ES2336092T3 - Variantes de proteasas con multiples sustituciones. - Google Patents
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Abstract
Variante de proteasa, que es una variante de una proteasa precursora de subtilisina de Bacillus lentus que tiene la secuencia mostrada en la figura 3, estando dicha variante caracterizada por tener la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y comprender una secuencia de aminoácidos que tiene las sustituciones R170SA1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R o R170S-G100R en relación a dicha proteasa precursora, donde las posiciones de dichas sustituciones son equivalentes a las posiciones especificadas en la subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la figura 3.
Description
Variantes de proteasas con múltiples
sustituciones.
Las serín proteasas son un subgrupo de carbonil
hidrolasas. Comprenden una clase diversa de enzimas que tienen un
amplio rango de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R.
Sci. Amer., 131: 74-88. A pesar de su diversidad
funcional, la maquinaria catalítica de las serín proteasas se ha
aproximado mediante por lo menos dos familias de enzimas
genéticamente diferentes: 1) las subtilisinas y 2) las serín
proteasas bacterianas homológas y relacionadas con la
quimiotripsina de mamífero (por ejemplo, tripsina y tripsina de
S. gresius). Estas dos familias de serín proteasas muestran
mecanismos destacadamente similares de catalizadores. Kraut, J.
(1977), Annu. Rev. Biochem., 46: 331-358. Además,
aunque la estructura primaria no esté relacionada, la estructura
terciaria de estas dos familias de enzimas reunirá una triada
catalítica conservada de aminoácidos que consisten en serina,
histidina y aspartato.
Las subtilisinas son serín proteasas
(aproximadamente PM 27.500) que se secretan en grandes cantidades a
partir de una amplia variedad de especies de Bacillus y otros
microorganismos. La secuencia de proteínas de subtilisina se ha
determinado a partir de por lo menos nueve especies diferentes de
Bacillus. Markland, F.S., et al. (1983),
Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.,
364:1537-1540. Se ha descrito la estructura
cristalográfica tridimensional de subtilisinas de Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus licheniforimis y varias
variantes naturales de B. lentus. Estos estudios indican que
aunque la subtilisina no está genéticamente relacionada con las
serín proteasas de mamífero, tiene una estructura similar en el
sitio activo. Las estructuras de cristales por rayos X que
contenían inhibidores de péptido unidos covalentemente (Robertus,
J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11:
2439-2449) o complejos de productos (Robertus, J.D.,
et al. (1976), J. Biol. Chem., 251:
1097-1103) también han proporcionado información
con respecto al sitio activo y al supuesto hueco de unión al
sustrato de la subtilisina. Además, se han descrito un gran número
de estudios de modificaciones cinéticas y químicas para la
subtilisina; Svendsen, B. (1976), Carlsberg Res. Commun., 41:
237-291; Markland, F.S. Id.), así como por lo menos
un informe en el que la cadena lateral de metionina en el residuo
222 de subtilisina se convertía mediante peróxido de hidrógeno en
metionin-sulfóxido (Stauffer, D.C., et al.
(1965), J. Biol. Chem., 244: 5333-5338) y se han
llevado a cabo mutagénesis específicas de sitio (Wells y Estell
(1988) TIBS 13: 291-297). WO98/55634, WO99/20727 y
WO99/20770 describen todos variantes de subtilisina que presentan
sustituciones en varias combinaciones de posiciones. La variante
descrita se puede utilizar (por ejemplo) en composiciones de
limpieza.
La presente invención proporciona una variante
de proteasa, que es una variante de una proteasa precursora de
subtilisina de Bacillus lentus que presenta la secuencia
mostrada en la figura 3, estando dicha variante caracterizada por
tener la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto
isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y que comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene la sustituciones
R170S-A1R, R170S-G61R,
R170S-N204R, R170S-S216R o
R170S-G100R en relación a dicha proteasa precursora,
donde las posiciones de dichas sustituciones son equivalentes a las
posiciones especificadas en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens madura mostrada en la figura 1.
La presente invención proporciona además ADN que
codifica dicha variante de proteasa, así como un vector de
expresión que comprende dicha secuencia de ADN y una célula huésped
transformada con dicho vector de expresión.
La presente invención proporciona además una
composición de limpieza que comprende la variante de proteasa
descrita anteriormente.
La presente invención también proporciona un
método de mejor rendimiento de lavado de una proteasa precursora de
subtilisina de Bacillus lentus que tiene la secuencia
mostrada en la figura 3, que comprende la introducción de las
sustituciones R170S-A1R, R170S-G61R,
R170S-N204R, R170S-S216R o
R170S-G100R en dicha proteasa precursora para
producir una variante de proteasa, donde dicha variante de proteasa
tiene la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto
isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y donde dicha variante
de proteasa tiene una mejor rendimiento de lavado en relación a
dicha proteasa precursora, donde las posiciones de dichas
sustituciones son equivalentes a las posiciones especificadas en la
subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en
la figura 1.
El método puede comprender modificar una
secuencia de ADN que codifica dicha proteasa precursora para
producir una secuencia de ADN modificada que codifica la variante de
proteasa. Puede comprender además transformar una célula huésped
con un vector que contiene la secuencia de ADN modificada y que
expresa la variante de proteasa a partir de la célula huésped
transformada.
Las figuras 1A-C representan las
secuencias de AND (SEC ID No. 1) y aminoácidos (SEC ID No. 2) para
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de
restricción parcial de este gen.
La figura 2 representa los residuos de
aminoácidos conservados entre subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens (BPN)' y Bacillus lentus (tipo
salvaje).
Las figuras 3A y 3B representan la secuencia de
aminoácido de cuatro subtilisinas. La línea superior representa la
secuencia de aminoácidos de subtilisina de subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens (a veces referida como
subtilisina BPN') (SEC ID NO: 3). La segunda línea representa la
secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus subtilis
(SEC ID NO: 4). La tercera línea representa la secuencia de
aminoácidos de subtilisina de B. licheniformis (SEC ID NO:
5). La cuarta línea representa la secuencia de aminoácidos de
subtilisina de Bacillus lentus (también referida como
subtilisina 309 en la PCT WO89/06276) (SEC ID NO: 6). El símbolo *
indica la ausencia de residuos de aminoácidos específicos en
comparación con la subtilisina BPN'.
La figura 4 representa el vector de expresión de
B. Subtilis pVS08.
La figura 5 representa la orientación del
cebador ApaI directo, el cebador ApaI inverso, el cebador mutagénico
inverso y el cebador mutagénico directo.
Las proteasas son carbonil hidrolasas que actúan
en general para dividir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos.
Tal como se utiliza en la presente invención, "proteasa"
significa una proteasa natural o una proteasa recombinante. Las
proteasas naturales incluyen una \alpha-aminoaceil
péptido hidrolada, peptidilaminoácido hidrolasa, acilamino
hidrolasa, serín carboxipeptidasa, metalocarboxipeptidasa, tiol
proteinasa, carboxil-proteinasa y metaloproteinasa.
Se incluyen serín, metalo, tiol y ácido proteasas, sí como endo y
exo proteasas.
La presente invención incluye enzimas proteasas
que son variantes de carbonil hidrolasa (variantes de proteasas) no
naturales que tienen una actividad proteolítica, estabilidad,
especificidad de sustrato, perfil de pH y/o rendimiento diferentes
característicos en comparación con la carbonil hidrolasa precursora
de la que deriva la secuencia de aminoácidos de la variante.
Específicamente, dichas variantes de proteasa presentan una
secuencia de aminoácidos no hallada en la naturaleza, que se deriva
mediante la sustitución de una pluralidad de residuos de
aminoácidos de una proteasa precursora con aminoácidos diferentes.
La proteasa precursora puede ser una proteasa natural o una
proteasa recombinante.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia
a varios aminoácidos mediante códigos de una letra y tres letras.
Dichos códigos se identifican en Dale, M.W. (1989), Molecular
Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Appendix B.
Las variantes de proteasas útiles en la presente
invención derivan de subtilisina de Bacillus lentus.
Las subtilisinas son proteasas bacterianas o
fúngicas que actúan en general para dividir enlaces peptídicos de
proteínas o péptidos. Tal como se utiliza en la presente invención,
"subtilisina" significa una subtilisina natural o una
subtilisina recombinante. Se conoce que un conjunto de subtilisinas
naturales se producen y a menudo se secretan mediante diversas
especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los miembros
de esta serie no son completamente homólogas. Sin embargo, las
subtilisinas en esta serie muestran el mismo tipo de actividad
proteolítica o similar. Esta clase de serín proteasas comparte una
secuencia de aminoácidos común que define una triada catalítica que
las diferencia de la clase de serín proteasas relacionadas con
quimiotripsina. Las serín proteasas relacionadas con subtilisinas y
quimiortipsina presentan una triada catalítica que comprende
aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con
subtilisina, el orden relativo de estos aminoácidos, leídos desde
el extremo amino al carboxilo, es
aspartato-histidina-serina. En las
proteasas relacionadas con quimiotripsina, el orden relativo, sin
embargo es
histidina-aspartato-serina. De este
modo, la subtilisina se refiere en la presente invención a una
serín proteasa que tiene la triada catalítica de proteasas
relacionadas con subtilisina. Algunos ejemplos incluyen, pero sin
limitación, a las subtilisinas identificadas en la figura 3 de la
presente invención. En general y para los objetivos de la presente
invención, la numeración de los aminoácidos en proteasas
corresponde a los números asignados a la secuencia de subtilisina
madura de Bacillus amyloliquefaciens presentada en la figura
1.
