gew.-% der Zusammensetzung, vorzugsweise von 0,01 Gew.-% bis 1 Gew.-% eingesetzt.
Weitere Komponenten: Weitere in Detergenzzusammensetzungen verwendete Komponenten können als Schmutzsuspendiermittel, Soil-Release-Mittel, optische Aufheller, Scheuermittel, Bakterizide, Anlaufinhibitoren, Farbmittel und/oder verkapselte oder nicht-verkapselte Duftstoffe eingesetzt werden.
Besonders geeignete Verkapselungsmaterialien sind wasserlösliche Kapseln, die aus einer Matrix von Polysaccharid- und Polyhydroxyverbindungen bestehen, wie in der GP 1 464 616 beschrieben.
Weitere geeignete wasserlösliche Verkapselungsmaterialien umfassen Dextrine, die sich von ungelatinisierten Stärkesäureestern von substituierten Dicarbonsäuren ableiten, wie in der US 3 455 838 beschrieben. Diese Säureester-Dextrine werden vorzugsweise aus solchen Stärken, wie wachsartiger Mais, wachsartige Hirse, Sago, Tapioca und Kartoffelstärke, hergestellt. Geeignete Beispiele für die Verkapselungsmaterialien umfassen N-Lok, das von der Firma National Starch hergestellt wird. Das N-Lok-Verkapselungsmaterial besteht aus einer modifizierten Maisstärke und Glucose. Die Stärke wird durch Zugabe von monofunktionellen substituierten Gruppen, wie Octenylsuccinsäureanhydrid, modifiziert.
Wiederabscheidungshemmmittel und Schmutzsuspendiermittel, die hier geeignet sind, umfassen Cellulosederivate, wie Methylcellulose, Carboxymethylcelluose und Hydroxyethylcellulose, und homo- oder copolymere Polycarbonsäure oder ihre Salze. Polymere dieses Typs umfassen die Polyacrylate und Maleinsäureanhydrid-Acrylsäure-Copolymere, die bereits als Builder erwähnt wurden, sowie Copolymere von Maleinsäureanhydrid mit Ethylen, Methylvinylether oder Methacrylsäure, wobei das Maleinsäureanhydrid mindestens 20 Mol-% des Copolymers ausmacht. Diese Materialien werden normalerweise in Konzentrationen von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, stärker bevorzugt von 0,75 Gew.-% bis 8 Gew.-%, am stärksten bevorzugt von 1 Gew.-% bis 6 Gew.-% der Zusammensetzung verwendet.
Bevorzugte optische Aufheller sind anionischen Charakters, wobei Beispiele Dinatrium-4,4'-bis-(2-diethanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino)stilben-2:2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(2-morpholino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino-stilben-2:2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ylamino)stilben-2:2'-disulfonat, Mononatrium-4',4''-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ylamino)stilben-2-sulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-methyl-N-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-ylamino)stilben-2,2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(4-phenyl-2,1,3-triazol-2-yl)-stilben-2,2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis(2-anilino-4-(1-methyl-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-ylamino)stilben-2,2'-disulfonat, Natrium-2-(stilbyl-4''-(naphtho-1',2':4,5)-1,2,3-triazol-2''-sulfonat und 4,4'-Bis-(2-sulfostyryl)biphenyl sind.
Weitere geeignete Polymermaterialien sind die Polyethylenglycole, insbesondere diejenigen mit einem Molekulargewicht von 1 000–10 000, stärker bevorzugt von 2 000 bis 8 000 und besonders bevorzugt von etwa 4 000. Diese werden in Konzentrationen von 0,20 Gew.-% bis 5 Gew.-%, stärker bevorzugt von 0,25 Gew.-% bis 2,5 Gew.-% verwendet. Diese Polymere und die zuvor erwähnten homo- oder copolymeren Polycarboxylatsalze sind zur Verbesserung der Weißretention, der Textilstoff-Ascheabscheidung und der Reinigungsleistung an Ton, proteinartigen und oxidierbaren Verschmutzungen und in Gegenwart von Übergangsmetallverunreinigungen wertvoll.
Soil-Release-Mittel, die in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignet sind, sind üblicherweise Copolymere oder Terpolymere von Terephthalsäure mit Ethylenglycol- und/oder Propylenglycoleinheiten in verschiedenen Anordnungen. Beispiele für solche Polymere sind in der US 4 116 885 und 4 711 730 und in der EP 0 272 033 offenbart. Ein besonders bevorzugtes Polymer gemäß EP 0 272 033 besitzt die Formel: (CH₃(PEG)₄₃)_0,75(POH)_0,25[T-PO)_2,8(T-PEG)_0,4]T(POH)_0,25((PEG)₄₃CH₃)_0,75, wobei PEG -(OC₂H₄)O- ist, PO(OC₃H₆O) ist und T(pOOC₆H₄CO) ist.
Ebenfalls sehr geeignet sind modifizierte Polyester als statistische Copolymere von Dimethylterephthalat, Dimethylsulfoisophthalat, Ethylenglycol und 1,2-Propandiol, wobei die Endgruppen hauptsächlich aus Sulfobenzoat und zweitens aus Monoestern von Ethylenglycol und/oder 1,2-Propandiol bestehen. Das Ziel ist der Erhalt eines Polymers, das an beiden Enden mit Sulfobenzoatgruppen gekappt ist, "hauptsächlich" in dem vorliegenden Zusammenhang sind die meisten der Copolymere hier durch Sulfobenzoatgruppen am Ende gekappt. Allerdings bestehen einige Copolymere, die weniger als vollständig gekappt sind, und deren Endgruppen darum aus Monoester von Ethylenglycol und/oder 1,2-Propandiol bestehen können, "sekundär" aus solchen Spezies.
Die hier gewählten Polyester enthalten etwa 46 Gew.-% Dimethylterephthalsäure, etwa 16 Gew.-% 1,2-Propandiol, etwa 10 Gew.-% Ethylenglycol, etwa 13 Gew.-% Dimethylsulfobenzoesäure und etwa 15 Gew.-% Sulfoisophthalsäure und besitzen ein Molekulargewicht von etwa 3 000. Die Polyester und ihr Herstellungsverfahren sind ausführlich in EP 311 342 beschrieben.
