CN105264058B - α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及α‑淀粉酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。
相关技术说明
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，这些用途如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，例如在制备高果糖糖浆中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。
属于首先被使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作特妙淀粉酶(Termamyl)，所述特妙淀粉酶已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。芽孢杆菌属淀粉酶(如特妙淀粉酶和SP707)形成一个特定组的已经用于洗涤剂中的α-淀粉酶。这些已知的细菌淀粉酶中许多已经经修饰以便改进它们在特定应用中的功能性。
已经充分研究了增加α-淀粉酶热稳定性的方法。铃木(Suzuki)等人(1989)披露了其中已经将解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶的指定区域置换为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的相应区域的嵌合α-淀粉酶。构建这种嵌合α-淀粉酶，目的在于鉴定负责热稳定性的区域。发现这类区域包含解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的第177-186位氨基酸残基和第255-270位氨基酸残基。五十岚(Igarashi)等人1998显示可以通过从环(F178至A184)中缺失两个氨基酸残基R179-G180(AmyS编号)而增加AmyS-型淀粉酶的热稳定性。然而，晓(Shiau)等人(2003)显示在相同环中具有缺失的AmyS酶在高温具有比亲本酶更低的玉米淀粉水解比活性，从而否定了AmyS淀粉酶的主要优点之一。
出于环境原因，在洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中降低温度已经日益重要。然而，大多数酶(包括淀粉酶)具有通常在低温洗涤中所用温度以上的最适温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。因此，重要的是找到这样的α-淀粉酶变体，它们在温度降低时保留其洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。然而，尽管当前洗涤剂酶组合物的效率，仍然存在着难以彻底去除的许多污渍。这些问题因利用低(例如，冷水)洗涤温度的增加和较短的洗涤周期而加剧。因而，需要获得这样的淀粉分解酶，这些酶可以在低温下起作用并同时保留或增加其他令人希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能。
因而，本发明的目的在于提供以下α-淀粉酶变体:在低温下具有高性能特别是高洗涤性能的α-淀粉酶变体和/或在洗涤剂组合物中具有高稳定性的α-淀粉酶变体和/或在洗涤剂中存储后具有高淀粉酶活性的α-淀粉酶变体。
本发明的另一个目的在于提供以下α-淀粉酶变体：在掺入洗涤剂组合物如液体洗涤剂中时,特别是在螯合剂、表面活性剂、蛋白酶和/或碱性条件的存在下，该α-淀粉酶变体展示出高水平稳定性。
本发明提供了与其亲本相比具有改进的稳定性的α-淀粉酶变体。
发明概述
本发明涉及一种分离的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括a)在对应于SEQ IDNO:1或2的成熟多肽的位置R180、S181、T182和G183的两个或更多个位置处的缺失，以及b)在对应于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的位置Y48、E169、S170、R171、K172、L173、N174、L205、R309、M317、I390的一个或多个位置处的改变，其中每个改变独立地是取代或插入并且其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
本发明还涉及包含这些变体的洗涤剂组合物，编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及这些变体在清洁过程中的用途。
本发明还涉及通过向亲本α-淀粉酶引入以下各项而改进α-淀粉酶的洗涤剂稳定性的方法：a)在对应于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的位置R180、S181、T182和G183的两个或更多个位置处的缺失，以及b)
在对应于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的位置Y48、E169、S170、R171、K172、L173、N174、L205、R309、M317、I390的一个或多个位置处的改变，
其中每个改变独立地是取代或插入，其中所得变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性，其中该所得变体具有α-淀粉酶活性并且与该亲本α-淀粉酶相比具有改进的洗涤剂稳定性。
定义
α-淀粉酶：术语“α-淀粉酶活性”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，其构成一组催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。出于本发明的目的，根据方法中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。
SEQ ID NO:1：
Figure BDA0000865189410000031
SEQ ID NO:2：
Figure BDA0000865189410000032
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽。其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一个片段包含至少480个氨基酸残基、至少481个氨基酸残基或至少482个氨基酸残基。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指一种与变体相关的特征，该特征相比于亲本或相比于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽得到了改进。此类改进的特性包括但不限于催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、存储条件下稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性以及热稳定性和改进的洗涤性能，特别是在低温下，例如5℃与35℃之间的温度，例如低于35℃或低于30℃或甚至低于20℃，或在低于15℃的温度下，或甚至在低于10℃的温度下的改进的洗涤性能。可以在这些变体中改进的另一种特性是在洗涤剂组合物中的稳定性，即洗涤剂稳定性。给定变体的洗涤剂稳定性(或残余活性)可以通过在洗涤剂标准溶液中孵育该变体来确定，该洗涤剂标准溶液优选包含螯合剂例如EDTA、EGTA、DTPA、DTMPA、MGDA或HEDP。例如，将包含DTMPA(终浓度0.2％)的90vol％的标准洗涤剂A(见下文)与10vol％淀粉酶溶液(0.6mg/ml)在40℃下孵育1小时。作为另一个实例，将还包含HEDP(终浓度1.5％)的90vol％的标准洗涤剂A(见下文)与10vol％淀粉酶溶液(0.6mg/ml)在37℃下孵育2小时。确定在给定温度下孵育给定时间段后的淀粉酶活性，举例来说，通过使用如下所述的EnzChek测定来确定。然后将此活性与在相同洗涤剂组合物中在4℃下孵育相同时间段的参照的活性进行比较。作为另一个实例，用10vol％淀粉酶溶液(0.6mg/ml)孵育还包含另外的终浓度为0.5％(w/v)的EDTA的90％终浓度的洗涤剂A。确定在给定温度下孵育给定时间段后的淀粉酶活性，举例来说，通过使用如下所述的Phadebas测定来确定。然后将此活性与在相同洗涤剂组合物中在4℃下孵育相同时间段的参照的活性进行比较。
在两种处理之间的差异越少，洗涤剂稳定性越高。使用包含螯合剂的标准洗涤剂J或其他洗涤剂可以进行相似测试。
洗涤性能：在本发明背景下，使用术语“洗涤性能”作为酶在例如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的能力。可以通过计算如在于此的定义中描述的所谓的δ反射值(ΔRem)量化洗涤性能。
改进的洗涤性能：在此将术语“改进的洗涤性能”定义为变体酶例如通过增加的污渍去除而相对于亲本淀粉酶的洗涤性能或相对于具有示于SEQ ID NO 1或2中的氨基酸序列的α-淀粉酶展现出淀粉酶变体的洗涤性能的改变。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。可以通过比较如在于此的定义中描述的所谓的δ反射值(ΔRem)测量改进的洗涤性能。
低温：“低温”是5℃-35℃，优选5℃-30℃更优选5℃-25℃，更优选5℃-20℃，最优选5℃-15℃并且特别是5℃-10℃的温度。在一个优选实施例中，“低温”是10℃-35℃，优选10℃-30℃，更优选10℃-25℃，最优选10℃-20℃，并且特别是10℃-15℃的温度。
δ反射值(Delta remission value，ΔRem)：在此将术语“δ反射”或“δ反射值”定义为测试材料在460nm处的反射率或反射测量值的结果，该测试材料是例如小块布样CS-28(测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV)，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰)或硬表面。将该小块布样与作为背景的至少一个其他小块布样一起测量，该其他小块布样是在相同条件下洗涤的。δ反射是用淀粉酶洗涤的测试材料的反射值减去未用淀粉酶洗涤的测试材料的反射值。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质上相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质上相关的启动子强的启动子)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQID NO:1的氨基酸1至583。在另一方面，该多肽具有C-末端CBM的截短，这样使得该成熟多肽意指对应于SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:1的氨基酸1-484。
本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行改变以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核酸核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母或丝状真菌)表达的一种α-淀粉酶。
变体命名惯例
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽用来确定另一种α-淀粉酶中的对应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定对应于SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537:_39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:_1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。在给定位置处的氨基酸可以用任何其他氨基酸取代的情况下，将其表示为T226ACDEFGHIKLMNPQRSWVY。因此，这意味着位置226处的苏氨酸可以被选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、W、V或Y的组的一个氨基酸取代。同样地，在给定位置处的氨基酸可以用选自特定的氨基酸组的一个氨基酸取代的情况下，例如在位置226处的苏氨酸可以被酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸中的任一个取代的情况下，将其表示为T226YFH。给定位置处的不同改变还可以由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”代表位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
发明详述
本发明涉及分离的α-淀粉酶变体，该变体包括a)在对应于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的位置R180、S181、T182和G183的两个或更多个位置处的缺失，以及b)在对应于SEQ IDNO:1或2的成熟多肽的位置Y48、E169、S170、R171、K172、L173、N174、L205、R309、M317、I390、D16、N19、Q53、V60、F105、F116、P124、S125、N128、T131、G133、K178、A185、E189、N194、A203、M208、H209、E211、V212、V213、K241、Y242、F245、F266、Y269、K280、G283、M285、N294、L323、K375、I404和Q407的一个或多个位置处的改变，其中每个改变独立地是取代、缺失或插入，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性。
在一个实施例中，该改变b)是在跨越氨基酸位置170-174的环中的插入。该插入可以选自以下清单，该表包括：S170SA、S170SC、S170SD、S170SE、S170SF、S170SG、S170SH、S170SI、S170SK、S170SL、S170SM、S170SN、S170SP、S170SQ、S170SR、S170SS、S170ST、S170SV、S170SW、S170SY、R171RA、R171RC、R171RD、R171RE、R171RF、R171RG、R171RH、R171RI、R171RK、R171RL、R171RM、R171RN、R171RP、R171RQ、R171RR、R171RS、R171RT、R171RV、R171RW、R171RY、K172KA、K172KC、K172KD、K172KE、K172KF、K172KG、K172KH、K172KI、K172KK、K172KL、K172KM、K172KN、K172KP、K172KQ、K172KR、K172KS、K172KT、K172KV、K172KW、K172KY、L173LA、L173LC、L173LD、L173LE、L173LF、L173LG、L173LH、L173LI、L173LK、L173LL、L173LM、L173LN、L173LP、L173LQ、L173LR、L173LS、L173LT、L173LV、L173LW、L173LY、N174NA、N174NC、N174ND、N174NE、N174NF、N174NG、N174NH、N174NI、N174NK、N174NL、N174NM、N174NN、N174NP、N174NQ、N174NR、N174NS、N174NT、N174NV、N174NW、N174NY。
在一个实施例中，该改变b)选自以下中的一个或多个：Y48W、Y48F、E169EQ、S170SL、R171RR、R171RQ、R171RL、R171RN、R171RF、K172KA、K172KF、K172KL、K172KN、K172KR、L173LR、L173LF、L173LL、L173LA、N174NQ、N174NF、N174NL、N174NA、N174NN、N174NS、L205F、L205Y、L205I、R309Q、M317F、M317I、M317L、M317V、M317Y、I390E、I390D、I390Q、I390N、N194F+L205Y、N194F+L205F、N194Y+L205Y、N194Y+L205F、Y48W+L205Y、V60A+L205Y、Y48W+V60A+L205F、Y48W+V60A+L205Y、D16Y、N19D、Q53R、V60A、F105M、F116W、P124*、P124D、P124S、P124T、S125N、S125P、N128F、N128H、N128I、N128K、N128R、T131D、T131E、T131L、G133D、K172Q、L173F、L173Y、N174NE、N174ND、K178L、A185F、A185H、A185L、A185I、A185P、E189P、N194F、N194Y、N194H、N194L、N194I、A203S、A203T、L205I、M208F、M208I、M208L、M208Y、H209D、H209M、H209T、E211D、E211L、V212G、V212A、V212S、V212T、V212P、V212N、V212I、V213I、V213S、V213T、V213Q、K241R、Y242F、F245I、F245L、F245M、F245S、F245T、F245V、F245Y、F266Y、Y269N、K280R、G283S、M285F、M285H、N294Y、M317F、L323H、K375Q、I404F、I404L、I404Y、Q407H、N194F+L205Y、N194F+L205F、N194Y+L205Y、N194Y+L205F、V212S+V213T、V212G+V213T、V212N+V213I、V212N+V213Q、V212P+V213T、D16Y+K375Q、N19D+Q53R、Y48W+V60A、Y48W+F105M、Y48W+L205Y、V60A+L205Y、Y48W+V60A+F105M、Y48W+V60A+L205F、V60A+F105M+L205F、Y48W+V60A+F105M+L205F、Y48W+V60A+L205Y、V60A+F105M+L205Y、Y48W+V60A+F105M+L205Y、P124D+S125P、P124D+S125N、S125N+N174NN、K172Q+N174NQ、K172Q+L173F、K172Q+L173F+N174NQ、Y242F+F266Y、Y269N+N294Y和G283S+L323H。
在一个优选的实施例中，该改变b)包括选自以下清单的取代或由其组成，该清单由以下各项组成：L205Y、L205F、Y48W、R309Q、M317L、I390E；或者包括选自以下清单的插入或由其组成，该清单由以下各项组成：N174NQ、N174NL和N174NN。
在另一个实施例中，该改变b)包括选自N194F或N194Y的取代或由其组成。
在一个优选的实施例中，该缺失a)选自以下清单，该清单由以下各项组成：R180*+S181*、R180*+T182*、R180*+G183*、S181*+T182*、S181*+G183*和T182*+G183*，优选的是R180*+S181*。
在一个优选的实施例中，该缺失a)和改变b)选自以下清单，该清单由以下各项组成：L205Y+R180*+S181*、L205Y+R180*+T182*、L205Y+R180*+G183*、L205Y+S181*+T182*、L205Y+T182*+G183*、L205F+R180*+S181*、L205F+R180*+T182*、L205F+R180*+G183*、L205F+S181*+T182*、L205F+T182*+G183*、Y48W+R180*+S181*、Y48W+R180*+T182*、Y48W+R180*+G183*、Y48W+S181*+T182*、Y48W+T182*+G183*、R309Q+R180*+S181*、R309Q+R180*+T182*、R309Q+R180*+G183*、R309Q+S181*+T182*、R309Q+T182*+G183*、M317L+R180*+S181*、M317L+R180*+T182*、M317L+R180*+G183*、M317L+S181*+T182*、M317L+T182*+G183*、N174NQ+R180*+S181*、N174NQ+R180*+T182*、N174NQ+R180*+G183*、N174NQ+S181*+T182*、N174NQ+T182*+G183*、N174NN+R180*+S181*、N174NN+R180*+T182*、N174NN+R180*+G183*、N174NN+S181*+T182*、N174NN+T182*+G183*、N174NL+R180*+S181*、N174NL+R180*+T182*、N174NL+R180*+G183*、N174NL+S181*+T182*、N174NL+T182*+G183*、N174NA+R180*+S181*、N174NA+R180*+T182*、N174NA+R180*+G183*、N174NA+S181*+T182*、N174NA+T182*+G183*、Y48W+L205Y+R180*+S181*、Y48W+L205Y+R180*+T182*、Y48W+L205Y+R180*+G183*、Y48W+L205Y+S181*+T182*、Y48W+L205Y+T182*+G183*、V60A+L205Y+R180*+S181*、V60A+L205Y+R180*+T182*、V60A+L205Y+R180*+G183*、V60A+L205Y+S181*+T182*、V60A+L205Y+T182*+G183*、Y48W+V60A+L205Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+L205Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+L205Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+L205Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+L205Y+T182*+G183*、I390E+R180*+S181*、I390E+R180*+T182*、I390E+R180*+G183*、I390E+S181*+T182*、I390E+T182*+G183*、E169EQ+R180*+S181*、E169EQ+R180*+T182*、E169EQ+R180*+G183*、E169EQ+S181*+T182*、和E169EQ+T182*+G183*。
、N194F+R180*+S181*、N194F+R180*+T182*、N194F+R180*+G183*、N194F+S181*+T182*、N194F+T182*+G183*、N194Y+R180*+S181*、N194Y+R180*+T182*、N194Y+R180*+G183*、N194Y+S181*+T182*、N194Y+T182*+G183*、V212G+R180*+S181*、V212G+R180*+T182*、V212G+R180*+G183*、V212G+S181*+T182*、V212G+T182*+G183*、V212S+R180*+S181*、V212S+R180*+T182*、V212S+R180*+G183*、V212S+S181*+T182*、V212S+T182*+G183*、V212P+R180*+S181*、V212P+R180*+T182*、V212P+R180*+G183*、V212P+S181*+T182*、V212P+T182*+G183*、V212T+R180*+S181*、V212T+R180*+T182*、V212T+R180*+G183*、V212T+S181*+T182*、V212T+T182*+G183*、V213I+R180*+S181*、V213I+R180*+T182*、V213I+R180*+G183*、V213I+S181*+T182*、V213I+T182*+G183*、V213T+R180*+S181*、V213T+R180*+T182*、V213T+R180*+G183*、V213T+S181*+T182*、V213T+T182*+G183*、K178L+R180*+S181*、K178L+R180*+T182*、K178L+R180*+G183*、K178L+S181*+T182*、K178L+T182*+G183*、E189P+R180*+S181*、E189P+R180*+T182*、E189P+R180*+G183*、E189P+S181*+T182*、和E189P+T182*+G183*。
在另一个实施例中，该改变a)和变体b)选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194F+R180*+S181*、N194F+R180*+T182*、N194F+R180*+G183*、N194F+S181*+T182*、N194F+T182*+G183*、N194Y+R180*+S181*、N194Y+R180*+T182*、N194Y+R180*+G183*、N194Y+S181*+T182*和N194Y+T182*+G183*。
