DE69936934T2 - Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen, mit einem zusätzlichen aminosäurerest in einer aktiven schleifenregion - Google Patents

Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen, mit einem zusätzlichen aminosäurerest in einer aktiven schleifenregion Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung betrifft neue Subtilaseenzyme der Untergruppen I-S1 und I-S2, welche einen oder zwei zusätzliche(n) Aminosäurerest(e) an Position 100 der Schleife (Loop) (b) der Region der aktiven Zentrums von Position 95-103 aufweisen. Diese Proteasen sind dadurch nützlich, dass sie eine exzellente oder verbesserte Waschleistung aufweisen, wenn sie in Detergenzien, in Reinigungs- und Detergenszusammensetzungen verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Gene, die die Expression dieser Enzyme kodieren, wenn sie in eine geeignete Wirtszelle oder einen Organismus insertiert werden; und solche Wirtszellen, die damit transformiert sind und die Fähigkeit besitzen, die Enzymvarianten zu exprimieren, und Verfahren zum Herstellen der neuen Enzyme.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In der Detergens-Industrie werden Enzyme seit mehr als 30 Jahren in Waschmittelzubereitungen eingesetzt. Enzyme, die in solchen Zubereitungen verwendet werden, umfassen Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen, und andere Enzyme oder Mischungen davon. Die kommerziell wichtigsten Enzyme sind Proteasen.
  • Eine steigende Anzahl von kommerziell verwendeten Proteasen sind bezüglich der Proteine technisch veränderte Varianten von natürlicherweise vorkommenden Wildtyp-Proteasen, z. B. DURAZYM® (Novo Nordisk A/S), RELASE® (Novo Nordisk A/S), MAXAPEM® (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT® (Genencor International, Inc.).
  • Weiterhin sind im Stand der Technik eine Anzahl von Proteasevarianten beschrieben, wie in EP 130756 (GENENTECH) (entsprechend dem US-Reissue-Patent Nr. 34,606 (GENENCOR); EP 214435 (HENKEL); WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX); EP 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell, und Fersht (1985) Nature 318 375-376 ; Thomas, Russell, und Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193 803-813; Russell und Fersht Nature 328 496-500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S.A.); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); US 5,543,302 (SOLVAY S.A.); EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S); WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S); EP 525 610 A1 (SOLVAY); und WO 94/02618 (GIST-BROCADES N.V.).
  • Jedoch besteht, obwohl eine Anzahl nützlicher Proteasevarianten beschrieben wurde, immer noch ein Bedarf an neuen verbesserten Proteasen oder Proteasevarianten für eine Anzahl von industriellen Verwendungen.
  • Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Proteasevarianten oder bezüglich der Proteine technisch veränderte Proteasevarianten bereitzustellen, besonders zur Verwendung in der Detergensindustrie.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die derzeitigen Erfinder haben gefunden, dass Subtilisine, in denen mindestens eine der Schleifen (Loops) des aktiven Zentrums länger ist als die, die zurzeit bekannt sind, verbesserte Waschleistungseigenschaften in Detergenszusammensetzungen aufweisen. Die Identifizierung davon wurde durchgeführt, indem Subtilisinvarianten konstruiert wurden, besonders von Subtilisin 309 (BLSAVI oder Savinase®), die verbesserte Waschleistungseigenschaften in Detergenszusammensetzungen in Bezug auf das Eltern-Wildtyp-Enzym aufweisen. Dieses wurde in unserer früheren Anmeldung DK 1332/97 beschrieben.
  • Es wurde jetzt gefunden, dass bestimmte Subtilasen oder Varianten davon der Untergruppen I-S1 (echte „Subtilisine") und I-S2 (hochalkalische Subtilisine), die einen oder zwei zusätzliche(n) Aminosäurerest(e) in Position 100 (oder eher zwischen Positionen 100 und 101) der Schleife (b) der Region des aktiven Zentrums von Position 95 bis 103 haben, überraschend verbesserte Waschleistung im Vergleich zu den derzeit bekannten und denen, die in besagter Anmeldung beschrieben werden, aufweisen.
  • Die erfindungsgemäßen verbesserten Proteasen können durch Isolierung aus natürlichen Quellen oder durch das Einfügen von einem oder zwei weiteren Aminosäurerest(en) (eine Insertion) in die Schleife (b) des aktiven Zentrums zwischen Positionen 100 und 101 in einer Wildtyp-Subtilase erhalten werden (für eine Definition der Schleife des aktiven Zentrums und der Nummerierung der Positionen siehe unten).
  • Obwohl dieser Befund in Subtilisin 309 gemacht wurde, wird vorhergesagt, dass es möglich sein wird, ähnliche vorteilhafte Subtilasen oder Subtilasevarianten herzustellen oder zu isolieren.
  • Weiterhin wird es möglich sein, spezifisch natürliche Isolate zu „screenen", um neue Wildtyp-Subtilasen zu identifizieren, die eine Schleife (b) des aktiven Zentrums umfassen, welche länger ist als die entsprechende Schleife des aktiven Zentrums in bekannten Wildtyp-Subtilasen wie Subtilisin 309, von welchen Subtilasen angenommen werden kann, dass sie einen insertierten Aminosäurerest zwischen Positionen 100 und 101 haben, und exzellente Waschleistung in einem Detergens im Vergleich zu ihrem nächstverwandten bekannten Subtilisin wie Subtilisin 309 aufweisen.
  • Was das „Alignment" und die Nummerierung betrifft, wird auf die nachstehenden 1, 1a, 2 und 2a verwiesen, die Alignments zwischen Subtilisin BPN' (BASBPN) (a) und Subtilisin 309 (BLSAVI) (b), und Alignments zwischen Subtilisin BPN' (a) (BASBPN) und Subtilisin Carlsberg (g) (BLSCAR) zeigen. In 1 und 2 wurden die Alignments unter Verwendung der GAP-Routine des GCG-Pakets wie nachstehend gezeigt erstellt, wobei die Alignments von 1a und 2a dieselben sind wie in WO 91/00345 gezeigt. Diese Alignments werden in dieser Patentanmeldung als eine Referenz zum Nummerieren der Reste verwendet.
  • Die sieben Schleifen des aktiven Zentrums (a) bis (g) (einschließlich beider gezeigter endständiger Aminosäurereste) werden hier definiert als umfassend die Aminosäurereste in den Abschnitten, die nachstehend genannt werden:
    • (a) die Region zwischen Aminosäurerest 33 und 43;
    • (b) die Region zwischen Aminosäurerest 95 und 103;
    • (c) die Region zwischen Aminosäurerest 125 und 132;
    • (d) die Region zwischen Aminosäurerest 153 und 173;
    • (e) die Region zwischen Aminosäurerest 181 und 195;
    • (f) die Region zwischen Aminosäurerest 202 und 204;
    • (g) die Region zwischen Aminosäurerest 218 und 219.
  • In Übereinstimmung damit bezieht sich die Erfindung in einem ersten Gegenstand auf ein isoliertes (d.h. mehr als 10 % reines) Subtilaseenzym der Untergruppen I-S1 und I-S2, welches einen oder zwei zusätzliche(n) Aminosäurerest(e) an Position 100 der Schleife (b) der Region des aktiven Zentrums von Position 95 bis 103 aufweist, wobei der/die zusätzliche(n) Aminosäurerest(e) der Insertion von einem oder zwei Aminosäurerest(en) zwischen den Positionen 100 und 101 entspricht/entsprechen.
  • In einem zweiten Gegenstand bezieht sich die Erfindung auf eine isolierte DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante kodiert. In einem dritten Gegenstand betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor, der eine isolierte DNA-Sequenz umfasst, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante kodiert.
  • In einem vierten Gegenstand bezieht sich die Erfindung auf eine mikrobielle Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor gemäß dem vierten Gegenstand transformiert ist.
  • In einem weiteren Gegenstand bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung der erfindungsgemäßen Subtilisinenzyme.
  • Die erfindungsgemäßen Enzyme können allgemein entweder durch Kultivierung eines mikrobiellen Stamms, von dem das Enzym isoliert wurde, und Gewinnen des Enzyms in im Wesentlichen reiner Form hergestellt werden; oder durch Insertieren eines Expressionsvektors gemäß dem vierten erfindungsgemäßen Gegenstand in einen geeigneten mikrobiellen Wirt, Kultivieren des Wirts, um das gewünschte Subtilaseenzym zu exprimieren, und Gewinnen des Enzymprodukts.
  • Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Subtilase oder Subtilasevariante umfasst.
  • Noch weiter bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Enzyme für eine Anzahl von relevanten industriellen Verwendungen, insbesondere zur Verwendung in Reinigungszusammensetzungen und Reinigungszusammensetzungen, die die Enzym-Mutanten umfassen, besonders Detergenszusammensetzungen, die die Subtilisinenzym-Mutanten umfassen.
  • DEFINITIONEN
  • Bevor diese Erfindung in weiteren Einzelheiten diskutiert wird, werden zuerst die folgenden Begriffe und Übereinkommen definiert. NOMENKLATUR VON AMINOSÄUREN
    A= Ala= Alanin
    V= Val= Valin
    L= Leu= Leucin
    I= Ile= Isoleucin
    P= Pro= Prolin
    F= Phe= Phenylalanin
    W= Trp= Tryptophan
    M= Met= Methionin
    G= Gly= Glycin
    S= Ser= Serin
    T= Thr= Threonin
    C= Cys= Cystein
    Y= Tyr= Tyrosin
    N= Asn= Asparagin
    Q= Gln= Glutamin
    D= Asp= Asparaginsäure
    E= Glu= Glutaminsäure
    K= Lys= Lysin
    R= Arg= Arginin
    H= His= Histidin
    x= Xaa= Beliebige Aminosäure
    NOMENKLATUR VON NUKLEINSÄUREN
    A= Adenin
    G= Guanin
    C= Cytosin
    T= Thymin (nur in DNA)
    U= Uracil (nur in RNA)
  • NOMENKLATUR UND ÜBEREINKOMMEN ZUR BEZEICHNUNG VON VARIANTEN
  • Beim Beschreiben der verschiedenen Enzymvarianten, die erfindungsgemäß hergestellt oder in Erwägung gezogen werden, wurden zur Erleichterung der Bezugnahme die folgenden Nomenklaturen und Übereinkommen angepasst:
    Ein Bezugsrahmen wird zuerst durch Alignment der isolierten oder Eltern-Wildtyp-Enzyme mit Subtilisin BPN' (BASBPN) definiert.
  • Das Alignment kann durch die GAP-Routine des GCG-Pakets Version 9.1 erhalten werden, um die Varianten unter Verwendung der folgenden Parameter zu nummerieren: „gap creation penalty" = 8 und „gap extension penalty" = 8, wobei alle anderen Parameter bei ihren vorgegebenen Werten gehalten werden.
  • Ein anderes Verfahren ist es, bekannte erkannte Alignments zwischen Subtilasen zu verwenden, wie das in WO 91/00345 gezeigte Alignment. In den meisten Fällen werden die Unterschiede nicht von Wichtigkeit sein.
  • Solche Alignments zwischen jeweils Subtilisin BPN' (BASBPN) und Subtilisin 309 (BLSAVI) und Subtilisin Carlsberg (BLSCAR) sind in 1, 1a, 2 und 2a gezeigt. Sie definieren eine Anzahl von Deletionen und Insertionen in Bezug auf BASBPN. In 1 hat Subtilisin 309 6 Deletionen in den Positionen 36, 58, 158, 162, 163 und 164 im Vergleich zu BASBPN, während in 1a Subtilisin 309 dieselben Deletionen in den Positionen 36, 56, 159, 164, 165 und 166 im Vergleich zu BASBPN hat. In 2 hat Subtilisin Carlsberg eine Deletion in Position 58 im Vergleich zu BASBPN, wobei in 2a Subtilisin Carlsberg die eine Deletion in Position 56 im Vergleich zu BASBPN hat. Diese Deletionen werden in 1, 1a, 2 und 2a durch Sternchen (*) angezeigt.
