JP2014221044A

JP2014221044A - タンパク質の特性の改良方法

Info

Publication number: JP2014221044A
Application number: JP2014118795A
Authority: JP
Inventors: エーレ、ヴォルフガング; Wolfgang Aehle; カスカオン−ペレイラ、ルイス・グスターボ; Gustavo Cascao-Pereira Luis; ケリス、ジュニア・ジェイムズ・ティー; T Kellis James Jr; ショウ、アンドリュー; Shaw Andrew
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2014-11-27
Also published as: JP2010529842A; US20100216682A1; RU2009149660A; DK2171056T3; JP5594895B2; KR20100032367A; JP5548613B2; CN101784662A; BRPI0812448A2; WO2008153934A2; EP2171055B1; BRPI0812446A2; US9133425B2; WO2008153934A3; CN101802194B; EP2171057B1; KR20100028031A; CA2690023C; JP5674462B2; WO2008153925A3

Abstract

【課題】不利な環境条件においてその触媒保存安定性を最適化するために酵素を操作する方法の提供。【解決手段】酵素（例えば、金属プロテアーゼ）の表面電荷及び/又は表面電荷分布を変え、当初の又は親酵素と比較して洗剤製剤において改良された能力及び/又は安定性を示す酵素変異体を得る。特定のアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼ中の位置と同等の位置に少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ単離された中性金属プロテアーゼ変異体を生成する。【選択図】なし

Description

関連出願との関係
本出願は２００７年６月６日に出願された米国仮特許出願第60/933,307号、第60/933,331号及び第60/933,312号の優先権の利益を主張するものであり、これらの出願はその全てが参照により本明細書に組み入れられる。

本発明はある関心の対象となる環境条件においてタンパク質の動作を最適化するためにタンパク質を操作する方法を提供する。ある実施の態様において、本発明は特定の環境条件においてその触媒活性を最適化するために酵素を操作する方法を提供する。

ある好ましい実施の態様において、本発明は不利な環境条件においてその触媒活性及び/又は安定性を最適化するために酵素を操作する方法を提供する。ある好ましい実施の態様において、本発明は特に不利な環境条件においてその触媒保存安定性を最適化するために酵素を操作する方法を提供する。

ある好ましい実施の態様において、本発明は酵素（例えば、金属プロテアーゼ）の表面電荷及び/又は表面電荷分布を変え、当初の又は親酵素と比較して洗剤製剤において改良された能力及び/又は安定性を示す酵素変異体を得る方法を提供する。

その自然の環境外で機能するタンパク質の特性はしばしば次善のものである。例えば、酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ等）はしばしば洗濯洗剤において繊維から汚れを落とすために用いられ、その洗剤は典型的には複雑な活性成分の組み合わせを含む。事実、殆んどの洗浄用製品は、界面活性剤系、漂白剤、ビルダー、汚れ抑制剤、汚れけん濁剤、汚れ剥離剤、光学的光沢剤、軟化剤、分散剤、染料転移抑止化合物、研磨剤、殺菌剤、及び香水並びに洗剤用酵素を含む。この様に、昨今の洗剤の多様さに関わらず、一部は、酵素の能力が次善のものに留まるため汚れによっては完全に取除くのが困難なものが多くある。酵素の開発で多くの研究がされているにも関わらず、特定の用途及び条件下でに用いるタンパク質を得るためにタンパク質を操作する方法が求められる。事実、その商業上の応用においてその能力を最適化するために、その静電特性を急速にかつシステマチックに調整するための方法が求められる。洗剤溶液中で改良された活性、安定性、溶解性を得るために、これらに限定されるものではないが、特に、リパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、マンナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ及び他の酵素を含み工業的に有用な酵素を操作する方法が求められる。

本発明は改良されたタンパク質変異体の生成方法を提供し、前記方法は以下を含む：複数の単一に置換されたタンパク質変異体を第一の特性の第一の試験及び第二の特性の第二の試験において試験を行い、その場合親タンパク質は各試験で1.0の値を持ち、有利な第一又は第二の特性は1.0よりも大きな値を持ち、過度に不利な第一又は第二の特性は約0.8未満の値を持ち、又はある好ましい実施の態様においては0.60未満の値を持ち；有利な第一の特性に関連しているが、過度に不利な第二の特性に関連していない、単一置換されたタンパク質変異体の少なくとも一つの置換を同定し；有利な第二の特性に関連しているが、過度に不利な第一の特性に関連していない、単一置換されたタンパク質変異体の少なくとも一つの置換を同定し；前のステップからの置換をタンパク質に導入し複数置換のタンパク質変異体を得ること。ある実施の態様においては、前記方法はさらに複数置換されたタンパク質変異体を第一及び第二の試験において試験を行うことを含み、その場合改良されたタンパク質変異体は第一及び第二の試験の両方において1.0より大きい値を又は第一の試験において1.0より大きい値を、第二の試験において0.80から1.0値を達成する。ある更なる実施の態様においては、前記方法はさらに改良されたタンパク質変異体を生成することを含む。ある実施の態様においては、第一又は第二の特性は逆相関する。ある別の実施の態様においては、有利な第一又は第二の特性は約1.2より大きい値を持つ。ある更に別の実施の態様においては、過度に不利な第一又は第二の特性は約0.40未満の値を持つ。ある実施の態様においては、第一の特性は安定性であり、第二の特性は洗濯能力である。ある特に好ましい実施の態様においては、安定性には洗剤中での安定性を含み、洗濯能力は洗剤中での血液、ミルク、インク（ＢＭＩ）の洗濯能力を含む。更にある好ましい実施の態様においては、タンパク質は中性金属プロテアーゼである。ある別の実施の態様においては、親タンパク質は中性金属プロテアーゼの野生型成熟型であり、他の実施の態様においては、変異体はバチルス科（Bacillaceae）の中性金属プロテアーゼに由来する。ある特に好ましい実施の態様においては、変異体はバチルス属（genus Bacillus）の中性金属プロテアーゼに由来する。更に別の実施の態様においては、洗濯能力は5から12.0の間のｐＨを持つ粉末又は液体洗剤組成物中で試験される。更に別の実施の態様においては、洗濯能力は塩基ｐＨを持つ冷水液体洗剤で試験される。更に別の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親中性金属プロテアーゼと比べて0、−１又は−２のネット電荷の変化を持ち、他の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親中性金属プロテアーゼと比べて0、＋１又は＋２のネット電荷の変化を持つ。本発明においては任意の好適な順序で実施されるため、これらのステップは厳密に上の記載の順序によることは必要でない。ある好ましい実施の態様においては、改良されたプロテアーゼ変異体は親中性金属プロテアーゼに比べて＋１又は＋２のネット電荷の変化を持つ。更に別の実施の態様においては、置換は約50％より大きい溶媒接近表面表面（ＳＡＳ）を持つ親中性金属プロテアーゼ中の位置である。更に別の実施の態様においては、親中性金属プロテアーゼ中の一以上の位置は約65％より大きい溶媒接近表面表面（ＳＡＳ）を持つ位置である。

本発明は改良されたプロテアーゼ変異体の生成方法を提供し、前記方法は以下を含む：複数の単一に置換されたプロテアーゼ変異体を第一の特性の第一の試験及び第二の特性の第二の試験において試験を行い、その場合親プロテアーゼの特性は各試験で1.0の値を持ち、有利な第一又は第二の特性は1.0よりも大きな値を持ち、過度に不利な第一又は第二の特性は約0.8未満の値を持ち、又はある好ましい実施の態様においては0.60未満の値を持ち；有利な第一の特性に関連しているが、過度に不利な第二の特性に関連していない、単一置換されたプロテアーゼ変異体の少なくとも一つの置換を同定し；有利な第二の特性に関連しているが、過度に不利な第一の特性に関連していない、単一置換されたプロテアーゼ変異体の少なくとも一つの置換を同定し；前のステップからの置換をプロテアーゼに導入し複数置換のプロテアーゼ変異体を得ること。ある実施の態様においては、前記方法はさらに複数置換されたプロテアーゼ変異体を第一及び第二の試験において試験をすることを含み、その場合改良されたプロモータ変異体は第一及び第二の試験の両方において1.0より大きい値を、又は第一の試験において1.0より大きい値を、第二の試験において0.80から1.0値を達成する。ある更なる実施の態様においては、前記方法はさらに改良されたプロテアーゼ変異体を生成することを含む。ある実施の態様においては、第一又は第二の特性は逆相関する。ある別の実施の態様においては、有利な第一又は第二の特性は約1.2より大きい値を持つ。ある更に別の実施の態様においては、過度に不利な第一又は第二の特性は約0.40未満の値を持つ。ある好ましい実施の態様においては、第一の特性は安定性であり、第二の特性は洗濯能力である。ある特に好ましい実施の態様においては、安定性には洗剤中での安定性を含み、洗濯能力は洗剤中での血液、ミルク、インク（ＢＭＩ）洗濯能力を含む。更にある好ましい実施の態様においては、プロテアーゼは中性金属プロテアーゼである。ある別の実施の態様においては、親プロテアーゼは中性金属プロテアーゼの野生型成熟型であり、他の実施の態様においては、変異体はバチルス科（Bacillaceae）の中性金属プロテアーゼに由来する。ある特に好ましい実施の態様においては、変異体はバチルス属（genus Bacillus）の中性金属プロテアーゼに由来する。更に別の実施の態様においては、洗濯能力は5から12.0の間のｐＨを持つ粉末又は液体洗剤組成物中で試験される。更に別の実施の態様においては、洗濯能力は塩基ｐＨを持つ冷水液体洗剤で試験される。更に別の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親中性金属プロテアーゼと比べて0、−１又は−２のネット電荷の変化を持ち、他の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親中性金属プロテアーゼと比べてネット電荷の変化が0、＋１又は＋２を持つ。本発明においては任意の好適な順序で実施されるため、これらのステップは厳密に上の記載の順序によることは必要でない。ある好ましい実施の態様においては、改良されたプロテアーゼ変異体は親中性金属プロテアーゼに比べて＋１又は＋２のネット電荷の変化である。更に別の実施の態様においては、置換は約50％より大きい溶媒接近表面表面（ＳＡＳ）を持つ親中性金属プロテアーゼ中の位置である。更に別の実施の態様においては、親中性金属プロテアーゼ中の一以上の位置は約65％より大きい溶媒接近表面表面（ＳＡＳ）を持つ位置である。本発明はまた本明細書に規定する方法を用いて生成された複数置換タンパク質を提供する。ある好ましい実施の態様においては、本発明は本明細書に規定された方法を用いて生成された中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明は配列番号３として規定するバチルス由来の中性金属プロテアーゼの残基位置８３に対応する残基位置に置換を持つプロテアーゼ変異体を提供する。ある更に好ましい実施の態様においては、置換はL83K置換を含む。また本発明は以下のものよりなる群から選択される置換基の組み合わせを含むNprEを提供する：
i)4K-45K-50R-54K-59K-90K-129I-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-2
65P-269H- 285R-296E; 45K-50R-59K-90K- 1291- 138L- 179P- 190L-
199E-214Q-220E-244S-265P-285R; 45K-59K-90K- 1291- 138L- 179P- 190L-
199E-214Q-220E-265P-285R;及び59K-90K- 1291- 179P- 190L-
199E-214Q-220E-265P-285R.
本発明はまた本明細書に記載のプロテアーゼ変異体をコードする分離されたポリヌクレオチドを提供する。更に、本発明は本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む、プロモータと動作可能に組み合わされた発現ベクターを提供する。

また本発明は本明細書に記載の発現ベクターにより形質転換される宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明の方法を用いて生成されたプロモータ変異体を含む洗剤組成物を提供する。

本発明は改良されたタンパク質変異体の生成方法を提供し、前記方法は以下を含む：a) 複数の単一に置換されたタンパク質変異体を第一の特性の第一の試験及び第二の特性の第二の試験において試験を行い、その場合親タンパク質は各試験で1.0の値とすると、有利な第一又は第二の特性は1.0よりも大きな値を持ち、過度に不利な第一又は第二の特性は約0.8未満の値を持ち；b) 有利な第一の特性に関連しているが、過度に不利な第二の特性に関連していない、単一置換されたタンパク質変異体の少なくとも一つの置換を同定し；c) 有利な第二の特性に関連しているが、過度に不利な第一の特性に関連していない、単一置換されたタンパク質変異体の少なくとも一つの置換を同定し；及びd) ステップb) からの置換及びステップc) からの置換をタンパク質に導入し複数置換のタンパク質変異体を得ること。ある実施の態様においては、前記方法はさらにe) 複数置換されたタンパク質変異体を第一及び第二の試験において試験を行い、その場合改良されたタンパク質変異体は第一及び第二の試験の両方において1.0より大きい値を又は第一の試験において1.0より大きい値を、第二の試験において0.80から1.0値を達成する。

ある実施の態様においては、タンパク質はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、カタラーゼ及びアルカラーゼよりなる群から選択される酵素である。ある好ましい実施の態様においては、酵素はプロテアーゼ又はアミラーゼである。

ある実施の態様においては、関心の対象である第一及び第二の特性は基質結合、酵素抑制、発現、洗剤中の安定性、熱安定性、反応速度、反応の範囲、熱活性、でんぷん液化、バイオマス分解、糖化、エステル加水分解、酵素漂白、洗濯能力、及び繊維改質よりなる群から選択された2以上特性を含む。ある特に好ましい実施の態様においては、前記方法は更に改良されたタンパク質変異体を生成することを含む。ある実施の態様においては、第一及び第二の特性は逆相関する。本発明のある実施の態様においては、有利な第一又は第二の特性は約１．２より大きい値を持ち、及び/又は過度に不利な第一及び第二の特性は約0.60未満の値を持つ。ある好ましい実施の態様においては、第一の特性は安定性であり第二の特性は洗濯能力である。これらの実施の態様のサブセットにおいては、安定性は洗剤中の安定性を含み、洗濯能力は洗剤中の血液、ミルク、インク（ＢＭＩ）洗濯能力を含む。ある実施の態様においては、第一の特性はタンパク質の発現であり、第二の特性は酵素活性である。これらの実施の態様のサブセットにおいては、酵素活性は洗剤中の米デンプン洗濯能力を含む。ある好ましい実施の態様においては、プロテアーゼは中性金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ及びスブチリシンよりなる群から選択される。これらの実施の態様のサブセットにおいては、中性金属プロテアーゼはバチルス科（Bacillaceae）の中性金属プロテアーゼである。ある代表的な実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス属（genus Bacillus）（例えば、バチルススブチリス NprE（Bacillus subtilis NprE）である。ある好ましい実施の態様においては、洗濯能力は5及び12の間のｐＨを持つ粉末又は液状洗剤組成物及び/又は塩基ｐＨを持つ冷水液状洗剤で試験される。ある実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親酵素に比べて０、−１、又は−２のネット電荷の変化を持つ。ある実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親酵素と比べて＋１、又は＋２のネット電荷の変化を持つ。ある好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの置換は少なくとも2つの置換を持つ、第一の置換は親酵素に比べて0、−１、又は−２のネット電荷の変化を持つ、第二の置換は親酵素に比べて＋１又は＋２のネット電荷の変化を持つ。ある実施の態様においては、少なくとも一つの置換は１から２０の置換（例えば、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 又は20)を含む。ある実施の態様においては、改良された酵素変異体は親酵素に比べて−2,−1 , 0, +1又は+2のネット電荷の変化を持つ。ある実施の態様においては、置換の位置は約２５％より大きい、約５０％より大きい、又は約６５％より大きい溶媒の接近可能な表面（SAS）を持つ親酵素中の位置である。

本発明はまた本明細書に記載の酵素変異体をコードする分離されたポリヌクレオチドを提供する。更なる実施の態様においては、本発明はプロモータと組み合わせて動作可能なポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ある実施の態様においては、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。更に別の実施の態様においては、本発明の方法を用いて生成される酵素変異体を含む洗剤組成物を提供する。

本発明は改良されたタンパク質変異体の生成方法を提供し、前記方法は操作可能な順序に従い以下を含む：a) 複数の単一に置換されたタンパク質変異体を第一の特性の第一の試験及び第二の特性の第二の試験において試験を行い、その場合親タンパク質は各試験で1.0の値を持つとすると、有利な第一又は第二の特性は1.0よりも大きな値を持ち、過度に不利な第一又は第二の特性は約0.8未満の値を持ち；b) 有利な第一の特性に関連しているが、過度に不利な第二の特性に関連していない、単一置換されたタンパク質変異体の少なくとも一つの置換を同定し；c) 有利な第二の特性に関連しているが、過度に不利な第一の特性に関連していない、単一置換されたタンパク質変異体の少なくとも一つの置換を同定し；及びd) ステップb) からの置換及びステップc) からの置換をタンパク質に導入して複数置換のタンパク質変異体を得て、複数置換のタンパク質変異体は改良されたタンパク質変異体である。ある好ましい実施の態様においては、前記方法はさらにe) 複数置換されたタンパク質変異体を第一及び第二の試験において試験を行い、その場合改良されたタンパク質変異体は第一及び第二の試験の両方において1.0より大きい値を又は第一の試験において1.0より大きい値を、第二の試験において0.80から1.0の値を達成する。ある更なる実施の態様においては、親タンパク質は酵素であり、改良されたタンパク質変異体は酵素である。ある別の実施の態様においては、酵素はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、カタラーゼ及びアルカラーゼより選択される。ある特に好ましい実施の態様においては、酵素はプロテアーゼ又はアミラーゼである。

ある別の実施の態様においては、関心の対象である第一及び第二の特性は基質結合、酵素抑制、発現、洗剤中の安定性、熱安定性、反応速度、反応の範囲、熱活性、でんぷん液化、バイオマス分解、糖化、エステル加水分解、酵素漂白、洗濯能力、及び繊維改質よりなる群から選択された2以上の特性を含む。ある更に別の実施の態様においては、前記方法は更に、改良されたタンパク質変異体を生成するステップを含む。ある別の実施の態様においては、第一及び第二の特性は逆相関する。ある特に好ましい実施の態様においては、有利な第一又は第二の特性は約１．２より大きい値を持つ。ある別の好ましい実施の態様においては、過度に不利な第一及び第二の特性は約0.60未満の値を持つ。更に別の実施の態様においては、過度に不利な第一及び第二の特性は約０．４０未満の値を持つ。ある好ましい実施の態様においては、ある好ましい実施の態様においては、第一の特性は洗剤中の安定性であり第二の特性は洗濯能力である。ある特に好ましい実施の態様においては、安定性は洗剤組成物中の安定性を含み、洗濯能力は洗剤中の血液、ミルク、インク（ＢＭＩ）洗濯能力を含む。

ある更に別の実施の態様においては、洗濯能力は5及び12の間のｐＨを持つ粉末又は液状洗剤組成物で試験される。ある別の好ましい実施の態様においては、洗濯能力は塩基ｐＨを持つ冷水液状洗剤で試験される。ある更に別の実施の態様においては、第一の特性はタンパク質の発現であり、第二の特性は酵素活性である。ある別の実施の態様においては、プロテアーゼは中性金属プロテアーゼ及びセリンプロテアーゼから選択される。ある特に好ましい実施の態様においては、セリンプロテアーゼはスブチリシンである。ある別の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス科（Bacillaceae）のメンバーから得た中性金属プロテアーゼである。他の代替的実施の態様においては、アミラーゼはバチルス科（Bacillaceae）のメンバーから得たアルファアミラーゼである。

更に別の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親酵素に比べて０、−１、又は−２のネット電荷の変化を持つ。

ある別の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親酵素に比べて＋１又は＋２のネット電荷の変化を持つ。

更に別の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は親酵素に比べて＋１又は＋２のネット電荷の変化を持つ。

更に別の実施の態様においては、改良された酵素変異体は親酵素に比べて＋１又は＋２のネット電荷の変化を持つ。

ある代替的な実施の態様においては、置換の位置は約２５％より大きい溶媒の接近可能な表面（SAS）を持つ親酵素中の位置である。ある好ましい実施の態様においては、置換の位置は約５０％より大きい、又は約６５％より大きい溶媒の接近可能な表面（SAS）を持つ親酵素中の位置である。

