JP5594895B2 - タンパク質の能力の改良方法 - Google Patents
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Description
本出願は2007年6月6日に出願された米国仮特許出願第60/933,307号、第60/933,331号 及び第60/933,312号の優先権の利益を主張するものであり、これらの出願はその全てが参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で用いる「プロテアーゼ」(protease)及び「タンパク質分解活性」(proteolytic activity)はペプチド又はペプチド結合を持つ基質を加水分解する能力を示すタンパク質又はペプチドを言う。タンパク質分解活性を測定するための多くの知られた手順が存在する(例えば、Kalisz,「微生物プロチナーゼ」(Microbial Proteinases)Fiechter (編纂), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988]を参照)。例えば、タンパク質分解活性は比較アッセイにより確認しても良く、それにより市販の基質を加水分解するプロテアーゼの各能力を分析する。その様なプロテアーゼ及びタンパク質分解活性の分析で有用な代表的な基質はジメチル カゼイン(Sigma C-9801), 牛のコラーゲン (Sigma C-9879), 牛のエラスチン(Sigma E- 1625)及び牛のケラチン (ICN Biomedical 902111)を含むがこれに限定されるものではない。これらの基質を使用する熱量アッセイは技術分野で良く知られている(例えば、WO 99/34011及び米国特許第6,376,450号を参照願いたい。両文献は参照により本明細書に組み入れられる。)pNAアッセイ(例えば、Del Mar他、Anal Biochem, 99:316-320 [1979]を参照願いたい)はまた、勾配溶離中に回収される部分の活性酵素濃度を決定するのに用いることが出来る。このアッセイは、酵素が可溶合成基質、スクシニルーアラニンーアラニンープロリンーフェニルアラニンーp−ニトロアニリド(sAAPF-pNA)を加水分解するに連れてp−ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応から黄色の生成される速度が分光光度計において410nm波長で測定され、これは活性酵素濃度に比例する。さらに280nmでの吸光測定は全タンパク質濃度の決定に用いることができる。活性酵素/全タンパク質の比率は酵素純度を示す。
アクチノバクテリア網(Class Actinobacteria)のメンバーとして分類されるグラム陽性細菌であるセルロモナス属内の全ての種を指す。セルロモナス属は分類状の再編成を受けていると認められる。この様に、属は再分類された種を含むことが予定されている。
Qβ レプリカーゼの場合, MDV-I RNAがレプリカーゼの特異鋳型である(例えば、 Kacian 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972]を参照)。他の核酸はこの増幅酵素によっては複製されない。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモータに厳格な特異性を持つ(Chamberlin他、Nature 228:227 [1970]を参照)。T4 DNAリガーゼの場合、この酵素は、結紮接合点でオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質及び鋳型間にミスマッチのある場合2つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを結紮しない(Wu 及びWallace, Genomics 4:560 [1989]を参照)。最後に、Taq 及びPfuポリメラーゼは、高温で機能するという能力のため、プライマにより画され(bounded)、それにより規定される配列に高い特異性を示すことが判明しており、高温はプライマが標的配列とハイブリッドするのに都合が良いが、非標的配列とハイブリッドするにはそうはならない熱力学条件を作り出す。
通常低洗剤濃度系であると考えられる。その理由は日本の洗剤は洗濯水中に通常約667 ppmの洗剤成分を含むからである。
部位評価ライブラリー(Site Evaluation Libraries(SELs))は成熟タンパク質の各アミノ酸が殆んどの他のアミノ酸により置換されているASPのために構築された(米国特許出願第10/576,331号及びWO 2005/052146を参照願いたい。これらの文献はSELに関係するものとして参照により本明細書に組み入れられる)。能力を向上させる単一の突然変異はその後組み合わされその能力が再試験された。続くSELの分析及び突然変異の組み合わせデータは分子の表面電荷の変化により汚れの除去能力が極めて大きく減衰していることを示した。
ASPについて採られたアプローチが次に完全に異なるプロテアーゼ骨格に拡大された。NprEのSELが生成され、洗剤中の汚れ除去能力がスクリーニングされた(例えば、米国特許出願第11/581,102号を参照願いたい。本文献はSELに関わる部分について参照により本明細書に組み入れられる)。極めて改良されたBMI洗浄能力を持つ突然変異体が同定された。全ての改良された突然変異体がNprE分子にプラスの電荷を与えた。電荷のバランスのとれたアプローチがNprEのネット表面電化及び表面電荷分布を最適化するために使用された。NprEの場合、分子の全体の電荷が野生型タンパク質のそれよりもよりプラスである場合に、洗濯能力は極めて大きく向上した。BMIでの最適の洗濯能力は、タンパク質上の電荷が野生型タンパク質に比べて+1又は+2である場合に得られた。
本明細書に記載の様に、BMIミクロ材料見本アッセイでの洗濯能力及び酵素の表面の全体の電荷の間の関係が決定された。本発明の方法は種々の酵素及びタンパク質(例えば、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ及び他の酵素)の能力を向上させるために使用することができる。加えて、これらの方法は、これに限定されるものではないが、発現、熱安定性、界面活性剤及び/又はキレート剤での安定性、及び、pHと活性の関係を含むタンパク質の望ましい他の特性を向上させるために使用することができる。
以下の実施例は本発明のある好ましい実施の態様及び特徴を示し及び説明するために提供するものであって本発明の範囲を限定するものでとして理解してはならない。