  • Die verschiedenen Modifikationen, die in einem Wildtyp-Enzym durchgeführt werden, werden allgemein unter Verwendung von drei Bestandteilen wie folgt gezeigt:
  • Ursprüngliche Aminosäure Position substituierte Aminosäure
  • Die Schreibweise G195E bedeutet daher eine Substitution eines Glycins in Position 195 mit einer Glutaminsäure.
  • Im Fall, dass der ursprüngliche Aminosäurerest ein beliebiger Aminosäurerest sein kann, kann manchmal eine verkürzte Schreibweise verwendet werden, die nur die Position und substituierte Aminosäure zeigt,
    Position substituierte Aminosäure
  • So eine Schreibweise ist besonders relevant in Verbindung mit Modifikation(en) in homologen Subtilasen (vide infra).
  • Auf ähnliche Weise, wenn die Identität der substituierenden Aminosäure(n) unwesentlich ist,
    ursprüngliche Aminosäure Position
  • Wenn sowohl die ursprüngliche(n) Aminosäure(n) und substituierte Aminosäure(n) irgendeine Aminosäure umfassen kann, dann wird nur die Position gezeigt, z. B.: 170.
  • Wenn die ursprüngliche Aminosäure(n) und/oder substituierte Aminosäure(n) mehr als eine, aber nicht alle Aminosäure(n) umfassen kann, dann werden die ausgewählten Aminosäuren in Klammern { } gezeigt,
    ursprüngliche Aminosäure Position {substituierte Aminosäurel, ... substituierte Aminosäuren}
  • Für spezifische Varianten werden die spezifischen Drei- oder Ein-Buchstabencodes verwendet, einschließlich der Codes Xaa und X, um einen beliebigen Aminosäurerest anzuzeigen.
  • SUBSTITUTIONEN:
  • Die Substitution von Glutaminsäure für Glycin in Position 195 wird bezeichnet als:
    Gly195Glu oder G195E
    oder die Substitution eines beliebigen Aminosäurerests für Glycin in Position 195 wird bezeichnet als:
    Gly195Xaa oder G195X
    oder
    Gly195 oder G195
  • Die Substitution von Serin für einen beliebigen Aminosäurerest in Position 170 würde daher bezeichnet werden
    Xaa170Ser oder X170S.
    oder
    170Ser oder 170S
  • So eine Schreibweise ist besonders relevant im Zusammenhang mit Modifikation(en) in homologen Subtilasen (vide infra). 170Ser soll daher bedeuten, dass z. B. sowohl eine Lys170Ser-Modifikation in BASBPN und Arg170Ser-Modifikation in BLSAVI umfasst wird (siehe 1).
  • Für eine Modifikation, bei der die ursprüngliche(n) Aminosäure(n) und/oder substituierte(n) Aminosäure(n) mehr als eine, aber nicht alle Aminosäure(n) umfassen kann, würde die Substitution von Glycin, Alanin, Serin oder Threonin für Arginin in Position 170 gezeigt werden durch
    Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr} oder R170 {G,A,S,T}
    um die Varianten anzuzeigen,
    R170G, R170A, R170S; und R170T.
  • DELETIONEN:
  • Eine Deletion von Glycin in Position 195 wird angezeigt werden durch:
    Gly195* oder G195*
  • Entsprechend wird die Deletion von mehr als einem Aminosäurerest, wie die Deletion von Glycin und Leucin in Positionen 195 und 196 bezeichnet werden als
    Gly195*+Leu196* oder G195*+L196*
  • INSERTIONEN:
  • Die Insertion eines zusätzlichen Aminosäurerests wie z. B. ein Lysin nach G195 ist:
    Gly195GlyLys oder G195GK; oder
    wenn mehr als ein Aminosäurerest insertiert wird, wie z. B. ein Lys, Ala und Ser nach G195, ist das:
    Gly195GlyLysAlaSer oder G195GKAS
  • In solchen Fällen wird/werden der/die insertierte(n) Aminosäurerest(e) durch Hinzufügen von Kleinbuchstaben zur Zahl der Position des Aminosäurerests, der dem insertierten Aminosäurerest(en) vorangeht, nummeriert. Im vorstehenden Beispiel wären damit die Sequenzen 194 bis 196:
    194 195 196
    BLSAVI A- G- L
    194 195 195a 195b 195c 196
    Variante A- G- K- A- S- L
  • In Fällen, in denen ein Aminosäurerest insertiert wird, der identisch zum bestehenden Aminosäurerest ist, ist klar, dass ein Fall von Degeneration der Nomenklatur entsteht. Wenn z. B. ein Glycin nach dem Glycin im vorstehend genannten Beispiel insertiert wird, wäre dies gezeigt durch G195GG. Dieselbe tatsächliche Änderung könnte genauso angezeigt werden als A194AG für die Änderung von
    194 195 196
    BLSAVI A- G- L
    nach 194 195 195a 196
    Variante A- G- G- L
    194 194a 195 196
  • Solche Beispiele werden dem Fachmann ersichtlich sein, und die Bezeichnung G195GG und entsprechende Bezeichnungen für diesen Typ von Insertionen sollen daher bedeuten, auch solche äquivalenten degenerierten Bezeichnungen zu umfassen.
  • FÜLLEN EINER LÜCKE:
  • Wo in einem Enzym eine Deletion im Referenzvergleich mit der Subtilisin BPN'-Sequenz, die zur Nummerierung verwendet wird, besteht, wird eine Insertion in so einer Position bezeichnet als:
    *36Asp oder *36D
    für die Insertion einer Asparaginsäure in Position 36.
  • VIELFACHE MODIFIKATIONEN
  • Varianten, die vielfache Modifikationen umfassen, werden durch Pluszeichen getrennt, z. B.:
    Arg170Tyr+Gly195Glu oder R170Y+G195E
    was Modifikationen in Positionen 170 und 195 darstellt, jeweils das Substituieren von Tyrosin und Glutaminsäure für Arginin und Glycin.
  • Oder z. B. Tyr167 {Gly,Ala,Ser,Thr}+Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr} bezeichnet die Varianten
    Tyr167Gly+Arg170Gly, Tyr167Gly+Arg170Ala,
    Tyr167Gly+Arg170Ser, Tyr167Gly+Arg170Thr,
    Tyr167Ala+Arg170Gly, Tyr167Ala+Arg170Ala,
    Tyr167Ala+Arg170Ser, Tyr167Ala+Arg170Thr,
    Tyr167Ser+Arg170Gly, Tyr167Ser+Arg170Ala,
    Tyr167Ser+Arg170Ser, Tyr167Ser+Arg170Thr,
    Tyr167Thr+Arg170Gly, Tyr167Thr+Arg170Ala,
    Tyr167Thr+Arg170Ser, und Tyr167Thr+Arg170Thr.
  • Diese Nomenklatur ist besonders relevant in Bezug auf Modifikationen, die zum Ziel haben, Aminosäurereste mit spezifischen gemeinsamen Eigenschaften zu substituieren, ersetzen, insertieren oder deletieren, wie Reste mit einer positiven Ladung (K, R, H), einer negativen Ladung (D, E), oder konservative Aminosäuremodifikation(en) von z. B. Tyr167{Gly,Ala,Ser,Thr}+Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr}, was bedeutet, dass eine kleine Aminosäure für eine andere kleine Aminosäure substituiert wird. Siehe den Abschnitt „Ausführliche Beschreibung der Erfindung" für weitere Einzelheiten.
  • Proteasen
  • Enzyme, die die Amidbindungen in Proteinsubstraten spalten, werden als Proteasen klassifiziert oder (austauschbar) Peptidasen (siehe Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Kapitel 3).
  • Nummerierung von Aminosäurepositionen/-resten
  • Wenn nicht anders erwähnt wird, entspricht die hierin verwendete Aminosäurenummerierung der der Subtilase BPN'-Sequenz (BASBPN). Für eine weitere Beschreibung der BPN'-Sequenz, siehe 1 und 2, oder Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737.
  • Serinproteasen
  • Eine Serinprotease ist ein Enzym, das die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert, und in dem sich ein essentieller Serinrest im aktivem Zentrum befindet (White, Handler und Smith, 1973 „Principles of Biochemistry," fünfte Ausgabe, McGraw-Hill Book Company, NY, S. 271-272).
  • Die bakteriellen Serinproteasen haben Molekulargewichte im Bereich von 20.000 bis 45.000 Dalton. Sie werden durch Diisopropylfluorophosphat inhibiert. Sie hydrolisieren einfache, endständige Ester und sind ähnlich in Aktivität zu eukaryotischem Chymotrypsin, auch eine Serinprotease. Ein engerer Begriff, alkalische Protease, der eine Untergruppe abdeckt, spiegelt das hohe pH-Optimum von pH 9,0 bis 11,0 einiger der Serinproteasen wieder (für eine Übersicht siehe Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753).
  • Subtilasen
  • Eine Untergruppe der Serinproteasen, die vorläufig als Subtilasen bezeichnet werden, wurde von Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 und Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523 vorgeschlagen. Sie werden durch eine Homologieanalyse von mehr als 170 Aminosäuresequenzen von Serinproteasen definiert, die vorher als Subtilisinartige Proteasen bezeichnet wurden. Ein Subtilisin war vorher oft als eine Serinprotease definiert, die durch Gram-positive Bakterien oder Pilze hergestellt wird, und nach Siezen et al. ist es nun eine Untergruppe der Subtilasen. Eine breite Vielfalt von Subtilasen wurde identifiziert, und die Aminosäuresequenz einer Anzahl von Subtilasen wurde bestimmt. Für eine ausführlichere Beschreibung solcher Subtilasen und ihrer Aminosäuresequenzen wird Bezug genommen auf Siezen et al. (1997).
  • Eine Untergruppe der Subtilasen, I-S1 oder „echte" Subtilisine, umfasst die „klassischen" Subtilisine wie Subtilisin 168 (BSS168), Subtilisin BPN', Subitilisin Carlsberg (ALCALASE®, NOVO NORDISK A/S) und Subtilisin DY (BSSDY).
  • Eine weitere Untergruppe der Subtilasen, I-S2 oder hoch alkalische Subtilisine, wird durch Siezen et al. anerkannt (supra). Proteasen der Untergruppe I-S2 werden als hoch alkalische Subtilisine beschrieben und umfassen Enzyme wie Subtilisin PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Gist-Brocades NV), Subtilisin 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK A/S), Subtilisin 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVO NORDISK A/S), und alkalische Elastase YaB (BSEYAB).
  • Liste von Abkürzungen für Subtilasen:
  • I-SI
    • Subtilisin 168, BSS168 (BSSAS (Subtilisin amylosacchariticus),
    • BSAPRJ (Subtilisin J), BSAPRN (Subtilisin NAT), BMSAMP (Mesentericopeptidase),
    • Subtilisin BPN', BASBPN,
    • Subtilisin DY, BSSDY,
    • Subtilisin Carlsberg, BLSCAR (BLKERA (Keratinase), BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3),
    • BSSPRC, Serinprotease C
    • BSSPRD, Serinprotease D
  • I-S2
    • Subtilisin Sendai, BSAPRS
    • Subtilisin ALP 1, BSAPRQ,
    • Subtilisin 147, Esperase® BLS147 (BSAPRM (SubtilisinAprM), BAH101),
    • Subtilisin 309, Savinase®, BLS309/BLSAVI (BSKSMK (M-Protease),
    • BAALKP (Subtilisin PB92, alkalophile alkalische Protease aus Bacillus), BLSUBL (Subtilisin BL)),
    • Alkalische Elastase YaB, BYSYAB,
  • "SAVINASE®"
  • SAVINASE® wird von NOVO NORDISK A/S vertrieben. Es ist Subtilisin 309 von B. Lentus und unterscheidet sich von BAALKP nur in einer Position (N87S, siehe 1 hierin). SAVINASE® hat die Aminosäuresequenz, die in 1 als b) bezeichnet wird.