在另一个实施例中，该改变a)和变体b)选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194F+L205Y+R180*+S181*、N194F+L205Y+R180*+T182*、N194F+L205Y+R180*+G183*、N194F+L205Y+S181*+T182*或N194F+L205Y+T182*+G183*。
在另一个实施例中，该变体进一步包括在相应于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的位置G475和S243的一个或两个位置处的取代，优选G475K和/或S243Q。
在另一个实施例中，该改变b)是在所述位置中的两处或更多处，例如所述位置中的三处或更多处、所述位置中的四处或更多处、所述位置中的五处或更多处、所述位置中的六处或更多处、所述位置中的七处或更多处、所述位置中的八处或更多处、或所述位置中的九处或更多处。
在另一个实施例中，该改变的数目是2-20个，例如，2-10个或2-5个，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
a.在一个优选实施例中，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：a.与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；b.与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；c.SEQ ID NO:1的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性；e.与针对SEQ ID NO:1的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽；f.与针对SEQ ID NO:2的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽；g.由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中-高严格条件下与(i)SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列或(ii)其全长互补体杂交；h.由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性。
在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。
在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:1的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
在一个优选的实施例中，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、存储条件下稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性、热稳定性，以及优选地低温下的改进的洗涤性能。
在一个特别优选的实施例中，与亲本α-淀粉酶相比，该变体具有改进的洗涤剂稳定性。
在另一个实施例中，该变体相对于SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶在液体洗涤剂中具有改进的存储稳定性。改进的存储稳定性可以确定为在1至8周的存储期(例如从2-6周，优选2、3、4、5或6周)后的残余活性。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205Y。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205Y。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205F。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205F。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194F。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194F。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194Y。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194Y。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代Y48W。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y48W。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代R309Q。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R309Q。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代M317L。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代M317L。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代I390E。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I390E。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NN。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NN。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NQ。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NQ。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NL。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NL。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NA。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NA。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NS。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NS。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入E169EQ。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入E169EQ。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入L173LA。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入L173LA。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代K178L。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K178L。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代E189P。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E189P。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失R180*+S181*。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失R180*+T182*。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失R180*+T182*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失R180*+G183*。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失R180*+G183*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失S181*+T182*。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失S181*+T182*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的缺失T182*+G183*。
在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失T182*+G183*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205Y和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205Y和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205Y和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205Y和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205Y和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205F和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205F和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205F和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205F和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代L205F和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194F和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194F和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194F和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194F和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194F和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194Y和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194Y和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194Y和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194Y和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N194Y和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代Y48W和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代Y48W和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代Y48W和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代Y48W和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代Y48W和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代R309Q和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代R309Q和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代R309Q和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代R309Q和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代R309Q和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代M317L和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代M317L和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代M317L和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代M317L和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代M317L和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代I390E和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代I390E和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代I390E和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代I390E和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代I390E和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NN和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NN和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NN和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NN和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NN和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NQ和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NQ和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NQ和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NQ和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入N174NQ和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代K178L和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代K178L和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代K178L和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代K178L和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代K178L和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代E189P和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代E189P和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代E189P和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代E189P和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代E189P和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205Y和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205Y和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205Y和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205Y和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205Y和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205F和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205F和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205F和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205F和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L205F和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194F和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194F和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194F和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194F和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194F和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194Y和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194Y和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194Y和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194Y和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N194Y和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y48W和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y48W和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y48W和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y48W和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y48W和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R309Q和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R309Q和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R309Q和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R309Q和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R309Q和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代M317L和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代M317L和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代M317L和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代M317L和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代M317L和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I390E和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I390E和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I390E和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I390E和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I390E和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NN和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NN和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NN和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NN和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NN和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NQ和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NQ和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NQ和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NQ和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的插入N174NQ和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K178L和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K178L和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K178L和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K178L和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K178L和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E189P和缺失R180*+S181*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E189P和缺失R180*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E189P和缺失R180*