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TECHNISCHES GEBIET
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Diese
Erfindung betrifft neue Subtilaseenzyme der Untergruppen I-S1 und
I-S2, welche mindestens einen zusätzlichen Aminosäurerest
an Position 99 der Schleife (Loop) (b) der Region der aktiven Zentrums
von Position 95-103 aufweisen. Diese Proteasen sind dadurch nützlich,
dass sie eine exzellente oder verbesserte Waschleistung aufweisen,
wenn sie in Detergenzien, in Reinigungs- und Detergenszusammensetzungen
verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Gene, die die
Expression dieser Enzyme kodieren, wenn sie in eine geeignete Wirtszelle
oder einen nicht-humanen Organismus insertiert werden; und solche
Wirtszellen, die damit transformiert sind und die Fähigkeit
besitzen, die Enzymvarianten zu exprimieren, und Verfahren zum Herstellen
der neuen Enzyme.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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In
der Detergens-Industrie werden Enzyme seit mehr als 30 Jahren in
Waschmittelzubereitungen eingesetzt. Enzyme, die in solchen Zubereitungen
verwendet werden, umfassen Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen,
und andere Enzyme oder Mischungen davon. Die kommerziell wichtigsten
Enzyme sind Proteasen.
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Eine
steigende Anzahl von kommerziell verwendeten Proteasen sind bezüglich der
Proteine technisch veränderte
Varianten von natürlicherweise
vorkommenden Wildtyp-Proteasen,
z. B. DURAZYM® (Novo
Nordisk A/S), RELASE® (Novo Nordisk A/S), MAXAPEM®(Gist-Brocades
N.V.), PURAFECT® (Genencor
International, Inc.).
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Weiterhin
sind im Stand der Technik eine Anzahl von Proteasevarianten beschrieben,
wie in
EP 130756 (GENENTECH)
(entsprechend dem US-Reissue-Patent Nr. 34,606 (GENENCOR);
EP 214435 (HENKEL); WO 87/04461
(AMGEN); WO 87/05050 (GENEX);
EP
260105 (GENENCOR); Thomas, Russell, und Fersht (1985) Nature
318 375-376; Thomas, Russell, und Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193
803-813; Russell und Fersht Nature 328 496-500 (1987); WO 88/08028
(Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S.A.); WO 95/30011
(PROCTER & GAMBLE
COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE
COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE
COMPANY);
US 5,543,302 (SOLVAY
S.A.);
EP 251 446 (GENENCOR); WO
89/06279 (NOVO NORDISK A/S);
EP
525 610 A1 (SOLVAY); und WO 94/02618 (GIST-BROCADES N.V.). Auch
WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S) offenbart mutierte Subtilisine, in
denen die elektrostatische Nettoladung durch Modifizieren der Aminosäurereste
des Enzyms an mindestens einer Anzahl von angegebenen Positionen
verändert
wurde.
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Jedoch
besteht, obwohl eine Anzahl nützlicher
Proteasevarianten beschrieben wurde, immer noch ein Bedarf an neuen
verbesserten Proteasen oder Proteasevarianten für eine Anzahl von industriellen
Verwendungen.
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Daher
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Proteasevarianten
oder bezüglich der
Proteine technisch veränderte
Proteasevarianten bereitzustellen, besonders zur Verwendung in der
Detergensindustrie.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
derzeitigen Erfinder haben gefunden, dass Subtilisine, in denen
mindestens eine der Schleifen (Loops) des aktiven Zentrums länger ist
als die, die zurzeit bekannt sind, verbesserte Waschleistungseigenschaften
in Detergenszusammensetzungen aufweisen. Die Identifizierung davon
wurde durchgeführt,
indem Subtilisinvarianten konstruiert wurden, besonders von Subtilisin
309 (BLSAVI oder Savinase®), die verbesserte Waschleistungseigenschaften
in Detergenszusammensetzungen in Bezug auf das Eltern-Wildtyp-Enzym aufweisen.
Dieses wurde in unserer früheren
Anmeldung DK 1332/97 beschrieben.
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Es
wurde jetzt gefunden, dass bestimmte Subtilasen oder Varianten davon
der Untergruppen I-S1 (echte „Subtilisine") und I-S2 (hochalkalische
Subtilisine), die mindestens einen zusätzlichen Aminosäurerest in
Position 99 (oder eher zwischen Positionen 99 und 100) der Schleife
(b) der Region des aktiven Zentrums von Position 95 bis 103 haben, überraschend
verbesserte Waschleistung im Vergleich zu den derzeit bekannten
und denen, die in besagter Anmeldung beschrieben werden, aufweisen.
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Die
erfindungsgemäßen verbesserten
Proteasen können
durch Isolierung aus natürlichen
Quellen oder durch das Einfügen
von mindestens einem weiteren Aminosäurerest (eine Insertion) in
die Schleife (b) des aktiven Zentrums zwischen Positionen 99 und
100 in einer Wildtyp-Subtilase erhalten werden (für eine Definition
der Schleife des aktiven Zentrums und der Nummerierung der Positionen
siehe unten).
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Obwohl
dieser Befund in Subtilisin 309 gemacht wurde, wird vorhergesagt,
dass es möglich
sein wird, ähnliche
vorteilhafte Subtilasen oder Subtilasevarianten herzustellen oder
zu isolieren.
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Weiterhin
wird es möglich
sein, spezifisch natürliche
Isolate zu „screenen", um neue Wildtyp-Subtilasen
zu identifizieren, die eine Schleife (b) des aktiven Zentrums umfassen,
welche länger
ist als die entsprechende Schleife des aktiven Zentrums in bekannten
Wildtyp-Subtilasen wie Subtilisin 309, von welchen Subtilasen angenommen
werden kann, dass sie einen insertierten Aminosäurerest zwischen Positionen
99 und 100 haben, und exzellente Waschleistung in einem Detergens
im Vergleich zu ihrem nächstverwandten
bekannten Subtilisin wie Subtilisin 309 aufweisen.
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Was
das „Alignment" und die Nummerierung
betrifft, wird auf die nachstehenden 1, 1a, 2 und 2a verwiesen,
die Alignments zwischen Subtilisin BPN' (BASBPN) (a) und Subtilisin 309 (BLSAVI)
(b), und Alignments zwischen Subtilisin BPN' (a) (BASBPN) und Subtilisin Carlsberg
(g) zeigen. In 1 und 2 wurden
die Alignments unter Verwendung der GAP-Routine des GCG-Pakets wie
nachstehend gezeigt erstellt, wobei die Alignments von 1a und 2a dieselben
sind wie in WO 91/00345 gezeigt. Diese Alignments werden in dieser
Patentanmeldung als eine Referenz zum Nummerieren der Reste verwendet.
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Die
sieben Schleifen des aktiven Zentrums (a) bis (g) (einschließlich beider
gezeigter endständiger Aminosäurereste)
werden hier definiert als umfassend die Aminosäurereste in den Abschnitten,
die nachstehend genannt werden:
- (a) die Region
zwischen Aminosäurerest
33 und 43;
- (b) die Region zwischen Aminosäurerest 95 und 103;
- (c) die Region zwischen Aminosäurerest 125 und 132;
- (d) die Region zwischen Aminosäurerest 153 und 173;
- (e) die Region zwischen Aminosäurerest 181 und 195;
- (f) die Region zwischen Aminosäurerest 202 und 204;
- (g) die Region zwischen Aminosäurerest 218 und 219.
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In Übereinstimmung
damit bezieht sich die Erfindung in einem ersten Gegenstand auf
ein isoliertes (d.h. mehr als 10 % reines) Subtilaseenzym der Untergruppen
I-S1 und I-S2, welches mindestens einen zusätzlichen Aminosäurerest
an Position 99 der Schleife (b) der Region des aktiven Zentrums
von Position 95 bis 103 aufweist, wobei der/die zusätzliche(n)
Aminosäurerest(e)
der Insertion von mindestens einem Aminosäurerest zwischen den Positionen
99 und 100 entspricht/entsprechen.
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In
einem zweiten Gegenstand bezieht sich die Erfindung auf eine isolierte
DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante kodiert.
In einem dritten Gegenstand betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor,
der eine isolierte DNA-Sequenz umfasst, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante
kodiert.
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In
einem vierten Gegenstand bezieht sich die Erfindung auf eine mikrobielle
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor gemäß dem vierten Gegenstand transformiert
ist.
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In
einem weiteren Gegenstand bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung
der erfindungsgemäßen Subtilisinenzyme.
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Die
erfindungsgemäßen Enzyme
können
allgemein entweder durch Kultivierung eines mikrobiellen Stamms,
von dem das Enzym isoliert wurde, und Gewinnen des Enzyms in im
Wesentlichen reiner Form hergestellt werden; oder durch Insertieren
eines Expressionsvektors gemäß dem vierten
erfindungsgemäßen Gegenstand
in einen geeigneten mikrobiellen Wirt, Kultivieren des Wirts, um
das gewünschte
Subtilaseenzym zu exprimieren, und Gewinnen des Enzymprodukts.
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Weiterhin
bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Subtilase
oder Subtilasevariante umfasst.
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Noch
weiter bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Enzyme
für eine Anzahl
von relevanten industriellen Verwendungen, insbesondere zur Verwendung
in Reinigungszusammensetzungen und Reinigungszusammensetzungen,
die die Enzym-Mutanten umfassen, besonders Detergenszusammensetzungen,
die die Subtilisinenzym-Mutanten umfassen.
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DEFINITIONEN
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Bevor
diese Erfindung in weiteren Einzelheiten diskutiert wird, werden
zuerst die folgenden Begriffe und Übereinkommen definiert.
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NOMENKLATUR
VON AMINOSÄUREN
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- A = Ala = Alanin
- V = Val = Valin
- L = Leu = Leucin
- I = Ile = Isoleucin
- P = Pro = Prolin
- F = Phe = Phenylalanin
- W = Trp = Tryptophan
- M = Met = Methionin
- G = Gly = Glycin
- S = Ser = Serin
- T = Thr = Threonin
- C = Cys = Cystein
- Y = Tyr = Tyrosin
- N = Asn = Asparagin
- Q = Gln = Glutamin
- D = Asp = Asparaginsäure
- E = Glu = Glutaminsäure
- K = Lys = Lysin
- R = Arg = Arginin
- H = His = Histidin
- X = Xaa = Beliebige Aminosäure
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NOMENKLATUR VON NUKLEINSÄUREN
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- A
- = Adenin
- G
- = Guanin
- C
- = Cytosin
- T
- = Thymin (nur in DNA)
- U
- = Uracil (nur in RNA)
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NOMENKLATUR UND ÜBEREINKOMMEN
ZUR BEZEICHNUNG VON VARIANTEN
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Beim
Beschreiben der verschiedenen Enzymvarianten, die erfindungsgemäß hergestellt
oder in Erwägung
gezogen werden, wurden zur Erleichterung der Bezugnahme die folgenden
Nomenklaturen und Übereinkommen
angepasst:
Ein Bezugsrahmen wird zuerst durch Alignment der
isolierten oder Eltern-Wildtyp-Enzyme
mit Subtilisin BPN' (BASBPN)
definiert.
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Das
Alignment kann durch die GAP-Routine des GCG-Pakets Version 9.1
erhalten werden, um die Varianten unter Verwendung der folgenden
Parameter zu nummerieren: „gap
creation penalty" =
8 und „gap
extension penalty" =
8, wobei alle anderen Parameter bei ihren vorgegebenen Werten gehalten
werden.