"Subtilisina recombinante" o "proteasa
recombinante" se refieren a una subtilisina o proteasa en la que
la secuencia de ADN que codifica la subtilisina o proteasa se
modifica para producir una variante (o mutante) de la secuencia de
ADN que codifica la sustitución, deleción o inserción de uno o más
aminoácidos en la secuencia de aminoácidos naturales. Métodos
adecuados para producir dicha modificación y que se puede combinar
con los descritos en la presente invención, incluyen los descritos
en la Patente de Estados Unidos RE 34,606, la Patente de Estados
Unidos 5,204,015 y la Patente de Estados Unidos 5,185,258, la
Patente de Estados Unidos 5,700,676, la Patente de Estados Unidos
5,801,038, y la Patente de Estados Unidos 5,763,257.
Una "variante de enzima" tiene una
secuencia de aminoácidos que deriva de la secuencia de aminoácidos
de una "enzima precursora". Las enzimas proteasas precursoras
incluyen enzimas naturales y enzimas recombinantes. La secuencia de
aminoácidos de la variante de enzima "deriva" de la secuencia
de aminoácidos de la enzima precursora mediante la sustitución,
deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de
aminoácidos de la enzima precursora. Dicha modificación es de la
"secuencia de ADN de la enzima precursora" que codifica la
secuencia de aminoácidos de la enzima precursora en lugar de la
manipulación de la enzima precursora per se. Los métodos
adecuados para dicha manipulación de la secuencia de ADN precursora
incluyen métodos descritos en la presente invención, así como
métodos conocidos por los expertos en la materia.
Una "variante de proteasa" tiene una
secuencia de aminoácidos que deriva de la secuencia de aminoácidos
de una "proteasa precursora". Las proteasas precursoras
incluyen proteasas naturales y proteasas recombinantes. La
secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa "deriva" de
la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora mediante la
sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora. Dicha
modificación es de la "secuencia de ADN de la precursora" que
codifica la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora en
lugar de la manipulación de la enzima proteasa precursora per
se. Los métodos adecuados para dicha manipulación de la
secuencia de ADN precursora incluyen métodos descritos en la
presente invención, así como métodos conocidos por los expertos en
la materia (véase, por ejemplo, EP 0 328299, WO89/06279 y las
Patentes de Estados Unidos y solicitudes ya referenciadas en la
presente invención).
"Aminoácido cargado" se define como un
aminoácido que es potencialmente ionizable, cambia de carga y
proporciona una carga electrostática a un pH o intervalo de pH
específico. Estos aminoácidos incluyen, por ejemplo, aminoácidos
ácidos, aminoácidos básicos y algunos aminoácidos polares. Los
aminoácidos ácidos son aquellos que están negativamente cargados a
un pH 6,0, por ejemplo, ácido aspártico (Asp o D) y/o ácido
glutámico (glu o E). Los aminoácidos básicos son aquellos que están
positivamente cargados a pH 6,0, por ejemplo, lisina (Lys o K),
arginina (arg o R) y/o histidina (His o H).
"Aminoácido no cargado" se define como un
aminoácido que no es potencialmente ionizable. Estos aminoácidos
incluyen, pero sin limitación, aminoácidos no polares no cargados
y/o aminoácidos polares no cargados. Los aminoácidos no polares no
cargados incluyen, pero sin limitación, alanina (Ala o A), valina
(Val o V), leucina (Leu o L), isoleucina (Ile o I), prolina (Pro or
P), fenilalanina (Phe o F), triptófano (Trp o W), y/o metionina
(Met o M). Los aminoácidos polares no cargados incluyen, pero sin
limitación, glicina (Gly o G), serina (Ser o S), treonina (Thr o
T), cisteína (Cys o C), tirosina (Tyr o Y), asparagina (Asn o N) y/o
glutamina (Gln o Q).
"Carga electrostática neutra" se define
como la suma de cargas electrostáticas de la variante o enzima o
proteasa precursora a un pH o intervalo de pH determinado. Un pH de
ejemplo es pH 6,0.
"Punto isoeléctrico" (pIo) se define como
el valor de pH en el que la proteína o complejo de proteínas, por
ejemplo, la proteasa o complejo de proteasas (con metal u otros
iones opcionalmente unidos) son neutros, es decir, la suma de
cargas electrostáticas (carga electrostática neta = NEC) en el
complejo es igual a cero. En esta suma, se debe tener en cuenta la
consideración de la naturaleza positiva o negativa de las cargas
electrostáticas individuales.
El "mismo punto isoeléctrico (pIo)" se
define como el pIo en un intervalo definido de unidades de pH. Por
ejemplo, un intervalo definido de unidades de pH no podía ser
superior a 1 unidad de pH, entre 0,25 y 0,75, por ejemplo, 0,5
unidades de pH, preferiblemente entre 0,01 y 0,5 unidades de pH, por
ejemplo, 0,1 unidades de pH, y más preferiblemente entre 0,001 y
0,05 unidades de pH, por ejemplo, 0,1 unidades de pH del pIo al que
se compara el otro pIo. El mismo punto isoeléctrico se puede
determinar a un pH determinado o en un intervalo de pH
definido.
"Carga electrostática idéntica" se define
como mantener "Z" o el mismo número de residuos cargados
específicos en la variante de proteasa como hay en la proteasa
precursora. Aunque el número de residuos cargados puede ser el
mismo, los residuos de aminoácidos específicos se pueden sustituir
en otras posiciones aproximadamente en el exterior de la variante
de proteasa, siempre y cuando la carga electrostática neutra sea la
misma que la de la proteasa precursora a un pH determinado.
La misma "carga electrostática neta" se
define como mantener Z, o la suma de las cargas electrostáticas de
la proteasa precursora en un intervalo definido de la suma de cargas
electrostáticas de la variante de proteasa. El mantenimiento de la
misma suma carga electrostática significa mantener la carga
electrostática neta en un intervalo definido de unidades de carga
sobre un intervalo definido de pH. Una variante de proteasa que
tiene la misma carga electrostática neta que la proteasa precursora
tendría una carga electrostática neta en un número definido de
unidades de carga de la proteasa precursora. Por ejemplo, la
variante de proteasa que tiene la misma carga electrostática neta
no puede tener más de 1 unidad de pH, en las unidades de carga de
0,25 a 0,75, por ejemplo, 0,5 unidades, de la carga electrostática
neta de la proteasa precursora. Aún más preferiblemente, la
variante de proteasa que tiene la misma carga electrostática neta
puede estar en 0,05 a 0,25 unidades, por ejemplo, 0,1 unidades de
la carga electrostática neta de la proteasa precursora. Aún más
preferiblemente, la variante de proteasa que tiene la misma carga
electrostática neta puede estar en 0,001 a 0,05 unidades, por
ejemplo, 0,01 unidades de la carga electrostática neta de la
proteasa precursora. Las unidades de carga se pueden definir como
el número de protones donados (ácidos) o aceptados (básicos). La
carga electrostática de un aminoácido individual se puede establecer
en general mediante la determinación del número de protones
aceptados o donados a un pH determinado, por ejemplo 6,0 ó 7,0. Los
valores Z también se pueden determinar mediante las ecuaciones
descritas posteriormente en esta
solicitud.
solicitud.
"Contenido de carga total" de la variante
de proteasa o la proteasa precursora se define como en número total
de cargas electrostáticas de la proteasa respectiva. Una variante de
proteasa con la misma carga electrostática neta puede tener un
contenido de carga total diferente a la proteasa precursora.
Tal como entenderán los expertos en la material,
el punto isoeléctrico se puede calcular de manera práctica
utilizando consideraciones de equilibrio utilizando valores de pK
para varios residuos cargados en la enzima en cuestión y, a
continuación, hallando mediante iteración el valor de pH en el que
la NEC de molécula de enzima es igual a cero tal como se describe
en EP 0945502 y los ejemplos de la misma.
Un problema con este cálculo es que los valores
de pK para los residuos cargados dependen de su medio y
consecuentemente están sujetos a variación. Sin embargo, se obtienen
buenos resultados al asignar valores de pK aproximados específicos
a los residuos cargados independientemente del valor real. También
es posible realizar cálculos más sofisticados, parcialmente tomando
en consideración el medio.
El pIo también se puede determinar
experimentalmente mediante enfoque isoeléctrico o mediante
valoración de la solución que contenía la enzima. Además, los
diversos valores de pK para los residuos cargados se pueden
determinar experimentalmente mediante valoración.
En un aspecto adicional de la invención, las
observaciones anteriores sobre el pIo se utilizan además en un
método para determinar o seleccionar la posición o posiciones y el
aminoácido o aminoácidos a eliminar, sustituir o insertar por el
aminoácido o aminoácidos en la proteasa precursora, de manera que la
carga electrostática neta o punto isoeléctrico de la variante de
proteasa son los mismos que la NEC o el pIo de la proteasa
precursora calculados al mismo valor de pH o un intervalo de pH
definido.
Otra manera de expresa este principio cubierto
por la invención es que la posición o posiciones y el aminoácido o
aminoácidos a eliminar, sustituir o insertar por el aminoácido o
aminoácidos en dicha proteasa precursora o enzima precursora se
seleccionan de manera que el número total de cargas o el contenido
de carga total (=TCC) y/o la NEC en una variante de proteasa o
enzima resultante se mantiene constante para proporcionar una
variante de proteasa o enzima que tiene un punto isoeléctrico que se
mantiene igual a un pH o intervalo de pH definido para un
rendimiento de lavado óptimo de la proteasa o la enzima, cuyo pH
óptimo debería ser tan próximo como sea posible al pH del líquido
de lavado, en el que se pretende utilizar dicha proteasa
mutante.
Tal como se ha indicado anteriormente, el pIo de
una macromolécula, tal como una enzima, se calcula como el pH en el
que la NEC de la molécula es cero. El procedimiento se ejemplifica
en los ejemplos descritos en EP 0 945 502, pero los principios se
describen con más detalle aquí.
Los valores de pK se asignan a cada uno de los
residuos de aminoácidos potencialmente cargados. A continuación, la
proporción de la aparición de un residuo de aminoácido a un pH
determinado en forma cargada o no cargada (C/U(i) cargado/no
cargado) se calcula para ambas cargas negativas y positivas mediante
el uso de las fórmulas Ia y Ib:
(Ia)C/U(i) =
10^{(pH-pKi)}\ (carga\
negativa)
(Ib)C/U(i) =
10^{(pKi-pH)}\ (carga\
positiva)
Según las fórmulas anteriores, si el pH es igual
a pKi C/U(i) es igual a 1.
