CN104603266B - 来自脂环酸芽孢杆菌属的金属蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来源于脂环酸芽孢杆菌属的新金属蛋白酶及其在清洁过程中的用途，例如衣物洗涤和餐具洗涤，并且特别涉及在低温洗涤中和在鸡蛋污物去除中的用途。本发明还涉及包括脂环酸芽孢杆菌属金属蛋白酶的洗涤剂组合物和清洁组合物。

Description

来自脂环酸芽孢杆菌属的金属蛋白酶
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及包括金属蛋白酶(E.C 3.4.24)的清洁和/或洗涤剂组合物。本发明进一步涉及来自脂环酸芽孢杆菌属的新金属蛋白酶及其在清洁过程(例如餐具洗涤和衣物洗涤)中的应用。另外，本发明涉及进行清洁(例如餐具洗涤和衣物洗涤)的方法。
发明背景
超过30年以来，洗涤剂工业已经在洗涤剂配制品中应用了不同酶，最常用的酶包括蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，每种酶适于除去不同类型的污物。除这些酶之外，洗涤剂组合物典型地包括成分的复合物组合。例如，大多数清洁产品包括表面活性剂体系、漂白剂或助洗剂。不管当前洗涤剂的复杂度如何，但是对于研发包括新的酶和/或酶共混物的新的洗涤剂组合物仍存在需要。
金属蛋白酶是对于其活性而言绝对需要金属离子的蛋白水解酶。大多数金属蛋白酶都是锌依赖性的，尽管一些金属蛋白酶使用其他过渡金属。金属蛋白酶已经被广泛地用于不同工业中，像食品和酿造工业。一组金属蛋白酶是已经用于各种应用中的M4家族金属蛋白酶。例如，被称为嗜热菌蛋白酶的M4金属蛋白酶已经被用作非特异性蛋白酶以获得用于肽测序的片段，如描述于例如EP 0 316 725中。它还已经被用作肽合成酶，如描述于WO2000/37486中，其披露了一种用于产生人造甜味剂阿斯巴甜的方法。另一种M4金属蛋白酶是解淀粉芽孢杆菌金属蛋白酶，又称其多年以来已经被用作不同食品和饲料产品中的添加剂，例如在酿造中。此金属蛋白酶还已经被描述用于在洗涤剂和清洁组合物和过程中使用，如描述于例如WO 2007/044993，储存稳定的金属蛋白酶在洗涤剂中的用途或WO 2009/058518，以及EP 1 288 282(联合利华(Unilever))中，其描述了一种用于在餐具洗涤中使用的金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的共混物。WO 2000/60042也描述了包含金属蛋白酶的洗涤剂组合物。
然而，金属蛋白酶在洗涤剂工业中的使用已经非常受限并且焦点已经聚于金属蛋白酶和/或“NprE”的使用，如WO 2007/044993中所阐述。通常，金属蛋白酶在常规洗涤条件下以及在常规洗涤剂组合物中是非常不稳定的。因此，金属蛋白酶在洗涤和清洁过程中以及在洗涤剂中的使用受限。
对改进洗涤过程以便使得它们更环保的增加的聚焦导致如下全球趋势：降低洗涤时间、pH和温度，减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。本发明针对这些以及其他重要目的。
发明概述
本发明涉及一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
a.一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性、至少65％序列一致性、至少70％序列一致性、至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；
b.一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严谨度条件下与(i)SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、(ii)包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交；
c.一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性、至少65％序列一致性、至少70％序列一致性、至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；
d.一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
e.(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明的分离的多肽是一种属于M4金属蛋白酶组的金属蛋白酶。优选地，该分离的多肽来源于脂环酸芽孢杆菌属。
本发明进一步涉及包括本发明的分离的多肽的组合物，特别是洗涤剂组合物，以及此类组合物在清洁过程(如衣物洗涤和硬表面清洁，例如自动餐具洗涤)中的用途。
在一个具体实施例中，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，包括此类多核苷酸的构建体、表达载体和宿主细胞及其用于产生本发明的多肽的用途。
在一个另外的实施例中，本发明还涉及来源于脂环酸芽孢杆菌属的新信号肽和前肽及其用于产生本发明的多肽或另一种多肽的用途。
发明详细说明
定义
在此将术语“蛋白酶活性”或“肽酶活性”定义为通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的肽键而破坏蛋白质的酰胺键的能力。
如在此使用的术语“金属蛋白酶”是指在结合/活性位点中具有一种或多种金属离子的蛋白酶。
如在此使用的术语“M4金属蛋白酶家族”或“M4金属蛋白酶”或“M4”意指根据罗林斯(Rawlings)等人，生物化学杂志(Biochem.J.)，290，205-218(1993)并且如进一步描述于MEROPS-(罗林斯等人，MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database)，核酸研究(Nucl Acids Res)，第34期数据库，D270-272，2006)中，落入M4金属蛋白酶家族的多肽。M4金属蛋白酶是主要包含内肽酶的中性金属蛋白酶。该家族中的所有肽酶都结合单个的催化锌离子。M4金属蛋白酶家族成员包括常见的HEXXH基序，其中组氨酸残基充当锌配体并且谷氨酸是活性位点残基。M4金属蛋白酶具有主要位于中性pH处的最优pH。M4金属蛋白酶家族包括例如(被分类为MEROPS亚类M04.014)、嗜热菌蛋白酶、杆菌溶素(Bacillolysin)、弧菌溶血素、假溶素(pseudolysin)、Msp肽酶、球菌溶素(coccolysin)、短梗霉溶素(aureolysin)、比梅溶素(vimelysin)、λ毒素中性肽酶B、PA肽酶(气单胞菌属类型)、格里塞溶素(griselysin)、硬脂溶素(stearolysin)、MprIII(交替单胞菌属菌株O-7)、pap6肽酶、中性肽酶(热放线菌属类型)、ZmpA肽酶(伯克霍尔德菌属)、zpx肽酶、PrtS肽酶(发光杆菌)、多变溶素(protealysin)、ZmpB肽酶(伯克氏菌属)。多肽的M4金属蛋白酶家庭已经被进一步表征并且根据MEROPS，目前包括至少二十二个已经为其指定独特MEROPS ID(即，具有式M04.xxx的标识符)的亚类以及非肽酶同系物和未指定的肽酶。
如在此使用的术语“分离的多肽”是指从来源分离的多肽。在一个方面中，该变体或多肽是至少20％纯的，更优选至少40％纯的，更优选至少60％纯的，甚至更优选至少80％纯的，最优选至少90％纯的并且甚至最优选至少95％纯的，如通过SDS-PAGE所确定。
术语“基本上纯的多肽”在此指一种包含按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的该多肽和与其天然地或重组地相关的其他多肽材料的多肽制剂。因此，优选的是该基本上纯的多肽按存在于该制剂中的所有多肽材料的重量计是至少92％纯的，优选至少94％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少97％纯的，更优选至少98％纯的，甚至更优选至少99％纯的，最优选至少99.5％纯的，并且甚至最优选100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来完成。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的一致性程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European MolecularBiology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends inGenetics)16:276-277；http://emboss.org)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，见上文；http://emboss.org)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的一致性程度。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
术语“片段”意指使一个或多个(若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。
术语“多肽的功能片段”或“其功能片段”用来描述衍生自更长的多肽(例如，成熟多肽)的多肽，以及已经在N-末端区或C-末端区或两个区域中截短以产生亲本多肽的片段的多肽。为了成为功能多肽，该片段必须保持全长/成熟多肽的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％的蛋白酶活性。M4金属蛋白酶可以被截短，这样使得某个结构域被除去以产生一个功能片段，该功能片段可以是其中少于200个氨基酸已经从成熟M4金属蛋白酶中除去，优选少于150个氨基酸，更优选少于120、100、80、60、40、30个氨基酸，甚至更优选少于20个氨基酸并且最优选少于10个氨基酸已经从成熟多肽中除去的多肽。
术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的一个片段。
术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基取代、插入和/或缺失)的具有金属蛋白酶活性的多肽。取代意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
术语“清洁组合物”和“清洁配制品”是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具(包括玻璃器皿)、接触镜、硬表面(例如瓷砖、锌(zincs)、地板和桌面)、头发(香波)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)所选的任何材料/化合物，只要该组合物与用于该组合物中的金属蛋白酶以及其他一种或多种酶可相容即可。通过考虑有待清洁的表面、物品或织物，以及针对使用过程中的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁组合物材料。这些术语进一步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。其意图是，这些术语包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；和纺织品和衣物预去污剂，以及餐具洗涤剂)。
除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；洗碗机洗碗剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴露、沐浴露；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。
就预期用于脏物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在某些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代的实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。其意图是，除了根据本发明的金属蛋白酶以外，该术语涵盖了包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。