℃(摂氏度);rpm(分当り回転数);H2O(水);HCL(塩酸);aa及びAA(アミノ酸);bp(塩基ペア);kb(キロベースペア);kD(キロダルトン)gm(グラム);μg及びug(ミクログラム);mg(ミリグラム);ng(ナノグラム);μl及びυl(ミクロリットル);ml (ミリリットル); mm (ミリメータ); nm (ナノメータ); μm 及び um (ミクロメータ); M (モルの); mM (ミリモルの); μM及び uM (ミクロモルの); U (単位); V (ボルト); MW (分子量); sec (秒); min(s) (分); hr(s) (時間); MgCl2 (塩化マグネシウム); NaCl (塩化ナトリウム); OD280 (280 nmの光学濃度); OD405 (405 nmの光学濃度); OD600 (600 nmの光学濃度); PAGE (ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法); EtOH (エタノール); PBS (リン酸緩衝生理食塩水 [150 mM NaCl, 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2]); LAS (ラウリル硫酸ナトリウム); SDS (ドデシル硫酸ナトリウム); Tris (トリ(ヒドロキシメチル)アミノメタン); TAED (N,N,N'N'-テトラアセチルエチレンジアミン); BES (スルホンポリエステル); MES (2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物; f.w. 195.24; Sigma # M-3671); CaCl2 (無水塩化カルシウム; f.w. 110.99; Sigma # C-4901); DMF (N,N-ジメチルフォルムアミド, f.w. 73.09, d = 0.95); Abz-AGLA-Nba (2-アイノベンゾイル-L- アラニルグリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4-ニトロベンジルアミド, f.w. 583.65; Bachem # H-6675, VWR catalog # 100040-598); SBGl % ("Super Broth with Glucose"; 6 g Soytone [Difco], 3 g イースト抽出、6 g NaCl, 6 g グルコース);pHは、技術分野で知れらている方法を用いて殺菌前にNaOHによって7.1に調整された;
; w/v (重量対容積); v/v (容積体容積); Npr及びnpr (中性金属プロテアーゼ); SEQUEST(登録商標) (SEQUEST データベースサーチプログラム、, University of Washington); Npr及びnpr (中性金属プロテアーゼ遺伝子); nprE 及びNprE (バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ); PMN (精製されたMULTIFECT(登録商標)金属プロテアーゼ); MTP (マイクロタイタープレート);MS (質量分光法); SRI (汚れ除去指数); TIGR (ゲノム調査機構(The Institute for Genomic Research)
, Rockville, MD); AATCC (米国繊維化学者・色彩技術者協会(American Association of Textile and Coloring Chemists)); Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); EMPA (スイス材料検査及び試験協会(Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt), St. Gallen, Switzerland); CFT (材料試験センター(Center for Test Materials)、Vlaardingen, The Netherlands); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); Perkin-Elmer (Perkin-Elmer, Wellesley, MA); Rainin (Rainin Instrument, LLC, Wobura, MA); Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg, Germany); Waters (Waters, Inc., MiIf ord, MA); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL 又はGibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Epicentre (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI); Zymo Research (Zymo Research Corp., Orange, CA); Integrated DNA Technologies (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA): New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ); Thermoelectron (Thermoelectron Corp., Waltham, MA); BMG (BMG Labtech, GmbH, Offenburg, Germany); Finnzymes (Finnzymes OY, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medical Instrumentation or GMI (Global Medical Instrumentation; Ramsey, MN); MJ Research (MJ Research, Waltham, MA); Infors (Infors AG, Bottmingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, UK); TOM (Terg-o-Meter); BMI (blood, milk, ink); BaChem (BaChem AG, Bubendorf, Switzerland); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA); MicroCal (Microcal, Inc., Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); NCBI (National Center for Biotechnology Information); GE Healthcare (GE Healthcare, UK).
実施例1
アッセイ
以下に記載のアッセイが以下に述べる実施例で実施された。以下に記載の手続きからの逸脱部分については実施例に記載する。これらの実験では反応の終了後に形成された製品の吸光度の測定に分光光度計を用いた。材料見本の反射率の測定には反射率計を使用した。
96ウエル マイクロタイタープレート(MTP)でのタンパク質含有量決定のためのBCAアッセイ
これらのアッセイでは、MTPスケール上でプロテアーゼサンプル中のタンパク質濃度の決定にBCA (ビシンコニン酸; Pierce)アッセイが用いられた。このアッセイシステムでは使用された化学品及び試薬溶液は:
BCA タンパク質アッセイ試薬及びPierce Dilution 緩衝液 (50 mM MES, pH 6.5, 2mM CaCl2, 0.005% TWEEN(登録商標)-80)である。
このアッセイで使用した洗剤は酵素を含んでいなかった。使用した機器はEppendorf Thermomixer及びSpectraMAX (type 340:分子装置) MTPリーダーであった。MTPはCostar (type 9017)製であった。
Milli-Q水が6 gpgの硬度(Ca/Mg=3/1)に調製され、0.78 g/1 TIDE(登録商標)2X Ultra, Clean Breeze洗剤が加えられた。洗剤は製剤中に存在する全ての酵素を不活性にするために1時間95℃で事前に予備加熱された。洗剤溶液は15分攪拌された。その後5 mM HEPES(遊離酸)が加えられ、pHが8.2に調整された。
0.25インチ円状直径のミクロ材料見本はCFT Vlaardingenから得た。材料見本を切断する前に、織物(EMPA 116)が水で洗濯された。一つのミクロ材料見本が各96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに置かれた。
所望の洗剤溶液が上に述べた様に生成された。Thermomixerを25°Cで平衡させた後、190 μlの洗剤溶液がMTPのミクロ材料を含む各ウエルに加えられた。この混合物に10 μlの希釈酵素溶液が添加され、最終酵素濃度がlμg/ml(BCAアッセイにより決定)とした。MTPはテープでシールされ培養器に30分間置かれ、1400rpmで攪拌された。適当な条件下で培養するのに続いて、各ウエルから100 μlの溶液が採られ新たなMTPに移された。新しいMTPを含む各ウエル100 μlの溶液はMTP SpectraMaxリーダーを用いて405nmで読み取られた。ミクロ材料見本及び洗剤を含むが酵素を含まない実験対照(コントロール)及び何も含まない対照(ブランク コントロール)も含んでいた。
米デンプンアッセイはアミラーゼの能力の試験である。洗剤が本明細書に記載の様に準備された。使用した装置はNew Brunswick Innova 4230 振動器/培養器及びSpectraMAX (タイプ340) MTP リーダーである。MTPはCorning (タイプ3641)より入手した。オレンジ着色材料見本を含む古い米デンプン(CS-28)は試験材料センター(Center for Test Materials) (Vlaardingen, Netherlands).より入手した。0.25インチ円形のミクロ材料見本を切る前に繊維は水で洗浄された。2つのミクロ材料見本が各96ウエル マイクロタイタープレートの各ウエルに置かれた。試験洗剤は20℃(北米)及び40℃(ヨーロッパ)で平衡にされた。
得られた吸光度は空試験値(すなわち、酵素の存在しない場合のミクロ材料見本を培養した後に得た)に対比し修正された。得られた吸光度は試験された酵素の加水分解活性の測定値を与えるものであった。
市販の洗剤配合の熱による不活性化は、非酵素成分の特性を維持しつつ、何れのタンパク質成分の酵素活性をも破壊する。したがって、この方法は本発明の酵素変異体の試験をするために、市販の洗剤を用いるのに好適である。北米(NA)及び西欧(WE)の高密度液体洗濯(HDL)洗剤で、熱不活性は事前に重量を測定した液体洗剤(ガラス瓶中の)を95℃の温浴バスに2時間置いて行った。北米(NA)及び日本(JPN)の高密度顆粒洗濯(HDG)洗剤の熱不活性の培養時間は8時間であり、西欧(WE)HDG洗剤では5時間であった。NA及びWE自動食器洗い(ADW) 洗剤の熱不活性のための培養時間は8時間であった。洗剤はその地域のスーパマーケットから購入した。不活性のパーセントを正確に決定するために、加熱しない及び加熱した洗剤の両方を共にアッセイした。洗剤は溶解後5分以内に。酵素活性はsuc-AAPF-pNAアッセイにより試験した。
BodipyデンプンアッセイをEnzChek(登録商標)Ultra Amylase Assay Kit (E33651, Invitrogen)を使用して行った。DQ デンプン基質の1 mg/mL原液が100 μLの50mM、pH4.0の酢酸ナトリウム中の凍結乾燥された基質を含む小瓶の内容量を溶解することにより作られた。小瓶が約20秒撹拌され、暗室に、室温で置かれ、溶解するまで時々混合された。900 μLのアッセイ緩衝液 (2.6 mM CaCl2 pH 5.8を含む50 mM酢酸ナトリウム)が加えられそして小瓶は約20秒撹拌された。基質溶液は4℃で使用可能になるまで、暗室に、室温で保存された。アッセイのため、DQ基質の希釈標準溶液100 μg/mLがアッセイ緩衝液中の1 mg/mL基質溶液から作られた。190 μLの100 μg/mL基質溶液が96-ウエル平底ミクロタイタープレートの各ウエルに添加された。10 μLの酵素サンプルがウエルに加えられ、800 rpmでサーモミキサーを用いて30秒混合された。緩衝液及び基質のみを含む(酵素を含まない)ブランクサンプルがアッセイに含まれていた。蛍光強度の変化率が蛍光ミクロタイタープレートリーダーで25℃で5分間測定された(励起:485nm、蛍光:520nm)。
このアッセイではコーンデンプン基質溶液の粘度の減少が粘度計により測定された。30%コーンデンプン基質スラリーがコーン粉乾燥固形物によりバッチモードで蒸留水で新たに作られ硫酸を用いてpH5.8に調整された。各運転毎に50グラムのスラリー(15グラム乾燥固形物)が重量が計測され10分間事前培養され70℃まで暖められた。アミラーゼを加え75rpmの回転速度で回転させると温度は直ちに70℃から85℃に上昇した。スラリー及びアミラーゼの温度が85℃に達すると、温度は一定に保たれ粘度がさらに30分モニターされた。
バチルス スブチリス (Bacillus subtilis)中のNprEプロテアーゼの生成
この実施例では、バチルス スブチリスでNprEを生成する実験についてのべる。特にバチルス スブチリスにpUBnprEプラスミドを形質転換するために用いられる方法について述べる。特に形質転換は技術分野で知られた方法で実施された(例えば、WO 02/14490及び米国特許出願第11/581,102号を参照。本文献は参照により本明細書に組み入れられる)。以下に記載するDNA配列(バチルス アミロリケファシエンス由来のnprE リーダー, nprE プロ(pro)及びnprE成熟DNA配列)はNprE前駆体タンパク質をコードする:
PCR手順:
1) 30 秒98℃;
2) 10秒98℃;
3) 20秒55℃;
4) 1 分 72℃;
5) 2 から4のステップを25サイクル;
6) 5 分72°C.;
この結果1.9 kb DNA断片が生成され、このDNA断片はBgIII及びBcII DNA制限酵素を用いて消化された。複数コピーバチルスベクターpUBl10 (例えば、Gryczan, J. Bacterid., 134:318-329 [1978]を参照)はBamHIにより消化された。PCR断片xBgIIIxBcII はその後pUB110 x BamΗIベクター中で結紮され
pUBnprE発現ベクターを形成した。