La carga relativa, Qr(i), o contribución
de carga asignada a cada residuo cargado, se calcula utilizando las
fórmulas IIa y IIb:
(IIa)Q_{r}\
(i) = C/U(i)/(1+C/U(i))\ (carga\
negativa)
(IIb)Q_{r}\
(i) = -C/U(i)/(1+C/U(i))\ (carga\
positiva)
El valor de pH cuando la suma de todas las
contribuciones de cargas a partir de los residuos cargados es igual
a cero se puede encontrar por iteración o a través de la
interpolación en una tabla de pH-suma de carga
suficientemente densa.
Los expertos en la material entenderán que otro
método de determinación de la carga electrostática neutra Z, como
si el grupo (tal como el grupo R o el grupo amino) tiene una forma
ácida catiónica, \alpha representa la carga positiva
fraccional.
Por otro lado, para grupos, tales como el
carboxilo, con una forma ácida neutra y una base conjugada
aniónica, \alpha representa la fracción no cargada. La carga
fraccional es entonces:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha indicado que varias proteínas generales de
proteasa o enzima dependen de la NEC y/o el punto isoeléctrico de
la molécula de proteasa o enzima. Por ejemplo, la solubilidad,
estabilidad, distribución de fases en medio en fases múltiples y/o
carga de la superficie de la proteasa o enzima son propiedades que
están afectadas por la alteración de la NEC y/o el punto
isoeléctrico de la molécula. Sorprendentemente, se pueden conseguir
características de proteasa mejoradas manteniendo el mismo punto
isoeléctrico o la misma carga electrostática neta. Aunque no desea
unirse a ninguna teoría, los inventores creen que existen
situaciones en las que se desea mantener las propiedades generales
de la proteína, enzima o proteasa en cuestión modificando la
cinética de la interacción de la molécula, por ejemplo, la
distribución de cargas u orientación de la molécula en relación a
un sustrato, superficie o
medio.
medio.
La variante de proteasa y la proteasa precursora
tienen una carga electrostática neta idéntica o un punto
isoeléctrico idéntico. Se puede mantener la misma carga
electrostática neta teniendo la carga electrostática idéntica o
compensando el cambio de carga resultante de las posiciones
modificadas adicionalmente mediante modificaciones adicionales en
la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora. Estas
modificaciones adicionales incluyen, pero sin limitación, la
sustitución o inserción de un residuo que tiene una carga opuesta a
la del residuo adicional (añadir un residuo ácido adicional para
compensar un residuo básico adicional). De este modo, se contempla
que el número de residuos cargados en la variante de proteasa puede
ser diferente de la del precursor de la proteasa, por ejemplo,
cuando el número de residuos cargados es superior que en la
proteasa precursora. Para compensar el residuo cargado adicional, se
puede realizar una sustitución de los correspondientes aminoácidos
cargados de forma opuesta para mantener la misma carga
electrostática neta. Adicionalmente, el número de residuos cargados
en la variante de proteasa o enzima puede ser inferior que el
número de residuos cargados en la proteasa o enzima precursora si la
eliminación o sustitución de los correspondientes aminoácidos
cargados de forma opuesta de otro residuo no cargado cuando se
elimina o sustituye un residuo cargado por un residuo no
cargado.
La NEC o el pIo son idénticos, por ejemplo,
cuando el contenido de carga total de la variante de proteasa y la
proteasa precursora son el mismo; o cuando se mantiene el mismo
número de residuos cargados en la proteasa precursora. Cuando se
recoloca el aminoácidos cargado para mantener la NEC o pIo
idénticos, por los menos uno de estos aminoácidos cargados se
sustituye en una posición de residuo diferente de la de la proteasa
precursora. Si existe un número específico de aminoácidos cargados
específicos en la proteasa precursora, "X" lisinas en
Bacillus lentus en (GG36), entonces la variante de proteasa
conservará el mismo número de residuos de lisina, es decir,
"X", pero a diferentes posiciones en relación a la proteasa
precursora. De este modo, por ejemplo, K27 se puede sustituir con
un residuo diferente y la correspondiente L sustituida en otra
posición, preferiblemente una posición de la superficie. En una
realización, un residuo cargado, por ejemplo, ácido glutámico, ácido
aspártico, lisina o arginina se pueden sustituir en una posición
diferente. Para mantener la carga electrostática idéntica, el
residuo específico del precursor que se sustituye por el residuo
cargado, por ejemplo, residuo K de la posición 27, se puede
sustituir en la posición 27. Por ejemplo, un
R45N-N204R tiene posiciones de residuos idénticos
para mantener idéntica carga electrostática. Además, si el residuo
específico del precursor que se sustituye por el residuo cargado es
un residuo no cargado, otros residuos no cargados se pueden
sustituir en una posición que originalmente tiene un residuo
cargado. Por ejemplo, la combinación R170S-A1R
sustituye una alanina por una arginina, sustituyendo una arginina
por una serina. Naturalmente, si se realizan múltiples
modificaciones, se puede sustituir cualquier residuo sustituido en
cualquiera de otros residuos que se modifican, siempre y cuando se
mantenga el mismo número de cada aminoácido respectivo. La carga
electrostática se puede determinar a cualquier pH predeterminado,
siempre y cuando se haga la determinación en el mismo pH para la
variante de proteasa y la proteasa precursora.
Se puede mantener la misma carga electrostática
neta de la molécula compensando el cambio en la carga
electrostática neta resultante de la modificación de la proteasa
precursora. Por ejemplo, una manera de conseguir dicha alteración
es insertar o sustituir en un residuo de aminoácido adicional
cargado de manera opuesta o eliminar un residuo de aminoácido
cargado de forma similar, pero diferente. Si, por ejemplo, existen
más aminoácidos ácidos presentes en la variante de proteasa que en
la proteasa precursora, la variante incluirá aminoácidos básicos
adicionales. Si, por ejemplo, existen más de un aminoácido ácidos
específico, por ejemplo, ácido glutámico, presente en la variante
de proteasa que en la proteasa precursora, para compensar dichas
modificaciones, se podría eliminar o sustituir una cantidad
correspondiente de residuos de ácido aspártico por un aminoácido no
cargado. Por ejemplo, si existe un número específico de aminoácidos
cargados en la proteasa precursora, los inventores contemplan un
incremento o disminución del número de ese aminoácido en la variante
de proteasa con el correspondiente incremento o disminución en los
aminoácidos que compensan el cambio en el número de aminoácidos
cargados. De este modo, tal como se ha descrito anteriormente, los
residuos cargados positivamente adicionales se podrían compensar
mediante la adición de un número correspondiente de aminoácidos
cargados negativamente o la sustitución de un número
correspondiente de otros aminoácidos cargados positivamente por un
residuo no cargado o combinaciones de los mismos. Un número inferior
de residuos carados positivamente se podría compensar por la
eliminación de un número correspondiente de aminoácidos cargados
negativamente, la sustitución de un número correspondiente de
residuos no cargados por un número correspondiente de aminoácidos
cargados negativamente o combinaciones de los
mismos.
mismos.
En una realización, el mismo residuo de
aminoácido cargado que se sustituye por un residuo no cargado en la
primera posición de aminoácido se sustituye en la segunda posición
de aminoácidos donde está presente el mismo aminoácido no cargado
que sustituye el residuo cargado. Se puede sustituir un residuo no
cargado en la posición original del aminoácido cargado, mientras
que el aminoácido cargado sustituido puede sustituir la posición
del aminoácido no cargado. Por ejemplo, R45N-N204R
refleja la sustitución de un aminoácido no cargado, asparagina por
un aminoácido cargado, arginina. El mismo aminoácido no cargado
sustituido por el aminoácido cargado no necesita estar presente en
la posición en la que se reinserta el aminoácido cargado. Por
ejemplo, un aminoácido no cargado seleccionado del grupo de alanina
(Ala o A), glicina (Gly o G), asparaginas (Asn o N), prolina (Pro o
P), serina (Ser o S) y/o treonina (Thr o T) se puede sustituir en
la posición del aminoácido cargado mientras que el residuo de
aminoácido cargado se sustituye en una posición de aminoácido
ocupada originalmente por otro del grupo anterior. Por ejemplo, en
la variante E271T-G100E, el aminoácido ácido
glutámico en la posición 271 se sustituye por un aminoácido
treonina, mientras que un residuo de glicina en la posición 100 se
sustituye por un aminoácido ácido glutámico. Así mismo, el
aminoácido cargado idéntico no necesitar sustituirse en la posición
originalmente no cargada, por ejemplo K27T-G100E.
Los aminoácidos cargados ácido aspártico (D), ácido glutámico (E),
lisina (K) y arginina (R) son útiles en este aspecto.
En otro aspecto de la presente invención, la NEC
de la variante de proteasa varía menos de un intervalo de 0,5
unidades de carga (Z) de las de la NEC de la proteasa precursora
sobre el intervalo de pH de 0 a 14.
En otro aspecto de la invención, la NEC de la
variante de proteasa varía menos de un intervalo de 1 unidad de
carga de la de la NEC de la proteasa precursora sobre un intervalo
de pH definido. El intervalote pH definido puede ser, por ejemplo,
en 2 unidades de pH del conocido en la técnica como pH óptimo o
deseado para el medio deseado de la proteasa o enzima o en un
intervalo de 4 unidades de pH.
En otro aspecto de la invención, se ha
determinado que la modificación de los residuos cargados hallados
en la proteasa precursora manteniendo la misma o idéntica carga
electrostática neta puede dar lugar a una variante de proteasa que
muestra unas características de lavado beneficiosas mejoradas.