  • Eltern-Subtilase
  • Der Begriff „Eltern-Subtilase" beschreibt eine Subtilase, die gemäß Siezen et al. (1991 und 1997) definiert ist. Für weitere Einzelheiten siehe die unmittelbar vorstehende Beschreibung von „SUBTILASEN". Eine Eltern-Subtilase kann auch eine Subtilase sein, die aus einer natürlichen Quelle isoliert wird, wobei anschließende Modifikationen gemacht wurden, wobei die Eigenschaft einer Subtilase erhalten wird. Alternativ kann der Begriff „Eltern-Subtilase" auch als „Wildtyp-Subtilase" bezeichnet werden.
  • Modifikation(en) einer Subtilasevariante
  • Der Begriff „Modifikation(en)", wie hierin verwendet, wird so definiert, dass er chemische Modifikationen einer Subtilase und genetische Manipulationen der DNA, die die Subtilase kodiert, einschließt. Die Modifikation(en) kann ersetzen der Aminosäureseitenkette(n), Substitution(en), Deletion(en) und/oder Insertionen in oder bei der interessierenden Aminosäure(n) sein.
  • Subtilasevariante
  • Im Zusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet der Begriff Subtilasevariante oder mutierte Subtilase eine Subtilase, die von einem Organismus hergestellt wurde, der eine Gen-Mutante exprimiert, die aus einem Eltern-Mikroorganismus abgeleitet wurde, welcher ein ursprüngliches oder Eltern-Gen besaß und der ein entsprechendes Elternenzym herstellte, wobei das Elterngen mutiert wurde, um die Gen-Mutante herzustellen, von der die mutierte Subtilaseprotease hergestellt wird, wenn sie in einem geeigneten Wirt exprimiert wird.
  • Homologe Subtilasesequenzen
  • Spezifische Regionen der Schleifen des aktiven Zentrums und Aminosäureinsertionen in diesen Schleifen von SAVINASE®-Subtilase werden hierin zur Modifikation identifiziert, um eine erfindungsgemäße Subtilasevariante zu erhalten.
  • Jedoch ist die Erfindung nicht auf Modifikationen dieser speziellen Subtilase beschränkt, sondern erstreckt sich auf andere Eltern-(Wildtyp)-Subtilasen, die eine homologe Primärstruktur zu der von SAVINASE® haben. Die Homologie zwischen zwei Aminosäuresequenzen wird in diesem Zusammenhang durch den Parameter „Identität" beschrieben.
  • Um den Grad an Identität zwischen zwei Subtilasen zu bestimmen, kann die GAP-Routine des GCG-Pakets Version 9.1 (infra) unter Verwendung derselben Einstellungen angewendet werden. Das Ergebnis dieser Routine ist neben dem Aminosäure-Alignment die Berechnung der „Prozent Identität" zwischen den zwei Sequenzen.
  • Basierend auf dieser Beschreibung ist es Routinearbeit für einen Fachmann, geeignete homologe Subtilasen und entsprechende Regionen der Schleife des aktiven Zentrums zu identifizieren, die erfindungsgemäß modifiziert werden können.
  • Waschleistung
  • Die Fähigkeit eines Enzyms, den Abbau von verschiedenen natürlicherweise vorkommenden Substraten, die auf den zu reinigenden Objekten vorhanden sind, während z. B. dem Waschen oder Reinigen harter Oberflächen zu katalysieren, wird oft als seine Fähigkeit zum Waschen, Wasch-Fähigkeit, Detergiereigenschaft, oder Waschleistung bezeichnet. Innerhalb dieser Anmeldung wird der Begriff Waschleistung verwendet werden, um diese Eigenschaft einzuschließen.
  • Isolierte DNA-Sequenz
  • Der Begriff „isoliert", wenn er auf ein DNA-Sequenzmolekül angewendet wird, kennzeichnet, dass die DNA-Sequenz aus ihrer natürlichen genetischen Umgebung entfernt wurde und daher frei von anderen äußeren oder ungewollten kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form ist, die geeignet ist zur Verwendung in genetisch manipulierten Proteinherstellungssystemen. Solch isolierte Moleküle sind die, die aus ihrer natürlichen Umgebung abgetrennt werden, und schließen cDNA und genomische Klone ein.
  • Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie gewöhnlich in Verbindung gebracht werden, aber können natürlicherweise auftretende 5' und 3' untranslatierte Regionen wie Promotoren und Terminatoren einschließen. Die Identifizierung von verbundenen Regionen wird für einen Fachmann offensichtlich sein (siehe zum Beispiel Dynan und Tijan, Nature 316:774-78, 1985). Der Begriff „eine isolierte DNA-Sequenz" kann alternativ als „eine klonierte DNA-Sequenz" bezeichnet werden.
  • Isoliertes Protein
  • Wenn er auf ein Protein angewendet wird, zeigt der Begriff „isoliert" an, dass das Protein aus seiner nativen Umgebung entfernt wurde.
  • In einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere anderen homologen Proteine (d.h. „homologe Verunreinigungen" (siehe unten)).
  • Ein isoliertes Protein ist mehr als 10 % rein, bevorzugt mehr als 20 % rein, weiter bevorzugt mehr als 30 % rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt wird. Weiterhin ist es bevorzugt, das Protein in einer hoch gereinigten Form bereitzustellen, d.h. mehr als 40 % rein, mehr als 60 % rein, mehr als 80 % rein, weiter bevorzugt mehr als 95 % rein und sogar noch weiter bevorzugt mehr als 99 % rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt wird.
  • Der Begriff „isoliertes Protein" kann alternativ als „gereinigtes Protein" bezeichnet werden.
  • Homologe Verunreinigungen
  • Der Begriff „homologe Verunreinigungen" bedeutet jegliche Verunreinigung (z. B. ein anderes Polypeptid als das erfindungsgemäße Polypeptid), welches aus der homologen Zelle stammt, aus der das erfindungsgemäße Polypeptid ursprünglich erhalten wurde.
  • Erhalten aus
  • Der Begriff „erhalten aus", wie hierin in Zusammenhang mit einer spezifischen mikrobiellen Quelle verwendet, bedeutet, dass das Polynukleotid und/oder Polypeptid von der spezifischen Quelle, oder von einer Zelle, in die ein Gen aus der Quelle insertiert wurde, hergestellt wird.
  • Substrat
  • Der Begriff „Substrat", wie hierin in Zusammenhang mit einem Substrat für eine Protease verwendet, sollte in seiner breitesten Form interpretiert werden als umfassend einer Substanz, die mindestens eine Peptidbindung enthält, die gegenüber Hydrolyse durch eine Subtilisinprotease empfänglich ist.
  • Produkt
  • Die Bezeichnung „Produkt", in Zusammenhang mit einem Produkt verwendet, das aus einer enzymatischen Reaktion einer Protease erhalten wird, sollte im Zusammenhang dieser Erfindung interpretiert werden als einschließend die Produkte einer Hydrolysereaktion, die eine Subtilaseprotease einbezieht. Ein Produkt kann das Substrat in einer anschließenden Hydrolysereaktion sein.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt ein Alignment zwischen Subtilisin BPN' (a) und Savinase® (b), unter Verwendung der vorstehend beschriebenen GAP-Routine.
  • 1a zeigt das Alignment zwischen Subtilisin BPN' und Savinase, wie aus WO 91/00345 erhalten.
  • 2 zeigt ein Alignment zwischen Subtilisin BPN' und Subtilisin Carlsberg, unter Verwendung der vorstehend erwähnten GAP-Routine.
  • 2a zeigt das Alignment zwischen Subtilisin BPN' und Subtilisin Carlsberg, wie aus WO 91/00345 erhalten.
  • 3 zeigt die dreidimensionale Struktur von Savinase (Eintrag in die Proteindatenbank (PDB), „protein data bank", 1SVN). In der Abbildung ist die Schleife (b) des aktiven Zentrums angezeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In einem ersten Gegenstand beziehen sich diese erfindungsgemäßen Subtilasen auf ein isoliertes (d.h. mehr als 10 % reines) Subtilaseenzym der Untergruppen I-S1 und I-S2 mit einem oder zwei zusätzlichen Aminosäurerest(en) in Position 100 der Schleife (b) des aktiven Zentrums von Position 95 bis 103, wobei der/die zusätzliche(n) Aminosäurerest(e) der Insertion von einem oder zwei Aminosäurerest(en) zwischen Positionen 100 und 101 entspricht.
  • Mit anderen Worten sind die erfindungsgemäßen Subtilasen dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Schleife (b) der Region des aktiven Zentrums von mehr als 9 Aminosäureresten umfassen, und wobei der/die zusätzliche(n) Aminosäurerest(e) insertiert ist/sind oder betrachtet werden kann/können als insertiert zu sein zwischen Positionen 100 und 101, verglichen zur Eltern- oder einer bekannten Wildtypsubtilase.
  • Eine Subtilase gemäß des ersten Gegenstands der Erfindung kann eine Eltern- oder Wildtypsubtilase sein, die aus der Natur identifiziert und isoliert wurde.
  • Nach einer solchen Eltern-Wildtypsubtilase kann durch im Stand der Technik bekannte Standardverfahren spezifisch gescreent werden. Eine bevorzugte Art, dies zu machen, kann spezifisches PCR-Amplifizieren von DNA-Regionen sein, von denen bekannt ist, dass sie Schleifen des aktiven Zentrums in Subtilasen aus zahlreichen verschiedenen Mikroorganismen, bevorzugt verschiedenen Bacillusstämmen, kodieren.
  • Subtilasen sind eine Gruppe konservierter Enzyme im Sinn, dass ihre DNA und Aminosäuresequenzen homolog sind.
  • Dementsprechend ist es möglich, relativ spezifische Primer zu konstruieren, die Schleifen des aktiven Zentrums flankieren.
  • Eine Art, dies zu machen, ist das Untersuchen eines Alignments verschiedener Subtilasen (siehe z. B. Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523). Ausgehend davon ist es eine Routinearbeit für einen Fachmann, PCR-Primer zu konstruieren, die die Schleife des aktiven Zentrums flankieren, die der Schleife (b) des aktiven Zentrums zwischen Aminosäurerest 95 bis 103 in einer beliebigen der I-S1-Gruppe oder I-S2-Gruppen wie von BLSAVI entspricht. Durch Verwenden solcher PCR-Primer, um DNA aus einer Anzahl von verschiedenen Mikroorganismen, bevorzugt verschiedenen Bacillusstämmen, zu amplifizieren, gefolgt durch DNA-Sequenzierung der amplifizierten PCR-Fragmente, wird es möglich sein, Stämme zu identifizieren, die Subtilasen dieser Gruppen herstellen, die eine im Vergleich zu z. B. BLSAVI längere Region des aktiven Zentrums umfassen, entsprechend der Schleifenregion des aktiven Zentrums von Positionen 95 bis 103, und wo eine Insertion zwischen Positionen 100 und 101 als existierend betrachtet werden kann. Nachdem der Stamm und eine teilweise DNA-Sequenz einer solchen interessierenden Subtilase identifiziert wurde, ist es Routinearbeit für einen Fachmann, Klonieren, Expression und Reinigung solch einer erfindungsgemäßen Subtilase zu vollenden. Jedoch wird in Betracht gezogen, dass ein erfindungsgemäßes Subtilaseenzym überwiegend eine Variante einer Elternsubtilase ist.