术语“纺织品”是指织造织物，连同适于转化为或用作纱线、织造、针织以及非织造织物的短纤维和长丝。该术语涵盖制自天然以及合成(例如，制造的)纤维的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。
术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于餐具洗涤洗涤剂组合物、口服洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。
术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒状、棒状)组合物等。术语金属蛋白酶的“有效量”是指例如在定义的洗涤剂组合物中达到希望水平的酶活性的在上文描述的金属蛋白酶量。
术语酶的“洗涤性能”是指酶对洗涤做出贡献而提供优于未向组合物中添加该酶的洗涤剂的另外的清洁性能。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。通过酶在适当的测试条件下除去某些代表性污物的能力而方便地测量其洗涤性能。在这些测试系统中，可以按这样一种方式控制其他相关因素，使得模拟某个细分市场中用于家庭应用的典型条件，这些其他相关因素是例如洗涤剂组成、洗涤剂浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度。
如在此使用的术语“水硬度”或“硬度(degree of hardness)”或“dH”或“°dH”是指德国硬度(degree of hardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。
在此使用术语“相关洗涤条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。
使用术语“改进的特性”指示与没有酶情况下进行的相同过程相比，在特性方面获得更好的最终结果。在本发明的过程中优选被改进的示例性特性包括洗涤性能、酶稳定性、酶活性以及底物特异性。
使用术语“改进的洗涤性能”指示与没有酶相比或与参比酶相比，在相关洗涤条件下在从洗涤的物品(例如，织物或餐具和/或刀具)中除去污物方面获得更好的最终结果，或指示在重量基础上，相对于没有酶或相对于参比酶获得相同的最终结果需要较少的酶。在此背景下，改进的洗涤性能还可以是例如在更短的洗涤时间内获得相同效果(例如去污效果)，例如该酶在测试条件下更加迅速地提供其效果。
使用术语“保留的洗涤性能”指示在重量基础上，在相关洗涤条件下，相对于另一种酶，酶的洗涤性能是至少80％。
在此将术语“酶洗涤力”或“洗涤力”或“洗涤效果”定义为针对一种洗涤剂，与不具有酶的同一洗涤剂相比，该酶可以增加的有利效果。可以由酶提供的重要的洗涤益处是在洗涤和/或清洁之后没有或有非常少的可见污垢的污物去除，预防或减少在洗涤过程中释放的污垢的再沉积(一种也被称作抗再沉积的效果)，完全或部分恢复纺织品的白度(一种也被称作增白的效果)，这些纺织品初始是白色的但是在重复使用和洗涤后获得浅灰色或浅黄色的外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。
如在此使用的术语“抗再沉积”描述减少或阻止溶解或悬浮于洗涤液中的污垢再沉积于清洁的物体上。在一个或多个洗涤循环后可以看到再沉积(例如，作为灰化、黄化或其他变色)。
术语“辅料”意指针对希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、棒状、糊状、喷雾、片、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选地与用于该组合物中的金属蛋白酶可相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“紧凑”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。
如在此使用的术语“去污酶(stain removing enzyme)”描述帮助从织物或硬表面除去污物或污垢的酶。去污酶对特定底物起作用，例如蛋白酶对蛋白质起作用、淀粉酶对淀粉起作用、脂肪酶和角质酶对脂质(脂肪和油)起作用、果胶酶对果胶起作用并且半纤维素酶对半纤维素起作用。污物通常是具有不同组分的复杂混合物的沉积物，这导致材料自身局部变色或这在物体上留下一个粘性表面，该粘性表面可以吸引溶解于洗涤液中的污物从而导致玷污的区域变色。当一种酶对存在于污物中的其特定底物起作用时，该酶降解或部分降解其底物，从而帮助在洗涤过程中除去与底物相关的污垢和污物组分。例如，当一种蛋白酶对草渍起作用时，它降解草中的蛋白组分并且允许在洗涤过程中释放绿色/棕色。
在此背景下，术语“减少的量”意指在其他方面相同的条件下，该组分的量小于将用于参比过程中的量。在一个优选实施例中，该量被减少例如至少5％，如至少10％、至少15％、至少20％或如另外在此所述的。
术语“低洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。亚洲(例如，日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度体系。
术语“中洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度体系。
术语“高洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度体系。
具有蛋白酶活性的多肽
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性、至少65％序列一致性、至少70％序列一致性、至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；
(b)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严谨度条件下与(i)SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、(ii)包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交；
(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性、至少65％序列一致性、至少70％序列一致性、至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；
(d)一种变体，该变体包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明涉及分离的多肽或催化结构域，这些分离的多肽或催化结构域与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽或催化结构域具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。在另一个优选方面中，该成熟多肽包括SEQ IDNO:2的氨基酸214至511或SEQ ID NO:4的氨基酸214至517或由其组成。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由以下多核苷酸编码，这些多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交(J.萨姆布鲁克(Sambrook)、E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(ColdSpring Harbor)，纽约)。
可以使用SEQ ID NO:1或3的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或其片段来设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆对来自不同属或种的菌株的具有蛋白酶活性的多肽进行编码的DNA。具体地说，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少14，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以筛选从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或3或其子序列同源的克隆或DNA，优选将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交指示在非常低至非常高严谨度条件下，多核苷酸与标记的核酸探针杂交，该标记的核酸探针对应于SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列；包括SEQID NO:1或3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；其全长互补链；或其子序列。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线胶片而进行检测。
在一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸692至1585。在一个方面中，该核酸探针是SEQ IDNO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:3的核苷酸740至1651。在另一个方面中，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2或4的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个优选方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1或3。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，非常低至非常高严谨度条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严谨度在25％甲酰胺中，对于中和中-高严谨度在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严谨度在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS在45℃下(非常低严谨度)、在50℃下(低严谨度)、在55℃下(中严谨度)、在60℃下(中-高严谨度)、在65℃下(高严谨度)以及在70℃下(非常高严谨度)洗涤三次，每次15分钟。
对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，严谨度条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算法所计算的Tm之下大约5℃至大约10℃，在每毫升0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特(Denhardt)溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在所计算的Tm之下5℃至10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤1次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤2次(每次15分钟)。
本发明涉及具有蛋白酶活性的由以下多核苷酸编码的分离的多肽，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的由以下多核苷酸编码的分离的多肽，这些多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