En otro aspecto de la invención, se ha
determinado que la modificación de los residuos cargados hallados
en la proteasa precursora manteniendo la misma o idéntica carga
electrostática neta a un pH definido, por ejemplo, sobre un
intervalo de 4 unidades de pH, o sobre el intervalo de pH de 0,001 a
14 puede dar lugar a una variante de proteasa que muestra unas
características de lavado beneficiosas mejoradas.
Los residuos de aminoácidos cargados de ejemplo
contemplados para la modificación por los inventores incluyen, por
ejemplo, aminoácidos básicos, tales como lisina, arginina y/o
histidina; aminoácidos ácidos, por ejemplo, ácido aspártico y/o
ácido glutámico; y/o en cualquier caso, grupos R polares, por
ejemplo, tirosina.
Las variantes de proteasas de la presente
invención pueden tener, en relación a dicha proteasa precursora, el
mismo número de residuos de aminoácidos cargados positivamente,
tanto los aminoácidos idénticos que en la proteasa precursora como
diferentes aminoácidos que tienen la misma carga, y el mismo número
de residuos de aminoácidos cargados negativamente que en la
proteasa precursora; o más o menos residuos de aminoácidos cargados
positivamente y correspondientemente más o menos residuos de
aminoácidos cargados negativamente, de manera que la carga
electrostática neta y/o el punto isoeléctrico de la variante de
proteasa son los mismos que la proteasa
precursora.
precursora.
Las variantes de proteasas de la presente
invención pueden tener, en relación a dicha proteasa precursora, el
mismo número de residuos de aminoácidos cargados positivamente,
tanto los aminoácidos idénticos que en la proteasa precursora como
diferentes aminoácidos que tienen la misma carga, y el mismo número
de residuos de aminoácidos cargados negativamente que en la
proteasa precursora; o más o menos residuos de aminoácidos cargados
positivamente y correspondientemente más o menos residuos de
aminoácidos cargados negativamente, de manera que la carga
electrostática neta y/o el punto isoeléctrico de la variante de
proteasa son los mismos que la proteasa precursora. Se observó que
un incremento en el número de residuos cargados positivamente
mediante la sustitución de los mismos puede dar lugar a un
incremento en la eficacia de esa variante concreta en un medio de
lavado concreto, mientras que un cambio de la correspondiente carga
opuesta puede dar lugar a un aumento de la eficacia en un medio de
lavado diferente. Por ejemplo, se anticipa que mutaciones de cargas
negativas proporcionan características beneficiosas en medios de
lavado de fuerza iónica baja. Se anticipa que variantes comprenden
tanto un incremento positivo como un incremento negativo manteniendo
la misma carga electrostática neta o punto isoeléctrico dará lugar
a una molécula de proteasa que muestra mejores características en
ambos medios en comparación con el rendimiento de la proteasa
precursora.
Estas sustituciones se realizan en subtilisina
de Bacillus lentus (recombinante o tipo nativo).
La variante de proteasa puede comprender además
por lo menos un aminoácidos sustituido adicional en una o más
posiciones de residuo equivalentes a las posiciones de residuo
seleccionadas del grupo que consiste en 1, 2 - 4, 6,
9-12, 14, 15, 17-20, 25, 27,
36-38, 40, 44, 49, 51, 52, 54-61,
68, 71, 75, 76, 87, 89, 91, 97, 100-102, 104, 108,
111, 112, 115, 117, 118, 120-123, 128, 129, 131,
133, 134, 136, 137, 140, 143-146, 159, 164, 165,
167, 171, 173, 175, 180, 182-187, 191, 192, 194,
195, 204, 206, 209-212, 216, 218, 222, 224, 226
234-245, 252, 255, 257-263 265, 268,
269, y 274. Las sustituciones específicas contempladas por los
inventores incluyen aquellas equivalentes a: I122A, Y195E, M222A,
M222S, Y167A, R170S, A194P, D36, N76D, H120D, G195E, y K235N de
subtilisina de Bacillus lentus.
De particular interés son las variantes en estas
posiciones que demuestran un mayor rendimiento de lavado con la
sustitución de un aminoácido cargado. La combinación de variantes
que incluyen estas posiciones y las que tienen originalmente un
aminoácido cargado es de interés.
Los expertos en la material entenderán que las
variantes de proteasas que tienen estas modificaciones se pueden
realizar y se describen en las Patentes de Estados Unidos 5,741,694;
6,190,900; y 6,197,567. Además, estas modificaciones también se
pueden realizar utilizando métodos de transformación directa de
Bacillus tal como se describe en la Solicitud Provisional Ser. No.
60/423,087 (solicitada el 1 de noviembre, 2002; Neelam Amin y
Volker Schellenberger). En una realización, se realizaron
modificaciones utilizando técnicas PCR de fusión (Teplyakov, AV,
et al, Protein Eng., 1992 Jul 5 (5):
413-20).
Los números de posición de los aminoácidos
especificados se refieren a los asignados a la secuencia de
subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens presentada
en la figura 1. La presente invención, sin embargo, no está
dirigida a la mutación de esta subtilisina concreta.
En cambio, la proteasa precursora es subtilisina
de Bacillus lentus (SEC Id No. 6) y se realizan las
sustituciones en las posiciones de los residuos de aminoácidos
equivalentes correspondientes a los indicados anteriormente.
Una posición de residuo (aminoácido) de una
proteasa precursora es equivalente a un residuo de subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens si es homóloga (es decir, que
corresponde en posición en la estructura primaria) a un residuo
específico en subtilisina de Bacillus amyloiquefaciens.
Con el fin de establecer homología con la
estructura primaria, se compara directamente la secuencia de
aminoácidos de una proteasa precursora con la secuencia primaria de
subtilisina de Bacillus amyloiquefaciens y, particularmente,
a un conjunto de residuos conocidos por ser invariables en
subtilisina cuya secuencia es conocida. Por ejemplo, la figura 2 de
la presente invención muestra los residuos conservados entre la
subtilisina de B. amyloiquefaciens y subtilisina de B.
lentus, después de alinear los residuos conservados, permitiendo
las inserciones y deleciones necesarias con el fin de mantener la
alineación (es decir, evitando la eliminación de residuos
conservados a través de la deleción e inserción arbitraria), se
definen los residuos equivalentes a aminoácidos concretos en la
secuencia primaria de subtilisina de Bacillus
amyloiquefaciens. La alineación de residuos conservados debería
concervar preferiblemente un 100% de dichos residuos. Sin embargo,
la alineación de más de un 98%, más de un 95%, más de un 90%, más
de un 85%, más de un 80%, más de un 75%, más de un 50%, o por lo
menso más de un 45% de los residuos conservados también es adecuada
para definir los residuos equivalentes. Debería mantenerse la
conservación de la triada catalítica Asp32/His64/Ser221. Siezen
et al. (1991) Protein Eng. 4 (7): 719-737
muestra la alineación de un gran número de serín proteasas. Siezen
et al. se refieren al agrupamiento como subtilasas o serín
proteasas de tipo
subtilisina.
subtilisina.
Por ejemplo, en la figura 3, las secuencias de
aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis
(carlsbergensis) y Bacillus lentus se alinea para
proporcionar la máxima cantidad de homología entre las secuencias
de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que
existe un conjunto de residuos conservados contenidos en cada
secuencia. Estos residuos conservados (como entre BPN' y B.
lentus) se identifican en la figura 2.
De este modo, estos residuos conservados se
pueden utilizar para definir los correspondientes residuos de
aminoácidos equivalentes de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens en subtilisina de Bacillus lentus
(Publicación PCT No. WO89/06279 publicada el 13 de Julio de
1989).
Las secuencias de aminoácidos de ciertas
subtilisinas se alinean en las figuras 3A y 3B con la secuencia de
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para producir la
máxima homología de residuos conservados. Tal como se puede
observar, existe un conjunto de deleciones en la secuencia de
Bacillus lentus en comparación con la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens. De este modo, por ejemplo, el
aminoácido equivalente para Val165 en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens en las otras subtilisinas es isoleucina para
B. lentus y B. licheniformis.
Algunos de los residuos identificados para la
sustitución son residuos conservados, mientras que otros no lo
están. En el caso de residuos que no están conservados, la
sustitución de uno o más aminoácidos se limita a sustituciones que
producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no
corresponde con la hallada en la naturaleza. En el caso de residuos
conservados, dichas sustituciones no deberían dar lugar a la
secuencia natural. Las variantes de proteasas de la presente
invención incluyen las formas maduras de variantes de proteasa, así
como las formas pro- y prepro- de dichas variantes de proteasa. Las
formas prepro- son la construcción preferida ya que facilita la
expresión, secreción y maduración de las variantes de proteasas.
"Prosecuencia" se refiere a una secuencia
de aminoácidos unida a la parte N-terminal de la
forma madura de una proteasa, que cuando se elimina da lugar a la
aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas
proteolíticas se encuentran en la naturaleza como productos de
proenzima traduccionales y, en ausencia de procesado
post-traduccional, se expresan de esta manera. Una
prosecuencia preferida para la producción de variantes de proteasas
es la supuesta prosecuencia de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens, aunque se pueden utiliza otras prosecuencias
de proteasa.
Una "secuencia señal" o "presecuencia"
se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos unida a la parte
N-terminal de una proteasa o a la parte
N-terminal de una preproteasa que puede participar
en la secreción de las formas madura o pro de la proteasa. Esta
definición de secuencia señal es funcional, y significa que incluye
todas las secuencias de aminoácidos codificadas por la parte
N-terminal del gen de proteasa que participan en la
realización de la secreción de la proteasa en condiciones nativas.
La presente invención utiliza dichas secuencias para realizar la
secreción de las variantes de proteasas tal como se define en la
presente invención. Una posible secuencia señal comprende los
primeros siete residuos de aminoácidos de la secuencia señal de
subtilisina de Bacillus subtilis fusionados a los restantes
de la secuencia señal de la subtilisina de Bacillus lentus
(ATCC 21536).