Weichmachmittel: Stoffweichmachmittel können ebenfalls in erfindungsgemäße Waschmittelzusammensetzungen eingearbeitet werden. Diese Mittel können vom anorganischen oder organischen Typ sein. Anorganische Weichmachmittel sind beispielsweise die Smectit-Tone, die in GB-A-1 400898 und in US 5 019 292 offenbart sind. Organische Stoffweichmachmittel umfassen die wasserunlöslichen tertiären Amine, wie in GB-A1 514 276 und EP 0 011 340 offenbart, und ihre Kombination mit mono-C₁₂-C₁₄-quaternären Ammoniumsalzen sind in EP-B-0 026 528 offenbart, und langkettige Amine, wie in EP 0 242 919 offenbart. Weitere geeignete organische Bestandteile von Stoffweichmachsystemen umfassen hochmolekulare Polyethylenoxidmaterialien, wie in EP 0 299 575 und 0 313 146 offenbart.
Die Konzentrationen an Smectit-Ton liegen normalerweise im Bereich von 5 Gew.-% bis 15 Gew.-%, stärker bevorzugt von 8 Gew.-% bis 12 Gew.-%, wobei das Material als trockengemischte Komponente dem Rest der Formulierung zugesetzt wird. Organische Stoffweichmachmittel, wie die wasserunlöslichen tertiären Amine oder langkettigen Amidmaterialien, werden in Konzentrationen von 0,5 Gew.-% bis 5 Gew.-%, normalerweise von 1 Gew.-% bis 3 Gew.-% eingearbeitet, während die hochmolekularen Polyethylenoxidmaterialien und die wasserlöslichen kationischen Materialien in Konzentrationen von 0,1 Gew.-% bis 2 Gew.-%, normalerweise von 0,15 Gew.-% bis 1,5 Gew.-% zugesetzt werden. Diese Materialien werden normalerweise dem sprühgetrockneten Teil der Zusammensetzung zugesetzt, obwohl es in einigen Fällen zweckmäßiger sein kann, sie als einen trockengemischten teilchenförmigen Stoff zuzusetzen oder sie als geschmolzene Flüssigkeit auf die anderen festen Komponenten der Zusammensetzung aufzusprühen.
Polymere Farbübertragungsinhibtoren: Die erfindungsgemäßen Detergenzzusammensetzungen können auch 0,001 Gew.-% bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 Gew.-% bis 2 Gew.-%, stärker bevorzugt 0,05 Gew.-% bis 1 Gew.-% polymere Farbübertragungsinhibitoren umfassen. Die polymeren Farbübertragungsinhibitoren werden normalerweise in Detergenzzusammensetzungen eingearbeitet, um die Übertragung von Farbstoffen aus gefärbten Textilstoffen auf Textilstoffe, die damit gewaschen werden, zu übertragen. Diese Polymere besitzen die Fähigkeit der Komplexierung oder der Adsorption der flüchtigen, aus den gefärbten Textilstoffen ausgewaschenen Farbstoffen, bevor die Farbstoffe die Gelegenheit haben, an andere Gegenstände in der Wäsche gebunden zu werden.
Besonders geeignete polymere Farbübertragungsinhibitoren sind Polyamin-N-oxid-Polymere, Copolymere von N-Vinyl-Pyrrolidon und N-Vinylimidazol, Polyvinylpyrrolidonpolymere, Polyvinyloxazolidone und Polyvinylimidazole oder Gemische davon.
Die Zugabe von solchen Polymeren verstärkt auch die Leistung der erfindungsgemäßen Enzyme.
Die erfindungsgemäße Detergenzzusammensetzung kann in flüssiger Form, in Pastenform, in Gelform, in Riegelform oder in granulärer Form vorhanden sein.
Nicht staubende Granulate können, z. B. wie offenbart in US 4 106 991 und 4 661 452 (beide Novo Industri A/S), hergestellt werden und können gegebenenfalls durch die auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele von wachsartigen Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1 000 bis 20 000; ethoxylierte Nonylphenole mit 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten; ethoxylierte Fettalkohole, wobei der Alkohol 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und wobei 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten vorhanden sind; Fettalkohole; Fettsäuren und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die zur Anwendung durch Wirbelbetttechniken geeignet sind, sind in GB 1483591 angegeben.
Erfindungsgemäße granuläre Zusammensetzungen können auch in "kompakter Form" vorhanden sein, d. h. sie können eine relativ höhere Dichte als herkömmliche granuläre Detergenzien aufweisen, d. h. von 550 bis 950 g/l; in einem solchen Fall enthalten die granulären erfindungsgemäßen Detergenzzusammensetzungen eine geringere Menge an "anorganischem Füllsalz" im Vergleich zu herkömmlichen granulären Detergenzien; typische Füllsalze sind Erdalkalimetallsalze von Sulfaten und Chloriden, typischerweise Natriumsulfat; ein "kompaktes" Detergenz umfasst typischerweise nicht mehr als 10% Füllsalz. Die erfindungsgemäßen flüssigen Zusammensetzungen können auch in "konzentrierter Form" vorliegen, in einem solchen Fall enthalten die flüssigen erfindungsgemäßen Detergenzzusammensetzungen eine geringere Menge an Wasser im Vergleich zu herkömmlichen flüssigen Detergenzien. Typischerweise beträgt der Wassergehalt des konzentrierten flüssigen Detergenz weniger als 30 Gew.-%, stärker bevorzugt weniger als 20 Gew.-%, am stärksten bevorzugt weniger als 10 Gew.-% der Detergenzzusammensetzungen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können beispielsweise als Hand- und Maschinenwaschmittelzusammensetzungen formuliert werden, einschließlich von Waschadditivzusammensetzungen und Zusammensetzungen, die zur Verwendung bei der Vorbehandlung von gefärbten Textilstoffen geeignet sind, als beim Spülvorgang zugesetzte Textilstoffweichspülerzusammensetzungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei allgemeinen Reinigungsvorgängen von harter Oberfläche im Haushalt und Geschirrspülvorgängen.
Die folgenden Beispiele sollen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung beispielhaft erläutern, jedoch nicht notwendigerweise den Umfang der Erfindung definieren oder einschränken.
In den Detergenzzusammensetzungen besitzen die abgekürzten Komponentenbezeichnungen die folgenden Bedeutungen:

LAS:: lineares Natrium-C₁₂-alkylbenzolsulfonat
TAS:: Natriumtalgfettsäurealkylsulfat
XYAS:: Natrium-C_1X-C_1Y-alkylsulfat
SS:e: sekundäres Seifentensid der Formel 2-Butyloctansäure
25EY:: ein überwiegend linearer primärer C₁₂-C₁₅-Alkohol, der mit im Durchschnitt Y-Molen Ethylenoxid kondensiert ist
45EY:: ein überwiegend linearer primärer C₁₄-C₁₅-Alkohol, der mit im Durchschnitt Y-Molen Ethylenoxid kondensiert ist
XYEZS:: C_1X-C_1Y-Natriumalkylsulfat, kondensiert mit im Durchschnitt Z Molen Ethylenoxid pro Mol
nicht-ionisch:: C₁₃-C₁₅-ethoxyliertes/propoxyliertes Fettalkoholgemisch mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 3,8 und einem durchschnittlichen Propoxylierungsgrad von 4,5, ist unter dem Namen Plurafax LF404 von der Firma BASF GmbH im Handel
CFAA:: C₁₂-C₁₄-Alkyl-N-methylglucamid
TFAA:: C₁₆-C₁₈-Alkyl-N-methylglucamid
Silikat:: amorphes Natriumsilicat (SiO₂:Na₂O-Verhältnis = 2,0)
NaSKS-6:: kristallines Schichtsilicat der Formel δ-Na₂Si₂O₅
Carbonat:: wasserfreies Natriumcarbonat
Phosphat:: Natriumtripolyphosphat
MA/AA:: Copolymer von 1:4 Maleinsäure/Acrylsäure, mittleres Molekulargewicht etwa 80 000
Polyacrylat:: Polyacrylathomopolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von 8 000, ist unter dem Namen PA30 von der Firma BASF GmbH im Handel
Zeolithe: A: hydriertes Natriumalumosilicat der Formel Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂·27H₂O mit einer primären Teilchengröße im Bereich von 1 bis 10 Mikrometer
Citrat:: Trinatriumcitratdihydrat
Citric:: Citronensäure
Perborat:: wasserfreie Natriumperboratmonohydratbleiche, empirische Formel NaBO₂·H₂O₂
PB4:: wasserfreies Natriumperborattetrahydrat
Percarbonat:: wasserfreie Natriumpercarbonatbleiche der empirischen Formel 2Na₂CO₃·3H₂O₂
TAED:: Tetraacetylethylendiamin
CMC:: Natriumcarboxymethylcellulose
DETPMP:: Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure), ist von der Firma Monsanto unter dem Namen Dequest 2060 im Handel
PVP:: Polyvinylpyrrolidonpolymer
EDDS:: Ethylendiamin-N,N'-disuccinsäure, [S,S]-Isomer in der Form des Natriumsalzes
Schaumunterdrücker:: 25% Paraffinwachs, FP 50°C, 17% hydrophobe Kieselsäure, 58% Suppressor: Paraffinöl
Granuläre: 12% Silikon/Kieselsäure, 18% Stearylalkohol, 70% Suppressor:
Schaumunterdrücker: Stärke in granulärer Form
Sulfat:: wasserfreies Natriumsulfat
HMWPEO:: hochmolekulares Polyethylenoxid
TAE25:: Talgalkoholethoxylat (25)