ある特に好ましい実施の態様においては、親酵素は野生型酵素である。

本発明はまた本明細書に記載の方法により生成された改良されたタンパク質変異体を含む洗剤組成物を提供する。

本発明はまた、配列番号3に規定するアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼ中の位置と同等の位置に少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ分離された中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。ある好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの置換は配列番号３に規定するアミノ酸配列８３の位置と同等の位置に作られる。ある特に好ましい実施の態様においては、置換はＬ８３Ｋである。

図１ＡはAmyS-S242Q組み合わせ電荷ライブラリー(CCL)の相対的BODIPYデンプン加水分解比活性と振動管の発現の対比を示す。図１ＢはAmyS-S242Q ＣＣＬのＴＩＤＡ２ｘ中の相対的米デンプンミクロ材料見本洗浄活性と振動管の発現の対比を示す。図２ＡはAmyS-S242Q ＣＣＬの相対的振動管の発現とネット電荷の変化の対比を示す。図２ＢはAmyS-S242Q ＣＣＬの相対的BODIPYデンプン加水分解比活性と相対的ネット電荷の変化の対比を示す。図３ＡはAmyS-S242Q ＣＣＬの相対的振動管の発現と相対的ネット電荷の変化の対比を示す。図３ＢはAmyS-S242Q ＣＣＬの米デンプンミクロ材料見本洗浄活性と相対的ネット電荷の変化の対比を示す。

発明の一般的な説明

本発明はある関心の対象となる環境条件においてタンパク質の動作を最適化するためにタンパク質を操作する方法を提供する。ある実施の態様において、本発明は特定の環境条件においてその触媒活性を最適化するために酵素を操作する方法を提供する。ある好ましい実施の態様においては、本発明は悪環境条件において酵素の触媒活性及び/又は安定性を最適化するために酵素を操作する方法を提供する。ある好ましい実施の態様においては、本発明は特に悪環境条件において酵素の保存安定性を最適化するために酵素を操作する方法を提供する。

ある好ましい実施の態様において、本発明は酵素（例えば、金属プロテアーゼ）の表面電荷及び/又は表面電荷分布を変え、当初の又は親酵素と比較して洗剤製剤において改良された能力を示す酵素変異体を得る方法を提供する。

プロテアーゼスブチリシンは洗濯洗剤で使用される主要な酵素であり、世界で恐らく最も広く使用されている。表面静電効果によりスブチリシンの触媒活性を調節することができることが知られている（例えば、Russell及びFersht, Nature 328:496-500 [1987]を参照）。より最近になり、スブチリシンのネット電荷を変化させる変異が洗剤の洗濯能力に劇的な効果を与えることが観察された(例えば、EP Patent No. 0 479 870 Blを参照願いたい。)。この有利な効果はスブチリシンのpI(等電点)を洗浄液のｐHの方向に動かすことによると信じられていた。しかし、後の研究の結果、この結論は必ずしも全ての場合に適用されるものではないことが判明した（例えば、米国特許第6,673,590 Blを参照。）。この特許が示す様に、スブチリシンの電荷の変異の効果は洗剤の濃度に極めて大きく依存し、変異は親スブチリシンのpIを下げ、それにより低い洗剤濃度でより効果的な酵素を提供し、変異はまたｐIを上昇させ、それにより高い洗剤濃度でより効果的な酵素を提供する。洗濯液中の洗剤濃度は世界の地域により非常に大きく変わるため、これは非常に役立つ。このようにスブチリシンの洗濯能力に対する最適のpIがあり、それは洗濯液中のpＨ及び洗剤濃度に依存することが当業者に明らかになって来た。さらに洗濯洗剤中のスブチリシンの活性を向上させるための努力について記述されている（米国特許出願公開公報第 2005/0221461を参照)。驚くことには、親スブチリシンと同じネット静電電荷を持つスブチリシン変異体は、高い及び低い両方の洗剤濃度の洗濯条件下で洗濯能力を向上させることが判明した。

特に断らない限り、本発明においてはタンパク質操作、分子生物学、微生物学、及び組み換えDNAで通常使用される従来の技術を用い、これらの技術は当業者の常識の範囲内にある。その様な技術は当業者に知られており、また当業者に知られている多くの書籍及び参考文献に記載されている。本明細書に記載の全ての特許、特許出願、論文及び刊行物は、本発明により提供される方法及び組成物に関するそれらの教示に関し、参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書において、他の意味を持つものとして規定しない限り、本明細書の全ての技術及び科学用語はこの発明が関係する技術分野の当業者により通常理解されると同じ意味を持つ。本明細書に記載のこれらの方法と同様又は同等な方法及び材料は、本発明の実施に使用することができるが、本明細書では好ましい方法及び材料が記載されている。したがって、以下に続いて定義される用語は明細書を全体として考察することにより、より完全に把握することができる。

また、本明細書で使用する単数を表わす「a」「an」及び「the」は、文意より明確に異なる意味に解せられない限りその複数形をも含む。数値範囲はその範囲を規定する数値を含む。他に断らない限り、各々、核酸は左から右へ5’ から3’の方向へ記載され；アミノ酸配列は左から右へ、アミノ基からカルボキシ基の方向に記載される。本発明は記載された特定の方法論、手順、及び試薬に限定されるものではないことを理解するべきである。これらは当業者により使用される状況により変わりうるからである。

本明細書を通じ記載されている各最大限界数値は、その下限数値が本明細書に記載されている様に、各下限値を含んでいることを意図している。本明細書を通じ記載されている各最小限界数値は、その上限限界値が本明細書に記載されている様に、各上限値を含んでいることを意図している。本明細書を通じ記載されている各数値範囲は、そのより狭い数値範囲が、全て本明細書に記載されている様に、その様なより広い数値範囲内にある各狭い数値範囲を含む。

更に、本明細書に記載の各見出しは、本発明の種々の特徴又は実施の態様を限定するものではなく、本発明は明細書を全体として考察することにより把握することができる。したがって、これに直ちに続く定義は明細書を全体として考察することにより更に十分に理解される。しかし、本発明の理解の促進を図るために、多数の用語を以下に定義する。

定義
本明細書で用いる「プロテアーゼ」（protease）及び「タンパク質分解活性」（proteolytic activity）はペプチド又はペプチド結合を持つ基質を加水分解する能力を示すタンパク質又はペプチドを言う。タンパク質分解活性を測定するための多くの知られた手順が存在する（例えば、Kalisz,「微生物プロチナーゼ」（Microbial Proteinases）Fiechter (編纂), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988]を参照)。例えば、タンパク質分解活性は比較アッセイにより確認しても良く、それにより市販の基質を加水分解するプロテアーゼの各能力を分析する。その様なプロテアーゼ及びタンパク質分解活性の分析で有用な代表的な基質はジメチルカゼイン(Sigma C-9801), 牛のコラーゲン (Sigma C-9879), 牛のエラスチン(Sigma E- 1625)及び牛のケラチン (ICN Biomedical 902111)を含むがこれに限定されるものではない。これらの基質を使用する熱量アッセイは技術分野で良く知られている（例えば、WO 99/34011及び米国特許第6,376,450号を参照願いたい。）pＮＡアッセイ（例えば、Del Mar他、Anal Biochem, 99:316-320 [1979]を参照願いたい)はまた、勾配溶離中に回収される部分の活性酵素濃度を決定するのに用いることが出来る。このアッセイは、酵素が可溶合成基質、スクシニルーアラニンーアラニンープロリンーフェニルアラニンーｐ−ニトロアニリド(sAAPF-pNA)を加水分解するに連れてｐ−ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応から黄色の生成される速度が分光光度計において４１０nm波長で測定され、これは活性酵素濃度に比例する。さらに２８０nmでの吸光測定は全タンパク質濃度の決定に用いることができる。活性酵素/全タンパク質の比率は酵素純度を示す。

本明細書で用いる、「ASPプロテアーゼ」（ASP protease）、「Aｓｐプロテアーゼ」（Asp protease）及び「Asp」は、本明細書及び米国特許出願第10/576,331号に記載のセリンプロテアーゼを指す。ある好ましい実施の態様においては、Aspプロテアーゼは、本明細書においてセルロモナス種（Cellulomonas strain）69B4から得られる69B4プロテアーゼとして設計されたプロテアーゼである。この様に、好ましい実施の態様においては、「69B4プロテアーゼ」（69B4 protease）の用語はセルロモナス種（Cellulomonas strain）69B4(DSM 16035)に由来する天然発生成熟プロテアーゼを指す。他の実施の態様においては、本発明はASPプロテアーゼの部分を提供する。

「セルロモナスプロテアーゼ同族体」（Cellulomonas protease homologue）の用語はセルロモナス種69B4又はその様な天然発生プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に由来する成熟プロテアーゼと実質的に同一のアミノ酸配列を持つ天然発生プロテアーゼを指し、そのプロテアーゼはその様な核酸によりコードされるセリンプロテアーゼの機能的特徴を保持している。ある実施の態様においては、これらのプロテアーゼの相同体は「セルロモナジン」（cellulomonadin）と呼ばれる。

本明細書で用いる「ASP変異体」（ASP variant）、「ASP プロテアーゼ変異体」（ASP protease variant）及び「69B プロテアーゼ変異体」（69B protease variant）は野生型ASP,特にその機能において類似するプロテアーゼに関して使用されるが、そのアミノ酸配列において、野生型プロテアーゼの配列と異なる変異を持つ。

本明細書で用いる「セルロモナスｓｓｐ」（Cellulomonas ssp）はセルロモナダセアエ科(Family Cellulomonadaceae) 、マイクロコッカス亜目 (Suborder Micrococcineae)、アクチノミセターレス目(Order Actinomycetales)
アクチノバクテリア網（Class Actinobacteria）のメンバーとして分類されるグラム陽性細菌であるセルロモナス属内の全ての種を指す。セルロモナス属は分類状の再編成を受けていると認められる。この様に、属は再分類された種を含むことが予定されている。

本明細書で用いる「ストレプトマイセスssp」（Streptomyces ssp）は「ストレプトマイセス」属内の全ての種を指し、それはストレプトマイセス科(Family Streptomycetaceae)、ストレプトマイセス亜目(Suborder Streptomycineae)、アクチノミセターレス目、アクチノバクテリア網のメンバ−として分類されるグラム陽性細菌である。ストレプトマイセス属は分類上の再編成を受けることが知られている。このように、属は再編成された種を含むことが予定されている。

本明細書で用いる「バチルス属」（genius Bacillus）は当業者に知られている「バチルス属」（genius Bacillus）属の範囲内の全ての種を含み、バチルススブチリス（Bacillus subtilis）、バチルスリチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルスレンツス（Bacillus lentus）、バチルスブレビス（Bacillus brevis）、バチルスステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルスアルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルスアミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens)、バチルスクラウシ（Bacillus clausii）、バチルスハロジュランス（Bacillus halodurans）、バチルスメガテリウム（Bacillus megaterium）バチルスコアグランス（Bacillus coagulans）、バチルスシルクランス（Bacillus circulans）、バチルスランツス（Bacillus lantus）、バチルスツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）を含むがこれに限定されるものではない。Bacillus属は分類上の再編成を受けることが知られている。バチルス属は、これに限定されるものではないが、現在「ゲオバチルスステアロテルモフィルス」（Geobacillus stearothermophilus）と呼ばれているバチルスステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）のような有機体を含み、分類上の再編成を受けた種を含むと考えられる。酸素の存在下において耐性のある内生胞子を生産することがバチルス属を規定する特徴と考えられる。この特徴はまた最近命名されたアリシクロバチルス(Alicyclobacillus), アンフィバチルス(Amphibacillus), アネウリニバチルス(Aneurinibacillus), アノキシバチルス(Anoxybacillus), ブレビバチルス(Brevibacillus), フィロバチルス(Filobacillus), グラシリバチルス(Gracilibacillus), ハロバチルス(Halobacillus), パエニバチルス(Paenibacillus), サリバチルス(Salibacillus), テルモバチルス(Thermobacillus), ウレイバチルス(Ureibacillus), ビルギバチルス(Virgibacillus)に当てはまる。

「ポリヌクレオチド」（polynucleotide）及び「核酸」（nucleic acid）の用語は本明細書において相互交換的に用いられ、任意の長さのポリマー形式のヌクレオチドを指し、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを問わない。これらの用語は単一鎖、二重鎖、又は三重鎖DNA、ゲノムDNA, cDNA, RNA, DNA-RNAハイブリッド又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー又は他の天然の、化学的、生物学的に修飾された、非天然の、又は誘導体ヌクレオチド塩基を含むがこれに限定されるものではない。以下に挙げるものはポリヌクレオチドの非限定的例である：遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、EST, エクソン、イントロン、mRNA, tRNA, rRNA, リボザイム, cDNA, 組み換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の分離RNA、核酸プローブ及びプライマである。ある実施の態様においては、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドの様な修飾されたヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ、ウラシル、他の糖、及びフロロリボース、チオエートのような連結基及びヌクレオチド分枝を含む。他の実施の態様においては、ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断される。

本明細書で用いる「DNA構築体」（DNA construct）及び「形質転換DNA」（transforming DNA）は相互交換的に用いられ、宿主細胞又は有機体に配列を導入するために用いるDNAを指す。このDNAはインビトロでPCRにより又は技術分野で知られた任意の好適な技術によって生成することができる。ある特に好ましい実施の態様においては、このDNA構築体は関心の対象の配列（例えば、入って来る配列（incoming sequence）として）を含む。ある実施の態様においては、配列は制御要素（例えば、プロモータ等）の様な追加要素に動作可能にリンクされている。DNA構築体はさらに選択可能なマーカーを含んでも良い。それはさらに、ホモロジーボックスが側面に付いた、入ってくる配列を含む。更なる実施の態様においては、形質転換DNAは末端に加えられた他の非相同配列を含む（例えば、スタッファ配列又は側面）。ある実施の態様においては、入ってくる配列の末端は閉じられており、そのため、形質転換DNAは閉じた円を形成する。形質転換配列は野生型、突然変異体又は修飾されたものであっても良い。ある実施の態様においては、DNA構築体は宿主細胞染色体に相同な配列を含む。他の実施の態様においては、DNA構築体は非相同配列を含む。DNA構築体がインビトロで組立てられると、それは１）非相同配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入する、及び/又は２）宿主細胞染色体の領域に突然変異を起させる（例えば、内在性配列を非相同配列で置換する）及び/又は３）標的遺伝子を欠失させる、及び/又は宿主に複製型プラスミドを導入する。

本明細書で用いる「発現カセット」（expression cassette）及び「発現ベクター」（expression vector）はある標的細胞中の特定の核酸の転写を認める一連の特定された核酸要素（nucleic acid element）を持つ組み換え又は合成により生成された核酸構築体を指す。組み換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアのDNA、プラスチドDNA、ウイルス、又は核酸断片に組み入れることができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写される核酸及びプロモータを含む。好ましい実施の態様においては、発現ベクターは宿主細胞に非相同DNA断片を組み入れ及び発現する能力を持つ。多くの原核生物及び真核生物発現ベクターは市場で調達可能である。好適な発現ベクターを選択することは当業者の常識の範囲にある。「発現カセット」（expression casette)の用語は本明細書において「DNA構築体」及びその文法的同等体と相互交換的に用いられる。適当な発現ベクターを選択することは当業者の常識の範囲内にある。

本明細書で用いる、「ベクター」（vector）は核酸を一以上の細胞型に導入する様に設計されたポリヌクレオチド構築体を指す。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等を指す。ある実施の態様においては、ポリヌクレオチド構築体は、好適な宿主細胞でDNAを発現させることのできる好適なプロ配列（例えば、分泌腺など）に動作可能にリンクされているプロテアーゼ（例えば、前駆体又は成熟プロテアーゼ）をコードするDNA配列を含む。

本明細書で用いる「プラスミド」（plasmid)はクローニングベクターとして用いられる環状二重鎖（ds）DNA構築体を指し、このプラスミドはある新核生物又は原核生物中の染色体外自己複製遺伝子要素を形成し又は宿主染色体に一体化する。

細胞に核酸配列を導入することについて本明細書で用いられる「導入される」（introduced）は核酸配列を細胞に転写するのに好適な任意の方法を指す。導入のためのその様な方法は原形質融合、トランスフェクション、形質転換、接合及び軽質導入を含むがこれに限定されるものではない(例えば、Ferrari他、「遺伝子」（Genetics）、Hardwood 他 (編纂), 「バチルス」（Bacillus）、Plenum Publishing Corp., 57-72ページ [1989]参照)。

本明細書で用いる「形質転換された」（transformed）及び「安定的に形質転換された」（stably transformed）は非天然（非相同）ポリヌクレオチド配列がそのゲノムに一体化され又は少なくとも２世代に亙り維持されるエピソーププラスミドとしての細胞を指す。

本明細書で用いる「選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列」（selectable marker-encoding nucleotide sequence）の用語は宿主細胞で発現が可能であり、選択可能なマーカーの発現は発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下で又は必須栄養素が存在しない中で成長する能力を与える、ヌクレオチド配列を指す。

本明細書で用いる、「選択可能なマーカー」（selectable marker）又は「選択マーカー」（selective marker）の用語は、ベクターを含むこれらの宿主の選択を容易にする宿主細胞中で発現することが可能な核酸（例えば、遺伝子）を指す。これらの選択可能なマーカーの例には、抗菌剤を含むが、これに限定されるものではない。このように「選択可能なマーカー」は、宿主細胞が関心の対象となる、入ってくるDNAを取り上げた、又は他のある反応が起きた兆候を示す遺伝子を言う。典型的には選択可能なマーカーは、外因性DNAを含む細胞を、形質転換中に外因性配列を受容していない細胞から区別する宿主細胞に抗菌剤耐性を与え、又は代謝上の利益を与える遺伝子を指す。「居住する選択可能なマーカー」（residing selectable marker）は形質転換される、微生物の染色体にあるマーカーである。居住する選択可能なマーカーは形質転換DNA構築体上の選択可能なマーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは当業者に良く知られている。上に述べた様に、好ましくはマーカーは抗菌剤耐性マーカーである（例えば、amp^R; phleo^R; spec^R ; kan^R; ery^R; tet^R; cmp^R; 及びneo^R (例えば、Guerot-Fleury, Gene, 167:335- 337 [1995); Palmeros他、Gene 247:255-264 [2000];及びTrieu-Cuot他、Gene, 23:331-341, [1983]を参照)のが良い。本発明で有用な他のマーカーは、トリプトファンの様な栄養要求性マーカー、β―ガラクトシダーゼの様な検出マーカーを含むがこれに限定されるものではない。

本明細書で用いる「プロモータ」（promoter）は下流遺伝子の転写を指示するように機能する核酸配列を指す。好ましい実施の態様においては、プロモータは標的遺伝子を発現させる宿主細胞に適している。プロモータは他の転写及び翻訳調整核酸配列（これは「制御配列」（control sequences)とも呼ばれる）とともにある遺伝子を発現させるのに必要である。一般的に転写及び翻訳調整配列には、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終了配列、翻訳開始及び終了配列、及びエンハンサ又は活性配列を含むがこれに限定されるものではない。

核酸は、他の核酸配列と機能的な関係におかれた場合「動作可能にリンクされている」（operably linked）。例えば、分泌リーダー（例えば、シグナルペプチド）をコードするDNAは、もしポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのDNAと動作可能にリンクされており；プロモータ又はエンハンサは、配列の転写に影響する場合は、コード配列に動作可能にリンクされており；リボソーム結合部位は、翻訳を促進するような位置にある場合、コード配列と動作可能にリンクされている。一般的に、「動作可能にリンクされている」はリンクされているDNA配列が連続しており、そして分泌リーダーの場合は連続しかつ読取層（reading phase）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続である必要はない。リンクは適当な制限部位での結紮により行われる。もしその様な部位がない場合は、従来の慣例に従い合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。

本明細書で用いる「遺伝子」（gene）はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、DNAセグメント）を指し、個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）のみならずコード領域に先行し及び続く領域を含む。

本明細書で用いる、「相同遺伝子」（homologous genes）は、異なるが、通常関連している種の一対の遺伝子を言い、これらの種は互いに対応し、及びお互いに同一又は非常に類似している。この用語は遺伝子複製によって分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）のみならず、種分化（speciation:すなわち、新しい種の開発）（例えば、オルソロガス遺伝子）によって分離された遺伝子を含む。