バチルス スブチリス(Bacillus subtilis)におけるASPプロテアーゼの生産
この実施例では、バチルス スブチリスで69B4 プロテアーゼ(また本明細書で「ASP」、「Asp」及び「ASP プロテアーゼ」及び「Aspプロテアーゼ」とも言う)を生成するための実験についてのべる。特にこの方法はpHPLT-ASP-Cl-2プラスミドをバチルス スブチリスに形質転換するために用いられる。形質転換は技術分野で知られた方法で実施された(例えば、WO 02/14490及び米国特許出願第11/583,334号を参照。本文献は参照により本明細書に組み入れられる)。バチルス スブチリス(Bacillus subtilis)中でのASPの発現を最適にするために合成DNA配列がDNA2.0により生成され、これらの発現実験で用いられた。バチルス(Bacillus)種の使用に適したコドンを持つ以下に記すDNA配列(合成ASP DNA配列)は野生型ASP前駆体タンパク質をコードする:
部位評価ライブラリー(Site Evaluation Libraries(SELs))及び部位飽和突然変異誘発ライブラリー(Site-Saturation Mutagenesis Libraries (SSMLs))の生成
この実施例においてはnprE及びasp SELsの構築で使用される方法が記述される。
上に述べたnprE発現カセットを含むpUBnprEベクターがテンプレートDNAとして使用された。このベクターは独特のBglII制限部位を含み、これは部位評価ライブラリー構築(site evaluation library construction)において使用された。端的に言えば、nprE部位評価ライブラリーを構築するために、3つのPCR反応が実施され、その2つは突然変異生成PCRであり、突然変異させた関心の対象のコドンを成熟nprE DNA配列に導入し、3つ目のPCRは、成熟nprE配列に所望の突然変異されたコドンを含むUBnprE発現ベクターを構築するために、2つの突然変異PCRを融合させるために用いる。
BglII制限部位を含んでいた。これらのプライマーは、Invitrogen (脱塩、50 nmol スケール)により生成された。
主PCR1:
pUB-BgIII-FW プライマー及び特異NPRE 逆突然変異誘発プライマー −共に1 μL (10 μM) ;
主PCR2:
pUB-BgIII-FW プライマー及び特異NPRE 前進突然変異誘発プライマー −共に1 μL (10 μM) ;及び
5 x Phusion HF 緩衝液 10 μL
10 mM dNTP混合物 1 μL
Phusion DNAポリメラーゼ 0.75 μL (2 単位/ μL)
DMSO, 100% l μL
pUBnprE テンプレートDNA l μL (0.1 - l ng/ μL)
精製された, オートクレーブ水 50 μLまで
PCRプログラムは以下の通りであった:
30秒98℃, 30x (10 秒 98℃, 20 秒 55℃, 1,5分 72℃)及び5 分72℃、PTC-200 Peltier 熱サイクル(MJ Research)で実施。
pUB-BgIII-FW プライマー及び pUB-BgIII-RV プライマー−共に1 μL (10 μM)及び
5 x Phusion HF 緩衝液 10 μL
10 mM dNTP混合物 1 μL
Phusion DNAポリメラーゼ 0.75 μL (2 単位/ μL)
DMSO, 100% 1 μL
主PCR 1 反応ミックス 1 μL
主PCR 2 反応ミックス 1 μL
精製された, オートクレーブ水 50 μLまで
PCR融合プログラムは以下の通り:
30秒98℃, 30x (10 秒 98℃, 20 秒 55℃, 2.40分 72℃)及び5 分72℃、PTC-200 Peltier 熱サイクル(MJ Research)で実施された。
- 35 μL 精製線状DNA 断片
- 4 μL REACT(登録商標)3緩衝液 (Invitrogen)
- 1 μLBglII, 10 単位/ml (Invitrogen)
反応条件:1時間、30℃
BgIIIによる消化及びQiaquick(登録商標)PCR精製キット(Qiagen, Cat. No. 28106)を用いて精製された断片の結紮により、所望の突然変異を含む環状及び多重結合DNAが生成された:
- 30μL 精製BglII消化DNA 断片
- 8 μL T4 DNAリガーゼ緩衝液 (Invitrogen(登録商標)Cat. No. 46300-018)
- 1 μL T4 DNA リガーゼ, 1 単位/μL (Invitrogen(登録商標)Cat. no. 15224-017)
反応条件:16-20時間、16℃
その後、結紮された混合物はバチルス スブチリス(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)株に形質転換された。バチルス スブチリスへの形質転換は、WO 02/14490に記載の様に実施された。本文献は参照により本明細書に組み入れられる。各ライブラリーについて、96単一コロニーが採取され、配列分析(BaseClear)及びスクリーニングの目的のために、ネオマイシン及び1.25 g/L イーストエキスを含むMOPS媒体中で成長させた。各ライブラリーは最大19 nprE部位特異変異体を含んでいた。
この実施例では、Aspの部位飽和突然変異誘発ライブラリー(SSML)を起させるための実験を行う。各部位飽和変異ライブラリーはpHPLT- ASP-c 1-2発現ベクターを持つ96Bスブチリス(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))クローンを含んでいた。このベクターは、Aspハイブリッド シグナル ペプチド及びAsp N末端プロ及び成熟タンパク質をコードする合成DNA配列よりなるAsp発現カセットを含み、以下に述べるタンパク質(シグナルペプチド及び前駆体プロテアーゼ)の発現及び成熟Aspプロテアーゼの分泌を可能にすることが判明した。
部位特異的突然変異誘発法による変異プロテアーゼの生成
この実施例では、QUICKCHANGE(登録商標)多部位特異的突然変異誘発法キット(Stratagene)を用いて、nprE SELを生成する方法について述べる。本明細書に記載のこれらの方法は関心の対象となる他の酵素のSELの生産に適している(例えば、Asp)。
pUBnprEベクターを含むバチルス株
Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen cat # 12143)
容易に溶解するリゾチーム(Ready-Lyse Lysozyme)(エピセンターcat # Rl802M)
dam メチラーゼ キット(New England Biolabs cat # M0222L)
チモクリーン ゲルDNA(Zymoclean Gel DNA )回収キット(Zymo Research cat # D4001)
nprE部位特異的突然変異プライマー、100nモルスケール、5'リン酸化され、PAGEにより精製されたもの(Integrated DNA Technologies, Inc.)