  • In Übereinstimmung damit betrifft eine Ausführungsform der Erfindung ein isoliertes Subtilaseenzym gemäß dem ersten Gegenstand der Erfindung, wobei das Subtilaseenzym eine konstruierte Variante ist, die eine längere Schleife (b) des aktiven Zentrums als ihr Elternenzym besitzt, indem sie eine oder zwei Aminosäure(n) insertiert zwischen Aminosäureresten 100 und 101 besitzt.
  • Die erfindungsgemäßen Subtilasen weisen exzellente Waschleistung in einem Detergens auf, und, wenn das Enzym eine konstruierte Variante ist, eine verbesserte Waschleistung in einem Detergens im Vergleich zu der am nächsten zu ihr verwandten Subtilase, wie Subtilisin 309.
  • Verschiedene Subtilaseerzeugnisse werden eine verschiedene Waschleistung in verschiedenen Arten von Detergenszusammensetzungen aufweisen. Eine erfindungsgemäße Subtilase besitzt im Vergleich zu ihrer am nächsten Verwandten verbesserte Waschleistung in der Mehrzahl solch verschiedener Arten von Detergenszusammensetzungen.
  • Vorzugsweise besitzt ein erfindungsgemäßes Subtilaseenzym eine verbesserte Waschleistung im Vergleich zu seinem nächsten Verwandten in der in Beispiel 3 hierin gezeigten Waschmittelzusammensetzung (vide infra).
  • Um zu bestimmen, ob eine gegebene Subtilase-Aminosäuresequenz (wobei es unerheblich ist, ob die Subtilasesequenz eine Eltern-Wildtyp-Subtilasesequenz oder eine Subtilasesequenz einer Variante hergestellt durch irgendein anderes Verfahren als durch ortspezifische Mutagenese ist) sich innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung befindet, kann die folgende Verfahrensweise verwendet werden:
    • i) Alignment der Subtilasesequenz mit der Aminosäuresequenz von Subtilisin BPN' (siehe Abschnitt „Definitionen" hierin (vide supra));
    • ii) Basierend auf dem Alignment, das in Schritt i) durchgeführt wird, Identifizieren der Schleife (b) des aktiven Zentrums in der Subtilasesequenz, die der Schleife (b) der Region des aktiven Zentrums von Subtilisin BPN', umfassend die Region (beide endständigen Aminosäuren eingeschlossen) zwischen Aminosäurerest 95 bis 103 entspricht;
    • iii) Bestimmen, ob die Schleife (b) des aktiven Zentrums in der Subtilasesequenz, die in Schritt ii) identifiziert wird, länger ist als die entsprechende Schleife des aktiven Zentrums in BLSAVI, und ob die Verlängerung der Insertion von einem oder zwei Aminosäurerest(en) zwischen Positionen 100 und 101 entspricht.
  • Wenn dies der Fall ist, dann ist die untersuchte Subtilase eine Subtilase innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • Das im vorstehenden Schritt i) durchgeführte Alignment wird wie vorstehend beschrieben unter Verwendung der GAP-Routine durchgeführt.
  • Basierend auf dieser Beschreibung ist es eine Routinetätigkeit für einen Fachmann, die Schleife (b) des aktiven Zentrums in einer Subtilase zu identifizieren und zu bestimmen, ob die fragliche Subtilase sich innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung befindet. Wenn eine Variante durch ortspezifische Mutagenese konstruiert wird, ist es natürlich vorher bekannt, ob die Subtilasevariante sich innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung befindet.
  • Eine erfindungsgemäße Subtilasevariante kann durch im Stand der Technik bekannte Standardtechniken wie ortspezifische-/Zufalls-Mutagenese oder durch DNA-Shuffling verschiedener Subtilasesequenzen konstruiert werden. Siehe den Abschnitt „HERSTELLEN EINER SUBTILASEVARIANTE" und Material und Methoden hierin (vide infra) für weitere Einzelheiten.
  • In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung
    • 1. ein erfindungsgemäßes isoliertes Subtilaseenzym, wobei der eine oder die zwei insertierte(n) Aminosäurerest(e) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe umfassend: T, G, A und S;
    • 2. ein erfindungsgemäßes isoliertes Subtilaseenzym, wobei der eine oder die zwei insertierte(n) Aminosäurerest(e) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe von geladenen Aminosäureresten umfassend: D, E, H, K und R, weiter bevorzugt D, E, K und R;
    • 3. ein erfindungsgemäßes isoliertes Subtilaseenzym, wobei der eine oder die zwei insertierte(n) Aminosäurerest(e) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe von hydrophilen Aminosäureresten umfassend: C, N, Q, S und T, weiter bevorzugt N, Q, S und T;
    • 4. ein erfindungsgemäßes isoliertes Subtilaseenzym, wobei der eine oder die zwei insertierte(n) Aminosäurerest(e) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe von kleinen hydrophoben Aminosäureresten umfassend: A, G und V; oder
    • 5. ein erfindungsgemäßes isoliertes Subtilaseenzym, wobei der eine oder die zwei insertierte(n) Aminosäurerest(e) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe von großen hydrophilen Aminosäureresten umfassend: F, I, L, M, P, W und Y, weiter bevorzugt F, I, L, M und Y.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein erfindungsgemäßes isoliertes Subtilaseenzym, wobei die Insertion zwischen Positionen 100 und 101 zwei Aminosäuren im Vergleich zur entsprechenden Schleife des aktiven Zentrums in BLSAVI umfasst.
  • In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein isoliertes Subtilaseenzym umfassend eine Insertion ausgewählt aus der Gruppe umfassend (in BASBPN-Nummerierung):
    X100X{T, G, A, S}
    X100X{D, E, K, R}
    X100X{H, V, C, N, Q}
    X100X{F, I, L, M, P, W, Y}
    oder genauer für Subtilisin 309 und nahe verwandte Subtilasen wie BAALKP, BLSUBL, und BSKSMK
    G100GA
    G100GT
    G100GG
    G100GS

    G100GD
    G100GE
    G100GK
    G100GR

    G100GH
    G100GV
    G100GC
    G100GN

    G100GQ
    G100GF
    G100GI
    G100GL
    G100GM
    G100GP
    G100GW
    G100GY
    oder eine beliebige der folgenden Kombinationen
    A98G+G100GA+S101A+S103T
    S99G+G100GGT+S101T
  • Es ist im Stand der Technik gut bekannt, dass von einer so genannten konservativen Substitution eines Aminosäurerests mit einem ähnlichen Aminosäurerest erwartet werden kann, dass sich nur eine geringe Änderung der Eigenschaft des Enzyms ergibt.
  • Die nachstehende Tabelle III zählt Gruppen von konservativen Aminosäuresubstitutionen auf. Tabelle III Konservative Aminosäuresubstitutionen
    Gemeinsame Eigenschaften Aminosäure
    Basisch (positive Ladung) K=Lysin H=Histidin
    Sauer (negative Ladung) E=Glutaminsäure D=Asparginsäure
    Polar Q=Glutamin N=Asparagin
    Hydrophob L=Leucin I=Isoleucin V=Valin M=Methionin
    Aromatisch F=Phenylalanin W=Tryptophan Y=Tyrosin
    Klein G=Glycin A=Alanin S=Serin T=Threonin
  • Gemäß diesem Prinzip wird von Subtilasevarianten, die konservative Substitutionen wie G97A+A98AS+S99G, G97S+A98AT+S99A umfassen, erwartet, dass sie Eigenschaften aufweisen, die voneinander nicht stark unterschiedlich sind.
  • Basierend auf den hierin offenbarten und/oder beispielhaft gezeigten Subtilasevarianten, ist es Routinearbeit für einen Fachmann, geeignete konservative Modifikation(en) dieser Varianten zu identifizieren, um andere Subtilasevarianten zu erhalten, die ähnliche verbesserte Waschleistung aufweisen.
  • Gemäß der Erfindung gehören die erfindungsgemäßen Subtilasen zu den Untergruppen I-S1 und I-S2, besonders zu Untergruppe I-S2, sowohl zum Isolieren von neuen erfindungsgemäßen Enzymen aus der Natur oder aus der künstlichen Erschaffung von Diversität, als auch zum Entwerfen und Herstellen von Varianten aus einer Elternsubtilase. In Bezug auf Varianten aus der Untergruppe I-S1 ist es bevorzugt, eine Elternsubtilase aus der Gruppe umfassend BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP), BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC und BSSPRD, oder funktionsfähige Varianten davon, die die Eigenschaft von Untergruppe I-S1 beibehalten haben, auszuwählen.
  • Im Bezug auf Varianten von Untergruppe I-S2 ist es bevorzugt, eine Elternsubtilase aus der Gruppe umfassend BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101), BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL), BYSYAB und BSAPRS, oder funktionsfähige Varianten davon, die die Eigenschaft der Untergruppe I-S2 beibehalten haben, auszuwählen. Insbesondere ist die Elternsubtilase BLSAVI (SAVINASE® NOVO NORDISK A/S), und eine bevorzugte erfindungsgemäße Subtilasevariante ist demgemäß eine Variante von SAVINASE®.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine beliebige der vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen Subtilasen in Kombination mit einer beliebigen anderen Modifikation der Aminosäuresequenz davon. Besonders Kombinationen mit anderen im Stand der Technik bekannten Modifikationen, um dem Enzym verbesserte Eigenschaften bereitzustellen, werden in Betracht gezogen. Der Stand der Technik beschreibt eine Anzahl von Subtilasevarianten mit verschiedenen verbesserten Eigenschaften, und eine Anzahl dieser werden im Abschnitt „Hintergrund der Erfindung" hierin erwähnt (vide supra). Diese Referenzen werden hier als Referenzen offenbart, um eine Subtilasevariante zu identifizieren, die vorteilhafterweise mit einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante kombiniert werden kann.
  • Solche Kombinationen umfassen die Positionen: 222 (verbessern die Stabilität gegenüber Oxidation), 218 (verbessert die thermische Stabilität), Substitutionen in den Ca- Bindungsstellen, die das Enzym stabilisieren, z. B. Position 76, und viele andere, die im Stand der Technik ersichtlich sind.
  • In weiteren Ausführungsformen kann eine erfindungsgemäße Subtilasevariante vorteilhafterweise mit einer oder mehreren Modifikation(en) in einer beliebigen der Positionen kombiniert werden:
    27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 und 274.
  • Speziell werden die folgenden Varianten von BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK und BAALKP als geeignet für eine Kombination betrachtet:
    K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, S103A, V104A, V1041, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167, R170, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L und T274A.
  • Weiterhin weisen Varianten, die eine beliebige der Varianten S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I oder N76D+V104A oder andere Kombinationen dieser Mutationen (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) in Kombination mit einer oder mehreren beliebigen der vorstehend genannten Modifikation(en) verbesserte Eigenschaften auf.
  • Noch weitere Subtilasevarianten des/der Hauptgegenstands/-gegenstände der Erfindung werden bevorzugt mit einer oder mehreren Modifikation(en) in einer beliebigen der Positionen 129, 131, 133 und 194 kombiniert, bevorzugt als Modifikationen 129K, 131H, 133P, 133D und 194P, und am meisten bevorzugt als Modifikationen P129K, P131H, A133P, A133D und A194P. Von jeder beliebigen dieser Modifikation(en) wird erwartet, dass sie ein höheres Expressionsniveau einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante bei der Herstellung davon bereitstellt.