Una forma "prepro" de una variante de
proteasa consiste en la forma madura de la proteasa que tiene una
prosecuencia unida operativamente al extremo amino de la proteasa y
una secuencia "pre" o "señal" unida operativamente al
extremo amino de la prosecuencia.
"Vector de expresión" se refiere a una
construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN que está
unidad operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de
realizar la expresión de dicho ADN en un huésped adecuado. Dichas
secuencias de control incluyen un promotor para realizar la
transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar
dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a
ribosoma de ARNm adecuados y secuencias que controlan la
terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede
ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un potencial
inserto genómico. Una vez se transforma en una huésped adecuado, el
vector se puede replicar y funcionar independientemente del genoma
huésped, o puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma.
En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se utilizan
a menudo indistintamente ya que el plásmido es la forma más
habitualmente utilizada de vector en la actualidad. Sin embargo, la
presente invención pretende incluir otras formas de vectores de
expresión que realizan funciones equivalentes y que son conocidas o
se conocerán en la técnica.
Las "células huésped" utilizadas en la
presente invención en general son huéspedes procariotas o eucariotas
que preferiblemente se han manipulado mediante los métodos
descritos en la Patente de Estados Unidos RE 34,606 y/o la Patente
de Estados Unidos 5,441,882 para volverlos incapaces de secretar
endoproteasa enzimáticamente activa. Una célula huésped útil para
expresar proteasa es la cepa de Bacillus BG2036 que es deficiente en
proteasa neutra enzimáticamente activa y proteasa alcalina
(subtilisina). La construcción de la cepa BG2036 se describe en
detalle en la Patente de Estados Unidos 5,264,366. Otras células
huésped para expresar proteasas incluyen Bacillus subtilis
I168 (también descrita en la Patente de Estados Unidos RE 34,606,
Patente de Estados Unidos 5,441,882 y Patente de Estados Unidos
5,264,366), así como cualquier cepa de Bacillus adecuada, tal como
B. licheniformis, B. lentus, etc. Una célula huésped
particularmente útil es la cepa de Bacillus BG2864. La construcción
de la cepa BG2864 se describe en detalle en D. Naki, C. Paech, G.
Ganshaw, V. Schellenberger. Appl Microbiol Biotechnol (1998) 49:
290-294.
Las células huésped se transforman o transfectan
con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante.
Dichas células huésped transformadas son capaces de replicar
vectores que codifican las variantes de proteasa o expresar la
variante de proteasa deseada. En el caso de vectores que codifican
la forma pre- o prepro- de la variante de proteasa, dichas
variantes, cuando se expresan, se secretan habitualmente a partir
de la célula huésped en el medio de la célula huésped.
"Unida operativamente", cuando describe la
relación entre dos regiones de ADN, simplemente significa que están
funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, una presecuencia
está unida operativamente a un péptido si actúa como secuencia
señal, participando en la secreción de la forma madura de la
proteína que está implicada más probablemente en la división de la
secuencia señal. Un promotor está unido operativamente a una
secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia;
un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una
secuencia codificante si se sitúa para permitir la traducción.
Los genes que codifican la proteasa precursora
natural se pueden obtener según los métodos generales conocidos por
los expertos en la materia. Los métodos comprenden generalmente
sintetizar sondas marcadas que tienen supuestas secuencias que
codifican regiones de la proteasa de interés, la preparación de
bibliotecas genómicas a partir de organismos que expresan la
proteasa y el cribado de las bibliotecas por el gen de interés
mediante la hibridación a las sondas. A continuación, los clones que
se hibridan de forma positivan se mapean y secuen-
cian.
cian.
A continuación, la proteasa clonada se utiliza
para transformar una célula huésped con el fin de expresar la
proteasa. El gen de proteasa se liga a continuación en plásmidos con
un alto número de copias. Este plásmido se replica en huéspedes en
el sentido de que contiene los elementos conocidos necesarios para
la replicación del plásmido: un promotor unido operativamente al
gen en cuestión (que se puede suministrar como el propio promotor
homólogo del gen si es reconocido, es decir, transcrito, por el
huésped), una terminación de la transcripción y la región de
poliadenilación (necesaria para la estabilidad del ARNm transcrito
por el huésped del gen de proteasa en ciertas células huésped
eucariotas) que es exógena o es suministrada por la región
terminadora endógena del gen de proteasa y, deseablemente, un gen
de selección, tal como un gen de resistencia a antibiótico que
permite el mantenimiento continuo del cultivo de células huésped
infectadas por plásmido mediante el crecimiento en medio que
contiene antibiótico. Los plásmido con un alto número de copias
también contienen un origen de replicación para el huésped,
permitiendo así que se generen amplias cantidades de plásmido en el
citoplasma sin limitaciones cromosómicas. Sin embargo, se encuentra
en el alcance de la presente invención integrar múltiples copias
del gen de proteasa en el genoma huésped. Esto se facilita mediante
organismos procariotas y eucariotas que son particularmente
susceptibles a recombinación homóloga.
El gen puede ser un gen de B. lentus
natural. Alternativamente, se puede producir un gen sintético que
codifica una proteasa precursora natural o mutante. En dicha
aproximación, se determina el ADN y/o la secuencia de aminoácidos
de la proteasa precursora. Los múltiples fragmentos de ADN
sintéticos solapantes de de cadena sencilla se sintetizan a
continuación, que tras la hibridación y la unión producen ADN
sintético que codifica la proteasa precursora. Un ejemplo de
construcción de gen sintético se indica ene l ejemplo 3 de la
Patente de Estados Unidos
5,204,015.
5,204,015.
Una vez se ha clonado el gen de la proteasa
precursora natural o sintética, se realizan una serie de
modificaciones para aumentar el uso del gen más allá de la síntesis
de la proteasa precursora natural. Dichas modificaciones incluyen
la producción de proteasas recombinantes tal como se describe en la
Patente de Estados Unidos RE 34,606; 5,741,694; 6,190,900;
6,197,567; 5,972,682; 5,185,258; 5,700,676 y Publicación EPO No. 0
251 446 y la producción de variantes de proteasas descritas en la
presente invención.
El siguiente métodos de mutagénesis de cassette
se puede utilizar para facilitar la construcción de las variantes
de proteasas de la presente invención, aunque se pueden utilizar
otros métodos. En primer lugar, el gen natural que codifica la
proteasa se obtiene y se secuencia total o parcialmente. A
continuación, se rastrea la secuencia por un punto en el que se
desea hacer una mutación (deleción, inserción o sustitución) de uno
o más aminoácidos en la enzima codificada. Las secuencias que
flanquean este punto se evalúan por la presencia de sitios de
restricción para sustituir un segmento corto del gen por un grupo de
oligonucleótidos que cuando se expresan codificará varios mutantes.
Dichos sitios de restricción son preferiblemente sitios únicos en
el gen de proteasa para facilitar la sustitución del segmento del
gen. Sin embargo, se puede utilizar cualquier sitio de restricción
adecuado que no sea demasiado redundante en el gen de proteasa,
siempre que los fragmentos de generados mediante digestión por
restricción se puedan reensamblar en la secuencia más adecuada. Si
los sitios de restricción no están presentes en los puntos en una
distancia adecuada desde el punto seleccionado (de 10 a 15
nucleótidos), dichos sitios se generan sustituyendo nucleótidos en
el gen, de manera que ni el marco de lectura ni los aminoácidos
codificados se cambian en la construcción final. La mutación del gen
con el fin de cambiar su secuencia para conformar la secuencia
deseada se realiza mediante la extensión del cebador M13 según los
métodos generalmente conocidos. La tarea de localizar regiones
flanqueantes adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar
a dos secuencias de sitios de restricción adecuadas se realiza por
rutina mediante la redundancia del código genético, un mapa de
enzimas de restricción del gen y un amplio número de diferentes
enzimas de restricción. Cabe indicar que si está disponible un sitio
de restricción flanqueante conveniente, el método anterior necesita
utilizarse sólo en relación a la región flanqueante que no contiene
un
sitio.
sitio.
Una vez se ha clonado el ADN natural o el ADN
sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones a
mutar se digieren con las enzimas de restricción afines y un
conjunto de cassettes de oligonucleótidos complementarios
terminales se ligan en el gen. La mutagénesis se simplifica mediante
este método, ya que todos los oligonucleótidos se pueden sintetizar
para tener los mismos sitios de restricción y no son necesarios
enlazadores sintéticos para crear los sitios de restricción.
Las variantes de proteasas expresadas tras la
transformación de los huéspedes adecuados se pueden cribar por
enzimas aislados o recuperados que muestras las características
deseadas, por ejemplo, mejor rendimiento de lavado, especificidad
de sustrato, estabilidad a la oxidación, perfiles de actividad de pH
y similares.
Tal como se utiliza en la presente invención,
actividad proteolítica se define como el grado de hidrólisis de
enlaces peptídicos por miligramo de enzima activa. Existen muchos
procedimientos conocidos para medir la actividad proteolítica (K.
M. Kalisz, "Microbial Proteinases," Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed., 1988). Otros métodos de
ejemplo para determinar la actividad proteolítica incluyen los
diversos ensayos espectrofotométricos que miden la conversión de
sustratos seleccionados indirectamente mediante la medición del
cambio en la absorción mediante la proteasa añadida a una
concentración predeterminada de sustrato. Los sustratos de ejemplo
incluyen dimetil caseína,
succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA,
y queratina (Véase la Patente de Estados Unidos No.
60/344,702).
\newpage
Además o alternativamente a la actividad
proteolítica modificada, las variantes de enzimas de la presente
invención pueden presentar otras propiedades modificadas, tales como
Km, kcat, relación kcat/Km y/o especificidad de sustrato modificada
y/o perfil de actividad de pH modificado. Estas enzimas se pueden
ajustar al sustrato concreto que se anticipa para que esté
presente, por ejemplo, en la preparación de péptidos o para procesos
hidrofóbicos, tales como usos en lavandería.