本明細書で用いる、「オルソログ」（ortholog）及び「オルソロガス遺伝子」（orthologous gene）は種分化によって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）より進化した異なる種の遺伝子を言う。典型的には、オルソログは進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの同定は新しく配列決定されたゲノムでの遺伝子機能を予測する信頼される方法として用いられる。

本明細書で用いる、「パラログ」（paralog）及び「パラロガス遺伝子」（paralogous gene）はゲノム内で複製されることにより関連する遺伝子を言う。オルソログが進化の過程で同じ機能を保持するのに対し、パラログは、その幾つかの機能は元の機能としばしば関連するものであるが、新しい機能を発展させる。

パラロガス遺伝子の例には、これらは全てセリンプロテナーゼであり、同じ種内で一緒に生じるトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子を含むがこれに限定されるものではない。

本明細書で用いる「相同」（ホモロジー）（homology）は配列の類似又は同一性、好ましくは同一であるのが良いが）を指す。この相同は技術分野で知られている標準的技術により決められる（例えば、Smith及びWaterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman及びWunsch, J. MoI. Biol., 48:443 [1970]; Pearson及びLipman, Proc. Natl. Acad .Sci. USA, 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics Software Package中のGAP, BESTFIT, FASTA, 及びTFASTAの様なプログラム, Genetics Computer Group, Madison, WI;及びDevereux 他、Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984)を参照)。

本明細書で用いる「類似配列」（アナログ配列）（analogous sequence）は、遺伝子の機能が親遺伝子に基づくものと実質的に同じであるものを指す（例えば、セルロモナス種（Cellulomonas strain）69B4タンパク質)。さらに、類似遺伝子は親遺伝子の配列と少なくとも約45%, 約50%,約55%,約60%,約65%,約70%,約75%,約80%,約85%,約90%,約95%,約97%,約98%,約99% 又は約100%同じ配列を含む。代替的に類似配列は親遺伝子（例えば、セルロモナス種69B4タンパク質)領域に見られる遺伝子の70から100%の配列のアラインメントを持ち、及び/又は親遺伝子を含む染色体中（例えば、セルロモナス種（Cellulomonas strain）69B4染色体)の遺伝子とアラインされた領域に少なくとも５−１０の遺伝子を持つ。更なる実施の態様においては、一以上の上記の特性が配列に適用される。類似配列は配列アラインメントにおける既知の方法により決定される。本明細書に述べる様に配列アラインメントで用いられる他の方法もあるが、通常用いられるアラインメント方法はBLASTである。

有用なアルゴリズムの一つの例はPILEUPである。PILEUPは漸進的、ペアーワイズアラインメント（progressive, pair-wise alignment）を用いた群の関連配列から多配列アラインメントを作る。またアラインメントを作るために用いられたクラスター関係を示すツリー（tree）をプロットすることもできる。PILEUPはFeng及びDoolittleの漸進的アラインメントを簡素化したものを用いる (Feng及びDoolittle, J. MoI. Evol., 35:351-360 [1987])。この方法はHiggins及びSharpにより記述されているもの(Higgins及びSharp, CABIOS 5:151-153 [1989])と類似する。有用なPILEUPパラメータは３．００のデフォールトギャップウエイト、０．１０のデフォールトギャップレングスウエイト、及び加重エンドギャップを含む。

他の有用なアルゴリズムの例は、BLASTアルゴリズムであり、Altschul他(Altschul他、J. MoI. Biol., 215:403-410 [1990];及びKarlin他、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:5873-5787 [1993))により記述されている。特に有用なBLAST プログラムはWU-BLAST-2 プログラムである(Altschul他, Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996]を参照)。WU-BLAST-2は幾つかのサーチパラメータを用いるが、その大半はデフォールト値に設定される。調整可能なパラメータは以下の値に設定される：重複範囲＝１、重複画分= 0.125、言語閾値（word threshold (T)）= 11。HSP S及びHSP S2 パラメータは動値であり、特定の配列の組成及び関心の対象となる配列が調査される特定のデータベースの組成に依存するプログラム自体により決定される。しかし、これらの値は感度を高めるように調整しても良い。％アミノ酸配列による同一性の値は一致する同一の残基の数をアラインされる領域中の「より長い」配列の残基の全数によって除して決定される。「より長い」配列はアラインされる領域中に最も確かな残基（mostr actuacl residue）を持つものである（アラインメント数値を最大にする様にWU-Blast-2により導入されたギャップは考慮されない）。

宿主細胞「パーセント（％）核酸配列の同一性」（percent (%) nucleic acid sequence identity）は、開始配列のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定義される。好ましい方法は、重複範囲及び重複画分をそれぞれ１及び０．１２５のデフォールトパラメータに設定したWU-BLAST-2のBLASTNの基準を用いる。

本明細書で用いる、「ハイブリッドする」（hybridization）は、技術分野で知られている様に、核酸の鎖が塩基ペアーを通して相補鎖と結合するプロセスを言う。

２つの配列が中程度から高度に厳格（stringency）なハイブリッド条件及び洗濯条件でお互いに特異的にハイブリッドする場合は、核酸配列は参照核酸配列に「選択的にハイブリッド可能である」（selectively hybridizable）と考えられる。ハイブリッド条件は核酸結合複合体又はプローブの溶融温度（Tm）に基づく。例えば、「最も厳格」（maximum stringency）は典型的には約Tm−5℃（プローブのTmより5℃低い）；「高度に厳格」（high stringency）は、Tmより5-10℃低い；「中程度に厳格」（intermidiate stringency）はプローブのTmより約10-20℃低い；「低度に厳格」（low stringency）はTmより約20-25℃低い。

機能的には、「最も厳格」条件は、ハイブリッドプローブを用いて厳格な同一性又は厳格な同一性に近い同一性を持つ配列を同定するのに用いても良く、中程度に厳格又は低度に厳格なハイブリッドはポリヌクレオチド配列の相同を同定又は検出するのに用いることができる。

中程度又は高度に厳格なハイブリッド条件は技術分野で良く知られている。高度に厳格な条件の例には50％ホルムアルデヒド中、約42℃、5X SSC, 5X デンハート溶液, 0.5% SDS及び100 μg/ml 変性キャリアー DNA、続いて2X SSC 及び0.5% SDS中で室温で2度洗浄し、さらに0.1 X SSC 及び 0.5% SDSで、42⁰Cで2度洗浄するハイブリッドを含む。中程度に厳格な条件は、20％ホルムアルデヒド、5 x SSC (150mM NaCl, 15 mM クエン酸3ナトリウム、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6), 5 x デンハート溶液、10% 硫酸デキストラン及び20 mg/ml 変性せん断した鮭の精液DNAを含む溶液中で37℃で一夜培養し、続いて約37−50℃でIx SSC でフィルターを洗浄することを含む。当業者は、プローブ長さ等の様な要素を用いるため必要に応じて、温度、イオン強度等の調整する方法を知っている。

本明細書で用いる「組み換え体」（recombinant）の用語は、非相同核酸配列の導入により修飾された細胞又はベクター、又はその様に修飾された細胞から誘導された細胞を含む。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）型の中に同一の型がない遺伝子を発現させ、又はそうでなければ異常に発現された又は人の意図的な干渉により低発現し又は発現しない天然の遺伝子を発現させる。

「組み換え」（Recombination）、「組み換えること」（recombining）及び「組み換えられた」（recombined）核酸を生成することは一般的に、その集合（assembly）がキメラ遺伝子を作る2以上の核酸断片の集合を作ることである。

ある好ましい実施の態様において、突然変異DNA配列は少なくとも一つのコドンで部位飽和突然変異誘発により生成される。他の好ましい実施の態様においては、部位突然変異誘発は2以上のコドンで実行される。さらに他の実施の態様においては、突然変異DNA配列は、野生型配列と50%より大きい、55%より大きい、 60%より大きい、 65%より大きい、 70%より大きい、 75%より大きい、80%より大きい、 85%より大きい、90%より大きい、95%より大きい、又は98%より大きい相同性を持つ。他の実施の態様においては、突然変異DNAはインビボで通常知られている任意の突然変異手順、例えば、放射、ニトロソグアジニン等を用いて生成される。そして所望のDNA配列が分離され本明細書に記載の方法に用いられる。

本明細書で用いる「標的配列」（target sequence）は、入ってくる配列が宿主細胞ゲノムに挿入されることが所望される、その配列をコードする宿主細胞中のDNA配列を指す。ある実施の態様においては、標的配列は機能的野生型遺伝子又はオペロンをコードし、他の実施の態様において標的配列は機能的突然変異遺伝子又はオペロン又は非機能的遺伝子又はオペロンをコードする。

本明細書用いる「フランキング配列」（flanking sequence）は以下に説明する配列の上流又は下流の任意の配列を指す（例えば、遺伝子A-B-Cにおいて, 遺伝子BはA及びC遺伝子配列が両側面に沿っている）。ある好ましい実施の態様においては入ってくる配列はそれぞれの側にホモロジーボックスが側面に沿っている。他の実施の態様においては、入ってくる配列及びホモロジーボックスは両側にスタッファ配列が沿うユニットを含む。ある実施の態様においては、フランキング配列は一つの末端にのみ存在する（３’又は５’）が、好ましい実施の態様においては、それはその側面に沿う配列の何れの側にも存在する。ある実施の態様においては、フランキング配列は一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施の態様においては、それが沿う配列の何れの側にも存在する。

本明細書で用いる「スタッファ配列」（stuffer sequence）はホモロジーボックス（典型的にはベクター配列）に沿う任意の追加のDNAを指す。しかし、この用語は任意の非相同DNA配列を含む。理論に捕われるわけではないが、スタッファ配列は細胞がDNAの取り込みを開始するための重要でない標的を提供する。

本明細書で用いる、「増幅」（amplification）及び「遺伝子増幅」（gene amplification）は、特定のDNA配列が不釣合いに複製され、増幅された遺伝子がゲノムに当初存在したよりも多いコピー数で存在するプロセスを言う。ある実施の態様においては、薬剤（例えば、抑制可能な酵素の抑制剤）の存在下で成長によって細胞を選択することにより、薬剤の存在下で成長に必要な遺伝子製品をコードする内生遺伝子を増幅するか、又はこの遺伝子製品をコードする外因性（すなわち、投入された）配列を増幅することによるかのいずれか、又はその双方となる。

「増幅」（amplification）は鋳型特異性（template specificity）を含む核酸の複製の特異な場合である。これは非特異的鋳型複製（すなわち、複製は鋳型に依存するが、特定の鋳型に依存するものではない）と対比されるべきである。ここでの鋳型特異性は、複製が忠実であるかどうか（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−又はデオキシリボ−）特異性とは区別される。鋳型特異性は、しばしば「標的」（target）特異性と呼ばれる。標的配列は、これらが他の核酸から選定されるという意味で「標的」である。増幅技術は、主にこの選定をするために設計されたものである。

本明細書で用いる、「共増幅」（co-amplification）は、単一細胞に他の遺伝子配列（すなわち、発現ベクターに含まれる一以上の非選択性遺伝子）と共に増幅マーカーを導入し、細胞が増幅可能なマーカー及び他の非選択的遺伝子配列を増幅する様に、適当な選択圧を与えることを言う。増幅可能なマーカーは物理的に他の遺伝子配列にリンクされても良く、又は代替的に、その一つは増幅可能なマーカーを含み、他は非選択的マーカーを含む２つの別々のDNA が同じ細胞に導入されても良い。

本明細書で用いる、「増幅可能なマーカー」（amplifiable marker）、「増幅可能な遺伝子」（amplifiable gene）及び「増幅ベクター」（amplification vector）は、適当な成長条件でその遺伝子を増幅させる、遺伝子又は遺伝子をコードするベクターを言う。

「鋳型特異性」（template specificity）は酵素を選択することにより殆んどの増幅技術によって実現される。増幅酵素は、それらが使用される条件下で、異種の核酸の混合物中の核酸の特異の配列のみを処理する酵素である。例えば、
Qβ レプリカーゼの場合, MDV-I RNAがレプリカーゼの特異鋳型である（例えば、 Kacian 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972]を参照）。他の核酸はこの増幅酵素によっては複製されない。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモータに厳格な特異性を持つ(Chamberlin他、Nature 228:227 [1970]を参照)。T4 DNAリガーゼの場合、この酵素は、結紮接合点でオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質及び鋳型間にミスマッチのある場合、2つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを結紮しない(Wu 及びWallace, Genomics 4:560 [1989]を参照)。最後に、Taq 及びPfuポリメラーゼは、高温で機能するという能力のため、プライマにより画され（bounded）、それにより規定される配列に高い特異性を示すことが判明しており、高温はプライマが標的配列とハイブリッドするのに都合が良いが、非標的配列とハイブリッドするにはそうはならない熱力学条件を作り出す。

本明細書で用いる、「増幅可能な核酸」（amplifiable nucleic acid）は、任意の増幅方法により増幅される核酸を言う。「増幅可能な核酸」は通常「サンプル鋳型」（sample template）を含むと考えられる。

本明細書で用いる、「サンプル鋳型」（sample template）は、「標的」（target）（以下に定義される）の存在が分析されるサンプル由来の核酸を言う。対照的に、「バックグラウンド鋳型」（background template）は、サンプル中に存在し、又は存在しないサンプル鋳型と異なる核酸について用いられる。バックグラウンド鋳型は殆んどの場合偶然による。それはキャリーオーバーの結果であるか、又はサンプルから精製されて除去される核酸汚染物質の存在によるものである。例えば、検知されるべき有機体以外の有機体からの核酸は、テストサンプル中にバックグラウンドとして存在することもある。

本明細書で用いる、「プライマ」（primer）は、精製された制限消化の様に自然に生成されるか合成により生成されるかを問わず、核酸鎖に相補的なプライマ伸長製品の合成が誘発される条件下に置かれる場合、合成の開始点として作動することができる（すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼの様な誘発剤の存在下及び好適な温度及びpＨで）オリゴヌクレオチドを言う。プライマは、増幅で最大の効果を得るためには好ましくは単一鎖であるのが良いが、代替的に、二重鎖であっても良い。もし、二重鎖の場合は、プライマはまず、伸長製品を得るために使用する以前に、その鎖を分離する処理がなされる。好ましくは、プライマはオリゴデキシリボヌクレオチドであるのが良い。プライマは誘発剤の存在下で伸長製品の合成を準備するために十分長くなければならない。プライマの正確な長さは、温度、プライマソース及び使用法を含み数多くの要因に依る。

本明細書で用いる、「プローブ」（probe）は、精製された制限消化の様に自然に生成されるか、合成により、組み換えにより又はPCR増幅により生成されるかを問わず、関心の対象である他のオリゴヌクレオチドにハイブリッドすることができるオリゴヌクレオチドを言う。プローブは単一鎖であるか又は二重鎖であっても良い。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で用いられるいずれのプローブも任意の「レポーター分子」（reporter molecule）によりラベルを付されることが予定され、酵素（例えば、酵素ベースの組織化学的アッセイのみならずELISA）、蛍光、放射線、及び発光システムを含む検出システムで検出することができるが、これに限定されるものではない。本発明は特定の検出システム又はラベル方式に限定されるものではない。

本明細書で用いる、「標的」（target）は、ポリメラーゼ連鎖反応との関係で用いる場合は、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマにより画された（bounded）核酸の領域を言う。したがって、「標的」は他の核酸配列から選定される。「部分」（segment）は標的配列内の核酸の領域として定義される。

本明細書で用いる、「ポリメラーゼ連鎖反応」（polymerase chain reaction (PCR)）は米国特許第4,683,195号, 第4,683,202号及び第4,965,188号に記載の方法を言う。この方法は、当業者に良く知られている様に、クローン又は精製をすることなくゲノムDNA混合物中で標的配列のある部分の濃度を増大させる方法を含む。標的配列の所望の増幅部分が混合物中の主要な配列（濃度において）になるため、これらは「PCR増幅された」と言われる。

本明細書で用いる、「増幅試薬」（amplification reagent）は、プライマ、核酸鋳型、及び増幅酵素を除く増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝剤等）を言う。典型的には、増幅試薬は他の反応成分と共に反応容器（テスト管、ミクロウエル等）に置かれ、そして収容される。

PCRでは、ゲノムDNAにおいて特定の標的配列の単一コピーをいくつかの異なる方法により検出可能なレベルまで増幅することが可能である（例えば、標識を付したプローブとハイブリッドさせ；ビオチニル化したプライマを組み込み、続いてアビジン酵素と結合させることにより検出する；dCTP 又はdATPの様な ³²P標識を付したデオキシヌクレオチド三リン酸を増幅された部分に組み込む）。ゲノムDNAの他に、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列も適切なプライマ分子のセットによって増幅することができる。特に、PCRプロセス自身により作られた増幅部分は、それ自身続くPCR増幅のための効果的な鋳型である。

本明細書で用いる、「PCR製品」（PCR product）、「PCRフラグメント」（PCR fragment）及び「増幅製品」（amplification product）はPCRの変性、アニーリング及び伸長の2以上のサイクルが終了した後の結果の化合物の混合物を言う。これらの用語は一以上の標的配列の一以上の部分が増幅された場合を含む。

本明細書で用いる「RT-PCR」（RT-PCR）はRNA配列の複製及び増幅を言う。この方法では、逆転写は、PCRに結合され、その場合非常にしばしば米国特許第5,322,770号に記載の様に熱安定性ポリメラーゼを用いた一つの酵素を用いる手順による。RT-PCRではRNA鋳型はポリメラーゼの逆転写酵素活性によりcDNAに変換され、そしてポリメラーゼの重合活性（すなわち、他のPCR方法の様に）を用いて増幅される。

本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」（restriction endonuclease）及び「制限酵素」（restriction enzyme）は細菌酵素を言い、そのそれぞれが特定のヌクレオチド配列において、又はその近辺で二重鎖DNAを切断する。

「制限部位」（restriction site）はある制限エンドヌクレアーゼにより認識され開裂されるヌクレオチド配列を指し、しばしばDNA断片の挿入部位である。本発明のある実施の態様においては制限部位は操作され選択マーカー及びDNA構築体の5' 及び3'末端に挿入される。

本明細書で用いる「染色体への組み込み」（chromosomal integration）は入ってくる配列が宿主細胞の染色体に導入されるプロセスを指す。形質転換するDNAの相同領域は染色体の相同領域とアラインする。続いて、ホモロジーボックスの間の配列は入ってくる配列によりダブルクロスオーバーで置換される（すなわち、相同的組み換え）。本発明のある実施の態様において、DNA構築体の不活性化染色体セグメントの相同部分はバチルス（Bacillus）染色体の固有の染色体領域の隣接する相同領域とアラインする。そして、固有の染色体領域はDNA構築体によりダブルクロスオーバーで取除かれる（すなわち、相同的組み換え）。

「相同的組み換え」（Homologous recombination）は同一又は同一に近いヌクレオチド配列の部位で2つのDNA分子又はペア染色体の間のDNA断片の交換を言う。好ましい実施の態様においては、染色体の統合は相同的組み換えである。

本明細書で用いる「相同配列」（Homologous sequence）は比較のために最も最適にアラインされた他の核酸又はポリペプチド配列と100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%, 又は70%同一配列を持つ核酸又はポリペプチド配列を言う。ある実施の態様においては、85%から100%の同一の配列を持ち、他の実施の態様においては、 90%から100%の同一配列を持ち、そしてより好ましい実施の態様においては、95%から100%の同一配列を持つ。

本明細書で用いる「アミノ酸」（amino acid）はペプチド又はタンパク質配列又はその一部を指す。「タンパク質」（protein）、「ペプチド」（peptide）及び「ポリペプチド」（polypeptide）の用語は相互交換的に用いられる。