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Ein
anderes Verfahren ist es, bekannte erkannte Alignments zwischen
Subtilasen zu verwenden, wie das in WO 91/00345 gezeigte Alignment.
In den meisten Fällen
werden die Unterschiede nicht von Wichtigkeit sein.
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Solche
Alignments zwischen jeweils Subtilisin BPN' (BASBPN) und Subtilisin 309 (BLSAVI)
und Subtilisin Carlsberg (BLSCAR) sind in 1, 1a, 2 und 2a gezeigt.
Dadurch wird eine Anzahl von Deletionen und Insertionen in Bezug
auf BASBPN definiert werden. In 1 hat Subtilisin
309 6 Deletionen in den Positionen 36, 58, 158, 162, 163 und 164
im Vergleich zu BASBPN, während
in 1a Subtilisin 309 dieselben Deletionen in den
Positionen 36, 56, 159, 164, 165 und 166 im Vergleich zu BASBPN
hat. In 2 hat Subtilisin Carlsberg eine
Deletion in Position 58 im Vergleich zu BASBPN, wobei in 2a Subtilisin
Carlsberg die eine Deletion in Position 56 im Vergleich zu BASBPN
hat. Diese Deletionen werden in 1, 1a, 2 und 2a durch
Sternchen (*) angezeigt.
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Die
verschiedenen Modifikationen, die in einem Wildtyp-Enzym durchgeführt werden,
werden allgemein unter Verwendung von drei Bestandteilen wie folgt
gezeigt:
Ursprüngliche
Aminosäure
Position substituierte Aminosäure
Die
Schreibweise G195E bedeutet daher eine Substitution eines Glycins
in Position 195 mit einer Glutaminsäure.
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Im
Fall, dass der ursprüngliche
Aminosäurerest
ein beliebiger Aminosäurerest
sein kann, kann manchmal eine verkürzte Schreibweise verwendet
werden, die nur die Position und substituierte Aminosäure zeigt,
Position
substituierte Aminosäure
So
eine Schreibweise ist besonders relevant in Verbindung mit Modifikation(en)
in homologen Subtilasen (vide infra).
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Auf ähnliche
Weise, wenn die Identität
der substituierenden Aminosäure(n)
unwesentlich ist,
ursprüngliche
Aminosäure
Position
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Wenn
sowohl die ursprüngliche(n)
Aminosäure(n)
und substituierte Aminosäure(n)
irgendeine Aminosäure
umfassen kann, dann wird nur die Position gezeigt, z. B.: 170.
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Wenn
die ursprüngliche
Aminosäure(n)
und/oder substituierte Aminosäure(n)
mehr als eine, aber nicht alle Aminosäure(n) umfassen kann, dann
werden die ausgewählten
Aminosäuren
in Klammern { } gezeigt,
ursprüngliche Aminosäure Position
substituierte Aminosäure1, ... substituierte Aminosäuren}
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Für spezifische
Varianten werden die spezifischen Drei- oder Ein-Buchstabencodes
verwendet, einschließlich
der Codes Xaa und X, um einen beliebigen Aminosäurerest anzuzeigen.
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SUBSTITUTIONEN:
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Die
Substitution von Glutaminsäure
für Glycin
in Position 195 wird bezeichnet als:
Gly195Glu oder G195E
oder
die Substitution eines beliebigen Aminosäurerests für Glycin in Position 195 wird
bezeichnet als:
Gly195Xaa oder G195X
oder
Gly195
oder G195
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Die
Substitution von Serin für
einen beliebigen Aminosäurerest
in Position 170 würde
daher bezeichnet werden
Xaa170Ser oder X170S.
oder
170Ser
oder 1705
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So
eine Schreibweise ist besonders relevant im Zusammenhang mit Modifikation(en)
in homologen Subtilasen (vide infra). 170Ser soll daher bedeuten,
dass z. B. sowohl eine Lys170Ser-Modifikation in BASBPN und Arg170Ser-Modifikation
in BLSAVI umfasst wird (siehe 1).
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Für eine Modifikation,
bei der die ursprüngliche(n)
Aminosäure(n)
und/oder substituierte(n) Aminosäure(n)
mehr als eine, aber nicht alle Aminosäure(n) umfassen kann, würde die
Substitution von Glycin, Alanin, Serin oder Threonin für Arginin
in Position 170 gezeigt werden durch
Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr}
oder R170{G,A,S,T}
um die Varianten anzuzeigen,
R170G,
R170A, R170S; und R170T.
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DELETIONEN:
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Eine
Deletion von Glycin in Position 195 wird angezeigt werden durch:
Gly195*
oder G195*
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Entsprechend
wird die Deletion von mehr als einem Aminosäurerest, wie die Deletion von
Glycin und Leucin in Positionen 195 und 196 bezeichnet werden als
Gly195*+Leu196*
oder G195*+L196*
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INSERTIONEN:
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Die
Insertion eines zusätzlichen
Aminosäurerests
wie z.B. ein Lysin nach G195 ist:
Gly195GlyLys oder G195GK;
oder
wenn mehr als ein Aminosäurerest insertiert wird, wie
z.B. ein Lys, Ala und Ser nach G195, ist das:
Gly195GlyLysAlaSer
oder G195GKAS
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In
solchen Fällen
wird/werden der/die insertierte(n) Aminosäurerest(e) durch Hinzufügen von
Kleinbuchstaben zur Zahl der Position des Aminosäurerests, der dem insertierten
Aminosäurerest(en)
vorangeht, nummeriert. Im vorstehenden Beispiel wären damit
die Sequenzen 194 bis 196:
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In
Fällen,
in denen ein Aminosäurerest
insertiert wird, der identisch zum bestehenden Aminosäurerest ist,
ist klar, dass ein Fall von Degeneration der Nomenklatur entsteht.
Wenn z.B. ein Glycin nach dem Glycin im vorstehend genannten Beispiel
insertiert wird, wäre
dies gezeigt durch G195GG. Dieselbe tatsächliche Änderung könnte genauso angezeigt werden
als A194AG für
die Änderung
von
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Solche
Beispiele werden dem Fachmann ersichtlich sein, und die Bezeichnung
G195GG und entsprechende Bezeichnungen für diesen Typ von Insertionen
sollen daher bedeuten, auch solche äquivalenten degenerierten Bezeichnungen
zu umfassen.
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FÜLLEN EINER LÜCKE:
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Wo
in einem Enzym eine Deletion im Referenzvergleich mit der Subtilisin
BPN'-Sequenz, die
zur Nummerierung verwendet wird, besteht, wird eine Insertion in
so einer Position bezeichnet als:
*36Asp oder *36D
für die Insertion
einer Asparaginsäure
in Position 36.
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VIELFACHE MODIFIKATIONEN
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Varianten,
die vielfache Modifikationen umfassen, werden durch Pluszeichen
getrennt, z.B.:
Arg170Tyr+Gly195Glu oder R170Y+G195E
was
Modifikationen in Positionen 170 und 195 darstellt, wobei jeweils
Tyrosin und Glutaminsäure
für Arginin und
Glycin substituiert werden.
Oder z.B. Tyr167 {Gly,Ala,Ser,Thr}+Arg170{G1y,Ala,Ser,Thr}
bezeichnet die Varianten
Tyr
167Gly+Arg170Gly, | Tyr167Gly+Arg170Ala, |
Tyr167Gly+Arg170Ser, | Tyr167Gly+Arg170Thr, |
Tyr167Ala+Arg170Gly, | Tyr167Ala+Arg170Ala, |
Tyr167Ala+Arg170Ser, | Tyr167Ala+Arg170Thr, |
Tyr167Ser+Arg170Gly, | Tyr167Ser+Arg170Ala, |
Tyr167Ser+Arg170Ser, | Tyr167Ser+Arg170Thr, |
Tyr167Thr+Arg170Gly, | Tyr167Thr+Arg170Ala, |
Tyr167Thr+Arg170Ser, | und
Tyr167Thr+Arg170Thr. |
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Diese
Nomenklatur ist besonders relevant in Bezug auf Modifikationen,
die zum Ziel haben, Aminosäurereste
mit spezifischen gemeinsamen Eigenschaften zu substituieren, ersetzen,
insertieren oder deletieren, wie Reste mit einer positiven Ladung
(K, R, H), einer negativen Ladung (D, E), oder konservative Aminosäuremodifikation(en)
von z.B.
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Tyr167{Gly,Ala,Ser,Thr}+Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr},
was bedeutet, dass eine kleine Aminosäure für eine andere kleine Aminosäure substituiert
wird. Siehe den Abschnitt „Ausführliche
Beschreibung der Erfindung" für weitere
Einzelheiten.
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Proteasen
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Enzyme,
die die Amidbindungen in Proteinsubstraten spalten, werden als Proteasen
klassifiziert oder (austauschbar) Peptidasen (siehe Walsh, 1979,
Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco,
Kapitel 3).
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Nummerierung von Aminosäurepositionen/-resten
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Wenn
nicht anders erwähnt
wird, entspricht die hierin verwendete Aminosäurenummerierung der der Subtilase
BPN'-Sequenz (BASBPN).
Für eine
weitere Beschreibung der BPN'-Sequenz,
siehe 1 und 2, oder Siezen et al., Protein
Engng. 4 (1991) 719-737.
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Serinproteasen
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Eine
Serinprotease ist ein Enzym, das die Hydrolyse von Peptidbindungen
katalysiert, und in dem sich ein essentieller Serinrest im aktivem
Zentrum befindet (White, Handler und Smith, 1973 „Principles
of Biochemistry," fünfte Ausgabe,
McGraw-Hill Book Company, NY, S. 271-272).
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Die
bakteriellen Serinproteasen haben Molekulargewichte im Bereich von
20.000 bis 45.000 Dalton. Sie werden durch Diisopropylfluorophosphat
inhibiert. Sie hydrolysieren einfache, endständige Ester und sind ähnlich in
Aktivität
zu eukaryotischem Chymotrypsin, auch eine Serinprotease. Ein engerer
Begriff, alkalische Protease, der eine Untergruppe abdeckt, spiegelt
das hohe pH-Optimum von pH 9,0 bis 11,0 einiger der Serinproteasen
wieder (für
eine Übersicht
siehe Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753).
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Subtilasen
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Eine
Untergruppe der Serinproteasen, die vorläufig als Subtilasen bezeichnet
werden, wurde von Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737
und Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523 vorgeschlagen. Sie
werden durch eine Homologieanalyse von mehr als 170 Aminosäuresequenzen
von Serinproteasen definiert, die vorher als Subtilisinartige Proteasen
bezeichnet wurden. Ein Subtilisin war vorher oft als eine Serinprotease
definiert, die durch Gram-positive Bakterien oder Pilze hergestellt
wird, und nach Siezen et al. ist es nun eine Untergruppe der Subtilasen.
Eine breite Vielfalt von Subtilasen wurde identifiziert, und die
Aminosäuresequenz
einer Anzahl von Subtilasen wurde bestimmt. Für eine ausführlichere Beschreibung solcher
Subtilasen und ihrer Aminosäuresequenzen
wird Bezug genommen auf Siezen et al. (1997).
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Eine
Untergruppe der Subtilasen, I-S1 oder „echte" Subtilisine, umfasst die „klassischen" Subtilisine wie
Subtilisin 168 (BSS168), Subtilisin BPN', Subitilisin Carlsberg (ALCALASE®,
NOVO NORDISK A/S) und Subtilisin DY (BSSDY).
