CN105368809A - 包含蛋白酶变体的组合物和方法 - Google Patents

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CN105368809A CN201510671611.3A CN201510671611A CN105368809A CN 105368809 A CN105368809 A CN 105368809A CN 201510671611 A CN201510671611 A CN 201510671611A CN 105368809 A CN105368809 A CN 105368809A
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Abstract

本发明提供蛋白酶变体、包含蛋白酶变体的组合物以及使用这种蛋白酶变体和组合物的方法。

Description

包含蛋白酶变体的组合物和方法
本申请是中国专利申请201080063354.0的分案申请，原申请的申请日是2010年12月9日，发明名称是“包含蛋白酶变体的组合物和方法”。
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2009年12月9日提交的美国临时专利申请No.61/285,127和于2010年10月12日提交的美国临时专利申请No.61/392,373的优先权和权益，将这两篇专利申请以引用的方式全文并入本文。
技术领域
本发明提供蛋白酶变体、包含蛋白酶变体的组合物以及使用这种蛋白酶变体及其组合物的方法。
背景技术
尽管蛋白酶已在工业酶领域中已久为人所知，但对于适于特定条件和用途的工程化蛋白酶仍存在需要。本发明满足这些及其他需要。
发明内容
在第一个方面，本发明提供亲本蛋白酶的分离的蛋白酶变体，所述蛋白酶变体具有蛋白水解活性并且包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的一个或多个与SEQIDNO:2的氨基酸位置对应的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列，其中所述至少一个变更独立地是(i)在占据所述位置的氨基酸残基的上游或下游插入一个或多个氨基酸残基，(ii)占据所述位置的氨基酸残基缺失，或者(iii)占据所述位置的氨基酸残基置换为另一不同的氨基酸残基，其中每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2所示的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。
在第二个方面，本发明提供亲本蛋白酶的分离的蛋白酶变体，所述变体包含具有选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的三个氨基酸置换的氨基酸序列，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。
在第三个方面，本发明提供具有蛋白酶活性的分离的多肽，所述多肽包含与选自如下的多肽序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列：
a)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G；
b)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S033T+N076D；
c)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+N109G+K141R+N243V；
d)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+K256R；
e)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T；
f)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+L257G；
g)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+L257G；
h)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061G+N109G+N243V；
i)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+S248A；
j)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R；
k)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T+N243V+K256R；
l)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V；
m)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G；
n)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+N243V；
o)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+T158S+L257G；
p)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061S+N109G+N243V；
q)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R；
r)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R；
s)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R；
t)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G；
u)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+K256R；
v)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+K256R；
w)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+K256R；
x)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N109G；
y)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S063G；
z)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N076D；
aa)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N218S；
bb)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N076D+N218S；以及
cc)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q，其中所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在第四个方面，本发明提供选自如下的具有蛋白酶活性的分离的多肽：(a)包含与SEQIDNO:6的多肽序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在至少高严格条件下与(i)SEQIDNO:5的多核苷酸序列或(ii)(i)的互补多核苷酸序列杂交的多核苷酸编码的多肽；和(c)由包含与SEQIDNO:5的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽。
在第五个方面，本发明提供亲本蛋白酶的分离的蛋白酶变体，其中：(a)相对于亲本蛋白酶，所述变体包含具有不超过20、15或10个变更的氨基酸序列，其中(i)所述变更独立地选自插入、缺失或置换，以及(ii)所述变更包括位置24和53处的甘氨酸置换、位置78和101处的天冬酰胺置换、位置128处的丙氨酸或丝氨酸置换以及位置217处的谷氨酰胺置换，(b)所述亲本蛋白酶与SEQIDNO:2具有至少90％序列同一性，(c)SEQIDNO:2的氨基酸序列用于确定位置编号；以及(d)相对于亲本蛋白酶，所述变体具有增加的蛋白水解活性，其中每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在第六个方面，本发明提供亲本蛋白酶的分离的蛋白酶变体，其中(a)所述变体包含(i)与SEQIDNO:2的序列具有至少85％同一性以及(ii)在位置24和53处具有甘氨酸置换、在位置78和101处具有天冬酰胺置换、在位置128处具有丙氨酸或丝氨酸置换以及在位置217处具有谷氨酰胺置换的氨基酸序列；(b)所述亲本蛋白酶与SEQIDNO:2具有至少85％序列同一性；(c)所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号；以及(d)相对于亲本蛋白酶，所述变体具有增加的蛋白水解活性。
在另一个方面，本发明提供分离的或重组的核酸，所述核酸包含编码至少一种本发明的多肽变体(如蛋白酶变体)的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供分离的或重组的核酸，所述核酸包含与SEQIDNO:3或SEQIDNO:5中所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的核酸的表达载体。还提供的是包含至少一种本发明的核酸或表达载体的重组宿主细胞或细胞培养物。
在另一个方面，本发明提供制备至少一种本发明的多肽(如蛋白酶变体)的方法，所述方法包括：(a)将编码本发明的多肽(如蛋白酶变体)的本发明的重组表达载体引入一群细胞中；(b)在有利于产生由所述表达载体编码的多肽(如蛋白酶变体)的条件下在培养基中培养所述细胞；以及任选地，(c)从所述细胞或从所述培养基分离或回收所述变体。
在另一个方面，本发明提供包含任选与另一种酶组合的至少一种本发明的蛋白酶变体或多肽的组合物。这种组合物可包含辅助成分(如表面活性剂和/或助洗剂)或载体。这种组合物可以是清洁组合物或洗涤剂组合物并且可用于本文其他地方所述的清洁方法中。这种组合物可以是织物和家居护理产品，或者这种组合物可以不是织物和家族护理产品。
在另一个方面，本发明提供用于清洁需要清洁的物品、物体或表面的方法，该方法包括用本发明的多肽或蛋白酶变体或本发明的组合物与所述物品、物体或表面接触，以及任选用水漂洗所述物品、物体或表面。
在另一个方面，本发明提供用于清洁物品或表面(如硬质表面)的方法，该方法包括用本发明的多肽或蛋白酶变体或本发明的组合物接触待清洁的物品或表面(如硬质表面)的至少一部分，该接触持续足以清洁或洗涤所述物品或表面(如硬质表面)至所需程度的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤所述物品或表面(如硬质表面)至所需程度的条件下进行，以及任选包括用水漂洗所述物品或表面(如硬质表面)。
本发明的其他方面在下文描述。
附图说明
图1提供了pHPLT-BPN’-v3的质粒图谱。
图2提供了pHPLT-BPN’-v3+S78N的质粒图谱。
图3提供了pHPLT-BPN’partialopt的质粒图谱。
图4提供了pHPLT-BPN’-v36的质粒图谱。
图5提供了包括BPN’(SEQIDNO:2)和GG36(SEQIDNO:755)在内的成熟参考枯草杆菌蛋白酶的比对。本文所述的每种蛋白酶变体(包括每种冷水蛋白酶变体)的每个氨基酸位置根据解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQIDNO:2)的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编码方式(如图5中所示)进行编码，该对应关系通过所述蛋白酶变体氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对确定。因而，除非本文另外指明，否则置换位置是以与BPN’的关系给出。
图6提供了pHPLT-GG36的图谱。
图7提供了pRA68的图谱。
图8提供了pRA96的图谱。
具体实施方式
定义
除非另外指明，否则本发明的实施涉及处于本领域技术范围内的常用于分子生物学、蛋白质工程、微生物学和重组DNA的常规技术。这类技术是本领域技术人员已知的并描述于本领域技术人员众所周知的许多文章和参考著作中。藉此将本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都明确以引用的方式并入本文。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。许多技术词典是本领域技术人员已知的。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施，但还是在本文中描述了一些合适的方法和材料。因此，通过整体参考本说明书更完全地描述了下文定义的术语。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外说明，否则分别是核酸以5'至3'的取向从左向右书写，而氨基酸序列以氨基至羧基取向从左向右书写。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些方面可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。
除非另外指明，否则本发明的实施可采用蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术以及蛋白质测序的常规技术，所有这些均在本领域技术人员的技能之内。
此外，本文提供的标题不是对本发明各方面的限制，对本发明各方面的限制可通过整体参考本说明书而获得因此，通过整体参考本说明书可更完全地限定下文定义的术语。尽管如此，为了便于理解本发明，将多个术语定义如下。
如本文所用，术语“蛋白酶”和“朊酶”是指具有分解其他蛋白质的能力的酶蛋白。蛋白酶具有进行“蛋白水解”的能力，其通过水解在形成该蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而开始蛋白质分解代谢。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性称为“蛋白水解活性”。存在许多众所周知的用于测量蛋白水解活性的方法(例如参见，Kalisz，“MicrobialProteinases(微生物蛋白酶)”，载于：Fiechter(编辑)，Advancesin BiochemicalEngineering/Biotechnology(《生物化学工程/生物技术进展》)(1988)中)。例如，蛋白水解活性可通过可分析该蛋白酶水解商业底物的能力的比较测定法来确定。可用于蛋白酶或蛋白水解活性的分析的示例性底物包括但不限于：二甲基酪蛋白(SigmaC-9801)、牛胶原(SigmaC-9879)、牛弹性蛋白(SigmaE-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical902111)。利用这些底物的比色测定法为本领域所熟知(例如参见，WO99/34011和美国专利6,376,450，将这两个专利以引用的方式并入本文)。pNA测定法(例如参见，DelMar等人，Anal.Biochem.(《分析生物化学》)99:316-320[1979])也可以用于测定在梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定法测量当该酶水解可溶性的合成底物即琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时对硝基苯胺释放的速率。用分光光度计在410nm处测量从该水解反应产生黄色的速率，其与活性酶浓度成比例。此外，280纳米(nm)处的吸光度测量可用于测定总蛋白质浓度。活性酶/总蛋白质比率给出了酶纯度。
如本文中所用，术语“枯草杆菌蛋白酶”是指如在MEROPS-肽酶数据库中所述的S8丝氨酸蛋白酶家族的任何成员(参见Rawlings等人，MEROPS:thepeptidasedatabase(MEROPS：肽酶数据库)，Nucl.AcidsRes.(《核酸研究》)，34Databaseissue(数据库期)，D270-272[2006])。如其中所述，肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物(Rawlings和Barrett，Biochem.J.(《生物化学杂志》)，290:205-218,[1993])。S8家族也称为枯草杆菌酶(subtilase)家族，是丝氨酸肽酶的第二大家族。现在已经测定了S8家族若干成员的三级结构。典型的S8蛋白质结构由三个层组成，一个七股β片层夹在两层螺旋之间。枯草杆菌蛋白酶(S08.001)是异种集团(clan)SB(SB)的典型结构。尽管结构不同，但枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(S01.001)的活性位点可叠合，这表明该相似性是趋同进化而不是趋异进化的结果。
“蛋白酶变体”(或“变体蛋白酶”)可以指其氨基酸序列与参考蛋白酶或亲本蛋白酶的氨基酸序列相差至少一个氨基酸残基的蛋白酶。亲本蛋白酶或参考蛋白酶不必是野生型蛋白酶，而是其自身可以是野生型蛋白酶的变体。并不意图参考蛋白酶或亲本蛋白酶限于任何特定的氨基酸序列。参考蛋白酶或亲本蛋白酶的蛋白酶变体可包含与所述参考蛋白酶或亲本蛋白酶的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并可相对于所述亲本蛋白酶或参考蛋白酶的氨基酸序列包含至少一个氨基酸置换、插入或缺失。在一个方面，本发明包括丝氨酸蛋白酶的变体，其中该变体相对于该丝氨酸蛋白酶具有至少一个突变。在一个方面，本发明包括“BPN’变体”(或“BPN’枯草杆菌蛋白酶变体”)，其相对于SEQIDNO:2的成熟BPN’序列包含具有一个或多个突变的氨基酸序列。
亲本蛋白酶或参考蛋白酶可以是(但不限于)例如已知的蛋白酶(包括但不限于例如BPN’)或市售的蛋白酶或市售蛋白酶的变体。亲本蛋白酶或参考蛋白酶自身可以是已知的或市售的蛋白酶的变体。蛋白酶变体可源自市售的亲本蛋白酶或这种市售亲本蛋白酶的变体。市售的蛋白酶包括但不限于例如以如下商品名销售的蛋白酶： LIQUANASESAVINASE(由NovozymesA/S销售)； 和PURAFECTPURAFASTTM、PRIME、(由美国丹尼斯克有限公司(DaniscoUSInc.)，原来的杰能科国际有限公司(GenencorInternational,Inc.)销售)；以及可获自汉高公司(Henkel)/凯米拉公司(Kemira)的那些蛋白酶：即BLAP(US5,352,604的图29中示出的具有如下突变S99D+S101R+S103A+V104I+G159S的氨基酸序列，下文中称为BLAP)和BLAPX(具有S3T+V4I+V205I的BLAP)。
如本文所用，“冷水蛋白酶”为表现具有如下四个标准中的一者或多者的酶：(a)当与Prime(具有氨基酸置换Y217L的SEQIDNO:2)比较时，在pH8和16℃(60℉)下对BMI，性能指数为至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5，如本文在第I部分实施例1中示出的“测试方法”中定义的；(b)当与BPN’(SEQIDNO:2)比较时，在pH8和16℃(60℉)下对BMI，性能指数为至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.3至约10、1.3至约8或甚至1.3至约5，如本文在第I部分实施例1中示出的“测试方法”中定义的；(c)当与BPN’-v3(SEQIDNO:4)比较时，在pH8和16℃(60℉)下对BMI，性能指数为至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、0.9至约10、0.9至约8或甚至0.9至约5，如本文在第I部分实施例1中示出的“测试方法”中定义的；和/或(d)当与BPN’-v36(SEQIDNO:6)比较时，在pH8和16℃(60℉)下对BMI，性能指数为至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、0.9至约10、0.9至约8、0.9至约5、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5，如本文在第I部分实施例1中示出的“测试方法”中定义的。
某些合适的冷水蛋白酶衍生自枯草杆菌蛋白酶，特别是衍生自枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQIDNO:2)的那些。冷水蛋白酶可以是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的BPN’的变体(如“BPN’变体”或“BPN’枯草杆菌蛋白酶变体”)。某些这种冷水蛋白酶包含本文所示氨基酸置换中的一者或多者。
如本文中所用，芽孢杆菌属(Bacillus)包括本领域技术人员已知的芽孢杆菌属内的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应该认识到，还在继续对芽孢杆菌属进行分类学整理。因此，意图是该属包含已重新分类的种，包括但不限于诸如现命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体。在氧存在下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征(definingfeature)，但该特征也可适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，指在链中共价键合的核苷酸单体的任何长度的聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)(包含脱氧核糖核苷酸的多核苷酸)和RNA(核糖核酸)(核糖核苷酸的聚合物)是具有独特生物学功能的多核苷酸或核酸的例子。多核苷酸或核酸包括(但不限于)：单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其他天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。如下是多核苷酸的非限制性实例：基因、基因片段、染色体片段、表达序列标签(EST)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。一些多核苷酸包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶基(uracyl)、其他糖和连接基如氟代核糖和硫代酸酯(thioate)，以及核苷酸支链。核苷酸的序列可间夹杂有非核苷酸组分。
如本文所用，术语“载体”指用于将核酸或多核苷酸引入或转移进靶细胞或组织中的核酸构建体或多核苷酸构建体。载体通常用于将外来DNA引入另一细胞或组织中。载体通常包含作为转基因的DNA序列和充当该载体“骨架”的较大的多核苷酸序列。载体通常起到转移遗传信息(如插入的转基因)至靶细胞或组织的作用，以便在该靶细胞或组织中分离、增殖或表达该插入物。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(如病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体、载体盒(cassette)等等。载体通常包含复制起点、多克隆位点和可选标记。将载体插入靶细胞中的方法在细菌和酵母细胞中通常称为转化，在哺乳动物细胞中通常称为转染。本发明包括载体，该载体包含编码蛋白酶变体(如前体或成熟蛋白酶变体)的DNA序列，该DNA序列与能够实现其在合适宿主中表达的合适前序列(prosequence)(如分泌序列、信号肽序列等)有效连接。
如本文所用，术语“表达盒”或“表达载体”指以重组方式或以合成方式产生的、用于所关注的核酸(如外来核酸或转基因)在靶细胞中的表达的核酸构建体或载体。所关注的核酸通常表达所关注的蛋白质。表达载体或表达盒通常包含驱动或促进外来核酸的表达的启动子核苷酸序列。表达载体或表达盒还通常包含允许特定核酸在靶细胞中的转录的任何其他规定的核酸元件。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。某些表达载体具有使异源DNA片段插入宿主细胞中以及使其在宿主细胞中表达的能力。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。适宜的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。用于从掺入表达载体中的核酸序列表达蛋白质的适当表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
DNA构建体是可被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。DNA构建体通常包含已被亚克隆进载体中的DNA插入物，该DNA插入物包含编码所关注的蛋白质的核苷酸序列。载体可含有用于在细菌中生长的细菌抗性基因和用于所关注的蛋白质在生物体中的表达的启动子。DNA可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其他合适的技术体外产生。DNA构建体可包含所关注的核酸序列。在一个方面，该序列与另外的元件如控制元件(如启动子等)有效连接。DNA构建体可还包含选择性标记并且可还包含侧接有同源盒(homologybox)的输入序列(incomingsequence)。构建体可包含添加至末端的其他非同源序列(如填充序列(stuffersequence)或旁侧序列(flank))。序列的末端可封闭而使得DNA构建体形成闭合环。用本领域熟知的技术掺入DNA构建体中的所关注的核酸序列可以是野生型的、突变型的或经修饰的核酸。DNA构建体可包含一条或多条与宿主细胞染色体同源的核酸序列。DNA构建体可包含一条或多条非同源核苷酸序列。一旦体外装配了DNA构建体，则可将其用于例如：1)将异源序列插入宿主细胞的所需靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即用异源序列置换内源序列)；3)使靶基因缺失；和/或4)将复制型质粒引入宿主中。在本文中“DNA构建体”可与“表达盒”互换使用。
如本文所用，“质粒”指染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。质粒是双链的(ds)并且可以是环状的，通常用作克隆载体。
如本文在将核酸序列引入细胞的语境中所用，术语“引入”指任何适于将核酸序列转移进细胞中的方法。适用于引入的方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导(例如，参见Ferrari等人，“Genetics(遗传学)”，载于Hardwood等人(编辑)，Bacillus(《芽孢杆菌》)，普莱南出版公司(PlenumPublishingCorp.)，第57-72页[1989])。
转化指因遗传物质(如DNA)的吸收、基因组掺入和表达所致的细胞的遗传变更。
如本文所用，某核酸当被设置成与另一核酸序列处于功能关系中时，其与另一核酸序列“有效连接”。例如，如果启动子影响核苷酸编码序列的转录，则该启动子或增强子与该编码序列有效连接。如果核糖体结合位点被设置成使得有利于编码序列的翻译，则该核糖体位点可与该编码序列有效连接。通常，“有效连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在便利的限制性位点处的连接来实现。如果这类位点不存在，则可根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头或连接物。
如本文所用，在用于指细胞时“重组的”通常指该细胞已通过引入异源核酸序列而进行了修饰或指该细胞衍自经过如此修饰的细胞。例如，重组细胞可包含这样的基因，其不以相同的形式存在于天然(非重组)形式的该细胞内，或者重组细胞可包含(存在于天然形式的细胞中的)天然基因，但该基因已经过修饰并被再次引入该细胞中。重组细胞可包含对该细胞而言是内源性的核酸，该核酸在未将其从该细胞移除的情况下进行了修饰；这种修饰包括通过基因置换、定点突变以及本领域一般技术人员已知的相关技术获得的那些修饰。重组DNA(rDNA)是人工DNA的形式，该人工DNA是通过将两条或更多条正常情况下不会通过基因剪接过程出现在一起的核苷酸序列进行组合而产生。重组DNA技术包括体外产生重组DNA以及将该重组DNA转移进细胞中的技术，在所述细胞中该重组DNA可表达和增殖，从而产生重组多肽。
如本文所用，术语核酸或基因“扩增”是指这样的一种过程，通过该过程特定DNA序列以不成比例的方式复制，使得被扩增的核酸或基因以高于基因组中最初存在的拷贝数的拷贝数存在。通过在药物(如可抑制的酶的抑制剂)的存在下进行生长来选择细胞，可导致编码在所述药物存在下的生长所需的基因产物的内源基因的扩增，或者导致编码这个核酸或基因产物的外源(即输入)序列的扩增，或者导致这两种扩增。
如本文所用，术语“引物”指这样的寡核苷酸(核苷酸残基的聚合物)，无论是如在纯化的限制酶切消化物中天然存在的还是以合成方式产生的，其当被置于与某核酸链互补的引物延伸产物的合成得以诱导的条件下(即在核苷酸、诱导剂如DNA聚合酶的存在下以及在合适的温度和pH下)时能够充当合成起始点。为了使扩增效率最高，引物优选为单链的，但作为另一种选择其也可以是双链的。如果是双链，则首先对引物进行处理以分离其链，然后再用于制备延伸产物。引物可包含寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源以及使用的方法。
如本文所用，术语“探针”指这样的寡核苷酸，无论是如在纯化的限制酶切消化物中的天然存在的还是以合成方式、重组方式或通过PCR扩增产生的，其通常能够与所关注的另一寡核苷酸杂交。探针可以是单链的或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴别和分离。设想到，本发明中所用的任何探针将用任何“报告分子”进行标记，从而其可在任何检测系统中检测，所述检测系统包括但不限于酶系统(如ELISA，以及基于酶的组织化学测定法)、荧光系统、放射性系统和发光系统。无意于将本发明受限于任何具体的检测系统或标记。
如本文所用，术语“聚合酶链反应”(PCR)指美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.4,965,188的方法(藉此以引用的方式将所述专利并入本文)，其包括在不进行克隆或纯化的情况下增加靶序列的某个区段在基因组DNA的混合物中的浓度的方法。扩增靶序列的这种方法是本领域众所周知的。
如本文所用，术语“扩增试剂”指扩增所需的除引物、核酸模板以及扩增酶以外的那些试剂(如脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲剂等)。通常，将扩增试剂连同其他反应组分放置于和装于反应容器(试管、微孔等)中。
如本文所用，术语“限制性内切酶”或“限制酶”指能够在称为限制位点的特定核苷酸序列处或附近切开双链或单链DNA的酶(如细菌酶)。包含限制位点的核苷酸序列为给定的限制性内切酶或限制酶所识别和切割并且常常是插入DNA片段的位点。可将限制位点工程引入到表达载体或DNA构建体中。
如本领域已知的，DNA序列可被RNA聚合酶转录而产生RNA序列，但RNA序列可被逆转录酶逆转录而产生DNA序列。
“宿主菌株”或“宿主细胞”指适合于包含所关注的DNA序列的表达载体的宿主。所关注的DNA序列可在宿主菌株或宿主细胞中表达所关注的蛋白质。
“蛋白质”或“多肽”或“肽”是氨基酸残基的多聚序列。一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基连接。术语“蛋白质”和“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。肽包含两个或更多个氨基酸。肽通常含有的氨基酸比多肽和蛋白质含有的氨基酸少。遵照国际纯化学及应用化学联合会-国际生物化学联合会的生物化学命名委员会(IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature,JCBN))所定义的氨基酸的单字母和三字母代码在整个本公开中使用。单字母X指二十种氨基酸中的任一种。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
在描述酶变体时，通常使用如下命名以易于指代：初始氨基酸：位置：置换的氨基酸。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。单字母“X”指任何氨基酸残基，然而，当在氨基酸置换的语境中(例如“X003C”)时，应当理解“X”是指除了因该置换而得到的氨基酸残基之外的氨基酸残基(例如，X为除了C之外的氨基酸残基)。突变通常通过这样命名：亲本氨基酸的一字母代码，后面是氨基酸序列中的三位数或二位数或一位数氨基酸位置编号，然后是置换的氨基酸的一字母代码。例如，将氨基酸序列中的氨基酸位置87处的氨基酸甘氨酸(G)通过用氨基酸丝氨酸(S)置换甘氨酸(G)来进行的突变，表示为“G087S”或“G87S”。通常，用苏氨酸置换位置2处的甘氨酸表示为G002T；但是，这种置换也可以表示为G02T或G2T。可包括一个或两个前面的零(“0”)，这仅仅是为每个氨基酸位置提供便利的三位数标号。氨基酸位置“001”与“1”相同，因而“A001C”与“A1C”相同。“X001G”指氨基酸序列中的氨基酸位置1处的甘氨酸(G)的置换，其中要被甘氨酸代替的氨基酸为任何氨基酸。多个突变通过在各突变之间插入“-”或通过在各突变之间使用加号(+)来指示。例如，氨基酸序列中的氨基酸残基位置87和90处的氨基酸置换表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”或者“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。对于缺失，使用单字母代码“Z”。对于相对于亲本序列的插入，单字母代码“Z”位于该位置号码的左侧。对于缺失，单字母代码“Z”位于该位置号码的右侧。对于插入，位置号码是在插入的氨基酸的前面的位置号码，每个氨基酸加0.01。例如，在位置87和88之间插入三个氨基酸即丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和酪氨酸(Y)显示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。因而，将上面所有的突变加上位置100处的缺失组合在一起为：“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。
“前序列”或“前肽序列”指蛋白酶分泌所必要的处于信号肽序列和成熟蛋白酶序列之间的氨基酸序列。前序列或前肽序列的切除会得到成熟的活性蛋白酶。
术语“信号序列”或“信号肽”指可参与成熟或前体形式的蛋白质的分泌或直接转运的氨基酸残基序列。
信号序列通常位于该前体或成熟蛋白质序列的N端。信号序列还可以称为前导序列。信号序列可以是内源性的或外源性的。一种示例性的外源性信号序列包含来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前七个氨基酸残基和这七个氨基酸残基所融合到的来自迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus,ATCC21536)枯草杆菌蛋白酶的信号序列的其余部分。通常成熟蛋白质缺少信号序列。在转运蛋白质后通常由信号肽酶从该蛋白质切除信号序列。
术语“杂合信号序列”指与待表达的基因的信号序列融合的信号序列，其中该序列的一部分从表达宿主获得。可利用合成的序列。
术语蛋白质、多肽或肽的“成熟”形式指无信号肽序列和前肽序列的该蛋白质、多肽或肽功能形式。
术语蛋白质或肽的“前体”形式指具有与该蛋白质的氨基或羰基末端有效连接的前序列的该蛋白质成熟形式。前体还可具有与前序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多核苷酸(例如这样的多核苷酸，从前体上将其切除会留下蛋白质、多肽或肽的成熟形式)。
关于氨基酸序列或核酸序列的术语“野生型”指所述氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”指自然界中存在的(如还未借助重组或化学方法进行过操纵的)任何东西(如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。如本文所用，术语“非天然存在的”指自然界中不存在的任何东西(如实验室中产生的重组的或化学合成的核酸)。
特定氨基酸序列中的氨基酸残基可通过与参考氨基酸序列的某个位置中的氨基酸残基的对应关系来编号。所关注的氨基酸序列的处于与参考氨基酸序列的氨基酸残基的该位置“相对应”的位置的氨基酸残基，表示该所关注的序列的该氨基酸残基位于与该参考氨基酸序列中的氨基酸残基的该位置等价或同源的位置处。本领域技术人员可确定多肽中特定残基位置是否与同源参考序列的位置相对应。例如，可使用已知的技术将某蛋白酶变体与参考序列的蛋白酶变体(如SEQIDNO:2的BPN’序列)进行比对。可将参考序列中的氨基酸残基的位置用于对所关注的序列中的氨基酸残基进行编号。因此，可根据参考序列的对应氨基酸残基位置编号方式对该蛋白酶变体的氨基酸残基进行编号。例如，可将SEQIDNO:2参考序列中的氨基酸残基用于确定所关注的蛋白酶变体的每个氨基酸残基的氨基酸残基位置编号方式。
如本文所用，“同源性”指序列相似性或同一性，其中同一性是优选的。同源性可用本领域已知的标准技术确定(例如，参见Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)，2:482[1981]；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，48:443[1970]；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，85:2444[1988]；威斯康辛遗传软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的软件如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(遗传计算小组公司(GeneticsComputerGroup)，威斯康辛州麦迪逊(Madison,WI))；和Devereux等人，Nucl.AcidRes.(《核酸研究》)，12:387-395[1984])。可用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP利用渐进式成对序列比对法，由一组相关的序列产生多序列比对。其还可以画出树状图，该图示出用于产生该比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法(参见Feng和Doolittle,J.Mol.Evol.(《分子进化杂志》)，35:351-360[1987])的简化方法。该方法与Higgins和Sharp描述的方法(参见Higgins和Sharp,CABIOS5:151-153[1989])类似。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重(gapweight)为3.00，默认空位长度权重(gaplengthweight)为0.10，加权的末端空位。可用的算法的另一个实例是BLAST算法，该算法由Altschul等人进行了描述(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，215:403-410[1990]；以及Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，90:5873-5787[1993])。尤其可用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul等人，Meth.Enzymol.(《酶学方法》)，266:460-480[1996])。WU-BLAST-2使用数种搜索参数，大部分参数设定为默认值。可调参数设定为如下值：重叠跨度(overlapspan)＝1，重叠分数(overlapfraction)＝0.125，字串阈值(wordthreshold)(T)＝11。HSPS和HSPS2参数是动态值，由程序自身根据特定序列的组成和被用来搜索所关注的序列的特定数据库的组成来确定。然而，可以调整所述值来增加灵敏度。
主题多肽序列与参考多肽序列之间的序列同一性百分数(序列同一性％或简称同一性％)意指当将所述序列进行最佳比对时，以氨基酸残基比氨基酸残基计，在比较长度上主题氨基酸序列与参考多肽序列相同达指定的百分数，这例如通过氨基酸序列比较算法或目测来确定。类似地，主题核酸序列与参考核酸序列之间的序列同一性百分数意指当将所述序列进行最佳比对时，以核酸残基比核酸残基计，在比较长度上主题核苷酸序列与参考核苷酸序列相同达指定的百分数。
参考序列与所关注的主题序列之间的序列同一性百分数(同一性百分数或序列同一性％或同一性％)可由本领域技术人员容易地确定。两条多肽序列具有的同一性百分数可例如通过对每条序列中的氨基酸残基的直接比较来确定，做法是对各序列的残基进行比对使达到最大相似性，并通过使用本领域已知的序列比较算法或通过目测来确定序列之间相同氨基酸残基的数目。可在比较长度上比较两条经最佳比对的多肽序列，并且可确定最佳比对中在两条多肽序列中出现的相同氨基酸残基的位置的数目，从而提供匹配的位置的数目，然后将匹配的位置的数目除以比较长度上位置总数目。所得的数目乘以100而得到主题多肽序列与参考(或查询)多肽序列的同一性百分数。类似地，两条核酸序列具有的同一性百分数可例如通过对每条序列中的核苷酸残基的直接比较来确定，做法是对各序列的残基进行比对使达到最大相似性，并通过使用序列比较算法或通过目测来确定核酸序列之间相同核酸残基的数目。两条或更多条序列之间的同一性百分数也可描述为所述序列相同达特定同一性百分数。
适于确定序列同一性的算法的例子是BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》),215:403-410[1990])。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串来确定高打分序列对(highscoringsequencepair,HSP)，该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T。这些最初的邻近命中字串充当起点来寻找含有它们的更长的HSP。使命中字串沿进行比较的两条序列的每一条朝两个方向扩展至累积比对分数不能增加为止。命中字串的延伸在如下情况时停止：累积比对分数从最大获得值下降达数量X；累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定该算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用如下默认值：字串长度(W)为11、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，89:10915[1992])，比对数(B)为50，期望值(E)为10，M’5，N’-4，以及两条链的比对。
BLAST算法然后对两条序列之间的相似性进行统计分析(例如参见Karlin和Altschul，出处同上)。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallestsumprobability,P(N))，其指示两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如，如果在试验核酸与蛋白酶编码核酸的比较中最小合计概率低于约0.1，更优选低于约0.01，最优选低于0.001，则该核酸可视为与本发明的蛋白酶编码核酸相似。在试验核酸编码蛋白酶多肽的情况中，如果比较得到低于约0.5，更优选低于约0.2的最小合计概率，则其视为与指定的蛋白酶编码核酸相似。
“最佳比对”或“最佳比对的”指两条(或更多条)序列的给出最高同一性百分比分数的比对。例如，可通过将两条多肽序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同氨基酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。可通过将两条核酸序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同核苷酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。
当用限定的参数，如限定的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(gapexistencepenalty)(也称为空位开放罚分)和空位延伸罚分(gapextensionpenalty)来比对两条序列(如多肽序列)，以实现该对序列所可能的最高同一性分数时，这两个序列可认为是“最佳比对的”。在多肽序列比对算法(如BLASTP)中，BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，出处同上)通常用作默认的打分置换矩阵。施加空位存在罚分以在被比对的序列之一者中引入单个氨基酸空位，并为该空位中的每一个残基位置施加空位延伸罚分。所采用的示例性比对参数是：BLOSUM62打分矩阵，空位存在罚分＝11，空位延伸罚分＝1。比对分数由每条序列的该对比开始和结束的氨基酸位置(如比对窗口)，以及任选由一条或两条序列中一个空位或多个空位的插入来限定，以实现可能的最高相似性分数。
两条或更多条序列之间的最佳比对可通过目测手动来确定，或通过使用计算机，例如但不限于如BLASTP程序(用于氨基酸序列)和BLASTN程序(用于核酸序列)(例如参见Altschul等人，NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)，25(17):3389-3402(1997)；还可参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站)或CLUSTALW程序来确定。
如果所关注的多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的氨基酸序列，则该所关注的多肽可被说成是与参考多肽是“实质上相同的”。两条这类多肽之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的多肽序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如在某条多肽与第二多肽仅因保守氨基酸置换或一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况中，这两条多肽是实质上相同的。
如果所关注的核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的核苷酸序列，则所关注的核酸可说成是与参考核酸“实质上相同”。两条这类核酸之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的核酸序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列实质上相同的一个指示是这两条核酸分子在严格条件(例如，在中等严格性至高严格性的范围内)下彼此杂交。
如本文所用，关于所关注的特定组分的“分离的”意指组分基本上或实质上不含其它组分。例如，“分离的”多肽意指该多肽基本上或实质上不含其它组分，包括但不限于例如其他多肽和细胞组分。“分离的”核酸意指该核酸基本上或实质上不含其它组分，包括但不限于其他核酸和细胞组分。出于本申请的目的，“分离的”指不是文库(例如筛选文库)的一部分的核酸或多肽。
纯度和同质性通常用分析化学技术(如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱)来确定。作为制备物中存在的主要物质的蛋白质或核酸是实质上纯化的。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经受密度梯度离心的介质中基本上产生一个带。具体而言，“纯化的”意指当分离时，以分离物的重量计，分离物含有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更高的核酸或蛋白质。纯化的多肽可通过多种方法获得，这些方法包括但不限于例如实验室合成；色谱法(如高效液相色谱法)；制备电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后进行染色可视化；离心；沉淀；亲和纯化等等。(一般参见RScopes,ProteinPurification(蛋白质纯化)，Springer-Verlag(施普林格),N.Y.(纽约)(1982)；Deutscher，MethodsinEnzymol.(酶学方法)，第182卷：GuidetoProteinPurification(《蛋白质纯化指导》)，AcademicPress,Inc.(美国学术出版社)，N.Y.(纽约)(1990))。本发明包括分离的或纯化的多肽(如本发明的分离的蛋白酶变体或枯草杆菌蛋白酶变体)和分离的或纯化的核酸(如编码本发明的蛋白酶变体或枯草杆菌蛋白酶变体的核酸)。
在相关的意义上，本发明提供对组合物富集一种或多种本发明的分子如一种或多种本发明的多肽(例如一种或多种本发明的蛋白酶变体)或一种或多种本发明的核酸(例如一种或多种本发明的编码一种或多种蛋白酶变体的核酸)的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则对组合物富集了该分子。以特定组合物中的所有大分子物质的重量计(以摩尔浓度计)，实质上纯的多肽或核酸将通常占至少约60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98、99％、99.5％或更高。
如本文所用，术语“组合诱变”指产生参考核酸序列的核酸变体的文库的方法。在这些文库中，变体含有选自一组预定突变的一个或数个突变。这类方法还提供了引入随机突变的手段，这些随机突变不是该预定突变组的成员。一些这类方法包括在美国专利No.6,582,914中列出的那些方法，藉此以引用的方式将该专利并入本文。一些这类组合诱变方法包括和/或涵盖在市售试剂盒(如多定点诱变试剂盒(Stratagene公司))中体现的方法。
如本文所用，与蛋白酶变体结合使用的具有“改善的特性”，是指与参考或亲本蛋白酶相比具有改善的特性的蛋白酶变体。本发明的蛋白酶变体可展现出如下特性中的一者或多者：与所关注的参考蛋白酶或亲本蛋白酶相比，增强的或改善的蛋白水解活性、增强的或改善的稳定性、增强的或改善的清洁表面或物品的能力、增强的或改善的清洁性能、增强的或改善的织物或衣物清洁性能或洗涤性能、增强的或改善的手洗性能、增强的或改善的手动或人工盛具洗涤性能、增强的或改善的自动盛具洗涤性能、增强的或改善的洗衣性能。
如本文所用，术语“功能测定法”指提供蛋白质活性的指示的测定法。该术语通常指其中针对蛋白质以其惯常的本领发挥作用的能力对该蛋白质进行分析的测定系统。例如，就酶而言，功能测定法涉及测定该酶催化反应的效力。
在分子的语境中术语“性质”或其语法上的等价物可以指该分子的可以选择或检测的任何特性或属性。例如，在多肽的语境中，性质可以是酶活性(如蛋白水解活性)、稳定性或其他性质。
“突变型”核酸序列通常指这样的核酸序列，其在宿主细胞的野生型序列中存在的至少一个密码子中具有变更，使得该突变型核酸序列的表达产物是相对于野生型蛋白质而言具有改变的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可具有改变的功能本领(例如增强的酶活性)。
如本文所用，术语“净电荷”定义为分子中存在的所有电荷的总和。可对亲本蛋白质分子作出“净电荷改变”，以提供具有与该亲本蛋白质分子的净电荷不同的净电荷的蛋白质变体(即该变体具有的净电荷与亲本分子的净电荷不相同)。例如，用一个带负电荷的氨基酸置换蛋白质的一个中性氨基酸或用一个中性氨基酸置换蛋白质的一个带正电荷的氨基酸，会导致相对于未经修饰的蛋白质而言净电荷为-1。用一个带负电荷的氨基酸置换一个带正电荷的氨基酸，会导致相对于未经修饰的蛋白质而言净电荷为-2。用一个带正电荷的氨基酸置换蛋白质的一个中性氨基酸或用一个中性氨基酸置换蛋白质的一个带负电荷的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为+1。用一个带正电荷的氨基酸置换一个带负电荷的氨基酸，会导致相对于未经修饰的蛋白质而言净电荷为+2。亲本蛋白质的净电荷还可通过缺失和/或插入一个或多个带电荷的氨基酸来改变。
关于多肽的术语“热稳定的”和“热稳定性”指该多肽对仅由热(例如，通过暴露于高温)而引起的其活性的永久改变有抗性。例如，热稳定的酶意指该酶对仅由热(例如，通过暴露于高温)而引起的其酶活性的永久改变有抗性。通常，热稳定的蛋白酶在给定的时期(例如至少约60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟等)内暴露于升高的温度后能够保持其蛋白水解活性的至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％。
多肽或蛋白酶的清洁活性可指蛋白酶所实现的清洁性能。清洁活性可通过使用各种用于清洁物体、物品或表面上的各种酶敏感性污渍(例如由食物、草、血、墨、血/奶/墨、奶/油/颜料、蛋黄、奶、油和/或卵蛋白质引起的污渍)之一者或多者的测定法来测定。多肽(例如本发明的多肽(如蛋白酶变体)或参考多肽(例如参考蛋白酶))的清洁性能，可通过使物体、物品或表面上的污渍经受标准的洗涤条件并使用各种色谱方法、分光光度方法或其它定量方法评估污渍被除去的程度来测定。示例性的清洁测定法和方法是本领域已知的，包括但不限于WO99/34011和美国专利6,605,458(将这二者均以引用的方式并入本文)中描述的那些方法以及下文提供的第I部分实施例和第II部分实施例中包括的那些清洁测定法和方法。
术语蛋白酶变体或参考蛋白酶的“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中实现所需水平的酶活性的蛋白酶的量。这种有效量可由本领域一般技术人员容易地确定并且基于多种因素，如所用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成，以及是需要液体组合物还是干燥(例如颗粒状、片状、条棒状)组合物等等。
术语“清洁辅助材料”是指清洁组合物中包含的除本发明蛋白酶变体之外的任何液体、固体或气体材料。本发明的清洁组合物可包括一种或多种清洁辅助材料。每种清洁辅助材料通常根据清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、条、糊、喷雾、片、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择。优选地，每种清洁辅助材料与组合物中所用的蛋白酶相容。
在清洁活性的语境中术语“增强的性能”是指酶对某些酶敏感性污渍如蛋、奶、草、墨、油和/或血的增加的或更高的清洁活性，这种活性是在标准的洗涤循环和/或多个洗涤循环后通过常用的评价法来测定的。
在清洁活性的语境中术语“减低的性能”是指酶对某些酶敏感性污渍如蛋、奶、草或血的降低的或较小的清洁活性，这种活性是在标准的洗涤循环后通过常用的评价法来测定的。
如本文所用，术语“公共场所用清洁组合物”是指适用于公共场所(包括但不限于学校、医院、工厂、商场、公司、建筑物、餐馆、办公楼和商厦、加工和/或制造车间、兽医院、工厂化农场、工厂化牧场等)的产品。
如本文所用，“织物和家庭护理用产品”是指通常旨在以其销售时的形式使用或消费以及用于处理的织物、硬质表面以及织物和家庭护理领域中任何其他表面的产品或装置，包括：空气护理(包括空气清新剂和香味递送系统)、汽车护理、盛具洗涤、织物调理(包括软化和/或鲜化(freshening))、衣物洗涤、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬质表面清洁和/或处理(包括地板和抽水马桶清洁剂，以及用于消费者和公共设施用途的其他清洁产品)。
如本文所用，术语“清洁组合物”和“清洁制剂”是指可用于从待清洁物品除去不期望的化合物的组合物，所述待清洁物品为例如但不限于例如织物、衣物、器皿、盛具、隐形眼镜、其他固体基材、毛发(包括人或动物毛发)(香波)、皮肤(肥皂、化妆品和霜剂)、牙齿(漱口水、牙膏)、非织物和家庭护理物体、过滤器、膜(如过滤膜，包括但不限于超滤膜)、硬质表面和其他表面，包括但不限于例如桌子(桌顶面或桌腿)、壁、其他家具物品或物体、地板、天花板等的硬质表面。清洁组合物或清洁制剂可用于个人护理应用和/或用于个人护理物品，例如包括但不限于香波(用于清洁人或动物的毛发)；皂、霜膏或化妆品(用于皮肤清洁和/或皮肤护理)；漱口水(用于口腔护理)；牙膏(用于清洁牙齿和/或口腔护理)。所述术语涵盖被选择用于特定类型的所需清洁组合物或制剂以及用于产品的形式(例如液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)的任何材料/化合物，只要组合物或制剂与组合物或制剂中所用的蛋白酶和/或其他酶相容。通过考虑待清洁的表面、物体或物品(如织物)，以及对于使用期间的清洁条件而言所需的组合物或制剂形式，可容易地作出对清洁组合物或制剂材料的具体选择。在一个方面，清洁组合物或制剂可以是织物和家庭护理产品(如用于清洁衣物的清洁组合物)。在另一个方面，清洁组合物或制剂不是织物和家庭护理产品(如用于清洁隐形眼镜、毛发、牙齿或皮肤，或可用于个人护理应用和/或个人护理物品的清洁组合物)。
清洁组合物和清洁制剂包括适于对任何物体、物品和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。这种组合物和制剂包括但不限于例如：液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片状、凝胶、条状、颗粒和/或固体衣物清洁组合物或洗涤剂组合物以及精细织物洗涤剂组合物；硬质表面清洁组合物和制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、洗衣添加剂清洁组合物和衣物预洗剂清洁组合物；盛具洗涤组合物，包括手动或手工盛具洗涤组合物(如“手动”或“手工”盛具洗涤剂)和自动盛具洗涤用组合物(如“自动盛具洗涤用洗涤剂”)。
除非另外指明，否则如本文所用，清洁组合物或清洁制剂包括颗粒状或粉末形式的多功能洗涤剂或重垢洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片或糊形式的多功能洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精细织物洗涤剂；手动或手工盛具洗涤剂，包括高泡类型的那些；手动或手工盛具洗涤剂、自动盛具洗涤用洗涤剂或盛具或餐具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁条棒、漱口水、假牙清洁剂、汽车清洗剂、地毯清洗剂、浴室清洁剂；个人护理物品，例如但不限于，例如用于人(和其他动物)的洗发香波和/或洗发剂、沐浴凝胶和泡沫浴剂、皮肤护理物品、化妆品、霜剂、浴室肥皂和个人用肥皂；金属清洁剂；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污条”或预处理类型。某些颗粒状组合物为“紧凑”形式；某些液体组合物为“浓缩”形式。
在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体或多肽的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述清洁组合物或洗涤剂组合物可用于清洁隐形眼镜。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体或多肽的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述清洁组合物或洗涤剂组合物可用于个人护理应用。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体或多肽的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述清洁组合物或洗涤剂组合物可用于清洁或漂洗毛发，包括人毛发和/或动物毛发(如洗发香波和/或洗发水)。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体或多肽的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述清洁组合物或洗涤剂组合物可用于清洁或处理皮肤(如人和/或动物皮肤)(如沐浴凝胶、泡沫浴剂、皮肤护理清洁剂、化妆品、霜剂和/或浴室肥皂)。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体或多肽的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述清洁组合物或洗涤剂组合物可用于清洁牙齿和/或假牙和/或用于口腔护理。这类清洁组合物或洗涤剂组合物可包含至少一种辅助成分或载体、至少一种另外的酶、至少一种助洗剂和/或至少一种表面活性剂，并且可配制成适于它们的用途的形式。这类清洁组合物或洗涤剂组合物可含有磷酸盐或可不含磷酸盐。关于本发明组合物的另外的细节在本文的其他地方提供。
如本文所用，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于染污织物(如衣物、亚麻布和其他纺织材料)的浸洗和/或预处理的组合物在内。
如本文所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织物(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于例如手动或手工或自动的盛具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物和个人清洁组合物。
如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于指旨在用于洗涤介质中用来清洁染污的或脏的物体(包括特定的织物和/或非织物物体或物品)的组合物。本发明的这类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，本发明的洗涤剂可包含至少一种本发明的蛋白酶变体，此外还包含一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、过水解酶、氧化还原酶、助洗剂(如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在某些情况下，助洗剂盐为硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选硅酸盐(如偏硅酸钠)比磷酸盐(如三聚磷酸钠)多。一些本发明的组合物(例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物)不含有任何磷酸盐(如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
如本文所用，“盛具洗涤组合物”是指所有形式的用于清洁盛具(包括刀叉盛具)的组合物，包括但不限于颗粒和液体形式。在一些方面，盛具洗涤组合物是可用于自动盛具洗涤机的“自动盛具洗涤”组合物。无意于将本发明受限于任何特定类型的盛具用组合物。实际上，本发明可用于清洁任何材料的盛具(如器皿，包括但不限于盘子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀叉盛具(如器具，包括但不限于匙、刀、叉、餐点器具等)，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃、丙烯酸树脂等。术语“盛具”在本文中用于指盛具和刀叉盛具二者。
如本文所用，术语“漂白”是指以足够的时长和/或在合适的pH和/或温度条件下处理材料(如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增亮(增白)和/或清洁。适用于漂白的化学品的例子包括但不限于例如ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
如本文所用，蛋白酶(如本发明的蛋白酶变体)的“洗涤性能”是指蛋白酶变体对洗涤的贡献，与未向组合物中添加该蛋白酶变体的洗涤剂相比其为洗涤剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较。在一些测试系统中，其他相关因素(如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度)可以以使得某些细分市场中的家居应用(手动或手用盛具洗涤、自动盛具洗涤、盛具清洁、餐具清洁、织物清洁等)的典型条件得以模拟的方式进行控制。
术语“相关洗涤条件”在本文中用于指在手动盛具洗涤、自动盛具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中在家庭中实际上使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
术语“改善的洗涤性能”用于指在相关洗涤条件下在去污方面获得更好的最终结果，或以重量计，相对于相应的野生型或起始亲本蛋白酶，需要较少的蛋白酶变体来获得相同的最终结果。
如本文所用，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。无意于将本发明受限于任何特定表面、物品或待移除的污染物或微生物。
本文的清洁组合物的“紧凑”形式最好由密度反映，就组成来说，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐是大量存在，通常占总组合物的约17重量％至约35重量％。相比之下，在紧凑型组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。填料盐可以不超过所述组合物的约10重量％，或更优选不超过约5重量％的量存在。无机填料盐可选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。填料盐可以是硫酸钠。
在本文中，给定氨基酸序列中氨基酸残基的位置通常利用SEQIDNO:2中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的对应氨基酸残基的位置的编号方式进行编号。SEQIDNO:2的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列因而充当参考序列。可利用本文所述的比对算法将给定氨基酸序列(如本文描述的蛋白酶变体氨基酸序列)与BPN’序列(SEQIDNO:2)比对，该给定氨基酸序列中与BPN’序列中的氨基酸残基比对(优选最佳比对)的氨基酸残基可通过参考该枯草杆菌蛋白酶BPN’序列中的对应氨基酸残基便利地进行编号。
一般来讲，本文所用的命名以及下文描述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学中的实验室方法中的许多方法是众所周知的，并常常为本领域一般技术人员所采用。重组核酸的产生和操纵的方法、核酸合成的方法、细胞培养方法以及转基因掺入(如转染、电穿孔)是本领域技术人员已知的并在许多标准文献中有描述。寡核苷酸合成和纯化步骤通常根据说明书来进行。技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法以及本文通篇中提供的各种一般文献来进行。本文的程序据信是本领域普通技术人员所熟知的，并为了阅读者的便利而提供。
织物和家庭护理产品可包含蛋白酶(包括蛋白酶变体)，包括一种或多种本发明的蛋白酶变体在内，以及选自包含香料的胶囊、调色剂、两亲性清洁聚合物以及它们的混合物的材料，上述组合物的任何方面的余量由一种或多种辅助材料补足。在上述织物和家庭护理产品的一个方面，以总织物和家庭护理产品重量计，所述织物和家庭护理产品可包含约0.005重量百分比(0.0005重量％)至约0.1重量％、约0.001重量％至约0.05重量％或甚至约0.002重量％至约0.03重量％的所述蛋白酶。在上述织物和家庭护理产品的一个方面，以总织物和家庭护理产品重量计，所述织物和家庭护理产品可包含约0.00003重量％至约0.1重量％、约0.00008重量％至约0.05重量％或甚至约0.0001重量％至约0.04重量％的织物调色剂(hueingagent)。在上述织物和家庭护理产品的一个方面，以总织物和家庭护理产品重量计，所述织物和家庭护理产品可包含约0.001重量％至约5重量％、约0.01重量％至约2重量％或甚至约0.03重量％至约0.5重量％的香料胶囊。在上述织物和家庭护理产品的一个方面，以总织物和家庭护理产品重量计，所述织物和家庭护理产品可包含约0.1重量％至约5重量％、约0.25重量％至约2.5重量％或甚至约0.3重量％至约1.5重量％的两亲性清洁聚合物。
本发明的多肽
本发明提供新型多肽，它们可统称为“本发明的多肽”。本发明的多肽包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体，包括例如枯草杆菌蛋白酶变体多肽在内，其具有酶活性(例如蛋白水解活性)和/或本文其他地方更详细论述的另外的特性(例如清洁活性、稳定性等)。本发明的多肽包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的冷水蛋白酶，其具有蛋白水解活性、清洁活性、稳定性和本文其他地方论述的其他特性。本发明的这种多肽，包括冷水蛋白酶在内，可相对于已知的蛋白酶具有增强的性能(增强的蛋白水解活性、增强的清洁性能或活性、增强的稳定性等)。本发明的多肽可用于清洁应用，并且可掺入可在清洁需要进行清洁的物品或表面(如物品的表面)的方法中使用的清洁组合物中。具有蛋白水解活性的本发明的多肽可用于织物和家庭护理产品，包括例如织物和家庭护理清洁组合物。某些具有蛋白水解活性的本发明多肽可用于个人护理组合物。具有蛋白水解活性的本发明多肽也可用于非织物和家庭护理产品(即本文描述的不是织物和家庭护理产品的那些产品)。本发明的蛋白酶变体可以是枯草杆菌蛋白酶变体。本发明包括芽孢杆菌蛋白酶变体和芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶变体。
本发明的多肽在本说明书通篇中公开，包括但不限于下文提供的第I部分实施例和第II部分实施例。本发明包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的蛋白酶变体(例如枯草杆菌蛋白酶变体)，所述多肽包含与下面第I和第II部分实施例任一者中列出的具体蛋白酶变体氨基酸序列具有至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一个方面，本发明包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶多肽，其中所述多肽是SEQIDNO:2的BPN’序列的蛋白酶变体，并且所述多肽包含与SEQIDNO:2具有至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性的氨基酸序列以及第I部分实施例任一者中列出的一组氨基酸置换。在一个方面，本发明包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶多肽，其中所述多肽是SEQIDNO:755的GG36序列的蛋白酶变体，并且所述多肽包含与SEQIDNO:755具有至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性的氨基酸序列以及第II部分实施例任一者中列出的一组氨基酸置换。
在第一个方面，本发明提供亲本蛋白酶的分离的或非天然存在的多肽蛋白酶变体，所述变体具有蛋白水解活性并且包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的一个或多个与SEQIDNO:2的氨基酸位置对应的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列，其中所述至少一个变更独立地是(i)在占据所述位置的氨基酸残基的上游或下游插入一个或多个氨基酸残基，(ii)占据所述位置的氨基酸残基缺失，或者(iii)占据所述位置的氨基酸残基置换为另一不同的氨基酸残基，其中每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。根据本发明的第一个方面的蛋白酶的变体可称为蛋白酶变体。根据本发明的第一个方面的变体可以是非天然存在的蛋白酶。根据本发明的第一个方面的变体可以是分离的或纯化的。根据本发明的第一个方面的变体可以是枯草杆菌蛋白酶变体。根据本发明的第一个方面的变体可具有蛋白水解活性。与SEQIDNO:2所示的BPN'氨基酸序列的蛋白水解活性相比，根据本发明的第一个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性。
根据本发明的第一个方面的变体可以是亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶，并且该枯草杆菌蛋白酶可以是芽孢杆菌蛋白酶。根据本发明的第一个方面的亲本芽孢杆菌蛋白酶可选自解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQIDNO:2)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、芽孢杆菌TS-23、苏云金芽孢杆菌、BPN'-v3(SEQIDNO4:)和BPN'-v36(SEQIDNO:6)。根据本发明的第一个方面的亲本蛋白酶可包含与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
根据本发明的第一个方面的变体可以是具有成熟形式的蛋白酶变体。根据本发明的第一个方面的变体可以是具有成熟形式的蛋白酶变体。
根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的两个氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的三个氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的四个氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的五个氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的六个氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的蛋白酶的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的与SEQIDNO:2的位置对应的氨基酸位置中的每一者处具有变更的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的某个位置处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。
根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的两个或三个位置中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的四个位置中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的五个位置中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的六个或七个位置中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含在位置24、53、78、101、128和217中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列，其中每个位置均通过与SEQIDNO:2中的位置的对应关系进行编号。
根据本发明的第一个方面的变体可包含具有至少一个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含具有至少两个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含具有至少三个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含具有至少四个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含具有至少五个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含具有至少六个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含具有选自如下的一组置换的氨基酸序列：(a)X128A/S和/或X217L/Q、(b)G128A/S和/或Y217L/Q以及(c)G097A、G128A/S和Y217L/Q。根据本发明的第一个方面的变体可包含具有氨基酸置换X024G/R+X053G+X078N+X101N+X128A/S+X217Q/L的氨基酸序列，其中所述变体具有蛋白水解活性；并且其中任选地，所述变体与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示蛋白酶相比具有增强的蛋白水解活性或增强的清洁活性，或者在蛋白水解测定(如AAPF测定)或清洁测定(如BMI、草或蛋微样本测定)中性能指数高于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所示的蛋白酶的性能指数。
根据本发明的第一个方面的变体可包含至少一个选自S024G、S053G、S078N、S101N、G128A/S和Y217Q的氨基酸置换。根据本发明的第一个方面的变体可包含具有氨基酸置换S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q的氨基酸序列。
根据本发明的第一个方面的变体可包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、80％或85％序列同一性的的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。根据本发明的第一个方面的变体可包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
与SEQIDNO:2所示的蛋白酶的蛋白水解活性相比，根据本发明的第一个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性。与SEQIDNO:4所示的蛋白酶的蛋白水解活性相比，根据本发明的第一个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性。与SEQIDNO:6所示的蛋白酶的蛋白水解活性相比，根据本发明的第一个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性。与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示的蛋白酶的清洁活性相比，根据本发明的第一个方面的变体可具有增强的清洁活性。根据本发明的第一个方面的变体在蛋白水解测定(如AAPF测定)或清洁测定(如BMI、草或蛋微样本测定)中性能指数可高于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所示的蛋白酶的性能指数。
在第二个方面，本发明提供亲本蛋白酶的分离的或非天然存在的多肽蛋白酶变体，所述变体包含具有三个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换的氨基酸序列，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示的蛋白酶相比，根据本发明的第一个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性或增强的清洁活性。根据本发明的第一个方面的变体在蛋白水解测定(如AAPF测定)或清洁测定(如BMI、草或蛋微样本测定)中性能指数可高于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所示的蛋白酶的性能指数。
根据本发明的第二个方面的变体包含具有三个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换的氨基酸序列，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。根据本发明的第二个方面的变体可包含具有四个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第二个方面的变体可包含具有五个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第二个方面的变体可包含具有六个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换的氨基酸序列。根据本发明的第二个方面的变体可包含还具有氨基酸置换X097A的氨基酸序列。根据本发明的第二个方面的变体可包含具有氨基酸置换X024G/R+X053G+X078N+X101N+X128A/S+X217L/Q或X097A+X128A/S+X217L/Q的氨基酸序列。
根据本发明的第二个方面的变体可包含具有氨基酸置换S024G/R+S053G+S078N+S101N+G128A/S+Y217L/Q或G097A+G128A/S+Y217L/Q的氨基酸序列。根据本发明的第二个方面的变体可包含具有氨基酸置换S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q或S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q的氨基酸序列。
根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N109G。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N076D。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S033T。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N243V。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S248A。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换A088T。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S063G。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可还包含两个或更多个选自N109G、N076D、S033T、N243V、S248A、A088T和S063G的置换。
根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可包含具有氨基酸置换S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q或S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q的氨基酸序列，并且可还包含选自如下的一组氨基酸置换：A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、S033T+N076D、S009T+N109G+K141R+N243V、S162G+K256R、N109G+A116T、N109G+L257G、S162G+L257G、N061G+N109G+N243V、N109G+N243V+S248A、S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R、N109G+A116T+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、A088T+N109G、N109G+N243V、T158S+L257G、N061S+N109G+N243V、P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、N109G+K256R、N109G+N243V+K256R、S063G+K256R、S063G+N109G、S063G、S063G+N076D、S033T+N076D+N218S和N076D+N218S。