  • Demgemäß betrifft ein noch weiterer Gegenstand der Erfindung eine erfindungsgemäße Variante, wobei die Modifikation ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
  • HERSTELLEN EINER SUBTILASEVARIANTE
  • Im Stand der Technik sind viele Verfahren zum Klonieren einer erfindungsgemäßen Subtilase und zum Einführen von Insertionen in Gene (z. B. Subtilasegene) bekannt, siehe die Referenzen, die im Abschnitt „HINTERGRUND DER ERFINDUNG" zitiert werden.
  • Im Allgemeinen können Standardverfahrensweisen zum Klonieren von Genen und zum Einführen von Insertionen (zufällig und/oder ortspezifisch) in die Gene verwendet werden, um eine erfindungsgemäße Subtilasevariante zu erhalten. Für eine weitere Beschreibung von geeigneten Techniken, wird auf die Beispiele hierin Bezug genommen (vide infra) und Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., und Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990); und WO 96/34946 .
  • Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Subtilasevariante durch Standardtechniken zum künstlichen Erschaffen von Diversität konstruiert werden, wie durch DNA-Shuffling von verschiedenen Subtilasegenen ( WO 95/22625 ; Stemmer WPC, Nature 370:389-91 (1994)). DNA-Shuffling von z. B. dem Savinase®-kodierenden Gen mit einer oder mehreren partiellen Subtilasesequenzen, die in der Natur identifiziert wurden, eine Schleifenregion (b) des aktiven Zentrums zu umfassen, die länger als die Schleife (b) des aktiven Zentrums von Savinase® ist, werden nach anschließendem Screenen auf Varianten mit verbesserter Waschleistung erfindungsgemäße Subtilasevarianten bereitstellen.
  • EXPRESSIONSVEKTOREN
  • Ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt umfasst, das das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann ein beliebiger Vektor sein, der günstig rekombinanten DNA-Verfahrensweisen unterzogen werden kann. Die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in die er eingerührt werden soll. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit besteht, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor einer sein, der nach Einführen in eine Wirtszelle in das Wirtszellgenom teilweise oder in seiner Gesamtheit integriert wird, und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in die er integriert wurde, repliziert wird.
  • Der Vektor ist bevorzugt ein Expressionsvektor, in dem die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, funktionell mit zusätzlichen Abschnitten verbunden ist, die zur Transkription der DNA benötigt werden. Im Allgemeinen wird der Expressionsvektor aus Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet, oder er kann Elemente von beiden enthalten. Der Begriff „funktionell verbunden" bedeutet, dass die Abschnitte so angeordnet sind, dass sie in Übereinstimmung mit ihren beabsichtigten Zwecken funktionieren, z. B. die Transkription in einem Promotor beginnt und durch die für das Enzym kodierende DNA-Sequenz fortschreitet.
  • Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die transkriptionelle Aktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt, und kann aus Genen abgeleitet werden, die für Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle sind.
  • Beispiele von geeigneten Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen schließen den Promotor des maltogenen Amylasegens aus Bacillus stearothermophilus, das alpha-Amylasegen aus Bacillus licheniformis, das alpha-Amylasegen aus Bacillus amyloliquefaciens, das alkalische Proteasegen aus Bacillus subtilis oder das Xylosidasegen aus Bacillus pumilus oder Promotoren der Phagen Lambda PR oder PL oder die Promotoren lac, trp oder tac aus E. coli ein.
  • Die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann auch, wenn nötig, funktionell mit einem geeigneten Terminator verbunden sein.
  • Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor erlaubt, in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren.
  • Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, oder ein Gen, das eine Resistenz gegenüber z. B. Antibiotika wie Kanamycin, Chloramphenicol, Erythromycin, Tetracyclin, Spectinomycin oder ähnlichem, oder eine Resistenz gegenüber Schwermetallen oder Herbiziden kodiert.
  • Um ein Enzym der vorliegenden Erfindung in den sekretorischen Weg der Wirtszellen zu steuern, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als „leader"-Sequenz, präpro-Sequenz oder prä-Sequenz) im rekombinanten Vektor bereitgestellt werden. Die sekretorische Signalsequenz wird im korrekten Leserahmen an die DNA-Sequenz angefügt, die das Enzym kodiert. Sekretorische Signalsequenzen werden gewöhnlich an 5'- Position zur DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, gestellt. Die sekretorische Signalsequenz kann die sein, die normalerweise mit dem Enzym verbunden ist, oder kann aus einem Gen stammen, das ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
  • Die Verfahrensweisen, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, die jeweils die vorliegenden Enzyme, den Promotor und wahlweise die Terminator und/oder sekretorische Signalsequenz kodieren, zu ligieren, oder um diese Sequenzen durch geeignete PCR-Amplifikationsmaßnahmen anzuordnen, und um sie in geeignete Vektoren zu insertieren, die die nötige Information zur Replikation oder Integration enthalten, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., op.cit.).
  • WIRTSZELLE
  • Die in die Wirtszelle eingeführte DNA-Sequenz, die das vorliegende Enzym kodiert, kann entweder homolog oder heterolog zur fraglichen Wirtszelle sein. Wenn sie zur Wirtszelle homolog ist, d.h. von der Wirtszelle in der Natur hergestellt wird, wird sie typischerweise funktionsfähig mit einer anderen Promotorsequenz oder, wenn anwendbar, einer anderen sekretorischen Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz als in ihrer natürlichen Umgebung verbunden werden. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „homolog" eine DNA-Sequenz einschließt, die ein Enzym kodiert, das zum fraglichen Wirtsorganismus nativ ist. Es wird beabsichtigt, dass der Begriff „heterolog" eine DNA-Sequenz einschließt, die durch die Wirtszelle in der Natur nicht exprimiert wird. Daher kann die DNA-Sequenz von einem anderen Organismus sein oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
  • Die Wirtszelle, in die das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt oder der erfindungsgemäße rekombinante Vektor eingeführt wird, kann eine beliebige Zelle sein, die die Fähigkeit besitzt, das vorliegende Enzym herzustellen, und schließt Bakterien, Hefe, Pilze und höhere eukaryotische Zellen einschließlich Pflanzen ein.
  • Beispiele für bakterielle Wirtszellen, die beim Kultivieren die Fähigkeit besitzen, das erfindungsgemäße Enzym herzustellen, sind grampositive Bakterien wie Stämme von Bacillus, wie Stämme von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis, oder Stämme von Streptomyces, wie S. lividans oder S. murinus, oder gramnegative Bakterien wie Escherichia coli.
  • Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation, Elektroporation, Konjugation, oder durch Verwendung kompetenter Zellen in einer per se bekannten Weise bewirkt werden (siehe Sambrook et al., supra).
  • Wenn das Enzym in Bakterien wie E. coli exprimiert wird, kann das Enzym im Cytoplasma typischerweise als unlösliche Körnchen zurückgehalten werden (bekannt als „inclusion bodies", Einschlusskörper), oder kann in den periplasmatischen Raum durch eine bakterielle Sekretionssequenz gerichtet werden. Im ersteren Fall werden die Zellen lysiert, und die Körnchen werden gewonnen und denaturiert, wobei das Enzym danach durch Verdünnen des denaturierenden Mittels zurückgefaltet wird. Im letzteren Fall kann das Enzym aus dem periplasmatischen Raum durch Aufbrechen der Zellen gewonnen werden, z. B. durch Schallbehandlung oder osmotischen Schock, um die Inhalte des periplasmatischen Raums freizusetzen und das Enzym zu gewinnen.
  • Wenn das Enzym in grampositiven Bakterien wie Bacillus- oder Streptomyces-Stämmen exprimiert wird, kann das Enzym im Cytoplasma zurückgehalten werden, oder kann in das extrazelluläre Medium durch eine bakterielle Sekretionssequenz gerichtet werden. Im letzteren Fall kann das Enzym wie nachstehend beschrieben aus dem Medium gewonnen werden.
  • VERFAHREN ZUM HERSTELLEN VON SUBTILASE
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, ein isoliertes erfindungsgemäßes Enzym herzustellen, wobei eine geeignete Wirtszelle, die mit einer das Enzym kodierenden DNA-Sequenz transfiziert wurde, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
  • Wenn ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das Enzym kodiert, in eine heterologe Wirtszelle transformiert wird, ist es möglich, eine heterologe rekombinante Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms zu ermöglichen.
  • Dabei ist es möglich, eine hoch gereinigte Subtilasezusammensetzung herzustellen, die dadurch charakterisiert ist, dass sie frei von homologen Verunreinigungen ist.
  • In diesem Zusammenhang bedeuten homologe Verunreinigungen jegliche Verunreinigungen (z. B. andere Polypeptide als das erfindungsgemäße Enzym), die aus der homologen Zelle stammen, aus der das erfindungsgemäße Enzym ursprünglich erhalten wird.
  • Das Medium, das verwendet wird, um die transformierten Wirtszellen zu kultivieren, kann ein beliebiges gewöhnliches Medium sein, das zum Wachsenlassen der fraglichen Wirtszellen geeignet ist. Die exprimierte Subtilase kann geeigneterweise in das Kulturmedium sekretiert werden und kann davon durch gut bekannte Verfahrensweise gewonnen werden, einschließlich Abtrennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Fällen proteinöser Bestandteile des Mediums mit Hilfe eines Salzes wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahrensweisen wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Ähnlichem.
  • VERWENDUNG EINER ERFINDUNGEMÄßEN SUBTILASEVARIANTE
  • Eine erfindungsgemäße Subtilase-Protease-Variante kann für eine Anzahl von industriellen Anwendungen verwendet werden, insbesondere innerhalb der Detergensindustrie.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung eine Enzymzusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante umfasst. Eine Zusammenfassung von bevorzugten industriellen Anwendungen und entsprechenden bevorzugten Enzymzusammensetzungen werden nachstehend beschrieben.
  • Es ist nicht beabsichtigt, dass diese Zusammenfassung in irgendeiner Weise eine vollständige Liste von geeigneten Anwendungen einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante ist. Eine erfindungsgemäße Subtilasevariante kann in anderen im Stand der Technik bekannten industriellen Anwendungen verwendet werden, um die Verwendung einer Protease, insbesondere einer Subtilase, einzuschließen.
  • DETERGENSZUSAMMENSETZUNGEN UMFASSEND DIE ENZYMMUTANTEN
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymmutanten in Reinigungs- und Detergenszusammensetzungen, und solche Zusammensetzungen, die die Subtilisin-Enzymmutanten umfassen. Solche Reinigungs- und Detergenszusammensetzungen sind im Stand der Technik gut beschrieben, und es wird Bezug genommen auf WO 96/34946 ; WO 97/07202 ; WO 95/30011 für eine weitere Beschreibung von geeigneten Reinigungs- und Detergenszusammensetzungen.
  • Weiterhin zeigen das/die nachstehende(n) Beispiel(e) die Verbesserung der Waschleistung für eine Anzahl von erfindungsgemäßen Subtilasevarianten.
  • Detergenszusammensetzungen
  • Das erfindungsgemäße Enzym kann zu einer Detergenszusammensetzung zugefügt werden und damit ein Bestandteil davon werden.
  • Die erfindungsgemäße Detergenszusammensetzung kann z. B. als eine Detergenszusammensetzung zum Hand- oder Maschinenwaschen formuliert werden, einschließlich einer Zusatzstoffzusammensetzung für Wäsche, geeignet zum Vorbehandeln von beschmutzten Geweben und eine zum Spülen zugefügte Zusammensetzung zum Weichmachen von Gewebe, oder kann als eine Detergenszusammensetzung formuliert werden zur Verwendung in allgemeinen Haushaltsbetätigungen zum Reinigen harter Oberflächen, oder kann für Betätigungen zum Geschirrspülen von Hand oder mit einer Maschine formuliert werden.
