JP6792524B2 - 複数置換プロテアーゼ変異体 - Google Patents
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Description
バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの5、7、23、26、28−31、34、47、63、65、66、69、70、73、82−85、88、90、92、93、105、113、125、138、139、148−151、176、178、179、193、196、200、201、202、207、219、220、223、229、233、250、266、267、及び273からなる群より選択される残基位置に等しい1以上の残基位置においてアミノ酸置換を含むプロテアーゼ変異体を提供することが本発明の目的である。
プロテアーゼは、一般的にタンパク質またはペプチドのペプチド結合を切断する働きを有するカルボニルヒドロラーゼである。ここで用いる“プロテアーゼ”は天然プロテアーゼまたは組換え型プロテアーゼを意味する。天然プロテアーゼはα−アミノアシルペプチド・ヒロドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシル−プロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼを含む。セリン、メタロ、チオール及び酸プロテアーゼが挙げられ、及びエンド及びエキソ−プロテアーゼが挙げられる。
より好ましくは、プロテアーゼ変異体はバチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・レンタスズブチリシン及び/またはズブチリシン309から得られる。
プラスミド複製、問題の遺伝子に作動可能に連結したプロモーター(認識される場合、遺伝子自身の相同プロモーターとして提供される、すなわち、宿主により転写される)、外来のまたはプロテアーゼ遺伝子の内生停止領域により提供された転写停止及びポリアデニル化領域(特定の真核宿主細胞のプロテアーゼ遺伝子から宿主により転写されたmRNAの安定に必要)、及び望ましくは、抗生物質含有培地での成長によりプラスミド感染宿主細胞の培養管理が維持できる抗生物質抵抗性遺伝子などの選択遺伝子に必要な公知の要素を含むという意味で、このプラスミドは宿主中で複製する。高コピー数プラスミドも宿主の複製起源を含み、それにより、多数のプラスミドが染色体の制限なしに細胞質中で生成することが可能となる。しかしながら、複数のプロテアーゼのコピーを宿主ゲノム内に組込むことは本発明の範囲内である。このことは特に相同組換えの影響を受けやすい原核及び真核生物により促進される。
当該技術は洗浄組成物として用いることができる種々の剤形でよく知られている。一般的な洗浄組成物に加えて、本発明のプロテアーゼ変異体は、天然または野生型プロテアーゼが使用される任意の目的に使用できることが容易に理解される。従って、これらの変異体は使用でき、例えば、固形または液体石けん用途、食器洗い用製剤、コンタクトレンズ洗浄液または製品、ペプチド加水分解、廃棄物処理、織物用途、タンパク質生成における融合−分解酵素としてである。本発明の変異体は洗剤組成物において高められた性能を有する(前駆体と比較して)。ここで用いるように、洗剤における高められた性能は、標準洗浄サイクル後の通常の評価により測定した、草または血液などのしみに敏感な特定酵素の洗浄の増加として定義する。
多数のプロテアーゼ変異体が生成でき、当業界に公知の方法を用いて精製できる。変異はバチルス・アミロリケファシエンス(BPN’)ズブチリシンまたはバチルス・レンタスGG36ズブチリシンにおいて作ることができる。変異体は以下から選択できる:5、7、23、26、28−31、34、47、63、65、66、69、70、73、82−85、88、90、92、93、105、113、125、138、139、148−151、176、178、179、193、196、200、201、202、207、219、220、223、229、233、250、266、267、及び273。
実施例1で生成した多数のプロテアーゼ変異体は、米国特許出願番号60/068,796、“An Improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition(好ましい酵素及び/または好ましい洗剤組成物の改善された分析方法)”に記載されている、マイクロスウォッチ(microswatch)分析法を用いて2種類の洗剤及び洗浄条件における性能を試験する。
表6は実施例1から分析された変異体プロテアーゼ及び4つの異なる洗剤における試験結果をリストする。実施例2と同じ性能試験を以下の洗剤を用いて記載した変異体プロテアーゼについて行った。A欄は、洗剤が0.67g/lろ過アリエール・ウルトラ(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)であり、溶液中3グレイン/ガロン合計Ca2+/Mg2+硬度を含み、及び20℃で各ウェル中0.3ppm酵素を使用した。B欄は、洗剤が3.38g/lろ過アリエールFutur(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)、であり、溶液中15グレイン/ガロン合計Ca2+/Mg2+硬度を含み、及び40℃で各ウェル中0.3ppm酵素を使用した。C欄は、3.5g/lHSP1洗剤(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)であり、溶液中8グレイン/ガロン合計Ca2+/Mg2+硬度を含み、及び20℃で各ウェル中0.3ppm酵素を使用した。D欄は、1.5ml/l Tide洗剤(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)であり、溶液中3グレイン/ガロン合計Ca2+/Mg2+硬度を含み、及び20℃で各ウェル中0.3ppmの酵素を使用した。
多数のプロテアーゼ変異体を生成し、当業界で公知の方法を用いて精製した。全ての変異はバチルス・レンタスGG36ズブチリシン中に作った。変異体を表1に示す。
突然変異生成の方法は領域−特異性変異方法(Teplyakov et al.,1992)に基づいて行い、変異するコドンの配列に対応し、そのコドンでのヌクレオチドのランダムな結合を保証する具体的に作成された3DNA配列NNS((A、C、TまたはG)、(A、C、TまたはG)、(CまたはG))を取り囲む30〜40ヌクレオチド長のフォワード及びリバース相補オリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて特定DNAコドン中に全ての可能な変異を一度に作成した。
フォワード及びリバース変異プライマーは両側の相同配列の15以下塩基を含むプライマーの中間に所望の変異を含む。これらの変異は目的のコドンをカバーし、所望のアミノ酸に特異的であり、意図的に合成される。
- 35μL精製DNA断片
- 4μL React(登録商標)4バッファ(Invitrogen(登録商標):20mM Tris−HCl、5mM MgCl2、50mM KCl、pH7.4)
- 1μL Apal、10単位/ml(Invitrogen(登録商標)、Cat.no.15440−019)