根据本发明的第二个方面的变体可包含具有氨基酸置换S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q的氨基酸序列，并且可还包含选自如下的一组氨基酸置换：A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、S033T+N076D、S009T+N109G+A128S+K141R+N243V、S162G+K256R、N109G+A116T、N109G+L257G、S162G+L257G、N061G+N109G+N243V、N109G+A128S+N243V+S248A、S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R、N109G+A116T+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、A088T+N109G、N109G+N243V、T158S+L257G、N061S+N109G+N243V、P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R、S009T+S018T+Y021N+N109G+A128S+K141R、A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、N109G+K256R、N109G+A128S+N243V+K256R、S063G+K256R、S063G+N109G、S063G+A128S、S063G+N076D、S033T+N076D+A128S+N218S和N076D+N218S，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。要注意的是，例如，包含具有置换S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q的序列并且还包含一组置换S009T+N109G+A128S+K141R+N243V的根据本发明的第二个方面的变体在位置128处具有丝氨酸(S)，因为位置128中的丙氨酸(即G128A置换)被S置换(A128S置换)。
根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少60％、65％或70％的序列同一性。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少80％或85％的序列同一性。根据本发明的第二个方面的变体的氨基酸序列可与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的序列同一性。
根据本发明的第二个方面的亲本蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶。根据本发明的第二个方面的亲本蛋白酶可包含与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。根据本发明的第二个方面的变体可以是具有成熟形式的蛋白酶变体。根据本发明的第一个方面的变体可以是具有成熟形式的蛋白酶变体。
本发明还提供了分离的根据本发明的第二个方面的多肽(如蛋白酶变体)，其包含与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列并且包含选自如下的一组氨基酸置换：
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、
S033T+N076D、
S009T+N109G+A128S+K141R+N243V、
S162G+K256R、
N109G+A116T、
N109G+L257G、
S162G+L257G、
N061G+N109G+N243V、
N109G+A128S+N243V+S248A、
S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R、
N109G+A116T+N243V+K256R、
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、
A088T+N109G、
N109G+N243V、
T158S+L257G、
N061S+N109G+N243V、
P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R、
S009T+S018T+Y021N+N109G+A128S+K141R、
A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、
A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、
N109G+K256R、
N109G+A128S+N243V+K256R、
S063G+K256R、
S063G+N109G、
S063G+A128S、
S063G+N076D、
S033T+N076D+A128S+N218S和
N076D+N218S，
其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示的蛋白酶相比，这种多肽可具有增强的蛋白水解活性或增强的清洁活性。这种多肽在蛋白水解测定(如AAPF测定)或清洁测定(如BMI、草或蛋微样本测定)中性能指数可高于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所示的蛋白酶的性能指数。与具有SEQIDNO:2的序列的BPN'蛋白酶的蛋白水解活性相比，根据本发明的第二个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性。与具有SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的序列的蛋白酶的蛋白水解活性相比，根据本发明的第二个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性。根据本发明的第二个方面的变体的亲本蛋白可以是枯草杆菌蛋白酶，并且任选地，该枯草杆菌蛋白酶可以是芽孢杆菌蛋白酶。根据本发明的第二个方面的变体的亲本枯草杆菌蛋白酶可选自解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQIDNO:2)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、芽孢杆菌TS-23、苏云金芽孢杆菌、BPN'-v3(SEQIDNO4:)和BPN'-v36(SEQIDNO:6)。根据本发明的第二个方面的亲本蛋白酶可包含与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
根据本发明的第二个方面的变体可以是具有成熟形式的蛋白酶变体。根据本发明的第二个方面的亲本蛋白酶可以是具有成熟形式的蛋白酶。
根据本发明的第二个方面的变体可包含与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在第三个方面，本发明提供分离的或非天然存在的具有蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含与选自如下的多肽序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：
a)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G；
b)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S033T+N076D；
c)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+N109G+K141R+N243V；
d)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+K256R；
e)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T；
f)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+L257G；
g)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+L257G；
h)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061G+N109G+N243V；
i)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+S248A；
j)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R；
k)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T+N243V+K256R；
l)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V；
m)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G；
n)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+N243V；
o)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+T158S+L257G；
p)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061S+N109G+N243V；
q)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R；
r)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R；
s)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R；
t)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G；
u)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+K256R；
v)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+K256R；
w)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+K256R；
x)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N109G；
y)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S063G；
z)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N076D；
aa)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N218S；
bb)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N076D+N218S；以及
cc)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q，其中所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示的蛋白酶相比，根据本发明的第三个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性或增强的清洁活性。根据本发明的第三个方面的变体在蛋白水解测定(如AAPF测定)或清洁测定(如BMI、草或蛋微样本测定)中性能指数可高于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所示的蛋白酶的性能指数。
根据本发明的第三个方面的多肽可包含上面a)至cc)任一者中示出的氨基酸序列或它们任一者的具有蛋白水解活性的片段，或由上面a)至cc)任一者中示出的氨基酸序列或它们任一者的具有蛋白水解活性的片段组成。根据本发明的第三个方面的变体或亲本蛋白酶可以是成熟形式。
在第四个方面，本发明提供分离的或非天然存在的具有蛋白酶活性的多肽，这些多肽选自：(a)包含与SEQIDNO:6的多肽序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在至少高严格条件下与(i)SEQIDNO:5的多核苷酸序列或(ii)(i)的互补多核苷酸序列杂交的多核苷酸编码的多肽；和(c)由包含与SEQIDNO:5的多核苷酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽。根据本发明的第四个方面的多肽可包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或其具有蛋白水解活性的片段，或者由SEQIDNO:6的氨基酸序列或其具有蛋白水解活性的片段组成。与成熟BPN'(SEQIDNO:2)相比，根据本发明的第四个方面的变体可具有增加的蛋白水解活性和/或清洁性能或活性。与SEQIDNO:4或SEQIDNO:6相比，根据本发明的第四个方面的变体可具有增加的蛋白水解活性和/或清洁性能或活性。根据本发明的第四个方面的变体或亲本蛋白酶可以是成熟形式。
在第五个方面，本发明提供分离的或非天然存在的亲本蛋白酶的蛋白酶变体，其中：(a)相对于亲本蛋白酶，所述变体包含具有不超过25、20、15或10个变更的氨基酸序列，其中(i)所述变更独立地选自插入、缺失或置换，以及(ii)所述变更包括位置24和53处的甘氨酸置换、位置78和101处的天冬酰胺置换、位置128处的丙氨酸或丝氨酸置换以及位置217处的谷氨酰胺置换，(b)所述亲本蛋白酶与SEQIDNO:2具有至少90％的序列同一性，(c)SEQIDNO:2的氨基酸序列用于确定位置编号方式；以及(d)相对于亲本蛋白酶，所述变体具有增加的蛋白水解活性，其中每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的序列同一性。
根据本发明的第五个方面的亲本蛋白酶可与EQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的序列具有至少80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。根据本发明的第五个方面的亲本蛋白酶可以是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白酶。根据本发明的第五个方面的变体或亲本蛋白酶可以是成熟形式。
根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N109G。根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N076D。根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S033T。根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N243V。根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S248A。根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换A088T。根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S063G。
根据本发明的第五个方面的变体的氨基酸序列可还包含选自如下的一组氨基酸置换：A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、S033T+N076D、S009T+N109G+K141R+N243V、S162G+K256R、N109G+A116T、N109G+L257G、S162G+L257G、N061G+N109G+N243V、N109G+N243V+S248A、S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R、N109G+A116T+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、A088T+N109G、N109G+N243V、T158S+L257G、N061S+N109G+N243V、P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、N109G+K256R、N109G+N243V+K256R、S063G+K256R、S063G+N109G、S063G、S063G+N076D、S033T+N076D+N218S和N076D+N218S。
根据本发明的第五个方面的亲本蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶。根据本发明的第五个方面的亲本蛋白酶可以是SEQIDNO:2中所示的BPN'。与SEQIDNO:4或SEQIDNO:6相比，根据本发明的第五个方面的变体具有增加的蛋白水解活性和/或清洁性能或活性。
在第六个方面，本发明提供亲本蛋白酶的分离的或非天然存在的蛋白酶变体，其中(a)所述变体包含(i)与SEQIDNO:2的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％同一性并且(ii)在位置24和53处具有甘氨酸置换、在位置78和101处具有天冬酰胺置换、在位置128处具有丙氨酸或丝氨酸置换以及在位置217处具有谷氨酰胺置换的氨基酸序列；(b)所述亲本蛋白酶与SEQIDNO:2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；(c)所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号；以及(d)相对于亲本蛋白酶，所述变体具有增加的蛋白水解活性。根据本发明的第六个方面的亲本蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶。根据本发明的第六个方面的亲本蛋白酶可以是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白酶。分别与亲本蛋白酶的蛋白水解活性和/或清洁活性相比，根据本发明的第六个方面的变体可具有增加的蛋白水解活性和/或清洁活性。
根据本发明的第六个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N109G。根据本发明的第六个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N076D。根据本发明的第六个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S033T。根据本发明的第六个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换N243V。根据本发明的第六个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S248A。根据本发明的第六个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换A088T。根据本发明的第六个方面的变体的氨基酸序列可还包含置换S063G。
根据本发明的第六个方面的变体的氨基酸序列可还包含选自如下的一组氨基酸置换：A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、S033T+N076D、S009T+N109G+K141R+N243V、S162G+K256R、N109G+A116T、N109G+L257G、S162G+L257G、N061G+N109G+N243V、N109G+N243V+S248A、S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R、N109G+A116T+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、A088T+N109G、N109G+N243V、T158S+L257G、N061S+N109G+N243V、P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、N109G+K256R、N109G+N243V+K256R、S063G+K256R、S063G+N109G、S063G、S063G+N076D、S033T+N076D+N218S和N076D+N218S。
与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6相比，根据本发明的第六个方面的变体可具有增加的蛋白水解活性和/或清洁性能或活性。根据本发明的第六个方面的变体在蛋白水解测定(如AAPF测定)或清洁测定(如BMI、草或蛋微样本测定)中性能指数可高于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所示的蛋白酶的性能指数。根据本发明的第六个方面的变体或亲本蛋白酶可以是成熟形式。
在第七个方面，本发明提供具有SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的BPN'枯草杆菌蛋白酶的分离的或非天然存在的蛋白酶变体，所述蛋白酶变体选自：
(a)包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白酶变体，所述变体与SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:4的蛋白酶相比具有增加的蛋白水解活性和/或增加的清洁活性，其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号，并且其中所述变体相对于SEQIDNO:2包含选自群组(i)至(x)的至少一组氨基酸置换：
(i)G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218A和G097A-G128A-P210S-Y217Q；
(ii)S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q-T244N、N061A-S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A、S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Q185T-Y217Q、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q-T244I和S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q；
(iii)S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q-T244N、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q和S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q-T244I；
(iv)G097A-I111V-M124V-Y217Q、G097A-I111V-Y167A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-V203Y-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q和V068A-A092G-Y217Q；
(v)N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q；
(vi)N061P-G097A-G128S-Y217Q、N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q；
(vii)N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N、S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q；
(viii)S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q；
(ix)N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q；和
(x)S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A、S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A、N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N、N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、T055P-N061P-G097A-A116S-G128A、S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、G097A-G128S-Y217Q、S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q；以及
(b)包含与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白酶变体，所述变体与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6相比具有增加的蛋白水解活性和/或增加的清洁活性，其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号，并且其中所述变体相对于SEQIDNO:6包含选自群组(i)至(xv)的至少一组氨基酸置换：
(i)选自如下的至少一个相对于SEQIDNO:6的置换：A116V、G160S、I111L、I115V、N109S、N117M、P005G、Q059V、T164S、Y262M、A015Q、A015S、A098E、A098N、A098S、A098T、A098V、A098Y、A114S、A114T、A116G、A116L、A116S、A116T、A116W、A133G、A133H、A133T、A133V、A137G、A137I、A137L、A137S、A137T、A138S、A216E、A216F、A216V、D099S、D181E、F261A、F261Q、G024F、G024I、G024Q、G024Y、G097S、G160T、G211L、G211V、H017F、H017W、H039V、H226A、I031V、I111V、I268V、K170R、K265R、L016Q、L016T、L135M、L209T、L209V、L233M、L257T、L257V、L267A、L267V、N025A、N025I、N025Q、N025R、N025T、N025V、N101I、N101Q、N101S、N109A、N109G、N109H、N109L、N109M、N109Q、N109T、N117Q、N184A、N184L、N184T、N184W、N212G、N212L、N212V、N243P、N252G、N252M、P005T、P014S、P040G、P040L、P040Q、P129A、P129S、P172G、P172S、P194Q、P210A、P210S、Q185F、Q185G、Q185I、Q185M、Q185N、Q185S、Q275H、R186K、S009A、S009G、S009H、S009M、S018T、S130T、S132N、S145K、S159T、S161I、S161K、S161N、S161T、S162I、S162M、S162Y、S163G、S182F、S182G、S182V、S182W、S183F、S183L、S183M、S183T、S183V、S183W、S224A、S236T、S249V、T022A、T022G、T022Q、T022V、T208V、T242S、T253N、T253S、T254A、T254S、T255L、T255S、T255V、V004A、V004P、V004W、V084C、V139C、V165M、V203F、Y021K、Y021N、Y021T、Y021V、Y167F、Y171F、Y214F、Y262F和Y262T；
(ii)选自如下的至少一个相对于SEQIDNO:6的置换：A216E、L090I、A098R、A098W、A098Y、A116G、A116R、A116S、A133M、I107L、I115V、M124L、N101I、N109H、N109S、N109T、N117R、P005G、Q185L、S089V、V095A、A015Y、A029G、A098D、A098E、A098G、A098N、A098S、A098T、A098V、A114S、A114T、A116E、A116L、A116T、A116V、A133H、A133L、A133S、A137G、A137I、A137L、A137S、A137V、A138S、A144S、A144V、A176S、A176T、A187T、A216F、A216P、A216Q、A216R、A216S、A216T、A216V、A216Y、D041E、D120A、D120E、D120Q、D120R、D120S、D181S、G020A、G020S、G024A、G097A、G097D、G097S、G131Q、G160S、G166I、G211L、G215N、H039N、H238N、I111L、I111V、I122A、L075I、L075Q、L135M、L209T、L209V、L233V、L235M、L235R、L257A、M119I、N025A、N025G、N025T、N061K、N101F、N101H、N101L、N101Q、N101R、N101S、N101T、N109A、N109G、N109K、N109L、N117E、N117H、N117K、N117S、N212G、N212S、N218F、N218G、N218H、N218L、N218S、N218W、N240Q、N252M、N252R、N252S、P005T、P040A、P040G、P040T、P129D、P129S、P194S、P210R、Q019R、Q019W、Q103L、Q103W、Q185A、Q185G、Q185M、Q185R、Q185T、Q206G、Q206Y、Q217A、Q217E、Q217R、Q217S、Q217T、S003Q、S009H、S018M、S033T、S130A、S130F、S130G、S130T、S130V、S145T、S159A、S161N、S161T、S162V、S162Y、S182L、S182W、S183F、S183L、S183V、S183W、S188K、S188W、S236Q、S236T、S248L、T022H、T022K、T208C、T253H、T255V、V044I、V121I、V139C、V143H、V143Q、V143T、V143W、V143Y、Y006K、Y021A、Y104W、A001F、A001G、A001H、A001K、A001L、A001Q、A001S、A001Y、A013V、A015G、A015K、A015R、A015S、A015T、A015W、A048S、A073N、A073S、A092S、A098K、A098P、A116D、A116W、A128S、A133P、A133T、A133V、A134G、A134S、A137H、A137N、A137T、A144D、A144K、A144L、A144M、A144N、A144R、A179G、A179S、A187V、A216G、A216L、A216W、A223S、A230C、A272K、A272L、A272P、A272S、A272T、A272W、A273G、A273S、A274G、A274M、A274T、D120K、D140E、D181A、D181E、D181G、D181H、D181T、D259E、D259N、D259Q、E054D、E156D、E156T、E251L、E251T、E251V、F058Y、F189W、F261K、F261Q、F261R、G007A、G007S、G020F、G020H、G020N、G020Q、G020T、G020Y、G024F、G024Q、G024R、G024T、G024V、G024W、G024Y、G053T、G097K、G097M、G097R、G097T、G131A、G131H、G131P、G131R、G131T、G131V、G160H、G160T、G166C、G166Q、G166S、G166T、G211A、G211D、G211K、G211M、G211N、G211Q、G211R、G211V、G211W、G215S、G215T、G215W、H017T、H017W、H017Y、H039V、H226A、H226F、H226I、H226L、H226M、H226V、I035V、I079A、I079S、I108V、I205V、I234L、I234V、I268V、K012S、K043P、K136H、K136R、K141A、K141F、K141T、K141W、K170A、K170G、K170R、K213A、K213R、K213S、K237A、K237H、K237L、K237S、K237V、K256A、K256G、K256H、K256M、K256P、K256Q、K256R、L016A、L016Q、L016T、L016V、L042V、L075M、L075T、L082M、L082V、L135F、L196I、L209H、L209Q、L209R、L209S、L209W、L233A、L233M、L233Q、L235I、L235K、L250I、L257S、L257T、L257V、L267A、L267Q、L267T、L267V、M119C、M199V、N025C、N025E、N025F、N025I、N025K、N025L、N025M、N025Q、N025V、N025Y、N061F、N061P、N061S、N061T、N076G、N078S、N101A、N109M、N109Q、N109R、N117A、N117M、N117Q、N118D、N118G、N118H、N118Q、N118R、N118S、N184A、N184C、N184G、N184L、N184R、N184S、N184T、N184V、N184W、N212C、N212F、N212I、N212K、N212L、N212P、N212Q、N212R、N212V、N212W、N212Y、N218A、N218P、N218T、N240A、N240E、N240G、N240H、N240L、N240R、N240S、N240T、N243C、N243Q、N243T、N243V、N252A、N252G、N252K、N252Q、P014G、P014Q、P014R、P014S、P014T、P040F、P040L、P040Q、P040S、P040V、P086C、P086H、P086S、P129A、P129E、P129G、P129K、P129R、P172A、P172K、P172Q、P172S、P194A、P194G、P194H、P194L、P194M、P194Q、P194R、P194V、P194W、P194Y、P210A、P210G、P210L、P210S、P239K、P239R、Q002A、Q002S、Q010A、Q010N、Q010R、Q010T、Q019A、Q019C、Q019D、Q019G、Q019S、Q019T、Q019V、Q059I、Q059V、Q103S、Q185F、Q185H、Q185I、Q185K、Q185N、Q185S、Q185Y、Q206H、Q206L、Q206P、Q206W、Q217F、Q217H、Q217I、Q217K、Q217L、Q217N、Q217V、Q271G、Q271R、Q271T、Q275F、Q275P、Q275R、R186A、R186I、R186K、S003A、S003F、S003G、S003H、S003K、S003R、S003T、S009T、S018N、S018T、S037G、S037T、S037V、S038G、S038Q、S063N、S063Q、S063T、S089M、S089N、S130K、S130L、S130R、S130W、S132N、S145G、S145K、S145M、S145R、S145V、S159C、S159H、S159L、S159Q、S159R、S159T、S159W、S161A、S161C、S161G、S161H、S161I、S161K、S161P、S161Q、S161R、S162F、S162G、S162I、S162L、S162M、S162N、S162P、S162R、S163G、S173A、S173G、S182F、S182G、S182K、S182N、S182Q、S182V、S183A、S183M、S183Q、S183R、S183T、S188A、S188F、S188G、S188P、S188R、S188T、S188V、S190C、S204A、S204G、S204I、S204L、S204Q、S204R、S204V、S207G、S224A、S224T、S236C、S236D、S236E、S236G、S236N、S248A、S248F、S248K、S248M、S248T、S249A、S249R、S249T、S249V、S249W、S249Y、S260G、S260H、S260K、S260N、T022A、T022G、T022Q、T022S、T022V、T022Y、T055A、T055K、T158A、T158S、T208L、T208S、T208V、T220S、T242D、T242N、T242S、T244E、T244G、T244I、T244R、T244V、T244W、T253A、T253G、T253N、T253S、T254S、T254V、T255H、T255I、T255K、T255L、T255Q、T255R、T255S、T255Y、V004A、V004N、V004P、V004W、V008A、V008M、V026I、V045S、V045W、V051I、V081Q、V081T、V084C、V093I、V095C、V143A、V143E、V143F、V143N、V143S、V147I、V147L、V147S、V147T、V148I、V149C、V149I、V165M、V180A、V180C、V180I、V180L、V180T、V192A、V192C、V192I、V192S、V192T、V192Y、V198L、V203A、V203F、V203K、V203L、V203M、V203N、V203Y、W241Y、Y006A、Y006G、Y006H、Y006L、Y006N、Y006P、Y006Q、Y006T、Y021E、Y021K、Y021L、Y021N、Y021Q、Y021R、Y021S、Y021T、Y104F、Y104I、Y104V、Y171F、Y214F、Y214L、Y214W、Y262F和Y262S；
(iii)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：A088T-L257G、A116T-A128S、N061S-N109G-A128S-N243V-S260P、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V、S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R和S162G-K256R；
(iv)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：A116T、A088T-N243V、G024E-A116T、K043Y、N076D-A116T、N218S-S248N、S033T-N243V、S033T-S063G、S248N-L257G、A001E-S249A、A088T-A116T、A088T-A128S、A088T-G131H、A088T-L257G、A088T-N109G、A088T-S248N、A088T-S249A、A116T-N243V、A116T-T158S、A128S、A128S-K256R、A128S-L257G、A128S-N243V、A128S-S248N、A128S-T158S、G024E-A088T、G024E-A128S、G024E-G131H、G024E-K256R、G024E-L257G、G024E-N218S、G024E-N243V、G024E-S162G、G024E-S249A、G024E-T158S、G131H、G131H-K256R、G131H-S249A、K043Y-A088T、K043Y-A116T、K256R、N076D-K256R、N109G、N109G-A116T、N109G-A128S、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-G131H、N109G-K256R、N109G-L257G、N109G-N218S、N109G-N243V、N109G-S248N、N218S-L257G、N243V、N243V-K256R、N243V-L257G、N243V-S248N、N243V-S249A、Q103H-A128S、Q103H-G131H、Q103H-K256R、Q103H-L257G、Q103H-N243V、Q103H-S248N、Q103H-S249A、Q103H-T158S、Q206D-N243V、S033T-A128S、S033T-K256R、S033T-N076D、S033T-N218S、S033T-S248N、S033T-T158S、S063G-A128S、S063G-K256R、S063G-N243V、S063G-S162G、S063G-T158S、S162G-K256R、S248N-K256R、S249A、T158S-N243V和T158S-S249A；
(v)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：A088T-L257G、G024E-K256R、G024E-L257G、N109G-A116T、N109G-L257G、N243V-K256R、S033T-N109G、S033T-T158S、S063G-L257G、A001E-L257G、A088T-A128S、A088T-G169A、A088T-K256R、A088T-N109G、A088T-N218S、A088T-N243V、A088T-S248N、A088T-T158S、A116T、A116T-A128S、A116T-G131H、A116T-K256R、A116T-L257G、A116T-N218S、A116T-S162G、A116T-T158S、A128S、A128S-G169A、A128S-K256R、A128S-L257G、A128S-N218S、G024E、G024E-A128S、G024E-G131H、G024E-N109G、G024E-N243V、G024E-S033T、G024E-S063G、G024E-S248N、G024E-S249A、G024E-T158S、G131H、G131H-G169A、G131H-K256R、G131H-N218S、G131H-S249A、G169A、G169A-L257G、G169A-N243V、K043Y-A088T、K043Y-N109G、K256R、K256R-L257G、N061G-N109G-N243V、N076D-N109G、N109G、N109G-A128S、N109G-G131H、N109G-K256R、N109G-N218S、N109G-S162G、N109G-S248N、N109G-S249A、N109G-T158S、N218S、N218S-K256R、N218S-L257G、N218S-S248N、N243V、N243V-L257G、N243V-S248N、N243V-S249A、P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、Q103H-K256R、Q103H-L257G、Q103H-N109G、S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R、S033T-A088T、S033T-A116T、S033T-A128S、S033T-G131H、S033T-K043Y、S033T-K256R、S033T-L257G、S033T-N076D、S033T-N218S、S033T-N243V、S033T-Q103H、S033T-S063G、S033T-S162G、S033T-S248N、S033T-S249A、S063G、S063G-A088T、S063G-A116T、S063G-A128S、S063G-G131H、S063G-K256R、S063G-N109G、S063G-N218S、S063G-N243V、S063G-S248N、S063G-S249A、S063G-T158S、S162G-K256R、S162G-N218S、S162G-N243V、S162G-S248N、S162G-S249A、S248N、S249A、S249A-L257G、T158S、T158S-L257G和T158S-N243V；
(vi)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：T158S-L257G、K256R、L257G、S033T-N109G、S162G-K256R、S162G-L257G、G024E-K256R、G024E-L257G、G024E-S033T、N109G-A116T、N218S-L257G、S033T-A088T、S033T-A116T、S033T-N243V、S033T-Q103H、S162G-N218S、S162G-N243V、T158S、T158S-N218S、T158S-N243V、A088T、A088T-G169A、A088T-K256R、A088T-L257G、A088T-S162G、A088T-T158S、A116T-K256R、A116T-L257G、A116T-N243V、A128S-L257G、A128S-N218S、A128S-N243V、A128S-S248N、G024E-A116T、G024E-A128S、G024E-G131H、G024E-N243V、G024E-S248N、G024E-S249A、G024E-T158S、G131H-N243V、G131H-T158S、G169A-N218S、G169A-N243V、G169A-S248N、K256R-L257G、N109G-A128S、N109G-G131H、N109G-N218S、N109G-N243V、N109G-S249A、N218S、N218S-K256R、N218S-N243V、N218S-S249A、N243V、N243V-K256R、N243V-L257G、N243V-S248N、Q103H-N109G、Q103H-N218S、S033T-A128S、S033T-L257G、S033T-N218S、S033T-S162G、S033T-S248N、S033T-T158S、S063G-K256R、S063G-L257G、S162G、S162G-G169A、S162G-S248N、S248N、S248N-K256R、S248N-L257G、S249A、T158S-S162G和T158S-S248N；
(vii)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：S033T-N076D-A128S-N218S、A001E-S033T-N109G-N218S、S033T-N218S、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V、A128S-G169A、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P、S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-A128S-G131H-N243P、P040E-N109G-A128S-G131H、S033T-A128S、S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、N109G-G169A、S063G-N109G-A128S-G131H、G169A、N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R、S033T-A128S-G131H-N243V、A128S-N218S、A001E-G169A、A088T-G169A、G169A-L257G、N109G-N218S、S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R、G169A-K256R、N076D-G169A、A001E-G131H-G169A-N243V、G169A-S249A、S033T-N109G、G169A-S248N、K043Y-G169A、K043Y-N218S、N218S-L257G、N218S-N243V、S063G-G169A、A001E-A128S-G131H-N243V、A001E-S033T-N109G-N243V、A088T-N218S、G024E-N218S、G024E-S033T、G169A-Q206D、N076D-N218S、S033T-L257G、S162G-G169A、A001E-N218S、A116T-N218S、G169A-N243V、N218S、P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-N076D、A001E-S033T、A128S-G131H、N218S-S248N、S018T-Y021N-N109G-A128S、S033T-K043Y、S033T-N243V、S033T-Q206D、S063G-N218S、S162G-N218S、T158S-G169A、A116T-G169A、G131H-G169A、N061S-N109G-A128S-S260P、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-A128S-N243V-S248A-K256R、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G、N218S-K256R、S009T-N109G-A128S-K141R、S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R、S033T-A088T、S033T-S063G、S033T-S162G、T158S-N218S、A001E-N076D-N109G-A128S、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-S248N-K256R、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V、S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P、S033T-A116T、S033T-S248N、S033T-S249A、S033T-T158S、G131H-N218S、N109A-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S、N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R、N218S-S249A、Q206D-N218S、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-K256R、A116T-A128S、N061S-N109G-A128S-N243V-S260P、N109G-A128S-N243V-S248N、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R、G024E-A128S、N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P、N109S-A128S-N243V-K256R、S033T、S033T-G131H、A001E-A128S、A128S、A128S-L257G、A128S-Q206D、N109Q-A128S-N243V-K256R、S009T-A128S-K141R-N243V、S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V、A088T-A128S、A128S-K256R、A128S-N243V、N061P-N109G-N243V、N061S-A128S-N243V-S260P、S018T-Y021N-A128S-N243V、A128S-N243V-S248N-K256R、A128S-S248N、A128S-S249A、N076D-A128S、S063G-A128S、A128S-S162G、A128S-T158S、S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P、S033T-Q103H-A128S-G131H、N061S-N109G-N243V、K043Y-A128S、N061P-N109G-G131H-N243V、N109G-L257G、A001E-G024E-S204E-Q206D、A001E-L257G、A088T-N109G、G024E-N109G、K043Y-N109G、N061G-N109G-N243V、N076D-N109G、N109G、N109G-A116T、N109G-K256R、N109G-N243V-K256R、N109G-N243V-S248A-K256R、N109G-Q206D、S063G-N109G、A001E-A116T、A001E-N109G、A001E-Q206D、A088T-A116T、A088T-N243V、A116T-L257G、G024E-A116T、G024E-L257G、G024E-N243V、G024E-Q206D、N109G-G131H、N109G-N243V、N109G-S162G、N109G-S248N、N109G-S248N-K256R、N109G-S249A、N109G-T158S、N243V-L257G、A001E-A088T、A001E-G024E、A001E-K256R、A001E-N076D、A001E-N243V、A088T、A088T-L257G、A088T-Q206D、A116T、A116T-K256R、A116T-N243V、G024E-A088T、G024E-K043Y、G024E-K256R、G024E-N076D、G024E-S162G、G024E-S248N、K043Y-A088T、K043Y-A116T、K043Y-L257G、K043Y-N243V、K043Y-Q206D、K256R-L257G、N076D-A116T、N076D-L257G、N076D-N243V、N076D-Q206D、N109G-N243V-S248N、N109G-N243V-S248N-K256R、N243V-K256R、Q206D、Q206D-L257G、Q206D-N243V、Q206D-S248N、S063G-K256R、S063G-L257G、T158S-L257G、A001E、A001E-K043Y、A001E-S162G、A001E-S248N、A001E-S249A、A001E-T158S、A088T-K256R、A088T-S162G、A088T-S248N、A088T-S249A、A116T-Q206D、A116T-S248N、A116T-S249A、G024E、G024E-G131H、G024E-S249A、G024E-T158S、G131H、G131H-K256R、G131H-L257G、K043Y-K256R、K043Y-N076D、K256R、L257G、N076D-A088T、N076D-K256R、N076D-S162G、N076D-S248N、N076D-S249A、N109G-N243P-S248A-K256R、N109G-N243P-S248N-K256R、N243V、Q206D-K256R、S033T-P040E-Q103H-N109G、S063G、S063G-A116T、S063G-Q206D、S162G-K256R、S162G-L257G、S162G-N243V、S162G-Q206D、S162G-S248N、S248N、S248N-L257G、S249A、S249A-L257G、T158S、T158S-N243V和T158S-Q206D；
(viii)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：A088T-A116T-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-N243V-L257G、A088T-T158S-N218S-K256R、A088T-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-L257G、A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S、A088T-N109G-A116T-G131H-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-N243V-L257G、A088T-N109G-N243V-S248N、A088T-N109G-T158S-N243V-L257G、A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G、A116T-T158S-S248N-L257G、Y006H-A116T-G131H-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-K256R、A088T-N109G-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-T158S-K256R、A088T-N109G-T158S-N243V、A088T-T158S-N243V-K256R-L257G、A116T、A116T-N218S-N243V-L257G-N269S、A116T-T158S-K256R-L257G、N109G-A116T-K256R-L257G、N109G-A116T-N243V、N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、N109G-G131H-L257G、N109G-G131H-S248N-K256R-L257G、N109G-G131H-T158S-K256R-L257G、S003P-A116T-T158S-S248N-K256R、T158S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S、A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-L257G、A088T-G131H-N243V-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-L257G、A088T-N109G-A116T、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-W241R-S248N-K256R、A088T-N109G-K256R-L257G、A088T-N109G-L257G、A088T-N109G-N243V、A088T-N109G-N243V-K256R、A088T-N109G-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-S248N-K256R、A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-T158S-N243V-K256R、A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D、A088T-N109G-T158S-S248N-L257G、A088T-T158S-K256R、A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-T158S-N243V-L257G、A116T-G131H-N218S-N243V-S248N、A116T-G131H-S248N-L257G、A116T-S248N-K256R-L257G、A116T-T158S-N218S-N243V-K256R、A116T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271R、A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、G131H-S248N、G131H-T158S-I234T-N243V-K256R、G131H-W241L-N243V-S248N-K256R、N109G-A116T-G131H-A137V-T158S-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-A151S-N218S-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N、N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N、N109G-A116T-S248N、N109G-A116T-T158S-L257G、N109G-A116T-T158S-N218S-W241R-N243V、N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-T158S-S248N-L257G、N109G-G131H-N218S-L257G、N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-A274T、N109G-K256R、N109G-N243V-L257G、N109G-T158S-N218S-K256R-L257G、N109G-T158S-N218S-L257G、N109G-T158S-S248N-K256R、P014L-A015L-L016C-H017T-S018L-Q019K-G020A-Y021T-T022L-G023E、S003F-A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、V004A-A088T-A116T-T158S-N218S、V004A-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、V004L-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G、Y006H-N109G-N218S-N243V-S248N、A001T-A116T-T158S-N243V-L257G、A088T-A116T、A088T-A116T-G131H-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-A116T-K256R、A088T-A116T-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-N243V-K256R、A088T-A116T-N243V-L257G、A088T-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R、A088T-A116T-T158S-N243V-L257G、A088T-A116T-T158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(ix)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G、A116T-N218S-N243V-L257G-N269S、A088T-A116T-K256R、A088T-G131H-K256R、A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T、A088T-A116T-N243V-L257G、A088T-A116T-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-N218S-S248N-L257G、A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-I268V、A088T-T158S-N218S-S248N-L257G、A116T-N218S-K256R-L257G、N109G-A116T、N109G-A116T-G131H-T158S-L257G、N109G-A116T-N243V、N109G-A116T-N243V-K256R、N109G-A116T-T158S-L257G、N109G-K256R、N109G-N243V-K256R-L257G、S003P-N109G-G131H-T158S-K256R、A088T-A116T、A088T-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-Q275R、A088T-A116T-T158S-A216S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S、A088T-A116T-T158S-N243V、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R、A088T-A116T-V147I-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-G131H-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-I107T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-N218T-K256R、A088T-N109G-A116T-N218T-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N243V、A088T-N109G-A116T-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N243V-K256R-L257G-N269D、A088T-N109G-A116T-T158S、A088T-N109G-A116T-T158S、A088T-N109G-A116T-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-A138V-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-V149A-K256R-L257G、A088T-N109G-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-N243V、A088T-N109G-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-N243V-L257G、A088T-N109G-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-K256R、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-Q275R、A088T-N109G-T158S-N243V、A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-I268V、A088T-N109G-T158S-N243V-L257G、A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N218S-N243V-L257G、A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N218S-S248N、A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-V143A-T158S-K256R、A088T-V147I-N218S-N243V-K256R-L257G、A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A116T-G131H-N243V-K256R、A116T-G131H-N243V-L257G、A116T-G131H-N243V-S248N-K256R、A116T-G131H-S248N-L257G、A116T-G131H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R、A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A116T-N218S-L257G、A116T-T158S-N218S-K256R-L257G、A116T-T158S-N218S-S248N、A116T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271R、A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A116T-T158S-S248N-L257G、G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、I107T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-A137V-T158S-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-A151S-N218S-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G、N109G-A116T-G131H-N243V-L257G、N109G-A116T-G131H-S248N-L257G、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、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(x)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：S018F-S162L、S018P-D120N、P014T-S037T、S009T-K141R和S161P-S162L；
(xi)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：I031V-S038W、P014T-S037T、S018F-S162L、S018P-D120N和S162L-D181H；
(xii)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：Y21H-D259G、S183T-S249R、N61D-Q206R、Y262N-Q275R、K043R-N076S、A133V-D259N和I079V-Q217H；
(xiii)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V、N109G-A128S-S183V、N109G-A128S-N243V-K256R、N109M-A128S-S224A、A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V、N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V、N109S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-N243V、N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109G-A116T-N243V-K256R、N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V；
(xiv)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-A128S-N218S、A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V、N109G-A114S-A128S、N109G-A114S-A128S-S183L-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-S183V、N109G-A114S-A128S-N243V、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-S224A、N109G-A128S-S183L-S224A、N61G-N109G-A128S-S224A、N109M-A128S-S224A、A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V、N109M-A128S-S224A-N243V、S63G-A128S、A88T-N109G-A116T-N243V、N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109G-A116T-N243V-K256R、N109G-A116T、S63G-N109G、A88T-N109G、N109G-K256R、N61G-N109G-N243V、S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V、N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V；以及
(xv)至少一组选自如下的相对于SEQIDNO:6的氨基酸置换：G24S-G53S-N78S-G97A-N101S-A128S、I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-A128S-N218S、S33T-A128S-N218S、A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V、N109G-A114S-A128S、N109G-A114S-A128S-S183L-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-S183V、N109G-A114S-A128S-N243V、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-S224A、N109G-A128S-S183L-S224A、N61G-N109G-A128S-S224A、N76D-N109G-A128S-S224A、N109M-A128S-S224A、N109G-A128S-S183L、S33T-N76D、A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V、N109Q-A128S-S224A-N243V、N109S-A128S-S224A、A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V、N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V、S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109M-A128S-S224A-N243V、S63G-A128S、N109S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-N243V、N61S-N109G-N243V、N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109G-A116T-N243V-K256R、A88T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R、N109G-A116T、S63G-N109G、A88T-N109G、N109G-K256R、N61G-N109G-N243V、S33T-N61P-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V、N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V。
在第八个方面，本发明提供具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的BPN’枯草杆菌蛋白酶的分离的或非天然存在的蛋白酶变体，所述变体具有蛋白水解活性并且包含至少一组选自如下的氨基酸置换：S182E、N109I、N109D-Y217L-S248R、N109D-S188R-Y217L、S87D-Y217L-S248R、S87R-N109D-Y217L-S248R、S87R-N109D-S188D-Y217L-S248R、G128A-Y217Q、I111V-M124V、M124V-Y217Q、N62Q-G97A、S89Y-M124V、V68A、V68A-A92G、V68A-G97A、V68A-I111V、V68A-S89Y、V68A-V227T、V68A-Y217Q、W106F-Y217Q、G97A-G128A-Y217Q、G97A-L126A-Y217Q、G97A-M124V-L126A-Y217Q、G97A-N123G-Y217Q、L96T-G97A-Y217Q、M124V-L126A-Y217Q、N62Q-G128A-Y217Q、N62Q-G97A-Y217Q、G97N-G128A-Y217M、G97G-G128S-Y217E、G97A-G128A-Y217Q、G97M-G128S-Y217E、G97A-G128S-Y217Q、G97D-G128S-Y217Q、G97M-G128G-Y217M、G97G-G128S-Y217Q、G97S-G128S-Y217Q、G97G-G128A-Y217Q、G97S-G128A-Y217E、G97A-G128S-Y217L、G97A-G128A-Y217N、G97Q-G128S-Y217L、G97A-G128A-Y217M、G97A-G128A-Y217S、G97D-G128A-Y217Q、G97M-G128S-Y217Q、G97Q-G128G-Y217D-S87Y、G97S-G128A-Y217N、G97A-G128S-Y217T、G97D-G128S-Y217E、G97D-G128A-Y217L、G97G-G128S-Y217E-S78P-A272T、G97T-G128S-Y217D、G97D-G128A-Y217I、G97Q-G128S-Y217Q、G97G-G128A-Y217D、G97Q-G128A-Y217N、G97S-G128A-Y217M、G97S-G128S-Y217N、G97S-G128S-Y217M、G97E-G128S-Y217M、G97S-G128P-Y217Q、G97T-G128S-Y217Q、G97D-G128S-Y217Q-A73T、G97E-G128S-Y217N、G97G-G128A-Y217I、G97Q-G128A-Y217D、G97Q-G128S-Y217M、G97R-G128T-Y217Q-S162P、G97S-G128S-Y217D、G97T-G128P-Y217I、G97Q-G128G-Y217E、G97C-G128G-Y217N、G97D-G128S-Y217H、G97M-G128S-Y217L、G97M-G128S-Y217N、G97S-G128S-Y217E、G97M-G128S-Y217I、G97A-G128P-Y217A、G97R-G128S-Y217D、G97A-G128A-Y217Q-S145D、G97A-G128A-Y217Q-P239R、G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S162K-K213L-N240K、G97A-G128A-Y217Q-N61E、G97A-G128A-Y217Q-P40E-A144K-K213L、G97A-G128A-Y217Q-P129E、G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S159K、G97A-G128A-Y217Q-K213L、G97A-G128A-Y217Q-S87D、G97A-G128A-Y217Q-Q206E、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-S145D-S159K-K213L、G97A-G128A-Y217Q-K265N、G97A-G128A-Y217Q-S24R、G97A-G128A-Y217Q-P40E、G97A-G128A-Y217Q-Q275E、G97A-G128A-Y217Q-P129E-S145D-N240K、G97A-G128A-Y217Q-A144K、G97A-G128A-Y217Q-S159K、G97A-G128A-Y217Q-S162K、G97A-G128A-Y217Q-N240K、G97A-G128A-Y217Q-S53G、G97A-G128A-Y217Q-S78N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-I111V、G97A-G128A-Y217Q-S53G-N117S、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S132N、G97A-G128A-Y217Q-Y104N-S132N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-I111V、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-N117S、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S132N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-Y104N-S132N、G97A-G128A-Y217Q-S78N-Y104N-S132N、Y217L-V068C-A069G、Y217L-I079F-A098G、Y217L-P086T-S101D-Q103S-V147I、Y217L-A088T-P129S-G146D、Y217L-V093I-G128D-P129R、Y217L-Z096.01D-A098R、Y217L-Z096.01H-A098G、Y217L-G097S-Z097.01S-A098G-A273T、Y217L-A098S-D099G-G100D、Y217L-Z098.01N、Y217L-D099G-Z099.01N、Y217L-D099G-Z099.01S、Y217L-D099V-S101D、Y217L-Z099.01S、Y217L-G100D、Y217L-S101D-Q103H、Y217L-S101G-A151V、Y217L-S101H-G102S、Y217L-S101H-Q103D、Y217L-G102R-Q103C-Y104C-V192I、Y217L-Q103D、Y217L-V121I-I122S-N123C、Y217L-V121L-N123C、Y217L-I122S-N123S、Y217L-M124I、Y217L-M124V、Y217L-L126F-P129Z-S182N、Y217L-L126Y、Y217L-G127S-P129D、Y217L-Z127.01N-G128S-P129S、Y217L-G128H-P129Y、Y217L-G128S-P129D、Y217L-G128S-P129D-S248R、Y217L-G128S-P129G、Y217L-P129G-G131Z、Y217L-P129G-S130H-S132Z、Y217L-P129H-G131Z、Y217L-P129L、Y217L-P129S-S130H-S132Z、Y217L-P129Z、Y217L-P129Z-S130G、Y217L-P129Z-S130G-G131H-S132H、Y217L-P129Z-S130H、Y217L-S130V-G131D-S132I、S87T-A88L-S89G-G97A-G128A-Y217Q、N61P-S63H-G97A-G128A-Y217Q、S87G-A88V-S89A-G97A-G128A-Y217Q、P86S-S87G-A88V-G97A-G128A-Y217Q、Q59S-N61P-G97A-G128A-Y217Q、S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q、N61P-N62S-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-P129Q-S130G-G131S-Y217Q、L75S-N76Y-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-V203Y-Y217Q、T55P-G97A-G128A-Y217Q、A88V-L90I-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-G211R-N212S-K213V-Y217Q、G23A-S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q、T22N-S24A-G97A-G128A-Y217Q、S24R-G97A-G128A-Y217Q、G97A-A98S-G128A-Y217Q、G97A-G128A-T158G-S159G-Y217Q、Q59E-N61P-G97A-G128A-Y217Q、G97A-A98E-G128A-Y217Q、G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-S63T-P86S-S87G-A88V、G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-P239R、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61P-N62S-P194L-A232T、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-A133V-L267V、G97A-G128A-Y217Q-A134T-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-P129E-S159K-K265R、G97A-G128A-Y217Q-A134T-G211T、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129E、G97A-G128A-Y217Q-I111V-S161P、G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q、G97A-G128A-Y217Q-I115V-L267V、G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116S-N117G-N118R、G97A-G128A-Y217Q-V203Y-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-P52S-T55P-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A116S-N117G-N118R、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-T242R、G97A-G128A-Y217Q-P40E-T55P-N269K、G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-V8L-N25Y-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-G211T-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-S24R-A128S-P129G、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-N240K、G97A-G128A-Y217Q-N25Y-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A134T、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-N61P-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S78N-S87T-A88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217Q-P239R-A273S、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-T242R、G97A-G128A-Y217Q-S3F-S87T-A88L-S89G-G211T、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-L75H-N76G、G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A144K、G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I111V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-S145D-P239R-Q275E、G97A-G128A-Y217Q-S145D-A273S、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-K141E-T242R、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-A116N-N117S-N118G-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-S89Y-G211T、G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G-A144T、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129V、G97A-Y217Q-N61P-A128G-P129S-S130P、G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S87T-A88L-S89G-G110C-S130P、G97A-Y217Q-N123G-A128G、G97A-G128A-Y217Q-N61P-N62Q-G100N-G102A-M124I、S78N-G97A-G128A-Y217Q、G97A-S101N-G128A-Y217Q、G97A-G128A-A137V-Y217Q、N61P-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-S130P-Y217Q、G97A-Q103N-G128A-Y217Q、S63T-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G102A-G128A-Y217Q、G97A-N109D-G128A-Y217Q-S248R、S87R-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-S188D-Y217Q、S87D-G97A-G128A-Y217Q-S248R、G97A-G128A-S188D-S248R-Y217Q、G97A-G128A-S248D-Y217Q、S78N-G97A-G128A-Y217Q-L267V、S78N-G97A-G128A-Y217Q-S161P、S78N-G97A-G128A-Y217Q-I115V、S78N-G97A-G128A-Y217Q-A273S、S78N-G97A-G128A-Y217Q-G211T、S78N-G97A-G128A-Y217Q、S78N-G97A-G128A-Y217Q-I111V、S78N-G97A-G128A-Y217Q-V147L、S78N-G97A-G128A-Y217Q-I108V、S78N-G97A-G128A-Y217Q-S89Y、S78N-G97A-G128A-Y217Q-A138T、G97A-G128A-Y217Q-A134T-K213L、G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P129V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P239R和G97A-G128A-Y217Q-S24R-S87T-A88L-S89G，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