  • In einem speziellen Gegenstand stellt die Erfindung einen Detergenszusatzstoff bereit, der das erfindungsgemäße Enzym umfasst. Der Detergenszusatzstoff und die Detergenszusammensetzung können ein oder mehrere andere Enzyme, wie eine Protease, eine Lipase, eine Cutinase, eine Amylase, eine Carbohydrase, eine Cellulase, eine Pectinase, eine Mannanase, eine Arabinase, eine Galactanase, eine Xylanase, eine Oxidase, z. B. eine Laccase und/oder eine Peroxidase, umfassen.
  • Im Allgemeinen sollten die Eigenschaften des/der gewählten Enzym(e) mit dem gewählten Detergens vereinbar sein, (d.h. pH-Optimum, Vereinbarkeit mit anderen enzymatischen und nicht-enzymatischen Inhaltsstoffen, etc.), und das/die Enzym(e) sollten in wirksamen Mengen vorhanden sein.
  • Proteasen: Geeignete Proteasen schließen die von tierischem, pflanzlichen oder mikrobiellem Ursprung ein. Ein mikrobieller Ursprung ist bevorzugt. Chemisch modifizierte oder bezüglich der Proteine technisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Die Protease kann eine Serinprotease oder eine Metalloprotease sein, bevorzugt eine alkalische mikrobielle Protease oder eine trypsinartige Protease. Beispiele für alkalische Proteasen sind Subtilisine, besonders die abgeleitet aus Bacillus, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279 ). Beispiele für trypsinartige Proteasen sind Trypsin (z. B. mit Ursprung aus Schwein oder Rind) und die Fusarium-Protease, beschrieben in WO 89/06270 und WO 94/25583 .
  • Beispiele nützlicher Proteasen sind die Varianten, die in WO 92/19729 , WO 98/20115 , WO 98/20116 und WO 98/34946 beschrieben werden, besonders die Varianten mit Substitutionen in einer oder mehreren der folgenden Positionen: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 und 274.
  • Bevorzugte im Handel erhältliche Proteaseenzyme schließen ein: AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM und KannaseTM (Novo Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM und FN3TM (Genencor International Inc.).
  • Lipasen: Geeignete Lipasen schließen die aus bakteriellem oder Pilz-Ursprung ein. Chemisch modifizierte oder bezüglich der Proteine technisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Beispiele für nützliche Lipasen schließen Lipasen aus Humicola (Synonym Thermomyces), z. B. von H. lanuginosa (T. lanuginosus) wie in EP 258 068 und EP 305 216 beschrieben oder aus H. insolens wie in WO 96/13580 beschrieben, eine Pseudomonas-Lipase, z. B. aus P. alcaligenes oder P. pseudoalcaligenes ( EP 218 272 ), P. cepacia ( EP 331 376 ), P. stutzeri ( GB 1,372,034 ), P. fluorescens, Pseudomonas sp.-Stamm (SD 705 ( WO 95/06720 und WO 96/27002 ), P. wisconsinensis ( WO 96/12012 ), eine Bacillus-Lipase, z. B. aus B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus ( JP 64/744992 ) oder B. pumilus ( WO 91/16422 ) ein.
  • Andere Beispiele sind Lipasevarianten wie die beschrieben in WO 92/05249 , WO94/01541, EP 407 225 , EP 260 105 , WO 95/35381 , WO 96/00292 , WO 95/30744 , WO 94/25578 , WO 95/14783 , WO 95/22615 , WO 97/04079 und WO 97/07202 .
  • Bevorzugte, im Handel erhältliche Lipaseenzyme schließen LipolaseTM und Lipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S) ein.
  • Amylasen: Geeignete Amylasen (α und/oder β) schließen die aus bakteriellem oder Pilz-Ursprung ein. Chemisch modifizierte oder bezüglich der Proteine technisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Amylasen schließen z. B. α-Amylasen erhalten aus Bacillus ein, z. B. ein spezieller Stamm von B. licheniformis, in weiteren Einzelheiten beschrieben in GB 1,296,839 .
  • Beispiele für nützliche Amylasen sind die in WO 94/02597 , WO 94/18314 , WO 96/23873 und WO 97/43424 , besonders die Varianten mit Substitutionen in einer oder mehreren der folgenden Positionen: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 und 444.
  • Im Handel erhältliche Amylasen sind DuramylTM, ThermamylTM, FungamylTM und BANTM (Novo Nordisk A/S), RapidaseTM und PurastarTM (von Genencor International, Inc.).
  • Cellulasen: Geeignete Cellulasen schließen die aus bakteriellem oder Pilz-Ursprung ein. Chemisch modifizierte oder bezüglich der Proteine technisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen schließen Cellulasen aus den Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, z. B. die Pilz-Cellulasen hergestellt aus Humicola insolens, Myceliophthora thermophila und Fusarium oxysporum, offenbart in US 4,435,307 , US 5,648,263 , US 5,691,178 , US 5,776,757 und WO 89/09259 ein.
  • Besonders geeignete Cellulasen sind die alkalischen oder neutralen Cellulasen, die die Vorteile von Farbpflege haben. Beispiele solcher Cellulasen sind Cellulasen beschrieben in EP 0 495 257 , EP 0 531 372 , WO 96/11262 , WO 96/29397 , WO 98/08940 . Andere Beispiele sind Cellulasevarianten, wie die beschrieben in WO 94/07998 , EP 0 531 315 , US 5,457,046 , US 5,686,593 , US 5,763,254 , WO 95/24471 , WO 98/12307 und PCT/DK98/00299 .
  • Im Handel erhältliche Cellulasen schließen CelluzymeTM und CarezymeTM (Novo Nordisk A/S), ClazinaseTM und Puradax HATM (Genencor International Inc.) und KAC-500(B)TM (Kao Corporation) ein.
  • Peroxidasen/Oxidasen: Geeignete Peroxidasen/Oxidasen schließen die aus pflanzlichem, bakteriellem oder Pilz-Ursprung ein. Chemisch modifizierte oder bezüglich der Proteine technisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Beispiele für nützliche Peroxidasen schließen Peroxidasen aus Coprinus, z. B. aus C. cinereus und Varianten davon, wie die beschrieben in WO 93/24618 , WO 95/10602 und WO 98/15257 ein.
  • Im Handel erhältliche Peroxidasen schließen GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S) ein.
  • Das/die Detergensenzym(e) können in eine Detergenszusammensetzung durch Zufügen getrennter Zusatzstoffe, die ein oder mehrere Enzyme enthalten, oder durch Zufügen eines kombinierten Zusatzstoffes, der alle diese Enzyme enthält, eingeschlossen werden. Ein erfindungsgemäßer Detergenszusatzstoff, d.h. ein einzelner Zusatzstoff oder ein kombinierter Zusatzstoff kann z. B. als ein Granulat, eine Flüssigkeit, eine Aufschlämmung, etc. formuliert werden. Bevorzugte Detergenszusatzstoffformulierungen sind Granulate, insbesondere nicht-staubende Granulate, Flüssigkeiten, insbesondere stabilisierte Flüssigkeiten, oder Aufschlämmungen.
  • Nicht-staubende Granulate können z. B. wie in US 4,106,991 und 4,661,452 hergestellt werden und können gegebenenfalls durch im Stand der Technik bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele für wachsartige Beschichtungsmaterialien sind Polyethylenoxid-Produkte (Polyethylenglykol, PEG) mit mittleren Molgewichten von 1000 bis 20.000; ethoxylierte Nonylphenole mit 16 bis 50 Ethylenoxid-Einheiten; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in denen 15 bis 80 Ethylenoxid-Einheiten sind; Fettalkohole, Fettsäuren, und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die zur Anwendung in Flüssigbetttechniken geeignet sind, werden in GB 1483591 genannt. Flüssige Enzymzubereitungen können z. B. durch Zufügen eines Polyols wie Propylenglykol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, Milchsäure oder Borsäure gemäß etablierter Verfahren stabilisiert werden. Geschützte Enzyme können gemäß dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Die erfindungsgemäße Detergenszusammensetzung kann in einer beliebigen geeigneten Form sein, z. B. eine Stange, eine Tablette, ein Pulver, ein Körnchen, eine Paste oder eine Flüssigkeit. Ein flüssiges Detergens kann wässrig sein, wobei es typischerweise bis zu 70 % Wasser und 0-30 % organisches Lösungsmittel enthält, oder nicht wässrig sein.
  • Die Detergenszusammensetzung umfasst ein oder mehrere Surfactants, die nicht ionisch sein können, einschließlich semi-polar und/oder anionisch und/oder kationisch und/oder zwitterionisch. Die Surfactants sind typischerweise in einer Menge von 0,1 % bis 60 % des Gewichts vorhanden.
  • Wenn es darin eingeschlossen wird, wird das Detergens gewöhnlich etwa von 1 % bis etwa 40 % eines anionischen Surfactants enthalten, wie lineares Alkylbenzolsulfonat, alpha- Olefinsulfonat, Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat), Alkohol-Ethoxysulfat, sekundäres Alkansulfonat, alpha-Sulfofettsäuremethylester, Akyl- oder Alkenylbernsteinsäure oder Seife.
  • Wenn es darin eingeschlossen wird, wird das Detergens gewöhnlicherweise von etwa 0,2 % bis etwa 40 % eines nicht-ionischen Surfactants enthalten, wie Alkoholethoxylat, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäure-Monoethanolamid, Polyhydroxyalkylfettsäureamid, oder N-Acyl-, N-Alkyl-Derivate von Glucosamin („Glucamide").
  • Das Detergens kann 0 bis 65 % eines Detergens-Gerüststoffes (Builder) oder komplexbildenden Mittels wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Carbonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure, Ethylendiaminteraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche Silikate oder Schichtsilikate (z. B. SKS-6 von Hoechst) enthalten.
  • Das Detergens kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyridin-N-oxid, Polyvinylimidazol, Polycarboxylate wie Polyacrylate, Malein-/Acrylsäurecopolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäurecopolymere.
  • Das Detergens kann ein System zum Bleichen enthalten, das eine H2O2-Quelle wie Perborat oder Percarbonat umfassen kann, welche mit einem Persäure-bildenden Bleichaktivator wie Tetraacetylethylendiamin oder Nonanoyloxybenzolsulfonat kombiniert werden können. Alternativ kann das System zum Bleichen Peroxysäuren von z. B. dem Amid-, Imid- oder Sulfontyp umfassen.
  • Das/die Enzym(e) der erfindungsgemäßen Detergenszusammensetzung können unter Verwendung von gewöhnlichen Stabilisierungsmitteln stabilisiert werden, z. B. ein Polyol wie Propylenglykol oder Glycerin, ein Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure, oder ein Borsäurederivat, z. B. ein aromatischer Boratester, oder ein Phenyl-Borsäurederivat wie 4-Formylphenylborsäure, und die Zusammensetzung kann wie in z. B. WO 92/10709 und WO 92/19708 beschrieben, formuliert werden.
  • Das Detergens kann auch andere gebräuchliche Detergenszutaten enthalten, wie z. B. Verbesserer von Gewebe, einschließlich Tonerde, Schaumverstärker, Mittel zum Unterdrücken von Seifenschaum, Mittel gegen Korrosion, Mittel zum Suspendieren von Schmutz, Mittel zum Verhindern einer Wiederablagerung von Schmutz, Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufhellungsmittel, hydrotrope Stoffe, Inhibitoren von Trübungen oder Parfüme.
