KR20100031669A - 단백질 성능을 향상시키는 방법 - Google Patents

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볼프강 애레
루이스 구스타보 카스카오-페레이라
주니어 제임스 티 켈리스
앤드류 쇼
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다니스코 유에스 인크.
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Abstract

본 발명은 관심있는 특정 환경 조건 하에 단백질의 성능을 최적화하도록 단백질을 조작하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 특정 환경 조건 하에 효소의 촉매 활성을 최적화시키기 위해 효소를 조작하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 출발 또는 모체 (parent) 효소와 비교해 세제 제형에서 향상된 성능이 증명된 변이체를 수득하기 위해, 효소 (예를 들어, 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제) 의 순 표면 전하 및/또는 표면 전하 분포를 변경하는 방법을 제공한다.
효소 변이체

Description

단백질 성능을 향상시키는 방법 {METHODS FOR IMPROVING PROTEIN PERFORMANCE}
관련 출원에 관한 교차 참조
본 출원은 그 전체가 참조로써 본원에 삽입된, 2007 년 6 월 6 일에 출원된 미국 가출원 특허 일련 번호 제 60/933,307 호, 제 60/933,331 호, 및 제 60/933,312 호를 우선권으로 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 관심있는 특정 환경 조건 하에 단백질의 성능을 최적화하도록 단백질을 조작하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 특정 환경 조건 하에 효소의 촉매 활성을 최적화시키기 위해 효소를 조작하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 출발 또는 모체 (parent) 효소와 비교해 세제 제형에서 성능이 향상되었음을 나타내는 효소 변이체를 수득하기 위해, 효소 (예를 들어, 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제) 의 순 표면 전하 및/또는 표면 전하 분포를 변경하는 방법을 제공한다.
그의 자연 환경 외부에서 단백질 기능의 특성이 종종 차선이 된다. 예를 들어, 효소 (예를 들어, 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 등) 는 세 탁 세제에서 직물의 오염물을 세정하는데 종종 사용되며, 이는 전형적으로 활성 성분의 복잡한 조합물을 포함한다. 사실상, 대부분의 세정 제품은 계면활성제 시스템, 표백제, 세척 강화제 (builder), 거품 억제제 (suds suppressor), 오염물-현탁화제 (soil-suspending agent), 방오제, 형광 증백제, 유연제, 분산제, 염료 이동 억제 화합물, 연마제, 살균제, 및 방향제, 뿐만 아니라 세정용 효소를 포함한다. 따라서, 현재 세제의 복잡성에도 불구하고, 부분적으로는 차선의 효소 성능으로 인해, 완전히 제거하기 어려운 오염물이 많이 있다. 효소 개발에 있어서의 많은 연구에도 불구하고, 특정 용도 및 조건에 대해 단백질을 조작하는 방법이 당업계에서 필요하다. 실제로, 시판에서 그의 성능을 최적화하기 위해 다른 정전기적 특성을 빠르게 그리고 시스템적으로 맞추는 방법이 당업계에 필요하다. 특히, 향상된 활성, 안정성, 및 용해성을 세정액에 제공하기 위해, 리파아제, 아밀라아제, 큐티나아제, 만나아제, 산환환원효소, 셀룰라아제, 펙티나아제, 프로테아제, 및 기타 효소를 포함하나 이에 제한되지 않는 산업상 유용한 효소를 조작하는 방법이 당업계에 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 관심있는 특정 환경 조건 하에 단백질의 성능을 최적화하도록 단백질을 조작하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 특정 환경 조건 하에 효소의 촉매 활성을 최적화시키기 위해 효소를 조작하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 출발 또는 모체 (parent) 효소와 비교해 세제 제형에서 성능이 향상되었음을 나타내는 효소 변이체를 수득하기 위해, 효소 (예를 들어, 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제) 의 순 표면 전하 및/또는 표면 전하 분포를 변경하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 특정 효소 내, 단백질에서 전하 치환하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 향상된 세정력을 갖는 효소를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다양한 효소, 뿐만 아니라 다른 단백질을 조작하는데 사용된다. 특히, 본 발명은 세정 (예를 들어, 세탁, 접시, 경질 표면 등) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 산업에서 사용되는 향상된 효소의 개발에 사용된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 효소 또는 단백질에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 모체 중성 메탈로프로테아제 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기를 치환시켜, 더욱 양성인 전하 또는 더욱 음성인 전하를 갖는 중성 메탈로프로테아제 변이체를 수득하는 것을 포함하는, 모체중성 메탈로프로테아제와 비교해 향상된 세정력을 갖는 중성 메탈로프로테아제 변이체의 생성 방법을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 오염을 제거하는 모체 효소 및 변이체 효소의 능력을 비교함으로써, 변이체의 세정력을 테스트하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 모체 효소의 세정력은 1.0 의 값으로 주어지고, 향상된 세정력을 갖는 변이체는 1.0 초과의 값을 달성한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 향상된 세정력을 갖는 변이체를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 모체중성 메탈로프로테아제는 중성 메탈로프로테아제의 야생형 성숙 형태이다. 일부 다른 구현예에서, 변이체는 바실라세아에 (Bacillaceae) 중성 메탈로프로테아제로부 터 유래된다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체는 바실러스 (Bacillus) 중성 메탈로프로테아제로부터 유래된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 세정력은 pH 가 6.5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트된다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에서 테스트된다. 일부 대안적인 바람직한 구현예에서, 모체중성 메탈로프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 50% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다. 일부 추가의 바람직한 구현예에서, 모체중성 메탈로프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, 모체중성 메탈로프로테아제와 비교해 향상된 세정력을 갖는 중성 메탈로프로테아제 변이체의 생성 방법을 제공한다 : 모체중성 메탈로프로테아제 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기를 치환시켜, 모체 효소와 비교해 더욱 양성인 전하 또는 덜 음성인 전하를 갖는 중성 메탈로프로테아제 변이체를 수득하는 단계 ; 모체중성 메탈로프로테아제 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기를 치환시켜, 모체 효소와 비교해 더욱 음성인 전하 또는 덜 양성인 전하를 갖는 중성 메탈로프로테아제 변이체를 수득하는 단계. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 추가로, 오염을 제거하는 모체 효소 및 변이체 효소의 능력을 비교함으로써, 변이체의 세정력을 테스트하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 모체 효소의 세정력은 1.0 의 값으로 주어지고, 향상된 세정력을 갖는 변이체는 1.0 초과의 값을 달성한다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 방법은 향상된 세정력을 갖는 변이체를 생성하는 것을 포함한다. 임의의 적합한 순서로 상기 단계를 수행하고자 한다. 일부 구현예에서, 모체중성 메탈로프로테아제는 중성 메탈로프로테아제의 야생형 성숙 형태이다. 일부 다른 구현예에서, 변이체는 바실라세아에 중성 메탈로프로테아제로부터 유래된다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체는 바실러스 중성 메탈로프로테아제로부터 유래된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 세정력은 pH 가 6.5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트된다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에서 테스트된다. 일부 대안적인 바람직한 구현예에서, 모체중성 메탈로프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 50% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다. 일부 추가의 바람직한 구현예에서, 모체중성 메탈로프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다. 일부 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기는 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 치환되며, 한편 다른 구현예에서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되고, 일부 추가의 구현예에서, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 염기성 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 다양한 치환의 조합이 제공된다. 추가의 구현예에서, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기는 하나 이상의 산성 아미노산 잔기로 치환되고, 한편 다른 구현예에서, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되고, 더욱 추가의 구현예에서, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 산성 아미노산로 치환된다. 더욱 추가의 구현예에서, 모체중성 메탈로프로테아제 내 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔 기로 치환되어, 모체 효소와 비교해 동일한 전하를 갖는 중성 메탈로프로테아제 변이체가 수득된다. 본 발명은 임의의 특정 치환 조합에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 치환은 임의의 특정 순서로 수행되는 것이다.
본 발명은 하기를 포함하는, 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기를 치환시켜, 모체 효소와 비교해 더욱 양성인 전하 또는 더욱 음성인 전하를 갖는 세린 프로테아제 변이체를 수득하는 것을 포함하는, 모체세린 프로테아제와 비교해 향상된 세정력을 갖는 세린 프로테아제 변이체의 생성 방법을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 추가로, 오염을 제거하는 모체 효소 및 변이체 효소의 능력을 비교함으로써, 변이체의 세정력을 테스트하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 모체 효소의 세정력은 1.0 의 값으로 주어지고, 향상된 세정력을 갖는 변이체는 1.0 초과의 값을 달성한다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 방법은 향상된 세정력을 갖는 변이체를 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 모체세린 프로테아제는 세린 프로테아제의 야생형 성숙 형태이다. 일부 다른 구현예에서, 변이체는 바실라세아에 세린 프로테아제 유래이다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체는 바실러스 세린 프로테아제 유래이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 세정력은 pH 가 6.5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트된다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에서 테스트된다. 일부 대안적인 바람직한 구현예에서, 모체세린프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 50% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다. 일부 추가의 바람직한 구현예에서, 모체세린 프로테 아제 내 하나 이상의 위치는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, 모체세린 프로테아제와 비교해 향상된 세정력을 갖는 세린 프로테아제 변이체의 생성 방법을 제공한다 : 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기를 치환시켜, 모체 효소와 비교해 더욱 양성인 전하 또는 덜 음성인 전하를 갖는 세린 프로테아제 변이체를 수득하는 단계 ; 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기를 치환시켜, 모체 효소와 비교해 더욱 음성인 전하 또는 덜 양성인 전하를 갖는 세린 프로테아제 변이체를 수득하는 단계. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 추가로, 오염을 제거하는 모체 효소 및 변이체 효소의 능력을 비교함으로써, 변이체의 세정력을 테스트하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 모체 효소의 세정력은 1.0 의 값으로 주어지고, 향상된 세정력을 갖는 변이체는 1.0 초과의 값을 달성한다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 방법은 향상된 세정력을 갖는 변이체를 생성하는 것을 포함한다. 임의의 적합한 순서로 상기 단계를 수행하고자 한다. 일부 구현예에서, 모체세린 프로테아제는 세린 프로테아제의 야생형 성숙 형태이다. 일부 다른 구현예에서, 변이체는 미크로코시네아에 (Micrococcineae) 세린 프로테아제로부터 유래된다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체는 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 세린 프로테아제로부터 유래된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 세정력은 pH 가 6.5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트된다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에 서 테스트된다. 일부 대안적인 바람직한 구현예에서, 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 50% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다. 일부 추가의 바람직한 구현예에서, 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다. 일부 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기는 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 치환되며, 한편 다른 구현예에서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되고, 일부 추가의 구현예에서, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 염기성 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 다양한 치환의 조합이 제공된다. 추가의 구현예에서, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기는 하나 이상의 산성 아미노산 잔기로 치환되고, 한편 다른 구현예에서, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되고, 더욱 추가의 구현예에서, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 산성 아미노산로 치환된다. 더욱 추가의 구현예에서, 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되어, 모체 효소와 비교해 동일한 전하를 갖는 중성 세린 프로테아제 변이체가 수득된다. 본 발명은 임의의 특정 치환 조합에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 치환은 임의의 특정 순서로 수행되는 것이다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, 모체세린 프로테아제와 비교해 향상된 세정력을 갖는 세린 프로테아제 변이체의 생성 방법을 제공한다 : 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기를 치환시켜, 모체 효소와 비교해 더욱 양성인 전하 또는 덜 음성인 전하를 갖는 세린 프로테아제 변이체를 수득하는 단계 ; 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기를 치환시켜, 모체 효소와 비교해 더욱 음성인 전하 또는 덜 양성인 전하를 갖는 세린 프로테아제 변이체를 수득하는 단계 ; 상기 단계에 의해 생성된 세린 프로테아제 변이체를 수득하는 단계. 추가의 구현예에서, 상기 방법은 오염을 제거하는 모체 효소 및 변이체 효소의 능력을 비교함으로써, 변이체의 세정력을 테스트하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 모체 효소의 세정력은 1.0 의 값으로 주어지고, 향상된 세정력을 갖는 변이체는 1.0 초과의 값을 달성한다. 추가의 구현예에서, 상기 방법은 향상된 세정력을 갖는 변이체를 생성하는 것을 포함한다. 임의의 적합한 순서로 상기 단계를 수행하고자 한다. 일부 구현예에서, 모체세린 프로테아제는 세린 프로테아제의 야생형 성숙 형태이다. 일부 다른 구현예에서, 변이체는 미크로코시네아에 세린 프로테아제로부터 유래된다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체는 셀룰로모나스 세린 프로테아제로부터 유래된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 세정력은 pH 가 6.5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트된다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에서 테스트된다. 일부 대안적인 바람직한 구현예에서, 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 50% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다. 일부 추가의 바람직한 구현예에서, 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 위치는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 위치이다. 일부 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기는 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 치환되며, 한편 다른 구현예에서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되고, 일부 추가의 구현예에서, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 염기성 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 다양한 치환의 조합이 제공된다. 추가의 구현예에서, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기는 하나 이상의 산성 아미노산 잔기로 치환되고, 한편 다른 구현예에서, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되고, 더욱 추가의 구현예에서, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 산성 아미노산로 치환된다. 더욱 추가의 구현예에서, 모체세린 프로테아제 내 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되어, 모체 효소와 비교해 동일한 전하를 갖는 중성 세린 프로테아제 변이체가 수득된다. 본 발명은 임의의 특정 치환 조합에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 치환은 임의의 특정 순서로 수행되는 것이다.
본 발명은 하기를 포함하는, 모체 단백질과 비교해 향상된 성능을 갖는 하나 이상의 단백질 변이체의 생성 방법을 제공한다 : 모체 단백질 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 모체 단백질과 비교해 더욱 양성이거나, 더욱 음성이거나, 덜 양성이거나 또는 덜 음성인 전하를 갖는 하나 이상의 단백질 변이체를 수득함. 일부 구현예에서, 상기 개질은 치환, 첨가 및/또는 결실을 포함하며, 한편 다른 구현예에서, 상기 개질은 화학적 개질을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 효소이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 효소는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 폴리에스터라아제, 에스터라아제, 리파아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 옥시다아제, 트랜스퍼라아제, 알칼라아제, 또는 카탈라아제이다. 일부 추가의 특히 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 중성 메탈로프로테아제이다. 일부 추가의 구현예에서, 하나 이상의 단백질 변이체의 성능은 하나 이상의 관심있는 테스트를 사용해 평가된다. 일부 추가의 구현예에서, 하나 이상의 관심있는 테스트는 기질 결합, 효소 억제, 발현 수준, 세제 안정성, 열적 안정성, 반응 속도, 반응 범위, 열적 활성, 전분 액화, 에스테르 가수분해, 효소적 표백, 세정력, 바이오매스 분해, 용해성, 킬란트 (chelant) 안정성, 및/또는 당화의 측정을 포함한다. 일부 더욱 추가의 구현예에서, 하나 이상의 단백질 변이체는 하나 이상의 관심있는 테스트에서 모체 단백질과 비교해 향상된 성능을 나타낸다.
본 발명은 하기를 포함하는, 모체 효소와 비교해 향상된 성능을 갖는 하나 이상의 효소 변이체의 생성 방법을 제공한다 : 모체 효소 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 모체 효소와 비교해 더욱 양성이거나, 더욱 음성이거나, 덜 양성이거나 또는 덜 음성인 전하를 갖는 하나 이상의 효소 변이체를 수득함. 일부 구현예에서, 상기 개질은 치환, 첨가 및/또는 결실을 포함하며, 한편 다른 구현예에서, 상기 개질은 화학적 개질을 포함한다. 일부 추가의 구현예에서, 상기 방법은 추가로 효소 변이체 및 모체 효소의 세정력을 테스트하여, 효소 변이체 및 모체 효소에 대한 성능 지표를 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 효소 변이체의 성능 지수는 1.0 초과의 값을 가지며, 모체 효소의 세정력은 0.1 의 성능 지수를 갖는다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상 기 방법은 향상된 세정력을 갖는 변이체 효소를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 추가의 구현예에서, 효소는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 폴리에스터라아제, 에스터라아제, 리파아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 옥시다아제, 트랜스퍼라아제, 알칼라아제, 또는 카탈라아제이다. 일부 추가의 특히 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 중성 메탈로프로테아제이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 바실러스 프로테아제이다. 일부 더욱 추가의 구현예에서, 세정력은 pH 가 5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트된다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에서 테스트되며, 한편, 일부 다른 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 포함하는 냉수 액체 세제에서 테스트된다. 일부 구현예에서, 치환은 약 25% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 모체 효소 내 위치에 존재한다. 일부 추가의 구현예에서, 치환은 약 50% 초과 또는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 모체 효소 내 위치에 존재한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 모체 효소와 비교해 향상된 성능을 갖는 하나 이상의 효소 변이체의 생성 방법을 제공한다 : a) 모체 효소 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 모체 효소와 비교해 더욱 양성이거나, 더욱 음성이거나, 덜 양성이거나 또는 덜 음성인 전하를 갖는 제 1 효소 변이체를 생성하는 단계 ; 및 b) 모체 효소 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 모체 효소와 비교해 더욱 양성이거나, 더욱 음성이거나, 덜 양성이거나 또는 덜 음성인 전하를 갖는 제 2 효소 변이체를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 개질은 치환, 첨가 및/또는 결실을 포함하며, 한편, 일부 대안적인 구현예에서, 개질은 화학적 개질을 포함한다. 일부 추가의 구현예에서, 상기 단계는 다수의 효소 변이체를 생성하기 위해 반복된다. 일부 추가의 구현예에서, 모체 효소는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 폴리에스터라아제, 에스터라아제, 리파아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 옥시다아제, 트랜스퍼라아제, 알칼라아제, 또는 카탈라아제이다. 일부 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 중성 메탈로프로테아제, 또는 세린 프로테아제이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 모체 효소는 바실러스 프로테아제이다. 일부 추가의 구현예에서, 상기 방법은 변이체 효소 및 모체 효소의 세정력을 테스트하고, 세정력 테스트에서 오염을 제거하는 모체 효소 및 변이체 효소의 능력을 비교하는 것을 추가로 포함하며, 여기서, 모체 효소의 세정력은 1.0 의 값으로 주어지고, 향상된 세정력을 갖는 변이체는 1.0 초과의 값을 달성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 모체 효소와 비교해 향상된 세정력을 갖는 효소 변이체를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 모체 효소는 세린 프로테아제이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 세린 프로테아제는 바실러스 세린 프로테아제 또는 셀룰로모나스 세린 프로테아제이다. 일부 추가의 구현예에서, 세정력은 pH 가 5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트된다. 일부 추가의 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에서 테스트된다. 더욱 추가의 구현예에서, 세정력은 염기성 pH 를 포함하는 냉수 액체 세제에서 테스트된다. 일부 대안적인 구현예에서, 치환은 약 25% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 모체 효소 내 위치에 존재하며, 한편, 일부 다른 구현예에서, 치환은 약 50% 초과 또는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 모체 효소 내 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기는 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 치환되며, 한편 다른 구현예에서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되고, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 염기성 아미노산 잔기로 치환되고, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기는 하나 이상의 산성 아미노산 잔기로 치환되고, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되고, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 산성 아미노산로 치환되며, 및/또는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기는 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되어, 모체 효소와 비교해 동일한 전하를 갖는 효소 변이체를 수득한다. 필요하다면, 상기 치환의 임의의 적합한 조합이 본 발명에서 이용가능할 것이다.
본 발명은 또한, 모체 단백질 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 모체 단백질과 비교해 더욱 양성이거나, 더욱 음성이거나, 덜 양성이거나 또는 덜 음성인 전하를 갖는 하나 이상의 단백질 변이체를 생성하는 것을 포함하는, 모체 단백질과 비교해 향상된 성능을 갖는 하나 이상의 단백질 변이체의 생성 방법을 제공하며, 여기서, 하나 이상의 위치는 약 25% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 위치는 모체 단백질 및 하나 이상의 추가의 단백질을 포함하는 상동성 단백질 서열의 아미노산 정렬에서 비-보존적이다. 일부 바람직한 구현예에서, 모체 단백질은 효소이다.
일부 특히 바람직한 구현예에서, 효소는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 폴리에스터라아제, 에스터라아제, 리파아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 옥시다아제, 트랜스퍼라아제, 알칼라아제, 또는 카탈라아제이다. 일부 추가의 구현예에서, 향상된 성능은 기질 결합, 효소 억제, 발현, 세제에서의 안정성, 열적 안정성, 반응 속도, 반응 범위, 열적 활성, 전분 액화, 바이오매스 분해, 당화, 에스테르 가수분해, 효소적 표백, 세정력, 용해성, 킬란트 안정성, 및/또는 직물 개질로부터 선택되는 하나 이상의 특성의 증가를 포함한다. 일부 추가의 구현예에서, 상기 개질은 치환, 첨가, 및/또는 결실을 포함하며, 한편 다른 구현예에서, 개질은 화학적 개질을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 치환은 모체 단백질에 대해 0, -1 또는 -2 의 순전하 변화를 포함하고, 한편 다른 구현예에서, 하나 이상의 치환은 모체 단백질에 대해 +1 또는 +2 의 순전하 변화를 포함한다. 일부 추가의 구현예에서, 모체 단백질에서의 하나 이상의 치환은 0, -1 또는 -2 의 전하 변화를 포함하고, 여기서, 모체 단백질에서의 하나 이상의 추가의 치환은 모체 단백질에 대해 +1 또는 +2 의 전하 변화를 포함한다. 일부 대안적인 구현예에서, 단백질 변이체는 모체 단백질에 대해 +1 또는 +2 의 순전하 변화를 갖고, 한편 다른 구현예에서, 단백질 변이체는 모체 단백질에 대해 0, -1, 또는 -2 의 순전하 변화를 갖는다. 일부 추가의 구현예에서, 치환은 약 50% 초과 또는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 모체 효소 내 위치에 존재한다.
도 1A 는 매칭 pH 및 전도성 (5 mM HEPES pH 8.0, 2.5 mM NaCl) 의 완충액 (채워지지 않은 원) 및 AATCC 액체 세제 (채워진 삼각형) 에서 측정된 바와 같은, 야생형 ASP 에 대해 순전하 변화의 함수로서 ASP 변이체의 상대적인 혈액, 밀크, 잉크 (BMI) 마이크로스와치 (microswatch) 활성 (최상의 수행자에 대해 표준화됨) 을 도시한다. 유사하게는, 도 1B 는 ASP 조합 전하 라이브러리 (CCL) 에 대한, 야생형에 대해 전하 변화의 함수로서 상대적인 BMI 마이크로스와치 활성을 도시한다.
도 2 는 NaCl 농도를 2.5 mM (채워지지 않은 원), 16 mM (회색 원) 및 100 mM (검은색 원) 로 다양하게 하면서 5 mM HEPES pH 8.0 에서 측정된 바와 같은, 야생형 ASP 에 대해 전하 변화의 함수로서 ASP 변이체의 상대적인 BMI 마이크로스와치 활성 (최상의 수행자에 대해 표준화됨) 을 도시한다.
도 3A 는 전하 변화의 함수로서 북미 세탁 세제에서 FNA CCL 의 BMI 세정력을 도시한다. 유사하게는, 도 3B 는 전하 변화의 함수로서 북미 세탁 세제에서 GG36 CCL 의 BMI 세정력을 도시한다.
도 4A 는 전하 변화의 함수로서 서유럽 액체 세탁 세제에서 FNA CCL 의 BMI 세정력을 도시한다. 유사하게는, 도 4B 는 전하 변화의 함수로서 서유럽 액체 세탁 세제에서 GG36 CCL 의 BMI 세정력을 도시한다.
도 5A 는 전하 변화의 함수로서 일본 세탁 세제에서 FNA CCL 의 BMI 세정력을 도시한다. 유사하게는, 도 5B 는 전하 변화의 함수로서 일본 세탁 세제에서 GG36 CCL 의 BMI 세정력을 도시한다.
도 6A 는 전하 변화의 함수로서 자동 식기세척기 세제에서 FNA CCL 의 BMI 세정력을 도시한다. 유사하게는, 도 6B 는 전하 변화의 함수로서 자동 식기세척기 세제에서 GG36 CCL 의 BMI 세정력을 도시한다.
도 7A 는 전하 변화의 함수로서 AmyS-S242Q CCL 에 대한 BODIPY 전분 상에서의 특정 효소 활성을 도시한다. 유사하게는, 도 7B 는 모체AmyS 효소에 대해 -12 내지 +4 의 전하 변화 사다리를 걸치는 AmyS 의 표면 전하 변이체에 대한 옥수수 전분 액화 후의 점도를 도시한다.
도 8 은 야생형 ASP 에 대해 순전하 변화의 함수로서 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 에서의 ASP 변이체의 발현 수준을 도시한다.
도 9 는 모체FNA 에 대해 순전하 변화의 함수로서 FNA 변이체의 LAS/EDTA 안정성을 도시한다.
도 10 은 야생형 ASP 에 대해 순전하 변화의 함수로서 ASP 변이체의 열안정성을 도시한다.
도 11 은 야생형 AmyS 에 대해 전하 변화의 함수로서 제 1 AmyS 전하 사다리의 열적 안정성을 도시한다.
도 12 는 pH 의 함수로서 제 1 AmyS 전하 사다리의 쌀 전분 세정 활성을 제공한다. pH 3.0 ~ 4.25 는 200 mM Na 포르메이트 + 0.01% Tween-80 이다. pH 4.25 ~ 5.5 는 200 mM Na 아세테이트 + 0.01% Tween-80 이다. 데이타는 적정 곡선에 맞추어져 있고, 각각은 단일 pKa 값을 갖는다.
도 13 은 야생형 AmyS 에 대해 전하 변화에 대해 그려진 도 31 에서 측정된 pKa 값을 제공한다.
발명의 일반적인 설명
본 발명은 관심있는 특정 환경 조건 하에 단백질의 성능을 최적화하기 위해 단백질을 조작하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 특정 환경 조건 하에 효소의 촉매 활성을 최적화하기 위해 효소를 조작하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 출발 또는 모체(parent) 효소와 비교해 세제 제형에서 성능이 향상되었음을 나타내는 효소 변이체를 수득하기 위해, 효소 (예를 들어, 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제) 의 순 표면 전하 및/또는 표면 전하 분포를 변경하는 방법을 제공한다.