与具有SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:4的序列的蛋白酶相比，根据本发明的第八个方面的变体可具有增加的蛋白水解活性和/或增加的清洁活性并且可以是成熟的形式。根据本发明的第八个方面的变体可包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体具有蛋白水解活性并且任选与具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的序列的蛋白酶相比具有增强的蛋白水解活性和/或增强的清洁活性。
根据本发明的第八个方面的变体可在选自位置24、25、40、52、53、55、58、59、61、62、63、68、78、86、87、88、89、92、96、97、100、101、103、104、106、111、114、115、116、117、118、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、144、145、159、161、162、167、194、203、206、213、217、227、232、239、240、242、265、267和275的位置处包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸置换。根据第八个方面的变体可包含总共3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个选自群组(a)和群组(b)的氨基酸置换：(a)选自N61E、A144K、P129E、P239R、P40E、Q103E、Q206E、Q7275E、S145D、S159K、S162K、S24R、S63H、S87D和T242R的带电荷氨基酸置换；以及(b)选自A114G、A116N、A133V、A134T、A232T、A88V、A92G、F58G、G100T、G128A、G131S、G97A、I111V、I115V、K213L、K265N、L126A、L267V、L96T、M124V、N117S、N118G、N123G、N240K、N25G、N61P、N62Q、N62R、N62S、P129Q、P129V、P194L、P239V、P52L、P86S、Q59S、S101N、S125A、S130G、S132N、S161P、S24G、S53G、S78N、S87G、S89Y、T55P、V203Y、V227T、V68A、W106F、Y104N、Y167A和Y217Q的中性氨基酸置换。根据本发明的第八个方面的变体可包含与SEQIDNO:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在第九个方面，本发明提供分离的或非天然存在的蛋白酶变体，其选自：
(a)具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQIDNO:2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，并且相对于SEQIDNO:2包含选自群组(i)至群组(vii)的至少一组氨基酸置换：
(i)Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q/-G211A-Y217Q-N252Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q-N252Q和S078N-S087E-G097A-M124I-G128A-Y217Q-S224A；
(ii)Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q-N252Q和S078N-S087E-G097A-M124I-G128A-Y217Q-S224A；
(iii)G097A-M124V-Y167A-Y217Q、V068A-Y167A-Y217Q、G097A-I111V-M124V-Y167A、I111V-M124V-Y167A-Y217Q、V068A-I111V-Y167A-Y217Q、G097A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q和P052L-V068A-I111V；
(iv)G097A-N123A-Y217Q、G097A-N123V-Y217Q、N061P-G102A-G128S-Y217Q、N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q、Y217Q、S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q和G102A-N123Q-Y217Q；
(v)G097A-N123A-Y217Q、G097A-N123V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q、N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q、Y217Q、N061P-G102A-G128S-Y217Q、S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q和G102A-N123Q-Y217Q；
(vi)N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q、N061P-G097A-M124I-Y217Q、G102A-N123Q-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q、S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q、G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q、G097A-N123Q-P210S-Y217Q、N061P-G097A-N123Q-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q、N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q、N061P-G097A-M124V-Y217Q、N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q、S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q、N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q、N061P-G102A-G128S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q、S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q、N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q、G097A-N123V-Y217Q、S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q、N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q、N062Q-G097A-I111V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、G097A-N123Q-Y217Q、N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q、S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q、G097A-I111V-M124I-Y217Q、S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q、S078N-G097A-G128S-Y217Q、S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q、G097A-N123A-Y217Q和Y217Q；和
(vii)S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A、S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N、N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q和S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q；以及
(b)具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且相对于SEQIDNO:6包含选自群组(i)至群组(xii)的至少一组氨基酸置换：
(i)A001C、A001D、A001E、A001F、A001H、A001K、A001L、A001M、A001N、A001P、A001Q、A001R、A001S、A001T、A001V、A013C、A013S、A015C、A015D、A015E、A015L、A015R、A048C、A048E、A048S、A073N、A073T、A074G、A074S、A085C、A085G、A085S、A085T、A085V、A088M、A088S、A092S、A098G、A114G、A133E、A133P、A133R、A137E、A137H、A137R、A142C、A144D、A144G、A144H、A144K、A144L、A144N、A144R、A152S、A153G、A153S、A153V、A176C、A179G、A187C、A187F、A187G、A187L、A187N、A187P、A187Q、A187S、A187T、A187V、A187W、A200G、A216C、A216H、A216R、A216W、A223S、A228S、A230G、A230S、A230T、A230V、A231V、A232C、A232V、A272E、A272G、A272K、A272P、A272R、A273D、A273G、A273H、A273L、A273P、A273Q、A273R、A273T、A273V、A274H、A274M、A274R、D036E、D036N、D036Q、D036S、D041C、D060G、D099A、D099H、D099Q、D120E、D181A、D181G、D181H、D181T、D197T、D259A、D259G、D259H、D259N、D259P、D259Q、D259S、D259T、E156A、E156C、E156G、E156H、E156L、E156Q、E156S、E156V、E195G、E251C、E251I、E251L、E251Q、E251T、F058Y、F189A、F189G、F189H、F189L、F189R、F189S、F189T、F189W、F189Y、F261C、F261D、F261E、F261K、F261P、G020C、G020E、G020F、G020H、G020L、G020N、G020Q、G020R、G020T、G020Y、G024A、G024D、G024P、G046D、G053A、G053D、G053E、G053F、G053L、G053M、G053Q、G053R、G053S、G053Y、G097K、G097M、G097R、G131C、G131D、G131R、G146A、G157A、G157N、G157P、G157S、G157T、G160A、G160L、G160R、G160V、G166C、G166I、G166L、G166Q、G166V、G166W、G169A、G178A、G211E、G211K、G215C、G215D、G215E、G215H、G215L、G215S、G215T、G215W、G258A、G258D、G258P、G258S、H017I、H039S、H226L、H238N、H238Y、I011L、I011T、I011V、I031C、I031F、I031L、I079E、I079F、I079K、I079L、I079M、I079Q、I079R、I107L、I111M、I175L、I205A、I205C、I205V、I268L、I268M、K012A、K012C、K012E、K012F、K012G、K012H、K012L、K012N、K012S、K012T、K012W、K027A、K027N、K027S、K027T、K043A、K043C、K043D、K043E、K043F、K043G、K043H、K043I、K043L、K043M、K043N、K043P、K043Q、K043R、K043T、K043V、K043W、K043Y、K136G、K136H、K141A、K141G、K141H、K141L、K141M、K141N、K141Q、K141R、K141T、K141V、K141W、K170A、K170C、K170G、K170Q、K170S、K213A、K213G、K213H、K213I、K213L、K213N、K213Q、K213R、K213S、K213T、K213V、K237A、K237H、K237I、K237L、K237N、K237S、K237T、K237V、K256A、K256C、K256D、K256E、K256G、K256H、K256M、K256P、K256Q、K256S、K256T、K256V、K256W、K265G、K265H、K265N、K265S、K265Y、L016E、L042C、L042F、L042M、L042V、L075G、L075H、L075I、L075T、L082A、L082E、L082F、L082H、L082R、L082S、L082T、L090M、L135F、L196M、L209A、L209C、L209E、L209G、L209H、L209R、L209S、L233E、L233G、L233S、L235M、L235R、L235V、L235W、L257C、L257D、L257E、L257G、L257P、L257R、L257W、L267E、L267F、M050L、M050Y、M119C、M119I、M124L、M222A、M222F、M222L、M222S、M222T、N025C、N025E、N025P、N056D、N056S、N061A、N061C、N061D、N061G、N061I、N061K、N061L、N061Q、N061R、N062A、N062C、N062H、N062L、N062Q、N062R、N062S、N062T、N062V、N062Y、N076A、N076D、N076E、N076L、N076M、N076P、N076Q、N076S、N076T、N076V、N078D、N078E、N078F、N078G、N078H、N078K、N078P、N078Q、N078R、N101D、N101F、N101R、N117G、N117R、N117S、N118A、N118D、N118H、N118Q、N118R、N118S、N118T、N184C、N184E、N184P、N184R、N212C、N212D、N212E、N212R、N212W、N218C、N218D、N218E、N218F、N218G、N218M、N218P、N218R、N218T、N218V、N218W、N240A、N240G、N240Q、N240S、N240W、N243C、N243G、N243S、N252D、N252E、N252V、N269C、N269H、P005A、P005D、P005M、P005Q、P005V、P005W、P014A、P014D、P014F、P014K、P014M、P014R、P014V、P040F、P040R、P040W、P057A、P057W、P129E、P129R、P129V、P172E、P172K、P172R、P194E、P194H、P194R、P194W、P201A、P201G、P201T、P210E、P210L、P239A、P239G、P239H、P239K、P239N、P239R、P239T、Q002D、Q002E、Q002G、Q002I、Q002K、Q002L、Q002P、Q002R、Q002V、Q010D、Q010R、Q010W、Q019C、Q019D、Q019E、Q019H、Q019L、Q019P、Q019R、Q059A、Q059C、Q059D、Q059E、Q059L、Q059R、Q059S、Q059T、Q059W、Q103W、Q185D、Q185E、Q185K、Q185R、Q185W、Q206D、Q206G、Q206H、Q206L、Q206V、Q206W、Q217A、Q217C、Q217E、Q217F、Q217G、Q217H、Q217K、Q217L、Q217R、Q217V、Q245A、Q245D、Q245E、Q245H、Q245M、Q245R、Q271A、Q271C、Q271D、Q271E、Q271F、Q271G、Q271L、Q271P、Q271R、Q271T、Q271W、Q271Y、Q275A、Q275F、Q275G、Q275I、Q275L、Q275P、Q275R、R186A、R186H、R186I、R186L、R186M、R186V、R186W、S003D、S003E、S003F、S003K、S003R、S009C、S009E、S009K、S018C、S018D、S018R、S037A、S037D、S037E、S037G、S037H、S037K、S037L、S037P、S037R、S037Y、S038D、S038M、S038P、S038R、S038Y、S049C、S049T、S063A、S063C、S063D、S063F、S063L、S063M、S063R、S063Y、S087C、S087D、S087K、S087L、S087M、S087N、S087R、S087Y、S089A、S089C、S089D、S089E、S089F、S089G、S089H、S089I、S089K、S089P、S089R、S089V、S089Y、S105T、S125A、S130C、S130D、S130E、S130K、S130R、S130W、S145D、S145G、S145L、S145R、S145T、S159C、S159D、S159L、S159P、S159W、S161C、S161E、S161R、S162C、S162E、S162W、S163A、S173T、S173V、S182C、S182E、S182R、S183C、S183D、S183P、S183R、S188C、S188D、S188E、S188F、S188K、S188L、S188P、S188R、S188W、S190A、S190C、S190G、S190T、S191G、S204E、S204G、S204R、S204Y、S207G、S224G、S224T、S236C、S236D、S236E、S236G、S248C、S248D、S248E、S248H、S248R、S249E、S249L、S249R、S260A、S260C、S260E、S260G、S260K、S260Q、S260R、S260V、S260Y、T022L、T022P、T055C、T055D、T055E、T055I、T055K、T055M、T055R、T055S、T055V、T055W、T055Y、T071A、T158A、T158D、T158E、T158G、T158L、T158P、T158Q、T158R、T158V、T158Y、T164A、T164G、T164K、T164Q、T164R、T208S、T220A、T242D、T242G、T244D、T244E、T244R、T253E、T253R、T253Y、T254G、T255C、T255D、T255E、T255K、T255R、V004D、V004E、V004T、V026A、V028I、V028L、V030I、V044A、V044C、V044P、V044T、V045C、V045D、V045E、V045G、V045I、V045N、V045R、V045T、V051H、V072L、V081A、V081G、V081H、V081R、V081S、V084I、V084M、V095A、V095C、V143A、V143C、V143E、V143F、V143G、V143H、V143Q、V143T、V143W、V147A、V147Q、V147S、V148I、V148L、V149C、V149I、V149L、V165C、V165L、V180A、V180C、V180M、V180S、V192C、V192F、V192G、V192I、V192Q、V192Y、V203A、V203C、V203D、V203E、V203G、V203K、V203M、V203R、V203S、V270C、V270G、V270L、V270P、W241F、W241L、Y006A、Y006C、Y006D、Y006E、Y006M、Y006N、Y006R、Y006S、Y021C、Y091W、Y104T、Y104V、Y104W、Y214H、Y214Q、Y262C、Y262D、Y262E、Y262H、Y262I、Y262R和Y262V；
(ii)A001C、A001E、A001P、A015C、A015E、A048C、A048E、A073T、A085C、A085G、A088I、A088M、A114G、A128H、A137R、A142C、A187C、A187F、A187L、A187N、A187P、A187W、A216C、A216H、A230G、A230S、A273D、A273H、A273P、A273Q、A273R、A273T、A274H、D036N、D036Q、D036S、D041C、D041N、D099A、D099H、D099N、D099Q、D099S、D197T、D259H、E156C、E156G、E156H、E156L、E156Q、F058G、F189A、F189G、F189H、F189L、F189R、F189S、F189T、F261C、F261D、F261E、G046D、G053E、G053L、G053M、G053Q、G053R、G131C、G131D、G146A、G157N、G157P、G157T、G160V、G178A、G215C、G215L、G258A、G258P、H039A、H039S、H067T、H238Y、I011L、I031F、I079E、I111M、I175L、I268M、K012A、K012C、K012E、K012F、K012G、K012H、K012L、K012N、K012W、K027N、K027S、K027T、K043C、K043D、K043G、K043L、K043R、K043W、K136E、K136G、K141G、K141L、K141M、K141N、K141R、K170C、K170Q、K213V、K256D、K265G、K265N、K265Q、K265S、K265Y、L042C、L042F、L075G、L075V、L082A、L082E、L082F、L082H、L082R、L082S、L090M、L090T、L126W、L233E、L233G、L233S、L235V、L257D、L257E、L257G、L257P、L257R、L257W、M050L、M222A、M222F、M222L、M222S、M222T、N025R、N056S、N062C、N062H、N062L、N062Q、N062R、N062T、N062Y、N076D、N076P、N078D、N078E、N078F、N078R、N078V、N117G、N118L、N184P、N269C、N269H、N269Q、P005V、P005W、P014K、P057A、P057W、P086F、P129V、P201T、P225G、P225S、P239A、P239G、P239H、P239N、P239T、Q002D、Q002I、Q002K、Q002L、Q002P、Q002R、Q002V、Q010W、Q019L、Q019P、Q059C、Q059D、Q059E、Q059W、Q185W、Q217C、Q245A、Q245H、Q271C、Q271D、Q271E、Q271L、Q271W、Q275A、Q275G、R186M、S009C、S009L、S018C、S018D、S037E、S037H、S037K、S037L、S037P、S038P、S038Y、S049C、S049N、S063C、S063D、S063F、S063L、S063Y、S087C、S087K、S087L、S087N、S087R、S087Y、S089D、S089E、S089F、S089G、S089P、S089W、S105T、S125A、S130C、S145D、S159D、S159P、S163A、S173V、S182P、S183P、S190A、S190G、S191G、S204E、S224G、S248E、S248H、S249E、S260V、S260Y、T022P、T055E、T055M、T055R、T055W、T158D、T158E、T164A、T164G、T164K、T164Q、T164R、T220A、T242G、T242P、T253E、T255C、T255G、V004D、V004T、V044A、V044L、V044P、V044T、V045C、V045G、V045I、V045K、V045L、V045N、V045R、V045T、V045V、V051H、V081A、V081G、V081H、V081R、V084S、V143G、V147A、V148L、V165C、V180S、V203D、V203G、V203S、V270C、V270G、V270P、V270S、W241L、Y104T、Y214H、Y214Q、Y262D、Y262E、Y262G、Y262H、Y262L、Y262N、Y263G和Y263W；
(iii)A001E、A001E-A088T、A001E-A116T、A001E-A128S、A001E-A128S-G131H-N243V、A001E-G024E、A001E-G131H、A001E-G131H-G169A-N243V、A001E-G169A、A001E-K043Y、A001E-K256R、A001E-L257G、A001E-N076D、A001E-N076D-N109G-A128S、A001E-N109G、A001E-N218S、A001E-N243V、A001E-Q103H、A001E-Q206D、A001E-S033T、A001E-S033T-N109G-N218S、A001E-S033T-N109G-N243V、A001E-S063G、A001E-S162G、A001E-S248N、A001E-S249A、A001E-T158S、A088T-A128S、A088T-G169A、A088T-N218S、A088T-Q206D、A116T-G169A、A116T-N218S、A116T-Q206D、A128S、A128S-G131H、A128S-G169A、A128S-N218S、A128S-N243V、A128S-Q206D、G024E、G024E-A088T、G024E-A128S、G024E-G131H、G024E-K043Y、G024E-N076D、G024E-N218S、G024E-Q103H、G024E-Q206D、G024E-S033T、G024E-S063G、G024E-S162G、G024E-S248N、G024E-S249A、G131H-G169A、G131H-N218S、G131H-N243V、G131H-Q206D、G169A、G169A-K256R、G169A-L257G、G169A-N218S、G169A-N243V、G169A-Q206D、G169A-S248N、G169A-S249A、K043Y、K043Y-A116T、K043Y-A128S、K043Y-G131H、K043Y-G169A、K043Y-L257G、K043Y-N076D、K043Y-N109G、K043Y-N218S、K043Y-Q103H、K043Y-Q206D、K043Y-S063G、K043Y-S162G、K043Y-S248N、K043Y-S249A、K043Y-T158S、N076D、N076D-A088T、N076D-A116T、N076D-A128S、N076D-G131H、N076D-G169A、N076D-N218S、N076D-N243V、N076D-Q103H、N076D-Q206D、N076D-S162G、N076D-S248N、N076D-S249A、N109G-G169A、N109G-Q206D、N109G-S248N、N218S、N218S-K256R、N218S-L257G、N218S-S248N、N218S-S249A、P040E-N109G-A128S-G131H、Q103H、Q103H-G169A、Q103H-Q206D、Q206D、Q206D-K256R、Q206D-L257G、Q206D-N218S、Q206D-N243V、Q206D-S248N、Q206D-S249A、S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T、S033T-A088T、S033T-A116T、S033T-A128S、S033T-A128S-G131H-N243P、S033T-G131H、S033T-G169A、S033T-K043Y、S033T-K256R、S033T-L257G、S033T-N076D、S033T-N076D-A128S-N218S、S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S033T-N109G、S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-N218S、S033T-P040E-Q103H-N109G、S033T-Q103H-A128S-G131H、S033T-Q206D、S033T-S063G、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V、S033T-S162G、S033T-S248N、S033T-S249A、S063G-A116T、S063G-G131H、S063G-G169A、S063G-N109G-A128S-G131H、S063G-N218S、S063G-N243V、S063G-Q206D、S063G-S249A、S162G-G169A、S162G-N218S、S162G-Q206D、S162G-S249A、S248N-K256R、S248N-S249A、S249A-K256R、S249A-L257G、T158S-G169A、T158S-K256R、T158S-Q206D和T158S-S162G；
(iv)A001E、A001E-A088T、A001E-A116T、A001E-A128S-G131H-N243V、A001E-G024E、A001E-G131H-G169A-N243V、A001E-G169A、A001E-K043Y、A001E-L257G、A001E-N076D、A001E-N076D-N109G-A128S、A001E-N109G、A001E-Q103H、A001E-Q206D、A001E-S033T-N109G-N218S、A001E-S033T-N109G-N243V、A001E-S248N、A001E-T158S、A088T-G169A、A088T-Q206D、A116T-G169A、A116T-N218S、A116T-Q206D、A128S-G131H、A128S-N243V-S248N-K256R、A128S-Q206D、G024E-K043Y、G024E-N076D、G024E-Q206D、G131H-G169A、G131H-N218S、G131H-N243V-K256R、G131H-Q206D、G131H-S248N、G169A-K256R、G169A-N218S、G169A-N243V、G169A-Q206D、G169A-S249A、K043Y-G169A、K043Y-N076D、K043Y-N218S、K043Y-Q206D、N061P-N109G-G131H-N243V、N061P-N109G-N243V、N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P、N061S-N109G-N243V、N076D、N076D-G131H、N076D-L257G、N076D-N109G、N076D-Q103H、N076D-Q206D、N076D-S249A、N109G-A128S-N243V-S248N、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-S248N-K256R、N109G-G169A、N109G-N243P-S248A-K256R、N109G-N243P-S248N-K256R、N109G-N243V-K256R、N109G-N243V-S248A-K256R、N109G-N243V-S248N、N109G-N243V-S248N-K256R、N109G-S248N-K256R、N218S-S249A、N243V-S248N-K256R、P040E-N109G-A128S-G131H、Q103H-Q206D、Q206D、Q206D-K256R、Q206D-L257G、Q206D-N218S、Q206D-S248N、Q206D-S249A、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R、S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V、S018T-Y021N-A128S-N243V、S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P、S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P、S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T、S033T-A128S-G131H-N243P、S033T-A128S-G131H-N243V、S033T-G169A、S033T-N076D-A128S-N218S、S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R、S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-P040E-Q103H-N109G、S033T-Q103H-A128S-G131H、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V、S063G-G131H、S063G-G169A、S063G-N109G-A128S-G131H、S063G-Q206D、S162G-Q206D、T158S-Q206D和T158S-S162G；
(v)A001E-A088T、A001E-A128S、A001E-A128S-G131H-N243V、A001E-G024E、A001E-G024E-S204E-Q206D、A001E-G131H-G169A-N243V、A001E-K043Y、A001E-N076D、A001E-N076D-N109G-A128S、A001E-N218S、A001E-N243V、A001E-Q103H、A001E-Q206D、A001E-S033T、A001E-S033T-N109G-N218S、A001E-S162G、A116T-Q206D、A128S-N243V-S248N-K256R、A128S-Q206D、G024E-Q206D、G131H-Q206D、K043Y-G131H、K043Y-Q103H、K043Y-Q206D、K043Y-S162G、N061S-N109G-A128S-N243V-S260P、N076D-A128S、N076D-Q206D、N076D-S162G、N076D-S248N、N109G-A128S-S248N-K256R、N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R、N109G-N243P-S248N-K256R、N109G-Q206D、N243V-S248N-K256R、P040E-N109G-A128S-G131H、Q103H-Q206D、Q206D-K256R、Q206D-N243V、Q206D-S248N、Q206D-S249A、S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P、S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P、S033T-A128S-G131H-N243P、S033T-N076D-A128S-N218S、S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S033T-P040E-Q103H-N109G、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P、S063G-Q206D、S162G-Q206D和T158S-Q206D；
(vi)A001E、A001E-A128S、A001E-G024E、A001E-G131H、A001E-G169A、A001E-K043Y、A001E-K256R、A001E-L257G、A001E-N076D、A001E-N109G、A001E-N218S、A001E-N243V、A001E-Q103H、A001E-Q206D、A001E-S033T、A001E-S063G、A001E-S162G、A001E-S248N、A001E-S249A、A001E-T158S、A088T-A116T、A088T-G131H、A088T-N109G、A088T-N218S、A088T-Q206D、A116T-A128S、A116T-G131H、A116T-Q206D、A116T-S248N、A128S、A128S-G131H、A128S-Q206D、G024E、G024E-N076D、G024E-N109G、G024E-Q206D、G131H、G131H-L257G、G131H-Q206D、G169A-K256R、G169A-Q206D、K043Y、K043Y-A088T、K043Y-A116T、K043Y-A128S、K043Y-G131H、K043Y-G169A、K043Y-K256R、K043Y-L257G、K043Y-N076D、K043Y-N109G、K043Y-N218S、K043Y-N243V、K043Y-Q103H、K043Y-S063G、K043Y-S162G、K043Y-S248N、K043Y-S249A、K043Y-T158S、N076D-A088T、N076D-A116T、N076D-A128S、N076D-G131H、N076D-G169A、N076D-N109G、N076D-N218S、N076D-N243V、N076D-Q103H、N076D-Q206D、N076D-S248N、N076D-T158S、N109G、N109G-G169A、N109G-Q206D、N109G-S162G、N109G-T158S、N218S-S248N、Q103H、Q103H-A128S、Q103H-G131H、Q103H-Q206D、Q103H-S248N、Q103H-S249A、Q103H-T158S、Q206D、Q206D-K256R、Q206D-L257G、Q206D-N218S、Q206D-N243V、Q206D-S248N、Q206D-S249A、S033T、S033T-K256R、S033T-S063G、S033T-S249A、S063G-A088T、S063G-G131H、S063G-G169A、S063G-N076D、S063G-N109G、S063G-N218S、S063G-Q103H、S063G-Q206D、S162G-Q206D、S162G-S249A、S248N-S249A、S249A-K256R、T158S-Q206D和T158S-S249A；
(vii)G131H-S162G、G131H-S248N、G131H-T158S、K043Y-G131H、K043Y-S162G、Q103H-A128S、Q103H-N218S、S033T-Q103H、S063G-A088T、S063G-G131H、S063G-S248N和T158S-S162G；
(viii)A015S-A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T-A098S-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-A098S-N218S-K256R、A088T-A116T-G131H-G146C、A088T-A116T-G131H-K256R、A088T-A116T-G131H-K256R-L257G-L267M、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-N243V、A088T-A116T-G131H-S248N、A088T-A116T-G131H-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S、A088T-A116T-N218S-I268V、A088T-A116T-N218S-K256R、A088T-A116T-N218S-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-Q271R、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-Q275R、A088T-A116T-N218S-S248N、A088T-A116T-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S、A088T-A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-T158S-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-E251K-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-S248N-L257G、A088T-A138E-N218S-N243V-K256R、A088T-G131H、A088T-G131H、A088T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-K256R、A088T-G131H-N218S-K237R-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-K256R、A088T-G131H-N218S-K256R、A088T-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-N218S-S248N、A088T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-N243V、A088T-G131H-N243V-K256R、A088T-G131H-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-N243V-S248N、A088T-G131H-N243V-S248N、A088T-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-S248N、A088T-G131H-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-A223G-S248N-K256R、A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-I108T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-K213N-N243V-S248N-K256R、A088T-K256R-L257G、A088T-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-A232S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-K141E-N218S、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-N269D、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-Q275R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G-I268V、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243F-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-W241L-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-K256R、A088T-N109G-A116T-M124I-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N2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(x)A045S-S236G、A045S-S236Y、A134T-S260G、G024A-S037W、I031V-S038W、I115T-S183T、I115V-N184Y、N025K-P129K、N025K-P129R、N025K-S037P、N061D-S260I、Q010L-S037P、Q010R-S037T、Q019L-S260N、Q019L-S260P、S037P-T254S、S161P-T253A和S162L-D181H；
(xi)A045S-S236G、A045S-S236Y、A133V-S260N、A134T-S260G、G024A-S037W、I031V-S038W、I115T-S183T、I115V-N184Y、N025K-P129R、N025K-S037P、N061D-S260I、Q010R-S037T、Q019L-S260N、Q019L-S260P和S162L-D181H；以及
(xii)A045S-S236G、A045S-S236Y、I115T-S183T、N025K-S037P、N061S-S260P、Q010L-S037P、Q010R-S037T、Q019L-S260N、S037P-T254S和S161P-S260P；其中所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号。
分别与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示的蛋白酶相比，根据本发明的第九个方面的变体可具有增强的蛋白水解活性和/或增强的清洁活性。根据本发明的第九个方面的变体在蛋白水解测定(如AAPF测定)或清洁测定(如BMI、草或蛋微样条测定)中性能指数可高于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中所示的蛋白酶的性能指数。根据本发明的第九个方面的变体可以是BPN’枯草杆菌蛋白酶(SEQIDNO:2)的蛋白酶变体。
在第二十一个方面，本发明提供分离的或非天然存在的为亲本蛋白酶的变体的冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶总共包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个选自下面群组(a)和群组(b)的突变，其中至少一个突变选自群组(a)：
(a)1、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、33、43、76、102、109、137、141、158、169、204、210、218、243、248、249、256、257、260和269；和
(b)24、25、40、52、53、55、58、59、61、62、63、68、78、86、87、88、89、92、96、97、100、101、103、104、106、111、114、115、116、117、118、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、144、145、159、161、162、167、194、203、206、213、217、227、232、239、240、242、265、267和275，其中氨基酸位置是通过与SEQIDNO:2的对应关系进行编号。根据本发明的第二十一个方面的亲本蛋白酶可包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且根据本发明的第二十一个方面的变体可总共包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个选自下面群组(a)和群组(b)的突变，其中至少一个突变选自群组(a)：
(a)A1E/T、S9/T、P14L、A15L、L16C、H17T、S18L/T、Q19K、G20A、Y21N/T、T22L、G23E、S33T、K43Y、N76D、G102A、N109A/S/G、A137V、K141R、T158S、G169A、S204E、P210S、N218S、N243P/V、S248N/A、S249A、K256R、L257G、S260P和N269D；和
(b)S24G/R/E、N25G、P40A/E、P52L、S53G、T55P、F58G、Q59S、N61E/P/G/S、N62Q/R/S、S63G/H、V68A、S78N、P86S、S87D/G、A88T/V、S89Y、A92G、L96T、G97A、G100N/Q/T、S101N、Q103E/H、Y104N、W106F、I111V、A114G、I115V、A116N/T、N117S、N118G、N123A/G/Q/V、M124I/V、S125A、L126A、G128A/S、P129E/Q/S/V、S130G、G131S/H、S132N、A133V、A134T、A144K、S145D、S159K、S161P、S162G/K、Y167A、P194L、V203Y、Q206D/E、K213L、Y217Q/L/D、V227T、A232T、P239R/V、N240K、T242R、K265N、L267V和Q275E。根据本发明的第二个方面的变体和亲本蛋白酶可以是成熟形式。
根据本发明的第二十一个方面的变体可相对于BPN’野生型具有-1、0或+1的总净电荷。
在本发明的第一、第二、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第二十一个方面，变体可以是枯草杆菌蛋白酶变体，该变体与亲本枯草杆菌蛋白酶相比在洗涤剂中具有改善的洗涤性能或清洁性能，其可以是枯草杆菌蛋白酶。在本发明的第三个方面，与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的蛋白酶相比，所述多肽可在洗涤剂中具有改善的洗涤性能或清洁性能。这些方面的示例性洗涤剂在第I部分实施例和第II部分实施例中示出。
根据本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第二十一个方面的蛋白酶变体可以是冷水蛋白酶。在一个方面，根据本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第二十一个方面的蛋白酶变体可以是冷水蛋白酶，该冷水蛋白酶：(i)当与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的酶相比较时，在pH8和60℉下对BMI，性能指数(PI)大于1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少1至约10、至少1至约8或至少1至约5，如第I部分实施例1中示出的测试方法中所定义的；或者(ii)当与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的酶相比较时，在pH8和60℉下对BMI，性能指数为至少1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少1至约10、至少1至约8或至少1至约5，如第I部分实施例1中示出的测试方法中所定义的；
如上所述，本发明的蛋白酶变体多肽具有酶活性(如蛋白水解活性)并因而可用于清洁应用，包括但不限于用于清洁盛具物品、餐具物品、织物和具有硬质表面的物品(如桌子、桌面、壁、家具物品、地板、天花板等的硬质表面)的方法。包含一种或多种本发明的蛋白酶变体多肽的示例性清洁组合物在下文中进行描述。本发明的蛋白酶变体多肽的酶活性(如蛋白酶活性)可使用本领域普通技术人员熟知的程序容易地测定。下文给出的实施例描述了用于评价酶活性、清洁性能和/或洗涤性能的方法。本发明的蛋白酶变体在移除污渍(如蛋白质性质的污渍)、清洁硬质表面或清洁衣物、盛具或餐具物品方面的性能可用本领域所熟知的程序和/或通过使用第I部分实施例和/或第II部分实施例中示出的程序容易地测定。
可对本发明的多肽进行多种改变，如一个或多个氨基酸的插入、缺失和/或置换(保守的或非保守的置换)，包括其中这类改变不会实质上改变该多肽的酶活性的情况。类似地，也可对本发明的核酸进行多种改变，如在一个或多个密码子中对一个或多个核酸进行一种或多种置换使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，从而导致沉默变异(如，核苷酸序列中的突变可导致氨基酸序列中的沉默突变，例如当所编码的氨基酸未因该核酸突变而变更时)或非沉默变异；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种缺失；序列中一个或多个核酸(密码子)的一种或多种添加或插入；和/或序列中一个或多个核酸(密码子)的切除或序列中一个或多个核酸(密码子)的一种或多种截短。与初始核酸序列编码的蛋白酶变体相比，核酸序列中的许多这类改变可能不会实质上改变所得的编码的蛋白酶变体的酶活性。还可对本发明的核酸进行修饰以包括一个或多个使得能在表达系统(如细菌表达系统)中进行最优表达的密码子，同时如果需要，所述一个或多个密码子仍编码相同氨基酸。
本发明包括一类多肽，所述多肽包含具有所需酶活性(如蛋白酶活性或清洁性能活性)的蛋白酶变体多肽，其包含具有本文所述的氨基酸置换的序列并且其还包含一个或多个另外的氨基酸置换，如保守和非保守置换，其中所述多肽展现出、维持或大致维持所需的酶活性(如蛋白酶活性或枯草杆菌蛋白酶活性，如该蛋白酶变体的清洁活性或性能所反映的)。根据本发明的氨基酸置换可包括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置换通常涉及将一功能类别的氨基酸残基中的成员替换为属于同一功能类别的残基(在计算功能同源性百分数时相同氨基酸残基被视为在功能上是同源的或保守的)。保守氨基酸置换通常涉及用功能相似的氨基酸置换氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸是功能相似的，因而可充当彼此的保守氨基酸置换。天冬氨酸和谷氨酸可充当彼此的保守置换。天冬酰胺和谷氨酰胺可充当彼此的保守置换。精氨酸、赖氨酸和组氨酸可充当彼此的保守置换。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸可充当彼此的保守置换。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充当彼此的保守置换。
可以设想其他的保守氨基酸置换组。例如，可通过相似的功能或化学结构或组成对氨基酸进行分组(如酸性、碱性、脂族、芳族、含硫氨基酸)。例如，脂族组可包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。含有可视为彼此保守置换的氨基酸的其他组包括：芳族组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫组：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性组：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带电荷的残基的组：半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和脯氨酸(P)；亲水性不带电荷的残基的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组是本领域技术人员所熟知的并在各种标准教科书中有描述。本文的多肽序列的列表，结合上文的置换组，提供了所有经保守置换的多肽序列的明确列表。
在上文描述的氨基酸残基类别中存在更保守的置换，其也可以是合适的或者其作为另一种选择可以是合适的。用于更保守的置换的保守组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。因而，例如，本发明包括分离的或重组的具有蛋白水解活性的蛋白酶变体多肽(如枯草杆菌蛋白酶变体)，所述蛋白酶变体多肽包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的氨基酸序列。本发明的蛋白酶变体中一个氨基酸保守置换另一个氨基酸预计不会显著改变该蛋白酶变体的酶活性或清洁性能活性。所得的蛋白酶的酶活性或清洁性能活性可容易地用标准测定法和本文所述的测定法进行测定。
本发明的多肽序列(例如本发明的蛋白酶变体)的保守置换变异包括用保守氨基酸置换该多肽序列的少部分的，有时低于约25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％或6％的氨基酸，或该多肽序列的低于5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸。
如本文其他地方更详细描述的以及本文提供的实施例中描述的，本发明的多肽可具有可与已知蛋白酶(包括已知枯草杆菌蛋白酶)相当的清洁能力。示例性的已知枯草杆菌蛋白酶包括但不限于例如迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L和克劳氏芽孢杆菌PB92。
许多本发明的多肽，包括蛋白酶变体在内，例如本说明书整篇中(包括但不限于在实施例中)描述和列出的枯草杆菌蛋白酶变体。第I部分实施例描述了本发明的蛋白酶变体，例如包括但不限于BPN’蛋白酶变体。第II部分实施例描述了另外的本发明蛋白酶变体，例如包括但不限于GG36蛋白酶变体。
本发明提供蛋白酶变体，包括丝氨酸蛋白酶变体在内，其与参考丝氨酸蛋白酶相比其具有一个或多个置换。在一个方面，本发明提供冷水蛋白酶。另外，本发明还提供了包含一种或多种这类蛋白酶变体(例如丝氨酸蛋白酶变体)的组合物。组合物可包含至少一种本发明的这类蛋白酶变体和辅助成分，如本文其它地方所述。在一个方面，本发明提供包含这些蛋白酶变体中的至少一种(例如丝氨酸蛋白酶变体)的清洁组合物。清洁组合物可以是洗涤剂组合物。清洁方面的趋势是使用较低的洗涤温度以节约能量。酶在较低温度下具有较低的活性，从而导致清洁性能降低。本领域对较于本领域目前已知的酶在冷水洗涤条件下具有增强的性能的酶存在需要。本发明解决了这个需要。
本发明提供包含至少一种本文所述的丝氨酸蛋白酶变体(如枯草杆菌蛋白酶变体)的清洁组合物。枯草杆菌蛋白酶变体可以是BPN’蛋白酶变体。如上文更详细论述的，本发明包括包含BPN’蛋白酶变体和GG36蛋白酶变体的组合物。某些蛋白酶变体(例如包括但不限于本发明的枯草杆菌蛋白酶变体)是冷水蛋白酶。清洁组合物可以是衣物洗涤剂。衣物洗涤剂可以是具有在3至11之间(如介于pH4、pH5、pH6、pH7、pH7.5、pH8、pH9、pH10、pH10.5等)的pH的洗涤剂、冷水洗涤剂、低pH洗涤剂(如pH3-6)、中性pH洗涤剂(如pH6.5-7.5)、碱性pH洗涤剂(如pH9-11)或紧凑型洗涤剂。洗涤剂可包括磷酸盐或可以无磷酸盐。清洁组合物可以是盛具洗涤剂。在一个方面，盛具洗涤剂是无磷酸盐洗涤剂，而在另一个方面，盛具洗涤剂是含磷酸盐的洗涤剂。在一个方面，本发明的清洁组合物还包含至少一种另外的酶，所述另外的酶可任选选自中性金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、过水解酶、氧化酶和过氧化物酶。还提供的是编码本发明的丝氨酸蛋白酶变体的分离的核酸、包含一种或多种本发明的这类核酸的表达载体以及包含至少一种本发明的这类表达载体的宿主细胞。
在整篇说明书中，为了易于指代，一“组氨基酸置换”或一“组置换”可以指多个氨基酸置换的组(即G097A+G128A+Y217Q)或单个氨基酸置换的组(即Y217Q)。因而，包含具有选自G097A-G128A-Y217Q和Y217Q的至少一组氨基酸置换的BPN’序列(SEQIDNO:2)的BPN’变体表示该BPN’变体包含具有BPN’-G097A-G128A-Y217Q或BPN’-Y217Q的氨基酸序列。
成熟BPN’-v3枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列(其在SEQIDNO:4中示出)可表示为BPN’-G097A-G128A-Y217Q，其意指具有三个置换G097A、G128A和Y217Q的SEQIDNO:2的BPN’氨基酸序列。在这个格式中，每个短划线(-)等价于使用加号(+)。因而，作为另一种选择，BPN’-G097A-G128A-Y217Q可写为BPN’+G097A+G128A+Y217Q。成熟BPN’-v36枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列(其在SEQIDNO:6中示出)可写为BPN’-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q或BPN’+S24G+S53G+S78N+S101N+G128A+Y217Q。本发明的BPN’变体可用这些格式来描述。
另外，本发明提供枯草杆菌蛋白酶变体，其中每一这种变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且包含具有至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-v3氨基酸序列(SEQIDNO:4)：S87T-A88L-S89G、N61P-S63H、S87G-A88V-S89A、P86S-S87G-A88V、Q59S-N61P、S24G-N25G、N61P-N62S、P129Q-S130G-G131S、L75S-N76Y、V203Y、T55P、A88V-L90I、G211R-N212S-K213V、G23A-S24G-N25G、T22N-S24A、S24R、A98S、T158G-S159G、Q59E-N61P和A98E，并且其中氨基酸位置通过与如SEQIDNO:2所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的对应关系进行编号。
注意，BPN’-v3氨基酸序列(其在SEQIDNO:4中示出)可写为BPN’-G97A-G128A-Y217Q。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，其中所述变体包含在SEQIDNO:4中具有氨基酸置换A128S的SEQIDNO:4的氨基酸序列。因而，本发明包括氨基酸序列BPN'-G97A-G128A-Y217Q。在整篇本说明书中，本发明的多肽变体可描述为参考多肽的变体，该变体在参考多肽序列中的一个或多个指定位置处分别具有一个或多个特定氨基酸置换。
本发明还提供枯草杆菌蛋白酶变体，其中每一这种变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且包含具有至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-v3氨基酸序列(SEQIDNO:4)：P86S-S87G-A88V-A116N-N117S-N118G、S24G-N25G-N61P-S101N、S24G-N25G-S53G-T55P-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、N61P-S78N-S101N-V203Y、T55P-N61P-S78N-S101N-V203Y、S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、V203Y-L267V、S24G-N25G-T55P-S101N、A134T-L267V、S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G、S24G-N25G-S53G-N61P-S101N-V203Y、N25Y-Q59S-N61P、I111V-S161P、I115V-L267V、T55P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、N25Y-P129Q-S130G-G131S-A137T、N61P-S63H-A128S-P129Q、S53G-N61P-S101N-V203Y、S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、N25Y-N61P-S63H、Q59S-N61P-V203Y、V8L-N25Y-P129Q-S130G-G131S、P86S-S87G-A88V-P239R、S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S101N-V203Y、S24G-N25G-P129Q-S130G-G131S、N240K、G23A-S24G-N25G-G211R-N212S-K213V、N61P-S63H-S78N-I111V-A134T、S63T-P86S-S87G-A88V、G23A-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G、S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、S24G-N25G-A116N-N117S-N118G、T55P-N240K、T55P-P129V-P194S、N25Y-S87G-A88V-S89A、S24G-N25G-S87T-A88L-S89G-S101N、P129Q-S130G-G131S-V203Y、Q59S-N61P-N240K、S24R-P40E-P129E-S159K-K265R、P52S-T55P-V203Y、S24R-P129E、S24G-N25G-S53G-N61P-S78N、S24G-N25G-T55P-S78N-S101N、P86S-S87G-A88V-A116S-N117G-N118R、N61P-S87T-A88L-S89G、S24G-N25G-S53G-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G、G23A-S24G-N25G-N61P-S63H、S24R-Q59S-N61P、N61P-P129Q-S130G-G131S、S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、S24G-N25G-S53G-T55P-S101N-V203Y、N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、S24G-N25G-S53G-T55P-S78N-S101N、S24G-N25G-S53G-S101N-V203Y、S24G-N25G-S78N-S101N-V203Y、P129Q-S130G-G131S-A133V-L267V、S87T-A88L-S89G-S101N、G23A-S24G-N25G-P239R、S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G、Q59S-N61P-A116S-N117G-N118R、Q59S-N61P-S87T-A88L-S89G、S24G-N25G-S53G-S87T-A88L-S89G-V203Y、A134T-G211T、T55P-A128S-P129Q、T55P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、P86S-S87G-A88V-T242R、S161P-V203Y、S24G-N25G-T55P-N61P-S78N-S101N-V203Y、G211T-L267V、P40E-T55P-N269K、S24R-A128S-P129G、S24G-N25G-N61P-N62S-P194L-A232T、T55P-A116S-N117G-N118R、S24G-N25G-S53G-S78N-S101N-V203Y、P129Q-S130G-G131S-N240K、S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G、N25Y-P129Q-S130G-G131S、T55P-I115V、N25Y-T55P、G23A-S24G-N25G-A128S-P129D、S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-P129S-V203Y、T55P-A134T、N61P-S63H-S78N-I111V、N61P-A97G-G102A-A128G-P129S、S53G-N61P-S101N、Q59S-N61P-S87G-A88V-S89A、S53G-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、S87T-A88L-S89G-P129S、S53G-T55P-S78N-S101N-V203Y、T55P-P129Q-S130G-G131S、Q59S-N61P-P129Q-S130G-G131S、A134T-P239R、T55P-V203Y、T55P-S78N-S89Y、T22N-S24A-N61P-S63H、S161P-L267V、T55P-L75H-N76G、A134T-S161P、S87T-A88L-S89G-A134T、T55P-A116N-N117S-N118G、A128S、T55P-S78N-I115V、Y6Q-P129Q-S130G-G131S、S24R-P129Q-S130G-G131S、S24G-N25G-S53G-S78N-S101N、T55P-P129V、N61P-N62Q-G100N-A128G、T55P-P129Q、S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、S87T-A88L-S89G-N240K、A134T-N240K、S87T-A88L-S89G-P239R、P129Q-S130G-G131S-L267V、P129Q-N240K、S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y、I111V-A273S、S24G-N25G-T55P-S78N-A88V-S101N、S24G-N25G-T55P-S78N、S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S101N-V203Y、S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y、S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、S87G-A88V-S89A-P129Q-S130G-G131S、N61P-S63H-S78N-S161P、T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、I111V-P129Q-S130G-G131S、T22N-S24A-T55P、I115V-N240K、S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G-P172H、S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、S24G-N25G-I115V-A134T、T55P-A128S-P129D、I111V-S159K、N240K-A273S、S159K-L267V、I111V-P129Q-G211T、I115V-A273S、S89Y、S24R-A116N-N117S-N118G、N61E-A144K、P129Q-S130G-G131S-P239R、S87T-A88L-S89G-I115V、T55P-A92G、S145D-S159K-N240K-Q275E、S89Y-P129Q-S130G-G131S、P129Q-S130G-G131S-S162K、I111V-A134T、P40E-S53Y-S78Y-P86S-S87G-A88V、S24G-N25G-L75H-N76G、N61P-A128G-P129S-S130P、S24R-S145D、S24R-S145D-P239R-Q275E、S24R-S78N-S182P-L267V、S53G-N61P-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、P5S-S87G-A88V-S89A-A116G-N117R、S53G-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、Q59S-N61P-A116N-N117S-N118G、P239R-A273S、S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、S24R-P129V、I111V-P239R、S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、T55P-P129L、S87T-A88L-S89G-I111V、S145D-A273S、P129Q-S130G-G131S-T242R、S3F-S87T-A88L-S89G-G211T、S87G-A88V-S89A-S162K、S89Y-G211T、S87T-A88L-S89G-A144K、P129Q-S130G-G131S-S159K、A116N-N117S-N118G-P129Q-S130G-G131S、S24G-N25G-P129V、S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、N123G-A128G、N61P-N62Q-G100N-G102A-M124I、S24G-N25G-K141E-T242R、S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G-A144T、T55P-N61P-S87T-A88L-S89G-G110C-S130P、L75S-N76Y-A116S-N117G-N118R、S145D-S159K-K213L-P239R-N240K、S24R-S87T-A88L-S89G、G23A-S24G-N25G-P129V、A134T-K213L、S89Y-A273S、S24R-P239R、N123G-A128G-P129S、S89Y-P239R、S24G-N25G-A92G、N61P-S63H-I115V-A228V、A97G-A128G-Q217L、L75S-N76Y-P129V、S24R-P129L、S87G-A88V-S89A-P129Q-S182Y-S204Y-P239Q、S24R-A92G、S24R-A116S-N117G-N118R、G23A-S24G-N25G-A116G-N117R、S24G-N25G-P129L、S87T-A88L-S89G-S101G、G23A-S24G-N25G-P129L、S53G-N61P-G102A-V203Y、T55P-V147P、Y6Q-L75S-N76Y、N61P-S63H-V147P、S24R-V147P、S24G-N25G-V68C-A69G、S24G-N25G-N61P-L75S-N76Y-S101N-V203Y、L75S-N76Y-S78N-S101N-V203Y、L75S-N76Y-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-S130P、S24G-N25G-S53G-S101N-S130P-V203Y、G47E-M50I-L75S-N76Y-S162K、S53G-T55P-S87T-A88L-S89G-S101N-S130P-V203Y、S24G-N25G-L75S-N76Y-A128T-P129T-S130G-G131Q-S132C-A133G-A134T、P129Q-S130G-G131S-V147P、S53G-T55P-N61P-L75S-N76Y-S87T-A88L-S89G-G102A-S130P-V203Y和S53G-T55P-N61P-L75S-N76Y-S101N-S130P-V203Y，并且其中氨基酸位置是通过与如SEQIDNO:2所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的对应关系进行编号。
本发明还提供枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且包含具有至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-v3氨基酸序列(SEQIDNO:4)：P40E-S78N-S87D-Y217L、P40E-Y217L、T22V-S78N-Q206E-K213N-Y217L、T22V-S78N-K213N-Y217L、S87D-Y217L、S78N-Y217L、K213N-Y217L、Q206E-Y217L和T22V-Y217L，并且其中氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的对应关系进行编号。
本发明还提供枯草杆菌蛋白酶变体，其中每一这种变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且该变体包含具有至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-v3氨基酸序列(SEQIDNO:4)：S87D-N76D-S78N、P40E-S78N-S87D、P40E-S87D、S78N-P40E、S87D-N76D、P40E、S78N-S87D、S87D和S78N，并且其中氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的对应关系进行编号。在一个方面，所述置换赋予改善的酶稳定性。