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Eine
weitere Untergruppe der Subtilasen, I-S2 oder hoch alkalische Subtilisine,
wird durch Siezen et al. anerkannt (supra). Proteasen der Untergruppe
I-S2 werden als hoch alkalische Subtilisine beschrieben und umfassen
Enzyme wie Subtilisin PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Gist-Brocades
NV), Subtilisin 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK A/S), Subtilisin
147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVO NORDISK A/S), und
alkalische Elastase YaB (BSEYAB).
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Liste von Abkürzungen
für Subtilasen:
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I-S1
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- Subtilisin 168, BSS168 (BSSAS (Subtilisin amylosacchariticus),
- BSAPRJ (Subtilisin J), BSAPRN (Subtilisin NAT), BMSAMP (Mesentericopeptidase),
- Subtilisin BPN',
BASBPN,
- Subtilisin DY, BSSDY,
- Subtilisin Carlsberg, BLSCAR (BLKERA (Keratinase), BLSCA1, BLSCA2,
BLSCA3),
- BSSPRC, Serinprotease C
- sBSSPRD, Serinprotease D
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I-S2
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- Subtilisin Sendai, BSAPRS
- Subtilisin ALP 1, BSAPRQ,
- Subtilisin 147, Esperase® BLS147 (BSAPRM (SubtilisinAprM),
BAH101),
- Subtilisin 309, Savinase®, BLS309/BLSAVI (BSKSMK
(M-Protease),
- BAALKP (Subtilisin PB92, alkalophile alkalische Protease aus
Bacillus), BLSUBL (Subtilisin BL)),
- Alkalische Elastase YaB, BYSYAB,
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"SAVINASE®"
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SAVINASE® wird
von NOVO NORDISK A/S vertrieben. Es ist Subtilisin 309 von B. Lentus
und unterscheidet sich von BAALKP nur in einer Position (N87S. siehe 1 hierin).
SAVINASE® hat
die Aminosäuresequenz,
die in 1 als b) bezeichnet wird.
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Eltern-Subtilase
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Der
Begriff „Eltern-Subtilase" beschreibt eine
Subtilase, die gemäß Siezen
et al. (1991 und 1997) definiert ist. Für weitere Einzelheiten siehe
die unmittelbar vorstehende Beschreibung von „SUBTILASEN". Eine Eltern-Subtilase
kann auch eine Subtilase sein, die aus einer natürlichen Quelle isoliert wird,
wobei anschließende
Modifikationen gemacht wurden, wobei die Eigenschaft einer Subtilase
erhalten wird. Alternativ kann der Begriff „Eltern-Subtilase" auch als „Wildtyp-Subtilase" bezeichnet werden.
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Modifikation(en) einer
Subtilasevariante
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Der
Begriff „Modifikation(en)", wie hierin verwendet,
wird so definiert, dass er chemische Modifikationen einer Subtilase
und genetische Manipulationen der DNA, die die Subtilase kodiert,
einschließt.
Die Modifikation(en) kann Ersetzen der Aminosäureseitenkette(n), Substitution(en),
Deletion(en) und/oder Insertionen in oder bei der interessierenden
Aminosäure(n)
sein.
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Subtilasevariante
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Im
Zusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet der Begriff Subtilasevariante
oder mutierte Subtilase eine Subtilase, die von einem Organismus
hergestellt wurde, der eine Gen-Mutante exprimiert, die aus einem Eltern-Mikroorganismus
abgeleitet wurde, welcher ein ursprüngliches oder Eltern-Gen besaß und der
ein entsprechendes Elternenzym herstellte, wobei das Elterngen mutiert
wurde, um die Gen-Mutante herzustellen, von der die mutierte Subtilaseprotease
hergestellt wird, wenn sie in einem geeigneten Wirt exprimiert wird.
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Homologe Subtilasesequenzen
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Spezifische
Regionen der Schleifen des aktiven Zentrums und Aminosäureinsertionen
in diesen Schleifen von SAVINASE®-Subtilase
werden hierin zur Modifikation identifiziert, um eine erfindungsgemäße Subtilasevariante
zu erhalten.
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Jedoch
ist die Erfindung nicht auf Modifikationen dieser speziellen Subtilase
beschränkt,
sondern erstreckt sich auf andere Eltern-(Wildtyp)-Subtilasen, die
eine homologe Primärstruktur
zu der von SAVINASE® haben. Die Homologie
zwischen zwei Aminosäuresequenzen
wird in diesem Zusammenhang durch den Parameter „Identität" beschrieben.
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Um
den Grad an Identität
zwischen zwei Subtilasen zu bestimmen, kann die GAP-Routine des GCG-Pakets
Version 9.1 (infra) unter Verwendung derselben Einstellungen angewendet
werden. Das Ergebnis dieser Routine ist neben dem Aminosäure-Alignment
die Berechnung der „Prozent
Identität" zwischen den zwei
Sequenzen.
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Basierend
auf dieser Beschreibung ist es Routinearbeit für einen Fachmann, geeignete
homologe Subtilasen und entsprechende Regionen der Schleife des
aktiven Zentrums zu identifizieren, die erfindungsgemäß modifiziert
werden können.
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Waschleistung
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Die
Fähigkeit
eines Enzyms, den Abbau von verschiedenen natürlicherweise vorkommenden Substraten,
die auf den zu reinigenden Objekten vorhanden sind, während z.B.
dem Waschen oder Reinigen harter Oberflächen zu katalysieren, wird
oft als seine Fähigkeit
zum Waschen, Wasch-Fähigkeit,
Detergiereigenschaft, oder Waschleistung bezeichnet. Innerhalb dieser
Anmeldung wird der Begriff Waschleistung verwendet werden, um diese
Eigenschaft einzuschließen.
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Isolierte DNA-Sequenz
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Der
Begriff „isoliert", wenn er auf ein
DNA-Sequenzmolekül
angewendet wird, kennzeichnet, dass die DNA-Sequenz aus ihrer natürlichen
genetischen Umgebung entfernt wurde und daher frei von anderen äußeren oder
ungewollten kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form ist, die
geeignet ist zur Verwendung in genetisch manipulierten Proteinherstellungssystemen.
Solch isolierte Moleküle
sind die, die aus ihrer natürlichen
Umgebung abgetrennt werden, und schließen cDNA und genomische Klone
ein.
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Isolierte
DNA-Moleküle
der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen
sie gewöhnlich
in Verbindung gebracht werden, aber können natürlicherweise auftretende 5' und 3' untranslatierte Regionen
wie Promotoren und Terminatoren einschließen. Die Identifizierung von
verbundenen Regionen wird für
einen Fachmann offensichtlich sein (siehe zum Beispiel Dynan und
Tijan, Nature 316:774-78, 1985). Der Begriff „eine isolierte DNA-Sequenz" kann alternativ
als „eine
klonierte DNA-Sequenz" bezeichnet
werden.
-
Isoliertes Protein
-
Wenn
er auf ein Protein angewendet wird, zeigt der Begriff „isoliert" an, dass das Protein
aus seiner nativen Umgebung entfernt wurde.
-
In
einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im Wesentlichen
frei von anderen Proteinen, insbesondere anderen homologen Proteine
(d.h. „homologe
Verunreinigungen" (siehe
unten)).
-
Ein
isoliertes Protein ist mehr als 10 % rein, bevorzugt mehr als 20
% rein, weiter bevorzugt mehr als 30 % rein, wie durch SDS-PAGE
bestimmt wird. Weiterhin ist es bevorzugt, das Protein in einer
hoch gereinigten Form bereitzustellen, d.h. mehr als 40 % rein,
mehr als 60 % rein, mehr als 80 % rein, weiter bevorzugt mehr als
95 % rein und sogar noch weiter bevorzugt mehr als 99 % rein, wie
durch SDS-PAGE bestimmt wird.
-
Der
Begriff „isoliertes
Protein" kann alternativ
als „gereinigtes
Protein" bezeichnet
werden.
-
Homologe Verunreinigungen
-
Der
Begriff „homologe
Verunreinigungen" bedeutet
jegliche Verunreinigung (z.B. ein anderes Polypeptid als das erfindungsgemäße Polypeptid),
welche aus der homologen Zelle stammt, aus der das erfindungsgemäße Polypeptid
ursprünglich
erhalten wird.
-
Erhalten aus
-
Der
Begriff „erhalten
aus", wie hierin
in Zusammenhang mit einer spezifischen mikrobiellen Quelle verwendet,
bedeutet, dass das Polynukleotid und/oder Polypeptid von der spezifischen
Quelle, oder von einer Zelle, in die ein Gen aus der Quelle insertiert
wurde, hergestellt wird.
-
Substrat
-
Der
Begriff „Substrat", wie hierin in Zusammenhang
mit einem Substrat für
eine Protease verwendet, sollte in seiner breitesten Form interpretiert
werden als umfassend einer Substanz, die mindestens eine Peptidbindung
enthält,
die gegenüber
Hydrolyse durch eine Subtilisinprotease empfänglich ist.
-
Produkt
-
Die
Bezeichnung „Produkt", in Zusammenhang
mit einem Produkt verwendet, das aus einer enzymatischen Reaktion
einer Protease erhalten wird, sollte im Zusammenhang dieser Erfindung
interpretiert werden als einschließend die Produkte einer Hydrolysereaktion,
die eine Subtilaseprotease einbezieht. Ein Produkt kann das Substrat
in einer anschließenden
Hydrolysereaktion sein.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt
ein Alignment zwischen Subtilisin BPN' (a) und Savinase® (b),
unter Verwendung der vorstehend beschriebenen GAP-Routine.
-
1a zeigt
das Alignment zwischen Subtilisin BPN' und Savinase®, wie
aus WO 91/00345 erhalten.
-
2 zeigt
ein Alignment zwischen Subtilisin BPN' und Subtilisin Carlsberg, unter Verwendung
der vorstehend erwähnten
GAP-Routine.
-
2a zeigt
das Alignment zwischen Subtilisin BPN' und Subtilisin Carlsberg, wie aus WO
91/00345 erhalten.
-
3 zeigt
die dreidimensionale Struktur von Savinase (Eintrag in die Proteindatenbank
(PDB), „protein
data bank", 1SVN).
In der Abbildung ist die Schleife (b) des aktiven Zentrums angezeigt.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
In
einem ersten Gegenstand beziehen sich die erfindungsgemäßen Subtilasen
auf ein isoliertes (d.h. mehr als 10 % reines) Subtilaseenzym der
Untergruppen I-S1 und I-S2 mit mindestens einem zusätzlichen Aminosäurerest
in Position 99 der Schleife (b) des aktiven Zentrums von Position
95 bis 103, wobei der/die zusätzliche(n)
Aminosäurerest(e)
der Insertion von mindestens einem Aminosäurerest zwischen Positionen
99 und 100 entspricht.
-
Mit
anderen Worten sind die erfindungsgemäßen Subtilasen dadurch gekennzeichnet,
dass sie eine Schleife (b) der Region des aktiven Zentrums von mehr
als 9 Aminosäureresten
umfassen, und wobei der zusätzliche
Aminosäurerest
insertiert ist oder betrachtet werden kann als insertiert zu sein
zwischen Positionen 99 und 100, verglichen zur Eltern- oder einer
bekannten Wildtypsubtilase.
-
Eine
Subtilase gemäß des ersten
Gegenstands der Erfindung kann eine Eltern- oder Wildtypsubtilase sein,
die aus der Natur identifiziert und isoliert wurde.
-
Nach
einer solchen Eltern-Wildtypsubtilase kann durch im Stand der Technik
bekannte Standardverfahren spezifisch gescreent werden. Eine bevorzugte
Art, dies zu machen, kann spezifisches PCR-Amplifizieren von DNA-Regionen
sein, von denen bekannt ist, dass sie Schleifen des aktiven Zentrums
in Subtilasen aus zahlreichen verschiedenen Mikroorganismen, bevorzugt
verschiedenen Bacillusstämmen,
kodieren.