本发明还涉及以下变体，这些变体包括SEQ ID NO:2或4的成熟多肽或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。优选地，该变体与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列一致性；例如，与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％一致性。
上述序列的基本上同源的多肽被表征为在成熟多肽中具有一个或多个(若干个)氨基酸取代、缺失、和/或插入。优选地，氨基酸变化是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一至约九个氨基酸，如一、二、三、四、五、六、七、八、或九个氨基酸，优选从一至约15个氨基酸，如10、11、12、13、14或15个氨基酸，并且最优选从一至约30个氨基酸，如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端甲硫氨酸残基；具有多达约五至十个残基，优选从10至15个残基并且最优选从20至25个残基的一种小连接肽，或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸标签、一种抗原表位、蛋白A、一种碳水化合物结合模块或另一种结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
一种亲本多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，FEBS快报309:59-64。还可以从与亲本多肽相关的多肽的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。还可以通过与已知的M4金属蛋白酶比对来确定催化残基，其中已经发现在所有此类蛋白酶中这些催化残基都是保守的。在一个实施例中，通过与已知的M4金属蛋白酶的比对确定的必需氨基酸残基是SEQ IDNO:2的Glu 350(E350)和His 435(H435)或SEQ ID NO:4的Glu 358(E358)和His 441(H441)。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
SEQ ID NO:2或4的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个。
除20个标准氨基酸之外，非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、和α-甲基丝氨酸)可以被野生型多肽的氨基酸残基取代。有限数目的非保守的氨基酸、不是由该遗传密码编码的氨基酸、以及非天然氨基酸可以被氨基酸残基取代。“非天然氨基酸”在蛋白质合成以后已被修饰，和/或在其一个或多个侧链中具有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然氨基酸可以是化学合成的，并且优选地是可商购的，并且包括哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、以及3,3-二甲基脯氨酸。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合蛋白还可以使用内含肽技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能与遗传(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
M4金属蛋白酶的来源
可用于本发明的M4金属蛋白酶可获得自任何属的微生物。对本发明来说，这里所使用的与指定来源相关的术语“从...中获得”意为由核苷酸序列编码的多肽是由一种天然地具有所述核苷酸序列的来源产生的或者由一种来自于该来源的核苷酸序列已经插入其中的菌株产生的。在一个优选方面中，从指定来源获得的多肽分泌到细胞外。
本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如具有金属蛋白酶活性的脂环酸芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属多肽，或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、脲原体属多肽。
在一个方面中，该多肽是嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidophilus)、酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)或酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)多肽。
在另一个方面中，该多肽是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一个方面中，该多肽是热溶土芽孢杆菌(Geobacillus caldolyticus)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)多肽。
在另一个方面中，该多肽是似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个方面中，该多肽是不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链丝菌、或变铅青链霉菌多肽。
本发明的多肽也可以是一种真菌多肽，并且更优选酵母多肽，例如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属多肽；或更优选丝状真菌多肽，例如支顶孢属、曲霉属、短柄霉属、毛壳菌属、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢霉属、腐质霉属、大毁壳属、毛霉属、蚀丝霉属、新美鞭菌、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、梨囊鞭菌属、孔座壳属(Poronia)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子嚢菌属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、木霉属或轮枝孢属多肽。
在一个优选方面中，该多肽是卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
在另一个优选方面中，该多肽是棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、球毛壳菌、灰盖鬼伞、棉色二孢(Diplodiagossyppina)、杆孢状镰孢、谷类镰抱、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、稻瘟病菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉菌、黄孢平革菌、点孔座壳(Poronia punctata)、淡黑假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)、嗜热子囊菌、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、褐孢长毛盘菌或幼嫩轮枝孢(Verticillium tenerum)多肽。
在一个优选方面中，该多肽是脂环酸芽孢杆菌属多肽。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
此外，可以使用上述探针，从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定并获得此类多肽。用于从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选这样一种微生物的基因组或cDNA文库来获得多核苷酸。一旦用这种或这些探针检测到编码一种多肽的多核苷酸序列，就可以通过使用本领域的普通技术人员熟知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽在该多肽或其片段的N-末端或C-末端处融合。融合多肽可通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其部分)产生。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guideto Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由脂环酸芽孢杆菌属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种类变体。
编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列；可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个优选方面中，该细胞是脂环酸芽孢杆菌属细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一个本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的这些多肽特异的方法可以检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
信号肽和前肽
本发明还涉及一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至25和SEQ ID NO 4的氨基酸1至25或由其组成。本发明还涉及一种编码前肽的分离的多核苷酸，该前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸26至213和SEQ ID NO 4的氨基酸26至213或由其组成。本发明还涉及一种编码信号肽和前肽的分离的多核苷酸，该信号肽和前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸26至213和SEQ ID NO 4的氨基酸26至213或由其组成。所述多核苷酸可以进一步包括编码蛋白质的基因，所述蛋白质与信号肽和/或前肽可操作地连接。该蛋白质优选地对于该信号肽和/或前肽来说是外来的。
本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)对包含这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且(b)回收该蛋白质。
该蛋白质对于宿主细胞来说可以是原生的或异源的。术语“蛋白质”在此不意图是指一种特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽及多肽。术语“蛋白质”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。
优选地，该蛋白质是一种激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告基因。例如，该蛋白质可以是一种水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
组合物
本发明还涉及包括本发明的金属蛋白酶的组合物。优选地，这些组合物富含本发明的金属蛋白酶。术语“富含”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加。
在一个实施例中，本发明涉及包括本发明的金属蛋白酶以及一种适合的载体和/或赋形剂的组合物，特别是清洁组合物和/或洗涤剂组合物。
在一个实施例中，该洗涤剂组合物可以适于具体用途，例如衣物洗涤(特别是家用衣物洗涤)、餐具洗涤或硬表面清洁。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。本发明的洗涤剂组合物可以应用于硬表面清洁、自动餐具洗涤应用、以及化妆品应用，例如义齿、牙齿、头发及皮肤中。
在一个优选实施例中，这些洗涤剂组合物包括一种或多种常规的载体和/或赋形剂，例如下文例示的那些。