本明細書で用いる、「関心の対象のタンパク質」（protein of interest）及び「関心の対象のポリペプチド」は所望され及び/又は評価されるタンパク質/ポリペプチドを指す。ある実施の態様においては、「関心の対象のタンパク質」は「親タンパク質」（すなわち、出発タンパク質）である。ある実施の態様においては、親タンパク質はタンパク質操作/設計のための出発点として使用される野生型酵素である。ある実施の態様においては、関心の対象のタンパク質は細胞間で発現し、他の実施の態様においては、関心の対象のタンパク質は分泌ポリペプチドである。特に好ましい実施の態様においてはこれらの酵素は本明細書に記載のセリンプロテアーゼ及び金属プロテアーゼを含む。ある実施の態様においては、関心の対象のタンパク質はシグナルペプチドに融合された分泌ポリペプチドである（すなわち、分泌されるタンパク質上のアミノ末端伸張である）。殆んど全ての分泌タンパク質はアミノ末端タンパク質伸張を用い、それは細胞膜に渡り前駆体タンパク質を標的にし、且つ前駆体タンパク質の転座に決定的な役割を果す。この伸張は膜転写の間又はその直後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質分解により除去される。

本明細書で用いる「非相同タンパク質」（heterologous protein）は宿主細胞で自然に生成されないタンパク質又はポリペプチドを指す。非相同タンパク質の例には、プロテアーゼを含むヒドロラーゼの様な酵素を含む。ある実施の態様においてはタンパク質をコードする遺伝子は天然に生ずる遺伝子であり、他の実施の態様においては突然変異の及び/又は合成遺伝子が使用される。

本明細書で用いる「相同タンパク質」（homologous protein）は、細胞中に自然に存在し、又は自然に生ずるタンパク質又はポリペプチドを言う。ある好ましい実施の態様においては細胞はグラム陽性細胞であり、特に好ましい実施の態様においては、細胞はバチルス（Bacillus)宿主細胞である。他の実施の態様においては、相同タンパク質は、これに限定されるものではないが、大腸菌、セルロモナス、バチルス、ストレプトマイセストリコデルマ及びアスペルギルスを含む他の有機体により生成される天然のタンパク質である。本発明は組み換えDNA技術により相同タンパク質を生成する宿主細胞を含む。

本明細書で用いる「オペロン領域」（operon region）は通常のプロモータから単一転写ユニットとして転写される隣接遺伝子のグループを含み、それにより同時制御される。ある実施の態様においては、オペロンは調節遺伝子を含む。もっとも好ましい実施の態様においては、RNAレベルで測定し高度に発現するが未知の又は不必要な機能を持ったオペロンが用いられる。

本明細書で用いる「抗菌領域」（antimicrobial region）は抗菌タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む領域である。

ポリヌクレオチドは、その天然の状態又は当業者に知られている方法により操作された場合、RNA、ポリペプチド又はその断片を生成するために転写され、及び/又は翻訳され得る場合、RNA又はポリペプチドを「コードする」（encode）すると言われる。その様な核酸のアンチセンス鎖はまたその配列をコードすると言われる。

技術分野で知られている様に、DNAはRNAポリメラーゼにより転写され、RNAを生成することができるが、RNAは逆転写酵素により逆転写されDNAを生成することができる。この様にDNAはRNAをコードしその逆も起きうる。

「制御セグメント」（regulatory segment）又は「制御配列」（regulatory sequence）又は「発現制御配列」（expression control sequence）はコードされたアミノ酸配列の発現を実行するためにポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードするDNAのポリヌクレオチド配列に動作可能にリンクされているDNAのポリヌクレオチド配列を指す。制御配列はアミノ酸をコードする動作可能にリンクされているポリヌクレオチド配列の発現を抑制し、抑止し又は促進することができる。

「宿主株」（Host strain）又は「宿主細胞」（host cell）は本発明のDNAを含む発現ベクターに相応しい宿主を指す。

酵素は、もし酵素が対応する野生型細胞で発現されるレベルよりもより高度のレベルで細胞で発現される場合、「過剰に発現される」（overexpressed）と言う。

「タンパク質」（protein）及び「ポリペプチド」（polypeptide）は本明細書では相互交換的に使用される。国際生化学分子生物学連合の命名法委員会の生化学命名法（JCBN）（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)）により定めたアミノ酸の３文字コードが本明細書で用いられる。また、ポリペプチドは遺伝子コードの縮退のため一より多いヌクレオチド配列によりコードされることもある。

「プロ配列」（prosequence）はシグナル配列とプロテアーゼの分泌に必要な成熟プロテアーゼの間にあるアミノ酸配列である。プロ配列の開裂により成熟活性を持つプロテアーゼが生成される。

「シグナル配列」（signal sequence）又は「シグナルペプチド」（signal peptide）の用語は成熟した又は前駆体の形のタンパク質の分泌に参加するヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列を指す。シグナル配列のこの定義は機能的なものであり、タンパク質遺伝子のN-末端部分によりコードされる全てのこれらのアミノ酸配列を含むことを意味し、このアミノ酸配列はタンパク質の分泌に参加する。しかし例外がない訳ではないが、これらはしばしばタンパク質のN-末端部分又は前駆体タンパク質のN-末端部分に結合される。シグナル配列は内因性又は外因性であることもある。シグナル配列は通常タンパク質（例えば、プロテアーゼ）と関連し、又は他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子から生成されることもある。一つの代表的な外因性シグナル配列は、バチルスレンツス（Bacillus lentus）(ATCC 21536)のスブチリシンのシグナル配列の残りの部分に融合されるバチルススブチリス（Bacillus subtilis）のシグナル配列の第一の7つのアミノ酸残基を含む。

「ハイブリッドシグナル配列」（hybrid signal sequence）はその配列の一部が、発現される遺伝子の配列に融合される発現宿主から得られるシグナル配列を言う。ある実施の態様においては合成配列が用いられる。

「実質的に同じシグナル活性」（substantially the same signal activity）の用語は、実質的に発酵培地にプロテアーゼの同じ分泌がなされることによって示される様に、シグナル活性を指し、例えば、発酵培地プロテアーゼのレベルはシグナル配列により提供される発酵培地中の分泌されたプロテアーゼのレベルの少なくとも50%, 少なくとも60%, 少なくとも70%, 少なくとも80%, 少なくとも90%, 少なくとも95%, 少なくとも98%である。

タンパク質又はペプチドの「成熟」形の用語はタンパク質又はペプチドの最終機能形態を指す。例証すると、本発明のNprEプロテアーゼの成熟した形は少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含む。

タンパク質又はペプチドの「前駆体」(precursor)の形は、タンパク質のアミノ酸末端又はカルボニル末端に動作可能にリンクされているプロ配列を持つタンパク質の成熟形を指す。前駆体はまたプロ配列のアミノ酸末端に動作可能にリンクされている「シグナル」配列を持つこともある。前駆体はまた翻訳後活動に関係する追加のポリヌクレオチドを持つこともある（例えば、それから開裂されたポリヌクレオチドはタンパク質又はペプチドの成熟形を残す）。

「天然発生酵素」（Naturally occurring enzyme）及び「天然発生タンパク質」（naturally occurring protein）は天然に見出される配列と同一の非修飾アミノ酸配列を持つ酵素又はタンパク質を指す。天然発生酵素は、天然の酵素、天然に発現された酵素又は特定の微生物に見出される天然の酵素を含む。

「由来する」（derived from)及び「から得られる」(obtained from)の用語は問題となる有機体の株から生成され、又は生成されうる酵素（例えば、プロテアーゼ）のみならず、その様な株から分離された及びその様なDNA配列を含む宿主有機体中で生成されたDNAによりコードされる酵素を指す。さらにこの用語は合成及び/又はcDNA起源のDNA配列によりコードされ、問題となる酵素として識別される特徴を持つ酵素を指す。

この定義の範囲内の「誘導体」（derivative）は誘導体が、野生型、天然、又は親の型と同様の目的に有用であるという限りにおいて、野生型、天然、又は親の型において観察される特徴的なタンパク質分解活性を通常持つ。機能的な酵素の誘導体は、親酵素の一般的特徴を持つ天然、合成又は組み換えにより生成されたペプチド又はペプチド断片を含む。

「機能的誘導体」（functional derivative）の用語は、酵素をコードする核酸の機能的特徴を持つ核酸の誘導体を指す。核酸の機能的誘導体は、本発明の酵素をコードするが、天然、合成又は組み換えにより生成される核酸又は断片を含む。本発明の酵素をコードする野生型核酸は、技術分野で知られている遺伝子コードの縮退に基づく天然の対立遺伝子及び同族体を含む。

2つの核酸又はポリペプチド配列について言う「同一」（identical）の用語は、以下の配列の比較又は解析アルゴリズムの一つを用いて測定され、最大の対応を生むようアラインされた場合に同一である2つの配列中の残基について言う。

「最適のアラインメント」（optimal alignment）は最大％の同一性の評点を与えるアラインメントを言う。2つのアミノ酸、ポリヌクレオチド及び/又は遺伝子配列（適当である場合）に関する「パーセント配列同一性」（Percent sequence identity）、（「パーセントアミノ酸配列同一性」（percent amino acid sequence identity）、「パーセント遺伝子配列同一性」（percent gene sequence identity）及び/又は「パーセント核酸/ポリヌクレオチド配列同一性」（percent nucleic acid/polynucleotide sequence identity）は、配列が最適にアラインされた場合に2つの配列中の同一の残基のパーセントを言う。したがって、80%のアミノ酸配列が同一であるということは2つの最適にアラインされたポリペプチド配列中のアミノ酸の８０％が同一であることを意味する。

２つの核酸又はポリペプチドについて言う「実質的に同一」（substantially identical）の用語は、標準パラメータを用いたプログラム又はアルゴリズム（例えば、BLAST, ALIGN, 及びCLUSTAL）を用いて、参照配列と比べて、少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約７５％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、好ましくは少なくとも約８５％同一、好ましくは少なくとも約９０％同一、好ましくは少なくとも約９５％同一、最も好ましくは少なくとも約９７％同一、好ましくは少なくとも約９８％及び約９９％同一の配列を持つポリヌクレオチド又はポリペプチドを言う。２つのポリペプチドが実質的に同一である一つの印は第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。典型的に、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのポリペプチドが保存置換のみが異なるポリペプチドの場合は実質的に第二ポリペプチドと同一である。2つの核酸配列が実質的に同一である他の印は2つの分子がお互いに厳格な条件（例えば、中程度から高度に厳格な条件の範囲内）においてお互いにハイブリッドすることである。
「分離された」（又は、単離された）（isolated）又は「精製された」（purified）はその元の環境（例えば、もし天然（自然）に発生する場合は自然環境）から取出された材料を言う。例えば、材料は、それが特別の組成物中で、天然に発生する又は野生型有機体に存在する、又は天然に発生する又は野生型有機体から発現して通常存在しない組成物と組み合わされたものよりも、より高い又は低い濃度で存在する場合「精製されている」と言う。例えば、生きている動物中で天然に発生するポリヌクレオチド又はポリペプチドは分離されていないが、天然のシステム中の共存する材料の一部又は全部から分離されている同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは分離されている。ある実施の態様においては、その様なポリヌクレオチドはベクターの一部であり、及び/又はその様なポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であり、及びさらにその様なベクター又は組成物はその自然環境の一部でないと言う意味で分離されている。ある好ましい実施の態様において、例えば、もしそれが電気泳動ゲル又はブロットで本質的に一つのバンドを生成する場合は核酸又はタンパク質は精製されていると言われる。

DNA配列について使用される場合、「分離された」（又は、単離された）（isolated）の用語は自然の遺伝子環境から取出されたDNA配列を言い、したがって、他の異質の又は望まれないコード配列を含まず、そして遺伝子的に操作されたタンパク質の生成システム内の使用に適した形である。その様な分離された分子はその自然環境から分離されたものであり、cDNA 及び遺伝子クローンを含む。本発明の分離されたDNA分子は、それが通常関連する他の遺伝子を含まないが、プロモータ又はターミネータのような天然に発生する5' 及び3'非翻訳領域を含んでも良い。関連する領域を同定することは当業者にとり明らかである(例えば、Dynan及びTijan, Nature 316:774-78, 1985を参照)。「分離されたDNA配列」（isolated DNA sequence）の用語は、代替的にまた「クローンされたDNA配列」（cloned DNA sequence）とも呼ばれる。

タンパク質との関係で用いられる「分離された」（又は、単離された）（isolated）の用語は自然環境以外の条件に見出されるタンパク質を指す。ある好ましい形では、分離されたタンパク質は本質的に他のタンパク質、特に他の相同タンパク質を含まない。分離されたタンパク質はSDS-PAGEにより決定される、10%より高い純度、好ましくは20%より高い純度、さらに好ましくは30%より高い純度を持つ。本発明の他の特徴にはSDS-PAGEにより決定される高度に純粋な形のタンパク質（すなわち、40%より高い純度、60% より高い純度、80%より高い純度、 90%より高い純度、 95%より高い純度、97% より高い純度、さらに99%より高い純度)を含む。

本明細書で用いる「組み合わせ突然変異誘発」（combinatorial mutagenesis）は開始配列の変異体ライブラリーが生成される方法を指す。これらのライブラリーでは、変異体は一組の所定の突然変異から選択される一又は幾つかの突然変異を含む。さらにこれらの方法はランダム突然変異を導入する方法を提供するが、ランダム突然変異は所定の一組の突然変異のメンバーではなかった。ある実施の態様においては、この方法は2000年10月26日出願された米国特許第09/699,250号に規定するものを含む。他の実施の態様においては、組み合わせ突然変異誘発法は商業的に入手可能なキット（例えば、QUIKCHANGE（登録商標）Multisite, Stratagene, La Jolla, CA)を含む。

本明細書で用いる「変異体」（variant）は、前駆体タンパク質（例えば、「親」タンパク質）から一以上のアミノ酸の追加、置換、欠失により誘導されたタンパク質を指す。ある実施の態様においては、変異体は前駆体タンパク質に比べて電荷の変化を含む少なくとも一つの修飾を含む。ある好ましい実施の態様においては、前駆体タンパク質は野生型タンパク質である親タンパク質である。

本明細書で用いる「突然変異体のライブラリー」（library of mutants）はそのゲノムの殆んどで同一であるが、一以上の遺伝子の異なる相同体を含む細胞集団を指す。その様なライブラリーは、例えば、改良された特質を持つ遺伝子又はオペロンを同定するために用いても良い。

本明細書で用いる「開始遺伝子」（starting gene）は、本発明を用いて改良及び/又は改変される関心の対象のタンパク質をコードする関心の対象の遺伝子を指す。

本明細書で用いる「多配列アラインメント」（multiple sequence alignment）及び「MSA」はアルゴリズム（例えば、Clustal W）を用いてアラインされる開始遺伝子の複数の同族体配列を指す。

本明細書で用いる「コンセンサス配列」（consensus sequence）及び「正準配列」（canonical sequence）の用語は特定のタンパク質又は関心の対象となる配列の全ての変異体が比較される原始型アミノ酸配列を指す。この用語はまた関心の対象となるDNA配列中に最もしばしば存在するヌクレオチドを記述する配列を指す。遺伝子の各位置に関しては、コンセンサス配列はMSA中のその位置に最も豊富なアミノ酸を作る。

「コンセンサス突然変異」（consensus mutation）の用語は開始遺伝子の配列とコンセンサス配列の相違を指す。コンセンサス突然変異は開始遺伝子の配列とMSAから得られたコンセンサス配列を比較することにより同定される。ある実施の態様においては、コンセンサス突然変異は開始遺伝子に導入されるため開始遺伝子はコンセンサス配列により一層類似する。コンセンサス突然変異はまた、開始遺伝子中のアミノ酸を、開始遺伝子中のそのアミノ酸の頻度に比較してその位置のMSA中に、より頻繁に見出されるアミノ酸に変えるアミノ酸の変化を含む。したがって、コンセンサス突然変異の用語は、開始遺伝子のアミノ酸をMSA中のアミノ酸よりもより豊富なアミノ酸によって置換する全ての単一アミノ酸の変化を含む。

本明細書で用いる「初期のヒット」（initial hit）の用語は、組み合わせコンセンサス突然変異ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される変異体を指す。好ましい実施の態様においては、初期のヒットは、開始遺伝子に比べて改良された能力を持つ特徴がある。

本明細書で用いる「改良されたヒット」（improved hit）の用語は強化された組み合わせコンセンサス突然変異ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される変異体を指す。

本明細書で用いる「改良する突然変異」（improving mutation）及び「能力を高める突然変異」（performance-enhancing mutation）は、それが開始遺伝子に導入される場合、改良された能力を生み出す突然変異を指す。ある好ましい実施の態様においては、これらの突然変異は本発明の方法のスクリーニングステップの間に同定されたヒットの配列決定をすることにより同定される。殆んどの実施の態様において、ヒットにおいて頻繁に見出される突然変異誘発は、スクリーニングされていない組み合わせコンセンサス突然変異体ライブラリーと比べて改良する突然変異である。

本明細書で用いる「効果を高めた組み合わせコンセンサス突然変異誘発ライブラリー」（enhanced combinatorial consensus mutagenesis library）はCCM突然変異誘発及びスクリーニングの初期の段階のスクリーニング及び/又は配列決定の結果の基づき設計され及び構築されたCCMライブラリーを指す。ある実施の態様においては、効果を高めたCCMライブラリーはCCMの初期の段階で得られた初期のヒットの配列に基づく。さらに他の実施の態様においては、効果を高めたCCMは、突然変異誘発及びスクリーニングの初期の段階の初期のヒットでしばしば観察される突然変異誘発である様に設計される。ある好ましい実施の態様においては、これは、初期のCCMライブラリーで使用される他のプライマと比べて、能力を低減する突然変異をコードするプライマを除去し、又は能力を増大させる突然変異をコードするプライマの濃度を増すことにより実現される。

本明細書で用いる「能力を低減する突然変異」（performance-reducing mutation）はスクリーニングされていない組み合わせコンセンサス突然変異誘発ライブラリーに比べて、スクリーニングされたものから得られたヒットにおいて、より低い頻度で見られる組み合わせコンセンサス突然変異誘発ライブラリー中の突然変異を指す。ある好ましい実施の態様においては、スクリーニングプロセスは「能力を低減する突然変異」を含む大量の変異体を除去し及び/又は低減させる。

本明細書で用いる「機能アッセイ」（functional assay）の用語はタンパク質活性の指標を提供するアッセイを言う。特に好ましい実施の態様においては、この用語はタンパク質がその通常の容量で機能する能力を分析するアッセイシステムを言う。例えば、酵素の場合、機能アッセイは反応を触媒作用する酵素の有効性を決定することを含む。

本明細書で用いる「目標特性」（target property）の用語は改変される開始遺伝子の特性を指す。本発明はある特定の目標特性に限定することを意図するものではない。しかし、ある好ましい実施の態様においては、目標特性は遺伝子製品の安定性（例えば、変性、タンパク質分解又は他の分解要素に対する抵抗力）であり、他の実施の態様においては、生成宿主中の生成レベルが変えられる。事実、開始遺伝子の任意の特性は本発明において使用することが考慮されている。

本明細書で用いる用語「特性」（property）又はその文法上の同等物は、核酸について言う場合、選択され又は検出され得る核酸の任意の特徴又は属性を言う。これらの特性には、ポリペプチドへの結合に影響を与える特性、特定の核酸を含む細胞についての特性、遺伝子転写に影響する特性（例えば、プロモータ強度、プロモータ認識、プロモータ制御、エンハンサー機能）、RNA処理に影響を与える特性（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡ配座、及び転写後修飾）、翻訳に影響を与える特性（例えば、レベル、制御、ｍＲＮＡのリボソームタンパク質への結合、翻訳後の修飾）を含むがこれに限定されるものではない。例えば、核酸の転写因子の結合部位、ポリメラーゼ、制御因子等は所望の特徴を生成し又は望まれない特徴を同定する様に改変しても良い。

本明細書で用いるポリヌクレオチドについて用いられる場合、用語「特性」（property）、又はその文法的な同等物は選択され又は検出され得るペプチドの任意の特徴又は属性を言う。これらの特性には、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性、タンパク質分解に対する抵抗力、K_M, k_cat, k_cat/k_M比、タンパク質折り畳み、免疫反応誘発、リガンド結合能力、受容体結合能力、分泌しうる能力、細胞表面上に表示される能力、オリゴマー化する能力、シグナルを発する能力、細胞増殖刺激能力、細胞増殖抑制能力、アポトーシス誘発能力、リン酸化又はグリコシル化により修飾される能力、疾病を治療する能力を含むがこれに限定されるものではない。

