CN101778940B - 改进多种蛋白质性质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了获得下述蛋白质的高效方法，所述蛋白质在工业、消费者或药物应用中具有一种或多种有益属性。在一些优选的实施方式中，本发明提供了通过筛选候选酶的缩略组生产用于给定应用的优质酶的方法。

Description

改进多种蛋白质性质的方法
与相关申请的交叉引用
本发明要求提交于2007年6月6日的美国临时专利申请Nos.60/933,307、60/933,331和60/933,312的优先权，它们整体通过引用并入本文。
发明领域
本发明提供了获得下述蛋白质的高效方法，所述蛋白质在工业、消费者或药物应用中具有一种或多种有益属性。在一些优选的实施方式中，本发明提供了通过筛选候选酶的缩略组(abbreviated set)生产用于给定应用的优质酶的方法。
发明背景
蛋白质在其天然环境外工作时，性质通常是次佳的。例如，酶(例如，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等)通常用于衣物洗涤剂中清洁织物上的污渍，所述衣物洗涤剂一般包括活性成分的复杂组合。事实上，大多数清洁用品包括表面活性剂系统、漂白剂、助洗剂、抑泡剂、污垢悬浮剂、污垢释放剂、荧光增白剂、软化剂、分散剂、染料转移抑制化合物、研磨剂、杀细菌剂和香料，以及用于清洁的酶。因此，尽管目前洗涤剂的复杂性，但仍存在难以完全去除的许多污渍，部分原因就在于亚最佳的酶性质。尽管有许多酶开发研究，但本领域仍需要改造蛋白质以用于特定用途和条件的方法。事实上，本领域仍需要快速且系统地修改蛋白质的静电性质以优化其在商业应用中的性质的方法。特别地，本领域仍需要改造在工业上有用的酶的方法，所述酶包括但不限于脂肪酶、淀粉酶、角质酶(cutinase)、甘露聚糖酶、氧化还原酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和其他酶，以便在清洁溶液中提供改进的活性、稳定性和溶解性。此外，本领域还需要对可以从经转化的宿主细胞高水平表达的重组酶进行工程改造的方法。
发明内容
本发明提供了获得下述蛋白质的高效方法，所述蛋白质在工业、消费者或药物应用中具有一种或多种有益属性。在一些优选的实施方式中，本发明提供了通过筛选候选酶的缩略组生产用于给定应用的优质酶的方法。
本发明提供了提供蛋白质变体文库的方法，所述方法包括：在感兴趣的测试中，对跨越感兴趣的性质(例如物理性质)范围的多种蛋白质变体加以测试；鉴定感兴趣的性质范围内的最优值，其与感兴趣的测试中的有利结果相关；以及提供处于感兴趣性质范围的最优值内的数种蛋白质变体，由此提供下述蛋白质变体文库，其中富含在感兴趣测试中具有有利结果的成员。在一些优选的实施方式中，有利结果对应于超过感兴趣测试中观察到的最大值的大约50％，大约60％，大约70％，大约80％，大约90％或大约95％。在还一些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：在感兴趣的测试中，测试数种蛋白质变体和野生型蛋白质。在另一些实施方式中，所述方法包括下述步骤：鉴定具有改进的结果的蛋白质变体，其中所述野生型蛋白质在感兴趣的测试中实现1.0的值，而具有改进的结果的蛋白质变体实现高于1.0的值。在一些优选的实施方式中，性能指数＝测试性能/野生型性能。在一些特别优选的实施方式中，蛋白质是酶。在还一些优选的实施方式中，酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶或氧化酶。在另一些实施方式中，蛋白质是抗体或激素或细胞因子(例如生长因子)。在一些优选的实施方式中，蛋白酶是中性金属蛋白酶。在一些特别优选的实施方式中，亲本蛋白酶是中性金属蛋白酶的野生型成熟形式。在还一些优选的实施方式中，变体源于芽孢杆菌科(Bacillaceae)的中性金属蛋白酶。在又一些实施方式中，变体源于芽胞杆菌属(Bacillus)的中性金属蛋白酶。在其它一些实施方式中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一些特别优选的实施方式中，亲本蛋白酶是丝氨酸蛋白酶的野生型成熟形式。在还一些优选的实施方式中，变体源于微球菌亚目(Micrococcinea)的丝氨酸蛋白酶。在另一些实施方式中，变体源于纤维单胞菌属(Cellulomonas)的丝氨酸蛋白酶。在还一些实施方式中，感兴趣的性质是相对于野生型酶而言的电荷。在一些特别优选的实施方式中，感兴趣的性质是ζ-电势。在另一些优选的实施方式中，感兴趣的测试包括洗涤性能。在一些特别优选的实施方式中，洗涤性能包括洗涤剂中的血奶墨汁(blood milk ink，BMI)洗涤性能。在一些实施方式中，在配制成具有5至12.0之间的pH的粉末或液体洗涤剂的洗涤剂组合物中测试洗涤性能。在另一些实施方式中，在具有碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。在一些备选实施方式中，感兴趣的测试包括测量底物结合，和/或测量酶抑制，和/或测量表达水平，和/或测量洗涤剂稳定性，和/或测量热稳定性；和/或测量反应速率；和/或测量反应程度；和/或测量热活性。
本发明还提供了生产测试蛋白质折叠的改进变体的方法，所述方法包括：在感兴趣的测定中，测定跨越感兴趣的性质范围的探针蛋白质折叠的多种变体；鉴定出感兴趣的性质范围内的最优值，其与感兴趣的测定中的有利结果相关；在感兴趣的测定中，测定测试蛋白质折叠的亲本蛋白质；以及，通过在亲本蛋白质中引入氨基酸取代，产生测试蛋白质折叠的改进变体，使得改进变体处于感兴趣的性质范围的最优值中。在一些实施方式中，测试蛋白质折叠和探针蛋白质折叠是不同的。在一些其它实施方式中，测试蛋白质折叠是丝氨酸蛋白酶，探针蛋白质折叠是中性金属蛋白酶。
本发明还提供了生产底物污渍特异性酶变体的方法，所述方法包括：测定参照缓冲液中的底物污渍的ζ-电势；测定参照缓冲液中亲本酶的ζ-电势；以及通过在亲本酶中引入氨基酸取代来生产底物污渍特异性酶变体，使得变体酶的ζ-电势较之亲本酶的ζ-电势更接近底物污渍的ζ-电势。
本发明还提供了生产用于清洁多种污渍的组合物的方法，所述方法包括：测定参照缓冲液中多种污渍中的每种的ζ-电势；选择在参照缓冲液中具有与多种污渍之一的ζ-电势基本相等的ζ-电势的清洁用酶，其中，所述选择持续进行，直到多种污渍中每种都与至少一种清洁用酶配对；以及，通过将步骤b的清洁用酶加入到具有与参照缓冲液基本相同的pH和传导性的洗涤剂溶液中，制备用于清洁多种污渍的组合物。
本发明提供了提供蛋白质变体文库的方法，所述方法包括：a)在至少一项感兴趣的测试中，对跨越至少一种感兴趣的性质范围的多种蛋白质变体加以测试；b)鉴定感兴趣的性质范围内的最优值，其与至少一项感兴趣的测试中的有利结果相关；以及c)提供处于感兴趣性质范围的最优值内的数种蛋白质变体，由此提供下述蛋白质变体文库，其中富含在至少一项感兴趣测试中具有有利结果的成员。在一些实施方式中，感兴趣的性质是物理性质。在另一些实施方式中，有利结果对应于超过感兴趣测试中观察到的最大值的至少大约50％。在还一些实施方式中，有利结果对应于超过感兴趣测试中观察到的最大值的至少大约60％、大约70％、大约80％、大约90％或大约95％。在另一些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：d)在至少一项感兴趣的测试中，测试数种蛋白质变体和至少一种野生型蛋白质。在另一些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：鉴定具有改进的结果的蛋白质变体，其中，野生型蛋白质在至少一项感兴趣的测试中获得的性能指数值为1.0，而具有改进的结果的蛋白质变体获得高于1.0的值。在一些实施方式中，蛋白质是抗体、激素或细胞因子。在一些优选的实施方式中，蛋白质是酶。在一些特别优选的实施方式中，酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶或转移酶。在一些更特别优选的实施方式中，蛋白酶是中性金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。在还一些优选的实施方式中，丝氨酸蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。在一些备选的优选实施方式中，中性金属蛋白酶从芽孢杆菌科的成员获得。在另一些实施方式中，丝氨酸蛋白酶从纤维单胞菌属的成员获得。在还一些实施方式中，酶是纤维素酶，而在其它一些实施方式中，酶是淀粉酶。在另一些实施方式中，感兴趣的性质是电荷。在还一些实施方式中，测定蛋白质变体和野生型酶的电荷，并加以比较。在另一些实施方式中，感兴趣的性质是ζ-电势。在还另一些实施方式中，测定蛋白质变体和野生型酶的ζ-电势，并加以比较。在一些优选的实施方式中，蛋白质变体的ζ-电势介于大约-40mV至大约+40mV之间，而在其它一些实施方式中，蛋白质变体的ζ-电势介于大约-20mV至大约+20mVm之间，在还一些实施方式中，蛋白质变体的ζ-电势介于大约-10mV至大约+10mV之间。在另一些实施方式中，感兴趣的测试包括洗涤性能。在一些优选的实施方式中，洗涤性能包括血奶墨汁洗涤性能。在另一些实施方式中，在洗涤剂组合物中测试蛋白质变体和野生型蛋白质。在一些优选的实施方式中，洗涤剂组合物被配制为pH介于大约5至大约12.0之间的粉末或液体洗涤剂。在另一些优选的实施方式中，在具有碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。在一些备选的实施方式中，在热水洗涤剂中测试洗涤性能。在一些优选的实施方式中，所述至少一项感兴趣的测试包括测量底物结合、酶抑制、表达水平、洗涤剂稳定性、热稳定性、反应速率、反应程度、热活性、淀粉液化、生物质降解和/或糖化。
本发明还提供了生产测试蛋白质折叠的至少一种改进变体的方法，所述方法包括：a)在至少一项感兴趣的测定中，测定跨越至少一种感兴趣的性质范围的探针蛋白质折叠的多种变体；b)鉴定出至少一种感兴趣的性质范围内的最优值，其与所述至少一项感兴趣的测定中的有利结果相关；c)在所述至少一项感兴趣的测定中，测定测试蛋白质折叠的亲本蛋白质；以及，d)通过在亲本蛋白质中引入氨基酸修饰，产生测试蛋白质折叠的至少一种改进变体，使得至少一种改进变体处于至少一种感兴趣的性质最优范围中。在另一些实施方式中，修饰包含至少一个氨基酸取代。在还一些实施方式中，测试蛋白质折叠和探针蛋白质折叠是不同的。在一些实施方式中，感兴趣的性质是ζ-电势。在另一些实施方式中，测试蛋白质折叠包含至少一种丝氨酸蛋白酶，探针蛋白质折叠包含至少一种中性金属蛋白酶。
本发明还提供了生产底物污渍特异性酶变体的方法，所述方法包括：a)测定参照缓冲液中底物污渍的ζ-电势，b)测定参照缓冲液中亲本酶的ζ-电势，以及c)通过在亲本酶中引入至少一处氨基酸修饰，产生底物污渍特异性酶变体，使得底物污渍特异性酶变体的ζ-电势较之亲本酶的ζ-电势更接近底物污渍的ζ-电势。在一些实施方式中，修饰包含至少一个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些备选的实施方式中，修饰包含对亲本酶的化学修饰。在另一些实施方式中，底物污渍特异性酶变体带正电荷并且是吸热性的，底物污渍带负电荷。在一些备选实施方式中，污渍特异性酶变体带负电荷并且是放热性的，底物污渍带负电荷。在另一些实施方式中，污渍特异性酶变体带正电荷并且是放热性的，底物污渍带电荷。在另一些实施方式中，污渍特异性酶变体带负电荷并且是吸热性的，底物污渍带正电荷。
本发明还提供了生产用于清洁多种污渍的组合物的方法，所述方法包括：a)测定参照缓冲液中多种污渍中每种的ζ-电势；b)选择在参照缓冲液中具有与多种污渍中至少一种的ζ-电势基本相等的ζ-电势的清洁用酶；以及c)生产用于清洁多种污渍的组合物，其中所述组合物包含步骤b)中选择的至少一种清洁用酶。在另一些实施方式中，组合物包含pH和传导性与参照缓冲液基本相等的洗涤剂溶液。在另一些实施方式中，选择步骤鉴定不止一种清洁用酶。在还一些实施方式中，组合物包含至少两种清洁用酶，其中所述至少两种清洁用酶具有与多种污渍中的至少两种的ζ-电势相应的ζ-电势。
本发明还提供了使用本文所示的方法生产的用于清洁多种污渍的组合物。在一些优选的实施方式中，组合物包含至少一种清洁用酶。在一些备选实施方式中，所述至少一种清洁用酶是变体蛋白质。在另一些实施方式中，变体蛋白质比用于生产变体蛋白质的野生型前体蛋白质带更多负电荷，而在一些备选实施方式中，变体蛋白质比用于生产变体蛋白质的野生型前体蛋白质带更多正电荷。在还一些实施方式中，变体蛋白质比用于生产变体蛋白质的野生型前体蛋白质带更多负电荷，以增强在含有阴离子表面活性剂的洗涤剂中的稳定性。
附图简述
图1描述了在匹配的pH和传导性(5mM HEPES pH 8.0，2.5mMNaCl)的AATCC液体洗涤剂(实心三角)和缓冲液(空心圆圈)中测量的ASP变体的相对的血、奶、墨汁(BMI)微布样(microswatch)活性(相对最佳性能者归一化)，其作为相对野生型ASP的净电荷变化的函数展示。
图2描述了在AATCC液体洗涤剂(实心三角)中测量的ASP电荷组合文库的相对血、奶、墨汁(BMI)微布样活性(相对最佳性能者归一化)，其作为相对野生型ASP的净电荷变化的函数展示。
图3描述了在NaCl浓度不同(2.5mM(空心圆圈)、16mM(灰色圆圈)和100mM(黑色圆圈))的5mM HEPES pH 8.0中测量的ASP变体的相对的BMI微布样活性(相对最佳性能者归一化)，其作为相对野生型ASP的电荷变化的函数展示。
图4描述了在北美液体洗衣条件下测量的FNA(图A)和GG36(图B)电荷组合文库变体(实心符号)的相对的血、奶、墨汁(BMI)微布样活性(相对亲本分子归一化)，其作为相对亲本FNA或野生型GG36(空心符号)的净电荷变化的函数展示。
图5描述了在西欧液体洗衣条件下测量的FNA(图A)和GG36(图B)电荷组合文库变体(实心符号)的相对的血、奶、墨汁(BMI)微布样活性(相对亲本分子归一化)，其作为相对亲本FNA或野生型GG36(空心符号)的净电荷变化的函数展示。
图6描述了在日本洗衣粉条件下测量的FNA(图A)和GG36(图B)电荷组合文库变体(实心符号)的相对的血、奶、墨汁(BMI)微布样活性(相对亲本分子归一化)，其作为相对亲本FNA或野生型GG36(空心符号)的净电荷变化的函数展示。
图7描述了在西欧自动餐具清洗条件下测量的FNA(图A)和GG36(图B)电荷组合文库变体(实心符号)的相对的烤蛋微布样活性(相对亲本分子归一化)，其作为相对亲本FNA或野生型GG36(空心符号)的净电荷变化的函数展示。
图8描述了在北美洗衣条件下测量的S242Q电荷组合文库变体(空心符号)的稻淀粉微布样活性(相对亲本归一化)，其作为相对亲本(实心符号)的净电荷变化的函数展示。
图9描述了在西欧洗衣条件下测量的TS23t电荷组合文库变体(空心符号)的稻淀粉微布样活性(相对亲本归一化)，其作为相对亲本(实心符号)的净电荷变化的函数展示。
图10描述了S242Q电荷组合文库变体(空心符号)的相对特异性BODIPY淀粉水解活性(相对亲本归一化)，其作为相对亲本(实心符号)的净电荷变化的函数展示。
图11描述了第一AmyS电荷梯级的最终粘度，其作为相对野生型AmyS的净电荷变化的函数展示。
图12在第一轴描述了在缓冲液(5mM HEPES pH 8.0，2.5mM NaCl)中测量的ASP变体的BMI微布样活性对ζ-电势。第二轴展示了ASP变体的BMI微布样活性(通过正态分布拟合的峰值归一化，实线)对z-分数。底物污渍的ζ-电势等于-8.97mV。
图13描述了在NaCl浓度不同(2.5mM NaCl(空心)、16mM NaCl(灰色)和100mM NaCl(黑色))的5mM HEPES pH 8.0中测量的ASP变体的BMI微布样活性对结合的ASP的比例。
图14描述了在AATCC HDL洗涤剂(三角形)或NaCl浓度不同(2.5mM NaCl(空心圆圈)、16mM NaCl(灰色圆圈)和100mM NaCl(黑色圆圈))的5mM HEPES pH 8.0中测量的结合的ASP的比例，其作为相对野生型ASP的净电荷变化的函数展示。
图15描述了在具有2.5mM NaCl的5mM HEPES pH 8.0中测量的ASP电荷组合变体(空心符号)的结合比例，其作为相对亲本ASP-R14I(实心符号)的净电荷变化的函数展示。
图16描述了在含有2.5mM NaCl的5mM HEPES pH 8.0中测量的结合的ASP的比例，其作为ζ-电势的函数展示。
图17描述了ASP变体在枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中的表达水平，其作为相对野生型ASP的净电荷变化的函数展示。
图18在第一轴描述了ASP变体(实心圆圈)和NprE变体(空心圆圈)在枯草芽孢杆菌中的表达水平，其作为ζ-电势的函数展示(在具有2.5mM NaCl的参照缓冲液5mM HEPES pH8.0中测量的)。第二轴展示了ASP变体的表达水平(通过正态分布拟合的峰值归一化，实线)对z-分数。
图19描述了ASP变体的LAS稳定性，其作为相对野生型ASP的净电荷变化的函数展示。
图20描述了FNA变体的LAS/EDTA稳定性，其作为相对亲本FNA的净电荷变化的函数展示。
图21描述了TS23t变体的LAS/EDTA稳定性，其作为相对亲本TS23t-7mut的净电荷变化的函数展示。
图22描述了ASP变体的热稳定性，其作为相对野生型ASP的净电荷变化的函数展示。
图23描述了第一AmyS电荷梯级的热稳定性，其作为相对野生型AmyS的电荷变化的函数展示。
图24描述了分别在不同温度40℃、50℃和60℃时ASP(图A)和NprE(图B)的热活性，其作为相对野生型ASP和NprE的净电荷变化的函数展示。热活性展示为30℃活性的比例(用升高的温度下的活性除以30℃时的活性)。
图25描述了在不同温度40℃、50℃和60℃时ASP(图A)和NprE(图B)的热活性，其作为ζ-电势的函数展示。热活性展示为30℃活性的比例(用升高的温度下的活性除以30℃时的活性)。
图26描述了含有2.5mM NaCl的5mM HEPES pH 8.0中30℃(空心圆圈)和40℃(实心圆圈)时ASP电荷梯级变体的热稳定性。
图27提供了电荷变化矩阵，其展示了pH 8.6下氨基酸残基取代的电荷变化。从该矩阵可以容易地测定变体酶较之亲本酶的净电荷变化。
图28提供了氢键合能力变化矩阵，其展示了氨基酸残基取代的氢键合能力变化。从该矩阵可以容易地测定变体酶较之亲本酶的净氢键合能力变化。
图29提供了Kyte-Doolittle亲水性(hydropathicity)变化矩阵，其展示了氨基酸残基取代的亲水性变化。从该矩阵可以容易地测定变体酶较之亲本酶的净亲水性变化。
图30提供了Eisenberg疏水性变化矩阵，其展示了氨基酸残基取代的疏水性变化。从该矩阵可以容易地测定变体酶较之亲本酶的净疏水性变化。
图31提供了第一AmyS电荷梯级的稻淀粉清洁活性，其作为pH的函数展示。pH 3.0-4.25是200mM甲酸钠+0.01％Tween-80。pH 4.25-5.5是200mM乙酸钠+0.01％Tween-80。将数据与滴定曲线拟合，每个有单一的pKa值。
图32提供了在图31中测定的pKa值对相对野生型AmyS的电荷变化作图。
发明的一般性描述
本发明提供了获得下述蛋白质的高效方法，所述蛋白质在工业、消费者或药物应用中具有一种或多种有益属性。在一些优选的实施方式中，本发明提供了通过筛选候选酶的缩略组生产用于给定应用的优质酶的方法。
蛋白酶枯草杆菌蛋白酶是在衣物洗涤剂中使用的主要酶，并且可能是全世界最广泛使用的酶。大约20年前，注意到表面静电效应可能调节枯草杆菌蛋白酶的催化活性(参见例如，Russell和Fersht，Nature 328：496-500[1987])。较为近来，观察到涉及改变枯草杆菌蛋白酶的净电荷的突变显著影响在洗涤剂中的洗涤性能(参见例如，引入本文作为参考的EP专利号0 479 870 B1)。这个有利效应被认为是使枯草杆菌蛋白酶pI(等电点)朝向洗涤液的pH迁移的结果。然而，随后的工作证实这个结论并非总是适用(参见例如，引入本文作为参考的美国专利号6,673,590 B1)。如本专利中指出的，枯草杆菌蛋白酶中电荷突变的效应显著地依赖于洗涤剂浓度，其中降低亲本枯草杆菌蛋白酶的pI的突变提供在低洗涤剂浓度下更有效的酶，而提高pI的突变提供在高洗涤剂浓度下更有效的酶。这具有极大用途，因为洗涤液中的洗涤剂浓度在全世界范围内变化极大。因此，对于本领域技术人员已经显而易见的是，对于枯草杆菌蛋白酶的洗涤性能，存在依赖于洗涤液中的pH和洗涤剂浓度的最优pI。改进枯草杆菌蛋白酶在衣物洗涤剂中的活性的其它努力已经描述(参见在本文引用作为参考的美国专利公开号2005/0221461)。令人惊讶的是，发现具有与亲本枯草杆菌蛋白酶相同的净静电荷的枯草杆菌蛋白酶变体在高和低洗涤剂浓度的洗涤条件下均具有增加的洗涤性能。因此，蛋白质(例如酶)的静电性质对其功能具有很大影响。
之前，针对最小化酶与表面的结合，努力开发了一些优质蛋白质。例如，一些方法涉及改变枯草杆菌蛋白酶序列，以获得具有减少的与不溶底物的吸附的变体酶(见，例如WO95/07991)。在另一方法中，改变枯草杆菌蛋白酶的pI，以获得在给定pH下净电荷为零的变体酶(见，例如WO 91/00345)。但是，如在本发明开发期间所测定的，这些方法并不总是成功的。如本文所述，酶的表面性质，包括结合性质，作为表面电荷或疏水性变化的函数，通常具有最优值，而非持续变化。甚至对于通常具有相当大活性的酶来说，表面性质也可导致在一些条件下以及用一些底物时比在其它条件下和/或用其它底物时慢得多的整体反应。在本发明的一些实施方式中，通过改变酶表面一个或多个氨基酸的性质，来修饰酶的表面性质。当这些变化在表面上不与任何其它氨基酸相互作用并且对于酶功能不必要的位点进行时，可使用本发明的方法，基于在那些位置取代的氨基酸的性质，预测蛋白质的性质。在一些实施方式中，容易从结构数据鉴定出这些位点，在其它一些实施方式中，可使用同源序列比对、位点评估文库数据和/或其任何组合。在另一些实施方式中，可使用氨基酸计分矩阵来指导氨基酸取代，以及鉴定与被取代的氨基酸的性质相关的蛋白质的那些物理性质。
本发明提供了获得下述蛋白质的高效方法，所述蛋白质在工业、消费者或药物应用中具有一种或多种有益属性。特别地，本发明提供了通过筛选候选酶的缩略组生产用于给定应用的优质酶的方法。虽然本文中是关于示例性丝氨酸蛋白酶(例如ASP)和示例性金属蛋白酶(例如NprE)进行描述的，但是本发明的组合物和方法并不限于蛋白酶。事实上，本发明可用于改进蛋白酶和多种类别的酶(例如淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、氧化还原酶、角质酶、甘露聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、脂肪酶等)的性能。事实上，本发明并不意欲限于任何特定的酶或者任何特定类别的酶。此外，本发明可用于对非酶蛋白质性质进行优化以及用于生产所述优质蛋白质。
除非另有说明，本发明的实践涉及属于本领域技术人员能力范围内的、分子生物学、微生物学和重组DNA中常用的常规技术。此类技术是本领域技术人员已知的，并且在本领域技术人员众所周知的众多教科书和参考文献中描述。本文中，上文和下文，提及的所有专利、专利申请、论文和出版物特此明确地引入此处作为参考。
除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。尽管本文描述了一些优选方法和材料，但与本文描述的那些相似或等价的任何方法和材料也均可以用于本发明的实践。因此，紧在下文定义的术语将通过参考说明书整体得到更充分的描述。
此外，如本文所使用的，除非上下文另有明确说明，单数“a”、“an”和“the”包括对复数的提及。数值范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，分别地，核酸以5′至3′方向从左往右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左往右书写。应当理解本发明并不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以由本领域技术人员根据它们所使用的环境而加以改变。
在整个本说明书中每个最大数值限制均旨在包括每个较低的数值限制，就好像这些较低数值限制已经在本文中明确进行过陈述一样。在整个本说明书中每个最小数值限制均旨在包括每个较高的数值限制，就好像这些较高的数值限制已经在本文中明确进行过陈述一样。在整个本说明书中每个数值范围都将包括落入此较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就好像这些较窄的数值范围均已经在本文中明确进行过陈述一样。
此外，本文提供的标题并不构成对本发明的各个方面或实施方案的限制，本发明的各个方面或实施方案可以通过参考说明书整体而获得。因此，紧在下文限定的术语将通过参考说明书整体作更充分的定义。然而，为了利于本发明的理解，下文定义了多个术语。
定义
如本文所使用的，术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”指显示水解肽或具有肽键的底物的能力的蛋白质或肽。存在用于测量蛋白水解活性的许多众所周知的方法(参见例如，Kalisz，″Microbial Proteinases，″In：Fiechter(编辑)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，[1988])。例如，蛋白水解活性可以通过比较测定法进行确定，所述比较测定法分析相应蛋白酶水解商业底物的能力。在蛋白酶或蛋白水解活性的此种分析中有用的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical 902111)。利用这些底物的比色测定法是本领域众所周知的(参见例如WO 99/34011；和美国专利号6,376,450，都引入本文作为参考)。pNA测定法(参见例如，Del Mar等人，Anal Biochem，99：316-320[1979])也可以用于测定梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。这个测定法测量随着酶水解可溶性合成底物——琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(sAAPF-pNA)，对硝基苯胺的释放速度。自水解反应产生黄色的速率在分光光度计上在410nm处进行测量，其与活性酶浓度成比例。此外，在280nm处的吸光度测量可以用于测定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白质的比值给出酶纯度。
如本文所使用的，术语“ASP蛋白酶”、“Asp蛋白酶”和“Asp”指在本文和美国专利申请序列号10/576,331(引入本文作为参考)中描述的丝氨酸蛋白酶。在某些优选实施方案中，Asp蛋白酶是本文中称为69B4蛋白酶的获自纤维单胞菌属菌株69B4的蛋白酶。因此，在优选实施方案中，术语“69B4蛋白酶”指源自纤维单胞菌属菌株69B4(DSM 16035)的天然成熟蛋白酶，具有与SEQ ID NO：8中提供的基本上相同的氨基酸序列。在备选实施方案中，本发明提供ASP蛋白酶的部分。
术语“纤维单胞菌属蛋白酶同源物”指与源自纤维单胞菌属菌株69B4的成熟蛋白酶具有基本上相同的氨基酸序列的天然蛋白酶，或指编码此种天然蛋白酶的多核苷酸序列，其中所述蛋白酶保持由此类核酸编码的丝氨酸蛋白酶的功能特征。在某些实施方案中，这些蛋白酶同源物称为“cellulomonadins”。
如本文所使用的，术语“ASP变体”、“ASP蛋白酶变体”和“69B蛋白酶变体”用于指这样的蛋白酶，其与野生型ASP相似，特别是在功能上相似，但在其氨基酸序列中具有使其与野生型蛋白酶存在序列差异的突变。
如本文所使用的，“纤维单胞菌属物种”指在“纤维单胞菌属”内的所有物种，其是分类为放线菌纲(Actinobacteria)放线菌目(Actinomycetales)微球菌亚目(Micrococcineae)纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)的成员的革兰氏阳性菌。应认识到纤维单胞菌属持续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重分类的物种。
如本文所使用的，“链霉菌属物种(Streptomyces ssp.)”指在“链霉菌属”内的所有物种，其是分类为放线菌纲放线菌目链霉菌亚目(Streptomycineae)链霉菌科(Streptomycetaceae)的成员的革兰氏阳性菌。应认识到链霉菌属持续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重分类的物种。
如本文所使用的，“芽孢杆菌属”包括在“芽孢杆菌属”内的所有物种，如本领域技术人员已知的，包括但不限于，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到芽孢杆菌属持续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重分类的物种，包括但不限于诸如现命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”的嗜热脂肪芽孢杆菌的生物。在氧存在下产生抗性内生孢子被视为芽孢杆菌属的定义特征，尽管这个特征也应用于近期命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、兼性芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、Filobacillus、Gracilibacillus、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、Salibacillus、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)、和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”指任何长度的聚合形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。这些术语包括但不限于，单链、双链或三链DNA，基因组DNA，cDNA，RNA，DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基、或其他天然、化学修饰、生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。下述是多核苷酸的非限制性例子：基因、基因片段、染色体片段、ESTs、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。在某些实施方案中，多核苷酸包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团例如氟代核糖(fluororibose)和硫酯(thioate)、和核苷酸分支。在备选实施方案中，核苷酸序列由非核苷酸组分中断。
如本文所使用的，术语“DNA构建体”和“转化DNA”可互换使用，指用于将序列引入宿主细胞或生物内的DNA。DNA可以在体外通过PCR或本领域技术人员已知的任何其他合适的一种或多种技术产生。在特别优选的实施方案中，DNA构建体包含目的序列(例如，作为引入的序列(incomingsequence))。在某些实施方案中，序列与另外的元件例如控制元件(例如启动子等)有效地连接。DNA构建体可以进一步包含选择标记。它可以进一步包含侧翼连接同源盒的引入序列。在一个进一步的实施方案中，转化DNA包含添加在末端的其他非同源序列(例如，填充序列或侧翼)。在某些实施方案中，引入序列的末端是闭合的，使得转化DNA形成闭合环。转化序列可以是野生型、突变型或经修饰的。在某些实施方案中，DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方案中，DNA构建体包含非同源序列。在体外装配DNA构建体后，它可以用于：1)将异源序列插入宿主细胞的期望靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替换内源序列)，和/或3)缺失靶基因；和/或将复制型质粒引入宿主内。
如本文所使用的，术语“表达盒”和“表达载体”指重组或合成产生的核酸构建体，具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列专门核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段内。一般地，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子等序列。在优选实施方案中，表达载体具有在宿主细胞中掺入且表达异源DNA片段的能力。许多原核生物和真核生物表达载体是商购可得的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员知识范围内。术语“表达盒”在本文中可与“DNA构建体”以及它们的语法等价物互换使用。合适的表达载体的选择在本领域技术人员知识范围内。
如本文所使用的，术语“载体”指设计用于将核酸引入一个或多个细胞类型内的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。在某些实施方案中，该多核苷酸构建体包含编码蛋白酶(例如，前体或成熟蛋白酶)的DNA序列，其与能够实现DNA在合适宿主中表达的合适前序列(prosequence)(例如，分泌序列等)有效地连接。
如本文所使用的，术语“质粒”指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，其在某些真核或原核生物中形成染色体外自主复制的遗传元件，或整合到宿主染色体内。
本文中，在将核酸序列引入细胞的情况下使用的术语“引入”，指适于将核酸序列转移到细胞内的任何方法。此种用于引入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导(参见例如，Ferrari等人，″Genetics，″in Hardwood等人，(编辑)，Bacillus，Plenum Publishing Corp.，第57-72页[1989])。