本发明的洗涤剂组合物可以呈任何便利的形式，如棒状、片、粉末、颗粒、糊状或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有至多70％的水和0-30％的有机溶剂，或可以是非水性的。
除非另外指出，在此提供的所有组分或组合物水平参照该组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购来源中的杂质，例如残余溶剂或副产品。
本发明的金属蛋白酶正常地以按该组合物的重量计从0.000001％至2％酶蛋白的水平，优选以按该组合物的重量计从0.00001％至1％酶蛋白的水平，更优选以按该组合物的重量计从0.0001％至0.75％酶蛋白的水平，甚至更优选以按该组合物的重量计从0.001％至0.5％酶蛋白的水平掺入进该洗涤剂组合物中。
此外，本发明的金属蛋白酶正常地以这样的量掺入进该洗涤剂组合物中，使得其在洗涤水中的浓度处于从0.0000001％至1％酶蛋白的水平，优选处于从0.000005％至0.01％酶蛋白的水平，更优选处于从0.000001％至0.005％酶蛋白的水平，甚至更优选在洗涤水中处于从0.00001％至0.001％酶蛋白的水平。
如众所周知的，酶量还将根据具体应用和/或作为被包括在这些组合物中的其他组分的结果而变化。
用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.001％-50％，例如0.01％-25％，例如0.02％-20％，例如0.1％-15％的酶蛋白。
用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-15％，例如0.05％-10％的酶蛋白。
用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。
在一些优选实施例中，在此提供的这些洗涤剂组合物典型地被这样配制，使得用于水性清洁操作过程中，洗涤水具有以下pH：从约5.0至约11.5，或在替代实施例中，甚至从约6.0至约10.5，例如从约5至约11、从约5至约10、从约5至约9、从约5至约8、从约5至约7、从约6至约11、从约6至约10、从约6至约9、从约6至约8、从约6至约7、从约7至约11、从约7至约10、从约7至约9或从约7至约8。在一些优选实施例中，颗粒或液体洗衣产品被这样配制，使得洗涤水具有从约5.5至约8的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。
酶组分重量是基于总活性蛋白的。除非另外指明，所有百分比和比率都是按重量计计算。除非另外指明，所有百分比和比率都是基于总组合物计算。在例示洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表示酶水平并且除非另外说明，按总组合物的重量计表示洗涤剂成分。
本发明的酶还应用于洗涤剂添加剂产品中。当例如，温度较低，pH在6与8之间并且洗涤时间较短，例如低于30min时，包括本发明的金属蛋白酶的洗涤剂添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。
该洗涤剂添加剂产品可以是本发明的金属蛋白酶并且优选是一种另外的酶。在一个实施例中，该添加剂被包装于剂型中用于添加至清洁过程中。单一剂量可以包括丸、片、囊形片(gelcap)或包括粉末和/或液体的其他单一剂量单位。在一些实施例中，包括填充物和/或一种或多种载体材料，适合的填充物或载体材料包括但不限于，硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。在一些实施例中，用于液体组合物的填充物和/或载体材料包括水和/或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。此类醇的实例包括但不限于，甲醇、乙醇、丙醇以及异丙醇。
在一个特别优选的实施例中，根据本发明的金属蛋白酶被用于颗粒组合物或液体中，该金属蛋白酶可以呈胶囊化粒子的形式。在一个实施例中，该胶囊化材料选自下组，该组由以下各项组成：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素和壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。
根据本发明的组合物典型地包括一种或多种洗涤剂成分。术语洗涤剂组合物包括物品和清洁及处理组合物。除非另外指明，术语清洁组合物包括片、颗粒状或粉末状的全效或“重垢”清洗剂，尤其是衣物洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；洗碗机洗碗剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型。该组合物还可以处于单位剂量包装中，包括本领域已知的那些以及水可溶、水不可溶和/或水可渗透的那些。
在清洁和/或洗涤剂组分可能与本发明的金属蛋白酶不相容的实施例中，可以使用适合方法来分离清洁和/或洗涤剂组分与该金属蛋白酶(即，彼此不互相接触)，直到组合两种组分适当时。此类分离方法包括本领域已知的任何适合的方法(例如，囊形片、胶囊化、片剂化、物理分离)。
如当本发明的金属蛋白酶被用作洗涤剂组合物(例如，衣物洗涤洗涤剂组合物或餐具洗涤洗涤剂组合物)的组分时所提及，它可以例如以非尘颗粒、稳定化液体或受保护的酶的形式被包括在该洗涤剂组合物中。可以例如像披露于US 4,106,991和4,661,452(两者都属于诺和工业公司(Novo Industri A/S))中，产生非尘颗粒并且可以通过本领域已知的方法任选地进行包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均分子量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单位的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。
在一些实施例中，在此利用的这些酶由存在于为这些酶提供此类离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，连同其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))稳定化。本发明的洗涤剂组合物的酶还可以使用常规稳定剂，如多元醇(例如，丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸来稳定化，并且可以如描述于例如WO 92/19709和WO 92/19708中配制该组合物。还可以通过添加可逆的酶抑制剂，例如，蛋白类型(如描述于EP 0 544 777 B1中)或硼酸类型的可逆的酶抑制剂，来稳定本发明的酶。其他酶稳定剂是本领域熟知的，例如肽醛和蛋白质水解物，例如可以使用肽醛或酮来稳定根据本发明的金属蛋白酶，如描述于WO 2005/105826和WO 2009/118375中。
如以上提及的，可以根据披露于EP 238 216中的方法制备包含在本发明的洗涤剂组合物中的受保护的酶。
可以用一种或多种试剂来扩充该组合物，用于预防生物膜的形成或除去形成的生物膜。这些试剂可以包括但不限于，分散剂、表面活性剂、洗涤剂、其他酶、抗微生物剂以及杀生物剂。
其他酶
在一个实施例中，将本发明的金属蛋白酶与一种或多种酶，例如至少两种酶，更优选是至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。
洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可以包括一种或多种酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、碳水化合物酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如，漆酶)和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即，最优pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括动物、植物或微生物来源的那些。特别适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 1999/001544中的那些纤维素酶变体。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物起源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚类。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰刀菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌属(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如衍生自解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于WO 92/19729、WO 96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264中的变体，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选的蛋白酶变体可以包括以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、Ultra、 Ultra、以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPreferenzTm、PurafectPurafectPurafectEffectenzTm、 以及(Danisco/DuPont(丹尼斯克/杜邦公司))、AxapemTM(Gist-Brocases N.V.(吉斯特布罗卡德斯公司))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(Henkel AG(汉高股份))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶：适合的脂肪酶包括动物、植物或微生物来源的那些。特别适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(与嗜热霉属同义)，例如来自如EP 258 068和EP 305 216中描述的疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉)或来自如WO 96/13580中描述的特异腐质霉的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、施氏假单胞菌(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌、假单胞菌属物种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达图瓦(Dartois)等人，1993，生物化学与生物物理学报(Biochemica etBiophysica Acta)，1131:253-360)，嗜热脂肪芽抱杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。
脂肪酶变体的其他实例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079以及WO 97/07202中描述的那些。
优选的可商购脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase UltraTM和LipexTM(诺维信公司(Novozymes A/S))。