-
Subtilasen
sind eine Gruppe konservierter Enzyme im Sinn, dass ihre DNA und
Aminosäuresequenzen
homolog sind.
-
Dementsprechend
ist es möglich,
relativ spezifische Primer zu konstruieren, die Schleifen des aktiven Zentrums
flankieren.
-
Eine
Art, dies zu machen, ist das Untersuchen eines Alignments verschiedener
Subtilasen (siehe z.B. Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523).
Ausgehend davon ist es eine Routinearbeit für einen Fachmann, PCR-Primer
zu konstruieren, die die Schleife des aktiven Zentrums flankieren,
die der Schleife (b) des aktiven Zentrums zwischen Aminosäurerest
95 bis 103 in einer beliebigen der I-S1-Gruppe oder I-S2-Gruppen wie
von BLSAVI entspricht. Beim Verwenden solcher PCR-Primer, um DNA
aus einer Anzahl von verschiedenen Mikroorganismen, bevorzugt verschiedenen
Bazillusstämmen,
zu amplifizieren, gefolgt durch DNA-Sequenzierung der amplifizierten
PCR-Fragmente, wird es möglich
sein, Stämme
zu identifizieren, die Subtilasen dieser Gruppen herstellen, die
eine im Vergleich zu z.B. BLSAVI längere Region des aktiven Zentrums
umfassen, entsprechend der Schleifenregion des aktiven Zentrums
von Positionen 95 bis 103, und wo eine Insertion zwischen Positionen
99 und 100 als existierend betrachtet werden kann. Nachdem der Stamm
und eine teilweise DNA-Sequenz einer solchen interessierenden Subtilase
identifiziert wurde, ist es Routinearbeit für einen Fachmann, Klonieren,
Expression und Reinigung solch einer erfindungsgemäßen Subtilase
zu vollenden. Jedoch wird in Betracht gezogen, dass ein erfindungsgemäßes Subtilaseenzym überwiegend
eine Variante einer Elternsubtilase ist.
-
In Übereinstimmung
damit betrifft eine Ausführungsform
der Erfindung ein isoliertes Subtilaseenzym gemäß dem ersten Gegenstand der
Erfindung, wobei das Subtilaseenzym eine konstruierte Variante ist,
die eine längere
Schleife (b) des aktiven Zentrums als ihr Elternenzym besitzt, indem
sie mindestens eine Aminosäureinsertion
zwischen Aminosäureresten
99 und 100 besitzt.
-
Die
erfindungsgemäßen Subtilasen
weisen exzellente Waschleistung in einem Detergens auf, und, wenn
das Enzym eine konstruierte Variante ist, eine verbesserte Waschleistung
in einem Detergens im Vergleich zu der am nächsten zu ihr verwandten Subtilase,
wie Subtilisin 309.
-
Verschiedene
Subtilaseerzeugnisse werden eine verschiedene Waschleistung in verschiedenen
Arten von Detergenszusammensetzungen aufweisen. Eine erfindungsgemäße Subtilase
besitzt im Vergleich zu ihrer am nächsten Verwandten verbesserte
Waschleistung in der Mehrzahl solch verschiedener Arten von Detergenszusammensetzungen.
-
Vorzugsweise
besitzt ein erfindungsgemäßes Subtilaseenzym
eine verbesserte Waschleistung im Vergleich zu seinem nächsten Verwandten
in der in Beispiel 3 hierin gezeigten Waschmittelzusammensetzung (vide
infra).
-
Um
zu bestimmen, ob eine gegebene Subtilase-Aminosäuresequenz (wobei es unerheblich
ist, ob die Subtilasesequenz eine Eltern-Wildtyp-Subtilasesequenz
oder eine Subtilasesequenz einer Variante hergestellt durch irgendein
anderes Verfahren als durch ortspezifische Mutagenese ist) sich
innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung befindet, kann die folgende
Verfahrensweise verwendet werden:
- i) Alignment
der Subtilasesequenz mit der Aminosäuresequenz von Subtilisin BPN' (siehe Abschnitt „Definitionen" hierin (vide supra));
- ii) basierend auf dem Alignment, das in Schritt i) durchgeführt wird,
Identifizieren der Schleife (b) des aktiven Zentrums in der Subtilasesequenz,
die der Schleife (b) der Region des aktiven Zentrums von Subtilisin BPN', umfassend die Region
(beide endständigen
Aminosäuren
eingeschlossen) zwischen Aminosäurerest
95 bis 103 entspricht;
- iii) Bestimmen, ob die Schleife (b) des aktiven Zentrums in
der Subtilasesequenz, die in Schritt ii) identifiziert wird, länger ist
als die entsprechende Schleife des aktiven Zentrums in BLSAVI, und
ob die Verlängerung der
Insertion von mindestens einem Aminosäurerest zwischen Positionen
99 und 100 entspricht.
-
Wenn
dies der Fall ist, dann ist die untersuchte Subtilase eine Subtilase
innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
-
Das
im vorstehenden Schritt i) durchgeführte Alignment wird wie vorstehend
beschrieben unter Verwendung der GAP-Routine durchgeführt.
-
Basierend
auf dieser Beschreibung ist es eine Routinetätigkeit für einen Fachmann, die Schleife
(b) des aktiven Zentrums in einer Subtilase zu identifizieren und
zu bestimmen, ob die fragliche Subtilase sich innerhalb des Schutzbereichs
der Erfindung befindet. Wenn eine Variante durch ortspezifische
Mutagenese konstruiert wird, ist es natürlich vorher bekannt, ob die
Subtilasevariante sich innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung
befindet.
-
Eine
erfindungsgemäße Subtilasevariante
kann durch im Stand der Technik bekannte Standardtechniken wie ortspezifische-/Zufalls-Mutagenese
oder durch DNA-Shuffling verschiedener Subtilasesequenzen konstruiert
werden. Siehe den Abschnitt „HERSTELLEN
EINER SUBTILASEVARIANTE" und
Material und Methoden hierin (vide infra) für weitere Einzelheiten.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein erfindungsgemäßes isoliertes Subtilaseenzym,
wobei die Insertion zwischen den Positionen 99 und 100 mindestens
zwei Aminosäuren
im Vergleich zur entsprechenden Schleife des aktiven Zentrums in
BLSAVI umfasst.
-
In
weiteren Ausführungsformen
betrifft die Erfindung ein isoliertes Subtilaseenzym umfassend mindestens
eine Insertion, ausgewählt
aus der Gruppe umfassend (in BASBPN-Nummerierung):
S99SA
S99ST
S99SG
S99SS
S99SQ
S99SI
S99TP
S99TQ
S99TN
S99SP
-
Weiterhin
betrifft die Erfindung Subtilasen umfassend die folgenden mehrfachen
Insertionen an Position 99
S99SSG
oder eine beliebige
der folgenden Kombinationen
S99ASG + S101T
S99TG + S101G
-
Es
ist im Stand der Technik gut bekannt, dass von einer so genannten
konservativen Substitution eines Aminosäurerests mit einem ähnlichen
Aminosäurerest
erwartet werden kann, dass sich nur eine geringe Änderung
der Eigenschaft des Enzyms ergibt.
-
Die
nachstehende Tabelle III zählt
Gruppen von konservativen Aminosäuresubstitutionen
auf. Tabelle
III Konservative
Aminosäuresubstitutionen
Gemeinsame
Eigenschaften | Aminosäure |
Basisch
(positive Ladung) | K
= Lysin |
| H
= Histidin |
Sauer
(negative Ladung) | E
= Glutaminsäure |
| D
= Asparginsäure |
Polar | Q
= Glutamin |
| N
= Asparagin |
Hydrophob | L
= Leucin |
| I
= Isoleucin |
| V
= Valin |
| M
= Methionin |
Aromatisch | F
= Phenylalanin |
| W
= Tryptophan |
| Y
= Tyrosin |
Klein | G
= Glycin |
| A
= Alanin |
| S
= Serin |
| T
= Threonin |
-
Gemäß diesem
Prinzip wird von Subtilasevarianten, die konservative Substitutionen
wie G97A+A98AS+S99G, G97S+A98AT+S99A umfassen, erwartet, dass sie
Eigenschaften aufweisen, die voneinander nicht stark unterschiedlich
sind.
-
Basierend
auf den hierin offenbarten und/oder beispielhaft gezeigten Subtilasevarianten,
ist es Routinearbeit für
einen Fachmann, geeignete konservative Modifikation(en) dieser Varianten
zu identifizieren, um andere Subtilasevarianten zu erhalten, die ähnliche
verbesserte Waschleistung aufweisen.
-
Gemäß der Erfindung
gehören
die erfindungsgemäßen Subtilasen
zu den Untergruppen I-S1
und I-S2, besonders zu Untergruppe I-S2, sowohl zum Isolieren von
neuen erfindungsgemäßen Enzymen
aus der Natur oder aus der künstlichen
Erschaffung von Diversität,
als auch zum Entwerfen und Herstellen von Varianten aus einer Elternsubtilase.
In Bezug auf Varianten aus der Untergruppe I-S1 ist es bevorzugt,
eine Elternsubtilase aus der Gruppe umfassend BSS168 (BSSAS, BSAPRJ,
BSAPRN, BMSAMP), BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1, BLSCA2,
BLSCA3), BSSPRC und BSSPRD, oder funktionsfähige Varianten davon, die die
Eigenschaft von Untergruppe I-S1 beibehalten haben, auszuwählen.
-
Im
Bezug auf Varianten von Untergruppe I-S2 ist es bevorzugt, eine
Elternsubtilase aus der Gruppe umfassend BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM,
BAH101), BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL), BYSYAB und BSAPRS, oder
funktionsfähige
Varianten davon, die die Eigenschaft der Untergruppe I-S2 beibehalten
haben, auszuwählen.
Insbesondere ist die Elternsubtilase BLSAVI (SAVINASE® NOVO
NORDISK A/S), und eine bevorzugte erfindungsgemäße Subtilasevariante ist demgemäß eine Variante
von SAVINASE®.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst auch eine beliebige der vorstehend
erwähnten
erfindungsgemäßen Subtilasen
in Kombination mit einer beliebigen anderen Modifikation der Aminosäuresequenz
davon. Besonders Kombinationen mit anderen im Stand der Technik
bekannten Modifikationen, um dem Enzym verbesserte Eigenschaften
bereitzustellen, werden in Betracht gezogen. Der Stand der Technik
beschreibt eine Anzahl von Subtilasevarianten mit verschiedenen
verbesserten Eigenschaften, und eine Anzahl dieser werden im Abschnitt „Hintergrund
der Erfindung" hierin
erwähnt
(vide supra). Diese Referenzen werden hier als Referenzen offenbart,
um eine Subtilasevariante zu identifizieren, die vorteilhafterweise
mit einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante
kombiniert werden kann.
-
Solche
Kombinationen umfassen die Positionen: 222 (verbessern die Stabilität gegenüber Oxidation), 218
(verbessert die thermische Stabilität), Substitutionen in den Ca-Bindungsstellen,
die das Enzym stabilisieren, z.B. Position 76, und viele andere,
die im Stand der Technik ersichtlich sind.
-
In
weiteren Ausführungsformen
kann eine erfindungsgemäße Subtilasevariante
vorteilhafterweise mit einer oder mehreren Modifikation(en) in einer
beliebigen der Positionen kombiniert werden:
27, 36, 57, 76,
87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 und
274.