QuikChange(登録商標)複数部位特異的突然変異キット(Stratagene cat # 200514)
MJ Research PTC-200 Peltier 熱サイクラー (Bio-Rad Laboratories)
1.2% 寒天E-ゲル (Invitrogen cat # G5018-01)
TempliPhi 増幅キット(GE Healthcare cat # 25-6400-10)
コンピテントバチルス スブチリス細胞 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA- comK)
方法
一つの突然変異(上の実施例4及び米国特許出願第11/581,102号に記載の様に、nprE SELにより同定されるものであり、本文献は参照により本明細書に組み入れられる)を含むpUBnprEプラスミドを得る為に、関心の対象となる各バチルス株単一コロニーが5ml LB + l0ppm ネオマイシン管(例えば、開始培養液)に植菌するために用いられた。培養液は37℃で、225rpmで6時間振とうさせて成長させた。その後、100 mlの新しいLB + l0ppmネオマイシンが1mlの開始培養液により植菌された。
関心の対象となる物理的特性の範囲に亘る多重タンパク質変異体が既存のライブラリーから選択され又は技術分野で知られている部位特異的突然変異誘発技術により生成される(例えば、米国特許出願第10/576,331号, 第11/581,102号, 及び第11/583,334号を参照)。この定義された一組のプローブタンパク質が関心の対象となる試験でアッセイされた。
バチルス レンツス スブチリシン(=GG36)(Bacillus lentus subtilisin)組み合わせ電荷ライブラリーの生成
コドンによる改良GG36遺伝子を持つpAC-GG36ciプラスミドが組み合わせ電荷ライブラリー(CCL)の生成のためにDNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA)に送られた。また形質転換のためバチルス スブチリス (Bacillus subtilis)株(遺伝子型:ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::lRPxylAcomK-phleo)が提供された。さらに、表5−7に示すGG36プロテアーゼの4つの部位の各々において位置ライブラリー(positional library)の生成がDNA2.0 Inc.に依頼された。変異体はグリセロール原料として96ウエルプレートで供給された。
FNA遺伝子を含むpAC-FNAreプラスミドがCCL生成のためDNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA)に送られた。形質転換のためこれらはバチルス スブチリス (Bacillus subtilis)株(遺伝子型:ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo)とともに提供された。DNA 2.0 Inc.に対して表5−8に示す4つのFNAプロテアーゼ部位の各々に位置ライブラリーを生成するよう要請された。変異体は96ウエルプレートによりグリセロール原液として供給された。
AmyS-S242QプラスミドDNAが形質転換されたバチルス スブチリス(Bacillus subtilis)株(遺伝子型:ΔaprE, ΔnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo)から分離され、CCL構築の鋳型としてDNA2.0 Inc.に送られた。 DNA 2.0 Inc. (Mountain View, CA) に対して表5−9に示すAmyS-S242Q (S242Q)アミラーゼの4つの部位の各々に、位置ライブラリーを生成する様要請された。変異体は96ウエルプレートでグリセロール原液として供給された。
変異プロテアーゼの精製及び特徴
この実施例では、先行する実施例の形質転換されたバチルス スブチリス 由来のプロテアーゼを精製するために用いられる方法について述べる。
洗濯能力
本実施例は0.25 μg/mlの液体洗剤でのBMI(blood, milk, ink:血液、ミルク、インク)ミクロ材料見本アッセイによるNprE及びASP変異体の試験について記述する(BMI-TIDE(登録商標)2X 「Ultra Clean Breeze」能力アッセイ)。
LAS安定性
この実施例では0.06% LAS (ドデシル ベンゼン スルホン酸ナトリウム(dodecylbenzenesulfonate sodium))の存在下で試験用プロテアーゼを培養した後にLAS安定性を測定し、そして残留活性をAAPFアッセイにより決定した。
(ドデシル ベンゼン スルホン酸ナトリウム塩(=LAS):Sigma D-2525 TWEEN(登録商標)-80: Sigma P-8074
TRIS緩衝液(遊離酸) Sigma T- 1378); 6.35 g が約960 mlの水に溶解された;; pHが4N HClにより8.2に調整された。TRISの最終濃度は52.5 mMである。
TRIS緩衝液―100 mM / pH 8.6 (100mM Tris/0.005% Tween80)
TRIS-Ca緩衝液, pH 8.6 (100mM Tris/10mM CaC12/0.005% Tween80)
装置
平底MTP: Costar (#9017)
Biomek FX
ASYS マルチピペット
Spectramax MTP リーダー
iEMS 培養器/かくはん器
Innova 4330培養器/かくはん器
Biohit 複数チャネル ピペット
BMG Thermostar かくはん器
方法
10 μl の0.063% LAS溶液が52.5 mM Tris 緩衝液pH 8.2で準備された。AAPF
希釈標準溶液が1 ml の100 mg/ml AAPF原液 (DMSO中)を100 ml (100 mM) TRIS緩衝液pH 8.6に加えて準備された。浮遊物を希釈するため平底プレートに希釈緩衝液が満たされ一定分量の浮遊物が添加され十分混合された。希釈率は成長板のASP対照の濃度によるものであった(AAPF 活性)。望むタンパク質濃度は80 ppmであった。