  • Es wird gegenwärtig in Betracht gezogen, dass ein beliebiges Enzym, insbesondere das erfindungsgemäße Enzym, zu den Detergenszusammensetzungen zugefügt werden kann, in einer Menge, die 0,01 bis 100 mg Enzymprotein pro Liter an Waschflüssigkeit entspricht, bevorzugt 0,05 bis 5 mg an Enzymprotein pro Liter an Waschflüssigkeit, insbesondere 0,1 bis 1 mg an Enzymprotein pro Liter an Waschflüssigkeit.
  • Das erfindungsgemäße Enzym kann zusätzlich in die Detergensformulierungen, die in WO 97/07202 offenbart sind, eingebracht werden.
  • ANWENDUNGEN IN DER LEDERINDUSTRIE
  • Eine erfindungsgemäße Subtilase kann in der Lederindustrie verwendet werden, insbesondere zur Verwendung zur Enthaarung von Häuten.
  • In dieser Anwendung wird eine erfindungsgemäße Subtilasevariante bevorzugt in einer Enzymzusammensetzung verwendet, die weiter eine andere Protease umfasst.
  • Für eine genauere Beschreibung von geeigneten weiteren Proteasen siehe den Abschnitt, der geeignete Enzyme zur Verwendung in einer Detergenszusammensetzung betrifft (vida supra).
  • ANWENDUNGEN IN DER WOLLINDUSTRIE
  • Eine erfindungsgemäße Subtilase kann in der Wollindustrie verwendet werden, insbesondere zur Verwendung zum Reinigen von Kleidungsstücken, die Wolle umfassen.
  • In dieser Anwendung wird eine erfindungsgemäße Subtilasevariante bevorzugt in einer Enzymzusammensetzung verwendet, die weiter eine andere Protease umfasst.
  • Für eine genauere Beschreibung von geeigneten weiteren Proteasen, siehe den Abschnitt, der geeignete Enzyme zur Verwendung in einer Detergenszusammensetzung betrifft (vida supra).
  • Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen genauer beschrieben, von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie den Schutzumfang der Erfindung wie beansprucht in irgendeiner Weise limitieren.
  • MATERIAL UND METHODEN STÄMME:
    • B. subtilis DN1885 (Diderichsen et al., 1990).
    • B. lentus 309 und 147 sind spezielle Stämme von Bacillus lentus, die bei der NCIB hinterlegt wurden und die Zugangsnummern NCIB 10309 und 10147 zugewiesen bekamen und in US-Patent Nr. 3,723,250 beschrieben werden.
    • E. coli MC 1000 (M.J. Casadaban und S.N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138 179-207), wurde durch gebräuchliche Verfahren r-, m+ gemacht, und wird auch in der US-Patentanmeldung, lfd. Nummer 039,298 beschrieben.
  • PLASMIDE:
    • pJS3: E. coli-B. subtilis-Überführungsvektor, der ein synthetisches Gen enthält, das Subtilase 309 kodiert. (Beschrieben durch Jacob Schiodt al et al. in Protein and Peptid letters 3: 39-44 (1996)).
    • pSX222: B. subtilis-Expressionsvektor (beschrieben in WO 96/34946 ).
  • ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE VERFAHREN:
  • Wenn es nicht anders erwähnt wird, wurden die DNA-Manipulationen und -Transformationen unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (Hrsg.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., und Cutting, S.M. (Hrsg.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
  • Enzyme für DNA-Manipulationen wurden gemäß den Angaben der Hersteller verwendet.
  • ENZYME FÜR DNA-MANIPULATIONEN
  • Wenn es nicht anders erwähnt wird, sind alle Enzyme für DNA-Manipulationen wie z. B. Restriktionsendonukleasen, Ligasen, etc. von New England Biolabs, Inc. erhalten.
  • PROTEOLYTISCHE AKTIVITÄT
  • Im Zusammenhang dieser Erfindung wird proteolytische Aktivität ausgedrückt als Kilo NOVO Protease-Einheiten (Kilo NOVO Protease Units, KNPU). Die Aktivität wird relativ zu einem Enzymstandard (SAVINASE®) bestimmt, und die Bestimmung basiert auf dem Verdau einer Dimethylkasein-(DMC-)-Lösung durch das proteolytische Enzym bei Standardbedingungen, d.h. 50 °C, pH 8,3, 9 min. Reaktionszeit, 3 min. Messzeit. Eine Broschüre AF 220/1 ist auf Anfrage bei Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich.
  • Eine GU ist eine Glycineinheit (Glycine Unit), definiert als die proteolytische Enzymaktivität, die unter Standardbedingungen während einer 50-minütigen Inkubation bei 40 °C mit N-Acetylkasein als Substrat eine Menge an NH2-Gruppen herstellt, die äquivalent zu 1 mMol Glycin sind.
  • Enzymaktivität kann auch unter Verwendung des PNA-Tests gemessen werden, gemäß der Reaktion mit dem löslichen Substrat Succinyl-Alanin-Alanin-Prolin-Phenyl-Alanin-Paranitrophenol, das beschrieben ist im Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., und Smith, L.A., (1988).
  • FERMENTATION:
  • Fermentationen zur Herstellung von Subtilaseenzymen wurden bei 30 °C auf einem rotierenden Schütteltisch (300 upm) in 500 ml eingebuchteten Erlenmeyer-Kolben, die 100 ml BPX-Medium enthalten, für 5 Tage durchgeführt.
  • Folglich wurden, um z. B. zwei Liter Brühe herzustellen, 20 Erlenmeyer-Kolben gleichzeitig fermentiert.
  • MEDIEN:
  • BPX-Medium-Zusammensetzung (pro Liter)
    Kartoffelstärke 100 g
    Gemahlene Gerste 50 g
    Sojabohnenmehl 20 g
    Na2HPO4 × 12 H2O 9 g
    Pluronic 0,1 g
    Natriumkaseinat 10 g
  • Die Stärke im Medium wird mit α-Amylase verflüssigt, und das Medium wird durch Erhitzen auf 120 °C für 45 Minuten sterilisiert. Nach der Sterilisierung wird der pH des Mediums auf 9 durch Zugabe von NaHCO3 auf 0,1 M eingestellt.
  • BEISPIEL 1
  • KONSTRUKTION UND EXPRESSION VON ENZYMVARIANTEN:
  • ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE:
  • Erfindungsgemäße ortsspezifische Varianten von Subtilase 309, die spezifische Insertionen in der Schleife (b) des aktiven Zentrums zwischen den Positionen 100 und 101 umfassen, wurden durch traditionelles Klonieren von DNA-Fragmenten gemacht (Sambrook et al., Molekular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor, 1989), die durch PCR von Oligos, die die gewünschten Insertionen enthalten, hergestellt wurden (siehe nachstehend).
  • Die Templat-Plasmid-DNA war pJS3 oder ein Analog davon, das eine Variante von Subtilase 309 enthält.
  • Insertionen wurden durch Oligo-gerichtete Mutagenese zur Konstruktion von G100GX-Insertionsvarianten eingefügt (X = ein beliebiger Aminosäurerest, der zwischen Positionen 100 und 101 eingefügt wird), was G100GX-Subtilase 309-Varianten zum Ergebnis hatte.
  • Die Varianten von Subtilase 309 wurden in E. coli transformiert. DNA, die aus einer Übernacht-Kultur dieser Transformanden gereinigt wurde, wurde in B. subtilis transformiert durch Verdau mit Restriktionsendonuklease, Reinigung der DNA-Fragmente, Ligation, Transformation von B. subtilis.
  • Transformation von B. subtilis wurde durchgeführt wie durch Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, S. 209-221, beschrieben.
  • LOKALISIERTE ZUFALLSMUTAGENESE, UM ZUFÄLLIGE INSERTIONEN IN EINER LOKALISIERTEN REGION EINZUFÜGEN:
  • Die allgemeine Strategie, die verwendet wurde, um lokalisierte Zufallsmutagenese durchzuführen, war:
    Ein mutagenisierender Primer (Oligonukleotid) wurde synthetisiert, der der DNA-Sequenz entspricht, die die Insertionsstelle flankiert, getrennt durch die DNA-Basenpaare, die die Insertion definieren.
  • Anschließend wurde der resultierende mutagenisierende Primer in einer PCR-Reaktion mit einem geeigneten entgegengesetzten Primer verwendet. Das resultierende PCR-Fragment wurde gereinigt und in einer zweiten PCR-Reaktion verlängert, bevor es durch Endonuklease verdaut wurde und in den E. coli-B. subtilis-Überführungsvektor kloniert wurde (siehe nachstehend).
  • Alternativ, und wenn nötig, wurde das resultierende PCR-Fragment in einer zweiten PCR-Reaktion als ein Primer mit einem geeigneten zweiten entgegengesetzten Primer verwendet, um einen Verdau und das Klonieren der mutagenisierten Region in den Überführungsvektor zu erlauben. Die PCR-Reaktionen werden unter normalen Bedingungen durchgeführt.
  • Durch Befolgen dieser Strategie wurde eine lokalisierte Zufallsbibliothek in SAVINASE konstruiert, wobei Insertionen in die Schleifenregion des aktiven Zentrums zwischen Positionen 100 und 101 eingefügt wurden.
  • Die Mutationen wurden durch mutagenisierende Primer eingefügt (siehe nachstehend), so dass alle 20 Aminosäuren vorhanden sind (N = 25 % von A, T, C und G; wobei S = 50 % C und G). Das hergestellte PCR-Fragment wurde gegen den N-Terminus von Savinase hin durch eine weitere Runde von PCR durch Kombination einer überlappenden Sequenz mit einem PCR-Fragment verlängert, das durch PCR-Amplifikation mit den Primer hergestellt wurde; 5' CTA AAT ATT CGT GGTGGC GC 3' (Sense) und 5' GAC TTT AAC AGC GTA TAG CTC AGC 3' (Antisense). Die verlängerten DNA-Fragmente wurden in die Hind III- und Mlu I-Schnittstellen des modifizierten Plasmids pJS3 (siehe vorstehend) kloniert, und zehn zufällig ausgewählte E. coli-Kolonien wurden sequenziert, um die entworfenen Mutationen zu bestätigen.
  • Der mutagenisierende Primer (5' GTT AAA GTC CTA GGG GCG AGC GGT NNS TCA GGT TCG GTC AGC TCG ATT G 3') (Sense) wurde in einer PCR-Reaktion mit einem geeigneten entgegengesetzten Anti-Sense-Primer verwendet, der stromabwärts der Mlu I-Schnittstelle in pJS3 gelegen ist (z. B. 5'-CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT-3' (Antisense)), und dem Plasmid pJS3 als Templat. Dieses resultierende PCR-Produkt wurde in den pJS3-Überführungsvektor unter Verwendung der Restriktionsenzyme Hind III und Mlu I kloniert.
  • Die Zufalls-Bibliothek wurde durch gut bekannte Techniken in E. coli transformiert. Die hergestellte Bibliothek enthielt ungefähr 100.000 einzelne Klone pro Bibliothek.
  • Zehn zufällig ausgewählte Kolonien wurden sequenziert, um die entworfenen Mutationen zu bestätigen.
  • Um eine erfindungsgemäße Subtilasevariante zu reinigen, wurde das B. subtilis pJS3-Expressionsplasmid, das eine erfindungsgemäße Variante umfasst, in einen kompetenten B. subtilis-Stamm transformiert, und wurde wie vorstehend beschrieben in einem Medium, das 10 μg/ml Chloramphenicol (CAM) enthält, fermentiert.
  • BEISPIEL 2
  • REINIGUNG VON ENZYMVARIANTEN:
  • Dieses Verfahren betrifft die Reinigung einer Fermentation im 2-Liter-Maßstab zur Herstellung der erfindungsgemäßen Subtilasen in einer Bacillus-Wirtszelle.