Detergenzbeispiel I

Eine granuläre Textilstoffreinigungszusammensetzung gemäß der Erfindung kann wie folgt hergestellt werden:

lineares Natrium-C₁₂-alkyl-benzolsulfonat	6,5
Natriumsulfat	15,0
Zeolith A	26,0
Natriumnitrilotriacetat	5,0
erfindungsgemäßes Enzym	0,1
PVP	0,5
TAED	3,0
Borsäure	4,0
Perborat	18,0
Phenolsulfonat	0,1
Rest	bis auf 100

Detergenzbeispiel II

Eine kompakte granuläre Textilstoffreinigungszusammensetzung (Dichte 800 g/l) gemäß der Erfindung kann wie folgt hergestellt werden:

45AS	8,0
25E3S	2,0
25E5	3,0
25E3	3,0
TFAA	2,5
Zeolith A	17,0
NaSKS-6	12,0
Citronensäure	3,0
Carbonat	7,0
MA/AA	5,0
CMC	0,4
erfindungsgemäßes Enzym	0,1
TAED	6,0
Percarbonat	22,0
EDDS	0,3
granulärer Schaumunterdrücker	3,5
Wasser/Rest	bis auf 100%

Detergenzbeispiel III

Granuläre Textilstoffreinigungszusammensetzungen gemäß der Erfindung, die besonders beim Waschen von gefärbten Textilstoffen geeignet sind, wurden wie folgt hergestellt:

LAS	10,7	-
TAS	2,4	-
TFAA	-	4,0
45AS	3,1	10,0
45E7	4,0	-
25E3S	-	3,0
68E11	1,8	-
25E5	-	8,0
Citrat	15,0	7,0
Carbonat	-	10
Citronensäure	2,5	3,0
Zeolith A	32,1	25,0
Na-SKS-6	-	9,0
MA/AA	5,0	5,0
DETPMP	0,2	0,8
erfindungsgemäßes Enzym	0,10	0,05
Silikat	2,5	-
Sulfat	5,2	3,0
PVP	0,5	-
Poly(4-vinylpyridin)-N-oxid/Copolymer von Vinylimidazol und Vinylpyrrolidon	-	0,2
Perborat	1,0	-
Phenolsulfonat	0,2	-
Wasser/Rest	bis auf 100%

Detergenzbeispiel IV

Granuläre Textilstoffreinigungszusammensetzungen gemäß der Erfindung, die die Fähigkeit des "Weichmachens durch das Waschen" bereitstellen, können wie folgt hergestellt werden:

45AS	-	10,0
LAS	7,6	-
68AS	1,3	-
45E7	4,0	-
25E3	-	5,0
Coco-alkyl-dimethylhydroxyethylammoniumchlorid	1,4	1,0
Citrat	5,0	3,0
Na-SKS-6	-	11,0
Zeolithe A	15,0	15,0
MA/AA	4,0	4,0
DETPMP	0,4	0,4
Perborat	15,0	-
Percarbonat	-	15,0
TAED	5,0	5,0
Smectit-Ton	10,0	10,0
HMWPEO	-	0,1
erfindungsgemäßes Enzym	0,10	0,05
Silicat	3,0	5,0
Carbonat	10,0	10,0
granulärer Schaumunterdrücker	1,0	4,0
CMC	0,2	0,1
Wasser/Rest	bis auf 100%