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E189P和缺失S181*+T182*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E189P和缺失T182*+G183*或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：D16Y+R180*+S181*、D16Y+R180*+T182*、D16Y+R180*+G183*、D16Y+S181*+T182*、D16Y+T182*+G183*、D16Y+N194F+R180*+S181*、D16Y+N194F+R180*+T182*、D16Y+N194F+R180*+G183*、D16Y+N194F+S181*+T182*、D16Y+N194F+T182*+G183*、D16Y+N194Y+R180*+S181*、D16Y+N194Y+R180*+T182*、D16Y+N194Y+R180*+G183*、D16Y+N194Y+S181*+T182*、D16Y+N194Y+T182*+G183*和D16Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N19D+R180*+S181*、N19D+R180*+T182*、N19D+R180*+G183*、N19D+S181*+T182*、N19D+T182*+G183*、N19D+N194F+R180*+S181*、N19D+N194F+R180*+T182*、N19D+N194F+R180*+G183*、N19D+N194F+S181*+T182*、N19D+N194F+T182*+G183*、N19D+N194Y+R180*+S181*、N19D+N194Y+R180*+T182*、N19D+N194Y+R180*+G183*、N19D+N194Y+S181*+T182*、N19D+N194Y+T182*+G183*和N19D+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+R180*+S181*、Y48W+R180*+T182*、Y48W+R180*+G183*、Y48W+S181*+T182*、Y48W+T182*+G183*、Y48W+N194F+R180*+S181*、Y48W+N194F+R180*+T182*、Y48W+N194F+R180*+G183*、Y48W+N194F+S181*+T182*、Y48W+N194F+T182*+G183*、Y48W+N194Y+R180*+S181*、Y48W+N194Y+R180*+T182*、Y48W+N194Y+R180*+G183*、Y48W+N194Y+S181*+T182*、Y48W+N194Y+T182*+G183*和Y48W+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48F+R180*+S181*、Y48F+R180*+T182*、Y48F+R180*+G183*、Y48F+S181*+T182*、Y48F+T182*+G183*、Y48F+N194F+R180*+S181*、Y48F+N194F+R180*+T182*、Y48F+N194F+R180*+G183*、Y48F+N194F+S181*+T182*、Y48F+N194F+T182*+G183*、Y48F+N194Y+R180*+S181*、Y48F+N194Y+R180*+T182*、Y48F+N194Y+R180*+G183*、Y48F+N194Y+S181*+T182*、Y48F+N194Y+T182*+G183*和Y48F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Q53R+R180*+S181*、Q53R+R180*+T182*、Q53R+R180*+G183*、Q53R+S181*+T182*、Q53R+T182*+G183*、Q53R+N194F+R180*+S181*、Q53R+N194F+R180*+T182*、Q53R+N194F+R180*+G183*、Q53R+N194F+S181*+T182*、Q53R+N194F+T182*+G183*、Q53R+N194Y+R180*+S181*、Q53R+N194Y+R180*+T182*、Q53R+N194Y+R180*+G183*、Q53R+N194Y+S181*+T182*、Q53R+N194Y+T182*+G183*和Q53R+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V60A+R180*+S181*、V60A+R180*+T182*、V60A+R180*+G183*、V60A+S181*+T182*、V60A+T182*+G183*、V60A+N194F+R180*+S181*、V60A+N194F+R180*+T182*、V60A+N194F+R180*+G183*、V60A+N194F+S181*+T182*、V60A+N194F+T182*+G183*、V60A+N194Y+R180*+S181*、V60A+N194Y+R180*+T182*、V60A+N194Y+R180*+G183*、V60A+N194Y+S181*+T182*、V60A+N194Y+T182*+G183*和V60A+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：F105M+R180*+S181*、F105M+R180*+T182*、F105M+R180*+G183*、F105M+S181*+T182*、F105M+T182*+G183*、F105M+N194F+R180*+S181*、F105M+N194F+R180*+T182*、F105M+N194F+R180*+G183*、F105M+N194F+S181*+T182*、F105M+N194F+T182*+G183*、F105M+N194Y+R180*+S181*、F105M+N194Y+R180*+T182*、F105M+N194Y+R180*+G183*、F105M+N194Y+S181*+T182*、F105M+N194Y+T182*+G183*和F105M+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：F116W+R180*+S181*、F116W+R180*+T182*、F116W+R180*+G183*、F116W+S181*+T182*、F116W+T182*+G183*、F116W+N194F+R180*+S181*、F116W+N194F+R180*+T182*、F116W+N194F+R180*+G183*、F116W+N194F+S181*+T182*、F116W+N194F+T182*+G183*、F116W+N194Y+R180*+S181*、F116W+N194Y+R180*+T182*、F116W+N194Y+R180*+G183*、F116W+N194Y+S181*+T182*、F116W+N194Y+T182*+G183*和F116W+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：P124*+R180*+S181*、P124*+R180*+T182*、P124*+R180*+G183*、P124*+S181*+T182*、P124*+T182*+G183*、P124*+N194F+R180*+S181*、P124*+N194F+R180*+T182*、P124*+N194F+R180*+G183*、P124*+N194F+S181*+T182*、P124*+N194F+T182*+G183*、P124*+N194Y+R180*+S181*、P124*+N194Y+R180*+T182*、P124*+N194Y+R180*+G183*、P124*+N194Y+S181*+T182*、P124*+N194Y+T182*+G183*和P124*+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：P124D+R180*+S181*、P124D+R180*+T182*、P124D+R180*+G183*、P124D+S181*+T182*、P124D+T182*+G183*、P124D+N194F+R180*+S181*、P124D+N194F+R180*+T182*、P124D+N194F+R180*+G183*、P124D+N194F+S181*+T182*、P124D+N194F+T182*+G183*、P124D+N194Y+R180*+S181*、P124D+N194Y+R180*+T182*、P124D+N194Y+R180*+G183*、P124D+N194Y+S181*+T182*、P124D+N194Y+T182*+G183*和P124D+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：P124S+R180*+S181*、P124S+R180*+T182*、P124S+R180*+G183*、P124S+S181*+T182*、P124S+T182*+G183*、P124S+N194F+R180*+S181*、P124S+N194F+R180*+T182*、P124S+N194F+R180*+G183*、P124S+N194F+S181*+T182*、P124S+N194F+T182*+G183*、P124S+N194Y+R180*+S181*、P124S+N194Y+R180*+T182*、P124S+N194Y+R180*+G183*、P124S+N194Y+S181*+T182*、P124S+N194Y+T182*+G183*和P124S+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：P124T+R180*+S181*、P124T+R180*+T182*、P124T+R180*+G183*、P124T+S181*+T182*、P124T+T182*+G183*、P124T+N194F+R180*+S181*、P124T+N194F+R180*+T182*、P124T+N194F+R180*+G183*、P124T+N194F+S181*+T182*、P124T+N194F+T182*+G183*、P124T+N194Y+R180*+S181*、P124T+N194Y+R180*+T182*、P124T+N194Y+R180*+G183*、P124T+N194Y+S181*+T182*、P124T+N194Y+T182*+G183*和P124T+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：S125N+R180*+S181*、S125N+R180*+T182*、S125N+R180*+G183*、S125N+S181*+T182*、S125N+T182*+G183*、S125N+N194F+R180*+S181*、S125N+N194F+R180*+T182*、S125N+N194F+R180*+G183*、S125N+N194F+S181*+T182*、S125N+N194F+T182*+G183*、S125N+N194Y+R180*+S181*、S125N+N194Y+R180*+T182*、S125N+N194Y+R180*+G183*、S125N+N194Y+S181*+T182*、S125N+N194Y+T182*+G183*和S125N+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：S125P+R180*+S181*、S125P+R180*+T182*、S125P+R180*+G183*、S125P+S181*+T182*、S125P+T182*+G183*、S125P+N194F+R180*+S181*、S125P+N194F+R180*+T182*、S125P+N194F+R180*+G183*、S125P+N194F+S181*+T182*、S125P+N194F+T182*+G183*、S125P+N194Y+R180*+S181*、S125P+N194Y+R180*+T182*、S125P+N194Y+R180*+G183*、S125P+N194Y+S181*+T182*、S125P+N194Y+T182*+G183*和S125P+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N128F+R180*+S181*、N128F+R180*+T182*、N128F+R180*+G183*、N128F+S181*+T182*、N128F+T182*+G183*、N128F+N194F+R180*+S181*、N128F+N194F+R180*+T182*、N128F+N194F+R180*+G183*、N128F+N194F+S181*+T182*、N128F+N194F+T182*+G183*、N128F+N194Y+R180*+S181*、N128F+N194Y+R180*+T182*、N128F+N194Y+R180*+G183*、N128F+N194Y+S181*+T182*、N128F+N194Y+T182*+G183*和N128F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N128H+R180*+S181*、N128H+R180*+T182*、N128H+R180*+G183*、N128H+S181*+T182*、N128H+T182*+G183*、N128H+N194F+R180*+S181*、N128H+N194F+R180*+T182*、N128H+N194F+R180*+G183*、N128H+N194F+S181*+T182*、N128H+N194F+T182*+G183*、N128H+N194Y+R180*+S181*、N128H+N194Y+R180*+T182*、N128H+N194Y+R180*+G183*、N128H+N194Y+S181*+T182*、N128H+N194Y+T182*+G183*和N128H+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N128I+R180*+S181*、N128I+R180*+T182*、N128I+R180*+G183*、N128I+S181*+T182*、N128I+T182*+G183*、N128I+N194F+R180*+S181*、N128I+N194F+R180*+T182*、N128I+N194F+R180*+G183*、N128I+N194F+S181*+T182*、N128I+N194F+T182*+G183*、N128I+N194Y+R180*+S181*、N128I+N194Y+R180*+T182*、N128I+N194Y+R180*+G183*、N128I+N194Y+S181*+T182*、N128I+N194Y+T182*+G183*和N128I+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N128K+R180*+S181*、N128K+R180*+T182*、N128K+R180*+G183*、N128K+S181*+T182*、N128K+T182*+G183*、N128K+N194F+R180*+S181*、N128K+N194F+R180*+T182*、N128K+N194F+R180*+G183*、N128K+N194F+S181*+T182*、N128K+N194F+T182*+G183*、N128K+N194Y+R180*+S181*、N128K+N194Y+R180*+T182*、N128K+N194Y+R180*+G183*、N128K+N194Y+S181*+T182*、N128K+N194Y+T182*+G183*和N128K+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N128R+R180*+S181*、N128R+R180*+T182*、N128R+R180*+G183*、N128R+S181*+T182*、N128R+T182*+G183*、N128R+N194F+R180*+S181*、N128R+N194F+R180*+T182*、N128R+N194F+R180*+G183*、N128R+N194F+S181*+T182*、N128R+N194F+T182*+G183*、N128R+N194Y+R180*+S181*、N128R+N194Y+R180*+T182*、N128R+N194Y+R180*+G183*、N128R+N194Y+S181*+T182*、N128R+N194Y+T182*+G183*和N128R+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：T131D+R180*+S181*、T131D+R180*+T182*、T131D+R180*+G183*、T131D+S181*+T182*、T131D+T182*+G183*、T131D+N194F+R180*+S181*、T131D+N194F+R180*+T182*、T131D+N194F+R180*+G183*、T131D+N194F+S181*+T182*、T131D+N194F+T182*+G183*、T131D+N194Y+R180*+S181*、T131D+N194Y+R180*+T182*、T131D+N194Y+R180*+G183*、T131D+N194Y+S181*+T182*、T131D+N194Y+T182*+G183*和T131D+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：T131E+R180*+S181*、T131E+R180*+T182*、T131E+R180*+G183*、T131E+S181*+T182*、T131E+T182*+G183*、T131E+N194F+R180*+S181*、T131E+N194F+R180*+T182*、T131E+N194F+R180*+G183*、T131E+N194F+S181*+T182*、T131E+N194F+T182*+G183*、T131E+N194Y+R180*+S181*、T131E+N194Y+R180*+T182*、T131E+N194Y+R180*+G183*、T131E+N194Y+S181*+T182*、T131E+N194Y+T182*+G183*和T131E+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：T131L+R180*+S181*、T131L+R180*+T182*、T131L+R180*+G183*、T131L+S181*+T182*、T131L+T182*+G183*、T131L+N194F+R180*+S181*、T131L+N194F+R180*+T182*、T131L+N194F+R180*+G183*、T131L+N194F+S181*+T182*、T131L+N194F+T182*+G183*、T131L+N194Y+R180*+S181*、T131L+N194Y+R180*+T182*、T131L+N194Y+R180*+G183*、T131L+N194Y+S181*+T182*、T131L+N194Y+T182*+G183*和T131L+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：G133D+R180*+S181*、G133D+R180*+T182*、G133D+R180*+G183*、G133D+S181*+T182*、G133D+T182*+G183*、G133D+N194F+R180*+S181*、G133D+N194F+R180*+T182*、G133D+N194F+R180*+G183*、G133D+N194F+S181*+T182*、G133D+N194F+T182*+G183*、G133D+N194Y+R180*+S181*、G133D+N194Y+R180*+T182*、G133D+N194Y+R180*+G183*、G133D+N194Y+S181*+T182*、G133D+N194Y+T182*+G183*和G133D+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：K172Q+R180*+S181*、K172Q+R180*+T182*、K172Q+R180*+G183*、K172Q+S181*+T182*、K172Q+T182*+G183*、K172Q+N194F+R180*+S181*、K172Q+N194F+R180*+T182*、K172Q+N194F+R180*+G183*、K172Q+N194F+S181*+T182*、K172Q+N194F+T182*+G183*、K172Q+N194Y+R180*+S181*、K172Q+N194Y+R180*+T182*、K172Q+N194Y+R180*+G183*、K172Q+N194Y+S181*+T182*、K172Q+N194Y+T182*+G183*和K172Q+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：L173F+R180*+S181*、L173F+R180*+T182*、L173F+R180*+G183*、L173F+S181*+T182*、L173F+T182*+G183*、L173F+N194F+R180*+S181*、L173F+N194F+R180*+T182*、L173F+N194F+R180*+G183*、L173F+N194F+S181*+T182*、L173F+N194F+T182*+G183*、L173F+N194Y+R180*+S181*、L173F+N194Y+R180*+T182*、L173F+N194Y+R180*+G183*、L173F+N194Y+S181*+T182*、L173F+N194Y+T182*+G183*和L173F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：L173Y+R180*+S181*、L173Y+R180*+T182*、L173Y+R180*+G183*、L173Y+S181*+T182*、L173Y+T182*+G183*、L173Y+N194F+R180*+S181*、L173Y+N194F+R180*+T182*、L173Y+N194F+R180*+G183*、L173Y+N194F+S181*+T182*、L173Y+N194F+T182*+G183*、L173Y+N194Y+R180*+S181*、L173Y+N194Y+R180*+T182*、L173Y+N194Y+R180*+G183*、L173Y+N194Y+S181*+T182*、L173Y+N194Y+T182*+G183*和L173Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N174NQ+R180*+S181*、N174NQ+R180*+T182*、N174NQ+R180*+G183*、N174NQ+S181*+T182*、N174NQ+T182*+G183*、N174NQ+N194F+R180*+S181*、N174NQ+N194F+R180*+T182*、N174NQ+N194F+R180*+G183*、N174NQ+N194F+S181*+T182*、N174NQ+N194F+T182*+G183*、N174NQ+N194Y+R180*+S181*、N174NQ+N194Y+R180*+T182*、N174NQ+N194Y+R180*+G183*、N174NQ+N194Y+S181*+T182*、N174NQ+N194Y+T182*+G183*和N174NQ+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N174NN+R180*+S181*、N174NN+R180*+T182*、N174NN+R180*+G183*、N174NN+S181*+T182*、N174NN+T182*+G183*、N174NN+N194F+R180*+S181*、N174NN+N194F+R180*+T182*、N174NN+N194F+R180*+G183*、N174NN+N194F+S181*+T182*、N174NN+N194F+T182*+G183*、N174NN+N194Y+R180*+S181*、N174NN+N194Y+R180*+T182*、N174NN+N194Y+R180*+G183*、N174NN+N194Y+S181*+T182*、N174NN+N194Y+T182*+G183*和N174NN+G475K+S243Q+R180*+S181*。