淀粉酶：可以与本发明的金属蛋白酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或其与SEQ ID NO:3具有90％序列一致性的变体。优选变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有一个缺失并且在位置193中具有一个取代的那些。其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。最优选的变体是在位置181和182或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、Stainzyme TM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase及Preferenz S100(来自来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购获得的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包括一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，例如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，特别是如以上所描述的非尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆料。
表面活性剂
典型地，该洗涤剂组合物包括(按该组合物的重量计)一种或多种在以下范围内的表面活性剂：0％至50％，优选从2％至40％，更优选从5％至35％，更优选从7％至30％，最优选从10％至25％，甚至最优选从15％至20％。在一个优选实施例中，该洗涤剂是液体或粉末洗涤剂，包括按重量计小于40％，优选小于30％，更优选小于25％，甚至更优选小于20％的表面活性剂。该组合物可以包括从1％至15％，优选从2％至12％、3％至10％，最优选从4％至8％，甚至最优选从4％至6％的一种或多种表面活性剂。优选的表面活性剂是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、两性表面活性剂及其混合物。优选地，该表面活性剂的主要部分是阴离子的。适合的阴离子表面活性剂在本领域是熟知的并且可以包括脂肪酸羧酸酯(肥皂)，支链、直链和随机链烷基硫酸酯或脂肪醇硫酸酯或伯醇硫酸酯或烷基苯磺酸酯(例如LAS和LAB)或苯基链烷磺酸酯(phenylalknesulfonate)或烯基磺酸酯或烯基苯磺酸酯或烷基乙氧基硫酸酯或脂肪醇醚硫酸酯或α-烯烃磺酸酯或十二烯基/十四烯基(tetradecnyl)琥珀酸。阴离子表面活性剂可以被烷氧基化。该洗涤剂组合物还可以包括从1wt％至10wt％的非离子表面活性剂，优选从2wt％至8wt％，更优选从3wt％至7wt％，甚至更优选少于5wt％的非离子表面活性剂。适合的非离子表面活性剂在本领域是熟知的并且可以包括醇乙氧基化物、和/或烷基乙氧基化物、和/或烷基酚乙氧基化物、和/或葡糖酰胺(例如脂肪酸N-葡糖基N-甲基酰胺)、和/或烷基多聚葡糖苷和/或单-或二乙醇酰胺或脂肪酸酰胺。该洗涤剂组合物还可以包括从0wt％至10wt％的阳离子表面活性剂，优选从0.1wt％至8wt％，更优选从0.5wt％至7wt％，甚至更优选少于5wt％的阳离子表面活性剂。适合的阳离子表面活性剂在本领域是熟知的并且可以包括烷基季铵化合物、和/或烷基吡啶鎓化合物和/或烷基季鏻化合物和/或烷基三元硫鎓化合物。该组合物优选包括在洗涤过程中于洗涤液中提供从100ppm至5,000ppm表面活性剂的量的表面活性剂。该组合物当与水接触后典型地形成一种洗涤液，该洗涤液包括从0.5g/l至10g/l洗涤剂组合物。许多适合的表面活性化合物是可获得的并且于文献中充分描述，例如由施瓦兹(Schwartz)、佩里(Perry)和伯谢(Berch)描述于“表面活性剂与洗涤剂(Surface-Active Agents and Detergents)”，第I卷和第11卷中。
助洗剂
助洗剂的主要作用在于从洗涤溶液中螯合二价金属离子(例如钙离子和镁离子)，该洗涤溶液否则将与表面活性剂体系消极地相互作用。助洗剂还可有效从织物表面除去金属离子和无机污垢，从而改进地除去微粒和饮料污物。助洗剂也是一种碱度来源并且将洗涤水的pH缓冲至9.5至11的水平。缓冲能力也叫做储备碱度，并且应该优选大于4。
本发明的洗涤剂组合物可以包括一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂体系。许多适合的助洗剂体系描述于文献中，例如描述于粉状洗涤剂(Powdered Detergents)，表面活性剂科学系列(Surfactant science series)，第71卷，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker,Inc)中。按主题组合物的重量计，助洗剂可以包括从0％至60％，优选从5％至45％，更优选从10％至40％，最优选从15％至35％，甚至更优选从20％至30％助洗剂。按主题组合物的重量计，该组合物可以包括从0％至15％，优选从1％至12％、2％至10％，最优选从3％至8％，甚至最优选从4％至6％的助洗剂。
助洗剂包括但不限于，聚磷酸盐的碱金属、铵和链烷醇铵盐(例如，三聚磷酸盐STPP)，碱金属硅酸盐，碱土金属和碱金属碳酸盐，铝硅酸盐助洗剂(例如，沸石)以及聚羧酸化合物，醚羟基聚羧酸酯，马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸，和羧基甲氧基琥珀酸，聚乙酸的各种碱金属、铵和取代的铵盐(如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)，连同聚羧酸酯，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸及其可溶盐。乙醇胺(MEA、DEA和TEA)也可以有助于液体洗涤剂中的缓冲能力。
漂白剂
本发明的洗涤剂组合物可以包括一种或多种漂白剂。具体而言，粉状洗涤剂可以包括一种或多种漂白剂。适合的漂白剂包括其他光漂白剂、预成型过酸、过氧化氢源、漂白活化剂、过氧化氢、漂白催化剂及其混合物。通常，当使用一种漂白剂时，本发明的组合物可以包括按标的清洁组合物的重量计从约0.1％至约50％或甚至从约0.1％至约25％的漂白剂。适合的漂白剂的实例包括：
(1)其他光漂白剂，例如维生素K3；
(2)预成型过酸：适合的预成型过酸包括但不限于选自下组的化合物，该组由以下各项组成：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone)及其混合物。适合的过氧羧酸包括具有化学式R-(C＝O)O-O-M的疏水性和亲水性过酸，其中R是烷基(任选是支链的)，当该过酸是疏水性的，具有从6至14个碳原子或从8至12个碳原子，并且当该过酸是亲水性的，具有少于6个碳原子或甚至少于4个碳原子；并且M是平衡离子，例如钠、钾或氢；
(3)过氧化氢源，例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)，过碳酸盐，过硫酸盐，过磷酸盐，过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一个方面中，无机过氧化氢合物盐选自下组，该组由以下各项组成：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的从0.05至40wt％或1至30wt％的量存在并且典型地被掺入进此类组合物中作为可以被包衣的结晶固体。适合的包衣包括无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。有用的漂白组合物描述于美国专利号5,576,282和6,306,812中；
(4)具有R-(C＝O)-L的漂白活化剂，其中R是烷基(任选是支链的)，当该漂白活化剂是疏水性的，具有从6至14个碳原子或从8至12个碳原子，并且当该漂白活化剂是亲水性的，具有少于6个碳原子或甚至少于4个碳原子；并且L是离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)以及壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)。适合的漂白活化剂还披露于WO 98/17767中。尽管可以使用任何适合的漂白活化剂，但是在本发明的一个方面中，主题清洁组合物可以包括NOBS、TAED或其混合物；以及
(5)能够接受来自过氧酸的氧原子并且将该氧原子转移至可氧化底物的漂白催化剂描述于WO 2008/007319中。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺鎓(iminium)阳离子及聚离子；亚胺鎓兼性离子；改性的胺；改性的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-膦酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。该漂白催化剂将典型地以按重量计从0.0005％至0.2％、从0.001％至0.1％或甚至从0.005％至0.05％的水平被包括在该洗涤剂组合物中。
当存在时，基于该组合物，该过酸和/或漂白活化剂通常以从约0.1至约60wt％、从约0.5至约40wt％或甚至从约0.6至约10wt％的量存在于该组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
辅料
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分,这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光增亮剂。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：
4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，
4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐，
4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，
4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐，
4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐以及，
2-(二苯乙烯基(stilbyl)-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。
还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(ParamountMinerals and Chemicals)，孟买，印度供应。
适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
织物调色剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包括所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收来改变所述织物色彩的染料或颜料。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276以及EP 1 876 226中。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。
污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污物释放聚合物可以例如是非离子或阴离子对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污物释放聚合物是包括一个芯结构和连接至该芯结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。芯结构可以包括如WO 2009/087523中详细描述的一个聚烯属烃亚胺结构或一个聚烷醇胺结构。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1 867 808或WO2003/040279中描述的那些。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他合适的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂、用于液体清洁剂的结构剂和/或结构弹性剂。