Detergenzbeispiel V

Erfindungsgemäße Textilstoffreinigungszusammensetzungen für schwere Verschmutzungen können wie folgt hergestellt werden:

	I	II
LAS-Säureform	-	25,0
Citronensäure	5,0	2,0
25AS-Säureform	8,0	-
25AE2S-Säureform	3,0	-
25AE7	8,0	-
CFAA	5	-
DETPMP	1,0	1,0
Fettsäure	8	-
Oleinsäure	-	1,0
Ethanol	4,0	6,0
Propandiol	2,0	6,0
erfindungsgemäßes Enzym	0,10	0,05
Coco-alkyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid	-	3,0
Smectit-Ton	-	5,0
PVP	2,0	-
Wasser/Rest	bis auf 100%

Lederindustrie-Anwendungen
Eine erfindungsgemäße Subtilase kann in der Lederindustrie, insbesondere zur Verwendung bei der Depilation von Häuten, verwendet werden.
Bei der Anwendung wird vorzugsweise eine erfindungsgemäße Subtilasevariante in einer Enzymzusammensetzung verwendet, die weiterhin eine andere Protease umfasst.
Für eine ausführliche Beschreibung von geeigneten weiteren Proteasen siehe den Abschnitt, der geeignete Enzyme zur Verwendung in einer Detergenzzusammensetzung betrifft (vide supra).
Wollindustrie-Anwendungen
Eine erfindungsgemäße Subtilase kann in der Wollindustrie insbesondere zur Verwendung bei der Reinigung von Kleidungsstücken, die Wolle umfassen, verwendet werden.
Bei der Anwendung wird vorzugsweise eine erfindungsgemäße Subtilasevariante in einer Enzymzusammensetzung verwendet, die weiterhin eine andere Protease umfasst.
Für eine ausführliche Beschreibung von geeigneten anderen Proteasen siehe den Abschnitt, der geeignete Proteine zur Verwendung in einer Detergenzzusammensetzung betrifft (vide supra).
Die Erfindung wird in weiteren Einzelheiten in den folgenden Beispielen beschrieben, die keineswegs zur Einschränkung des Umfangs der Erfindung, wie beansprucht, gedacht sind.
Materialien und Methoden
Stämme:

B. subtilis DN1885 (Diderichsen et al., 1990).
B. lentus 309 und 147 sind spezielle Stämme von Bacillus lentus, hinterlegt bei der NCIP und mit den Zugriffsnummern NCIB 10309 und 10147 versehen und in der US-Patentschrift Nr. 3 723 250 beschrieben, die hierdurch Bezugnahme mit umfasst ist.
E. coli MC 1000 (M. J. Casadaban und S. N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138 179–207) wurde r^–, m⁺ durch herkömmliche Verfahren gemacht und ist auch in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 039 298 beschrieben.

Plasmide:

pJS3: E. coli – B. subtilis-Shuttle-Vektor, der ein synthetisches Gen enthält, das Subtilase 309 codiert (beschrieben von Jacob Schiødt et al. in Protein and Peptide letters 3: 39–44 (1996)).
pSX222: B. subtilis-Expressionsvektor (beschrieben in WO 96/34946 ).

Allgemeine molekularbiologische Verfahren:
Wenn nicht anderweitig angegeben, wurden die DNA-Manipulationen und -Transformationen unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.), "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. und Cutting, S. M. (Hrsg.), "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Enzyme für DNA-Manipulationen wurden gemäß den Angaben der Einzelhändler verwendet.
Enzyme für die DNA-Manipulationen
Wenn nicht anderweitig angegeben, wurden sämtliche Enzyme für DNA-Manipulationen, wie z. B. Restriktionsendonukleasen, Ligasen etc. von New England Biolabs, Inc. erhalten.
Proteolytische Aktivität
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird die proteolytische Aktivität in Kilo NOVO Proteasen Units (KNPU) ausgedrückt. Die Aktivität wird relativ zu einem Enzymstandard (SAVINASEÔ) bestimmt, und die Bestimmung beruht auf dem Verdau einer Dimethylcasein(DMC)-Lösung durch das proteolytische Enzym bei Standardbedingungen, d. h. 50°C, pH 8,3, 9 min Reaktionszeit, 3 min Messzeit. Eine Broschüre AF 220/1 ist auf Nachfrage von der Firma Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich, wobei die Broschüre hier durch Bezugnahme mit umfasst ist.
Ein GU ist eine Glycineinheit, definiert als die proteolytische Enzymaktivität, die, unter Standardbedingungen, während einer 15-minütigen Inkubation bei 40°C mit N-Acetylcasein als Substrat eine Menge an NH₂-Gruppen produziert, die 1 mMol Glycin entspricht.
Die Enzymaktivität kann auch unter Verwendung des PNA-Assays gemäß der Umsetzung mit dem löslichen Substrat Succinyl-alanin-alanin-prolin-phenyl-alanin-para-nitrophenol gemessen werden, das in Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T. M., Goodlander, B. D., Garrison, P. H. und Smith, L. A. (1988), beschrieben ist.
Fermentation:
Die Fermentation von Subtilaseenzymen wurde bei 30°C auf einem Rotationsschütteltisch (300 U/min) in 500-ml-Schikane-Erlenmeyerkolben, die 100 ml BPX-Medium enthielten, 5 Tage lang durchgeführt.
Folglich wurden, um z. B. 2 Liter Brühe herzustellen, 20 Erlenmeyer-Kolben gleichzeitig fermentiert. Medien:

BPX: Zusammensetzung (pro Liter)

Kartoffelstärke 100 g

gemahlene Gerste 50 g

Sojamehl 20 g

Na₂HPO₄ × 12H₂O 9 g

Pluronic 0,1 g

Natriumcaseinat 10 g
Die Stärke in dem Medium wird mit α-Amylase verflüssigt, und das Medium wird durch Erhitzen bei 120°C für 45 Minuten sterilisiert. Nach der Sterilisation wird der pH des Mediums durch Zugabe von NaHCO₃ bis auf 0,1 M auf 9 eingestellt.
Beispiele
Beispiel 1
Konstruktion und Expression der Enzymvarianten:
Ortsgerichtete Mutagenese:
Subtilase 309-ortsgerichtete Varianten wurden durch die "Unique site elimination (USE)" bzw. die "Uracil-USE"-Technik, beschrieben von Deng et al. (Anal. Biochem. 200: 81–88 (1992)) und Markvardsen et al. (BioTechniques 18 (3): 371–372 (1995)), hergestellt.
Das Templat-Plasmid war pJS3 oder ein Analog von diesem, das eine Variante von Subtilase 309 enthielt, z. B. wurde die USE-Mutagenese an einem pJS3-Analog durchgeführt, das ein Gen enthielt, das die N252L-Variante codiert, mit einem auf das Konstrukt einer T255I-Variante gerichteten Oligonukleotid, was zu einer finalen N252L + T255I Subtilase 309-Variante führte.
Die pJS3-konstruierte Subtilase 309-Varianten wurden dann in das B. subtilis pSX222-Expressionsplasmid unter Verwendung der Restriktionsenzyme KpnI und MluI subkloniert.
Lokalisierte statistische Mutagenese:
Die Gesamtstrategie, die verwendet wird, um lokalisierte statistische Mutagenese durchzuführen, lautete:
Ein mutagener Primer (Oligonukleotid) wurde synthetisiert, der dem Teil der zu mutagenisiererenden DNA-Sequenz entspricht, mit Ausnahme der Nukleotid(e) entsprechend dem Aminosäurecodon (Aminosäurecodons), die zu mutagenisieren sind.
Anschließend wurde der resultierende mutagene Primer in einer PCR-Reaktion mit einem geeigneten Primer-Gegenstück verwendet. Das resultierende PCR-Fragment wurde aufgereinigt und verdaut und in einen E. coli-B. subtilis-Shuttle-Vektor kloniert.
Alternativ, und sofern notwendig, wird das resultierende PCR-Fragment in einer zweiten PCR-Reaktion als ein Primer mit einem zweiten geeigneten Primergegenstück verwendet, sodass der Verdau und die Klonierung der mutagenisierten Region in den Shuttlevektor erlaubt ist. Die PCR-Reaktionen werden unter normalen Bedingungen durchgeführt.
Unter Befolgung dieser Strategie wurde eine lokalisierte statistische Bibliothek in SAVINASE konstruiert, wobei die Positionen N252, T255 und S259 vollständig randomisiert waren.
Ein Oligonukleotid wurde mit 25% von jeder der vier Basen (N) in der ersten und der zweiten Base an den Aminosäurecodons, deren Mutagenese gewünscht war, synthetisiert. Das dritte Nukleotid (die Wobble-Base) in Codons wurde mit 50% G/50% C (S) synthetisiert, um zwei (TAA, TGA) der drei Stoppcodons zu vermeiden.
Der mutagene Primer (5'-C TTC TGC GTT AAC AAG TCC GCT TCC ATA CAA GTT CGT SNN TCC TAA ACT SNN TGC CGT SNN CTT TAG ATG ATT-3' (anti-sense) wurde bei einer PCR-Reaktion mit einem geeigneten gegenläufigen Primer (z. B. 5' GAA CTC GAT CCA GCG ATT TC 3' (sense)) und dem Plasmid pJS3 als Template verwendet. Dieses resultierende PCR-Produkt wurde in den pJS3-Shuttle-Vektor unter Verwendung der Restriktionsenzyme XhoI und HpaI kloniert.