如本文所使用的，术语“转化”和“稳定转化”指细胞具有整合到其基因组内或作为附加型质粒维持至少2代的非天然(异源)多核苷酸序列。
如本文所使用的，术语“编码可选择标记的核苷酸序列”指这样的核苷酸序列，其能够在宿主细胞中表达，并且选择标记的表达能够赋予包含该表达基因的细胞在存在相应选择试剂或缺乏必需营养素的情况下生长的能力。
如本文所使用的，术语“可选择标记”和“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如，基因)，其允许容易地选择包含载体的那些宿主。此种选择标记的例子包括但不限于抗微生物药。因此，术语“可选择标记”指提供宿主细胞已摄取目的引入DNA或某些其他反应已发生的指示的基因。一般地，选择标记是能向宿主细胞赋予抗微生物药抗性或代谢优势的基因，由此允许将包含该外源DNA的细胞与在转化过程中未接受任何外源序列的细胞区分开来。“居留型选择标记”(residing selectable marker)是位于待转化的微生物的染色体上的选择标记。居留型选择标记编码不同于在转化DNA构建体上的选择标记的基因。选择标记是本领域技术人员众所周知的。如上所述，优选地，标记是抗微生物药抗性标记(例如，ampR；phleoR；specR；kanR；eryR；tetR；cmpR；和neoR(参见例如，Guerot-Fleury，Gene，167：335-337[1995)；Palmeros等人，Gene 247：255-264[2000]；和Trieu-Cuot等人，Gene，23：331-341，[1983])。依照本发明有用的其他标记包括但不限于营养(例如色氨酸)缺陷型标记；和检测标记，例如β-半乳糖苷酶。
如本文所使用的，术语“启动子”指作用在于指导下游基因转录的核酸序列。在优选实施方案中，启动子对待表达靶基因的宿主细胞是适宜的。启动子，以及其他转录和翻译调节核酸序列(也称为“控制序列”)，是表达给定基因所需的。一般而言，转录和翻译调节序列包括但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活物序列。
当核酸被放置在与另一核酸序列形成功能关系的位置上时，它是“有效地连接的”。例如，编码分泌引导区(例如，信号肽)的DNA与编码多肽的DNA有效地连接时，其将作为参与多肽分泌的前蛋白表达；启动子或增强子与编码序列有效地连接时，它将影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列有效地连接时，它的放置将促进翻译的进行。一般地，“有效地连接”意味着所连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌引导区的情况下，是邻接且在阅读框中的。然而，增强子无需是邻接的。连接可以通过在方便的限制位点处的连接来完成。如果不存在此种位点，那么可以依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所使用的，术语“基因”指编码多肽且包括位于编码区前和后的区域以及在单个的编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)的多核苷酸(例如，DNA区段)。
如本文所使用的，“同源基因”指来自不同但通常相关的物种的一对基因，其彼此对应并且彼此相同或非常相似。该术语涵盖通过物种形成(即，新物种发生)而分离的基因(例如直系同源基因)，以及已通过基因复制而分离的基因(例如，旁系同源基因)。
如本文所使用的，“直系同源物”和“直系同源基因”指在不同物种中的基因，其通过物种形成由共同祖先基因(即，同源基因)进化而来。一般地，直系同源物在进化过程中保留相同功能。直系同源物的鉴定可以用于在新测序的基因组中可靠地预测基因功能。
如本文所使用的，“旁系同源物”和“旁系同源基因”指通过基因组内的复制而关联的基因。虽然直系同源物在进化过程中保留相同功能，但旁系同源物会进化出新功能，尽管某些功能通常与原始功能相关。旁系同源基因的例子包括但不限于，编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，这些都是丝氨酸蛋白酶并且一起存在于相同物种内。
如本文所使用的，“同源性”指序列相似性或同一性，其中同一性是优选的。这种同源性可以使用本领域已知的标准技术进行确定(参见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444[1988]；程序例如Wisconsin GeneticsSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup，Madison，WI；和Devereux等人，Nucl.Acid Res.，12：387-395[1984])。
如本文所使用的，“类似序列”是指这样的序列，其中该基因的功能与基于亲本基因(例如，纤维单胞菌属菌株69B4蛋白酶)的基因基本上相同。此外，类似基因包括与亲本基因的序列至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％的序列同一性。备选地，类似序列具有与亲本基因(例如，纤维单胞菌属菌株69B4蛋白酶)区域中的70-100％基因的序列匹配、和/或具有与包含亲本基因的染色体(例如，纤维单胞菌属菌株69B4蛋白酶)中的基因比对的至少5-10个在该区域中的基因。在另外的实施方案中，一种以上的上述性质适用于该序列。通过序列比对的已知方法可以确定类似序列。常用的比对方法是BLAST，尽管如上文和下文所述，其他方法也适用于比对序列。
有用算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对，由一组相关序列产生多重序列比对。它还可以绘制显示聚类关系的树，用于构建比对。PILEUP使用简化的Feng和Doolittle(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360[1987])的渐进式比对方法。该方法与Higgins和Sharp(Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153[1989])描述的方法相似。有用的PILEUP参数包括缺省空位权重3.00、缺省空位长度权重0.10和加权的末端空位。
另一个有用算法的例子是由Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410[1990]；和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：5873-5787[1993])。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，Altschul等人，Meth.Enzymol.，266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其中大多数可以被设定为缺省值。这些可调参数可以使用下述值进行设定：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠部分(overlap fraction)＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序自身根据具体序列的组成和目的序列所搜索的具体数据库的组成来建立。然而，可以调整这些值以增加灵敏度。通过匹配的相同残基的数目除以比对区域中“较长”序列的总残基数目，确定氨基酸序列同一性％。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(不计为使比对分数达到最大而由WU-Blast-2引入的空位)。
因此，“核酸序列同一性百分比(％)”定义为在候选序列中与起始序列(即，目的序列)的核苷酸残基等同的核苷酸残基的百分比。优选方法利用设定为缺省参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠跨度和重叠部分分别设定为1和0.125。
如本文所使用的，术语“杂交”指如本领域已知的、一条核酸链通过碱基配对与互补链连接的过程。
如果核酸序列与参考核酸序列在中等至高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则核酸序列被视为与参考核酸序列“可选择性地杂交”。杂交条件基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高严格性”一般在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)发生；“高严格”在低于Tm约5-10℃发生；“中等严格”在低于探针的Tm约10-20℃发生；和“低严格”在低于Tm约20-25℃发生。在功能上，最高严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格相同或接近严格相同的序列；而中等或低严格杂交可以用于鉴定或检测多核苷酸序列同源物。
中等和高严格杂交条件是本领域众所周知的。高严格条件的例子包括在约42℃在50％甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，随后在2X SSC和0.5％SDS中室温洗涤2次，并且在0.1 X SSC和0.5％SDS中42℃再洗涤2次。中等严格条件的例子包括在37℃在溶液中过夜温育，所述溶液包含20％甲酰胺、5 x SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5 x Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA；随后在1xSSC中在约37-50℃洗涤滤膜。本领域技术人员明了如何按照需要来调整温度、离子强度等，以适应诸如探针长度等的因素。
如本文所使用的，“重组体”包括提及已通过引入异源核酸序列进行了修饰的细胞或载体，或衍生自如此修饰的细胞的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内无等同形式的基因，或作为有意人为干预的结果而表达原本异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。“重组”、“进行重组”和产生“重组”核酸一般是指装配2个或更多个核酸片段，其中该装配导致产生嵌合基因。
在一个优选实施方案中，用位点饱和诱变在至少一个密码子中产生突变DNA序列。在另一个优选实施方案中，位点饱和诱变针对2个或更多个密码子执行。在一个进一步的实施方案中，突变DNA序列与野生型序列具有大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、或大于98％的同源性。在备选实施方案中，可以使用任何已知的诱变方法，例如辐射、亚硝基胍等，在体内产生突变DNA。随后在本文提供的方法中分离期望DNA序列并且使用。
如本文所使用的，术语“靶序列”指在宿主细胞中编码如下序列的DNA序列，其中期望在该序列处将引入的序列插入宿主细胞基因组中。在某些实施方案中，靶序列编码功能性野生型基因或操纵子，而在其他实施方案中，靶序列编码功能性突变基因或操纵子、或非功能性基因或操纵子。
如本文所使用的，“侧翼序列”指在所讨论序列的上游或下游的任何序列(例如，对于基因A-B-C，基因B的侧翼为A和C基因序列)。在一个优选实施方案中，引入的序列在每侧上均侧接同源盒。在另一个实施方案中，引入的序列和同源盒构成单元，该单元在每侧上均侧接填充序列。在某些实施方案中，侧翼序列仅存在于单侧上(3′或5′)，但在优选实施方案中，序列每一侧都有侧翼序列。在某些实施方案中，侧翼序列仅存在于单侧上(3′或5′)，而在优选实施方案中，它存在于侧接其的序列的每一侧上。
如本文所使用的，术语“填充序列(stuffer sequence)”指位于同源盒侧翼的任何额外DNA(一般是载体序列)。然而，该术语涵盖任何非同源DNA序列。不受任何理论束缚，填充序列可以为细胞提供非关键靶以起始DNA摄取。
如本文所使用的，术语“扩增”和“基因扩增”指特定DNA序列不成比例地复制的过程，由此扩增后基因以比初始存在于基因组中的拷贝数要高的拷贝数存在。在某些实施方案中，通过在药物(例如，可抑制性酶的抑制剂)存在下的生长来进行的细胞选择，导致编码在药物存在下生长所必需的基因产物的内源基因的扩增、或编码此基因产物的外源(即，输入)序列的扩增，或两者的扩增。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的一种特殊情况。它与非特异性模板复制(即，模板依赖性但不依赖于特定模板的复制)形成对比。模板特异性在此处与复制的保真性(即，合成正确多核苷酸序列)和核苷酸(核糖或脱氧核糖-核苷酸)的特异性是不同的。模板特异性通常就“靶”特异性而言进行描述。靶序列，在寻求将其从其他核酸中挑选出来这一意义上，是“靶”。已设计了主要用于这种挑选的扩增技术。
如本文所使用的，术语“共扩增”指将可扩增标记与其他基因序列(即，包含一个或多个非选择基因，例如表达载体中包含的那些)一起引入单个细胞内，应用合适的选择压力，从而使得细胞扩增该可扩增标记和该其他非选择基因序列。可扩增标记可以与该其他基因序列进行物理连接，或备选地2个分开的DNA片段，一个包含可扩增标记并且另一个包含该非选择标记，可以引入相同细胞内。
如本文所使用的，术语“可扩增标记”、“可扩增基因”和“扩增载体”指基因或编码基因的载体，其允许该基因在合适的生长条件下扩增。
“模板特异性”可以在大多数扩增技术中通过选择酶来达到。扩增酶是在使用条件下仅加工异源核酸混合物中的特定核酸序列的酶。例如，在Qβ复制酶的情况下，MDV-1RNA是该复制酶的特定模板(参见例如，Kacian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：3038[1972])，其他核酸不能通过这种扩增酶复制。类似地，在T7RNA聚合酶的情况下，这种扩增酶具有针对其自身启动子的严格特异性(参见，Chamberlin等人，Nature 228：227[1970))。在T4 DNA连接酶的情况下，当在寡核苷酸或多核苷酸底物和模板之间在连接接头处存在错配时，该酶将无法连接这2个寡核苷酸或多核苷酸(参见，Wu和Wallace，Genomics 4：560[1989])。最后，Taq和Pfu聚合酶，由于其在高温下起作用的能力，而被发现能够对引物结合并由此规定的序列显示出高特异性；高温导致有利于引物与靶序列杂交而不利于与非靶序列杂交的热力学条件。
如本文所使用的，术语“可扩增核酸”指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。可以考虑到，“可扩增核酸”通常可以包含“样品模板”。
如本文所使用的，术语“样品模板”指源于待就“靶”(下文定义)的存在进行分析的样品的核酸。相对地，“本底模板”用于指样品模板之外的核酸，其可以存在或不存在于样品中。本底模板最通常是无意的。它可以是遗留(carryover)引起的，或它可以由于待从样品中纯化除去的核酸杂质的存在而引起。例如，来自待检生物之外的生物的核酸可以作为本底在测试样品中存在。
如本文所使用的，术语“引物”指天然的(如在纯化的限制消化物中)或合成产生的寡核苷酸，当被置于可以诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(即，在核苷酸和诱导试剂例如DNA聚合酶存在下以及合适温度和pH下)时，它能够充当合成起始点。对于扩增中的最大效率，引物优选是单链的，但备选地可以是双链的。如果是双链的，那么首先处理引物，以在用于制备延伸产物前使其链分开。优选地，引物是寡脱氧核苷酸。引物必须足够长以在诱导试剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度依赖于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。
如本文所使用的，术语“探针”指天然的(如在纯化的限制消化物中)或合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(即，核苷酸序列)，它能够与另一目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可以用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。可以考虑到，在本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记，从而使得可在任何检测系统中检测，所述检测系统包括但不限于酶(例如，ELISA以及基于酶的组织化学测定法)、荧光、放射性和发光系统。本发明不旨在限制于任何具体检测系统或标记。
如本文所使用的，当用于聚合酶链反应时，术语“靶”指用于聚合酶链反应的引物所结合的核酸区域。由此，可以寻求将“靶”从其他核酸序列中挑选出来。“区段”定义为靶序列内的核酸区域。
如本文所使用的，术语“聚合酶链反应”(“PCR”)指在此引入作为参考的美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中的方法，其包括无需克隆或纯化用于增加靶序列区段在基因组DNA混合物中的浓度的方法，这是本领域技术人员已知的。因为靶序列的期望扩增区段在混合物中成为主要序列(就浓度而言)，故将其称作“PCR扩增的”。
如本文所使用的，术语“扩增试剂”指除引物、核酸模板和扩增酶外，扩增所需的那些试剂(三磷酸脱氧核糖核苷酸、缓冲液等)。一般地，将扩增试剂连同其他反应组分一起置于和容纳在反应器皿(试管、微孔等)中。
用PCR，可以将基因组DNA中单拷贝的特定靶序列扩增至通过几种不同方法(例如，与标记探针杂交；掺入生物素化引物后利用抗生物素蛋白-酶缀合物检测；32P标记的三磷酸脱氧核苷酸，例如dCTP或dATP掺入扩增区段内)可以检测的水平。除了基因组DNA外，任何寡核苷酸或多核苷酸序列都可以用合适的引物分子对进行扩增。特别地，通过PCR过程本身产生的扩增区段自身就可以是后续PCR扩增的有效模板。
如本文所使用的，术语“PCR产物”、“PCR片段”和“扩增产物”指在变性、退火和延伸的PCR步骤的2个或更多个循环完成后得到的化合物混合物。这些术语涵盖已经扩增了一个或多个靶序列的一个或多个区段的情况。
如本文所使用的，术语“RT-PCR”指RNA序列的复制和扩增。在这种方法中，逆转录与PCR偶联，最通常使用其中采用热稳定聚合酶的酶法，见引入本文作为参考的美国专利号5,322,770中的描述。在RT-PCR中，由于聚合酶的逆转录酶活性，RNA模板被转化成cDNA，并且随后使用聚合酶的聚合活性扩增(即，如在其他PCR方法中一样)。
如本文所使用的，术语“限制性核酸内切酶”和“限制酶”指各自在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA的细菌酶。
“限制位点”指由给定的限制性核酸内切酶识别并切割的核苷酸序列，其通常是用于插入DNA片段的位点。在本发明的某些实施方案中，在选择标记以及DNA构建体的5′和3′端中构建限制位点。
如本文所使用的，术语“染色体整合”指将引入的序列导入宿主细胞染色体内的过程。转化DNA的同源区与染色体的同源区进行序列匹配(align)。随后，同源盒之间的序列在双交换中被引入的序列置换(即，同源重组)。在本发明的某些实施方案中，DNA构建体的失活染色体区段的同源部分与芽孢杆菌染色体的天生染色体区域的侧翼同源区进行序列匹配。随后，天生的染色体区域在双交换中通过DNA构建体缺失(即，同源重组)。
“同源重组”意指2个DNA分子或配对染色体之间在等同或接近等同的核苷酸序列位点处发生的DNA片段交换。在一个优选实施方案中，染色体整合是同源重组。如本文所使用的，“同源序列”指当就比较进行最佳比对时，一个核酸或多肽序列与另一个核酸或多肽序列具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、88％、85％、80％、75％或70％的序列同一性。在某些实施方案中，同源序列具有85％-100％序列同一性，而在其他实施方案中，存在90％-100％序列同一性，并且在更优选的实施方案中，存在95％-100％序列同一性。
如本文所使用的，“氨基酸”指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。
如本文所使用的，“目的蛋白质”和“目的多肽”指期望的和/或待评估的蛋白质/多肽。在某些实施方案中，“目的蛋白质”是“亲本蛋白质”(即，起始蛋白质)。在某些实施方案中，亲本蛋白质是用作蛋白质工程/设计的起始点的野生型酶。在某些实施方案中，目的蛋白质在细胞内表达，而在其他实施方案中，它是分泌多肽。在特别优选的实施方案中，这些酶包括本文描述的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。在某些实施方案中，目的蛋白质是与信号肽(即，在待分泌的蛋白质上的氨基末端延伸)融合的分泌多肽。几乎所有分泌蛋白都使用氨基末端蛋白质延伸，其在前体蛋白质的靶向和跨膜转运中起关键作用。该延伸可以在膜转移过程中或紧在膜转移后通过信号肽酶被蛋白水解去除。
如本文所使用的，术语“异源蛋白质”指非天然存在在宿主细胞中的蛋白质或多肽。异源蛋白质的例子包括酶，例如水解酶，包括蛋白酶。在某些实施方案中，编码蛋白质的基因是天然存在的基因，而在其他实施方案中，使用突变和/或合成的基因。
如本文所使用的，“同源蛋白质”指细胞中天生的或天然存在的蛋白质或多肽。在优选实施方案中，细胞是革兰氏阳性细胞，而在特别优选的实施方案中，细胞是芽孢杆菌属宿主细胞。在备选实施方案中，同源蛋白是由其他生物，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、纤维单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、木霉(Trichoderma)和曲霉(Aspergillus)，产生的天然蛋白质。本发明包括经由重组DNA技术产生同源蛋白质的宿主细胞。
在本文中使用时，如果蛋白质在相同排列中以及采用相同拓扑连结时具有相同的主要二级结构，它们就被定义为具有共同“折叠”。具有相同折叠的不同蛋白质通常具有大小和构象不同的转角区域和二级结构周边元件。在一些情况下，这些不同的周边区域可包含结构的一半。放在同一折叠类别下的蛋白质并不必须要有共同的进化起源(例如，来自偏好某些包装排列或链拓扑结构的蛋白质的物理或化学的结构相似性)。
在本文中使用时，“测试蛋白质折叠”指其性能指数在感兴趣的测定中被改进的蛋白质。
在本文中使用时，术语“结合”和“分配(partitioning)”指与底物结合的酶的量，或吸附到表面上的蛋白质的量，而不管热力学意义上的达成平衡与否或动力学意义上的可逆或不可逆吸附。
如本文所使用的，“操纵子区”包含一组邻近基因，其作为单个转录单位自共同启动子转录，并且由此受到共调节。在某些实施方案中，操纵子包括调节基因。在最优选的实施方案中，使用高度表达(如通过RNA水平测量)的、但具有未知或非必需功能的操纵子。
如本文所使用的，“抗微生物区”是包含编码抗微生物蛋白质的至少一个基因的区域。
如果多核苷酸，在其自然状态中或当通过本领域技术人员已知的方法操纵后，可以转录和/或翻译以产生RNA、多肽或其片段，则称该多核苷酸“编码”RNA或多肽。此种核酸的反义链也被说成编码该序列。
如本领域已知的，DNA可以通过RNA聚合酶转录以产生RNA，而RNA可以通过逆转录酶进行逆转录以产生DNA。因此，DNA可以编码RNA并且反之亦然。
术语“调节区段”或“调节序列”或“表达控制序列”指与编码多肽链的氨基酸序列的DNA多核苷酸序列有效地连接以实现该编码氨基酸序列的表达的DNA多核苷酸序列。调节序列可以抑制、阻遏或促进有效地连接的编码氨基酸的多核苷酸序列的表达。
“宿主菌株”或“宿主细胞”指对于包含本发明DNA的表达载体合适的宿主。
如果酶在细胞中以比其在相应野生型细胞中的表达水平更高的水平表达，那么酶在宿主细胞中“过量表达”。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。本公开内容自始至终使用符合IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN)定义的氨基酸3字母代码。还应当理解由于遗传密码简并性，多肽可以由一种以上的核苷酸序列编码。
“前序列”是在信号序列和成熟蛋白酶之间的氨基酸序列，其对于蛋白酶分泌是必需的。前序列的切割将导致成熟的活性蛋白酶。
术语“信号序列”或“信号肽”指参与成熟或前体形式的蛋白质分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信号序列的这个定义是功能定义，意欲包括由蛋白质基因的N末端部分编码的、参与实现蛋白质分泌的、所有那些氨基酸序列。它们通常但不是绝对地与蛋白质的N末端部分或前体蛋白质的N末端部分结合。信号序列可以是内源或外源的。信号序列可以是与蛋白质(例如，蛋白酶)天然结合的信号序列，或可以来自编码其它分泌蛋白质的基因。一种示例性外源信号序列包含与来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前7个氨基酸残基融合的、来自迟缓芽孢杆菌(ATCC21536)的枯草杆菌蛋白酶的信号序列的其余部分。
术语“杂合信号序列”指该信号序列的部分得自表达宿主、与待表达基因的信号序列融合。在某些实施方案中，利用合成序列。
术语“基本上相同的信号活性”是指如通过蛋白酶向发酵培养基的基本上相同的分泌所指示的信号活性，例如，发酵培养基蛋白酶水平是由SEQID NO：9的信号序列提供的发酵培养基中分泌蛋白酶水平的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％。
术语“成熟”形式的蛋白质或肽指蛋白质或肽的最终功能形式。为了例示，本发明的成熟形式的ASP蛋白酶至少包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列，而本发明的成熟形式的NprE蛋白酶至少包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
术语蛋白质或肽的“前体”形式指具有与蛋白质的氨基或羧基末端有效地连接的前序列的成熟形式蛋白质。前体还可以具有与前序列的氨基末端有效地连接的“信号”序列。前体还可以具有参与翻译后活性的另外多核苷酸(例如，被切除以留下成熟形式的蛋白质或肽的多核苷酸)。
“天然存在的酶”和“天然存在的蛋白质”指具有与自然界中发现的酶或蛋白质等同的未经修饰的氨基酸序列的酶或蛋白质。天然存在的酶包括天然酶，在特定微生物中天然表达或存在的那些酶。
术语“源自”或“得自”不仅指由所讨论的生物株产生的或可产生的酶(例如，蛋白酶)，还指由此生物株中分离的DNA序列编码且在包含此DNA序列的宿主生物中产生的酶。此外，该术语还指由合成来源和/或cDNA来源的DNA序列编码的、具有所讨论酶的鉴定特征的酶。
在本定义范畴中“衍生物”一般保留在野生型、天然或亲本形式中观察到的特征性蛋白水解活性，且保留的程度使得衍生物可以与野生型、天然或亲本形式用于相似的用途。功能性酶衍生物包括具有亲本酶的一般特征的、天然存在的或合成或重组产生的肽或肽片段。
术语“功能性衍生物”指具有编码酶的核酸的功能特征的核酸衍生物。编码本文提供的酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在、合成或重组产生的核酸或片段。编码本发明酶的野生型核酸包括基于本领域已知的遗传密码简并性的天然存在的等位基因和同源物。
与2个核酸或多肽序列相关的术语“相同(同一)”是指，当就最大对应性进行比对时，在2个序列中相同的残基，可以使用下述序列比较或分析算法之一确定。
术语“最佳比对”是指给出最高同一性百分比分数的比对。
“序列同一性百分比”、“氨基酸序列同一性百分比”、“基因序列同一性百分比”和/或“核酸/多核苷酸序列同一性百分比”，就2个氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(合适时)而言，指当序列进行最佳比时，在2个序列中等同的残基的百分比。因此，80％氨基酸序列同一性指在2个最佳比对的多肽序列中有80％氨基酸是等同的。
因此，与2个核酸或多肽相关的短语“基本上相同(同一)”是指，使用程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)，使用标准参数，与参考序列比较，一个多核苷酸或多肽包含至少70％序列同一性、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少97％、优选至少98％且优选至少99％序列同一性。2个多肽基本上等同的一个指标是第一多肽与第二多肽具有免疫学交叉反应性。一般地，差异在于保守氨基酸置换的多肽具有免疫学交叉反应性。因此，例如，当一个多肽与第二多肽的差异仅在于保守置换时，这2个多肽基本上等同。2个核酸序列基本上等同的另一个指标是2个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格范围内)彼此杂交。
术语“分离的”或“纯化的”指物质自其最初环境(例如，如果它是天然存在的，那么天然环境)中被移出。例如，一个物质将被说成是“纯化的”，如果该物质在特定组合物中的存在浓度比其在天然或野生型生物中的存在浓度高或低、或如果该物质在特定组合物中与其自天然或野生型生物表达时通常不存在的组分组合存在。例如，在活动物中存在的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统中共存的一些或所有物质分开的该同一多核苷酸或多肽是分离的。在某些实施方案中，此种多核苷酸是载体的部分，和/或此种多核苷酸或多肽是组合物的部分，并且仍是分离的，因为此种载体或组合物不是其天然环境的一部分。在某些优选实施方案中，核酸或蛋白质被说成是纯化的，例如，如果它在凝胶电泳或印迹中产生基本上一个条带时。
术语“分离的”，当用于DNA序列时，指这样的DNA序列，其已从其天然遗传环境中被移出并因此不含其他额外的或不希望有的编码序列，并且具有适于在遗传改造的蛋白质生产系统内使用的形式。此种分离的分子可以是从其天然环境中分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含通常与之关联的其他基因，但可以包括天然存在的5′和3′非翻译区例如启动子和终止子。关联区域的鉴定对于本领域普通技术人员将是显而易见的(参见例如，Dynan和Tijan，Nature 316：774-78，1985)。术语“分离的DNA序列”备选地称为“克隆的DNA序列”。
术语“分离的”，当用于蛋白质时，指存在于非其天然环境的条件下的蛋白质。在优选形式中，分离的蛋白质基本上不含其他蛋白质，特别是其他同源蛋白质。分离的蛋白质，如通过SDS-PAGE测定的，可以具有大于10％的纯度、优选大于20％的纯度、并且更加优选大于30％的纯度。本发明的进一步方面包含，如通过SDS-PAGE测定的，高度纯化形式(即，大于40％纯、大于60％纯、大于80％纯、大于90％纯、大于95％纯、大于97％纯、以及甚至大于99％纯)的蛋白质。
如本文所使用的，术语“组合诱变”指产生起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体包含选自预定一组突变的一个或几个突变。此外，该方法可以提供引入并非该组预定突变的成员的随机突变的手段。在某些实施方案中，该方法包括在美国申请号9/699,250中阐述的那些，所述美国申请于2000年10月26日提交，在此引入作为参考。在备选实施方案中，组合诱变方法包括商购可得的试剂盒(例如，Multisite，Stratagene，La Jolla，CA)。
如本文所使用的，术语“突变体文库”指一群细胞，这些细胞在其大部分基因组上是相同的，但包括一个或多个基因的不同同源物。此种文库可以用于例如鉴定具有改进性状的基因或操纵子。
如本文所使用的，术语“起始基因”指编码待使用本发明改进和/或改变的感兴趣的蛋白质的感兴趣的基因。
如本文所使用的，术语“变体”指通过一个或多个氨基酸的添加、置换或缺失而衍生自前体蛋白质(例如，“亲本”蛋白质)的蛋白质。在某些实施方案中，与前体蛋白质比较，变体包含至少一种修饰，所述修饰包含电荷的改变。在一些优选实施方案中，前体蛋白质是本身为野生型蛋白质的亲本蛋白质。
如本文所使用的，术语“多重序列比对”和“MSA”指使用算法(例如，Clustal W)比对的起始基因的多个同源物的序列。
如本文所使用的，术语“共有序列”和“规范序列”指与特定目的蛋白质或序列的所有变体进行比较的原型氨基酸序列。该术语还指这样的序列，该序列陈列出在目的DNA序列中最常存在的核苷酸。对于基因的每个位置，共有序列给出在MSA中在那个位置中丰度最大的氨基酸。
如本文所使用的，术语“共有突变”指在起始基因的序列和共有序列中的差异。共有突变可以通过比较起始基因的序列和得自MSA的共有序列进行鉴定。在某些实施方案中，将共有突变引入起始基因内，从而使得它变得与共有序列更相似。共有突变还包括如下氨基酸改变，所述改变导致起始基因的氨基酸变为在MSA中于该位置处出现频率高于起始基因氨基酸的出现频率的氨基酸。因此，术语共有突变包含用在MSA中比起始基因的氨基酸丰度更高的氨基酸替换起始基因的氨基酸的所有单氨基酸改变。
如本文所使用的，术语“初始命中物”指通过筛选组合共有诱变文库鉴定到的变体。在优选实施方案中，与起始基因比较，初始命中物具有改进的性能特征。
如本文所使用的，术语“改进命中物”指通过筛选增强的组合共有诱变文库鉴定到的变体。
如本文所使用的，术语“改进突变”和“性能增强突变”是指，当被引入起始基因内时，导致改进性能的突变。在某些优选实施方案中，这些突变通过测序在本方法的筛选步骤过程中鉴定到的命中物来鉴定。在大多数实施方案中，与未筛选的组合共有诱变文库比较，在命中物中更频繁出现的突变很可能是改进突变。