프로테아제 서브틸리신은 세탁 세제에 사용되는 주요 효소이고, 아마도 세계에서 가장 광범위하게 사용되는 효소이다. 대략 20 년 전에, 표면 정전기 효과가 서브틸리신의 촉매 활성을 조정할 수 있음을 주지하였다 (예를 들어, Russell and Fersht, Nature 328:496-500 [1987] 참조). 더욱 최근에는, 서브틸리신의 순전하를 변화시키는 것을 포함한 돌연변이가 세제의 세정력에 대해 극적인 효과를 가진다는 것이 관찰되었다 (예를 들어, 본원에 참조로서 삽입된 EP 특허 제 0 479 870 B1 호 참조). 이러한 유익한 효과는 서브틸리신의 pI (등전점) 를 세정 액체의 pH 로 이동시킨 결과인 것으로 여겨졌다. 그러나, 이후의 연구에서, 상기 결론이 항상 이용가능한 것은 아닌 것으로 나타났다 (예를 들어, 본원에 참조로서 삽입된 미국 특허 제 6,673,590 B1 호 참조). 상기 특허에서 지시된 바와 같이, 서브틸리신에서의 전하 돌연변이의 효과는 세제 농도에 크게 의존하고, 상기 돌연변이는 모체서브틸리신의 pI 를 저하시켜 낮은 세제 농도에서 더욱 효과적인 효소를 제공하고, 상기 돌연변이는 pI 를 상승시켜 높은 세제 농도에서 더욱 효과적인 효소를 제공한다. 이는 세정 액체 내 세제 농도가 전세계적으로 크게 다양하기 때문에 상당히 유용하다. 따라서, 서브틸리신의 세정력에 최적인 pI 가 존재하며, 이는 세정 액체의 pH 및 세제 농도에 의존한다는 것이 당업자에게 분명해지게 되었다. 세탁 세제에서의 서브틸리신의 활성을 향상시키기 위한 추가의 노력이 기술되었다 (미국 특허 공개 제 2005/0221461 호 참조). 놀랍게도, 모체서브틸리신과 동일한 순 정전하를 갖는 서브틸리신 변이체가 높고 그리고 낮은 세제 농도 세정 조건 둘 다에서 높은 세정력을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 실시는 다르게 언급되지 않는다면, 모두 당업계 내에 있는 단백질 조작, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술에서 흔히 사용되는 통상의 기술을 포함한다. 이러한 기술은 당업자에게 공지된 것들이며, 당업자에게 공지된 많은 문헌 및 참조 논문에 기재되어 있다. 본원의 상기 및 이하 모두에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 공보는 여기에 참조로서 본원에 표현적으로 인용된다.
본원에 다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기재된다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어는 전체로서 명세서를 참조로 더욱 상세히 기재된다.
또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형에는 문맥이 명확하게 다르게 지시 하지 않는 한 복수형 참조가 포함된다. 다르게 지시되지 않는다면, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 표기한다. 본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있기 때문에 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 최대 수치 한계는 모든 더 낮은 수치 한계를 포함하고, 상기 더 낮은 수치 한계는 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다. 본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 최소 수치 한계는 모든 더 높은 수치 한계를 포함할 것이고, 상기 더 높은 수치 한계는 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다. 본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 수치 범위는 그러한 더 광범위한 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이고, 상기 더 좁은 수치 범위는 모두 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다.
더욱이, 본원에서 제공되는 제목은 본 발명의 다양한 측면 또는 구현예를 제한하는 것이 아니며, 이는 전체로서 명세서를 참조로 하여 주어질 수 있다. 따라서, 바로 하기에서 정의되는 용어들은 전체로서 명세서를 참조로 하여 더욱 상세히 정의된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 이해를 용이하게 하고자, 많은 용어가 하기에서 정의된다.
정의
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로테아제," 및 "단백질분해 활성" 은 펩타이드 연결을 갖는 펩타이드 또는 기질을 가수분해하는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩타이드를 말한다. 많은 잘 공지된 절차가 단백질분해 활성의 측정을 위해 존재한다 (Kalisz, "Microbial Proteinase," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, [1988] 참조). 예를 들어, 단백질분해 활성은 통상의 기질을 가수분해하는 각각의 프로테아제의 능력을 분석하는 비교 어세이에 의해 확인될 수 있다. 프로테아제 또는 단백질분해 활성의 분석에 유용한 예시적 기질에는, 디-메틸 카세인 (Sigma C-9801), 소 콜라겐 (Sigma C-9879), 소 엘라스틴 (Sigma E-1625), 및 소 케라틴 (ICN Biomedical 902111) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기질을 사용하는 비색 어세이는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, WO 99/34011 호; 및 미국 특허 번호 제 6,376,450 호 참조, 둘다 본원에 참조로서 인용됨). pNA 어세이 (예를 들어, Del Mar 등, Anal. Biochem., 99:316-320 [1979] 참조) 이 또한 구배 용리 동안 수집된 분획에 대한 활성 효소 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 어세이는 효소가 용해성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (sAAPF-pNA) 를 가수분해함에 따라 p-니트로아닐린이 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로 인한 황색조의 생성 속도는 분광광도계로 410 nm 에서 측정되고, 활성 효소 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 사용하여, 총 단백질 농도를 측정할 수 있다. 활성 효소/총-단백질 비율은 효소 순도를 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "ASP 프로테아제," "Asp 프로테아제," 및 "Asp" 는 본원에 기재된 세린 프로테아제를 말하고, 미국 특허 출원 일련 번호 제 10/576,331 호에 기술되어 있으며, 상기 출원은 본원에 참조로서 삽입된다. 일부 바람직한 구현예에서, Asp 프로테아제는 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 균주 69B4 로부터 수득된 69B4 프로테아제로서 본원에서 디자인된 프로테아제이다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 용어 "69B4 프로테아제" 는 SEQ ID NO:8 에 제공된 것과 실질적으로 동일하는 아미노산 서열을 갖는 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 로부터 유래된 자연 발생적 성숙 프로테아제를 말한다. 대안적인 구현예에서, 본 발명은 ASP 프로테아제의 일부를 제공한다.
용어 "셀룰로모나스 프로테아제 호모로그 (homologue)" 는 셀룰로모나스 균주 69B4 유래의 성숙 프로테아제와 실질적으로 동일하는 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 프로테아제, 또는 상기 자연 발생 프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 말하고, 상기 프로테아제는 이러한 핵산에 의해 암호화된 세린 프로테아제의 기능적인 특징을 보유한다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 호모로그는 "셀룰로모나딘 (cellulomonadin)" 으로 불린다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "ASP 변이체," "ASP 프로테아제 변이체," 및 "69B 프로테아제 변이체" 는 야생형 ASP 와 특히 그 기능 면에서 유사하나, 그의 아미노산 서열에 돌연변이가 있어서 야생형 프로테아제와 서열 면에서 상이하게 되는 프로테아제를 말할 때 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같은, "셀룰로모나스 종 (Cellulomonas ssp.)" 은 "셀룰로모나스 (Cellulomonas)" 속명 내의 모든 종을 말하며, 이것은 셀룰로모나다세아에 과 (Family Cellulomonadaceae), 마이크로코시네아에 아목 (Suborder Micrococcineae), 악티노마이세탈레스 목 (Order Actinomycetales), 악티노박테리아 강 (Class Actinobacteria) 의 일원으로 분류되는 그람-양성 박테리아이다. 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 속명에 대한 지속적인 분류학적 개편이 있다는 것으로 인지된다. 그러므로, 속명에는 재분류된 종명이 포함되는 것으로 인지된다.
본원에 사용되는 바와 같은, "스트렙토마이세스 종 (Streptomyces ssp.)" 은 "스트렙토마이세스 (Streptomyces)" 속명 내의 모든 종을 말하며, 이것은 스트렙토마이세타세아에 과 (Family Streptomycetaceae), 스트렙토마이시네아에 아목 (Suborder Streptomycineae), 악티노마이세탈레스 목 (Order Actinomycetales), 악티노박테리아 강 (Class Actinobacteria) 의 일원으로 분류되는 그람-양성 박테리아이다. 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속명에 대한 지속적인 분류학적 개편이 있다는 것으로 인지된다. 그러므로, 속명에는 재분류된 종명이 포함되는 것으로 인지된다.
본원에 사용되는 바와 같은, "바실러스 (Bacillus) 속" 에는 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 서큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 가 포함되나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 바와 같이 "바실러스 (Bacillus)" 속명 내의 모든 종이 포함된다. 바실러스 (Bacillus) 속명에 대한 지속적인 분류학적 개편이 있다는 것으로 인지된다. 그러므로, 속명에는 이제는 "제오바실러스 스테아로테르모필루스 (Geobacillus stearothermophilus)" 라고 불리는 B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus) 와 같은 이러한 유기체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 재분류된 종명이 포함되는 것으로 인지된다. 산소의 존재하에서의 내성 내생포자의 생성은, 상기 특징이 또한 현재 명칭 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아네우리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 테르모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus), 및 비르지바실러스 (Virgibacillus) 에 적용됨에도 불구하고, 바실러스 (Bacillus) 속명의 특징을 정의하는 것으로 간주된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산" 은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태 (리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드) 를 말한다. 상기 용어에는 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 기타 자연, 화학적으로, 생화학적으로 개질된 비-자연 또는 유도된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적인 예이다: 유전자, 유전자 절편, 염색체 절편, EST, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 개질 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체, 우라실, 다른 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티오에이트, 및 뉴클레오타이드 분지를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 방해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 구축물" 및 "형질전환 DNA" 는 숙주 세포 또는 개체에 서열을 도입하는데 사용되는 DNA 를 말하는 것으로서, 상호교환적으로 사용된다. DNA 는 시험관 내에서 PCT 또는 당업자에게 공지된 다른 적합한 기술(들) 에 의해 생성될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, DNA 구축물은 관심있는 서열 (예를 들어, 유입 (incoming) 서열) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 조절 구성원 (예를 들어, 프로모터 등) 과 같은 추가의 구성원에 조작적으로 연결된다. DNA 구축물은 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상동성 박스 옆에 유입 서열을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 형질전환 DNA 는 말단에 첨가된 다른 비상동성 서열을 포함한다 (예를 들어, 스터퍼 (stuffer) 서열 또는 측면 (flank)). 일부 구현예에서, 유입 서열의 말단은 형질전환 DNA 가 닫힌 고리를 형성하도록 밀접해 있다. 형질전환 서열은 야생형, 돌연변이 또는 개질될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 구축물은 숙주 세포 염색체에 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 구축물은 비상동성 서열을 포함한다. 일단 DNA 구축물이 시험관 내에서 조립되면, 이는 하기를 위해 사용될 수 있다 : 1) 숙주 세포의 목적하는 표적 서열에 이종성 서열을 삽입함 ; 및/또는 2) 숙주 세포 염색체의 영역을 돌연변이시킴 (즉, 내인성 서열을 이종성 서열로 대체함), 및/또는 3) 표적 유전자를 결실시킴 ; 및/또는 숙주에 복제 플라스미드를 도입함.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 카세트" 및 "발현 벡터" 는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 구성원이 있는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구축물을 말한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 절편에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부위는 다른 서열 중에서도, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 숙주 세포에서 이종성 DNA 절편을 혼입 및 발현하는 능력을 갖는다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터는 시판된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식으로 가능하다. 용어 "발현 카세트" 는 본원에서 "DNA 구축물" 및 그의 문법적인 상응물과 상호교환적으로 사용된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식으로 가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터" 는 하나 이상의 세포 유형에 핵산을 도입하도록 디자인된 폴리뉴클레오타이드 구축물을 말한다. 벡터에는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 카세트 등이 포함된다. 일부 구현예 에서, 폴리뉴클레오타이드 구축물은 프로테아제 (예를 들어, 전구체 또는 성숙 프로테아제) 를 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 이 서열은 적합한 숙주에서 DNA 의 발현에 영향을 줄 수 있는 적합한 전구서열 (예를 들어, 분비 등) 에 조작적으로 연결되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드" 는 클로닝 벡터로서 사용되는 환형의 이중-가닥 (ds) DNA 구축물을 말하며, 이는 일부 진핵세포 또는 원핵세포에서 염색체외 자가복제성 유전적 구성원을 형성하거나, 또는 숙주 염색체에 함입된다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열을 세포에 도입하는 맥락에서, 용어 "도입된" 은 핵선 서열을 세포에 이동시키기에 적합한 방법을 말한다. 상기 도입 방법에는 원형질 융합, 형질감염, 형질전환, 접합, 및 유전자도입이 포함되나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Ferrari 등, "Genetics, " in Hardwood 등, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72 [1989] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환된" 및 "안정하게 형질전환된" 은 본래의 것이 아닌 (이종성) 폴리뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈에 함입되거나, 또는 2 개 이상의 세대 동안 유지되는 에피좀 플라스미드로서의 세포를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "선별 마커-암호화 뉴클레오타이드 서열" 은 숙주 세포에서 발현할 수 있는 뉴클레오타이드 서열로서, 여기서, 선별 마커의 발현은 상응하는 선별제의 존재 시 또는 필수 영양소의 결여 시에 성장할 수 있는 발현된 유전자를 함유하는 세포를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "선별 마커" 및 "선별성 마커" 는 벡터를 함유하는 숙주를 쉽게 선별할 수 있게 하는, 숙주 세포에서 발현할 수 있는 핵산 (예를 들어, 유전자) 을 말한다. 상기 선별 마커의 예에는 항생제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 용어 "선별 마커" 는 숙주 세포가 관심있는 유입 DNA 를 취하였거나 또는 일부 다른 반응이 발생하였다는 지시를 제공하는 유전자를 말한다. 전형적으로, 선별 마커는 외인성 DNA 를 함유하는 세포를 형질전환 동안에 임의의 외인성 서열을 받지 못한 세포와 구별할 수 있도록, 숙주 세포에 대사성 이점 또는 항생제 내성을 부여하는 유전자이다. "상주 (residing) 선별 마커" 는 형질전환되는 미생물의 염색체 상에 위치하는 마커이다. 상주 선별 마커는 형질전환 DNA 구축물 상의 선별 마커와 상이한 유전자를 암호화한다. 선별성 마커는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 상기 지시한 바와 같이, 바람직하게는 마커는 항생제 내성 마커이다 (예를 들어, ampR; phleoR; specR; kanR; eryR; tetR; cmpR; 및 neoR (예를 들어, Guerot-Fleury, Gene, 167:335-337 [1995); Palmeros 등, Gene 247:255-264 [2000]; 및 Trieu-Cuot 등, Gene, 23:331-341, [1983] 참조). 본 발명에 따라 유용한 다른 마커에는 트립토판과 같은 영양요구성 마커 ; 및 β-갈락토시다아제와 같은 검출 마커가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터" 는 하류 유전자의 전사를 지도하는 기능을 하는 핵산 서열을 말한다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적절하다. 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열 ("조절 서열" 이라고도 함) 과 함께 프로모터는 해당 유전자의 발현에 필요하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열에는 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 정지 서열, 번역 개시 및 정지 서열, 및 인핸서 또는 활성화 서열이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계를 맺도록 위치되는 경우 "조작적으로 연결된다". 예를 들어, DNA 암호화 분비 리더 (즉, 신호 펩타이드) 는 그것이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 프리단백질 (preprotein) 로서 발현된다면 폴리펩타이드에 대한 DNA 에 조작적으로 연결되며 ; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호화 서열에 조작적으로 연결되거나 ; 또는 리보좀 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 암호화 서열에 조작적으로 연결된다. 일반적으로, "조작적으로 연결된" 은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우, 인접해 있고 해독 기 (reading phase) 에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 통상의 제한효소 인식부위에서의 결합에 의해 이루어진다. 상기 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상의 실행에 따라 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "유전자" 는 폴리펩타이드를 암호화하고, 암호화 영역 전 후 영역뿐만 아니라, 개별 암호화 분절 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론) 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 분절) 를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "상동 유전자" 는 상이하지만 일반적으로는 연 관된 종으로부터 비롯된 유전자 쌍을 말하며, 상기 상동 유전자는 서로에게 상응하며 서로 동일하거나 또는 매우 유사하다. 상기 용어는 종분화에 의해 분리된 유전자 (즉, 신규 종의 개발) (예를 들어, 오르토로그 (orthologous) 유전자) 뿐만 아니라 유전적 복제에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 파라로그 (paralogous) 유전자) 를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "오르토로그" 및 "오르토로그 유전자" 는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자 (즉, 상동 유전자) 로부터 진화한 상이한 종의 유전자를 말한다. 전형적으로, 오르토로그는 진화 과정 동안에 동일한 기능을 유지한다. 오르토로그의 규명은 새로 서열화된 게놈에서 유전자 기능을 신뢰할만하게 예측하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "파라로그" 및 "파라로그 유전자" 는 게놈 내에서의 복제 (duplication) 에 의해 관계되는 유전자를 말한다. 오르토로그는 진화 과정 동안에 동일한 기능을 유지하는 한편, 파라로그는 일부 기능이 본래의 것과 종종 관련있더라도 새로운 기능을 진화시킨다. 파라로그 유전자의 예에는, 모두 세린 단백분해효소이고 동일 종에서 함께 발생하는 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 및 트롬빈을 암호화하는 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "상동" 은 서열 유사성 또는 동일성을 말하며, 동일성이 바람직하다. 상기 상동은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 측정된다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; 프로그램, 예컨대 GAP, BESTFlT, FASTA, 및 TFASTA {Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)}; 및 Devereux 등, Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).
본원에 사용되는 바와 같이, "유사 서열" 은 유전자의 기능이 모체유전자 (예를 들어, 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제) 를 바탕으로 한 유전자와 본질적으로 동일한 서열이다. 부가적으로는, 유사 유전자는 모체유전자의 서열과 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 서열 동일성을 포함한다. 대안적으로는, 유사 서열은 모체유전자 (예를 들어, 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제) 영역에서 발견되는 유전자의 70 내지 100% 의 정렬을 갖고/갖거나, 또는 모체유전자 (예를 들어, 셀룰로모나스 균주 69B4 염색체) 를 함유하는 염색체 내의 유전자와 정렬된 영역에서 발견되는 적어도 5 내지 10 개의 유전자를 갖는다. 부가적인 구현예에서, 상기 특성 중 하나 초과가 서열에 적용된다. 유사 서열은 공지된 서열 정렬 방법에 의해 측정된다. 통상 사용되는 정렬 방법은 BLAST 이나, 상기 및 하기에 나타나 있듯이, 서열 정렬에 사용될 수 있는 다른 방법도 있다.
유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP 이다. PILEUP 는 점진, 2쌍 정렬을 사용하는 관련 서열의 군으로부터의 다중 서열 정렬을 만든다. 이는 정렬을 만드는데 사용되는 클러스터링 관계 (clustering relationship) 를 보여주는 나무 (tree) 를 그릴 수 있다. PILEUP 는 Feng 및 Doolittle 의 점진 정렬 방법의 단일화 (simplification) 를 사용한다 (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]). 상기 방법은 Higgins 및 Sharp 에 의해 기술된 방법과 유사하다 (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00 의 디폴트 갭 가중치 (weight), 0.10 의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 가중치 엔드 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 또다른 예는 Altschul 등에 의해 기술된 BLAST 알고리즘이다 (Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410 [1990]; and Karlin 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:5873-5787 [1993)). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (Altschul 등, Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996] 참조). WU-BLAST-2 는 다수의 검색 파라미터를 사용하는데, 이의 대부분은 디폴트 값에 맞춰진다. 조정가능한 파라미터는 하기 값을 사용해 맞춰진다 : 오버랩 스팬 (overlap span) = 1, 오버랩 프랙션 (overlap fraction) = 0.125, 워드 역치 (word threshold) (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값 (dynamic 값) 이고, 관심있는 서열이 검색되는 특정 데이타베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 의존하여 프로그램 자체에 의해 구축된다. 그러나, 상기 값은 민감도를 증가시키도록 조정될 수 있다. 아미노산 서열 동일성 값 % 는 매칭하는 동일한 잔기의 수를 정렬된 영역 내 "더 긴" 서열의 잔기의 총 수로 나누어서 측정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 가장 실제적인 잔기를 갖는 서열이다 (정렬 스코어를 최대화하기 위해 WU-Blast-2 에 의해 도입된 갭은 무시함).
따라서, "핵산 서열 동일성 %" 는 출발 서열 (즉, 관심있는 서열) 의 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 후보 서열 내 뉴클레오타이드 잔기의 % 로서 정의된다. 바람직한 방법은 WU-BLAST-2 의 BLASTN 모듈을 디폴트 파라미터에 맞추는데 사용되고, 오버랩 스팬 및 오버랩 프랙션은 각각 1 및 0.125 로 맞추어진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혼성화" 는 당업계에 공지된 바와 같이, 핵산 중 한 가닥이 염기쌍을 통해 상보성 가닥과 결합하는 방법을 말한다.
핵산 서열과 대조군 서열이 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건 하에 서로 특이적으로 혼성된다면, 핵산 서열은 대조군 핵산 서열에 "선택적으로 혼성화가능한" 것으로 간주된다. 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도 (Tm) 를 바탕으로 한다. 예를 들어, "최대의 엄격성" 은 전형적으로 약 Tm - 5℃ (프로브의 Tm 보다 5℃ 낮음) 에서 발생하고 ; "높은 엄격성" 은 Tm 보다 약 5 ~ 10℃ 낮은 온도에서 발생하고 ; "중간 정도의 엄격성" 은 프로브의 Tm 보다 약 10 ~ 20℃ 낮은 온도에서 발생하고 ; "낮은 엄격성" 은 Tm 보다 약 20 ~ 25℃ 낮은 온도에서 발생한다. 기능적으로, 혼성화 프로브를 사용해 엄격한 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 갖는 서열을 규명하기 위해서는 최대의 엄격한 조건이 사용될 수 있으며 ; 한편, 중간 또는 낮은 엄격한 혼성화는 폴리뉴클레오타이드 서열 호모로그 (homolog) 를 규명 또는 검출하는데 사용될 수 있다.
중간 및 높은 엄격한 혼성화 조건은 당업계에 잘 공지되어 있다. 높은 엄격한 조건의 예는 50% 포름아마이드, 5X SSC, 5X Denhardt 용액, 0.5% SDS 및 100 μg/ml 변성된 운반체 DNA 내, 약 42℃ 에서 혼성화하고, 이어서 2X SSC 및 0.5% SDS 내, 실온에서 2 회 세정하고, 0.1X SSC 및 0.5% SDS 내, 42℃ 에서 추가로 2 회 세정하는 것을 포함한다. 중간정도의 엄격한 조건의 예는 20% 포름아 마이드, 5X SSC (15O mM NaCl, 15 mM 트리나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.6), 5X Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml 변성된 쉐어드 연어 정자 DNA (denatured sheared salmon sperm DNA) 를 포함하는 용액 내, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하고, 이어서 약 37 ~ 50℃, 1X SSC 에서 필터를 세정하는 것을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요소를 조절하는데 필요한 온도, 이온 세기 등을 조정하는 방법을 알고 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, "재조합" 은 이종 핵산 서열의 도입에 의해 개질된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 해서 개질된 세포로부터 유래된 세포를 말하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 본래의 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 고의적인 인간 개입의 결과로서 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는, 즉, 다르게 비정상적으로 발현되는 본래의 유전자를 발현한다. "재조합," "재조합화," 및 "재조합된" 핵산의 발생은 일반적으로 2 개 이상의 핵산 절편의 어셈블리로서, 이러한 어셈블리는 키메라 유전자를 산출한다.
바람직한 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 하나 이상의 코돈에서의 부위 포화 돌연변이화로 발생된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 부위 포화 돌연변이화는 2 개 이상의 코돈에 대해 수행된다. 추가의 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 야생형 서열과 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 98% 초과의 상동성을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 돌연변이체 DNA 는 임의의 공지된 돌연변이화 과 정 예컨대, 방사선조사, 니트로소구아니딘 등을 사용하여 생체 내에서 발생된다. 다음, 목적하는 DNA 서열을 단리하고 본원에 제공된 방법에 사용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 서열" 은 유입 서열을 숙주 세포 게놈에 삽입하는 것이 바람직한 경우, 서열을 암호화하는 숙주 세포 내 DNA 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 기능성 야생형 유전자 또는 오페론을 암호화하는 한편, 다른 구현예에서, 표적 서열은 기능성 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비-기능성 유전자 또는 오페론을 암호화한다.
본원에 사용된 바와 같이, "측면 서열 (flanking sequence)" 은 논의되는 서열의 상류 또는 하류에 있는 임의의 서열을 말한다 (예를 들어, 유전자 A-B-C 에 대해서, 유전자 B 는 A 및 C 유전자 서열의 측면에 있음). 바람직한 구현예에서, 유입 서열은 각 면 상에 있는 상동성 박스의 측면에 있다. 또다른 구현예에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 각 면 상의 스터퍼 서열의 측면에 있는 단위 (unit) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 측면 서열은 단지 단일 면 (3' 또는 5') 상에만 존재하나, 바람직한 구현예에서, 상기 서열은 측면에 있는 서열의 각 면 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 측면 서열은 단지 단일 면 (3' 또는 5') 상에만 존재하나, 한편, 바람직한 구현예에서, 상기 서열은 측면에 있는 서열의 각 면 상에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스터퍼 서열" 은 상동성 박스의 측면에 있는 임의의 외부 DNA (전형적으로 벡터 서열) 를 말한다. 그러나, 상기 용어는 임의의 비상동성 DNA 서열을 포함한다. 이론에 제한되지 않으면서, 스터퍼 서 열은 세포가 DNA 취득을 개시하도록, 중요하지 않은 표적을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭" 은, 증폭된 유전자가 게놈에 처음에 존재하던 것보다 높은 복사수로 존재하게 되는 식으로 특정 DNA 서열이 과잉 복제되는 방법을 말한다. 일부 구현예에서, 약물 (예를 들어, 억제가능 효소의 억제자) 의 존재하에서의 성장에 의한 세포의 선별은, 상기 약물의 존재하의 성장에 필요한 유전자 생성물을 암호화하는 내인성 유전자의 증폭, 또는 상기 유전자 생성물을 암호화하는 외인성 (즉, 투입됨) 서열의 증폭, 또는 둘 다를 초래한다.
"증폭" 은 주형 특이성과 관련된 핵산 복제의 특별한 경우이다. 이것은 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이나 특이적 주형에는 의존하지 않는 복제) 와는 대조적인 것이다. 여기서 주형 특이성은 복제 충성도 (즉, 적합한 폴리뉴클레오타이드 서열의 합성) 및 뉴클레오타이드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성과는 구별된다. 주형 특이성은 종종 "표적" 특이성과 관련되어 기술된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 색출된다는 점에서 "표적" 이다. 증폭 기술은 이러한 색출을 위해 일차적으로 고안되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공동-증폭" 은 단일 세포 내로의 다른 유전자 서열과 함께 증폭가능 마커의 도입 (즉, 발현 벡터 내에 함유된 유전자들과 같은 하나 이상의 비-선별적 유전자를 포함함) 및 적합한 선택적 압력의 적용을 말하며, 세포는 증폭가능 마커 및 기타, 비-선별적 유전자 서열 모두를 증폭시킨다. 증폭가능 마커는 다른 유전자 서열에 물리적으로 연결될 수 있거나 대안적으로는 하나는 증폭가능 마커를 함유하고 다른 하나는 비-선별적 마커를 함유하는 2 개의 분리된 DNA 절편이 동일 세포 내에 도입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭가능 마커," "증폭가능 유전자" 및 "증폭 벡터" 는 적합한 성장 조건하에서 유전자의 증폭을 가능하게하는 유전자를 암호화하는 유전자 또는 벡터를 말한다.