%残留活性は[t-60値] * 100 / [t- 10値]。
ΔΔG = −RT In (kvariant/kparent)
ここで、kvariantは変異体酵素の速度定数(rate constant)であり、kparent は親酵素の速度定数であり、Rは理想気体の法則定数であり、Tは絶対温度である。殆んどのアッセイは真の自由エネルギーを決定できる様に構築されていない。したがって、見かけの自由エネルギー変化(ΔΔGapp )を次の通り定義する:
ΔΔGapp =−RT In (Pvariant/Pparent)
ここでPvariantは変異体の能力値及びPparentは同一条件による親酵素の能力値である。LASの安定性を示すΔΔGapp値を算出するために、野生型の残留活性は野生型分子の能力値(Pparent)を測定したものとして、変異体の残留活性は変異体分子の能力値(Pvariant)として定義される。マイナスのΔΔGapp値は変異体のLAS安定性の向上を示し、プラスのΔΔGapp値は変異体のLASの安定性の減少を示す。
この実施例では、イオン強度が変化する条件下で1.0 μg/ml AATCC HDL洗剤又は5 mM HEPES緩衝液中のBMI(血液、ミルク、インキ)ミクロ材料見本アッセイでのASP変異体の試験について記述する。また、洗濯及び自動食器洗いの両方の使用での、種々の市場条件(例えば、異なるpH,温度及び/又は水の硬度)を示す洗剤中のBMIミクロ材料見本及び焼き卵アッセイでのFNA 及びGG36変異体の試験について記述する。
図1Aに示す様に、AATCC HDL洗剤中のASPの洗浄能力について最適のネット電荷の変化がある。その能力はBMIミクロ材料見本アッセイ中で観察される相対的な洗浄能力について測定される。約1.0の値はこのアッセイで最高の洗浄能力を示す。図から明らかな様に、野生型に比べて極端にマイナス(−5)又はプラス(+3)の電荷の蓄積は洗浄能力を低下させる。野生型ASPと比較して−2を中心として、洗浄能力にとって明確に最適な電荷がある。
タンパク質の発現
この実施例ではタンパク質電荷とタンパク質の発現の関係を決定することについて述べる。
ASPプロテアーゼ組み合わせ電荷ライブラリー変異体(R14I-N112E-T1 16E-R123F-R159F , R14I-N1 12E-T116E-R123F, R14I-N1 12E-T116E , R14I-N112E, R14I, R14I-D184T, R14I-D184T-T86K, 14I-T86K-D184T-A64K 及びR14I-T86K-D184T-A64K- Q81K)の生産レベルを比較のため、14Lスケールで一組の流加醗酵が実施され、その場合変異体の電荷は−5から +3に変化する。種培養を各変異体に対応する1mLのバチルス スブチリス(Bacillus subtilis)グリセロール原料を含む600Lの培養媒体(LB培養液+ 1%グルコース+ 20 mg/Lネオマイシン)を含む2L邪魔板なし振とうフラスコに接種することにより成長させた。培養液は37℃で振とう培養器で175rpmで攪拌しながらOD550が0.8-1.5に達するまで培養した。その段階で全種培養が、温度、%表示の酸素溶解度、pH及び攪拌をモニターする統合制御機を備えた14L醗酵器に無菌で移された。排気ガスは組み込まれた質量分光光度計によりモニターされた。使用された醗酵媒体(7L)は硫酸マグネシウム、微量のミネラル及び20 mg/Lの追加のネオマイシンを含むリン酸塩ベースの緩衝液中の10%大豆ミールよりなるものであった。初期醗酵パラメータは次の様に設定された:温度37℃、pH 6.8 (運転中水酸化アンモニウムで調整された), 750 rpm で攪拌、40% DO (運転中空気及び攪拌を調節して維持)、11 slpm エアフロー及び圧力1 バール。発泡を制御するために必要に応じて消泡剤(Mazu DF204)が加えられた。
醗酵で得られたバチルス スブチリス (Bacillus subtilis)培養物のサンプルについて変異ASPプロテアーゼの生産アッセイを行った。生産された酵素について基質、N−スクシニル−-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド(N-succinyl- -Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAA-pNA))に対する活性がアッセイされた。このアッセイにより修飾されたプロテアーゼの生成を、加水分解及びN−ニトロアニリンの放出による405nmでの吸光度の増加により測定した(Estell 他、J Biol Chem, 260: 6518-6521 [1985])。醗酵物から一定量のバチルス スブチリス(Bacillus subtilis)浄化浮遊物が100 mM Tris, 0.01 mM CaC12, 0.005% Triton X-100, pH 8.6を含む緩衝液中でアッセイされた。野生型ASPプロテアーゼ標準がg/L 醗酵培養液中で生産されるタンパク質の計算の較正曲線を生成するために用いられた。
宿主細胞中でのタンパク質の発現及び分泌は発現されるタンパク質と多くの宿主タンパク質の相互反応を起す。発現されるタンパク質と宿主細胞タンパク質の最適な相互反応、特に津速反応はタンパク質の生成に必須である。この相互反応は発現されるタンパク質(又は宿主細胞タンパク質)の表面電荷/疎水性を修飾することにより適正化することができる。しかしながら、関係するその仕組みについての知識は本発明の実行及び使用するためには必要ではない。
LAS及びキレート安定性
この実施例ではアニオン性界面活性剤及びキレート剤の何れをも含む反応媒体でのタンパク質電荷及び安定性の関係を決定する。ストレスを加えられた及びストレスを加えられていないサンプルのプロテアーゼ活性を決定するために、suc-AAPF-pNAアッセイが使用された。
熱安定性
この実施例はタンパク質の電荷と熱安定性の関係の決定について記述する。プロテアーゼアッセイは緩衝化培養浮遊物を加熱する前及び加熱した後のジメチルカゼイン(DMC)の加水分解に基づくものである。アミラーゼアッセイは培養浮遊物加熱する前及び加熱した後に、BODIPYデンプンの加水分解に基づくものである。これらのアッセイには実施例1に記載の化学品及び試薬溶液と同じものを用いた。