本明細書で用いる「スクリーニング」（screening）の用語は技術分野で用いる通常の意味で用いられ、一般的に複数ステッププロセスである。第一のステップでは突然変異核酸又はその変異ポリペプチドが提供される。第二のステップでは、突然変異核酸又はその変異ポリペプチドの特性が決定される。第三のステップでは、その突然変異核酸を生成するために、決定された特性が対応する親核酸、対応する天然発生のポリペプチドの特性又は開始材料の特性（例えば、初期配列）と比較される。

改変された特性を持つ核酸又はタンパク質を得るためのスクリーニング手順は、突然変異核酸の生成が促進することを意図する修飾の対象である開始材料の特性によることは当業者に明らかである。したがって、当業者は、本発明はスクリーニングの対象を特定の特性に限定するものでなく以下に示す特性は単に例示に過ぎないことを理解するであろう。特定の特性をスクリーニングする方法は一般的に技術分野で明らかである。例えば、変化が改変（alteration）を意味する場合、突然変異の前後の結合、ｐＨ，特異性等を測定することができる。好ましくは、スクリーニングは複数のサンプルが同時にスクリーニングされることを含む高収率の処理が可能な方法で実行され、チップ、ファージ提示法、及び複数基質及び/又は測定器を用いるアッセイを含むがこれに限定されるものではない。

明細書で用いるスクリーニングは、ある実施の態様においては、関心の対象である変異体が変異体集団から濃縮される選択ステップを含む。これらの実施の態様の例には、変異体がその結合又は触媒特性に基づき変異体集団から捕捉されるファージ提示法又は他の任意の提示法のみならず、宿主有機体に成長の利益を与える変異体の選択を含む。ある好ましい実施の態様においては、変異体のライブラリーはストレス（熱、プロテアーゼ、変性）に曝され、そして無傷の変異体はスクリーニングにより同定され又は選択されて濃縮される。この用語は任意の好適な選択方法を含むものである。事実、本発明は特定のスクリーニング方法に限定されるものではない。

本明細書で用いる「標的を定めたランダム化」（targeted randomization）の用語は、ランダム化された一又は幾つかの位置を持つ複数の配列を生成するプロセスを指す。ある実施の態様においては、ランダム化は完全に行われる（すなわち、全ての4つのヌクレオチド、Ａ，Ｔ，Ｇ及びＣはランダムの位置で起きる）。他の実施の態様においては、ヌクレオチドのランダム化は４つのヌクレオチドのサブセットに限定される。標的を定めたランダム化は関心の対象となる一又は幾つかのタンパク質をコードする、配列の一又は幾つかのコドンに適用することができる。発現すると、生成されたライブラリーは一以上のアミノ酸の位置が、ランダム化されたコドンのランダム化スキームにより決定された全ての２０のアミノ酸、又はサブセットのアミノ酸の混合物を含むことのあるタンパク質集団を生成する。ある実施の態様においては、目標を定めたランダム化から得られる集団の個々のメンバーは、標的を定めた、又はランダムに挿入し、又は欠失したコドンのため、アミノ酸の数において異なる。さらに他の実施の態様においては、合成アミノ酸は生成されるタンパク質集団に含まれる。ある好ましい実施の態様においては、標的を定めたランダム化から得られる集団の大半のメンバーは開始遺伝子よりもコンセンサス配列により大きい配列相同性を示す。ある実施の態様においては、配列は関心の対象となる一以上のタンパク質をコードする。他の実施の態様においては、タンパク質は異なる生物学的機能を持つ。ある好ましい実施の態様においては、入ってくる配列は少なくとも一つの選択マーカーを含む。この配列は関心の対象である一以上のタンパク質をコードすることができる。それは他の生物学的機能を持つこともある。多くの場合入って来る配列は抗生物質に耐性を与える遺伝子の様な選択可能なマーカーを含む。

「修飾された配列」(modified sequence)又は「修飾された遺伝子」(modified gene)は、天然発生核酸配列の欠失、挿入、又は中断を含む配列を指し、相互交換的に用いられる。ある好ましい実施の態様においては、修飾された配列の発現生成物は短縮タンパク質（例えば、修飾が配列の欠失、又は中断である場合）である。ある特に好ましい実施の態様においては、短縮されたタンパク質は生物学的活性を維持する。他の実施の態様においては、修飾された配列の発現生成物は細長いタンパク質である（例えば、修飾は核酸配列中への挿入を含む）。ある実施の態様においては、挿入により短縮タンパク質となる（例えば、挿入がストップコドンを形成する場合）。この様に、挿入は、短縮タンパク質又は発現生成物として細長いタンパク質となることもある。

本明細書で用いる「突然変異配列」（mutant sequence）及び「突然変異遺伝子」（mutant gene）は相互交換的用いられ、宿主細胞の野生型配列中に少なくとも一つのコドンの改変を持つ配列を言う。突然変異配列の発現生成物は野生型と比べて改変されたアミノ酸配列を持つタンパク質である。発現生成物は改変された機能的能力（例えば、強化された酵素活性）を持つこともある。

「変異プライマ」（mutagenic primer）又は「変異オリゴヌクレオチド」（mutagenic oligonucleotide） (本明細書において相互交換的に使用される)は鋳型配列の一部に対応し、かつそれとハイブリッドすることの出来るオリゴヌクレオチド組成を指す。変異プライマについて言うと、そのプライマは鋳型核酸と厳密にマッチするものでなく、用いられるプライマ中の一のミスマッチ又は複数のミスマッチは核酸ライブラリーに所望の突然変異を導入するのに用いられる。本明細書で用いる「非変異プライマ」（non-mutagenic primer）又は「非変異オリゴヌクレオチド」（non-mutagenic oligonucleotide）は鋳型核酸と厳密にマッチするオリゴヌクレオチド組成を指す。本発明のある実施の態様においては、変異プライマのみが使用される。本発明の他の好ましい実施の態様においては、プライマは、変異プライマが含まれている少なくとも一つの領域で、またオリゴヌクレオチド混合物に非変異プライマも含まれる様に設計される。変異プライマ及び少なくとも一つの変異プライマに対応する非変異プライマの混合物を加えることにより、種々の組み合わせ突然変異パターンが生ずる核酸ライブラリーを生成することができる。例えば、変異核酸ライブラリーのメンバーの幾つかがある位置で親配列を維持し、他のメンバーはその様な部位で変異することを望む場合、非変異プライマはある残基の核酸ライブラリー内のある特定のレベルの非変異メンバーを得る能力を提供する。本発明の方法は、その塩基の長さが通常10-50塩基、より好ましくは約15-45塩基の間の変異及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかし、所望の突然変異誘発の結果を得るためには１０塩基より短い又は５０塩基より長いプライマを使用することが必要なこともある。対応する変異プライマ及び非変異プライマについて言うと、対応するオリゴヌクレオチドは同一の長さである必要はないが、追加される変異に対応する領域で重複があることが必要である。

ある実施の態様においては、プライマは事前に規定された比率で添加される。例えば、結果のライブラリーが、添加されるプライマの量を調整することにより、かなりのレベルの、ある特定の変異体を持ち、同じ又は異なる部位でより少ない異なる量の変異体をもつことを所望する場合、所望の偏ったライブラリーを生成することが可能である。代替的に、より少量の又はより多量の非変異プライマを加えることにより、変異体核酸ライブラリー中に対応する変異がおきる頻度を調整することができる。

本明細書で用いる「隣接変異」(contiguous mutation)は同じオリゴヌクレオチドプライマ内に現れる変異を言う。例えば、隣接変異体はお互いに隣合わせており又は近接していることもあるが、それらは同じプライマによって結果の変異鋳型核酸に導入される。

本明細書で用いる非隣接変異（discontiguous mutation）は別々のオリゴヌクレオチドプライマに現れる変異を言う。例えば、非隣接変異は別個に準備されたオリゴヌクレオチドプライマにより結果の変異鋳型核酸に導入される。

「野生型配列」（wild-type sequence）又は「野生型核酸配列」（wild-type nucleic acid sequence）及び「野生型遺伝子」（wild-type gene）は、本明細書では相互交換的に用いられ、天然に存在し又は宿主細胞中で自然発生的に生じる配列を指す。ある実施の態様においては野生型配列はタンパク質組み換え計画の開始点である関心の対象である配列を言う。野生型配列は相同タンパク質又は非相同タンパク質をコードすることもある。相同タンパク質はインターベンションなしに宿主細胞が生成するタンパク質である。非相同タンパク質は、インターベンションがない場合には宿主細胞は生成しないタンパク質である。

「酸化に安定的」（oxidation stable）の用語はタンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他のプロセスにおいて存在する条件下で、例えば、漂白剤又は酸化剤に曝され又は接触している条件で、ある一定の時間に亘りある特定量の酵素活性を維持する本発明のプロテアーゼについて言う。ある実施の態様においては、プロテアーゼは、漂白剤又は酸化剤とある一定の時間、例えば、少なくとも1分、３分、５分、８分、１２分、16分、２０分等の間接触した後にそのタンパク質分解活性を少なくとも50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%,又は99%を維持する。

「キレート剤に安定的」(chelator stable)の用語はタンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他のプロセスにおいて存在する条件下で、例えば、キレート剤に曝され又は接触している条件で、ある一定の時間に亘りある特定量の酵素活性を維持する本発明のプロテアーゼについて言う。ある実施の態様においては、プロテアーゼは、キレート剤とある一定の時間、例えば、少なくとも1０分、２０分、４０分、６０分、１００分等の間接触した後にそのタンパク質分解活性の少なくとも50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%,又は99%を維持する。

「熱に安定的」（thermally stable）及び「熱安定的」（thermostable）は、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他のプロセスにおいて存在する条件で、例えば、変更された温度に曝されて、プロテアーゼがある一定の時間に亘りある特定の温度に曝された後にある特定量の酵素活性を維持する本発明のプロテアーゼについて言う。変更された温度には、高い又は低い温度を含む。ある実施の態様においては、プロテアーゼは、変更された温度にある一定の時間、例えば、少なくとも６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分等の間曝した後にそのタンパク質分解活性の少なくとも50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%,又は99%を維持する。

酸化、キレート剤、熱及び/又はｐＨ安定的プロテアーゼについて用いる場合、「安定性の強化された」（enhanced stability）の用語は、他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシンプロテアーゼ）及び/又は野生型酵素に比べて、長時間に亘りより高いタンパク質分解活性が維持されることを言う。

酸化、キレート剤、熱及び/又はｐＨ安定的プロテアーゼについて用いる場合、「安定性の低下した」（diminished stability）の用語は他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシンプロテアーゼ）及び/又は野生型酵素に比べて、長時間に亘りタンパク質分解活性の維持の程度が低いことを言う。

本明細書で用いる「洗浄用組成物」（cleaning composition）は、特に断らない限り、顆粒状又は粉末状汎用又は「強力」(heavy-duty)洗濯剤、特に洗浄洗剤；液体、ゲル、又はペースト状汎用洗濯用剤、特にいわゆる強力液タイプ；液状のきめ細かい織物用洗剤；手洗い用食器洗い用洗剤又は軽質食器洗い用洗剤、特に高泡立ちタイプの食器洗い用洗剤；家庭用及び業務用の種々の錠剤、顆粒、液体及びすすぎ補助タイプを含む機械洗い食器洗い用洗剤；抗菌性手洗いタイプ、洗浄用石鹸、うがい薬、入れ歯洗浄剤、車又はカーペット用シャンプー、フロ洗浄剤を含む液体洗浄剤及び殺菌剤；ヘアシャンプー、及びヘアリンス；シャワーゲル及び泡バス及び金属洗浄剤を含み、並びに漂白用添加剤及び「汚染物用棒」（stain stick）又は事前処理タイプの様な洗浄補助剤を含む。

特に断らない限り、本明細書に記載の成分又は組成物のレベルはすべて、その活性レベルに関して言うものであり、不純物、例えば、市販の商品に存在する残留溶媒又は副生物を除いたものである。

酵素成分の重量は全活性タンパク質に基づく。全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り重量に基づき計算される。全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り全組成に基づき計算される。

本明細書を通じ記載されている各最大限界数値は、その下限数値が本明細書に記載されている様に、各下限値を含んでいると理解される。本明細書を通じ記載されている各最小限界数値は、その上限限界値が本明細書に記載されている様に、各上限値を含んでいることを意図している。本明細書を通じ記載されている各数値範囲は、そのより狭い数値範囲が、全て本明細書に記載されている様に、その様なより広い数値範囲内にある各狭い数値範囲を含む。

「洗浄活性」（cleaning activity）はタンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他のプロセスの間に存在する条件下でプロテアーゼにより達成される洗浄能力を指す。ある実施の態様においては、洗浄能力は、汚れを標準の洗濯条件に付した後に、種々のクロマトグラフィー、分光光度計又は他の数量測定法によって決定される、草、血液、ミルク、又は卵のタンパク質の様な酵素に反応する汚れに関する種々の洗浄アッセイにより決定される。代表的なアッセイには、実施例に記載の方法及びWO 99/34011及び米国特許第6,605,458号に記載のものを含むがこれに限定されるものではない。

プロテアーゼの「洗浄に効果的な量」（cleaning effective amount）は上で述べたプロテアーゼの量を言い、特定の洗浄組成物において所望のレベルの酵素活性を達成する量である。その様な効果的な量は当業者により容易に確認され、また多くの要因、例えば、使用される特定のプロテアーゼ、洗浄方法、洗浄組成物中の特定の組成物、液体又は乾燥（例えば、粒状、棒状）組成物が必要か等に基づく。

本明細書で用いる「洗浄添加材料」（cleaning adjunct material）は特定のタイプの所望の洗浄組成物及び製品の形（例えば、液体、粒状、粉末、棒状、ペースト、霧状、錠剤、ゲル、又は泡組成物）のために選択される任意の液体状、固体状又は気体状材料を指し、その材料はまた好ましくは組成物中で用いられるプロテアーゼ酵素と適合性のあるものが良い。ある実施の態様においては粒状組成物は「コンパクト」な形のものであり、他の実施の態様においては液体組成物は「濃縮された」形である。

洗浄活性について言う場合「強化された能力」（enhanced performance）の用語は、標準の洗濯サイクル及び/又は複数の洗濯サイクルの後に通常の評価により決定される、ある酵素に反応する汚れ、例えば、卵、ミルク、草、血液の汚れに対する向上し又は増大した洗浄活性を言う。

洗浄活性について言う場合「低減した能力」（diminished performance）の用語は標準の洗濯サイクルの後に通常の評価により決定される、ある酵素に反応する汚れ、例えば、卵、ミルク、草、血液の汚れに対する低減し又は低下した洗浄活性を言う。

洗浄活性について言う場合「相対的能力」(comparative performance)は、比較プロテアーゼ（例えば、商業的に入手可能なプロテアーゼ）の少なくとも60%, 少なくとも70%, 少なくとも80% 少なくとも90% 少なくとも95%の洗浄活性を指す。洗浄能力は本発明のプロテアーゼを、標準の洗濯サイクル条件を経た後に、通常の分光光度計又は他の分析測定法によって決定される、血液、ミルク、及び/又はインク（ＢＭＩ）の様な酵素に反応する汚れに関する種々の洗浄アッセイにより他のプロテアーゼと比較することにより決定することができる。

本明細書で用いる「低洗剤濃度」（low detergent concentration）系は洗濯水中に約８００ppmより低い洗剤成分が存在する場合の洗剤を含む。日本の洗剤は通常低洗剤濃度系であると考えられる。その理由は日本の洗剤は洗濯水中に通常約667 ppmの洗剤成分を含むからである。

本明細書で用いる「中程度の洗剤濃度」（medium detergent concentration）系は洗濯水中に約８００ppmから約２０００ppmの間の洗剤成分が存在する場合の洗剤を含む。北米の洗剤は通常洗濯水中に約９７５ppmの洗剤成分が存在するため、一般的に中程度の洗剤濃度系と考えられる。ブラジルの洗剤は通常洗濯水中に約１５００ppmの洗剤成分を含む。

本明細書で用いる「高洗剤濃度」（high detergent concentration）系は洗濯水中に約２０００ppmより大きい洗剤成分が存在する場合の洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は通常洗濯水中に約３０００−８０００ppmの洗剤成分を含むため一般的に高洗剤濃度系と考えられる。

本明細書で用いる「繊維洗浄組成物」（fabric cleaning composition）は、洗浄用添加組成物及び汚れた繊維（例えば、衣服、リンネル、及び他の繊維材料）を浸し及び/又は事前処理するのに適した組成物を含む、手洗い及び/又は機械洗い洗浄組成物を含む。

本明細書で用いる「非繊維洗浄組成物」（non-fabric cleaning composition）は、食器洗浄用組成物、口内洗浄組成物、入れ歯洗浄組成物、パーソナル洗浄組成物を含む非織物（すなわち、非繊維）表面洗浄組成物を含むがこれに限定されるものではない。

本明細書で用いる洗浄組成物の「コンパクト」（compact）な形のものはその密度、及び組成については無機充填塩の量に最も反映される。無機充填塩は粉末形の洗剤組成物に従来用いられる成分である。従来の洗剤組成物では、充填塩は主要な分量、典型的には全組成物の重量の17-35%存在する。対照的にコンパクトな組成物では、充填塩は全組成物の１５％を超えない量で存在する。ある実施の態様においては、充填塩は組成物の重量の１０％を超えない、より好ましくは５％を超えない量で存在する。ある実施の態様においては無機充填塩は硫酸塩及び塩化物のアルカリ及びアルカリ土類金属塩から選択される。好ましい充填塩は硫酸ナトリウムである。

発明の詳細な説明

ある実施の態様において、単一の変異の効果が分析されこれら２つの特性が逆相関する場合においてさえも、本発明は不利な環境条件においてその触媒活性及び安定性を同時に最適化するために酵素を操作する方法を提供する。特に本発明は金属プロテアーゼの表面電荷及び/又は表面電荷分布を変えて、洗剤製剤において改良された能力を示す酵素変異体を得る方法を提供する。

本発明は洗剤製剤において改良された洗濯能力及び/又は安定性を持つ少なくとも一つの変異中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある特に好ましい実施の態様において、本発明はバチルスアミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）中性金属プロテアーゼの変異体を提供する。本発明はこれに限定されるものではないが、特に洗浄、漂白及び殺菌を含む応用に適している。さらに本発明は不都合な環境条件下でその触媒活性を最適化する酵素の操作方法を提供する。特に本発明は洗剤製剤で改良された能力及び/又は安定性を示す酵素変異体を得るために金属プロテアーゼのネット表面電荷及び/又は表面電荷分布を変える方法を提供する。

多くのタンパク質及び酵素は、洗濯洗剤に含まれると変性に非常に反応し及び不可逆的変性を受ける。界面活性剤を水中でのイオン（電荷）特性により分類すると、洗濯洗剤はアニオン性、カチオン性及び非イオン性界面活性剤を含むことが知られている。これらの成分はタンパク質分子の表面電荷と相互に反応し、タンパク質の変性（例えば、構造及び機能の消失）をもたらす。

NprE（中性金属プロテアーゼ）は、ＬＡＳのような界面活性剤を含む洗剤製剤に置かれると不安定となる。ＬＡＳはアニオン性界面活性剤であり、全体のマイナス電荷がタンパク質表面のアミノ酸のプラスに荷電した側鎖との反応を高める。その様な静電相互反応は、静電相互反応の安定性を弱め又は乱すことによりタンパク質の固有の安定性に影響する。安定性を失ったタンパク質は開かれて（unfold）不活性となる。本発明の開発中に酵素の表面電荷は洗濯能力及び/又は洗剤の安定性に極めて大きい影響を与えることが判明した。さらに、プロテアーゼ表面の、電荷を帯びた残基の分布は洗濯能力及び/又は安定性に大きく影響することが判明した。本発明のタンパク質操作法は、ネット表面電荷及び/又は表面電荷分布を最適化することにより洗剤製剤中のプロテアーゼのその能力を向上させるため、一以上の特性において効果的に最適化するものである。