如本文所使用的，术语“增强的组合共有诱变文库”指基于来自较早的CCM诱变和筛选循环的筛选和/或测序结果设计和构建的CCM文库。在某些实施方案中，增强的CCM文库基于得自较早的CCM循环的初始命中物的序列。在另外的实施方案中，设计增强的CCM，以有利于在较早诱变和筛选循环的初始命中物中频繁观察到的突变。在某些优选实施方案中，这通过如下方式实现：省略编码性能降低突变的引物，或者相对于在较早CCM文库中使用的其他引物，增加编码性能增强突变的引物的浓度。
如本文所使用的，术语“性能降低突变”指与未筛选的组合共有诱变文库比较，在组合共有诱变文库中在筛选得到的命中物中出现频率较低的突变。在优选实施方案中，筛选过程去除和/或降低包含“性能降低突变”的变体的丰度。
如本文所使用的，术语“功能测定”指指示蛋白质活性的测定。在特别优选的实施方案中，该术语指分析蛋白质以其通常的能力起作用的能力的测定系统。例如，在酶的情况下，功能测定涉及测定酶催化反应的效力。
如本文所使用的，术语“靶性质”指起始基因中待改变的性质。本发明不旨在局限于任何具体靶性质。然而，在某些优选实施方案中，靶性质是基因产物的稳定性(例如，对抗变性、蛋白水解或其他降解因素的抗性)，而在其他实施方案中，改变在生产宿主中的生产水平。事实上，可以考虑到，本发明适用于起始基因的任何性质。
如本文所使用的，与核酸相关的术语“性质”或其语法等价物是指，核酸的可以选择或检测的任何特征或属性。这些性质包括但不限于，影响与多肽的结合的性质，赋予包含特定核酸的细胞的性质、影响基因转录的性质(例如，启动子强度、启动子识别、启动子调节、增强子功能)、影响RNA加工的性质(例如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、影响翻译的性质(例如，水平、调节、mRNA与核糖体蛋白质的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点，以产生期望特征或鉴定不希望有的特征。
如本文所使用的，在多肽相关的术语“性质”或其语法等价物是指，多肽的可以选择或检测的任何特征或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、KM、kcat、kcat/kM比、蛋白质折叠、诱导免疫应答、与配体结合的能力、与受体结合的能力、被分泌的能力、在细胞表面上展示的能力、寡聚化的能力、发信号的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导凋亡的能力、被磷酸化或糖基化修饰的能力、治疗疾病的能力。
如本文所使用的，术语“筛选”具有其在本领域中的通常含义，并且一般而言是多步骤过程。在第一个步骤中，提供突变体核酸或来自其的变体多肽。在第二个步骤中，测定突变体核酸或变体多肽的性质。在第三个步骤中，使测定的性质与相应亲本核酸的性质、相应天然多肽的性质、或用于产生该突变体核酸的原料(例如，初始序列)的性质比较。
对于技术人员显而易见的是，用于获得具有改变性质的核酸或蛋白质的筛选操作将取决于原材料的如下性质，其中突变体核酸的产生旨在促进所述性质的变化。技术人员因此将理解本发明并不限于待筛选的任何特定性质，并且下述性质描述仅列出了举例说明性例子。用于筛选任何具体性质的方法在本领域中有一般描述。例如，可以测量在突变前和后的结合、pH、特异性等，其改变指示变化。优选地，筛选以高通量方式进行，包括同时筛选多个样品，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示、以及多底物和/或指示物的测定法。
如本文所使用的，在某些实施方案中，筛选包括自变体群体中富集目的变体的选择步骤。这些实施方案的例子包括对赋予宿主生物生长优势的变体的选择、以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中变体可以基于其结合或催化性质从变体群体中被捕获出来。在一个优选实施方案中，使变体文库暴露于胁迫(热、蛋白酶、变性)，并且随后在筛选中鉴定仍完整的变体或通过选择富集之。该术语旨在包含任何合适的筛选方法。事实上，本发明不旨在局限于任何具体筛选方法。
如本文所使用的，术语“靶向随机化”指产生其中一个或多个位置已被随机化的多个序列的过程。在某些实施方案中，随机化是完全的，即，所有4种核苷酸，A、T、G和C都可以存在于进行随机化的位置处。在备选实施方案中，核苷酸的随机化被局限于4种核苷酸的子集。靶向随机化可以应用于序列的一个或几个密码子，从而编码一种或几种目的蛋白质。当表达时，所得到的文库产生蛋白质群体，在该蛋白质群体中一个或多个氨基酸位置可以包含所有20种氨基酸的混合物或氨基酸的子集，这由随机化密码子的随机化方案确定。在某些实施方案中，由于密码子的靶向或随机插入或缺失，由靶向随机化产生的群体的个体成员具有不同的氨基酸数目。在其它实施方案中，合成的氨基酸被包括在产生的蛋白质群体中。在某些优选实施方案中，与起始基因比较，由靶向随机化产生的群体的大多数成员显示与共有序列更大的序列同源性。在某些实施方案中，序列编码一种或多种目的蛋白质。在备选实施方案中，这些蛋白质具有不同的生物学功能。在某些另外的优选实施方案中，引入的序列包含至少一个可选择标记。
术语“经修饰的序列”和“经修饰的基因”在本文中可互换使用，指包括对天然核酸序列的缺失、插入或中断的序列。在某些优选实施方案中，经修饰的序列的表达产物是截短蛋白质(例如，如果修饰是序列的缺失或中断)。在某些特别优选的实施方案中，截短蛋白质保留生物活性。在备选实施方案中，经修饰的序列的表达产物是延长蛋白质(例如，修饰包含在核酸序列内的插入)。在某些实施方案中，插入导致截短蛋白质(例如，当插入导致形成终止密码子时)。因此，插入可以导致作为表达产物的截短蛋白质或延长蛋白质。
如本文所使用的，术语“突变序列”和“突变基因”可互换使用，并且指在宿主细胞的野生型序列的至少一个密码子中具有改变的序列。突变序列的表达产物是相对于野生型具有改变的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可以具有改变的功能能力(例如，增强的酶促活性)。
术语“诱变引物”或“诱变寡核苷酸”(在本文中可互换使用)意欲指与模板序列的一部分对应并且能够与之杂交的寡核苷酸组合物。就诱变引物而言，引物与模板核酸不精确匹配，引物中该一个或多个错配用于将期望突变引入核酸文库内。如本文所使用的，“非诱变引物”或“非诱变寡核苷酸”指与模板核酸精确匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一个实施方案中，仅使用诱变引物。在本发明的另一个优选实施方案中，设计引物，使得对于已包括诱变引物的至少一个区域，还存在非诱变引物包括在寡核苷酸混合物中。通过加入诱变引物和与至少一种诱变引物对应的非诱变引物的混合物，可以导致所得核酸文库呈现出各种各样的组合突变模式。例如，如果希望突变体核酸文库的某些成员在某些位置处保留其亲本序列，而其他成员在此位点处发生突变，则非诱变引物能够针对给定残基在核酸文库中获得特定水平的非突变成员。本发明的方法采用诱变和非诱变的寡核苷酸，其长度一般为10-50个碱基、更优选长度约15-45个碱基。然而，为获得期望诱变结果，可能需要使用短于10个碱基或长于50个碱基的引物。就相应的诱变和非诱变引物而言，相应寡核苷酸无需具有等同长度，而是仅需要在与待添加的突变对应的区域中存在重叠。
在某些实施方案中，引物以预定比例加入。例如，如果希望所得到的文库具有显著水平的某种特定突变以及在相同或不同位点处较少量的不同突变，那么通过调整加入的引物量，可以产生期望的偏倚文库。备选地，通过加入更少或更多量的非诱变引物，可以调整一种或多种相应突变在突变核酸文库中的产生频率。
如本文所使用的，短语“邻接突变”指在相同寡核苷酸引物内呈现的突变。例如，邻接突变可以是彼此邻近或接近的，然而，它们将通过相同引物引入到所得到的突变体模板核酸内。
如本文所使用的，短语“非邻接突变”指在分开的寡核苷酸引物中呈现的突变。例如，非邻接突变将通过分开制备的寡核苷酸引物引入到所得到的突变体模板核酸内。
术语“野生型序列”、“野生型核酸序列”和“野生型基因”在本文中可互换使用，指在宿主细胞中天生或天然存在的序列。在某些实施方案中，野生型序列指作为蛋白质改造计划的起始点的目的序列。野生型序列可以编码同源或异源蛋白质。同源蛋白质是宿主细胞在无干预的情况下产生的蛋白质。异源蛋白质是如果没有干预，宿主细胞将不产生的蛋白质。
术语“氧化稳定的”指在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间占优势的条件下，例如在暴露于漂白剂或氧化剂或者与漂白剂或氧化剂接触时，经过给定时间段，本发明的蛋白酶保留特定量的酶促活性。在某些实施方案中，在与漂白剂或氧化剂接触给定时间段，例如至少1分钟、3分钟、5分钟、8分钟、12分钟、16分钟、20分钟等后，蛋白酶保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％蛋白水解活性。
术语“螯合剂稳定的”指在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间占优势的条件下，例如在暴露于螯合剂或与螯合剂接触时，经过给定时间段，本发明的蛋白酶保留特定量的酶促活性。在某些实施方案中，在与螯合剂接触给定时间段，例如至少10分钟、20分钟、40分钟、60分钟、100分钟等后，蛋白酶保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％蛋白水解活性。
术语“热稳定的(thermally stable)”和“热稳定的(thermostable)”指在本发明的酶促、水解、清洁或其他过程期间占优势的条件下，在暴露于鉴定温度给定时间段后，例如，在暴露于改变的温度时，本发明的酶保留特定量的酶促活性。改变的温度包括增加或减少的温度。在某些实施方案中，在暴露于改变的温度给定时间段，例如至少60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟等后，蛋白酶保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％蛋白水解活性。
术语“热活化”或“热活性”指本发明的下述酶：在酶促、水解、清洁或本发明的其它过程中占优势的条件下，例如当暴露给改变的温度时，所述酶在给出的温度下给定的时间段后获得特定量的酶促活性。改变的温度包括增加或减少的温度。在一些实施方式中，在给定的温度给定的时间段(例如至少10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟等)后，蛋白酶获得至少大约10％，大约20％，大约30％，大约40％，大约50％，大约60％，大约70％，大约75％，大约80％，大约85％，大约90％，大约92％，大约95％，大约96％，大约97％，大约98％或大约99％或更多的酶促活性。
在本文中使用时，术语“化学稳定性”指蛋白质(例如酶)对负面影响其活性的化学品的稳定性。在一些实施方式中，此类化学品包括但不限于：过氧化氢、过酸、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、非离子洗涤剂、螯合试剂等。但是，本发明不欲限于任何特定的化学稳定性水平或者任何范围的化学稳定性。特别地，术语“洗涤剂稳定”和“LAS稳定”指本发明的下述蛋白酶：在蛋白质水解、水解、清洁或本发明的其它过程中占优势的条件下，所述蛋白酶在暴露给洗涤剂组合物给定的时间段后保留特定量的酶促活性。在一些实施方式中，暴露给洗涤剂给定时间段(例如至少60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟等)后，蛋白酶保留至少大约50％，大约60％，大约70％，大约75％，大约80％，大约85％，大约90％，大约92％，大约95％，大约96％，大约97％，大约98％或大约99％的蛋白水解活性。
在本文中使用时，术语“洗涤稳定性”指蛋白质(例如酶)在酶促、水解、清洁或本发明的其它过程中占优势的条件下的稳定性。但是，本发明并不欲限于任何特定的洗涤稳定性水平。特别地，术语“洗涤稳定”和“洗涤条件稳定性”指本发明的下述蛋白酶：在酶促水解、清洁或本发明的其它过程中占优势的条件下，所述蛋白酶在给定的时间段上保留特定量的酶促活性。在一些实施方式中，在暴露给洗涤剂给定时间段(例如至少5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟等)后，蛋白酶保留至少大约50％，大约60％，大约70％，大约75％，大约80％，大约85％，大约90％，大约92％，大约95％，大约96％，大约97％，大约98％或大约99％的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性的酶的上下文中，术语“增强的稳定性”或“减小的稳定性”表示较之野生型酶而言随着时间分别保留下来的更高或更低的酶促活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性的酶的上下文中，术语“增强的稳定性”或“减小的稳定性”表示较之野生型酶而言随着时间分别保留下来的更高或更低的酶促活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性的蛋白酶的上下文中，术语“增强的稳定性”表示较之其它丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶而言随着时间保留下来的更高的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性的蛋白酶的上下文中，术语“减小的稳定性”表示较之其它丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶而言随着时间保留下来的更低的蛋白水解活性。
在本文中使用时，术语“益处”和“有利结果”指对蛋白质加以改进使得其更适合动物、人和工业应用的后果。在一些实施方式中，有利结果与最终想要的应用中的蛋白质用途直接相关，例如，洗涤剂蛋白酶的清洁性能，而在其它一些实施方式中，其提供了涉及其生产的益处。有利结果的例子包括但不限于以下方面的改进：底物结合、酶抑制、反应速率、洗涤剂稳定性、热稳定性、热活性、构象稳定性、针对蛋白质水解和/或自溶的稳定性、表达水平、溶解性、可复原性、pH活性情况、乳化性、发泡性和润湿。
在本文中使用时，术语“放热性的”和“吸热性的”根据其在本领域内的通常含义使用。在本文描述的一些测定系统中，剩下的活性比例小于1表示该变体在较高的温度下活性较低(即，放热性的)，因此，其更适合在低温下的性能。相反，剩下的活性比例大于1表示该变体在较高温度下具有更高活性(即，吸热性的)，因此，其更适合在较高温度下的性能。
在本文中使用时，术语“物理性质”指适于描述蛋白质的物理化学特征的任何参数。在本文中使用时，“感兴趣的物理性质”和“感兴趣的性质”可互换使用，用于表示被研究和/或修饰的蛋白质的物理性质。术语“蛋白质”在一般含义上包括酶、多肽和聚电解质。物理性质的例子包括但不限于：净表面电荷和电荷在蛋白质表面上的分布、净疏水性和疏水残基在蛋白质表面的分布、表面电荷密度、表面疏水性密度、表面可离子化基团总数、表面张力、蛋白质大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容量和第二维里系数。
如本文所使用的，除非另有说明，术语“清洁用组合物”包括颗粒或粉末形式的通用或“重型(heavy-duty)”洗涤剂，特别是清洁用洗涤剂；液体、凝胶或糊形式的通用洗涤剂，特别是所谓的重型液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻型(lightduty)餐具洗涤剂，特别是高泡型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括用于家用和公共机构使用的各种片剂、颗粒、液体和漂洗辅助类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手类型、清洁皂、漱口水、牙清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和发漂洗剂(hair-rinse)；沐浴凝胶和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁辅助剂例如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理类型。
本文中使用时，用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”表示意欲用于清洁被弄脏的客体的洗涤媒介中的混合物。在一些优选的实施方式中，在提到对织物和/或衣服进行洗涤时使用该术语(例如“洗衣洗涤剂”)。在一些备选的实施方式中，所述术语指其它洗涤剂，例如用于清洁餐具、刀叉等的洗涤剂(例如“餐具洗涤洗涤剂”)。本发明不欲受到任何特别的洗涤剂制剂或组合物的限制。事实上，该术语意图包括含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白激活物、发蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活物、抗氧化剂和加溶剂的洗涤剂。
在本文中使用时，术语“参照缓冲液”指用于测量感兴趣的性质(例如ζ-电势)的、pH和离子强度已知的缓冲液。
在本文中使用时，术语“改进变体”指相对野生型或其它亲本分子展示出大于1.0的性能指数的酶变体，如上下文所述。
在本文中使用时，术语“底物污渍特异性酶变体”指在存在其它污渍时优先水解特定污渍的酶。
在本文中使用时，术语“感兴趣的测定”指用于针对酶测定感兴趣的特定性质的任何测试方法。在一些实施方式中，使用多种感兴趣的测定。
在本文中使用时，洗涤剂中“增强的性能”被定义为：标准洗涤循环后通过常用评估测定时，对污渍(例如草、茶、酒、血、脏(dingy)、食物等)的清洁增加。在一些特别的实施方式中，本发明的酶变体在对有色污渍或污迹(soil)的去除中提供了增强的性能。在另一些实施方式中，本发明的酶在对污渍的去除和/或脱色中提供了增强的性能。
在本文中使用时，术语“硬表面清洁用组合物”指用于清洁硬表面，例如地板、墙壁、瓷砖、浴室和厨房固定装置(fixture)等的洗涤剂组合物。此类组合物以任何形式提供，其包括但不限于固体、液体、乳液等。
在本文中使用时，“餐具洗涤组合物”指所有形式的、用于清洁餐具的组合物，其包括但不限于颗粒和液体形式的。
在本文中使用时，“织物(fabric)清洁用组合物”指所有形式的、用于清洁织物的洗涤剂组合物，其包括但不限于颗粒、液体和条(bar)形式的。
在本文中使用时，“纺织品(textile)”指机织物(woven fabrics)以及适于转化为或用作为纱线、机织织物、针织物和非机织织物的短纤维和长丝。该术语包括从天然以及合成(例如人造)纤维制造的纱线。
在本文中使用时，“纺织品材料”是用于纤维、纱线中间产物、纱线、织物和从织物制造的产品(例如衣服和其它产品)的一般性术语。
在本文中使用时，“织物”包括任何纺织品材料。因此，该术语意欲包括衣服以及织物、纱线、纤维、非机织材料、天然材料、合成材料以及任何其它纺织品材料。
在本文中使用时，术语“相容”表示：在正常使用情况期间，清洁用组合物材料不将本发明的酶的酶促活性降低到所述酶不能像所期待的那样有效的程度。在下文中详细示例了一些特定的清洁用组合物材料。
在本文中使用时，“酶的有效量”表示实现特定应用(例如个人护理产品、清洁用组合物等)中需要的酶促活性所必需的酶的量。此类有效量是本领域普通技术人员易于确定的，它们基于很多因素，例如所使用的特别的酶变体，清洁应用，清洁用组合物的特定组成以及是否需要液体或干的(例如颗粒、条块)组合物等。
在本文中使用时，“非织物清洁用组合物”包括硬表面清洁用组合物、餐具洗涤组合物、个人护理清洁用组合物(例如口腔清洁用组合物、牙齿清洁用组合物、个人清洁用组合物等)以及适用于纸浆和造纸工业的组合物。
除非另有指明，提到组分或组合物的活性水平时，所有组分或组合物水平都排除杂质，例如，残余溶剂或副产物(其可能存在于商业可获得的来源中)。
酶组分重量基于总的活性蛋白质。除非另有指明，所有百分比和比例都是通过重量计算的。除非另有指明，所有百分比和比例都是基于总组合物计算的。
应当理解，申请文件通篇中给出的每个最大数值限制包括每一个更低的数值限制，这等于在本文中明确给出了这些更低的数值限制。本申请文件通篇中给出的每个最小数值限制也将包括每一个更高的数值限制，这等于在本文中明确给出了这些更高的数值限制。本申请文件通篇中给出的每个数值范围也将包括落在此类较宽数值范围内的每一个较窄的数值范围，这等于在本文中明确给出了这些较窄的数值范围。
术语“清洁活性”指：在酶促、水解、清洁或本发明的其它过程中占优势的条件下，通过酶获得的清洁性能。在一些实施方式中，通过应用多种清洁测定来测定清洁性能，所述测定涉及对酶敏感的污渍，例如，草、血、奶或卵蛋白，这通过在对污渍应用标准洗涤条件后进行多种色谱、分光光度或其它定量方法来测定。示例性测定包括但不限于WO 99/34011和美国专利No.6,605,458(两者都通过引用并入本文)中描述的那些以及实施例中包括的那些方法。
术语酶的“清洁有效量”表示在特定的清洁用组合物中获得想要的酶促活性水平的前文所述的蛋白酶的量。此类有效量是本领域普通技术人员易于确定的，它们基于很多因素，例如所使用的特定的酶，清洁应用，清洁用组合物的特定组成以及是否需要液体或干的(例如颗粒、条块)组合物等。
在本文中使用时，术语“清洁辅助材料”表示选用于想要的特定类型的清洁组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、条块、糊状、喷雾、片状、凝胶或泡沫组合物)的任何液体、固体或气体材料，所述材料还优选与用于组合物中的蛋白酶相容。在一些实施方式中，颗粒组合物是“压缩”形式的，而在其它一些实施方式中，液体组合物是“浓缩”形式的。
在清洁活性的上下文中，术语“增强的性能”和“有利性质”指某些对酶敏感的污渍(例如血、奶、墨汁、蛋、草、茶、酒等)的增加的或更高的清洁活性(较之亲本酶)，这是通过在标准洗涤循环和/或多个洗涤循环之后进行常规评估来测定的。在一些特别的实施方式中，本发明的蛋白酶变体在对有色污渍的去除中提供增强的性能。
在清洁活性的上下文中，术语“减小的性能”和“不利性质”指某些对酶敏感的污渍(例如血、奶、墨汁、蛋、草、茶、酒等)的减少的或更小的清洁活性(较之亲本酶)，这是通过在标准洗涤循环之后进行常规评估来测定的。
在清洁活性的上下文中，术语“相当性能”和“可接受的性能”指相当酶(例如，商业可获得的蛋白酶)的清洁活性的至少大约60％，至少大约70％，至少大约80％，至少大约90％，至少大约95％。可通过在多种清洁测定中将本发明的蛋白酶与其它蛋白酶进行比较来测定清洁性能，所述测定涉及对酶敏感的污渍，例如，血、奶和/或墨汁(BMI)，这通过在对标准洗涤循环条件后进行常用的分光光度或分析方法来测定。
在本文中使用时，“低洗涤剂浓度”系统包括这样的洗涤剂，其中，洗涤水中存在少于大约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中仅存在大约667ppm的洗涤剂组分。
在本文中使用时，“中等洗涤剂浓度”系统包括这样的洗涤剂，其中，洗涤水中存在大约800ppm至大约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洗涤剂通常被认为中等洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在大约975ppm的洗涤剂组分。巴西洗涤剂通常地在洗涤水中具有存在大约1500ppm的洗涤剂组分。
在本文中使用时，“高洗涤剂浓度”系统包括这样的洗涤剂，其中，洗涤水中存在超过大约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度系统，因为它们在洗涤水中具有大约3000-8000ppm的洗涤剂组分。
在本文中使用时，“织物清洁用组合物”包括手洗和机洗洗衣洗涤剂组合物，所述组合物包括洗衣添加组合物和适用于浸泡和/或预处理带有污渍的织物(例如，织物(cloth)、亚麻和其它纺织品材料)
在本文中使用时，“非织物清洁用组合物”包括非纺织品(即织物)表面清洁用组合物，包括但不限于餐具清洗洗涤剂组合物、口腔清洁用组合物、牙齿清洁用组合物和个人清洁用组合物。
“压缩”形式的清洁组合物在本文中由密度最好地反映，并且就组合物而言，通过无机填充盐的量最佳反映。无机填充盐是粉末形式的洗涤剂组合物中的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填充盐以实质量存在，一般是总组合物的17-35重量％。相比之下，在压型组合物中，填充盐以不超过总组合物15％的量存在。在某些实施方案中，填充盐以不超过组合物的10重量％、或更优选地5重量％的量存在。在某些实施方案中，无机填充盐选自硫酸和氯化物的碱金属和碱土金属盐。优选的填充盐是硫酸钠。
发明详述
本发明提供了获得下述蛋白质的高效方法，所述蛋白质在工业、消费者或药物应用中具有一种或多种有益属性。在一些优选的实施方式中，本发明提供了通过筛选候选酶的缩略组生产用于给定应用的优质酶的方法。
目前用于改进蛋白质在工业、消费者或药物应用中的性能的大多数策略都关注于酶活性位点上或附近的氨基酸取代，以增加催化效率。但是，在本发明的开发中确定，酶表面其它地方的突变显著地增加了酶性能，使其超过通过催化效率改进可能获得的程度。基本上，操纵酶介导的底物到产物的转化的反应速率仅部分由化学催化转化步骤单独控制。酶和底物在其作为酶-底物ES复合体联合之前以及在化学转化后从形成的酶-产物EP复合体上解离期间，它们还作为胶体发生相互作用。即使反应步骤快速进行，针对底物的酶接近过程也极其慢(例如扩散限制)，就像是同符号(same-sign)胶体经历静电排斥力一样。类似地，酶从酶产物-EP复合物上的释放也可能极其地慢(例如扩散限制)，就像胶体经历吸引短距离疏水和分散力一样。两种条件都增加了酶从底物到产物的运送时间，并且较之化学转化而言成为了限速步骤。虽然可能设想，带相反电荷的胶体实际上将加速ES复合物的形成(例如，超出扩散限制)，但随后EP复合物的解离仍相当慢(假设没有产生也没有丢失电荷)，总体反应速率仍将降低。因此，利用成对相互作用势能的不对称性，以确保ES和EP复合体的运送时间都最小。这在工业生物技术中特别有用，因为人们想要在通常的酶受限条件下以尽可能最短的时间，将所有底物都转化成产物。历史上，蛋白质工程技术人员关注化学转化步骤的特异性酶-底物相互作用，但他们没有认识到分子间胶体和表面力导致的短范围和长范围非特异性相互作用两者的影响，所述影响操纵着结合和解离步骤。本发明的一种目的是对分子间力进行最优化至这样的点，其中化学转化步骤变成限速步骤。一旦化学转化步骤成为限速步骤，就可通过酶活性位点的变化对其加以改进。无论底物是溶液中的小肽还是不可溶的宏观底物，该目的都可适用。但是，为了产生和使用本发明，并不一定要了解涉及的机制。本发明并不欲受限于任何特定的机制。
举例而言，在液体洗衣应用中，观察到酶和带电荷的底物污渍间性能的电荷最优值。不被理论束缚的话，当酶和底物污渍具有强烈相反符号的电荷时，检测到极少的性能，这可能是由于紧密的非生产性结合导致的。相反，当它们的电荷是强烈的同符号匹配时，也检测到极少的性能，这可能是增加的排斥力导致的。对于给定的酶折叠来说，用相对亲本酶的净电荷，足以描述性能的这种电荷最优值。但是，当对不同酶折叠间的性能加以比较时，必须使用共同标度(scale)。示例性的共同标度包括但不限于通过ζ-电势、电泳、氢离子滴定测量实验测定的或者甚至使用公众(例如SwissProt)或商业软件(例如DelPhi，MOE)计算的酶电荷。在本文中提到时，对于给定的底物污渍和洗涤剂制剂来说，来自不同折叠的最优酶展示出可比较的净电荷。该发现为在任何反应媒介中针对给定应用快速鉴定性能最好的酶的方法提供了基础。
性能最优值的位置受利用的媒介(例如洗涤剂制剂、pH、离子强度等)以及感兴趣的酶的氨基酸残基的电荷分布和净电荷很大影响。因此认为，针对不同pH、离子强度、表面活性剂类性和比例、助洗剂和螯合剂(所有这些都影响静电现象)的不同制剂存在最优酶。本发明提出，使用酶掺合物(其中掺合物的每种成员具有不同的电荷最优值)来生产适于多种条件的制剂(例如，在水硬度不同的不同地理区域或位置售卖的洗涤剂制剂中的蛋白酶)。本发明还提出，使用酶掺合物(其中掺合物的每种成员擅长于清洁不同的污渍)来生产适于清洁多种污渍的制剂。此外，本发明提出，在酶底物自身在酶反应期间经历电荷变化的情况下，使用酶掺合物，其中掺合物的每种成员具有不同的电荷最优值。
虽然本文是涉及蛋白酶和血、奶和墨汁污渍来描述的，但本发明的方法适用于对任何反应媒介中的任何酶-底物相互作用加以优化。特别地，本发明提出，本发明的方法可用于改进其它蛋白酶和酶类别(例如淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶等)的性质。此外，提出，本发明的方法适用于改进其它制剂(例如缓冲液)中酶和其它蛋白质的性质。
在一些实施方式中，本发明的方法可用于改进纤维素酶。纤维素酶与纤维素底物反应，在多种工业应用中提供多种益处。它们包括但不限于：在纺织品上的石磨水洗作用、在洗衣过程中从织物上清洁污渍、对棉和棉/合成纤维混纺去毛球和预防起球以及将生物质分解为可发酵的糖。可通过按照本文针对蛋白酶所述对其表面电荷和/或疏水性加以优化，获得给定应用条件下的最优性能，来改进纤维素酶在所有这些应用中的性能。特别地，在纺织品和织物护理应用中，与纤维素酶的使用相关的主要问题之一是纤维素酶处理会使得织物被削弱。由于织物是带电荷的表面，使用本发明的方法优化酶表面的电荷可用于预防纤维素酶穿透进纤维。具有最优电荷的酶变体仍可通过在纤维表面反应来抛光表面，但是不会穿透表面。因此，本发明提供了获得具有良好织物护理性能但是具有较低织物强度损失的纤维素酶的方法。在还一些实施方式中，本发明提供的改进的纤维素酶可用于生物质和其它应用。
此外，本发明的方法可用于改进用于淀粉水解(可用于多种商业和工业应用)的淀粉酶。
聚酯酶和角质酶可用于修饰聚酯的表面。该反应可用于为聚酯和聚酯/棉混纺提供织物护理益处。已知酶的主要缺陷之一在于它们与织物非常紧密地结合。这导致酶在多种织物护理应用中性能不佳。本发明提供了改进聚酯酶和角质酶的性能的手段，这通过修饰这些酶的表面电荷和/或疏水性来实现。
将脂肪酶用于洗衣应用，以清洁油性污渍。通常，这些污渍非常疏水。本发明提供了改进脂肪酶的性能的手段，这通过优化这些酶的表面电荷和/或疏水性来实现。脂肪酶性能的另一缺点在于脂肪酶与织物和/或污渍结合导致的臭味产生。类似地，本发明可用于使得臭味产生最小化，这通过优化脂肪酶的表面电荷和/或疏水性以降低酶与织物的结合来实现。
清洁用组合物通常需要含有蛋白酶和非蛋白酶的酶的制剂。蛋白酶通常会降解其它酶以及它们自身(通过自溶)。目前，这通过加入抑制蛋白酶的化合物来解决。本发明可用于增加酶对蛋白水解的抗性，这通过确定具有蛋白酶抗性的给定酶的物理性质最优值来实现。
简言之，本发明的方法涉及下文详述的步骤中的一个或多个：(I)对跨越物理性质范围的探针蛋白质加以测定；(II)针对给定的有利结果测定物理性质最优值；以及(III)提供具有物理性质最优值的变体蛋白质。
I.测定探针蛋白质
在一些实施方式中，该步骤涉及：在合适的测定中，对跨越感兴趣的物理性质(即，“感兴趣的性质”)范围的多种探针蛋白质(即，“探针蛋白质折叠”)加以测试。在一些实施方式中，探针蛋白质包括有限的蛋白质和/或其变体的组。在一些示例性的实施方式中，该步骤涉及针对一种或多种益处对多种丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶(例如两种不同的蛋白质折叠)加以测试。例如，提供了两种蛋白酶——ASP(丝氨酸蛋白酶)和NprE(中性金属蛋白酶)的电荷梯级变体。本文所述的ASP的蛋白酶电荷梯级变体较之亲本ASP(例如R14I)而言跨越了-4到+4的相对净电荷变化范围，或者较之野生型ASP而言，跨越了-5到+3的范围。在一些实施方式中，探针蛋白质组还包括商业可获得的蛋白质，它们用作为目的应用的基准(例如，用于洗涤剂制剂的枯草杆菌蛋白酶)。
II.测定物理性质最优值
在一些优选的实施方式中，该步骤涉及针对有利结果鉴定物理性质最优值或其范围。在一些示例性的实施方式中，测量蛋白酶电荷梯级变体的清洁性能。当对用具有不同折叠的蛋白质获得的益处加以比较时，使用共同物理性质标度(例如，作为ζ-电势报道的蛋白质电荷)。相反，当对用具有相同折叠的蛋白质获得的益处加以比较时，可利用相对标度(例如，相对于野生型或亲本蛋白质的净电荷差异)。在一些特别优选的实施方式中，利用跨越宽物理性质范围的探针蛋白质，以增加界定物理性质最优值的可能性。一旦已通过测定探针蛋白质建立了针对感兴趣的益处的最优值或最优范围，就可预测将劣等性能者(例如，在最优范围外)转化为优质性能者(例如，在最优范围内)可能所需的电荷的一般方向和大小。
本发明提出，使用超过一种探针蛋白质系列，以允许针对感兴趣的益处鉴定不同的物理性质最优值。例如，在一些实施方式中，在血、奶、墨汁测定中，针对清洁性能，对洗涤剂蛋白酶的电荷梯级和疏水性梯级二者均加以测试。相反，提出相同的物理性质展示出针对不同益处的不同最优值。例如，对于NprE而言，针对清洁性能存在一种最优蛋白酶电荷，这与针对洗涤剂稳定性的最优蛋白酶电荷不同。
在一些实施方式中，在测量的ζ-电势、净电荷、电荷密度和/或可离子化基团表面计数的方面，在不同蛋白质折叠之间比较电荷相关的物理性质。通常，从滴定或电泳测量来测定蛋白质电荷的任何方法都适于比较不同的蛋白质折叠。在一些备选的实施方式中，通过基于蛋白质的一级、二级和/或三级序列信息(可获得的话)计算上述量中的一种或多种，来比较不同的蛋白质折叠。用于此类目的的典型的生物信息学工具包括使用Henderson-Hesselbach公式(例如European Molecular BiologyLaboratory)的等电点计算器或Poisson-Boltzmann静电解算器(例如Delphi，MOE)。
在一些实施方式中，在测量的蛋白质在其天然水性环境和疏水相之间的分配的方面，在不同蛋白质折叠间比较疏水性相关的物理性质。例子包括但不限于水-空气或庚烷-水界面上的表面张力以及接触角和润湿测量(水性和固体含底物相之间)。通常，适于表征蛋白质在两相间分配的任何方法都适用于本发明，包括光学(例如，椭圆偏光法、表面等离振子共振、干涉量度法和/或反射率)、声学(例如，石英晶体微量天平)、荧光、分光光度(例如，衰减全反射红外)或浓度(例如，酶活性)测定。在一些实施方式中，使用文献中可获得并且本领域已知的很多氨基酸疏水性标度中的一种或多种来计算总体疏水性作用，其中要考虑到蛋白质一级、二级和/或三级结构的信息。