"주형 특이성" 은 대부분 효소 선택에 의한 증폭 기술로 달성된다. 증폭 효소는 사용되는 조건 하에서 핵산의 불균질 혼합물 중의 오직 특이적 서열의 핵산만을 조작할 효소이다. 예를 들어, Qβ 복제효소의 경우, MDV-1 RNA 가 복제효소에 대한 특이적 주형이고 (예를 들어, Kacian 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972] 참조), 다른 핵산은 상기 증폭 효소에 의해 복제되지 않는다. 유사하게, T7 RNA 중합효소의 경우, 상기 증폭 효소는 그 자신의 프로모터에 대해 엄격한 특이성을 갖는다 (Chamberlin 등, Nature 228:227 [1970] 참조). T4 DNA 리가아제의 경우, 상기 효소는 연결 접합점에서 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 기질과 주형 사이의 미스매치가 있는 경우, 2 개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 연결하지는 않을 것이다 (Wu and Wallace, Genomics 4:560 [1989] 참조). 마지막으로, Taq 및 Pfu 중합효소는 고온에서 작용하는 그들의 능력에 비추어, 결합된 서열에 대해 높은 특이성을 나타내는 것으로 발견되므로, 프라이머에 의해 정의되며; 고온은 표적 서열과의 프라이머 혼성화를 선호하고 비-표적 서열과의 혼성화를 선호하지 않는 열역학적 상태를 야기한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭가능 핵산" 은 임의의 증폭 방법에 의 해 증폭될 수 있는 핵산을 말한다. "증폭가능 핵산" 은 통상 "샘플 주형" 을 포함할 것으로 생각된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "샘플 주형" 은 "표적" (하기 정의됨) 의 존재를 분석하는 샘플로부터 기원하는 핵산을 말한다. 대조적으로, "배경 주형" 은 샘플에 존재할 수 있거나 존재할 수 없는, 샘플 주형 이외의 핵산을 말할 때 사용된다. 배경 주형은 대부분 종종 부주의에 의한 것이다. 이것은 잔류 결과일 수 있거나, 샘플로부터 정제해서 제거되어야 할 핵산 오염물의 존재로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 검출되는 것 이외의 개체로부터의 핵산은 테스트 샘플 중의 배경으로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머" 는 정제된 제한 분해물과 같이 자연 발생하거나 또는 합성적으로 생성되든지 간에, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 확장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓인 경우 (즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 유도제의 존재 하에서 및 적합한 온도 및 pH 에서) 합성 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 프라이머는 증폭시 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일 가닥이지만, 대안적으로는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 먼저 가닥을 분리시키기 위해 처리된 후, 확장 생성물을 생성하는데 사용된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 유도제의 존재하에서 확장 생성물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야만 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 방법의 용도를 포함하는 많은 요소에 따라 다를 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브" 는 정제된 제한 분해물과 같이 자연 발생하거나 또는 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되든지간에, 또다른 관심있는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (즉, 일련의 뉴클레오타이드) 를 말한다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 프로브는 효소 (예를 들어, ELISA 뿐만 아니라, 효소-기반 면역화학적 어세이), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 검출 시스템으로 검출가능하도록, 임의의 "리포터 분자" 로 표지될 것이 계획된다. 본 발명이 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응과 관련하여 사용되는 경우 용어 "표적" 은, 중합효소 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산의 영역을 말한다. 그러므로, "표적" 은 다른 핵산 서열로부터 색출된다. "분절" 은 표적 서열 내의 핵산의 영역으로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중합효소 연쇄 반응" ("PCR") 은 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,965,188 호의 방법을 말하고, 여기에는 당업자에게 공지된 바와 같은 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA 의 혼합물 중의 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키기 위한 방법이 포함된다. 표적 서열의 원하는 증폭된 분절이 혼합물 중의 주된 서열이 되기 때문에 (농도에 있어서), 이들을 "PCR 증폭됨" 이라고 부른다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭 시약" 은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 완충액 등) 을 말한다. 전형적으로는, 다른 반응 성분과 함께 증폭 시약을 반응 용기 (시험관, 마이크로웰 등) 에 넣고 포함시킨다.
PCR 로, 게놈 DNA 중의 특이적 표적 서열의 단일 복사를 여러 상이한 방법론 (예를 들어, 표지된 프로브로의 혼성화; 비오티닐화 프라이머의 혼입 후 아비딘-효소 컨쥬게이트 검출; 증폭된 분절 내로 32P-표지된 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트, 예컨대 dCTP 또는 dATP 의 혼입) 에 의해 검출가능한 수준으로 증폭시키는 것이 가능하다. 게놈 DNA 외에도, 임의의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 적합한 세트의 프라이머 분자로 증폭될 수 있다. 특히, PCR 과정 그 자체에 의해 제작된 증폭된 분절 그 자체는 수반되는 PCR 증폭에 대한 효과적인 주형이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PCR 생성물," "PCR 절편," 및 "증폭 생성물" 은 변성, 어닐링 및 확장의 PCR 단계의 2 회 이상의 사이클이 완료된 후 화합물의 수득된 혼합물을 말한다. 이러한 용어는 하나 이상의 표적 서열의 하나 이상의 분절의 증폭이 있는 경우를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "RT-PCR" 은 RNA 서열의 복제 및 증폭을 말한다. 이 방법에서는, 역전사가 PCR 에 커플링되어 있는데, 가장 흔히는 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 제 5,322,770 호에 기술된 바와 같은 열안정 중합효 소를 이용하는 1 가지 효소 방법을 사용한다. RT-PCR 에서, RNA 주형은 상기 중합효소의 역전사효소 활성에 기인하여 cDNA 로 변환되며, 그 후, 상기 중합효소의 중합활성을 사용하여 증폭된다 (즉, 기타 PCR 방법들에서와 같음).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소" 는 특정 뉴클레오타이드 서열에서 또는 그 근처에서 이중 가닥 DNA 를 각각 절단하는 박테리아 효소를 말한다.
"제한효소 인식부위" 는 주어진 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식 및 절단되는 뉴클레오타이드 서열을 말하며, 흔히 DNA 절편의 삽입 부위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제한효소 인식부위는 선별 마커 및 상기 DNA 구축물의 5' 및 3' 말단 내로 조작된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염색체 함입" 은 유입 서열이 숙주 세포의 염색체 내로 도입되는 방법을 말한다. 형질전환 DNA 의 상동 영역은 염색체의 상동 영역 내에 정렬된다. 이어서, 상동 박스 사이의 서열이 이중 교차 (즉, 상동 재조합) 내의 유입 서열에 의해 대체된다. 본 발명의 일부 구현예에서, DNA 구축물의 염색체 분절을 불활성화시키는 상동 섹션이 바실러스 (Bacillus) 염색체의 토착 염색체 영역의 측면 상동 영역에 정렬된다. 이어서, 토착 염색체 영역이 이중 교차 (즉, 상동 재조합) 내의 DNA 구축물에 의해 결실된다.
"상동 재조합" 은 동일한 또는 거의 동일한 뉴클레오타이드 서열의 부위에서의 2 개의 DNA 분자 또는 쌍을 이룬 염색체들 사이의 DNA 절편의 교환을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 염색체 함입은 상동 재조합이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "상동 서열" 은 비교를 위해 최적으로 정렬되었을 때 또다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%, 또는 70% 서열 상동성을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 상동 서열은 85% 내지 100% 서열 상동성을 갖고, 다른 구현예에서 90% 내지 100% 서열 상동성이 있으며, 더욱 바람직한 구현예에서는, 95% 내지 100% 서열 상동성이 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "아미노산" 은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이들의 일부를 말한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드" 는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은, "관심있는 단백질" 및 "관심있는 폴리펩티드" 는 목적하는 및/또는 평가되는 단백질/폴리펩티드를 말한다. 일부 구현예에서, "관심있는 단백질" 은 "모체 단백질" (즉, 출발 단백질) 이다. 일부 구현예에서, 모체 단백질은 단백질 조작/디자인을 위한 출발점으로서 사용되는 야생형 효소이다. 일부 구현예에서, 관심있는 단백질은 세포내부에서 발현되는 반면, 다른 구현예에서, 이것은 분비된 폴리펩티드이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 효소에는 본원에 기재된 세린 프로테아제 및 메탈로프로테아제가 포함된다. 일부 구현예에서, 관심있는 단백질은 신호 펩티드와 융합된 분비된 폴리펩티드 (즉, 분비되는 단백질 상에 아미노-말단 확장) 이다. 거의 모든 분비된 단백질은 아미노-말단 단백질 확장을 사용하며, 이는 막을 가로지르는 전구체 단백질의 위치이전에, 및 상기 단백질에 표적하는데 중요한 역할을 한다. 상기 확장은 막 이동 동안 또는 그 즉시 신호 펩티다아제에 의해 단백질 가수분해적으로 제거된다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "이종 단백질" 은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 이종 단백질의 예에는 프로테아제를 비롯한 히드롤라아제와 같은 효소가 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 자연 발생적인 유전자인 반면, 다른 구현예에서는 돌연변이 및/또는 합성 유전자가 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은, "상동 단백질" 은 고유의 또는 세포에서 자연적으로 발생하는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 그람-양성 세포이고, 특히 바람직한 구현예에서, 세포는 바실러스 (Bacillus) 숙주 세포이다. 대안적인 구현예에서, 상동 단백질은 E. 콜라이 (E. coli), 셀룰로모나스 (Cellulomonas), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 트리코데르마 (Trichoderma), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 유기체에 의해 생성된 고유의 단백질이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술에 의해 상동 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "오페론 영역" 은 공통 프로모터로부터 단일 전사 단위로서 전사되어, 공동-조절되는 인접 유전자의 그룹을 포함한다. 일부 구현예에서, 오페론에는 조절자 유전자가 포함된다. 가장 바람직한 구현예에서, RNA 수준에 의해 측정된 바로는 높게 발현되나, 미공지된 또는 불필요한 기능을 갖는 오페론이 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은, "항생제 영역" 은 항생제 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 영역이다.
폴리뉴클레오타이드는 고유의 상태에서 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작되는 경우, 전사 및/또는 번역되어 RNA, 폴리펩티드 또는 그의 절편을 생산할 수 있는 경우 RNA 또는 폴리펩티드를 "암호화한다 (encode)" 라고 언급된다. 이러한 핵산의 안티-센스 가닥은 또한 서열을 암호화하는 것으로 언급된다.
당업계에 공지된 바와 같이, DNA 는 RNA 중합효소에 의해 전사되어 RNA 를 생산할 수 있으나, RNA 는 역전사효소에 의해 역전사되어 DNA 를 생산할 수 있다. 그러므로 DNA 는 RNA 를 암호화할 수 있으며 역도 성립한다.
용어 "조절 분절" 또는 "조절 서열" 또는 "발현 조절 서열" 은 암호화된 아미노산 서열의 발현에 영향을 주는 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 의 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 의 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 조절 서열은 아미노산을 암호화하는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 저해, 억제 또는 촉진할 수 있다.
"숙주 균주" 또는 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 대한 적합한 숙주를 말한다.
효소가 상응하는 야생형 세포에서 발현되는 수준보다 높은 수준으로 세포에서 발현되는 경우 효소는 숙주 세포에서 "과발현" 된다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)] 에 따라 정의 된 아미노산에 대한 3 자리 코드가 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된다. 또한 유전적 코드의 퇴행으로 인해 폴리펩티드가 하나 초과의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다는 것이 이해된다.
"전구서열" 은, 신호 서열과 성숙 프로테아제 사이에 존재하는, 프로테아제의 분비에 필요한 아미노산 서열이다. 상기 전구 서열의 절단으로 성숙 활성 프로테아제가 생성될 것이다.
용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드" 는 단백질의 성숙 또는 전구 형태의 분비에 참여하는 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산의 임의 서열을 말한다. 신호 서열에 대한 이 정의는 기능상의 것으로서, 단백질 분비의 유효화에 참여하는, 상기 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 암호화되는 모든 이러한 아미노산 서열들을 포함하는 것으로 의도된다. 이들은, 보편적인 것은 아니나 종종, 단백질의 N-말단 부분 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합한다. 상기 신호 서열은 내인성일 수도 있고 외인성일 수도 있다. 상기 신호 서열은 상기 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 에 정상적으로 결합된 것일 수 있고, 또는 또 다른 분비 단백질을 암호화하는 유전자로부터일 수도 있다. 한 가지 예시적인 외인성 신호 서열은 B. 렌투스 (B. lentus) (ATCC 21536) 로부터의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지에 융합되는 B. 서브틸리스 서브틸리신으로부터의 신호 서열의 최초 7 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
용어 "하이브리드 신호 서열" 은, 서열 일부가 발현될 유전자의 신호 서열에 융합되는 발현 숙주로부터 수득되는 신호 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 합 성 서열이 이용된다.
용어 "실질적으로 동일한 신호 활성" 은 발효 배지 내로 프로테아제의 실질적으로 동일한 분비에 의해 나타내지는 바와 같은 신호 활성을 말하며, 예를 들어, 발효 배지 프로테아제 수준은 SEQ ID NO:9 의 신호 서열에 의해 제공되는 바와 같은 발효 배지 중에 분비된 프로테아제 수준의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상이다.
단백질 또는 펩티드의 "성숙" 형태라는 용어는 단백질 또는 펩티드의 최종적인 기능적 형태를 말한다. 예시하자면, 본 발명의 ASP 프로테아제의 성숙 형태에는 SEQ ID NO:8 의 아미노산 서열이 적어도 포함되고, 본 발명의 NprE 프로테아제의 성숙 형태에는 SEQ ID NO:3 의 아미노산 서열이 적어도 포함된다.
단백질 또는 펩티드의 "전구체" 형태라는 용어는, 상기 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 작동가능하게 연결된 전구서열을 가진 단백질의 성숙한 형태를 말한다. 전구체는 또한 상기 전구서열의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 "신호" 서열을 가질 수 있다. 상기 전구체는 또한 번역후 활성에 관계된 부가적인 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙한 형태를 남기는 폴리뉴클레오타이드) 를 가질 수 있다.
"자연 발생적 효소" 및 "자연 발생적 단백질" 은 자연에서 발견된 서열과 일치하는 미개질 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 단백질을 말한다. 자연 발생적 효소에는 특정 미생물에서 자연 발현되거나 발견된 효소인 고유의 효소가 포함된다.
용어 "~ 로부터 유래된" 및 "~ 로부터 수득된" 은 문제의 유기체의 균주에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 효소 (예를 들어, 프로테아제) 뿐만 아니라, 또한 그러한 균주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 암호화되고 그러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생성된 효소를 말한다. 부가적으로는, 상기 용어는 합성 DNA 서열 및/또는 cDNA 기원에 의해 암호화되고 문제의 효소의 확인된 특성을 갖는 효소를 말한다.
본 정의 범위 내의 "유도체" 는 일반적으로 유도체가 야생형, 고유형 또는 모체형태로서 유사한 목적에 유용한 범위로 야생형, 고유형 또는 모체형태에서 관찰된 단백질 가수분해 활성 특성을 보유한다. 기능성 효소 유도체는 모체 효소의 일반적 특성을 갖는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 펩티드 또는 펩티드 절편을 포함한다.
용어 "기능성 유도체" 는 효소를 암호화하는 핵산의 기능적 특성을 갖는 핵산의 유도체를 말한다. 본원에 제공되는 효소를 암호화하는 핵산의 기능성 유도체는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 핵산 또는 절편을 포함한다. 본 발명에 따른 효소를 암호화하는 야생형 핵산에는 자연 발생적 대립유전자 및 당업계에 공지된 유전 코드의 퇴행에 근거한 상동이 포함된다.
2 개 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥 중의 용어 "일치하는" 은 하기 서열 비교 또는 분석 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 최대 대응에 대해 정렬되었을 때 동일한 2 개 서열 중의 잔기를 말한다.
용어 "최적 정렬" 은 가장 높은 % 일치성 점수를 제공하는 정렬을 말한다.
2 개의 아미노산, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 유전자 서열 (적합하게는) 과 관련된 "% 서열 일치성," "% 아미노산 서열 일치성," "% 유전자 서열 일치성," 및/또는 "% 핵산/폴리뉴클레오타이드 서열 일치성," 은, 서열이 최적으로 정렬된 경우 2 개의 서열 중 일치하는 잔기의 % 를 말한다. 그러므로, 80% 아미노산 서열 일치성은 2 개의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열 중의 아미노산의 80% 가 일치한다는 것을 의미한다.
그러므로 2 개의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 구 "실질적으로 일치하는" 은 표준 파라미터를 사용하는 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들어, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 을 사용하여 참조 서열과 비교하여 70% 이상의 서열 일치성, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상 및 바람직하게는 99% 이상의 서열 일치성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드를 말한다. 2 개의 폴리펩티드가 실질적으로 일치한다는 하나의 지표는 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응하는 것이다. 전형적으로는, 보존 아미노산 치환에 의해 상이한 폴리펩티드는 면역학적으로 교차 반응한다. 그러므로, 폴리펩티드는 예를 들어, 2 개의 펩티드가 보존 치환에 의해서만 상이한 경우 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 일치한다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 일치한다는 또다른 지표는 2 개의 분자가 엄격한 조건 (예를 들어, 중간 ~ 높은 엄격함 범위 내) 하에서 서로 혼성화되는 것이다.
용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 본래 환경 (예를 들어, 자연적으로 발생되 는 경우 자연 환경) 으로부터 제거된 물질을 말한다. 예를 들어, 상기 물질은 자연적으로 발생하는 또는 야생형 유기체에 존재하는 것보다 높은 또는 낮은 농도로 특정 조성물에 존재하거나 또는 자연 발생적 또는 야생형 유기체로부터 발현 시 정상적으로 존재하지 않는 성분과 함께 존재하는 경우 "정제된다" 라고 말한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 자연계 중의 공존 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 또한, 이러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 일부가 아닐수도 있다는 점에서 단리될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 핵산 또는 단백질은, 예를 들어, 전기영동 젤 또는 블롯에서 본질적으로 하나의 밴드로 나타나는 경우 정제되었다고 말한다.
DNA 서열을 참조로 사용되는 경우 용어 "단리된" 은, 자연적인 유전 환경으로부터 제거되어 다른 외부적인 또는 원치않는 암호화 서열이 없으며, 유전공학적 단백질 생성 시스템에서 사용하기에 적합한 형태의 DNA 서열을 말한다. 이러한 단리된 분자는 자연 환경으로부터 단리된 것들이고, cDNA 및 게놈 클론이 포함된다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 보통 관련된 기타 유전자가 없고, 프로모터 및 종결자와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 미번역 영역이 포함될 수 있다. 관련 영역의 확인은 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985] 참조). 용어 "단리된 DNA 서열" 은 대안적으로는 "클로닝된 DNA 서열" 로 언급된다.
단백질을 참조로 하여 사용되는 경우, 용어 "단리된," 은, 고유의 환경 이외의 상태에서 발견된 단백질을 말한다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동 단백질이 실질적으로 없다. 단리된 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 10% 초과의 순도, 바람직하게는 20% 초과의 순도, 및 훨씬 더 바람직하게는 30% 초과의 순도를 갖는다. 발명의 추가 양상은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 고도로 정제된 형태 (즉, 40% 초과의 순도, 60% 초과의 순도, 80% 초과의 순도, 90% 초과의 순도, 95% 초과의 순도, 97% 초과의 순도, 및 심지어 99% 초과의 순도) 의 단백질을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "조합 돌연변이화" 는 출발 서열의 변이체의 라이브러리가 생성되는 방법을 말한다. 상기 라이브러리에서, 변이체는 미리 정의된 일련의 돌연변이로부터 선택된 하나 또는 여러 돌연변이를 함유한다. 또한, 상기 방법은 미리 정의된 일련의 돌연변이의 일원이 아닌 랜덤 돌연변이를 도입하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에는 본원에 참조로서 인용된, 2000 년 10 월 26 일에 출원된 미국 출원 제 09/699,250 호에 언급된 것들이 포함된다. 대안적인 구현예에서, 조합 돌연변이화 방법은 시판되는 키트 (예를 들어, QUIKCHANGE® Multi부위, Stratagene, La Jolla, CA) 를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "돌연변이체의 라이브러리" 는 게놈의 대부분이 일치하나, 하나 이상의 유전자의 상이한 상동이 포함되는 세포의 집단을 말한다. 이러한 라이브러리는 예를 들어, 향상된 특색을 갖는 유전자 또는 오페 론을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "출발 유전자" 는 본 발명을 사용하여 향상 및/또는 변화되는 관심있는 단백질을 암호화하는 관심있는 유전자를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "변이체" 는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 치환 또는 결실에 의해 전구체 단백질 (예를 들어, "모" 단백질) 로부터 유래된 단백질을 말한다. 일부 구현예에서, 변이체는 전구체 단백질과 비교해, 전하 변화를 포함하는 하나 이상의 개질을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 전구체 단백질은 야생형 단백질인 모체 단백질이다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "다중 서열 정렬" 및 "MSA" 은 알고리즘 (예를 들어, Clustal W) 을 사용하여 정렬된 출발 서열의 다중 상동 서열을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 서열" 및 "정준 서열" 은 관심있는 특정 단백질 또는 서열의 모든 변이체가 비교되는 것과는 대조되는 원형의 (archetypical) 아미노산 서열을 말한다. 상기 용어는 또한 관심있는 DNA 서열에 대부분 종종 존재하는 뉴클레오타이드를 언급하는 서열을 말한다. 유전자의 각 위치에 대해, 보존 서열은 MSA 중의 위치에 가장 풍부한 아미노산을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 돌연변이" 는 출발 유전자 및 보존 서열의 서열의 차이를 말한다. 보존 돌연변이는 MSA 로부터 수득된 출발 유전자 및 보존 서열의 서열을 비교하여 확인된다. 일부 구현예에서, 보존 돌연변이가 출발 유전자 내에 도입되어, 보존 서열과 더욱 유사하게 된다. 보존 돌연 변이에는 또한 출발 유전자 중의 아미노산의 빈도와 관련된 위치에서 출발 유전자 중의 아미노산이 MSA 에서 더욱 종종 발견되는 아미노산으로 변경되는 아미노산 변경이 포함된다. 그러므로, 용어 보존 돌연변이는 출발 유전자의 아미노산을 MSA 중의 아미노산보다 더욱 풍부한 아미노산으로 대체하는 모든 단일 아미노산 변화를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "초기 적중" 은 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리를 스크리닝하여 확인되는 변이체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 초기 적중은 출발 유전자와 비교하여, 향상된 성능 특성을 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "향상된 적중" 은 향상된 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리를 스크리닝하여 확인되는 변이체를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "향상 돌연변이" 및 "성능-향상 돌연변이" 는 출발 유전자 내로 도입되는 경우 성능을 향상시키는 돌연변이를 말한다. 일부 바람직한 구현예에서, 이들 돌연변이는 그러한 방법의 스크리닝 단계 동안 확인된 서열분석 적중에 의해 확인된다. 대부분의 구현예에서, 적중에서 더욱 종종 발견되는 돌연변이는 비스크리닝된 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리에 비해 향상된 돌연변이인 것 같다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "향상된 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리" 는 CCM 돌연변이생성 및 스크리닝의 초기 조사로부터의 스크리닝 및/또는 서열분석 결과에 근거해 디자인 및 구축된 CCM 라이브러리를 말한다. 일부 구현예에서, 향상된 CCM 라이브러리는 CCM 의 초기 조사로부터 수득된 초기 적중의 서 열을 근거로 한다. 부가적인 구현예에서, 향상된 CCM 은 돌연변이생성 및 스크리닝의 초기 조사로부터의 초기 적중에서 종종 발견된 돌연변이가 바람직하도록 디자인된다. 일부 바람직한 구현예에서, 이것은 성능-감소 돌연변이를 암호화하는 프라이머를 생략하거나 초기 CCM 라이브러리에 사용된 다른 프라이머에 대해 성능-향상 돌연변이를 암호화하는 프라이머의 농도를 증가시켜 달성된다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "성능-감소 돌연변이" 는 비스크리닝된 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리와 비교하여 스크리닝으로부터 결과하는 적중에서 좀 덜 자주 발견된 조합적 보존 돌연변이생성 라이브러리 중의 돌연변이를 말한다. 바람직한 구현예에서, 스크리닝 방법은 "성능-감소 돌연변이" 를 함유하는 변이체의 풍부함을 제거 및/또는 감소시킨다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "기능성 어세이" 은 단백질의 활성을 유도시키는 어세이를 말한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 용어는 단백질을 통상의 역량으로 기능하는 능력에 대해 분석하는 어세이 시스템을 말한다. 예를 들어, 효소의 경우, 기능성 어세이에는 반응을 촉진하는 효소의 유효성을 측정하는 것이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "표적 특성" 은 변경되게 되는 출발 유전자의 특성을 말한다. 본 발명이 임의의 특정 표적 특성에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 그러나, 일부 바람직한 구현예에서, 표적 특성은 유전자 생성물의 안정성 (예를 들어, 변성, 단백질 가수분해 또는 다른 분해 인자에 대한 내성) 이고, 다른 구현예에서, 생성 숙주에서의 생성 수준은 변경된다. 게다가, 출발 유전자의 임의의 특성을 본 발명에서 발견할 수 있을 것으로 고려된다.