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在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：A185H+R180*+S181*、A185H+R180*+T182*、A185H+R180*+G183*、A185H+S181*+T182*、A185H+T182*+G183*、A185H+N194F+R180*+S181*、A185H+N194F+R180*+T182*、A185H+N194F+R180*+G183*、A185H+N194F+S181*+T182*、A185H+N194F+T182*+G183*、A185H+N194Y+R180*+S181*、A185H+N194Y+R180*+T182*、A185H+N194Y+R180*+G183*、A185H+N194Y+S181*+T182*、A185H+N194Y+T182*+G183*和A185H+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：A185L+R180*+S181*、A185L+R180*+T182*、A185L+R180*+G183*、A185L+S181*+T182*、A185L+T182*+G183*、A185L+N194F+R180*+S181*、A185L+N194F+R180*+T182*、A185L+N194F+R180*+G183*、A185L+N194F+S181*+T182*、A185L+N194F+T182*+G183*、A185L+N194Y+R180*+S181*、A185L+N194Y+R180*+T182*、A185L+N194Y+R180*+G183*、A185L+N194Y+S181*+T182*、A185L+N194Y+T182*+G183*和A185L+G475K+S243Q+R180*+S181*。
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在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：A185P+R180*+S181*、A185P+R180*+T182*、A185P+R180*+G183*、A185P+S181*+T182*、A185P+T182*+G183*、A185P+N194F+R180*+S181*、A185P+N194F+R180*+T182*、A185P+N194F+R180*+G183*、A185P+N194F+S181*+T182*、A185P+N194F+T182*+G183*、A185P+N194Y+R180*+S181*、A185P+N194Y+R180*+T182*、A185P+N194Y+R180*+G183*、A185P+N194Y+S181*+T182*、A185P+N194Y+T182*+G183*和A185P+G475K+S243Q+R180*+S181*。
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在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194F+R180*+S181*、N194F+R180*+T182*、N194F+R180*+G183*、N194F+S181*+T182*、N194F+T182*+G183*和N194F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194Y+R180*+S181*、N194Y+R180*+T182*、N194Y+R180*+G183*、N194Y+S181*+T182*、N194Y+T182*+G183*和N194Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194H+R180*+S181*、N194H+R180*+T182*、N194H+R180*+G183*、N194H+S181*+T182*、N194H+T182*+G183*和N194H+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194L+R180*+S181*、N194L+R180*+T182*、N194L+R180*+G183*、N194L+S181*+T182*、N194L+T182*+G183*和N194L+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194I+R180*+S181*、N194I+R180*+T182*、N194I+R180*+G183*、N194I+S181*+T182*、N194I+T182*+G183*和N194I+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：A203S+R180*+S181*、A203S+R180*+T182*、A203S+R180*+G183*、A203S+S181*+T182*、A203S+T182*+G183*、A203S+N194F+R180*+S181*、A203S+N194F+R180*+T182*、A203S+N194F+R180*+G183*、A203S+N194F+S181*+T182*、A203S+N194F+T182*+G183*、A203S+N194Y+R180*+S181*、A203S+N194Y+R180*+T182*、A203S+N194Y+R180*+G183*、A203S+N194Y+S181*+T182*、A203S+N194Y+T182*+G183*和A203S+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：A203T+R180*+S181*、A203T+R180*+T182*、A203T+R180*+G183*、A203T+S181*+T182*、A203T+T182*+G183*、A203T+N194F+R180*+S181*、A203T+N194F+R180*+T182*、A203T+N194F+R180*+G183*、A203T+N194F+S181*+T182*、A203T+N194F+T182*+G183*、A203T+N194Y+R180*+S181*、A203T+N194Y+R180*+T182*、A203T+N194Y+R180*+G183*、A203T+N194Y+S181*+T182*、A203T+N194Y+T182*+G183*和A203T+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：L205F+R180*+S181*、L205F+R180*+T182*、L205F+R180*+G183*、L205F+S181*+T182*、L205F+T182*+G183*、L205F+N194F+R180*+S181*、L205F+N194F+R180*+T182*、L205F+N194F+R180*+G183*、L205F+N194F+S181*+T182*、L205F+N194F+T182*+G183*、L205F+N194Y+R180*+S181*、L205F+N194Y+R180*+T182*、L205F+N194Y+R180*+G183*、L205F+N194Y+S181*+T182*、L205F+N194Y+T182*+G183*和L205F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：L205Y+R180*+S181*、L205Y+R180*+T182*、L205Y+R180*+G183*、L205Y+S181*+T182*、L205Y+T182*+G183*、L205Y+N194F+R180*+S181*、L205Y+N194F+R180*+T182*、L205Y+N194F+R180*+G183*、L205Y+N194F+S181*+T182*、L205Y+N194F+T182*+G183*、L205Y+N194Y+R180*+S181*、L205Y+N194Y+R180*+T182*、L205Y+N194Y+R180*+G183*、L205Y+N194Y+S181*+T182*、L205Y+N194Y+T182*+G183*和L205Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：L205I+R180*+S181*、L205I+R180*+T182*、L205I+R180*+G183*、L205I+S181*+T182*、L205I+T182*+G183*、L205I+N194F+R180*+S181*、L205I+N194F+R180*+T182*、L205I+N194F+R180*+G183*、L205I+N194F+S181*+T182*、L205I+N194F+T182*+G183*、L205I+N194Y+R180*+S181*、L205I+N194Y+R180*+T182*、L205I+N194Y+R180*+G183*、L205I+N194Y+S181*+T182*、L205I+N194Y+T182*+G183*和L205I+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：M208F+R180*+S181*、M208F+R180*+T182*、M208F+R180*+G183*、M208F+S181*+T182*、M208F+T182*+G183*、M208F+N194F+R180*+S181*、M208F+N194F+R180*+T182*、M208F+N194F+R180*+G183*、M208F+N194F+S181*+T182*、M208F+N194F+T182*+G183*、M208F+N194Y+R180*+S181*、M208F+N194Y+R180*+T182*、M208F+N194Y+R180*+G183*、M208F+N194Y+S181*+T182*、M208F+N194Y+T182*+G183*和M208F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：M208I+R180*+S181*、M208I+R180*+T182*、M208I+R180*+G183*、M208I+S181*+T182*、M208I+T182*+G183*、M208I+N194F+R180*+S181*、M208I+N194F+R180*+T182*、M208I+N194F+R180*+G183*、M208I+N194F+S181*+T182*、M208I+N194F+T182*+G183*、M208I+N194Y+R180*+S181*、M208I+N194Y+R180*+T182*、M208I+N194Y+R180*+G183*、M208I+N194Y+S181*+T182*、M208I+N194Y+T182*+G183*和M208I+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：M208L+R180*+S181*、M208L+R180*+T182*、M208L+R180*+G183*、M208L+S181*+T182*、M208L+T182*+G183*、M208L+N194F+R180*+S181*、M208L+N194F+R180*+T182*、M208L+N194F+R180*+G183*、M208L+N194F+S181*+T182*、M208L+N194F+T182*+G183*、M208L+N194Y+R180*+S181*、M208L+N194Y+R180*+T182*、M208L+N194Y+R180*+G183*、M208L+N194Y+S181*+T182*、M208L+N194Y+T182*+G183*和M208L+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：M208Y+R180*+S181*、M208Y+R180*+T182*、M208Y+R180*+G183*、M208Y+S181*+T182*、M208Y+T182*+G183*、M208Y+N194F+R180*+S181*、M208Y+N194F+R180*+T182*、M208Y+N194F+R180*+G183*、M208Y+N194F+S181*+T182*、M208Y+N194F+T182*+G183*、M208Y+N194Y+R180*+S181*、M208Y+N194Y+R180*+T182*、M208Y+N194Y+R180*+G183*、M208Y+N194Y+S181*+T182*、M208Y+N194Y+T182*+G183*和M208Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：H209D+R180*+S181*、H209D+R180*+T182*、H209D+R180*+G183*、H209D+S181*+T182*、H209D+T182*+G183*、H209D+N194F+R180*+S181*、H209D+N194F+R180*+T182*、H209D+N194F+R180*+G183*、H209D+N194F+S181*+T182*、H209D+N194F+T182*+G183*、H209D+N194Y+R180*+S181*、H209D+N194Y+R180*+T182*、H209D+N194Y+R180*+G183*、H209D+N194Y+S181*+T182*、H209D+N194Y+T182*+G183*和H209D+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：H209M+R180*+S181*、H209M+R180*+T182*、H209M+R180*+G183*、H209M+S181*+T182*、H209M+T182*+G183*、H209M+N194F+R180*+S181*、H209M+N194F+R180*+T182*、H209M+N194F+R180*+G183*、H209M+N194F+S181*+T182*、H209M+N194F+T182*+G183*、H209M+N194Y+R180*+S181*、H209M+N194Y+R180*+T182*、H209M+N194Y+R180*+G183*、H209M+N194Y+S181*+T182*、H209M+N194Y+T182*+G183*和H209M+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：H209T+R180*+S181*、H209T+R180*+T182*、H209T+R180*+G183*、H209T+S181*+T182*、H209T+T182*+G183*、H209T+N194F+R180*+S181*、H209T+N194F+R180*+T182*、H209T+N194F+R180*+G183*、H209T+N194F+S181*+T182*、H209T+N194F+T182*+G183*、H209T+N194Y+R180*+S181*、H209T+N194Y+R180*+T182*、H209T+N194Y+R180*+G183*、H209T+N194Y+S181*+T182*、H209T+N194Y+T182*+G183*和H209T+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：E211D+R180*+S181*、E211D+R180*+T182*、E211D+R180*+G183*、E211D+S181*+T182*、E211D+T182*+G183*、E211D+N194F+R180*+S181*、E211D+N194F+R180*+T182*、E211D+N194F+R180*+G183*、E211D+N194F+S181*+T182*、E211D+N194F+T182*+G183*、E211D+N194Y+R180*+S181*、E211D+N194Y+R180*+T182*、E211D+N194Y+R180*+G183*、E211D+N194Y+S181*+T182*、E211D+N194Y+T182*+G183*和E211D+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：E211L+R180*+S181*、E211L+R180*+T182*、E211L+R180*+G183*、E211L+S181*+T182*、E211L+T182*+G183*、E211L+N194F+R180*+S181*、E211L+N194F+R180*+T182*、E211L+N194F+R180*+G183*、E211L+N194F+S181*+T182*、E211L+N194F+T182*+G183*、E211L+N194Y+R180*+S181*、E211L+N194Y+R180*+T182*、E211L+N194Y+R180*+G183*、E211L+N194Y+S181*+T182*、E211L+N194Y+T182*+G183*和E211L+G475K+S243Q+R180*+S181*。
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在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：I390E+R180*+S181*、I390E+R180*+T182*、I390E+R180*+G183*、I390E+S181*+T182*、I390E+T182*+G183*、I390E+N194F+R180*+S181*、I390E+N194F+R180*+T182*、I390E+N194F+R180*+G183*、I390E+N194F+S181*+T182*、I390E+N194F+T182*+G183*、I390E+N194Y+R180*+S181*、I390E+N194Y+R180*+T182*、I390E+N194Y+R180*+G183*、I390E+N194Y+S181*+T182*、I390E+N194Y+T182*+G183*和I390E+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：M317L+R180*+S181*、M317L+R180*+T182*、M317L+R180*+G183*、M317L+S181*+T182*、M317L+T182*+G183*、M317L+N194F+R180*+S181*、M317L+N194F+R180*+T182*、M317L+N194F+R180*+G183*、M317L+N194F+S181*+T182*、M317L+N194F+T182*+G183*、M317L+N194Y+R180*+S181*、M317L+N194Y+R180*+T182*、M317L+N194Y+R180*+G183*、M317L+N194Y+S181*+T182*、M317L+N194Y+T182*+G183*和M317L+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V212N+R180*+S181*、V212N+R180*+T182*、V212N+R180*+G183*、V212N+S181*+T182*、V212N+T182*+G183*、V212N+N194F+R180*+S181*、V212N+N194F+R180*+T182*、V212N+N194F+R180*+G183*、V212N+N194F+S181*+T182*、V212N+N194F+T182*+G183*、V212N+N194Y+R180*+S181*、V212N+N194Y+R180*+T182*、V212N+N194Y+R180*+G183*、V212N+N194Y+S181*+T182*、V212N+N194Y+T182*+G183*和V212N+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V212I+R180*+S181*、V212I+R180*+T182*、V212I+R180*+G183*、V212I+S181*+T182*、V212I+T182*+G183*、V212I+N194F+R180*+S181*、V212I+N194F+R180*+T182*、V212I+N194F+R180*+G183*、V212I+N194F+S181*+T182*、V212I+N194F+T182*+G183*、V212I+N194Y+R180*+S181*、V212I+N194Y+R180*+T182*、V212I+N194Y+R180*+G183*、V212I+N194Y+S181*+T182*、V212I+N194Y+T182*+G183*和V212I+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N174NN+R180*+S181*、N174NN+R180*+T182*、N174NN+R180*+G183*、N174NN+S181*+T182*、N174NN+T182*+G183*、N174NN+N194F+R180*+S181*、N174NN+N194F+R180*+T182*、N174NN+N194F+R180*+G183*、N174NN+N194F+S181*+T182*、N174NN+N194F+T182*+G183*、N174NN+N194Y+R180*+S181*、N174NN+N194Y+R180*+T182*、N174NN+N194Y+R180*+G183*、N174NN+N194Y+S181*+T182*、N174NN+N194Y+T182*+G183*和N174NN+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V213S+R180*+S181*、V213S+R180*+T182*、V213S+R180*+G183*、V213S+S181*+T182*、V213S+T182*+G183*、V213S+N194F+R180*+S181*、V213S+N194F+R180*+T182*、V213S+N194F+R180*+G183*、V213S+N194F+S181*+T182*、V213S+N194F+T182*+G183*、V213S+N194Y+R180*+S181*、V213S+N194Y+R180*+T182*、V213S+N194Y+R180*+G183*、V213S+N194Y+S181*+T182*、V213S+N194Y+T182*+G183*和V213S+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N174NQ+R180*+S181*、N174NQ+R180*+T182*、N174NQ+R180*+G183*、N174NQ+S181*+T182*、N174NQ+T182*+G183*、N174NQ+N194F+R180*+S181*、N174NQ+N194F+R180*+T182*、N174NQ+N194F+R180*+G183*、N174NQ+N194F+S181*+T182*、N174NQ+N194F+T182*+G183*、N174NQ+N194Y+R180*+S181*、N174NQ+N194Y+R180*+T182*、N174NQ+N194Y+R180*+G183*、N174NQ+N194Y+S181*+T182*、N174NQ+N194Y+T182*+G183*和N174NQ+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V213Q+R180*+S181*、V213Q+R180*+T182*、V213Q+R180*+G183*、V213Q+S181*+T182*、V213Q+T182*+G183*、V213Q+N194F+R180*+S181*、V213Q+N194F+R180*+T182*、V213Q+N194F+R180*+G183*、V213Q+N194F+S181*+T182*、V213Q+N194F+T182*+G183*、V213Q+N194Y+R180*+S181*、V213Q+N194Y+R180*+T182*、V213Q+N194Y+R180*+G183*、V213Q+N194Y+S181*+T182*、V213Q+N194Y+T182*+G183*和V213Q+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：K241R+R180*+S181*、K241R+R180*+T182*、K241R+R180*+G183*、K241R+S181*+T182*、K241R+T182*+G183*、K241R+N194F+R180*+S181*、K241R+N194F+R180*+T182*、K241R+N194F+R180*+G183*、K241R+N194F+S181*+T182*、K241R+N194F+T182*+G183*、K241R+N194Y+R180*+S181*、K241R+N194Y+R180*+T182*、K241R+N194Y+R180*+G183*、K241R+N194Y+S181*+T182*、K241R+N194Y+T182*+G183*和K241R+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y242F+R180*+S181*、Y242F+R180*+T182*、Y242F+R180*+G183*、Y242F+S181*+T182*、Y242F+T182*+G183*、Y242F+N194F+R180*+S181*、Y242F+N194F+R180*+T182*、Y242F+N194F+R180*+G183*、Y242F+N194F+S181*+T182*、Y242F+N194F+T182*+G183*、Y242F+N194Y+R180*+S181*、Y242F+N194Y+R180*+T182*、Y242F+N194Y+R180*+G183*、Y242F+N194Y+S181*+T182*、Y242F+N194Y+T182*+G183*和Y242F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：F245I+R180*+S181*、F245I+R180*+T182*、F245I+R180*+G183*、F245I+S181*+T182*、F245I+T182*+G183*、F245I+N194F+R180*+S181*、F245I+N194F+R180*+T182*、F245I+N194F+R180*+G183*、F245I+N194F+S181*+T182*、F245I+N194F+T182*+G183*、F245I+N194Y+R180*+S181*、F245I+N194Y+R180*+T182*、F245I+N194Y+R180*+G183*、F245I+N194Y+S181*+T182*、F245I+N194Y+T182*+G183*和F245I+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：F245L+R180*+S181*、F245L+R180*+T182*、F245L+R180*+G183*、F245L+S181*+T182*、F245L+T182*+G183*、F245L+N194F+R180*+S181*、F245L+N194F+R180*+T182*、F245L+N194F+R180*+G183*、F245L+N194F+S181*+T182*、F245L+N194F+T182*+G183*、F245L+N194Y+R180*+S181*、F245L+N194Y+R180*+T182*、F245L+N194Y+R180*+G183*、F245L+N194Y+S181*+T182*、F245L+N194Y+T182*+G183*和F245L+G475K+S243Q+R180*+S181*。