-
Speziell
werden die folgenden Varianten von BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK und BAALKP
als geeignet für
eine Kombination betrachtet:
K27R, *36D, S57P, N76D, S87N,
G97N, S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167, R170,
Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L und T274A.
-
Weiterhin
weisen Varianten, die eine beliebige der Varianten S101G+V104N,
S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I oder
N76D+V104A oder andere Kombinationen dieser Mutationen (V104N, S101G,
K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) in Kombination mit einer
oder mehreren beliebigen der vorstehend genannten Modifikation(en)
verbesserte Eigenschaften auf.
-
Noch
weitere Subtilasevarianten des/der Hauptgegenstands/-gegenstände der
Erfindung werden bevorzugt mit einer oder mehreren Modifikation(en)
in einer beliebigen der Positionen 129, 131, 133 und 194 kombiniert,
bevorzugt als Modifikationen 129K, 131H, 133P, 133D und 194P, und
am meisten bevorzugt als Modifikationen P129K, P131H, A133P, A133D
und A194P. Von jeder beliebigen dieser Modifikation(en) wird erwartet,
dass sie ein höheres
Expressionsniveau einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante bei der
Herstellung davon bereitstellt.
-
Demgemäß betrifft
ein noch weiterer Gegenstand der Erfindung eine erfindungsgemäße Variante,
wobei die Modifikation ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
-
HERSTELLEN (EINER SUBTILASEVARIANTE
-
Im
Stand der Technik sind viele Verfahren zum Klonieren einer erfindungsgemäßen Subtilase
und zum Einführen
von Insertionen in Gene (z.B. Subtilasegene) bekannt, siehe die
Referenzen, die im Abschnitt „HINTERGRUND
DER ERFINDUNG" zitiert
werden.
-
Im
Allgemeinen können
Standardverfahrensweisen zum Klonieren von Genen und zum Einführen von Insertionen
(zufällig
und/oder ortspezifisch) in die Gene verwendet werden, um eine erfindungsgemäße Subtilasevariante
zu erhalten. Für
eine weitere Beschreibung von geeigneten Techniken wird auf die
Beispiele hierin Bezug genommen (vide infra) und Sambrook et al.
(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor
lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) "Current protocols
in Molecular Biology".
John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., und Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological
Methods for Bacillus".
John Wiley and Sons, 1990); und WO 96/34946.
-
Weiterhin
kann eine erfindungsgemäße Subtilasevariante
durch Standardtechniken zum künstlichen Erschaffen
von Diversität
konstruiert werden, wie durch DNA-Shuffling von verschiedenen Subtilasegenen (WO
95/22625; Stemmer WPC, Nature 370:389-91 (1994)). DNA-Shuffling
von z.B. dem Savinase®-kodierenden Gen mit einer
oder mehreren partiellen Subtilasesequenzen, die in der Natur identifiziert
wurden, eine Schleifenregion (b) des aktiven Zentrums zu umfassen,
die länger
als die Schleife (b) des aktiven Zentrums von Savinase ist, werden
nach anschließendem
Screenen auf Varianten mit verbesserter Waschleistung erfindungsgemäße Subtilasevarianten
bereitstellen.
-
EXPRESSIONSVEKTOREN
-
Ein
rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt umfasst,
das das erfindungsgemäße Enzym
kodiert, kann ein beliebiger Vektor sein, der günstig rekombinanten DNA-Verfahrensweisen
unterzogen werden kann. Die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle
abhängen,
in die er eingeführt
werden soll. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor
sein, d.h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit besteht,
dessen Replikation unabhängig
von der chromosomalen Replikation ist, z.B. ein Plasmid. Alternativ
kann der Vektor einer sein, der nach Einführen in eine Wirtszelle in
das Wirtszellgenom teilweise oder in seiner Gesamtheit integriert
wird, und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in die er integriert
wurde, repliziert wird.
-
Der
Vektor ist bevorzugt ein Expressionsvektor, in dem die DNA-Sequenz,
die das erfindungsgemäße Enzym
kodiert, funktionell mit zusätzlichen
Abschnitten verbunden ist, die zur Transkription der DNA benötigt werden.
Im Allgemeinen wird der Expressionsvektor aus Plasmid- oder viraler
DNA abgeleitet, oder er kann Elemente von beiden enthalten. Der
Begriff „funktionell
verbunden" bedeutet,
dass die Abschnitte so angeordnet sind, dass sie in Übereinstimmung
mit ihren beabsichtigten Zwecken funktionieren, z.B. die Transkription in
einem Promotor beginnt und durch die für das Enzym kodierende DNA-Sequenz
fortschreitet.
-
Der
Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die transkriptionelle
Aktivität
in der gewählten Wirtszelle
zeigt, und kann aus Genen abgeleitet werden, die für Proteine
kodieren, die entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle sind.
-
Beispiele
von geeigneten Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen
schließen
den Promotor des maltogenen Amylasegens aus Bacillus stearothermophilus,
das alpha-Amylasegen aus Bacillus licheniformis, das alpha-Amylasegen
aus Bacillus amyloliquefaciens, das alkalische Proteasegen aus Bacillus subtilis
oder das Xylosidasegen aus Bacillus pumilus oder Promotoren der
Phagen Lambda PR oder PL oder die
Promotoren lac, trp oder tac aus E. coli ein.
-
Die
DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann auch,
wenn nötig,
funktionell mit einem geeigneten Terminator verbunden sein.
-
Der
erfindungsgemäße rekombinante
Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor
erlaubt, in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren.
-
Der
Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z.B. ein
Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, oder
ein Gen, das eine Resistenz gegenüber z.B. Antibiotika wie Kanamycin, Chloramphenicol,
Erythromycin, Tetracyclin, Spectinomycin oder ähnlichem, oder eine Resistenz
gegenüber Schwermetallen
oder Herbiziden kodiert.
-
Um
ein Enzym der vorliegenden Erfindung in den sekretorischen Weg der
Wirtszellen zu steuern, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch
bekannt als „leader"-Sequenz, präpro-Sequenz
oder prä-Sequenz)
im rekombinanten Vektor bereitgestellt werden. Die sekretorische
Signalsequenz wird im korrekten Leserahmen an die DNA-Sequenz angefügt, die
das Enzym kodiert. Sekretorische Signalsequenzen werden gewöhnlich an 5'-Position zur DNA-Sequenz, die das Enzym
kodiert, gestellt. Die sekretorische Signalsequenz kann die sein, die
normalerweise mit dem Enzym verbunden ist, oder kann aus einem Gen
stammen, das ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
-
Die
Verfahrensweisen, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, die
jeweils die vorliegenden Enzyme, den Promotor und wahlweise die
Terminator und/oder sekretorische Signalsequenz kodieren, zu ligieren,
oder um diese Sequenzen durch geeignete PCR-Amplifikationsmaßnahmen anzuordnen, und um
sie in geeignete Vektoren zu insertieren, die die nötige Information
zur Replikation oder Integration enthalten, sind dem Fachmann gut
bekannt (siehe z.B. Sambrook et al., op.cit.).
-
WIRTSZELLE
-
ie
in die Wirtszelle eingeführte
DNA-Sequenz, die das vorliegende Enzym kodiert, kann entweder homolog
oder heterolog zur fraglichen Wirtszelle sein. Wenn sie zur Wirtszelle
homolog ist, d.h. von der Wirtszelle in der Natur hergestellt wird,
wird sie typischerweise funktionsfähig mit einer anderen Promotorsequenz
oder, wenn anwendbar, einer anderen sekretorischen Signalsequenz
und/oder Terminatorsequenz als in ihrer natürlichen Umgebung verbunden
werden. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „homolog" eine DNA-Sequenz einschließt, die ein Enzym kodiert,
das zum fraglichen Wirtsorganismus nativ ist. Es wird beabsichtigt,
dass der Begriff „heterolog" eine DNA-Sequenz
einschließt,
die durch die Wirtszelle in der Natur nicht exprimiert wird. Daher
kann die DNA-Sequenz von einem anderen Organismus sein oder sie
kann eine synthetische Sequenz sein.
-
Die
Wirtszelle, in die das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt oder der erfindungsgemäße rekombinante
Vektor eingeführt
wird, kann eine beliebige Zelle sein, die die Fähigkeit besitzt, das vorliegende
Enzym herzustellen, und schließt
Bakterien, Hefe, Pilze und höhere
eukaryotische Zellen einschließlich
Pflanzen ein.
-
Beispiele
für bakterielle
Wirtszellen, die beim Kultivieren die Fähigkeit besitzen, das erfindungsgemäße Enzym
herzustellen, sind grampositive Bakterien wie Stämme von Bacillus, wie Stämme von
B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus,
B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulars,
B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis, oder Stämme von
Streptomyces, wie S. lividans oder S. murinus, oder gramnegative
Bakterien wie Escherichia coli.
-
Die
Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation,
Elektroporation, Konjugation, oder durch Verwendung kompetenter
Zellen in einer per se bekannten Weise bewirkt werden (siehe Sambrook
et al., supra).
-
Wenn
das Enzym in Bakterien wie E. coli exprimiert wird, kann das Enzym
im Cytoplasma typischerweise als unlösliche Körnchen zurückgehalten werden (bekannt
als „inclusion
bodies", Einschlusskörper), oder kann
in den periplasmatischen Raum durch eine bakterielle Sekretionssequenz
gerichtet werden. Im ersteren Fall werden die Zellen lysiert, und
die Körnchen
werden gewonnen und denaturiert, wobei das Enzym danach durch Verdünnen des
denaturierenden Mittels zurückgefaltet
wird. Im letzteren Fall kann das Enzym aus dem periplasmatischen
Raum durch Aufbrechen der Zellen gewonnen werden, z. B. durch Schallbehandlung
oder osmotischen Schock, um die Inhalte des periplasmatischen Raums
freizusetzen und das Enzym zu gewinnen.
-
Wenn
das Enzym in grampositiven Bakterien wie Bacillus- oder Streptomyces-Stämmen exprimiert wird,
kann das Enzym im Cytoplasma zurückgehalten
werden, oder kann in das extrazelluläre Medium durch eine bakterielle
Sekretionssequenz gerichtet werden. Im letzteren Fall kann das Enzym
wie nachstehend beschrieben aus dem Medium gewonnen werden.
-
VERFAHREN
ZUM HERSTELLEN VON SUBTILASE
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, ein isoliertes
erfindungsgemäßes Enzym
herzustellen, wobei eine geeignete Wirtszelle, die mit einer das
Enzym kodierenden DNA-Sequenz transfiziert wurde, unter Bedingungen
kultiviert wird, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das
resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
-
Wenn
ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das Enzym
kodiert, in eine heterologe Wirtszelle transformiert wird, ist es
möglich,
eine heterologe rekombinante Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms
zu ermöglichen.
-
Dabei
ist es möglich,
eine hoch gereinigte Subtilasezusammensetzung herzustellen, die
dadurch charakterisiert ist, dass sie frei von homologen Verunreinigungen
ist.
-
In
diesem Zusammenhang bedeutet homologe Verunreinigungen jegliche
Verunreinigungen (z. B. andere Polypeptide als das erfindungsgemäße Enzym),
die aus der homologen Zelle stammen, aus der das erfindungsgemäße Enzym
ursprünglich
erhalten wird.