본원에 사용되는 바와 같은 핵산의 문맥에서 용어 "특성" 또는 그의 문법적인 동일어는, 선택되거나 검출될 수 있는 핵산의 임의의 특성 또는 속성을 말한다. 이러한 특성에는 폴리펩티드에 대한 결합에 영향을 주는 특성, 특정 핵산을 포함하는 세포에 부여된 특성, 유전자 전사에 영향을 주는 특성 (예를 들어, 프로모터 강도, 프로모터 인식, 프로모터 조절, 인핸서 기능), RNA 프로세싱에 영향을 주는 특성 (예를 들어, RNA 스플라이싱, RNA 안정성, RNA 형태, 및 전사 후 개질), 전사에 영향을 주는 특성 (예를 들어, 리보솜 단백질에 대한 mRNA 의 수준, 조절, 결합, 번역 후 개질) 이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 핵산의 전사 인자, 중합효소, 조절 인자 등에 대한 결합 부위는 바람직한 특성을 생성하거나 바람직하지 않은 특성을 확인하기 위해 변경될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 폴리펩티드의 문맥에서 용어 "특성" 또는 그의 문법적인 동일어는, 선택되거나 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의의 특성 또는 속성을 말한다. 이러한 특성에는 산화 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열 안정성, 알칼리 안정성, pH 활성 프로파일, 단백질 가수분해에 대한 내성, KM, kcat, kcat/kM 비율, 단백질 접힘, 면역 반응 유도, 리간드에 결합하는 능력, 수용체에 결합하는 능력, 분비되는 능력, 세포의 표면에 전시되는 능력, 올리고머를 형성하는 능력, 신호를 보내는 능력, 세포 증식을 촉진하는 능력, 세포 증식을 억제하는 능력, 세포자멸사를 유도하는 능력, 인산화 또는 글리코실화에 의해 개질되는 능력, 질환을 치료하는 능력이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "스크리닝" 은 당업계의 통상의 의미를 갖고, 일반적으로는 다단계 공정이다. 첫번째 단계에서, 돌연변이 핵산 또는 그로부터의 변이체 폴리펩티드를 제공한다. 두번째 단계에서, 돌연변이 핵산 또는 변이체 폴리펩티드의 특성을 측정한다. 세번째 단계에서, 측정된 특성을 상응하는 모체 핵산의 특성, 상응하는 자연 발생적 폴리펩티드의 특성 또는 돌연변이 핵산 발생에 대한 출발 물질 (예를 들어, 초기 서열) 의 특성을 비교한다.
변형된 특성을 갖는 핵산 또는 단백질의 수득을 위한 스크리닝 절차는 출발 물질의 특성에 따라 다르고, 이의 개질은 돌연변이 핵산의 발생이 용이하게 의도된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로 당업자는 본 발명이 스크리닝될 임의의 특정 특성에만 제한되는 것이 아니며, 하기 특성 기재 목록은 단지 예시로서만 설명된다는 것을 인지할 것이다. 임의의 특정 특성을 위한 스크리닝 방법은 일반적으로 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, 돌연변이화 전후로 결합, pH, 특이성 등을 측정할 수 있으며, 이의 변화는 변경을 나타낸다. 바람직하게는, 스크리닝은 칩, 파지 디스플레이, 및 복합 기질 및/또는 표시자를 사용하는 어세이를 포함하나 이에 제한되지 않게 다중 샘플를 동시에 스크리닝하는 것을 포함하는 고-처리량 방식으로 수행된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 스크리닝은 관심 변이체를 변이체 집단으로부터 풍부하게 하는 선별 단계를 포함한다. 이들 구현예의 예에는 숙주 유기체에 대한 성장 유리성을 부여하는 변이체의 선별, 뿐만 아니라 파지 디스플레이 또는 임의의 기타 디스플레이 방법이 포함되며, 여기서 변이체는 결합 또는 촉매 특성을 기준으로 한 변이체의 집단으로부터 포획될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 변이체의 라이브러리는 스트레스 (열, 프로테아제, 변성)에 노출되고, 이어서 여전히 미손상된 변이체가 스크리닝에서 확인되고 선별에 의해 풍부해진다. 상기 용어는 선별을 위해 임의의 적합한 수단을 포함하는 것으로 의도된다. 실제로, 본 발명이 임의의 특정 스크리닝 방법에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "표적 랜덤화"는 하나 또는 여러 위치가 랜덤화된 다수의 서열을 생성하는 방법을 나타낸다. 일부 구현예에서, 랜덤화는 완료된다 (즉, 모든 4개의 뉴클레오타이드, A, T, G 및 C 는 랜덤화 위치에서 일어날 수 있다). 대안적인 구현예에서, 뉴클레오타이드의 랜덤화는 4개의 뉴클레오타이드의 아집합에 제한된다. 표적된 랜덤화는 하나 또는 여러 관심 단백질을 암호화하는, 하나 또는 여러 개의 서열 코돈에 적용될 수 있다. 발현되는 경우, 생성된 라이브러리는 하나 이상의 아미노산 위치가 랜덤화 코돈의 랜덤화 계획에 의해 측정된 바와 같이, 모든 20개의 아미노산의 혼합물 또는 아미노산의 아집합을 함유할 수 있는 단백질 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 표적 랜덤화로부터 발생한 집단의 개별 구성원은 코돈의 표적 또는 랜덤 삽입 또는 결실로 인해 아미노산의 수가 상이하다. 추가적인 구현예에서, 합성 아미노산은 생성된 단백질 집단에 포함된다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 랜덤화로부터 생성된 집단의 대부분의 구성원은 출발 유전자보다 보존 서열에 대해 더 큰 서열 상 동을 나타낸다. 일부 구현예에서, 서열은 하나 이상의 관심 단백질을 인암호화한다. 대안적인 구현예에서, 단백질은 상이한 생물학적 기능을 갖는다. 일부 바람직한 구현예에서, 후임 서열은 하나 이상의 선별가능 표지를 포함한다. 이러한 서열은 하나 이상의 관심 단백질을 암호화할 수 있다. 이는 다른 생물학적 기능(들)을 가질 수 있다. 많은 경우에서 후임 서열은 선택가능한 표지, 예컨대 항생제에 내성을 부여하는 유전자를 포함할 것이다.
용어 "개질된 서열" 및 "개질된 유전자"는 자연 발생적 핵산 서열의 결실, 삽입 또는 개입을 포함하는 서열을 나타내는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 절단된 단백질이다 (예를 들어, 개질이 서열의 결실 또는 개입인 경우). 일부 특히 바람직한 구현예에서, 절단된 단백질은 생물학적 활성을 유지한다. 대안적인 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 신장된 단백질이다 (예를 들어, 핵산 서열 내의 삽입을 포함하는 개질). 일부 구현예에서, 삽입은 절단된 단백질을 야기한다 (예를 들어, 삽입이 중지 코돈을 형성하는 경우). 따라서, 삽입은 발현 생성물로서 절단된 단백질 또는 신장된 단백질을 야기할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이 서열" 및 "돌연변이 유전자"는 상호교환적으로 사용되고, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 하나 이상의 코돈에서 변경이 이루어진 서열을 나타낸다. 돌연변이 서열의 발현 생성물은 야생형과 비교해 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 발현 생성물은 변경된 기능적 역량을 가질 수 있다 (예를 들어, 향상된 효소적 활성).
용어 "돌연변이성 프라이머" 또는 "돌연변이성 올리고뉴클레오타이드" (본원에서 상호교환적으로 사용됨)는 주형 서열의 일부에 상응하고 그곳에 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 조성물을 나타내는 것으로 의도된다. 돌연변이성 프라이머에 있어서, 프라이머는 주형 핵산에 정확하게 부합하지 않을 것이고, 프라이머에서의 미스매치(들)은 핵산 라이브러리 내에 원하는 돌연변이를 도입하는데 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같은 "비-돌연변이성 프라이머" 또는 "비-돌연변이성 올리고뉴클레오타이드"는 주형 핵산에 정확하게 부합하는 올리고뉴클레오타이드 조성물을 나타낸다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 오직 돌연변이성 프라이머만이 사용된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 프라이머는 하나 이상의 부위에 돌연변이성 프라이머가 포함되고, 올리고뉴클레오타이드 혼합물에 포함된 비-돌연변이성 프라이머가 또한 있도록 디자인된다. 돌연변이성 프라이머 중 하나 이상에 상응하는 돌연변이성 프라이머 및 비-돌연변이성 프라이머의 혼합물을 첨가하여, 다양한 조합 돌연변이 패턴이 제시된 생성된 핵산 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 돌연변이 핵산 라이브러리의 구성원 중 일부는 특정 위치에서 그의 전구체 서열을 유지하는 반면 다른 구성원은 상기 위치에서 돌연변이되는 것이 바람직한 경우, 비-돌연변이성 프라이머는 제시된 잔기에 대한 핵산 라이브러리 내 비-돌연변이 구성원의 특정 수준을 수득하는 능력을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 길이가 10~50개 염기인, 보다 바람직하게는 길이가 약 15~45개 염기인 돌연변이성 및 비-돌연변이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 그러나, 원하는 돌연변이화 결과를 얻기 위해 10개 염기보다 는 짧거나 50개 염기보다는 긴 길이의 프라이머를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 상응하는 돌연변이성 및 비-돌연변이성 프라이머에 있어서, 상응하는 올리고뉴클레오타이드의 길이가 일치해야할 필요는 없으나, 첨가되는 돌연변이에 상응하는 부위 중에 오버랩은 있다.
일부 구현예에서, 프라이머는 미리 정의된 비율로 첨가된다. 예를 들어, 생성된 라이브러리가 특정한 특이적 돌연변이의 유의한 수준을 가지며, 동일 또는 상이한 위치에서 상이한 돌연변이의 양이 더 적은 것이 바람직한 경우, 첨가되는 프라이머의 양을 조절하여, 원하는 방향의 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로는, 비-돌연변이성 프라이머를 더 적게 또는 더 많이 첨가함으로써, 상응하는 돌연변이(들)가 돌연변이 핵산 라이브러리에서 생성되는 빈도를 조정하는 것이 가능하다.
본원에 사용되는 바와 같은, 구 "인접 돌연변이"는 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 존재하는 돌연변이를 나타낸다. 예를 들어, 인접 돌연변이는 서로 인접하거나 근처에 있을 수 있으나, 이들은 동일한 프라이머에 의해, 생성된 돌연변이 주형 핵산에 도입될 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은, 구 "비인접 돌연변이"는 별도의 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 존재하는 돌연변이를 나타낸다. 예를 들어, 비인접 돌연변이는 별도로 생성된 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 의해, 생성된 돌연변이 주형 핵산에 도입될 것이다.
용어 "야생형 서열," "야생형 핵산 서열" 및 "야생형 유전자"는 숙주 세포에 서 천연 또는 자연 발생하는 서열을 나타내는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 야생형 서열은 단백질 공학 프로젝트의 출발점인 관심 서열을 나타낸다. 야생형 서열은 상동 또는 이종 단백질을 인암호화할 수 있다. 상동 단백질은 숙주 세포 개입 없이 생성될 단백질이다. 이종 단백질은 숙주 세포 개입이 없다면 생성되지 않을 단백질이다.
용어 "산화에 안정한"은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 표백제 또는 산화제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 특이적 양의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 1분, 3분, 5분, 8분, 12분, 16분, 20분 등의 주어진 시간에 걸쳐 표백제 또는 산화제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 유지한다.
용어 "킬레이트제에 안정한"은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 킬레이트제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 특이적 양의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 10분, 20분, 40분, 60분, 100분 등의 주어진 시간에 걸쳐 킬레이트제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 유지한다.
용어 "열적으로 안정한" 및 "열안정성"은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 변경된 온도에 노출되는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 확인된 온도에 노출 후 특이적 양의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 나타낸다. 변경된 온도에는 증가 또는 감소된 온도가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 60분, 120분, 180분, 240분, 300분 등의 주어진 시간에 걸쳐 변경된 온도에 노출된 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 유지한다.
산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "향상된 안정성"은 다른 세린 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 높은 단백질분해 활성을 유지하는 것을 나타낸다.
산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "감소된 안정성"은 다른 세린 프로테아제 (예를 들어 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 낮은 단백질분해 활성을 유지하는 것을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "세정 조성물"에는, 다르게 나타내지 않는 한, 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 중질 ("heavy-duty") 세척제, 특히 세정 세제; 액체, 젤 또는 페이스트 형태의 다목적 세척제, 특히 소위 중질 액체형; 액체 미세-직물 세제; 손 식기세척제 또는 경량 식기세척제, 특히 고발포형의 것; 가 정 및 영업용 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼 보조 유형을 포함하는 기계 식기세척제; 항균 손 세척 유형, 세척 바, 구강세척제, 의치 세정제, 차량 또는 카페트 샴푸, 욕실 세정제; 헤어 샴푸 및 헤어 린스; 샤워 젤 및 거품 목욕제 및 금속 세정제를 포함하는 액체 세정제 및 살균제 뿐만 아니라; 세정 보조제 예컨대 표백 첨가제 및 "오염물-막대" 또는 전처리 유형이 포함된다.
다르게 언급하지 않는 한, 모든 성분 또는 조성물 수준은 상기 성분 또는 조성물의 활성 수준에 관련된 것이며, 불순물 (예를 들어 잔류 용매 또는 부산물)은 제외되는데, 이는 시판되는 공급원 중 존재할 수 있다.
효소 성분 중량은 총 활성 단백질을 기준으로 한다. 다르게 나타내지 않는 한, 모든 백분비 및 비율은 중량에 대해 계산된다. 다르게 나타내지 않는 한, 모든 백분비 및 비율은 총 조성물을 기준으로 계산된다.
용어 "세정 활성"은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법 동안 널리 행해지는 조건 하에서 프로테아제에 의해 달성되는 세정 성능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세정 성능은 표준 세정 조건에 적용 후 다양한 크로마토그래프, 분광광도계 또는 다른 정량 방법론에 의해 측정된 바와 같이 예를 들어 잔디, 혈액, 우유, 또는 계란 단백질과 같은 효소 민감성 오염물과 관련된 다양한 세정 어세이의 적용에 의해 측정된다. 예시적 어세이에는 WO 99/34011 및 미국 특허 제 6,605,458 호에 기재된 것들 뿐만 아니라, 실시예에 포함된 방법들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 프로테아제의 "세정 유효량"은 특정 세정 조성물에서 원하는 수준의 효 소 활성을 달성하는 본원에서 이전에 기재된 프로테아제의 양을 나타낸다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인되며, 많은 인자, 예컨대 사용된 특정 프로테아제, 세정 적용, 세정 조성물의 특정 조성, 및 액체 또는 건조 (예를 들어 과립, 바) 조성물이 필요한지의 여부 등에 근거한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세정 보조 물질" 은, 특정 유형의 바람직한 세정 조성물 및 생성물 형태 (예를 들어 액체, 과립, 분말, 바, 페이스트, 분무, 정제, 젤; 또는 발포 조성물)로부터 선택되는 임의의 액체, 고체 또는 기체 물질을 의미하고, 상기 물질은 또한 바람직하게는 조성물에 사용된 프로테아제 효소와 상용가능하다. 일부 구현예에서, 과립 조성물은 "압축" 형태이고, 다른 구현예에서, 액체 조성물은 "농축" 형태이다.
세정 활성의 문맥에서 용어 "향상된 성능" 및 "향상된 세정력" 은 표준 세척 사이클 및/또는 다중 세척 사이클 후 통상의 평가에 의해 측정된 바와 같은 달걀, 우유, 잔디 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 오염물의 증가된 또는 더 큰 세정 활성을 나타낸다.
세정 활성의 문맥에서 용어 "감소된 성능"은 표준 세척 사이클 후 통상의 평가에 의해 측정된 바와 같은 달걀, 우유, 잔디 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 오염물의 감소된 또는 더 적은 세정 활성을 나타낸다.
세정 활성의 문맥에서 용어 "비교 성능"은 비교 프로테아제 (예를 들어 시판되는 프로테아제)의 세정 활성의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 95% 이상을 나타낸다. 세정 성능은 표준 세척 사이클 조건 후 통상의 분광 광도적 또는 분석 방법론에 의해 측정된 바와 같은 혈액, 우유 및/또는 잉크 (BMI)와 같은 효소 민감성 오염물에 관한 다양한 세정 어세이에서 본 발명의 프로테아제와 다른 프로테아제를 비교하여 측정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "저 세제 농도" 시스템에는 약 800 ppm 미만의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 일본 세제는 통상 약 667 ppm의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 전형적으로 저 세제 농도 시스템으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "중간 세제 농도" 시스템에는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 북미 세제는 통상 대략 975 ppm의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 일반적으로 중간 세제 농도 시스템인 것으로 간주된다. 브라질 세제는 전형적으로 대략 1500 ppm의 세제 성분이 세척수에 존재한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "고 세제 농도" 시스템에는 약 2000 ppm 초과의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 유럽 세제는 대략 3000~8000 ppm의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 일반적으로 고 세제 농도 시스템인 것으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "직물 세정 조성물"에는 얼룩진 직물 (예를 들어 옷감, 린넨 및 기타 텍스타일 물질)의 적심 및/또는 예비처리에 사용하기에 적합한 조성물 및 세탁 첨가 조성물을 포함하는 손세탁 및 기계세탁 세제 조성물이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "비-직물 세정 조성물"에는 식기세척 세제 조성물, 구강 세정 조성물, 의치 세정 조성물 및 개인 세안 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-텍스타일 (즉, 직물) 표면 세정 조성물이 포함된다.
본원의 세정 조성물의 "압축" 형태는 밀도에 의해, 그리고 조성에 있어서 무기 충전제 염의 양에 의해 가장 잘 반영된다. 무기 충전제 염은 분말 형태의 세제 조성물이 통상적인 성분이다. 통상적인 세제 조성물에서, 충전제 염은 상당한 양으로, 전형적으로 총 조성의 17~35 중량%로 존재한다. 반대로, 압축 조성물에서, 충전제 염은 총 조성의 15% 를 넘지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 충전제 염은 조성의 10 중량%를 넘지 않는 양으로, 또는 더욱 바람직하게는 5 중량%로 존재한다. 일부 구현예에서, 무기 충전제 염은 설페이트 및 클로라이드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로부터 선택된다. 바람직한 충전제 염은 나트륨 설페이트이다.
본 발명은 관심있는 특정 환경 조건 하에 단백질의 성능을 최적화하기 위해 단백질을 조작하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 특정 환경 조건 하에 효소의 촉매 활성을 최적화하기 위해 효소를 조작하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 출발 또는 모체 (parent) 효소와 비교해 세제 제형에서 성능이 향상되었음을 나타내는 효소 변이체를 수득하기 위해, 효소 (예를 들어, 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제) 의 순 표면 전하 및/또는 표면 전하 분포를 변경하는 방법을 제공한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 세제 제형에서 향상된 세정력을 갖는 하나 이상의 변이체 중성 메탈로프로테아제 및/또는 변이체 세린 프로테아제를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 중성 메탈로프로테아제의 변이체를 제공한다. 다른 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 셀룰로모나스 보고리엔시스 (Cellulomonas bogoriensis) 단리물 69B4 세린 프로테아제의 변이체를 제공한다. 본 발명은 세정, 표백 및 소독을 포함하나 이에 제한되지 않는 적용에서 특정하게 사용된다. 추가로, 본 발명은 불리한 환경 조건 하에서 효소의 촉매 활성을 최적화하기 위해 효소를 조작하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제의 순 표면 전하 및/또는 표면 전하 분포를 변경시켜, 세제 제형에서 향상된 성능을 나타내는 효소 변이체를 수득하는 방법을 제공한다.
많은 단백질 및 효소는 세탁 세제에서 저장 시 변성을 받기가 매우 쉽고 불가역적인 변성을 받게 된다. 세탁 세제는 음이온성, 양이온성 및 비-이온성 계면활성제를 함유하는 것으로 알려져 있으며, 여기서, 계면활성제는 물에서의 그의 이온 (전기 전하) 특성에 의해 분류된다. 이들 성분은 단백질 분자의 표면 전하와 상호작용하여, 단백질 변성 (예를 들어, 구조 및 기능의 결실) 을 초래한다.
2 가지 프로테아제, ASP (세린 프로테아제) 및 NprE (중성 메탈로프로테아제) 는 LAS 와 같은 계면활성제를 포함하는 세제 제형에서 보관 시 고도로 불안정한 것으로 나타났다. LAS 는 전체 음전하가 단백질 표면 상에 위치한 아미노산의 양성으로 하전된 측쇄와의 상호작용을 증진시키는 음이온성 계면활성제이다. 상기 정전기적 상호작용은 정전기적 상호작용을 약화시키거나 또는 그의 안정화를 방해함으로써, 단백질 고유의 안정성에 영향을 준다. 다음, 탈안정화된 단백질은 접힘이 풀리고, 불활성이 된다.
프로테아제 표면 상 하전된 잔기의 분포는 세정력에 강하게 영향을 미치는 것으로 발견되었다. 본 발명의 단백질-조작 방법은 프로테아제의 순 표면 전하 및/또는 표면 전하 분포를 최적화함으로써, 세제 제형에서 하나 이상의 특성 중 향상된 성능을 위해 프로테아제를 효율적으로 최적화하는 것이다. 메탈로프로테아제 및 세린 프로테아제가 본 발명의 방법에 의해 제공된 방법을 예시하는데 사용됨에도 불구하고, 본 발명은 상기 특정 효소에 제한되는 것은 아니다. 실제로, 본 발명은 다양한 효소 및 다른 단백질과 함께 사용될 수 있다.
간락하게는, 본 발명의 일부 구현예에서 상기 방법에는 관심 효소에서의 많은 아미노산 잔기에서 위치-평가 라이브러리의 생성, 및 관심 특성에 대한 변이체 효소의 어세이가 포함된다. 이는 유익한, 중성, 및 해로운 돌연변이 뿐만 아니라 관심 특성(들)에 대한 최적 전하 변화 (모체 효소에 관한)가 확인되도록 한다. 일부 대안적인 구현예에서, 각각의 위치에서 전하를 바꾸는 돌연변이로 변이체를 생성하기 위한 모든 잔기의 전하 스캔은, 예를 들어 중성 잔기를 양성 및/또는 음성 전하로 돌연변이시키고, 하전된 잔기를 반대로 하전된 잔기 및/또는 중성 잔기로 돌연변이시킨다. 일부 추가적인 바람직한 구현예에서, 방법은 변이체의 복합 "전하-평형" 라이브러리 생성 (이는 원하는 방향에서 효소 전하를 바꾸는 유익한 돌연변이, 및 반대 방향에서 전하를 바꾸는 유익 또는 중성 돌연변이를 포함함), 이후 관심 특성(들)에 대해 전하-균형 라이브러리를 어세이하는 것을 포함한다. 따라서, 효소의 표면 전하, 및 표면 전하 분포는 동시에 최적화되며, 다중 특성에서 향상을 갖는 효소를 확인할 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 클래스의 효소 뿐만 아니라 프로테아제 (예를 들어 아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 만난아제, 펙티나아제, 아밀라아제, 리파아제 등)의 성능을 향상하는데 사용된다. 실제로, 본 발명은 임의의 특정한 효소나 효소의 클래스에 제한되도록 의도되지는 않는다. 또한, 본 발명은 특정 표면 전하 및 전하 분포를 필요로 하는 비-효소적 단백질 특성의 최적화에 사용된다 (예를 들어 발현, 세포-표면 결합, 제형에 대한 유순 등).
I. 향상된 특성을 갖는 프로테아제 변이체의 생성
많은 수의 위치-평가 라이브러리가 ASP 에 대해 구축되었으며, 여기서 성숙 단백질의 모든 아미노산은 대부분의 다른 아미노산으로 대체되었다 (미국 특허 출원 일련 번호 10/576,331 호 및 WO 2005/052146 참고). 이어서, 성능을 향상시키는 단일 돌연변이를 조합하고, 성능을 테스트하였다. SEL 및 돌연변이 조합 데이타의 후속한 분석은, 분자의 표면 전하의 변화에 의해 오염물 제거 성능이 유의하게 저하되었음을 나타내었다.
세제 내 ASP 의 오염물 제거 성능에 대한 표면 전하의 효과를 측정하여, 정의된 라이브러리를 디자인하였는데, 여기서, ASP 분자의 표면 전하는 시스템적으로 다양하였고, 변이체의 성능을 측정하였다. 액체 TIDE 에서의 향상된 세정력을 위해, 야생형에 대해 ASP 분자의 전하 변화를 억지로 발생시켰다 (예를 들어, +2 내지 -2 의 범위, 최적의 성능은 약 0 내지 -1 에서 발생함). 따라서, 만약 이러한 첨가가 이들 조건 하에 ASP 에 대한 총 전하 변화에 대한 제한을 어긴다면, 향상된 변이체와의 조합은 부가적이지 않다 (예를 들어, -2 미만 또는 +2 초과). 이후 인지되지 않는 전하 변화 한계의 측정은 돌연변이의 디자인을 할 수 있게 하여, 향상된 성능을 위한 최적의 전하가 있는 분자를 생성한다.
조합 "전하-균형" 라이브러리를 디자인하고, 구축하고, 스크리닝하였다 (전하-균형 라이브러리에 속하는 참조로서 삽입된 미국 출원 일련 번호 제 11/583,334 호 참조). 상기 라이브러리는 4 가지 유익한 음전하 돌연변이 및 4 가지 해롭지 않은 양전하 돌연변이 (음전하 돌연변이와 균형을 맞추기 위한 것임) 를 거의 모든 가능한 조합으로 함유하였다 (230/256 가능한 변이체). 상기 라이브러리를 많은 특성에 대해 스크리닝하고, 효소 변이체를 하나 이상의 관심있는 특성에서 상승된 활성을 갖는 것으로 규명하였다.
일부 구현예에서, 일단 최적의 전하가 주어진 효소에 대해 측정되면, 최적의 전하/전하 분포를 갖는 효소 변이체를 규명하기 위해 천연 단리물을 스크리닝하는 것이 또한 수행된다.
II . 향상된 특성을 갖는 NprE 변이체의 생성
ASP 를 사용한 접근을 이어서 완전히 상이한 프로테아제 골격에까지 확장시켰다. NprE 의 SEL 을 생성하고 세제에서의 오염물 제거능에 대해 스크리닝하였다 (SEL 에 관한 것인 참조로서 본원에 삽입된 미국 특허 출원 일련 번호 제 11/581,102 호 참조). 돌연변이체는 유의한 향상된 BMI 세정력을 갖는 것으로 규명하였다. 모든 향상된 돌연변이체는 NprE 분자에 양전하를 첨가하였다. 전하-균형 접근을 사용하여, NprE 의 순 표면 전하 및 표면 전하 분포를 최적화하였다. NprE 의 경우, 세정력은 분자의 전체 전하가 야생형 단백질의 것보다 더욱 양성인 경우에 유의하게 향상되었다. 야생형 단백질에 대해 단백질 상의 전하가 +1 또는 +2 인 경우, BMI 에 대해 최적의 세정력을 수득하였다.