电荷和疏水性标度并不互相独立，因为带电荷的残基会增加疏水特征。因此，并非简单地选择一种标度(而不是另一种)，本发明的一些实施方式利用了多种不同的标度(例如理论或实验测定的)来鉴定物理性质依赖性。关于最常使用的疏水性标度中的23种的参考文献包括：疏水性(Rao和Argos)计算膜中埋藏的螺旋参数(Rao和Argos，Biochim.Biophys.Acta869：197-214[1986])；疏水性(Black和Mould)计算生理性的L-α氨基酸的疏水性(Black和，Mould，Anal.Biochem.，193：72-82[1991])；疏水性(Bull和Breese)计算疏水性(以千卡/摩尔表示的转移到表面的自由能)(Bull和Breese，Arch.Biochem.Biophys.161：665-670[1974])；疏水性(Chothia)计算95％埋藏的残基的比例(12个蛋白质中)(Chothia，J.Mol.Biol.，105：1-14[1976])；疏水性(Kyte和Doolittle)计算亲水性(hydropathicity)(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132[1982])；疏水性(Eisenberg等人)计算归一化的共有疏水性标度(Eisenberg等人，J.Mol.Biol.179：125-142[1984])；疏水性(Fauchere和Pliska)计算疏水性标度(pi-r)(Fauchere和Pliska，Eur.J.Med.Chem.，18：369-375[1983])；疏水性(Guy)计算基于转移自由能的疏水性标度(千卡/摩尔)(Guy，Biophys J.，47：61-70[1985])；疏水性(Janin)计算从球形蛋白质的内部转移到外部的自由能(Janin，Nature 277：491-492[1979])；疏水性(Abraham和Leo)计算疏水性(δG1/2cal)(Abraham和Leo，Proteins：Structure，Function and Genetics 2：130-152[1987])；疏水性(Manavalan等人)计算平均周围疏水性(Manavalan等人，Nature 275：673-674[1978])；疏水性(Miyazawa等人)计算疏水性标度(源于3D数据的接触能)(Miyazawa等人，Macromolecules 18：534-552[1985])；疏水性(Aboderin)计算层析纸上的氨基酸的迁移率(RF)(Aboderin，Int.J.Biochem.，2：537-544[1971])；疏水性HPLC(Parker等人)计算源于HPLC肽驻留时间的疏水性标度(Parker等人，Biochem.，25：5425-5431[1986])；Hphob.HPLC pH3.4计算通过HPLC测定的pH 3.4处的疏水性指数(Cowan和Whittaker，Peptide Res.，3：75-80[1990])；Hphob.HPLCpH7.5计算通过HPLC测定的pH 7.5处的疏水性指数(Cowan和Whittaker，Peptide Res.，3：75-80[1990])；疏水性(Rose等人)(AA)计算平均级分面积损失(mean fractional area loss)(f)[平均埋藏面积/标准状况面积(average area buried/standard state area)](Rose等人，Science229：834-838[1985])；和疏水性(Roseman)计算疏水性标度(pi-r)(Roseman，J.Mol.Biol.，200：513-522[1988])。
在一些实施方式中，在之前提到的电荷和疏水性标度两方面，在不同蛋白质折叠间比较溶解性相关的物理性质。通常，表征蛋白质-蛋白质对蛋白质-溶剂相互作用的任何热力学或动力学的量都适用于本发明的方法。例如，可使用第二维里系数(见，Wilson，ActaCrystallographica，D50：361-365[1994])、chi参数、渗透压和活性或逸性(fugacity)系数(反映与理想混合行为的偏差)(见，例如Reid等人，“The Properties of GasesandLiquids”，第4版，McGraw-Hill，[1987])。
在一些实施方式中，使用适用于测定蛋白质或聚合物尺寸的任何实验手段，在不同蛋白质折叠间比较大小相关的物理性质。在还一些实施方式中，使用通常可获得的蛋白质或聚合物构象(卷曲、球形、带分支)、它们的分子量和流体动力学或回转半径之间的关联，从分子量推断大小。用于测定大小或分子量的合适技术包括但不限于：静态和动态光散射、凝胶电泳、质谱和色谱。在另一些实施方式中，易于从关于实验测定的蛋白质晶体结构或结构同源性模型的知识来估计大小。
通常，通过监测温度扫描过程中的物理报道性质，来测定蛋白质的熔融温度(Tm)。合适的方法包括但不限于，差示扫描量热法、圆二色性、动态光散射和UV-可见光光谱。
III.提供具有物理性质最优值的变体蛋白质
在前述步骤中测定了最优值或范围之后，提供针对感兴趣的物理性质被限制的多种候选蛋白质。用于提供候选蛋白质的合适方法包括但不限于：通过重组技术生产人工酶变体，以及通过色谱纯化天然酶变体(例如同源物)，体外合成糖基化或磷酸化酶变体或者体外生产酶缀合物。通过糖基化改变蛋白质疏水性的另一方法是在酶表面产生新的糖基化位点。将在表达期间对这些变体进行体内糖基化。
使用ASP和NprE电荷梯级探针蛋白质揭示：通过相同的标准正态分布，很好地描述了来自不同物理性质的益处或有利结果。在一些实施方式中，使用探针蛋白质的组，针对给定应用测定该分布的均值和宽度。接着，将该分布用作为参照，以测定从相同或不同折叠获得其它酶变体(在同样条件下测试时具有想要的益处)所需的改进的方向和大小。
例如，ASP和NprE电荷梯级变体在枯草芽孢杆菌中在同样生长条件下的最优表达水平都遵循相同的标准分布，对于每种酶而言在-8.84mV的ζ-电势处发生。例如，在匹配北美洗涤剂pH和传导性的缓冲液中，ASP电荷梯级变体对血、奶、墨汁污渍的最优清洁性能遵循正态分布，最优清洁为-9.68mV的ζ-电势，其大致等于底物污渍的-8.97mV。此外，使用蛋白质工程改造、通过共价或非共价连接的化学修饰、天然分离株选择和翻译后修饰(例如糖基化)，提供了达到该电荷要求的ASP和NprE蛋白酶。
实验
提供下述实施例以展示且进一步举例说明本发明的某些优选实施方案和方面，不应将这些实施例解释为限制本发明的范围。
在随后的实验公开内容中，应用下述缩写：℃(摄氏度)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；HCl(盐酸)；aa和AA(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM和uM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟/复数分钟)；hr(s)(小时/复数小时)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；OD280(在280nm处的光密度)；OD405(在405nm处的光密度)；OD600(在600nm处的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸盐缓冲盐水)[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2])；LAS(月桂基磺酸钠)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；TAED(N，N，N′N′-四乙酰乙二胺)；BES(polyesstersulfone)；MES(2-吗啉代乙磺酸，一水合物；f.w.195.24；Sigma#M-3671)；CaCl2(氯化钙，无水；f.w.110.99；Sigma#C-4901)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺，f.w.73.09，d＝0.95)；Abz-AGLA-Nba(2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酸-4-硝基苄基酰胺，f.w.583.65；Bachem#H-6675，VWR目录#100040-598)；SBG1％(″SuperBroth with Glucose″；6g大豆蛋白胨(Soytone)[Difco]、3g酵母提取物、6gNaCl、6g葡萄糖)；在使用本领域已知的方法灭菌前用NaOH将pH调整至7.1；w/v(重量与体积比)；v/v(体积与体积比)；Npr和npr(中性金属蛋白酶)；(SEQUEST数据库搜索程序，Universityof Washington)；Npr和npr(中性金属蛋白酶基因)；nprE和NprE(解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶)；PMN(纯化的金属蛋白酶)；MS(质谱法)；SRI(污渍去除指数)和BMI(血奶墨汁)。
此外，材料从下述机构中的一些获得：TIGR(The Institute forGenomicResearch，Rockville，MD)；AATCC(American Association ofTextile and ColoringChemists)；Amersham(Amersham Life Science，Inc.Arlington Heights，IL)；Corning(Corning International，Corning，NY)；ICN(ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA)；Pierce(PierceBiotechnology，Rockford，IL)；Equest(Equest，WarwickInternationalGroup，Inc.，Flintshire，UK)；EMPA(Eidgenossische MaterialPrufungsund Versuch Anstalt，St.Gallen，Switzerland)；CFT(Center forTestMaterials，Vlaardingen，The Netherlands)；Amicon(Amicon，Inc.，Beverly，MA)；ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA)；BectonDickinson(BectonDickinson Labware，Lincoln Park，NJ)；Perkin-Elmer(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)；Rainin(Rainin Instrument，LLC，Woburn，MA)；Eppendorf(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)；Waters(Waters，Inc.，Milford，MA)；Geneart(Geneart GmbH，Regensburg，Germany)；Perseptive Biosystems(Perseptive Biosystems，Ramsey，MN)；MolecularProbes(Molecular Probes，Eugene，OR)；BioRad(BioRad，Richmond，CA)；Clontech(CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)；Cargill(Cargill，Inc.，Minneapolis，MN)；Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)；GIBCO BRL或Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；New Brunswick(New Brunswick Scientific Company，Inc.，Edison，NJ)；Thermoelectron(Thermoelectron Corp.，Waltham，MA)；BMG(BMG Labtech，GmbH，Offenburg，Germany)；Greiner(GreinerBio-One，Kremsmuenster，Austria)；Novagen(Novagen，Inc.，Madison，WI)；Novex(Novex，San Diego，CA)；Finnzymes(Finnzymes OY，Finland)Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；DuPontInstruments(Asheville，NY)；Global Medical Instrumentation或GMI(Global Medical Instrumentation；Ramsey，MN)；MJ Research(MJResearch，Waltham，MA)；Infors(Infors AG，Bottmingen，Switzerland)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；Roche(HoffmannLa Roche，Inc.，Nutley，NJ)；Agilent(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)；Merck(Merck&Co.，Rahway，NJ)；Ion Beam Analysis Laboratory(Ion Bean AnalysisLaboratory，The University of Surrey Ion BeamCentre(Guildford，UK)；TOM(Terg-o-Meter)；BMI(血、奶、墨汁)；BaChem(BaChem AG，Bubendorf，Switzerland)；MolecularDevices(Molecular Devices，Inc.，Sunnyvale，CA)；Corning(CorningInternational，Corning，NY)；MicroCal(Microcal，Inc.，Northhampton，MA)；Chemical Computing(Chemical Computing Corp.，Montreal，Canada)；NCBI(National Center forBiotechnology Information)；Beckman(Beckman-Coulter，Fullerton，CA)；SeitzSchenk(SeitzSchenkFiltersystems GmbH，Bad Kreuznach，Germany)；Pall(Pall Corp.，EastHills，NY)；和Malvern Instruments(Malvern Instruments，Inc.，Worcestershire，UK)。
实施例1
测定
下述测定用于下文所述的实施例中。与下文提供的方案的任何偏差都在实施例中指出。在这些实验中，使用分光光度计来测量反应完成之后形成的产物的吸光度。
A.蛋白质含量测定
BCA(二辛可宁酸)测定
在这些测定中，BCA(Pierce)测定被用于在微滴定板(MTP)规模上测定蛋白酶样品中的蛋白质浓度。在该测定系统中，使用的化学品和试剂溶液是：BCA蛋白质测定试剂和Pierce稀释缓冲液(50mM MES，pH6.5，2mM CaCl2，0.005％)。使用的设备是SpectraMAX(340型；Molecular Devices)MTP读数仪。从Costar获得MTPs(9017型)。
在测试中，向每个孔中移入200μl BCA试剂，接着加入20μl经稀释的蛋白质。彻底混合之后，在37℃对MTPs进行30分钟温育。排出气泡，在562nm处读取孔中溶液的光密度(OD)。为测定蛋白质浓度，从样品读数中减去背景读数。将OD562对蛋白质标准(经纯化的蛋白酶)作图，产生标准曲线。从标准曲线插入样品的蛋白质浓度。
Bradford测定
在这些测定中，用Bradford染料试剂(Quick Start)测定来在MTP规模上测定蛋白酶样品中的蛋白质浓度。在该测定系统中，使用的化学品和试剂溶液是：Quick StartBradford染料试剂(BIO-RAD Catalog No.500-0205)、稀释缓冲液(10mM NaCl，0.1mMCaCl2，0.005％)。使用的设备是Biomek FX Robot(Beckman)和SpectraMAX(340型)MTP读数仪。MTPs来自Costar(9017型)。
在测试中，向每个孔中移入200μl Bradford染料试剂，接着加入15μl稀释缓冲液。最后向孔中加入10μl经过滤的培养液(culture broth)。彻底混合之后，在室温下对MTPs进行至少10分钟的温育。吹走气泡，在595nm处读取孔的ODs。为测定蛋白质浓度，从样品读数中减去背景读数(即，来自未接种的孔的)。获得的OD595值提供了对样品中蛋白质含量的相对量度。
B.酶性能测定
用于该测定的洗涤剂不含酶，或者已通过如本文别处描述的热失活破坏了商业洗涤剂中存在的酶。使用的设备包括Eppendorf恒温混合仪和SpectraMAX(340型)MTP读数仪。从Costar获得MTPs(9017型)。
洗涤剂制备(AATCC HDL；美国条件)
将Milli-Q水调节至水硬度为6gpg(Ca/Mg＝3/1)，加入1.5g/l AATCC2003标准参照液体洗涤剂(不含增亮剂)。对洗涤剂溶液进行至少15分钟的剧烈搅拌。然后，加入5mMHEPES(游离的酸)，将pH调节至8.0。
BMI微布样测定
从CFT Vlaardingen获得0.25英寸圆形直径的微布样，其含有血奶和墨汁(BMI)。在切割布样之前，用水洗织物(EMPA 116)。在96孔微滴定板的每个孔中垂直放一块微布样，以暴露整个表面区域(即，不平铺在孔底部)。按照本文所述来制备想要的洗涤剂溶液。在25℃对恒温混合仪平衡之后，向MTP的每个孔(含有微布样)中加入190μl洗涤剂溶液。向该混合物中加入10μl稀释的酶溶液，最终酶浓度为1μg/ml(从BCA测定测定的)。用胶条密封MTP，在温育箱中放置30分钟，其间以1400rpm搅动。在合适的条件下温育之后，从每个孔取100μl溶液，转移到新的MTP中。新的MTP含有100μl溶液/孔，使用MTP SpectraMax读数仪在405nm处对其加以读数。还包括了空白对照以及含有两块微布样和洗涤剂但是没有酶的对照。
烤蛋微清洁测定
从鸡蛋黄制备96孔烤蛋黄(baked egg yolk)底物板。将鸡蛋黄与蛋清分开，从膜囊释放出来，并用Milli-Q水进行20％(体积/重量)稀释。在室温下用磁性搅拌器对经稀释的蛋黄搅拌15分钟。使用8通道移液器，取5μL，小心加入到96孔V底板(Costar#3894)每个孔的中央。板在90℃烘烤1小时，在室温下冷却。将经烘烤的蛋黄底物板贮存于室温下，在制备1周内使用。按照本文别处所述制备自动餐具洗涤剂，并将其预热至50℃。使用8通道移液器，向96孔板的每个孔中加入190μL的洗涤剂等分试样。使用96通道移液装置，向每个孔中加入10μL经稀释的酶。用粘性箔封小心密封96孔板，将其在50℃搅拌下温育30分钟。将120μL反应混合物转移至新的96孔平底板，在405nm处测定吸光度/光散射。405nm处的吸光度/光散射与蛋黄的去除成比例。
蛋黄微布样测定
按照本文别处所述制备自动餐具洗涤剂。使用的设备包括NewBrunswick Innova4230摇床/温育箱和SpectraMAX(340型)MTP读数仪。从Costar获得MTPs(9017型)。从Centerfor Test Materials(Vlaardingen，Netherlands)获得有色素的陈化的蛋黄布样(agedegg yolkwith pigment swatches)(CS-38)。在切0.25英寸圆形微布样之前，用水洗织物。在96孔微滴定板的每个孔中放一块微布样。在50℃平衡测试洗涤剂。向MTP的每个孔(含有微布样)中加入190μl洗涤剂溶液。向该混合物中加入10μl稀释的酶溶液。用粘性箔密封MTP，将其放进温育箱中，搅动下温育30分钟。温育之后，从每个孔取100μl溶液，转移到新的MTP中。使用MTP SpectraMax读数仪在405nm处对该MTP加以读数。还包括了空白对照以及含有微布样和洗涤剂但是没有酶的对照。
稻淀粉微布样测定
稻淀粉测定是对淀粉酶性能的测试。洗涤剂如本文中其他地方所述进行制备。使用的设备包括New Brunswick Innova 4230摇床/温育箱和SpectraMAX(型号340)MTP读数仪。MTPs得自Corning(型号3641)。陈化的稻淀粉与橙色颜料布样(CS-28)得自Center forTest Materials(Vlaardingen，Netherlands)。在切割0.25英寸环状微布样前，用水洗涤织物。在96孔微量滴定板的每个孔中放置2个微布样。测试洗涤剂在20℃(北美)或40℃(西欧)平衡，向MTP的每个含微布样的孔中加入190μl洗涤剂溶液。向这个混合物中，加入10μl稀释的酶溶液。用粘性箔密封MTP，并且置于温育箱中1小时同时在期望测试温度(一般是20℃或40℃)以750rpm搅动。温育后，将来自每个孔的150μl溶液转移到新鲜MTP内。这个MTP使用MTP SpectraMax读数仪在488nm处进行读数，以量化清洁。还包括空白对照以及包含微布样和洗涤剂但不含酶的对照。
计算酶性能
针对空白值(即，没有酶的情况下，温育微布样之后获得的)，校正获得的吸光度值。得到的吸光度是水解活性的量度。
C.suc-AAPF-pNA水解测定，用于测试蛋白酶活性
在该测定系统中，使用的试剂溶液是：100mM Tris/HCl，pH 8.6，0.005％(Tris)；100mM Tris/HCl，pH 8.6，10mM CaCl2和0.005％(Tris/Ca)；和160mM suc-AAPF-pNA(处于DMSO中)(suc-AAPF-pNA贮液)(Sigma：S-7388)。为制备suc-AAPF-pNA工作溶液，向100ml Tris/Ca缓冲液中加入1ml AAPF贮液，并良好混合至少10秒。通过向每个孔中加入10μl稀释的蛋白酶溶液接着(快速)加入190μl1mg/ml AAPF工作溶液，来进行测定。对溶液混合5秒，于25℃在MTP读数仪中于410nm处测定吸光度变化率。
D.二甲基酪蛋白水解测定，用于测试蛋白酶活性
在该测定系统中，使用的化学品和溶液是：
二甲基酪蛋白(DMC)：Sigma C-9801；Sigma P-8074；PIPES缓冲液(游离酸)：Sigma P-1851-15.1g溶解于大约960ml水中，用4N NaOH将pH调节至7.0，加入1ml 5％将体积加至1000ml。PIPES和的最终浓度分别为50mM和0.005％；
间三硝苯基磺酸(TNBS)：Sigma P-2297(5％水溶液)；
试剂A：将45.4g Na2B4O7.10H2O(Merck 6308)和15ml 4N NaOH一起溶解，至终体积为1000ml(如果需要的话，通过加热溶解)；以及
试剂B：将35.2g NaH2PO4.1H2O(Merck 6346)和0.6g Na2SO3(Merck6657)一起溶解，至终体积为1000ml。
为制备底物，将4g DMC溶解于400ml PIPES缓冲液中。用PIPES缓冲液稀释经过滤的培养物上清液；生长板中对照的最终浓度为20ppm。然后，向MTP孔中的200μl底物中加入10μl每种经稀释的上清液。用胶带封上MTP板，振荡数秒，在37℃烘箱中放置2小时，其间不加搅动。从烘箱中取出第一块板之前大约15分钟，通过将1ml TNBS溶液与每50ml试剂A混合，来制备TNBS试剂。MTPs的每孔填装60μl TNBS试剂A。将温育的板振荡数秒，之后向MTPs中转入10μl TNBS试剂A。用胶带封板，将其在台式摇床(BMG Thermosta)上以500rpm于室温下振荡20分钟。最后，向孔中加入200μl试剂B，在摇床上混合1分钟，使用MTP-读数仪测定405nm处的吸光度。
针对空白值(没有酶的底物)校正获得的吸光度值。得到的吸光度是水解活性的量度。通过用吸光度除以测定的蛋白质浓度，计算样品的(任意)比活性。
E.通过抗体滴定测定淀粉酶浓度
如本文所述，通过用抑制性多克隆抗体进行滴定，来测定α-淀粉酶浓度和比活性。我们发现，针对嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶产生的多克隆抗体对来自的芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)TS23的α-淀粉酶和AmyS有强烈抑制性(例如，结合足够紧密，足以产生活性损失的线性滴定)。因此，可使用该抗体来测量酶浓度，进而可用酶浓度来计算比活性。简言之，测量数种已知浓度的抗体产生的酶抑制的量。从该信息外推出完全抑制所需的抗体浓度，这与样品中酶浓度相等。使用荧光BODIPY-淀粉测定来测量α-淀粉酶活性和抑制。缓冲液是50mM MOPS，pH 7.0，其中含有0.005％Tween-80。
在兔中产生针对经纯化的AmyS的多克隆抗体，并通过标准方法加以纯化。通过测量对已知比活性的AmyS样品的抑制，来确定抗体贮液的经验“表观浓度”值。然后，用抗体样品来测定AmyS和TS23t变体的浓度和比活性。用这些值产生归一化的96孔酶贮液板，其中，所有变体都被稀释至一样的浓度。
F.通过水蛭蛋白酶抑制剂(Eglin)C抑制来测定蛋白酶浓度
如本文所述，通过用水蛭蛋白酶抑制剂C进行滴定，来测定枯草杆菌蛋白酶和ASP蛋白酶浓度和比活性。来自水蛭(Hirudo medicinalis)的水蛭蛋白酶抑制剂c是枯草杆菌蛋白酶和ASP蛋白酶的紧密结合的蛋白质抑制剂(Heinz等人，Biochemistry，31(37)：8755-66[1992])。因此，水蛭蛋白酶抑制剂C可用于测量酶浓度，进而可计算比活性。简言之，测量数种已知浓度的水蛭蛋白酶抑制剂c产生的酶抑制的量。从该信息计算完全抑制所需的水蛭蛋白酶抑制剂c浓度，这与样品中酶浓度相等。
使用上文所述的发色suc-AAPF-pNA测定来测量蛋白酶活性。通过标准方法，合成针对水蛭蛋白酶抑制剂c的基因，并将其在大肠杆菌(E.coli)中表达。其性质和抑制效能与从Sigma购得的水蛭蛋白酶抑制剂c相同。通过测量对已知比活性的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶样品的抑制，来测定水蛭蛋白酶抑制剂c贮液的浓度。然后，用经校正的水蛭蛋白酶抑制剂c样品来测定枯草杆菌蛋白酶和ASP蛋白酶变体的浓度和比活性。用这些值产生归一化的96孔酶贮液板，其中，所有变体都被稀释至一样的浓度。
G.天然蛋白质凝胶电泳
使用PhastGel系统(GE Healthcare)在预先凝铸的7.5％或12.5％浓度的天然聚丙烯酰胺凝胶(PhastGel Homogeneous)上测量变体蛋白质样品的电泳迁移率。使用缓冲带(Buffer strips)(PhastGel Native)，其由0.88M L-丙氨酸、0.25M Tris缓冲液，pH 8.8构成。典型的电泳条件由400V进行12.75分钟以及3.7cm的阳极阴极距离构成。
或者，在多种pH值(即，5.8、8.0和10.0)下，通过选择合适的缓冲液系统，在1mm厚的0.5-1.5％琼脂糖凝胶上测量变体蛋白质样品的电泳迁移率。在非变性条件下进行电泳。阴极-阳极长度为13.9cm。将1-2μg蛋白质的样品与5％甘油+0.05％溴酚兰混合，并上样到每条条带上。通常，凝胶电泳在100V进行1小时。
在各情况下，用溶解于10％乙酸中的Louiseville蓝染料对凝胶进行染色，并用水中的10％甲醇和10％酸性的酸来脱色。可同时上样12至20种蛋白质变体，这取决于使用的天然凝胶系统。由此，可立即相对上样到相同凝胶上的电荷梯级标准，来评估蛋白质变体的电泳迁移率。
H.洗涤剂热灭活
通过热灭活商业洗涤剂制剂，可以破坏任何蛋白质组分的酶促活性同时保留非酶组分的性质。因此，这个方法适用于准备在测试本发明的酶变体中使用的商购洗涤剂。对于北美(NA)和西欧(WE)重型液体衣物(HDL)洗涤剂，热灭活通过将预称重的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)置于95℃水浴中2小时来执行。对于北美(NA)和日本(JPN)重型颗粒衣物(HDG)洗涤剂，热灭活的温育时间是8小时，对于西欧(WE)HDG洗涤剂是5小时。用于热灭活NA和WE自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂的温育时间是8小时。这些洗涤剂购自当地超市店。未加热和加热的洗涤剂均在溶解洗涤剂的5分钟内进行测定，以精确测定失活百分比。通过suc-AAPF-pNA测定法测定酶活性。
对于在热灭活的洗涤剂中测试酶活性，由热灭活贮液制备洗涤剂的工作溶液。将合适量的水硬度(6gpg或12gpg)和缓冲剂加入洗涤剂溶液中以匹配期望条件(表1-1)。溶液通过涡旋或颠倒瓶子进行混合。
＊缩写：Procter&Gamble(P&G)；和Reckitt Benckiser(RB)。
I.用于测定淀粉酶活性的Bodipy淀粉测定法
使用Ultra Amylase Assay Kit(E33651，Invitrogen)执行Bodipy淀粉测定。通过使包含冻干底物的小瓶内容物溶解于100μL pH4.0的50mM乙酸钠缓冲液中，制备DQ淀粉底物的1mg/mL贮液。涡旋小瓶约20秒，留置室温黑暗中伴随偶尔的混合直至溶解。加入900μL测定缓冲液(具有2.6mM CaCl2 pH 5.8的50mM乙酸钠)，涡旋小瓶约20秒。底物溶液贮藏在室温黑暗中直至临用前，或贮藏在4℃。对于该测定，在测定缓冲液中由1mg/mL底物溶液制备100μg/mL的DQ底物工作溶液。将190μL 100μg/mL底物溶液加入96孔平底微量滴定板的每个孔中。将10μL酶样品加入孔中，使用恒温混合仪以800rpms混合30秒。在测定中包括仅包含缓冲液和底物的空白样品(无酶空白)。在荧光微滴定板读数仪中在25℃测量荧光强度的改变速率5分钟(激发：485nm，发射：520nm)。
J.玉米粉水解，用于测定淀粉酶活性
针对酶活性，玉米粉底物的淀粉水解测定。
使用固体分散装置(V&P Scientific)，将有机玉米粉(Azure Farms，lotno.03227)均匀铺进Greiner 96孔微滴定板的聚丙烯黑色平底烟囱(chimney)孔(Cat.No.655209)中。向每个孔中加入85μL 20mM乙酸钠(pH 5.6)，并混合。向板的顶部应用箔封，在恒温混合仪中于70℃对板预先温育20-30分钟。将酶样品稀释于Agilent聚丙烯板(5042-1385)中的20mM乙酸钠缓冲液中。向底物板中加入11μL经稀释的酶样品，用另一张箔紧紧封住板。然后将板转入预先加热至95℃的具有金属台(metalblocks)的LabnetVorTemp 56温育箱/摇床(Cat.No.S2056A)中，振荡速率设置为500rpm。温育继续30分钟。在温育最后，在冰桶中对板快速冷却，通过向每个孔中加入100μL 0.1N H2SO4来停止淀粉水解反应。简单对板加以混合，通过PAHBAH测定或HPLC来分析淀粉水解反应产物。
对来自玉米粉底物的酶促水解的可溶糖浓度的比色检测。
向空的PCR板的所有孔中加入80μL 0.5N NaOH的等分试样，接着加入20μL PAHBAH试剂(5％w/v对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH，Sigma#H9882，溶于0.5N HCl中))并混合(PAHBAH反应板)。向PAHBAH反应板中加入10μL淀粉水解反应上清液。所有板都被密封，并放置于热循环仪(MJ Research Tetrad)中，在95℃进行2分钟的程序，然后冷却至20℃。将80μL反应过的PAHBAH反应混合物样品转移到读数板中，在分光光度计中于405nm测量吸光度。
对来自玉米粉底物的酶促水解的可溶糖浓度的HPLC测定。
在Milli-Q水中，将从Sigma(St.Louis，MO)获得的可溶糖标准(DP1-DP7)全都稀释至100mg/ml，并用于将糖的峰面积转化实际糖浓度。在Beckman Coulter Allegra 6R离心机上，以3000rpm于25℃对来自淀粉水解测定的淬灭板进行5分钟离心。从经离心的板中吸取上清液，将其转移至Multiscreen-HV过滤板(目录No.MAHVN4550)。在HettichRotanta离心机中，以6000rpm于25℃，在Agileng HPLC板上对过滤板加以离心10分钟。将50μL 0.01N硫酸移动相(0.1N硫酸，用Milli-Q水稀释10X)转移到另一干净的Agilent HPLC板的每个孔中。简单混合经过滤的板，将50μL滤液转移到每孔含有50μL移动相的板的相应孔中。向将要用于校正的板的空孔中加入经稀释的糖标准。在平台摇床上简单混合内容物，用NalgenePre-slit孔盖盖上板。提前制备HPLC柱(Bio-RadAminex HPX-87H柱，Cat No.125-0140)，用2L移动相以0.6mL/分钟的恒定流速流经该柱。板中的所有样品都以20μL的注射体积运行，使用AMINEXH.M和RID(折射率)作为检测指标来进行分析所述样品。运行结束后，将HPLC的流速降至0.05mL/分钟。
K.测定由淀粉酶引起的淀粉粘度下降
在这个测定中，在粘度计中测量玉米淀粉底物溶液的粘度减少。玉米淀粉底物浆以分批方式由30％玉米粉干固形物在蒸馏水中新鲜配制，并且使用硫酸调整至pH 5.8。对于每次运行，称出50克浆(15克干固形物)，并且预温育10分钟以热至70℃。在淀粉酶加入后，使温度立即从70℃升高到85℃，伴随75rpm的旋转速度。浆和淀粉酶的混合物的温度达到85℃后，使温度保持恒定，并且监控粘度另外30分钟。
L.测量酶与大分子底物的结合