-
Das
Medium, das verwendet wird, um die transformierten Wirtszellen zu
kultivieren, kann ein beliebiges gewöhnliches Medium sein, das zum
Wachsenlassen der fraglichen Wirtszellen geeignet ist. Die exprimierte
Subtilase kann geeigneterweise in das Kulturmedium sekretiert werden
und kann davon durch gut bekannte Verfahrensweise gewonnen werden,
einschließlich
Abtrennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration,
Fällen
proteinöser
Bestandteile des Mediums mit Hilfe eines Salzes wie Ammoniumsulfat,
gefolgt von chromatographischen Verfahrensweisen wie Ionenaustauschchromatographie,
Affinitätschromatographie
oder Ähnlichem.
-
VERWENDUNG EINER ERFINDUNGEMÄßEN SUBTILASEVARIANTE
-
Eine
erfindungsgemäße Subtilase-Protease-Variante
kann für
eine Anzahl von industriellen Anwendungen verwendet werden, insbesondere
innerhalb der Detergensindustrie.
-
Weiterhin
betrifft die Erfindung eine Enzymzusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Subtilasevariante
umfasst. Eine Zusammenfassung von bevorzugten industriellen Anwendungen
und entsprechenden bevorzugten Enzymzusammensetzungen werden nachstehend
beschrieben.
-
Es
ist nicht beabsichtigt, dass diese Zusammenfassung in irgendeiner
Weise eine vollständige
Liste von geeigneten Anwendungen einer erfindungsgemäßen Subtilasevariante
ist. Eine erfindungsgemäße Subtilasevariante
kann in anderen im Stand der Technik bekannten industriellen Anwendungen
verwendet werden, um die Verwendung einer Protease, insbesondere
einer Subtilase, einzuschließen.
-
DETERGENSZUSAMMENSETZUNGEN
UMFASSEND DIE ENZYMMUTANTEN
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymmutanten
in Reinigungs- und Detergenszusammensetzungen, und solche Zusammensetzungen,
die die Subtilisin-Enzymmutanten umfassen. Solche Reinigungs- und Detergenszusammensetzungen
sind im Stand der Technik gut beschrieben, und es wird Bezug genommen
auf WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011 für eine weitere Beschreibung
von geeigneten Reinigungs- und Detergenszusammensetzungen.
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Weiterhin
zeigen das/die nachstehende(n) Beispiel(e) die Verbesserung der
Waschleistung für
eine Anzahl von erfindungsgemäßen Subtilasevarianten.
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Detergenszusammensetzungen
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Das
erfindungsgemäße Enzym
kann zu einer Detergenszusammensetzung zugefügt werden und damit ein Bestandteil
davon werden.
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Die
erfindungsgemäße Detergenszusammensetzung
kann z. B. als eine Detergenszusammensetzung zum Hand- oder Maschinenwaschen
formuliert werden, einschließlich
einer Zusatzstoffzusammensetzung für Wäsche, geeignet zum Vorbehandeln
von beschmutzten Geweben und eine zum Spülen zugefügte Zusammensetzung zum Weichmachen
von Gewebe, oder kann als eine Detergenszusammensetzung formuliert
werden zur Verwendung in allgemeinen Haushaltsbetätigungen
zum Reinigen harter Oberflächen,
oder kann für Betätigungen
zum Geschirrspülen
von Hand oder mit einer Maschine formuliert werden.
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In
einem speziellen Gegenstand stellt die Erfindung einen Detergenszusatzstoff
bereit, der das erfindungsgemäße Enzym
umfasst. Der Detergenszusatzstoff und die Detergenszusammensetzung
können
ein oder mehrere andere Enzyme, wie eine Protease, eine Lipase,
eine Cutinase, eine Amylase, eine Carbohydrase, eine Cellulase,
eine Pectinase, eine Mannanase, eine Arabinase, eine Galactanase,
eine Xylanase, eine Oxidase, z. B. eine Laccase und/oder eine Peroxidase,
umfassen.
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Im
Allgemeinen sollten die Eigenschaften des/der gewählten Enzym(e)
mit dem gewählten
Detergens vereinbar sein, (d.h. pH-Optimum, Vereinbarkeit mit anderen
enzymatischen und nicht-enzymatischen Inhaltsstoffen, etc.), und
das/die Enzym(e) sollten in wirksamen Mengen vorhanden sein.
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Proteasen:
Geeignete Proteasen schließen
die von tierischem, pflanzlichen oder mikrobiellem Ursprung ein.
Ein mikrobieller Ursprung ist bevorzugt. Chemisch modifizierte oder
bezüglich
der Proteine technisch veränderte
Mutanten sind eingeschlossen. Die Protease kann eine Serinprotease
oder eine Metalloprotease sein, bevorzugt eine alkalische mikrobielle
Protease oder eine trypsinartige Protease. Beispiele für alkalische
Proteasen sind Subtilisine, besonders die abgeleitet aus Bacillus,
z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin
147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279). Beispiele für trypsinartige Proteasen
sind Trypsin (z. B. mit Ursprung aus Schwein oder Rind) und die
Fusarium-Protease, beschrieben in WO 89/06270 und WO 94/25583.
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Beispiele
nützlicher
Proteasen sind die Varianten, die in WO 92/19729, WO 98/20115, WO
98/20116 und WO 98/34946 beschrieben werden, besonders die Varianten
mit Substitutionen in einer oder mehreren der folgenden Positionen:
27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206,
218, 222, 224, 235 und 274.
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Bevorzugte
im Handel erhältliche
Proteaseenzyme schließen
ein: AlcalaseTM, SavinaseTM,
PrimaseTM, DuralaseTM,
EsperaseTM und KannaseTM (Novo
Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect
OxPTM, FN2TM und
FN3TM (Genencor International Inc.).
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Lipasen:
Geeignete Lipasen schließen
die aus bakteriellem oder Pilz-Ursprung ein. Chemisch modifizierte
oder bezüglich
der Proteine technisch veränderte
Mutanten sind eingeschlossen. Beispiele für nützliche Lipasen schließen Lipasen
aus Humicola (Synonym Thermomyces), z. B. von H. lanuginosa (T.
lanuginosus) wie in
EP 258 068 und
EP 305 216 beschrieben oder
aus H. insolens wie in WO 96/13580 beschrieben, eine Pseudomonas-Lipase,
z. B. aus P. alcaligenes oder P. pseudoalcaligenes (
EP 218 272 ), P. cepacia (
EP 331 376 ), P. stutzeri (
GB 1,372,034 ), P. fluorescens, Pseudomonas
sp.-Stamm (SD 705 (WO 95/06720 und WO 96/27002), P. wisconsinensis
(WO 96/12012), eine Bacillus-Lipase, z. B. aus B. subtilis (Dartois
et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B.
stearothermophilus (JP 64/744992) oder B. pumilus (WO 91/16422)
ein.
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Andere
Beispiele sind Lipasevarianten wie die beschrieben in WO 92/05249,
WO 94/01541,
EP 407 225 ,
EP 260 105 , WO 95/35381,
WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO
97/04079 und WO 97/07202.
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Bevorzugte,
im Handel erhältliche
Lipaseenzyme schließen
LipolaseTM und Lipolase UltraTM (Novo Nordisk
A/S) ein.
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Amylasen:
Geeignete Amylasen (α und/oder β) schließen die
aus bakteriellem oder Pilz-Ursprung
ein. Chemisch modifizierte oder bezüglich der Proteine technisch
veränderte
Mutanten sind eingeschlossen. Amylasen schließen z. B. α-Amylasen erhalten aus Bacillus
ein, z. B. ein spezieller Stamm von B. licheniformis, in weiteren
Einzelheiten beschrieben in
GB
1,296,839 .
-
Beispiele
für nützliche
Amylasen sind die in WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 und WO 97/43424,
besonders die Varianten mit Substitutionen in einer oder mehreren
der folgenden Positionen: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154,
156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391,
408 und 444.
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Im
Handel erhältliche
Amylasen sind DuramylTM, ThermamylTM, FungamylTM und
BANTM (Novo Nordisk A/S), RapidaseTM und PurastarTM (von
Genencor International, Inc.).
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Cellulasen:
Geeignete Cellulasen schließen
die aus bakteriellem oder Pilz-Ursprung ein. Chemisch modifizierte
oder bezüglich
der Proteine technisch veränderte
Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen schließen Cellulasen
aus den Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium,
z. B. die Pilz-Cellulasen hergestellt aus Humicola insolens, Myceliophthora
thermophila und Fusarium oxysporum, offenbart in
US 4,435,307 ,
US 5,648,263 ,
US 5,691,178 ,
US 5,776,757 und WO 89/09259 ein.
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Besonders
geeignete Cellulasen sind die alkalischen oder neutralen Cellulasen,
die die Vorteile von Farbpflege haben. Beispiele solcher Cellulasen
sind Cellulasen beschrieben in
EP
0 495 257 ,
EP 0 531
372 , WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Andere Beispiele
sind Cellulasevarianten, wie die beschrieben in WO 94/07998,
EP 0 531 315 ,
US 5,457,046 ,
US 5,686,593 ,
US 5,763,254 , WO 95/24471, WO 98/12307
und PCT/DK98/00299.
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Im
Handel erhältliche
Cellulasen schließen
CelluzymeTM und CarezymeTM (Novo
Nordisk A/S), ClazinaseTM und Puradax HATM (Genencor International Inc.) und KAC-500(B)TM (Kao Corporation) ein.
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Peroxidasen/Oxidasen:
Geeignete Peroxidasen/Oxidasen schließen die aus pflanzlichem, bakteriellem
oder Pilz-Ursprung ein. Chemisch modifizierte oder bezüglich der
Proteine technisch veränderte
Mutanten sind eingeschlossen. Beispiele für nützliche Peroxidasen schließen Peroxidasen
aus Coprinus, z. B. aus C. cinereus und Varianten davon, wie die
beschrieben in WO 93/24618, WO 95/10602 und WO 98/15257 ein.
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Im
Handel erhältliche
Peroxidasen schließen
GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S) ein.
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Das/die
Detergensenzym(e) können
in eine Detergenszusammensetzung durch Zufügen getrennter Zusatzstoffe,
die ein oder mehrere Enzyme enthalten, oder durch Zufügen eines
kombinierten Zusatzstoffes, der alle diese Enzyme enthält, eingeschlossen
werden. Ein erfindungsgemäßer Detergenszusatzstoff,
d.h. ein einzelner Zusatzstoff oder ein kombinierter Zusatzstoff
kann z. B. als ein Granulat, eine Flüssigkeit, eine Aufschlämmung, etc.
formuliert werden. Bevorzugte Detergenszusatzstoffformulierungen
sind Granulate, insbesondere nicht-staubende Granulate, Flüssigkeiten,
insbesondere stabilisierte Flüssigkeiten,
oder Aufschlämmungen.
Nicht-staubende Granulate können
z. B. wie in
US 4,106,991 und
4,661,452 hergestellt werden
und können
gegebenenfalls durch im Stand der Technik bekannte Verfahren beschichtet
werden. Beispiele für wachsartige
Beschichtungsmaterialien sind Polyethylenoxid-Produkte (Polyethylenglykol,
PEG) mit mittleren Molgewichten von 1000 bis 20.000; ethoxylierte
Nonylphenole mit 16 bis 50 Ethylenoxid-Einheiten; ethoxylierte Fettalkohole,
in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in
denen 15 bis 80 Ethylenoxid-Einheiten sind; Fettalkohole, Fettsäuren, und
Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende
Beschichtungsmaterialien, die zur Anwendung in Flüssigbetttechniken
geeignet sind, werden in
GB 1483591 genannt.
Flüssige
Enzymzubereitungen können
z. B. durch Zufügen
eines Polyols wie Propylenglykol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols,
Milchsäure
oder Borsäure
gemäß etablierter
Verfahren stabilisiert werden. Geschützte Enzyme können gemäß dem in
EP 238,216 offenbarten Verfahren
hergestellt werden.