III . 유익한 효소 변이체의 생성을 위한 일반적인 방법
본원에서 기재된 바와 같이, BMI 마이크로스와치 어세이에서의 세척 성능과 효소 표면상 전체 전하 사이의 관계를 측정하였다. 본 발명의 방법은 다양한 효소 및 단백질 (예를 들어 아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 만난아제, 펙티나아제 리파아제, 프로테아제 및 다른 효소)의 성능을 향상시키는데 사용된다. 추가로, 이들 방법은 발현, 열적 안정성, 계면활성제 및/킬란트에서의 안정성, 및 pH-활성 관계를 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질의 다른 바람직한 특성을 향상시키는데 사용가능하다. 간략하게는, 약 35% 초과로 용매에 노출, 바람직하게는 약 50% 초과로 용매에 노출, 및 가장 바람직하게는 약 65% 초과로 용매에 노출된 야생형 효소의 표면 상 위치한 아미노산 잔기가 확인되며, 각각의 야생형 잔기가 다수의 다른 자연 발생적 아미노산으로 치환되는 위치-평가 라이브러리가 생성된다. 또한, 이러한 구조-기능 관계를 정의하기 위해, BMI에서의 향상된 세척 성능을 나타내는 변이체 효소의 순 전하 변화가 주목된다. 추가적인 구현예에서, 주어진 효소에 대한 최적 전하가 측정되고 나면, 최적 전하/전하 분포를 갖는 효소 변이체를 확인하기 위해 천연 단리물이 스크리닝된다.
실험
본 발명의 특정 바람직한 구현예 및 측면을 나타내고 더 설명하기 위해, 하기의 실시예를 제공하며, 이는 이의 범주를 제한하는 것으로서 해석되지는 않는다.
하기의 실험 개시물에는 하기의 축약이 적용된다: ℃ (섭씨 온도); rpm (분 당 회전); H2O (물); HCl (염산); aa 및 AA (아미노산); bp (염기쌍); kb (킬로염기쌍); kD (킬로달톤); gm (그램); ㎍ 및 ug (마이크로그램); mg (밀리그램); ng (나노그램); ㎕및 ul (마이크로리터); ml (밀리리터); mm (밀리미터); nm (나노미터); μm 및 um (마이크로미터); M (몰); mM (밀리몰); μM 및 uM (마이크로몰); U (단위); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min (분); hr (시간); MgCl2 (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); OD28O (280 nm에서의 광학 밀도); OD405 (405 nm에서의 광학 밀도); OD600 (600 nm에서의 광학 밀도); PAGE (폴리아크릴아미드 젤 전기영동); EtOH (에탄올); PBS (인산 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.2]); LAS (라우릴 나트륨 설포네이트); SDS (나트륨 도데실 설페이트); 트리스 (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄); TAED (N,N,N'N'-테트라아세틸에틸렌디아민); BES (폴리에스테르설폰); MES (2-몰포리노에탄설폰산, 모노하이드레이트; f.w. 195.24; Sigma # M-3671); CaCl2 (염화칼슘, 무수; f.w. 110.99; Sigma # C- 4901); DMF (N,N-디메틸포름아미드, f.w. 73.09, d = 0.95); Abz-AGLA-Nba (2-아미노벤조일-L-알라닐글리실-L-류실-L-알라니노-4-니트로벤질아미드, f.w. 583.65; Bachem # H-6675, VWR 카탈로그 # 100040-598); SBG 1% ("글루코오스를 갖는 슈퍼 브로쓰"; 6 g 소이톤 [Difco], 3 g 효모 추출물, 6 g NaCl, 6 g 글루코오스); 당업계에 공지된 방법을 사용하여 멸균 전에 NaOH로 pH를 7.1로 조정하였음; w/v (중량 대 부피); v/v (부피 대 부피); Npr 및 npr (중성 메탈로프로테아제); SEQUEST® (SEQUEST 데이터베이스 검색 프로그램, University of Washington); Npr 및 npr (중성 메탈로프로테아제 유전자); nprE 및 NprE (B. 아밀로리퀘파시엔스 중성 메탈로프로테아제); PMN (정제된 MULTIFECT® 메탈로프로테아제); MTP (마이크로타이터 플레이트); MS (질량 분광학); SRI (오염물 제거 인자); TIGR (유전체 연구소, Rockville, MD); AATCC (미국 섬유화학 염색자 협회); Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); Beckman (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); EMPA (스위스 연방재료시험 연구소, St. Gallen, Switzerland); CFT (재료 시험 센터, Vlaardingen, The Netherlands); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (미국 미생물 보존 센터, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); Perkin-Elmer (Perkin-Elmer, Wellesley, MA); Rainin (Rainin Instrument, LLC, Woburn, MA); Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg, Germany); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL 또는 Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Epicentre (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI); Zymo Research (Zymo Research Corp., Orange, CA); Integrated DNA Technologies (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA): New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ); Thermoelectron (Thermoelectron Corp., Waltham, MA); BMG (BMG Labtech, GmbH, Offenburg, Germany); Greiner (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria); Novex (Novex, San Diego, CA); Finnzymes (Finnzymes OY, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medical Instrumentation 또는 GMI (Global Medical Instrumentation; Ramsey, MN); MJ Research (MJ Research, Waltham, MA); Infors (Infors AG, Bottmingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, UK); TOM (Terg-o-Meter); BMI (혈액, 밀크, 잉크); BaChem (BaChem AG, Bubendorf, Switzerland); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA); MicroCal (Microcal, Inc., Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); NCBI (National Center for Biotechnology Information); GE Healthcare (GE Healthcare, UK).
실시예 1
어세이
하기 어세이를 하기에 기재한 실시예에서 사용하였다. 하기에 제공된 프로토콜에서의 임의의 편차가 실시예에 나타난다. 이들 실험에서, 분광광도계를 사용하여 반응 완료 후에 형성된 생성물의 흡광도를 측정하였다. 반사율계를 사용하여 스와치 (swatch) 의 반사율을 측정하였다.
A. 96-웰 마이크로타이터 플레이트 ( MTP ) 에서의 단백질 함량 측정을 위한 BCA 어세이
이들 어세이에서, BCA (Pierce) 어세이를 사용하여 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 눈금 상에서 프로테아제 샘플 중 단백질 농도를 측정하였다. 상기 어세이 시스템에서, 하기의 화학 및 시약 용액이 사용되었다: BCA 단백질 어세이 시약, 및 Pierce 희석 완충액 (50 mM MES, pH 6.5, 2mM CaCl2, 0.005% TWEEN®-80). 사용된 설비는 SpectraMAX (340 유형) MTP 판독기였다. MTP를 Costar로부터 수득하였다 (9017 유형). 시험에서, 200 ㎕ BCA 시약을 각각의 웰에 파이펫팅한 후, 20 ㎕ 희석 단백질을 파이펫팅하였다. 충분한 혼합 후, MTP를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 공기 방울을 제거하고, 웰 내의 용액의 광학 밀도 (OD)를 562 nm에서 판독하였다. 단백질 농도를 측정하기 위해, 배경 판독값을 샘플 판독값으로부터 뺐다. OD562 값을 단백질 표준 (정제된 프로테아제)에 대해 표시하여 표준 곡선을 생성하였다. 샘플의 단백질 농도를 표준 곡선으로부터 추론하였다.
B. 프로테아제 성능을 시험하기 위한 마이크로스와치 어세이
사용된 설비에는 Eppendorf 열혼합기 및 SpectraMAX (340 유형; Molecular Devices) MTP 판독기가 포함된다. MTP는 Costar로부터의 것이었다 (9017 유형).
세제 제제 (TIDE® 2X 울트라, Clean Breeze 액체 세탁 세제 (Procter & Gamble); 미국 세척 조건)
Milli-Q 물을 6 gpg 물 경도 (Ca/Mg=3/1)로 조정하고, 0.78 g/1 TIDE® 2X 울트라 Clean Breeze 세제를 첨가하였다. 세제를 이전에 95℃에서 1시간 동안 열처리하여 제형에 존재하는 임의의 효소를 불활성화시켰다. 세제 용액을 15분 동안 교반하였다. 그후, 5 mM HEPES (자유산)을 첨가하고 pH를 8.2로 조정하였다.
마이크로스와치
CFT Vlaardingen으로부터 0.25 인치 환형 직경의 마이크로스와치을 수득하였다. 스와치을 절단하기 전에, 직물 (EMPA 116)을 물로 세척하였다. 한 마이크로스와치을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 두었다.
시험 방법
원하는 세제 용액을 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 열혼합기를 25℃에서 평형화한 후, 190 ㎕의 세제 용액을 MTP의 각각의 마이크로스와치-함유 웰에 첨가하였다. 상기 혼합물에, 10 ㎕의 희석된 효소 용액을 첨가하여 최종 효소 농도가 1 ㎍/㎖이 되도록 하였다 (BCA 어세이으로부터 측정됨). MTP를 테이프로 밀봉하고 인큐베이터에서 1400 rpm으로 회전시키면서 30분 동안 두었다. 적절한 조건 하 인큐베이션 후, 각각의 웰로부터의 100 ㎕의 용액을 새로운 MTP에 옮겼다. 100 ㎕용액/웰을 함유하는 새 MTP를 MTP SpectraMax 판독기를 사용하여 405 nm에서 판독하였다. 공백 대조군 뿐만 아니라 마이크로스와치 및 세제를 함유하나 효소는 함유하지 않는 대조군이 또한 포함되었다.
쌀 전분 마이크로스와치 어세이
쌀 전분 어세이는 아밀라아제 성능의 테스트이다. 본 문서 중 어디에나 기술된 바와 같이 세제를 제조하였다. 사용된 장치는 New Brunswick Innova 4230 쉐이커/인큐베이터 및 SpectraMAX (340 유형) MTP 판독기를 포함하였다. MTP 는 Corning (3641 유형) 에서 구입하였다. 주황색 안료 스와치가 있는 숙성된 쌀 전분 (CS-28) 은 테스트 물질 센터 (Vlaardingen, Netherlands) 에서 구입하였다. 0.25 인치의 환형 마이크로스와치로 자르기 전에, 직물을 물로 세정하였다. 2 개의 마이크로스와치를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 두었다. 테스트 세제를 20℃ (북미) 또는 40℃ (서유럽) 에서 평형화시켰다. 190 ㎕ 의 세제액을 마이크로스와치가 든 MTP 의 각 웰에 첨가하였다. 상기 혼 합물에, 10 ㎕ 의 희석된 효소액을 첨가하였다. MTP 를 접착 호일로 밀봉하고, 목적하는 테스트 온도 (전형적으로는 20℃ 또는 40℃) 에서 750 rpm 으로 진탕하면서 1 시간 동안 인큐베이터에 두었다. 인큐베이션 후, 각 웰의 용액 중 150 ㎕ 를 새 MTP 에 옮겼다. 이 MTP 를 SpectraMAX MTP 판독기를 사용해 488 nm 에서 판독하여, 세정량을 측정하였다. 공백 대조군, 뿐만 아니라 마이크로스와치 및 세제를 포함하는 그러나 효소는 포함하지 않는 대조군도 포함되었다.
효소 성능의 계산
수득한 흡광도 값을 공백 값에 대해 수정하였다 (즉, 효소의 부재 하에 마이크로스와치의 인큐베이션 후 수득된). 생성된 흡광도는 시험된 효소의 가수분해적 활성의 측정을 제공하였다.
H. 세제 열 불활성화
시판의 세제 제형의 열 불활성화는 비-효소적 성분의 특성을 유지하면서 임의의 단백질 성분의 효소 활성을 파괴하도록 작용한다. 따라서, 상기 방법은 o본 발명의 효소 변이체를 테스트하는데 사용하기 위해 시판의 구입한 세제를 제조하는데 적합하였다. 북미 (NA) 및 Western European (WE) 중질 액체 세탁 (HDL) 세제에 대해, 95℃ 에서 2 시간 동안 수조에 미리-중량을 잰 (pre-weighed) 액체 세제 (유리병 내) 를 넣음으로써, 열 불활성화를 수행하였다. 북미 (NA) 및 일본 (JPN) 중질 과립 세탁 (HDG) 세제의 열 불활성화를 위한 인큐베이션 시간은 8 시간이었고, 서유럽 (WE) HDG 세제에 대해서는 5 시간이었다. NA 및 WE 자동식기세척기 (ADW) 세제의 열 불활성화를 위한 인큐베이션 시간은 8 시간이었 다. 세제는 지역 슈퍼마켓에서 구입하였다. 열처리를 받지 않은 및 열처리를 받은 세제 둘 다 세제를 용해시키는 시간인 5 분 내에 어세이하여, 불활성화된 % 를 정확하게 측정하였다. 효소 활성을 suc-AAPF-pNA 어세이에 의해 테스트하였다.
열-불활성화된 세제에서 효소 활성을 테스트하기 위해, 열 불활성화된 원료 (원료) 로부터 세제의 작업 용액을 제조하였다. 적당한 양의 물의 경도 (6 gpg 또는 12 gpg) 및 완충액을 세제 용액에 첨가하여, 목적하는 조건을 맞추었다 (표 1-1). 병을 보텍싱하거나 또는 뒤집어서 상기 용액을 혼합하였다.
Figure 112009075183142-PCT00001
아밀라아제 활성의 측정을 위한 Bodipy -전분 어세이
EnzChek® 울트라 아밀라아제 어세이 키트 (E33651, Invitrogen) 를 사용해 Bodipy-전분 어세이를 수행하였다. 동결건조된 기질을 함유하는 바이알의 내용물을 pH 4.0 의 100 ㎕ 의 5OmM 나트륨 아세테이트 완충액에서 용해시킴으로써 DQ 전분 기질의 1 mg/㎖ 원료 용액을 제조하였다. 상기 바이알을 약 20 초 동안 보텍싱하고, 실온, 암실에서 용해될 때까지 간혹 혼합해주면서 놔두었다. 900 ㎕ 의 어세이 완충액 (50 mM 나트륨 아세테이트 + 2.6 mM CaCl2 pH 5.8) 을 첨가하고, 바이알을 약 20 초 동안 보텍싱하였다. 사용하기 전까지 기질 용액을 실온, 암실, 또는 4℃ 에서 보관하였다. 어세이를 위해, 어세이 완충액 내 1 mg/㎖ 기질 용액으로부터 DQ 기질의 100 ㎍/㎖ 의 작업 용액을 제조하였다. 190 ㎕ 의 100 ㎍/㎖ 기질 용액을 96-웰 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 내 각 웰에 첨가하였다. 10 ㎕ 의 효소 샘플을 웰에 첨가하고, 800 rpm 에서 열혼합기를 사용해 30 초 동안 혼합하였다. 완충액 및 기질만을 함유한 공백 (blank) 샘플 (비-효소 공백) 을 어세이에 포함하였다. 25℃ 에서 5 분 동안 형광 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 형광 세기의 변화율을 측정하였다 (여기 : 485 nm, 방출 : 520 nm).
K. 아밀라아제에 의한 전분 점도 감소의 측정
본 어세이에서, 옥수수 전분 기질 용액의 점도 감소를 점도계에서 측정하였다. 증류수에서 30% 옥수수 가루 건조 고체를 사용해 회분식으로 옥수수 전분 기질 슬러리를 방금 제조하였고, 황산을 사용해 pH 5.8 로 조정하였다. 각각의 진행 동안에, 50 g 의 슬러리 (15 g 건조 고체) 의 무게를 재고, 10 분 동안 예비인큐베이션시켜서, 70℃ 로 가온시켰다. 아밀라아제 첨가 시, 온도를 즉시 70℃ 에서 85℃ 로 끌어올렸고, 이 때의 회전 속도는 75 rpm 이었다. 일단 슬러리 및 아밀라아제 혼합물의 온도가 85℃ 에 도달하면, 상기 온도를 일정하게 유지 하고, 점도를 추가의 30 분 동안 모니터링하였다.
실시예 2
B. 서브틸리스에서의 NprE 프로테아제 생성
본 실시예에서, B. 서브틸리스에서 NprE 프로테아제를 생성하도록 수행된 실험이 기술된다. 특히, B. 서브틸리스에 플라스미드 pUBnprE 를 형질전환하는데 사용되는 방법이 제공된다. 형질전환을 당업계에 공지된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어, 본원에 참조로서 삽입된 WO 02/14490, 및 미국 특허 출원 일련 번호 제 11/581,102 호, 참조). 하기에 제공된 DNA 서열 (B. 아밀로리퀘파시엔스 (B.amyloliquefaciens) 의 nprE 리더, nprE 전구 및 nprE 성숙 DNA 서열) 은 NprE 전구체 단백질을 암호화한다 :
Figure 112009075183142-PCT00002
Figure 112009075183142-PCT00003
상기 서열에서, 굵은 글씨는 성숙 NprE 프로테아제를 암호화하는 DNA 를 지시하고, 보통의 폰트는 리더 서열 (nprE 리더) 을 지시하고, 밑줄 친 것은 전구서열 (nprE 전구) 을 지시한다. 하기 제공된 아미노산 서열 (NprE 리더, nprE 전구 및 NprE 성숙 DNA 서열) (SEQ ID NO:2) 은 전장 NprE 단백질에 상응한다. 상기 서열에서, 밑줄 친 것은 전구서열을 지시하고, 굵은 글씨는 성숙 NprE 프로테아제를 지시한다.
Figure 112009075183142-PCT00004
성숙 NprE 서열은 SEQ ID NO :3 에 나타나 있다. 상기 서열은 본원에 기술된 변이체 라이브러리의 제조를 위한 기본으로서 사용되었다.
Figure 112009075183142-PCT00005
2 개의 특정 프라이머를 사용한 PCR 에 의해 B. 아밀로리퀘파시엔스의 염색체 DNA 로부터 nprE 유전자를 증폭시켜 pUBnprE 발현 벡터를 구축하였다 :
Figure 112009075183142-PCT00006
Phusion High Fidelity DNA 중합효소 (FINNZYMES) 를 사용하여 서모사이클러 에서 PCR 을 수행하였다. PCR 혼합물은 10 ㎕ 5X 완충액 (Finnzymes Phusion), 1 ㎕ 1OmM dNTP, 1.5 ㎕ DMSO, 1 ㎕ 의 각각의 프라이머, 1 ㎕ Finnzymes Phusion DNA 중합효소, 1 ㎕ 염색체 DNA 용액 50 ng/㎕, 34.5 ㎕ MiIIiQ 물을 함유하였다. 하기 프로토콜을 사용하였다 :
PCR 프로토콜 :
1) 98℃ 에서 30 초 ;
2) 98℃ 에서 10 초 ;
3) 55℃ 에서 20 초 ;
4) 72℃ 에서 1 분 ;
5) 단계 2 내지 4 를 25 사이클 ; 및
6) 72℃ 에서 5 분.
이는 BglII 및 BclI DNA 제한 효소를 사용하여 분해된 1.9 kb DNA 절편을 초래하였다. 다중복사 바실러스 벡터 pUB110 (예를 들어, Gryczan, J Bacteriol, 134:318-329 [1978) 참조) 을 BamH1 을 사용해 분해하였다. 다음, PCR 절편 x BglII x BclI 을 pUB110 x BamH1 벡터에서 연결하여, pUBnprE 발현 벡터를 형성하였다.
pUBnprE 을 B. 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE: : (xylR,pxylA-comK) 균주에 형질전환하였다. B. 서브틸리스에의 형질전환은 본원에 참조로서 삽입된 WO 02/14490 에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 20 mg/L 네오마이신이 든 25 ml MBD 배지 (MOPS 기재 정의된 배지) 를 함유하는 쉐이크 플라스크에서 pUBnprE 벡터를 갖고 있는 B. 서브틸리스 형질전환체의 선택적인 성장을 수득하였다. NH4Cl2, FeSO4, 및 CaCl2 를 기본 배지에서 빼고, 3 mM K2HPO4 를 사용하고, 기본 배지에 60 mM 우레아, 75 g/L 글루코스, 및 1 % 소이톤을 보충한 것을 제외하고는, 당업계에 공지된 바와 같이 본질적으로 MBD 배지를 제조하였다 (Neidhardt 등, J Bacteriol, 119: 736-7 '47 [1974] 참조). 또한, 미량 원소는 1 ℓ 에서, 400 mg FeSO4·7H2O, 100 mg MnSO4·H2O, 100 mg ZnSO4·7H2O, 50 mg CuCl2·2H2O, 100 mg CoCl2·6H2O, 100 mg NaMoO4·2H2O, 100 mg Na2B4O7·10H2O, 10 ml 의 1 M CaCl2, 및 10 ml 의 0.5 M 나트륨 시트레이트를 함유하는 100 X 원료로서 제조되었다. 배양물을 인큐베이터/쉐이커 (Infors) 에서 37℃ 에서 3 일 동안 인큐베이션하였다. 상기 배양물은 프로테아제 어세이에 의해 측정되는 바와 같이, 단백질분해 활성을 갖는 분비성 NprE 프로테아제의 생성을 초래하였다. NuPage Novex 10% Bis-Tris 젤 (Invitrogen, 카탈로그 번호 NP0301BOX) 을 사용해 젤 분석을 수행하였다. 분석용 샘플을 제조하기 위해, 상층액 중 2 부피를 1 부피의 1 M HCl, 1 부피의 4X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen, 카탈로그 번호 NP0007), 및 1% PMSF (20 mg/㎖) 와 함께 혼합하고, 이어서 70℃ 에서 10 분 동안 가열하였다. 다음, 10 ㎕ 의 SeeBlue + 2 예비-염색된 (pre-stained) 단백질 표준물 (Invitrogen, 카탈로그 번호LC5925) 과 함께, 25 ㎕ 의 각각의 샘플을 젤에 로딩하였다. 결과는, 상기 실시예에서 기술된 nprE 클로닝 전략이 B. 서브틸리 스에서 활성 NprE 의 생성에 적합함을 분명하게 나타내었다.
실시예 3
B. 서브틸리스에서의 ASP 프로테아제 생성
본 실시예에서, B. 서브틸리스에서 69B4 프로테아제 (본원에서는 또한 "ASP," "Asp," 및 "ASP 프로테아제," 및 "Asp 프로테아제" 라고 함) 를 생성하기 위해 수행되는 실험을 기술한다. 특히, 플라스미드 pHPLT-ASP-Cl-2 를 B. 서브틸리스에 형질전환하는데 사용되는 방법이 제공된다. 형질전환은 당업계에 공지된 바와 같이 수행하였다 (본원에 참조로서 삽입된 예를 들어, WO 02/14490 및 미국 특허 출원 제. 11/583,334 호 참조). B. 서브틸리스에서의 ASP 발현을 최적화하기 위해, 합성 DNA 서열을 DNA2.0 에 의해 생성하였고, 이들 발현 실험에 이용하였다. 하기 제공된 DNA 서열 (합성 ASP DNA 서열) 은 바실러스 종에 적응된 코돈 사용과 함께, 야생형 ASP 전구체 단백질을 암호화한다 :
Figure 112009075183142-PCT00007
Figure 112009075183142-PCT00008
상기 서열에서, 굵은 글씨는 성숙 ASP 프로테아제를 암호화하는 DNA 를 지시하고, 보통의 폰트는 리더 서열 (ASP 리더) 을 지시하고, 밑줄 친 것은 N-말단 및 C-말단 전구서열을 지시한다. 하기 제공된 아미노산 서열 (SEQ ID NO:7) 은 전장 ASP 단백질에 상응한다. 상기 서열에서, 밑줄 친 것은 전구서열을 지시하고, 굵은 글씨는 성숙 ASP 프로테아제를 지시한다.
Figure 112009075183142-PCT00009
성숙 ASP 서열은 SEQ ID N0:8 에 나타나 있다. 상기 서열을 본원에 기술된 변이체 라이브러리를 제조하기 위한 기본으로서 사용하였다.
Figure 112009075183142-PCT00010
Asp 발현 카세트를 pXX-KpnI 벡터에서 구축하고, 이어서 B. 서브틸리스에서 ASP 를 발현하기 위해 pHPLT 벡터에 클로닝하였다. pXX-KpnI 은 B. 서브틸리스에서 복사수의 증폭을 위한 복제 aprE 프로모터, 발현을 구동하는 aprE 프로모터 (B. 서브틸리스), 및 cat 유전자가 있는 pUC 기재 벡터이다. bla 유전자는 이. 콜라이에서 선택적인 성장을 할 수 있게 한다. 리보좀 결합 부위에 도입된 KpnI, aprE 프로모터 영역의 하류는 HindIII 부위와 함께 pXX-KpnI 에서 Asp 발현 카세트에서 클로닝을 할 수 있게 한다. pHPLT 의 유도체인 pHPLT-EBS2c2 (Solingen 등, Extremophiles 5:333-341 [2001]) 는 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 의 열안정한 아밀라아제 LAT 프로모터 (PLAT) 를 함유하고, 이어서 클로닝 ASP 발현 구축물을 위한 XbaI 및 HpaI 제한효소 인식부위를 함유한다. Asp 발현 카세트를, 25 Asp C-말단 신호 펩타이드 아미노산에 융합된 5 서브틸리신 AprE N-말단 신호 펩타이드 아미노산의 구축된 하이브리드 신호 펩타이드 (SEQ ID NO:9) 를 암호화하는 DNA 를 함유하는 pXX-KpnI 벡터에서 클로닝하였다 :
Figure 112009075183142-PCT00011
하이브리드 ASP 신호 펩타이드는 하기 DNA 서열에 의해 암호화된다 :
Figure 112009075183142-PCT00012
pXX-KpnI 벡터에서 클로닝된 Asp 발현 카세트를 이. 콜라이에 형질전환하였다 (Electromax DHlOB, Invitrogen, Cat.No. 12033-015). 사용된 프라이머 및 클로닝 전략은 하기에 제공된다. 이어서, 발현 카세트를 이들 벡터로부터 클로닝하고, B. 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK) 균주에 형질전환하기 위한 pHPLT 발현 벡터에 도입하였다. pHPLT 에서의 ASP 발현 카세트 클로닝을 위한 프라이머 및 클로닝 전략 또한 하기에 제공된다.