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在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：G283S+R180*+S181*、G283S+R180*+T182*、G283S+R180*+G183*、G283S+S181*+T182*、G283S+T182*+G183*、G283S+N194F+R180*+S181*、G283S+N194F+R180*+T182*、G283S+N194F+R180*+G183*、G283S+N194F+S181*+T182*、G283S+N194F+T182*+G183*、G283S+N194Y+R180*+S181*、G283S+N194Y+R180*+T182*、G283S+N194Y+R180*+G183*、G283S+N194Y+S181*+T182*、G283S+N194Y+T182*+G183*和G283S+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：M285F+R180*+S181*、M285F+R180*+T182*、M285F+R180*+G183*、M285F+S181*+T182*、M285F+T182*+G183*、M285F+N194F+R180*+S181*、M285F+N194F+R180*+T182*、M285F+N194F+R180*+G183*、M285F+N194F+S181*+T182*、M285F+N194F+T182*+G183*、M285F+N194Y+R180*+S181*、M285F+N194Y+R180*+T182*、M285F+N194Y+R180*+G183*、M285F+N194Y+S181*+T182*、M285F+N194Y+T182*+G183*和M285F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：M285H+R180*+S181*、M285H+R180*+T182*、M285H+R180*+G183*、M285H+S181*+T182*、M285H+T182*+G183*、M285H+N194F+R180*+S181*、M285H+N194F+R180*+T182*、M285H+N194F+R180*+G183*、M285H+N194F+S181*+T182*、M285H+N194F+T182*+G183*、M285H+N194Y+R180*+S181*、M285H+N194Y+R180*+T182*、M285H+N194Y+R180*+G183*、M285H+N194Y+S181*+T182*、M285H+N194Y+T182*+G183*和M285H+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N294Y+R180*+S181*、N294Y+R180*+T182*、N294Y+R180*+G183*、N294Y+S181*+T182*、N294Y+T182*+G183*、N294Y+N194F+R180*+S181*、N294Y+N194F+R180*+T182*、N294Y+N194F+R180*+G183*、N294Y+N194F+S181*+T182*、N294Y+N194F+T182*+G183*、N294Y+N194Y+R180*+S181*、N294Y+N194Y+R180*+T182*、N294Y+N194Y+R180*+G183*、N294Y+N194Y+S181*+T182*、N294Y+N194Y+T182*+G183*和N294Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
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在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194Y+L205Y+R180*+S181*、N194Y+L205Y+R180*+T182*、N194Y+L205Y+R180*+G183*、N194Y+L205Y+S181*+T182*、N194Y+L205Y+T182*+G183*和N194Y+L205Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N194Y+L205F+R180*+S181*、N194Y+L205F+R180*+T182*、N194Y+L205F+R180*+G183*、N194Y+L205F+S181*+T182*、N194Y+L205F+T182*+G183*和N194Y+L205F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：R309Q+N174NQ+R180*+S181*、R309Q+N174NQ+R180*+T182*、R309Q+N174NQ+R180*+G183*、R309Q+N174NQ+S181*+T182*、R309Q+N174NQ+T182*+G183*、R309Q+N174NQ+N194F+R180*+S181*、R309Q+N174NQ+N194F+R180*+T182*、R309Q+N174NQ+N194F+R180*+G183*、R309Q+N174NQ+N194F+S181*+T182*、R309Q+N174NQ+N194F+T182*+G183*、R309Q+N174NQ+N194Y+R180*+S181*、R309Q+N174NQ+N194Y+R180*+T182*、R309Q+N174NQ+N194Y+R180*+G183*、R309Q+N174NQ+N194Y+S181*+T182*、R309Q+N174NQ+N194Y+T182*+G183*和R309Q+N174NQ+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+N174NQ+R180*+S181*、Y48W+N174NQ+R180*+T182*、Y48W+N174NQ+R180*+G183*、Y48W+N174NQ+S181*+T182*、Y48W+N174NQ+T182*+G183*、Y48W+N174NQ+N194F+R180*+S181*、Y48W+N174NQ+N194F+R180*+T182*、Y48W+N174NQ+N194F+R180*+G183*、Y48W+N174NQ+N194F+S181*+T182*、Y48W+N174NQ+N194F+T182*+G183*、Y48W+N174NQ+N194Y+R180*+S181*、Y48W+N174NQ+N194Y+R180*+T182*、Y48W+N174NQ+N194Y+R180*+G183*、Y48W+N174NQ+N194Y+S181*+T182*、Y48W+N174NQ+N194Y+T182*+G183*和Y48W+N174NQ+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V212N+N174NN+R180*+S181*、V212N+N174NN+R180*+T182*、V212N+N174NN+R180*+G183*、V212N+N174NN+S181*+T182*、V212N+N174NN+T182*+G183*、V212N+N174NN+N194F+R180*+S181*、V212N+N174NN+N194F+R180*+T182*、V212N+N174NN+N194F+R180*+G183*、V212N+N174NN+N194F+S181*+T182*、V212N+N174NN+N194F+T182*+G183*、V212N+N174NN+N194Y+R180*+S181*、V212N+N174NN+N194Y+R180*+T182*、V212N+N174NN+N194Y+R180*+G183*、V212N+N174NN+N194Y+S181*+T182*、V212N+N174NN+N194Y+T182*+G183*和V212N+N174NN+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V212N+V213Q+R180*+S181*、V212N+V213Q+R180*+T182*、V212N+V213Q+R180*+G183*、V212N+V213Q+S181*+T182*、V212N+V213Q+T182*+G183*、V212N+V213Q+N194F+R180*+S181*、V212N+V213Q+N194F+R180*+T182*、V212N+V213Q+N194F+R180*+G183*、V212N+V213Q+N194F+S181*+T182*、V212N+V213Q+N194F+T182*+G183*、V212N+V213Q+N194Y+R180*+S181*、V212N+V213Q+N194Y+R180*+T182*、V212N+V213Q+N194Y+R180*+G183*、V212N+V213Q+N194Y+S181*+T182*、V212N+V213Q+N194Y+T182*+G183*和V212N+V213Q+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：M317L+N174NQ+R180*+S181*、M317L+N174NQ+R180*+T182*、M317L+N174NQ+R180*+G183*、M317L+N174NQ+S181*+T182*、M317L+N174NQ+T182*+G183*、M317L+N174NQ+N194F+R180*+S181*、M317L+N174NQ+N194F+R180*+T182*、M317L+N174NQ+N194F+R180*+G183*、M317L+N174NQ+N194F+S181*+T182*、M317L+N174NQ+N194F+T182*+G183*、M317L+N174NQ+N194Y+R180*+S181*、M317L+N174NQ+N194Y+R180*+T182*、M317L+N174NQ+N194Y+R180*+G183*、M317L+N174NQ+N194Y+S181*+T182*、M317L+N174NQ+N194Y+T182*+G183*和M317L+N174NQ+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：D16Y+K375Q+R180*+S181*、D16Y+K375Q+R180*+T182*、D16Y+K375Q+R180*+G183*、D16Y+K375Q+S181*+T182*、D16Y+K375Q+T182*+G183*、D16Y+K375Q+N194F+R180*+S181*、D16Y+K375Q+N194F+R180*+T182*、D16Y+K375Q+N194F+R180*+G183*、D16Y+K375Q+N194F+S181*+T182*、D16Y+K375Q+N194F+T182*+G183*、D16Y+K375Q+N194Y+R180*+S181*、D16Y+K375Q+N194Y+R180*+T182*、D16Y+K375Q+N194Y+R180*+G183*、D16Y+K375Q+N194Y+S181*+T182*、D16Y+K375Q+N194Y+T182*+G183*和D16Y+K375Q+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：N19D+Q53R+R180*+S181*、N19D+Q53R+R180*+T182*、N19D+Q53R+R180*+G183*、N19D+Q53R+S181*+T182*、N19D+Q53R+T182*+G183*、N19D+Q53R+N194F+R180*+S181*、N19D+Q53R+N194F+R180*+T182*、N19D+Q53R+N194F+R180*+G183*、N19D+Q53R+N194F+S181*+T182*、N19D+Q53R+N194F+T182*+G183*、N19D+Q53R+N194Y+R180*+S181*、N19D+Q53R+N194Y+R180*+T182*、N19D+Q53R+N194Y+R180*+G183*、N19D+Q53R+N194Y+S181*+T182*、N19D+Q53R+N194Y+T182*+G183*和N19D+Q53R+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+V60A+R180*+S181*、Y48W+V60A+R180*+T182*、Y48W+V60A+R180*+G183*、Y48W+V60A+S181*+T182*、Y48W+V60A+T182*+G183*、Y48W+V60A+N194F+R180*+S181*、Y48W+V60A+N194F+R180*+T182*、Y48W+V60A+N194F+R180*+G183*、Y48W+V60A+N194F+S181*+T182*、Y48W+V60A+N194F+T182*+G183*、Y48W+V60A+N194Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+N194Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+N194Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+N194Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+N194Y+T182*+G183*和Y48W+V60A+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+F105M+R180*+S181*、Y48W+F105M+R180*+T182*、Y48W+F105M+R180*+G183*、Y48W+F105M+S181*+T182*、Y48W+F105M+T182*+G183*、Y48W+F105M+N194F+R180*+S181*、Y48W+F105M+N194F+R180*+T182*、Y48W+F105M+N194F+R180*+G183*、Y48W+F105M+N194F+S181*+T182*、Y48W+F105M+N194F+T182*+G183*、Y48W+F105M+N194Y+R180*+S181*、Y48W+F105M+N194Y+R180*+T182*、Y48W+F105M+N194Y+R180*+G183*、Y48W+F105M+N194Y+S181*+T182*、Y48W+F105M+N194Y+T182*+G183*和Y48W+F105M+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+L205Y+R180*+S181*、Y48W+L205Y+R180*+T182*、Y48W+L205Y+R180*+G183*、Y48W+L205Y+S181*+T182*、Y48W+L205Y+T182*+G183*、Y48W+L205Y+N194F+R180*+S181*、Y48W+L205Y+N194F+R180*+T182*、Y48W+L205Y+N194F+R180*+G183*、Y48W+L205Y+N194F+S181*+T182*、Y48W+L205Y+N194F+T182*+G183*、Y48W+L205Y+N194Y+R180*+S181*、Y48W+L205Y+N194Y+R180*+T182*、Y48W+L205Y+N194Y+R180*+G183*、Y48W+L205Y+N194Y+S181*+T182*、Y48W+L205Y+N194Y+T182*+G183*和Y48W+L205Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V60A+L205Y+R180*+S181*、V60A+L205Y+R180*+T182*、V60A+L205Y+R180*+G183*、V60A+L205Y+S181*+T182*、V60A+L205Y+T182*+G183*、V60A+L205Y+N194F+R180*+S181*、V60A+L205Y+N194F+R180*+T182*、V60A+L205Y+N194F+R180*+G183*、V60A+L205Y+N194F+S181*+T182*、V60A+L205Y+N194F+T182*+G183*、V60A+L205Y+N194Y+R180*+S181*、V60A+L205Y+N194Y+R180*+T182*、V60A+L205Y+N194Y+R180*+G183*、V60A+L205Y+N194Y+S181*+T182*、V60A+L205Y+N194Y+T182*+G183*和V60A+L205Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+V60A+F105M+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+T182*+G183*、Y48W+V60A+F105M+N194F+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+N194F+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+N194F+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+N194F+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+N194F+T182*+G183*、Y48W+V60A+F105M+N194Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+N194Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+N194Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+N194Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+N194Y+T182*+G183*和Y48W+V60A+F105M+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+V60A+L205F+R180*+S181*、Y48W+V60A+L205F+R180*+T182*、Y48W+V60A+L205F+R180*+G183*、Y48W+V60A+L205F+S181*+T182*、Y48W+V60A+L205F+T182*+G183*、Y48W+V60A+L205F+N194F+R180*+S181*、Y48W+V60A+L205F+N194F+R180*+T182*、Y48W+V60A+L205F+N194F+R180*+G183*、Y48W+V60A+L205F+N194F+S181*+T182*、Y48W+V60A+L205F+N194F+T182*+G183*、Y48W+V60A+L205F+N194Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+L205F+N194Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+L205F+N194Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+L205F+N194Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+L205F+N194Y+T182*+G183*和Y48W+V60A+L205F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V60A+F105M+L205F+R180*+S181*、V60A+F105M+L205F+R180*+T182*、V60A+F105M+L205F+R180*+G183*、V60A+F105M+L205F+S181*+T182*、V60A+F105M+L205F+T182*+G183*、V60A+F105M+L205F+N194F+R180*+S181*、V60A+F105M+L205F+N194F+R180*+T182*、V60A+F105M+L205F+N194F+R180*+G183*、V60A+F105M+L205F+N194F+S181*+T182*、V60A+F105M+L205F+N194F+T182*+G183*、V60A+F105M+L205F+N194Y+R180*+S181*、V60A+F105M+L205F+N194Y+R180*+T182*、V60A+F105M+L205F+N194Y+R180*+G183*、V60A+F105M+L205F+N194Y+S181*+T182*、V60A+F105M+L205F+N194Y+T182*+G183*和V60A+F105M+L205F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+V60A+F105M+L205F+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+L205F+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205F+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205F+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205F+T182*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194F+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194F+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194F+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194F+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194F+T182*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205F+N194Y+T182*+G183*和Y48W+V60A+F105M+L205F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+V60A+L205Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+L205Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+L205Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+L205Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+L205Y+T182*+G183*、Y48W+V60A+L205Y+N194F+R180*+S181*、Y48W+V60A+L205Y+N194F+R180*+T182*、Y48W+V60A+L205Y+N194F+R180*+G183*、Y48W+V60A+L205Y+N194F+S181*+T182*、Y48W+V60A+L205Y+N194F+T182*+G183*、Y48W+V60A+L205Y+N194Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+L205Y+N194Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+L205Y+N194Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+L205Y+N194Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+L205Y+N194Y+T182*+G183*和Y48W+V60A+L205Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：V60A+F105M+L205Y+R180*+S181*、V60A+F105M+L205Y+R180*+T182*、V60A+F105M+L205Y+R180*+G183*、V60A+F105M+L205Y+S181*+T182*、V60A+F105M+L205Y+T182*+G183*、V60A+F105M+L205Y+N194F+R180*+S181*、V60A+F105M+L205Y+N194F+R180*+T182*、V60A+F105M+L205Y+N194F+R180*+G183*、V60A+F105M+L205Y+N194F+S181*+T182*、V60A+F105M+L205Y+N194F+T182*+G183*、V60A+F105M+L205Y+N194Y+R180*+S181*、V60A+F105M+L205Y+N194Y+R180*+T182*、V60A+F105M+L205Y+N194Y+R180*+G183*、V60A+F105M+L205Y+N194Y+S181*+T182*、V60A+F105M+L205Y+N194Y+T182*+G183*和V60A+F105M+L205Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y48W+V60A+F105M+L205Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+T182*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194F+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194F+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194F+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194F+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194F+T182*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194Y+R180*+S181*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194Y+R180*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194Y+R180*+G183*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194Y+S181*+T182*、Y48W+V60A+F105M+L205Y+N194Y+T182*+G183*和Y48W+V60A+F105M+L205Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：P124D+S125P+R180*+S181*、P124D+S125P+R180*+T182*、P124D+S125P+R180*+G183*、P124D+S125P+S181*+T182*、P124D+S125P+T182*+G183*、P124D+S125P+N194F+R180*+S181*、P124D+S125P+N194F+R180*+T182*、P124D+S125P+N194F+R180*+G183*、P124D+S125P+N194F+S181*+T182*、P124D+S125P+N194F+T182*+G183*、P124D+S125P+N194Y+R180*+S181*、P124D+S125P+N194Y+R180*+T182*、P124D+S125P+N194Y+R180*+G183*、P124D+S125P+N194Y+S181*+T182*、P124D+S125P+N194Y+T182*+G183*和P124D+S125P+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：P124D+S125N+R180*+S181*、P124D+S125N+R180*+T182*、P124D+S125N+R180*+G183*、P124D+S125N+S181*+T182*、P124D+S125N+T182*+G183*、P124D+S125N+N194F+R180*+S181*、P124D+S125N+N194F+R180*+T182*、P124D+S125N+N194F+R180*+G183*、P124D+S125N+N194F+S181*+T182*、P124D+S125N+N194F+T182*+G183*、P124D+S125N+N194Y+R180*+S181*、P124D+S125N+N194Y+R180*+T182*、P124D+S125N+N194Y+R180*+G183*、P124D+S125N+N194Y+S181*+T182*、P124D+S125N+N194Y+T182*+G183*和P124D+S125N+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：S125N+N174NN+R180*+S181*、S125N+N174NN+R180*+T182*、S125N+N174NN+R180*+G183*、S125N+N174NN+S181*+T182*、S125N+N174NN+T182*+G183*、S125N+N174NN+N194F+R180*+S181*、S125N+N174NN+N194F+R180*+T182*、S125N+N174NN+N194F+R180*+G183*、S125N+N174NN+N194F+S181*+T182*、S125N+N174NN+N194F+T182*+G183*、S125N+N174NN+N194Y+R180*+S181*、S125N+N174NN+N194Y+R180*+T182*、S125N+N174NN+N194Y+R180*+G183*、S125N+N174NN+N194Y+S181*+T182*、S125N+N174NN+N194Y+T182*+G183*和S125N+N174NN+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：K172Q+N174NQ+R180*+S181*、K172Q+N174NQ+R180*+T182*、K172Q+N174NQ+R180*+G183*、K172Q+N174NQ+S181*+T182*、K172Q+N174NQ+T182*+G183*、K172Q+N174NQ+N194F+R180*+S181*、K172Q+N174NQ+N194F+R180*+T182*、K172Q+N174NQ+N194F+R180*+G183*、K172Q+N174NQ+N194F+S181*+T182*、K172Q+N174NQ+N194F+T182*+G183*、K172Q+N174NQ+N194Y+R180*+S181*、K172Q+N174NQ+N194Y+R180*+T182*、K172Q+N174NQ+N194Y+R180*+G183*、K172Q+N174NQ+N194Y+S181*+T182*、K172Q+N174NQ+N194Y+T182*+G183*和K172Q+N174NQ+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：K172Q+L173F+R180*+S181*、K172Q+L173F+R180*+T182*、K172Q+L173F+R180*+G183*、K172Q+L173F+S181*+T182*、K172Q+L173F+T182*+G183*、K172Q+L173F+N194F+R180*+S181*、K172Q+L173F+N194F+R180*+T182*、K172Q+L173F+N194F+R180*+G183*、K172Q+L173F+N194F+S181*+T182*、K172Q+L173F+N194F+T182*+G183*、K172Q+L173F+N194Y+R180*+S181*、K172Q+L173F+N194Y+R180*+T182*、K172Q+L173F+N194Y+R180*+G183*、K172Q+L173F+N194Y+S181*+T182*、K172Q+L173F+N194Y+T182*+G183*和K172Q+L173F+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：K172Q+L173F+N174NQ+R180*+S181*、K172Q+L173F+N174NQ+R180*+T182*、K172Q+L173F+N174NQ+R180*+G183*、K172Q+L173F+N174NQ+S181*+T182*、K172Q+L173F+N174NQ+T182*+G183*、K172Q+L173F+N174NQ+N194F+R180*+S181*、K172Q+L173F+N174NQ+N194F+R180*+T182*、K172Q+L173F+N174NQ+N194F+R180*+G183*、K172Q+L173F+N174NQ+N194F+S181*+T182*、K172Q+L173F+N174NQ+N194F+T182*+G183*、K172Q+L173F+N174NQ+N194Y+R180*+S181*、K172Q+L173F+N174NQ+N194Y+R180*+T182*、K172Q+L173F+N174NQ+N194Y+R180*+G183*、K172Q+L173F+N174NQ+N194Y+S181*+T182*、K172Q+L173F+N174NQ+N194Y+T182*+G183*和K172Q+L173F+N174NQ+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y242F+F266Y+R180*+S181*、Y242F+F266Y+R180*+T182*、Y242F+F266Y+R180*+G183*、Y242F+F266Y+S181*+T182*、Y242F+F266Y+T182*+G183*、Y242F+F266Y+N194F+R180*+S181*、Y242F+F266Y+N194F+R180*+T182*、Y242F+F266Y+N194F+R180*+G183*、Y242F+F266Y+N194F+S181*+T182*、Y242F+F266Y+N194F+T182*+G183*、Y242F+F266Y+N194Y+R180*+S181*、Y242F+F266Y+N194Y+R180*+T182*、Y242F+F266Y+N194Y+R180*+G183*、Y242F+F266Y+N194Y+S181*+T182*、Y242F+F266Y+N194Y+T182*+G183*和Y242F+F266Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：Y269N+N294Y+R180*+S181*、Y269N+N294Y+R180*+T182*、Y269N+N294Y+R180*+G183*、Y269N+N294Y+S181*+T182*、Y269N+N294Y+T182*+G183*、Y269N+N294Y+N194F+R180*+S181*、Y269N+N294Y+N194F+R180*+T182*、Y269N+N294Y+N194F+R180*+G183*、Y269N+N294Y+N194F+S181*+T182*、Y269N+N294Y+N194F+T182*+G183*、Y269N+N294Y+N194Y+R180*+S181*、Y269N+N294Y+N194Y+R180*+T182*、Y269N+N294Y+N194Y+R180*+G183*、Y269N+N294Y+N194Y+S181*+T182*、Y269N+N294Y+N194Y+T182*+G183*和Y269N+N294Y+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的多种改变，这些改变选自以下清单，该清单由以下各项组成：G283S+L323H+R180*+S181*、G283S+L323H+R180*+T182*、G283S+L323H+R180*+G183*、G283S+L323H+S181*+T182*、G283S+L323H+T182*+G183*、G283S+L323H+N194F+R180*+S181*、G283S+L323H+N194F+R180*+T182*、G283S+L323H+N194F+R180*+G183*、G283S+L323H+N194F+S181*+T182*、G283S+L323H+N194F+T182*+G183*、G283S+L323H+N194Y+R180*+S181*、G283S+L323H+N194Y+R180*+T182*、G283S+L323H+N194Y+R180*+G183*、G283S+L323H+N194Y+S181*+T182*、G283S+L323H+N194Y+T182*+G183*和G283S+L323H+G475K+S243Q+R180*+S181*。
在其他实施例中，该变体包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的如下改变或由其组成(由分号分开单独的实施例)：D16Y+R180*+S181*；D16Y+R180*+T182*；D16Y+R180*+G183*；D16Y+S181*+T182*；D16Y+T182*+G183*；D16Y+N194F+R180*+S181*；D16Y+N194F+R180*+T182*；D16Y+N194F+R180*+G183*；D16Y+N194F+S181*+T182*；D16Y+N194F+T182*+G183*；D16Y+N194Y+R180*+S181*；D16Y+N194Y+R180*+T182*；D16Y+N194Y+R180*+G183*；D16Y+N194Y+S181*+T182*；D16Y+N194Y+T182*+G183*；D16Y+G475K+S243Q+R180*+S181*；
N19D+R180*+S181*；N19D+R180*+T182*；N19D+R180*+G183*；N19D+S181*+T182*；N19D+T182*+G183*；N19D+N194F+R180*+S181*；N19D+N194F+R180*+T182*；N19D+N194F+R180*+G183*；N19D+N194F+S181*+T182*；N19D+N194F+T182*+G183*；N19D+N194Y+R180*+S181*；N19D+N194Y+R180*+T182*；N19D+N194Y+R180*+G183*；N19D+N194Y+S181*+T182*；N19D+N194Y+T182*+G183*；N19D+G475K+S243Q+R180*+S181*；
Y48W+R180*+S181*；Y48W+R180*+T182*；Y48W+R180*+G183*；Y48W+S181*+T182*；Y48W+T182*+G183*；Y48W+N194F+R180*+S181*；Y48W+N194F+R180*+T182*；Y48W+N194F+R180*+G183*；Y48W+N194F+S181*+T182*；Y48W+N194F+T182*+G183*；Y48W+N194Y+R180*+S181*；Y48W+N194Y+R180*+T182*；Y48W+N194Y+R180*+G183*；Y48W+N194Y+S181*+T182*；Y48W+N194Y+T182*+G183*；Y48W+G475K+S243Q+R180*+S181*；
Y48F+R180*+S181*；Y48F+R180*+T182*；Y48F+R180*+G183*；Y48F+S181*+T182*；Y48F+T182*+G183*；Y48F+N194F+R180*+S181*；Y48F+N194F+R180*+T182*；Y48F+N194F+R180*+G183*；Y48F+N194F+S181*+T182*；Y48F+N194F+T182*+G183*；Y48F+N194Y+R180*+S181*；Y48F+N194Y+R180*+T182*；Y48F+N194Y+R180*+G183*；Y48F+N194Y+S181*+T182*；Y48F+N194Y+T182*+G183*；Y48F+G475K+S243Q+R180*+S181*；
Q53R+R180*+S181*；Q53R+R180*+T182*；Q53R+R180*+G183*；Q53R+S181*+T182*；Q53R+T182*+G183*；Q53R+N194F+R180*+S181*；Q53R+N194F+R180*+T182*；Q53R+N194F+R180*+G183*；Q53R+N194F+S181*+T182*；Q53R+N194F+T182*+G183*；Q53R+N194Y+R180*+S181*；Q53R+N194Y+R180*+T182*；Q53R+N194Y+R180*+G183*；Q53R+N194Y+S181*+T182*；Q53R+N194Y+T182*+G183*；Q53R+G475K+S243Q+R180*+S181*；
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在其他实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的如下改变或由其组成(由分号分开单独的实施例)：D16Y+R180*+S181*；D16Y+R180*+T182*；D16Y+R180*+G183*；D16Y+S181*+T182*；D16Y+T182*+G183*；D16Y+N194F+R180*+S181*；D16Y+N194F+R180*+T182*；D16Y+N194F+R180*+G183*；D16Y+N194F+S181*+T182*；D16Y+N194F+T182*+G183*；D16Y+N194Y+R180*+S181*；D16Y+N194Y+R180*+T182*；D16Y+N194Y+R180*+G183*；D16Y+N194Y+S181*+T182*；D16Y+N194Y+T182*+G183*；D16Y+G475K+S243Q+R180*+S181*；N19D+R180*+S181*；N19D+R180*+T182*；N19D+R180*+G183*；N19D+S181*+T182*；N19D+T182*+G183*；N19D+N194F+R180*+S181*；N19D+N194F+R180*+T182*；N19D+N194F+R180*+G183*；N19D+N194F+S181*+T182*；N19D+N194F+T182*+G183*；N19D+N194Y+R180*+S181*；N19D+N194Y+R180*+T182*；N19D+N194Y+R180*+G183*；N19D+N194Y+S181*+T182*；N19D+N194Y+T182*+G183*；N19D+G475K+S243Q+R180*+S181*；
Y48W+R180*+S181*；Y48W+R180*+T182*；Y48W+R180*+G183*；Y48W+S181*+T182*；Y48W+T182*+G183*；Y48W+N194F+R180*+S181*；Y48W+N194F+R180*+T182*；Y48W+N194F+R180*+G183*；Y48W+N194F+S181*+T182*；Y48W+N194F+T182*+G183*；Y48W+N194Y+R180*+S181*；Y48W+N194Y+R180*+T182*；Y48W+N194Y+R180*+G183*；Y48W+N194Y+S181*+T182*；Y48W+N194Y+T182*+G183*；Y48W+G475K+S243Q+R180*+S181*；
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在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少91％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少92％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少93％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少94％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。
在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少91％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少92％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少93％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少94％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少96％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少97％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少98％序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％序列一致性。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-端的或羧基端的延伸，例如氨基端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH、改进洗涤性能等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如，德弗斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的催化效率。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的催化速率。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的化学稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的氧化稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的洗涤剂稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的pH活性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的pH稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的比活性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的存储条件下稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有降低的底物结合。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的底物特异性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的底物稳定性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的表面特性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的热活性。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的热稳定性。