端的に言うと、本発明のある実施の態様においては本方法は関心の対象である酵素中の多くのアミノ酸残基に部位評価ライブラリー（Site Evaluation Library）を生成し、及び関心の対象である特性について変異酵素をアッセイすることを含む。これにより関心の対象となる特性について、最適の電荷の変化（親酵素との比較で）のみならず有益な、中立の及び有害な突然変異を同定することが可能になる。ある代替的な実施の態様においては、全ての残基の電荷を走査して、各部位（例えば、中性残基をプラス及び/又はマイナス電荷に、及び荷電残基を反対の電荷を持つ及び/又は中性残基に突然変異させる）において電荷を変える突然変異を生ずる変異体を生成する。

ある更に好ましい実施の態様においては、この方法は組み合わせ「電荷バランスのとれた」（charge-balanced）変異体のライブラリーを生成することを含み、このライブラリーは所望の方向に酵素の電荷を変える有利な突然変異、及び反体の方向に電荷を変える有利な又は中立の突然変異を含み、そして電荷バランスのとれたライブラリーの関心の対象となる特性をアッセイすることを含む。この様に酵素の表面電荷及び表面電荷分布は同時に最適化され、複数の特性において改良された酵素変異体を同定することが可能である。

本発明の方法はプロテアーゼのみならず種々の種類の酵素（例えば、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、マンナーゼ、リパーゼ等）の能力を改良することができる。事実、本発明は特定の酵素又は酵素の種類を限定するものでない。さらに本発明は特定の表面電荷及び電荷分布を必要とする非酵素タンパク質特性の最適化に用いることができる（例えば、発現、細胞―表面結合、調剤の容易性等）。

改良された特性を持つプロテアーゼ変異体の生成
多数の部位評価ライブラリー（Site Evaluation Library）は成熟タンパク質の各アミノ酸が殆んどの他のアミノ酸により置換されているNprEのために構築された（米国特許出願第10/576,331号及びWO 2005/052146を参照願いたい）。

これらのライブラリーは洗剤の安定性及びＢＭＩ洗浄能力がスクリーニングされた。スクリーニングのデータはその後変異により与えられる電荷の変化の効果について分析がなされた。安定性の増大及び良好なＢＭＩ（血液、ミルク、インキ）洗浄能力はいずれも操作されたNprE変異体において望ましいものであるが、これらは当初お互いに排他的な特性である様に思われた。本発明は良好なＢＭＩ洗浄能力を示すより安定性のある変異体を生成する手段を提供する。

本発明は他のパラメータを過度に犠牲にすることなく高い安定性があり又はより良好なＢＭＩ洗浄能力を示す変異を同定する方法を提供する。本明細書で用いる「過度に不利でない」(unduly unfavourable)の語句は所望の値未満のタンパク質の特性を言う。この用語は中性変異を持つ低い能力のタンパク質（親又は野生型の能力の８０％未満）；有害でない変異を持つ能力の低いタンパク質（５０％未満）；及び有害な変異を持つ本質的に不活性なタンパク質（５％未満）を含む。ある実施の態様においては、相対的能力値は能力指数（ＰＩ）で表され、この指数は変異タンパク質の能力の親タンパク質の能力との比である。その後電荷変異はバランスされ、最終変異体は野生型酵素に比べて＋１から＋３の電荷である。更に本発明は酵素の３Ｄ構造中において非干渉的であり、それにより複数の変異間で非加法性（non-additivity）を最小にする様に見えるアミノ酸残基を選択する手段を提供する。

本明細書に記載の様に、４つのNprE変異体は本発明の方法を用いて構築された。これらの変異体は１０から１８の変異を含んでいた。実施例においてより詳細に記述するが、これらの変異体は野生型酵素に比べて安定性及びＢＭＩ洗浄能力が増大していることを示した。

ＩＩ．有益な酵素変異体の生成のための一般的な方法
本明細書に記載の様に、BMIミクロ材料見本アッセイでの洗濯能力及び酵素の表面の全体の電荷の間の関係が決定された。本発明の方法は種々の酵素及びタンパク質（例えば、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ及び他の酵素）の能力を向上させるために使用することができる。

簡潔に言えば、溶媒に約２５％より多く、約５０％より多く、又は約６５％より多く露出している野生型酵素の表面にあるアミノ酸残基が同定され、各野生型残基が複数の他の天然発生アミノ酸により置換される部位評価ライブラリーが生成される。ある実施の態様においては、分子の表面でのタンパク質の操作は、中性アミノ酸側鎖を酸性又は塩基性側鎖により置換し、及び/又はプラスの電荷を持つ側鎖を中性又はマイナスの電荷を持つ側鎖により置換すること又はその逆の操作を含む。さらに、ＢＭＩで改良された洗濯能力を示す変異酵素のネット電荷の変化がこの構造―機能の関係を規定するものとして注目される。更なる実施の態様においては、ある酵素について最適の電荷が決定されると天然の分離されたものが、最適の電荷及び最適の電荷分布を持つ酵素変異体を同定するためにスクリーニングされる。

ＩＩＩ．改良された特性を持つアミラーゼ変異体の生成
AmyS-S242Qについて、成熟酵素の４つの位置に組み合わせ置換を導入することにより組み合わせ電荷ライブラリーが構築された。このライブラリーはBODIPYデンプン加水分解、米デンプンミクロ材料見本洗浄能力、及び酵素発現のためにスクリーニングされた。その後スクリーニングデータは変異により起こった電荷の変化の効果が分析された。操作されたAmyS-S242Q変異体においてはタンパク質発現及び良好な酵素の能力の増加が望ましい。しかしこれらの特性は逆相関することが判明した。本発明は良好な米デンプン洗浄能力を示す、より高度に発現された変異体を生成する手段を提供する。この様に本発明は過度に他のパラメータを犠牲にすることなく発現又は酵素活性を増大させる変異を同定する手段を提供する。

実験
以下の実施例は本発明のある好ましい実施の態様及び特徴を示し及び説明するために提供するものであって本発明の範囲を限定するものでとして理解してはならない。

以下に開示される実験においては、以下の略称が用いられる：
℃（摂氏度）；ｒｐｍ（分当り回転数）；Ｈ_２Ｏ（水）；ＨＣＬ（塩酸）；aa及びAA（アミノ酸）；ｂｐ（塩基ペア）；ｋｂ（キロベースペア）；ｋＤ（キロダルトン）ｇｍ（グラム）；μｇ及びuｇ（ミクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；nｇ（ナノグラム）；μｌ及びυｌ（ミクロリットル）；ml (ミリリットル); mm (ミリメータ); nm (ナノメータ); μm 及び um (ミクロメータ); M (モルの); mM (ミリモルの); μM及び uM (ミクロモルの); U (単位); V (ボルト); MW (分子量); sec (秒); min(s) (分); hr(s) (時間); MgCl₂ (塩化マグネシウム); NaCl (塩化ナトリウム); OD₂₈₀ (280 nmの光学濃度); OD₄₀₅ (405 nmの光学濃度); OD₆₀₀ (600 nmの光学濃度); PAGE (ポリアクリルアミドゲル電気泳動法); EtOH (エタノール); PBS (リン酸緩衝生理食塩水 [150 mM NaCl, 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2]); LAS (ラウリル硫酸ナトリウム); SDS (ドデシル硫酸ナトリウム); Tris (トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン); TAED (N,N,N'N'-テトラアセチルエチレンジアミン); BES (スルホンポリエステル); MES (2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物; f.w. 195.24; Sigma # M-3671); CaCl₂ (無水塩化カルシウム; f.w. 110.99; Sigma # C-4901); DMF (N,N-ジメチルフォルムアミド, f.w. 73.09, d = 0.95); Abz-AGLA-Nba (2-アイノベンゾイル-L- アラニルグリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4-ニトロベンジルアミド, f.w. 583.65; Bachem # H-6675, VWR catalog # 100040-598); SBGl % ("Super Broth with Glucose"; 6 g Soytone [Difco], 3 g イースト抽出、6 g NaCl, 6 g グルコース)；pHは、技術分野で知れらている方法を用いて殺菌前にNaOHによって７．１に調整された；
; w/v (重量対容積); v/v (容積体容積); Npr及びnpr (中性金属プロテアーゼ); SEQUEST（登録商標） (SEQUEST データベースサーチプログラム、, University of Washington); Npr及びnpr (中性金属プロテアーゼ遺伝子); nprE 及びNprE (バチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ); PMN (精製されたMULTIFECT（登録商標）金属プロテアーゼ); MTP (マイクロタイタープレート);MS (質量分光法); SRI (汚れ除去指数); TIGR (ゲノム調査機構（The Institute for Genomic Research）
, Rockville, MD); AATCC (米国繊維化学者・色彩技術者協会（American Association of Textile and Coloring Chemists)）; Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); Beckman (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); EMPA (スイス材料検査及び試験協会（Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt）, St. Gallen, Switzerland); CFT (材料試験センター（Center for Test Materials）、Vlaardingen, The Netherlands); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); Perkin-Elmer (Perkin-Elmer, Wellesley, MA); Rainin (Rainin Instrument, LLC, Wobura, MA); Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg, Germany); Waters (Waters, Inc., MiIf ord, MA); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL 又はGibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Epicentre (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI); Zymo Research (Zymo Research Corp., Orange, CA); Integrated DNA Technologies (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA): New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ); Thermoelectron (Thermoelectron Corp., Waltham, MA); BMG (BMG Labtech, GmbH, Offenburg, Germany); Greiner (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria); Novex (Novex, San Diego, CA); Finnzymes (Finnzymes OY, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medical Instrumentation or GMI (Global Medical Instrumentation; Ramsey, MN); MJ Research (MJ Research, Waltham, MA); Infors (Infors AG, Bottmingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, UK); TOM (Terg-o-Meter); BMI (blood, milk, ink); BaChem (BaChem AG, Bubendorf, Switzerland); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA); MicroCal (Microcal, Inc., Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); NCBI (National Center for Biotechnology Information); GE Healthcare (GE Healthcare, UK).
実施例１
アッセイ
以下に記載のアッセイが以下に述べる実施例で実施された。以下に記載の手続きからの逸脱部分については実施例に記載する。これらの実験では反応の終了後に形成された製品の吸光度の測定に分光光度計を用いた。材料見本の反射率の測定には反射率計を使用した。

Ａ．タンパク質含有量の決定
１．タンパク質含有量決定のためのＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイ
これらのアッセイでは、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）スケール上でプロテアーゼサンプル中のタンパク質濃度の決定にBCA (Pierce)アッセイが用いられた。このアッセイシステムでは使用された化学品及び試薬溶液は：
BCA タンパク質アッセイ試薬及びPierce Dilution 緩衝液 (50 mM MES, pH 6.5, 2mM CaCl₂, 0.005% TWEEN（登録商標）-80)である。

使用された機器はSpectraMAX (type 340) MTP リーダーであり、MTPはCostar (type 9017)製であった。

テストでは、200 μl BCA試薬が各ウエルにピペットで採られ、続いて20 μl希釈緩衝液が加えられた。十分攪拌後にＭＴＰは３７℃で30分培養された。空気の泡が除去され、各ウエル内の溶液の吸光度（ＯＤ）が５６２nｍで計測された。タンパク質濃度を決定するため、このサンプルの計測数値よりノイズ数値が差し引かれた。ＯＤ₅₆₂値がタンパク質標準（精製タンパク質）についてプロットされ、標準曲線が得られた。サンプルのタンパク質濃度が標準曲線から推定された。

２．タンパク質含有量決定のためのBradfordアッセイ
このアッセイでは、Bradford染料試薬(Quick Start)アッセイがMTPスケールでプロテアーゼサンプル中のタンパク質濃度を決定するために用いられた。

このアッセイシステムでは、次の化学品及び試薬溶液が使用された：Quick Start Bradford Dye Reagent (BIO-RAD Catalog No. 500-0205), 希釈緩衝液 ( 10mM NaCl, 0.1 mM CaC12, 0.005% TWEEN（登録商標）-80)。使用された機器はBiomek FX Robot (Beckman) 及び SpectraMAX (タイプ 340; 分子用機器：Molecular Devices) MTPリーダーである。MTPはCostar 製(type 9017)である。

試験では200 μl Bradford 染料試薬が各ウエルにピペットで採られ、続いて15 μl 希釈緩衝液が加えられた。最後に10 μl ろ過培養液がウエルに加えられた。

十分攪拌後にＭＴＰは３７℃で少なくとも10分培養された。空気の泡が除去され、各ウエル内の溶液の吸光度（ＯＤ）が５９５nｍで計測された。

タンパク質濃度を決定するため、このサンプルの計測数値よりノイズ数値（すなわち、非接種ウエルから）が差し引かれた。得られたOD₅₉₅ 値はサンプル中のタンパク質含有量の相対的測定値を提供する。

Ｂ.プロテアーゼの能力をテストするためのミクロ材料見本
使用した機器はEppendorf Thermomixer及びSpectraMAX (type 340：分子装置) MTPリーダーを含む。MTPはCostar (type 9017)製であった。

洗剤の調製（(TIDE（登録商標） 2X Ultra, Clean Breeze液体洗濯洗剤 (Procter & Gamble); 米国洗濯条件）
Milli-Q水が6 gpgの硬度(Ca/Mg=3/1)に調製され、0.78 g/1 TIDE（登録商標）2X Ultra, Clean Breeze洗剤が加えられた。洗剤は製剤中に存在する全ての酵素を不活性にするために1時間９５℃で事前に予備加熱された。洗剤溶液は15分攪拌された。その後5 mM HEPES（遊離酸）が加えられ、ｐＨが８．２に調整された。

ミクロ材料見本
0.25インチ円状直径のミクロ材料見本はCFT Vlaardingenから得た。材料見本を切断する前に、織物(EMPA 116)が水で洗濯された。一つのミクロ材料見本が各９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに置かれた。

試験方法
所望の洗剤溶液が上に述べた様に生成された。Thermomixerを25°Cで平衡させた後、190 μlの洗剤溶液がＭＴＰのミクロ材料を含む各ウエルに加えられた。この混合物に10 μlの希釈酵素溶液が添加され、最終酵素濃度がlμg/ml（ＢＣＡアッセイにより決定）とした。ＭＴＰはテープでシールされ培養器に30分間置かれ、１４００ｒｐｍで攪拌された。適当な条件下で培養するのに続いて、各ウエルから100 μlの溶液が採られ新たなＭＴＰに移された。各ウエル100 μlの溶液を含む新しいMTPはMTP SpectraMaxリーダーを用いて405nmで読み取られた。ミクロ材料見本及び洗剤を含むが酵素を含まない実験対照（コントロール）及び何も含まない対照（ブランクコントロール）も含んでいた。

米デンプンミクロ材料アッセイ
ＢＭＩの能力の計算
得られた吸光度は空試験値（すなわち、酵素の存在しない場合のミクロ材料見本を培養した後に得た）に対比し修正された。得られた吸光度は試験された酵素の加水分解活性の測定値を与えるものであった。

TIDA(登録商標）安定性アッセイ
野生型及び変異プロテアーゼの安定性が２５％の熱処理されたTIDA(登録商標）２x Ultra Clean Breeze液体洗濯洗剤中でので培養ステップを経た後に測定された。当初及び残留活性が以下に述べるAGLAアッセイ、蛍光９６ウエルプレートリーダー、培養器/振とう器(iEMS; Thermoelectron)及び培養器/振とう器(Innova; New Brunswick (type 4230)）を用いて決定された。MTPはCostar (type 9017)及びGreiner (black plates, type 655076)製であった。

化学品及び試薬
このアッセイシステムで使用された化学品及び試薬溶液は以下の通りである：
TIDE（登録商標） 2x Ultra Clean Breeze
125 g のTIDE（登録商標）2x Ultra Clean Breeze (上と同じく95°Cで熱処理)を50 gの50 mM HEPES pH 8.2及び275 ml 水の混合したものに溶解させた；TIDE（登録商標）の濃度は上澄み25 % (以下に"TIDE（登録商標）"と呼ぶ)で希釈した後27.7%であった。

MES 希釈緩衝液
52.6 mM MES/NaOH, 2.6 mM CaCl₂, 0.005% TWEEN（登録商標）80, pH 6.5
AGLA基質
BaChem, Catalog No. H-6675又はAmerican Peptide Co., Catalog No. 81 -0-31
AGLA基質溶液
16 ml N,N ジメチルフォルムアミド（dimethylformamide）に溶解させた451 mgのAGLA；この溶液は304 mlのMES緩衝液 (52.6 mM MES/NaOH, 2.6 mM CaCl₂, 0.005% TWEEN（登録商標）-80, pH 6.5)に攪拌しつつ注いだ。

試験方法
ストレスのない条件
まず、20 μl ろ過培養液が180 μl MES 希釈緩衝液により希釈された。その後20 μl のこの希釈培養駅が180 μl MES希釈緩衝液により希釈された。その後に 10 μl のこの希釈培養駅が25℃で事前に暖められたプレートで190 μl AGLA-基質溶液で希釈された。全ての空気泡が取り払われそしてプレートがAGLA プロテアーゼアッセイ手順に従い測定された。

ストレスのある条件
まず20 μl ろ過培養液が180 μl TIDE（登録商標）洗剤溶液で希釈されiEMS振とう器中で５分事前混合された後にさらにInnova 振とう器で培養した。プレートは３２℃で、２００rpmで回転振動しつつ全６０分の間培養された。さらに20 μl ろ過培養液が180 μl TIDE（登録商標）洗剤溶液で希釈されiEMS振とう器中で５分事前混合された後にさらにInnova 振とう器で培養した。プレートは２０℃で、２００rpmで回転振動しつつ全４０分の間培養した。その後20 μlのこれらの溶液のいずれかが180 μl MES希釈緩衝液で希釈され、そして10 μlのこの希釈液は25℃で事前に暖められたプレートで190 μl AGLA-基質溶液で希釈された。全ての空気泡が取り払われそしてプレートがAGLA プロテアーゼアッセイ手順に従い測定された。

計算
蛍光測定が励起350 nm及び放射415 nmで行われた。蛍光分光光度計用ソフトが相対蛍光単位（RFU)ミリ/分の線形回帰線に従って各ウエルの蛍光の増加の反応速度を計算した。

残留活性のパーセント：（ストレス条件の傾き）＊１００/（ストレスない条件の傾き）
D. アミノベンゾイル−L−アラニングリシル−L−ロイシン−アラニノー４−ニトロベンジルアミドプロテアーゼアッセイ(Abz-AGLA-Nba)
以下に述べる方法は、時間と場所に係わりなく再現可能なプロテアーゼアッセイデータを与えるあるレベルの技術の詳細を提供する。このアッセイは与えられた実験室条件に適合させることができるが、変更された手順により得られたデータは全てもとの方法により得られる結果と調整させねばならない。

中性金属プロテアーゼは２−アミノベンゾイル−L−アラニングリシル−L−ロイシン−アラニノー４−ニトロベンジルアミドプロテアーゼアッセイ(Abz-AGLA-Nba)のグリシンとロイシンの間のペプチド結合を切り離す。溶液中の自由な２−アミノベンゾイル−L−アラニングリシル（2-aminobenzoyl-L- alanylglycine (Abz-AG)）は４１５nmで最大蛍光放射を持ち、励起の最大は340nmである。Abz-AGの蛍光は無傷のAbz-AGLA-Nba分子中でニトロベンゼンアミドにより消光（quench）される。

これらの実験では、プロテアーゼによるAbz-AGLA- Nbaの開裂によりAbz-AGの放出が蛍光分光計によりモニターされた(励起340 /放射415)。Abz-AGの出現速度はタンパク質分解活性の測定の尺度となる。アッセイは非基質限定初期速度条件で行われた。

温度制御付のマイクロプレートミキサー(例えば、Eppendorf Thermomixer)が再現可能なアッセイの結果を得るために必要であった。アッセイ溶液が酵素を加える前にマイクロプレートミキサー中で所望の温度（例えば、２５℃）に培養された。酵素の溶液がミキサー中のプレートに加えられ、強く混合されそして迅速にプレートリーダーに移された。