Se puede definir un cambio en la especificidad
de sustrato como la diferencia entre la relación de kcat/Km de la
enzima precursora y la del mutante. La relación kcat/Km es una
medida de la eficacia catalítica. Las carbonil hidrolasas
procariotas con mayor o menor relación de kcat/Km se describen en
los ejemplos. En general, el objetivo será asegurar un mutante que
tenga una mayor relación kcat/Km (más elevada numéricamente) para
un sustrato determinado, permitiendo así el uso de la enzima para
actuar más eficazmente en un sustrato diana. Un incremento en la
relación de kcat/Km para un sustrato puede estar acompañado por una
reducción en la relación de kcat/Km para otro sustrato. Esto es un
cambio en la especificidad de sustrato y los mutantes que muestran
dichos cambios son útiles cuando los precursores no son deseables,
por ejemplo, para evitar una hidrólisis no deseada de un sustrato
concreto en una mezcla de sustratos.
kcat y Km se pueden medir según procedimientos
conocidos o tal como se describe en el ejemplo 18 de la Patente de
Estados Unidos No. 5,441,882.
La estabilidad a la oxidación es un objetivo
adicional que se puede llevar a acabo por la variante de proteasa
descrita en los ejemplos. La estabilidad puede aumentar o disminuir
según se desee para varios usos. Una mayor estabilidad se puede
conseguir mediante la eliminación de uno o más residuos de
metionina, triptófano, cisteína o lisina y, opcionalmente,
sustituyendo otros residuo de aminoácido que no es metionina,
triptófano, cisteína o lisina. Las sustituciones opuestas dan lugar
a una menor estabilidad a la oxidación. El residuo sustituido puede
ser alanilo, pero también son adecuados residuos neutros.
La estabilidad, por ejemplo, la
termoestabilidad, es un objetivo adicional que se puede lleva a cabo
por la variante de proteasa descrita en los ejemplos. La
estabilidad se puede aumentar o disminuir según se desee para
varios usos. Una mayor estabilidad se puede conseguir mediante la
sustitución de uno o más residuos identificados en la presente
solicitud y, opcionalmente, sustituyendo otro residuo de aminoácido
que no sean éstos. La termoestabilidad mantiene la actividad
enzimática con el tiempo a una temperatura determinada. Una mayor
termoestabilidad implica el mantenimiento de una mayor cantidad de
actividad enzimática por la variante en comparación con la proteasa
precursora. Por ejemplo, se mide un mayor nivel de actividad
enzimática de la variante en comparación con el precursor a una
temperatura determinada, habitualmente la temperatura de
trabajo.
Las variantes de proteasas descritas en la
presente invención pueden mostrar una mejor rendimiento de lavado
en condiciones de lavado específicas. Por ejemplo, las variantes de
proteasas pueden mostrar un rendimiento de lavado diferente en
diferentes condiciones de lavado, por ejemplo, temperatura, dureza
del agua y/o concentraciones de detergente tal como se indica por
el rendimiento determinado mediante varios ensayos conocidos en la
técnica, por ejemplo, WO 99/34011 ("An Improved Method of Assaying
for a Preferred enzyme and/or Preferred Detergent composition.",
publicada el 8 de julio de 1999).
En el caso de subtilisina de Bacillus o sus
formas pre, prepro y pro, las mutaciones en las posiciones
descritas anteriormente producen mutantes que presentan cambios en
las características descritas anteriormente o en el procesado de la
enzima. Cabe indicar que estos números de posiciones de aminoácidos
son los asignados a la subtilisina de B. amyloliquefaciens
mostrada en la Fig. 1. Debe entenderse que una deleción o inserción
en la dirección N-terminal a partir de una posición
determinada desplazará las posiciones de aminoácido relativas, de
manera que un residuo no ocupará su posición numérica original o de
tipo salvaje. Además, las diferencias alélicas y la variación ente
varias especies procariotas darán lugar a desplazamientos de las
posiciones, de manera que la posición 169 en dichas subtilisinas no
serán ocupadas por glicina. En dichos casos, las nuevas posiciones
para glicina se considerarán equivalentes y comprendidas en la
designación glicina+169. La nueva posición para glicina+169 se
identifica fácilmente mediante el rastreo de la subtilisina en
cuestión para una región homóloga a glicina+169 en la figura 1.
Se pueden mutar uno o más, habitualmente hasta
aproximadamente 10, residuos de aminoácidos. Sin embargo, no existe
un límite en el número de mutaciones que deben realizarse a parte de
considerar la práctica comercial.
Las enzimas de la presente invención se pueden
obtener como sales. Está claro que el estado de ionización de una
proteína dependerá del pH del medio circundante, si está en
solución, o de la solución a partir de la que se prepara, si está
en forma sólida. Se preparan habitualmente proteínas ácidas como,
por ejemplo, las sales de amonio, sodio o potasio; proteínas
básicas, tales como cloruros, sulfatos o fosfatos. Por consiguiente,
la presente solicitud incluyen tanto formas eléctricamente neutras
como sales de las variantes de proteasas designadas y el término
proteasa se refiere al esqueleto orgánico estructural
independientemente del estado de ionización.
Las variantes de proteasa son particularmente
útiles en el procesado de alimentos y en la limpieza. Las carbonil
hidrolasas, incluyendo variantes de proteasas y proteasas
precursoras, se producen mediante fermentación tal como se ha
descrito en la presente invención y se recuperan mediante técnicas
adecuadas. Véase, por ejemplo, K. Anstrup, 1974, índustrial Aspects
of Biochemistry, ed. B. Spencer pp. 23-46.
En un aspecto de la presente invención, el
objetivo es asegurar que una variante de proteasa tenga una
rendimiento de lavado alterado, preferiblemente mejorado, en
comparación con una proteasa precursora en por lo menos una
formulación de detergente y/o bajo por lo menso un conjunto de
condiciones de lavado. Se formulan con detergentes y otros
tensoactivos según métodos conocidos per se para su uso en
procesos industriales, especialmente lavandería. En el último caso,
las enzimas se combinan con detergentes, reforzadores (builders),
lejía y/o agentes blanqueadores fluorescentes conocidos en la
técnica para enzimas proteolíticas. Entre los detergentes adecuados
se incluyen alquil benceno sulfonatos lineales, alquil sulfato
etoxilado, alcohol lineal sulfatado o alcohol lineal etoxilado. Las
composiciones se pueden formular en forma granular o líquida. Véase,
por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 3,623,957; 4,404,128;
4,381,247; 4,404,115; 4,318,818; 4,261,868; 4,242,219; 4,142,999;
4,111,855; 4,011,169; 4,090,973; 3,985,686; 3,790,482; 3,749,671;
3,560,392; 3,558,498; y 3,557,002.
Existe un conjunto de condiciones de lavado,
incluyendo formulaciones de detergente variantes, volumen de lavado
de agua, temperatura de agua de lavado y longitud de del tiempo de
lavado a las que se puede exponer una variante de proteasa. Por
ejemplo, las formulaciones de detergente utilizadas en diferentes
áreas tienen concentraciones diferentes de sus componentes
pertinentes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, un
detergente europeo contiene habitualmente aproximadamente
3000-8000 ppm de componentes de detergente en el
agua de lavado, mientras que un detergente japonés contiene
habitualmente menos de 800 ppm, por ejemplo 667 ppm de componentes
de detergente en el agua de lavado. En Norteamérica, concretamente
en los Estados Unidos, un detergente contiene habitualmente
aproximadamente de 800 a 2000 ppm, por ejemplo 975 ppm de
componentes de detergente presentes en el agua de lavado.
Un sistema con una concentración baja de
detergente incluye detergentes en los que están presentes menos de
aproximadamente 800 ppm de componente del detergente en el agua de
lavado. Los detergentes japoneses se consideran habitualmente como
un sistema con una concentración baja de detergente, ya que
presentan aproximadamente 667 ppm de componentes del detergente
presentes en el agua de lavado.
Una concentración media de detergente incluye
detergentes en los que están presentes ente aproximadamente 800 ppm
y aproximadamente 2000 ppm de componentes del detergente en el agua
de lavado. Los detergentes norteamericanos estás considerados
generalmente como sistemas con una concentración media de
detergente, ya que tienen aproximadamente 975 ppm de componentes
del detergente presentes en el agua de lavado. Brasil tiene
habitualmente aproximadamente 1500 ppm de componentes del
detergente presentes en el agua de lavado.
Un sistema con una concentración elevada de
detergente incluye detergentes en los que están presentes más de
aproximadamente 2000 ppm de componentes del detergente en el agua de
lavado. Los detergentes europeos se consideran habitualmente como
un sistema con una concentración elevada de detergente, ya que
presentan aproximadamente 3000-8000 ppm de
componentes del detergente presentes en el agua de lavado.
Los detergentes latinoamericanos son
generalmente detergentes con detergentes con reforzadores de fosfato
con elevada espuma de jabón y el rango de detergentes utilizados en
Latinoamérica puede encontrarse tanto en concentraciones medias
como elevadas de detergente, ya que varían desde 1500 ppm hasta 6000
ppm de componentes del detergente en el agua de lavado. Tal como se
ha mencionado anteriormente, Brasil habitualmente utiliza
aproximadamente 1500 ppm de componentes del detergente presentes en
el agua de lavado. Sin embargo, otras puntos geográficos de
detergentes con reforzadores de fosfato con elevada espuma de jabón,
no limitadas a otros países latinoamericanos, pueden tener sistemas
con una concentración elevada de detergente de hasta
aproximadamente 6000 ppm de componentes del detergente presentes en
el agua de lavado.