在一个方面中，该洗涤剂是一种紧凑液体衣物洗涤剂组合物，包括：a)按该组合物的重量计，至少约10％，优选从20％至80％的表面活性剂，选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、肥皂及其混合物；b)按该组合物的重量计，从约1％至约30％，优选从5％至30％的水；c)按该组合物的重量计，从约1％至约15％，优选从3％至10％的非氨基官能溶剂；以及d)按该组合物的重量计，从约5％至约20％的性能添加剂，选自螯合剂、污物释放聚合物、酶及其混合物；其中该紧凑液体衣物洗涤剂组合物包括以下各项中的至少一项：(i)该表面活性剂的阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂的重量比为从约1.5:1至约5:1，该表面活性剂包括按该组合物的重量计从约15％至约40％的阴离子表面活性剂并且包括按该组合物的重量计从约5％至约40％的肥皂；(ii)按该组合物的重量计从约0.1％至约10％的促泡剂(suds boosting agent)，选自促泡聚合物、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、氧化胺表面活性剂、两性表面活性剂及其混合物；以及(ii)(i)和(ii)两者。所有成分都描述于WO 2007/130562中。可用于这些洗涤剂配制品中的另外的聚合物描述于WO 2007/149806中。
在另一个方面中，该洗涤剂是一种紧凑颗粒状(粉状)洗涤剂，包括a)按该组合物的重量计，至少约10％，优选从15％至60％的表面活性剂，选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、肥皂及其混合物；b)按该组合物的重量计，从约10％至80％，优选从20％至60％的助洗剂，其中该助洗剂可以是一种选自以下各项的助洗剂的混合物，i)磷酸盐助洗剂，优选少于20％，更优选少于10％，甚至更优选少于5％的总助洗剂是磷酸盐助洗剂；ii)沸石助洗剂，优选少于20％，更优选少于10％，甚至更优选少于5％的总助洗剂是沸石助洗剂；iii)柠檬酸盐，优选0至5％的总助洗剂是柠檬酸盐助洗剂；iv)聚羧酸盐，优选0至5％的总助洗剂是聚羧酸盐助洗剂；v)碳酸盐，优选0至30％的总助洗剂是碳酸盐助洗剂以及vi)硅酸钠，优选0至20％的总助洗剂是硅酸钠助洗剂；c)按该组合物的重量计，从约0％至25％的填充物，例如硫酸盐，按该组合物的重量计，优选从1％至15％，更优选从2％至10％，更优选从3％至5％的填充物；以及d)按该组合物的重量计，从约0.1％至20％的酶，按该组合物的重量计，优选从1％至15％，更优选从2％至10％的酶。
M4金属蛋白酶在洗涤剂中的用途
对于洗涤剂配制者而言重要的污垢和污物由许多不同物质构成，已经开发具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用至其中的清洁过程中特异性地改善污物去除。本领域中已知的去污酶包括以下酶，例如碳水化合物酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、角质酶以及果胶酶。
在一个方面中，本发明涉及本发明的金属蛋白酶在洗涤剂组合物和清洁过程，例如衣物洗涤和硬表面清洁中的用途。因此，在一个方面中，本发明展示了本发明的金属蛋白酶对各种污物以及在各种条件下的洗涤效果。在本发明的一个具体方面中，该洗涤剂组合物及在清洁过程中的用途涉及本发明的金属蛋白酶与以上提及的去污酶中的至少一种一起使用，例如另一种蛋白酶，并且特别是丝氨酸蛋白酶。
在本发明的一个优选方面中，根据本发明有用的本发明的金属蛋白酶可以与至少两种酶组合。这些另外的酶详细描述于“其他酶”部分中，更优选是至少三种、四种或五种酶。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如碳水化合物分解活性(carbolyticactivity)、蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。酶组合可以例如是本发明的一种金属蛋白酶与另一种去污酶，例如本发明的金属蛋白酶和蛋白酶、本发明的金属蛋白酶和淀粉酶、本发明的金属蛋白酶和纤维素酶、本发明的金属蛋白酶和半纤维素酶、本发明的金属蛋白酶和脂肪酶、本发明的金属蛋白酶和角质酶、本发明的金属蛋白酶和果胶酶或本发明的金属蛋白酶和抗再沉积酶。更优选地，本发明的金属蛋白酶与至少两种其他去污酶组合，例如本发明的金属蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶和淀粉酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶和脂肪酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶和果胶酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶和纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶和半纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶和角质酶；或本发明的金属蛋白酶、淀粉酶和果胶酶；或本发明的金属蛋白酶、淀粉酶和角质酶；或本发明的金属蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、淀粉酶和半纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、脂肪酶和果胶酶；或本发明的金属蛋白酶、脂肪酶和角质酶；或本发明的金属蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、脂肪酶和半纤维素酶。甚至更优选地，本发明的金属蛋白酶可以与至少三种其他去污酶组合，例如本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶及果胶酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶及角质酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶及半纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及果胶酶；或本发明的金属蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及角质酶；或本发明的金属蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及半纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及果胶酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及角质酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶；或本发明的金属蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及半纤维素酶。根据本发明的金属蛋白酶可以与任何选自非穷尽性列表的酶组合，该列表包括：碳水化合物酶(例如淀粉酶)、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶、黄原胶酶或支链淀粉酶、肽酶、蛋白酶或脂肪酶。
在一个优选实施例中，本发明的金属蛋白酶与丝氨酸蛋白酶组合，例如S8家族蛋白酶，如或其变体。
在本发明的另一个实施例中，根据本发明有用的本发明的金属蛋白酶可以与一种或多种其他金属蛋白酶组合，例如另一种M4金属蛋白酶，包括或嗜热菌蛋白酶。此类组合可以进一步包括如上概述的其他洗涤剂酶的组合。
清洁过程或者纺织品保养过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗涤，但是它也可以是工业洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤织物和/或衣服的方法，其中该方法包括用包含一种洗涤剂组合物和至少一种本发明的金属蛋白酶的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是含有洗涤剂组合物的水洗溶液。
经过洗涤、清洁的织物和/或衣物或者本发明的纺织品保养过程可以是常规的可洗涤衣物洗涤，例如家用洗涤。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。
最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物相比时相似或改进的洗涤剂性能。
本发明进一步涉及本发明的金属蛋白酶在除去蛋白质污物过程中的用途。蛋白质污物可能是如食品污物等污物，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血、奶、墨水、草、或其组合。
典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污物被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且许多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。
在一个具体实施例中，本发明涉及包括本发明的金属蛋白酶的一种组合物在衣物或餐具洗涤中的用途，其中所述酶组合物进一步包括以下各项中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分。
在本发明的一个优选实施例中，表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的金属蛋白酶情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量有所减小。优选地，作为一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分按以下量存在：比在不添加本发明的金属蛋白酶的情况下组分在系统中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一个方面中，将本发明的金属蛋白酶用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。
洗涤方法
本发明的洗涤剂组合物理想地适用于在洗衣应用中使用。因此，本发明包括一种洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约8的pH。可以在溶液中按以下浓度使用这些组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约90℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。
在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下执行该洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约8。
在具体实施例中，在以下硬度下执行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。
本发明涉及一种用包括本发明的金属蛋白酶的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。
一个优选实施例涉及一种清洁方法，所述方法包括在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包括本发明的金属蛋白酶的清洁组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，该清洁组合物是一种洗涤剂组合物并且该过程是一个衣物洗涤或餐具洗涤过程。
另一个实施例涉及一种用于从织物上除去污物的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物与包括本发明的金属蛋白酶的组合物接触。