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Die
erfindungsgemäße Detergenszusammensetzung
kann in einer beliebigen geeigneten Form sein, z. B. eine Stange,
eine Tablette, ein Pulver, ein Körnchen,
eine Paste oder eine Flüssigkeit.
Ein flüssiges
Detergens kann wässrig
sein, wobei es typischerweise bis zu 70 % Wasser und 0-30 % organisches
Lösungsmittel
enthält,
oder nicht wässrig
sein.
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Die
Detergenszusammensetzung umfasst ein oder mehrere Surfactants, die
nicht ionisch sein können,
einschließlich
semi-polar und/oder anionisch und/oder kationisch und/oder zwitterionisch.
Die Surfactants sind typischerweise in einer Menge von 0,1 % bis
60 % des Gewichts vorhanden.
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Wenn
es darin eingeschlossen wird, wird das Detergens gewöhnlich etwa
von 1 % bis etwa 40 % eines anionischen Surfactants enthalten, wie
lineares Alkylbenzolsulfonat, alpha-Olefinsulfonat, Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat),
Alkohol-Ethoxysulfat, sekundäres
Alkansulfonat, alpha-Sulfofettsäuremethylester,
Akyl- oder Alkenylbernsteinsäure
oder Seife.
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Wenn
es darin eingeschlossen wird, wird das Detergens gewöhnlicherweise
von etwa 0,2 % bis etwa 40 % eines nicht-ionischen Surfactants enthalten,
wie Alkoholethoxylat, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid,
ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid,
Fettsäure-Monoethanolamid,
Polyhydroxyalkylfettsäureamid,
oder N-Acyl-, N-Alkyl-Derivate von Glucosamin („Glucamide").
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Das
Detergens kann 0 bis 65 % eines Detergens-Gerüststoffes (Builder) oder komplexbildenden
Mittels wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Carbonat,
Citrat, Nitrilotriessigsäure,
Ethylendiaminteraessigsäure,
Diethylentriaminpentaessigsäure,
Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure,
lösliche
Silikate oder Schichtsilikate (z. B. SKS-6 von Hoechst) enthalten.
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Das
Detergens kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind
Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol,
Polyvinylalkohol, Polyvinylpyridin-N-oxid, Polyvinylimidazol, Polycarboxylate
wie Polyacrylate, Malein-/Acrylsäurecopolymere
und Laurylmethacrylat/Acrylsäurecopolymere.
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Das
Detergens kann ein System zum Bleichen enthalten, das eine H2O2-Quelle wie Perborat
oder Percarbonat umfassen kann, welche mit einem Persäure-bildenden
Bleichaktivator wie Tetraacetylethylendiamin oder Nonanoyloxybenzolsulfonat
kombiniert werden können.
Alternativ kann das System zum Bleichen Peroxysäuren von z. B. dem Amid-, Imid-
oder Sulfontyp umfassen.
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Das/die
Enzym(e) der erfindungsgemäßen Detergenszusammensetzung
können
unter Verwendung von gewöhnlichen
Stabilisierungsmitteln stabilisiert werden, z. B. ein Polyol wie
Propylenglykol oder Glycerin, ein Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure, oder
ein Borsäurederivat,
z. B. ein aromatischer Boratester, oder ein Phenyl-Borsäurederivat
wie 4-Formylphenylborsäure,
und die Zusammensetzung kann wie in z. B. WO 92/10709 und WO 92/19708
beschrieben, formuliert werden.
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Das
Detergens kann auch andere gebräuchliche
Detergenszutaten enthalten, wie z. B. Verbesserer von Gewebe, einschließlich Tonerde,
Schaumverstärker,
Mittel zum Unterdrücken
von Seifenschaum, Mittel gegen Korrosion, Mittel zum Suspendieren
von Schmutz, Mittel zum Verhindern einer Wiederablagerung von Schmutz,
Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufhellungsmittel, hydrotrope
Stoffe, Inhibitoren von Trübungen oder
Parfüme.
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Es
wird gegenwärtig
in Betracht gezogen, dass ein beliebiges Enzym, insbesondere das
erfindungsgemäße Enzym,
zu den Detergenszusammensetzungen zugefügt werden kann, in einer Menge,
die 0,01 bis 100 mg Enzymprotein pro Liter an Waschflüssigkeit
entspricht, bevorzugt 0,05 bis 5 mg an Enzymprotein pro Liter an
Waschflüssigkeit,
insbesondere 0,1 bis 1 mg an Enzymprotein pro Liter an Waschflüssigkeit.
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Das
erfindungsgemäße Enzym
kann zusätzlich
in die Detergensformulierungen, die in WO 97/07202 offenbart sind,
eingebracht werden, welche hiermit als Referenz aufgenommen ist.
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ANWENDUNGEN IN DER LEDERINDUSTRIE
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Eine
erfindungsgemäße Subtilase
kann in der Lederindustrie verwendet werden, insbesondere zur Verwendung
zur Enthaarung von Häuten.
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In
dieser Anwendung wird eine erfindungsgemäße Subtilasevariante bevorzugt
in einer Enzymzusammensetzung verwendet, die weiter eine andere
Protease umfasst.
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Für eine genauere
Beschreibung von geeigneten weiteren Proteasen siehe den Abschnitt,
der geeignete Enzyme zur Verwendung in einer Detergenszusammensetzung
betrifft (vide supra).
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ANWENDUNGEN IN DER WOLLINDUSTRIE
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Eine
erfindungsgemäße Subtilase
kann in der Wollindustrie verwendet werden, insbesondere zur Verwendung
zum Reinigen von Kleidungsstücken,
die Wolle umfassen.
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In
dieser Anwendung wird eine erfindungsgemäße Subtilasevariante bevorzugt
in einer Enzymzusammensetzung verwendet, die weiter eine andere
Protease umfasst.
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Für eine genauere
Beschreibung von geeigneten weiteren Proteasen siehe den Abschnitt,
der geeignete Enzyme zur Verwendung in einer Detergenszusammensetzung
betrifft (vide supra).
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Die
Erfindung wird in den folgenden Beispielen genauer beschrieben,
von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie den Schutzumfang der
Erfindung wie beansprucht in irgendeiner Weise limitieren.
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MATERIAL UND METHODEN
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STÄMME:
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- B. subtilis DN1885 (Diderichsen et al., 1990).
- B. lentus 309 und 147 sind spezielle Stämme von Bacillus lentus, die
bei der NCIB hinterlegt wurden und die Zugangsnummern NCIB 10309
und 10147 zugewiesen bekamen und in US-Patent Nr. 3,723,250 beschrieben werden,
das durch Bezugnahme hier aufgenommen wird.
- E. coli MC 1000 (M.J. Casadaban und S.N. Cohen (1980); J. Mol.
Biol. 138 179-207), wurde durch gebräuchliche Verfahren r–,
m+ gemacht, und wird auch in der US-Patentanmeldung,
lfd. Nummer 039,298 beschrieben.
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PLASMIDE:
-
- pJS3: E. coli-B. subtilis-Überführungsvektor, der ein synthetisches
Gen enthält,
das Subtilase 309 kodiert. (Beschrieben durch Jacob Schi⌀dt et
al. in Protein and Peptide letters 3: 39-44 (1996)).
- pSX222: B. subtilis-Expressionsvektor (beschrieben in WO 96/34946).
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ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE
VERFAHREN:
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Wenn
es nicht anders erwähnt
wird, wurden die DNA-Manipulationen und -Transformationen unter Verwendung
von Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt (Sambrook
et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring
Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (Hrsg.) "Current protocols
in Molecular Biology".
John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., und Cutting, S.M. (Hrsg.) "Molecular Biological
Methods for Bacillus".
John Wiley and Sons, 1990).
-
Enzyme
für DNA-Manipulationen
wurden gemäß den Angaben
der Hersteller verwendet.
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ENZYME FÜR DNA-MANIPULATIONEN
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Wenn
es nicht anders erwähnt
wird, sind alle Enzyme für
DNA-Manipulationen wie z. B. Restriktionsendonukleasen, Ligasen,
etc. von New England Biolabs, Inc. erhalten.
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PROTEOLYTISCHE AKTIVITÄT
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Im
Zusammenhang dieser Erfindung wird proteolytische Aktivität ausgedrückt als
Kilo NOVO Protease-Einheiten (Kilo NOVO Protease Units, KNPU). Die
Aktivität
wird relativ zu einem Enzymstandard (SAVINASE®) bestimmt,
und die Bestimmung basiert auf dem Verdau einer Dimethylkasein-(DMC-)-Lösung durch
das proteolytische Enzym bei Standardbedingungen, d.h. 50 °C, pH 8,3,
9 min. Reaktionszeit, 3 min. Messzeit. Eine Broschüre AF 220/1
ist auf Anfrage bei Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich, diese Broschüre wird hierbei
durch Bezugnahme eingeschlossen.
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Eine
GU ist eine Glycineinheit (Glycine Unit), definiert als die proteolytische
Enzymaktivität,
die unter Standardbedingungen während
einer 50-minütigen
Inkubation bei 40 °C
mit N-Acetylkasein als Substrat eine Menge an NH2-Gruppen
herstellt, die äquivalent
zu 1 mMol Glycin sind.
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Enzymaktivität kann auch
unter Verwendung des PNA-Tests gemessen werden, gemäß der Reaktion mit
dem löslichen
Substrat Succinyl-Alanin-Alanin-Prolin-Phenyl-Alanin-Paranitrophenol,
das beschrieben ist im Journal of American Oil Chemists Society,
Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., und Smith, L.A., (1988).
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FERMENTATION:
-
Fermentationen
zur Herstellung von Subtilaseenzymen wurden bei 30 °C auf einem
rotierenden Schütteltisch
(300 upm) in 500 ml eingebuchteten Erlenmeyer-Kolben, die 100 ml
BPX-Medium enthalten, für 5
Tage durchgeführt.
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Folglich
wurden, um z. B. zwei Liter Brühe
herzustellen, 20 Erlenmeyer-Kolben gleichzeitig fermentiert. MEDIEN: BPX-Medium-Zusammensetzung
(pro Liter)
Kartoffelstärke | 100
g |
Gemahlene
Gerste | 50
g |
Sojabohnenmehl | 20
g |
Na2HPO4 × 12H2O | 9
g |
Pluronic | 0,1
g |
Natriumkaseinat | 10
g |
-
Die
Stärke
im Medium wird mit α-Amylase
verflüssigt,
und das Medium wird durch Erhitzen auf 120 °C für 45 Minuten sterilisiert.
Nach der Sterilisierung wird der pH des Mediums auf 9 durch Zugabe
von NaHCO3 auf 0,1 M eingestellt.
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BEISPIEL 1
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KONSTRUKTION UND EXPRESSION
VON ENZYMVARIANTEN:
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ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE:
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Erfindungsgemäße ortsspezifische
Varianten von Subtilase 309, die spezifische Insertionen in der Schleife
(b) des aktiven Zentrums zwischen den Positionen 99 und 100 umfassen,
wurden durch traditionelles Klonieren von DNA-Fragmenten gemacht
(Sambrook et al., Molekular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold
Spring Harbor, 1989), die durch PCR von Oligos, die die gewünschten
Insertionen enthalten, hergestellt wurden (siehe nachstehend).
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Die
Templat-Plasmid-DNA war pJS3 oder ein Analog davon, das eine Variante
von Subtilase 309 enthält.