进行结合测定，来测定下述底物结合：蛋白酶(ASP)电荷梯级变体(相对野生型ASP的电荷变化＝-5至+3)与木质素和纤维素，以及淀粉酶(AmyS)电荷梯级变体(相对野生型AmyS的电荷变化＝-12至+12)与玉米秸秆和蔗渣。使用的底物包括：木质素(从对蔗渣的完全糖化回收的)、87.5％液体、蔗渣(甘蔗渣，来自巴西，通过National RenewableEnergyLaboratory进行了稀酸预处理，洗涤过并缓冲为pH 5)、PASC(磷酸溶胀(swollen)纤维素；纯，无定型纤维素，稀释于50mM乙酸钠pH5中)、AFEX(氨纤维扩张玉米秸秆)和PCS(经稀硫酸预处理，洗过并调节至pH 5的玉米秸秆)。使用前令所有底物都具有想要的百分比固体。
蛋白酶结合
纯化ASP蛋白酶电荷梯级变体(相对野生型ASP的电荷变化＝-5至+3)，并稀释至0.5mg/ml-1.5mg/ml。在硼酸盐缓冲液(40mM，pH8.5，0.016％Tween20)中制备大约2.4％木质素、0.5％PASC和1％蔗渣溶液。向96孔过滤板每孔中加入200μl。对照孔仅加入缓冲溶液。向每个孔中加入10μl 0.276g/ml Tween-20，使得Tween-20的最终浓度为1.38％。对照孔获得10μl水。为进行木质素和蔗渣结合测定，将ASP电荷梯级变体稀释至200ppm，向每个孔中加入10μl经稀释的酶。为进行PASC结合测定，将ASP梯级稀释至40ppm，向每个孔中加入10μl经稀释的酶。酶加入后，使用移液枪头来混合每个孔。对板加以密封，在振荡下于室温温育。1小时温育后，收集96孔板中的滤液。对滤液进行1∶20稀释之后，通过suc-AAPF-pNA测定来测量滤液中的酶活性。结合的蛋白质的百分比被计算为：和底物一起温育的样品的滤液中的活性与对照孔中的活性之比。
淀粉酶结合
纯化淀粉酶电荷梯级变体，并稀释至200ppm用于测试。在硼酸盐缓冲液(40mM，pH8.5，0.016％Tween80)中制备1％纤维素蔗渣溶液。向微滴定过滤板中每个孔中加入150μl蔗渣溶液。向一组单独的孔中加入150μl硼酸盐缓冲液，其用作为对照。向过滤板中加入10μl淀粉酶电荷梯级变体，每种条件一式两份。在室温下对板温育2小时。收集滤液，通过BODIPY-淀粉测定来测量上清液中的淀粉酶活性。
与微布样结合的蛋白酶
在标准洗涤条件下，有或没有BMI微布样时，对蛋白酶变体进行30分钟的温育。通过suc-AAPF-pNA测定来测量游离酶的量。与微布样结合的酶的比例如下计算：结合比例＝(没有布样时的酶活性-有布样时的酶活性)/(没有布样时的酶活性)。
与微布样的结合的α-淀粉酶
在标准洗涤条件下，有或没有CS-28稻淀粉微布样时，对淀粉酶变体进行30分钟的温育。通过BODIPY-淀粉测定来测量游离酶的量。与微布样结合的酶的比例如下计算：结合比例＝(没有布样时的酶活性-有布样时的酶活性)/(没有布样时的酶活性)。
实施例2
在枯草芽孢杆菌中生产蛋白酶
在本实施例中，描述了进行来在枯草芽孢杆菌中生产多种蛋白酶的实验。特别地，提供了用于用针对NprE、ASP、GG36和FNA re的表达载体转化枯草芽孢杆菌的方法。按照本领域已知的那样来进行转化(见，例如WO 02/14490)。
NprE蛋白酶生产
提供了用于将质粒pUBnprE转化进枯草芽孢杆菌的方法。下文提供的DNA序列(nprE前导序列、nprE前(pro)DNA序列和nprE成熟DNA序列，来自解淀粉芽孢杆菌)编码NprE前体蛋白质：
gtgggtttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgccgcttcctttatgagtttaaccatcagtctgccgggtgttcaggccgctgagaatcctca
gcttaaagaaaacctgacgaattttgtaccgaagcattctttggtgcaatcagaattgccttctgtcagtgacaaag ctatcaagcaatacttga
aacaaaacggcaaagtctttaaaggcaatccttctgaaagattgaagctgattgaccaaacgaccgatgatctcggc tacaagcacttccgtt
atgtgcctgtcgtaaacggtgtgcctgtgaaagactctcaagtcattattcacgtcgataaatccaacaacgtctat gcgattaacggtgaatta
aacaacgatgtttccgccaaaacggcaaacagcaaaaaattatctgcaaatcaggcgctggatcatgcttattaagc gatcggcaaatcac
ctgaagccgtttctaacggaaccgttgcaaacaaaaacaaagccgagctgaaagcagcagccacaaaagacggcaaa taccgcctcgc
ctatgatgtaaccatccgctacatcgaaccggaacctgcaaactgggaagtaaccgttgatgcggaaacaggaaaaa tcctgaaaaagca
aaacaaagtggagcat
(SEQ ID NO：1).
在上述序列中，粗体表示编码成熟NprE蛋白酶的DNA，标准字体表示前导序列(nprE前导序列)，下划线表示前序列(nprE前序列)。下文提供的氨基酸序列(NprE前导序列、nprE前序列和nprE成熟DNA序列)对应于全长NprE前体蛋白质。在该NprE序列中，下划线表示前序列，粗体表示成熟NprE蛋白酶：
MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAI
KQYLKQNGKVFKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSN
NVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQALDHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELK
AAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANWEVTVDAETGKILKKQNKVEH
(SEQ ID NO：2).
成熟NprE序列被用作为制造变体文库的基础：
(SEQ ID NO：3).
通过使用两条特异性引物，从解淀粉芽孢杆菌的染色体DNA扩增nprE基因，来构建pUBnprE表达载体：
Oligo AB 1740：CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCG(SEQ IDNO：4)；和
Oligo AB 1741：GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC(SEQ IDNO：5)
用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes)在热循环仪上进行PCR。PCR混合物含有10μl 5x缓冲液(Finnzymes Phusion)、1μl 10mM dNTP’s、1.5μl DMSO、1μl各引物、1μlFinnzymes Phusion DNA聚合酶、1μl染色体DNA溶液50ng/μl、34.5μl MilliQ水。使用下述PCR方案：1)98℃，30秒；2)98℃，10秒；3)55℃，20秒；4)72℃，1分钟；5)步骤2至4进行25个循环；以及5)72℃，5分钟。
这产生了1.9kb的DNA片段，用BglII和BclI DNA限制性酶对其加以消化。用BamHI对多拷贝芽孢杆菌属载体pUB110(见例如，Gryczan，J Bacteriol，134：318-329[1978])加以消化。然后将PCR片段x BglII x BclI连接进pUB110x BamHI载体，形成pUBnprE表达载体。
将pUBnprE转化进枯草芽孢杆菌(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK))菌株。按照WO 02/14490(通过引用并入本文)所述来进行向枯草芽孢杆菌中的转化。在含有25mL MBD培养基(基于MOPS的确定培养基，含有20mg/L新霉素)的摇瓶中进行具有pUBnprE载体的枯草芽孢杆菌转化子的选择性生长。基本上按照本领域已知(见Neidhardt等人，J Bacteriol，119：736-747[1974])来制造MBD培养基，不同之处在于：基础培养基中去掉NH4Cl2、FeSO4和CaCl2，使用3mM K2HPO4，并且向基础培养基补充60mM尿素、75g/L葡萄糖和1％大豆蛋白胨(soytone)。此外，制备作为100X贮液的微量营养物，其1L中含有：400mg FeSO4.7H2O、100mg MnSO4.H2O、100mgZnSO4.7H2O、50mg CuCl2.2H2O、100mg CoCl2.6H2O、100mgNaMoO4.2H2O、100mg Na2B4O7.10H2O、10ml 1M CaCl2和10ml of0.5M柠檬酸钠。37℃在温育箱/摇床(Infors)中对培养物温育3天。该培养物导致具有蛋白水解活性(通过蛋白酶测定展示的)的分泌的NprE蛋白酶的产生。使用NuPage Novex 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录No.NP0301BOX)进行凝胶分析。为制备用于分析的样品，将2份体积的上清液与1份体积的1M HCl、1份体积的4xLDS样品缓冲液(Invitrogen，目录No.NP0007)和1％PMSF(20mg/ml)混合，随后在70℃加热10分钟。然后，将每种样品25μL与10μL经SeeBlue plus 2预染色的蛋白质标准(Invitrogen，目录No.LC5925)一起上样到凝胶上。结果清楚显示，本实施例中描述的nprE克隆策略适合在枯草芽孢杆菌中生产活性NprE。
ASP蛋白酶生产
提供了用于将质粒pHPLT-ASP-C1-2转化进枯草芽孢杆菌的方法。为优化枯草芽孢杆菌中的ASP表达，通过DNA2.0生产合成的DNA序列，用于这些表达实验。下文提供的DNA序列(合成的ASP DNA序列)具有适应枯草杆菌属物种的密码子选择，其编码野生型ASP前体蛋白质：
atgacaccacgaactgtcacaagagctctggctgtggcaacagcagctgctacactcttggctgggggtatggcagcacaagctaacgaa
ccggctcctccaggatctgcatcagcccctccacgattagctgaaaaacttgaccctgacttacttgaagcaatgga acgcgatctggggtt
agatgcagaggaagcagctgcaacgttagcttttcagcatgacgcagctgaaacgggagaggctcttgctgaggaac tcgacgaagattt
cgcgggcacgtgggttgaagatgatgtgctgtatgttgcaaccactgatgaagatgctgttgaagaagtcgaaggcg aaggagcaactgc
tgtgactgttgagcattctcttgctgatttagaggcgtggaagacggttttggatgctgcgctggagggtcatgatg atggtgcctacgtggtac
gtcgacgtgcctacgaattcggtagtcgttgctgtaaaggcaggagcgcaggatgtagctgcaggacttgtggaagg cgctgatgtgccat
cagatgcggtcacttttgtagaaacggacgaaacgcctagaacgatg
gctccagcacctacatcatgtacaggctacgcaagaacgttcacaggaaccctcgcagcaggaagagcagcagctca acc
gaacggtagctatgttcaggtcaaccggagcggtacacattccgtctgtctcaatggacctagcggtgcggactttg atttgtatgtgcagcg
atggaatggcagtagctgggtaaccgtcgctcaatcgacatcgccgggaagcaatgaaaccattacgtaccgcggaa atgctggatattat
cgctacgtggttaacgctgcgtcaggatcaggagcttacacaatgggactcaccctcccctga(SEQID NO：6).
在上述序列中，粗体表示编码成熟ASP蛋白酶的DNA，标准字体表示前导序列(ASP前导序列)，下划线表示N-末端和C-末端前序列。下文提供的氨基酸序列对应于全长ASP前体蛋白质，其中下划线表示前序列，粗体表示成熟ASP蛋白酶：
MTPRTVTRALAVATAAATLLAGGMAAQANEPAPPGSASAPPRLAEKLDPDLLEAMER
DLGLDAEEAAATLAFQHDAAETGEALAEELDEDFAGTWVEDDVLYVATTDEDAVEEV
EGEGATAVTVEHSLADLEAWKTVLDAALEGHDDVPTWYVDVPTNSVVVAVKAGAQD
VAAGLVEGADVPSDAVTFVETDETPRTM
APAPTSCT
GYARTFTGTLAAGRAAAQPNGSYVQVNRSGTHSVCLNGPSGADFDLYVQRWNGSSW
VTVAQSTSPGSNETITYRGNAGYYRYVVNAASGSGAYTMGLTLP(SEQ ID NO：7).
用成熟ASP序列作为制造本文所述的变体文库的基础：
(SEQ ID NO：8).
在pXX-KpnI载体中构建Asp表达盒，随后将其克隆进pHPLT载体，用于在枯草芽孢杆菌中表达ASP。pXX-KpnI是基于pUC的载体，其具有aprE启动子(枯草芽孢杆菌)以驱动表达、cat基因和双份重复的aprE启动子用于在枯草芽孢杆菌中扩增拷贝数。bla基因允许在大肠杆菌中选择性生长。引入aprE启动子区域下游的核糖体结合位点的KpnI和HindIII位点一起使得能够在pXX-KpnI中克隆Asp表达盒。pHPLT-EBS2c2是pHPLT的衍生物(Solingen等人，Extremophiles 5：333-341[2001])，其含有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的热稳定的淀粉酶LAT启动子(PLAT)，之后是XbaI和HpaI限制性位点，用于克隆ASP表达构建体。在含有编码杂合信号肽(SEQ ID NO：9)的DNA的pXX-KpnI载体中克隆Asp表达盒，所述信号肽由与25个Asp C-末端信号肽氨基酸融合的5个枯草杆菌蛋白酶AprEN-末端信号肽氨基酸构成：
MRSKKRTVTRALAVATAAATLLAGGMAAQA(SEQ ID NO：9).。
杂合ASP信号肽由下述DNA序列编码：
ATGAGAAGCAAGAAGCGAACTGTCACAAGAGCTCTGGCTGTGGCAACAGCAGCTG
CTACACTCTTGGCTGGGGGTATGGCAGCACAAGCT(SEQ ID NO：10).
将克隆进pXX-KpnI载体的Asp表达盒转化进大肠杆菌(ElectromaxDH10B，Invitrogen，目录No.12033-015)。使用的引物和克隆策略如下文所提供。随后，从这些载体克隆表达盒，并引入pHPLT表达载体，用于转化进枯草芽孢杆菌(ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR，pxylA-comK))菌株。用于pHPLT中ASP表达盒克隆的引物和克隆策略也见下文所提供。
引物获得自MWG和Invitrogen。按照Invitrogen的方案，用InvitrogenPlatinumTaq DNA高保真聚合酶(目录No.11304-029)来进行PCR扩增(0.2μM引物，25至30个循环)。利用针对一般粘末端克隆推荐的方案，用Invitrogen T4DNA连接酶(目录No.15224-025)来完成ASP表达盒和宿主载体的连接酶反应。
在枯草芽孢杆菌菌株(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK))中研究asp基因的表达。将质粒pHPLT-ASP-C1-2转化进枯草芽孢杆菌(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK))。按照本领域已知的那样进行转化(见，例如WO 02/14490，其通过引用并入本文)
在含有25ml合成Maxatase培养基(SMM)的摇瓶中进行携带有pHPLT-ASP-C1-2载体的枯草芽孢杆菌(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK))转化子的选择性生长，所述培养基具有0.97g/lCaCl2.6H2O代替0.5g/lCaCl2(见美国专利No.5,324,653，其通过引用并入本文)以及20mg/L新霉素。这种生长导致产生分泌的具有蛋白水解活性的ASP。使用NuPage Novex 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录No.NP0301BOX)进行凝胶分析。为制备用于分析的样品，将2份体积的上清液与1份体积的1MHCl、1份体积的4xLDS样品缓冲液(Invitrogen，目录No.NP0007)和1％PMSF(20mg/ml)混合，随后在70℃加热10分钟。然后，将每种样品25μL与10μL经SeeBlue plus 2预染色的蛋白质标准(Invitrogen，目录No.LC5925)一起上样到凝胶上。结果清楚显示，本实施例中描述的asp克隆策略适合在枯草芽孢杆菌中生产活性Asp。
GG36蛋白酶生产
在本实施例中，提供了进行来在枯草芽孢杆菌中生产GG36(本文中也称为迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)的实验。使用经GG36密码子改进的基因来装配表达质粒pAC-GG36ci，该基因在aprE信号序列的第八个密码子处融合，处于共有的aprE启动子和BPN’转录终止子的控制下。在下文提供的序列中，粗体且斜体表示共有的aprE启动子，标准字体表示信号序列，下划线字体表示前序列，粗体表示编码GG36成熟蛋白酶的DNA，带下划线的斜体表示BPN’终止子。GG36成熟蛋白酶的编码区域侧翼是用于克隆目的的KpnI和XhoI限制性位点：
gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatcgcat
ccgctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaa gttgaggcaaatgac
gaggtagccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttctgtc cgttgagttaagcccag
aagatgtggacgcgttagagctcgatccagctatttcttatattgaagaggatgcagaagtaactacaatg
(SEQ ID NO：15).
下文提供了GG36前体蛋白质的氨基酸序列。在该序列中，粗体表示成熟的GG36蛋白酶。
MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAI
LSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTM
(SEQ ID NO：16).
成熟的GG36蛋白酶的氨基酸序列用作为制造本文所述的变体文库的基础：
(SEQ ID
NO：17).
质粒pAC-GG36ci的元件包括：pUB110＝来自质粒pUB110(McKenzie等人，Plasmid15：93-103[1986])的DNA片段，pBR322＝来自质粒pBR322(Bolivar等人，Gene2：95-113[1977])的DNA片段，pC194＝来自质粒pC194(Horinouchi等人，J Bacteriol，150：815-825[1982])的DNA片段。质粒特征如下：用于枯草芽孢杆菌的Ori＝来自pUB110的复制起点，CAT＝来自pC194的氯霉素抗性基因，pMB1起点＝来自pBR322的复制起点，bla＝来自pBR322的β-内酰胺酶，短(Short)aprE启动子＝共有转录启动子，信号肽＝信号肽，前(Pro)肽＝GG36前区域，GG36ci成熟肽＝成熟的GG36(被该研究中表达的每种变体的编码区域替换)，BPN’终止子＝来自枯草杆菌蛋白酶BPN’的转录终止子。
FNA蛋白酶生产
在本实施例中，描述了进行来在枯草芽孢杆菌中生产FNA(本文中也称为解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L)的实验。使用FNA基因来装配表达质粒pAC-FNAre，该基因在aprE信号序列的第八个密码子处融合，处于共有的aprE启动子和BPN’转录终止子的控制下。在下文提供的序列中，粗体且斜体表示共有的aprE启动子，标准字体表示信号序列，下划线字体表示前序列，粗体表示编码FNA成熟蛋白酶的DNA，带下划线的斜体表示BPN’终止子。FNA成熟蛋白酶的编码区域包含用于克隆目的的KpnI和XhoI限制性位点：
gtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatct
ttacgatggcgttcggcagcacatccagcgcgcaggctgcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcggg tttaaacagacaa
tgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagacgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatat gtagacgcagcta
gcgctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgta gcacacgcgtacg
(SEQ ID NO：18).
下文提供了FNA前体蛋白质的氨基酸序列。在该序列中，粗体表示成熟的FNA蛋白酶：
MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKD
VISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAY
(SEQ ID
NO：19).
成熟的FNA蛋白酶的氨基酸序列用作为制造本文所述的变体文库的基础：
(SEQ
ID NO：20).
质粒pAC-FNAre的元件包括：pUB110＝来自质粒pUB110(McKenzie等人，Plasmid15：93-103[1986])的DNA片段，pBR322＝来自质粒pBR322(Bolivar等人，Gene 2：95-113[1977])的DNA片段，pC194＝来自质粒pC194(Horinouchi等人，J Bacteriol，150：815-825[1982])的DNA片段。质粒特征如下：用于枯草芽孢杆菌的Ori＝来自pUB110的复制起点，CAT＝来自pC194的氯霉素抗性基因，pMB1起点＝来自pBR322的复制起点，bla＝来自pBR322的β-内酰胺酶，短aprE启动子＝共有转录启动子，信号肽＝信号肽，Pro肽＝FNA前区域，FNA成熟肽＝成熟的FNA(被该研究中表达的每种变体的编码区域替换)，BPN’终止子＝来自枯草杆菌蛋白酶BPN’的转录终止子。
实施例3
枯草芽孢杆菌中的淀粉酶生产
在本实施例中，描述了进行来生产嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文中也被称为AmyS)、AmyS的突变截短形式(具有29个氨基酸缺失的S242Q，本文中也被称为S242Q)和来自芽孢杆菌属物种TS-23的α-淀粉酶的截短形式(本文中也被称为AmyTS-23t)及其在枯草芽孢杆菌中的变体的实验。按照本领域的已知进行实验(参见例如WO02/14490)。简言之，将编码亲本淀粉酶的基因克隆进pHPLT表达载体，该载体含有LAT启动子(PLAT)、编码LAT信号肽的序列(preLAT)，接着是用于克隆的PstI和HpaI限制性位点。
LAT信号肽的编码区域如下所示：
atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagca(SEQID NO：21).
LAT信号肽的氨基酸序列如下所示：
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA(SEQ ID NO：22)。
成熟AmyS淀粉酶的编码区域如下所示：
gccgcaccgtttaacggtaccatgatgcagtattttgaatggtacttgccggatgatggcacgttatggaccaaagtggccaatgaagccaa
caacttatccagccttggcatcaccgctctttggctgccgcccgcttacaaaggaacaagccgcagcgacgtagggtacggagtatacga
cttgtatgacctcggcgaattcaatcaaaaagggaccgtccgcacaaaatatggaacaaaagctcaatatcttcaagccattcaagccgccc
acgccgctggaatgcaagtgtacgccgatgtcgtgttcgaccataaaggcggcgctgacggcacggaatgggtggacgccgtcgaagtc
aatccgtccgaccgcaaccaagaaatctcgggcacctatcaaatccaagcatggacgaaatttgattttcccgggcggggcaacacctact
ccagctttaagtggcgctggtaccattttgacggcgttgactgggacgaaagccgaaaattaagccgcatttacaaattccgcggcatcggc
aaagcgtgggattgggaagtagacacggaaaacggaaactatgactacttaatgtatgccgaccttgatatggatcatcccgaagtcgtga
ccgagctgaaaaactgggggaaatggtatgtcaacacaacgaacattgatgggttccggcttgatgccgtcaagcatattaagttcagtttttt
tcctgattggttgtcgtatgtgcgttctcagactggcaagccgctatttaccgtcggggaatattggagctatgacatcaacaagttgcacaatt
acattacgaaaacaaacggaacgatgtctttgtttgatgccccgttacacaacaaattttataccgcttccaaatcagggggcgcatttgatat
gcgcacgttaatgaccaatactctcatgaaagatcaaccgacattggccgtcaccttcgttgataatcatgacaccgaacccggccaagcg
ctgcagtcatgggtcgacccatggttcaaaccgttggcttacgcctttattctaactcggcaggaaggatacccgtgcgtcttttatggtgact
attatggcattccacaatataacattccttcgctgaaaagcaaaatcgatccgctcctcatcgcgcgcagggattatgcttacggaacgcaac
atgattatcttgatcactccgacatcatcgggtggacaagggaaggggtcactgaaaaaccaggatccgggctggccgcactgatcaccg
atgggccgggaggaagcaaatggatgtacgttggcaaacaacacgctggaaaagtgttctatgaccttaccggcaaccggagtgacacc
gtcaccatcaacagtgatggatggggggaattcaaagtcaatggcggttcggtttcggtttgggttcctagaaaaacgaccgtttctaccatc
gctcggccgatcacaacccgaccgtggactggtgaattcgtccgttggaccgaaccacggttggtggcatggcct(SEQ IDNO：23)
成熟的AmyS淀粉酶的氨基酸序列用作为制造本文所述的变体文库的基础：
AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGTSRSD
VGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHK
GGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHF
DGVDWDESRKLSRIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTE
LKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSY
DINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLA
VTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPS
LKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGS
KWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVS
TIARPITTRPWTGEFVRWTEPRLVAWP(SEQ ID NO：24).
具有经取代氨基酸(以斜体显示)的成熟的截短S242Q淀粉酶的氨基酸序列用作为制造本文所述的变体文库的基础：
AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGTSRSD
VGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHK
GGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHF
DGVDWDESRKLSRIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTE
LKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSY
DINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLA
VTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPS
LKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGS
KWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTT(SEQ ID NO：25).
成熟AmyTS-23t淀粉酶的编码区域如下所示：
aatacggcgccgatcaacgaaacgatgatgcagtattttgaatgggatctgccgaatgatggaacgctgtggacgaaagtcaaaaacgaa
gcggcgaatcttagcagcctgggaatcacagcactttggcttccgccggcatataaaggaacgagccaaagcgatgtcggctatggcgtc
tatgatctgtatgacctgggcgaatttaaccaaaaaggcacgatccggacgaaatatggcacgaaaacacagtatatccaagcgatccagg
cagcaaaagcagcaggcatgcaagtctatgccgacgtcgtctttaatcataaagcgggagcggatggcacagaatttgtcgatgccgtcg
aagttgatccgagcaacagaaaccaagaaacgagcggcacgtatcaaatccaagcgtggacgaaatttgattttccgggcagaggcaata
cgtatagcagctttaaatggcgctggtatcattttgacggcacggattgggatgaaagcagaaaactgaaccggatctataaatttcggagc
acgggcaaagcatgggattgggaagtcgatacggaaaacggcaactatgactatctgatgtttgccgatctggatatggatcatccggaag
tcgtcacggaactgaaaaattggggcacgtggtatgttaatacgacgaacatcgatggctttagactggatgccgtcaaacatatcaaatata
gcttttttccggactggctgacgtatgtcagaaaccagacgggcaaaaacctttttgccgtcggcgaattttggagctatgacgtcaacaaac
ttcataactatatcacgaaaacgaacggcagcatgagcctttttgatgccccgcttcataacaacttttatacggcgagcaaaagctcaggct
attttgatatgagatatctgctgaacaacacgctgatgaaagatcaaccgagcctggcagtcacactggtcgataaccatgatacacaaccg
ggccaaagccttcaaagctgggtcgaaccgtggtttaaaccgctggcgtatgcctttatcctgacgagacaagaagggtatccttgcgtcttt
tatggcgactattatggcatcccgaaatataatatcccgggcctgaaaagcaaaatcgatccgctgctgatcgccagacgggattatgcctat
ggcacacagcgggattatatcgaccatcaggacatcatcggctggacaagagaaggcatcgatacgaaaccgaatagcggactggcag
cactgattacagatggaccgggcggaagcaaatggatgtatgtcggcaaaaaacatgccggcaaagtcttttatgatctgacgggcaaca
gaagcgatacggtcacgatcaatgctgatggctggggagaatttaaagtcaatggcggcagcgtttcaatctgggtcgccaaa(SEQID NO：26).