在一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物进一步包括至少一种如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，如选自下组的酶，该组由以下各项组成：碳水化合物酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶，木聚糖酶或角质酶或其组合。在又另一个优选实施例中，这些组合物包括减少的量的以下组分中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分或聚合物。
低温用途
如上所述，本发明的金属蛋白酶是M4金属蛋白酶。还已经将M4金属蛋白酶称为嗜热菌蛋白酶家族，因为叫做“嗜热菌蛋白酶”的M4金属蛋白酶是首先被表征的M4金属蛋白酶并且是被最佳表征的M4金属蛋白酶之一。嗜热菌蛋白酶由于其高温性能而已知。高温性能是优选的，例如在用于蛋白质合成的过程中，其中嗜热菌蛋白酶已经被频繁使用。因此，由于高温性能在这些过程中是有利的，已经制备了若干嗜热菌蛋白酶的耐热变体。
因此，出人意料的是，一些M4金属蛋白酶-例如，本发明的金属蛋白酶–当在例如AMSA中测试时，与在例如约60℃或以上的较高温度下相比，在低温(例如约40℃或以下的温度)下，实际表现相对较好。
此外，在一个特别优选的实施例中，当在AMSA中测试时，在约40℃或以下的洗涤温度下，本发明的金属蛋白酶在至少一些污物上比商业金属蛋白酶(例如)表现相对较好。
因此，本发明的一个实施例涉及一种进行衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁的方法，该方法包括使有待清洁的表面与本发明的一种金属蛋白酶接触，并且其中所述衣物洗涤、餐具洗涤、工业或机构清洁在约40℃或以下的温度下进行。本发明的一个实施例涉及金属蛋白酶在衣物洗涤、餐具洗涤或清洁过程中的用途，其中衣物洗涤、餐具洗涤、工业清洁中的温度是约40℃或以下。
在另一个实施例中，本发明涉及金属蛋白酶在除蛋白过程中的用途，其中除蛋白过程中的温度是约40℃或以下。
本发明还涉及与商业金属蛋白酶(例如)相比具有至少一种改进特性的金属蛋白酶在衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁过程中的用途并且其中衣物洗涤、餐具洗涤或清洁过程中的温度在约40℃或以下的温度下进行。
在以上确定的方法和用途的每一者中，洗涤温度是约40℃或以下，例如约39℃或以下、例如约38℃或以下、例如约37℃或以下、例如约36℃或以下、例如约35℃或以下、例如约34℃或以下、例如约33℃或以下、例如约32℃或以下、例如约31℃或以下、例如约30℃或以下、例如约29℃或以下、例如约28℃或以下、例如约27℃或以下、例如约26℃或以下、例如约25℃或以下、例如约24℃或以下、例如约23℃或以下、例如约22℃或以下、例如约21℃或以下、例如约20℃或以下、例如约19℃或以下、例如约18℃或以下、例如约17℃或以下、例如约16℃或以下、例如约15℃或以下、例如约14℃或以下、例如约13℃或以下、例如约12℃或以下、例如约11℃或以下、例如约10℃或以下、例如约9℃或以下、例如约8℃或以下、例如约7℃或以下、例如约6℃或以下、例如约5℃或以下、例如约4℃或以下、例如约3℃或以下、例如约2℃或以下、例如约1℃或以下。
在另一个优选实施例中，洗涤温度在约5℃-40℃的范围内，例如约5℃-30℃、约5℃-20℃、约5℃-10℃、约10℃-40℃、约10℃-30℃、约10℃-20℃、约15℃-40℃、约15℃-30℃、约15℃-20℃、约20℃-40℃、约20℃-30℃、约25℃-40℃、约25℃-30℃或约30℃-40℃。在一个特别优选的实施例中，洗涤温度是约30℃。
在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下执行该低温洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约8。
在具体实施例中，在以下硬度下执行该低温洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。
在除去鸡蛋污物中的用途
本发明的另一个具体实施例涉及鸡蛋污物的去除。这些类型的污物通常非常难于完全去除。鸡蛋污物在硬表面清洁中是特别有问题的，例如餐具洗涤，其中污物在洗涤后通常留在盘和刀具上。本发明的金属蛋白酶特别适于去除鸡蛋污物。
因此，本发明进一步涉及用于从纺织品、织物和/或硬表面(像餐具和刀具)，特别是从织物和纺织品去除鸡蛋污物的方法。本发明的一个优选方面涉及一种从纺织品和/或织物去除鸡蛋污物的方法，该方法包括使需要去除鸡蛋污物的表面与本发明的金属蛋白酶接触。在一个实施例中，本发明包括一种从纺织品和/或织物去除鸡蛋污物的方法，该方法包括使需要去除鸡蛋污物的表面与包括本发明的金属蛋白酶的洗涤剂组合物接触。本发明还涉及一种去除鸡蛋污物的方法，该方法包括向待洗衣物和/或在洗涤过程中添加本发明的金属蛋白酶，其中所述纺织品和/或织物包括不同鸡蛋污物。
本发明的一个实施例涉及一种用于从硬表面或从待洗衣物除去鸡蛋污物的方法，该方法包括将含鸡蛋污物的硬表面或含鸡蛋污物的衣物与包含本发明的金属蛋白酶的清洁或洗涤剂组合物，优选衣物洗涤或餐具洗涤组合物接触。
另一个实施例涉及一种用于从织物或纺织品去除鸡蛋污物的方法，该方法包括使该织物或纺织品与包括本发明的金属蛋白酶的清洁或洗涤剂组合物，优选衣物洗涤或餐具洗涤组合物接触。
一个仍另外的实施例涉及一种用于从织物或纺织品去除鸡蛋污物的方法，该方法包括使所述织物或纺织品与包括本发明的金属蛋白酶的组合物接触，其中所述组合物进一步包括至少一种如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，例如一种选自下组的酶，该组由以下各项组成：碳水化合物酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、角质酶或其组合。
在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下执行该除鸡蛋方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约8。
在具体实施例中，在以下硬度下执行该除鸡蛋方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。
在此引用的所有文献均通过引用以其全文结合在此。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
材料和方法
Protazyme AK活性测定：
底物：Protazyme AK片(AZCL-酪蛋白，麦格酶(Megazyme)T-PRAK1000)。
温度：37℃
测定缓冲液：50mM HEPES/NaOH，pH 7.0。
通过温和搅拌，将一片Protazyme AK悬浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德(Eppendorf)管中并置于冰上。向冰冷管中添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm)下孵育15分钟。通过将管转移回冰浴中终止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD650作为蛋白酶活性的量度。在测定法中包含空白缓冲液(代替酶)。
用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
为了评定洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行衣物洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械压力。关于进一步描述,参见WO 2002/42740，特别是第23-24页上的“特定方法实施例”段落。
在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：
洗涤剂剂量 2g/L和8g/L(洗衣液标准洗涤剂)
酶剂量 30nM
测试溶液体积 160微升(140微升洗涤剂和20微升酶/缝)
pH 调节至pH 7或pH 6(洗衣液标准洗涤剂)
洗涤时间 20分钟
温度 20℃和40℃
水硬度 15°dH
标准洗涤剂和测试材料如下：
所有测试材料都获得自EMPA测试材料公司(EMPA Testmaterials AG)12，圣加伦CH-9015街，瑞士，来自测试材料BV公司中心(Center ForTestmaterials BV)，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰，和WFKTestgewebe有限公司，克里斯坦菲尔(Christenfeld)10，D-41379布吕根(Brüggen)，德国。
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:NaHCO3＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。以另一种表达方式，较干净的样品将反射更多光并且将具有较高的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))，Midtager 29，DK-2605(丹麦(Denmark))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
实例1.脂环酸芽孢杆菌属O2525基因组的测序
从收集于丹麦森林的环境样品中分离新颖的细菌菌株，该细菌菌株被指定为脂环酸芽孢杆菌属O2525，表示脂环酸芽孢杆菌属内的一个新物种。
通过QIAamp DNA血液迷你试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit”)(凯杰公司(Qiagen)，希尔登，德国)分离该菌株的染色体DNA。使2ug的染色体DNA经受部分鸟枪基因组测序，一种在FASTERIS SA，瑞士可商购的服务。分析编码M4金属蛋白酶的蛋白质序列的基因组序列并且鉴定了两个编码M4金属蛋白酶的基因(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)。
实例2：包含编码SEQ ID NO:2的M4金属蛋白酶多肽的脂环酸芽孢杆菌属O2525基因组序列的芽孢杆菌属表达载体的构建
蛋白酶的克隆与表达
如描述于WO 99/43835(通过引用结合在此)中，通过SOE PCR融合将框内的来自克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶(aprH)的信号肽融合至编码该蛋白酶的DNA。为了扩增编码DNA，将脂环酸芽孢杆菌属O2525的基因组DNA用作模板并且将寡聚物C25DU.f和C25DU.r用来通过PCR扩增该基因，其中加下划线的序列对应于基因序列并且未加下划线的序列对应于SOE表达盒。
C25DU.f GTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGTCACCGACAAGCAA(SEQ ID NO:5)
C25DU.r CCAAGGCCGGTTTTTTATGTTTTAGTTGACGCCTACGTT(SEQ ID NO:6)
PCR反应混合物具有以下组成：
1μl基因组脂环酸芽孢杆菌属O2525DNA(10.4ng/μl)
1μl引物C25DU.f(50pmol/μl)
1μl引物C25DU.r(50pmol/μl)
2μl dNTP(10mM)
10μl缓冲液HF(5x)
0.5μlPhusion聚合酶
34.5μl水。
Phusion聚合酶和缓冲液HF由费泽姆公司(Finnzymes)提供并且根据制造商的说明书进行使用。
使PCR反应混合物经受以下程序：
1.98℃，持续30min。
2.98℃，持续10s
3.60℃，持续20s
4.72℃，持续2min
5.将步骤2至4重复35次
6.72℃，持续10min
7.在4℃下浸泡。
将反应混合物装载在TAE琼脂糖凝胶上并且观察到一个预期大小的条带。