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Insertionen
wurden durch Oligo-gerichtete Mutagenese zur Konstruktion von S99SX-Insertionsvarianten
eingefügt
(X = ein beliebiger Aminosäurerest,
der zwischen Positionen 99 und 100 eingefügt wird), was S99SX-Subtilase
309-Varianten zum Ergebnis hatte.
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Die
Varianten von Subtilase 309 wurden in E. coli transformiert. DNA,
die aus einer Übernacht-Kultur dieser
Transformanten gereinigt wurde, wurde in B. subtilis durch Verdau
mit Restriktionsendonuklease, Reinigung der DNA-Fragmente, Ligation,
Transformation von B. subtilis transformiert.
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Transformation
von B. subtilis wurde durchgeführt
wie durch Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, S. 209-221, beschrieben.
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LOKALISIERTE ZUFALLSMUTAGENESE,
UM ZUFÄLLIGE
INSERTIONEN IN EINER LOKALISIERTEN REGION EINZUFÜGEN:
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Die
allgemeine Strategie, die verwendet wurde, um lokalisierte Zufallsmutagenese
durchzuführen, war:
Ein
mutagenisierender Primer (Oligonukleotid) wurde synthetisiert, der
der DNA-Sequenz entspricht, die die Insertionsstelle flankiert,
getrennt durch die DNA-Basenpaare, die die Insertion definieren.
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Anschließend wurde
der resultierende mutagenisierende Primer in einer PCR-Reaktion
mit einem geeigneten entgegengesetzten Primer verwendet. Das resultierende
PCR-Fragment wurde gereinigt und in einer zweiten PCR-Reaktion verlängert, bevor
es durch Endonuklease verdaut wurde und in den E. coli-B. subtilis-Überführungsvektor
kloniert wurde (siehe nachstehend).
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Alternativ,
und wenn nötig,
wird das resultierende PCR-Fragment in einer zweiten PCR-Reaktion als ein
Primer mit einem geeigneten zweiten entgegengesetzten Primer verwendet,
um einen Verdau und das Klonieren der mutagenisierten Region in
den Überführungsvektor
zu erlauben. Die PCR-Reaktionen werden unter normalen Bedingungen
durchgeführt.
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Durch
Befolgen dieser Strategie wurde eine lokalisierte Zufallsbibliothek
in SAVINASE konstruiert, wobei Insertionen in die Schleifenregion
des aktiven Zentrums zwischen Positionen 99 und 100 eingefügt wurden.
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Die
Mutationen wurden durch mutagenisierende Primer eingefügt (siehe
nachstehend), so dass alle 20 Aminosäuren vorhanden sind (N = 25
% von A, T, C und G; wobei S = 50 % C und G). Das hergestellte PCR-Fragment
wurde gegen den N-Terminus von Savinase hin durch eine weitere Runde
von PCR durch Kombination einer überlappenden
Sequenz mit einem PCR-Fragment verlängert, das durch PCR-Amplifikation mit
den Primern hergestellt wurde; 5' CTA
AAT ATT CGT GGTGGC GC 3' (Sense)
und 5' GAC TTT AAC
AGC GTA TAG CTC AGC 3' (Antisense).
Die verlängerten
DNA-Fragmente wurden in die Hind III- und Mlu I-Schnittstellen des
modifizierten Plasmids pJS3 (siehe vorstehend) kloniert, und zehn
zufällig
ausgewählte
E. coli-Kolonien wurden sequenziert, um die entworfenen Mutationen
zu bestätigen.
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Der
mutagenisierende Primer (5' GTT
AAA GTC CTA GGG GCG AGC NNS GGT TCA GGT TCG GTC AGC TCG 3') (Sense) wurde in
einer PCR-Reaktion mit einem geeigneten entgegengesetzten Anti-Sense-Primer
verwendet, der stromabwärts
der Mlu I-Schnittstelle
in pJS3 gelegen ist (z. B. 5'-CCC
TTT AAC CGC ACA GCG TTT-3' (Antisense)),
und dem Plasmid pJS3 als Templat. Dieses resultierende PCR-Produkt
wurde in den pJS3-Überführungsvektor
unter Verwendung der Restriktionsenzyme Hind III und Mlu I kloniert.
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Die
Zufalls-Bibliothek wurde durch gut bekannte Techniken in E. coli
transformiert. Die hergestellte Bibliothek enthielt ungefähr 100.000
einzelne Klone pro Bibliothek.
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Zehn
zufällig
ausgewählte
Kolonien wurden sequenziert, um die entworfenen Mutationen zu bestätigen.
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Um
eine erfindungsgemäße Subtilasevariante
zu reinigen, wurde das B. subtilis pJS3-Expressionsplasmid, das eine erfindungsgemäße Variante
umfasst, in einen kompetenten B. subtilis-Stamm transformiert, und
wurde wie vorstehend beschrieben in einem Medium, das 10 μg/ml Chloramphenicol
(CAM) enthält,
fermentiert.
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BEISPIEL 2
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REINIGUNG VON ENZYMVARIANTEN:
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Dieses
Verfahren betrifft die Reinigung einer Fermentation im 2-Liter-Maßstab zur
Herstellung der erfindungsgemäßen Subtilasen
in einer Bacillus-Wirtszelle.
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Ungefähr 1,6 Liter
der Fermentationsbrühe
wurden bei 5000 upm für
35 Minuten in 1-Liter-Bechern zentrifugiert.
Die Überstände wurden
auf pH 6,5 unter Verwendung von 10 % Essigsäure eingestellt und durch Seitz
Supra S100-Filterplatten filtriert.
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Die
Filtrate wurden auf ungefähr
400 ml unter Verwendung einer Amicon CH2A UF-Einheit, die mit einer Amicon S1Y10
UF-Patrone ausgestattet ist, konzentriert. Das UF-Konzentrat wurde
zentrifugiert und vor der Absorption bei Raumtemperatur auf eine
Bacitracin-Affinitätssäule bei
pH 7 filtriert. Die Protease wurde von der Bacitracinsäule bei
Raumtemperatur unter Verwendung von 25 % 2-Propanol und 1 M Natriumchlorid
in einer Pufferlösung
mit 0,01 Dimethylglutarsäure,
0,1 M Borsäure
und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 7, eluiert.
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Die
Fraktionen mit Proteaseaktivität
aus dem Bacitracin-Reinigungsschritt wurden vereinigt und auf eine
750-ml-Sephadex-G25-Säule
(5 cm Durchmesser), äquilibriert
mit einem Puffer, der 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und
0,002 M Calciumchlorid enthält,
eingestellt auf pH 6,5, aufgetragen.
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Fraktionen
mit proteolytischer Aktivität
von der Sephadex-G25-Säule
wurden vereinigt und auf eine 150-ml-CM-Sepharose-CL-6B-Kationenaustauschersäule (5 cm
Durchmesser), äquilibriert
mit einem Puffer, der 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und
0,002 Calciumchlorid enthält,
eingestellt auf pH 6,5, aufgetragen.
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Die
Protease wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0
bis 0,1 M Natriumchlorid in 2 Litern desselben Puffers eluiert (0
bis 0,2 M Natriumchlorid im Fall von Subtilisin 147).
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In
einem letzten Reinigungsschritt wurden die Protease enthaltenden
Fraktionen von der CM-Sepharosesäule
vereinigt und in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle, ausgestattet
mit einer GR81PP-Membran (von den Danish Sugar Factories Inc.) konzentriert.
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Durch
Verwenden der Techniken von Beispiel 1 zur Herstellung und Fermentation
und der vorstehend beschriebenen Isolationsverfahrensweise wurden
die folgenden Varianten von Subtilisin 309 hergestellt und isoliert:
S99ST
S99SS
S99SD
S99SE
S99SP
S99SG
S99SH
S99SI
S99SA
S99TP
S99TK
S99TN
S99TQ
S99TR
S99SSG
S99ST+Y167A
S99TG+S101G
S99ASG+S101T
S99TC+S101C
A98G+S99SQ
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Diese
Varianten wiesen in einem vorläufigen
Test bessere Waschleistung als Savinase auf.
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BEISPIEL 3
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WASCHLEISTUNG VON DETERGENSZUSAMMENSETZUNGEN,
DIE ENZYMVARIANTEN UMFASSEN
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Die
folgenden Beispiele stellen Ergebnisse einer Anzahl von Waschtests
bereit, die unter den angegebenen Bedingungen durchgeführt wurden. MINI-WASCHEN WASCHBEDINGUNGEN:
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DETERGENZIEN:
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Die
verwendeten Detergenzien waren entweder ein Modell-Detergens, Detergens
95 genannt, oder wurden jeweils aus Supermärkten in Dänemark (OMO, Datenblatt ED-9745105) und den
USA (Wisk, Datenblatt ED-9711893) erhalten. Vor der Verwendung wurde
sämtliche
enzymatische Aktivität
in den Detergenzien durch Behandlung mit Mikrowellen inaktiviert.
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Detergens
95 ist eine einfache Modell-Zubereitung. Der pH wird auf 10, 5 eingestellt,
was innerhalb des normalen Bereichs für ein Pulver-Detergens liegt.
Die Zusammensetzung von Detergens 95 ist wie folgt:
25% STP
(Na5P3O10)
25%
Na2SO4
10%
Na2CO3
20%
LAS (Nansa 80S)
5,0% Nichtionische Tenside (Dobanol 25-7)
5,0%
Na2Si2O5
0,5%
Carboxymethylcellulose (CMC)
9,5% Wasser
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STOFFPROBEN:
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Die
verwendeten Stoffproben waren EMPA116 und EMPA117, erhalten von
EMPA Testmaterialien, Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gall, Schweiz.
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REFLEXION
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Eine
Messung der Reflexion (R) auf dem Testmaterial wurde bei 460 nm
unter Verwendung eines Macbeth-ColorEye-7000-Photometers durchgeführt. Die
Messungen wurden gemäß dem Protokoll
des Herstellers durchgeführt.
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AUSWERTUNG
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Die
Auswertung der Waschleistung einer Subtilase wird entweder durch
den Verbesserungsfaktor oder den Leistungsfaktor für die untersuchte
Subtilase bestimmt.
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Der
Verbesserungsfaktor, IFDosis/Wirkung, wird
definiert als das Verhältnis
der Steigungen der Kurven der Waschleistung für ein Detergens, das die untersuchte
Subtilase enthält,
und für
dasselbe Detergens, das eine Referenzsubtilase enthält, bei
der asymptotischen Konzentration der Subtilase, die auf Null geht.
IFDosis/Wirkung = a/aref
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Die
Waschleistung wird gemäß der Formel
I berechnet:
wobei
R die Waschleistung
in Reflexionseinheiten ist; R
0 der Schnittpunkt
der angepassten Kurve mit der Y-Achse ist (blind); a ist die Steigung
der angepassten Kurve als c → 0;
c ist die Enzymkonzentration; und ΔR
max ist
der theoretische maximale Wascheffekt als c → ∞.
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Der
Leistungsfaktor P wird berechnet gemäß der Formel II
wobei
R
Variante die
Reflexion des Testmaterials ist, das mit 10 nM-Variante gewaschen
wurde;
R
Savinase ist die Reflexion
des Testmaterials, das mit 10 nM Savinase gewaschen wurde;
R
Leerwert ist die Reflexion des Testmaterials,
das mit keinem Enzym gewaschen wurde. Modell-Detergens
95
US
(Detergens: US Wisk, Stoffprobe: EMPA117)
- *P berechnet als [E] = 5nM
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Es
wird daher gesehen, dass die erfindungsgemäßen Subtilasen eine verbesserte
Waschleitung im Vergleich zu Savinase
® aufweisen. SEQUENZPROTOKOLL