成熟的AmyTS-23t淀粉酶的氨基酸序列用作为制造本文所述的变体文库的基础：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQSD
VGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHKA
GADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFD
GTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTEL
KNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYD
VNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAV
TLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPGL
KSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDHGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPGGSK
WMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGSVSIWVAK(SEQ IDNO：27).
AmyS基因作为来自质粒pICatH-Ethyl4(ori1)的PstI-HpaI片段被扩增，其中使用下述引物：
Ethyl 4F：5’CTTCTTGCTG CCTCATTCTG CAGCTTCAGC AGCCGCACCGTTTAACGGTACCATG 3’(SEQ ID NO：28)；和
Ethyl 4R：5’CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAGGTCGTTTTTCTAGGAAC 3’(SEQ ID NO：29).
使用来自Qiagen的Qiaquik柱来纯化PCR产物，并将其重新悬浮于50μL去离子水中。用HpaI(Roche)和PstI(Roche)消化50μL经纯化的DNA，将得到的DNA重新悬浮于30μL去离子水中。使用PstI和HpaI克隆位点，将10-20ng/μL DNA克隆进质粒pHPLT。将连接混合物直接转化进感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)。这些枯草芽孢杆菌细胞具有放置于木糖诱导型启动子下的感受态基因(comK)，因此用木糖来诱导针对DNA结合和并入的感受态。
质粒pHPLT-AmyS的元件包括：pUB110＝来自质粒pUB110(McKenzie等人，Plasmid15：93-103[1986])的DNA片段。质粒特征包括：ori-pUB110＝来自pUB110的复制起点，neo＝来自pUB110的新霉素抗性基因，Plat＝来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录启动子，Pre LAT＝来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的信号肽，AmyS＝截短的AmyS和淀粉酶变体的编码区域，终止子＝来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录终止子。
实施例4
酶变体的表达
本实施例描述了用于表达前述实施例中经转化的枯草芽孢杆菌的多种重组酶的方法。
中性金属蛋白酶-600ml的规模
通过传统分批发酵，在营养培养基中培养重组枯草芽孢杆菌。用1甘油瓶的枯草芽孢杆菌培养物(含有解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶或其变体)接种600ml含有200mg/L氯霉素的SBG 1％培养基。培养物在37℃下培养36-48小时，该时间后，按照本领域已知的那样，通过以12,000rpm离心回收培养物流体。该过程一式两份重复进行。使用Amicon过滤器系统8400(具有10kDa截留点(cutoff)的BES(聚醚砜))，将分泌的中性金属蛋白酶浓缩大约10倍。
将经浓缩的上清液在4℃对含有10mM NaCl的25mM MES缓冲液(pH 5.4)渗析过夜。然后按照下文所述将渗析物上样到阳离子交换柱Poros HS20上(总体积～83mL；结合容量～4.5g蛋白质/mL柱；水)。用含有10mM NaCl的25mM MES缓冲液(pH 5.4)对柱进行预平衡。然后，将大约200-300mL样品上样到柱上。使用5.4至6.2的pH梯度，以10倍柱体积的MES缓冲液来洗脱结合的蛋白质。蛋白质的洗脱在pH5.8至6.0之间，按照本文所述使用蛋白水解活性和10％(w/v)SDS-PAGE(Novex)对其加以评估。然后合并含有中性蛋白酶的级分。在调节pH至5.8之前，加入比例为3∶1的氯化钙和氯化锌盐。用PerceptiveBiosystemsVision(GMI)进行蛋白质纯化。使用10％(w/v)SDS-PAGE评估的经纯化蛋白质被测定为均质的，其具有高于95％的纯度。
丝氨酸蛋白酶-600ml的规模
通过传统分批发酵，在营养培养基中培养重组枯草芽孢杆菌。用1甘油瓶的枯草芽孢杆菌培养物(含有C.bogoriensis丝氨酸蛋白酶或其变体)接种600ml含有200mg/L氯霉素的SBG 1％培养基。培养物在37℃下培养36-48小时，该时间后，按照本领域已知的那样，通过在10℃以12,000rpm离心30分钟回收培养物流体(离心机型号RC5B)。该过程一式两份进行。通过在Seitz EKS(SeitzSchenk)上深度过滤来澄清得到的上清液。然后使用截留点(cut-off)为10kDa的超滤盒(Pall Omega10kDa Minisette；Pall)，通过超滤，对得到的灭菌培养物上清液再浓缩大约10倍。冷冻得到的经浓缩粗制丝氨酸蛋白酶样品，将其贮藏于-20℃直到进一步使用。
使用8K分子量截留点(MWCO)的Spectra-Por7(Spectrum)渗析管，将细胞分离的培养物对20mM(2-(4-吗啉代)-乙烷磺酸(MES)，pH 5.4，1mM CaCl2渗析。渗析进行过夜，或进行到样品的传导性低于或等于MES缓冲液的传导性。使用具有10x100mm(7.845mL)POROS高密度磺丙基(Sulfo-propyl)(HS)20(20微米)阳离子交换柱(PerSeptive Biosystems)的BioCad VISION(Applied Biosystems)来纯化经渗析的酶样品。将酶以5mL/分钟上样到之前平衡过的柱上后，用25倍柱体积中的25mMMES，pH 6.2，1mM CaCl2至25mM(N-[2-羟基乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷]磺酸[C8H18N2O4S，CAS#7365-45-9])(HEPES)pH 8.0，1mM CaCl2的pH梯度以40mL/分钟来洗柱。收集运行间的级分(8mL)。pH 8.0的洗涤步骤保持5倍柱体积，然后使用梯度(0-100mM NaCl，在同样的缓冲液中，以35倍柱体积进行)来洗脱酶。使用suc-AAPF-pNA测定监测级分中的蛋白酶活性。浓缩在40mM NaCl时洗脱的蛋白酶活性，将其缓冲交换进(使用5K MWCO VIVA Science 20mL浓缩器)20mM MES，pH 5.8，1mM CaCl2。该材料用于对酶的进一步表征。
丝氨酸蛋白酶-200μl的规模
用钢制96孔复制器(replicator)将含有ASP表达载体蛋白质的枯草芽孢杆菌克隆从甘油贮液复制进含有200μl TSP培养基+20μg/ml新霉素的96孔培养板(BD，353075)，在湿润的封闭环境中，220rpm和37℃下培养过夜。用15μl来自过夜培养物的等分试样接种MilliporeMultiScreen过滤板中的185μl确定成分培养基+20μg/ml新霉素。培养基富含基于MOPS缓冲液的半确定成分培养基，其中含有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆蛋白胨用于加强细胞生长。在37℃，220rpm下，湿润封闭环境中，对过滤板进行60小时温育。该温育之后，将培养液滤经过滤板并对其加以收集。不进行进一步的纯化或浓缩。将滤液贮液配制为40％丙二醇终浓度(用于长期稳定性)，并于4℃贮存于96孔清洁的非结合聚苯乙烯板(Corning，CLS3641)中。
枯草杆菌蛋白酶-2ml的规模
用钢制96孔复制器将含有FNA或GG36表达载体的枯草芽孢杆菌克隆从甘油贮液复制进含有200μl LB培养基+25μg/ml氯霉素的96孔培养板(BD，353075)，在湿润的封闭环境中，220rpm和37℃下培养过夜。用200μl来自过夜培养物的等分试样接种5ml塑料培养管中的2000μl确定成分培养基+25μg/ml氯霉素。培养基富含基于MOPS缓冲液的半确定成分培养基，其中含有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆蛋白质胨用于加强细胞生长。在37℃，220rpm下，对培养管进行60小时温育。该温育之后，以高于8000xRCF来离心培养液。将上清液溶液倾析进15ml聚丙烯锥形管中，用于贮存。不进行进一步的纯化或浓缩。将上清液贮液配制为40％丙二醇终浓度(用于长期稳定性)，并于4℃贮存。
淀粉酶表达-2ml的规模
用钢制96孔复制器将含有AmyS、S242Q或AmyTS23t表达载体的枯草芽孢杆菌克隆从甘油贮液复制进含有150μl LB培养基+10μg/ml新霉素的96孔培养板(BD，353075)，在湿润的封闭环境中，220rpm和37℃下培养过夜。用100μl来自过夜培养物的等分试样接种5ml塑料培养管中的2000μl确定成分培养基+10μg/ml新霉素。培养基富含基于MOPS缓冲液的半确定成分培养基，其中含有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆蛋白胨和5mM钙用于加强细胞生长。在37℃，250rpm下，对培养管进行72小时温育。该温育之后，以3000x g来离心培养液10分钟。将上清液溶液倾析进15ml聚丙烯锥形管中，每种样品取80μL分装进96孔板，用于蛋白质定量。
实施例5
生产酶变体
该实施例描述了对酶电荷梯级和组合电荷文库的生产
酶电荷梯级
跨越感兴趣的物理性质范围的多种蛋白质变体选自现有的文库，或者通过本领域已知的定点诱变技术来产生它们(见，例如美国专利申请序列号Nos.，10/576,331、11/581,102和11/583,334)。然后在感兴趣的测试中测定该给定的探针蛋白质的组。
下述表中展示了示例性的蛋白酶电荷梯级变体，按照本文所述对它们进行测定。在这些表中，电荷变化是相对野生型酶而言的。
下述表中展示了示例性的淀粉酶电荷梯级变体，按照本文所述对它们进行测定。在这些表中，电荷变化是相对野生型酶而言的。
向Gene Oracle(Mountain View，CA)提供AmyS基因的序列，用于合成表5所示的28种电荷梯级变体。Gene Oracle合成AmyS变体，并将其克隆进载体pGov4，并将其转化进大肠杆菌。针对每种变体提供从微量制备物分离的DNA以及琼脂穿刺物(stab)。
PCR扩增变体，并将其克隆进pHPLT枯草芽孢杆菌表达载体。变体作为PstI-HindIII片段从质粒pGov4克隆，其中使用下述引物：
AmyS引物F
5′-CTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC-3′(SEQ ID NO：30)；和
AmyS引物R
5′-TTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGC-3′(SEQ ID NO：31)。
使用来自Qiagen的Qiaquik柱来纯化PCR产物，并将其重新悬浮于50μL milliQ水中。用HindIII(Roche)和PstI(Roche)消化50μL经纯化的DNA，将得到的DNA重新悬浮于30μL去离子水中。使用PstI和HpaI克隆位点，将10-20ng/μL DNA克隆进质粒pHPLT。将连接混合物直接转化进感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。这些枯草芽孢杆菌细胞具有放置于木糖诱导型启动子下的感受态基因(comK)，因此用木糖来诱导DNA结合和并入的感受态。
酶组合电荷文库
产生迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(＝GG36)组合电荷文库
将含有经密码子改进的GG36基因的pAC-GG36ci质粒交给DNA 2.0Inc.(MenloPark，CA)，用于产生组合电荷文库(CCL)。还向他们提供了枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)用于转化。此外，我们要求DNA2.0Inc.在表5-7所示的GG36蛋白酶中四个位点中的每一个产生位置文库。变体作为96孔板中的甘油贮液提供。
通过鉴定活性位点之外的四个良好分布的、表面暴露的、不带电荷的极性氨基酸残基，来设计GG36CCL。这些残基是Ser-85、Gln-107、Ser-182和Asn-242(在BPN’编号中是残基87、109、188和248)。通过制造每个位点三种可能性(野生型、精氨酸或天冬氨酸)的全部组合，产生了81个成员的组合文库(G-1至G-81)。
产生解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L(＝FNA)CCL
将含有FNA6基因的pAC-FNAre质粒交给DNA 2.0Inc.(Menlo Park，CA)，用于产生CCL。还向他们提供了枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)用于转化。此外，我们要求DNA2.0Inc.在表5-8所示的四个FNA蛋白酶位点中的每一个产生位置文库。变体作为96孔板中的甘油贮液提供。
通过鉴定活性位点之外的四个良好分布的、表面暴露的、不带电荷的极性氨基酸残基，来设计枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L组合电荷文库。这些残基是Ser-87、Asn-109、Ser-188和Ser-248。通过制造每个位点三种可能性(野生型、精氨酸或天冬氨酸)的全部组合，产生了81个成员的组合文库(F-1至F-81)。
产生嗜热脂肪芽孢杆菌AmyS-S242Q CCL
从经转化的枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)分离AmyS-S242Q质粒DNA，将其交给DNA2.0 Inc.，用作为CCL构建的模板。我们要求DNA2.0Inc.(Mountain View，CA)在表5-9所示的AmyS-S242Q(S242Q)淀粉酶的四个位点中的每一个产生位置文库。变体作为96孔板中的甘油贮液提供。
通过鉴定下述四个残基：Gln-97、Gln 319、Gln 358和Gln 443，来设计AmyS S242Q组合电荷文库。通过制备每个位点三种可能性(野生型、精氨酸或天冬氨酸)的全部组合，产生了四个位点的81个成员的CCL。
产生芽孢杆菌属物种AmyTS23t CCL
AmyTS23t是芽孢杆菌属物种TS-23的α-淀粉酶的截短版本。已经描述了AmyTS23t在多种蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌株(degUHy32，oppA，ΔspoII3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)中的表达(见，例如，US2005/0202535A1)。将从经转化的枯草芽孢杆菌细胞分离的AmyTS23t质粒DNA交给DNA 2.0Inc.(Menlo Park，CA)，用作为CCL构建的模板。此外，我们要求DNA2.0通过向AmyTS23t中引入下述7种突变来制备CCL的亲本构建体，其随后被称为AmyTS23t-7mut(本文中也被称为TS23t’)：Q98R、M201L、S243Q、R309A、Q320R、Q359E和K444E。变体作为在96孔板中的甘油贮液提供。随后，我们要求DNA2.0 Inc.在表5-10所示的AmyTS23t-7mut淀粉酶的四个位点中的每一个产生位置文库。
通过鉴定AmyTS23t-7mut中的下述四个残基：Gln 87、Asn 225、Asn272和Asn 282，来设计AmyTS23t组合电荷文库。通过制备每个位点三种可能性(野生型、精氨酸或天冬氨酸)的全部组合，产生了四个位点的81个成员的CCL。
实施例6
酶性能
本实施例描述了在BMI(血、奶、墨)微布样测定中在AATCC HDL洗涤剂或5mM HEPES缓冲液中在各种离子强度下以1.0μg/ml测试ASP变体。还描述了就衣物和自动餐具洗涤两种应用，在BMI微布样和烤蛋测定中在代表各种地理市场的洗涤剂(例如，不同pH、T和/或水硬度)中测试FNA和GG36变体。本实施例进一步描述了在清洁应用中以及在淀粉液化中测试α-淀粉酶变体。使用实施例1中提供的方法(参见，“酶性能测定”和“玉米粉水解”)。
如图1中所示，对于ASP在AATCC HDL洗涤剂中的清洁性能，存在最佳的净电荷改变。性能就在BMI微布样活性测定中观察到的相对清洁性能进行量度。在此测定中，约1.0的值指示最高清洁性能。如由该图显而易见的，相对于野生型的极端负(-5)或正(+3)电荷积聚将导致弱清洁性质。存在相对于野生型ASP以-2为中心的独特清洁性质电荷最优值。这是优化蛋白质物理性质(例如，净电荷)以改善给定结果或益处(例如，在液体衣物洗涤剂中的清洁性质)的一个例子。用该组有限的探针蛋白质鉴定到的电荷最优值与测量整个ASP电荷组合文库时观察到的电荷最优值相吻合，见图2所示。因此，探针蛋白质的使用可以预示整个文库的行为。
根据Debye-Hückel理论(Israelachivili，Intermolecular and SurfaceForces，第2版：With Applications to Colloidal and Biological Systems，Academic Press第2版.[1992])，静电相互作用主要由在恒定电位或恒定电荷的相互作用物(酶、底物、织物和洗涤剂)之间的双层力的强度、它们的大小和周围介质的介电常数控制。为了表征微粒在复杂介质例如洗涤剂制剂中的静电行为，利用它们在具有相同Debye屏蔽长度的简化环境中的相互作用将是足够的。这通过选择与洗涤条件下的洗涤剂具有匹配的pH和传导性的缓冲液来完成。如图1中所示，在此缓冲液中对ASP电荷梯的筛选正确地预测了用AATCC洗涤剂(实心圆圈)观察到的在-2电荷最优值。图3描述了，随着相对于野生型ASP的电荷改变，在具有各种量的支持电解质(在该情况下NaCl)的5mM HEPES缓冲液pH 8.0中，相对的BMI污渍去除。2.5mM NaCl在该缓冲液中的添加可以导致匹配典型北美洗涤条件的pH和传导性。更高浓度NaCl的添加代表一般离子强度更高(由增加的水硬度和洗涤剂浓度引起)的日本和欧洲洗涤条件。因此，ASP电荷最优值是溶液环境(例如，洗涤剂制剂)的函数。
存在立即变得明显的2个特征。首先，在具有匹配的pH和传导性的简化缓冲液环境中使用由针对给定物理性质的有限数目的探针蛋白质(例如，电荷梯ASP变体)组成的模式系统，可以预示在洗涤剂条件下筛选的大型ASP文库的行为。事实上，图1中所示的在包含2.5mM NaCl的缓冲液(空心圆圈)中测量到的电荷最优值，与在北美洗涤条件下在AATCC洗涤剂中筛选该ASP电荷梯时所观察到的最优值是一致的。其次，电荷最优值的定位是强的离子强度函数。随着NaCl的进一步添加，电荷最优值朝向相对于野生型ASP具有正电荷的变体移动。简言之，电荷梯蛋白质探针的使用允许快速预测不同酶变体在代表各种地理市场的制剂中的性能。
上述观察对于其他丝氨酸蛋白酶例如枯草杆菌蛋白酶FNA和GG36适用。例如，图4A和4B分别显示，就使用TIDE 2X洗涤剂在北美洗衣条件下的清洁性能而言，FNA和GG36的电荷最优值。左侧Y轴显示微布样清洁性能，其中更高的数指示优良的BMI污渍去除。右侧Y轴显示定义为变体(实心符号)相对于亲本分子(空心符号)的清洁性能的性能指数。水平线指示在测定的噪声上2或3个标准差的性能指数。FNA电荷组合文库(CCL)显示电荷最优值在相对于亲本FNA的零电荷改变处，而GG36CCL显示电荷最优值在相对于GG36亲本的负2电荷处。
图5A、5B、6A、6B、7A和7B证实电荷最优值的位置是洗涤剂制剂、pH、温度和由于水硬度以及洗涤剂浓度的离子强度决定的溶液环境的函数。例如，FNA CCL的电荷最优值从在北美洗衣条件下的零急剧迁移至在西欧和日本条件下的更正电荷。此外，对于液体和颗粒(粉末)衣服洗涤剂制剂，观察到电荷最优值。相似地，在自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂(例如，Reckitt Benckiser Calgonit 40℃，12gpg，pH 10)中针对烤蛋作为酶底物，观察到了FNA和GG36CCL的电荷最优值。
如在本发明的开发过程中证实的，蛋白酶电荷变体(例如，ASP、GG36、FNA等)在不同洗涤剂中的清洁性能在很大程度上由工作溶液pH和传导性决定。最终的传导性是离子强度的量度，并且由水硬度、洗涤剂浓度和组成导致。例如，当在pH 10.6和3.0mS/cm的传导性下进行时，在欧洲和北美ADW洗涤剂下GG36和FNA变体针对烤蛋污渍的清洁性能之间存在相关性。具体地，如果pH和传导性相同，则电荷变体的清洁性能是良好相关的。这个发现使得能够使用给定洗涤剂筛选酶性能，从这些结果外推至匹配pH和传导性的另一种洗涤剂。同样地，可以在匹配pH和传导性的缓冲液中筛选酶性能，从这些结果外推至显示相似的工作pH和传导性的洗涤剂。
类似地，对于淀粉酶电荷变体(例如，AmyS-S242Q和AmyTS23t等)在清洁应用中的清洁性能，存在电荷最优值，其是工作溶液的pH和传导性的强函数。具体地，如在本发明的开发过程中确定的，对于在北美洗衣条件(例如，TIDE 2X)下清洁稻淀粉微布样，S242Q的正电荷改变变体较好(如图8所示)，而对于在西欧洗衣条件下清洁稻淀粉微布样，AmyTS23t的负电荷改变变体更佳(如图9所示)。此外，这些观察对于在淀粉水解反应中使用的淀粉酶适用。如图10中所示，正S242Q变体对BODIPY淀粉底物的水解显示更高的比活性。
通过监控在玉米淀粉液化后的最终粘度，测定了通过AmyS电荷梯变体的淀粉液化。低粘度值指示淀粉多糖的降解。如在图11中所示，对于液化，观察到电荷最优值(例如，-4至-2)。太负(例如，-12至-10)的AmyS变体显示极高的最终粘度，并且太正(例如，+6或更大)的变体显示甚至更高的最终粘度(例如，由于转矩超负荷而超过实验设备的限度)
实施例7
ζ-电势测定
本实施例描述了对酶和底物的ζ-电势的测定。颗粒表面电荷的存在影响到离子在周围界面区域的分布。结果是与颗粒表面附近的颗粒电荷相反的反离子的浓度增加。随着从颗粒表面的移除，离子的不均匀分布最终变均匀。获得均匀分布时的距离被称为Debye长度(1/κ)或筛选距离，其取决于下面的表达式显示的离子强度，其中ε0是自由空间的介电常数(8.854x 10-12F m-1)，εr是液体的介电常数，k是Boltzmann常数(1.38x10-23JK-1)，T是开氏温度，e是电子电荷(1.6022x10-19C)，I是摩尔离子强度，NA是Avogadro’s常数(6.022x1023mol-1)。
可从下述公式计算摩尔离子强度，其中Ci是离子种类浓度，Zi是价。
对于298K的水而言，Debye长度表达式还原为下述形式。
k-1＝0.304(I-0.5)(0.3)
颗粒周围的液体层作为两个部分存在；内部区(Stern层)(其中离子强烈结合)和外(扩散)区域(其中它们将不稳固地结合)。在扩散层中存在边界，离子和颗粒在其中形成稳定体。当颗粒移动，边界中的离子就随之移动。边界那边(beyond the boundary)的那些离子并不随颗粒运动。在该边界(也被称为流体动力剪切表面)处的电势被定义为ζ-电势。
在电泳光散射中，使用下文所示Henry公式，从测量的电泳迁移率u来计算ζ-电势Z，其中，ε是电容率，h是溶液粘度，κ是Debye长度倒数，a是颗粒半径，f(ka)是Henry函数。
κ的单位是倒数长度，1/κ是电双层的“厚度”(Debye长度)。参数a表示颗粒的半径，因此，κa是颗粒半径与电双层厚度之比。Henry函数f(ka)取决于颗粒形状，但是其已知是球形。在上述表达式中，其在f(0)＝1(Hückel限制)和f(￥)＝1.5(Smoluchowski限制)范围间。低介电媒介(或低离子强度媒介)中，对于小颗粒(例如，蛋白质)而言，f(ka)＝1的Hückel限制是更合适的模型。
按照上文给出的原则，用Zetasizer NS(Malvern Instruments，UK)来测量蛋白质的ζ-电势。使用上述原则的流动电势工具，用SurPass(Anton-Paar，Austria)来测量被BMI弄脏的织物的ζ-电势。表面电荷的定义，通常以库仑表示：
qs＝4peoera(1+ka)z(0.5)
这还可表示为净电荷z乘以基本电荷e 1.6＊10-19C：
qs＝ze(0.6)
因此，下文给出了由于净电荷增加导致的预期ζ-电势变化：
还可使用实施例1所述的天然凝胶技术(Sparks等人，Journal ofLipidResearch，33：123-130[1992])来测量ζ-电势。用天然凝胶测量的电泳迁移率通常小于溶液中的，因为凝胶基质导致阻滞。这种方法计算的ζ-电势通常要比基于溶液的方法计算出的更低。我们因此将通过天然凝胶技术获得的ζ-电势称为表观ζ-电势。
在给定制剂中的有效电荷被表示为其ζ-电势。将ζ-电势用作为共同电荷标度允许在感兴趣的条件下(例如，AATCC HDL洗涤剂)对具有不同折叠的酶变体(例如，丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等)以及与不同底物(例如BMI微布样)的相互作用加以比较。虽然对于比较不同蛋白质折叠来说ζ-电势是优选的，但是电泳迁移率或测量的电荷也提供了绝对标度，并且足以进行比较。图12显示了BMI性能(左Y轴)，其作为针对丝氨酸蛋白酶ASP(黑色圆圈)的ζ-电势(底部X轴)的函数表示。ASP电荷梯级变体跨越相对于野生型ASP而言8个电荷的范围。如实施例5所示，对清洁性能存在净电荷最优值。图12显示，作为酶ζ-电势的函数的BMI性能由标准正态分布良好描述，其由实线示出，平均μ等于-9.68mV，标准偏差σ为11.39mV，峰值为0.4056[A600-背景]。该分布在标准约化坐标中被表示为BMI活性除以右Y轴上的峰值(作为顶部X轴上Z分数的函数)。Z分数被如常定义为(X-μ)/σ，其中该情况下的X是ζ-电势。
＊平均μ＝-9.68mV，标准偏差σ＝11.39mV，ζ-电势ζ＝Z＊σ+μ
参照缓冲液：5mM HEPES pH 8.0，2.5mM NaCl
在给定的反应条件(pH、传导性、盐的类型、洗涤剂螯合剂等)下，每种底物污渍的正态分布是独特的。不同的益处或有利结果遵循在来自不同折叠的酶间保持的物理性质(例如，对于ASP和NprE电荷梯级变体而言的表达水平和ζ-电势的情况)的正态分布。在正态分布中，峰值在均值时出现。在共同ζ-电势标度上对酶和底物电荷的比较揭示，当这种情况下的平均酶ζ-电势为-9.68mV时，出现最优BMI性能，该-9.68mV基本上匹配底物污渍ζ-电势(在相同条件下测量到的为-8.97mV)。
针对其z分数，方便地描述了标准正态分布的性能水平，如表7-1所示(见Abramowitz和Stegun，Handbook of Mathematical Functions withFormulas，Graphs，andMathematical Tables，Dover，New York，第9版[1964])。向ζ-电势的转化由均值和标准偏差(界定了针对给定应用的分布)直接给出。在本实施例中，针对蛋白质折叠测量的清洁性能限于-40mV至+20mV之间的ζ-电势值。具有高于其折叠最优值的80％(即z＝±0.65)的清洁性能的变体限于-17.08mV至-2.28mV之间的ζ-电势值。具有高于其折叠最优值的90％(即z＝±0.46)的清洁性能的变体限于-14.92mV至-4.44mV之间的ζ-电势值。
在同样制剂下，不同底物污渍(例如，草、机体污垢、西红柿)具有不同的ζ-电势，而同样的底物污渍在不同制剂(例如北美HDL、欧洲粉末餐具洗涤洗涤剂)下也具有不同ζ-电势。而不管怎样，尽管底物污渍电荷有所变动，正态分布的标准偏差预计保持恒定。给定的洗涤剂制剂中酶和底物ζ-电势的信息允许快速鉴定出该变体的预计性能水平，以及实现最优性能水平所需的电荷变化的方向和大小。在想要的反应媒介中测量底物ζ-电势允许对该媒介中特定底物上的酶反应加以优化。可使用相似的方法来优化任何媒介中的任何酶反应。
在一些实施方式中，通过优化给定条件下特定污渍上的酶性能，来获得污渍特异性的酶。这通过下述方法获得：测量污渍去除条件下的污渍的ζ-电势，然后改造酶，使得产生在相同条件下具有基本相等的ζ-电势的变体(例如，ζ-电势对应于最优表现的至少大约80％，大约90％，大约95％，大约97％或大约99％)。在一些实施方式中，这通过遗传或化学修饰在酶表面修饰一个或多个氨基酸来完成。在其它一些实施方式中，通过筛选探针酶的天然分离物或同源物以鉴定具有靶范围内的ζ-电势的酶来获得污渍特异性酶。虽然本实施例涉及清洁BMI污渍，但是本发明的方法还适用于优化对其它污渍(例如但不限于草、酒或尿)的清洁。类似地，虽然本实施例涉及丝氨酸蛋白酶活性，但本发明的方法还适用于优化其它酶的活性，例如但不限于蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、聚酯酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶和氧化还原酶。
实施例8
酶向底物污渍的分配
该实施例描述了对酶电荷、底物污渍分配和清洁性能之间的关系的测定。图13和下文中的表显示了在不同离子强度下的5mM HEPES pH 8.0缓冲液中ASP电荷梯级探针蛋白质的清洁性能，这作为BMI微布样活性测量，其作为通过排除(depletion)测量的酶向底物污渍的分配的函数来表示。通过加入不同量的惰性电解质：2.5mM NaCl(空心圆圈)、16mMNaCl(灰色圆圈)和100mM NaCl(实心圆圈)来控制离子强度。在低和高的酶向底物污渍的分配中，ASP电荷梯级探针蛋白质的BMI清洁性能都减少。对于清洁性能来说，最优分配在结合的酶的比例为0.1至0.5之间发生。虽然预计酶向底物的分配极少时的性能很低，但观察到在高的酶向底物分配时性能也低是出人意料的。