将衍生的PCR产物融合至表达盒元件。通过三联启动子系统进行控制来表达来自脂环酸芽孢杆菌属的蛋白酶基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyQ)和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。表达盒已经描述于WO 99/43835中。此外，该表达盒包含一个终止子(term)序列和一种用于编码氯霉素乙酰转移酶(cam)的基因，该氯霉素乙酰转移酶被用作枯草芽孢杆菌的选择性标记(如描述于帝德里奇森(Diderichsen)等人，1993，质粒(Plasmid)30:312-315中)。
将作为上述完整表达盒的一部分的融合的基因片段转化进枯草芽孢杆菌中并且将该蛋白酶基因通过同源重组整合进果胶裂解酶基因座中的枯草芽孢杆菌染色体中(WO99/43835)。
通过DNA测序分析氯霉素抗性转化株，以验证该构建体的正确的DNA序列。
将转化株涂在LB+6μg/ml氯霉素+脱脂乳上于37℃下过夜。在菌落周围观察到透明圈，指示这些菌落产生了活性蛋白酶，而没有脂环酸芽孢杆菌属金属蛋白酶基因的对照未给出任何圈。
实例3：具有SEQ ID NO:1并且编码具有蛋白酶活性的多肽的脂环酸芽孢杆菌属基因组序列的表征
用应用生物系统公司3700型全自动DNA测序仪(Applied Biosystems Model3700Automated DNA Sequencer)，使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)，福斯特城，加州，美国)和引物步移策略进行脂环酸芽孢杆菌属基因组克隆的DNA测序。仔细检查核苷酸序列数据的质量，并且借助PHRED/PHRAP软件(华盛顿大学，西雅图，华盛顿州，美国)将所有序列互相比较。获得的序列与来自基因组测序的序列相同(参见实例1)。
脂环酸芽孢杆菌属D1426D基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQID NO:1和SEQ ID NO:2中。编码序列是1535bp，包括终止密码子。编码的预测蛋白质是511个氨基酸。使用SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学10:1-6)预测出25个残基的信号肽。
实例4：包含编码SEQ ID NO:4的M4金属蛋白酶多肽的脂环酸芽孢杆菌属基因组序列的芽孢杆菌属表达载体的构建
设计两个PCR引物来扩增编码SEQ ID NO:4的M4金属蛋白酶的基因组DNA序列：
D726XU.f：TTTTCTGTATTGACGTACTATTCTGAGATG(SEQ ID NO.7)
D726XU.r：ACTGTTTAAATACTACGATAATTTCGCAG(SEQ ID NO:8)
进行第一次PCR扩增，以便扩增SEQ ID NO:3的基因组序列。
1μl基因组脂环酸芽孢杆菌属O2525DNA(10.4ng/μl)
0.5μl引物D726XU.f(100pmol/μl)
0.5μl引物D726XU.r(100pmol/μl)
2μl dNTP(10mM)
10μl缓冲液HF(5x)
0.5μlPhusion聚合酶
34.5μl水。
Phusion聚合酶和缓冲液HF由费泽姆公司提供并且根据制造商的说明书进行使用。
使PCR反应混合物经受以下程序：
1.98℃，持续30min。
2.98℃，持续10s
3.52℃，持续20s
4.72℃，持续90s
5.将步骤2至4重复35次
6.72℃，持续10min
7.在4℃下浸泡。
使5μl的反应混合物在琼脂糖凝胶上跑胶并且观察到一个预期大小的条带。将此第一PCR反应混合物用作进行第二次PCR的模板DNA，使用描述于实例2中的相同引物和条件。
将来自第二次PCR的所得PCR反应混合物用作进行SOE PCR融合的模板，形成具有控制元件的融合并且形成表达盒，如描述于实例2和WO 99/43835中进行，并且分离包括具有SEQ ID NO:3的脂环酸芽孢杆菌属O2525 D726XU基因的转化株。
将转化株涂在LB+6μg/ml氯霉素+脱脂乳上于37℃下过夜。在菌落周围观察到透明圈，指示这些菌落产生了活性蛋白酶，而没有脂环酸芽孢杆菌属金属蛋白酶基因的对照未给出任何圈。
实例5：具有SEQ ID NO:3并且编码具有蛋白酶活性的多肽的脂环酸芽孢杆菌属O2525基因组序列的表征
用应用生物系统公司3700型全自动DNA测序仪，使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(应用生物系统公司，福斯特城，加州，美国)和引物步移策略进行脂环酸芽孢杆菌属O2525基因组克隆的DNA测序。仔细检查核苷酸序列数据的质量，并且借助PHRED/PHRAP软件(华盛顿大学，西雅图，华盛顿州，美国)将所有序列互相比较。获得的序列与来自基因组测序的序列相同(参见实例1)。
脂环酸芽孢杆菌属D726XU基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQID NO:3和SEQ ID NO:4中。编码序列是1554bp，包括终止密码子。编码的预测蛋白质是517个氨基酸。使用SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学10:1-6)预测出25个残基的信号肽。
实例6：具有SEQ ID NO:2的M4金属蛋白酶的纯化
选择一个获得于实例2中的表达克隆并且在富培养基中于旋转的摇床上在500mL带挡板锥形瓶中进行培养，每个锥形瓶都包含100ml补充有34mg/l氯霉素的酪蛋白基培养基。将该克隆在26℃下培养120小时，之后收获烧瓶并且将培养液合并。
将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液施加至在100mM H3BO3，10mM MES，2mM CaCl2，pH 6中平衡的杆菌肽琼脂糖柱(来自Upfront层析公司(Upfront chromatography))上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后，将M4蛋白酶用具有25％(v/v)2-丙醇的100mM H3BO3，10mM MES，2mM CaCl2，1M NaCl，pH 6洗脱。分析来自该柱的部分的蛋白酶活性(pH 7下的Protazyme AK纯化活性测定)并通过SDS-PAGE进一步分析活性部分。在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上仅有一个条带可见的情况下，将各部分合并并且转移至作为纯化制剂的G25葡聚糖凝胶柱上的100mM H3BO3，10mM MES，2mMCaCl2，pH 6上。
实例7：具有SEQ ID NO:4的M4金属蛋白酶的纯化
选择一个获得于实例4中的表达克隆。培养该克隆并且使用与描述于实例6中的相同方法纯化金属蛋白酶。
实例8：M4金属蛋白酶的表征
根据制造商的说明书，使用应用生物系统公司Procise氨基酸测序仪型号494(Applied Biosystems Procise Amino acid Sequencer Model 494)，使实例6中纯化的具有SEQ ID NO:2的M4金属蛋白酶和实例7中纯化的具有SEQ ID NO:4的M4金属蛋白酶经受通过埃德曼降解进行的N-末端测序。
对于具有SEQ ID NO:2的M4金属蛋白酶，将N-末端确定为VAGTGTG，对应于SEQ IDNO:2中的氨基酸214至220。因此，成熟蛋白对应于SEQ ID NO:2的氨基酸214至511并且由298个氨基酸组成。SEQ ID NO:2的氨基酸1至25是预测的信号序列并且SEQ ID NO:2的氨基酸26至213是前肽。完整成熟蛋白的质谱分析显示，该成熟蛋白具有预期质量(数据未示出)。
对于具有SEQ ID NO:4的M4金属蛋白酶，将N-末端确定为DNTATAT，对应于SEQ IDNO:4中的氨基酸214至220。因此，成熟蛋白对应于SEQ ID NO:4的氨基酸214至517并且由304个氨基酸组成。SEQ ID NO:4的氨基酸1至25是预测的信号序列并且SEQ ID NO:4的氨基酸26至213是前肽。完整成熟蛋白的质谱分析显示，该成熟蛋白具有预期质量(数据未示出)。
实例9：AMSA洗涤性能
如以上所描述的，在AMSA测试中测试来自实例6和7的纯化的金属蛋白酶，使用商业蛋白酶9(SEQ ID NO 9)作为参照。
获得以下强度值：
2g/L洗涤剂，20℃
8g/L洗涤剂，20℃
2g/L洗涤剂，40℃
8g/L洗涤剂，40℃
这些结果显示，本发明的金属蛋白酶在衣物洗涤中具有良好性能并且与商业蛋白酶处于相同水平或优于商业蛋白酶本发明的金属蛋白酶对鸡蛋污物(CS-37)的表现特别好，其中在所有测试条件下，性能都高于参照。

Claims (19)

1.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
a.一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少99％序列一致性；和
b.一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少99％序列一致性，
其中所述多肽来源于脂环酸芽孢杆菌属菌种(Alicyclobacillus sp.)。
2.如权利要求1所述的多肽，其中该多肽由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成。
3.如权利要求2所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸214至511。
4.如权利要求1所述的多肽，其中该多肽由SEQ ID NO:4的成熟多肽组成。
5.如权利要求4所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸214至517。
6.一种组合物，该组合物包括如权利要求1-5中任一项所述的多肽。
7.如权利要求6所述的组合物，该组合物是一种洗涤剂组合物。
8.如权利要求7所述的组合物，该洗涤剂组合物进一步包括一种或多种选自以下各项的另外的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、碳水化物酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、和/或过氧化物酶。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述氧化酶是漆酶。
10.如权利要求7-9中任一项所述的组合物，该洗涤剂组合物处于以下形式：棒、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩的或浓缩的液体。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的组合物在清洁过程中的用途。
12.根据权利要求11的用途，其中所述清洁过程为衣物洗涤或硬表面清洁。
13.根据权利要求11的用途，其中所述清洁过程为餐具洗涤。
14.根据权利要求11的用途，其中所述清洁过程为自动化餐具洗涤。
15.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-5中任一项所述的多肽。
16.一种核酸构建体，该核酸构建体包括如权利要求15所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
17.一种表达载体，该表达载体包括如权利要求15所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
18.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求15所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
19.一种产生具有蛋白酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求18所述的宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
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