本发明还提供枯草杆菌蛋白酶变体，其中每一这种变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且包含具有至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-v3氨基酸序列(SEQIDNO:4)：S101N、A137V、N61P、S130P、Q103N、S63T、G102A、N109D-S248R、S87R、S188D、S87D-S248R、S188D-S248R、S248D、N109D-S188D-S248R、N109D、S87R-S248R、N109D-S188R、N76D、S87D-N109D-S188D-S248R、S87R-N109D-S188D-S248R、S87R-S188R-S248R、A187D、N109D-S248D、S87R-N109R-S188R-S248R、F189D、G100N、S87R-N109D-S188D、S87D-N109D-S188D、S87R-S188D-S248D、N62D和S87D-N109D-S188D-S248D，并且其中氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的对应关系进行编号。
本发明还提供枯草杆菌蛋白酶变体，其中每一这种变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且包含具有至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-v3氨基酸序列(SEQIDNO:4)：S78N-L267V、S78N-S161P、S78N-I115V、S78N-A273S、S78N-G211T、S78N、S78N-I111V、S78N-V147L、S78N-I108V、S78N-S89Y、S78N-A138T、S78N-P172V、S78N-Q59G、P129T-V147Q-S159D-S161P-S183T-Q185T-G211A-S224A、Q059V-I108V-V147Q-G211A-N252Q、S78N-Y167A、S78N-A92G、S78N-P129L、N061A-S087E-M124I-S161P-S224A、S78N-N62Q、S78N-V68A、S063T-S101A-L126V-S183T-T244N、S78N-M124T、P040L-S053G-Q059V-N061A-N062Q-S063T-S087E-G100N、N062Q-G100N-S125A-S159D-N240S、V68A-G102A-G211A-S125A和S053G-V068A-G102A-P129T-Q185T，并且其中氨基酸位置通过与如SEQIDNO:2所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的氨基酸残基位置的对应关系进行编号。
本发明还提供枯草杆菌蛋白酶变体，其中每一这种变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且包含具有至少一组选自如下的氨基酸置换的氨基酸序列：G97A-G128S-Y217Q-S24G-N25G-N61P-S101N、G97A-G128S-Y217Q-S53G-N61P-S101N-V203Y、G97A-G128S-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-N61P-S101N-V203Y、P52L-V68A-G97A-I111V、I111V-M124V-Y167A-Y217Q、Y104N-G128A-Y217Q、M124V-Y167A-Y217Q、I111V-M124V-Y217Q、P52L-V68A-G97A、G97A-I111V-M124V、V68A-A92G-G97A、G97A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q、P52L-V68A-I111V-Y217Q、P52L-V68A-I111V、V68A-A92G-I111V、P52L-V68A-G97A-I111V-Y217Q、V68A-G97A-I111V、G97A-I111V-Y217Q、G97A-I111V-M124V-Y167A、S89Y-I111V-M124V、V68A-S89Y-I111V、V68A-A92G-Y217Q、I111V-Y167A-Y217Q、G97A-I111V-Y167A-Y217Q、G97A-I111V-M124V-Y217Q、V68A-I111V-Y167A-Y217Q、I111V-G128A-Y217Q、G97A-M124V-Y217Q、V68A-Y167A-Y217Q、I111V-M124V-Y167A、N62Q-G97A-I111V、G97A-M124V-Y167A-Y217Q、G97A-L126A-Y217Q、V68A-I111V-Y217Q、S89Y-M124V-Y217Q和L96T-G97A-Y217Q，并且其中位置通过与如SEQIDNO:2所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的氨基酸残基位置的对应关系进行编号。一些这类变体包含具有至少一组选自所述群组的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)。
本发明还提供枯草杆菌蛋白酶变体，其中每一这种变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且包含具有选自如下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或更多个置换的BPN’氨基酸序列：S182E、N109I、N117H、K237D、L257Q、P225N、S105H、S236I、L235H、S249E、N76E、S145N、N243D、R247N、E195N、A98K、S182N、S161H、G83H、G131D、T71C、K136Q、P40D、A187H、L250K、S9I、N76M、S132D、Q19F、E112H、S249P、S53D、V68E、D41I、K43H、V4H、A13Y、N62P、L196E和V44D，并且其中位置通过与如SEQIDNO:2所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的氨基酸残基位置的对应关系进行编号。
本发明还提供包含枯草杆菌蛋白酶变体的盛具洗涤组合物以及包含枯草杆菌蛋白酶变体的织物清洁组合物。在一些优选的方面，该盛具和织物清洁组合物还包含至少一种另外的酶。在一些优选的方面，该另外的酶选自：蛋白酶(如中性金属蛋白酶、野生型丝氨酸蛋白酶或第二变体丝氨酸蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、过水解酶、氧化酶和过氧化物酶。此外，本发明提供盛具洗涤方法，该方法包括如下步骤：提供i)包含枯草杆菌蛋白酶变体的盛具洗涤组合物，和ii)需要清洁的盛具；以及使该盛具与该盛具洗涤组合物在可有效清洁该盛具的条件下接触。类似地，本发明提供织物清洁方法，该方法包括如下步骤：提供i)包含枯草杆菌蛋白酶变体的织物清洁组合物，和ii)需要清洁的衣物；以及使该衣物与该织物清洁组合物在可有效清洁该衣物的条件下接触。在进一步的方面，本发明提供编码所述变体的分离的核酸、包含与启动子有效组合的该分离的核酸的表达载体，和/或提供包含该表达载体的宿主细胞。
本发明还提供包含本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物。在一个方面，清洁组合物包含液体、凝胶、片状、粉末和/或颗粒洗涤剂。在一些另外的方面，清洁组合物选自衣物洗涤剂和盛具洗涤剂。在一些优选的方面，清洁组合物包含衣物洗涤剂。在一些特别优选的方面，清洁组合物是重垢洗涤剂。在一些另外的方面，清洁组合物包含选自手动盛具洗涤剂和自动盛具洗涤剂的盛具洗涤剂。在一些进一步优选的方面，本文提供的清洁组合物还包含至少一种漂白剂。在一些另外的方面，本文提供的清洁组合物是不含磷酸盐的，而在一些另选的方面，本文提供的清洁组合物是含磷酸盐的洗涤剂。在一些更进一步的方面，本文提供的清洁组合物是冷水洗涤剂。在又一些另外的方面，本文提供的清洁组合物还包含至少一种另外的酶。在一个方面，该清洁组合物包含至少一种另外的选自如下的酶：半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶；以及任何这些酶的混合物。
本发明还提供用于清洁的方法，所述方法包括提供待清洁的物品和包含至少一种本文提供的清洁组合物的组合物，以及使它们与该组合物在可有效清洁所述物品的条件下接触。在一个方面，所述方法还包括在使物品与清洁组合物接触后对物品进行漂洗的步骤。在一些优选的方面，待清洁的物品包括盛具。在一些备选的方面，待清洁的物品包括织物。
在一些进一步的方面，可将上述突变、缺失、插入或它们的组合中的任一者应用至含有突变Y217L的SEQIDNO:2的酶或含有突变G97A-G128A-Y217Q的SEQIDNO:2的酶。
在一个方面，本发明提供源于枯草杆菌蛋白酶，尤其是枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQIDNO:2)的合适冷水蛋白酶(即BPN’枯草杆菌蛋白酶变体)。在一个方面，相对于SEQIDNO:2，冷水蛋白酶包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或更多个如下氨基酸置换：Q002W、P005K、P005L、P005Y、G007T、V008G、V008K、V008P、I011G、I011H、I011S、K012L、A013M、L016W、G023S、V026H、V026W、V026Y、K027P、V028Q、V028S、V028T、A029C、A029D、A029S、A029T、A029V、V030D、V030E、V030G、V030T、I031E、I031G、I031H、I031K、I031N、I031Q、I031S、I031Y、S033F、S033H、D036L、S037P、D041A、D041C、D041M、D041N、D041S、L042S、L042Y、V044H、V044Q、V044T、G046F、G046L、G046M、G046V、G047T、G047W、S049I、S049V、M050D、M050I、M050R、V051A、V051G、V051S、P052C、P052I、P052L、P052M、P052V、P052W、P052Y、E054R、N056G、N056I、N056K、N056M、N056Q、N056R、N056V、N056Y、P057I、P057K、P057L、P057R、P057T、P057V、F058T、Q059P、Q059W、N061P、N062D、N062M、N062Q、S063C、S063Q、S063T、G065Q、V068A、V068G、V068M、V068S、A069C、A069D、A069F、A069H、A069M、A069N、A069P、A069Q、A069R、A069T、T071D、T071E、T071G、T071K、T071M、V072D、V072G、V072K、V072Q、V072S、V072T、A073E、A073I、A073K、A073M、A073Q、A073S、A073V、A074E、A074F、A074H、A074I、A074L、A074M、A074Q、A074R、A074V、A074W、A074Y、L075A、N076A、N077G、N077L、N077P、N077Q、N077R、N077S、N077T、S078W、G080H、V081D、V081F、V081H、V081N、V081Q、V081R、V081W、L082G、L082N、L082W、A085I、A085T、A085V、P086A、P086G、P086M、P086Q、P086R、P086T、P086W、P086Y、S087F、S087I、S087L、S087M、S087Q、S087V、S087W、A088D、A088E、A088K、A088P、A088Q、S089D、S089Q、S089V、L090D、L090E、L090F、L090H、L090P、L090S、L090T、Y091L、Y091Q、Y091T、A092C、A092I、A092M、A092N、A092P、A092V、V093D、V093F、V093L、V093T、K094C、K094R、K094S、V095I、L096F、L096H、L096I、L096M、L096N、L096Q、L096S、L096T、L096V、L096W、L096Y、G097A、G097C、G097D、G097E、G097F、G097L、G097M、G097P、G097Q、G097S、G097V、G097W、G097Y、D099C、D099E、D099I、D099M、D099P、D099V、D099Y、G100D、G100E、G100H、G100I、G100K、G100M、G100Q、G100T、G100V、G100Y、S101A、S101E、S101G、S101N、S101P、S101Q、S101T、S101V、G102A、G102S、Q103E、Q103G、Q103H、Q103K、Q103N、Y104L、Y104M、Y104N、Y104T、Y104V、S105D、S105I、S105R、S105V、W106A、W106C、W106E、W106F、W106G、W106I、W106L、W106M、W106S、W106T、W106V、I107R、I107S、I107T、I108S、I108T、G110S、G110T、I111A、I111C、I111F、I111L、I111M、I111T、I111V、E112I、E112L、E112T、W113H、A114I、A114V、I115A、I115E、I115F、I115H、I115M、I115N、I115P、I115Q、I115R、I115S、I115T、I115V、I115Y、N117K、N117V、N117W、N118I、N118L、N118V、M119F、M119N、D120Y、I122R、I122S、I122T、N123A、N123C、N123G、N123S、M124A、M124H、M124N、M124Q、M124S、M124T、M124V、S125A、L126A、L126Q、L126S、L126T、L126Y、G128E、G128N、G128T、P129V、S130P、S132I、S132N、S132P、S132Q、S132V、A134I、A134L、A134M、L135I、L135T、L135V、L135W、L135Y、K136D、K136F、K136I、K136V、K136Y、A137P、A138D、A138E、A138F、A138H、A138Q、A138Y、A142G、A142I、A142T、A142V、V143W、A144P、G146L、G146T、G146Y、V147D、V147P、V147W、V147Y、V148N、V148Y、V149E、A151T、A153T、A153V、S159K、T164W、V165T、Y167A、Y167D、Y167E、Y167M、Y167P、Y167S、Y167T、P168L、P168T、G169C、K170E、K170N、K170P、K170Q、K170S、K170T、K170Y、Y171C、Y171D、Y171L、Y171N、Y171W、P172E、P172G、P172I、P172L、P172V、P172Y、S173H、S173W、S173Y、V174A、V174I、V174L、V174S、I175A、I175F、I175R、I175T、I175V、A176V、V177W、V180F、V180H、V180Q、S182W、N184A、N184L、N184V、Q185D、Q185E、Q185I、Q185S、Q185T、R186C、R186D、R186E、R186F、R186G、R186I、R186L、R186N、R186P、R186Q、R186S、R186T、R186V、R186W、R186Y、A187D、A187E、A187Q、S190G、S190N、Y192D、Y192E、Y192L、Y192Q、G193H、G193Q、G193T、G193V、P194E、P194I、P194L、P194M、P194N、P194T、P194V、E195C、E195K、E195W、L196I、L196M、L196T、L196V、D197I、D197M、M199F、M199Q、A200C、A200H、A200N、A200T、A200V、A200Y、P201L、P201T、P201V、V203G、I205L、I205T、T208C、T208L、T208M、T208P、T208V、L209C、L209W、P210C、P210D、P210E、P210F、P210G、P210Q、P210R、P210S、P210V、G211A、G211D、G211E、G211P、G211T、G211V、G211W、N212E、N212T、K213Q、K213T、Y214A、Y214D、Y214N、Y214P、Y214S、G215D、G215Q、G215V、A216E、Y217E、Y217L、Y217M、N218P、A223W、S224D、S224N、S224Q、H226E、H226T、V227G、V227L、V227S、A230H、A230N、A231W、A231Y、A232N、I234W、L235N、S236W、H238A、H238G、H238I、P239H、P239S、W241G、W241Q、R247H、R247L、R247W、R247Y、L250E、L250T、N252Q、T253Y、T254D、T254Q、T254R、T255L、T255P、K256G、K256R、G258P、Y263D、Y263K、Y263R、K265P、I268S、I268T、I268W、V270F、A273K、A273P、A273R、A273V、A273W、A274W、S182E和N109I，其中该变体序列的位置通过与SEQIDNO:2的位置的对应关系进行编号。
在另一个方面，本发明提供合适的冷水蛋白酶，包括枯草杆菌蛋白酶变体在内，尤其是相对于SEQIDNO:2具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或更多个如下突变组的成熟BPN’(SEQIDNO:2)的变体：N109D-Y217L-S248R、N109D-S188R-Y217L、S87D-Y217L-S248R、S87R-N109D-Y217L-S248R、S87R-N109D-S188D-Y217L-S248R、G128A-Y217Q、I111V-M124V、M124V-Y217Q、N62Q-G97A、S89Y-M124V、V68A、V68A-A92G、V68A-G97A、V68A-I111V、V68A-S89Y、V68A-V227T、V68A-Y217Q、W106F-Y217Q、G97A-G128A-Y217Q、G97A-L126A-Y217Q、G97A-M124V-L126A-Y217Q、G97A-N123G-Y217Q、L96T-G97A-Y217Q、M124V-L126A-Y217Q、N62Q-G128A-Y217Q、N62Q-G97A-Y217Q、G97N-G128A-Y217M、G97G-G128S-Y217E、G97A-G128A-Y217Q、G97M-G128S-Y217E、G97A-G128S-Y217Q、G97D-G128S-Y217Q、G97M-G128G-Y217M、G97G-G128S-Y217Q、G97S-G128S-Y217Q、G97G-G128A-Y217Q、G97S-G128A-Y217E、G97A-G128S-Y217L、G97A-G128A-Y217N、G97Q-G128S-Y217L、G97A-G128A-Y217M、G97A-G128A-Y217S、G97D-G128A-Y217Q、G97M-G128S-Y217Q、G97Q-G128G-Y217D-S87Y、G97S-G128A-Y217N、G97A-G128S-Y217T、G97D-G128S-Y217E、G97D-G128A-Y217L、G97G-G128S-Y217E-S78P-A272T、G97T-G128S-Y217D、G97D-G128A-Y217I、G97Q-G128S-Y217Q、G97G-G128A-Y217D、G97Q-G128A-Y217N、G97S-G128A-Y217M、G97S-G128S-Y217N、G97S-G128S-Y217M、G97E-G128S-Y217M、G97S-G128P-Y217Q、G97T-G128S-Y217Q、G97D-G128S-Y217Q-A73T、G97E-G128S-Y217N、G97G-G128A-Y217I、G97Q-G128A-Y217D、G97Q-G128S-Y217M、G97R-G128T-Y217Q-S162P、G97S-G128S-Y217D、G97T-G128P-Y217I、G97Q-G128G-Y217E、G97C-G128G-Y217N、G97D-G128S-Y217H、G97M-G128S-Y217L、G97M-G128S-Y217N、G97S-G128S-Y217E、G97M-G128S-Y217I、G97A-G128P-Y217A、G97R-G128S-Y217D、G97A-G128A-Y217Q-S145D、G97A-G128A-Y217Q-P239R、G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S162K-K213L-N240K、G97A-G128A-Y217Q-N61E、G97A-G128A-Y217Q-P40E-A144K-K213L、G97A-G128A-Y217Q-P129E、G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S159K、G97A-G128A-Y217Q-K213L、G97A-G128A-Y217Q-S87D、G97A-G128A-Y217Q-Q206E、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-S145D-S159K-K213L、G97A-G128A-Y217Q-K265N、G97A-G128A-Y217Q-S24R、G97A-G128A-Y217Q-P40E、G97A-G128A-Y217Q-Q275E、G97A-G128A-Y217Q-P129E-S145D-N240K、G97A-G128A-Y217Q-A144K、G97A-G128A-Y217Q-S159K、G97A-G128A-Y217Q-S162K、G97A-G128A-Y217Q-N240K、G97A-G128A-Y217Q-S53G、G97A-G128A-Y217Q-S78N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-I111V、G97A-G128A-Y217Q-S53G-N117S、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S132N、G97A-G128A-Y217Q-Y104N-S132N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-I111V、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-N117S、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S132N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-Y104N-S132N、G97A-G128A-Y217Q-S78N-Y104N-S132N、Y217L-V068C-A069G、Y217L-I079F-A098G、Y217L-P086T-S101D-Q103S-V147I、Y217L-A088T-P129S-G146D、Y217L-V093I-G128D-P129R、Y217L-Z096.01D-A098R、Y217L-Z096.01H-A098G、Y217L-G097S-Z097.01S-A098G-A273T、Y217L-A098S-D099G-G100D、Y217L-Z098.01N、Y217L-D099G-Z099.01N、Y217L-D099G-Z099.01S、Y217L-D099V-S101D、Y217L-Z099.01S、Y217L-G100D、Y217L-S101D-Q103H、Y217L-S101G-A151V、Y217L-S101H-G102S、Y217L-S101H-Q103D、Y217L-G102R-Q103C-Y104C-V192I、Y217L-Q103D、Y217L-V121I-I122S-N123C、Y217L-V121L-N123C、Y217L-I122S-N123S、Y217L-M124I、Y217L-M124V、Y217L-L126F-P129Z-S182N、Y217L-L126Y、Y217L-G127S-P129D、Y217L-Z127.01N-G128S-P129S、Y217L-G128H-P129Y、Y217L-G128S-P129D、Y217L-G128S-P129D-S248R、Y217L-G128S-P129G、Y217L-P129G-G131Z、Y217L-P129G-S130H-S132Z、Y217L-P129H-G131Z、Y217L-P129L、Y217L-P129S-S130H-S132Z、Y217L-P129Z、Y217L-P129Z-S130G、Y217L-P129Z-S130G-G131H-S132H、Y217L-P129Z-S130H、Y217L-S130V-G131D-S132I、G97A-G128A-Y217Q-A134T-K213L、G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P129V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P239R和G97A-G128A-Y217Q-S24R-S87T-A88L-S89G，其中该变体序列的位置通过与SEQIDNO:2的位置的对应关系进行编号。
在另一个方面，本发明提供合适的冷水蛋白酶，包括枯草杆菌蛋白酶变体在内，尤其是相对于SEQIDNO:2具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或更多个如下突变组的成熟BPN’(SEQIDNO:2)的变体：S87T-A88L-S89G-G97A-G128A-Y217Q、N61P-S63H-G97A-G128A-Y217Q、S87G-A88V-S89A-G97A-G128A-Y217Q、P86S-S87G-A88V-G97A-G128A-Y217Q、Q59S-N61P-G97A-G128A-Y217Q、S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q、N61P-N62S-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-P129Q-S130G-G131S-Y217Q、L75S-N76Y-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-V203Y-Y217Q、T55P-G97A-G128A-Y217Q、A88V-L90I-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-G211R-N212S-K213V-Y217Q、G23A-S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q、T22N-S24A-G97A-G128A-Y217Q、S24R-G97A-G128A-Y217Q、G97A-A98S-G128A-Y217Q、G97A-G128A-T158G-S159G-Y217Q、Q59E-N61P-G97A-G128A-Y217Q、G97A-A98E-G128A-Y217Q、G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-S63T-P86S-S87G-A88V、G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-P239R、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61P-N62S-P194L-A232T、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-A133V-L267V、G97A-G128A-Y217Q-A134T-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-P129E-S159K-K265R、G97A-G128A-Y217Q-A134T-G211T、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129E、G97A-G128A-Y217Q-I111V-S161P、G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q、G97A-G128A-Y217Q-I115V-L267V、G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116S-N117G-N118R、G97A-G128A-Y217Q-V203Y-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-P52S-T55P-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A116S-N117G-N118R、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-T242R、G97A-G128A-Y217Q-P40E-T55P-N269K、G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-V8L-N25Y-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-G211T-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-S24R-A128S-P129G、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-N240K、G97A-G128A-Y217Q-N25Y-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A134T、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-N61P-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129V-P194S、G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129V、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N-S101N、G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-I115V、G97A-G128A-Y217Q-N25Y-S87G-A88V-S89A、G97A-G128A-Y217Q-A134T-N240K、G97A-G128A-Y217Q-S24R-Q59S-N61P、G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P239R、G97A-G128A-Y217Q-T55P-A116S-N117G-N118R、G97A-G128A-Y217Q-A134T-S161P、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-N61P-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-N25Y-Q59S-N61P、G97A-G128A-Y217Q-N25Y-P129Q-S130G-G131S-A137T、G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-N61P-S63H、G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S78N-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-N240K、G97A-G128A-Y217Q-T55P-A134T、G97A-G128A-Y217Q-N25Y-N61P-S63H、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-P129S、G97A-G128A-Y217Q-T55P-L75H-N76G、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-T55P-I115V、G97A-G128A-Y217Q-T55P-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-G211R-N212S-K213V、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-N61P-S78N-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-I115V-A273S、G97A-G128A-Y217Q-N25Y-T55P、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-N240K、G97A-G128A-Y217Q-S161P-L267V、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61P-S101N、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-N240K、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S101N、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-A128S-P129Q、G97A-G128A-Y217Q-S89Y-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-I115V-N240K、G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61P-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S161P-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-N240K、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-P239R、G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-I115V-A134T、G97A-G128A-Y217Q-Y6Q-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S89Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N-A88V-S101N、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-S78N-I111V-A134T、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S78N-S101N、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61P-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-S78N-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-N240K-A273S、G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-S87T-A88L-S89G、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-S78N-S161P、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-S78N-I111V、G97A-G128A-Y217Q-T55P-A128S-P129Q、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S78N-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-N61E-A144K、G97A-G128A-Y217Q-A134T-P239R、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-T55P-N240K、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-P239R、G97A-G128S-Y217Q、G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61P-S101N、G97A-G128A-Y217Q-I111V-P129Q-G211T、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-S87G-A88V-S89A、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-S162K、G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-T55P-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G、G97A-G128A-Y217Q-I111V-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-I111V-A273S、G97A-G128A-Y217Q-N61P-S87T-A88L-S89G、G97A-G128A-Y217Q-T22N-S24A-N61P-S63H、G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-P129S-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S159K-L267V、G97A-G128A-Y217Q-P40E-S53Y-S78Y-P86S-S87G-A88V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-S145D、G97A-G128A-Y217Q-I111V-S159K、G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129L、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S101N、G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S89Y、G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129V、G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G-P172H、G97A-G128A-Y217Q-I111V-A134T、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-P5S-S87G-A88V-S89A-A116G-N117R、Y217Q-N61P-A97G-G102A-A128G-P129S、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-N61P-S78N、G97A-G128A-Y217Q-S145D-S159K-N240K-Q275E、G97A-G128A-Y217Q-T55P-A128S-P129D、G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-A128S-P129D、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-I111V-P239R、G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-S162K、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I115V、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N、G97A-G128A-Y217Q-T55P-A92G、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S87T-A88L-S89G-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-T22N-S24A-T55P、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-S159K、G97A-Y217Q-N61P-N62Q-G100N-A128G、G97A-G128A-Y217Q-S24R-S78N-S182P-L267V、G97A-G128A-Y217Q-P239R-A273S、G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-T242R、G97A-G128A-Y217Q-S3F-S87T-A88L-S89G-G211T、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-L75H-N76G、G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A144K、G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A116N-N117S-N118G、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I111V、G97A-G128A-Y217Q-S24R-S145D-P239R-Q275E、G97A-G128A-Y217Q-S145D-A273S、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-K141E-T242R、G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-A116N-N117S-N118G-P129Q-S130G-G131S、G97A-G128A-Y217Q-S89Y-G211T、G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G-A144T、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y、G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129V、G97A-Y217Q-N61P-A128G-P129S-S130P、G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S87T-A88L-S89G-G110C-S130P、G97A-Y217Q-N123G-A128G、G97A-G128A-Y217Q-N61P-N62Q-G100N-G102A-M124I、S78N-G97A-G128A-Y217Q、G97A-S101N-G128A-Y217Q、G97A-G128A-A137V-Y217Q、N61P-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-S130P-Y217Q、G97A-Q103N-G128A-Y217Q、S63T-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G102A-G128A-Y217Q、G97A-N109D-G128A-Y217Q-S248R、S87R-G97A-G128A-Y217Q、G97A-G128A-S188D-Y217Q、S87D-G97A-G128A-Y217Q-S248R、G97A-G128A-S188D-S248R-Y217Q、G97A-G128A-S248D-Y217Q、S78N-G97A-G128A-Y217Q-L267V、S78N-G97A-G128A-Y217Q-S161P、S78N-G97A-G128A-Y217Q-I115V、S78N-G97A-G128A-Y217Q-A273S、S78N-G97A-G128A-Y217Q-G211T、S78N-G97A-G128A-Y217Q、S78N-G97A-G128A-Y217Q-I111V、S78N-G97A-G128A-Y217Q-V147L、S78N-G97A-G128A-Y217Q-I108V、S78N-G97A-G128A-Y217Q-S89Y和S78N-G97A-G128A-Y217Q-A138T，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的位置的对应关系进行编号。
在另一个方面，该冷水蛋白酶是具有SEQIDNO:2的枯草杆菌蛋白酶BPN’的变体，其中该变体包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个选自氨基酸位置24、25、40、52、53、55、58、59、61、62、63、68、78、86、87、88、89、92、96、97、100、101、103、104、106、111、114、115、116、117、118、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、144、145、159、161、162、167、194、203、206、213、217、227、232、239、240、242、265、267和275的突变，其中该变体序列的位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置的对应关系进行编号。
在另一个方面，该冷水蛋白酶是包含SEQIDNO:2的枯草杆菌蛋白酶BPN’的变体(即BPN’枯草杆菌蛋白酶变体)，其中该变体总共包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个选自群组(a)和群组(b)的突变：(a)选自N61E、A144K、P129E、P239R、P40E、Q103E、Q206E、Q7275E、S145D、S159K、S162K、S24R、S63H、S87D和T242R的带电突变；和(b)选自A114G、A116N、A133V、A134T、A232T、A88V、A92G、F58G、G100T、G128A、G131S、G97A、I111V、I115V、K213L、K265N、L126A、L267V、L96T、M124V、N117S、N118G、N123G、N240K、N25G、N61P、N62Q、N62R、N62S、P129Q、P129V、P194L、P239V、P52L、P86S、Q59S、S101N、S125A、S130G、S132N、S161P、S24G、S53G、S78N、S87G、S89Y、T55P、V203Y、V227T、V68A、W106F、Y104N、Y167A和Y217Q的中性突变，其中该变体序列的位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置的对应关系进行编号。
本发明的核酸
本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸(在本文中也称为“多核苷酸”)，其可统称为“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”，其编码本发明的多肽(如蛋白酶变体)。本发明的核酸(包括下文描述的全部核酸在内)可用于本发明多肽的重组生产(如表达)，通常是通过表达包含编码所关注的多肽或其片段的序列的质粒表达载体来进行。如上面所论述的，多肽包括蛋白酶变体多肽，包括具有酶活性(如蛋白水解活性)的枯草杆菌蛋白酶变体多肽在内，其可用于清洁应用和清洁组合物，以供清洁需要进行清洁的物品或表面(如物品的表面)。
本发明包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的核酸，其包含编码上文在标题为“本发明的多肽”的小节中以及本文其他地方(包括但不限于实施例，包括第I部分实施例和第II部分实施例在内)描述的任何本发明的蛋白质、多肽或蛋白酶变体(包括任何融合蛋白等在内)的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。本发明还提供分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的核酸，其包含编码上文中以及本文其他地方(包括但不限于实施例，包括第I部分实施例和第II部分实施例在内)描述的任何本发明的多肽、蛋白质或蛋白酶变体(包括任何融合蛋白在内)中的两者或更多者的组合的多核苷酸序列。
在第十个方面，本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸，其包含编码本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九个方面的变体(或如在第三个方面中的多肽)的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。
在第十一个方面，本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸，其包含与SEQIDNO:3或SEQIDNO:5中示出的多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。
本发明还提供编码蛋白酶变体的核酸，该蛋白酶变体包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且其中该蛋白酶变体的总净电荷相对于解淀粉芽孢杆菌BPN’枯草杆菌蛋白酶的总净电荷为+1、+2、+3、+4、+5、0、-1、-2、-3、-4或-5，并且其中蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQIDNO:2中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过该蛋白酶变体氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对确定的。
本发明提供编码解淀粉芽孢杆菌BPN’枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中BPN’枯草杆菌蛋白酶包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列，并且其中该蛋白酶变体包含这样的氨基酸序列，其与SEQIDNO:2的氨基酸序列差异在于在选自氨基酸位置1-275的氨基酸位置处有不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个突变，其中枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置通过与如SEQIDNO:2所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的对应关系进行编号，其中该蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQIDNO:2中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过与该蛋白酶变体的比对确定的。
本发明提供编码枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，该枯草杆菌蛋白酶变体包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且其中该蛋白酶变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白酶的总净电荷为+1、+2、+3、+4、+5、0、-1、-2、-3、-4或-5，并且其中该蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQIDNO:2中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过该蛋白酶变体氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对确定的。
上面的低离子强度蛋白酶变体可形成洗涤剂组合物的一部分，将该洗涤剂组合物稀释于水中，通常是洗衣机内的水中，以形成衣物洗涤剂洗液，其电导率为约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm。该蛋白酶变体可以是高离子强度蛋白酶变体。这种高离子强度蛋白酶变体包含两个或更多个突变，并且相对于SEQIDNO:2中所示的野生型BPN’枯草杆菌蛋白酶野生型具有+5、+4、+3、+2、+1或0的总净电荷。
上面的高离子强度蛋白酶变体可形成洗涤剂组合物的一部分，将该洗涤剂组合物稀释于水中，通常是洗衣机内的水中，以形成衣物洗涤剂洗液，其电导率为约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。
蛋白酶变体的电荷是相对于具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的BPN’来表示。赋予单个负电荷的氨基酸是D和E，赋予单个正电荷的氨基酸是R、H和K。将可改变电荷的任何相对于SEQIDNO:2的氨基酸变化用于计算蛋白酶变体的电荷。例如，从野生型中性位置引入负电荷突变将给蛋白酶变体添加净电荷-1，而从野生型正电荷氨基酸残基(R、H或K)引入负电荷突变(D或E)将添加净电荷-2。将蛋白酶变体的相对于具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的BPN’而言不同的所有氨基酸残基的电荷变化进行加和，可得到该蛋白酶变体的电荷变化。不希望受理论束缚，但认为：对于待用于低电导率衣物洗涤剂溶液中的冷水蛋白酶，优选的电荷范围为-5、-4、-3、-2、-1、0，尤其是-2、-1；对于待用于高电导率衣物洗涤剂溶液中的冷水蛋白酶，优选的电荷范围为+5、+4、+3、+2、+1、0，尤其是+2、+1。通过正确选择电荷，可获得水平得到出乎意料的改善的冷水清洁性能。“低电导率衣物洗涤剂溶液”定义为具有约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm的电导率。“高电导率衣物洗涤剂溶液”定义为具有约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm或甚至约4mS/cm至约10mS/cm的电导率。意图到，上述例子是非限制性的。一旦将各突变进行组合以优化冷水性能时，还可以通过在另外的位置的突变来平衡酶电荷。
本发明包括冷水蛋白酶和包含至少一种冷水蛋白酶的产品。在一个方面，冷水蛋白酶是具有SEQIDNO:2的枯草杆菌蛋白酶BPN’的变体，所述变体包含具有一个或多个突变的氨基酸序列，并且相对于野生型BPN’(SEQIDNO:2)具有总净电荷-1、0或+1。赋予负电荷的氨基酸通常是D和E，赋予正电荷的氨基酸通常是R、H和K。不希望受理论束缚，但认为该电荷范围(-1、0、+1)是赋予冷水性能的最佳电荷。然而，这些例子应该被视为非限制性的。在一个方面，一旦将各突变进行组合以优化冷水性能，则通过在另外的位置中的突变来平衡酶电荷。
本发明提供分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的蛋白酶变体(如枯草杆菌蛋白酶变体)，所述蛋白酶变体包含与SEQIDNO:2所示氨基酸序列相差50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸位置是根据SEQIDNO:2中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编码方式进行编码，如通过蛋白酶变体氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对确定的，其中该枯草杆菌蛋白酶变体包括BPN’-v3的氨基酸序列(SEQIDNO:4)或BPN’-v36的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。
在一个方面，本发明提供分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的蛋白酶变体(如枯草杆菌蛋白酶变体)，所述蛋白酶变体包含与SEQIDNO:2所示氨基酸序列相差50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、6、5、4、3、2个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸位置是根据SEQIDNO:2中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编码方式进行编码，如通过蛋白酶变体氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列(如本文所示)的比对确定的。
本发明包括分离的、重组的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码以下物质的多核苷酸序列或任何其互补多核苷酸序列：(a)至少一种本发明的蛋白酶变体，包括本文所述的任何蛋白酶变体在内，包括但不限于第I部分实施例中示出的那些蛋白酶变体在内，(b)至少一种本发明的冷水蛋白酶，或(c)至少一种本发明的蛋白酶变体，包括本文所述的任何蛋白酶变体在内，包括但不限于第II部分实施例中示出的系列IGG36变体在内。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的核酸的表达载体。表达载体可与启动子有效连接。
在另一个方面，本发明提供包含与SEQIDNO:3或SEQIDNO:5中所示多核苷酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列的核酸。
本发明的核酸可通过使用任何合适的合成、操纵和/或分离技术或这些技术的组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可用标准的核酸合成技术，如本领域技术人员所熟知的固相合成技术来制备。在这类技术中，通常合成多达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(如通过酶连接方法或化学连接方法，或者聚合酶介导的重组方法连接)以形成基本上任何所需的连续核酸序列。还可通过本领域已知的任何合适的方法，包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法(例如参见Beaucage等人，TetrahedronLetters(《四面体通讯》)，22:1859-69(1981))；或Matthes等人，EMBOJ.(《欧洲分子生物学组织杂志》)，3:801-805(1984)描述的方法(其为自动合成方法中通常采用的)进行化学合成，来促进(或者完成)本发明核酸的合成。本发明的核酸也可以通过使用自动DNA合成仪来制备。定制的核酸可从多个商业来源订购(如MidlandCertifiedReagentCompany、GreatAmericanGeneCompany、OperonTechnologiesInc.和DNA2.0)。合成核酸的其他技术和相关原理是本领域已知的(例如参见Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.(《生物化学年评》)，53:323(1984)；和Itakura等人，Science(《科学》)198:1056(1984))。
如上文所指出的，可用于修饰核酸的重组DNA技术是本领域所熟知的。例如，诸如限制性内切酶消化、连接、逆转录和cDNA产生以及聚合酶链反应(如PCR)的技术是已知的并容易地由本领域技术人员采用。本发明的核苷酸还可以通过使用一种或多种可与编码本发明蛋白酶变体多肽的多核苷酸杂交或使之PCR扩增的寡核苷酸探针来筛选cDNA文库(如用本领域一般使用的诱变技术(包括本文所述的那些)产生的cDNA文库)而获得。筛选和分离cDNA克隆的程序和PCR扩增程序是本领域技术人员所熟知的，并在本领域技术人员已知的标准参考文献中描述。本发明的一些核酸可通过利用例如已知的诱变程序(如定点诱变、点饱和诱变以及体外重组)来改变天然存在的多核苷酸骨架(如编码酶或亲本蛋白酶的多核苷酸骨架)来获得。
本发明包括与本发明的目标核酸(如SEQIDNO:3或5)或其互补多核苷酸序列杂交的核酸，其中杂交是在目标核酸的基本上整个长度上。杂交核酸可在至少严格条件下或在至少高严格条件下与本发明的核苷酸序列杂交。核酸杂交实验的中等严格杂交条件、严格杂交条件和高严格杂交条件是已知的。可进行组合来实现这种严格性水平的各因素的例子在本文中进行了简略的论述。
核酸由于多种得到很好表征的物理化学力(如氢键键合、溶剂排斥、碱基堆积等等)而可杂交。核酸杂交的详尽指导可见于P.Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology–HybridizationwithNucleicAcidProbes(生物化学和分子生物学中的实验技术–使用核酸探针的杂交)，第24卷，第I部分，第2章，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays(杂交原理及核酸探针测定法策略的综述)”，(纽约爱思唯尔出版社(Elsevier,N.Y.))(下文称为“Tijssen”)。还可参见：Hames和Higgins(1995)GeneProbes1and2(基因探针1和2)。两条核酸序列实质上相同的指示是这两个分子在至少严格条件下彼此杂交。在核酸杂交实验(如DNA杂交法和RNA杂交法)的背景中，严格杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境参数下不同。通常选择高严格条件使得杂交在比确定的离子强度和pH下特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃下发生。Tm是50％的测试序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。Tm指在给定条件下核酸双链体有50％变性的温度，并且其代表核酸杂交体稳定性的直接量度。因而，Tm对应于与螺旋向无规卷曲转变的中间点相对应的温度。其取决于长核苷酸链段的长度、核苷酸组成以及离子强度。在严格条件下，探针将通常与其靶子序列杂交，而不与其他序列杂交。“十分严格条件”被选择成等于特定探针的Tm。
DNA-DNA双链体的Tm可用公式(1)估计：Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.72(％f)-500/n，其中M为单价阳离子(通常是Na+)的摩尔浓度，(％G+C)是鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核苷酸的百分数，(％f)是甲酰胺(formalize)的百分数，n是杂交体的核苷酸碱基的数目(即长度)。RNA-DNA双链体可用公式(2)估计：Tm(℃)＝79.8℃+18.5(log10M)+0.58(％G+C)-11.8(％G+C)2-0.56(％f)-820/n，其中M为单价阳离子(通常是Na+)的摩尔浓度，(％G+C)是鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核苷酸的百分数，(％f)是甲酰胺的百分数，n是杂交体的核苷酸碱基的数目(即长度)。上面的公式1和2通常仅对于长于约100-200个核苷酸的杂交双链体是精确的。短于50个核苷酸的核酸序列的Tm可计算如下：Tm(℃)＝4G+C)+2(A+T)，其中A(腺嘌呤)、C、T(胸腺嘧啶)和G是相应核苷酸的数目。
在进行杂交分析时，非杂交核酸物质通常通过一系列洗涤来除去，可根据所需的结果调节洗涤的严格性。低严格性洗涤条件(如使用较高盐和较低的温度)可增加灵敏性，但可产生非特异性杂交信号和高的背景信号。较高的严格性条件(如使用较低的盐和更接近于杂交温度的较高温度)可降低背景信号，通常仅保留特异性信号。有关另外的指导，可参见Hames和Higgins(出处同上)。
用于分析至少两条包含至少100个核苷酸的核酸的示例性严格条件包括在42℃下在溶液中进行温育或在DNA印迹或RNA印迹情况中在过滤器上进行温育，该溶液或过滤器包含具有1毫克(mg)肝素的50％福尔马林(或甲酰胺)，其中杂交过夜进行。惯常的严格洗涤可用包含0.2xSSC缓冲液的溶液，在约65℃下洗涤约15分钟来进行(关于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验手册)，ColdSpringHarborPress(冷泉港出版社)以及该手册的第三版(2001))。惯常的严格性洗涤之前可进行低严格性洗涤以除去背景探针信号。低严格性洗涤可例如在约40℃下在包含2xSSC缓冲液的溶液中进行约15分钟。高严格洗涤可用包含0.15MNaCl的溶液在约72℃下进行约15分钟。示例性的中等严格性条件包括在包含20％福尔马林(或甲酰胺)、0.5xSSC、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x登哈特溶液(Denhardt'ssolution)、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切鲑鱼精DNA的溶液中于37℃温育过夜，然后在约37-50℃下在1xSSC中洗涤过滤器。高严格性条件是这样的条件：(a)使用低离子强度和高温度来洗涤，如50℃的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，(b)在杂交期间采用变性剂，如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺，其具有0.1％牛血清白蛋白(BSA)/0.1％菲科尔(Ficoll)/0.1％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)/50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)，该缓冲液具有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，在42℃下进行，或者(c)在42℃下采用50％甲酰胺、5xSSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x登哈特溶液、超声处理过的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，且在(1)42℃下0.2xSSC中，(2)55℃下50％甲酰胺中，以及(3)55℃下0.1xSSC(优选具有EDTA)下洗涤。在特定杂交测定中信噪比为针对不相关的探针所观察到的信噪比的2倍或2.5倍-5倍则指示检测到特异性杂交。在本发明的情形中检测到两条序列之间的至少严格杂交则指示与本发明核酸具有相对强的结构相似性或同源性。
用于制备本发明的蛋白酶变体多肽的载体、细胞和方法
多种适于产生编码本发明蛋白酶变体(如本发明的冷水蛋白酶)的本发明经修饰的多核苷酸的方法是本领域已知的，包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及各种其他重组方法。用于制备经修饰的多核苷酸和蛋白质(如蛋白酶变体)的方法包括DNA改组方法(例如参见StemmerWP,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)91(22):10747-51(1994))；基于基因的非同源重组的方法，例如ITCHY(Ostermeier等人，Bioorg.Med.Chem.(《生物有机化学和医药化学》)7:2139-44[1999])；SCRATCHY(Lutz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，98:11248-53[2001])；SHIPREC(Sieber等人，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)，19:456-60[2001])；NRR(Bittker等人，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)，20:1024-9[2001]；Bittker等人，ProcNatl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，101:7011-6[2004])；依赖于使用寡核苷酸来插入随机和定标性突变、缺失和/或插入的方法(Ness等人，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)，20:1251-5[2002]；Coco等人，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)，20:1246-50[2002]；Zha等人，Chembiochem.(《化学生化》)，4:34-9[2003]；Glaser等人，J.Immunol.(《免疫学杂志》)，149:3903-13[1992])；还可参见Arkin和Youvan，Biotechnology(《生物技术》)，10:297-300(1992)；Reidhaar-Olson等人，MethodsEnzymol.(《酶学方法》)，208:564-86(1991)。
在一个方面，将全长亲本多核苷酸连接进适当的表达质粒中，并将以下诱变方法用于促进本发明的经修饰的蛋白酶的构建，但也可使用其他方法。该方法是基于Pisarchik等人(Pisarchik等人，Prot.Eng.Des.Select.(《蛋白质工程设计和选择》)，20:257-265[2007])所述的方法。在一个方面，在如下方面提供了额外的优点：限制酶外切其识别序列，这使得能消化实际上任何核苷酸序列以及排除形成限制位点疤痕(restrictionsitescar)。
在一个方法中，获得天然存在的编码全长蛋白酶的基因并测序并且扫描一个或多个期望在一个或多个氨基酸处进行突变(如缺失、插入、置换)的点。对基因进行突变以改变其序列从而与所需的序列相符，这根据公知的方法通过引物延伸来完成。在所需的突变点左边和右边的片段通过PCR来扩增并扩增成包括Eam1104I限制位点。将左边和右边的片段用Eam1104I消化以产生多个具有互补的三碱基突出端的片段，然后收集并连接以产生含有一个或多个突变的经修饰的序列的文库。该方法可避免出现移码突变。该方法还可简化诱变程序，因为可以将所有的寡核苷酸合成为具有相同的限制位点，且不需要合成的接头来产生限制位点，而某些其他方法需要。
在一个方面，本发明包括制备冷水蛋白酶的方法，该方法包括：(a)提供编码亲本蛋白酶的DNA底物分子的核酸变体的文库；(b)将该核酸变体的文库转化进宿主细胞中；(c)表达该文库以提供多肽表达产物；(d)筛选该多肽表达产物以鉴别具有至少一种选自如下的特性的突变型蛋白酶：(i)与Prime(具有氨基酸置换Y217L的SEQIDNO:2)相比，在pH8和16℃下对血/奶/墨(BMI)污渍的性能指数为1.1至10，如第I部分实施例1中示出的“测试方法”中所定义的。(ii)与BPN’(SEQIDNO:2)相比，在pH8和16℃下对BMI污渍的性能指数为1.3至10，如第I部分实施例1中示出的“测试方法”中所定义的；(iii)与BPN’-v3(SEQIDNO:4)相比，在pH8和16℃下对BMI污渍的性能指数为0.9至约10，如第I部分实施例1中示出的“测试方法”中所定义的；以及(d)与BPN’-v36(SEQIDNO:6)相比，在pH8和16℃下对BMI的性能指数为1.0至约10，如第I部分实施例1中示出的“测试方法”中所定义的，其中冷水蛋白酶得以鉴定。
在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的核酸的表达载体。这种核酸可包含编码如下物质的多核苷酸序列或任何其互补多核苷酸序列：(a)至少一种本发明的蛋白酶变体，包括本文所述的任何蛋白酶变体在内，包括但不限于第I部分实施例中示出的那些蛋白酶变体，(b)至少一种本发明的冷水蛋白酶，或(c)至少一种本发明的蛋白酶变体，包括本文所述的任何蛋白酶变体在内，包括但不限于第II部分实施例中示出的系列IGG36变体。这种表达载体可与启动子有效连接。
在另一个方面，本发明提供重组宿主细胞，其包含：(a)本发明的核酸，(b)包含本发明的核酸的表达载体，(c)本发明的蛋白酶变体，包括但不限于例如本发明的冷水蛋白酶。重组宿主细胞可以是细菌细胞，例如但不限于例如芽孢杆菌细胞。示例性的芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
在另一个方面，本发明提供包含如下物质的细胞培养物：(a)本发明的核酸，(b)包含本发明的核酸的表达载体，(c)本发明的蛋白酶变体，包括但不限于例如本发明变体的冷水蛋白酶。
在另一个方面，本发明提供分离的或重组的包含至少一种本文所述的本发明多核苷酸(如编码本文所述的本发明蛋白酶变体的多核苷酸)的载体；分离的或重组的包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的表达载体或表达盒；分离的、实质上纯的或重组的包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的DNA构建体；分离的或重组的包含至少一种本发明的多核苷酸的细胞；包含细胞的细胞培养物，该细胞包含至少一种本发明的多核苷酸；包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的细胞培养物；和包含一种或多种这类载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或它们的任何组合或混合物的组合物。
在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的载体(如表达载体或DNA构建体)的重组细胞，所述载体包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸。一些这类重组细胞转化有或转染有所述至少一种载体。这类细胞通常称为宿主细胞。一些这类细胞包括细菌细胞，包括但不限于例如芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体的重组细胞(如重组宿主细胞)。
在另一个方面，本发明提供包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。载体可以是表达载体或表达盒，其中编码本发明蛋白酶变体的本发明多核苷酸序列有效连接至有效基因表达所需的一个或额外的核酸区段(例如与编码本发明蛋白酶变体的本发明多核苷酸有效连接的启动子)。载体可包含转录终止子和/或选择基因，如抗生素抗性基因，该抗性基因使得能通过在含有抗微生物剂的培养基中生长而对质粒感染的宿主细胞进行连续的培养维持。
表达载体可衍自质粒或病毒DNA，或在另选的方面，含有这二者的元件。示例性的载体包括但不限于pXX、pC194、pJH101、pE194、pHP13(Harwood和Cutting(编辑))，MolecularBiologicalMethodsforBacillus(《芽孢杆菌的分子生物学方法》),JohnWiley&Sons(约翰威立出版社)(1990)，例如参见第3章；适于枯草芽孢杆菌的复制型质粒包括第92页列出的那些；Perego,M.(1993)IntegrationalVectorsforGeneticManipulationsinBacillussubtilis(枯草芽孢杆菌中遗传操纵的整合载体)，第615-624页；A.L.Sonenshein,J.A.Hoch和R.Losick(编辑)，BacillussubtilisandotherGram-positivebacteria:biochemistry,physiologyandmoleculargenetics(《枯草芽孢杆菌及其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学》)，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.(美国微生物学会，华盛顿特区)。
为了在细胞中表达和生产所关注的蛋白质(如蛋白酶变体)，将至少一个包含至少一个拷贝(优选包含多个拷贝)的编码所述经修饰的蛋白酶的多核苷酸的表达载体在适于表达该蛋白酶的条件下转化进细胞中。在一个方面，将编码蛋白酶变体的多核苷酸序列(以及载体中包含的其他序列)整合进宿主细胞的基因组中，而在另一个方面，将包含编码蛋白酶变体的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合进宿主细胞基因组中的输入核苷酸序列二者。本文所述的载体可用于产生本发明的蛋白酶变体。在一个方面，编码蛋白酶变体的多核苷酸构建体存在于整合型载体上，该整合型载体使得编码蛋白酶变体的多核苷酸能整合以及任选扩增进细菌染色体中。整合位点的例子是本领域技术人员已知的。在一个方面，编码本发明蛋白酶变体的多核苷酸的转录通过启动子来实现，该启动子对所选择的前体蛋白酶而言是野生型启动子。在一些其他的方面，启动子对于前体蛋白酶而言是异源的，但在宿主细胞中有功能。具体而言，适用于细菌宿主细胞中的启动子的例子包括但不限于例如amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子以及噬菌体λPR或PL启动子，和大肠杆菌lac、trp或tac启动子。
本发明的蛋白酶变体可在任何合适的革兰氏阳性微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中生产。例如，在一个方面，蛋白酶变体在真菌和/或细菌来源的宿主细胞中产生。在一个方面，宿主细胞是芽孢杆菌、链霉菌(Streptomycessp.)、埃希杆菌(Escherichiasp.)或曲霉菌(Aspergillussp.)。在一个方面，蛋白酶变体由芽孢杆菌宿主细胞产生。可用于生产本发明蛋白酶变体的芽孢杆菌宿主细胞的例子包括但不限于地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一个方面，枯草芽孢杆菌宿主细胞用于生产蛋白酶变体。美国专利5,264,366和4,760,025(RE34,606)描述了多种可用于生产本发明蛋白酶变体的芽孢杆菌属宿主菌株，但可以使用其他合适的菌株。
可用于生产本发明蛋白酶变体的数种工业细菌菌株包括非重组(即野生型)的芽孢杆菌菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一个方面，宿主菌株是重组菌株，其中编码所关注的多肽的多核苷酸已引入该宿主中。在一个方面，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，尤其是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC39,087)、ATCC21332、ATCC6051、MI113、DE100(ATCC39,094)、GX4931、PBT110和PEP211菌株(例如参见Hoch等人，Genetics(《遗传》)，73:215–228(1973))(还可参见美国专利No.4,450,235和No.4,302,544以及EP0134048，将这些专利每一者以引用的方式全文并入本文)。枯草芽孢杆菌用作表达宿主细胞是本领域众所周知的(例如参见Palva等人，Gene(《基因》)，19:81-87(1982)；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，165:796–804(1986)；以及Wang等人，Gene(《基因》)，69:39–47(1988))。
在一个方面，芽孢杆菌宿主细胞是在如下基因中的至少一者中包括突变或缺失的芽孢杆菌：degU、degS、degR和degQ。突变可以在degU基因中，在某些情况下突变可以是degU(Hy)32。例如参见Msadek等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，172:824-834(1990)和Olmos等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)，253:562–567(1997))。典型的宿主菌株是携带degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌。芽孢杆菌宿主可在如下基因中包含氨基酸突变(如置换)或缺失：scoC4(例如参见Caldwell等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，183:7329-7340(2001))；spoIIE(例如参见Arigoni等人，Mol.Microbiol.(《分子微生物学》)，31:1407-1415(1999))；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(例如参见Perego等人，Mol.Microbiol.(《分子微生物学》)，5:173-185(1991))。实际上，设想到opp操纵子中的导致与oppA基因中的突变相同的表型的任何突变将可用于本发明的改变的芽孢杆菌菌株的一个方面。这种突变可单独出现或者可存在突变的组合。在一个方面，可用于生产本发明的蛋白酶变体的改变的芽孢杆菌宿主细胞菌株是已在上述基因中的一者或多者中包含突变的芽孢杆菌宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌宿主细胞。芽孢杆菌宿主细胞可包含aprE和nprE基因的缺失。芽孢杆菌宿主细胞可包含5个蛋白酶基因的缺失，或者芽孢杆菌宿主细胞可包含9个蛋白酶基因的缺失(例如参见美国专利申请公布No.2005/0202535)。
使用任何合适的本领域已知的方法用至少一条编码至少一种本发明蛋白酶变体的核酸转化宿主细胞。无论是将核酸整合进载体中还是在不存在质粒DNA的情况下使用核酸，通常将其引入微生物中，在一个方面，优选引入大肠杆菌细胞或感受态芽孢杆菌细胞中。利用质粒DNA构建体或载体并将这类质粒DNA构建体或载体转化进芽孢杆菌细胞或大肠杆菌细胞中来将核酸(如DNA)引入这类细胞中的方法是众所周知的。在一个方面，随后从大肠杆菌细胞分离该质粒并转化进芽孢杆菌细胞中。然而，使用诸如大肠杆菌之类的中间微生物不是必需的，在一个方面，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌宿主中。
本领域的技术人员十分知道适于将本发明的核酸或多核苷酸引入芽孢杆菌细胞中的方法(例如参见Ferrari等人，“Genetics(遗传学)”，载于Harwood等人(编辑)，Bacillus(《芽孢杆菌》)，PlenumPublishingCorp.(普莱南出版公司)，(1989)，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，157:718-726(1984)；Hoch等人，(《细菌学杂志》)，93:1925-1937(1967)；Mann等人，CurrentMicrobiol.(《当代微生物学》)13:131-135(1986)；以及Holubova,FoliaMicrobiol.(《微生物学报》)30:97(1985)；Chang等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学及普通遗传学》)，168:11-115(1979)；Vorobjeva等人，FEMSMicrobiol.Lett.(《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》)，7:261-263(1980)；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.(《应用与环境微生物学》)，51:634(1986)；Fisher等人，Arch.Microbiol.(《微生物学档案》)，139:213-217(1981)；和McDonald,J.Gen.Microbiol.(《普通微生物学杂志》)，130:203(1984))。实际上，诸如转化(包括原生质体转化和中板集合(congression)、转导和原生质体融合)之类的方法是众所周知的并且适用于本发明。使用转化方法将包含编码本发明蛋白酶变体的核酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞中。本领域已知的转化芽孢杆菌细胞的方法包括诸如质粒标志补救(markerrescue)转化之类的方法，质粒标志补救转化涉及携带部分同源的内生质粒(residentplasmid)的感受态细胞摄入供体质粒(Contente等人，Plasmid(质粒)，2:555-571(1979)；Haima等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学及普通遗传学》)，223:185-191(1990)；Weinrauch等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，154:1077-1087(1983)；和Weinrauch等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，169:1205-1211(1987))。在这个方法中，输入的供体质粒与内生的“辅助”质粒的同源区在模拟染色体转化的过程中发生重组。