图14显示了多种离子强度下的5mM HEPES pH 8.0缓冲液(圆圈)和AATCC HDL洗涤剂(三角形)中结合的酶的比例，这是相对于野生型ASP的电荷的函数。如该图证明的，在低盐条件下，相对于野生型ASP极负(-5)电荷的积累导致酶向底物污渍的分配极少，因此清洁性能不佳。类似地，如该图证明的，在低盐条件下，相对于野生型ASP极正(+3)电荷的积累导致酶过多地向底物污渍分配，因此清洁性能也不佳。
类似地，在图15所示的5mM HEPES pH 8缓冲液(含2.5mM NaCl)中，针对整个ASP电荷组合文库而言，结合的酶的比例对净电荷变化作图与针对ASP电荷梯级变体所获得的图类似。再次地，使用探针蛋白质(例如电荷梯级)代表了整个文库的行为。因此，使用ASP电荷梯级探针蛋白质允许针对酶向底物污渍的分配快速鉴定出最优电荷。在这种情况下，相对于野生型ASP而言-2到+2之间的净电荷范围对应于0.1至0.5之间的结合比例，这是对低盐条件下清洁性能来说最优的。这是优化蛋白质物理性质(这种情况下是净电荷/疏水性)以调节蛋白质-底物结合的一个例子。
图16显示了在5mM HEPES pH 8.0缓冲液(含2.5mM NaCl)中与底物污渍结合的蛋白质的比例，其作为酶ζ-电势的函数展示。如可预计地，在加入的惰性电解质的量相同时，整体情况类似于之前在图14中描述的。底物污渍ζ-电势等于-8.97mV。
不被理论束缚的情况下，实心圆圈显示的带负电荷的酶变体(例如比-15mV更负)被带负电荷的底物污渍抵制接近，导致低分配。相反，空心圆圈显示的带正电荷的变体(例如高于零电荷点)则被带负电荷的底物污渍吸引，导致高分配。因此，对于清洁性能而言存在最优分配。
通常，对于任何酶、底物和溶液条件的组合而言，向底物污渍的分配限于同样条件下测量的底物污渍ζ-电势值(这种情况下是-8.97mV)中央的ζ-电势窗(potentialwindow)。ζ-电势窗的宽度决定了预期的结合比例。例如，通过-8.97mV±15mV给出的30-mV宽的ζ-电势窗包括了小于0.1(低结合剂)和高于0.5(高结合剂)之间的底物分配。通过-8.97mV±10mV给出的20-mV宽的ζ-电势窗包括了高于0.1和低于0.5之间的底物分配。通过-8.97mV±5mV给出的10-mV宽的ζ-电势窗(0.15至0.4之间)可被认为是这些条件下针对该底物污渍的清洁性能来说最优的。
不同底物污渍(例如草、机体污垢、西红柿等)在相同制剂下具有不同的ζ-电势，相同底物污渍在不同制剂(例如北美HDL、欧洲粉末餐具洗涤洗涤剂)下具有不同ζ-电势。而不管怎样，包括不同底物分配水平的ζ-电势窗预计保持恒定。给定的洗涤剂制剂中酶和底物ζ-电势的信息允许快速鉴定出该变体的预计底物分配水平，以及实现最优分配所需的电荷变化的方向和大小。因此，在想要的反应媒介中测量底物ζ-电势允许对该媒介中特定底物上的酶反应加以优化。可使用相似的方法来优化任何媒介中的任何酶反应。相反，关于支持性织物基质(即，压载物(ballast))的ζ-电势的信息可用于预防结合。BMI污渍具有-8.97mV的ζ-电势，而未被弄脏的下层棉织物具有-14.43mV的ζ-电势。
虽然本实施例涉及从BMI底物污渍的丝氨酸蛋白酶分配，但本发明的方法还适用于优化其它酶和底物的分配。例如，本发明的方法适用于优化纤维素酶变体向织物或生物质的分配，如实施例14所示。在一些实施方式中，测量应用条件下待处理的织物的ζ-电势，获得与织物的ζ-电势差异可达+/-30mV的纤维素酶变体。通过遗传工程改造或化学修饰获得这些变体。然后针对缓冲液(纺织品应用)或洗涤剂(清洁应用)中应用条件下表面抛光性能和抗张强度损失对变体加以筛选。因此，可使用该方法高效鉴定出具有最优表面抛光性能和最小抗张强度损失的纤维素酶变体。此外，可使用该方法，容易地鉴定出具有与植物生物聚合物底物最优结合(用于增加对燃料乙醇生产的糖化)的纤维素酶变体。
实施例9
蛋白质表达
本实施例描述了测定蛋白质电荷和蛋白质表达之间的关系。
在14L发酵罐规模生产ASP变体
进行了一组14L规模的补料分批发酵，以比较ASP蛋白酶组合电荷文库变体(R14I-N112E-T116E-R123F-R159F、R14I-N112E-T116E-R123F、R14I-N112E-T116E、R14I-N112E、R14I、R14I-D184T、R14I-D184T-T86K、R14I-T86K-D184T-A64K和R14I-T86K-D184T-A64K-Q81K)的生产水平，所述变体的电荷变化从-5到+3。通过用与每种变体对应的1mL枯草芽孢杆菌甘油贮存物接种包含600mL培养基(LB肉汤+1％葡萄糖+20mg/L新霉素)的2L无挡板摇瓶，生长种子培养物。培养物在37℃在振荡培养箱中以175rpm振荡培养，直至OD550达到0.8-1.5。在那时，将整个种子培养物无菌转移至14L发酵罐，该发酵罐配备有联合控制器以监控：温度、溶氧百分比(％DO)、pH和搅动。废气通过线内质谱分光光度计进行监控。使用的发酵培养基(7L)由在基于磷酸盐的缓冲液中的10％大豆粉组成，所述缓冲液包含硫酸镁、微量矿物质和另外的20mg/L新霉素。起始发酵参数设为：37℃、pH6.8(在运行过程中用氢氧化铵调整)、750rpm搅动、40％DO(在运行过程中通过调整空气和搅动进行维持)、11slpm气流和1bar压力。需要时加入消泡剂(Mazu DF204)以控制泡沫。设置10小时0.5-2.1g/分钟葡萄糖线性补料的补料分批程序(使用60％葡萄糖溶液用于补料)，其中以pH的升高作为触发器。每4小时进行一次发酵取样，取15mL整个肉汤以执行下述测量：在分光光度计上的细胞密度(测量550nm吸光度)、ASP变体生产、葡萄糖、氮、磷酸盐和总蛋白质。总发酵运行时间为40-45小时。
使用Aaa-Pna测定测量ASP变体滴度
就变体ASP蛋白酶的生产，测定在发酵过程中获得的枯草芽孢杆菌培养物样品。测定产生的酶在底物N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺(AAA-pNA)上的活性。根据由对硝基苯胺的水解和释放引起的405nm吸光度增加，该测定测量了经修饰的蛋白酶的产生(Estell等人，J BiolChem，260：6518-6521[1985])。来自发酵罐的枯草芽孢杆菌澄清上清液的等分试样在缓冲液中进行测定，所述缓冲液包含：100mM Tris、0.01mMCaCl2、0.005％Triton X-100，pH 8.6。野生型ASP蛋白酶标准品用于产生标准曲线以计算产生的蛋白质(g/L发酵肉汤)。
图17描述了作为相对于野生型ASP的净电荷的函数，ASP电荷梯探针蛋白质在枯草芽孢杆菌中的表达水平。如由该图显而易见的，相对于野生型ASP的极端负(-5)或正(+3)电荷积聚导致弱表达水平。ASP电荷梯探针蛋白质的使用，使得可以快速地鉴定对于改善在给定宿主生物中的表达而言最适的净电荷。在该情况下，相对于野生型ASP的-2至+1的净电荷改变与最佳表达水平对应。在针对ASP观察到的电荷最优值(-2)本身处，与具有极端电荷改变的变体比较，观察到表达接近4倍的改善。在摇瓶水平的这些观察在14L发酵规模上得以证实。表9-1显示14L发酵罐中的表达的2个量度，即，在40小时时的ASP近似滴度以及由表达曲线的线性部分计算的ASP生产。摇瓶滴度在最后1列中提供用于参考。所有滴度已相对于ASP-R14I水平进行归一化。相对于野生型ASP的-2至+1的净电荷改变范围对应于发酵罐规模的最佳表达水平。这是优化蛋白质物理性质(在该情况下净电荷)用于调节完全不同的益处(在该情况下重组蛋白质表达)的另一个例子。
＊14L发酵规模下ASP变体在枯草芽孢杆菌中的表达，以及关于摇瓶规模中的峰滴度和生产力。
蛋白质在宿主细胞中的表达和分泌涉及表达的蛋白质与多种宿主蛋白质的相互作用。表达的蛋白质与宿主细胞蛋白质的最佳相互作用，特别是速率限制相互作用，对于蛋白质的生产是重要的。该相互作用可以通过修饰表达蛋白质(或宿主细胞蛋白质)的表面电荷/疏水性进行优化。然而，对涉及的一种或多种机制的了解不是实施且使用本发明所必需的。
图18显示了两种不同的蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达水平，其作为ζ-电势的函数展示。丝氨酸蛋白酶ASP的表达以黑色圆圈显示，而金属蛋白酶NprE的表达以空心三角显示。这些蛋白酶变体跨越了相对野生型酶而言至少8个电荷的范围。如前文所述，对于表达而言存在净电荷最优值。对于溶液，例如具有2.5mM加入的NaCl的5mM HEPES pH 8.0而言，共同电荷标度(例如ζ-电势)允许对具有两种大为不同的蛋白质折叠的变体表达水平加以比较。蛋白质表达限于40-mV宽的ζ-电势窗，在该情况下在-40mV至+20mV之间。如针对BMI性能的，通过实线指示的标准正态分布(平均μ等于-8.92mV，标准偏差σ为8.95mV，峰值为181[mg蛋白质/升培养物])，很好地描述了ASP和NprE在枯草芽孢杆菌中的表达水平(作为酶ζ-电势的函数)。该分布在标准约化坐标中被表示为表达水平除以右Y轴上的峰值(作为顶部X轴上Z分数的函数)。Z分数被如常定义为(X-μ)/σ，其中该情况下的X是ζ-电势。该正态分布是每种宿主生物在给定培养条件(例如pH、传导性、盐类型、矿物质等)下独特的。蛋白质折叠间的最优表达水平在等于-8.92mV的分布均值处发生。
针对其z分数，方便地描述了标准正态分布的性能水平，如表9-2所示。向ζ-电势的转化由均值和标准偏差(界定了针对给定应用的分布)直接给出。在本实施例中，所有测量的表达水平限于-40mV至+20mV之间的ζ-电势值。具有高于其蛋白质折叠最优值的80％(即z＝±0.65)的表达水平的变体限于-14.73mV至-3.11mV之间的ζ-电势值。具有高于蛋白质折叠最优值的90％(即z＝±0.46)的表达水平的变体限于-13.03mV至-4.80mV之间的ζ-电势值。还显示了其它性能水平、z分数和向ζ-电势范围的转化。
＊平均μ＝-8.92mV，标准偏差σ＝8.95mV，ζ-电势＝Z＊σ+μ
参照缓冲液：具有2.5mM NaCl的5mM HEPES pH 8.0
关于给定生产宿主中表达的现有蛋白质的ζ-电势的信息，允许在同样条件下测量时针对具有不同蛋白质折叠但ζ-电势相当的蛋白质快速鉴定出预计表达水平。此外，关于ζ-电势的信息允许确定获得最优表达水平所需的电荷变化的方向和大小。该方法的应用可不限于枯草芽孢杆菌，只要具有不同折叠的蛋白质的表达水平在同样生长条件下在相同生物(或者在具有可估计的种系发生同源性的生物)中被比较即可。
就阐述而言，描述了针对在枯草芽孢杆菌中的增加的蛋白质表达对NprE的电荷优化。
步骤1涉及测量至少一种NprE变体的表达水平以及在相同宿主中克隆并在相同条件下培养的ASP电荷梯级探针的表达水平。在该情况下，较之野生型NprE具有四处正突变的NprE变体(T14R-S23R-N46K-T54R)在枯草芽孢杆菌中表达。ASP探针蛋白质系列指示出针对表达的电荷最优值的存在(图17)。该最优值针对较之野生型ASP具有两个负电荷的ASP变体存在。为确定NprE的电荷变化的方向和大小，必须在共同电荷标度上比较ASP探针蛋白质和亲本NprE。
步骤2涉及测量(或计算)ASP电荷梯级探针蛋白质和NprE变体在相同溶液条件下的ζ-电势。在该情况下，用低离子性的参照溶液，最小化电荷效应的筛选。合适的参照溶液是含有2.5mM NaCl的5mM HEPESpH 8.0缓冲液。
如前文提到的，图18显示了作为在参照溶液中测量的ζ-电势的函数的ASP探针蛋白质表达水平。我们发现，该图上显示的NprE(+4)变体具有13.24mV的平均ζ-电势值，这对应于不佳的蛋白质表达水平(例如，每升培养物33.7mg蛋白质)。为获得可以在枯草芽孢杆菌中以高水平表达的NprE变体，对该NprE变体进行工程改造，使得其处于或接近正态分布的平均ζ-电势(μ等于-8.92mV)确定的峰值。这对应于在该宿主中等于每升培养物大约181mg的最优表达水平。为实现该目标，获得更多负电荷的NprE变体(这是需要的电荷变化的方向)。需要的电荷变化的大小由-8.92mV-(13.28mV)＝-22.2mV给出。这是电荷约束(chargeconstraint)。
步骤3涉及通过在本实施例中进行蛋白质工程改造获得感兴趣的NprE变体。用于获得感兴趣的NprE变体的其它可能包括：对天然分离物加以选择、糖基化或化学修饰以匹配想要的ζ-电势。用公式(0.7)来指导蛋白质工程改造的举动。NprE具有等于2.654nm的流体动力学半径，这是例如通过在高离子强度条件下(以消除双电层力对流体动力学半径的影响)进行光散射来测量的。根据公式(0.3)，在ζ-电势测量的被良好界定的参照溶液条件下，Debye长度k-1等于2.087nm。将这些值与前文指出的物理常数一起引入公式(0.7)，针对每种净电荷变化计算出预计的ζ-电势变化3.04mV。因此，为弥合+4NprE变体的ζ-电势缺口，对具有-22.2/3.04＝-7.3或七个负电荷的NprE变体进行工程改造。该计算通常过多地估计了需要的电荷数量，这是由于电泳迁移率测量中滑动面(plane of slip)的定位的不确定性导致的(见Hunter in“Zeta Potential in Colloid Science”，Academic Press，[1981])。设计较之亲本NprE具有总体负电荷的NprE变体。为快速鉴定用于降低亲本NprE的正电荷的氨基酸取代的类型，提供了电荷矩阵。
如图18所示，较之亲本NprE(T14R-S23R-N46K-T54R)具有5个负电荷变化的NprE变体T60D与测试的NprE变体的表达最优值最接近。NprE变体T60D具有-10.72mV的ζ-电势和等于每升培养物171.9mg蛋白质的表达水平。较之用亲本NprE变体T14R-S23R-N46K-T54R获得的值，有5倍改进。
实施例10
LAS和螯合剂稳定性
本实施例描述了对蛋白质电荷和在含有阴离子表面活性剂和螯合剂中之一或两者的反应媒介中的稳定性之间的关系的测定。为测定受胁迫和非胁迫样品的蛋白酶活性，使用suc-AAPF-pNA测定。为测定受胁迫和非胁迫样品的α-淀粉酶活性，使用BODIPY-淀粉测定。来自胁迫板的残余LAS和EDTA不影响suc-AAPF-pNA或BODIPY-淀粉测定。
LAS稳定性
使用的试剂包括：十二烷基苯磺酸，钠盐(＝LAS)，Sigma D-2525；Sigma P-8074；TRIS缓冲液(游离酸)，Sigma T-1378；将6.35g溶于大约960ml水中，用4N HCl将pH调节为8.2。最终TRIS浓度为52.5mM；LAS贮液：MQ水中的10.5％LAS溶液(＝10.5g/100mlMQ)；TRIS缓冲液-100mM/pH 8.6(100mM Tris/0.005％Tween80)和TRIS-Ca缓冲液，pH 8.6(100mM Tris/10mM CaCl2/0.005％Tween80)。使用的硬件包括：平底MTPs，Costar(#9017)；Biomek FX；ASYSMultipipettor；Spectramax MTP读数仪；iEMS温育箱/摇床；Innova 4330温育箱/摇床；Biohit多通道移液器和BMG Thermostar摇床。
在存在0.06％LAS(十二烷基苯磺酸钠)下温育测试蛋白酶后，测量LAS稳定性，这通过在suc-AAPF-pNA测定中测量残余活性来进行。在52.5mM Tris缓冲液(pH 8.2)中制备0.063％LAS溶液。通过向100ml(100mM)TRIS缓冲液(pH 8.6)中加入1ml 100mg/ml AAPF贮液(DMSO中)，来制备AAPF工作溶液。为稀释上清液，向平底板中装入稀释缓冲液，加入上清液的等分试样，并良好混合。稀释比取决于生长板中ASP对照的浓度(suc-AAPF-pNA活性)。想要的蛋白质浓度为80ppm。
加入10μl经稀释上清液至190μl 0.063％LAS缓冲液/孔中。用胶带(tape)盖上MTP，振荡数秒，放在温育箱(Innova 4230)中，于25°或35℃以200rpm搅动温育60分钟。温育10分钟后，测定初始活性(t＝10分钟)，这通过每个孔取10μl混合物转入新鲜的含有190μlsuc-AAPFpNA工作溶液的MTP来进行。良好混合这些溶液，使用MTP读数仪来测量suc-AAPF-pNA活性(25℃下5分钟内进行20次读数)。
60分钟温育后，从温育板再移出10μl溶液，来测定最终活性(t＝60分钟)。然后按照上文所述来测定suc-AAPF-pNA活性。如下文所述进行计算：
％残余活性＝[t-60值]＊100/[t-10值]。
图19描述了作为相对野生型ASP的净电荷变化的函数的LAS稳定性(针对含有229种变体的文库)。设计并构建该文库(见，例如美国专利申请序列号Nos.10/576,331和11/583,334)，以跨越相对于具有突变R14I的亲本ASP分子而言几个净电荷。通过在LAS中温育60分钟的残余活性相对于仅温育10分钟的比例，来测量洗涤剂稳定性。如图所证实的，相对野生型ASP负电荷(多至-5)的积累对LAS稳定性有益。这是优化蛋白质物理性质(在该情况下是净电荷)来改进蛋白质在复合液体洗衣环境中的稳定性的一个例子。
LAS/EDTA稳定性
使用的试剂包括：对照缓冲液：50mM HEPES、0.005％Tween-80，pH 8.0；和胁迫缓冲液50mM HEPES、0.1％(w/v)LAS(十二烷基苯磺酸，钠盐，Sigma D-2525)、10mM EDTA，pH8.0。将酶变体(20ppm)1∶20稀释到包含对照或胁迫缓冲液的96孔非结合平底板内且混合。对照平板在室温温育，而胁迫平板立即放置于37℃30-60分钟(依赖于待测酶的稳定性)。温育后，使用suc-AAPF-pNA测定(针对蛋白酶)和BODIPY-淀粉测定(针对淀粉酶)测量酶活性。剩余或残余活性的比例等于胁迫样品的反应速率除以对照样品的反应速率。亲本酶和变体在对照缓冲液中60分钟是稳定的。
图20描述了对于包含80种变体的文库，作为相对于亲本FNA的净电荷改变的函数的LAS/EDTA稳定性。根据实施例2中描述的方法设计且构建了这个文库，以跨越相对于亲本FNA分子几个净电荷。如由该图显而易见的，相对于亲本FNA的负电荷(直至-4)聚集对于组合的LAS/螯合剂稳定性是有利的。这是优化蛋白质物理性质(在该情况下净电荷)用于改进蛋白质在复杂液体洗衣环境中的稳定性的例子。
对于ASP和FNA的LAS/EDTA稳定性，存在电荷依赖性。添加负电荷增加稳定性。但是，甚至在比亲本多1个或2个正电荷时，通过我们的方法，也可以找到能够赋予与亲本相等或更大稳定性的电荷突变排列。这种手段也对更大的酶有效，例如，图21所示的TS23t′，其中，加入正电荷对稳定性的有害影响可被增加稳定性的最优电荷排列弥补。
实施例11
热稳定性
本实施例描述了测定蛋白质电荷和热稳定性之间的关系。蛋白质测定基于在加热缓冲的培养上清液前和后的二甲基酪蛋白(DMC)水解。淀粉酶测定基于在加热培养上清液前和后的BODIPY淀粉水解。使用与实施例1中所述相同的化学和试剂溶液用于这些测定。
蛋白酶的热稳定性测定
过滤的培养上清液在PIPES缓冲液中稀释至20ppm(基于生长平板中的对照浓度)。首先，取10μl每种稀释的酶样品在二甲基酪蛋白测定中测定起始活性，如下所述进行处理。随后，将50μl每种稀释的上清液置于MTP的空孔中。MTP平板在iEMS温育箱/摇床HT(ThermoLabsystems)中在60℃和400rpm温育90分钟。平板在冰上冷却5分钟。随后，将10μl溶液加入包含200μl二甲基酪蛋白底物/孔的新鲜MTP，以测定在温育后的最终活性。用胶带覆盖这个MTP，振荡数秒并且置于烤箱中在37℃2小时无搅动。
样品的残余活性表示为最终吸光度和起始吸光度(两者都相对于于空白进行过校正)的比值。图22显示对于SEL文库，作为相对于野生型ASP的净电荷改变的函数的热稳定性指数。更高的指数指示热稳定更高的变体。如由该图显而易见的，相对于野生型酶的极端负(-2)或正(+2)电荷积聚，对于热稳定性是有害的。以相对于野生型ASP的零净电荷改变为中心，存在一个明显的热稳定电荷最优值。这是优化蛋白质物理性质(在该情况下净电荷)用于改进液体洗衣应用中酶的热稳定性的一个例子。
α-淀粉酶的热稳定性测定
过滤的培养上清液在具有002％Tween的50mM乙酸钠+2mMCaCl2pH 5.8中进行系列稀释。通过BODIPY淀粉测定，分析10μl每种稀释的培养上清液，以确定起始淀粉酶活性。将50μl每种稀释的培养上清液置于VWR无裙边(low profile)96孔板中。向每个孔中加入30μL矿物油作为密封剂。使平板在BioRad DNA engine Peltier Thermal Cycler中在95℃温育30或60分钟，这取决于亲本酶的稳定性。温育后，使平板冷却至4℃5分钟，并且随后保持在室温。将10μl每种样品加入新鲜平板中，并且如实施例1中所述，通过BODIPY淀粉测定进行测定，以确定最终淀粉酶活性。
热稳定性的计算
样品的残余活性表示为最终吸光度和起始吸光度(两者都相对于空白进行过校正)的比值。这些观察也对淀粉酶电荷变体进行。图23显示作为相对于野生型的电荷改变的函数，第一AmyS电荷梯的残余活性。再次，相对于野生型的极端负(-12)或正(+10)电荷积聚，对于热稳定性是有害的。这是优化蛋白质物理性质(在该情况下净电荷)用于改进液体洗衣应用中酶的热稳定性的例子。
实施例12
热活性
本实施例描述了对蛋白质电荷和取决于温度的反应速率间关系的测定，其中热活性是一种表现形式。
洗涤条件期间的稳定性测定
该测定基于对经缓冲的培养物上清液加热之前和之后的suc-AAPF-pNA水解测定。使用与实施例1的suc-AAPF-pNA水解测定中所述相同的化学品和试剂溶液。
方法
在含0.005wt％Tween 80的100mM Tris缓冲液(pH 8.6)中，将经过滤的培养物上清液稀释至400ppm(基于生长板中对照的蛋白质浓度(通过BCA))。首先，针对每项测定进行20倍稀释。然后，向190μL 5mMHEPES缓冲液pH 8.0(含有2.5mM NaCl)中加入10μL经稀释的样品。预期每个孔中的最终酶浓度在1ppm的数量级上。在30℃或40℃以及400rpm下，在iEMS温育箱/摇床HT(Thermo Labsystems)中对MTP板进行30分钟温育。接着，每种经稀释的酶样品取10μl，用suc-AAPF-pNA测定测定初始活性，并进行处理(按照上文所述，在7分钟和30分钟时都进行)。
计算洗涤条件期间的稳定性
样品的残余活性被表示为30分钟时的suc-AAPF-pNA水解速率除以7分钟时的suc-AAPF-pNA水解速率的比例，两者均针对空白校正过。
在一些实施方式中，想要对酶进行工程改造，以改进其在不同反应温度下的性能。例如，作为全球能源节省趋势的一部分，人们想要开发出能在降低的温度下(如在冷水洗涤的情况下)运作的洗涤剂蛋白酶。对于给定的酶-底物反应而言，总反应活化的障碍是催化(化学转化的活化能障碍)和物理(与底物和/或产物结合的焓)方面的总和。公知，放热反应在更低的温度下以更快的速率进行，而吸热反应在更高的温度下以更快的速率进行。该现象由化学热动力学中的Van’t Hoff公式很好地描述，其将给定焓变下的温度变化与平衡常数变化关联起来(见Laidler，“Chemical Kinetics”，Harper Collins第3版[1987])。部分摩尔热容量或活化能障碍的方面也被描述。活性位点外的氨基酸取代不会影响到化学催化的活化障碍，但是它们却会影响与底物和/或产物的结合焓。因此，为增加较低温度下的反应速率，可对酶结合焓方面进行工程改造，以促进反应的总体放热性的焓，而不考虑仅与催化步骤相关的反应的焓。相反，为增加在更高温度下的反应速率，可对酶结合焓方面进行工程改造，以促进反应的总体吸热性的焓，而不管仅与催化步骤相关的反应的焓。实现此的一种策略通过改变酶的电荷或疏水性来进行。
图24显示了较之30℃的初始清洁活性而言在增加的温度下残留的BMI微布样活性，其作为ASP和NprE电荷梯级蛋白质探针相对野生型蛋白酶的净电荷变化的函数展示。小于1的残留活性比例表示变体在更高的温度下活性更低(例如，放热性的)，因此，其更适于低温下的性能。相反，大于1的残留活性比例表示变体在更高的温度下活性更高(例如，吸热性的)，因此，其更适于较高的温度下的性能。如该图所示，具有比野生型蛋白酶更多负电荷的变体是放热性的，而具有更多正电荷的变体是吸热性的。只要变体稳定性没有受明显影响，可应用该信息，以高效获得在改变的温度下具有优质性能的酶。事实上，图26显示，ASP变体的稳定性在30℃和40℃都得以保持。
结合焓对反应总焓的贡献通常被忽略，假设反应速率的改进仅是催化步骤带来的。事实上，根据Arrhenius’法则的一些变化(见上文Laidler)，只要酶是热稳定性的，预计反应速率将仅随温度增加。但如本文所示，放热性的ASP和NprE变体(相对其野生型蛋白酶是负的)在更高的温度下具有更低活性，它们与该假设明显相悖。这是优化蛋白质物理性质(在该情况下是净电荷)来改进在液体洗衣应用中给定温度下的酶反应速率的一个例子。使用有限的ASP或NprE电荷梯级探针蛋白质的组，允许对这些蛋白质折叠内的吸热和放热变体进行快速鉴定。特别地，当想要针对改进的冷洗涤性能而鉴定酶时，本发明教导将搜索局限于放热性的变体。
为设计一组标准，以将这些发现应用到其它蛋白质折叠间，必须要在共同标度上来描述电荷效果。图25显示了较之30℃时的初始活性而言在增加的温度下的残留BMI微布样活性，其作为在相同条件(反应缓冲液是含有2.5mM NaCl的5mM HEPES pH 8.0)下测量的ASP和NprE电荷梯级蛋白质探针的ζ-电势的函数展示。当在相同条件下测量时，底物污渍(未固定的BMI)的ζ-电势的值等于-8.97mV。如所预期的，每条曲线的总体情况类似图24，电荷表示为相对于野生型蛋白酶的净变化。此外，ζ-电势的信息表示，在这些条件下，确实为正的变体(零电荷的点以上；例如0mV)是吸热性的，而负的变体是放热性的。当要搜索适于冷洗涤应用的酶时，通过选择天然分离物、化学修饰或蛋白质工程改造，本发明提供了从在这些条件下限于负ζ-电势的任何蛋白质折叠来鉴定蛋白质的指导。简言之，使用跨越感兴趣的物理性质(例如ASP电荷梯级)的探针蛋白质，提供了快速鉴定优胜者(例如，在感兴趣的测试中具有有利结果的蛋白质变体)的标准。
本发明的方法可外推至任何酶、底物和反应媒介组合。具体地，给定制剂环境中，指示放热或吸热行为的ζ-电势值是酶和底物电荷的函数。在这种情况下，与底物符号相反的酶变体是吸热的。这由0mV(零电荷的点，此时蛋白质快速改变符号)处或附近的斜率改变明显示出。不被理论束缚的情况下，带相反电荷的酶和底物(或反应产物)紧密结合，并且在比化学催化转化步骤(例如，扩散受限的)的更长的时间保持接触。这限制了进行后续反应可获得的酶的浓度。加入热能因此改善了酶性能，因为其帮助酶从底物(或产物)复合体脱离，由此降低了非生产性结合的量。对于任何给定的酶、底物和制剂环境的组合而言，放热和吸热变体的区域是零电荷的点和底物电荷的点的函数。如果在应用条件下底物带负电荷，那么吸热性变体就限于正ζ-电势值或零电荷点的右侧。相反，如果底物带正电荷，则吸热性变体就限于负ζ-电势值或零电荷点的左侧。通常，酶和底物的ζ-电势的乘积对于吸热变体来说是负的，对放热变体来说是正的。
因此，使用有限的ASP或NprE电荷梯级探针蛋白质的组，允许对这些蛋白质折叠内的吸热和放热变体进行快速鉴定。特别地，当想要针对改进的冷洗涤性能来鉴定酶时，本发明教导将搜索局限于放热性的变体。
该方法可应用于针对多种温度下的清洁性能来改进蛋白酶、淀粉液化中的淀粉酶、生物质降解中的纤维素酶和在冷或热的温度下需要热活化的任何酶。当电荷积累有害的情况下，例如对热稳定性或崔化步骤的效率有害的情况下，可使用美国申请No.60/933,331描述的用于平衡相互矛盾的性质的方法，以使用该手段实现热活化。
实施例13
对氨基酸性质进行统计测定
氨基酸特征，例如，电荷、疏水性、氢键等，是蛋白质的重要性质。例如，用于带电荷的底物时，蛋白质的表面电荷或总电荷可能对活性来说是重要的，而疏水性则可能对溶解性来说是重要的。我们有兴趣进行基于统计的测试，以鉴定出对蛋白质性能来说重要的氨基酸性能。此类测试可指示氨基酸性质和突变体蛋白质性能之间的关联的存在。对于每种氨基酸性质而言，用分数从数字上反映一种氨基酸被另一氨基酸取代导致的性质变化。存在或可构建若干计分矩阵，来预测在氨基酸取代时的性质变化。附图中给出了其四个例子。图27提供了pH 8.6处大致电荷变化的电荷变化矩阵。图28提供了氢键计分矩阵。图29提供了Kyte-Doolittle亲水性(hydropathicity)矩阵(上文Kyte and Doolittle)。最后，图30提供了Eisenberg疏水性矩阵(上文Eisenberg等)。
对于任何变体数据组(例如，针对ASP蛋白酶的位点评估文库数据(WO 2005/052146))，可将数据归类为比任意截留点值好的那些变体(例如＞100％wt活性，＞50％wt活性或＞5％wt活性)以及差的那些。可使用氨基酸计分矩阵，向每种氨基酸取代给出分数值。就方便起见，可将分数作为(电荷分数)使用或分析入五分位数(quintile)(亲水性、疏水性、氢键)。例如，Kyte-Doolittle亲水性，分数分为-2的五分位数(分数＜-4)、-1的五分位数(分数在-4至-1之间)、0的五分位数(分数在-1到+1之间)、+1的五分位数(分数在1至4之间)和+2的五分位数(分数高于4)。可对超过截留点值和针对氨基酸性质具有某分数或分数范围的变体的数量进行简单计数。可基于氨基酸性质和性能间的无关联，从高于或低于截留点值的突变的百分比和具有给定分数或分数范围的氨基酸变化的百分比，来计算每类的预计数量。可将其与观察到的数量相比，并计算观察与预计的比例。显著高于1的比例指示性质与性能具有正相关，低于1的比例则指示性质与性能的负相关。产生氨基酸分数的十种随机搅乱的组，针对随机数据组，计算十种观察/预计(o/e)比。然后对结果取均值，确定随机化数据的标准偏差。可将真实的o/e比与随机化的均值相比较，基于随机化的标准偏差将所述真实的o/e比确定为在1、2或3σ水平上显著。ASP、酰基转移酶(ACT)和AmyS的结果分别显示于表13-1、13-2和13-3中。1σ水平处显著的观察/预计比以粗体表示。
表13-1显示了对较之基于图27的矩阵电荷变化分数(ΔCHRG)优于野生型的ASP变体的计算(ΔΔG＜0)。对角蛋白(KER)和AAPF活性以及BMI活性、LAS、热(THER)稳定性而言，在3σ上显著的电荷变化有强烈影响，而对于酪蛋白(CAS)活性和在枯草芽孢杆菌中的蛋白质表达([蛋白质])来说，影响没那么明显。表13-1还显示了针对氢键键合的值(ΔHB)，分数为-2表示丢了氢键键合能力。对于该酶和其性质而言，减少的氢键键合通常是有好处的。此外，表13-1显示了Kyte-Doolittle亲水性(ΔK-D)和Eisenberg疏水性标度(ΔE)的结果。对于所有性质都有显著的疏水性影响，而Eisenberg标度显示出更明显的影响。