En vista de lo anterior, es evidente que las
concentraciones de composiciones de detergente en soluciones de
lavado habituales a lo largo del mundo varían desde menos de
aproximadamente 800 ppm de composición de detergente ("puntos
geográficos con concentración baja de detergente"), por ejemplo,
aproximadamente 667 ppm en Japón, hasta ente aproximadamente 800
ppm y 2000 ppm ("puntos geográficos con concentración media de
detergente"), por ejemplo aproximadamente 975 ppm en EEUU y 1500
ppm en Brasil, hasta más de aproximadamente 2000 ppm ("puntos
geográficos con concentración elevada de detergente"), por
ejemplo de aproximadamente 4500 ppm a aproximadamente 5000 ppm en
Europa y aproximadamente 6000 ppm en puntos geográficos con
reforzadores de fosfato con elevada espuma de jabón.
Las concentraciones de las soluciones de lavado
habituales se determinan empíricamente. Por ejemplo, en los EEUU,
una máquina de lavado habitual contiene un volumen de
aproximadamente 64,4 L de solución de lavado. Por consiguiente, con
el fin de obtener una concentración de aproximadamente 975 ppm de
detergente en la solución de lavado, deben añadirse aproximadamente
62,79 g de composición de detergente a los 64,4 L de solución de
lavado. Esta cantidad es la cantidad habitual medida en el agua de
lavado por el consumidor utilizando la copa de medición
proporcionada con el detergente.
Como ejemplo adicional, diferentes puntos
geográficos utilizan diferentes temperaturas de lavado. La
temperatura del agua de lavado en Japón es inferior habitualmente a
la utilizada en Europa. Por ejemplo, la temperatura en el agua de
lavado europea es generalmente del orden de 30 a 50 grados
centígrados, habitualmente aproximadamente 40 grados centígrados.
La temperatura en el agua de lavado de Norteamérica y/o Japón es
generalmente inferior al agua de lavado europea, por ejemplo del
orden de 10 a 30 grados centígrados, habitualmente aproximadamente
de 20 grados centígrados.
Como ejemplo adicional, diferentes puntos
geográficos utilizan diferente dureza del agua. La dureza del agua
se describe habitualmente como granos por galón de
Ca^{2}+/Mg^{2+} mezclados. La dureza es una medida de la
cantidad de calcio 8Ca^{2+}) y magnesio (Mg^{2+}) en el agua. La
mayoría del agua en los Estados Unidos es dura, pero el grado de
dureza varía. El agua moderadamente dura (60-120
ppm) a dura (121-181 ppm) tiene de 60 a 181 partes
por millón (partes por millón convertido a granos por galón US es
ppm # dividido por 17,1 igual a granos por galón) de minerales para
la dureza.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La dureza del agua europea es habitualmente
10-20 granos por galón de Ca^{2+}/Mg^{2+}
mezclados, por ejemplo, aproximadamente 15 granos por galón de
Ca^{2+}/Mg^{2+} mezclados. La dureza del agua en Norteamérica es
habitualmente superior a la dureza del agua japonesa, pero inferior
a la dureza del agua europea, por ejemplo, entre 3 y 10 granos,
3-8 granos o aproximadamente 6 granos. La dureza del
agua japonesa es habitualmente inferior a la dureza del agua
nortemericana, habitualmente inferior a 4, por ejemplo, 3 granos por
calón de Ca^{2+}/Mg^{2+} mezclados.
Por consiguiente, un aspecto de la presente
invención incluye una variante de proteasa que muestra una mejor
rendimiento de lavado en por lo menos un conjunto de condiciones de
lavado. Otro aspecto de la presente invención incluye una variante
de proteasa que muestra una mejor rendimiento de lavado en más de
una condición de lavado, por ejemplo, en condiciones europeas,
japonesas o norteamericanas.
En base a los resultados del cribado obtenidos
con las variantes de proteasas, las mutaciones indicadas en
subtilisina de Bacillus son importantes en la actividad
proteolítica, el rendimiento y/o estabilidad de estas enzimas y el
rendimiento de la limpieza o el lavado de dichas variantes de
enzimas.
Muchas de estas variantes de proteasa de la
presente invención son útiles en la formulación de varias
composiciones de detergente o formulaciones para el cuidado persona,
tales como champús o lociones. Un conjunto de compuestos conocidos
son tensoactivos adecuados útiles en composiciones que comprenden
los mutantes de proteasas de la invención. Éstos incluyen
detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos o zwitteriónicos, tal
como se describe en US 4,404,128 de Barry J. Anderson y US 4,261,868
de Jiri Flora, et al. Una formulación de detergente adecuada
es la descrita en el Ejemplo 7 de la Patente de Estados Unidos
5,204,015.
La técnica es familiar con las diferentes
formulaciones que se pueden utilizar como composiciones de
limpieza. Además de las habituales composiciones de limpieza, se
comprende fácilmente que las variantes de proteasas de la presente
invención se pueden utilizar para cualquier objetivo en que se
utilicen proteasas nativas o de tipo salvaje. De este modo, se
pueden utilizar estas variantes, por ejemplo, en aplicaciones de
pastillas de jabón o jabón líquido, formulaciones para lavar los
platos, soluciones o productos para limpiar las lentes de contacto,
hidrólisis de péptidos, tratamiento de residuos, aplicaciones
textiles, como enzimas de división por fusión en la producción de
proteínas, etc. Las variantes de la presente invención pueden
comprender un mayor rendimiento en una composición de detergente
(en comparación con el precursor). Tal como se utiliza en la
presente invención, un mayor rendimiento en un detergente se define
como el incremento del lavado de ciertas manchas sensibles a
enzimas, tales como hierba o sangre, determinada mediante evaluación
visual después de un ciclo de lavado estándar.
\newpage
Las proteasas de la presente invención se pueden
formular en detergentes en polvo o líquidos conocidos que tienen un
pH entre 6,5 y 12,0 a niveles de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 5% (preferiblemente 0,1% a 0,5%) en peso. Estas
composiciones de limpieza detergentes también pueden incluir otras
enzimas, tales como proteasas, amilasas, celulasas, lipasas o
endoglicosidasas conocidas, así como reforzadores y
estabilizantes.
La adición de proteasas de la presente invención
a composiciones de limpieza convencionales no crea ninguna
limitación especial de uso. En otras palabras, cualquier temperatura
y pH adecuados para el detergente es también adecuado para las
presentes composiciones, siempre y cuando el pH se encuentre en el
intervalo anterior, y la temperatura por debajo de la temperatura
de desnaturalización de proteasa descrita. Además, las proteasas de
la presente invención se pueden utilizar en una composición de
limpieza sin detergentes, de nuevo solas o en combinación con
reforzadores y estabilizantes.
La presente invención también se refiere a
composiciones de limpieza que contienen las variantes de proteasa
de la presente invención. Las composiciones de limpieza pueden
contener adicionalmente aditivos que se utilizan habitualmente en
composiciones de limpieza. Éstos se pueden seleccionar entre, pero
sin limitación, agentes blanqueadores, reforzadores, enzimas y
catalizadores blanqueadores. Sería fácilmente evidente para un
experto en la materia saber que aditivos son adecuados para la
inclusión en las composiciones. La lista proporcionada aquí no
pretende ser exhaustiva y sólo debería tomarse como ejemplo de
aditivos adecuados. También será fácilmente evidente para un
experto en la materia utilizar aquellos aditivos que son compatibles
con las enzimas y otros componentes en la composición, por ejemplo,
tensoactivo.
Cuando está presente, la cantidad de aditivo
presente en la composición de limpieza es de aproximadamente 0,01%
a aproximadamente 99,9%, preferiblemente de aproximadamente 1% a
aproximadamente 95%, más preferiblemente de aproximadamente 1% a
aproximadamente 80%.
Las variantes de proteasas de la presente
invención se pueden incluir en alimentación animal, tal como parte
de los aditivos de la alimentación animal, tal como se describe en,
por ejemplo, US 5,612,055; US 5,314,692; y US 5,147,642.
Una composición para el tratamiento de un tejido
puede incluir variantes de proteasa de la presente invención, La
composición se puede utilizar para tratar, por ejemplo, seda o lana,
tal como se describe en publicaciones, tales como RE 216,034; EP
134,267; US 4,533,359; y EP 344,259.
Los siguientes ejemplos se presentan a modo de
ejemplo y no deben interpretarse como una limitación del alcance de
las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se produjeron un gran número de variantes de
proteasa y se purificaron utilizando procedimientos bien conocidos
en la técnica. Todas las mutaciones se realizaron en subtilisina
GG36 de Bacillus lentus. En la Tabla 1 se muestran las
variantes. Algunas de estas son variantes de la invención. Se
proporcionan otras con propósito ilustrativo.
Para construir las bibliotecas saturadas de
sitio GG36 y variantes específicas de sitio, se realizaron tres
reacciones de PCR: dos PCRs para introducir el codón mutado de
interés en GG36 y una PCR de fusión para construir el vector de
expresión que incluye la mutación o mutaciones deseadas.
Se numeran los codones de GG36 de interés según
la numeración de BPN' (enumerados en las Figuras
1A-C y 3A-B).
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de mutagénesis se basó en la
estrategia de mutaciones de región específica (Teplyakov et
al., 1992) en la cual se realizó la creación de todas las
posibles mutaciones a la vez en un codón de ADN específico
utilizando un conjunto de cebadores de oligonucleótidos
complementarios directos e inversos con una longitud de
30-40 nucleótidos que incluyen una secuencia NNS de
ADN triple de diseño específico ((A,C,T o G), (A,C,T o G), (C o G))
que corresponde con la secuencia del codón a mutar y garantiza la
incorporación aleatoria de nucleótidos en ese codón.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador mutagénico directo e inverso incluye
las tres mutaciones deseadas en el centro del cebador con \sim15
bases de secuencias homólogas en ambos lados. Estas mutaciones, que
cubren el codón de interés, son específicas para el aminoácido
deseado y se sintetizan por diseño.