在另一个实施例中，与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比，该变体具有改进的洗涤性能，特别是低温下的改进的洗涤性能。
亲本α-淀粉酶
该亲本α-淀粉酶可以是(a)一种与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；(b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性或(c)一种与针对SEQ ID NO:1的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。
在另一方面，该亲本α-淀粉酶可以是(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；(b)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性或(c)一种与针对SEQ ID NO:2的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。
在一方面，该亲本与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在一方面，该亲本与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一方面，该亲本与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成。
在又另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的等位基因变体。
亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属α-淀粉酶。
在一方面，该亲本是一种芽孢杆菌属物种TS-23α-淀粉酶，例如SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶。
还可以通过本领域已知的方法人工制造SEQ ID NO 1和2的α-淀粉酶连同其变体。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，该方法包括向与SEQ IDNO:1或2具有至少80％序列一致性的亲本α-淀粉酶引入以下各项：a)在对应于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的位置R180、S181、T182和G183的两个或更多个位置处的缺失以及b)在对应于SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的位置Y48、E169、S170、R171、K172、L173、N174、L205、R309、M317、I390、D16、N19、Q53、V60、F105、F116、P124、S125、N128、T131、G133、K178、A185、E189、N194、A203、M208、H209、E211、V212、V213、K241、Y242、F245、F266、Y269、K280、G283、M285、N294、L323、K375、I404和Q407的一个或多个位置处的改变，其中每个改变独立地是取代或插入，其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖α-淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖α-淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKAα-淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代)；及其突变型启动子、截短型启动子以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKAα-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列5’-端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖α-淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子以及米曲霉葡糖α-淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
可以如WO 2010/115021中所描述的表达本发明的α-淀粉酶变体。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
该宿主细胞可以是一种包括本发明的多核苷酸的植物细胞，以便以可回收的量表达和产生该变体。此类转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。表达构建体宜为包括编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。而且，表达构建体可包括用于鉴定整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。
组合物
本发明还涉及包含本发明的一种变体的组合物。优选地，这些组合物富含这种变体。术语“富含”意指该组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，富集因子为1.1。
该组合物可以包括一种变体作为主要酶组分，例如一种单组分组合物。可替代地，该组合物可以包括多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。例如可以通过属于以下属的微生物来产生另外的一种或多种酶：曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉菌、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，例如杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，例如特异腐质霉或柔毛腐质霉；或者木霉属，例如哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，本发明针对以下洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包括与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明的α-淀粉酶变体。
另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。组分的选择可以包括(用于织物保养)有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
本发明的酶
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液体0.001-100mg的蛋白，例如0.01-100mg的蛋白，优选是0.01-50mg的蛋白，更优选是0.01-25mg的蛋白，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白，最优选是0.05-5mg的蛋白，并且甚至最优选是0.05-1mg的蛋白。
可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。
本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约0％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种基于类异戊二烯的表面活性剂，如在国际专利申请WO 2013043857(A1)、WO 2013043855(A2)、WO 2013043852(A2)、WO 2013043805(A1)或WO 2013043803(A2)中所描述的那些。
助水溶剂
助水溶剂是一种化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)的综述，(2007)，胶体&界面科学新见(Current Opinion inColloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。
洗涤剂可以包含按重量计0％-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约10％至约40％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-50％，例如约10％至约40％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0-20％，如大约0％至大约10％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物+餐具洗涤+I&I洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(邻苯二甲酰亚胺基)过氧己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
Figure BDA0000865189410001401
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。
另外的酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是具有一种序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶,该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性,或一种家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有一种序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、CellucleanClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
甘露聚糖酶
适合的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或特异腐质霉。适合的甘露聚糖酶描述于WO 1999/064619中。一种可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的完整的纤维素酶或单-组分的内切葡聚糖酶。包括化学或基因修饰的突变体。该纤维素酶可以，例如，是通常就称为内切葡聚糖酶的单-组分的内切-1,4-β-葡聚糖酶的单-组分或混合物。适合的纤维素酶包括一种真菌纤维素酶，该真菌纤维素酶来自特异腐质霉(US 4,435,307)或来自木霉属，例如里氏木霉或绿色木霉。纤维素酶的实例在EP 0 495 257进行了描述。其他适合的纤维素酶来自梭孢壳菌属，例如如在WO 96/29397中描述的土生梭孢壳霉或如在WO 91/17244中描述的尖镰孢，或者来自如在WO 02/099091和JP 20002 10081中所描述的芽孢杆菌属。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307中的那些纤维素酶变体，可商购的纤维素酶包括
Figure BDA0000865189410001431
和
Figure BDA0000865189410001432
(诺维信公司(Novozymes A/S))、
Figure BDA0000865189410001433
Puradax HA、和Puradax EG(可从杰能科公司(Genencor)获得)。
过氧化物酶/氧化酶
适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚类。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及衍生自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如衍生自解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：
Figure BDA0000865189410001441
DuralaseTm、DurazymTm、
Figure BDA0000865189410001442
Ultra、
Figure BDA0000865189410001443
Ultra、
Figure BDA0000865189410001444
Ultra、
Figure BDA0000865189410001445
Ultra、
Figure BDA0000865189410001446
以及
Figure BDA0000865189410001451
(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：
Figure BDA0000865189410001452
Figure BDA0000865189410001453
Purafect
Figure BDA0000865189410001454
PreferenzTm、Purafect
Figure BDA0000865189410001455
Purafect
Figure BDA0000865189410001456
Purafect
Figure BDA0000865189410001457
EffectenzTm、
Figure BDA0000865189410001458
以及
Figure BDA0000865189410001459
(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶：
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶：
可以与本发明的酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 13184577中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选变体是以下位置：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K和G477K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
E187P+I203Y+G476K
E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K
其中这些变体任选地进一步在位置241处包括取代和/或在位置178和/或位置179处包括缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 10104675中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQ ID NO:1的更优选变体是以下位置：N21D、D97N、V128I K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N21D+D97N+V128I
其中这些变体任选地进一步在位置200处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、特妙淀粉酶TM、FungamylTM、StainzymeTM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100及Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独添加剂或组合添加剂，可以被配制为，例如颗粒、液体、浆体等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆体。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚乙二醇(PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；具有15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇含有12至20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨基芪-磺酸衍生物类型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的ParawhiteKX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。
适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污物释放聚合物可以例如是非离子或阴离子对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污物释放聚合物是包括一个核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，随机接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制品
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为具有袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及,羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSolLLC公司销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970 A1)。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
这些形式的定义/特征：
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0％-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂也可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的α-淀粉酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的肥皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将一固体物体(例如洗衣皂条)放置于一个容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。条典型地是处于条形的固体但是可以处于其他固体形状，例如圆形或卵形。
洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、α-淀粉酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的α-淀粉酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
颗粒洗涤剂配制品
如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO 09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO09/021813、WO 09/030632以及WO 09/015951。
WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO 2011005830、WO2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO 2011005813、WO 2010135238、WO2010120863、WO 2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、WO2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO 2010024467、WO2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO 2010014395、WO 2010044905、
WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO 2010069718、WO2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO 2010018043、WO 2010003783、WO2010003792、
WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO 2010084203、WO2010078979、WO 2010072456、WO 2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO2010066486、WO 2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO2010049187、WO 2010031607、WO 2010000636。
用途
本发明还涉及用于使用α-淀粉酶变体的方法。
本发明的α-淀粉酶变体可用于洗涤剂组合物、衣物洗涤、餐具洗涤和/或低温清洁过程以及硬表面清洁(ADW、洗车、工业表面)。
在洗涤剂中的用途。可以将本发明的多肽添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
洗涤剂组合物可以进一步配制为单位剂量形式或为肥皂条或洗衣条，
在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。在另一方面，本发明提供了一种适合在35℃或低于35℃的温度进行清洁的洗涤剂。
方法
淀粉酶表达：可以如WO 2010115021中所披露的表达本发明的α-淀粉酶变体。
菌株：例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，这些菌株在质粒上的或整合在芽孢杆菌属染色体上(例如在Pel或Amy基因座中)的表达盒中携带淀粉酶。
培养基：例如，LB、TY、培养基-16
培养基16
·甘油-5％w/v
·胰蛋白胨-0.5％w/v
·牛肉膏-0.5％w/v
·硝酸钠-1％w/v
·Na2HPO4-1.7％w/v
·KH2PO4-0.4％w/v
·NH4Cl-0.1％w/v
·NaCl-0.05％w/v
·调节pH至7并且高压杀菌。
就在接种前分开高压杀菌并且添加
·1.47％CaCl2-0.4ml用于100ml培养基
·2.465％MgSO4.7H2O-0.4ml用于100ml培养基
·1.39％FeSO4-0.04ml用于100ml培养基
·0.2％Na2MoO4.2H2O-0.04ml用于100ml培养基
·维生素混合液(包含0.25％硫胺素和0.25％抗坏血酸)-0.4ml的维生素混合液用于100ml培养基
·微量元素(包含0.5％MnCl2.4H2O、0.2％ZnCl2和0.1％CuSO4.5H2O)-0.04ml的微量元素溶液用于100ml培养基
TS23变体的构建
编码成熟但是CBM截短的淀粉酶的合成DNA购自外部供应商(基因艺术公司(GeneArt)，德国)，并且通过由N和C末端引物(CA509：GCCTCATTCTGCAGCCGCGGCAGCTAATACTGCACCTATTAACG和CA508：GAGCGGATTGAACATGCGACTATTTAGCCACCCAAATCGAAACGGAGCC)以及引入双缺失R180*+S181*的一对诱变引物(CA512：CCGTTTTCTGTATCGACTTCCCAGTCCCATGC和CA511：GCATGGGACTGGGAAGTCGATACAGAAAACGG)扩增淀粉酶基因而产生变体基因(SEQ.IDNO:9)。这两个片段装配有包括上Pel基因座的上游片段和包括下Pel基因座的下游片段，这样使得该淀粉酶在枯草芽孢杆菌中转化时将通过双交叉替换整合到Pel基因座中。
上片段进一步包含：三联启动子系统(如WO 99/43835中所述)，该三联启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子(包括控制淀粉酶表达的稳定化序列)的启动子组成；以及用以指导到细胞外的输出的地衣芽孢杆菌淀粉酶信号的信号序列。下游片段进一步包括用于在包含氯霉素的培养基上进行选择的cat基因。