Die pJS3-konstruierte lokalisierte statistische Bibliothek wurde dann in das B. subtilis pSX222-Expressionsplasmid unter Verwendung der Restriktionsenzyme KpnI und MluI subkloniert.
Die hergestellte Bibliothek enthielt ungefähr 100 000 individuelle Klone/Bibliothek.
Zehn statistisch gewählte Kolonien wurden sequenziert, um die bezeichneten Mutationen zu bestätigen.
Um eine erfindungsgemäße Subtilasevariante aufzureinigen, wurde das B. subtilis pSX222-Expressionsplasmid, das eine Variante der Erfindung einschloss, in einen kompetenten B. subtilis-Stamm transformiert und wie vorstehend beschrieben in einem Medium fermentiert, das 10 μg/ml Chloramphenicol (CAM) enthielt.
Beispiel 2
Aufreinigung der Enzymvarianten:
Diese Vorgehensweise betrifft die Aufreinigung einer Fermentation im 2-Liter-Maßstab des Enzyms Subtilisin 147, des Enzyms Subtilisin 309 oder von Mutanten davon.
Ungefähr 1,6 Liter Fermentationslösung wurden bei 5 000 U/min 35 Minuten in 1-Liter-Bechergläsern zentrifugiert. Die Überstände wurden unter Verwendung von 10% Essigsäure auf pH 6,5 eingestellt und auf Seitz Supra S100-Filterplatten filtriert.
Die Filtrate wurden unter Verwendung einer Amicon CH2A UF-Einheit, ausgestattet mit einer Amicon S11Y10 UF-Patrone, auf ungefähr 400 ml konzentriert. Das UF-Konzentrat wurde vor der Absorption bei Raumtemperatur über eine Bacitracin-Affinitätssäule bei pH 7 zentrifugiert und filtriert. Die Protease wurde von der Bacitracin-Säule bei Raumtemperatur unter Verwendung von 25% 2-Propanol und 1 M Natriumchlorid in einer Pufferlösung mit 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,1 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 7, eluiert.
Die Fraktionen mit Proteaseaktivität aus dem Bacitracin-Aufreinigungsschritt wurden vereinigt und auf eine 750-ml-Sephadex G25-Säule (5 cm Durchmesser) aufgebracht, die mit einem Puffer äquilibriert war, der 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 6,5, enthielt.
Fraktionen mit proteolytischer Aktivität von der Sephadex G25-Säule wurden vereinigt und auf eine 150 ml CM Sepharose CL 6B-Kationenaustauschersäule (5 cm Durchmesser) aufgebracht, die mit einem Puffer äquilibriert war, der 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 6,5, enthielt.
Die Protease wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–0,1 M Natriumchlorid in 2 Litern des gleichen Puffers (0–0,2 M Natriumchlorid im Falle von Subtilisin 147) eluiert.
In einem finalen Aufreinigungsschritt wurde die Protease, die Fraktionen aus der CM Sepharose-Säule enthielt, vereinigt und in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle konzentriert, die mit einer GR81PP-Membran (von Danish Sugar Factories Inc.) ausgestattet war.
Unter Verwendung der Techniken von Beispiel 1 für die Konstruktion und das obige Isolationsverfahren wurden die folgenden Subtilisin 309-Varianten hergestellt und isoliert:
N252L + T255I
N252V + T255A
N252M + T255C + S259H
N252S + T255E + S259C und
N252K + T255S + S259C.
Beispiel 3
Waschleistung von Detergenzzusammensetzungen, die Enzymvarianten enthalten
Die folgenden Beispiele stellen Ergebnisse für eine Anzahl von Waschtests bereits, die unter den angegebenen Bedingungen durchgeführt wurden.
Experimentelle Bedingungen