除了通常使用的方法，在一个方面，将宿主细胞直接用包含编码本发明蛋白酶变体的核酸的DNA构建体或载体转化(即在引入宿主细胞之前，未使用中间细胞来扩增该DNA构建体或载体，或未对该DNA构建体或载体以别的方式处理)。将本发明的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的那些在不插入质粒或载体的情况下将核酸序列(如DNA序列)引入宿主细胞中的物理和化学方法。这类方法包括但不限于氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法、脂质体法等等。在另外的方面，将DNA构建体或载体与质粒共同转化，而不插入质粒中。在进一步的方面，通过本领域已知的方法从已改变的芽孢杆菌菌株缺失掉选择标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，158:411-418(1984)；和Palmeros等人，Gene(《基因》)，247:255-264(2000))。
在一个方面，将本发明的转化的细胞在常规营养培养基中培养。合适的具体培养条件(如温度、pH等)是本领域技术人员已知的。此外，某些培养条件可在科学文献中例如如下文献中以及从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)找到：Hopwood(2000)Practical StreptomycesGenetics(《实用链霉菌遗传学》),JohnInnesFoundation(约翰英纳斯基金),NorwichUK(英国诺里奇)；Hardwood等人，(1990)MolecularBiologicalMethodsforBacillus(《芽孢杆菌的分子生物学方法》)，JohnWiley(约翰威立)。在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体或至少一种本发明的核酸的培养物(如细胞培养物)。还提供的是包含至少一种本发明的核酸、载体或DNA构建体的组合物。
可将用至少一条编码至少一种本发明蛋白酶变体的多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本蛋白酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，此后从该培养物回收所得的蛋白酶。用于培养细胞的培养基包含任何适于生长宿主细胞的常规培养基，如含有适当的补充成分的基本培养基和复合培养基。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公布的配方(如美国典型培养物保藏中心的目录中公布的配方)制备。可通过常规的程序从培养基回收由细胞产生的蛋白酶，包括但不限于例如，通过离心或过滤从培养基分离出宿主细胞，借助于盐(硫酸铵)沉淀出上清液或滤液的蛋白质组分，进行色谱纯化(如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等)。可使用任何适于回收或纯化本发明的蛋白酶变体的方法。
在一个方面，由重组宿主细胞产生的蛋白酶变体分泌进培养基中。编码利于纯化的结构域的核酸序列可用来利于可溶性蛋白质的纯化。包含编码蛋白酶变体的多核苷酸序列的载体或DNA构建体，可还包含编码利于纯化的结构域的核酸序列以利于纯化蛋白酶变体(例如参见Kroll,D.J.等人，DNACellBiol.(《DNA和细胞生物学》)，12:441-53(1993))。这种利于纯化的结构域包括但不限于例如：金属螯合肽如组氨酸-色氨酸模组(histidine-tryptophanmodule)，其使得能在固定化金属上纯化(PorathJ.，ProteinExpr.Purif.(《蛋白质表达和纯化》)，3:263-281(1992))；A蛋白结构域，其使得能在固定化免疫球蛋白上纯化；以及FLAGS延伸/亲和纯化系统(华盛顿州西雅图(Seattle,WA)的英姆纳克斯公司(ImmunexCorp.))中使用的结构域。在纯化结构域和异源蛋白质之间包括可裂解的连接序列如XA因子或肠激酶(加利福尼亚州圣地牙哥(SanDiego,CA)的英杰公司(Invitrogen))也可用于利于纯化。
用于检测和测量酶(如本发明的蛋白酶变体)的酶活性的测定法是众所周知的。各种用于检测和测量蛋白酶(例如本发明的蛋白酶变体)的测定法也是本领域一般技术人员已知的。具体地讲，有基于酸可溶性肽从酪蛋白或血红蛋白的释放的测定法可供测量蛋白酶活性，其作为280nm处的吸光度测量或利用福林(Folin)法进行比色测量(例如参见Bergmeyer等人，“MethodsofEnzymaticAnalysis(酶分析方法)”，第5卷，Peptidases,Proteinasesand theirInhibitors(《肽酶、蛋白酶及它们的抑制剂》)，VerlagChemie(德国化学出版社)，Weinheim(魏恩海姆)(1984))。其他示例性的测定法涉及显色底物的增溶作用(例如参见Ward,“Proteinases(蛋白酶)”，载于Fogarty(编辑)，MicrobialEnzymesandBiotechnology(《微生物酶和生物技术》)，AppliedScience(应用科学出版社)，London(伦敦)，(1983)，第251-317页)。其他示例性的测定法包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定法(SAAPFpNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定法(TNBS测定法)。本领域人员已知的许多另外的参考文献提供合适的方法(例如参见Wells等人，NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)，11:7911-7925(1983)；Christianson等人，Anal.Biochem.(《分析生物化学》)，223:119-129(1994)；以及Hsia等人，AnalBiochem.(《分析生物化学》)，242:221-227(1999))。
有多种方法可用于测定成熟蛋白酶(本发明的成熟蛋白酶变体)在宿主细胞中的产生水平。这类方法包括但不限于例如利用蛋白酶特异性的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性的方法包括但不限于例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)和荧光激活细胞分选法(FACS)。这些及其他测定法是本领域所熟知的(例如参见Maddox等人，J.Exp.Med.(《实验医学杂志》)，158:1211(1983))。
在另一个方面，本发明提供用于制备或生产本发明的成熟蛋白酶变体的方法。成熟蛋白酶变体不包含信号肽或前肽序列。一些这类方法包括在重组细菌宿主细胞(例如芽孢杆菌细胞，包括例如枯草芽孢杆菌细胞)中制备或生产本发明的蛋白酶变体。在一个方面，本发明提供生产本发明的蛋白酶变体的方法，该方法包括在有利于生产蛋白酶变体的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本发明的蛋白酶变体的核酸。一些这类方法还包括从培养物回收蛋白酶变体。
在一个方面，本发明提供生产本发明的蛋白酶变体的方法，该方法包括：(a)将包含编码本发明蛋白酶变体的核酸的重组表达载体引入一群细胞(例如细菌细胞，如枯草芽孢杆菌细胞)中；以及(b)在有利于生产由该表达载体编码的蛋白酶变体的条件下在培养基中培养该细胞。一些这类方法还包括：(c)从细胞或从培养基分离蛋白酶变体。
除了重组生产外，本发明的蛋白酶变体多肽可用固相技术通过直接的肽合成来生产(例如参见Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis(固相肽合成)，W.H.弗里曼公司(W.H.FreemanCo)，SanFrancisco(圣弗朗西斯科)；Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc(《美国化学学会杂志》)，85:2149-2154)。肽合成可用手动技术或自动化技术来进行。自动化合成可例如用应用生物系统公司431A肽合成仪(AppliedBiosystems431APeptideSynthesizer)(加利福尼亚州福斯特城(FosterCity,Calif.)的珀金埃尔默公司(PerkinElmer))根据生产商提供的说明书来完成。例如，可分别化学合成出子序列并用化学方法组合以提供蛋白酶变体或其功能片段。作为另一种选择，这种变体多肽序列从多个专业生产多肽的公司订购。最常见的是，本发明的多肽通过表达编码核酸并回收多肽来生产，例如，如上面及实施例中所述的。
在另一个方面，本发明提供生产蛋白酶变体的方法，该方法包括在有利于生产该变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞，所述宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含至少一条本发明的核酸。该方法可还包括从培养物回收变体。
在另一个方面，本发明包括生产蛋白酶变体的方法，该方法包括：(a)将本发明的重组表达载体引入一群细胞中；以及(b)在有利于生产由该表达载体编码的枯草杆菌蛋白酶变体的条件下在培养基中培养该细胞。该方法可还包括(c)从细胞或从培养基分离该变体。
在另一个方面，本发明提供生产芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶变体的方法，该方法包括：用包含编码丝氨酸蛋白酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；以及在适于生产该丝氨酸蛋白酶变体的条件下培养该转化的宿主细胞。在一个方面，该方法还包括收获所生产的丝氨酸蛋白酶变体的步骤。在一个方面，宿主细胞是芽孢杆菌细胞，在这些方面的子集中，芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。此外，本发明提供清洁方法，该方法包括使构成织物的表面和/或制品与包含丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物接触的步骤。在一些另选的方法中，本发明提供清洁方法，该方法包括使构成盛具的表面和/或制品与包含丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物接触的步骤。
在另一个方面，本发明提供鉴别野生型枯草杆菌蛋白酶的方法，所述枯草杆菌蛋白酶包含具有如下氨基酸的氨基酸序列：氨基酸位置24处的甘氨酸或精氨酸，氨基酸位置53处的甘氨酸，氨基酸位置78处的天冬酰胺，氨基酸位置97处的丙氨酸，氨基酸位置101处的天冬酰胺，氨基酸位置128处的丙氨酸或丝氨酸，和/或氨基酸位置217处的亮氨酸或谷氨酰胺，其中所述氨基酸位置通过与SEQIDNO:2中所示的BPN’的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系编号，所述方法包括：a)提供包含至少一种野生型枯草杆菌蛋白酶或野生型枯草杆菌蛋白酶的文库的样品，或提供包含一种或多种编码野生型枯草杆菌蛋白酶的DNA序列的DNA样品；以及b)鉴别野生型枯草杆菌蛋白酶或编码野生型蛋白酶的DNA序列。
在第十二个方面，本发明提供表达载体，该表达载体包含至少一条本发明的第十个方面或第十一个方面的核酸。根据本发明的第十二个方面的表达载体可与启动子有效连接。这种表达载体可以是分离的或纯化的形式。
在第十三个方面，本发明提供重组宿主细胞，其包含：(a)本发明的第十个或第十一个方面的核酸或(b)本发明的第十二个方面的表达载体。本发明的第十三个方面的重组宿主细胞可以是细菌细胞，其可任选是芽孢杆菌细胞。本发明的第十三个方面的重组宿主细胞可以是枯草芽孢杆菌细胞。
在第十四个方面，本发明提供细胞培养物，其包含：(a)本发明的第十个或第十一个方面的核酸或(b)本发明的第十二个方面的表达载体。
在第十五个方面，本发明提供生产蛋白酶变体的方法，该方法包括在有利于生产该变体的条件下培养本发明的第十三个方面的重组宿主细胞。根据本发明的第十五个方面的方法可还包括从培养物分离或回收变体。
在第十六个方面，本发明提供生产蛋白酶变体的方法，该方法包括：(a)将本发明的第十二个方面的重组表达载体引入一群细胞中；以及(b)在有利于生产由该表达载体编码的蛋白酶变体的条件下在培养基中培养该细胞。根据本发明的第十六个方面的方法可还包括(c)从细胞或从培养基分离或回收变体。
本发明的组合物
本发明包括组合物，该组合物包含至少一种本发明的多肽(如至少一种蛋白酶变体)。本发明的多肽在下文和上文中(包括第I部分实施例和第II部分实施例中)进行了描述。这类组合物可包含至少一种赋形剂、载体、辅助成分或其他取代物(substituent)、组分或材料。
例如，在一个方面，本发明包括包含至少一种蛋白酶变体和至少一种赋形剂、载体、辅助成分或其他取代物、组分或材料的组合物。所述至少一种蛋白酶变体可以是本文中(包括但不限于第I部分实施例中)列出的那些蛋白酶变体中的任一者。所述至少一种蛋白酶变体可以是BPN’蛋白酶变体。例如，本发明的组合物可以是BPN’蛋白酶变体，如BPN’-v36(SEQIDNO:6)或BPN’-v3(SEQIDNO:4)或本文中或第I部分实施例2-23中示出的任何蛋白酶变体。这种组合物可以是织物和家居护理产品或者织物和家居护理组合物。作为另一种选择，这种组合物可以是织物和家居护理产品或者织物和家居护理组合物。
这种组合物可(除了BPN’蛋白酶变体之外)还包含至少一种GG36蛋白酶变体，如至少一种第II部分实施例中描述的系列IGG36蛋白酶变体。这种组合物可用于多种如本文其他地方描述的应用中。
在第十七个方面，本发明提供组合物，该组合物包含本发明的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个或第九个方面的变体(或如第三个方面中的多肽)。根据本发明的第十七个方面的组合物可包含辅助成分或载体，如本文其他地方更详细描述的。根据本发明的第十七个方面的组合物可包含至少一种助洗剂和/或至少一种表面活性剂。根据本发明的第十七个方面的组合物可包含磷酸盐或者可不包含磷酸盐。
根据本发明的第十七个方面的组合物可以是清洁组合物或洗涤剂组合物。根据本发明的第十七个方面的组合物可以是织物或家居护理产品。根据本发明的第十七个方面的组合物可以不是织物或家居护理产品。根据本发明的第十七个方面的组合物可以是为织物或家居护理产品的清洁组合物或洗涤剂组合物。根据本发明的第十七个方面的组合物可以是不为织物或家居护理产品的清洁组合物或洗涤剂组合物。
根据本发明的第十七个方面的组合物可包含可还包含一种、两种、三种、四种、五种或更多种另外的酶。这类另外的酶可选自半纤维素酶、纤维素酶、淀粉酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶和漆酶。
根据本发明的第十七个方面的另外的酶可以是具有蛋白水解活性的GG36蛋白酶变体，例如系列IGG36蛋白酶变体，该系列IGG36蛋白酶变体可包含与SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性的氨基酸序列以及至少一个选自如下的氨基酸置换：A1R、Q2S、V4R、V4S、S9A、R10S、P14K、A16S、H17R、N18R、G20R、T22A、T22R、S24R、S24W、G25R、G25V、V26F、L42I、N43R、N43A、G46R、P52F、P52E、P52N、T57R、Q59A、N62E、N62Q、V68A、V68C、T71G、I72C、A74C、L75A、L75F、L75R、N76D、S78R、L82R、P86W、E89P、E89T、E89G、E89H、E89I、E89V、E89W、Y91N、K94N、G100S、S101A、S101N、S101G、S101D、S103G、S103N、V104L、V104I、S106V、S106G、A108I、L111V、E112V、G115K、G115R、N117F、G118I、V121F、S128D、S128F、S128L、S128N、P129E、S144R、L148I、A158E、G159E、S160D、S166D、N185E、N185I、R186H、S188E、S188D、D197F、V203E、Y209S、Y209N、Y209F、Y209T、Y209E、Y209H、Y209G、P210R、S212I、S212F、Y214F、A215N、A215D、A215E、L217E、L217N、T224A、A230E、A231I、Q236F、N238R、N238K、P239K、P239G、P239R、P239S、W241R、S242R、S242L、N243R、V244R、N248I、N248V、H249R、L250I、N252R、T253R、L262D、Y263F、S265F、L267V、L267N、N269I、N269R、E271F、E271I、E271H、E271P、E271T、E271V、E271L和A272F，其中该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白酶的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号。包含另外的酶(如蛋白酶，例如，如本文所述的系列IG36蛋白酶变体)的根据本发明的第十七个方面的组合物可以是织物和家居护理产品。作为另一种选择，这种组合物可以不是织物和家居护理产品。
根据本发明的第十七个方面的组合物可包含系列IGG36蛋白酶变体，该蛋白酶变体包含与SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列以及至少一个选自如下的氨基酸置换：T022R-S024R、S009A-E271L、N018R-W241R、N018R-G115R、N043R-H249R、G020R-H249R、V004R-H249R、G020R-S024R、N018R-H249R、S009A-G020R、G020R-W241R、S009A-S078R、G020R-G115R、N018R-S024R、S024R-S242R、T022R-G115R、N018R-N043R、G020R-N043R、N018R-S242R、S242R-N269R、N018R-V244R、S024R-N269R、G020R-E271L、S024R-E271L、V004R-S009A、G020R-N269R、A001R-S024R、V244R-E271L、S009A-N018R、W241R-E271L、V004R-S024R、S009A-H249R、S009A-T022R、N062E-P129E、N062E-G159E、A016S-L148I、A158E-H249R、A016S-N062E、L111V-S188D、T022A-N062E、N062E-L148I、T022A-P129E、N062E-E271F、N062E-A158E、A016S-G159E、N062E-R186H、S128N-G159E、N062E-S188D、N062E-S128N、L148I-G159E、S103G-A158E、L111V-G159E、A158E-E271F、A016S-S188D、T022A-L111V、S128N-A158E、A016S-A158E、V104L-A158E、S128N-R186H、G159E-Y209E、N062E-S101A、L111V-Y209E、L148I-S188D、S101A-Y209E、T022A-S188D、A016S-T022A、S128N-P129E、A016S-Y209E、A016S-S128N、T022A-E089P、S128N-Y209E、E089P-A158E、N062E-S103G、R186H-E271F、A016S-P129E、E089P-G159E、L111V-H249R、S101A-P129E、L148I-Y209E、T022A-G159E、P129E-H249R、P129E-Y209E、V104L-P129E、S128N-S188D、L111V-A158E、T022A-A158E、N062E-Y209E、N062E-H249R、S101A-R186H、E089P-P129E、P129E-E271、T22A-L111V-G159E、S101A-S103G-V104L-Y209E、S101A-S103G-V104L-G159E、S101A-S103G-V104L-S188D、S101G-S103A-V104I-G159D、T22A-S103G-G159E、T22A-S128N-E271F-Y209E、T22A-Y209E-E271F、T22A-S101A-Y209E、S101A-Y209E-E271F、T22A-L111V-S128N、T22A-S101A-G159E、S101A-S103G-V104L、T22A-S101A-S103G-V104L、S101A-S103G-V104L、S101G-S103A-V104I、S101A-S103G-V104L-S128N、S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D、N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R、T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R、T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D和S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F，其中该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白酶的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号。这种组合物可以是织物和家居护理产品或者织物和家居护理组合物。在另一个方面，这种组合物可以不是织物和家居护理产品或织物和家居护理组合物。
根据本发明的第十七个方面的组合物可包含系列IGG36蛋白酶变体，该蛋白酶变体包含与SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性的氨基酸序列并且包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或甚至25个选自如下的氨基酸置换：A1R、Q2S、V4R、V4S、S9A、R10S、P14K、A16S、H17R、N18R、G20R、T22A、T22R、S24R、S24W、G25R、G25V、V26F、L42I、N43R、N43A、G46R、P52F、P52E、P52N、T57R、Q59A、N62E、N62Q、V68A、V68C、T71G、I72C、A74C、L75A、L75F、L75R、N76D、S78R、L82R、P86W、E89P、E89T、E89G、E89H、E89I、E89V、E89W、Y91N、K94N、G100S、S101A、S101N、S101G、S101D、S103G、S103N、V104L、V104I、S106V、S106G、A108I、L111V、E112V、G115K、G115R、N117F、G118I、V121F、S128D、S128F、S128L、S128N、P129E、S144R、L148I、A158E、G159E、S160D、S166D、N185E、N185I、R186H、S188E、S188D、D197F、V203E、Y209S、Y209N、Y209F、Y209T、Y209E、Y209H、Y209G、P210R、S212I、S212F、Y214F、A215N、A215D、A215E、L217E、L217N、T224A、A230E、A231I、Q236F、N238R、N238K、P239K、P239G、P239R、P239S、W241R、S242R、S242L、N243R、V244R、N248I、N248V、H249R、L250I、N252R、T253R、L262D、Y263F、S265F、L267V、L267N、N269I、N269R、E271F、E271I、E271H、E271P、E271T、E271V、E271L和A272F；并且任选至少一个氨基酸置换选自：S103A、G159D、Q236H、Q245R、N248D和N252K，其中该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白酶的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号。这种组合物可以是织物和家居护理产品或者织物和家居护理组合物。在另一个方面，这种组合物可以不是织物和家居护理产品或织物和家居护理组合物。
根据本发明的第十七个方面的组合物可包含系列IGG36蛋白酶变体，该蛋白酶变体包含与SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性的氨基酸序列以及(a)两个或更多个选自如下的置换：A1R、Q2S、V4R、V4S、S9A、R10S、P14K、A16S、T22A、T22R、S24R、G25V、V26F、L42I、P52F、P52E、P52N、N62E、N62Q、V68A、V68C、T71G、I72C、A74C、L75A、L75F、S78R、E89P、E89T、E89G、E89H、E89W、Y91N、K94N、G100S、S101A、S101N、S101G、S101D、S103G、S103N、V104L、V104I、A108I、L111V、E112V、G115K、N117F、V121F、S128D、S128F、S128L、S128N、P129E、L148I、A158E、G159E、S160D、S166D、N185E、R186H、S188E、S188D、V203E、Y209S、Y209N、Y209F、Y209T、Y209E、Y209H、Y209G、P210R、S212I、S212F、Y214F、A215N、A215D、A215E、L217E、L217N、T224A、A230E、A231I、Q236F、N238R、N238K、P239K、P239G、P239R、N248V、H249R、L250I、L262D、Y263F、S265F、L267V、L267N、N269I、N269R、E271F、E271I、E271H和A272F和/或(b)一组或多组选自如下的置换：N062E-P129E、N062E-G159E、A016S-L148I、A158E-H249R、A016S-N062E、L111V-S188D、T022A-N062E、N062E-L148I、T022A-P129E、N062E-E271F、N062E-A158E、A016S-G159E、N062E-R186H、S128N-G159E、N062E-S188D、N062E-S128N、L148I-G159E、S103G-A158E、L111V-G159E、A158E-E271F、A016S-S188D、T022A-L111V、S128N-A158E、A016S-A158E、V104L-A158E、S128N-R186H、G159E-Y209E、N062E-S101A、L111V-Y209E、L148I-S188D、S101A-Y209E、T022A-S188D、A016S-T022A、S128N-P129E、A016S-Y209E、A016S-S128N、T022A-E089P、S128N-Y209E、E089P-A158E、N062E-S103G、R186H-E271F、A016S-P129E、E089P-G159E、L111V-H249R、S101A-P129E、L148I-Y209E、T022A-G159E、P129E-H249R、P129E-Y209E、V104L-P129E、S128N-S188D、L111V-A158E、T022A-A158E、N062E-Y209E、N062E-H249R、S101A-R186H、E089P-P129E、P129E-E271F、T22A-L111V-G159E、S101A-S103G-V104L-Y209E、S101A-S103G-V104L-G159E、S101A-S103G-V104L-S188D、S101G-S103A-V104I-G159D、T22A-S103G-G159E、T22A-S128N-E271F-Y209E、T22A-Y209E-E271F、T22A-S101A-Y209E、S101A-Y209E-E271F、T22A-L111V-S128N、T22A-S101A-G159E、S101A-S103G-V104L、T22A-S101A-S103G-V104L、S101A-S103G-V104L、S101G-S103A-V104I、S101A-S103G-V104L-S128N、S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D、N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R、T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R、T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D和S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F，其中该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白酶的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号。这种组合物可以是织物和家居护理产品或者织物和家居护理组合物。在另一个方面，这种组合物可以不是织物和家居护理产品或织物和家居护理组合物。
根据本发明的第十七个方面的组合物可包含系列IGG36蛋白酶变体，该蛋白酶变体包含与SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性的氨基酸序列以及(a)两个或更多个选自如下的置换：V4R、H17R、N18R、G20R、T22R、S24R、S24W、G25R、N43R、N43A、G46R、P52F、P52N、T57R、Q59A、N62Q、T71G、L75R、N76D、S78R、L82R、P86W、E89P、E89W、E89T、E89I、E89H、E89V、V104L、S106V、S106G、G115R、G118I、V121F、S144R、N185I、D197F、Y209N、Y209S、L217E、A231I、P239R、P239S、W241R、S242R、S242L、N243R、V244R、N248I、H249R、N252R、T253R、E271T、E271V、E271L、E271H、E271F、E271P、A1R、S9A、S212F和N269R；和/或(b)一组或多组选自如下的置换：T022R-S024R、S009A-E271L、N018R-W241R、N018R-G115R、N043R-H249R、G020R-H249R、V004R-H249R、G020R-S024R、N018R-H249R、S009A-G020R、G020R-W241R、S009A-S078R、G020R-G115R、N018R-S024R、S024R-S242R、T022R-G115R、N018R-N043R、G020R-N043R、N018R-S242R、S242R-N269R、N018R-V244R、S024R-N269R、G020R-E271L、S024R-E271L、V004R-S009A、G020R-N269R、A001R-S024R、V244R-E271L、S009A-N018R、W241R-E271L、V004R-S024R、S009A-H249R、S009A-T022R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K和S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，其中该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白酶的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号。这种组合物可以是织物和家居护理产品或者织物和家居护理组合物。在另一个方面，这种组合物可以不是织物和家居护理产品或织物和家居护理组合物。
根据本发明的第十七个方面的组合物可包含至少一种另外的选自如下的酶：半纤维素酶、纤维素酶、淀粉酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶和漆酶。根据本发明的第十七个方面的组合物可包含两种或更多种另外的选自如下的酶：半纤维素酶、纤维素酶、淀粉酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶和漆酶。
根据本发明的第十七个方面的组合物可包含磷酸盐或者可不含磷酸盐。根据本发明的第十七个方面的组合物可包含至少一种助洗剂和/或至少一种表面活性剂。
如本文其他地方进一步描述的，本发明的多肽(包括本发明的蛋白酶变体)可用于多种清洁应用，包括衣物清洁应用、自动盛具洗涤应用、手动盛具洗涤应用、硬质表面清洁应用、个人护理应用和本文描述的其他应用。因而，例如，在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的多肽(如蛋白酶变体)的清洁组合物。如上所述，这类清洁组合物包括但不限于例如自动和手洗用盛具洗涤剂组合物、衣物洗涤剂组合物(例如包括液体和粉末衣物洗涤剂组合物)、织物清洁组合物、硬质表面清洁组合物(包括但不限于例如非盛具物品、非餐具物品、桌子、桌面、家具物品、壁、地板、天花板等的硬质表面)。可用于清洁需要进行清洁的物品或表面的方法中的这类清洁组合物，可包含例如但不限于至少一种赋形剂、载体和/或其他取代物、组分或材料。
在另一个方面，本发明提供包含任何本文所述的本发明多肽(如任何本发明的蛋白酶变体或枯草杆菌蛋白酶变体)，其中所述组合物是织物和家居护理组合物或织物和家居护理产品。
在另一个方面，本发明提供包含任何本文所述的本发明多肽(如任何本发明的蛋白酶变体或枯草杆菌蛋白酶变体)，其中所述组合物不是织物和家居护理组合物或不是织物和家居护理产品。包含本发明的蛋白酶变体的本发明的组合物可还包含至少一种选自如下的辅助材料：香料囊粒；织物调色剂；冷水溶性增白剂；漂白催化剂，其可包含选自亚胺阳离子、亚胺聚离子、亚胺两性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮；第一洗涤脂肪酶；细菌清洁纤维素酶；Guerbet非离子表面活性剂；以及任何它们的混合物。本发明的组合物可还包含至少一种另外的选自如下的非免疫等价的蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)；胰蛋白酶样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶；金属蛋白酶；以及它们的混合物。
本发明的组合物可还包含至少一种另外的选自如下的非免疫等价的蛋白酶：衍自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(B.pumilus)和吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)的枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)；衍自纤维单胞菌属(Cellulomonas)的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶。衍自解淀粉芽孢杆菌的金属蛋白酶；以及它们的混合物。
本发明的组合物还包含至少一种另外的选自如下的酶：第一洗涤脂肪酶；α-淀粉酶；细菌清洁纤维素酶；以及它们的混合物。
本发明的组合物可还包含如下物质中的至少一者：包含香料的囊粒，其包含香料微胶囊；调色剂，其包含选自具有550nm至650nm的峰值吸收波长的碱性染料、酸性染料、疏水性染料、直接染料和聚合物染料及染料缀合物以及它们的混合物的材料；去污表面活性剂，其包含选自阴离子型去污表面活性剂、非离子型去污表面活性剂、阳离子型去污表面活性剂、两性离子型去污表面活性剂和两性型去污表面活性剂以及它们的混合物的材料；助洗剂，其包含选自沸石、磷酸盐以及它们的混合物的材料；硅酸盐，其包含选自硅酸钠、硅酸钾以及它们的混合物的材料；增白剂，其包含选自冷水溶性增白剂以及它们的混合物的材料；羧酸系聚合物，其包含选自马来酸系/丙烯酸系无规共聚物或聚丙烯酸系均聚物以及它们的混合物的材料；去污聚合物，其包含选自对苯二甲酸酯共聚物以及它们的混合物的材料；纤维素聚合物，其包含选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素以及它们的混合物的材料；漂白催化剂，其包含选自亚胺阳离子；亚胺聚离子；亚胺两性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮以及它们的混合物的材料；漂白活化剂，其包含选自十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)以及它们的混合物的材料；过氧化氢的来源，其包含选自无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸的钠盐(通常为一水合物或四水合物)、过碳酸的钠盐、过磷酸的钠盐、过硅酸的钠盐以及它们的任何混合物的材料；螯合剂，其包含选自DTPA(二亚乙基三胺五醋酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、所述螯合剂的衍生物的材料；以及它们的任何混合物。
本发明的组合物可包含选自如下的织物调色剂：染料；染料-粘土缀合物，其包含至少一种阳离子-碱性染料和绿土；以及它们的任何混合物。
本发明的组合物可包含至少一种选自如下的织物调色剂：小分子染料、高分子染料以及它们的任何混合物；染料-粘土缀合物，其包含至少一种阳离子-碱性染料和绿土；以及它们的任何混合物。
包含本发明的蛋白酶的组合物可以单室或多室单位剂量提供。该组合物可以是多室单位剂量，其中蛋白酶变体处于与任何过氧化氢来源和/或螯合剂和/或另外的酶不同的隔室中。包含至少一种本发明的蛋白酶变体或多肽的组合物可包含洗涤液。
包含至少一种本发明的蛋白酶变体的组合物可包含如下成分(以总组合物重量计)中的一者或多者：约0.0005重量％至约0.1重量％、约0.001重量％至约0.05重量％或甚至约0.002重量至约0.03重量％的所述蛋白酶变体；以及如下物质中的一者或多者：约0.00003重量％至约0.1重量％的织物调色剂；约0.001重量％至约5重量％的香料囊粒；约0.001重量％至约1重量％的冷水溶性增白剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的漂白催化剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的第一洗涤脂肪酶；约0.00003重量％至约0.1重量％的细菌清洁纤维素酶；和/或约0.05重量％至约20重量％的Guerbet非离子型表面活性剂。
组合物可以是包含冷水蛋白酶或包含不是冷水蛋白酶的蛋白酶变体的颗粒或粉末衣物洗涤剂。
本发明的组合物可以任何合适的形式(包括液体或固体)提供。组合物可以是单位剂量小袋的形式，特别是在为液体形式时，并且组合物可至少部分地，或甚至完全地被水溶性小袋封闭。另外，组合物可具有上文详细描述的参数和/或特性的任何组合。
除非另作说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性水平，而且市售来源中可能存在的杂质(例如残余溶剂或副产物)不排除在外。酶组分重量是以总活性蛋白质计。除非另作说明，否则所有百分比和比率都以重量计算。除非另作说明，否则所有百分比和比率都是以总组合物计算。在示例性的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总组合物的重量比表示，并且除非另作规定，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。
如本文所指出样，在一个方面，本发明的清洁组合物可还包含一种或多种辅助材料或成分，包括但不限于，例如一种或多种表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、香料胶囊、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物软化剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒(colorspeckle)、银护理剂(silvercare)、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、赋形剂、加工助剂、颜料、漂洗助剂(如含有至少一种表面活性剂以通过使水以薄膜从被清洁的物品的表面排出而不是形成小滴来防止水滴形成的漂洗助剂)、溶剂和/或pH控制剂(例如参见美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，将所有这些专利以引用的方式并入本文)。具体清洁组合物材料的各方面在下文中详细举例说明。如果在所需的清洁组合物中清洁辅助材料与本发明蛋白酶变体不相容，则使用将清洁辅助材料与蛋白酶变体在适于将这两种组分进行组合之前保持分开(即彼此不接触)的合适方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如明胶胶囊法(gelcap)、包封法、片剂法、物理分离法等)。
有利的是，本发明的清洁组合物用于例如洗衣应用、硬质表面清洁应用、手动或人工盛具洗涤应用、自动盛具洗涤应用、镜片清洁应用以及美容应用，例如用于清洁假牙、牙齿、毛发和皮肤。由于在较低温溶液中效力增加的独特优势，本发明的蛋白酶变体酶适于洗衣应用和盛具洗涤应用，包括手动和自动盛具洗涤应用。此外，本发明的蛋白酶变体酶可用于固体、凝胶、颗粒和/或液体组合物，包括固体、凝胶、颗粒和/或液体洗涤剂组合物和/或制剂。
本发明的蛋白酶变体还可用于清洁添加剂产品组合物。在一个方面，本发明的蛋白酶变体可用于低温溶液清洁应用和方法。在一个方面，本发明提供清洁添加剂产品组合物，其包括至少一种本发明的蛋白酶变体酶并且在需要额外的漂白效力时其可理想地适于包括在洗涤过程中。这种情况包括但不限于例如低温溶液清洁应用。在一个方面，添加剂产品组合物为其最简单的形式–即一种或多种本发明的蛋白酶变体。在一个方面，添加剂产品组合物以用于添加至清洁过程的剂型进行包装。在一个方面，添加剂产品组合物以用于添加到采用过氧源并且需要增加的漂白效力的清洁过程的剂型进行包装。可使用任何合适的单一剂量单位形式，包括(但不限于)：丸剂、片剂、软明胶胶囊剂，或其它单一剂量单位如预先测量的粉末或液体。因而，在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明蛋白酶变体的清洁产品组合物，其中该产品以合适的形式(例如，作为液体、粉末、固体、丸粒、片、软明胶胶囊或其他合适的形式)配制成合适的单一剂量单位，使得可提供单一剂量的蛋白酶变体。这种清洁产品可用于多种清洁方法和应用，包括但不限于例如机械或手动洗衣方法和应用、自动盛具洗涤或手动盛具洗涤方法和应用等。这类清洁方法和应用可在低温或低pH条件下进行。在一个方面，包括至少一种填料和/或至少一种载体材料以增加这类组合物的体积。合适的填料或载体材料包括但不限于例如硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐，以及滑石、粘土等。适于液体组合物的填料或载体材料包括但不限于例如水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。这些醇的例子包括但不限于例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一个方面，组合物含有约5％至约90％的这类填料或载体材料。可在这类组合物中包含酸性填料以在清洁方法或应用中降低所得溶液的pH。作为另一种选择，在一个方面，清洁添加剂包括一种或多种辅助成分，如下文更全面描述的。
本清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的单独的或与其它蛋白酶和/或额外的酶进行组合的至少一种本发明蛋白酶变体。所需的酶水平通过添加一种或多种本发明的蛋白酶变体来实现。通常，清洁组合物包含至少约0.0001重量％至约20重量％、约0.0001至约10重量％、约0.0001至约1重量％、约0.001至约1重量％或约0.01至约0.1重量％的至少一种本发明的蛋白酶变体。在一个方面，本发明的组合物(如本发明的清洁组合物)每克组合物包含约0.01毫克(mg)至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01mg至约2mg、约0.01至约1mg、约0.5mg至约10mg、约0.5至约5mg、约0.5至约4mg、约0.5至约4mg、约0.5至约3mg、约0.5至约2mg、约0.5至约1mg、约0.1至约10mg、约0.1至约5mg、约0.1至约4mg、约0.1至约3mg、约0.1至约2mg、约0.1至约2mg、约0.1至约1mg、约0.1至约0.5mg的至少一种本发明的活性蛋白酶变体。
本发明包括清洁组合物，该清洁组合物包含一定量的本发明蛋白酶变体(所述组合物任选包含一种或多种辅助成分)，使得当清洁组合物添加至洗涤水时，所得洗涤液中所得的蛋白酶浓度为0.01ppm至10ppm，包括例如0.1ppm至1ppm、0.1至5ppm、1至5ppm、1ppm至10ppm、5ppm至10ppm、5ppm至7ppm。
通常配制本发明的清洁组合物，使得在含水清洁操作中使用期间，洗涤水的pH将为约5.0至约11.5或甚至约7.5至约10.5。液体产品组合物或制剂通常配制成具有约3.0至约9.0或约3.0至约5.0的净pH。颗粒洗衣用产品组合物通常配制成pH为约9至约11。手工盛具洗涤剂组合物和自动洗涤盛具洗涤剂组合物通常配制成具有约8至约11.5的pH，包括但不限于例如约8至约10、约9至约11.5和约9.5至约11.5的pH范围，这取决于方法和具体的应用。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员众所周知的。
合适的低pH清洁组合物的净pH通常为约3至约5，并且通常不含在此类pH环境中水解的表面活性剂。这类表面活性剂包括包含至少一个环氧乙烷部分或甚至约1至约16摩尔的环氧乙烷的烷基硫酸钠表面活性剂。这类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，用以使此类清洁组合物的净pH为约3至约5。这些组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一个方面，组合物为液体，而在其他方面，它们为固体。这类液体组合物的pH通常是以净pH度量。这类固体组合物的pH是以所述组合物的10％固形物溶液度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些方面，除非另作说明，否则所有pH测量值都是在20℃下取得。
在一个方面，当颗粒组合物或液体中采用本发明的蛋白酶变体时，期望蛋白酶变体为封装颗粒的形式，以在存储过程中保护蛋白酶变体免受该颗粒组合物的其他组分的影响。此外，封装还是控制蛋白酶变体在清洁过程期间的利用度(availability)的手段。在一个方面，封装可增强蛋白酶变体和/或额外的酶的性能。就这点而言，本发明的蛋白酶变体用本领域已知的任何合适的封装材料封装。在一个方面，封装材料通常包封本发明蛋白酶变体的催化剂的至少一部分。通常，封装材料具有水溶性和/或水分散性。在一些方面中，封装材料的玻璃化转变温度(Tg)为0℃或更高。玻璃化转变温度在WO97/11151中进行了更详细的描述。封装材料通常选自如下：碳水化合物、天然的或合成的树胶、甲壳质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡以及它们的组合。当封装材料是碳水化合物时，其通常选自单糖、寡糖、多糖以及它们的组合。在一些典型的方面，封装材料是淀粉(例如参见EP0922499；美国专利No.4,977,252、No.5,354,559和No.5,935,826)。在一个方面，封装材料是由诸如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它们的混合物之类的塑料制成的微球体；可使用的市售微球体包括(但不限于)由(瑞典斯托克韦斯文肯(Stockviksverken,Sweden))以及PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、 和(宾夕法尼亚州翠谷的PQ公司(PQCorp.,ValleyForge,PA))提供的微球体。
如本文所述的，本发明的蛋白酶变体特别可用于清洁方法和应用，包括但不限于例如清洁、洗衣、手工盛具洗涤和自动盛具洗涤剂组合物。这些应用使酶处于各种环境压力下。本发明的蛋白酶变体由于其在各种条件下的蛋白水解活性和稳定性，提供了优于许多目前在这类清洁应用中使用的酶的优势。
参与洗涤过程的蛋白酶暴露于多种洗涤条件，包括变化的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，不同地理区域中使用的洗涤剂制剂在洗涤水中存在不同浓度的其相关组分。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500-5000份每一百万份(ppm)的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。
低洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。日本的洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。
中等洗涤剂浓度包括在洗涤水中存在介于约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂组分的洗涤剂。北美的洗涤剂一般被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约975ppm的洗涤剂组分。巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。
高洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在超过约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲的洗涤剂一般被认为是高洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲的洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，而且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可在中等洗涤剂浓度至高洗涤剂浓度之间，因为其在洗涤水中具有1500ppm至6000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其它高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理区域(不限于其它拉丁美洲国家)也可具有在洗涤水中存在最高达约6000ppm的洗涤剂组分的高洗涤剂浓度系统。
根据前述内容，很明显在全世界范围内，典型洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度在低于约800ppm洗涤剂组合物(“低洗涤剂浓度地理区域”；例如在日本约667ppm)到介于约800ppm至约2000ppm之间(“中等洗涤剂浓度地理区域”；例如在美国约975ppm，在巴西约1500ppm)再到高于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理区域”；例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm，以及在高泡磷酸盐助洗剂地理区域中约6000ppm)间变动。
典型的洗涤溶液的浓度凭经验确定。例如，在美国，典型洗涤机器容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液内获得约975ppm的洗涤剂浓度，须将约62.79g洗涤剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。该量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加入洗涤水中的典型量。
再举个例子，不同地理区域使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水温度通常低于欧洲所用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常介于约10℃至约30℃之间(例如为约20℃)，而欧洲的洗涤水温度通常介于约30℃至约60℃之间(例如为约40℃)。然而，为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用于洗衣以及盛具洗涤应用。在一个方面，本发明的“冷水洗涤”利用在约4℃至约10℃、约10℃至约40℃或约20℃至约30℃、约15℃至约25℃、约10℃至约20℃、约14℃至约18℃以及在约15℃至约35℃范围内的所有其它组合和在10℃至40℃内的所有范围以及约16℃的温度下进行的洗涤。
再举个例子，不同地理区域通常具有不同的水硬度。水硬度经常按每加仑混合的Ca2+/Mg2+的格令数(grain)来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。在美国，大多数水都较硬，但硬度有波动。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(ppm换算成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数)的硬度矿物质。
水 每加仑格令数 份每一百万份
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
极硬 大于10.5 大于180
欧洲的水硬度通常是每加仑混合的Ca2+Mg2+高于约10.5(例如约10.5至约20.0)格令(例如每加仑混合的Ca2+/Mg2+为约15格令)。北美的水硬度通常高于日本的水硬度，但小于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令之间或为约6格令。日本的水硬度通常小于北美的水硬度，通常小于约4，例如每加仑混合的Ca2+/Mg2+为约3格令。
因此，在一个方面，本发明提供蛋白酶变体，其在至少一组洗涤条件(如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)下显示出惊人的洗涤性能。在一个方面，本发明的蛋白酶变体与其他枯草杆菌蛋白酶的洗涤性能相当。在一个方面，与目前市售的枯草杆菌蛋白酶相比本发明的蛋白酶变体显示出增强的洗涤性能。因而，在本发明的一个方面，本文提供的蛋白酶变体显示出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的在各种条件下的清洁能力和/或增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的蛋白酶变体可用于不包含洗涤剂(同样单独或与助洗剂和稳定剂组合)的清洁组合物。
在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明蛋白酶变体的清洁组合物，以该组合物的重量计，该蛋白酶变体以约0.00001％至约10％的水平存在，以组合物的重量计，余量(如约99.999％至约90.0％)包含一种或多种清洁辅助材料。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明蛋白酶变体的清洁组合物，以该组合物的重量计，该蛋白酶变体以约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的水平存在，该清洁组合物的余量(如约99.9999重量％至约90.0重量％、约99.999重量％至约98重量％、约99.995重量％至约99.5重量％)包含一种或多种清洁辅助材料。
在一个方面，除了至少一种本发明的蛋白酶变体外，本发明的清洁组合物还包含一种或多种另外的酶，该另外的酶可提供清洁性能和/或织物护理和/或手动或人工盛具洗涤和/或自动盛具洗涤益处。合适酶的实例包括但不限于例如半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和/或淀粉酶、中性金属蛋白酶(简写为“nprE”)或任何它们的混合物。在一个方面，除了至少一种本发明的蛋白酶变体外，清洁组合物还包含另外的酶的组合(即“混合物(cocktail)”)，所述的另外的酶的组合包含常规的可适用的酶例如至少一种另外的蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素和/或淀粉酶。
除了本文提供的蛋白酶变体，任何其他合适的蛋白酶均可用于本发明的组合物并可包括在本发明的组合物中。在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种另外的蛋白酶的组合物(如清洁组合物)。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的酶。在一个方面，可包括微生物蛋白酶。可包括蛋白酶的经化学或遗传修饰的突变体。在一个方面，所述至少一种另外的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子包括枯草杆菌蛋白酶，特别是衍自芽孢杆菌的那些(如枯草杆菌蛋白酶，迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(即GG36)、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(即BPN’)、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisinCarlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、PB92和枯草杆菌蛋白酶168)。另外的例子包括美国专利No.RE34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628中描述的那些突变型蛋白酶(即蛋白酶变体)，将所有这些专利以引用的方式并入本文。另外的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶(如猪或牛来源的胰蛋白酶)和WO89/06270中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。包含至少一种本发明蛋白酶变体的本发明组合物还可包含至少一种市售的蛋白酶。可用于本发明组合物的市售蛋白酶包括但不限于例如MAXACALTM、MAXAPEMTM、 OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM和PURAFASTTM(杰能科公司(Genencor))； DURAZYMTM、 和(诺维信公司(Novozymes))；具有A230V+S256G+S259N的KAP嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(花王公司(Kao))；以及BLAPTM迟缓芽孢杆菌蛋白酶，BLAPX和BLAPS(德国杜塞尔多夫(Duesseldorf,Germany)的汉高公司(HenkelKommanditgesellschaftaufAktien))。可包括在本发明的组合物中的另外的蛋白酶包括在WO95/23221、WO92/21760、美国专利公布No.2008/0090747和美国专利No.5,801,039、No.5,340,735、No.5,500,364、No.5,855,625、No.RE34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628以及多个其他专利中描述的那些。金属蛋白酶可包括在本发明的组合物中。这类金属蛋白酶包括但不限于例如WO07/044993中描述的中性金属蛋白酶(nprE)。
在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种脂肪酶的组合物(如清洁组合物)。合适的脂肪酶包括但不限于例如细菌或真菌来源的那些脂肪酶。脂肪酶的经化学或遗传修饰的突变体可包括在组合物中。可用的脂肪酶的例子包括绵毛状腐质菌(Humicolalanuginosa)脂肪酶(例如参见EP258068和EP305216)、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶(例如参见EP238023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶，如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极假丝酵母脂肪酶A或B；例如参见EP214761)、假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(例如参见EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(例如参见EP331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(例如参见GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)脂肪酶(Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta(《生物化学与生物物理学报》)，1131:253-260(1993))；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂肪酶(例如参见JP64/744992)；和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶(例如参见WO91/16422))。
此外，许多克隆的脂肪酶可用于本发明的组合物(例如清洁组合物)，包括但不限于例如卡门柏青霉(Penicilliumcamembertii)脂肪酶(Yamaguchi等人，Gene(《基因》)，103:61-67(1991))、白地霉(Geotricumcandidum)脂肪酶(Schimada等人，J.Biochem.(《生物化学杂志》)，106:383-388(1989))和各种根霉(Rhizopus)脂肪酶，如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(Hass等人，Gene(《基因》)，109:117-113(1991))和雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.(《生物科学、生物技术和生物化学》)，56:716-719(1992))和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
其它类型的脂肪分解酶(如角质酶)也可用于本发明的一个方面，包括但不限于例如衍自门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)的角质酶(参见WO88/09367)和衍自豌豆根腐镰孢菌(Fusariumsolanipisi)的角质酶(参见WO90/09446)。
其它合适的脂肪酶包括市售脂肪酶，如M1LIPASETM、LUMAFASTTM和LIPOMAXTM(杰能科公司(Genencor))；和ULTRA(诺维信公司(Novozymes))；和LIPASEPTM“Amano”(日本的天野制药有限公司(AmanoPharmaceuticalCo.Ltd.,Japan))。
在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种脂肪酶的组合物(例如清洁组合物)，以该组合物的重量计脂肪酶以约0.00001％至约10％的另外的脂肪酶的水平存在，且以组合物的重量计余量为一种或多种清洁辅助材料。在一个方面，除了至少一种本发明蛋白酶变体外，本发明的清洁组合物还包含至少一种脂肪酶，以该组合物的重量计，该脂肪酶的水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％。
还包括的是包含至少一种本发明的变体和至少一种淀粉酶的组合物(例如清洁组合物)。任何适用于碱性溶液的淀粉酶(例如α和/或β淀粉酶)可用于包括在这种组合物中。合适的淀粉酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的那些酶。可包括淀粉酶的经化学或遗传修饰的突变体。可用于本发明的组合物中的淀粉酶包括但不限于例如从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶(例如参见GB1,296,839)。可用于本发明组合物中的市售淀粉酶包括但不限于例如STAINZYMESTAINZYME和BANTM(诺维信公司)以及POWERASETM、和P(杰能科公司)。
在一个方面，本发明提供包含至少一种蛋白酶变体或至少一种淀粉酶的清洁组合物，其中以该组合物的重量计淀粉酶以约0.00001％至约10％的水平存在，且以组合物的重量计余量为一种或多种清洁辅助材料。在另一个方面，本发明包括包含至少一种蛋白酶变体和至少一种淀粉酶的清洁组合物，以该组合物的重量计，淀粉酶以约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的水平存在。
任何合适的纤维素酶可用于本发明的清洁组合物。在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和一种或至少一种纤维素酶的清洁组合物。合适的纤维素酶包括但不限于例如细菌或真菌来源的那些。纤维素酶的经化学或遗传修饰的突变体可包括在本发明的组合物中。合适的纤维素酶包括但不限于例如特异腐质霉(Humicolainsolens)纤维素酶(例如参见美国专利No.4,435,307)和具有颜色护理益处的纤维素酶(例如参见EP0495257)。另外的合适的纤维素酶是本领域已知的。可用于并且可包括于本发明组合物中的市售纤维素酶包括但不限于例如 (诺维信公司)和KAC-500(B)TM(花王公司)、Puradax7000L、PuradaxHA4000G(杰能科公司)。在一个方面，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分缺失(例如参见美国专利No.5,874,276)。在一个方面，本发明的清洁组合物包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种纤维素酶，以该组合物的重量计该纤维素酶的水平为约0.00001％至约10％，以组合物的重量计余量为一种或多种清洁辅助材料。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种纤维素酶的清洁组合物，以该组合物的重量计该纤维素酶的水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％。
任何适用于洗涤剂组合物的甘露聚糖酶也可用于本发明的清洁组合物中并因而可包括在本发明的清洁组合物中。在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种甘露聚糖酶的清洁组合物。合适的甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。甘露聚糖酶的经化学或遗传修饰的突变体可包括在本发明的组合物中。多种可用于本发明组合物并且可包括在本发明组合物中的甘露聚糖酶是已知的(例如参见美国专利No.6,566,114、No.6,602,842和No.6,440,991中所述的甘露聚糖酶，所有这些专利均以引用方式并入本文)。在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种甘露聚糖酶的清洁组合物，以该组合物的重量计该甘露聚糖酶的水平为约0.00001％至约10％，且以组合物的重量计余量为一种或多种清洁辅助材料。在一些这类清洁组合物中，以该组合物的重量计，每种甘露聚糖酶以约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的水平存在。
过氧化物酶可与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于本发明的组合物中。氧化酶可与氧组合用于本发明的组合物中。这两种类型的酶都优选连同增强剂一起用于“溶液漂白”(即，当各织物一起在洗涤液中洗涤时防止纺织品染料由染色的织物转移到另一织物)(例如参见WO94/12621和WO95/01426)。可包括在本发明的组合物中的合适过氧化物酶/氧化酶包括但不限于例如植物、细菌或真菌来源的那些。过氧化物酶或氧化酶的经化学或遗传修饰的突变体可包括在本发明的组合物中。在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种过氧化物酶和/或至少一种氧化酶的清洁组合物。以该组合物的重量计，每一所述过氧化物酶或氧化酶可以约0.00001％至约10％过氧化物酶或氧化酶的水平存在于该组合物中，且以组合物重量计余量为一种或多种清洁辅助材料。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和至少一种过氧化物酶和/或至少氧化酶的清洁组合物，其中以该组合物的重量计，每一所述过氧化物酶或氧化酶分别以约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％过氧化物酶或氧化酶的水平存在。
在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体和一种或多种另外的可用的酶的组合物(例如清洁组合物)，所述酶包括但不限于例如一种或多种过水解酶(例如参见WO05/056782)。
在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体并包含上述各种酶的一种或多种混合物的组合物(例如清洁组合物)，所述酶涵括例如一种或多种另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或纤维素酶。实际上，设想到这些酶的各种混合物将可用于本发明的组合物。还设想到，蛋白酶变体与一种或多种另外的酶的不同水平都可独立地在最高达约10％的范围内，该清洁组合物的余量为一种或多种清洁辅助材料。通过考虑待清洁的物品(例如盛具物品、餐具物品或织物物品)的表面或织物，以及在使用过程中对于清洁条件(例如，通过手动或自动盛具洗涤剂用途)所希望的组合物形式，可容易地对清洁辅助材料作出具体选择。
在一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体(以及任选至少一种另外的酶，如果需要的话)和一种或多种清洁辅助材料的组合物(例如清洁组合物)。合适的清洁辅助材料的例子包括但不限于例如：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其它酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构增塑剂、分散剂、抑泡剂、染料、芳香剂、着色剂、填料盐、水溶助长剂、香料、香料囊粒、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(例如参见美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，所有专利都以引用的方式并入本文中)。具体清洁组合物材料的各方面在下文中详细举例说明。如上所述，如果清洁辅助材料与包括在所需的清洁组合物中的本发明蛋白酶变体不相容，则使用将清洁辅助材料与蛋白酶变体这两种组分在适于进行组合之前保持分开(即彼此不接触)的合适方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如明胶胶囊法、包封法、片剂法、物理分离法等)。
在一个方面，本发明的组合物(例如清洁组合物)包含有效量的至少一种本发明的蛋白酶变体，该蛋白酶变体可用于清洁或能有效清洁需要移除蛋白质性质的污渍的表面。这种清洁组合物包括用于诸如清洁硬质表面、衣物、织物、器皿、餐具或盛具(例如通过手动或人工盛具洗涤或自动盛具洗涤来清洁)之类的应用的清洁组合物。实际上，在一个方面，本发明提供织物清洁组合物，而在另一个方面，本发明提供非织物清洁组合物。要注意的是，本发明还提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体的清洁组合物，其中这种清洁组合物适于个人护理，包括口腔护理(包括洁牙剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物)，适于清洁皮肤和毛发，以及适合清洁镜片。意图的是，本发明涵盖任何形式(即，液体、颗粒状、条状、固体、半固体、凝胶、乳液、片状、胶囊等)的洗涤剂组合物。
举例来说，在下文更详细地描述了数种在其中可使用本发明蛋白酶变体的清洁组合物。在其中本发明的清洁组合物配制成适用于洗衣机洗涤方法的组合物的一个方面，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂和至少一种助洗化合物以及一种或多种清洁辅助材料，包括例如一种或多种选自有机高分子化合物、漂白剂、另外的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂的清洁辅助材料。在一个方面，洗衣组合物还含有一种或多种软化剂(即作为另外的清洁辅助材料)。可添加一种或多种本发明蛋白酶变体的另外的示例性衣物或织物清洁组合物和制剂在下面的实施例中给出。
本发明的组合物还可用作固体或液体形式的洗涤剂添加剂产品。所述添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可在洗涤过程的任何阶段添加。在一个方面，在20℃下测量时衣物洗涤剂组合物的密度在约400至约1200g/升组合物的范围内，而在其他方面，其在约500至约950g/升组合物的范围内。
在一个方面，本发明提供清洁组合物，例如美国专利No.6,605,458中描述的那些，其包含至少本发明的蛋白酶变体。在一个方面，包含至少一种本发明的蛋白酶变体的组合物是紧凑型颗粒状织物清洁组合物，而在其他方面，组合物是可用于洗涤有色纤维的颗粒状织物清洁组合物。在另一个方面，组合物是通过洗涤能力提供软化的颗粒状织物清洁组合物。在另一个方面，组合物是重垢液体织物清洁组合物。在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明的蛋白酶变体的组合物，其中该组合物是织物清洁组合物，如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中描述的织物清洁组合物。还提供的是在欧洲或日本洗涤条件下特别实用的颗粒状衣物洗涤剂组合物(例如参见美国专利No.6,610,642)，其包含至少一种本发明的蛋白酶变体。
在一个方面，本发明提供包含至少一种本文提供的蛋白酶变体的硬质表面清洁组合物。一些这类组合物包含硬质表面清洁组合物，如在美国专利No.6,610,642、No.6,376,450和No.6,376,450中描述的那些，其包含至少一种所述蛋白酶变体。
本发明包括包含至少一种本文提供的蛋白酶变体的手动盛具洗涤或自动盛具洗涤剂组合物。一些这类组合物包含硬质表面清洁组合物，如在美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中描述的那些。
在一个方面，本发明提供用于人工或手动盛具洗涤或自动盛具洗涤方法的清洁组合物，其包含至少一种本发明的蛋白酶变体和/或至少一种表面活性剂和/或至少一种另外的清洁辅助材料，所述清洁辅助材料选自有机高分子化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和另外的酶。
在其中本发明的清洁组合物配制成适用于自动盛具洗涤机方法的组合物的一个方面，本发明的组合物通常含有至少一种表面活性剂和/或至少一种助洗化合物并且可含有一种或多种清洁辅助材料，所述清洁辅助材料优选选自有机高分子化合物、漂白剂、另外的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。可添加一种或多种本发明蛋白酶变体的另外的示例性盛具洗涤组合物和制剂在下面的实施例中给出。
在另一个方面，本发明提供包含至少一种本发明蛋白酶变体的口腔护理组合物，其可用于口腔护理(如清洁牙齿和假牙)；口腔护理组合物的可用于并且可包含在其中的组分包括在美国专利No.6,376,450中描述的那些。本发明的组合物可还包含美国专利No.6,376,450、No.6,605,458和No.6,610,642中描述的清洁辅助材料和化合物，将所有这些专利以引用的方式并入本文。
本发明的清洁组合物可配制成任何合适的形式以及通过配制人员选择的任何方法制备，其非限制性例子描述于美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利都以引用的方式并入本文中。当需要低pH清洁组合物时，通过添加诸如单乙醇胺之类的材料或诸如氯化氢(HCl)之类的酸性材料来调整此类组合物的pH。
尽管不是实现本发明目的所必需的，但下文示例的辅助材料的非限制性名单适用于本发明清洁组合物。在一个方面，掺入这些辅助材料，例如以帮助或增强清洁性能以处理待清洁的基材，或改变清洁组合物的美观性，如芳香剂、着色剂、染料等就是这样。应该理解，这些助剂是本发明的蛋白酶变体的补充。这些另外的组分的精确性质以及其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和打算使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括但不限于例如：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、另外的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、芳香剂、结构增塑剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂和/或颜料。除下文的公开内容外，此类其它助剂及使用水平的适合例子见于美国专利No.5,576,282、No.6,306,812和No.6,326,348(以引用的方式并入本文)中。上述辅助成分可构成本发明清洁组合物的余量。
在一个方面，本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂选自：非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子型表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物。在一些低pH清洁组合物方面(例如净pH为约3至约5的组合物)，组合物通常不含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信此类表面活性剂可能会被所述组合物的酸性内容物水解。在一个方面，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以约0.1％至约60％的水平存在，而在另选的方面，所述水平为约1％至约50％，而在更进一步的方面，所述水平为约5％至约40％。
在一个方面，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助剂或助洗剂系统。在一些这类掺入至少一种助洗剂的组合物中，以清洁组合物的重量计清洁组合物包含至少约1％、约3％至约60％或甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于例如：聚磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸系化合物；醚羟基聚羧酸系；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物；1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸；和羧甲基氧基琥珀酸；聚乙酸(如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)的各种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐；以及聚羧酸系，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三甲酸、羧甲基氧基琥珀酸以及它们的可溶性盐。设想到任何合适的助洗剂将可用于本发明的各种组合物。
在一些这类组合物中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，如柠檬酸盐和聚磷酸盐(例如三聚磷酸钠和六水合三聚磷酸钠、三聚磷酸钾以及三聚磷酸钠与三聚磷酸钾的混合物等)。设想到，任何合适的助洗剂都将可用于本发明，包括本领域已知的那些助洗剂(例如参见EP2100949)。
除了至少一种蛋白酶变体，一些本发明的清洁组合物还包含至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于例如：铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。在其中使用至少一种螯合剂的各方面，以本发明清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.1％至约15％或甚至约3％至约10％的螯合剂。
除了至少一种蛋白酶变体，本文提供的一些清洁组合物还包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于例如：聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸系；去污聚合物，如聚对苯二甲酸；粘土，如高岭土、蒙脱石、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土以及它们的混合物。
如本文所指出，在一个方面，抗再沉积剂可用于本发明的一个方面。在一个方面，可使用非离子型表面活性剂。这些非离子型表面活性剂也可用于防止污垢再沉积。在一个方面，抗再沉积剂是本领域已知的非离子型表面活性剂(例如参见EP2100949)。
在一个方面，本发明的清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括(但不限于)：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。在其中使用至少一种染料转移抑制剂的各方面，以本发明的清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或甚至约0.1％至约3％。
在一个方面，硅酸盐包括本发明的组合物中。在一些此类方面，可使用硅酸钠(例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一个方面，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一个方面，以组合物的重量计，硅酸盐以约5％至约15％的水平存在。
在一个方面，本发明的清洁组合物还包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括但不限于例如：均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中多元羧酸包含至少两个彼此相隔不超过两个碳原子的羧基。