連続してデータを記録し及び温度制御と共に線形回帰分析する能力を持つ分光光度計が必要であった（例えば、SpectraMax M5, Gemini EM, Molecular Devices)。リーダーは常に所望の温度（例えば、25℃)に維持された。リーダーは最高の蛍光検出に設定され、そしてカットオフフィルタを使用しないで、励起は350 nm及び放射は415 nmに設定された。PMTが中程度の感度に設定され各ウエルについて５度の計測を行った。自動校正を作動させたが、校正は最初の計測前にのみ行った。このアッセイはモニター対象に選定されるウエルの数に従い計測間隔を最小にして３分計測した。リーダーは分当たりのミリーRFUの速度（分当たりの相対蛍光単位の千分の一）を計算するように設定された。速度(Vmax ポイント)の計算に使用された計測の数は計測間隔により決定される、２分に等しい数に設定された（例えば、計測が１０秒毎に行われる場合は速度を計算するために１２ポイントが必要である）。最大のRFUは50,000に設定された。

酵素及び基質原液用の全てのピペットは容積式ピペット(Rainin Microman)を用いた。緩衝液、アッセイ及び酵素希釈標準溶液は単一又は複数チャンネル空気置換ピペット(Rainin LTS)を用いて管、試薬容器又は原液マイクロプレートからピペットで採った。僅かの数のウエルのみが使用される場合は、試薬のロスを最小にするためアッセイ溶液をマイクロプレートウエルに移す場合、繰り返しピペット(Eppendorf)が有用である。自動化されたピペット器具、例えば、Beckman FX又はCybio Cybi−ウエルはまた、同時に全部のマイクロプレートに植菌するために作業原液マイクロプレートからアッセイマイクロプレートに酵素溶液を移す場合に有用である。

試薬及び溶液
52.6 mM MES/NaOH, 2.6 mM CaCl₂, pH 6.5 − MES緩衝液
MES酸 (10.28 g) 及び292 mg 無水CaCl₂が約900mLの精製水に溶解された。

溶液はNaOH滴下によりpH 6.5にされた(25℃で又は温度調整ｐＨプローブにより)。ｐＨ調整緩衝液が全１Ｌ容量にされた。最終溶液は0.22 μm無菌フィルターを通してろ過され室温に維持された。

DMF中の48 mM Abz-AGLA-Nba - Abz-AGLA-Nba原液
約28 mgのAbz-AGLA-Nbaが小さな管に入れられ、ＤＭＦ（容量は集められたAbz-AGLA-Nbaにより変わる）で溶解され数分間攪拌された。溶液は光から遮断され室温で保存された。

50 mM MES, 2.5 mM CaCl₂, 5% DMF, 2.4 mM Abz-AGLA-Nba pH 6.5 -
アルファ溶液
１mL Abz-AGLA-Nba原液が19 mL MES 緩衝液に加えられ攪拌された。溶液は光から遮断され室温で保存された。

50 mM MES, 2.5 mM CaCl₂, pH 6.5 -酵素希釈緩衝液
この緩衝液は5 mL精製水を95 mL MES緩衝液に加えて生成された。

50 mM MES, 2.5 mM CaCl₂, 5% DMF, pH 6.5 −基質希釈緩衝液
５mL の純粋なDMFが95 mL MES 緩衝液に加えられた。この緩衝液は反応速度パラメータを決定するために用いられた。

酵素溶液
酵素原料溶液が酵素希釈緩衝液により1 ppm (1 mg/mL)濃度に希釈された。

MULTIFECT（登録商標）中性プロテアーゼ(野生型NprE)が6 ppm (6 mg/mL)より低い濃度に希釈された。連続した希釈が好ましい。溶液は室温で1時間安定的であったが、長く保存するために氷上で保存された。

手順
まず全ての緩衝液、原液及び希釈標準溶液が準備された。特に断らない限り各酵素希釈液剤は3回アッセイされた。まったく一杯というわけではないが、酵素希釈標準溶液原料マイクロプレートがプレートの左から（プレートリーダーを収めるために）垂直解カラムを満たす様に準備された。対応するアッセイプレートは同様ｊに設定された。マイクロプレート蛍光光度計が先に述べた様に設定された。

まずアッセイ溶液200 mL量が９６ウエルマイクロプレートのウエルに入れられた。プレートは光から遮断された状態で温度制御されたマイクロプレートミキサーにおいて25℃で10分培養された。アッセイは、10 uLの試験用酵素溶液を原料マイクロプレートからミキサーのアッセイマイクロプレートに移すことから始めた。任意選択的に９６ウエルピペットヘッドが用いられ又はある実験では８ウエル複数チャネルピペットがまず左端カラムから移すために用いられた。溶液は１５秒強く混合された(Eppendorf Thermomixer中で900rpm)。直ちにアッセイマイクロプレートがマイクロプレート蛍光光度計に移され、励起350nm及び放射415nmで蛍光測定の記録を始めた。蛍光光度計用ソフトが各ウエルについて傾向の増加の反応速度を分当たりミリーＲＦＵの線形回帰線により計算した。ある実験では、第二のプレートは温度の平衡のためにマイクロプレートミキサーに置かれ一方第一のプレートの表示が読まれた。

当初速度の割合は0.3 mMまでの製品濃度（すなわち、放出された２アミノベンゾイル蛍光）に関して線形であり、これはAbz-AGLA-Nba で開始する溶液中の約50,000 RFU に対応しバックグラウンド蛍光が約22,000 RFUであった。. Abz-AGLA-NbaはＤＭＦで溶解され準備された当日に使用された。

実施例２
バチルススブチリスにおけるNprEの生成
この実施例では、バチルススブチリスでNprEプロテアーゼを生成する実験について述べる。特にバチルススブチリスにpUBnprEプラスミドを形質転換するために用いられる方法について述べる。形質転換は技術分野で知られた方法で実施された（例えば、WO 02/14490及び米国特許出願第11/581,102号を参照）。以下に記載するDNA配列（バチルスアミロリケファシエンス由来のnprE リーダー, nprE プロ（pro）及びnprE成熟DNA配列）はNprE前駆体タンパク質をコードする：

上の配列において太字は成熟NprEプロテアーゼをコードするDNAを示し、標準フォントはリーダー配列(nprE リーダー)を示し、下線部分はプロ配列(nprE プロ)を示す。以下に示すアミノ酸配列(NprEリーダー, NprE プロ及びNprE成熟DNA配列) （配列番号２）は完全長NprEタンパク質に対応する。この配列では下線部分はプロ配列を示し太字は成熟NprEプロテアーゼを示す。

成熟NprE配列は配列番号3として記載する。この配列はこの明細書に記載する変異体ライブラリーを生成するベースとして用いられた。

pUBnprE発現ベクターは、2つの特異プライマを用いて、ＰＣＲによりバチルスアミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の染色体DNAからnprE遺伝子を増幅することにより構築された。

ＰＣＲはPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼを用いて熱サイクラー上で実施された（フィンザイム(Finnzyme)）。ＰＣＲ混合物は10 μl 5x緩衝液(Finnzymes Phusion)、lμl 10mM dNTP, 1.5μl DMSO, 各プライマーlμl、lμl Finnzymes Phusion DNA ポリメラーゼ, lμl 染色体DNA 溶液50ng/μl, 34.5 μl MiIIiQ 水を含んでいた。使用されたＰＣＲ手順は以下の通りである：
ＰＣＲ手順：
1) 30 秒98°C；
2) 10秒98°C；
3) 20秒55°C；
4) 1 分 72°C;
5) 2 から4のステップを25サイクル;
6) 5 分72°C.；
この結果1.9 kb DNA断片が生成され、このDNA断片はBgIII及びBcII DNA制限酵素を用いて消化された。複数コピーバチルスベクターpUBl10 (例えば、Gryczan, J. Bacterid., 134:318-329 [1978]を参照)はBamHIにより消化された。ＰＣＲ断片ｘBgIIIｘBcII はその後pUB110 x BamΗIベクター中で結紮されpUBnprE発現ベクターを形成した。

pUBnprE はバチルススブチリス(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)株に形質転換された。バチルススブチリスへの形質転換はWO 02/14490に記載の様に実施された。pUBnprEベクターを宿すバチルススブチリス形質転換体の選択的成長は、20 mg/L ネオマイシンにより、25 ml MBD媒体（定義されたMOPSベースの媒体）を含む振とうフラスコでなされた。MBD媒体は、NH₄Cl₂, FeSO₄ 及びCaCl₂が塩基媒体から除かれたこと、3 mM K₂HPO₄ が用いられたこと、及び塩基媒体に60 mM 尿素、75 g/Lグルコース、及び1 % ソイトン（soytone）が追加されたことを除いては本質的に技術分野で知られた方法により生成された（Neidhardt他、J Bacteriol, 1 19: 736-747 [1974]を参照)。また、微量栄養素は、100Ｘ原液として、１リットル中に400 mg FeSO₄.7H₂O, 100 mg MnSO₄.H₂O, 100 mg ZnSO₄.7H₂O, 50mg CuCl₂.2H₂O, 100 mg CoCl₂.6H₂O, 100 mg NaMoO₄.2H₂O, 100 mg Na₂B₄O_7.10H₂O, 10 mlの１M CaCl₂,及び10 ml の0.5 Mクエン酸ナトリウムを含むものであった。

培養液は培養器/振とう器(Infors)で37℃で3日間培養された。この培養により、プロテアーゼアッセイにより示されたタンパク質分解活性を持つ分泌NprEプロテアーゼが生成された。ゲル分析がNuPage Novex 10% Bis-Tris ゲル (Invitrogen, Cat.番号NP0301BOX)を用いて実施された。分析のためのサンプルを準備するため、２容量の上澄が、１容量の１M HCl、１容量の4xLDS サンプル緩衝液 (Invitrogen, Cat.No. NP0007)、及び1% PMSF (20 mg/ml)と混合され、その後に70℃で10分加熱された。

その後、各サンプル25 μLが、10 μLのSeeBlue プラス2 つの事前に染色された標準(Invitrogen, Cat.No.LC5925)と共にゲルに導入された。この結果は、この実施例に記載のNprEクローン戦略は、バチルススブチリス中で活性を持つNprEを生成するのに適していることを明確に示した。

実施例３
部位評価ライブラリー（ＳＥＬ）の生成
この実施例においてはnprE SELsの構築で使用される方法が記述される。

上に述べたnprE発現カセットを含む、pUBnprEベクターがテンプレートDNAとして使用された。このベクターは独特のBglII制限部位を含み、これは部位評価ライブラリー構築（site evaluation library construction）において使用された。端的に言えば、nprE部位評価ライブラリーを構築するために、３つのＰＣＲ反応が実施され、その2つは突然変異生成ＰＣＲであり、突然変異させた関心の対象のコドンを成熟nprE DNA配列に導入し、3つ目のＰＣＲは、成熟nprE配列に所望の突然変異されたコドンを含むUBnprE発現ベクターを構築するために、2つの突然変異ＰＣＲを融合させるために用いる。

突然変異誘発の方法は、コドンー特異の突然変異アプローチに基づくものであり、特異DNAトリプレット中で全ての可能な突然変異を同時に生成するが、特異にデザインされたトリプレットDNA配列NNS (Ｎ＝A,C,T又は G、Ｓ＝C 又はG)を囲む２５から４５のヌクレオチドの長さを持つ前進（forward）及び逆(reverse)オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施された。NNSは突然変異されるコドンの配列に対応し、そしてその特異nprE成熟コドンにヌクレオチドをランダムに組み入れることを保証するものであった。

プライマー名称に記載の数は特異nprE成熟コドンの位置に対応する。評価された部位は以下を含む：4, 12, 13, 14, 23, 24, 33, 45, 46, 47, 49, 50, 54, 58, 59, 60, 65, 66, 87, 90, 96, 97, 100, 186, 196, 211, 214, 228 及び280。プライマ配列の代表的なリストは米国特許出願第11/581,102号に記載されている。

部位評価ライブラリーを構築するために使用される追加の2つのプライマーは、BglII制限部位に隣接して位置するpUBnprE DNA配列の一部分と共にBglII制限部位を含んでいた。これらのプライマーは、Invitrogen (脱塩、50 nmol スケール)により生成された。

pUB-Bglll-FW GTCAGTCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACC (配列番号6); 及び
pUB-Bglll-RV GTCTCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTC (配列番号7).
各SELの構築は、pUB-BgIII-FWプライマー及び特異nprE逆突然変異誘発プライマーを用いて2つの主PCR増幅により開始された。第２のPCRではpUB-BgIII−Rvプライマー及び特異nprE前進突然変異誘発プライマー（前進及び逆突然変異プライマーのための同等nprE 成熟コドンの位置が使用された。

成熟nprE配列中での突然変異の導入は、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes; Cat. No. F-530L)を用いて実施された。全てのPCRはポリメラーゼと共に供給されFinnzymesが示す手順により実施された。主PCRの条件は：
主PCR１：
pUB-BgIII-FW プライマー及び特異NPRE 逆突然変異誘発プライマー −共に1 μL (10 μM) ;
主PCR２：
pUB-BgIII-FW プライマー及び特異NPRE 前進突然変異誘発プライマー −共に1 μL (10 μM) ;及び
5 x Phusion HF 緩衝液 10 μL
10 mM dNTP混合物 1 μL
Phusion DNAポリメラーゼ 0.75 μL (2 単位/ μL)
DMSO, 100% l μL
pUBnprE テンプレートDNA l μL (0.1 - l ng/ μL)
精製された, オートクレーブ水 50 μLまで
PCRプログラムは以下の通りであった：
30秒98℃, 30x (10 秒 98℃°C, 20 秒 55℃, 1,5分 72℃)及び5 分72℃、PTC-200 Peltier 熱サイクル（MJ Research）で実施。

PCRの実験により、約2から3 kBの2つの断片が生成され、これらは関心の対象であるNPRE成熟コドンの周囲に約30ヌクレオチド塩基が重なるものである。断片は、前記の2つの断片及び前進及び逆行BglIIプライマーを用いて第3のPCR反応で融合された。この融合PCRは以下の溶液を用いて実施された：
pUB-BgIII-FW プライマー及び pUB-BgIII-RV プライマー−共に1 μL (10 μM)及び
5 x Phusion HF 緩衝液 10 μL
10 mM dNTP混合物 1 μL
Phusion DNAポリメラーゼ 0.75 μL (2 単位/ μL)
DMSO, 100% 1 μL
主PCR 1 反応ミックス 1 μL
主PCR ２反応ミックス 1 μL
精製された, オートクレーブ水 50 μLまで
PCR融合プログラムは以下の通り：
30秒98℃, 30x (10 秒 98℃, 20 秒 55℃, 2.40分 72℃)及び5 分72℃、PTC-200 Peltier 熱サイクル（MJ Research）で実施された。

増幅された線状6.5 Kb断片は、Qiaquick（登録商標）PCR精製キット
(Qiagen, Cat. No. 28106)を用いて精製され、融合断片の両端に付着端を生成するためにBgIII制限部位で消化された：
- 35 μL 精製線状DNA 断片
- 4 μL REACT（登録商標）３緩衝液 (Invitrogen)
- 1 μLBglII, 10 単位/ml (Invitrogen)
反応条件：1時間、30℃
BgIIIによる消化及びQiaquick（登録商標）PCR精製キット(Qiagen, Cat. No
. 28106)を用いて精製された断片の結紮により、所望の突然変異を含む環状及び多重結合DNAが生成された：
- 30μL 精製BglII消化DNA 断片
- 8 μL T4 DNAリガーゼ緩衝液 (Invitrogen（登録商標）Cat. no. 46300-018)
- 1 μL T4 DNA リガーゼ, 1 単位/μL (Invitrogen（登録商標）Cat. No.15224-017)
反応条件：16-20時間、16℃
その後、結紮された混合物はバチルススブチリス(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)株に形質転換された。バチルススブチリスへの形質転換は、WO 02/14490に記載の様に実施された。各ライブラリーについて、９６単一コロニーが採取され、配列分析(BaseClear)及びスクリーニングの目的のために、ネオマイシン及び1.25 g/L イーストエキスを含むMOPS媒体中で成長させた。各ライブラリーは最大19 nprE部位特異変異体を含んでいた。

変異体は、バチルススブチリスSEL形質転換体を９６ウエルMTPで20 mg/L ネオマイシン及び1.25 g/Lイーストエキスを含むMBD媒体中で37℃の温度で68時間成長させることにより生成された。

実施例４
QUICKCHANGE（登録商標）突然変異誘発法による変異プロテアーゼの生成
本明細書に記載のこれらの方法は関心の対象となる他の酵素のSELの生産に適している（例えば、Asp)がこの実施例では、nprE SELを生成する他の方法について述べる。

上の実施例３の様に、nprE発現カセットを含むpUBnprEベクターはnprE SEL及びNprE変異体生成のためのテンプレートDNAソースとしての役目を果たした。二つの方法の主な違いは、この方法では、相補的部位特異突然変異プライマーを用いて全ベクターの増幅をすることが必要であることである。

材料
pUBnprEベクターを含むバチルス株
Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen cat # 12143)
容易に溶解するリゾチーム（Ready-Lyse Lysozyme）（エピセンターcat # Rl802M）
dam メチラーゼキット(New England Biolabs cat # M0222L)
チモクリーンゲルDNA（Zymoclean Gel DNA ）回収キット(Zymo Research cat # D4001)nprE部位特異的突然変異プライマー、100nモルスケール、5'リン酸化され、PAGEにより精製されたもの(Integrated DNA Technologies, Inc.)
QuikChange（登録商標）複数部位特異的突然変異キット(Stratagene cat # 200514)
MJ Research PTC-200 Peltier 熱サイクラー (Bio-Rad Laboratories)
1.2% 寒天E-ゲル (Invitrogen cat # G5018-01)
TempliPhi 増幅キット(GE Healthcare cat # 25-6400-10)
コンピテントバチルススブチリス細胞 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA- comK)
方法
一つの突然変異（上の実施例４及び米国特許出願第11/581,102号に記載の様に、nprE SELにより同定される）を含むpUBnprEプラスミドを得る為に、関心の対象となる各バチルス株単一コロニーが5ml LB + l0ppm ネオマイシン管（例えば、開始培養液）に植菌するために用いられた。培養液は37℃で、225ｒｐｍで6時間振とうさせて成長させた。その後、100 mlの新しいLB + l0ppmネオマイシンが１mlの開始培養液により植菌された。この培養液は、225rpmで振とうさせつつ37℃で一夜成長させた。この培養に続いて、細胞ペレットを得るために十分な遠心分離を行うことにより細胞ペレットが収集された。細胞ペレットは10 ml 緩衝液Pl (Qiagen Plasmid Midi Kit)中で再けん濁された。その後l0ulのReady-Lyse Lysozymeが再けん濁細胞ペレットに添加され、37℃で30分間培養された。細胞培養液の増加させるためである10ml の緩衝液P2及びP3を使用してQiagen Plasmid Midi Kitの手順が続けられた。単一nprE変異を含む各pUBnprEプラスミドがバチルス（Bacillus）から分離された後各プラスミドの濃度が決定された。プラスミドはその後製造者の指示に従いdam Methylase Kit (New England Biolabs)を用いてdamメチル化され一つの管当り約2 ug のpUBnprEプラスミドがメチル化された。チモクリーンゲルDNA（Zymoclean Gel DNA）回収キットがdam メチル化されたpUBnprE プラスミドを精製し及び濃縮するために用いられた。dam メチル化されたpUBnprEプラスミドは数値化され、その後各50ng/ulの作業濃度に希釈された。混合された部位特異突然変異誘発プライマが各反応のため別個に準備された。例えば、pUBnprE T14R プラスミドを鋳型ソースとして用いて、混合された部位特異突然変異誘発プライマ管は10 μl のnprE-S23R, 10 μl nprE-G24R, 10 μl nprE-N46K, 及び10 μl nprE-T54R (全てのプライマは各10 μM)を含む。QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（多部位特異突然変異誘発キット）(Stratagene)を用いたPCR反応が以下の製造者指示に従い実施された（例えば、一つの突然変異を含む1 μl damメチル化されたpUBnprE プラスミド(50 ng/μl), 2 μl nprE 部位特異突然変異誘発プライマ(10 μM), 2.5 μl 10x QuikChange Multi Reaction 緩衝液, 1 μl dNTP Mix, 1 μl QuikChange Multi 酵素ブレンド(2.5U/μl),及び17.5 μl 蒸留加圧滅菌水で全反応混合物量で25 μlとなる)。

nprE変異体ライブラリーは、以下の条件を用いて増幅された：95℃, 1分 (第一のサイクルのみ), 続いて95℃で1分, 55℃ で1分, 65℃で13.5分及びサイクルを23度繰り返した。