Tabelle VI: Experimentelle Bedingungen zur Bewertung von Subtilisin 309-Varianten.

Detergenz	Protease-Modell Detergenz 95
Detergenzdosis	3,0 g/l
pH	10,5
Waschzeit	15 min
Temperatur	15°C
Wasserhärte	6° dH
Enzyme	Subtilisin 309-Varianten wie unten aufgeführt
Enzymkonzentration	10 nM
Testsystem	150-ml-Glasbecher mit Rührstab
Textilie/Volumen	5 Textilstücke (⌀ 2,5 cm) in 50 ml Detergenz
Testmaterial	EMPA117 vom Zentrum für Testmaterialien, Holland

Das verwendete Detergenz ist eine einfache Modellformulierung. Der pH wird auf 10,5 eingestellt, was innerhalb des normalen Bereichs für ein Waschpulver liegt. Die Zusammensetzung des Modell-Detergenz 95 ist wie folgt:

25% STP (Na₅P₃O₁₀)

25% Na₂SO₄

10% Na₂CO₃

20% LAS (Nansa 80S)

5,0% nicht-ionisches Tensid (Dobanol 25-7)

5,0% Na₂Si₂O₅

0,5% Carboxymethylcellulase (CMC)

9,5% Wasser
Die Wasserhärte wurde durch Zugabe von CaCl₂ und MgCl₂ (Ca²⁺:Mg²⁺ = 2:1) zu deionisiertem Wasser eingestellt (siehe auch Surfactants in Consumer Products – Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1986). Der pH der Detergenzlösung wurde durch Zugabe von HCl auf pH 10,5 eingestellt.
Die Messung der Reflektanz (R) auf dem Testmaterial erfolgte bei 460 nm unter Verwendung eines Macbeth ColorEye 7000-Photometers (Macbeth, Division of Kollmorgen Instruments Corporation, Deutschland). Die Messungen erfolgten nach dem Protokoll des Herstellers.
Die Waschleistung der Subtilisin 309-Varianten wurde durch Berechnung eines Leistungsfaktors bewertet:

P:: Leistungsfaktor
R_Variant:: Reflektanz von Testmaterial, das mit Variante gewaschen wurde
R_Savinase:: Reflektanz von Testmaterial, das mit Savinase^® gewaschen wurde
R_Blank:: Reflektanz von Testmaterial, das ohne Enzym gewaschen wurde

Die beanspruchten Subtilisin 309-Varianten besitzen im Vergleich zu Savinase^® alle verbesserte Waschleistung – d. h. P > 1.
Die Varianten werden in Verbesserungsklassen eingeteilt, die mit Großbuchstaben bezeichnet werden.

Klasse A: 1 < P ≤ 1,5
Klasse B: 1,5 < P ≤ 2
Klasse C: P > 2

Verbesserungsklasse	Varianten
A	N252L + T255I
	N252V + T255A
	N252M + T255C + S259H
	N252S + T255E + S259C
	N252K + T255S + S259C
B
C

Claims

Subtilaseenzymvariante, abgeleitet aus einer parentalen Subtilase mit verbesserter Waschleistung in Detergentien verglichen mit der parentalen Subtilase, umfassend mindestens eine Substitution ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, in BASBPN-Nummerierung: 252L + 255I 252V + 255A 252M + 255C + 259H 2525 + 255E + 259C 252K + 255S + 259C.
Subtilaseenzymvariante nach Anspruch 1, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus, in BASBPN-Nummerierung: N252L + T255I N252V + T255A N252M + T255C + S259H N252S + T255E + S259C N252K + T255S + S259C.
Variante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 2, wobei die parentale Subtilase ausgewählt aus der Untergruppe I-S1 ist.
Variante nach Anspruch 3, wobei die parentale Subtilase ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend ABSS168, BASBPN, BSSDY und BLSCAR.
Variante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 2, wobei die parentale Subtilase ausgewählt ist aus der Untergruppe I-S2.
Variante nach Anspruch 5, wobei die parentale Subtilase ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend BLS147, BLS309, BAPB92, TVTHER und BYSYAB.
Variante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Substitution(en) kombiniert ist/sind mit einer oder mehreren Modifikation(en) in einer oder mehreren der Positionen 27, 36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 129, 131, 133, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 und 274.
Variante nach Anspruch 7, wobei die Subtilase zur Untergruppe I-S2 gehört, und die weitere Veränderung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus K27R, *36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, P129K, P131H, A133P, A133D, Y167A, Y167I, R170S, R170L, R170N, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L und T274A.
Variante nach Anspruch 8, umfassend eine beliebige der Substitutionen V104N + S101G, K27R + V104Y + N123S + T274A oder N76D + V104A, oder andere Kombinationen dieser Mutationen (V104N, S101G, K27R, V104V, N123S, T274A, N76D, V104A), in Kombination mit einer beliebigen oder mehreren beliebigen der Substitutionen und/oder Insertionen, die in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8 erwähnt werden.
Isolierte DNA-Sequenz, die eine Subtilasevariante eines beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 kodiert.
Expressionsvektor umfassend eine isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 10.
Mikrobielle Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 11.
Mikrobieller Wirt nach Anspruch 12, der ein Bakterium ist.
Mikrobieller Wirt nach Anspruch 13, der ein Bacillus lentus ist.
Mikrobieller Wirt nach Anspruch 12, der ein Pilz oder eine Hefe ist.
Mikrobieller Wirt nach Anspruch 15, der ein Aspergillus ist.
Verfahren zum Herstellen einer Variante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9, wobei ein Wirt nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 16 unter Bedingungen kultiviert wird, die der Expression und Sekretion der Variante förderlich sind, und die Variante gewonnen wird.
Zusammensetzung umfassend eine Subtilasevariante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, die weiterhin eine Cellulase, Lipase, Cutinase, Oxidoreduktase, eine andere Protease oder eine Amylase umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Zusammensetzung eine Detergenszusammensetzung ist.
Verwendung einer Subtilasevariante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9, oder einer Enzymzusammensetzung nach einem beliebigen der Ansprüche 18 bis 20 in einem Wasch- und/oder Geschirrspüldetergens.