在一个方面，通过任何合适的技术使用于清洁组合物中的酶(例如本发明的蛋白酶变体或其他另外的酶)稳定化。在一个方面，本文所用的酶由成品组合物中存在的可给该酶提供钙和/或镁离子的水溶性钙和/或镁离子源来稳定化。在一个方面，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐(包括碱土金属，如钙盐)。设想到，各种酶稳定化技术将可用于本发明。例如，在一个方面，本文所采用的酶由成品组合物中存在的可给该酶提供锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性的这类离子源，以及其它金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))来稳定化。氯化物和硫酸盐也可用于本发明的一个方面。合适的寡糖和多糖(例如糊精)的例子是本领域已知的(例如参见WO07/145964)。在一个方面，还可使用可逆的蛋白酶抑制剂，如含硼的化合物(例如硼酸盐、苯基硼酸、4-甲酰基苯基硼酸、其他苯基硼酸衍生物、肽抑制剂等等)和/或根据需要，三肽醛可用于本发明的组合物中以进一步改善稳定性。
在一个方面，一种或多种漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂包括在本发明的组合物中。在一个方面，本发明的清洁组合物包含无机的和/或有机的漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一个方面，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一个方面，无机过氧化氢合物盐作为结晶固体被包括在内，而不需另外的保护，但在一些其他的方面，所述盐带涂层。本领域已知的任何合适的盐都可用于本发明的组合物(例如参见EP2100949)。
在一个方面，漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，这些有机过酸前体在60℃和低于60℃温度下进行的清洁过程中会增强漂白作用。适用于本文的漂白活化剂包括在过水解(perhydrolysis)条件下提供优选具有约1至约10个碳原子，尤其约2至约4个碳原子的脂族过氧羧酸的化合物，和/或任选取代的过苯甲酸。另外的漂白活化剂是本领域已知的并且可用于本发明的组合物(例如参见EP2100949)。
在一个方面以及如本文进一步描述的，本发明的清洁组合物还包含至少一种漂白催化剂。在一个方面，可使用三氮杂环壬烷锰和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的漂白催化剂可用于本发明(例如参见美国专利No.4,246,612、No.5,227,084和No.4,810410；WO99/06521；和EP2100949)。
在一个方面，本发明的清洁组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一个方面，可使用含金属漂白催化剂。在一些方面，金属漂白催化剂包含催化剂系统，所述催化剂系统包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有极低或无漂白催化活性的辅助性金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，和对催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的金属封锁剂(sequestrate)，尤其可使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐(例如参见美国专利No.4,430,243)。在一个方面，使用锰化合物催化本发明的清洁组合物。这些化合物及使用水平是本领域公知的(例如参见美国专利No.5,576,282)。在另外的方面，钴漂白催化剂可以使用，并且包括在本发明的清洁组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(例如参见美国专利No.5,597,936和No.5,595,967)且易于用已知程序制备。
在一个方面，本发明的清洁组合物包含大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为一种实践(但绝非限制)，在一个方面，对本发明提供的组合物和清洁方法进行调整以在水性洗涤介质中提供大约至少1份每亿份的活性MRL物质，而在一个方面，在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm，约0.05ppm至约10ppm、约0.1ppm至约5ppm的MRL。
在一个方面，本发明过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括但不限于例如锰、铁和铬。优选MRL还包括但不限于例如：交叉桥接的特殊超刚性配体(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环(6.6.2)十六烷)。合适的过渡金属MRL易于通过已知程序制备(例如参见WO2000/32601和美国专利No.6,225,464)。
在一个方面，本发明提供配制为洗涤剂片的自动洗涤盛具洗涤剂组合物。这类洗涤剂片包含至少一种本发明的蛋白酶变体和助洗剂，例如助洗剂盐。一些这类洗涤剂片具有至少等价于3克(g)氢氧化钠/100克片状组合物的碱度和至少1.4克/立方厘米的密度。助洗剂盐可包含硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选硅酸盐(如偏硅酸钠)比磷酸盐(如三聚磷酸钠)多。一些这类洗涤剂片不含表面活性剂材料并且特别适合用于自动盛具洗涤机。
在一个方面，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于防止和/或减少包括铝、不锈钢和非铁金属(例如银和铜)在内的金属的锈污、腐蚀和/或氧化。合适的金属护理剂包括EP2100949、WO9426860和WO94/26859中所述的金属护理剂。在一些这类清洁组合物中，金属护理剂是锌盐。一些这类清洁组合物包含约0.1重量％至约5重量％的一种或多种金属护理剂。
如上文所指出的，本发明清洁组合物配制成任何合适的形式并由配制者选择的任何方法制备，其非限制性例子描述于美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利都以引用的方式并入本文中。在需要低pH清洁组合物的一个方面，通过添加诸如氯化氢(HCl)之类的酸性物质来调整此类组合物的pH。
本文所公开的清洁组合物可用于清洁位置(situs)(例如表面、盛具、餐具或织物)。通常，使所述位置的至少一部分与纯的本发明清洁组合物或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物接触，随后任选洗涤和/或漂洗所述位置。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于例如擦洗和机械搅动。在一个方面，清洁组合物在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述位置包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。
制备和使用组合物的方法
本文通篇所述的本发明组合物(包括例如清洁组合物)可配制成任何合适的形式并可通过配制者所选择的任何合适方法制备(例如参见美国专利No.5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392、5,486,303、4,515,705、4,537,706、4,515,707、4,550,862、4,561,998、4,597,898、4,968,451、5,565,145、5,929,022、6,294,514和6,376,445)。
在一个方面，本发明的清洁组合物以单位剂型提供，包括片剂、胶囊剂、囊剂(sachet)、袋剂(pouch)和多隔室袋剂。在一个方面，对单位剂量形式进行设计以提供多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内的成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(例如参见EP2100949、WO02/102955、美国专利No.4,765,916和No.4,972,017，以及参见WO04/111178关于适用于单位剂量和控制释放形式的材料)。在一个方面，单位剂型由包有水溶性膜或水溶性小袋的片剂提供。各种用于单位剂量的形式在EP2100947中提供，并且是本领域已知的。
涉及制备和使用本发明组合物的本发明的另外的方面在本文其他地方进行了描述。
本发明的方法
本发明提供用于清洁或洗涤需要清洁的物品或表面(如硬质表面)的方法，包括但不限于例如清洁或洗涤盛具物品、餐具物品、织物物品、衣物物品、个人护理物品、镜片等等的方法，以及清洁或洗涤硬质或软质表面(例如物品的硬质表面)的方法。
在一个方面，本发明提供清洁需要清洁的物品、物体或表面的方法，该方法包括使物品或表面(或希望进行清洁的物品或表面的一部分)与任何本发明的蛋白酶变体或本发明的组合物接触足以清洁所述物品、物体或表面至所需程度的时间和/或在适于或有效用于清洁所述物品、物体或表面至所需程度的的条件下进行接触。一些这类方法还包括用水漂洗物品、物体或表面。对于一些这类方法，清洁组合物是盛具洗涤剂组合物，而待清洁的物品或物体是盛具物品或餐具物品。盛具物品是通常用于供给食物或食用食物的器皿物品。盛具物品可以是但不限于例如盘子、碟子、杯子、碗等等。餐具是更广泛的术语，其包括但不限于例如器皿、刀具、餐刀、餐叉、匙、筷子、玻璃器具、罐壶、调味汁碟、饮用容器等等；餐具物品包括这些或相似的用于供应食物或食用食物的物品中的任何一种。对于一些这类方法，清洁组合物是自动盛具洗涤剂组合物或手动盛具洗涤剂组合物，而待清洁的物品或物体是盛具或餐具物品。对于一些这类方法，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物，例如粉末衣物洗涤剂组合物或液体衣物洗涤剂组合物，而待清洁的物品是织物物品。
在一个方面，本发明提供用于清洁或洗涤任选需要分别清洁或洗涤的织物物品的方法。一些这类方法包括提供包含蛋白酶变体的组合物(例如但不限于例如织物或衣物清洁组合物)和需要清洁的织物物品或衣物物品，并使该织物物品或衣物物品(希望进行清洁的物品的一部分)与该组合物在足以或有效清洁或洗涤该织物或衣物物品至所需程度的条件下接触。
在一个方面，本发明提供清洁或洗涤任选需要清洁的物品或表面(例如硬质表面)的方法，该方法包括提供待清洁或洗涤的物品或表面，使物品或表面(希望进行清洁或洗涤的物品或表面的一部分)与至少一种本发明的蛋白酶变体或包含至少一种这类蛋白酶变体的本发明组合物接触足以清洁或洗涤物品或表面至所需程度的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的条件下接触。这类组合物包括但不限于：例如本发明的清洁组合物或洗涤剂组合物(包括但不限于：例如手动盛具洗涤剂组合物、手动盛具洗涤清洁组合物、衣物洗涤剂组合物或织物洗涤剂组合物或者衣物或织物清洁组合物、液体衣物洗涤剂、液体衣物清洁组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、粉末衣物清洁组合物、自动盛具洗涤剂组合物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、衣物清洁添加剂和衣物预洗剂组合物等)。在某些情况下，如果需要，可将该方法重复一次或多次，尤其是如果需要额外的清洁或洗涤的话。例如，在某些情况下，该方法任选还包括让物品或表面与至少一种蛋白酶变体或组合物保持接触足以或有效清洁或洗涤物品或表面至所需程度的一段时间。一些这类方法还包括用水漂洗物品或表面。一些这类方法还包括再次用至少一种本发明的蛋白酶变体或本发明的组合物接触物品或表面，并让该物品或表面与至少一种蛋白酶变体或组合物保持接触足以清洁或洗涤物品或表面至所需程度的一段时间。对于一些这类方法，清洁组合物是盛具洗涤剂组合物，而待清洁的物品是盛具或餐具物品。对于一些这类方法，清洁组合物是自动盛具洗涤剂组合物或手动盛具洗涤剂组合物，而待清洁的物品是盛具或餐具物品。对于一些这类方法，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物，而待清洁的物品是织物物品。
在一个方面，本发明提供在自动盛具洗涤机中清洁餐具或盛具物品的方法，该方法包括提供自动盛具洗涤机，在机器中放入足以清洁餐具或盛具物品的一定量的包含至少一种本发明蛋白酶变体或本发明的组合物的自动盛具洗涤组合物(例如，通过将该组合物置于机器中的合适的或提供的洗涤剂隔室或分配器中)，将盛具或餐具物品放入该机器中，运行该机器以清洁该餐具或盛具物品(例如按照生产商的说明书)。这种方法可包括本文所述的任何自动盛具洗涤组合物，其包含但不限于例如本文描述的任何蛋白酶变体。待使用的自动盛具洗涤组合物的量可根据生产商的说明书或建议容易地确定，可采用任何形式的包含至少一种本发明蛋白酶变体的自动盛具洗涤组合物(例如液体、粉末、固体、片、凝胶等)，包括本文所述的任何组合物在内。
在一个方面，本发明提供清洁任选需要清洁的表面、物品或物体的方法，该方法包括使物品或表面(或希望进行清洁的物品或表面的一部分)与纯的或在洗涤液中稀释的至少一种本发明蛋白酶变体或本发明清洁组合物接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的条件下进行接触。然后如果需要，可对表面、物品或物体(任选)进行洗涤和/或漂洗。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于例如擦洗和机械搅动。在一个方面，清洁组合物在溶液(如水溶液)中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述位置(situs)包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。
在一个方面，本发明提供在洗涤机中清洁衣物或织物物品的方法，该方法包括提供洗涤机，将足以清洁衣物或织物物品的一定量的包含至少一种本发明蛋白酶变体的衣物洗涤剂组合物置于该机器中(例如通过该组合物置于机器中的合适的或提供的洗涤剂隔室中或分配器中)，将衣物或织物物品放入该机器中，运行该机器以清洁餐具或盛具物品(例如，按照生产商的说明书)。这种方法可包括本文所述的任何衣物洗涤剂组合物，其包含但不限于例如本文描述的任何蛋白酶变体。要使用的衣物洗涤剂组合物的量可根据生产商的说明书或建议容易地确定，可采用任何形式的包含至少一种本发明蛋白酶变体的衣物洗涤剂组合物(例如固体、粉末、液体、片、凝胶等)，包括本文所述的任何组合物在内。
在第十八个方面，本发明提供清洁需要清洁的物品、物体或表面的方法，该方法包括使该物品、物体或表面与(i)本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九个方面的变体(或如第三个方面的多肽)或(ii)本发明的第十七个方面的组合物接触。本发明的第十八个方面的方法可还包括用水漂洗物品、物体或表面。
在第十九个方面，本发明提供清洁物品或硬质表面的方法，该方法包括使待清洁的物品或硬质表面的至少一部分与(i)本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九个方面的变体(或如第三个方面的多肽)或(ii)本发明的第十七个方面的组合物接触足以清洁或洗涤该物品或硬质表面至所需程度的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤该物品或硬质表面至所需程度的条件下进行接触，并任选包括用水漂洗该物品或硬质表面。
在第二十个方面，本发明提供处理和/或清洁表面或织物的方法，该方法包括如下步骤：任选洗涤和/或漂洗所述表面或织物，使所述表面或织物与(i)本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九个方面的变体(或如第三个方面的多肽)或(ii)本发明的第十七个方面的组合物接触，然后任选洗涤和/或漂洗所述表面或织物。
包括在内的是本发明蛋白酶变体或多肽在洗涤剂组合物(包括但不限于在衣物和/或盛具洗涤剂组合物)中的用途。
另外的示例性清洁方法在整篇中以及在下面的实施例提供。
总之，本申请公开了以下各项实施方案：
1.亲本蛋白酶的一种分离的蛋白酶变体，所述变体包含具有三个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换的氨基酸序列，其中所述变体具有蛋白水解活性并且所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。
2.根据项1所述的变体，其中所述变体氨基酸序列具有四个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换。
3.根据项1所述的变体，其中所述变体氨基酸序列具有五个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换。
4.根据项1所述的变体，其中所述变体氨基酸序列具有六个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换。
5.根据任何前述项所述的变体，其中所述变体氨基酸序列还具有氨基酸置换X097A。
6.根据任何前述项所述的变体，其中所述变体氨基酸序列具有氨基酸置换X024G/R+X053G+X078N+X101N+X128A/S+X217L/Q或X097A+X128A/S+X217L/Q。
7.根据任何前述项所述的变体，其中所述变体氨基酸序列具有氨基酸置换S024G/R+S053G+S078N+S101N+G128A/S+Y217L/Q或G097A+G128A/S+Y217L/Q。
8.根据项7所述的变体，其中所述变体氨基酸序列具有氨基酸置换S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q或S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q，并且任选还具有选自N109G、N076D、S033T、N243V、S248A、A088T和S063G的置换。
9.根据项7所述的变体，其中所述变体氨基酸序列还具有一组选自如下的氨基酸置换：
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G，
S033T+N076D，
S009T+N109G+K141R+N243V，
S162G+K256R，
N109G+A116T，
N109G+L257G，
S162G+L257G，
N061G+N109G+N243V，
N109G+N243V+S248A，
S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R，
N109G+A116T+N243V+K256R，
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V，
A088T+N109G，
N109G+N243V，
T158S+L257G，
N061S+N109G+N243V，
P040A+N109G+N243V+S248N+K256R，
S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R，
A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R，
A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G，
N109G+K256R，
N109G+N243V+K256R，
S063G+K256R，
S063G+N109G，
S063G，
S063G+N076D，
S033T+N076D+N218S，和
N076D+N218S。
10.根据项7所述的变体，其中所述变体氨基酸序列具有氨基酸置换S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q，并且还具有一组选自如下的氨基酸置换：
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G，
S033T+N076D，
S009T+N109G+A128S+K141R+N243V，
S162G+K256R，
N109G+A116T，
N109G+L257G，
S162G+L257G，
N061G+N109G+N243V，
N109G+A128S+N243V+S248A，
S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R，
N109G+A116T+N243V+K256R，
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V，
A088T+N109G，
N109G+N243V，
T158S+L257G，
N061S+N109G+N243V，
P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R，
S009T+S018T+Y021N+N109G+A128S+K141R，
A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R，
A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G，
N109G+K256R，
N109G+A128S+N243V+K256R，
S063G+K256R，
S063G+N109G，
S063G+A128S，
S063G+N076D，
S033T+N076D+A128S+N218S，和
N076D+N218S。
11.根据任何前述项所述的变体，其中所述变体氨基酸序列与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。
12.根据任何前述项所述的变体，其中所述变体氨基酸序列与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
13.根据项1-12中任一项所述的变体，其中所述变体与所述亲本蛋白酶相比具有增强的蛋白水解活性和/或清洁活性或者与具有SEQIDNO:2的序列的BPN'蛋白酶的蛋白水解活性相比具有增强的蛋白水解活性和/或清洁活性。
14.根据项1-12中任一项所述的变体，其中所述变体与具有SEQIDNO:4的序列的蛋白酶的蛋白水解活性相比具有增强的蛋白水解活性。
15.根据项1-12中任一项所述的变体，其中所述变体与具有SEQIDNO:6的序列的蛋白酶的蛋白水解活性相比具有增强的蛋白水解活性。
16.根据任何前述项所述的变体，其中所述亲本蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
17.根据项16所述的变体，其中所述亲本蛋白酶与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’具有至少80％序列同一性。
18.根据项16所述的变体，其中所述亲本蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
19.根据项1所述的变体，其中所述变体包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。
20.亲本蛋白酶的一种分离的蛋白酶变体，所述蛋白酶变体具有蛋白水解活性并且包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的一个或多个与SEQIDNO:2的氨基酸位置对应的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列，其中所述至少一个变更独立地是
(i)在占据所述位置的氨基酸残基的上游或下游插入一个或多个氨基酸残基，
(ii)占据所述位置的氨基酸残基缺失，或者
(iii)占据所述位置的氨基酸残基置换为另一不同的氨基酸残基，
其中每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2的比对确定。
21.根据项20所述的变体，其中所述变体包含在两个选自位置24、53、78、97、101、128和217的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。
22.根据项21所述的变体，其中所述变体包含在三个选自位置24、53、78、97、101、128和217的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。
23.根据项22所述的变体，其中所述变体包含在四个选自位置24、53、78、97、101、128和217的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。
24.根据项23所述的变体，其中所述变体包含在五个选自位置24、53、78、97、101、128和217的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。
25.根据项24所述的变体，其中所述变体包含在六个选自位置24、53、78、97、101、128和217的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列。
26.根据项25所述的变体，其中所述变体包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的与SEQIDNO:2的位置对应的氨基酸位置中的每一者处具有变更的氨基酸序列。
27.根据项20-26中任一项所述的变体，其中所述变体包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的某个位置处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。
28.根据项27所述的变体，其中所述变体包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的两个位置中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。
29.根据项28所述的变体，其中所述变体包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的四个位置中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。
30.根据项29所述的变体，其中所述变体包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的五个位置中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。
31.根据项30所述的变体，其中所述变体包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的六个位置中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列。
32.根据项31所述的变体，其中所述变体包含在位置24、53、78、101、128和217中的每一者处氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基置换的氨基酸序列，其中每个位置均通过与SEQIDNO:2中的位置的对应关系进行编号。
33.根据项20-32中任一项所述的变体，其中所述变体包含具有至少一个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。
34.根据项33所述的变体，其中所述变体包含具有至少两个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。
35.根据项34所述的变体，其中所述变体包含具有至少三个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。
36.根据项35所述的变体，其中所述变体包含具有至少四个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。
37.根据项36所述的变体，其中所述变体包含具有至少五个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。
38.根据项37所述的变体，其中所述变体包含具有至少六个选自X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S和X217Q/L的氨基酸置换的氨基酸序列。
39.根据项20-38中任一项所述的变体，其中所述变体包含具有一组选自如下的置换的氨基酸序列：(a)X128A/S和/或X217L/Q，(b)G128A/S和/或Y217L/Q和(c)G097A、G128A/S和Y217L/Q。
40.根据项20-39中任一项所述的变体，其中所述变体包含具有氨基酸置换X024G/R+X053G+X078N+X101N+X128A/S+X217Q/L的氨基酸序列。
41.根据项20-40中任一项所述的变体，其中所述变体包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
42.根据项41所述的变体，其中所述变体包含与SEQIDNO:2具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
43.根据项20-42中任一项所述的变体，其中所述变体氨基酸序列包含至少一个选自S024G、S053G、S078N、S101N、G128A/S和Y217Q的氨基酸置换。
44.根据项20-43中任一项所述的变体，其中所述变体氨基酸序列具有氨基酸置换S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q。
45.根据项20-44中任一项所述的变体，其中所述变体与所述亲本蛋白酶相比具有增强的蛋白水解活性具有增强的蛋白水解活性和/或清洁活性或者与SEQIDNO:2中示出的蛋白酶的蛋白水解活性相比具有增强的蛋白水解活性和/或清洁活性。
46.根据项20-44中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQIDNO:4中示出的蛋白酶的蛋白水解活性相比具有增强的蛋白水解活性。
47.根据项20-44中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQIDNO:6中示出的蛋白酶的蛋白水解活性相比具有增强的蛋白水解活性。
48.根据项20-47中任一项所述的变体，其中所述亲本蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
49.根据项48所述的变体，其中所述亲本蛋白酶与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’具有至少80％序列同一性。
50.根据项49所述的变体，其中所述亲本蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
51.亲本蛋白酶的一种分离的蛋白酶变体，其中(a)所述蛋白酶变体包含(i)与SEQ:2的序列具有至少90％同一性以及(ii)在位置24和53处具有甘氨酸置换、在位置78和101处具有天冬酰胺置换、在位置128处具有丙氨酸或丝氨酸置换以及在位置217处具有谷氨酰胺置换的氨基酸序列；(b)所述亲本蛋白酶与SEQIDNO:2具有至少90％序列同一性；(c)所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号；以及(d)所述蛋白酶变体相对于所述亲本蛋白酶具有增加的蛋白水解活性和/或清洁活性。
52.根据前述项中任一项所述的变体，其中所述变体是成熟形式。
53.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，所述多肽包含与选自如下的多肽序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列：
a)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G；
b)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S033T+N076D；
c)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+N109G+K141R+N243V；
d)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+K256R；
e)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T；
f)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+L257G；
g)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+L257G；
h)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061G+N109G+N243V；
i)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+S248A；
j)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R；
k)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T+N243V+K256R；
l)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V；
m)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G；
n)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+N243V；
o)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+T158S+L257G；
p)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061S+N109G+N243V；
q)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R；
r)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R；
s)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R；
t)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G；
u)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+K256R；
v)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+K256R；
w)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+K256R；
x)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N109G；
y)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S063G；
z)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N076D；
aa)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N218S；
bb)BPN'-
S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N076D+N218S；以及
cc)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q，其中所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
54.一种分离的核酸，所述核酸包含编码根据项1-52中任一项所述的变体或根据项53所述的多肽的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。
55.一种分离的核酸，所述核酸包含与SEQIDNO:3或SEQIDNO:5中所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。
56.一种表达载体，所述表达载体包含至少一条根据项54或55所述的核酸。
57.根据项56所述的表达载体，其中所述至少一条核酸与启动子有效连接。
58.一种重组宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a)根据项54或55所述的核酸，或(b)根据项56或57所述的表达载体。
59.根据项58所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
60.根据项59所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌(Bacillus)细胞。
61.根据项70所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞。
62.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含：(a)根据项54或55所述的核酸，或(b)根据项56或57所述的表达载体。
63.一种生产蛋白酶变体的方法，所述方法包括在有利于生产所述变体的条件下培养根据项58-61中任一项所述的重组宿主细胞。
64.根据项63所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物回收所述变体。
65.一种制备蛋白酶变体的方法，所述方法包括：
(a)将根据项56或57所述的重组表达载体引入一群细胞中；以及
(b)在有利于制备由所述表达载体编码的蛋白酶变体的条件下在培养基中培养所述细胞。
66.根据项65所述的方法，所述方法还包括：
(c)从所述细胞或从所述培养基分离或回收所述变体。
67.一种包含根据项1-52中任一项所述的变体或根据项53所述的多肽的组合物，所述组合物不是织物和家庭护理产品。
68.根据项67所述的组合物，所述组合物包含至少一种辅助成分或载体。
69.根据项67或68所述的组合物，其中所述组合物包含另外的酶。
70.根据项69所述的组合物，其中所述另外的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、淀粉酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶和漆酶。
71.根据项67-70中任一项所述的组合物，其中所述组合物是用于清洁隐形眼镜的洗涤剂组合物。
72.根据项67-70中任一项所述的组合物，其中所述组合物是可用于个人护理应用的清洁组合物。
73.根据项67-72中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种助洗剂和/或至少一种表面活性剂。
74.一种用于清洁需要清洁的物品或表面的方法，所述方法包括使所述物品或表面与根据项1-52中任一项所述的变体、根据项53所述的多肽或根据项67-73中任一项所述的组合物接触。
75.根据项74所述的方法，所述方法还包括用水漂洗所述物品或表面。
76.一种用于清洁表面或物体的方法，所述方法包括使待清洁的物品或表面的至少一部分与根据项1-52中任一项所述的变体、根据项53所述的多肽或根据项67-73中任一项所述的组合物接触足以或有效清洁或洗涤所述物品或表面至所需程度的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤所述物品或表面至所需程度的条件下接触，并且任选包括用水漂洗所述物品或表面。
77.一种处理和/或清洁表面或织物的方法，所述方法包括如下步骤：任选洗涤和/或漂洗所述表面或织物，使所述表面或织物与根据项1-52中任一项所述的变体、根据项52所述的多肽或根据项67-73中任一项所述的组合物接触，然后任选洗涤和/或漂洗所述表面或织物。
78.根据项1-52中任一项所述的变体，其中所述亲本蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶，并且所述变体是与所述亲本枯草杆菌蛋白酶相比在洗涤剂中具有改善的洗涤性能或改善的清洁性能的枯草杆菌蛋白酶变体，或根据项53所述的多肽，其中所述多肽与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的蛋白酶相比在洗涤剂中具有改善的洗涤性能或改善的清洁性能。
实验
在第I部分实施例和后面的第I部分实施例的实验公开内容中1/4适用如下缩写：PI(性能指数)，ppm(份每一百万份)；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)；μM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(足量)；ND(未进行)；rpm(每分钟转数)；GH(德国硬度度数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝DNA或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量/体积比)；v/v(体积比)；w/w(重量比)；g(重力)；OD(光密度)；ppm(份每一百万份)；杜伯科氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲溶液(DPBS)；SOC(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母抽提物、10mMNaCl、2.5mMKCl)；极品肉汤(TerrificBroth,TB；12g/l细菌用胰蛋白胨、24g/l甘油、2.31g/lKH2PO4和12.54g/lK2HPO4)；OD280(280nm处的光密度)；OD600(600nm处的光密度)；A405(405nm处的吸光度)；Vmax(酶催化反应的最大初速度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mMNaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2])；PBST(PBS+0.25％)；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐水)；Tris-HCl(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸盐)；Tricine(N-[三-(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)；TAPS(3-{[三-(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸)；CAPS(3-(环己基氨基)-丙磺酸；DMSO(二甲基亚砜)；DTT(1,4-二硫代-DL-苏糖醇)；SA(芥子酸(s,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)；TCA(三氯乙酸)；Glut和GSH(还原型谷胱甘肽)；GSSG(氧化型谷胱甘肽)；TCEP(三[2-羧乙基]膦)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；HPLC(高效液相色谱)；RP-HPLC(反相高压液相色谱)；TLC(薄层色谱)；MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离--飞行时间)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙基)，Me(甲基)；Taq(水生栖热菌(Thermusaquaticus)DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)N,N,N',N'-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因)；HDL(重垢液体)；HDD(重垢粉末洗涤剂)；HSG(高泡颗粒状洗涤剂)；CEE(中欧和东欧)；WE(西欧)；当用于指洗涤剂时，NA(北美)；当用于指洗涤剂时，JPN(日本)；MTP(微量滴定板)；MJResearch(MJResearch公司，内华达州雷诺(Reno,NV))；Baseclear(BaseclearBV公司，荷兰莱顿(Leiden,TheNetherlands))；PerSeptive(PerSeptiveBiosystems公司，迈阿密费雷明汉(Framingham,MA))；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan公司，加利福尼亚州圣荷西(SanJose,CA))；Argo(ArgoBioAnalytica公司，新泽西州莫里斯普莱恩斯(MorrisPlains,NJ))；SeitzEKS(SeitzSchenkFiltersystemsGmbH有限责任公司，德国巴特克罗伊茨纳赫(BadKreuznach,Germany))；Pall(PallCorp.公司，纽约州东希尔斯(EastHills,NY)和德国巴特克罗伊茨纳赫(BadKreuznach,Germany))；Spectrum(SpectrumLaboratories公司，加利福尼亚州多明格斯农场(DominguezRancho,CA))；MolecularStructure(MolecularStructureCorp.公司，得克萨斯州伍德兰兹(Woodlands,TX))；Accelrys(阿赛乐德网络公司Accelrys,Inc.，加利福尼亚州圣地牙哥(SanDiego,CA))；ChemicalComputing(ChemicalComputingCorp.公司，加拿大蒙特利尔(Montreal,Canada))；NewBrunswick(NewBrunswickScientific,Co.公司，新泽西爱迪生(Edison,NJ))；CFT(材料测试中心(CenterforTestMaterials)，荷兰费拉尔丁恩(Vlaardingen,TheNetherlands))；P&G和Procter&Gamble(宝洁公司(Procter&Gamble,Inc.)，美国俄亥俄州辛辛那提(Cincinnati,OH))；GEHealthcare(通用电气医疗集团(GEHealthcare)，英国查尔芬特.圣贾尔斯(ChalfontSt.Giles,UnitedKingdom))；DNA2.0(DNA2.0公司，加利福尼亚州门洛帕克(MenloPark,CA))；OXOID(Oxoid公司，英国汉普郡贝辛斯托克(Basingstoke,Hampshire,UK))；Megazyme(MegazymeInternationalIrelandLtd.有限公司，爱尔兰维克罗郡布雷市布雷商业园(BrayBusinessPark,Bray,Co.,Wicklow,Ireland))；Finnzymes(FinnzymesOy公司，芬兰埃斯波(Espoo,Finland))；Kelco(CPKelco公司，特拉华州威尔明顿(Wilmington,DE))；Corning(康宁生命科学(CorningLifeSciences)，纽约州科宁(Corning,NY))；(NEN(NENLifeScienceProducts公司，麻萨诸塞州波士顿(Boston,MA))；PharmaAS(PharmaAS公司，挪威奥斯陆(Oslo,Norway))；Dynal(Dynal公司，挪威奥斯陆)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis公司，得克萨斯州刘易斯维尔(Lewisville,TX))；ATCC(美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，马里兰州罗克维尔(Rockville,MD))；Gibco/BRL(Gibco/BRL公司，纽约州格兰德岛(randIsland,NY))；Sigma(西格玛化工有限公司(SigmaChemicalCo.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))；Pharmacia(法玛西亚生物技术公司(PharmaciaBiotech)，新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,NJ))；NCBI(美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation))；AppliedBiosystems(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，加利福尼亚州福斯特城(FosterCity,CA))；BDBiosciences和/或Clontech(BDBiosciencesCLONTECHLaboratories，加利福尼亚州帕罗奥图(PaloAlto,CA))；OperonTechnologies(OperonTechnologies,Inc.公司，加利福尼亚州阿拉米达(Alameda,CA))；MWGBiotech(MWGBiotech公司，北卡罗来纳州海波因特(HighPoint,NC))；OligosEtc(OligosEtc.Inc公司，俄勒冈州威尔逊维尔(Wilsonville,OR))；Bachem(BachemBioscience,Inc.公司，宾夕法尼亚州普鲁士王(KingofPrussia,PA))；Difco(DifcoLaboratories公司，密歇根州底特律(Detroit,MI))；Mediatech(Mediatech公司，弗吉尼亚州赫恩登(Herndon,VA))；SantaCruz(SantaCruzBiotechnology,Inc.公司，加利福尼亚州圣塔克鲁兹(SantaCruz,CA))；Oxoid(OxoidInc.公司，纽约州奥格登斯堡(Ogdensburg,NY))；Worthington(WorthingtonBiochemicalCorp.公司，新泽西州弗里霍尔德(Freehold,NJ))；GIBCOBRL或GibcoBRL(LifeTechnologies,Inc.公司，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,MD))；Millipore(密理博公司(Millipore)，麻萨诸塞州比尔里卡(Billerica,MA))；Bio-Rad(伯乐公司(Bio-Rad)，加利福尼亚州赫尔克里士(Hercules,CA))；Invitrogen(英杰公司(InvitrogenCorp.)，加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego,CA))；NEB(NewEnglandBiolabs公司，麻萨诸塞州贝弗利(Beverly,MA))；Sigma(西格玛化工有限公司(SigmaChemicalCo.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))；Pierce(Pierce生物技术公司(PierceBiotechnology)，伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL))；Takara(宝生物工程株式会社(TakaraBioInc.)，日本大津市(Otsu,Japan))；Roche(罗氏公司(Hoffmann-LaRoche)，瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland))；GeneOracle(GeneOracle,Inc.公司，加利福尼亚州山景城(MountainView,CA))；EMScience(EMScience公司，新泽西州吉布斯敦Gibbstown,NJ))；Qiagen(凯杰公司(Qiagen,Inc.)，加利福尼亚瓦伦西亚(Valencia,CA))；Biodesign(BiodesignIntl.公司，缅因州索科(Saco,Maine))；Aptagen(Aptagen,Inc.公司，弗吉尼亚州赫恩登(Herndon,VA))；Sorvall(Sorvall牌，来自KendroLaboratoryProducts公司，北卡罗来纳州阿什维尔(Asheville,NC))；MolecularDevices(MolecularDevices,Corp.公司，加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale,CA))；R&DSystems(R&DSystems公司，明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis,MN))；SiegfriedHandel(SiegfriedHandelAG公司，瑞士祖芬根(Zofingen,Switzerland))；Stratagene(StratageneCloningSystems公司，加利福尼亚州拉荷雅(LaJolla,CA))；Marsh(MarshBiosciences公司，纽约州罗彻斯特(Rochester,NY))；Geneart(GeneartGmbH)有限公司(，德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))；Bio-Tek(Bio-TekInstruments公司，佛蒙特州威努斯基(Winooski,VT))；(Biacore(Biacore,Inc.公司，新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,NJ))；PeproTech(PeproTech公司，新泽西州罗基希尔(RockyHill,NJ))；SynPep(SynPep公司，加利福尼亚州都柏林(Dublin,CA))；NewObjective(NewObjective牌；ScientificInstrumentServices,Inc.公司，新泽西州灵戈斯(Ringoes,NJ))；Waters(沃特斯公司(Waters,Inc.)，麻萨诸塞州米尔福德(Milford,MA))；MatrixScience(MatrixScience公司，麻萨诸塞州波士顿(Boston,MA))；Dionex(戴安公司(Dionex,Corp.)，加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale,CA))；Monsanto(孟山都公司(MonsantoCo.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))；Wintershall(WintershallAG公司，德国卡塞尔(Kassel,Germany))；BASF(巴斯夫公司(BASFCo.)，新泽西州弗洛勒姆帕克(FlorhamPark,NJ))；Huntsman(亨斯迈石化公司(HuntsmanPetrochemicalCorp.)，犹他州盐湖城(SaltLakeCity,UT))；ShellChemicals(壳牌化学品公司(ShellChemicals,Inc.)，英国伦敦(London,UK))；Stepan(Stepan公司，伊利诺伊州诺斯菲尔德(Northfield,IL))；Clariant(Clariant公司，德国苏尔茨巴赫(Sulzbach,Germany))；IndustrialZeolite(IndustrialZeoliteLtd.公司，英国艾塞克斯格雷斯(Grays,Essex,UK))；Jungbunzlauer(Jungbunzlauer公司，巴塞尔(Basel,Switzerland))；Solvay(Solvay公司，比利时布鲁塞尔(Brussels,Belgium))；3VSigma(3VSigma公司，意大利贝尔加莫(Bergamo,Italy))；Innospec(Innospec公司，英国埃尔斯米尔港(EllesmerePort,UK))；Thermphos(Thermphos公司，荷兰弗利辛恩奥斯特(Vlissiggen-Ost,TheNetherlands))；CibaSpecialty(汽巴精化公司(CibaSpecialtyChemicals)，瑞士布鲁塞尔(Basel,Switzerland))；DowCorning(道康宁公司(DowCorning)，英国巴里(Barry,UK))；Enichem(EnichemIberica公司，西班牙巴萨罗那(Barcelona,Spain))；FlukaChemieAG(FlukaChemieAG公司，瑞士布克斯(Buchs,Switzerland))；Gist-Brocades(Gist-Brocades,NV公司，荷兰代夫特(Delft,TheNetherlands))；DowCorning(道康宁公司(DowCorningCorp.)，密歇根州米德兰(Midland,MI))；Mettler-Toledo(Mettler-ToledoInc，俄亥俄州哥伦布(Columbus,OH))；RB(Reckitt-Benckiser公司，英国斯劳(Slough,UK))；以及Microsoft(微软公司(Microsoft,Inc.)，华盛顿州雷德蒙德(Redmond,WA))。
在本文提供的示例性洗涤剂组合物中，酶水平是以总组合物重量计的纯酶表示，除非另外指明，否则洗涤剂成分是以总组合物的重量表示。其中的缩写的组分标识具有如下含义：
对于北美(NA)和西欧(WE)重垢液体衣物(HDL)洗涤剂，通过将预称重的液体洗涤剂(于玻璃瓶中)置于95℃水浴中2小时对市售洗涤剂中存在的酶进行热灭活。NA和WE自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂的温育时间是8小时。未加热的和加热过的洗涤剂二者均在溶解该洗涤剂5分钟内测定，以便精确地测定灭活百分比。通过AAPF测定法测试酶活性。
为了测试在热灭活洗涤剂中的酶活性，由热灭活的储备液制备洗涤剂的工作溶液。添加适当量的水硬度(例如6gpg或12gpg)和缓冲液至该洗涤剂溶液以匹配所需的条件。通过涡旋或倒转瓶子来混合溶液。下表提供了关于本文所用的一些市售洗涤剂和测试条件的信息。在一些实验中，另外的和/或其他的市售洗涤剂可用于如下实施例。
在一些另外的方面，可使用如下溶液：
实施例——其旨在对本发明进行纯粹地示例性说明，因而不应该被视为以任何方式限制本发明——也描述并详细说明了上面论述的本发明的各方面和各实施方案。上述例子和详细描述是以示例方式而不是以限制方式给出。
第I部分
洗涤剂片
用于第I部分实施例中的测定法的洗涤剂的组成在表1-3中示出。如第I部分实施例1中所述，将BPN’变体蛋白样品添加至洗涤剂组合物以测定多种所测试的特性。
下面是适于顶开式自动洗涤机的液体衣物洗涤剂组合物(1、2和4)和适于前开式自动洗涤机的液体衣物洗涤剂组合物(3)。
1无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不超过1个接枝点。
2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物是聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个–NH具有24个乙氧基化基团，每个–NH具有16个丙氧基化基团
第I部分实施例
实施例1
测定法
如下文所示使用了各种测定法。任何偏离于下文提供的方案的地方均在后续的实施例中指出。
A.96孔微量滴定板中测定蛋白质含量的TCA测定法
对于BPN’和BPN’变体，这个测定法使用过滤过的枯草芽孢杆菌培养上清液来开始，该上清液来自在33-37℃下以230-250rpm振荡和增湿通气的条件下培养3-4天的微量滴定板。将新的96孔平底微量滴定板(MTP)用于该测定法。首先，将100μL/孔的0.25NHCl置于每孔中。然后，添加25μL过滤过的培养液。然后测定405nm处的光散射/吸光度(在读板机中使用5秒混合模式)以提供“空白”读数。对于该测试，将100μL/孔的30％(w/v)三氯乙酸(TCA)置于板中并在室温下温育10分钟。然后测定405nm处的光散射/吸光度(在读板机中使用5秒混合模式)。使用的设备为BiomekFXRobot(BeckmanCoulter)和SpectraMAX(340型；MolecularDevices)MTP读板机；MTP来自Costar(9017型)。
通过从使用TCA时的测试读数减去空白值(无TCA)进行计算以提供样品中蛋白质含量的相对度量。如果需要，可通过用具有已知转换因子的克隆的AAPF测定法校准TCA读数来产生标准曲线。然而，TCA结果对于250至2500微克蛋白质/ml(ppm)的蛋白质浓度而言是线性的，因而可相对于酶性能直接绘图以选择表现良好的变体。样品中浊度/光散射的增加与培养上清液中可沉淀蛋白质的总量相关。
B.96孔微量滴定板中的AAPF蛋白酶测定法
为了测定本发明的蛋白酶或其变体的蛋白酶活性，对N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解进行了测量。使用的试剂溶液是：100mMTris/HCl，pH8.6，含有0.005％ (Tris稀释缓冲液)；100mMTris缓冲液，pH8.6，含有10mMCaCl2和0.005％(Tris/Ca缓冲液)；和DMSO中的160mMsuc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA储备溶液)(Sigma:S-7388)。为制备suc-AAPF-pNA工作溶液，将1mlsuc-AAPF-pNA储备溶液添加至100mlTris/Ca缓冲液并充分混合至少10秒。通过添加10μl的稀释蛋白酶溶液至每个孔，随即添加190μl1mg/mlsuc-AAPF-pNA工作溶液来进行该测定法。将溶液混合5秒，25℃下在MTP读板机中在405nm处读取动力学模式的吸光度变化(5分钟内25个读数)。蛋白酶活性表示为AU(活性＝ΔOD·min-1ml-1)。
C.BMI微样本测定法
从CFT获得具有5.5毫米圆直径的血、奶和墨(BMI)染污的微样本。在切割前，用水洗涤织物(EMPA116)。将96孔非结合微量滴定板(Corning3641)的每个孔放置一微样本。用于测定法的洗涤剂包括洗涤剂组合物1、洗涤剂组合物2和洗涤剂组合物4。将洗涤剂在Milli-Q(去离子)水中稀释至0.788g/L的工作强度浓度。用5mMHEPES(pH8.2或pH7.2)缓冲这些洗涤剂，该缓冲液在添加至洗涤剂时，分别缓冲处于pH8或pH7。另外，添加6格令/加仑(gpg)水硬度(3:1Ca:Mg-CaCl2:mgCl2·6H2O)。将洗涤剂溶液在冰水浴中预先平衡以用于16℃测定法(在室温下预先平衡以用于32℃测定法)并泵送进循环贮存器(BeckmanFX)中。然后，将190μl所需的洗涤剂溶液添加至MTP的装有微样本的每个孔。向这个混合物添加10μl稀释的酶母稀释溶液(enzymemasterdilutionsolution)，从而大概的酶浓度为0.4-0.5μg/mL。该母稀释液从培养上清液制备成8μg/mL，其中培养上清液和BPN’-v3或BPN’-v36亲本对照的大概酶浓度用AAPF蛋白酶活性测定法进行测定，将该浓度基于已知浓度的纯化的BPN’-v3或BPN’-v36标准品。将MTP用胶带密封并置于冷冻奶制品容器中的预先设定为16℃或台面上的预先设定为32℃的iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)中20分钟，伴随1400rpm搅拌。在适当的条件下温育后，从每个板移除密封胶带并将125μl(如果用手吸移用于更小的筛网(smallerscreens)的话，则150μl)来自每个孔的溶液转移进新的MTP(Corning9017)。将每孔装有125μl–150μl溶液的新MTP用MTPSpectraMax读板机(340型；MolecularDevices)在600nm处读数(在读板机中使用5秒混合模式)。还包括了装有微样本和洗涤剂但无酶的空白对照。然后针对空白值(无酶的底物)校正获得的吸光度值，从而提供水解活性的度量。对于每个样品(变体)，如下所述计算性能指数。这个BMI微样本测定法(在60℉(16℃)和pH8下进行)在本文中称为“测试方法”。
D.蛋微样本测定法
被带有颜料的CS38老化蛋黄染污的5.5毫米圆直径的棉微样本从CRT获得。未在水中对这些进行预漂洗。将96孔非结合微量滴定板(Corning3641)的每个孔放置一微样本。将洗涤剂组合物4在Milli-Q(去离子)水中稀释至0.788g/L的工作强度浓度。用5mMHEPESpH8.2缓冲这些洗涤剂，该缓冲液添加至洗涤剂后，缓冲处于pH8。另外，添加6格令/加仑(gpg)水硬度(3:1Ca:Mg-CaCl2:mgCl2·6H2O)。将洗涤剂溶液在冰水浴中预先平衡以用于16℃测定法(在室温下预先平衡以用于32℃测定法)并泵送进循环贮存器(BeckmanFX)中。然后，将185μl所需的洗涤剂溶液添加至MTP的装有微样本的每个孔。向这个混合物添加15μl稀释的酶母稀释溶液，从而反应中大概的酶浓度为0.6μg/mL。该母稀释液从培养上清液制备成8μg/mL，其中培养上清液和BPN’-v3或BPN’-v36亲本对照的大概酶浓度用AAPF蛋白酶活性测定法进行测定，将该浓度基于已知浓度的纯化的BPN’-v3或BPN’-v36标准品。将MTP用胶带密封并置于冷冻奶制品容器中的预先设定为16℃或台面上的预先设定为32℃的iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)中30分钟，伴随以1400rpm搅拌。在合适的条件下温育后，从每个板移除密封胶带并将125μl(如果用手吸移用于更小的筛网的话，则150μl)来自每个孔的溶液转移到新的MTP(Corning9017)中。将每孔装有125μl–150μl溶液的新MTP用MTPSpectraMax读板机(340型；MolecularDevices)在405nm处读数(在读板机中使用5秒混合模式)。还包括了装有微样本和洗涤剂但无酶的空白对照。然后针对空白值(无酶底物)校正获得的吸光度值，从而提供了对水解活性的度量。对于每个样品(变体)，如下所述计算性能指数。
E.草微样本测定法
WarwickEquest擦有草的织造棉从Warwick获得。使用定制的96孔打孔机将这些切成5.5毫米圆直径的微样本，该打孔机在96孔非结合微量滴定板(Corning3641)的每个孔中放置一微样本。在切制后，用100μl/孔的在水中稀释的50％工作强度洗涤剂组合物4将该织物在孔中洗涤(预漂洗)。20分钟预漂洗后，用手小心地吸移出100μl50％洗涤剂漂洗液。将洗涤剂组合物4在Milli-Q(去离子)水中稀释至0.788g/L的工作强度浓度。用5mMHEPESpH8.2缓冲这些洗涤剂，该缓冲液添加至洗涤剂后，缓冲处于pH8。另外，添加6格令/加仑(gpg)水硬度(3:1Ca:Mg-CaCl2:mgCl2·6H2O)。将洗涤剂溶液在冰水浴中预先平衡用于16℃测定法(在室温下预先平衡用于32℃测定法)。然后，在预漂洗完成后，即刻将180μl所需洗涤剂溶液添加至装有微样本的MTP的每个孔。向该混合物添加20μl稀释的酶母稀释溶液，从而反应中大概的酶浓度为0.8μg/mL。该母稀释液从8μg/mL的培养上清液制备，其中该培养上清液和BPN’-v36亲本对照的大概酶浓度用AAPF蛋白酶活性测定法，基于已知浓度的纯化的BPN'-v36标准品的浓度测定。将MTP用胶带密封并置于冷冻奶制品容器中的预先设定为16℃或台面上的预先设定为32℃的iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)中30分钟，伴随以1400rpm搅拌。在合适的条件下温育后，从每个板移除密封胶带并将125μl(如果用手吸移用于更小的筛网的话，则150μl)来自每个孔的溶液转移到新的MTP(Corning9017)中。将每孔装有125μl–150μl溶液的新MTP用MTPSpectraMax读板机(340型；MolecularDevices)在430nm和670nm处进行读数(在读板机中使用5秒混合模式)。还包括了装有微样本和洗涤剂但无酶的空白对照。然后针对空白值(无酶的底物)校正获得的吸光度值，从而提供水解活性的度量。对于每个样品(变体)，如下所述计算性能指数。
F.稳定性测定法
在存在在水中稀释的40％浓洗涤剂组合物3的情况下测定蛋白酶变体的稳定性。使用的试剂是在Milli-Q水中稀释至50％的洗涤剂组合物3、10mMMES0.01％pH5.8母稀释缓冲液、AAPF试剂：参见方案AAPF测定法。使用的设备为用于将稀释的酶稀释进洗涤剂中以及用于suc-AAPF-pNA板的F形底MTP(Corning9017)、BiomekFX(BeckmanCoulter)、SpectramaxPlus384MTP读板机(MolecularDevices)、iEMS温育器/振荡器(1mm振幅)(ThermoElectronCorporation)、密封胶带：Nunc(236366)、循环贮存器(BeckmanFx)。
一开始，将洗涤剂组合物3在水中稀释至50％。将这个洗涤剂保持在室温下并循环通过循环贮存器。将iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)预先设定在43℃。将培养上清液稀释到装有母稀释缓冲液的板中至大约20ppm的浓度(母稀释板)。然后，将40μl来自母稀释板的样品添加至装有160μl50％洗涤剂组合物3的板以得到4ppm的最终温育浓度。将内容物混合并保持在室温下，立刻对这些板重复进行三次AAPF测定法并记录为非应激读数(unstressedread)。对该AAPF测定法进行修改，使得20μl来自上面步骤的样品添加至190μl的suc-AAPF-pNA工作溶液。将板立刻用密封胶带覆盖并置于650rpm的43℃iEMS振荡器中30分钟。温育30分钟后，对这些板重复进行三次AAPF测定法并记录为应激读数(stressedread)。如下通过计算残余和初始AAPF活性之比来测定样品的稳定性：残余活性(％)＝[mOD.min-1应激]*100/[mOD.min-1非应激]。对于每个样品(变体)，如下所述计算性能指数。
G.LAS/EDTA稳定性测定法
在限定条件下温育后测量蛋白酶变体在存在代表性阴离子型表面活性剂(LAS＝直链烷基苯磺酸盐，特别是，十二烷基苯磺酸钠-DOBS)和乙二胺四乙酸二钠的情况下的稳定性，使用AAPF测定法测定残余的活性。使用的试剂是十二烷基苯磺酸钠盐(DOBS,SigmaNo.D-2525)、(SigmaNo.P-8074)、乙二胺四乙酸二钠(SiegfriedHandelNo.164599-02)、HEPES(SigmaNo.H-7523)、非应激缓冲液(50mMHEPES(11.9g/l)+0.005％pH8.0)、应激缓冲液(50mMHEPES(11.9g/l)、0.1％(w/v)DOBS(1g/l)、10mMEDTA(3.36g/l),pH8.0)、含有200-400μg/ml蛋白质的参考蛋白酶和蛋白酶变体培养上清液。使用的设备是作为稀释板的V形底或U形底MTP(分别为Greiner651101和650161)、用于非应激缓冲液和LAS/EDTA缓冲液以及用于suc-AAPF-pNA板的F形底MTP(Corning9017)、BiomekFX(BeckmanCoulter)、SpectramaxPlus384MTP读板机(MolecularDevices)、iEMS温育器/振荡器(1mm振幅)(ThermoElectronCorporation)和Nunc密封胶带(236366)。
iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)设定为29℃。将培养上清液稀释到装有非应激缓冲液的板中至大约25ppm的浓度(母稀释板)。然后，将20μl来自母稀释板的样品添加至装有180μl非应激缓冲液的板以得到2.5ppm的最终温育浓度。将内容物混合并保持在室温下，对该板进行AAPF测定法。然后，将20μl来自母稀释板的样品也添加到装有180μl应激缓冲液(50mMHEPES(11.9g/l),0.1％(w/v)DOBS(1g/l),10mMEDTA(3.36g/l),pH8.0)的板。将溶液混合并立刻置于29℃iEMS震荡器中400rpm下30分钟。温育30分钟后，对应激板进行AAPF测定法。如下通过计算残余和初始AAPF活性之比来测定样品的稳定性：残余活性(％)＝[mOD.min-1应激]*100/[mOD.min-1非应激]。对于每个样品(变体)，如下所述计算性能指数。
性能指数
性能指数提供相同蛋白质浓度下变体性能(实际值)和标准或参考蛋白酶性能(理论值)的比较。理论值可用标准/参考蛋白酶的性能剂量响应曲线(即使用朗缪尔方程来产生性能曲线)的参数来计算。大于1的性能指数(PI)(PI>1)可确定较于标准或参考蛋白酶(可以是例如野生型蛋白酶或其他蛋白酶变体)更好的变体，而等于1的PI(PI＝1)可确定与标准或参考蛋白酶性能相同的变体，小于1的PI(PI<1)可确定性能比标准或参考蛋白酶差的变体。因而，PI可确定优胜者(例如与标准/参考蛋白酶相比具有增强的蛋白水解活性的变体)以及在某些情况下可能较不希望使用的变体(例如具有比标准/参考蛋白酶的蛋白水解活性低的蛋白水解活性的变体)。
要着重指出的是，具有低于参考或标准蛋白酶的性能指数值的本发明蛋白酶变体仍然可用于本文描述的应用和方法。例如，具有低于参考或标准蛋白酶的性能指数值的本发明蛋白酶变体具有蛋白水解活性并因而可用于本发明的组合物中，例如但不限于例如用于清洁多种表面和物品(包括但不限于例如衣物、织物和餐具)的清洁组合物(包括但不限于例如洗涤剂清洁组合物)，以及可用于如本文其他地方所述的个人护理应用和组合物。这类蛋白酶变体也可用于织物和家庭护理产品及组合物和可用于本文其他地方描述的非织物和家庭护理产品及组合物以及可用于本发明的方法，包括但不限于例如本文其他地方描述的清洁方法、用于个人护理的方法等。
下面示出的各个术语用于描述该变体：非有害变体具有PI>0.05；有害变体具有低于或等于0.05的PI；可组合的变体是变体对于至少一种特性具有大于或等于0.2的性能指数值以及对于所有性质具有>0.05的性能指数值的那些。可组合的变体是可以进行组合以提供对于一种或多种所需性质而言具有适当性能指数的蛋白质的那些。这些数据可用于对任何枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶进行工程改造。即使待进行工程改造的枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶在一个或多个特定位置处具有与枯草杆菌蛋白酶BPN'不同的氨基酸，但这些数据可用于通过鉴别置换(包括BPN'野生型氨基酸的置换)的最佳选择来鉴别可改变所需特性的氨基酸置换。
实施例2
BPN’文库的构建和BPN’变体的清洁性能
a)用于文库构建的BPN’-v3表达盒的描述
用于组合文库构建的BPN’-v3(含有G097A-G128A-Y217Q置换的BPN’蛋白酶)表达盒用BPN’表达盒产生，BPN’表达盒包含aprE-BPN’杂合前导序列(即信号序列)、来自解淀粉芽孢杆菌的BPN’前序列和BPN’成熟序列。该DNA序列在下面示出为SEQIDNO:1并编码在下面示出为SEQIDNO:168的BPN’前体蛋白。
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGGCAGG GAAATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGACAAT GAGCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGG CGGGAAAGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTAC ATTAAACGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGC TTACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACATGCGTAC (SEQIDNO:1)
在SEQIDNO:1的核苷酸序列中，编码成熟蛋白酶的DNA序列以粗体示出，编码前导序列的核苷酸序列(aprE-BPN’杂合前导序列)以标准的(不带下划线的)文本示出，编码前序列(BPN’)的核苷酸序列用下划线标出。在SEQIDNO:168中示出的BPN’前体蛋白的氨基酸序列(aprE-BPN’杂合前导序列、BPN’前序列和BPN’成熟蛋白质序列)中，粗体部分表示成熟BPN’枯草杆菌蛋白酶。
VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAY (SEQIDNO：168）
因而，成熟BPN’枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列是：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:2)
成熟BPN’-v3基因的核苷酸序列在下面示出(BPN’-v3表达盒中使用的信号序列和前肽序列与SEQIDNO:1中所示的BPN’的相同)：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATTCTATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAG(SEQIDNO:3)
成熟BPN’-v3蛋白酶变体的蛋白质序列在下面示出(BPN’-v3表达盒中使用的信号序列和前肽序列与SEQIDNO:168中所示的BPN’的相同)：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLAADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:4)
b)使用pHPLT-BPN’-v3质粒构建组合文库
含有上述BPN’-v3表达盒的pHPLT-BPN’-v3质粒(参见图1)充当克隆用的DNA模板以提供衍自BPN’-v3的变体。载体pHPLT(美国专利No.6,566,112中的图4)含有地衣芽孢杆菌LAT启动子(“Plat”)；编码LAT信号肽的序列(“preLAT”)。来自McKenzie等人，Plasmid(《质粒》)，15(2):93-103(1986)中公开的质粒pUB110的另外的质粒元件：“ori-pUB”是来自pUB110的复制起点；“neo”是来自pUB110的新霉素/卡那霉素抗性基因；“Terminator”是来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录终止子。
组合DNA文库在DNA2.0合成并作为单独的连接反应物提供。在一些情况中为有效转化枯草芽孢杆菌，将来自连接反应混合物的DNA用IllustraTempliphi试剂盒(GEHealthcare)通过滚环扩增(RCA)来进行扩增。根据生产商的方案进行该反应。将一微升的十倍稀释的扩增DNA用于转化50μl的感受态枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将该转化混合物在37℃下振荡1小时。将该转化混合物的10微升等分试样平板接种于补充有10μg/ml新霉素(Teknova)的脱脂乳(1.6％)Luria琼脂板上。
将在脱脂乳板上形成晕圈的转化体挑拣到装有150μl补充有10μg/ml新霉素的Luria肉汤(LB)培养基的微量滴定板中。使用Enzyscreen微量滴定板盖(Enzyscreen)，以250-300rpm振荡和70-80％湿度将板在37℃下培养过夜。使用96针复制工具(Enzyscreen)，将过夜培养板用于接种装有180μl具有2.5μg/ml新霉素的MBD培养基(基于MOPS的成分确定的培养基)的新微量滴定板。基本上如本领域所知(参见Neidhardt等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，119:736-747[1974])来制备MBD培养基，例外的是在基础培养基中省掉NH4Cl2、FeSO4和CaCl2，使用3mMK2HPO4，并且基础培养基补充有60mM尿素和100ml由210g/l葡萄糖和350g/l麦芽糖糊精制成的溶液。添加1g/lBD细菌用酵母抽提物并用KOH将pH调节至7.4。补足微量营养素，营养素为100X储备溶液，其1升含有400mgFeSO4·7H2O、100mgMnSO4·H2O、100mgZnSO4·7H2O、50mgCuCl2·2H2O、100mgCoCl2·6H2O、100mgNaMoO4·2H2O、100mgNa2B4O7·10H2O、10ml1MCaCl2和10ml0.5M柠檬酸钠。使用Enzyscreen盖(Enzyscreen)，将装有MBD培养基的微量滴定板在37℃、250-300rpm和70-80％湿度下培养64小时，以进行蛋白酶变体表达。第二天，将培养物滤过微过滤器板(0.22um；Millipore)，将所得的含有蛋白酶变体的滤液用于生化分析。
在16℃和pH8的洗涤剂组合物1中用BMI微样本测定法测试蛋白酶变体的清洁性能，以及在16℃和pH8的洗涤剂组合物2中用BMI微样本测定法测试蛋白酶变体的清洁性能。用TCA测定法测定蛋白质含量。如实施例1中所述进行测定法并计算相对于BPN'-v3(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’枯草杆菌蛋白酶变体相对于BPN’-v3(SEQIDNO:4)具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2至约5，或大于1.0至约5的PI值：包含氨基酸置换组G097A-G128A-P210S-Y217Q的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这种变体在这个BMI微样本清洁测定法中相对于BPN’-v3的PI值为1.1，且在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比较具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体具有包含氨基酸置换G097A-G128A-P210S-Y217Q的氨基酸序列，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。还包括的是在这个测定法中与SEQIDNO:2相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸置换G097A-G128A-P210S-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还提供的是在BMI微样本清洁测定法中，与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或具有大于BPN’(SEQIDNO:2)和/或BPN'-v3的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含置换X097A-X128A-X210S-X217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号，并且任选其中该变体包含至少一个选自G097A、G128A、P210S和Y217Q的置换。这种蛋白酶变体可以是分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体。还包括的是包含这种蛋白酶变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用这种变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-Y217Q、G097A-G128A-E156S-P210S-Y217Q、G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218A、G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218S和G097A-Y104F-G128A-E156S-P210I-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这种变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中，与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还提供的是在这个BMI微样本清洁测定法中，与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v3相比具有约1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X097A、X104F、X128A、X156A/S、X210I/S、X217Q、X218A/S的置换和任选至少一个选自G097A、Y104F、G128A、E156A/S、P210I/S、Y217Q和N218A/S的置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-E156A-P210S-Y217Q-N218S和G097A-G128A-Y217Q-N218A，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或相比于BPN’具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218A和G097A-G128A-P210S-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。还提供的是在这个BMI微样本清洁测定法中，与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v3相比具有大于1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X097A、X104F、X128A、X156A/S、X210I/S、X217Q、X218A/S的置换和任选至少一个选自G097A、Y104F、G128A、E156A/S、P210I/S、Y217Q和N218A/S的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-Y217Q(即BPN’-v3)、G097A-G128A-E156S-P210S-Y217Q和G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218S，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’相比具有蛋白水解活性和增强的蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有1.0的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-E156A-P210S-Y217Q-N218S、G097A-G128A-Y217Q-N218A和G097A-Y104F-G128A-E156S-P210I-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例3