  • Ungefähr 1,6 Liter der Fermentationsbrühe wurden bei 5000 upm für 35 Minuten in 1-Liter-Bechern zentrifugiert. Die Überstände wurden auf pH 6,5 unter Verwendung von 10 % Essigsäure eingestellt und durch Seitz Supra S100-Filterplatten filtriert.
  • Die Filtrate wurden auf ungefähr 400 ml unter Verwendung einer Amicon CH2A UF-Einheit, die mit einer Amicon S1Y10 UF-Patrone ausgestattet ist, konzentriert. Das UF-Konzentrat wurde zentrifugiert und vor der Absorption bei Raumtemperatur auf eine Bacitracin-Affinitätssäule bei pH 7 filtriert. Die Protease wurde von der Bacitracinsäule bei Raumtemperatur unter Verwendung von 25 % 2-Propanol und 1 M Natriumchlorid in einer Pufferlösung mit 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,1 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 7, eluiert.
  • Die Fraktionen mit Proteaseaktivität aus dem Bacitracin-Reinigungsschritt wurden vereinigt und auf eine 750-ml-Sephadex-G25-Säule (5 cm Durchmesser), äquilibriert mit einem Puffer, der 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid enthält, eingestellt auf pH 6,5, aufgetragen.
  • Fraktionen mit proteolytischer Aktivität von der Sephadex-G25-Säule wurden vereinigt und auf eine 150-ml-CM-Sepharose-CL-6B-Kationenaustauschersäule (5 cm Durchmesser), äquilibriert mit einem Puffer, der 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 Calciumchlorid enthält, eingestellt auf pH 6,5, aufgetragen.
  • Die Protease wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 0,1 M Natriumchlorid in 2 Litern desselben Puffers eluiert (0 bis 0,2 M Natriumchlorid im Fall von Subtilisin 147).
  • In einem letzten Reinigungsschritt wurden die Protease enthaltenden Fraktionen von der CM-Sepharosesäule vereinigt und in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle, ausgestattet mit einer GR81PP-Membran (von den Danish Sugar Factories Inc.) konzentriert.
  • Durch Verwenden der Techniken von Beispiel 1 zur Herstellung und Fermentation und der vorstehend beschriebenen Isolationsverfahrensweise wurden die folgenden Varianten von Subtilisin 309 hergestellt und isoliert:
    G100GT
    G100GA
    G100GS
    G100GD
    G100GE
    G100GP
    G100GG
    G100GH
    G100GI
    G100GT+Y167A
    S99G+G100GT+S101T
    A98G+G100GA+S101A+S103T
  • Diese Varianten wiesen in einem vorläufigen Test bessere Waschleistung auf als Savinase.
  • BEISPIEL 3
  • WASCHLEISTUNG VON DETERGENSZUSAMMENSETZUNGEN, DIE ENZYM-VARIANTEN UMFASSEN
  • Die folgenden Beispiele stellen Ergebnisse einer Anzahl von Waschtests bereit, die unter den angegebenen Bedingungen durchgeführt wurden. MINI-WASCHEN WASCHBEDINGUNGEN:
    Europe Detergent 95 US
    Detergensdosierung 4 g/l 3 g/l 1 g/l
    Waschtemp. 30°C 15°C 25°C
    Waschzeit 30 min 15 min. 10 min
    Wasserhärte 18°dH (Ca2 +/Mg2+ =5:1) 6°dH 6°dH (Ca2+/Mg2+= 2:1)
    pH nicht eingestellt 10.5 nicht eingestellt
    Enzymkonz. 1, 2, 5, 10, 30 nM 1, 2, 5, 10, 30 nM
    Testsystem 150-ml-Glasbecher mit einem Rührstab 10 nm 150-ml-Glasbecher mit einem Rührstab
    Textil/Volumen 5 Textilstücke (∅ 2,5 cm) in 50 ml Detergens 5 Textilstücke (∅ 2,5 cm) in 50 ml Detergens 5 Textilstücke (∅ 2,5 cm) in 50 ml Detergens
    Testmaterial EMPA116 EMPA117 EMPA117
  • DETERGENZIEN:
  • Die verwendeten Detergenzien waren entweder ein Modell-Waschmittel, Detergens 95 genannt, oder aus Supermärkten in Dänemark (OMO, Datenblatt ED-9745105) und den USA (Wisk, Datenblatt ED-9711893) erhalten. Vor der Verwendung wurde sämtliche enzymatische Aktivität in den Detergenzien durch Behandlung mit Mikrowellen inaktiviert. Detergens 95 ist eine einfache Modell-Formulierung. Der pH wird auf 10.5 eingestellt, was innerhalb des normalen Bereichs für ein pulverförmiges Waschmittel ist.
  • Die Zusammensetzung von Detergens 95 ist wie folgt:
    25% STP (Na5P3O10)
    25% Na2SO4
    10% Na2CO3
    20% LAS (Nansa 80S)
    5.0% Nicht-ionische Tenside (Dobanol 25-7)
    5.0% Na2Si2O5
    0.5% Carboxymethylcellulose (CMC)
    9.5% Wasser
  • STOFFPROBEN:
  • Die verwendeten Stoffproben waren EMPA116 und EMPA117, erhalten von EMPA Testmaterialien, Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gall, Schweiz.
  • REFLEXION
  • Eine Messung der Reflexion (R) auf dem Testmaterial wurde bei 460 nm unter Verwendung eines Macbeth-ColorEye-7000-Photometers durchgeführt. Die Messungen wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.
  • AUSWERTUNG
  • Die Auswertung der Waschleistung einer Subtilase wird entweder durch den Verbesserungsfaktor oder den Leistungsfaktor für die untersuchte Subtilase bestimmt.
  • Der Verbesserungsfaktor, IFDosis/Wirkung, wird definiert als das Verhältnis der Steigungen der Kurven der Waschleistung für ein Detergens, das die untersuchte Subtilase enthält, und dasselbe Detergens, das eine Referenzsubtilase enthält, bei der asymptotischen Konzentration der Subtilase, die auf Null geht. IFDosis/Wirkung = a/aref
  • Die Waschleistung wird gemäß der Formel I berechnet:
    Figure 00420001
    wobei
    R die Waschleistung in Reflexionseinheiten ist; R0 der Schnittpunkt der angepassten Kurve mit der Y-Achse ist (blind); a ist die Steigung der angepassten Kurve als c → 0; c ist die Enzymkonzentration; und ΔRmax ist der theoretische maximale Wascheffekt als c → ∞.
  • Der Leistungsfaktor P wird berechnet gemäß der Formel II
    Figure 00430001

    wobei
    • RVariante
    die Reflexion des Testmaterials ist, das mit 10 nM-Variante gewaschen wurde;
    RSavinase
    ist die Reflexion des Testmaterials, das mit 10 nM Savinase gewaschen wurde;
    RLeerwert
    ist die Reflexion des Testmaterials, das mit keinem Enzym gewaschen wurde.
    US (Detergens: US Wisk, Stoffprobe: EMPA117)
    Varianten P
    G100GA 1,2
    S99G+G100GGT+S101T 1,6
    • *P berechnet bei [E] = 5nM
  • Es kann daher gesehen werden, dass die erfindungsgemäßen Subtilasen eine verbesserte Waschleistung im Vergleich zu Savinase® aufweisen. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00440001
    Figure 00450001
    Figure 00460001

Claims (25)

  1. Isoliertes Subtilaseenzym der Untergruppen I-S1 und I-S2, welches einen oder zwei zusätzliche Aminosäurereste an Position 100 der Schleife (Loop) (b) der Region des aktiven Zentrums von Position 95 bis 103 aufweist, wobei der/die eine oder zwei Aminosäurerest(e) zwischen den Positionen 100 und 101 insertiert ist/sind, welche Aminosäurereste ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: T, S, C, N, Q, A, G, V, P, I, F, L, M, W und Y.
  2. Isoliertes Subtilaseenzym nach Anspruch 1, wobei das Subtilaseenzym eine konstruierte Variante ist.
  3. Subtilaseenzym nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die Insertion(en) zwischen den Positionen 100 und 101 mit einer oder mehreren weiteren Modifikation(en) an beliebiger/beliebigen anderer/n Position(en) kombiniert ist/sind.
  4. Subtilaseenzym nach Anspruch 3, wobei die weitere(n) Modifikation(en) an einer oder mehreren der Positionen 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 und 274 vorliegt/vorliegen.
  5. Subtilaseenzym nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Modifikation(en) mit Modifikation(en) an einer oder mehreren der Positionen 129, 131, 133 und 194 kombiniert ist/sind.
  6. Subtilase nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die Subtilase der Untergruppe I-S1 angehört.
  7. Subtilase nach Anspruch 6, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus BSS168, BASBPN, BSSDY und BLSCAR.
  8. Subtilase nach einem beliebigen der Ansprüche 1-5, wobei die Subtilase der Untergruppe I-S2 angehört.
  9. Subtilase nach Anspruch 8, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus BLS147, BLS309, BAPB92 und BYSYAB.
  10. Subtilase nach Anspruch 8 oder 9, wobei die weitere(n) Modifikation(en) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167X, R170X, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L und T274A.
  11. Subtilase nach Anspruch 8 oder 9, wobei die weitere(n) Modifikation(en) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I oder N76D+V104A oder anderen Kombinationen dieser Mutationen (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A), in Kombination mit einer beliebigen oder mehreren beliebigen der Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen, die in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7 erwähnt ist/sind.
  12. Subtilasevariante nach Anspruch 8 oder 9, wobei die weitere(n) Modifikation(en) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus P129K, P131H, A133P, A133D und A194P.
  13. Variante nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, welche die Modifikation A98G+G100GA+S101A+S103T oder S99G+G100GGT+S101T umfasst.
  14. Subtilase nach Anspruch 1, welche die Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure 00480001
    Figure 00490001
    oder eine homologe Subtilase mit einer Aminosäuresequenz, die einen Aminosäurerest an Position 100a umfasst und die eine Identität von mehr als 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% dazu aufweist.
  15. Subtilase nach Anspruch 1, welche die Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure 00490002
    Figure 00500001
    oder eine homologe Subtilase mit einer Aminosäuresequenz, die einen Aminosäurerest an Position 100a umfasst und die eine Identität von mehr als 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% dazu aufweist.
  16. Isolierte DNA-Sequenz, welche eine Subtilase oder eine Subtilasevariante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
  17. Expressionsvektor, welcher eine isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 16 umfasst.
  18. Mikrobielle Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 17 transformiert ist.
  19. Mikrobieller Wirt nach Anspruch 18, welcher ein Bakterium, bevorzugt ein Bacillus, besonders B. lentus, ist.
  20. Mikrobieller Wirt nach Anspruch 18, welcher ein Pilz oder Hefe, bevorzugt ein filamentöser Pilz, besonders ein Aspergillus, ist.
  21. Verfahren zum Herstellen einer Subtilase oder einer Subtilasevariante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15, wobei ein Wirt nach einem beliebigen der Ansprüche 18 bis 20 unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression und Sekretion der Variante zuträglich sind, und die Variante gewonnen wird.
  22. Zusammensetzung, welche eine Subtilase oder eine Subtilasevariante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15 umfasst.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, welche zusätzlich eine Cellulase, Lipase, Cutinase, Oxidoreductase, eine andere Protease oder eine Amylase umfasst.
  24. Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Zusammensetzung eine Detergenszusammensetzung ist.
  25. Verwendung einer Subtilase oder einer Subtilasevariante nach einem beliebiegen der Ansprüche 1 bis 15 oder einer Enzymzusammensetzung nach Ansprüchen 22 oder 23 in einem Wasch- und/oder einem Geschirrspüldetergens.
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