프라이머를 MWG 및 Invitrogen 에서 구입하였다. Invitrogen 의 프로토콜에 따라, Invitrogen Platinum Taq DNA 중합효소 High Fidelity (카탈로그 번호 11304-029) 를 PCR 증폭 (0.2 μM 프라이머, 25 내지 30 사이클) 에 사용하였다. 접착 말단의 유전자 클로닝에 권고되는 프로토콜을 이용해 Invitrogen T4 DNA 리가아제 (Cat. No. 15224-025) 를 사용해 Asp 발현 카세트 및 숙주 벡터의 리가아제 반응을 완료하였다.
asp 유전자의 발현을 B. 서브틸리스 균주 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)) 에서 조사하였다. 플라스미드 pHPLT-ASP-C1-2 를 B. 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, Δ amyE::(xylR,pxylA-comK)) 에 형질전환하였다. 형질전환은 당업계에 공지된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어, 본원에 참조로서 삽입된 WO 02/14490 참조).
pHPLT-ASP-C1-2 벡터를 갖고 있는 B. 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)) 형질전환체의 선택적인 성장을 0.5 g/1 CaCl2 대신에 0.97 g/1 CaCl2·6H2O 및 20 mg/L 네오마이신이 든 25 ml 합성 Maxatase 배지 (SMM) 를 함유하는 쉐이크 플라스크에서 수행하였다 (본원에 참조로서 삽입된 미국 특허 제 5,324,653 호 참조). 상기 성장은 단백질분해 활성을 갖는 분비성 ASP 의 생성을 초래하였다. NuPage Novex 10% Bis-Tris 젤 (Invitrogen, 카탈로그 번호 NP030 IBOX) 을 사용해 젤 분석을 수행하였다. 분석용 샘플을 제조하기 위해, 상층액 중 2 부피를 1 부피의 1 M HCl, 1 부피의 4X LDS 샘플 완충액 (Invitrogen, 카탈로그 번호 NP0007), 및 1% PMSF (20 mg/㎖) 와 함께 혼합하고, 이어서 70℃ 에서 10 분 동안 가열하였다. 다음, 10 ㎕ 의 SeeBlue + 2 예비-염색된 (pre-stained) 단백질 표준물 (Invitrogen, 카탈로그 번호LC5925) 과 함께, 25 ㎕ 의 각각의 샘플을 젤에 로딩하였다. 결과는, 상기 실시예에서 기술된 Asp 클로닝 전략이 B. 서브틸리스에서 활성 Asp 의 생성에 적합함을 분명하게 나타내었다.
Figure 112009075183142-PCT00013
실시예 4
위치 평가 라이브러리 ( SEL ) 및 위치-포화 돌연변이 라이브러리 ( SSML ) 의 발생
본 실시예에서, nprE 및 asp SEL 의 구축에 사용되는 방법을 기술한다.
A. nprE SEL 의 생성
상기 기술된 nprE 발현 카세트를 함유하는 pUBnprE 벡터는 주형 DNA 로서 작용한다. 상기 벡터는 독특한 BglII 제한효소 인식부위를 함유하며, 위치 평가 라이브러리 구축에 유용하였다. 간략하게는, nprE 위치 평가 라이브러리를 구축하기 위해, 3 개의 PCR 반응을 수행하였는데, 이에는 관심있는 돌연변이된 코돈을 성숙 nprE DNA 서열에 도입하는 2 개의 돌연변이 PCR, 및 2 개의 돌연변이 PCR 을 융합하는데 사용되는 제 3 의 PCR 이 포함되며, 이로 인해, 성숙 nprE 서열에서 목적하는 돌연변이된 코돈을 포함하는 pUBnprE 발현 벡터를 구축하였다.
돌연변이 방법은 코돈-특이적 돌연변이 접근법을 바탕으로 하였는데, 여기서, 특정 DNA 트리플렛에서 한 번에 모든 가능한 돌연변이의 발생은 돌연변이되는 코돈의 서열에 상응하고 그러한 특정 nprE 성숙 코돈에서의 뉴클레오타이드의 무작위 혼입을 보장하는 특정 디자인된 트리플 DNA 서열 NNS (N = A, C, T 또는 G ; 및 S = C 또는 G) 을 넣는 25 내지 45 개 길이의 뉴클레오타이드가 있는 포워드 및 리버스 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행하였다. 프라이머 명칭에 열거되는 수는 특정 nprE 성숙 코돈 위치에 상응한다. 평가되는 부위에는 하기가 포함된다 : 4, 12, 13, 14, 23, 24, 33, 45, 46, 47, 49, 50, 54, 58, 59, 60, 65, 66, 87, 90, 96, 97, 100, 186, 196, 211, 214, 228 및 280. 실례의 프라이머 서열 목록은 본원에 참조로서 삽입된 미국 특허 출원 일련 번호 제 11/581,102 호에 기술되어 있다.
위치 평가 라이브러리를 구축하는데 사용되는 2 개의 추가의 프라이머는 BglII 제한효소 인식부위의 측면에 있는 pUBnprE DNA 서열의 일부와 함께 BglII 제한효소 인식부위를 함유하였다. 이들 프라이머는 Invitrogen (50 nmole 규모, 탈염됨) 에 의해 제조되었다.
Figure 112009075183142-PCT00014
각각의 SEL 의 구축은 pUB-BglII-FW 프라이머 및 특정 nprE 리버스 돌연변이 프라이머를 사용한 2 개의 1 차 PCR 증폭으로 시작하였다. 제 2 PCR 을 위해, pUB-BglII-RV 프라이머 및 특정 nprE 포워드 돌연변이 프라이머 (포워드 및 리버스 돌연변이 프라이머에 대한 동일한 nprE 성숙 코돈 위치) 를 사용하였다.
성숙 nprE 서열 내 돌연변이의 도입은 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소 (Finnzymes; 카탈로그 번호 F-530L) 를 사용해 수행하였다. 모든 PCR 을 중합효소가 공급된 Finnzymes 프로토콜에 따라 수행하였다. 1 차 PCR 을 위한 PCR 조건은 하기와 같았다 :
1 차 PCR 1 에 대해 : pUB-BglII-FW 프라이머 및 특정 NPRE 리버스 돌연변이 프라이머 - 둘 다 1 ㎕ (10 μM) ;
1 차 PCR 2 에 대해 : pUB-BglII-RV 프라이머 및 특정 NPRE 포워드 돌연변이 프라이머 - 둘 다 1 ㎕(10 μM) ; 와 함께
5 x Phusion HF 완충액 10 ㎕
1O mM dNTP 혼합물 1 ㎕
Phusion DNA 중합효소 0.75 ㎕ (2 단위/㎕)
DMSO, 100% 1 ㎕
pUBnprE 주형 DNA 1 ㎕ (0.1 - 1 ng/㎕)
증류된, 오토클레이브된 물 50 ㎕ 이하
PCR 프로그램은 하기와 같았다 : 98℃ 에서 30 초, 3O 회 (98℃ 에서 10 초, 55℃ 에서 20 초, 72℃ 에서 1.5 분) 및 72℃ 에서 5 분, PTC-200 Peltier 서모 사이클 (MJ Research) 에서 수행함. PCR 실험 결과, 대략 2 내지 3 kB 의 절편 2 개가 생성되었고, 이는 약 30 개 뉴클레오타이드 염기를 가졌고, 관심있는 NprE 성 숙 코돈 주변에서 오버랩되었다. 상기 2 개의 언급된 절편 및 포워드 및 리버스 BglII 프라이머를 사용한 제 3 PCR 반응에서 절편을 융합하였다. 융합 PCR 반응을 하기 용액에서 수행하였다 :
pUB-BglII-FW 프라이머 및 pUB-Bglll-RV 프라이머 - 둘 다 1 ㎕(10 μM), 와 함께
5 x Phusion HF 완충액 10 ㎕
10 mM dNTP 혼합물 1 ㎕
Phusion DNA 중합효소 0.75 ㎕ (2 단위/㎕)
DMSO, 100% 1 ㎕
1 차 PCR 1 반응 혼합물 1 ㎕
1 차 PCR 2 반응 혼합물 1 ㎕
증류된, 오토클레이브된 물 50 ㎕ 이하
PCR 융합 프로그램은 하기와 같았다 : 98℃ 에서 30 초, 3O 회 (98℃ 에서 10 초, 55℃ 에서 20 초, 72℃ 에서 2:40 분) 및 72℃ 에서 5 분, PTC-200 Peltier 서모 사이클 (MJ Research) 에서 수행함.
증폭된 선형 6.5 Kb 절편을 QIAQUICK® PCR 정제 키트 (Qiagen, 카탈로그 번호 28106) 를 사용해 정제하고, BglII 제한 효소를 사용해 분해하여, 융합 절편의 양 쪽 면 상에 접착 말단을 만들었다 :
- 35 ㎕ 정제된 선형 DNA 절편
- 4 ㎕ REACT® 3 완충액 (Invitrogen)
- 1 ㎕ BglII, 10 단위/㎖ (Invitrogen)
반응 조건 : 1 시간, 30°C.
QIAQUICK® PCR 정제 키트 (Qiagen, 카탈로그 번호 28106) 를 사용해 BglII 분해되고 정제된 절편의 연결은 목적하는 돌연변이를 함유하는 환형이면서 다중 결합의 DNA 를 생성하였다 :
- 30 ㎕ 정제된 BglII 분해된 DNA 절편
- 8 ㎕ T4 DNA 리가아제 완충액 (Invitrogen 카탈로그 번호 46300-018)
- 1 ㎕ T4 DNA 리가아제, 1 단위/㎕ (Invitrogen 카탈로그 번호 15224-017)
반응 조건: 16 ~ 20 시간, 16℃ 에서.
이어서, 연결 혼합물을 B. 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK) 균주에 형질전환하였다. B. 서브틸리스로의 형질전환은 본원에 참조로서 삽입된 WO 02/14490 에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 각각의 라이브러리에 대해, 96 개의 단일 콜로니를 집어 내고, 이를 스크리닝 목적 및 서열 분석 (BaseClear) 용 1.25 g/L 효모 추출물 및 네오마이신이 든 MOPS 배지에서 배양하였다. 각각의 라이브러리는 최대의 19 nprE 부위-특정 변이체를 포함하였다.
96 웰 MTP 내, 20 mg/L 네오마이신 및 1.25 g/L 효모 추출물이 든 MBD 배지 내, 37℃ 에서 68 시간 동안 B. 서브틸리스 SEL 형질전환체를 배양함으로써 변이체를 제조하였다.
B. Asp SSML 의 생성
본 실시예에서, Asp 의 위치-포화 돌연변이 라이브러리 (SSML) 를 개발하기 위해 수행된 실험이 기술되어 있다. 위치 포화 Asp 라이브러리 각각은 pHPLT-ASP-c1-2 발현 벡터를 갖는 96 개의 B. 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK) 클론을 함유하였다. 합성 DNA 서열 암호화로 이루어진 Asp 발현 카세트, Asp 하이브리드 신호 펩타이드 및 Asp N-말단 프로 및 성숙 단백질을 함유하는 상기 벡터는 하기 지시되는 단백질 (신호 펩타이드 및 전구체 프로테아제) 의 발현 및 성숙 Asp 프로테아제의 분비를 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112009075183142-PCT00015
Figure 112009075183142-PCT00016
189 개 Asp 부위 포화 돌연변이 라이브러리 (SSML) 의 구축을 주형으로서 pHPLT-ASP-C1-2 발현 벡터를 사용해 완성하였다. 이들 실험에 사용된 돌연변이 프라이머는 모두 돌연변이되는 Asp 성숙 서열의 코돈에 상응하는 위치에서 트리플 DNA 서열 코드 NNS (N = A, C, T 또는 G ; 및 S = C 또는 G) 를 함유하였고, 상기 위치에서의 뉴클레오타이드의 무작위 혼입을 보장하였다. 각각의 SSM 라이브러리의 구축은 pHPLT-BglII-FW 프라이머 및 특정 리버스 돌연변이 프라이머, 및 pHPLT-BglII-RV 프라이머 및 특정 포워드 돌연변이 프라이머 (돌연변이 프라이머에 대해 동등한 위치) 를 사용하는 2 개의 PCR 증폭으로 시작하였다. 특정 포워드 및 리버스 프라이머 서열의 실례의 목록은 프라이머 서열에 관한 것인 본원에 참조로서 삽입된 WO 2005/052146 에 기술되어 있다. pHPLT-BglII-FW 프라이머의 서열은 SEQ ID NO: 18 (GCAATCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACC) 에 나타나 있고 ; pHPLT-BglII-RV 프라이머의 서열은 SEQ ID NO : 19 (GCATCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTC) 에 나타나 있다.
Platinum Taq DNA 중합효소 High Fidelity (Invitrogen. 카탈로그 번호 11304-029) 를 제조업자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 PCR 증폭 (0.2 μM 프라이머, 20 내지 30 사이클) 에 사용하였다. 간략하게는, 특정 PCR 혼합물 둘 다의 1 ㎕ 증폭된 DNA 절편 (둘 다 동일한 코돈을 표적으로 함) 을 프라이머 pHPLT-BglII-FW 및 pHPLT-BglIIl-RV 가 있는 48 ㎕ 의 신선한 PCR 반응 용액에 첨가하였다. 상기 융합 PCR 증폭 (22 사이클) 은 무작위하게 돌연변이된 특정 Asp 성숙 코돈 및 2 개 말단 모두에 있는 독특한 BglII 제한효소 인식부위가 있는 선형 pHPLT-ASP-c1-2 DNA 절편을 생성하였다. 상기 DNA 절편 (Qiagen PCR 정제 키트, 카탈로그 번호 28106) 의 정제, BglII 를 사용한 이의 분해, 추가의 정제 단계 및 연결 반응의 수행 (Invitrogen T4 DNA 리가아제 (카탈로그 번호 15224-025) 은 환형 및 다중 결합의 DNA 를 생성하였고, 이어서 이를 B. 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK) 에 형질전환하였다. 각각의 라이브러리를 위해, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션한 후, 96 개의 단일 콜로 니를 20 mg/L 네오마이신이 든 Heart Infusion agar 플레이트에서 집어 내고, 20 mg/㎖ 네오마이신 및 1.25 g/L 효모 추출물이 든 MOPS 배지 내, 37℃ 에서 4 시간 동안 배양하였다 (본원에서 사용되는 정확한 배지 제형에 대해서는 본원에 참조로서 삽입된 WO 03/062380 을 참조). 스크리닝 목적을 위해 각각의 콜로니에 대해 서열 분석 (BaseClear) 및 프로테아제 발현을 측정하였다. 라이브러리 수의 범위는 1 내지 189 였고, 각각의 수는 무작위하게 돌연변이된 성숙 Asp 서열의 코돈을 나타낸다. 선별 후, 각각의 라이브러리는 최대 19 개의 Asp 프로테아제 변이체를 포함하였다.
실시예 5
위치 특이적 돌연변이를 통한 변이체 프로테아제의 생성
본 실시예에서, Quikchange® Multi 위치-특이적 돌연변이 키트 (Stratagene) 를 사용하여 nprE SEL 을 생성하는 방법이 기술된다. 그러나, 본원에 제공된 방법은 관심있는 다른 효소 (예를 들어, Asp) 의 SEL 의 생성에 적합하다. 상기 실시예 4 에서와 같이, nprE 발현 카세트를 함유하는 pUBnprE 벡터는 nprE SEL 및 NprE 변이체의 생성을 위한 주형 DNA 공급원으로서 작용하였다. 2 가지 방법 간의 주요 차이는 상기 방법이 상보성 위치-특이적 돌연변이 프라이머를 사용한 전체 벡터의 증폭을 필요로 한다는 점이다.
재료 :
pUBnprE 벡터를 함유하는 바실러스 균주
Qiagen 플라스미드 Midi 키트 (Qiagen 카탈로그 번호 12143)
Ready-Lyse 리소자임 (Epicentre 카탈로그 번호 R1 802M)
dam 메틸라아제 키트 (New England Biolabs 카탈로그 번호 M0222L)
Zymoclean Gel DNA 회수 키트 (Zymo Research 카탈로그 번호 D4001)
nprE 위치-특이적 돌연변이 프라이머, 1OO nmole 규모, 5' 인산화되고, PAGE 정제된 것 (Integrated DNA Technologies)
Quikchange® Multi 위치-특이적 돌연변이 키트 (Stratagene 카탈로그 번호 200514)
MJ Research PTC-200 Peltier 서모 사이클러 (Bio-Rad Laboratories)
1.2% 아가로스 E-젤 (Invitrogen 카탈로그 번호 G5018-01)
TempliPhi 증폭 키트 (GE Healthcare 카탈로그 번호 25-6400-10)
경쟁적 B. 서브틸리스 세포 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)
방법 :
하나의 돌연변이를 함유하는 pUBnprE 플라스미드를 수득하기 위해 (실시예 4 및 본원에 참조로서 삽입된 미국 특허 출원 일련 번호 제 11/581,102 호에서 기술된 바와 같은 nprE SEL 스크리닝을 통해 규명됨), 관심있는 각각의 바실러스 균주의 단일 콜로니를 사용하여, 5 ml LB + 10 ppm 네오마이신 튜브 (예를 들어, 시작 배양물) 에 주입하였다. 225 rpm 에서 6 시간 동안 쉐이킹하면서, 상기 배양물을 37℃ 에서 배양하였다. 다음, 100 ml 의 신선한 LB + 1O ppm 네오마이신을 1 ml 의 시작 배양물과 함께 주입하였다. 225 rpm 에서 쉐이킹하면서, 상기 배 양물을 37℃ 에서 배양하였다. 상기 인큐베이션 후, 세포 펠렛을 충분한 원심분리에 의해 수합하여, 세포 펠렛을 제공하였다. 상기 세포 펠렛을 10 ml 완충액 P1 (Qiagen 플라스미드 Midi Kit) 에서 재현탁하였다. 다음, 1O ㎕ 의 Ready-Lyse 리소자임을 재현탁된 세포 펠렛에 첨가하고, 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 10 ml 의 완충액 P2 및 P3 을 사용해 Qiagen 플라스미드 Midi 키트 프로토콜을 계속하여, 세포 배양물의 증가된 부피를 계산하였다. 단일 nprE 돌연변이를 함유하는 각각의 pUBnprE 플라스미드의 바실러스로부터의 단리 후에, 각각의 플라스미드의 농도를 측정하였다. 다음, 플라스미드를 제조업자의 지시에 따라 dam 메틸라아제 키트 (New England Biolabs) 를 사용해 dam 메틸화시켜, 튜브 당 대략 2 ㎍ 의 각각의 pUBnprE 플라스미드를 메틸화시켰다. Zymoclean Gel DNA 회수 키트를 사용하여, dam-메틸화된 pUBnprE 플라스미드를 정제 및 농축시켰다. 다음, dam-메틸화된 pUBnprE 플라스미드를 정량화하고, 희석시켜 각각에 대해 50 ng/㎕ 의 작업 농도를 수득하였다. 혼합된 위치-특이적 돌연변이 프라이머를 각각의 반응에 대해 따로 제조하였다. 예를 들어, pUBnprE T14R 플라스미드를 주형 공급원으로서 사용하면, 혼합된 위치-특이적 돌연변이 프라이머 튜브는 10 ㎕ 의 nprE-S23R, 10 ㎕ nprE-G24R, 10 ㎕ nprE-N46K, 및 10 ㎕ nprE-T54R (각각 10 μM 에 있는 모든 프라이머) 를 함유할 것이다. Quikchange Multi 위치-특이적 돌연변이 키트 (Stratagene) 를 사용한 PCR 반응을 제조업자의 지시에 따라 수행하여 (예를 들어, 하나의 돌연변이 (50 ng/㎕) 를 함유하는 1 ㎕ dam 메틸화된 pUBnprE 플라스미드, 2 ㎕ nprE 위치-특이적 돌연변이 프라이머 (10 μM), 2.5 ㎕ 10x Quikchange Multi 반응 완충액, 1 ㎕ dNTP 혼합물, 1 ㎕ Quikchange Multi 효소 혼화물 (2.5 U/㎕), 및 17.5 ㎕ 증류된 오토클레이브시킨 물), 25 ㎕ 의 총 반응 혼합물을 수득하였다. nprE 변이체 라이브러리는 하기 조건을 사용해 증폭시켰다 : 95℃ 에서 1 분 동안 (제일 처음의 사이클에서만), 이어서 95℃ 에서 1 분 동안, 55℃ 에서 1 분 동안, 65℃ 에서 13.5 분 동안, 및 상기 사이클을 29 회 반복. 반응 생성물을 4℃ 에서 밤새 보관하였다. 다음, 반응 혼합물을 DpnI 분해 처리 (Quikchange® Multi 위치-특이적 돌연변이 키트가 제공됨) 시켜, 제조업자의 프로토콜에 따라 모체 pUB-nprE 플라스미드를 분해하였다 (즉, 1.5 ㎕ DpnI 제한 효소를 각각의 튜브에 첨가하고, 이를 37℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션함 ; 다음, 2 ㎕ 의 DpnI-분해된 PCR 반응을 1.2% E-젤 상에서 분석하여, PCR 반응이 작업되었고 모체 주형이 분해되었음을 확인함). 다음, TempliPhi 롤링 사이클 증폭을 사용하여, nprE 멀티 변이체의 라이브러리 크기를 증가시키기 위한 다량의 DNA 를 제조업자의 프로토콜을 사용해 생성하였다 (즉, 대략 11 ㎕ 총 반응물에 대해, 1 ㎕ DpnI 처리된 Quikchange Multi 위치-특이적 돌연변이 PCR, 5 ㎕ TempliPhi 샘플 완충액, 5 ㎕ TempliPhi 반응 완충액, 및 0.2 ㎕ TempliPhi 효소 혼합물 ; 3O℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션 ; 200 ㎕ 의 증류된, 오토클레이브한 물을 첨가하여 TempliPhi 반응물을 희석시키고, 간단히 보텍싱하였다. 다음, 1.5 ㎕ 의 희석된 TempliPhi 물질을 성분 B. 서브틸리스 세포에 형질전환하고, nprE 멀티 변이체를 LA + 10 ppm 네오마이신 + 1.6 % 스킴 밀크 플레이트를 사용해 선별하였다. 콜로니를 집어 낸 다음, 이를 서열화하여, 상이한 nprE 변이체 라이브러리 조합을 규명하였다.
표 5-1 은 이들 실험에 사용된 프라이머 명칭, 및 서열을 제공한다. 삽입된 DNA 기술은 모든 프라이머를 합성하였다 (100 nmole 규모, 5'-인산화된, 및 PAGE 정제된). 추가의 돌연변이 프라이머는 미국 특허 출원 일련 번호 제 11/581,102 호에 기술되어 있다).
Figure 112009075183142-PCT00017
본 실시예는 또한, 프로테아제 및 아밀라아제 모두에 대한 조합 전하 라이브러리 및 효소 전하 사다리의 생성을 기술한다.
효소 전하 사다리
일련의 관심있는 물리적 특성을 걸치는 다중 단백질 변이체를 기존의 라이브러리로부터 선택하고, 당업계에 공지된 바와 같은 위치-특이적 돌연변이 기술에 의해 생성하였다 (예를 들어, 미국 특허 출원 일련 번호 제 10/576,331 호, 제 11/581,102 호, 및 제 11/583,334 호 참조). 이는 프로브 단백질의 세트를 정의하고, 그런 다음 관심있는 테스트에서 어세이된다.
실례의 프로테아제 전하 사다리 변이체는 하기 표에 나타나 있으며, 본원에 기술된 바와 같이 어세이된다. 이들 표에서, 전하 변화는 야생형 효소에 대해서이다.
Figure 112009075183142-PCT00018
Figure 112009075183142-PCT00019
성숙 FNA 프로테아제의 아미노산 서열을 본원에 기술된 변이체 라이브러리를 제조하는 기본으로서 사용하였다 :
Figure 112009075183142-PCT00020
Figure 112009075183142-PCT00021
성숙 GG36 프로테아제의 아미노산 서열을 본원에 기술된 변이체 라이브러리를 제조하는 기본으로서 사용하였다 :
Figure 112009075183142-PCT00022
실례의 아밀라아제 전하 사다리 변이체는 하기 표에 나타나 있으며, 본원에 기술된 바와 같이 어세이된다. 이들 표에서, 전하 변화는 야생형 효소에 대해서이다.
AmyS 유전자의 서열을 제공하여 표 5-5 에 나타낸 25 개의 전하 사다리 변이체의 합성을 위한 Oracle (Mountain View, CA) 을 생성하였다. 유전자 Oracle 을 합성하고, AmyS 변이체를 벡터 pGov4 에 클로닝하고, 이들을 이.콜라이에 형질전환하였다. 미니프렙 (minprep) 에서 단리한 DNA, 뿐만 아니라 아가 스탭 (agar stab) 에서 단리한 DNA 를 각각의 변이체에 공급하였다.
변이체는 PCR 증폭되고, pHPLT B. 서브틸리스 발현 벡터에 클로닝된 것이었다.
Figure 112009075183142-PCT00023
Figure 112009075183142-PCT00024
성숙 AmyS 프로테아제의 아미노산 서열을 본원에 기술된 변이체 라이브러리를 제조하는 기본으로서 사용하였다 :
Figure 112009075183142-PCT00025
Figure 112009075183142-PCT00026
Figure 112009075183142-PCT00027
이탤릭체로 나타낸 치환된 아미노산이 있는 성숙 절단된 (truncated) S242Q 아밀라아제의 아미노산 서열을 본원에 기술된 변이체 라이브러리를 생성하기 위한 기본으로서 사용하였다 :
Figure 112009075183142-PCT00028
Figure 112009075183142-PCT00029
효소 조합 전하 라이브러리
B. 렌투스 서브틸리신 ( B. lentus subtilisin ) (= GG36 ) 조합 전하 라이브러리의 생성
코돈-향상된 GG36 유전자를 함유하는 pAC-GG36ci 플라스미드는 조합 전하 라이브러리 (CCL) 의 생성을 위해 DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) 에 보내졌다. 형질전환을 위해 바실러스 서브틸리스 균주 (유전형 : ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amy::wxylRPxylAcomK-phleo) 가 제공되었다. 또한, 표 5-7 에서 나타낸 GG36 프로테아제의 4 가지 부위의 각각에서 위치 라이브러리를 생성하기 위해 DNA2.0 Inc. 에 요청되었다. 변이체는 96-웰 플레이트에서 글리세롤 원료로서 제공되었다.
GG36 CCL 은 활성 부위 외부의 4 가지 잘-분포된, 표면-노출된 비전하성 극성 아미노산 잔기를 규명함으로써 디자인되었다. 이들 잔기는 Ser-85, Gln-107, Ser-182, 및 Asn-242 (BPN 번호매김에서 잔기 87, 109, 188, 및 248) 이었다. 각각의 부위 : 야생형, 아르기닌, 또는 아스파르트산에서의 3 가지 가능성의 모든 조합을 만듦으로써 81-원 조합 라이브러리 (G-1 내지 G-81) 를 제조하였다.
Figure 112009075183142-PCT00030
Figure 112009075183142-PCT00031
Figure 112009075183142-PCT00032
B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' - Y217L (= FNA ) CCL 의 생성
FNA 유전자를 함유하는 pAC-FNAre 플라스미드를 CCL 의 생성을 위해 DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) 에 보냈다. 상기 회사에 형질전환을 위해 바실러스 서브틸리스 균주 (유전형: ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amy::wxylRPxylAcomK-phleo) 도 제공하였다. 표 5-8 에 나타낸 4 개의 FNA 프로테아제 부위의 각각에서 위치 라이브러리를 생성하기 위한 요청을 DNA 2.0 Inc. 에 하였다. 변이체는 96-웰 플레이트에서 글리세롤 원료로서 제공되었다.