BPN’-v3+S78N的变体的组合文库产生和清洁性能
a)BPN’-v3+S78N变体和衍自这个变体的合成基因序列的描述
GeneOracle合成了八个基因并克隆进pHPLT-BPN’-v3+S78N(BPN’-S78N-G97A-G128A-Y217Q)亲本质粒(参见图2)中。将这些基因中的一些用作模板(亲本)以产生组合文库。BPN’-v3+S78N变体用本领域已知的标准分子生物学方法产生。编码BPN’-v3+S78N变体的核苷酸序列在下面示出：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATTGATTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAG(SEQIDNO:7)
BPN’-v3+S78N变体的氨基酸序列在下面示出：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNNIGVLGVAPSASLYAVKVLAADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:8)
基因GcM90-96以及GcM100的核苷酸和蛋白质序列在下面示出。合成的基因GcM90的核苷酸序列是：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGGGAGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGCAGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGATCAGCACAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGCAACAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATACACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA(SEQIDNO:9)
GcM90的氨基酸序列在下面提供：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPGETNPFQDNNSHGTHAAGTVAALNNNIGVLGVAPSASLYAVKVLAADGSAQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGATSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNTRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:10)
合成的基因GcM91的核苷酸序列在下面提供：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTGTCGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGATTGTCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTCAAGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGCAAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAACAAACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA(SEQIDNO:11)
GcM91的氨基酸序列在下面提供：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFVDNNSHGTHVAGTVAALNNNIGVLGVAPSASLYAVKVLAADGSGQYSWIVNGIEWAIANNMDVINMSLGAPSGSAALKAAVDKAVASGQVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPANKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLEQTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:12)
合成的基因GcM92的核苷酸序列在下面提供：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATGCAAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGGAAGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATCAGCCTGGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGACCTTCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCGCACCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA(SEQIDNO:13)
GcM92的氨基酸序列在下面提供：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDANSHGTHVAGTVAALNNNIGVLGVAPEASLYAVKVLAADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINISLGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGPSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMAAPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:14)
合成的基因GcM93的核苷酸序列在下面提供：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACCAATCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACAACTCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGGCACTGGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACAGATGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGTCATGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA(SEQIDNO:15)
GcM93的氨基酸序列在下面提供：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNQSHGTHVAGTVAALNNNIGVLGVAPSASLYAVKVLAADNSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMALGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTDGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPSWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:16)
合成的基因GcM94的核苷酸序列在下面提供：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATACACATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGAGCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCGTCGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTACAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACAACCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA(SEQIDNO:17)
GcM94的氨基酸序列在下面提供：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNTHGTHVAGTVAALNNNIGVLGVAPSASLYAVKVLAADGAGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSVGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSTNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNNQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:18)
合成的基因GcM95的核苷酸序列在下面提供：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCTGGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGGGAGAAACAAACCCGTTTGTCGATGCACAAACACATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGGAAGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACAACGCAGCACAATACTCATGGATTGTCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA(SEQIDNO:19)
GcM95的氨基酸序列在下面提供：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHLDLKVAGGASMVPGETNPFVDAQTHGTHVAGTVAALNNNIGVLGVAPEASLYAVKVLAADNAAQYSWIVNGIEWAIANNMDVINMSLGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:20)
合成的基因GcM96的核苷酸序列在下面提供：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGCAACAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTCAAGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACAGATGGACCTTCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTACAAATACACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGCAAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCGCACCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGTCATGGACAAACAACCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAACAAACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA(SEQIDNO:21)
GcM96的氨基酸序列在下面提供：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNNIGVLGVAPSASLYAVKVLAADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGATSGSAALKAAVDKAVASGQVVVAAAGNEGTDGPSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSTNTRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPANKYGAQNGTSMAAPHVAGAAALILSKHPSWTNNQVRSSLEQTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:22)
合成的基因GcM100的核苷酸序列在下面提供：
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGCAGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATAATATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGATCAGCACAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGGCACTGGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGCAAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA(SEQIDNO:23)
GcM100的氨基酸序列在下面提供：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHAAGTVAALNNNIGVLGVAPSASLYAVKVLAADGSAQYSWIINGIEWAIANNMDVINMALGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPANKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:24)
b)使用合成的基因GcM90-94和GcM100构建组合文库CG1-CG5和 CG8
将每个合成的基因构建进pHPLT-BPN’-S78N-G97A-G128A-Y217Q亲本分子中。所得的含有6个合成的基因GcM90-94以及GcM100的质粒充当模板来制备在各个位置的组合物文库(表3-1)。还合成了两个另外的基因(GcM95和GcM96)用于分析，但不充当文库的亲本DNA。这些基因每一者在pHPLT-BPN’-S78N-G97A-G128A-Y217Q亲本分子之上具有九个突变。
根据甲基化酶(NEB)方案，使用两微克DNA和NEB将含有合成的基因GcM90-94和GcM100的亲本质粒(模板DNA)进行甲基化。然后用DNA纯化与浓缩试剂盒(DNACleanandConcentratorkit)(ZymoResearch)纯化甲基化的DNA。使用多定点诱变试剂盒(MultiSite-DirectedMutagenesiskit)(“QCMS试剂盒”；Stratagene)按照生产商的方案制备组合文库CG1-5和CG8(关于各模板和引物组合参见表3-1)，但文库CG3和CG4例外，其使用86.5ng的每种引物来替代该方案中建议的50ng。用于在每个文库中引入所需置换的所有引物在表3-1中列出。它们由IntegratedDNATechnologies公司合成和提供。在每个文库的QCMS反应完成后，通过添加0.5-1μlDpnI(来自QCMS试剂盒)并在37℃下温育1-4小时，然后另外添加0.5-1μlDpnI并在37℃下再温育1-4小时来消化模板DNA。为了有效转化枯草芽孢杆菌，如实施例2中所述扩增来自QCMS反应混合物的DNA，然后进行转化和培养转化株。
由DNA2.0制备BPN’-v3+S78N的另外的变体。将以下置换分别引入BPN’-v3+S78N亲本分子中：Q59G、N62Q、V68A、S89Y、A92G、I108V、I115V、M124T、P129L、A138T、V147L、S161P、Y167A、P172V、G211T、L267V和A273S。
在16℃和pH8的洗涤剂组合物1中使用BMI微样本测定法以及在16℃和pH8的洗涤剂组合物2中使用BMI微样本测定法，对所有上述组合文库变体和在DNA2.0合成的变体进行测试。用TCA测定法测定蛋白质含量。如实施例1中所述进行测定法并计算相对于BPN'-v3(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q-T244N、N061A-S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A、S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Q185T-Y217Q、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q-T244I和S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’和BPN’-v3的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X040E、X053G、X059V、X061A、X062H/Q、X068A、X078N、X087E、X101A、X102A、X108V、X124I、X125A、X126V、X129T、X147Q、X159D、X183T、X185T、X211A、X224A、X244I/N、X252Q和X274D的置换和任选至少一个选自X040E、X053G、X059V、X061A、X062H/Q、X068A、X078N、X087E、X101A、X102A、X108V、M124I、S125A、L126V、P129T、V147Q、S159D、S183T、Q185T、G211A、S224A、T244I/N、N252Q和A274D的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-Y217Q、N061A-S078N-S087E-G097A-G128A-Y217Q-S224A、Q059V-S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q、Q059V-S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q、Q059V-S078N-G097A-G128A-Y217Q、Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-Y217Q-N252Q、S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q、S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q、S078N-G097A-G128A-Q185T-Y217Q、S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q、S078N-G097A-G128A-Y217Q、S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A和S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A-A274D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含氨基酸置换组S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q-N252Q和S078N-S087E-G097A-M124I-G128A-Y217Q-S224A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q-T244N、S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q和S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q-T244I，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于约1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-Y217Q、N061A-S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A、N061A-S078N-S087E-G097A-G128A-Y217Q-S224A、Q059V-S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q、Q059V-S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q、Q059V-S078N-G097A-G128A-Y217Q、Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-Y217Q-N252Q、S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Q185T-Y217Q、S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q、S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q、S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q、S078N-G097A-G128A-Q185T-Y217Q、S078N-G097A-G128A-Y217Q、S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A和S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A-A274D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q和S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种这类变体清洁需要清洁的物品或表面的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q、S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q-N252Q和S078N-S087E-G097A-M124I-G128A-Y217Q-S224A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种这类变体清洁需要清洁的物品或表面的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例4
BPN’变体的产生和清洁性能
通过 多定点诱变产生BPN’变体LC1-LC4
使用多定点诱变试剂盒从不同亲本质粒构建BPN’变体。使用NEBDam甲基化酶试剂盒(DamMethylaseKit)使亲本质粒(表4-1)在在37℃下含有77.5μlH20+10μL缓冲液10X+0.25μlSAM+2μlDAM甲基化酶+10μlminiprepDNA(约150ng/μL)的反应中进行甲基化过夜。用PCR纯化试剂盒纯化甲基化的质粒DNA。对每一个DNA模板在含有2.5μL缓冲液5X+0.5μl引物1(25μM)+0.5μl引物2(25μM)+1μldNTP+1μl酶混合物+18μlH2O+1.5μlDNA的反应混合物中建立多定点诱变反应。使用的PCR程序为：95℃1分钟；(95℃1分钟，53℃1分钟，65℃9:39分钟)×29个循环；65℃10分钟，保持4℃。引物序列在表4-2中示出。在所有反应中，用MJResearchPTC-200Peltier热循环仪进行PCR。通过将1μlDpnI添加至多定点诱变反应在37℃下过夜来从PCR样品移除亲本DNA。为了增加转化频率，使用IllustraTempliPhi试剂盒根据生产商的方案用滚环扩增法(RCA)扩增经DpnI消化的反应物。用1μl每种RCA反应物转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)，将转化的细胞平板接种至含有10ppm新霉素的LA+1.6％脱脂乳板上，并在37℃下温育过夜。选取来自过夜生长的菌落以使用“puReTaqReady-To-GoPCRBeads”(Amersham)进行菌落PCR用于测序。所使用的PCR和测序引物为pHPLTF1(/5PHOS/TACATATGAGTTATGCAGTTTG(SEQIDNO:54))和pHPLTseqR1(/5PHOS/TTATCCTTTACCTTGTCTC(SEQIDNO:55))。将具有适当序列的克隆冷冻。如实施例2所述通过在96孔微量滴定板中在含有尿素的基于MOPS的培养基中将枯草芽孢杆菌转化株于37℃培养68小时，来生产BPN’变体蛋白。
另外的BPN’变体LC5-LC37的产生
另外的33个BPN’变体(依次称为LC5至LC37)由DNA2.0用BPN’核酸作为包含在表达质粒pHPLT-BPN’partialopt(参见图3)中的亲本基因来产生。LC5至LC37BPN’变体分别如下：BPN'-P52L-V68A-G97A-I111V、BPN'-I111V-M124V-Y167A-Y217Q、BPN'-Y104N-G128A-Y217Q、BPN'-M124V-Y167A-Y217Q、BPN'-I111V-M124V-Y217Q、BPN'-P52L-V68A-G97A、BPN'-G97A-I111V-M124V、BPN'-V68A-A92G-G97A、BPN'-G97A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q、BPN'-P52L-V68A-I111V-Y217Q、BPN'-P52L-V68A-I111V、BPN'-V68A-A92G-I111V、BPN'-P52L-V68A-G97A-I111V-Y217Q、BPN'-V68A-G97A-I111V、BPN'-G97A-I111V-Y217Q、BPN'-G97A-I111V-M124V-Y167A、BPN'-S89Y-I111V-M124V、BPN'-V68A-S89Y-I111V、BPN'-V68A-A92G-Y217Q、BPN'-I111V-Y167A-Y217Q、BPN'-G97A-I111V-Y167A-Y217Q、BPN'-G97A-I111V-M124V-Y217Q、BPN'-V68A-I111V-Y167A-Y217Q、BPN'-I111V-G128A-Y217Q、BPN'-G97A-M124V-Y217Q、BPN'-V68A-Y167A-Y217Q、BPN'-I111V-M124V-Y167A、BPN'-N62Q-G97A-I111V、BPN'-G97A-M124V-Y167A-Y217Q、BPN'-G97A-L126A-Y217Q、BPN'-V68A-I111V-Y217Q、BPN'-S89Y-M124V-Y217Q和BPN'-L96T-G97A-Y217Q。质粒pHPLT-BPN’partialopt也由DNA2.0产生。
将转化株挑选进微量滴定板中并如实施例2所述进行培养。在16℃和pH8的洗涤剂组合物2中用BMI微样本测定法测定变体的清洁性能。用TCA测定法测定蛋白质含量。如实施例1中所述进行测定法并计算相对于BPN'-v3(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-I111V-M124V-Y217Q、G097A-I111V-Y167A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-V203Y-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q和V068A-A092G-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还提供的是在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v3a相比具有大于1.0至约5的PI值的的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X024G、X025G、X052L、X053G、X055P、X061P、X062Q、X068A、X089Y、X092G、X096T、X097A、X101N、X104N、X111V、X124V、X126A、X128A/S、X167A、X203Y和X217Q的置换和任选至少一个选自S024G、N025G、P052L、S053G、T055P、N061P、N062Q、V068A、S089Y、A092G、L096T、G097A、S101N、Y104N、I111V、M124V、L126A、G128A/S、Y167A、V203Y和Y217Q的置换，并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-Y217Q、G097A-G128S-Y217Q、G097A-I111V-Y217Q、I111V-G128A-Y217Q、I111V-M124V-Y167A、I111V-M124V-Y217Q、L096T-G097A-Y217Q、N062Q-G097A-I111V、S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q、S089Y-M124V-Y217Q和V068A-I111V-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、具有高于BPN’的PI值并且与BPN’-v3相比具有约1.0的PI值。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-I111V-M124V、G097A-L126A-Y217Q、G097A-M124V-Y217Q、I111V-Y167A-Y217Q、M124V-Y167A-Y217Q、P052L-V068A-G097A、S089Y-I111V-M124V、V068A-A092G-G097A、V068A-A092G-I111V、V068A-G097A-I111V、V068A-S089Y-I111V、和Y104N-G128A-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物2中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-M124V-Y167A-Y217Q、V068A-Y167A-Y217Q、G097A-I111V-M124V-Y167A、I111V-M124V-Y167A-Y217Q、V068A-I111V-Y167A-Y217Q、G097A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q和P052L-V068A-I111V，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例5
BPN’变体的清洁性能
基于亲本BPN’的变体由DNA2.0制备。将变体如实施例2中所述进行培养，并在16℃和pH8的洗涤剂组合物1中用BMI微样本测定法、在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中用BMI微样本测定法和在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中用蛋微样本测定法来测试清洁性能。用TCA测定法测定蛋白质含量。如实施例1中所述进行测定法并计算相对于BPN'-v3(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-Y217Q、G097A-G128A-P210S-Y217Q、G097A-G128S-P210S-Y217Q、G097A-I111V-M124I-Y217Q、G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q、G097A-N123Q-P210S-Y217Q、G097A-N123Q-Y217Q、N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q、N061P-G097A-G128S-Y217Q、N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q、N061P-G097A-N123Q-Y217Q、N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、N061P-G102A-P129S-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q、N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q、N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q、N062Q-G097A-I111V-Y217Q、N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q、S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q、S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q、S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q、S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、S053-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q、S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q、S078N-G097A-G128S-Y217Q和S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：N061P-G097A-M124I-Y217Q、N061P-G097A-M124V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q、N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q、N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q和S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物1或4中，在BMI微样本清洁测定法中与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v3相比具有大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X024G、X025G、X053G、X061P、X062Q、X078N、X097A、X100D/N/Q、X101N、X102A、X111V、X123A/Q/V、X124I/V、X128A/S、X129S、X210S、X217Q的置换和任选至少一个选自S024G、N025G、S053G、N061P、N062Q、S078N、G097A、G100D/N/Q、S101N、G102A、I111V、N123A/Q/V、M124I/V、G128A/S、P129S、P210S和Y217Q的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-N123A-Y217Q、G097A-N123V-Y217Q、N061P-G102A-G128S-Y217Q、N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q、Y217Q、S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q和G102A-N123Q-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：N061P-G097A-G128S-Y217Q、N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-Y217Q、G097A-G128A-P210S-Y217Q、G097A-G128S-P210S-Y217Q、G097A-I111V-M124I-Y217Q、G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q、G097A-N123Q-P210S-Y217Q、G097A-N123Q-Y217Q、N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q、N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q、N061P-G097A-M124V-Y217Q、N061P-G097A-N123Q-Y217Q、N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、N061P-G102A-P129S-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q、N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q、N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q、N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q、N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q、N062Q-G097A-I111V-Y217Q、N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q、S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q、S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q、S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q、S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q、S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q、S078N-G097A-G128S-Y217Q和S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：N061P-G097A-M124I-Y217Q、N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q、N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q和S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-N123A-Y217Q、G097A-N123V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q、N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q、Y217Q、N061P-G102A-G128S-Y217Q、S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q和G102A-N123Q-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值：包含氨基酸置换组N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3蛋白酶变体具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸置换N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128A-Y217Q、N061P-G102A-P129S-Y217Q、N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q、N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q、G097A-G128S-P210S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q、N061P-G097A-G128S-Y217Q和G097A-G128A-P210S-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中，与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有等于或大于0.5且等于或小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：N061P-G097A-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q、G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q、G097A-N123Q-P210S-Y217Q、S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q、S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q、N062Q-G097A-I111V-Y217Q、N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、G097A-N123Q-Y217Q、N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q、S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q、S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q、S078N-G097A-G128S-Y217Q、S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q、N061P-G097A-N123Q-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q、S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q、N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q、N061P-G097A-M124V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q、N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q、S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q、N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q、G097A-I111V-M124I-Y217Q、Y217Q、N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q、S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q、N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q、N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q、G097A-N123V-Y217Q、G097A-N123A-Y217Q、G102A-N123Q-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q、S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q、N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q和N061P-G102A-G128S-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有等于或大于0.5且等于或小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v3相比具有大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X024G、X025G、X053G、X061P、X062Q、X078N、X097A、X100D/N/Q、X101N、X102A、X111V、X123A/Q/V、X124I/V、X128A/S、X129S、X210S和X217Q的置换和任选至少一个选自S024G、N025G、S053G、N061P、N062Q、S078N、G097A、G100D/N/Q、S101N、G102A、I111V、N123A/Q/V、M124I/V、G128A/S、P129S、P210S和Y217Q的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例6
BPN’变体的构建和清洁性能
基于BPN’亲本的BPN’组合文库由DNA2.0制备并作为连接反应物提供。为了有效转化枯草芽孢杆菌，如实施例2中所述扩增来自连接反应混合物的DNA，然后进行转化和培养转化株。在16℃和pH8的洗涤剂组合物1和洗涤剂组合物4中使用BMI微样本测定法以及在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用蛋微样本测定法测试这些变体的清洁性能。用TCA测定法测定蛋白质含量，用AAPF测定法测定蛋白酶活性。如实施例1中所述进行测定法并计算相对于BPN'-v3(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N、S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128S-Y217Q、G097A-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q、N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-I035V-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q、S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A、S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S101N-G128A-Y217Q、T055P-N061P-G097A-A116S-G128A和T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中，在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v3相比具有大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X024G、X025G、X035V、X038G、X053G、X055P、X061P、X078N、X097A、X101N、X116S、X128A/S、X130G、X216Q、X217Q和X249N的置换和任选至少一个选自S024G、N025G、I035V、S038G、S053G、T055P、N061P、S078N、G097A、S101N、A116S、G128A/S、S130G、Y216Q、Y217Q和S249N的置换，并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128S-Y217Q、G097A-G128A-Y217Q、N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-I035V-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A、S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A、S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N、S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S101N-G128A-Y217Q、T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：T055P-N061P-G097A-A116S-G128A和S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中具有蛋白水解活性并且与BPN’(SEQIDNO:2)相比可具有增强的蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q和S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：G097A-G128S-Y217Q、G097A-G128A-Y217Q、S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q、N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、T055P-N061P-G097A-A116S-G128A、S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q和S024G-I035V-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和包括利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A、S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N、N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.8的PI值：包含氨基酸置换S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.8的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸置换S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在AAPF蛋白水解测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1至约12、大于4至约12、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A、S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A、N061P-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q、N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q、T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N、N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、T055P-N061P-G097A-A116S-G128A、S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q、G097A-G128S-Y217Q、S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q、S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q、S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q、S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q、N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’蛋白酶(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个AAPF测定汪中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在AAPF蛋白水解测定法中测出以下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值：包含氨基酸置换G097A-G128A-Y217Q的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’蛋白酶(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个AAPF测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸置换G097A-G128A-Y217Q，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例7
BPN’-v36的位点评价文库的构建和BPN’-v36变体的清洁性能
BPN’-v36的位点评价文库的构建
BPN’-v36的氨基酸序列在下面的SEQIDNO:6中示出：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGGNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPGETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNNIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGNGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQIDNO:6)
编码BPN’-v36蛋白酶变体的核酸序列是：
Gcgcagtccgtgccttacggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacactggaggcaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgactcgagccatccagatcttaaagtcgctggaggggcttctatggtgccgggcgaaacaaacccgtttcaagataacaattctcatggcacacacgtcgcaggaacggttgcggcgttaaacaataatattggcgtgcttggtgtagccccgtctgcttcgctctacgccgttaaagttcttggcgcagacggaaatggccaatactcatggattatcaacggcatcgaatgggccatcgcgaataacatggatgtaatcaacatgagcctgggagcaccaagcggcagtgcggcacttaaagcagcagttgataaagctgttgcatctggtgtcgtcgtagtagcggcagctgggaatgagggaacatccggatcatcgagtaccgtcggttatccaggcaagtacccttcagtgattgcagtgggcgctgtagactcttcaaatcaacgtgcctctttttcctccgtgggaccggagctggatgtcatggcccctggcgtttctattcaatcgacgcttccagggaacaagtatggtgcgcaaaacgggacttccatggcctcgccgcatgtagctggggcggccgcattgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagcagtttagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaacgtacaggcggcagctcag(SEQIDNO:5)
BPN’-v36的氨基酸序列可通过参考SEQIDNO:2的枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列来表示。即，BPN’-v36可表示为具有六个氨基酸置换S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q的SEQIDNO:2的枯草杆菌蛋白酶BPN’序列。BPN’-v36氨基酸序列可便利地命名为BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q或BPN’+S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q。在本说明书通篇中，除非另外指明，否则氨基酸序列的每个氨基酸位置是根据SEQIDNO:2中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过该变体氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对确定的。
通过PCR融合在成熟BPN’-v36(即BPN’-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)蛋白质中的每一单个氨基酸位置处产生位点评价文库(SEL)。
对于BPN’-v36蛋白酶中要突变的每个密码子，设计了一对部分重叠、互补的(诱变正向和反向)引物。每个诱变引物在中间含有NNS(N＝A、C、G或T，S＝G或C)诱变密码子，该诱变密码子旁侧的每一侧有至少15个核苷酸。为了在给定位置处产生文库，用通用正向基因旁侧引物(P4974,GCCTCACATTTGTGCCACCTA；SEQIDNO:60)和诱变NNS反向引物或者通用反向基因旁侧引物(P4976,CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC；SEQIDNO:61)和诱变NNS正向引物进行两个PCR反应。这些PCR反应产生两种PCR片段，一种编码突变体BPN’-v36基因的5’半(5’基因片段)，另一种编码突变体BPN’-v36基因的3’半(3’基因片段)。
每个PCR扩增反应物含有30皮摩尔的每种引物和100ng的BPN’-v36亲本模板DNA(质粒pHPLT-BPN’-v36，参见图4)。用VentDNA聚合酶(NEB)进行扩增。一开始将该PCR反应物(20μL)在95℃下加热2.5分钟，然后30个循环的：94℃下变性15秒，55℃下退火15秒，72℃下延伸40秒。扩增后，用凝胶带纯化试剂盒(gel-bandpurificationkit)对5’和3’基因片段进行凝胶纯化，将其混合(50ng每种片段)，混合并使用引物P4973(AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC；SEQIDNO:62)和P4950(CTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAA；SEQIDNO:63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长基因片段。PCR条件与上面描述的相同，例外的是延伸阶段，其在72℃下进行2分钟。将该全长DNA片段用凝胶带纯化试剂盒进行凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制酶消化并与也用相同限制酶消化的pHPLT-BPN’partialopt载体连接。在IllustraTempliphi试剂盒中根据生产商的建议用法(GEHealthcare)利用滚环扩增对连接混合物进行扩增，以产生用于转化到枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。为此，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃3分钟并在冰上冷却。接着，将5μl反应缓冲液和0.2μl酶添加至每根管，接着在30℃下温育10小时。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样平板接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。随后，将具有晕圈的菌落接种在含有10μg/mL新霉素的150μlLB培养基中。第二天，将培养物用15％甘油冷冻或如实施例2中所述在MBD培养基中培养用于生化分析。
BPN’-v36变体的清洁性能
在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用BMI微样本测定法、在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用蛋微样本测定法，测试了来自BPN’-v36SEL的蛋白酶变体的清洁性能。用TCA测定法测定蛋白质含量。如实施例1中所述进行测定法并计算相对于BPN'-v36(即BPN’-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一个选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q(SEQIDNO:6)(即BPN’-v36)：A116V、G160S、I111L、I115V、N109S、N117M、P005G、Q059V、T164S、Y262M、A015Q、A015S、A098E、A098N、A098S、A098T、A098V、A098Y、A114S、A114T、A116G、A116L、A116S、A116T、A116W、A133G、A133H、A133T、A133V、A137G、A137I、A137L、A137S、A137T、A138S、A216E、A216F、A216V、D099S、D181E、F261A、F261Q、G024F、G024I、G024Q、G024Y、G097S、G160T、G211L、G211V、H017F、H017W、H039V、H226A、I031V、I111V、I268V、K170R、K265R、L016Q、L016T、L135M、L209T、L209V、L233M、L257T、L257V、L267A、L267V、N025A、N025I、N025Q、N025R、N025T、N025V、N101I、N101Q、N101S、N109A、N109G、N109H、N109L、N109M、N109Q、N109T、N117Q、N184A、N184L、N184T、N184W、N212G、N212L、N212V、N243P、N252G、N252M、P005T、P014S、P040G、P040L、P040Q、P129A、P129S、P172G、P172S、P194Q、P210A、P210S、Q185F、Q185G、Q185I、Q185M、Q185N、Q185S、Q275H、R186K、S009A、S009G、S009H、S009M、S018T、S130T、S132N、S145K、S159T、S161I、S161K、S161N、S161T、S162I、S162M、S162Y、S163G、S182F、S182G、S182V、S182W、S183F、S183L、S183M、S183T、S183V、S183W、S224A、S236T、S249V、T022A、T022G、T022Q、T022V、T208V、T242S、T253N、T253S、T254A、T254S、T255L、T255S、T255V、V004A、V004P、V004W、V084C、V139C、V165M、V203F、Y021K、Y021N、Y021T、Y021V、Y167F、Y171F、Y214F、Y262F和Y262T，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、具有大于BPN’-v3的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一个选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001G、A001Y、A013G、A013V、A015F、A015G、A015K、A015M、A015P、A015T、A015W、A015Y、A029G、A073S、A088C、A088I、A088L、A088T、A088V、A098D、A098K、A098P、A098R、A098W、A116D、A116E、A116R、A128S、A133L、A133M、A133S、A134G、A134S、A137N、A137V、A144M、A144Q、A144S、A144T、A144V、A151C、A176S、A176T、A179S、A216G、A216L、A216P、A216Q、A216S、A216T、A216Y、A228T、A230C、A231C、A272I、A272L、A272Q、A272S、A272T、A272W、A273S、A274G、A274L、A274Q、A274T、A274V、D041E、D099G、D099N、D120A、D120K、D120Q、D120R、D120S、D140E、D181S、D259E、E054D、E156D、E156T、E251V、F261G、F261H、F261L、F261R、F261S、F261T、F261V、F261W、G007A、G007S、G020A、G020D、G020S、G024N、G024R、G024S、G024T、G024V、G024W、G053H、G053K、G053N、G053T、G097A、G097D、G097T、G131A、G131H、G131P、G131Q、G131T、G131V、G160H、G160P、G166A、G166S、G166T、G211A、G211D、G211M、G211N、G211P、G211Q、G211R、G211W、G215A、G215N、G215V、H017L、H017M、H017T、H017V、H017Y、H039A、H039C、H039N、H226F、H226I、H226M、H226S、H226V、H226Y、I035V、I079A、I079S、I079T、I079V、I079W、I108V、I115L、I122A、I234L、I234V、K012R、K027R、K136R、K141F、K213W、K237R、K256R、K265Q、L016A、L016F、L016I、L016S、L016V、L042I、L075A、L075M、L075Q、L075V、L075Y、L082K、L082M、L082Q、L082V、L090I、L196I、L196V、L209Q、L209W、L233A、L233Q、L233V、L235I、L235K、L250I、L257A、L257H、L257Q、L257S、L257Y、L267Q、L267R、L267S、L267T、M199V、N025F、N025G、N025H、N025K、N025L、N025M、N025S、N025Y、N061F、N061H、N061P、N061S、N061T、N061V、N061W、N076G、N076W、N078S、N078T、N078V、N101A、N101H、N101L、N101T、N109K、N109R、N117A、N117E、N117H、N117K、N118G、N184G、N184H、N184I、N184S、N184V、N212A、N212F、N212I、N212K、N212P、N212Q、N212S、N212Y、N218A、N218H、N218L、N218S、N240E、N240H、N240L、N240R、N240T、N243A、N243Q、N243T、N243V、N252A、N252K、N252L、N252Q、N252R、N252S、N252T、N269Q、N269S、P014G、P014Q、P014T、P040A、P040H、P040S、P040T、P040V、P040Y、P086A、P086C、P086F、P086H、P086S、P129D、P129G、P129K、P129T、P172A、P172Q、P194A、P194G、P194L、P194M、P194S、P194V、P194Y、P210G、P210R、P210V、Q002A、Q002S、Q010A、Q010F、Q010H、Q010I、Q010L、Q010N、Q010S、Q010T、Q019A、Q019G、Q019N、Q019S、Q019T、Q019V、Q019W、Q059I、Q103L、Q103S、Q185A、Q185H、Q185L、Q185T、Q185Y、Q206P、Q206S、Q206Y、Q217I、Q217N、Q217S、Q217T、Q245K、Q275D、Q275S、Q275W、S003A、S003G、S003H、S003M、S003P、S003Q、S003T、S003V、S009I、S009L、S009P、S009T、S009W、S018A、S018G、S018I、S018L、S018M、S018N、S018P、S018V、S018W、S033T、S037Q、S037T、S037V、S038G、S038H、S038K、S038Q、S038T、S063K、S063N、S063Q、S063T、S087A、S087F、S087G、S087Q、S087T、S089L、S089M、S089N、S089Q、S089T、S089W、S130A、S130F、S130G、S130L、S130V、S145A、S145H、S145M、S145V、S159A、S159G、S159H、S159Q、S159R、S161A、S161G、S161H、S161L、S161M、S161P、S161Q、S161W、S162A、S162F、S162G、S162L、S162N、S162P、S162R、S162V、S163P、S173A、S173G、S182A、S182H、S182K、S182L、S182N、S182P、S182Q、S182T、S183A、S183G、S183H、S183Q、S188A、S188G、S188T、S188V、S191A、S204A、S204I、S204L、S204Q、S204V、S224C、S236A、S236N、S236Q、S248A、S248F、S248G、S248I、S248K、S248L、S248M、S248N、S248Q、S248T、S248V、S249A、S249C、S249H、S249Q、S249T、S249W、S249Y、S260H、S260N、S260P、S260T、T022H、T022K、T022N、T022R、T022S、T022Y、T055A、T055G、T055L、T055N、T055P、T055Q、T071S、T158H、T158S、T164N、T208C、T208L、T220S、T242N、T244A、T244G、T244H、T244I、T244Q、T244S、T244V、T244W、T253A、T253G、T253H、T253Q、T254V、T255A、T255G、T255H、T255I、T255Q、T255Y、V004G、V004N、V004R、V008A、V008C、V008M、V026I、V044I、V044L、V045H、V045K、V045L、V045M、V045Q、V045S、V045V、V045W、V045Y、V051I、V081L、V081Q、V081T、V084A、V084S、V084T、V093I、V121I、V143N、V143S、V143Y、V147C、V147I、V147L、V147T、V180I、V180L、V180T、V192A、V192S、V192T、V198I、V198L、V198M、V203H、V203I、V203L、V203N、V203Q、V203T、V203W、V203Y、V270A、V270S、V270T、W241M、W241Y、Y006G、Y006H、Y006I、Y006K、Y006L、Y006P、Y006Q、Y006T、Y006V、Y006W、Y021A、Y021D、Y021E、Y021L、Y021Q、Y021R、Y021S、Y104F、Y104I、Y214L、Y214V、Y214W、Y262A、Y262G、Y262L、Y262N、Y262S、Y262W、Y263G和Y263W，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。因而，例如，本发明包括包含置换A128S的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)，例如BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128S-Y217Q。