反応生成物は4℃で一夜保存された。その後、反応混合物は、以下の製造者の手順を用いてDpnl 消化処理が行われ (QuikChange 複数部位特異的突然変異キット（Multi Site-Directed Mutagenesis Kit）を用いて)親 pUBnprE プラスミドが消化された(すなわち、1.5μl Dpnl 制限酵素が各管に加えられ、37℃で3時間培養され； 2μl のDprcl-消化PCR 反応が1.2% E-ゲル上で分析され、PCR 反応が機能しており、親テンプレートが分解されていることが確認された。)その後、製造者の定める手順に従い、TempliPhiローリングサークル増幅法が、nprE多変異体のライブラリーサイズを大きくするため、多量のDNAを生成することに用いられた（すなわち、1μl Dpnl で処理されたQuikChange PCR Multi Site-Directed Mutagenesis) PCR, 5ul TempliPhi サンプル緩衝液, 5ul TempliPhi 反応緩衝液及び0.2μl TempliPhi 酵素ミックス、11μl までの全反応量; 30℃で3 時間培養）TempliPhi 反応物は200μl の添加により希釈され、オートクレーブ水を加えて、短時間攪拌した)。

その後、1.5μlの希釈TempliPhi材料がコンピテントバチルススブチリス細胞中に形質転換され、及びnprE 多変異体がLA + l0ppm ネオマイシン + 1.6% スキムミルクプレートを用いて選択された。コロニーが取出され、そして異なるnprE変異体ライブラリーの組み合わせを同定するために配列決定された。

表４−１はこれらの実験で用いられたプライマの名称、及び配列を表す。統合されたDNA技術により全てのプライマが合成された（100nmスケール、５’リン酸化、及びPAGE精製による）。更なる突然変異誘発プライマについては米国特許出願第1 1/581,102号に記載がある）。

含まれる評価部位は次の通り：4, 12, 13, 23, 45, 49, 50, 54, 59, 60, 65, 82, 90, 1 10, 1 19, 128, 129, 130, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 151 , 152, 155, 179, 190, 197, 198, 199, 204, 205, 214, 216, 217, 218, 219, 220, 221 ,222, 224, 243, 244, 260, 261 , 263, 265, 269, 273, 282, 285, 286, 289, 293, 296, 297 及び299。

実施例５
変異プロテアーゼの発現、発酵、精製及び特性評価
この実施例では、先行する実施例の形質転換されたバチルススブチリスで発現されたプロテアーゼを発現、発酵及び精製するために用いられる方法について述べる。

組み換えバチルススブチリス（Bacillus subtilis)が培養液において通常のバッチ発酵により培養された。バチルスアミロリケファシエンス（Bacillus中性金属プロテアーゼを含むバチルススブチリス（Bacillus subtilis)培養液のグリセロール瓶が200 mg/Lクロラムフェニコールを含む600 ml SBG 1%培養基を植菌するのに用いられた。培養液は３７℃で36-48時間成長させ、その後培養液は技術分野で知られている様に12,000 rpmの遠心分離によって回収された。この手順は2度行われた。48時間培養したものについて最終的に得られた酵素の濃度は約1.4及び2 g/Lであった。37℃で36時間培養後に、発酵液は回収され12,000 rpmで遠心分離された (SORVALL（登録商標）遠心分離器モデル RC5B)。分泌された中性金属プロテアーゼは培養液から分離されBES (ポリエーテルスルホン膜) 10 IcDa 遮断を備えたAmiconろ過システム8400により約10倍に濃縮された。

濃縮された上澄は、pH 5.4の、10 mM NaClを含む2 5 mM MES緩衝液中で温度4℃で一夜透析された。透析物はその後、以下に記載のカチオン交換カラムPorous HS20 (全容量〜83 mL; 結合能力〜4.5g タンパク質/mL カラム; Waters)に投入された。カラムはpH 5.4の、10 mM NaClを含む2 5 mM MES緩衝液で事前平衡された。その後約200-300 mLのサンプルがカラムに装入された。結合されたタンパク質は、1 0-カラム容量の5.4から 6.2 の傾斜のpHのMES緩衝液を用いて溶出させた。タンパク質の溶出はpH 5.8から6.0の間であり、本明細書に記載の様にタンパク質分解活性及び10 % (w/v) NUPAGE（登録商標）SDS-PAGE (Novex)を用いて評価された。その後、中性プロテアーゼを含む部分が集められた。ｐHを5.8に調整する前にカルシウム及び塩化亜鉛が比率3:1で加えられた。タンパク質精製にはPerceptive Biosystems BIOCAD（登録商標）Vision (GMI)が使用された。

10 % (w/v) NUPAG（登録商標）SDS-PAGEを用いて評価された精製されたタンパク質は、95％より高純度であり均質であることが確認された。典型的には精製調剤は、基質スクシニル-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L- Phe-p-ニトロアニリド (Bachem)による標準プロテアーゼアッセイを用いて評価した時、無視できるレベルのセリンプロテアーゼ活性を示した。このアッセイは10 mM CaCl₂及び0.005 % TWEEN（登録商標）80を含む100 mM Tris-HCl緩衝液を用いてマイクロタイタープレート（MTP)フォーマット（９６ウエル）で行われた。基質(p-AAPF NA)が、DMSO (ジメチルスルホキシド) (100 mg/ml)中で160 mM原液を作りこの原液をCaCl₂ 及び0.005 % TWEEN（登録商標）-80を含むTris-HCl緩衝液で100倍に希釈することにより準備した。その後10 μLの希釈プロテアーゼ溶液（希釈は10mMのCaCl₂ 及び0.005 % TWEEN（登録商標）-80を含む100mM Tris-HCl緩衝液、ｐH8.5を用いて準備した）が190 μL 1 mg/ml p-AAPF NAに加えられた。アッセイは5分混合され410nmでの運動の変化が2から5分亙り計測された。反応傾斜が測定されセリンプロテアーゼ活性を測る指標として用いられた。

タンパク質は、塩化亜鉛1 mM、塩化カルシウム及び40 % のプロピレングリコールを含むpH 5.8のMES緩衝液25 mMを用いて保存用に製剤された。

実施例６
プロテアーゼ活性及び安定性に対する突然変異の効果の平衡
この実施例では2つの競合する酵素特性を最適化するために操作された複数置換プロテアーゼ変異体について記載する。

表６−１は電荷の変化の計算方法を示す：

本発明の開発中に確認された様に、安定性の中央発現値はプラスの電荷が増えると低下した。しかし、ＢＭＩ洗浄能力はプラスの電荷が増えると増大した。試験での条件において最適なBMI洗浄能力は約＋１の電荷の変化により達成された。

強化された安定性及びBMI洗浄能力は、NprEの操作された変異体では望ましい。しかしこれらの特性は対立する特性である様に思われる。本発明の開発中に確認された様に、本発明の方法を用いて単一変異を選択的に組み合わせることによりBMI洗浄能力をひどく損なうことなくよりより安定した変異体を生成することが可能である。本発明に記載の戦略は、第一の特性（例えば、安定性を主要特性として）が改良された複数置換されたNprE変異体を上手に生成するために用いることができ、他方第二の特性（BMI洗浄能力を第二の特性として）を改良し又は犠牲にすることがない。特に以下の基準が関心を対象である置換を選択するために用いられた。過度に他のパラメータを犠牲にすることなく洗剤の安定性を高め又はBMI洗浄能力を高める変異体が選択された。さらに電荷の変異がバランスされ、最終的な変異体は野生型酵素にくらべて+ 1から+3の電荷である。さらに３−D構造で非干渉に見えるアミノ酸残基は複数の変異体間の非加法性を最小にする。

本発明の開発中に確認された様に、4つの変異体が構築されその各々は１０から１８の置換を持つ。これらの変異体は表６−３に示す。重要なことは、これらの複数置換変異体は野生型酵素に較べて洗剤安定性及び同様な洗浄能力を増大させているということである。これはBMI洗浄能力に大きく不利益を与えないマイナス及び中性電荷安定性を持つ変異体を導入し、過度に安定性に影響を与えないプラスの電荷の能力を持つ変異とバランスさせることにより達成された。更に追加の変異体の組が構築された。各組の最初のものはBMI洗浄能力を低減させる安定性を与えるマイナス電荷の変異を持ち、各組の第2のものは野生型のレベルより安定性を維持しつつBMI洗浄能力を回復させる補償的なプラスの電荷の変異を持つ。これらの変異体の洗浄能力及び安定性の値も表６−４に記載する。

実施例７
アミラーゼ活性及び発現に対する変異効果の平衡
この実施例では2つの競合する酵素特性が複数のアミノ酸置換を導入することにより同時に最適化することができることを示す。

この実施例では、バチルスステアロテルモフィルス（Bacillus stearothemophilus)アルファアミラーゼ（またAmySとも言う）、AmySの切断型変異体（２９アミノ酸の欠失を持つS242Q、また本明細書でS242Qとも言う）、バチルススブチリス（Bacillus subtilis)でそれらの変異体を生成する実験を実施した。形質転換は技術分野で知られている方法で行った（例えば、WO 02/14490を参照)。簡潔に言えば、親アミラーゼをコードする遺伝子がpHPLT発現ベクターにクローンされ、同ベクターはLAT プロモータ (PLAT)、LAT シグナルペプチド (preLAT)をコードする配列を含んでおり、続いてPstl及びHpal制限部位でクローンされる。

AmyS- S242Q CCL1の生成
AmyS-S242QプラスミドDNAが形質転換されたバチルススブチリス（Bacillus subtilis）株（遺伝子型：ΔaprE, ΔnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo)から分離され、CCL構築の鋳型としてDNA2.0 Inc.に送られた。 DNA 2.0 Inc. (Mountain View, CA) に対してAmyS-S242Q (S242Q)アミラーゼの4つの部位の各々に、位置ライブラリーを生成する様要請された。変異体は９６ウエルプレートでグリセロール原液として供給された。

AmyS S242Q組み合わせ電荷ライブラリー(combinatorial charge library)は以下の4つの残基Gln-97, GIn 319, GIn 358,及びGIn 443を同定することにより設計された。4つの部位の、８１のメンバーCCLが各部位で3つの可能性を全て組み合わせて作られた（野生型、アルギニン、又はアスパラギン）。

イタリックで示した置換アミノ酸を持つ成熟切断型S242Qアミラーゼのアミノ酸配列が本明細書に示す変異体ライブラリーを作るベースとして用いられた：

アミラーゼの発現−2mlスケール
AmyS, S242Q 又はAmyTS23t発現ベクターを含むバチルススブチリス（Bacillus subtilis）クローンがグリセロール原料を150 μl of LB媒体 + 10 μg/ml ネオマイシンを含む９６ウエル培養プレートに入れたものからスチール製９６ウエル複製器により複製され、湿気を与えた密封した中で220ｒｐｍ、37℃で一夜成長させた。一夜媒体から100 μlを採り5mlプラスチック管中に2000 μl の内容の明らかな媒体 + l0μg/ml ネオマイシンを接種するのに用いた。培養媒体はMOPS緩衝液に基づく濃縮された準定義済みの媒体であり、尿素を主要な窒素源とし、グルコースを主要な炭素源とし、強力に細胞を成長させるために1% ソイトーン（soytone）及び5 mMカルシウムで補強された。

培養管は37°C, 250 rpmで72時間培養された。この培養に続いて培養液は３０００ｘｇで10分間遠心分離された。上澄み溶液は15 mlポリプロピレン円錐状管に移され、80 μLの各サンプルがタンパク質の数量を確認のため96 ウエルプレートに採られた。

抗体滴下によるアミラーゼ濃度の決定
本明細書に記載の様に、アルファ−アミラーゼの濃度及び比活性度が抑制多クローン抗体の滴定により決定された。バチルスステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のアルファ−アミラーゼ(AmyS)対する多クローン抗体はAmyS及びバチルス種由来のアルファアミラーゼＴＳ２３の強い抑制作用を持つことが判明した（例えば、結合は活性ロスの線形滴定を作りだすほどに堅いものである）。したがって、この抗体は酵素の濃度を測定するために用いることができ、その濃度は更に比活性度を計算する点に使用される。端的に言えば、幾つかの知られている抗体濃度により生成される酵素抑制量が測定される。この情報から完全な抑制に必要な抗体濃度が推定される、それはサンプル中の酵素濃度に等しい。アルファ−アミラーゼ活性及び抑制は蛍光BODIPYデンプンアッセイを用いて測定された。緩衝液は0.005% Tween-80を含む50 mM MOPS, pH 7.0であった。

精製されたAmySに対する多クローン抗体はウサギで育てられ標準的な方法により精製された。経験的な抗体原料液の「見掛け濃度」（apparent concentration）は既知の比活性度を持つAmySサンプルの抑制度を測定することにより決定された。その後抗体サンプルがAmyS及びTS23t 変異体の濃度及び比活性度を決定するために用いられた。これらの値は正規化された９６ウエル酵素原料プレートを作るために用いられ、そこでは全ての変異体が共通の濃度に希釈された。

アミラーゼ活性の決定のためのBodipyデンプンアッセイ
Bodipy（有機ホウ素色素）デンプンアッセイをEnzChek（登録商標）Ultra Amylase Assay Kit (E33651, Invitrogen)を使用して行った。DQ デンプン基質の1 mg/mL原液が100 μLの50mM、pH4.0の酢酸ナトリウム中の凍結乾燥された基質を含む小瓶の内容量を溶解することにより作られた。小瓶が約20秒撹拌され、暗室に、室温で置かれ、溶解するまで時々混合された。900 μLのアッセイ緩衝液 (2.6 mM CaCl₂ pH 5.8を含む50 mM酢酸ナトリウム)が加えられそして小瓶は約20秒撹拌された。基質溶液は４℃で使用可能になるまで、暗室に、室温で保存された。アッセイのため、DQ基質の希釈標準溶液100 μg/mLがアッセイ緩衝液中の1 mg/mL基質溶液から作られた。190 μLの100 μg/mL基質溶液が96-ウエル平底マイクロタイタープレートの各ウエルに添加された。10 μLの酵素サンプルがウエルに加えられ、800 rpmでサーモミキサーを用いて30秒混合された。緩衝液及び基質のみを含む（酵素を含まない）ブランクサンプルがアッセイに含まれていた。蛍光強度の変化率が蛍光マイクロタイタープレートリーダーで２５℃で5分間測定された（励起：485nm、蛍光：520nm）。

アルファ−アミラーゼ結合
アミラーゼ変異体がＣＳ−２８米デンプンミクロ材料見本と共に又はそれを使用せずに標準洗濯条件で30分培養された。遊離型酵素の量がBodipyデンプンアッセイにより測定された。ミクロ材料見本に結合している酵素の割合が以下の様に計算された：結合された割合＝（材料見本が存在しない場合の酵素活性−材料見本が存在する場合の酵素活性）/（材料見本が存在しない場合の酵素活性）。

結果
本発明の開発中に確認された様に、AmyS-242Qの中央発現値はプラスの電荷が増えると低下した。しかし、特定のBodipyデンプン加水分解はプラスの電荷が増えると増大した。強化された組み換えアミラーゼの発現及びデンプンの加水分解は、例えば、燃料エタノール産業又は洗剤を使用する洗浄におけるデンプン液化にとり好適なAmyS-242Qの操作された変異体では望ましい。しかしこれらの特性は競合する特性である様に思われる。本発明の開発中に確認された様に、本発明の方法を用いて単一変異を選択的に組み合わせることによりデンプンの加水分解をひどく損なうことなくより高度に発現されたアミラーゼ変異体を生成することが可能である。本明細書に記載の戦略は、第一の特性（例えば、発現を主要特性として）が改良された複数置換されたAmyS-242Q変異体を生成しそして選択するために上手に用いることができ、他方第二の特性（デンプンの加水分解を第二の特性として）を改良し又は犠牲にすることがない。

更に、AmyS-242Q変異体の中央発現値に対して、米デンプンミクロ材料見本洗浄力はプラスの電荷が増大すると増大した。強化された組み換えアミラーゼ発現及び洗浄能力はAmyS-242Qの操作された変異体において望ましいものである。しかし、これらの特性はまた競合する特性である様に思われる。本発明の開発中に確認された様に、本発明の方法を用いて単一変異を選択的に組み合わせることにより洗浄能力をひどく損なうことなくより高度に発現されたアミラーゼ変異体を生成することが可能である。本明細書に記載の戦略は、第一の特性（例えば、発現を主要特性として）が改良された複数置換されたAmyS-242Q変異体を生成しそして選択するために上手に用いることができ、他方第二の特性（米デンプンの加水分解を第二の特性として）を改良し又は犠牲にすることがない。

特に、電荷を持った残基を１から４置換した組み合わせを持つ変異体を含む８０員数のAmyS-242Q電荷組み合わせライブラリー（ＣＣＬ）が振動管での発現、BODIPY-デンプン加水分解及び米デンプン洗浄活性が試験された。AmyS-S242Qの勝者を表７−１及び７−２に示す。重要なことは、表７−１の複数置換された変異体は親酵素に比べて同等又は改良された発現、及び同等又は改良されたBODIPY-デンプン加水分解力を持つことである。同様に、表７−２の複数置換された変異体は親酵素に比べて同等又は改良された発現及び同等又は改良された米デンプン洗浄活性を持つ。

以上を纏めると、酵素活性及び酵素生産力は異なる電荷に依存するため(図2A, 2B, 3A及び3Bを参照)、それらは逆相関する(図1A 及び1Bを参照)。しかし、両方の発現及び活性で改良が見られる多くの変異体があり、この方法によりライブラリーを分析することによりそれらを同定することができる。

アミラーゼによって説明したが、この方法は他の種類の酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、トランスフェラーゼ、及びペクチナーゼにも適用することができる。更に任意の2以上の特性、例えば、発現、活性、結合度、熱安定性、洗剤及び/又はキレート安定性を組み合わせたものを同時に分析することができる。

本明細書に記載の全ての特許、刊行物はこの発明が関係する技術分野の当業者の水準を示すものである。

その技術分野の当業者であれば、本発明に固有のものに限らず、本発明を、本明細書に記載の目的を実施するために容易に改変されうることを、直ちに理解し、本明細書に記載の目的と利益を達成するであろう。本明細書に記載の組成物、方法は好ましい実施の形態の代表例であり、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。本発明の範囲及び精神から離れることなく種々の置換、修飾を加えることは当業者にとって容易なことである。

本明細書に説明により記載された発明は、特にそこで記載されていない要素、限定が含まれていない場合においても適切に実施しうると考える。用いられた用語、及び表現は記載のために用いられるもので、限定の意味に解してはならない。そのようは用語及び表現は、その特徴を持つ同等物及びその部分を除外するものではない、しかし、本発明の特許請求の範囲内において種々の修飾が可能であることを認識すべきである。このように、本発明は、好ましい実施の形態及び任意選択された特徴により特に開示されたものであるが、本明細書に開示された概念の、修飾及び変形は当業者により実施が可能であり、したがって、そのような修飾及び変形は特許請求の範囲に記載された、本発明の範囲内であると解される。

本発明は、広く又一般的な表現により記載されている。一般的な開示に含まれるより狭い範囲の種類、亜属のグループの夫々もまた本発明の部分を構成する。したがって、これは、排除された材料が特に本明細書に記載されているか否かを問わず、その属からあるものを除外するという条件又は否定的限定を持つ本発明の一般的な記載についても同様に適用される。

Claims

配列番号3に規定するアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼ中の位置と同等の位置に少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ単離された中性金属プロテアーゼ変異体。
前記少なくとも一つの置換は配列番号３に規定するアミノ酸配列８３の位置と同等の位置に作られる、請求項１の単離された中性金属プロテアーゼ変異体。
前記置換はＬ８３Ｋである、請求項２の単離された中性金属プロテアーゼ変異体。