활성 부위 외부에서 4 가지 잘-분포된, 표면-노출된, 비전하성 극성 아미노산 잔기를 규명하기 위해 서브틸리신 BPN'-Y217L 조합 전하 라이브러리를 디자인하였다. 이들 잔기는 Ser-87, Asn-109, Ser-188, 및 Ser-248 이다. 각각의 부위: 야생형, 아르기닌, 또는 아스파르트산에서 3 가지 가능성의 모든 조합을 만들기 위해, 81-원 조합 라이브러리 (F-1 내지 F-81) 를 제조하였다.
Figure 112009075183142-PCT00033
Figure 112009075183142-PCT00034
B. 스테아로테모필루스 (B. stearothermophilus ) AmyS - S242Q CCL 의 생성
AmyS-S242Q 플라스미드 DNA 를 형질전환된 B. 서브틸리스 균주 (유전형: △aprE, △nprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) 로부터 단리하고, DNA2.0 Inc. 에 CCL 구축을 위한 주형으로서 보냈다. 표 5-9 에 나타낸 AmyS-S242Q (S242Q) 아밀라아제 내 4 개의 부위 각각에서 위치 라이브러리를 생성하기 위한 요청을 DNA 2.0 Inc. (Mountain View, CA) 에 하였다. 변이체는 96-웰 플레이트에서 글리세롤 원료로서 제공되었다.
AmyS S242Q 조합 전하 라이브러리는 하기 4 개의 잔기 : Gln-97, Gln 319, Gln 358, 및 Gln 443 의 규명에 의해 디자인되었다. 4 가지 부위, 81-원 CCL 은 각각의 부위 : 야생형, 아르기닌, 또는 아스파르트산에서의 3 가지 가능성의 모든 조합을 만듦으로써, 제조되었다.
Figure 112009075183142-PCT00035
Figure 112009075183142-PCT00036
실시예 6
변이체 프로테아제의 정제 및 특징화
본 실시예는 선행 실시예의 형질전환된 B. 서브틸리스에 의해 발현된 프로테아제를 정제하는데 사용되는 방법을 기술한다.
37℃ 에서 인큐베이션한 지 36 시간 후에, 발효액을 회수하고, 12,000 rpm (SORV ALL® 원심분리기 모델 RC5B) 에서 원심분리하였다. 분비된 중성 메탈로프로테아제를 배양액으로부터 단리하고, BES (폴리에테르술폰) 10 kDa 컷오프가 있는 Amicon 필터 시스템 8400 을 사용해 대략 10-배 농축시켰다. .
농축된 상층액을 10 mM NaCl 을 함유하는 25 mM MES 완충액, pH 5.4 에 대해 4℃ 에서 밤새 투석하였다. 다음, 투석물을 하기 기술된 바와 같은 양이온-교환 칼럼 Poros HS20 (총 부피 ~ 83 mL ; 결합력 ~ 4.5 g 단백질/㎖ 칼럼 ; 물) 에 로딩하였다. 상기 칼럼을 10 mM NaCl 을 함유하는 25 mM MES 완충액, pH 5.4 를 사용해 미리평형화시켰다. 다음, 대략 200 ~ 30O mL 의 샘플을 칼럼에 로딩하였다. 결합된 단백질을 10-칼럼 부피의 MES 완충액에 걸쳐서 5.4 내지 6.2 의 pH 구배를 사용해 용출하였다. 단백질 용출물은 pH 5.8 내지 6.0 이었고, 본원에서 기술된 바와 같이 10 % (w/v) NUPAGE® SDS-PAGE (Novex) 를 이용해 단백질분해 활성을 사용해 평가하였다. 다음, 분획을 함유하는 중성 프로테아제를 풀링하였다 (pooled). 3:1 의 비율로 있는 칼슘 및 아연 클로라이드염을 첨가하여, pH 를 5.8 로 조정하였다. Perceptive Biosystems BIOCAD Vision (GMI) 을 단백질 정제에 사용하였다.
10% (w/v) NUPAGE® SDS-PAGE 를 사용해 평가된 정제된 단백질은 균질한 것으로 측정되었고, 순도가 95% 초과였다. 전형적으로, 정제된 제제는 기질 N-숙시닐-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드 (Bachem) 를 사용한 표준 세린 프로테아제 어세이를 이용해 평가되었을 때, 무시할만한 세린 프로테아제 활성을 나타내었다. 단백질을 1 mM 아연 클로라이드, 4 mM 칼슘 클로라이드, 및 40 % 프 로필렌 글리콜이 든 25 mM MES 완충액, pH 5.8 을 사용해 보관용으로 제형하였다.
실시예 7
세정력
실시예는 액체 세제 내 0.25 ㎍/㎖ 에서 BMI (혈액, 밀크, 잉크) 마이크로스와치 어세이에서 NprE 및 ASP 변이체를 테스트하는 것을 기술한다 (BMI-TIDE® 2X 울트라 Clean Breeze" 성능 어세이).
표 7-1a 는 야생형 (WT) NprE 및 다양한 NprE 변이체에 대해 수득된 데이타를 요약한다. 표는 WT NprE 에 대해 아미노산 위치 및 치환, BMI 세정력, 및 순전하 변화를 열거한다.
표 7.1b 는 표 7-1a 에서 NprE 변이체 주어진 "AA" 정의에 함유된 돌연변이를 열거한다.
Figure 112009075183142-PCT00037
Figure 112009075183142-PCT00038
표 7-2a 및 7-2b 는 야생형 (WT) ASP 및 다양한 ASP 변이체에 대해 수득된 데이타를 요약한다. 표는 WT ASP 에 대해 아미노산 위치 및 치환, BMI 세정력, 및 순전하 변화를 열거한다.
Figure 112009075183142-PCT00039
Figure 112009075183142-PCT00040
따라서, 프로테아제 내 표면 전하 돌연변이는 BMI 상에서 그의 세정력에 영 향을 미치고, 단백질의 표면 전하의 최적화는 그의 세정력을 향상시킨다.
실시예 8
LAS 안정성
실시예에서, 0.06% LAS (도데실벤젠술포네이트 나트륨) 의 존재 하에 테스트 프로테아제의 인큐베이션 후에 LAS 안정성을 측정하고, 잔여 활성을 AAPF 어세이를 사용해 측정하였다.
시약 :
도데실벤젠술포네이트, 나트륨염 (=LAS) : Sigma D-2525
TWEEN®-80: Sigma P-8074
TRIS 완충액 (자유산) : Sigma T- 1378); 6.35 g 을 약 960 ml 물에 용해시키고 ; 4 N HCl 을 사용해 pH 를 8.2 로 조정함. TRIS 의 최종 농도는 52.5 mM 임.
LAS 원료 용액: MQ 물에서 10.5 % LAS 용액 (100 ml MQ 당 10.5 g) 을 제조함.
TRIS 완충액 - 100 mM / pH 8.6 (10O mM Tris/0.005% Tween80)
TRIS-Ca 완충액, pH 8.6 (10O mM Tris/1O mM CaCl2/0.005% Tween8O)
하드웨어 :
편평 바닥 MTP : Costar (#9017)
Biomek FX
ASYS 멀티파이펫터
Spectramax MTP 판독기
iEMS 인큐베이터/쉐이커
Innova 4330 인큐베이터/쉐이커
Biohit 멀티채널 파이펫
BMG Thermostar 쉐이커
방법 :
10 ㎕ 0.063% LAS 용액을 52.5 mM Tris 완충액 pH 8.2 에서 제조하였다. 1 ml 의 100 mg/㎖ AAPF 원료 용액 (DMSO 중) 을 100 ml (100 mM) TRIS 완충액, pH 8.6 에 첨가하여 AAPF 작업 용액을 제조하였다. 상층액을 희석하기 위해, 편평 바닥 플레이트를 희석 완충액으로 채우고, 상층액의 분획을 웰에 첨가 및 혼합하엿다. 희석비는 성장 플레이트 내 ASP-조절의 농도 (AAPF 활성) 에 의존한다. 목적하는 단백질 농도는 80 ppm 이었다.
희석된 상층액 중 10 ㎕ 를 190 ㎕ 0.063% LAS 완충액/웰에 첨가하였다. MTP 를 테이프로 덮고, 수 초 간 쉐이킹하고, 인큐베이터 (Innova 4230) 에 25℃ 에서 200 rpm 으로 진탕하면서 60 분 동안 놔두었다. 각각의 웰에 있는 혼합물 중 10 ㎕ 를 190 ㎕ AAPF 작업 용액이 든 신선한 MTP 에 옮김으로써, 초기 활성 (t=10 분) 을 인큐베이션 한 지 10 분 후에 측정하였다. 이들 용액을 잘 혼합하고, MTP 판독기 (25℃ 에서 5 분 내에 20 회 판독) 를 사용해 AAPF 활성을 측정하였다.
인큐베이션한 지 60 분 후에 인큐베이션 플레이트에서 또다른 10 ㎕ 의 용액을 제거함으로써 최종 활성 (t = 60 분) 을 측정하였다. 다음, AAPF 활성을 상기 기술된 바와 같이 측정하였다. 계산은 하기와 같이 수행하였다 : % 잔여 활성은 [t-60 값] * 100 / [t-10 값] 이었다.
일부 구현예에서, 변이체 분석을 위한 바람직한 방식은 관심있는 방법에서 변이체 대 (vs) 모체 단백질에 대한 자유 에너지 차이를 통해서이다. 주어진 방법을 위해, 모체 효소 (ΔΔ G) 에 대한 Gibbs 자유 에너지 변화는 하기와 같이 주어진다 :
ΔΔG = -RT ln (k변이체/k모)
(여기서, k변이체 는 변이체 효소에 대한 속도 상수이고, 및 k모체 는 모체 효소에 대한 속도 상수이고, R 은 기체 법칙 상수이고, T 는 절대 온도임). 대부분의 어세이는 참 자유 에너지의 측정을 가능하도록 구축되지 않아서, 겉보기 자유 에너지 변화 (ΔΔGapp) 가 하기와 같이 정의된다 :
ΔΔGapp = -RT ln (P변이체/P모)
(여기서, P변이체 는 변이체에 대한 성능 값이고, P모체 는 동일 조건 하에 모체 효소에 대한 성능 값임). LAS-안정성의 ΔΔGapp 값의 계산을 위해, 야생형의 잔여 활성을 야생형 분자 (P모) 의 성능에 대한 측정으로서 정의하고, 변이체의 잔여 활성을 변이체 분자 (P변이체) 의 성능에 대한 측정으로서 정의한다. ΔΔGapp 의 음성값은 변이체의 LAS 안정성의 향상을 지시하고, 한편, 양성 ΔΔGapp 값은 감소된 LAS 안정성을 가진 변이체의 지표이다.
다음, +2 내지 -7 의 범위에 대해, 야생형 효소에 대한 전하 변화의 빈 (bin) 에 대해 평균 ΔΔGapp 값을 컴퓨터화하였다. 상기 분석으로부터, ASP 효소의 총 음전하를 증가시키는 것이 LAS 에 대한 효소의 안정성을 증가시킨다는 것이 분명해진다.
Figure 112009075183142-PCT00041
실시예 9
효소 성능
본 실시예는 다양한 이온 세기 하에 AATCC HDL 세제 또는 5 mM HEPES 완충액 내, 1.0 ㎍/㎖ 에서 BMI (혈액, 밀크, 잉크) 마이크로스와치 어세이에서 ASP 변이 체를 테스트하는 것을 기술한다. 또한, 다양한 시장 지리학 (예를 들어, pH, T, 및/또는 물의 경도의 다르게 하면서) 을 나타내는 세제에서, 세탁 및 자동식기세척 적용 둘 다에서, BMI 마이크로스와치 및 구운 계란 어세이에서 FNA 및 GG36 변이체의 테스트를 기술한다. 본 실시예는 추가로, 세정 적용에서, 뿐만 아니라 전분 액화에서 알파-아밀라아제 변이체의 테스트를 기술한다. 실시예 1 에서 제공된 방법을 사용하였다 ("효소 성능 어세이" 및 "옥수수 가루 가수분해" 참조).
도 1A 에서 나타낸 바와 같이, AATCC HDL 세제에서 ASP 에 대한 세정력에 대해 최적의 순전하 변화가 있다. 성능은 BMI 마이크로스와치 어세이에서 관찰된 상대적 세정력에 관해 측정된다. 약 1.0 의 값은 상기 어세이에서 최상의 세정력을 지시한다. 도에서 알 수 있듯이, 야생형에 대해 극도의 음성 (-5) 또는 양성 (+3) 전하의 축적은 불량한 세정력을 초래한다. 야생형 ASP 에 대해 -2 에서 집중되어 있는 세정력에 대한 분명한 전하 최적이 있다. 이는 주어진 결과 또는 이점 (예를 들어, 액체 세탁 세제에서의 세정력) 을 향상시키기 위한, 단백질 물리적 특성 (예를 들어, 순전하) 을 최적화하는 예이다. 프로브 단백질의 상기 제한된 세트와 일치하는 전하 최적은 도 1B 에서 나타낸 전체 ASP 전하 조합 라이브러리를 측정하는 경우 관찰되는 최적 전하와 일치한다. 따라서, 프로브 단백질의 사용은 전체 라이브러리의 거동의 예고자이다.
Debye-Hueckel 이론 (Israelachivili, Intermolecular and Surface Forces, Second Edition: With Applications to Colloidal and Biological Systems, Academic Press 2nd Ed. [1992]) 에 따르면, 정전기적 상호작용은 정전압 또는 정전하 (효소, 기질, 직물 및 세제) 에서의 상호작용하는 종 간의 이중층 힘의 세기, 그의 크기, 및 주변 배지의 유전 상수에 의해 주로 지배된다. 세제 제형과 같은 복합적인 배지에서 입자의 정전기적 거동을 특징화하기 위해, 동일한 Debye 스크리닝 길이를 갖는 환원된 환경에서의 그의 상호작용은 충분하다. 이는, 세정 조건 하에 세제의 것에 pH 및 전도성을 매칭하는 완충액을 선택함으로써 달성된다. 도 1A 에 지시한 바와 같이, 상기 완충액에서의 ASP 전하 사다리의 스크리닝은 에 AATCC 세제 (채워진 원) 에서 관찰된 -2 에서 전하 최적을 정확하게 예고하였다. 도 2 는 중요하지 않은 전해질, 이 경우 NaCl 의 양을 다양하게 하면서, pH 8.0 에서 5 mM HEPES 완충액에서, 야생형 ASP 에 대해 전하 변화의 함수로서 상대적인 BMI 오염 제거를 도시한다. 2.5 mM NaCl 을 상기 완충액에 첨가하는 것은, 전형적인 북미 세정 조건의 pH 및 전도성을 맞추는 것이다. 더 높은 농도의 NaCl 의 첨가는 일본 및 유럽 세정 조건을 대표하는 것이고, 전형적으로 증가된 물의 경도 및 세제 농도 둘 다로 인해 이온 세기가 더 높다. 따라서, ASP 전하 최적은 용액 환경의 기능이다 (예를 들어, 세제 제형).
2 가지 특징이 즉시 분명해진다. 우선, pH 및 전도성을 맞추는 환원된 완충액 환경에서의 주어진 물리적 특성 (예를 들어, 전하 사다리 ASP 변이체) 에 대한 프로브 단백질의 제한된 수로 이루어진 모델 시스템의 사용은 세제 조건 하에 스크리닝된 큰 ASP 라이브러리의 거동의 예고자이다. 실제로, 2.5 mM NaCl (채워지지 않은 원) 이 든 완충액에서 측정된 도 1A 에서 나타낸 전하 최적은 북미 세 정 조건 하에서 AATCC 세제에서 스크리닝된 상기 ASP 전하-사다리에 대해 관찰된 최적과 일치한다. 둘째로, 전하 최적의 위치는 이온 세기의 강한 기능이다. 야생형 ASP 에 대해 양전하와 함께 변이체로 전하 최적을 이동시키는 NaCl 의 추가 첨가. 짧게는, 전하 사다리 단백질 프로브의 사용은 다양한 지리학적 시장의 제형 대표에 걸쳐서 상이한 효소 변이체의 성능을 빨리 예고할 수 있게 한다.
상기 관찰은, 서브틸리신 FNA 및 GG36 와 같은 다른 세린 프로테아제에 대해서도 그러하다. 예를 들어, 도 3A 및 3B 는 TIDE 2X 세제를 사용하는 북미 세탁 조건 하에 세정력에서, 각각 FNA 및 GG36 에 대해 최적 전하를 나타낸다. 왼쪽의 Y-축은 마이크로스와치 세정력을 나타내고, 여기서, 더 높은 수는 탁월한 BMI 오염 제거를 지시한다. 오른쪽의 Y-축은 모체 분자 (채워지지 않은 기호) 에 대해 변이체 (채워진 기호) 의 세정력으로서 정의되는 성능 지수를 보여준다. 수평선은 어세이의 노이즈 상의 2 또는 3 의 표준 편차에서의 성능 지수를 지시한다. FNA 전하 조합 라이브러리 (CCL) 는 모체 FNA 에 대해 0 전하 변화에서 전하 최적을 보여주며, 한편, GG36 CCL 은 GG36 모에 대해 음성의 2 개의 전하에서 최적을 보여준다.
도 4A, 4B, 5A 및 5B 는 전하 최적의 위치는 물의 경도 및 세제 농도로 인해 세제 제형, pH, 온도 및 이온 세기에 의해 측정되는 용액 환경의 기능임을 나타낸다. 예를 들어, FNA CCL 에 대한 전하 최적은 북미 세탁 조건 하에 0 에서 서유럽 및 일본 조건 하에 더 많은 양전하로 급격하게 이동한다. 더욱이, 전하 최적은 액체 및 과립 (분말) 세탁 세제 제형 둘 다에서 관찰된다. 유사하게는, 전하 최적은 도 6A 및 6B 에서 나타낸 바와 같이 효소 기질로서 (예를 들어, Reckitt Benckiser Calgonit 4O℃, 12 gpg, pH 10) 구운 계란에 대한 자동식기세척 (ADW) 세제에서 FNA 및 GG36 둘 다에 대해 관찰된다.
본 발명의 개발 동안에 나타난 바와 같이, 상이한 세제 내 프로테아제 전하 변이체 (예를 들어, ASP, GG36, FNA 등) 의 세정력은 작업 용액 pH 및 전도성에 의해 크게 지배된다. 최종 전도성은 이온 세기의 측정값이고, 물의 경도, 세제 농도 및 조성물로 인한 것이다. 예를 들어, pH 10.6 및 3.0 mS/cm 의 전도성에서 수행되는 경우 유럽 및 북미 ADW 세제 하에서 구운 계란 오염물에 대한 GG36 및 FNA 변이체의 세정력 간에 관계가 있다. 특히, 전하 변이체의 세정력은 잘 관련되어 있고, 제공된 pH 및 전도성은 동일하다. 이러한 발견은, pH 및 전도성을 매칭하는 또다른 세제를 초래하는 추정에 대해, 주어진 세제를 사용한 효소 성능을 스크리닝하는 것을 가능하게 한다. 마찬가지로, 유사한 작업 pH 및 전도성을 나타내는 세제를 초래하는 추정에 대해, pH 및 전도성을 매칭하는 완충액에서 효소 성능을 스크리닝하는 것이 가능하다.
작업 용액 pH 및 전도성의 강한 기능인, 세정 적용에서 아밀라아제 전하 변이체 (예를 들어, AmyS-S242Q, 및 AmyTS23t 등) 의 세정력을 위한 전하 최적이 존재한다. 구체적으로는, 본 발명의 개발 동안에 측정되는 바와 같이, S242Q 의 양전하 변화 변이체는 북미 세탁 조건 (예를 들어, TIDE 2X) 하에 쌀 전분 마이크로스와치의 세정에 대해 탁월하며, 한편 AmyTS23t 의 음성 전하 변화 변이체는 유럽 세탁 조건 하에 쌀 전분 마이크로스와치의 세정에 대해 탁월하다. 더욱이, 이러한 관찰은 전분 가수분해 반응에서 사용되는 아밀라아제에 대해서는 참이 된다. 도 7A 에 나타낸 바와 같이, 양성 S242Q 변이체는 BODIPY 전분 기질의 가수분해에 대해 더 높은 특이적인 활성을 나타낸다.
옥수수 전분의 액화 후에 최종 점도를 모니터링함으로써 AmyS 전하 사다리 변이체에 의한 전분 액화를 측정하였다. 낮은 점도 값은 전분 폴리사카라이드의 분해의 지표이다. 도 7B 에 나타낸 바와 같이, 전하 최적 (예를 들어, -4 내지 -2) 은 액화에 대해서 관찰되었다. 매우 음성이었던 (예를 들어, -12 내지 -10) AmyS 변이체는 매우 높은 최종 점도를 나타내었고, 매우 양성인 (예를 들어, +6 이상) 변이체는 심지어 더 높은 최종 점도 (예를 들어, 토르크 오버로드로 인해 실험실 장비의 한계를 넘어서는 점도) 를 나타내었다.
실시예 10
단백질 발현
본 실시예는 단백질 전하 및 단백질 발현 간의 관계를 측정하기 위해 기술된다.
14 ℓ 발효기 규모에서의 ASP 변이체의 제조
-5 내지 +3 으로 전하가 다양한 ASP 프로테아제 조합 전하 라이브러리 변이체 (R14I-N112E-T116E-R123F-R159F, R14I-N112E-T116E-R123F, R14I-N112E-T116E, R14I-N112E, R14I, R14I-D184T, R14I-D184T-T86K, R14I-T86K-D184T-A64K 및 R14I-T86K-D184T-A64K-Q81K) 의 제조 수준을 비교하기 위해, 14 ℓ 규모 상에서 1 세트의 유가 발효를 수행하였다. 각각의 변이체에 상응하는 1 mL 의 바실러스 서 브틸리스 글리세롤 원료와 함께 600 mL 의 배양 배지 (LB 액 + 1% 글루코스 + 20 mg/L 네오마이신) 이 든 2 ℓ 언배플드 (unbaffled) 쉐이크 플라스크에 주입하여 시드 배양물 (Seed culture) 을 배양하였다. OD550 이 0.8 ~ 1.5 에 도달할 때까지, 쉐이킹 인큐베이터에서 175 rpm 으로 진탕하면서 상기 배양물을 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 이 때, 전체 시드 배양물을 함입 조절기가 있는 14 ℓ 발효기에 무균처리하면서 옮겨 하기를 모니터링하였다 : 온도, 용존 산소 % (% DO), pH 및 진탕. 오프 기체 (Off gas) 를 인-라인 분광계에 의해 모니터링하였다. 사용된 발효 배지 (7 ℓ) 는 20 mg/L 에서 추가의 네오마이신, 마그네슘 술페이트, 및 미량의 무기물이 든 인산염 기재 완충액 내 10% 소이 밀 (soy meal) 로 이루어졌다. 초기 발효 파라미터는 : 37℃ 온도, pH 6.8 (진행 중에 수산화암모늄으로 조정함), 750 rpm 진탕, 40% DO (공기를 조정 및 진탕함으로써 진행 중에 유지됨), 11 slpm 기류, 및 1 bar 압력으로 설정되었다. 필요하다면, 소포제 (Mazu DF204) 를 거품 조절을 위해 첨가하엿다. 10 시간에 걸쳐 0.5 내지 2.1g/분의 글루코스 선형 공급물의 유가 공정을 프로그래밍하였는데 (공급을 위해 60% 글루코스 용액을 사용), pH 는 유도하면서 상승한다. 발효 샘플링을 매 4 시간마다 하였는데, 전체 액 중 15 ml 을 취하여, 하기 측정을 수행하였다 : 분광계 상에서의 세포 밀도 (550 nm 에서 흡광도를 측정함), ASP 변이체 생성, 글루코스, 질소, 인산염 및 총 단백질. 총 발효 진행 시간은 40 내지 45 시간이었다.
Aaa - Pna 어세이를 사용한 ASP 변이체 타이터의 측정
발효 동안에 수득된 B. 서브틸리스 배양물의 샘플을 변이체 ASP 프로테아제의 생성에 대해 어세이하였다. 생성된 효소를 기질인 N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드 (AAA-pNA) 에 대한 활성에 대해 어세이하였다. 상기 어세이는 가수분해로 인한 405 nm 에서의 흡광도 증가 및 p-니트로아닐린의 방출로서 개질된 프로테아제의 생성을 측정하였다 (Estell 등, J Biol Chem, 260: 6518-6521 [1985]). 발효기에서 맑게 된 B. 서브틸리스의 분획물을 하기를 함유하는 완충액에서 어세이하였다 : 100 mM Tris, 0.01 mM CaCl2, 0.005% Triton X-100, pH 8.6. 야생형 ASP 프로테아제 표준은 발효액에서 생성된 단백질 (g/L) 의 계산을 위한 보정 곡선을 만드는데 작용하였다.
도 8 은 야생형 ASP 에 대한 순전하의 함수로서 바실러스 서브틸리스에서 ASP 전하 사다리 프로브 단백질의 발현 수준을 도시한다. 상기 도면에서 나타난 바와 같이, 야생형 ASP 에 대한 극도의 음성 (-5) 또는 양성 (+3) 전하의 축적은 불량한 발현 수준을 초래하였다. ASP 전하 사다리 프로브 단백질의 사용은 주어진 숙주 개체에서 발현을 향상시키기 위한 최적의 순전하를 빠르게 규명하게 한다. 이러한 경우, 야생형 ASP 에 대한 -2 및 + 1 의 순전하 범위는 최적 발현 수준에 상응한다. 전하 최적 자체에서, ASP (-2) 에 대해 거의 4-배의 발현 향상이 극도의 전하 변화를 갖는 변이체와 비교해 관찰되었다. 쉐이크 플라스크 수준에서의 이러한 관찰은 14 ℓ 발효기 규모에서 확인되었다. 표 8-1 은 14 ℓ 발효기에서의 발현 중 2 개의 측정을 나타내며, ASP 는 대략 40 시간째의 타 이터이고, 뿐만 아니라 ASP 생성은 발현 곡선의 선형 부분에서 계산되었다. 쉐이크 플라스크 타이터는 마지막 칼럼에서 참조로서 제공된다. 모든 타이터는ASP-R14I 수준에 대해 정상화되었다. 야생형 ASP 에 대해 -2 내지 + 1 범위의 순전하 변화는 발효기 규모에서 최적의 발현 수준에 상응한다. 이는, 단백질의 물리적 특성, 이 경우 순전하를 최적화하며, 완전히 상이한 이점, 이 경우 재조합 단백질 발현을 조정하는 또다른 실시예이다.