通过大引物诱变方法，使用编码所希望的氨基酸变化的诱变寡核苷酸，并且克隆到关于上述参照淀粉酶的表达盒中，来引入突变。通过淀粉酶基因的DNA测序确认该序列。
淀粉酶的生产和纯化
在培养基-16中，在37℃下，将淀粉酶表达克隆在180rpm下发酵72小时，并且将该发酵液在13131g下离心25分钟，以去除细胞块，并且然后使用0.7微米的玻璃滤器GF-F(沃特曼(Whatman))使用tarsons过滤组件进行过滤。
通过如下24孔板蛋白质纯化方法从上清液中纯化出参照淀粉酶和变体淀粉酶：将3ml的在milli Q水中的丁基toyopearl树脂的50％浆体添加到24孔滤板的每个孔中，并且使该板经受真空以装填该塔板。通过添加8mL的平衡缓冲液(50mM HEPES，pH 8.0+1M硫酸铵+1mM CaCl2)平衡该树脂，并且将8ml的淀粉酶样品添加至滤板的孔中并在板混合器上在350rpm下孵育8min。通过真空去除未结合部分，并且将树脂通过4个循环的以下行为来洗涤：添加8mL的平衡缓冲液(50mM HEPES，pH 8.0+1M硫酸铵+1mM CaCl2)，随后混合并孵育，并且最后通过真空去除洗涤缓冲液。
通过添加洗脱缓冲液(50mM HEPES，pH 8.0+1mM CaCl2)将该淀粉酶洗脱，进行混合并且孵育，之后通过真空将淀粉酶溶液收集在收集盘中。
测量淀粉分解活性(α-淀粉酶活性)的测定
EnzChek测定
可以通过如下EnzCheck测定确定淀粉酶活性或残余淀粉酶活性。该底物是一种玉米淀粉衍生物，DQTM淀粉(玉米淀粉BODIPY FL轭合物)，它是用
Figure BDA0000865189410001551
FL(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸)染料标记以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。含有大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100μL的50mM乙酸钠(pH 4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下、黑暗中保持，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加950μL 10mM乙酸钠、0.01％(w/V)
Figure BDA0000865189410001561
X100((聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10))，pH 5.0，充分涡旋并且在室温下、黑暗中储存直到准备使用为止。从1mL的此溶液中，通过与5mL 50mM HEPES、0.01％(w/V)Triton X100、1mM CaCl2，pH 7.0混合来制备该底物工作溶液。
将含酶洗涤剂在50mM HEPES、0.01％Triton X100、1mM CaCl2，pH 7.0中稀释至15ng酶蛋白/ml(6826.7倍稀释)的浓度。
为了测定，在一个黑色384孔微量滴定板中，将25μL底物工作溶液与25μL稀释酶混合10秒。在每个孔中在25℃每两分钟测量一次荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)持续30分钟，并且将Vmax计算作为荧光强度相对于时间的曲线的斜率。曲线应是线性的，并且已经调整了残余活性测定以使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。
在一些实例中，对于测定存在来自不具有淀粉酶的洗涤剂的显著干扰。在此类情况下，可以使用可替代的淀粉酶测定。可以通过向处于两种水平的洗涤剂添加已知量的淀粉酶，并且然后测量两种样品的活性，来测试洗涤剂对淀粉酶测定的干扰。如果在所测量活性中的差异对应于在所添加淀粉酶之间的水平中的差异，那么可以使用该测定来确定储存后淀粉酶的残余活性。
PNP-G7测定
可以通过使用了PNP-G7底物的方法来确定α-淀粉酶活性。PNP-G7是4,6-亚乙基(G7)-对-硝基苯基(G1)-α,D-麦芽七糖苷的缩写，它是可由内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的一种嵌段低聚糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放游离PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-PNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-PNP和52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0)。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、>4kU/Lα-葡糖苷酶。
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-PNP底物混合，产生底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM EPPS、0.01％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))、1mM CaCl2，pH 7.0。
程序：
将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来执行测定。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm在5分钟范围内每20秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。
百分点(pp)的确定
相对于亲本，变体的残余活性(稳定性)的改进百分点(pp)被计算为变体的残余活性和亲本的残余活性之间的差异，即，变体的残余活性减去亲本的残余活性。
Amylazyme活性测定：
α-淀粉酶活性还可通过使用了Amylazyme底物(来自麦格酶公司(Megazyme)，爱尔兰(Ireland))的方法来确定。Amylazyme片剂包括互联直链淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联直链淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了直链淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在650nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。
淀粉酶样品应稀释成使得650nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
Phadebas活性测定：
α-淀粉酶活性还可通过使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学(MagleLife Sciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了直链淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在650nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。
淀粉酶样品应稀释成使得650nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
还原糖活性测定
α-淀粉酶活性还可通过使用例如玉米淀粉底物的还原糖测定来确定。通过与p-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)反应来确定用α-淀粉酶水解淀粉中的α-1,4-糖苷键所形成的多个还原端。与PHBAH反应之后，可通过405nm下的吸光度来测量还原端的数量并且还原端的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
使玉米淀粉底物(3mg/mL)在milliQ水中蒸煮5分钟来溶解并且在测定之前冷却。关于终止液，制备一种Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液(K-Na-酒石酸盐(默克(Merck)8087)50g/l，NaOH 20g/l)并且通过将p-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH，西格玛(Sigma)H9882)添加至Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液至15mg/mL来新鲜制备终止液。
在PCR-MTP中，将50μl活性缓冲液与50μl底物混合。添加50μl稀释酶并且混合。在PCR机器中在所需温度孵育5分钟。通过添加75μl终止液(Ka-Na-酒石酸盐/NaOH/PHBAH)来停止反应。在PCR机器中在95℃孵育10分钟。将150μl转移至新MTP并且测量405nm下的吸光度。
淀粉酶样品应稀释成使得405nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能
为了评定α-淀粉酶在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA测试，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织品小块布样对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
洗涤性能总体描述
制备一种测试溶液，该测试溶液包含水(6°dH)、0.79g/l洗涤剂(例如，如下文描述的标准洗涤剂J)和处于浓度0或0.2mg酶蛋白/L的本发明的酶。添加带有淀粉污渍的织物(来自测试材料中心BV的CS-28，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)并且将它们在15℃和30℃洗涤20分钟，或可替代地在15℃和40℃洗涤20分钟，如在实例中详细说明的那样。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。AMSA洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下实施：
表A：实验条件
洗涤剂 液体标准洗涤剂J(参见表B)
洗涤剂剂量 0.79g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃或30℃
水硬度 6°dH
测试中的酶浓度 0.2mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉)
表B：标准洗涤剂J
化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w)
LAS 5.15 5.00
AS 5.00 4.50
AEOS 14.18 10.00
可可脂肪酸 1.00 1.00
AEO 5.00 5.00
MEA 0.30 0.30
MPG 3.00 3.00
乙醇 1.50 1.35
DTPA(作为Na5盐) 0.25 0.10
柠檬酸钠 4.00 4.00
甲酸钠 1.00 1.00
氢氧化钠 0.66 0.66
H<sub>2</sub>O，离子交换 58.95 58.95
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝2:1:4.5)添加到测试系统中将水硬度调节至6°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表C：实验条件
洗涤剂 液体标准洗涤剂A(参见表D)
洗涤剂剂量 3.33g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃或40℃
水硬度 15°dH
测试中的酶浓度 0.2mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉)
表D：标准洗涤剂A
化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w)
LAS 12.00 11.60
AEOS，SLES 17.63 4.90
大豆脂肪酸 2.75 2.48
可可脂肪酸 2.75 2.80
AEO 11.00 11.00
氢氧化钠 1.75 1.80
乙醇/丙-2-醇 3.00 2.70/0.30
MPG 6.00 6.00
甘油 1.71 1.70
TEA 3.33 3.30
甲酸钠 1.00 1.00
柠檬酸钠 2.00 2.00
DTMPA 0.48 0.20
PCA 0.46 0.18
苯氧基乙醇 0.50 0.50
H<sub>2</sub>O，离子交换 33.64 33.64
通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝4:1:7.5)添加到测试系统中，将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表E：实验条件
洗涤剂 粉末状标准洗涤剂X(参见表F)
洗涤剂剂量 1.75g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃或30℃
水硬度 12°dH
测试中的酶浓度 0.2mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉)
表F：标准洗涤剂X
化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w)
LAS 16.50 15.00
AEO* 2.00 2.00
碳酸钠 20.00 20.00
硅酸二钠 12.00 9.90
沸石A 15.00 12.00
硫酸钠 33.50 33.50
PCA 1.00 1.00
*将标准洗涤剂X混合，不含AEO。在洗涤之前，将AEO单独地添加。
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
标准洗涤剂1和2
Figure BDA0000865189410001611
Figure BDA0000865189410001621
洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达(Kodak))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
Figure BDA0000865189410001622
纺织品：
纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自测试材料BV中心，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰。
用于自动餐具洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
进行洗涤实验，以便评估所选α-淀粉酶变体在餐具洗涤洗涤剂组合物中的洗涤性能。可以使用自动机械应力测定(AMSA)测试本申请的α-淀粉酶变体。使用AMSA，可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，盖子将待洗涤的三聚氰胺瓦片对槽开口强力挤压。在洗涤期间，板、测试溶液、三聚氰胺瓦片和盖子剧烈振动从而使测试溶液与玷污的三聚氰胺瓦片接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
可以在根据以下一个或多个表指定的实验条件下进行实验：
Figure BDA0000865189410001623
Figure BDA0000865189410001631
Figure BDA0000865189410001632
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+＝4:1:10)添加到测试系统中将水硬度调节至17°dH。在洗涤之后，将三聚氰胺瓦片用自来水沖洗并干燥。
将酶变体的性能作为用该特定α-淀粉酶洗涤的三聚氰胺瓦片的颜色的亮度来测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量蛋白酶的洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))，Midtager29，DK-2605
Figure BDA0000865189410001633
丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤三聚氰胺瓦片的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，使用专门设计的软件应用程序(诺维信颜色矢量分析仪(Novozymes Colour Vector Analyzer))。该程序从图像中检索24位像素值并将其转化成红、绿和蓝色的值(RGB)。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
Figure BDA0000865189410001641
纺织品：
带有淀粉的标准三聚氰胺瓦片(例如DM-77和DM-78)可以获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
AMSA洗涤性能
通过如方法部分中所述的AMSA测试方法测试变体和对应的亲本α-淀粉酶的洗涤性能。将结果给出为(变体的性能-空白的性能)除以(亲本的性能-空白的性能)乘以100，其中空白是通过在相同的条件下、但是不存在α-淀粉酶时洗涤所获得的性能。
Terg-O-tometer(TOM)洗涤测定
Tergo-To-Meter(TOM)是一种中等规模标准洗涤系统，它可以应用于同时测试12种不同洗涤条件。TOM基本上是大型的具有多达12个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的顶部加载型洗涤机器并且在实验期间，它们中的每一者将含有特定洗涤剂/酶系统的溶液并且对玷污的和未玷污的织物测试其性能。通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂搅拌在每个烧杯内的液体。因为TOM杯子不含盖子，所以有可能在TOM实验期间收回样品并且在洗涤期间在线分析信息。
TOM标准洗涤系统主要用于清洁剂和酶的中等规模测试，在例如US或LA/AP洗涤条件下。在一个TOM实验中，如压载物与污物的比率和织物与洗涤液的比率的因素可以变化。因此，TOM提供了在小规模实验(如AMSA和微型洗涤)与在顶部加载型洗衣机中的更费时的全规模实验之间的联系。
设备：水浴具有12个钢制烧杯并且每个烧杯1个旋转臂，每个烧杯的容量是500或1200mL的洗涤剂溶液。温度范围是从5℃至80℃。水浴应当用去离子水填充。转动速度可以设定到高达70至120转/分钟。
TOM洗涤性能
通过添加CaCl2、MgCl2和NAHCO3将水硬度调节至下述强度。如下所述，在一个桶中制备具有所希望的量的洗涤剂、温度和水硬度的洗涤溶液。洗涤剂在磁搅拌10min期间溶解。
在Terg-O-Tometer中，根据以下设置设定水浴中的温度和转速(rpm)。当根据设置调节温度(公差是+/-0.5℃)时，将洗涤溶液根据下文描述的量添加至TOM烧杯中。
在烧杯中以120rpm进行搅拌。将2个大米淀粉小块布样(CS-28)和污垢压载物添加至每个烧杯中并且根据下文所述的时间进行洗涤。将小块布样在冷自来水中冲洗5min。将小块布样于黑暗中静置干燥过夜。
纺织品：纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
污垢压载物：污垢压载物(棉花/聚酯上的大米淀粉)(EMPA 162)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。Bistro肉汁(063KC)、Frij巧克力奶昔、Heinz意大利面条(113KC)、Herseys双层巧克力获得自Warwick Equest有限公司，55单元，康塞特商业园(Consett Business Park)，康塞特，达勒姆郡，DH86BN，英国
实验条件TOM
Figure BDA0000865189410001651
洗涤剂和测试材料可以如下：
Figure BDA0000865189410001652
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度来测量，表示为反射值。使用Macbeth7000 Color Eye分光光度计进行反射测量。测量每个干小块布样。由于存在来自背景的干扰风险，在测量反射期间将小块布样置于4层织物的顶部。在460nm处测量反射。不包括UV滤光片。计算小块布样的反射的平均结果。
实例
实例1 在40℃下用标准洗涤剂J孵育后的残余活性
通过如在方法下所描述的Amylazyme测定确定本发明变体的(残余的)淀粉酶活性。
通过将50ul淀粉酶样品与450ul标准J混合来进行稳定性测试，并且将该混合物等分在两个管中，将这些管分别在40℃培养箱中孵育90分钟，或者在4℃下在冰箱中孵育90分钟。
在使用Amylazyme测定测量活性之前，在测定缓冲液(具有0,12mM CaCl2和0,01％brij的100mM B&R缓冲液(pH 7,3))中将孵育的样品稀释10×。
相对于经受过相同测试的参照淀粉酶的残余活性，计算稳定性指数。
该参照α-淀粉酶是具有氨基酸R180+S181的缺失的SEQ ID NO:2的淀粉酶，在此将该α-淀粉酶披露为SEQ ID NO:10。换言之，在下表中，变体的亲本是具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的α-淀粉酶。因此，在下表中，“L205F”意指一种具有SEQ ID NO:2的序列而还具有(R180+S181)的缺失并且另外具有L205F取代的α-淀粉酶变体。
Figure BDA0000865189410001661
Figure BDA0000865189410001671
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
Figure IDA0000865189440000011
Figure IDA0000865189440000021
Figure IDA0000865189440000031
Figure IDA0000865189440000041
Figure IDA0000865189440000051
Figure IDA0000865189440000061
Figure IDA0000865189440000071
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Claims (13)

1.SEQ ID NO: 2的成熟多肽的亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，其中引入以下缺失a)和变化b)：
a)SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置R180*+S181*处的缺失，和
b)SEQ ID NO: 2的成熟多肽中的Y48W+L205Y, Y48W+V60A+L205Y, Y48W+V60A+L205F,V60A+L205Y或V60A+F105M+L205Y。
2.如权利要求1所述的变体，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性是在低温下改进的洗涤性能。
3.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体相比于SEQ ID NO: 2的α-淀粉酶具有改进的洗涤剂稳定性。
4.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体相比于具有氨基酸R180和S181缺失的SEQ ID NO: 2的α-淀粉酶具有改进的洗涤剂稳定性，其中该稳定性是在标准洗涤剂J中在40°C下持续90分钟来测试。
5.一种洗涤剂组合物，包括如权利要求1-4中任一项所述的变体α-淀粉酶。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的变体α-淀粉酶在清洁过程中的用途。
7.权利要求6的用途，其中该清洁过程是衣物洗涤或硬表面清洁。
8.权利要求7的用途，其中所述硬表面清洁是自动化餐具洗涤。
9.一种编码如权利要求1-4中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。
10.一种包括如权利要求9所述的多核苷酸的核酸构建体。
11.一种包括如权利要求9所述的多核苷酸的表达载体。
12.一种包括如权利要求9所述的多核苷酸的宿主细胞。
13.一种生产α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：
a)在适于表达该变体的条件下培养如权利要求12所述的宿主细胞；并且
b)回收该变体。
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