ろ過した培養浮遊物がPIPES緩衝液中20 ppmに希釈された(成長板で対照の濃度に基づく)。まず各10 μlの希釈された酵素サンプルが採られ、ジメチルカゼインアッセイでの初期活性が決定され、以下に述べる様に処理された。その後各50 μlの希釈された浮遊物がMTPの空のウエルに入れられた。MTPプレートはiEMS培養器/攪拌器HT(Thermo Labsystems)中において60℃及び400 rpmで90分培養された。プレートは氷上で5分冷却された。その後10 μlの溶液がウエル当たり200 μlジメチルカゼイン基質を含む新しいMTPに加えられ、培養の後最終活性が決定された。このMTPはテープで覆われ、数秒振動されそして攪拌されることなく炉に2時間、37℃で置かれた。
ろ過された培養浮遊物がTweenを含む50mM酢酸ナトリウム及び2 mM CaCl2 pH 5.8で続けて希釈された。各10 μlの希釈された培養浮遊物はBODIPY デンプンアッセイにより当初のアミラーゼ活性が決定された。各50 μlの希釈された培養浮遊物がVWR 薄型PCR 96 ウエルプレートに入れられた。30μLの鉱油が各ウエルに封止剤として加えられた。プレートはBioRad DNA engine Peltier Thermal Cycler中で95°Cで、親酵素の安定性によって30又は60分培養された。培養に続いて、プレートは4℃まで5分間冷却され、その後室温に保たれた。各10 μlのサンプルを新しいプレートに加え、実施例1に記載のBODIPY デンプンアッセイにより最終アミラーゼ活性が決定された。
サンプルの残留活性が何れも空試験値と対比して矯正された最終吸光度と当初吸光度の比率として表された。これらの観察はまたアミラーゼ荷電変異体でも行われた。図11は第一のAmyS電荷ラダーの残留活性を野生型と比べた電荷の変化の関数として示す。再び、野生型酵素に比べ極端にマイナス(-12) 又はプラス (+10)の電荷の蓄積は熱安定性に有害となる。これは液体洗濯での使用における酵素の熱安定性を向上させるためにタンパク質の物理的特性(この場合は、ネット電荷)を最適化する例である。
酵素のpH活性の調整
この実施例ではある反応において酵素のpH活性を最適化するために表面電化変異を用いることについて記載する。
Claims (50)
- 親タンパク質に比べて改良された洗浄能力を持つ少なくとも一つのタンパク質変異体を生成する方法であって、
a) 複数の置換されたタンパク質変異体を試験することにより、タンパク質の関心の対象となる特性を得るために最適電荷を決定し、前記タンパク質変異体は、親タンパク質と比べて
i) 0、−1、又は-2、又は
ii) +1又は+2
のネット電荷の変化を持ち、
b) 親タンパク質の一以上の位置で少なくとも一つのアミノ酸残基を修飾し、親タンパク質と比べてより大きいプラス、より大きいマイナス、より小さいプラス、又はより小さいマイナスの電荷を持つ少なくとも一つのタンパク質変異体を生成することを含み、前記修飾することには置換、添加及び/又は欠失することを含み、また、前記置換の位置は、35%より大きい溶媒の接近可能な表面(SAS)を持つ親タンパク質中の位置であり、そして前記タンパク質変異体は、a)の工程で決定された最適の電荷を持つ、
前記方法。 - 前記修飾することには化学的に修飾することを含む、請求項1の方法。
- 前記タンパク質が酵素である、請求項1の方法。
- 前記酵素がプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、アルカラーゼ又はカタラーゼである、請求項3の方法。
- 前記プロテアーゼがセリンプロテアーゼ又は中性金属プロテアーゼである、請求項4の方法。
- 前記少なくとも一つのタンパク質変異体は少なくとも一つの関心の対象である試験を用いて評価される、請求項1の方法。
- 前記少なくとも一つの関心の対象である試験は、基質結合、酵素抑制、発現レベル、洗剤安定性、熱安定性、反応速度、反応の範囲、熱活性、でんぷん液化、エステル加水分解、酵素漂白、洗濯能力、バイオマス分解、溶解度、キレート安定性及び/又は糖化の測定を含む、請求項6の方法。
- 前記少なくとも一つのタンパク質変異体は、前記親タンパク質に比べて、関心の対象である試験において改良された能力を示す、請求項7の方法。
- 親酵素に比べて改良された洗浄能力を持つ少なくとも一つの酵素変異体を生成する方法であって、
a) 複数の置換された酵素変異体を試験することにより、酵素の関心の対象となる特性を得るために最適電荷を決定し、前記酵素変異体は、親酵素と比べて
i) 0、−1、又は-2、又は
ii) +1又は+2
のネット電荷の変化を持ち、
b)親酵素の一以上の位置で少なくとも一つのアミノ酸残基を修飾し、親酵素と比べてより大きいプラス、より大きいマイナス、より小さいプラス、又はより小さいマイナスの電荷を持つ酵素変異体を生成することを含み、前記修飾することには置換、添加及び/又は欠失することを含み、また、前記置換の位置は、35%より大きい溶媒の接近可能な表面(SAS)を持つ親酵素中の位置であり、そして前記酵素変異体は、a)の工程で決定された最適の電荷を持つ、
前記方法。 - 前記修飾することには化学的に修飾することを含む、請求項9の方法。
- 請求項9の方法であって、さらに前記酵素変異体及び前記親酵素の洗濯能力を試験を行い、前記酵素変異体及び前記親酵素の能力指数を提供することを含む、前記方法。
- 前記酵素変異体の能力指数が1.0より大きい値を持ち前記親酵素の洗濯能力は1.0の能力指数である、請求項11の方法。
- 請求項9の方法であって、さらに改良された洗濯能力を持つ変異酵素を生成することを含む方法。
- 請求項9の方法であって、前記酵素はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、アルカラーゼ又はカタラーゼである前記方法。
- 請求項14の方法であって、前記プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又は中性金属プロテアーゼである方法。
- 前記プロテアーゼがバチルス(Bacillus)由来のプロテアーゼである、請求項15の方法。
- 前記洗濯能力が5から12.0のpHを持つ粉末又は液状洗剤組成物で試験される請求項11の方法。