反応条件:1時間、30℃
- 40μL Apal消化DNA断片
- 1μL Dpnl、4単位/μL(Invitrogen(登録商標)、Cat.no.15242−019)
反応条件:16〜20時間、37℃
- 30μLのApal及びDpnl消化DNA断片
- 8μL T4リガーゼ・バッファ(Invitrogen(登録商標)、Cat.no.46300−018)
- 1μL T4 DNAリガーゼ、1単位/μl(Invitrogen(登録商標)、Cat.no.15224−017)
反応条件:16〜20時間、16℃
炭素源(グルコース及びマルトデキシトリン、10.5及び17.5g/l)、窒素源(尿、素、3.6g/l)及びリン酸塩(0.5g/l)及び硫酸塩(0.5g/l)などの必須養分を含み、及びさらに微量元素(Fe、Mn、Zn、Cu、Co、1〜4mg/ml)を補足したMops培地(Frederick C.Neidhardt et al.,1974)中で1〜50μLのグリセロール培養物を植菌する。培地はMOPS/トリシン混合物を用いて中和し、7〜8のpHを生じる。培養物を1〜5日、37℃/220rpm(Infors HT(登録商標)Multitron II)で培養する。
Protein engineering of the high-alkaline serine protease PB92 from Bacillus alcalophilus: functional and structural consequences of mutation at the S4 substrate binfing pocket. (バチルスalcalophilus由来の高アルカリ性セリンプロテアーゼPB92のタンパク質工学:S4基質結合ポケットでの変異の機能的及び構造的結果。)
Teplyakov AV、van der Laan JM、Lammers AA、Kelders H、Kalk KH、Misset O、Mulleners LJ、Dijkstra BW
Protein Eng.1992 Jul;5(5): 413-20.
Selection of a subtilisin-hyperproducing Bachillus in a highly structured environment (高度構造環境におけるズブチリシン−過剰生成バチルスの選択)
D.Naki、C.Paech、G.Ganshaw、V.Schellenberger.Appl Microbiol Biotechnol (1998) 49: 290-294.
Requirements for transformation in Bacillus subtilis (バチルス・ズブチリスにおける形質転換の必要条件)
Anagnostopoulos、C. and Spizizen、J. in J. Bacteriol. 81、741-746 (1961).
Culture Medium for Enterobacteria (腸内細菌の培養基)
Frederick C. Neidhardt、Philip L. Bloch and David F. Smith in Journal of Bacteriology、Sept 1974. p736-747 Vol. 119. No. 3.
実施例1で生成した多数のプロテアーゼ変異体を、米国特許出願番号09/554,992(WO99/34011)、“An Improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition(好ましい酵素及び/または好ましい洗剤組成物の改善された分析方法)”に記載されているマイクロスウォッチ(microswatch)分析法を用いて2種類の洗剤及び洗浄条件における性能を試験した。
変異体の洗浄性能 ÷ GG36の洗浄性能(野生型)
4つの性能値を平均し、表2で示す値に達した。
実施例1で生成したプロテアーゼ変異体をさらに数個、米国特許出願番号09/554,992(WO99/34011)、“An Improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition(好ましい酵素及び/または好ましい洗剤組成物の改善された分析方法)”に記載されているマイクロスウォッチ(microswatch)分析法を用いて2種類の洗剤及び洗浄条件における性能を試験した。
耐熱性
ヨーロッパ洗剤溶液におけるプロテアーゼ変異体の耐熱性を実験した。
材料:
iEMS培養器(Lab systems)
マイクロタイター・プレートリーダー
ASYS Multispense
Beckman Biomek FXロボット
96ウェル・マイクロタイタープレート
アリエールFutur(Ariel Futur)洗剤(バッチ’97)
N−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe p ニトロアニリド(AAPF);シグマS−7388
Tween 80;シグマP−8074
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス);T−1378
サンプル調製:
約6.0ppm(タンパク質)に希釈し、最初の濃度が10mM NaCl/0.005%Tween 80(登録商標)である酵素サンプル。10μlの希釈酵素溶液を190μlのろ過していない3.4g/lアリエールFutur(プロクター&ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国)に15グレイン/ガロン水硬度で移した。pHを8.6に調節した。
説明のため、変異をGG36に作り、例えば、G7Nは7位置のグリシンがアスパラギンで置換されたことを意味する。結果を表4に示す。
Claims (5)
- 配列番号6に示すバチルス・レンタス・ズブチリシンと比較して、改善された耐熱性を有する、配列番号6に示すバチルス・レンタス・ズブチリシンの変異体であって、
前記変異体は、G7N、V26T、V28S、A29G、V30A、L31A、L31T、G65M、A85S、P86Y、A88S、L90I、L90M、V93S、L148G、V149A、V149F、V149G、V149H、V177R、G178L、G178S、I198L、V203T、A232C、V26S−N218S、V93T−E136G、V139A−V150A、E89G−A142E、Q12H−V149S、V150C−N218S、T38S−V150A、N43D−G178C、N116D−A232M、及びV93A−S103Cからなる群から選択されたアミノ酸置換を有し、前記アミノ酸置換の位置番号は、配列番号3に示すバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの位置番号に基づく、変異体。 - 請求項1に記載の変異体をエンコードするDNA。
- 請求項2に記載のDNAをエンコードする発現ベクター。
- 請求項3に記載の発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
- 請求項1に記載の変異体を含んだ洗浄組成物。
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