表13-2显示了针对ACT(见，例如，美国专利申请序列号No.10/581,014)的电荷变化(ΔCHRG)和Kyte-Doolittle亲水性(ΔK-D)对过酸形成(PAF)、过酸降解(PAD)和蛋白质在大肠杆菌中的表达的影响。清楚地，氨基酸取代的性质(例如电荷和疏水性)可影响在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的表达水平以及蛋白质的基础活性和稳定性。
表13-3显示了对针对5、10和60分钟时的玉米粉水解(CF5、CF10、CF60)、pH4.0和5.8时在DP7底物上的活性(pH 4、pH 5.8)、在pH 8.6和10时的稻淀粉清洁(清洁8和清洁10)以及在枯草芽孢杆菌中的蛋白质表达(EXP)优于野生型的AmyS变体的计算。电荷对活性的影响与电荷对表达的影响方向相反。氢键键合和疏水性也显示出对这些性质统计上相关的影响。清楚地，氨基酸取代的性质(例如电荷和疏水性)可影响在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的表达水平以及蛋白质的基础活性和稳定性。
表13-4显示了对针对玉米粉水解(CF)、在DP3和DP7寡糖底物上的活性(DP3和DP7)、热稳定性(DP3HS)、在pH 8.6和10时清洁的稻淀粉微布样(清洁8和清洁10)以及在枯草芽孢杆菌中的表达(EXP)优于野生型的AmyE变体的计算。清洁活性具有最强的电荷影响。
实施例14
优化展示出可变电荷的底物上的反应
通过本领域已知的技术来评估纤维素转化(见，例如，Baker等人，ApplBiochemBiotechnol，70-72：395-403[1998])。在实验中使用标准的纤维素转化测定。在该测定中，将酶和经缓冲的底物放在容器中，在一定温度下温育一定时间。用足够的100mM甘氨酸(pH11)来淬灭反应，令反应混合物的pH为至少pH 10。一旦反应被淬灭，将反应混合物的等分试样滤经0.2微米的膜，以除去固体。然后通过HPLC，按照上文Baker等人描述的方法，针对可溶糖测定经过滤的溶液。
经预处理的玉米秸秆(PCS)
按照Schell等人，J Appl Biochem Biotechnol，105：69-86[2003]所述，用2％w/wH2SO4预处理玉米秸秆，接着用去离子水洗多次，获得4.5的pH。加入乙酸钠，产生50mM的终浓度，将溶液滴定至pH 5.0。反应混合物中的纤维素浓度为大约7％。
将通过商业纤维素酶混合物(Spezyme CP和Indiage 44L)进行糖化之前或之后的PCS等分试样装入1.5mL Eppendorf离心管，占到大约1/3的体积。样品在6,000rpm离心5分钟，用Milli-QTM水交换上清液，过程重复5次。从经润洗的玉米秸秆制备MIlli-QTM水中的100mg/mL贮液。在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中将该贮液稀释至1mg/mL，用于ζ-电势测量。每种底物样品取1mL等分试样，转到干净的MalvernInstruments(UK)一次性ZetasizerNSTM透明管中。
表14-1显示，在糖化反应期间，表示为ζ-电势的PCS底物电荷接近成为两倍负的。不被理论束缚的情况下，关于净负电荷的增加有很多解释，包括但不限于：木质素、该底物的非反应性部分以及整个纤维素酶和其它蛋白质的非生产性结合或污损(fouling)的富集。如从实施例8中的BMI微布样活性(酶向底物的分配)可观察到的，对于性能(例如，反应程度和反应速率)来说有最优的酶ζ-电势，其与反应媒介条件下底物ζ-电势匹配。不同的生物质预处理可极大影响初始底物电荷。如果酶或底物的ζ-电势在反应期间不匹配，酶-底物相互作用将不再是最优的。对于接近10mV的变化(正是生物质转化的情况)来说，该效果将是很显著的。
用于补救这种状况的策略包括但不限于：提供跨越多种电荷的酶掺合物；补料分批工艺手段，其中，在不同反应时间和/或转化程度时提供具有新的最优值处不同电荷的酶；通过加入配方活性剂，特别是表面活性剂(离子性和非离子性的)或其它蛋白质，来控制底物表面电荷；通过pH调节控制底物表面电荷；通过反应来调节离子强度以改变酶电荷最优值；膜过滤，特别是反渗透和纳米过滤，以控制反应期间的离子强度；加入螯合剂，通过去除盐来控制离子强度；以及通过预处理工艺控制生物质底物电荷。
对木霉属物种(Trichoderma sp.)纤维素酶制备物的化学修饰
本实施例描述了用琥珀酸酐对商业的木霉属物种纤维素制备物LAMINEX BG酶复合物(Genencor Division，Danisco US，Inc.)的处理，以对赖氨酸残基乙酰化。LAMINEX BG酶复合物赖氨酸残基的乙酰化改变了蛋白质的净电荷(例如，增加的负电荷)。也可使用其它类似的化学修饰，来将赖氨酸的正电荷转化为带负电荷的基团(例如，用乙酰氧琥珀酸酐、马来酸酐、酒石酸酐和邻苯二甲酸酐处理)或者甚至转化为两个负电荷(例如，用1，2，4-苯三酸酐、顺-乌头酸酐和4-硝基邻苯二甲酸酐处理)。可使用其它化学修饰，除去赖氨酸残基的正电荷，产生不带电荷的残基(例如，乙酸酐、丁酸酐、异丁酸酐、己酸酐、戊酸酐、异戊酸酐和新戊酸酐处理)。
使用公开的方法的变化形式(Lundblad，Chemical Reagents forProteinModification，编著：R.Lundblad，第3版，CRC press，1984)，用琥珀酸酐修饰纤维素酶制备物上的赖氨酸残基。对该反应而言，在1mL500mM HEPES缓冲液pH 8中制备236mg LAMINEXBG酶复合物的样品。在加入酶复合物之前，通过将粉末溶于DMSO至500mg/mL的终浓度制备琥珀酸酐(Aldrich)溶液。加入琥珀酸酐的等分试样，使得在反应管中获得＞1∶100的赖氨酸与琥珀酸之比。另一反应管仅装入相似体积的DMSO和酶，用作为未经修饰的蛋白质对照。对管加以涡旋，放在室温下过夜。第二天，向每个管中加入1∶10体积的1M甘氨酸(pH 3)，淬灭琥珀酸酐反应。
通过在天然凝胶上比较经修饰的和未经修饰的蛋白质来验证化学修饰。在梯度8-25％上以pH 8.8和100伏运行天然凝胶(Phast System gels，GE Healthcare)，来分析来自每种反应的等分试样(经化学修饰的和未经修饰的)。用考马斯蓝对凝胶染色后，观察蛋白质，以验证成功的修饰。染色揭示了蛋白质条带迁移的变化，验证了纤维素酶制备物的多种蛋白质组分电荷的变化。木霉属物种纤维素酶制备物的经修饰样品要比未经修饰的样品带更多的负电荷。
为分离经修饰的和未经修饰的(对照)蛋白质，使用旋转脱盐柱(Pierce)，对80μl每种样品的等分试样进行脱盐。样品1∶10稀释后，使用NanoDropTM分光光度计(Thermo)，测量经脱盐样品(包括未经修饰的对照)在280nm处的吸光度，这以一式两份进行，以测定样品的总蛋白质浓度。
评估木质素结合
木质素是苯基丙烷类(phenylpropanoid)的复合生物聚合物，其是木头的主要非碳水化合物组成成分，其与纤维素纤维结合，以硬化和强化植物的细胞壁。因为其与其它细胞壁组分交联，木质素使得纤维素降解酶的纤维素和半纤维素的可及性最小化。因此，木质素通常与所有植物生物质的降低的可消化性相关(Berlin等人，Appl BiochemBiotechnol，121-124：163-170[2005])。特别地，纤维素酶与木质素的结合降低了纤维素酶对纤维素的降解。木质素是疏水性的，其表观带负电荷。因此，本发明的发明人考虑，向纤维素酶添加负电荷，可降低其与木质素的结合。
如本文所述，设置反应，以测量化学修饰对木霉属物种纤维素酶制备物结合植物聚合物的组分(即木质素)的能力的影响。简言之，将在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中制备的50μL 1.16％木质素(从对蔗渣的完全糖化回收)与4μl经脱盐经修饰或未经修饰的木霉属物种纤维素酶制备物合并。在室温下对含有反应混合物的微离心管温育1小时，然后高速离心，将可溶材料与不可溶材料分开。收集来自每个管的10μl上清液。将反应管重新混合，并再温育2小时，之后从每个管收集第二份10μl的上清液等分试样。通过SDS-PAGE分析上清液样品。经修饰的木霉属物种纤维素酶制备物中，条带强度的降低是木质素结合降低的指示。
评估蔗渣结合。
蔗渣是甘蔗被挤压以提取其果汁后的残留的生物质。在50mM乙酸钠(pH 5)中制备含有2％纤维素的蔗渣溶液(经酸处理，28％固体，57％聚糖)。在同样的乙酸钠缓冲液中对未经修饰或经化学修饰的木霉属物种纤维素酶制备物的样品进行10倍稀释。将经稀释的酶的等分试样与蔗渣溶液或缓冲液单独混合，在室温下温育1小时。收集上清液，针对纤维素酶组分(即β-葡糖苷酶)的活性对其加以测定。
使用氯-硝基-苯基-β-D-葡糖苷(CNPG)测定，来测量β-葡糖苷酶活性。CNPG测定是动力学测定，其中，β-葡糖苷酶将CNPG转化为有色产物2-氯-4-硝基苯酚(CNP)。在37℃，10分钟期间，测量405nm处的OD。使用SpectraMax软件获得作为Vmax的速率，然后将其转化为比活性(μM CNP/秒/mg蛋白质)。简言之，将200μl 50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)加入96孔微滴定板的每个孔中。盖上板，将其于37℃放在Eppendorf恒温混合仪中，放置15分钟，以允许其平衡至该温度。平衡后，向每个孔中加入5μl经在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中系列稀释的酶样品。使用50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)来1∶5稀释10mM CNPG贮液，然后向含有酶样品的每个孔中加入20μl经稀释的CNPG溶液(2mM)。将微滴定板转入设置为37℃的分光光度计(SpectraMAX，340型；MolecularDevices)，在405nm处读取OD 0-15分钟，以≤9秒的间隔读取。
保持不与蔗渣底物结合的纤维素酶样品的β-葡糖苷酶活性的量要比经化学修饰的木霉属物种纤维素酶制备物的高相当多。特别地，如CNPG测定所测定的，未经修饰的β-葡糖苷酶中不到50％保持为不与蔗渣底物结合(例如，50％结合)，而经修饰的bglu中有接近80％保持与蔗渣底物不结合(例如20％结合)。全盘考虑，经修饰的纤维素酶结合的数据表明，降低纤维素酶的正电荷，导致与更具负电荷的植物聚合物底物的结合降低。在这种情况下，植物聚合物底物是经酸处理的生物质中残留的木质素。经酸处理的来自玉米秸秆的生物质(具有相似化学组成的植物生物聚合物)显示在糖化过程期间接受了增加更多的负电荷，如通过测量ζ-电势来测定的(见表14-1)。
对经酸预处理的蔗渣的糖化
使用经化学修饰的和未经修饰的木霉属物种纤维素酶制备物，评估在含有多种量的其它木质素的经预酸处理的蔗渣(APB)中存在的纤维素的糖化，并通过HPLC对其加以测定，以监测糖DP1至DP7的释放。在微滴定板中，在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中制备200μL3.5％APB，将其调节至多种木质素的量。向孔中加入20微升纤维素酶溶液(未经修饰的或经修饰的LAMINEX BG)。用铝板密封物盖上板，将其放在50℃的温育箱中，振荡下温育24小时或48小时。通过向每个孔中加入100μl 100mM甘氨酸pH 10来终止反应。彻底混合之后，将微滴定板孔的内容物滤经Millipore 96-孔过滤板(0.45μm，PES)。将滤液稀释进含有100μl10mM甘氨酸pH 10的板，通过HPLC测量产生的可溶糖(DP1至DP7)的量。用脱灰(deashing)/保护柱(Biorad目录No.125-0118)和Aminex基于铅的碳水化合物柱(Aminex目录No.HPX-87P)装备Agilent 1100系列HPLC。使用的移动相是流速为0.6ml/分钟的水。将自Sigma获得的可溶糖标准(DP1-DP7)全部稀释于Milli-Q水中，至100mg/mL，用其将针对各糖的峰面积转化为实际的糖浓度。通过用从HPLC测量的糖除以纤维素到葡萄糖的100％转化来计算转化百分比。
与木质素结合的纤维素将降低其降解纤维素的效率。这显示为：存在增加的木质素的量时，糖化反应中存在的纤维素转化的降低。该趋势在经修饰的纤维素酶制备物中也一样持续。但是，在上述反应条件下，较之未经修饰的纤维素酶样品，经修饰的纤维素酶样品中纤维素转化增加了10％。该结果表明，纤维素酶增加的负电荷降低了纤维素酶与木质素的非生产性结合。此外，本实施例显示，化学修饰是为了控制酶电荷进行的诱变的替代手段。
经化学修饰的CBH2增加了APB的糖化
按照上文所述，对经纯化的木霉属物种CBH1、CBH2变体、EG1、EG2和β-葡糖苷酶进行化学修饰。用于本实验的CBH2变体具有多处取代(P98L/M134V/T154A/I2112V/S316P/S413Y，数字对应于野生型成熟CBH2纤维素酶)，如美国公开号No.2006/0205042所述。成熟CBH2变体的氨基酸序列如下所示：
QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVS
PTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTLWANAYYASEVSSLAIPSLTG
AMATAAAAVAKVPSFVWLDTLDKTPLMEQTLADIRAANKNGGNYAGQFVVYDLPDR
DCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDVRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPK
CANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKN
ASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPPYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFI
TDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSD
SSAPRFDYHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL(SEQ ID NO：32).
通过其在天然凝胶上变化的迁移(相对未经修饰的蛋白质而言)，验证了CBH1、CBH2变体、EG1、EG2和β-葡糖苷酶的化学修饰。经修饰的CBH1、CBH2变体、EG1、EG2和β-葡糖苷酶具有更多负电荷。所有蛋白质浓度都是使用NanoDropTM分光光度计(Thermo)来测量的。在微滴定板中设置糖化反应，微滴定板的每个孔中，在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中制备150uL 7％APB，加入21μg总蛋白质中的20μl酶混合物，使得每个孔中最终的蛋白质对纤维素之比为20mg/g。通过向里氏木霉(T.reesei)背景中加入经纯化的经修饰或未经修饰的Bglu、CBH2变体、EG1或EG2，产生6种酶混合物，其中，已经失活了编码纤维二糖水解酶I(CBHI，Cel7a)、纤维二糖水解酶II(CBHII，Cel6a)、内切葡聚糖酶I(EGI，Cel7b)和内切葡聚糖酶II(EGII，Cel5a)的基因(见US 2007/0128690)。在每种混合物中，加入72.5％里氏木霉背景、2.5％Bglu、15％CBH2变体、5％EG1、5％EG2，前四种混合物具有一种未经修饰的蛋白质，第五种混合物具有的全部蛋白质都未经修饰，第六种混合物则所有蛋白质都是经修饰的。板在50℃温育72小时。通过向每个孔中加入100μl 100mM甘氨酸(pH 10)来终止反应。彻底混合之后，将微滴定板孔的内容物滤经Millipore 96孔过滤板(0.45μm，PES)。将滤液稀释进含有100μl10mM甘氨酸pH 10的板，通过HPLC测量产生的可溶糖(DP1至DP7)的量。用脱灰/保护柱(Biorad目录No.125-0118)和Aminex基于铅的碳水化合物柱(Aminex目录No.HPX-87P)装备Agilent 1100系列HPLC。使用的移动相是流速为0.6ml/分钟的水。将自Sigma获得的可溶糖标准(DP1-DP7)全部溶解于Milli-Q水中，至100mg/mL，用其将针对各糖的峰面积转化为实际的糖浓度。通过用从HPLC测量的糖除以纤维素到葡萄糖的100％转化来计算转化百分比。
如本发明的开发期间测定的，所有蛋白质都经修饰的第六种酶混合物(经修饰的EG2、EG1、CBH2变体和β-葡糖苷酶)具有最大的纤维素转化率，而所有蛋白质都未经修饰的第五种酶混合物则具有最低的纤维素转化率。将前四种酶混合物加以比较，具有未经修饰的CBH2的第二种酶混合物给出了次低的净纤维素转化率。因此，在纤维素转化中，经修饰的蛋白质较之未经修饰的蛋白质具有明显的优点。
制备里氏木霉CBH2表面电荷变体
如本发明的开发期间测定的，对CBH2表面赖氨酸残基的琥珀酰化改进了APB上(如上文所述)和经预处理的玉米秸秆上的性能。较之未经修饰的CBH2变体而言，经修饰的CBH2变体的电荷为大约-17。考虑到此，设计CBH2电荷梯级，用于在纤维素酶性能应用中测定最优表面电荷。亲本野生型里氏木霉cbh2的编码区域在下文中显示，标准字体表示信号序列的DNA，粗体表示成熟酶的DNA序列：
atgattgtcggcattctcaccacgctggctacgctggccacactcgcagctagtgtgcctctagaggagcgg
(SEQ ID NO：33).
亲本野生型里氏木霉(T.reesei)cbh2前体蛋白质的氨基酸序列如下所示：
MIVGILTTLATLATLAASVPLEERQACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYY
SQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVG
VTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIR
TANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSD
IRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGW
LGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNE
KLYIHAIGRLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTG
DSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAAQAGAWFQAYFVQLLTN
ANPSFL(SEQ ID NO：34).
亲本野生型里氏木霉cbh2成熟蛋白质的氨基酸序列如下所示：
QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVS
PTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTG
AMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDR
DCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPK
CANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKN
ASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGRLLANHGWSNAFFI
TDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSD
SSAPRFDSHCALPDALQPAAQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL(SEQ ID NO：35).
选用来诱变的残基包括非保守的、暴露的赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺残基，选择它们用于取代，以引入负电荷。通过质谱鉴定经修饰的CBH2中经琥珀酰化的赖氨酸，选其用于向谷氨酸的诱变，每次取代导致-2个电荷的区别。通过分析CBH2三维结构与对同源CBH2序列的氨基酸比对组合(见，例如美国公开号No.US 2006/0205042，通过引用将图3并入本文)，来选择用于取代的其它残基。在CBH2氨基酸序列比对中高度可变的表面残基是诱变的候选者。但是，要避免紧密相邻的取代的积累。用谷氨酰胺代替精氨酸(电荷-1)，用其分别的羧基变体取代谷氨酰胺和天冬酰胺(电荷-1)。此外，选择天冬氨酸和谷氨酸残基用于取代成分别的胺残基，以完成电荷梯级(电荷+1)。表5-1显示了具体的CBH2取代，显示的所有位置(除了R63和R77之外)都位于CBH2催化结构域。可通过除去带负电荷的残基或通过引入带正电荷的残基，来制造净正电荷。类似地，可通过除去带正电荷的残基或通过引入带负电荷的残基，来制造净负电荷。
为制备CBH2电荷梯级，设计十种CBH2电荷变体(C-1至C-10)，它们较之野生型CBH2跨越了+8至-32的电荷范围，它们示于表14-3中。
将变体的氨基酸序列反翻译回DNA，使用GeneDesigner软件(DNA2.0)针对在里氏木霉(Trichoderma reesei)中的表达进行密码子优化。合成经密码子优化的cbh2变体基因，使用下述引物，从DNA 2.0构建体PCR扩增出CBH2表面电荷变体(SCVs)的DNA：
GGHTK22正向
5’-CACCATGATCGTGGGAATTCTTACTACTC-3’(SEQ ID NO：36)；
和GGTHK23反向
5’-CTACAAAAACGAAGGGTTCGCATT-3’(SEQ ID NO：37)
但是，在一项实验中，用定点诱变向野生型CBH2的基因组DNA中引入K129E和K157E突变(cbh2电荷变体C3)。将CBH2cbh2电荷变体C3克隆进pTrex3GM，按照本文所述进行表达。纯化PCR产物，将其克隆进pENTR/TOPO，用于对大肠杆菌TOP10细胞的转化。从单个菌落分离质粒DNA，验证正确的序列。将CBH2SCVs克隆进pTrex3GM、pTTTpyr(pcbh1)和pTTTpyr(pstp1)，如表14-4所示。
表14-4.CBH2表面电荷变体的表达克隆
CBH2变体 目的载体
pTrex3gM pTTTpyr(Pcbh1) pTTTpyr(Pstpl)
C-1(pTK354a) 1 11 21
C-2(pTK355a) 2 12 22
C-3(pTK356a) 3 13 23
C-4(pTK357a) 4 14 24
C-5(pTK358a) 5 15 25
C-8(pTK361a) 6 16 26
C-6(pTK359a) (7) (17) (27)
C-7(pTK360a) 8 18 28
C-9(pTK362a) 9 19 29
C-10(pTK363b) 10 20 30
CBH2变体在里氏木霉中的表达
本实施例描述了用于在里氏木霉中表达CBH2表面电荷变体(SCV)的方法。简言之，使用下文所述的方案，用含有cbh2电荷变体C3(具有K129E和K157E突变)可读框的pTrex3gM表达载体进行对里氏木霉的生物射弹转化。使用的里氏木霉中，编码纤维二糖水解酶I(CBHI，Cel7a)、纤维二糖水解酶II(CBHII，Cel6a)、内切葡聚糖酶I(EGI，Cel7b)和内切葡聚糖酶II(EGII，Cel5a)的基因已被失活。使用来自Bio-Rad(Hercules，CA)的PDS-1000/he颗粒递送系统，按照厂商指导，通过生物射弹转化方法来完成对里氏木霉菌株的转化(见WO 05/001036和US2006/0003408)。将转化子转入新的乙酰胺选择板。将合适的转化子接种进过滤微滴定板(Millipore)中，其中含有的甘氨酸极限培养基(6.0g/L甘氨酸；4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/LKH2PO4；1.0g/LMgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；p.H.5.5)，后来灭菌加入～2％葡萄糖/槐糖混合物作为碳源，10ml/L的100g/L CaCl2，2.5ml/L里氏木霉痕量元素(400X)：175g/L无水柠檬酸；200g/L FeSO4·7H2O；16g/LZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/L MnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3。在放置于28℃温育箱的富O2室中，于液体培养物中对转化子培养5天。通过使用真空复合管，获得来自过滤微滴定板的上清液样品。按照厂商指导，在4-12％NuPAGE凝胶(Invitrogen)上运行样品。用Simply Blue染料(Invitrogen)对凝胶加以染色。可使用该方法完成其它CHB2表面电荷变体的表达。
实施例15
酶的pH-活性情况(profile)的调节
本实施例描述了使用表面电荷突变以优化酶在给定反应中的pH-活性情况。
图31显示对于实施例5的第一AmyS电荷梯级，作为pH的函数的稻淀粉微布样清洁活性。3.0-4.25的pH范围在包含0.01％Tween-80的200mM甲酸钠中，而4.25-5.5的pH范围在包含0.01％Tween-80的200mM乙酸钠中。数据拟合成滴度曲线，各自具有单个pKa值。
图32显示对于实施例5的第一AmyS电荷梯级，作为电荷改变的函数的AmyS催化的表观pKa。这些数据证实对于α-淀粉酶，pH活性情况可通过表面电荷突变而显著地迁移，甚至是在200mM缓冲液中。尽管对于枯草杆菌蛋白酶(Russell等人，J Mol Biol，193：803-13[1987])以及对于D-木糖异构酶(Cha等人，Mol Cell，8：374-82[1998])，这已在极低离子强度下进行过报道，但在α-淀粉酶上这据信是第一次，并且令人惊讶的是，甚至在高离子强度下也是如此。
本申请文件中提到的所有专利和公开文本都是本发明所属领域技术人员水平的指示。本领域技术人员容易理解本发明完全适用于实现目的并达到目的和获得所提及的以及其中所固有的那些益处。本文描述的组合物和方法代表优选实施方案且是示例性的，不旨在限制本发明范围。对于本领域技术人员显而易见是的，无需背离本发明的精神和范围，即可对本文公开的本发明进行各种置换和修饰。
本文举例说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制因素的情况下实施。已采用的术语和表达用作描述性而不是限制性术语，并且不希望此种术语和表达的使用排除所显示或描述的特征或其部分的任何等价物，应认识到各种修饰在请求保护的本发明范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以诉诸于对本文公开概念的修饰和变化，并且此种修饰和变化应视为在如通过本文限定的本发明的范围内。
本发明已在本文中进行了广泛且一般地描述。落入此一般公开内容内的下位或较具体内容也形成本发明的部分。这包括具有如下前提或负面限制的本发明上位描述，所述前提或负面限制是从该上位描述中排除任何主题，而不管该被排除物是否在本文中有过具体提及。

Claims (17)

1.提供酶变体文库的方法，所述方法包括：
a)在至少一项感兴趣的测试中，对跨越ζ-电势范围的多种探针酶变体加以测试，其中所述酶变体的所述ζ电势在-40mV和+40mV之间，并且其中感兴趣的测试在匹配洗涤条件下的洗涤剂的pH和传导性的缓冲液中进行；
b)鉴定所述ζ-电势范围内的最优值，其与大于所述至少一项感兴趣的测试中的最大值的至少50％的值相关；
c)提供处于所述ζ-电势范围的所述最优值内的多种候选酶变体，其中所述酶变体文库富含具有在所述至少一项感兴趣测试中最大值的至少50％的值的成员，所述感兴趣的测试在所述洗涤条件下的洗涤剂中进行，
其中所述酶是蛋白酶或淀粉酶；
其中所述探针酶变体和所述多种候选酶变体是通过重组技术产生的、天然酶变体、体外合成的糖基化或磷酸化酶变体、和/或体外产生的酶缀合物；并且
其中所述感兴趣的测试包括测量洗涤性能、底物结合、酶抑制、洗涤剂稳定性、热稳定性、反应速率、反应程度、和/或热活性；
d)在所述至少一项感兴趣的测试中，测试所述多种候选酶变体和至少一种野生型酶；和
e)鉴定具有改进的结果的酶变体，其中，所述野生型酶在所述至少一项感兴趣的测试中获得的性能指数值为1.0，而具有改进的结果的所述酶变体获得高于1.0的值。
2.权利要求1的方法，其中所述ζ-电势范围内的最优值对应于大于所述感兴趣测试中观察到的最大值的至少60％、70％、80％、90％或95％的值。
3.权利要求1的方法，其中所述酶是蛋白酶。
4.权利要求3的方法，其中所述蛋白酶是中性金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。
5.权利要求4的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
6.权利要求4的方法，其中所述中性金属蛋白酶从芽孢杆菌科的成员获得。
7.权利要求4的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶从纤维单胞菌属(Cellulomonas)的成员获得。
8.权利要求1的方法，其中所述酶是淀粉酶。
9.权利要求1的方法，其中测定所述候选酶变体和所述野生型酶的ζ-电势，并加以比较。
10.权利要求1的方法，其中所述候选酶变体的所述ζ-电势介于-20mV至+20mV之间。
11.权利要求1或9的方法，其中所述候选酶变体的所述ζ-电势介于-10mV至+10mV之间。
12.权利要求1的方法，其中所述感兴趣的测试包括洗涤性能。
13.权利要求12的方法，其中所述洗涤性能包括血奶墨汁洗涤性能。
14.权利要求13的方法，其中在洗涤剂组合物中测试所述候选酶变体和野生型酶。
15.权利要求14的方法，其中所述洗涤剂组合物被配制为具有pH介于5至12.0之间的粉末或液体洗涤剂。
16.权利要求14的方法，其中在具有碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试所述洗涤性能。
17.权利要求14的方法，其中在热水洗涤剂中测试所述洗涤性能。
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