Figure 112009075183142-PCT00042
숙주 세포에서의 단백질의 발현 및 분비는 발현된 단백질과 많은 숙주 단백질과의 상호작용을 포함한다. 특히 속도 제한 상호작용과 함께, 발현된 단백질과 숙주 세포 단백질과의 최적의 상호작용은 단백질 생성에 필수적이다. 상기 상호작용은 발현된 단백질 (또는 숙주 세포 단백질) 의 표면 전하/소수성의 개질에 의해 최적화될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 관여된 기작(들) 에 대한 지식은 본 발명을 만들고 이용하는데 필수적이지는 않다.
실시예 11
LAS 및 킬란트 안정성
본 실시예는 음이온성 계면활성제 및 킬란트 둘 다를 함유하는 반응 배지에서 단백질 전하 및 안정성 간의 관꼐를 측정하는 것을 기술한다. 스트레스를 받은 및 스트레스를 받지 않은 샘플의 프로테아제 활성의 측정을 위해, suc-AAPF-pNA 어세이를 사용하였다.
사용된 시약은 하기를 포함하였다 : 50 mM HEPES, 0.005% Tween-80, pH 8.0 ; 및 스트레스 완충액 50 mM HEPES, 0.1% (w/v) LAS (도데실벤젠-술포네이트, 나트륨염, Sigma D-2525), 10 mM EDTA, pH 8.0. 효소 변이체 (20 ppm) 를 대조군 또는 스트레스 완충액을 함유하는 96-웰 비-결합 편평 바닥 플레이트에 1:20 으로 희석하고, 혼합하였다. 대조군 플레이트를 실온에서 인큐베이션하고, 한편, 스트레스 플레이트는 즉시 37℃ 에서 30 ~ 60 분간 (테스트되는 효소의 안정성에 따라 달라짐) 놔두었다. 인큐베이션 후에, suc-AAPF-pNA 어세이를 이용해 효소 활성을 측정하였다. 남은 또는 잔여 활성의 분획은 스트레스 샘플의 반응 속도를 대조군 샘플의 반응 속도로 나눈 것과 동일하다. 모체 효소 및 변이체는 조절 완충액에서 60 분 동안 안정하다.
도 9 는 80 개의 변이체를 함유하는 라이브러리를 위해, 모체 FNA 에 대해 순전하 변화의 함수로서 LAS/EDTA 안정성을 도시한다. 상기 라이브러리를 실시예 5 에서 기술된 방법에 따라 디자인하고 구축하여, 모체 FNA 분자에 대해 다수의 순전하를 스팬하였다 (span). 상기 도면으로부터 알 수 있듯이, 모체 FNA 에 대해 음전하의 축적 (-4 이하) 은 조합된 LAS/킬란트 안정성에 대해 유익하다. 이는 복잡한 액체 세탁 환경에서 단백질 안정성을 향상시키기 위해, 단백질 물리적 특성, 이 경우 순전하를 최적화하는 실시예이다.
ASP 및 FNA 에 대해, LAS/EDTA 안정성에 대한 전하 의존성이 존재한다. 음전하 첨가는 안정성을 증가시킨다. 그러나, 1 또는 2 개의 전하가 모보다 더 양성이 되는 경우에조차, 본 발명의 방법에 의해, 모와 동일하게 또는 더 큰 안정성을 부여하는 전하 돌연변이의 정렬을 찾을 수 있다.
실시예 12
열적 안정성
본 실시예는 단백질 전하 및 열적 안정성 간의 관계를 알아보기 위해 기술된다. 프로테아제 어세이는 완충된 배양 상층액의 첨가 전 및 후의 디메틸카세인 (DMC) 가수분해를 바탕으로 하였다. 아밀라아제 어세이는 배양 상층액의 첨가 전 및 후의 BODIPY 전분 가수분해를 바탕으로 하였다. 상기 어세이를 위해 동일한 화학 및 시약 용액을 실시예 1 에서 기술된 바와 같이 사용하였다.
프로테아제에 대한 열적 안정성 어세이
여과된 배양 상층액을 PIPES 완충액에서 20 ppm 로 희석하였다 (성장 플레이트에서의 대조군 농도를 바탕으로). 우선, 10 ㎕ 의 각각의 희석된 효소 샘플을 취하여, 하기 기술된 바와 같이 디메틸카세인 어세이에서 초기 활성을 측정하고, 처리하였다. 다음, 50 ㎕ 의 각각의 희석된 상층액을 MTP 의 빈 웰에 놓았 다. MTP 플레이트를 iEMS 인큐베이터/쉐이커 HT (Thermo Labsystems) 에서 60℃ 및 400 rpm 에서 90 분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 얼음 상에서 5 분 동안 냉각시켰다. 다음, 10 ㎕ 의 용액을 200 ㎕ 디메틸카세인 기질/웰을 함유하는 새 MTP 에 첨가하여, 인큐베이션 후 최종 활성을 측정하였다. 상기 MTP 를 테이프로 덮고, 수 초 간 쉐이킹하고, 진탕 없이 37℃ 에서 2 시간 동안 오븐에 두었다.
샘플의 잔여 활성을 최종 흡광도 및 최초 흡광도의 비율로서 표현하고, 둘 다 공백에 대해 보정된 값이다. 도 10 은 SEL 라이브러리를 위해 야생형 ASP 에 대해 순전하 변화의 함수로서 열안정성 지수를 보여준다. 더 높은 지수는 더욱 열적으로 안정한 변이체를 지시한다. 도에서 나타낸 바와 같이, 야생형 효소에 대해 극도의 음성 (-2) 또는 양성 (+2) 전하의 축적은 열적 안정성에 대해 불리하다. 야생형 ASP 에 대해 0 의 순전하 변화에서 집중된 열적 안정성에 대한 구별되는 전하 최적이 존재한다. 이는 액체 세탁 적용을 위해 효소 열적 안정성을 안정시키기 위해, 단백질 물리적 특성, 이 경우 순전하를 최적화하는 실시예이다.
알파- 아밀라아제에 대한 열적 안정성 어세이
여과된 배양 상층액을 002% Tween 이 있는 5O mM 나트륨 아세테이트 + 2 mM CaCl2 pH 5.8 에서 단계 희석하였다. 10 ㎕ 의 각각의 희석된 배양 상층액을 어세이하여, 초기 아밀라아제 활성을 BODIPY 전분 어세이에 의해 측정하였다. 50 ㎕ 의 각각의 희석된 배양 상층액을 VWR 로우 프로파일 PCR 96 웰 플레이트에 두었다. 30 ㎕ 의 무기 오일을 밀봉제로서 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 모체 효소의 안정성에 따라 95℃ 에서 30 또는 60 분 동안 BioRad DNA 엔진 Peltier 서모 사이클러에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 4℃ 로 5 분 동안 냉각시키고, 다음 실온에서 유지시켰다. 10 ㎕ 의 각각의 샘플을 새 플레이트에 첨가하고, 및 실시예 1 에서 기술된 바와 같이 BODIPY 전분 어세이에 의해 최종 아밀라아제 활성을 측정하였다.
열안정성의 계산
샘플의 잔여 활성을 최종 흡광도 및 최초 흡광도의 비율로서 표현하였으며, 둘 다 공백에 대해 보정되었다. 이러한 관찰은 또한, 아밀라아제 전하 변이체를 사용해서도 이루어졌다. 도 11 은 야생형에 대해 전하 변화의 함수로서 제 1 AmyS 전하 사다리의 잔여 활성을 보여준다. 일단, 야생형 효소에 대해 극도의 음성 전하 (-12) 또는 양전하 (+10) 를 다시 축적하는 것은 열적 안정성에 대해 불리하다. 이는 액체 세탁 적용을 위해 효소 열적 안정성을 안정시키기 위해, 단백질 물리적 특성, 이 경우 순전하를 최적화하는 실시예이다.
실시예 13
효소의 pH -활성 프로파일의 조정
본 실시예는 주어진 반응에 대해 효소의 pH-활성 프로파일을 최적화하기 위해, 표면 전하 돌연변이를 사용하는 것을 기술한다.
도 12 는 실시예 5 의 제 1 AmyS 전하 사다리에 대한 pH 의 함수로서 쌀 전 분 마이크로스와치 세정 활성을 보여준다. 3.0 내지 4.25 의 pH 범위는 0.01% Tween-80 을 함유하는 200 mM Na 포르메이트에서 존재하였고, 한편, 4.25 내지 5.5 의 pH 범위는 0.01% Tween-80 을 함유하는 200 mM Na 아세테이트에서 존재하였다. 데이타를 적정 곡선에 맞추었고, 각각은 단일 pKa 값을 가졌다.
도 13 은 실시예 5 의 제 1 AmyS 전하 사다리에 대한 전하 변화의 기능으로서 AmyS 촉매분해에 대해 가시 pKa 값을 나타낸다. 이들 데이타는 알파-아밀라아제에 대한 pH-활성 프로파일이 200 mM 완충액에서조차 표면 전하 돌연변이에 의해 유의하게 이동될 수 있음을 기술한다. 이는 서브틸리신 (Russell 등, J Mol Biol, 193: 803-13 [1987]) 및 D-자일로스 이성질체 (Cha 등, Mol Cell, 8: 374-82 [1998]) 에 대한 매우 낮은 이온 세기에서 보고되었음에도 불구하고, 이는 처음에 알파-아밀라아제를 사용해 달성되었으며, 높은 이온 세기에서조차 달성된 것으로 생각된다.
본 발명의 특정 구현예가 예시되고 기술되는 한편, 당업자는 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 다른 변화 및 개질이 이루어질 수 있음을 알게 될 것이다. 따라서, 이는 본 발명의 범주 내에 속하는 모든 그러한 변화 및 개질을 첨부된 청구항에서 포함하는 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 발행물은 본 발명이 속하는 당업자의 수준의 지표이다. 모든 특허 및 공보는 본원에 참조로서 삽입되는데, 그 범위는 각각의 개별 공보가 참조로서 삽입되어 구체적으로 그리고 개별적으로 지시되었다.
본 발명의 바람직한 구현예를 기술하여, 당업자는 다양한 개질이 개시된 구 현예에서 이루어질 수 있으며, 그러한 개질이 본 발명의 범주 내에 속함을 알게 될 것이다.
당업자는 본 발명이 언급된 목적을 실행하고, 언급된 목표 및 장점, 뿐만 아니라 발명 고유의 것을 수득하기 위해 잘 조정된다는 것을 쉽게 인지한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 바람직한 구현예를 대표하는 것이고, 예시적이고, 본 발명의 범주에 대한 제한으로 의도되는 것은 아니다. 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 다양한 치환 및 변형이 본원에 개시된 본 발명에 대해 만들어질 수 있다는 것이 당업자에게 이의없이 명백하다.
본원에 설명으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한(들) 없어도 적합하게 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명을 위해 사용되며, 나타내고 기재된 특징 또는 그의 일부의 임의의 동등물을 제외하여 이러한 용어 및 표현을 사용하는 것으로는 의도되지 않으나, 청구된 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인지된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본원에 기재된 개념의 변형 및 변화가 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변화는 본원에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야만 한다.
본 발명은 본원에 광범위하고 일반적으로 기재되어 있다. 속명 개시 내에 포함되는 좀 더 좁은 종명 및 하부 속명 그룹 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 여기에는 속명으로부터 임의의 대상을 제거하는 단서 또는 부정적 제 한을 갖는 본 발명의 속명 기재가, 결실된 물질이 본원에 구체적으로 언급되었는지의 여부와 관계없이 포함된다.
<110> Danisco US Inc., Genencor Division Aehle, Wolfgang Cascao-Pereira, Luis Gustavo Kellis Jr., James T. Shaw, Andrew <120> Methods for Improving Protein Performance <130> 30972WO-2 <140> PCT/US2008/007113 <141> 2008-06-06 <150> US 60/933,307 <151> 2007-06-06 <150> US 60/933,331 <151> 2007-06-06 <150> US 60/933,312 <151> 2007-06-06 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1566 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 gtgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgccgctt cctttatgag tttaaccatc 60 agtctgccgg gtgttcaggc cgctgagaat cctcagctta aagaaaacct gacgaatttt 120 gtaccgaagc attctttggt gcaatcagaa ttgccttctg tcagtgacaa agctatcaag 180 caatacttga aacaaaacgg caaagtcttt aaaggcaatc cttctgaaag attgaagctg 240 attgaccaaa cgaccgatga tctcggctac aagcacttcc gttatgtgcc tgtcgtaaac 300 ggtgtgcctg tgaaagactc tcaagtcatt attcacgtcg ataaatccaa caacgtctat 360 gcgattaacg gtgaattaaa caacgatgtt tccgccaaaa cggcaaacag caaaaaatta 420 tctgcaaatc aggcgctgga tcatgcttat aaagcgatcg gcaaatcacc tgaagccgtt 480 tctaacggaa ccgttgcaaa caaaaacaaa gccgagctga aagcagcagc cacaaaagac 540 ggcaaatacc gcctcgccta tgatgtaacc 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Val Thr Val Glu His Ser Leu 115 120 125 Ala Asp Leu Glu Ala Trp Lys Thr Val Leu Asp Ala Ala Leu Glu Gly 130 135 140 His Asp Asp Val Pro Thr Trp Tyr Val Asp Val Pro Thr Asn Ser Val 145 150 155 160 Val Val Ala Val Lys Ala Gly Ala Gln Asp Val Ala Ala Gly Leu Val 165 170 175 Glu Gly Ala Asp Val Pro Ser Asp Ala Val Thr Phe Val Glu Thr Asp 180 185 190 Glu Thr Pro Arg Thr Met Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Thr 195 200 205 Ile Gly Gly Arg Ser Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Asn Gly Gly 210 215 220 Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr Ala Asn 225 230 235 240 Pro Thr Gly Thr Phe Ala Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala 245 250 255 Phe Val Arg Thr Gly Ala Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val Asn Asn 260 265 270 Tyr Ser Gly Gly Arg Val Gln Val Ala Gly His Thr Ala Ala Pro Val 275 280 285 Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 290 295 300 Thr Ile Thr Ala Leu Asn Ser Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val 305 310 315 320 Arg Gly Leu Ile Arg Thr Thr Val Cys 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Gly His 20 25 30 Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr Ala Asn Pro Thr Gly Thr Phe Ala 35 40 45 Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Phe Val Arg Thr Gly Ala 50 55 60 Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val Asn Asn Tyr Ser Gly Gly Arg Val 65 70 75 80 Gln Val Ala Gly His Thr Ala Ala Pro Val Gly Ser Ala Val Cys Arg 85 90 95 Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Thr Ala Leu Asn 100 105 110 Ser Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val Arg Gly Leu Ile Arg Thr 115 120 125 Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Ala Gly 130 135 140 Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr 145 150 155 160 Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn Pro Ile Leu Gln Ala Tyr 165 170 175 Gly Leu Arg Met Ile Thr Thr Asp Ser Gly Ser Ser Pro 180 185 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic hybrid signal sequence <400> 9 Met Arg Ser Lys Lys Arg Thr Val Thr Arg Ala Leu Ala Val Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Gly Gly Met Ala Ala Gln Ala 20 25 30 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synthetic primer <400> 16 gtctcgaaga tctgattgct taactgcttc 30 <210> 17 <211> 387 <212> PRT <213> Cellulomonas bogoriensis <400> 17 Met Thr Pro Arg Thr Val Thr Arg Ala Leu Ala Val Ala Thr Ala Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Leu Ala Gly Gly Met Ala Ala Gln Ala Asn Glu Pro Ala 20 25 30 Pro Pro Gly Ser Ala Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ala Glu Lys Leu Asp 35 40 45 Pro Asp Leu Leu Glu Ala Met Glu Arg Asp Leu Gly Leu Asp Ala Glu 50 55 60 Glu Ala Ala Ala Thr Leu Ala Phe Gln His Asp Ala Ala Glu Thr Gly 65 70 75 80 Glu Ala Leu Ala Glu Glu Leu Asp Glu Asp Phe Ala Gly Thr Trp Val 85 90 95 Glu Asp Asp Val Leu Tyr Val Ala Thr Thr Asp Glu Asp Ala Val Glu 100 105 110 Glu Val Glu Gly Glu Gly Ala Thr Ala Val Thr Val Glu His Ser Leu 115 120 125 Ala Asp Leu Glu Ala Trp Lys Thr Val Leu Asp Ala Ala Leu Glu Gly 130 135 140 His Asp Asp Val Pro Thr Trp Tyr Val Asp Val Pro Thr Asn Ser Val 145 150 155 160 Val Val Ala Val Lys Ala Gly Ala Gln Asp Val Ala Ala Gly Leu Val 165 170 175 Glu Gly Ala Asp Val Pro Ser Asp Ala Val Thr Phe Val Glu Thr Asp 180 185 190 Glu Thr Pro Arg Thr Met Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Thr 195 200 205 Ile Gly Gly Arg Ser Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Asn Gly Gly 210 215 220 Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr Ala Asn 225 230 235 240 Pro Thr Gly Thr Phe Ala Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala 245 250 255 Phe Val Arg Thr Gly Ala Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val Asn Asn 260 265 270 Tyr Ser Gly Gly Arg Val Gln Val Ala Gly His Thr Ala Ala Pro Val 275 280 285 Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 290 295 300 Thr Ile Thr Ala Leu Asn Ser Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val 305 310 315 320 Arg Gly Leu Ile Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 325 330 335 Gly Ser Leu Leu Ala Gly Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 340 345 350 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn 355 360 365 Pro Ile Leu Gln Ala Tyr Gly Leu Arg Met Ile Thr Thr Asp Ser Gly 370 375 380 Ser Ser Pro 385 <210> 18 <211> 29 <212> DNA 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic protease <400> 25 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 26 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus clausii <400> 26 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 27 <211> 515 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 27 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn 210 215 220 Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly 245 250 255 Lys Pro Leu Phe 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Claims (60)

  1. 모체 단백질과 비교해 향상된 성능을 갖는 하나 이상의 단백질 변이체의 생성 방법으로서, 상기 모체 단백질 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 모체 단백질과 비교해 더욱 양성인, 더욱 음성인, 덜 양성인, 또는 덜 음성인 전하를 갖는 하나 이상의 단백질 변이체를 수득하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 개질이 치환, 첨가, 및/또는 결실을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 개질이 화학적 개질을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 효소인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 효소가 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 폴리에스터라아제, 에스터라아제, 리파아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 옥시다아제, 트랜스퍼라아제, 알칼라아제, 또는 카탈라아제인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 프로테아제가 세린 프로테아제 또는 중성 메탈로프로테아제인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 변이체의 성능이 하나 이상의 관심있는 테스트를 사용해 평가되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 하나 이상의 관심있는 테스트가 기질 결합, 효소 억제, 발현 수준, 세제 안정성, 열적 안정성, 반응 속도, 반응 범위, 열적 활성, 전분 액화, 에스테르 가수분해, 효소적 표백, 세정력, 바이오매스 분해, 용해성, 킬란트 안정성, 및/또는 당화의 측정을 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 변이체가 관심있는 하나 이상의 상기 테스트에서 상기 모체 단백질과 비교해 향상된 성능을 나타내는 방법.
  10. 모체 효소와 비교해 향상된 세정력을 갖는 하나 이상의 효소 변이체의 생성 방법으로서, 상기 모체 효소 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 모체 효소와 비교해 더욱 양성인, 더욱 음성인, 덜 양성인, 또는 덜 음성인 전하를 갖는 하나 이상의 효소 변이체를 생성하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 개질이 치환, 첨가, 및/또는 결실을 포함하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 개질이 화학적 개질을 포함하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 효소 변이체 및 상기 모체 효소의 세정력을 테스트하여 상기 효소 변이체 및 상기 모체 효소에 대한 성능 지표를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 효소 변이체의 상기 성능 지표가 1.0 초과인 값을 갖고, 상기 모체 효소의 세정력은 1.0 의 성능 지수를 갖는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 향상된 세정력을 갖는 변이체 효소를 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 효소가 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 폴리에스터라아제, 에스터라아제, 리파아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 옥시다아제, 트랜스퍼라아제, 알칼라아제, 또는 카탈라아제인 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 프로테아제가 세린 프로테아제 또는 중성 메탈로프로테아제인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 프로테아제가 바실러스 ( Bacillus ) 프로테아제인 방법.
  19. 제 13 항에 있어서, 상기 세정력이 pH 가 5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트되는 방법.
  20. 제 13 항에 있어서, 상기 세정력이 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에서 테스트되는 방법.
  21. 제 13 항에 있어서, 상기 세정력이 염기성 pH 를 갖는 냉수 액체 세제에서 테스트되는 방법.
  22. 제 10 항에 있어서, 치환이 약 25% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 상기 모체 효소 내 위치에 존재하는 방법.
  23. 제 10 항에 있어서, 치환이 약 50% 초과 또는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 상기 모체 효소 내 위치에 존재하는 방법.
  24. 하기 단계를 포함하는, 모체 효소와 비교해 향상된 세정력을 갖는 효소 변이체의 생성 방법 :
    a) 모체 효소 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하 여, 모체 효소와 비교해 더욱 양성인, 더욱 음성인, 덜 양성인, 또는 덜 음성인 전하를 갖는 제 1 효소 변이체를 생성하는 단계 ; 및
    b) 모체 효소 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 모체 효소와 비교해 더욱 양성인, 더욱 음성인, 덜 양성인, 또는 덜 음성인 전하를 갖는 제 2 효소 변이체를 생성하는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 개질이 치환, 첨가, 및/또는 결실을 포함하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 개질이 화학적 개질을 포함하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 단계를 반복하여, 다수의 효소 변이체를 생성하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, 상기 모체 효소는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 폴리에스터라아제, 에스터라아제, 리파아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 옥시다아제, 트랜스퍼라아제, 알칼라아제, 또는 카탈라아제인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 프로테아제가 중성 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제인 방법.
  30. 제 24 항에 있어서, 상기 모체 효소가 바실러스 프로테아제인 방법.
  31. 제 24 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법 :
    변이체 효소 및 모체 효소의 세정력을 테스트하는 단계, 및
    상기 세정력 테스트에서 오염물을 제거하는 상기 모체 효소 및 상기 변이체 효소의 능력을 비교하는 단계,
    여기서, 상기 모체 효소의 세정력은 1.0 의 값으로 주어지고, 향상된 세정력을 갖는 변이체 효소는 1.0 초과의 값을 달성함.
  32. 제 31 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법 :
    모체 효소와 비교해 향상된 세정력을 갖는 효소 변이체를 생성하는 단계.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 모체 효소가 세린 프로테아제인 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 세린 프로테아제가 바실러스 세린 프로테아제 또는 셀룰로모나스 ( Cellulomonas ) 세린 프로테아제인 방법.
  35. 제 31 항에 있어서, 상기 세정력이 pH 가 5 내지 12.0 인 분말 또는 액체 세제 조성물에서 테스트되는 방법.
  36. 제 31 항에 있어서, 상기 세정력이 염기성 pH 를 갖는 액체 세탁 세제에서 테스트되는 방법.
  37. 제 31 항에 있어서, 상기 세정력이 염기성 pH 를 갖는 냉수 액체 세제에서 테스트되는 방법.
  38. 제 25 항에 있어서, 치환이 약 25% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 상기 모체 효소 내 위치에 존재하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 치환이 약 50% 초과 또는 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 상기 모체 효소 내 위치에 존재하는 방법.
  40. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기가 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 치환되는 방법.
  41. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 산성 아미노산 잔기가 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되는 방법.
  42. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기가 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 치환되는 방법.
  43. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기가 하나 이상의 산성 아미노산 잔기로 치환되는 방법.
  44. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기가 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되는 방법.
  45. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 중성 아미노산 잔기가 하나 이상의 산성 아미노산 잔기로 치환되는 방법.
  46. 제 25 항에 있어서, 상기 모체 효소 내 하나 이상의 중성 아미노산 잔기가 하나 이상의 중성 아미노산 잔기로 치환되어, 모체 효소와 비교해 동일한 전하를 갖는 효소 변이체가 수득되는 방법.
  47. 모체 단백질과 비교해 향상된 성능을 갖는 하나 이상의 단백질 변이체의 생성 방법으로서, 상기 모체 단백질 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질하여, 상기 모체 단백질과 비교해 더욱 양성인, 더욱 음성인, 덜 양성인, 또는 덜 음성인 전하를 갖는 하나 이상의 단백질 변이체를 생성하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 위치는 약 25% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 하나 이상의 위치가 상기 모체 단백질 및 하나 이상의 추가의 단백질을 포함하는 상동성 단백질 서열의 아미노산 정렬에서 비-보존성인 방법.
  49. 제 47 항에 있어서, 상기 모체 단백질이 효소인 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 효소가 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 폴리에스터라아제, 에스터라아제, 리파아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 옥시다아제, 트랜스퍼라아제, 알칼라아제, 또는 카탈라아제인 방법.
  51. 제 47 항에 있어서, 상기 향상된 성능이 기질 결합, 효소 억제, 발현, 세제에서의 안정성, 열적 안정성, 반응 속도, 반응 범위, 열적 활성, 전분 액화, 바이오매스 분해, 당화, 에스테르 가수분해, 효소적 표백, 세정력, 용해성, 킬란트 안정성, 및/또는 직물 개질로부터 선택되는 하나 이상의 특성의 증가를 포함하는 방법.
  52. 제 47 항에 있어서, 상기 개질이 치환, 첨가, 및/또는 결실을 포함하는 방법.
  53. 제 47 항에 있어서, 상기 개질이 화학적 개질을 포함하는 방법.
  54. 제 52 항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 모체 단백질에 대해 0, -1 또는 -2 의 순전하 변화를 포함하는 방법.
  55. 제 52 항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 모체 단백질에 대해 +1 또는 +2 의 순전하 변화를 포함하는 방법.
  56. 제 52 항에 있어서, 상기 모체 단백질 내 상기 하나 이상의 치환이 0, -1 또는 -2 의 전하 변화를 포함하고, 여기서, 상기 모체 단백질 내 상기 하나 이상의 추가의 치환은 상기 모체 단백질에 대해 +1 또는 +2 의 전하 변화를 포함하는 방법.
  57. 제 52 항에 있어서, 상기 단백질 변이체가 모체 단백질에 대해 +1 또는 +2 의 순전하 변화를 갖는 방법.
  58. 제 52 항에 있어서, 상기 단백질 변이체가 모체 단백질에 대해 0, -1 또는 -2 의 순전하 변화를 갖는 방법.
  59. 제 52 항에 있어서, 상기 치환이 약 50% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 모체 효소 내 위치에 존재하는 방법.
  60. 제 52 항에 있어서, 상기 치환이 약 65% 초과의 용매 접근가능 표면 (SAS) 을 갖는 모체 효소 내 위치에 존재하는 방법.
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