\newpage
El segundo conjunto de cebadores utilizado para
construir las bibliotecas y variantes contiene el sitio de
digestión ApaI de pVS08 junto con su secuencia de nucleótidos
flanqueantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador ApaI directo:
- \quad
- GTGTGTGGGCCCATCAGTCTGACGACC
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador ApaI inverso:
- \quad
- GTGTGTGGGCCCTATTCGGATATTGAG
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la introducción de la mutación o
mutaciones en moléculas GG36 utilizando Platinum® Taq DNA
Polymerase High Fidelity de Invitrogen (Carlsbad, CA, Cat. nº
11304-102) junto con ADN de molde de pVS08 y
cebador mutagénico directo y cebador ApaI inverso para la
reacción 1, o cebador mutagénico inverso y cebador ApaI directo
para la reacción 2.
Se llevó a cabo la construcción del vector de
expresión que incluía la mutación mutaciones deseadas mediante una
PCR de fusión utilizando un fragmento de PCR de ambas reacciones 1 y
2, cebador ApaI directo e inverso y Platinum® Taq DNA
Polymerase High Fidelity de Invitrogen (Cat. nº
11304-102).
Se realizaron todas las PCRs según el protocolo
de Invitrogen proporcionado con las polimerasas, excepto por el
número de ciclos: 20 en lugar de 30. Se realizaron dos reacciones
PCR separadas utilizando Platinum® Taq DNA Polymerase High
Fidelity de Invitrogen (Cat. nº 11304-102): se
purificó el fragmento de 5,6 Kb lineal amplificado (utilizando el
kit de purificación de PCR Qiagen® Qiaquick Cat. nº 28106) y se
digirió con enzima de restricción ApaI para crear extremos
cohesivos en ambos lados del fragmento de fusión:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Condiciones de reacción: 1 hora, 30ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una digestión adicional con
DpnI de Invitrogen para extraer el ADN de la plantilla
pVS08:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Condiciones de reacción: 16-20
horas, 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión del fragmento digerido y purificado
doble da como resultado ADN circular nuevo que contiene la mutación
deseada que se transformó directamente a Bacillus subtilis
competente:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Condiciones de reacción: 16-20
horas, 16ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformaron mezclas de unión a Bacillus
subtilis BG2864 (Naki et al., 1997) utilizando el
procedimiento de Anagnostopoulos y Spizizen (1961) y se
seleccionaron según la resistencia al cloramfenicol y actividad
protea-
sa.
sa.
\newpage
Se inocularon 1-50 \mul de
cultivo de glicerol en medio Mops (Frederick C. Neidhardt et
al., 1974) que contenía una fuente de nitrógeno (Glucosa y
Maltodextrina, 10,5 y 17,5 g/l), una fuente de nitrógeno (Urea, 3,6
g/l), y nutrientes esenciales, tales como fosfato (0,5 gl) y sulfato
(0,5 g/l) y se suplementa además con elementos traza (Fe, Mn, Zn,
Cu, Co, 1-4 mg/ml). El medio se tamponó con una
mezcla de MOPS/tricina dando lugar a un pH que varía de 7 a 8. Se
incubó el cultivo de 1 a 5 días a 37ºC/220 rpm (Infors HT® Multitron
II).
\vskip1.000000\baselineskip
Protein engineering of the
high-alkaline serine protease PB92 from Bacillus
alcalophilus: functional and structural consequences of
mutation at the S4 substrate binding pocket. Teplyakov A V,
van der Laan J M, Lammers A A, Kelders H,
Kalk K H, Misset O, Mulleners L J,
Dijkstra B W. Protein Eng. 1992 Jul; 5 (5):
413-20.
Selection of a subtilisin-hyper
producing Bacillus in a highly structured environment de D.
Naki, C. Paech, G. Ganshaw, V.
Schellenberger en AppI Microbiol Biotechnol
(1998) 49: 290-294
Requirements for transformation in Bacillus
subtilis de Anagnostopoulos, C. y Spizizen, J. in
J. Bacterio/81, 741-746 (1961).
Culture Medium for Enterobacteria de Frederick
C. Neidhardt, Philip L. Bloch y David F. Smith
en Journal of Bacteriology, Sept 1974.
p736-747 Vol. 119. No. 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las variantes de proteasa producidas en el
ejemplo 1 se analizaron por su rendimiento en dos tipos de
detergente y condiciones de lavado utilizando un ensayo
"microswatch" descrito en "An improved method of assaying
for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition",
U.S. Serie No. 09/554,992 [WO 99/34011].
Las tablas 2 y 3 indican las variantes de
proteasas analizadas y los resultados del análisis en dos
detergentes diferentes. Para la columna A y C, el material ensayado
se produjo mediante el crecimiento de las cepas transformantes en
una placa MTP. Para las columnas B y D, el material ensayado se
produjo mediante el crecimiento de las cepas transformantes en un
matraz de agitación (250 ml). Para las columnas A y B, el
detergente fue 7,6 g/l de Ariel Regular filtrado (Procter &
Gamble, Cincinnati, OH, USA), en una solución que contenía una
dureza de 15 granos por galón de Ca^{2+}/Mg^{2+} mezclado, y se
utilizaron 0,5 ppm de enzima en cada pocillo a 40ºC (condiciones
europeas). Para las columnas C y D, el detergente fue 0,67 g/l de
Tide Opal filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA), en
una solución que contenía una dureza de 3 granos por galón de
Ca^{2+}/Mg^{2+} mezclado, y se utilizaron 0,5 ppm de enzima en
cada pocillo a 20ºC (condiciones japonesas). Se calculó un índice
de rendimiento mediante la siguiente
fórmula:
fórmula:
El rendimiento de lavado de la variante dividido
por el rendimiento de lavado de GG36 (tipo salvaje).
Se promediaron cuatro valores del rendimiento
hasta llegar a los valores de la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como resultado de los análisis descritos
anteriormente, algunas variantes mostraron un índice de rendimiento
superior al de la proteasa de tipo salvaje GG36. Por ejemplo, las
variantes R45N-G118E-E271 R,
R45N-P14R, R45N-N204R, D181NG118D y
R45N-G258R mostraron unos índice de rendimiento de
1,75, 1,28, 1,28, 1,24 y 1,23 respectivamente (Tabla 2), en un
ensayo "microswatch" (WO 99/34011) en condiciones europeas
(dureza de 15 granos por galón de Ca^{2+}/Mg^{2+} mezclados, 40
grados centígrados, 0,5 ppm). Las variantes
R170S-A1P, R170S-G61R,
R170S-N204R, K251G-S87K, y
R170SS216R mostraron índices de rendimiento de 2,09, 2,03, 1,79,
1,54, 1,47, 1,39, y 1,21 respectivamente (Tabla 3). Las variantes
E271T-G100E, E271T-G102E,
E271T-S128E, K27T-G100E,
R170S-G100R, y E271T-S49E mostraron
índices de rendimiento de 3,22, 1,85, 2,33, 2,04, 1,79 y 1,43
respectivamente (Columna Tabla 3), en un ensayo en placa de 96
pocillos de microtitulación Microswatch (WO 99/34011) en
condiciones japonesas (dureza de 3 granos por galón de
Ca^{2+}/Mg^{2+} mezclados, 20 grados centígrados, 0,5 ppm). Las
variantes K251 G-S87K, R170S-A1R, y
E271T-S128E mostraron índices de rendimiento de
2,06, 1,55 y 1,20 respectivamente (Tabla 3). Las variantes
K251G-S87K y R170S-A1 R mostraron
índices de rendimiento superiores a 100 tanto en condiciones
japonesas como europeas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el
máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
- \bullet WO 9855634 A [0002]
- \bullet US 60344702 B [0075]
- \bullet WO 9920727 A [0002]
- \bullet WO 9934011 A [0081] [0126] [0130]
- \bullet WO 9920770 A [0002]
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- \bullet WO 8906276 A [0008]
- \bullet US 4404128 A [0086] [0098]
- \bullet US RE34606 E [0014] [0065] [0071]
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- \bullet US 5204015 A [0014] [0070] [0098]
- \bullet US 4404115 A [0086]
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- \bullet US 5700676 A [0014]
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- \bullet US 4242219 A [0086]
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Claims (8)
1. Variante de proteasa, que es una variante de
una proteasa precursora de subtilisina de Bacillus lentus
que tiene la secuencia mostrada en la figura 3, estando dicha
variante caracterizada por tener la misma carga
electrostática neta a pH 7 o el mismo punto isoeléctrico que dicha
proteasa precursora, y comprender una secuencia de aminoácidos que
tiene las sustituciones R170SA1R, R170S-G61R,
R170S-N204R, R170S-S216R o
R170S-G100R en relación a dicha proteasa
precursora, donde las posiciones de dichas sustituciones son
equivalentes a las posiciones especificadas en la subtilisina
madura de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la figura
3.
2. ADN que codifica una variante de proteasa
según la reivindicación 1.
3. Vector de expresión que comprende el ADN
según la reivindicación 2.
4. Célula huésped transformada con el vector de
expresión según la reivindicación 3.
5. Composición de limpieza que comprende la
variante de proteasa según la reivindicación 1.
6. Método de mejora del rendimiento del lavado
de una proteasa precursora de subtilisina de Bacillus lentus
que tiene la secuencia mostrada en la figura 3, que comprende
introducir las sustituciones R170S-A1R,
R170S-G61R, R170S-N204R, R170SS216R
o R170S-G100R en dicha proteasa precursora para
producir una variante de proteasa, donde dicha variante de proteasa
tiene la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto
isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y donde dicha variante
de proteasa mejora el rendimiento de lavado en relación a dicha
proteasa precursora, donde las posiciones de dichas sustituciones
son equivalentes a las posiciones especificadas en la subtilisina
madura de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la figura
3.
7. Método según la reivindicación 6, que
comprende modificar una secuencia de ADN que codifica dicha proteasa
precursora para producir una secuencia de ADN modificada que
codifica dicha variante de proteasa.
8. Método según la reivindicación 7, que
comprende transformar una célula huésped con un vector que contiene
dicha secuencia de ADN modificada y expresar dicha variante de
proteasa a partir de la célula huésped transformada.
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