- 前記洗濯能力が塩基pHを持つ液状洗濯洗剤で試験される請求項11の方法。
- 前記洗濯能力が塩基pHを持つ冷水液状洗剤で試験される、請求項11の方法。
- 前記置換の位置は50%又は65%より大きい溶媒の接近可能な表面(SAS)を持つ親酵素中の位置である、請求項9の方法。
- 親酵素に比べて改良された洗浄能力を持つ酵素変異体を生成する方法であって、
a) 複数の置換された酵素変異体を試験することにより、酵素の関心の対象となる特性を得るために最適電荷を決定し、前記酵素変異体は、親酵素と比べて
i) 0、−1、又は-2、又は
ii) +1又は+2
のネット電荷の変化を持ち、
b) 親酵素の一以上の位置で少なくとも一つのアミノ酸残基を修飾し、親酵素と比べてより大きいプラス、より大きいマイナス、より小さいプラス、又はより小さいマイナスの電荷を持つ第一の酵素変異体を生成する;及び
c) 親酵素の一以上の位置で少なくとも一つのアミノ酸残基を修飾し、親酵素と比べてより大きいプラス、より大きいマイナス、より小さいプラス、又はより小さいマイナスの電荷を持つ第二の酵素変異体を生成するステップを含み、前記修飾することには置換、添加及び/又は欠失することを含み、また、前記置換の位置は、35%より大きい溶媒の接近可能な表面(SAS)を持つ親酵素中の位置であり、そして前記酵素変異体は、a)の工程で決定された最適の電荷を持つ、
前記方法。 - 前記修飾することには化学的に修飾することを含む、請求項21の方法。
- 複数の酵素変異体を生成するために前記ステップが繰り返される、請求項21の方法。
- 請求項21の方法であって、前記親酵素はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、アルカラーゼ又はカタラーゼである前記方法。
- 前記プロテアーゼが中性金属プロテアーゼ又はセリンプロテアーゼである、請求項24の方法。
- 前記親酵素がバチルス(Bacillus)由来のプロテアーゼである請求項21の方法。
- 請求項21の方法であって、さらに、前記変異酵素と前記親酵素の洗濯能力を試験して、前記洗濯能力試験において汚れを除去する前記親酵素と前記変異酵素との能力を比較することを含み、その場合前記親酵素の洗濯能力を1.0とした場合、改良された洗濯能力を持つ変異酵素は1.0より大きい値を達成する、前記方法。
- 請求項27の方法であって、さらに、親酵素と比べて改良された洗濯能力を持つ酵素変異体を生成することを含む前記方法。
- 前記親酵素がセリンプロテアーゼである、請求項28の方法。
- 前記セリンプロテアーゼがバチルス(Bacillus)由来のセリンプロテアーゼ又はセルロモナス(Cellulomonas)由来のセリンプロテアーゼである、請求項29の方法。
- 前記洗濯能力が5から12.0のpHを持つ粉末又は液状洗剤組成物で試験される、請求項27の方法。
- 前記洗濯能力が塩基pHを持つ液状洗濯洗剤で試験される、請求項27の方法。
- 前記洗濯能力が塩基pHを持つ冷水液状洗剤で試験される、請求項27の方法。
- 前記置換の位置は、50%又は65%より大きい溶媒の接近可能な表面(SAS)を持つ前記親酵素中の位置である、請求項21の方法。
- 少なくとも一つの酸性アミノ酸残基が少なくとも一つの塩基性アミノ酸残基により置換されている、請求項21の方法。
- 少なくとも一つの酸性アミノ酸残基が少なくとも一つの中性アミノ酸残基により置換されている、請求項21の方法。
- 少なくとも一つの中性アミノ酸残基が少なくとも一つの塩基性アミノ酸残基により置換されている、請求項21の方法。
- 少なくとも一つの塩基性アミノ酸残基が少なくとも一つの酸性アミノ酸残基により置換されている、請求項21の方法。
- 少なくとも一つの塩基性アミノ酸残基が少なくとも一つの中性アミノ酸残基により置換されている、請求項21の方法。
- 少なくとも一つの中性アミノ酸残基が少なくとも一つの酸性アミノ酸残基により置換されている、請求項21の方法。
- 請求項21の方法であって、前記親酵素中の少なくとも一つの中性アミノ酸残基が少なくとも一つの中性アミノ酸残基により置換され、親酵素と比較して同じ電荷を持つ酵素変異体を生成する、前記方法。
- 親タンパク質に比べて改良された洗浄能力を持つ少なくとも一つのタンパク質変異体を生成する方法であって、
a) 複数の置換されたタンパク質変異体を試験することにより、タンパク質の関心の対象となる特性を得るために最適電荷を決定し、前記タンパク質変異体は、親タンパク質と比べて
i) 0、−1、又は-2、又は
ii) +1又は+2
のネット電荷の変化を持ち、
b) 親タンパク質の一以上の位置で少なくとも一つのアミノ酸残基を修飾し、親タンパク質と比べてより大きいプラス、より大きいマイナス、より小さいプラス、又はより小さいマイナスの電荷を持つタンパク質変異体を生成し、前記一以上の位置は25%より大きい溶媒の接近可能な表面(SAS)を持ち、
そして前記タンパク質変異体は、a)の工程で決定された最適の電荷を持つ、
前記方法。 - 請求項42の方法であって、前記一以上の位置は前記親タンパク質及び少なくとも一つの追加タンパク質を含む相同タンパク質配列のアミノ酸アラインメント中の非保存性である、前記方法。
- 前記親タンパク質は酵素である、請求項42の方法。
- 前記酵素がプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、アルカラーゼ又はカタラーゼである請求項44の方法。
- 前記改良された能力は、基質結合、酵素抑制、発現、洗剤中の安定性、熱安定性、反応速度、反応の範囲、熱活性、でんぷん液化、バイオマス分解、糖化、エステル加水分解、酵素漂白、洗濯能力、溶解度、キレート安定性及び/又は繊維修飾から選択される一以上の特性における能力の増大を含む、請求項42の方法。
- 前記修飾することには置換、添加及び/又は欠失することを含む、請求項42の方法。
- 前記修飾することには化学的に修飾することを含む、請求項42の方法。
- 前記置換の位置が、50%より大きい溶媒の接近可能な表面(SAS)を持つ親酵素中の位置である、請求項47の方法。
- 前記置換の位置が、65%より大きい溶媒の接近可能な表面(SAS)を持つ親酵素中の位置である、請求項47の方法。
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