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值和/或相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值：包含至少一个选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001F、A001K、A001L、A001M、A001Q、A001R、A001S、A001T、A001V、A013C、A013S、A015D、A015E、A015L、A015R、A048S、A073N、A073T、A074G、A074S、A085C、A085G、A085S、A085V、A088M、A088S、A092S、A098G、A114G、A133P、A137E、A137H、A144G、A144H、A144K、A144L、A144N、A153S、A153V、A176C、A179G、A187G、A187S、A200G、A216W、A223S、A228S、A230T、A230V、A231V、A232C、A232V、A272E、A272G、A272K、A272P、A273G、A273L、A273V、A274M、A274R、D036E、D099A、D099Q、D120E、D181A、D181G、D259A、D259G、D259Q、D259T、E156A、E156S、E251I、E251L、E251Q、E251T、F058Y、F261C、F261D、F261K、F261P、G020E、G020F、G020H、G020L、G020N、G020Q、G020R、G020T、G020Y、G024A、G024P、G053A、G053D、G053E、G053F、G053L、G053Q、G053S、G053Y、G097K、G097M、G157A、G157S、G160A、G160L、G166C、G166I、G166Q、G169A、G211K、G215H、G215L、G215S、G215T、G215W、G258S、H017I、H039S、H226L、H238N、H238Y、I011L、I011V、I031L、I079F、I079K、I079L、I079M、I079Q、I205A、I205V、I268L、I268M、K012G、K043F、K043H、K043I、K043N、K043Q、K043T、K141A、K141R、K141W、K170A、K213A、K213G、K213H、K213I、K213L、K213N、K213Q、K213R、K213S、K213T、K213V、K237A、K237H、K237I、K237L、K237N、K237S、K256A、K256G、K256H、K256M、K256P、K256Q、K256W、K265H、L016E、L042V、L075G、L075H、L075I、L075T、L082A、L082F、L082H、L082R、L082S、L082T、L090M、L135F、L196M、L209C、L209H、L209S、L233S、L235M、L235R、L235W、L257C、L257G、L267F、M050Y、M119C、M119I、M124L、N025C、N025E、N025P、N061A、N061G、N061I、N061K、N061L、N061Q、N061R、N062S、N062T、N076A、N076P、N076Q、N076S、N076T、N076V、N078G、N078H、N078K、N078P、N078Q、N078R、N101F、N117R、N117S、N118D、N118H、N118Q、N118R、N118S、N118T、N184C、N184E、N184R、N212D、N212R、N212W、N218F、N218G、N218M、N218P、N218T、N218V、N218W、N240A、N240G、N240Q、N240S、N240W、N243C、N243G、N243S、N252V、N269H、P005A、P005D、P005M、P005Q、P014A、P014M、P014R、P014V、P040F、P040R、P040W、P129E、P129R、P172E、P172K、P194H、P194R、P194W、P201A、P201G、P210L、P239K、P239R、Q002D、Q002E、Q002G、Q002I、Q002P、Q002V、Q010D、Q010R、Q019C、Q019D、Q019E、Q019H、Q019L、Q019P、Q019R、Q059A、Q059E、Q059L、Q059S、Q059T、Q103W、Q185D、Q185K、Q185R、Q185W、Q206G、Q206H、Q206L、Q206V、Q206W、Q217E、Q217F、Q217H、Q217L、Q217V、Q245M、Q271A、Q271D、Q271G、Q271L、Q271P、Q271T、Q271Y、Q275F、Q275L、Q275P、Q275R、S003D、S003F、S003K、S003R、S009K、S018D、S018R、S037A、S037G、S037K、S037L、S037P、S038M、S063A、S063F、S063G、S063M、S063R、S063Y、S087C、S087K、S087L、S087M、S087N、S087Y、S089A、S089D、S089F、S089G、S089H、S089I、S089K、S089R、S089V、S089Y、S130D、S130E、S130K、S130W、S145G、S145L、S145R、S145T、S159D、S159L、S159W、S161E、S161R、S162C、S162E、S162W、S163A、S182E、S182R、S183C、S183D、S183P、S183R、S188D、S188P、S204G、S204Y、S207G、S224G、S224T、S236C、S236G、S248D、S248H、S248R、S249E、S249L、S249R、S260A、S260G、S260K、S260Q、S260V、S260Y、T022L、T055D、T055E、T055I、T055K、T055M、T055S、T055V、T055Y、T158A、T158G、T158L、T158Q、T158V、T164K、T164Q、T208S、T244D、T244E、T244R、T253E、T253R、T253Y、T254G、T255D、T255E、T255K、T255R、V026A、V028I、V028L、V030I、V044C、V044P、V045E、V045G、V045N、V072L、V081A、V081G、V081H、V081S、V084I、V084M、V095A、V095C、V143A、V143F、V143H、V143Q、V143T、V143W、V147A、V147Q、V147S、V148I、V148L、V149C、V149I、V149L、V165L、V180A、V180C、V180M、V192C、V192F、V192I、V192Q、V192Y、V203A、V203G、V203K、V203S、V270C、V270L、V270P、W241F、Y006A、Y006M、Y006N、Y006R、Y006S、Y021C、Y091W、Y104V、Y104W、Y262C、Y262D、Y262E、Y262H、Y262I、Y262R和Y262V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比可具有增强的蛋白水解活性和/或高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一个选自如下的氨基酸置换的BPN’-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001D、A001H、A001N、A015C、A048C、A048E、A085T、A133R、A137R、A142C、A144D、A144R、A152S、A153G、A187P、A187Q、A187T、A187V、A216R、A230S、A272R、A273H、A273T、A274H、D036N、D036S、D181H、D181T、D259N、D259P、D259S、E156G、E156H、E156L、E156Q、E156V、E251C、F189S、F189T、F189W、F189Y、F261E、G020C、G024D、G053M、G053R、G097R、G131D、G131R、G157N、G160R、G160V、G166L、G166W、G211E、G215D、G258A、G258D、G258P、I011T、I031C、I079E、I079R、I175L、I205C、K012H、K012N、K027A、K027N、K027S、K043A、K043D、K043E、K043G、K043L、K043M、K043P、K043V、K043W、K043Y、K136H、K141H、K141L、K141M、K141N、K141Q、K141T、K141V、K170G、K170S、K237T、K237V、K256D、K256S、K256T、K256V、K265N、K265S、L042F、L042M、L082E、L209A、L209E、L209G、L209R、L233G、L235V、L257D、L257E、L257P、L257R、L257W、L267E、M050L、N056D、N056S、N061C、N061D、N062A、N062H、N062L、N062V、N062Y、N076D、N076L、N076M、N078D、N078F、N101D、N101R、N118A、N212C、N212E、N218C、N218D、N218E、N252D、N252E、P014F、P014K、P057A、P057W、P172R、P194E、P201T、P210E、Q059C、Q059D、Q059R、Q185E、Q206D、Q217A、Q217K、Q217R、Q245A、Q245D、Q245E、Q245H、Q245R、Q271E、Q271F、Q271R、Q271W、Q275G、Q275I、R186I、R186L、R186V、R186W、S003E、S009C、S009E、S018C、S037D、S037E、S037H、S037R、S037Y、S038D、S038P、S038R、S038Y、S063L、S087D、S087R、S089C、S089E、S130C、S130R、S145D、S159C、S159P、S161C、S173T、S182C、S188E、S188F、S188K、S188L、S188R、S188W、S190A、S190G、S190T、S204R、S236D、S236E、S248C、S248E、S260C、S260E、S260R、T022P、T055C、T055W、T071A、T158D、T158E、T158P、T158R、T158Y、T164R、T242D、T242G、T255C、V004E、V004T、V045C、V045D、V045R、V045T、V051H、V081R、V143C、V143E、V143G、V192G、V203C、V203D、V203E、V203M、V203R、V270G、W241L、Y214H、Y214Q、A001E、A133E、A187L、A187N、A216C、A216H、A273Q、D099H、D259H、E156C、E195G、F189H、G131C、G146A、G166V、G215C、G215E、I107L、K012A、K012S、K012T、K043C、K170C、K256C、K256E、K265G、K265Y、L233E、M222F、M222S、N062Q、N076E、N078E、N184P、N218R、P005V、P014D、Q002K、Q002L、Q002R、Q010W、Q271C、R186H、S049C、S063C、S063D、S105T、S188C、S190C、S204E、T055R、T164G、V004D、V044T、V045I、V165C、V180S、Y006C、Y006D、Y006E、Y104T、A001C、A187C、A230G、A273D、A273P、D036Q、F189G、F189L、F189R、G157T、G178A、I031F、I111M、K012F、K012L、K027T、K043R、K136G、K141G、K170Q、M222A、M222L、N062R、N117G、N269C、P005W、P129V、P239A、P239H、P239T、Q059W、Q217G、Q275A、R186A、S191G、T164A、T220A、A001P、A187F、A187W、A273R、D041C、D060G、D197T、F189A、G046D、G157P、K012C、K012E、K012W、L042C、M222T、N062C、P239G、P239N、Q217C、R186M、S049T、S089P、S125A、S173V和V044A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一个选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A216E、L090I、A098R、A098W、A098Y、A116G、A116R、A116S、A133M、I107L、I115V、M124L、N101I、N109H、N109S、N109T、N117R、P005G、Q185L、S089V、V095A、A015Y、A029G、A098D、A098E、A098G、A098N、A098S、A098T、A098V、A114S、A114T、A116E、A116L、A116T、A116V、A133H、A133L、A133S、A137G、A137I、A137L、A137S、A137V、A138S、A144S、A144V、A176S、A176T、A187T、A216F、A216P、A216Q、A216R、A216S、A216T、A216V、A216Y、D041E、D120A、D120E、D120Q、D120R、D120S、D181S、G020A、G020S、G024A、G097A、G097D、G097S、G131Q、G160S、G166I、G211L、G215N、H039N、H238N、I111L、I111V、I122A、L075I、L075Q、L135M、L209T、L209V、L233V、L235M、L235R、L257A、M119I、N025A、N025G、N025T、N061K、N101F、N101H、N101L、N101Q、N101R、N101S、N101T、N109A、N109G、N109K、N109L、N117E、N117H、N117K、N117S、N212G、N212S、N218F、N218G、N218H、N218L、N218S、N218W、N240Q、N252M、N252R、N252S、P005T、P040A、P040G、P040T、P129D、P129S、P194S、P210R、Q019R、Q019W、Q103L、Q103W、Q185A、Q185G、Q185M、Q185R、Q185T、Q206G、Q206Y、Q217A、Q217E、Q217R、Q217S、Q217T、S003Q、S009H、S018M、S033T、S130A、S130F、S130G、S130T、S130V、S145T、S159A、S161N、S161T、S162V、S162Y、S182L、S182W、S183F、S183L、S183V、S183W、S188K、S188W、S236Q、S236T、S248L、T022H、T022K、T208C、T253H、T255V、V044I、V121I、V139C、V143H、V143Q、V143T、V143W、V143Y、Y006K、Y021A、Y104W、A001F、A001G、A001H、A001K、A001L、A001Q、A001S、A001Y、A013V、A015G、A015K、A015R、A015S、A015T、A015W、A048S、A073N、A073S、A092S、A098K、A098P、A116D、A116W、A128S、A133P、A133T、A133V、A134G、A134S、A137H、A137N、A137T、A144D、A144K、A144L、A144M、A144N、A144R、A179G、A179S、A187V、A216G、A216L、A216W、A223S、A230C、A272K、A272L、A272P、A272S、A272T、A272W、A273G、A273S、A274G、A274M、A274T、D120K、D140E、D181A、D181E、D181G、D181H、D181T、D259E、D259N、D259Q、E054D、E156D、E156T、E251L、E251T、E251V、F058Y、F189W、F261K、F261Q、F261R、G007A、G007S、G020F、G020H、G020N、G020Q、G020T、G020Y、G024F、G024Q、G024R、G024T、G024V、G024W、G024Y、G053T、G097K、G097M、G097R、G097T、G131A、G131H、G131P、G131R、G131T、G131V、G160H、G160T、G166C、G166Q、G166S、G166T、G211A、G211D、G211K、G211M、G211N、G211Q、G211R、G211V、G211W、G215S、G215T、G215W、H017T、H017W、H017Y、H039V、H226A、H226F、H226I、H226L、H226M、H226V、I035V、I079A、I079S、I108V、I205V、I234L、I234V、I268V、K012S、K043P、K136H、K136R、K141A、K141F、K141T、K141W、K170A、K170G、K170R、K213A、K213R、K213S、K237A、K237H、K237L、K237S、K237V、K256A、K256G、K256H、K256M、K256P、K256Q、K256R、L016A、L016Q、L016T、L016V、L042V、L075M、L075T、L082M、L082V、L135F、L196I、L209H、L209Q、L209R、L209S、L209W、L233A、L233M、L233Q、L235I、L235K、L250I、L257S、L257T、L257V、L267A、L267Q、L267T、L267V、M119C、M199V、N025C、N025E、N025F、N025I、N025K、N025L、N025M、N025Q、N025V、N025Y、N061F、N061P、N061S、N061T、N076G、N078S、N101A、N109M、N109Q、N109R、N117A、N117M、N117Q、N118D、N118G、N118H、N118Q、N118R、N118S、N184A、N184C、N184G、N184L、N184R、N184S、N184T、N184V、N184W、N212C、N212F、N212I、N212K、N212L、N212P、N212Q、N212R、N212V、N212W、N212Y、N218A、N218P、N218T、N240A、N240E、N240G、N240H、N240L、N240R、N240S、N240T、N243C、N243Q、N243T、N243V、N252A、N252G、N252K、N252Q、P014G、P014Q、P014R、P014S、P014T、P040F、P040L、P040Q、P040S、P040V、P086C、P086H、P086S、P129A、P129E、P129G、P129K、P129R、P172A、P172K、P172Q、P172S、P194A、P194G、P194H、P194L、P194M、P194Q、P194R、P194V、P194W、P194Y、P210A、P210G、P210L、P210S、P239K、P239R、Q002A、Q002S、Q010A、Q010N、Q010R、Q010T、Q019A、Q019C、Q019D、Q019G、Q019S、Q019T、Q019V、Q059I、Q059V、Q103S、Q185F、Q185H、Q185I、Q185K、Q185N、Q185S、Q185Y、Q206H、Q206L、Q206P、Q206W、Q217F、Q217H、Q217I、Q217K、Q217L、Q217N、Q217V、Q271G、Q271R、Q271T、Q275F、Q275P、Q275R、R186A、R186I、R186K、S003A、S003F、S003G、S003H、S003K、S003R、S003T、S009T、S018N、S018T、S037G、S037T、S037V、S038G、S038Q、S063N、S063Q、S063T、S089M、S089N、S130K、S130L、S130R、S130W、S132N、S145G、S145K、S145M、S145R、S145V、S159C、S159H、S159L、S159Q、S159R、S159T、S159W、S161A、S161C、S161G、S161H、S161I、S161K、S161P、S161Q、S161R、S162F、S162G、S162I、S162L、S162M、S162N、S162P、S162R、S163G、S173A、S173G、S182F、S182G、S182K、S182N、S182Q、S182V、S183A、S183M、S183Q、S183R、S183T、S188A、S188F、S188G、S188P、S188R、S188T、S188V、S190C、S204A、S204G、S204I、S204L、S204Q、S204R、S204V、S207G、S224A、S224T、S236C、S236D、S236E、S236G、S236N、S248A、S248F、S248K、S248M、S248T、S249A、S249R、S249T、S249V、S249W、S249Y、S260G、S260H、S260K、S260N、T022A、T022G、T022Q、T022S、T022V、T022Y、T055A、T055K、T158A、T158S、T208L、T208S、T208V、T220S、T242D、T242N、T242S、T244E、T244G、T244I、T244R、T244V、T244W、T253A、T253G、T253N、T253S、T254S、T254V、T255H、T255I、T255K、T255L、T255Q、T255R、T255S、T255Y、V004A、V004N、V004P、V004W、V008A、V008M、V026I、V045S、V045W、V051I、V081Q、V081T、V084C、V093I、V095C、V143A、V143E、V143F、V143N、V143S、V147I、V147L、V147S、V147T、V148I、V149C、V149I、V165M、V180A、V180C、V180I、V180L、V180T、V192A、V192C、V192I、V192S、V192T、V192Y、V198L、V203A、V203F、V203K、V203L、V203M、V203N、V203Y、W241Y、Y006A、Y006G、Y006H、Y006L、Y006N、Y006P、Y006Q、Y006T、Y021E、Y021K、Y021L、Y021N、Y021Q、Y021R、Y021S、Y021T、Y104F、Y104I、Y104V、Y171F、Y214F、Y214L、Y214W、Y262F和Y262S，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一个选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001D、A001M、A001N、A001R、A001T、A001V、A013C、A013G、A013S、A015D、A015F、A015L、A015M、A015P、A015Q、A074G、A074S、A085S、A085T、A085V、A088C、A088L、A088S、A088T、A088V、A133E、A133G、A133R、A137E、A144G、A144H、A144Q、A144T、A151C、A152S、A153G、A153S、A153V、A176C、A187G、A187Q、A187S、A200G、A228S、A228T、A230T、A230V、A231C、A231V、A232C、A232V、A272E、A272G、A272I、A272Q、A272R、A273L、A273V、A274L、A274Q、A274R、A274V、D036E、D259A、D259G、D259P、D259S、D259T、E156A、E156S、E156V、E195G、E251C、E251I、E251Q、F189Y、F261A、F261G、F261H、F261L、F261P、F261S、F261T、F261V、F261W、G020C、G020D、G020E、G020L、G020R、G024D、G024I、G024N、G024P、G024S、G053A、G053D、G053F、G053H、G053K、G053N、G053S、G053Y、G157A、G157S、G160A、G160L、G160P、G160R、G166A、G166L、G166V、G166W、G169A、G211E、G211P、G215A、G215D、G215E、G215H、G215V、G258D、G258S、H017F、H017I、H017L、H017M、H017V、H039C、H226S、H226Y、I011T、I011V、I031C、I031L、I031V、I079F、I079K、I079L、I079M、I079Q、I079R、I079T、I079V、I079W、I115L、I205A、I205C、I268L、K012R、K012T、K027R、K043A、K043E、K043F、K043H、K043I、K043M、K043N、K043Q、K043T、K043V、K043Y、K141H、K141Q、K141V、K170S、K213G、K213H、K213I、K213L、K213N、K213Q、K213T、K213W、K237I、K237N、K237R、K237T、K256C、K256E、K256S、K256T、K256V、K256W、K265H、K265R、L016E、L016F、L016I、L016S、L042I、L042M、L075A、L075H、L075Y、L082K、L082Q、L082T、L196M、L196V、L209A、L209C、L209E、L209G、L235W、L257C、L257H、L257Q、L257Y、L267E、L267F、L267R、L267S、M050Y、N025H、N025P、N025S、N056D、N061A、N061C、N061D、N061G、N061H、N061I、N061L、N061Q、N061R、N061V、N061W、N062A、N062S、N062V、N076A、N076E、N076L、N076M、N076Q、N076S、N076T、N076W、N078G、N078H、N078K、N078P、N078Q、N078T、N101D、N118A、N118T、N184E、N184H、N184I、N212A、N212D、N212E、N218C、N218D、N218E、N218M、N218R、N218V、N240W、N243A、N243G、N243P、N243S、N252D、N252E、N252L、N252T、N252V、N269S、P005A、P005D、P005M、P005Q、P014A、P014D、P014F、P014M、P014V、P040H、P040R、P040W、P040Y、P086A、P129T、P172E、P172G、P172R、P194E、P201A、P201G、P210E、P210V、Q002E、Q002G、Q010D、Q010F、Q010H、Q010I、Q010L、Q010S、Q019E、Q019H、Q019N、Q059A、Q059L、Q059R、Q059S、Q059T、Q185D、Q185E、Q206D、Q206S、Q206V、Q217G、Q245D、Q245E、Q245K、Q245M、Q245R、Q271A、Q271F、Q271P、Q271Y、Q275D、Q275H、Q275I、Q275L、Q275S、Q275W、R186H、R186L、R186V、R186W、S003D、S003E、S003M、S003P、S003V、S009A、S009E、S009G、S009I、S009K、S009M、S009P、S009W、S018A、S018G、S018I、S018L、S018P、S018R、S018V、S018W、S037A、S037D、S037Q、S037R、S037Y、S038D、S038H、S038K、S038M、S038R、S038T、S063A、S063G、S063K、S063M、S063R、S087A、S087D、S087F、S087G、S087Q、S087T、S089A、S089C、S089H、S089I、S089K、S089L、S089Q、S089R、S089T、S089Y、S130D、S130E、S145A、S145H、S145L、S159G、S161E、S161L、S161M、S161W、S162A、S162C、S162E、S162W、S163P、S173T、S182A、S182C、S182E、S182H、S182R、S182T、S183C、S183D、S183G、S183H、S188C、S188D、S188E、S188L、S190T、S191A、S204Y、S224C、S236A、S248C、S248D、S248G、S248I、S248N、S248Q、S248R、S248V、S249C、S249H、S249L、S249Q、S260A、S260C、S260E、S260P、S260Q、S260R、S260T、T022L、T022N、T022R、T055C、T055D、T055G、T055I、T055L、T055N、T055Q、T055S、T055V、T055Y、T071A、T071S、T158G、T158H、T158L、T158P、T158Q、T158R、T158V、T158Y、T164N、T164S、T244A、T244D、T244H、T244Q、T244S、T253Q、T253R、T253Y、T254A、T254G、T255A、T255D、T255E、V004E、V004G、V004R、V008C、V026A、V028L、V030I、V044C、V045D、V045E、V045H、V045M、V045Q、V045Y、V072L、V081L、V081S、V084A、V084I、V084M、V084T、V143C、V147C、V147Q、V149L、V165L、V180M、V192F、V192G、V192Q、V198I、V198M、V203C、V203E、V203H、V203I、V203Q、V203R、V203T、V203W、V270A、V270L、V270T、W241F、W241M、Y006C、Y006D、Y006E、Y006I、Y006M、Y006R、Y006S、Y006V、Y006W、Y021C、Y021D、Y021V、Y091W、Y167F、Y214V、Y262A、Y262C、Y262I、Y262M、Y262R、Y262T、Y262V和Y262W，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值和/或相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值：包含至少一个选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E、A015C、A015E、A048C、A048E、A073T、A085C、A085G、A088I、A088M、A114G、A137R、A187L、A187N、A187P、A187W、A216C、A230S、A273D、A273H、A273T、D036N、D099N、D259H、E156C、E156G、E156H、E156Q、F189H、F189R、F189S、F189T、F261C、F261D、F261E、G053E、G053M、G053Q、G131C、G131D、G157N、G160V、G215C、G215L、G258A、H039A、I011L、I079E、I268M、K012A、K012G、K012H、K012N、K027N、K043C、K043D、K043G、K043L、K043W、K136G、K141G、K141L、K141M、K141N、K141R、K170C、K170Q、K213V、K256D、K265G、K265N、K265Q、K265S、L082A、L082F、L082H、L082R、L082S、L090M、L233S、L235V、L257E、L257G、L257R、L257W、M222S、N025R、N062H、N062T、N076D、N076P、N078D、N078E、N078F、N078R、N078V、N269H、N269Q、P014K、P057A、P086F、P201T、Q002D、Q002I、Q002P、Q002V、Q019L、Q019P、Q059C、Q059D、Q059E、Q185W、Q271C、Q271D、Q271E、Q271L、Q271W、Q275G、R186M、S009C、S009L、S018D、S037E、S037H、S037K、S037L、S037P、S038P、S063C、S063D、S063F、S063L、S063Y、S087L、S087N、S087R、S087Y、S089D、S089F、S089G、S089W、S105T、S125A、S130C、S159D、S159P、S163A、S182P、S183P、S190A、S190G、S204E、S224G、S248E、S248H、S249E、S260V、S260Y、T055M、T055R、T055W、T158D、T158E、T164G、T164K、T164Q、T220A、T242G、T253E、T255C、T255G、V004D、V044L、V044P、V045C、V045G、V045L、V045N、V045R、V045V、V081A、V081G、V081H、V084S、V147A、V203D、V203G、V270C、V270P、V270S、W241L、Y104T、Y214Q、Y262D、Y262E、Y262G、Y262H、Y262L、Y262N、Y263G和Y263W，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一个选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001C、A142C、A187C、A216H、A273Q、A274H、D036Q、D036S、D099S、D197T、E156L、F189A、F189L、G053L、G053R、G157P、G178A、G258P、H039S、H238Y、K012C、K012E、K012L、K012W、K136E、K265Y、L075G、L075V、L082E、L126W、L257D、L257P、M050L、M222A、M222F、M222L、N056S、N062C、N062L、N062Y、N269C、P057W、Q002K、Q002L、Q217C、Q245A、Q245H、S018C、S038Y、S049C、S087C、S087K、S145D、S191G、T022P、T055E、T164A、T164R、V045K、V051H、V081R、V143G、V148L、V180S、V203S、V270G、Y214H、A187F、A273P、F189G、G046D、G146A、G157T、I031F、I175L、K012F、K027T、L042F、L233E、L233G、M222T、N062R、N184P、P005V、P005W、P129V、P239N、P239T、Q010W、Q059W、Q275A、V004T、V165C、A128H、A230G、D041C、H067T、K027S、K043R、L090T、N062Q、N117G、P225G、P225S、P239G、P239H、Q002R、S089E、V044A、V045I、A001P、A273R、D041N、D099A、D099H、D099Q、F058G、I111M、L042C、N118L、P239A、S049N、S089P、S173V、T242P、V044T和V045T，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例8
另外的基于BPN’-v36亲本的组合变体的清洁性能
另外的基于亲本BPN’-v36(BPN’-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)的组合变体由DNA2.0制备和提供。在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用BMI微样本测定法、在16℃和pH7的洗涤剂组合物4中使用BMI微样本测定法、在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用蛋微样本测定法以及在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用草微样本测定法测试了这些变体的清洁性能。用TCA测定法测定蛋白质含量，用AAPF测定法测定蛋白酶活性。如实施例1中所述进行所有测定法并计算相对于BPN'-v36(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A088T-L257G、A116T-A128S、N061S-N109G-A128S-N243V-S260P、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V、S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R和S162G-K256R，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A088T、A088T-A116T、A088T-G131H、A088T-K256R、A088T-N109G、A088T-N243V、A088T-Q103H、A088T-S162G、A088T-S248N、A088T-S249A、A088T-T158S、A116T、A116T-G131H、A116T-K256R、A116T-L257G、A116T-N243V、A116T-S162G、A116T-S248N、A116T-S249A、A116T-T158S、A128S-K256R、A128S-L257G、A128S-N243V-S248N-K256R、A128S-S162G、A128S-S248N、A128S-S249A、A128S-T158S、G024E-A116T、G024E-K256R、G024E-L257G、G024E-N109G、G024E-N243V、G024E-T158S、G131H、G131H-K256R、G131H-L257G、G131H-N243V-K256R、G131H-S162G、G131H-S248N、G131H-S249A、G131H-T158S、K043Y-A088T、K043Y-K256R、K043Y-N243V、K256R、K256R-L257G、L257G、N061G-N109G-N243V、N061P-N109G-G131H-N243V、N061P-N109G-N243V、N061S-A128S-N243V-S260P、N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P、N061S-N109G-A128S-S260P、N061S-N109G-N243V、N076D-K256R、N076D-L257G、N076D-N109G、N076D-T158S、N109A-A128S-N243V-K256R、N109G、N109G-A116T、N109G-A128S、N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-A128S-N243V-S248A-K256R、N109G-A128S-N243V-S248N、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-S248N-K256R、N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R、N109G-G131H、N109G-K256R、N109G-L257G、N109G-N218S、N109G-N243P-S248A-K256R、N109G-N243P-S248N-K256R、N109G-N243V、N109G-N243V-K256R、N109G-N243V-S248A-K256R、N109G-N243V-S248N、N109G-N243V-S248N-K256R、N109G-S162G、N109G-S248N-K256R、N109G-S249A、N109G-T158S、N109Q-A128S-N243V-K256R、N109S-A128S-N243V-K256R、N218S-N243V、N243V、N243V-K256R、N243V-L257G、N243V-S248N、N243V-S248N-K256R、N243V-S249A、P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、Q103H-A116T、Q103H-A128S、Q103H-G131H、Q103H-K256R、Q103H-L257G、Q103H-N109G、Q103H-N218S、Q103H-N243V、Q103H-S162G、Q103H-S248N、Q103H-S249A、Q103H-T158S、S009T-A128S-K141R-N243V、S009T-N109G-A128S-K141R、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R、S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V、S018T-Y021N-A128S-N243V、S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P、S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P、S018T-Y021N-N109G-A128S、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R、S033T-N243V、S033T-Q103H、S033T-T158S、S063G、S063G-A088T、S063G-A128S、S063G-K256R、S063G-L257G、S063G-N076D、S063G-N109G、S063G-Q103H、S063G-S162G、S063G-S248N、S063G-T158S、S162G、S162G-L257G、S162G-N243V、S162G-S248N、S248N、S248N-L257G、S249A、T158S、T158S-L257G、T158S-N218S、T158S-N243V、T158S-S248N和T158S-S249A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值以及相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E-A088T、A001E-A116T、A001E-A128S-G131H-N243V、A001E-G131H-G169A-N243V、A001E-K256R、A001E-N109G、A001E-N243V、A001E-S033T、A001E-S033T-N109G-N218S、A001E-S033T-N109G-N243V、A001E-S162G、A001E-T158S、A088T-A128S、A088T-G169A、A088T-N218S、A088T-Q206D、A116T-G169A、A116T-N218S、A116T-Q206D、A128S、A128S-G131H、A128S-G169A、A128S-N218S、A128S-N243V、A128S-Q206D、G024E、G024E-A088T、G024E-A128S、G024E-G131H、G024E-K043Y、G024E-N218S、G024E-Q103H、G024E-S033T、G024E-S063G、G024E-S162G、G024E-S248N、G024E-S249A、G131H-G169A、G131H-N218S、G131H-N243V、G131H-Q206D、G169A、G169A-K256R、G169A-L257G、G169A-N218S、G169A-N243V、G169A-Q206D、G169A-S248N、G169A-S249A、K043Y、K043Y-A116T、K043Y-A128S、K043Y-G131H、K043Y-G169A、K043Y-L257G、K043Y-N109G、K043Y-N218S、K043Y-Q103H、K043Y-S063G、K043Y-S162G、K043Y-S248N、K043Y-S249A、K043Y-T158S、N076D、N076D-A088T、N076D-A128S、N076D-G131H、N076D-N218S、N076D-N243V、N076D-Q103H、N076D-S162G、N076D-S248N、N076D-S249A、N109G-G169A、N109G-Q206D、N109G-S248N、N218S、N218S-K256R、N218S-L257G、N218S-S248N、N218S-S249A、P040E-N109G-A128S-G131H、Q103H、Q103H-G169A、Q206D、Q206D-K256R、Q206D-L257G、Q206D-N218S、Q206D-N243V、Q206D-S248N、Q206D-S249A、S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T、S033T-A088T、S033T-A116T、S033T-A128S、S033T-A128S-G131H-N243P、S033T-G131H、S033T-K043Y、S033T-K256R、S033T-L257G、S033T-N076D、S033T-N076D-A128S-N218S、S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S033T-N109G、S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-N218S、S033T-P040E-Q103H-N109G、S033T-Q103H-A128S-G131H、S033T-Q206D、S033T-S063G、S033T-S162G、S033T-S248N、S033T-S249A、S063G-A116T、S063G-G131H、S063G-G169A、S063G-N109G-A128S-G131H、S063G-N218S、S063G-N243V、S063G-Q206D、S063G-S249A、S162G-G169A、S162G-N218S、S162G-Q206D、S162G-S249A、S248N-K256R、S248N-S249A、S249A-K256R、S249A-L257G、T158S-G169A、T158S-K256R、T158S-Q206D和T158S-S162G，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E、A001E-A128S、A001E-G024E、A001E-G131H、A001E-G169A、A001E-L257G、A001E-N218S、A001E-Q103H、A001E-S063G、A001E-S248N、A001E-S249A、G024E-N076D、K043Y-N076D、K043Y-Q206D、N076D-A116T、N076D-G169A、N076D-Q206D、Q103H-Q206D、S033T-G169A、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V、A001E-K043Y、A001E-N076D、A001E-N076D-N109G-A128S、A001E-Q206D和G024E-Q206D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。
本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH7和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A116T、A088T-N243V、G024E-A116T、K043Y、N076D-A116T、N218S-S248N、S033T-N243V、S033T-S063G、S248N-L257G、A001E-S249A、A088T-A116T、A088T-A128S、A088T-G131H、A088T-L257G、A088T-N109G、A088T-S248N、A088T-S249A、A116T-N243V、A116T-T158S、A128S、A128S-K256R、A128S-L257G、A128S-N243V、A128S-S248N、A128S-T158S、G024E-A088T、G024E-A128S、G024E-G131H、G024E-K256R、G024E-L257G、G024E-N218S、G024E-N243V、G024E-S162G、G024E-S249A、G024E-T158S、G131H、G131H-K256R、G131H-S249A、K043Y-A088T、K043Y-A116T、K256R、N076D-K256R、N109G、N109G-A116T、N109G-A128S、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-G131H、N109G-K256R、N109G-L257G、N109G-N218S、N109G-N243V、N109G-S248N、N218S-L257G、N243V、N243V-K256R、N243V-L257G、N243V-S248N、N243V-S249A、Q103H-A128S、Q103H-G131H、Q103H-K256R、Q103H-L257G、Q103H-N243V、Q103H-S248N、Q103H-S249A、Q103H-T158S、Q206D-N243V、S033T-A128S、S033T-K256R、S033T-N076D、S033T-N218S、S033T-S248N、S033T-T158S、S063G-A128S、S063G-K256R、S063G-N243V、S063G-S162G、S063G-T158S、S162G-K256R、S248N-K256R、S249A、T158S-N243V和T158S-S249A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH7和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E-A128S、A001E-G131H、A001E-K256R、A001E-N218S、A001E-N243V、A001E-S033T、A001E-S063G、A001E-S162G、A088T、A088T-K256R、A088T-N218S、A088T-Q103H、A088T-S162G、A088T-T158S、A116T-A128S、A116T-G131H、A116T-K256R、A116T-L257G、A116T-S162G、A116T-S248N、A116T-S249A、A128S-G169A、A128S-N218S、A128S-S162G、A128S-S249A、G024E、G024E-N109G、G024E-Q103H、G024E-S033T、G024E-S063G、G024E-S248N、G131H-L257G、G131H-N243V、G131H-S162G、G131H-T158S、G169A、G169A-L257G、G169A-S248N、K043Y-A128S、K043Y-G131H、K043Y-K256R、K043Y-L257G、K043Y-N109G、K043Y-N243V、K043Y-Q103H、K043Y-S063G、K043Y-S162G、K043Y-S248N、K043Y-S249A、K043Y-T158S、K256R-L257G、L257G、N061G-N109G-N243V、N061S-A128S-N243V-S260P、N061S-N109G-A128S-N243V-S260P、N061S-N109G-A128S-S260P、N076D-A088T、N076D-A128S、N076D-G169A、N076D-N218S、N076D-N243V、N076D-S162G、N076D-S248N、N076D-T158S、N109A-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-N243V-S248A-K256R、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R、N109G-Q206D、N109G-S162G、N109G-S249A、N109G-T158S、N109Q-A128S-N243V-K256R、N109S-A128S-N243V-K256R、N218S、N218S-K256R、N218S-N243V、P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、Q103H、Q103H-A116T、Q103H-G169A、Q103H-N109G、Q103H-N218S、Q103H-S162G、S009T-A128S-K141R-N243V、S009T-N109G-A128S-K141R、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V、S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R、S018T-Y021N-N109G-A128S、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-A088T、S033T-A116T、S033T-G131H、S033T-K043Y、S033T-L257G、S033T-N109G、S033T-Q103H、S033T-Q206D、S033T-S162G、S033T-S249A、S063G、S063G-A088T、S063G-A116T、S063G-L257G、S063G-N076D、S063G-N109G、S063G-N218S、S063G-Q103H、S063G-S248N、S063G-S249A、S162G、S162G-G169A、S162G-L257G、S162G-N218S、S162G-N243V、S162G-S248N、S162G-S249A、S248N、S248N-S249A、S249A-K256R、S249A-L257G、T158S、T158S-G169A、T158S-K256R、T158S-L257G、T158S-N218S和T158S-S248N，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’蛋白酶(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有1.0的PI值以及相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH7和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E、A001E-A088T、A001E-A116T、A001E-G169A、A001E-L257G、A001E-N109G、A001E-S033T-N109G-N243V、A001E-T158S、A088T-G169A、A088T-Q206D、A116T-N218S、A128S-G131H、A128S-N243V-S248N-K256R、A128S-Q206D、G024E-K043Y、G024E-N076D、G024E-Q206D、G131H-G169A、G131H-N218S、G131H-N243V-K256R、G131H-Q206D、G131H-S248N、G169A-K256R、G169A-N218S、G169A-N243V、G169A-Q206D、K043Y-N076D、K043Y-N218S、N061P-N109G-G131H-N243V、N061P-N109G-N243V、N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P、N061S-N109G-N243V、N076D、N076D-G131H、N076D-L257G、N076D-N109G、N076D-Q103H、N076D-S249A、N109G-A128S-N243V-S248N、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-S248N-K256R、N109G-N243P-S248A-K256R、N109G-N243P-S248N-K256R、N109G-N243V-K256R、N109G-N243V-S248A-K256R、N109G-N243V-S248N、N109G-N243V-S248N-K256R、N109G-S248N-K256R、N218S-S249A、N243V-S248N-K256R、Q103H-Q206D、Q206D、Q206D-K256R、Q206D-N218S、Q206D-S248N、Q206D-S249A、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R、S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V、S018T-Y021N-A128S-N243V、S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P、S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P、S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T、S033T-G169A、S033T-N076D-A128S-N218S、S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R、S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S063G-G131H、S063G-G169A、S162G-Q206D和T158S-S162G，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH7和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E-A128S-G131H-N243V、A001E-G024E、A001E-G131H-G169A-N243V、A001E-Q103H、A001E-S033T-N109G-N218S、A001E-S248N、A116T-G169A、A116T-Q206D、G169A-S249A、K043Y-G169A、N109G-G169A、P040E-N109G-A128S-G131H、Q206D-L257G、S033T-A128S-G131H-N243P、S033T-A128S-G131H-N243V、S033T-P040E-Q103H-N109G、S033T-Q103H-A128S-G131H、S063G-N109G-A128S-G131H、S063G-Q206D、T158S-Q206D、A001E-K043Y、A001E-N076D、A001E-Q206D、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V、A001E-N076D-N109G-A128S、K043Y-Q206D和N076D-Q206D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A088T-L257G、G024E-K256R、G024E-L257G、N109G-A116T、N109G-L257G、N243V-K256R、S033T-N109G、S033T-T158S、S063G-L257G、A001E-L257G、A088T-A128S、A088T-G169A、A088T-K256R、A088T-N109G、A088T-N218S、A088T-N243V、A088T-S248N、A088T-T158S、A116T、A116T-A128S、A116T-G131H、A116T-K256R、A116T-L257G、A116T-N218S、A116T-S162G、A116T-T158S、A128S、A128S-G169A、A128S-K256R、A128S-L257G、A128S-N218S、G024E、G024E-A128S、G024E-G131H、G024E-N109G、G024E-N243V、G024E-S033T、G024E-S063G、G024E-S248N、G024E-S249A、G024E-T158S、G131H、G131H-G169A、G131H-K256R、G131H-N218S、G131H-S249A、G169A、G169A-L257G、G169A-N243V、K043Y-A088T、K043Y-N109G、K256R、K256R-L257G、N061G-N109G-N243V、N076D-N109G、N109G、N109G-A128S、N109G-G131H、N109G-K256R、N109G-N218S、N109G-S162G、N109G-S248N、N109G-S249A、N109G-T158S、N218S、N218S-K256R、N218S-L257G、N218S-S248N、N243V、N243V-L257G、N243V-S248N、N243V-S249A、P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、Q103H-K256R、Q103H-L257G、Q103H-N109G、S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R、S033T-A088T、S033T-A116T、S033T-A128S、S033T-G131H、S033T-K043Y、S033T-K256R、S033T-L257G、S033T-N076D、S033T-N218S、S033T-N243V、S033T-Q103H、S033T-S063G、S033T-S162G、S033T-S248N、S033T-S249A、S063G、S063G-A088T、S063G-A116T、S063G-A128S、S063G-G131H、S063G-K256R、S063G-N109G、S063G-N218S、S063G-N243V、S063G-S248N、S063G-S249A、S063G-T158S、S162G-K256R、S162G-N218S、S162G-N243V、S162G-S248N、S162G-S249A、S248N、S249A、S249A-L257G、T158S、T158S-L257G和T158S-N243V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E、A001E-A116T、A001E-G131H、A001E-G169A、A001E-K256R、A001E-N109G、A001E-S033T-N109G-N243V、A001E-S063G、A001E-S248N、A001E-S249A、A001E-T158S、A088T、A088T-A116T、A088T-G131H、A088T-Q103H、A088T-Q206D、A088T-S162G、A088T-S249A、A116T-G169A、A116T-N243V、A116T-S248N、A116T-S249A、A128S-G131H、A128S-N243V、A128S-S162G、A128S-S248N、A128S-S249A、A128S-T158S、G024E-A088T、G024E-A116T、G024E-K043Y、G024E-N076D、G024E-N218S、G024E-Q103H、G024E-S162G、G131H-L257G、G131H-N243V、G131H-N243V-K256R、G131H-S162G、G131H-S248N、G131H-T158S、G169A-K256R、G169A-N218S、G169A-Q206D、G169A-S248N、G169A-S249A、K043Y、K043Y-A116T、K043Y-A128S、K043Y-G169A、K043Y-K256R、K043Y-L257G、K043Y-N076D、K043Y-N218S、K043Y-N243V、K043Y-S063G、K043Y-S248N、K043Y-S249A、K043Y-T158S、L257G、N061P-N109G-G131H-N243V、N061P-N109G-N243V、N061S-A128S-N243V-S260P、N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P、N061S-N109G-A128S-S260P、N061S-N109G-N243V、N076D、N076D-A088T、N076D-A116T、N076D-G131H、N076D-G169A、N076D-K256R、N076D-L257G、N076D-N218S、N076D-N243V、N076D-Q103H、N076D-S249A、N076D-T158S、N109A-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-A128S-N243V-S248A-K256R、N109G-A128S-N243V-S248N、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R、N109G-G169A、N109G-N243P-S248A-K256R、N109G-N243V-K256R、N109G-N243V-S248A-K256R、N109G-N243V-S248N、N109G-N243V-S248N-K256R、N109G-S248N-K256R、N109Q-A128S-N243V-K256R、N109S-A128S-N243V-K256R、N218S-N243V、N218S-S249A、Q103H、Q103H-A116T、Q103H-A128S、Q103H-G131H、Q103H-G169A、Q103H-N218S、Q103H-N243V、Q103H-S162G、Q103H-S248N、Q103H-S249A、Q103H-T158S、Q206D、Q206D-L257G、Q206D-N218S、S009T-A128S-K141R-N243V、S009T-N109G-A128S-K141R、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R、S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V、S018T-Y021N-A128S-N243V、S018T-Y021N-N109G-A128S、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T、S033T-A128S-G131H-N243V、S033T-G169A、S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R、S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-Q103H-A128S-G131H、S033T-Q206D、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V、S063G-G169A、S063G-N076D、S063G-N109G-A128S-G131H、S063G-Q103H、S063G-S162G、S162G、S162G-G169A、S162G-L257G、S248N-K256R、S248N-L257G、S248N-S249A、S249A-K256R、T158S-G169A、T158S-K256R、T158S-N218S、T158S-S162G、T158S-S248N和T158S-S249A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’蛋白酶(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个蛋微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值以及相对于BPN’-v36具有1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E-A088T、A001E-A128S、A001E-A128S-G131H-N243V、A001E-G024E、A001E-G024E-S204E-Q206D、A001E-G131H-G169A-N243V、A001E-K043Y、A001E-N076D、A001E-N076D-N109G-A128S、A001E-N218S、A001E-N243V、A001E-Q103H、A001E-Q206D、A001E-S033T、A001E-S033T-N109G-N218S、A001E-S162G、A116T-Q206D、A128S-N243V-S248N-K256R、A128S-Q206D、G024E-Q206D、G131H-Q206D、K043Y-G131H、K043Y-Q103H、K043Y-Q206D、K043Y-S162G、N061S-N109G-A128S-N243V-S260P、N076D-A128S、N076D-Q206D、N076D-S162G、N076D-S248N、N109G-A128S-S248N-K256R、N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R、N109G-N243P-S248N-K256R、N109G-Q206D、N243V-S248N-K256R、P040E-N109G-A128S-G131H、Q103H-Q206D、Q206D-K256R、Q206D-N243V、Q206D-S248N、Q206D-S249A、S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P、S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P、S033T-A128S-G131H-N243P、S033T-N076D-A128S-N218S、S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S033T-P040E-Q103H-N109G、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P、S063G-Q206D、S162G-Q206D和T158S-Q206D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在草微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：T158S-L257G、K256R、L257G、S033T-N109G、S162G-K256R、S162G-L257G、G024E-K256R、G024E-L257G、G024E-S033T、N109G-A116T、N218S-L257G、S033T-A088T、S033T-A116T、S033T-N243V、S033T-Q103H、S162G-N218S、S162G-N243V、T158S、T158S-N218S、T158S-N243V、A088T、A088T-G169A、A088T-K256R、A088T-L257G、A088T-S162G、A088T-T158S、A116T-K256R、A116T-L257G、A116T-N243V、A128S-L257G、A128S-N218S、A128S-N243V、A128S-S248N、G024E-A116T、G024E-A128S、G024E-G131H、G024E-N243V、G024E-S248N、G024E-S249A、G024E-T158S、G131H-N243V、G131H-T158S、G169A-N218S、G169A-N243V、G169A-S248N、K256R-L257G、N109G-A128S、N109G-G131H、N109G-N218S、N109G-N243V、N109G-S249A、N218S、N218S-K256R、N218S-N243V、N218S-S249A、N243V、N243V-K256R、N243V-L257G、N243V-S248N、Q103H-N109G、Q103H-N218S、S033T-A128S、S033T-L257G、S033T-N218S、S033T-S162G、S033T-S248N、S033T-T158S、S063G-K256R、S063G-L257G、S162G、S162G-G169A、S162G-S248N、S248N、S248N-K256R、S248N-L257G、S249A、T158S-S162G和T158S-S248N，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在草微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E-A088T、A001E-A116T、A088T-A128S、A088T-N243V、A088T-Q103H、A088T-S248N、A088T-S249A、A116T、A116T-G169A、A116T-N218S、A116T-S162G、A116T-S249A、A116T-T158S、A128S-G169A、A128S-K256R、A128S-S162G、A128S-S249A、A128S-T158S、G024E-A088T、G024E-K043Y、G024E-N218S、G024E-Q103H、G024E-S063G、G024E-S162G、G131H-G169A、G131H-K256R、G131H-N218S、G131H-S162G、G131H-S248N、G131H-S249A、G169A、G169A-L257G、G169A-S249A、N076D、N076D-K256R、N076D-L257G、N076D-S162G、N076D-S249A、N109G-K256R、N109G-L257G、N109G-S248N、N243V-S249A、Q103H-A116T、Q103H-G169A、Q103H-K256R、Q103H-L257G、Q103H-N243V、Q103H-S162G、S033T-G131H、S033T-G169A、S033T-K043Y、S033T-N076D、S033T-Q206D、S063G、S063G-A116T、S063G-A128S、S063G-N243V、S063G-S162G、S063G-S248N、S063G-S249A、S063G-T158S、S249A-L257G、T158S-G169A和T158S-K256R，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个BMI微样本清洁测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有1.0的PI值以及相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在草微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E-G169A、A001E-K256R、A001E-N109G、A001E-N218S、A088T-A116T、A088T-G131H、A088T-N109G、A088T-N218S、A116T-A128S、A116T-G131H、A116T-S248N、A128S、A128S-G131H、G024E、G024E-N109G、G131H、G131H-L257G、G169A-K256R、G169A-Q206D、K043Y、K043Y-A088T、K043Y-L257G、K043Y-N109G、N076D-A088T、N076D-G131H、N076D-G169A、N076D-N243V、N076D-T158S、N109G、N109G-S162G、N109G-T158S、N218S-S248N、Q103H-A128S、Q103H-S248N、Q103H-S249A、Q103H-T158S、Q206D-K256R、Q206D-L257G、Q206D-N218S、Q206D-N243V、Q206D-S248N、S033T、S033T-K256R、S033T-S063G、S033T-S249A、S063G-A088T、S063G-G131H、S063G-G169A、S063G-N109G、S162G-Q206D、S162G-S249A、S248N-S249A、S249A-K256R、T158S-Q206D、T158S-S249A、A001E-L257G、A001E-N243V、A001E-Q103H、A001E-S063G、A001E-S162G、A001E-T158S、G024E-N076D、G131H-Q206D、K043Y-A116T、K043Y-G169A、K043Y-K256R、K043Y-N076D、K043Y-S063G、K043Y-S162G、K043Y-S248N、K043Y-S249A、K043Y-T158S、N076D-A116T、N076D-A128S、N076D-S248N、N109G-G169A、Q103H、Q103H-G131H、Q206D-S249A、S063G-N076D、S063G-N218S、S063G-Q103H、A001E-A128S、A001E-G024E、A001E-G131H、A001E-N076D、A001E-Q206D、A001E-S033T、A001E-S248N、A001E-S249A、A088T-Q206D、A116T-Q206D、A128S-Q206D、G024E-Q206D、K043Y-A128S、K043Y-G131H、K043Y-N218S、K043Y-Q103H、N076D-N109G、N076D-N218S、N076D-Q103H、N109G-Q206D、Q103H-Q206D、Q206D、A001E、A001E-K043Y、K043Y-N243V和S063G-Q206D、N076D-Q206D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个草微样本清洁测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
以下BPN’-v36变体在AAPF蛋白水解测定法中测出相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：S033T-N076D-A128S-N218S、A001E-S033T-N109G-N218S、S033T-N218S、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V、A128S-G169A、S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P、S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-A128S-G131H-N243P、P040E-N109G-A128S-G131H、S033T-A128S、S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、N109G-G169A、S063G-N109G-A128S-G131H、G169A、N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R、S033T-A128S-G131H-N243V、A128S-N218S、A001E-G169A、A088T-G169A、G169A-L257G、N109G-N218S、S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R、G169A-K256R、N076D-G169A、A001E-G131H-G169A-N243V、G169A-S249A、S033T-N109G、G169A-S248N、K043Y-G169A、K043Y-N218S、N218S-L257G、N218S-N243V、S063G-G169A、A001E-A128S-G131H-N243V、A001E-S033T-N109G-N243V、A088T-N218S、G024E-N218S、G024E-S033T、G169A-Q206D、N076D-N218S、S033T-L257G、S162G-G169A、A001E-N218S、A116T-N218S、G169A-N243V、N218S、P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-N076D、A001E-S033T、A128S-G131H、N218S-S248N、S018T-Y021N-N109G-A128S、S033T-K043Y、S033T-N243V、S033T-Q206D、S063G-N218S、S162G-N218S、T158S-G169A、A116T-G169A、G131H-G169A、N061S-N109G-A128S-S260P、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-A128S-N243V-S248A-K256R、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G、N218S-K256R、S009T-N109G-A128S-K141R、S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R、S033T-A088T、S033T-S063G、S033T-S162G、T158S-N218S、A001E-N076D-N109G-A128S、N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-S248N-K256R、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V、S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P、S033T-A116T、S033T-S248N、S033T-S249A、S033T-T158S、G131H-N218S、N109A-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S、N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R、N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R、N218S-S249A、Q206D-N218S、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V、S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R、S033T-K256R、A116T-A128S、N061S-N109G-A128S-N243V-S260P、N109G-A128S-N243V-S248N、S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R、G024E-A128S、N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P、N109S-A128S-N243V-K256R、S033T、S033T-G131H、A001E-A128S、A128S、A128S-L257G、A128S-Q206D、N109Q-A128S-N243V-K256R、S009T-A128S-K141R-N243V、S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V、A088T-A128S、A128S-K256R、A128S-N243V、N061P-N109G-N243V、N061S-A128S-N243V-S260P、S018T-Y021N-A128S-N243V、A128S-N243V-S248N-K256R、A128S-S248N、A128S-S249A、N076D-A128S、S063G-A128S、A128S-S162G、A128S-T158S、S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P、S033T-Q103H-A128S-G131H、N061S-N109G-N243V、K043Y-A128S、N061P-N109G-G131H-N243V、N109G-L257G、A001E-G024E-S204E-Q206D、A001E-L257G、A088T-N109G、G024E-N109G、K043Y-N109G、N061G-N109G-N243V、N076D-N109G、N109G、N109G-A116T、N109G-K256R、N109G-N243V-K256R、N109G-N243V-S248A-K256R、N109G-Q206D、S063G-N109G、A001E-A116T、A001E-N109G、A001E-Q206D、A088T-A116T、A088T-N243V、A116T-L257G、G024E-A116T、G024E-L257G、G024E-N243V、G024E-Q206D、N109G-G131H、N109G-N243V、N109G-S162G、N109G-S248N、N109G-S248N-K256R、N109G-S249A、N109G-T158S、N243V-L257G、A001E-A088T、A001E-G024E、A001E-K256R、A001E-N076D、A001E-N243V、A088T、A088T-L257G、A088T-Q206D、A116T、A116T-K256R、A116T-N243V、G024E-A088T、G024E-K043Y、G024E-K256R、G024E-N076D、G024E-S162G、G024E-S248N、K043Y-A088T、K043Y-A116T、K043Y-L257G、K043Y-N243V、K043Y-Q206D、K256R-L257G、N076D-A116T、N076D-L257G、N076D-N243V、N076D-Q206D、N109G-N243V-S248N、N109G-N243V-S248N-K256R、N243V-K256R、Q206D、Q206D-L257G、Q206D-N243V、Q206D-S248N、S063G-K256R、S063G-L257G、T158S-L257G、A001E、A001E-K043Y、A001E-S162G、A001E-S248N、A001E-S249A、A001E-T158S、A088T-K256R、A088T-S162G、A088T-S248N、A088T-S249A、A116T-Q206D、A116T-S248N、A116T-S249A、G024E、G024E-G131H、G024E-S249A、G024E-T158S、G131H、G131H-K256R、G131H-L257G、K043Y-K256R、K043Y-N076D、K256R、L257G、N076D-A088T、N076D-K256R、N076D-S162G、N076D-S248N、N076D-S249A、N109G-N243P-S248A-K256R、N109G-N243P-S248N-K256R、N243V、Q206D-K256R、S033T-P040E-Q103H-N109G、S063G、S063G-A116T、S063G-Q206D、S162G-K256R、S162G-L257G、S162G-N243V、S162G-Q206D、S162G-S248N、S248N、S248N-L257G、S249A、S249A-L257G、T158S、T158S-N243V和T158S-Q206D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
以下BPN’-v36变体在AAPF蛋白水解测定法中测出相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A001E-G131H、A001E-S063G、A088T-G131H、A088T-T158S、A116T-G131H、A116T-S162G、A116T-T158S、G024E-S063G、G131H-N243V、G131H-N243V-K256R、G131H-Q206D、G131H-S249A、K043Y、K043Y-S063G、K043Y-S248N、K043Y-S249A、K043Y-T158S、N076D、N076D-G131H、N076D-T158S、N243V-S248N、N243V-S248N-K256R、N243V-S249A、Q103H-G169A、Q206D-S249A、S063G-N076D、S063G-N243V、S063G-S162G、S063G-S249A、S063G-T158S、S162G、S162G-S249A、S248N-K256R、S248N-S249A、S249A-K256R、T158S-K256R、T158S-S248N和T158S-S249A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值以及相对于BPN’-v36具有1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
以下BPN’-v36变体在AAPF蛋白水解测定法中测出相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：G131H-S162G、G131H-S248N、G131H-T158S、K043Y-G131H、K043Y-S162G、S063G-A088T、S063G-G131H、S063G-S248N、T158S-S162G、Q103H-N218S、S033T-Q103H和Q103H-A128S，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个蛋白水解测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在BMI微样本清洁测定法中具有蛋白水解活性、与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性或具有大于BPN’(SEQIDNO:2)的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自如下的置换：X001E、X009T、X018T、X021N、X024G、X033T、X040A、X043Y、X061G/P/S、X063G、X076D、X088T、X103H、X109A/G/Q/S、X116T、X128S、X131H、X141R、X158S、X162G、X169A、X204E、X206D、X218S、X243P/V、X248A/N、X249A、X256R、X257G和X260P，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号，并且任选其中该变体包含至少一个选自如下的置换：A001E、S009T、S018T、Y021N、S024G、S033T、P040A、K043Y、N061G/P/S、S063G、N076D、A088T、Q103H、N109A/G/Q/S、A116T、G128S、G131H、K141R、T158S、S162G、G169A、S204E、Q206D、N218S、N243P/V、S248A/N、S249A、K256R、L257G和S260P，并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例9
来自基于BPN’-v36亲本的组合文库的变体的构建及清洁性能
基于BPN’-v36亲本分子的BPN’组合文库由DNA2.0制备并作为连接反应物提供。为了有效转化枯草芽孢杆菌，如实施例2中所述扩增来自连接反应混合物的DNA，然后进行转化和培养转化株。在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用BMI微样本测定法、在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用蛋微样本测定法测试该变体的清洁性能。用TCA测定法测定蛋白质含量。如实施例1中所述进行测定法并计算相对于BPN'-v36(即BPN’-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A088T-A116T-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-N243V-L257G、A088T-T158S-N218S-K256R、A088T-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-L257G、A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S、A088T-N109G-A116T-G131H-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-N243V-L257G、A088T-N109G-N243V-S248N、A088T-N109G-T158S-N243V-L257G、A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G、A116T-T158S-S248N-L257G、Y006H-A116T-G131H-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-K256R、A088T-N109G-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-T158S-K256R、A088T-N109G-T158S-N243V、A088T-T158S-N243V-K256R-L257G、A116T、A116T-N218S-N243V-L257G-N269S、A116T-T158S-K256R-L257G、N109G-A116T-K256R-L257G、N109G-A116T-N243V、N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、N109G-G131H-L257G、N109G-G131H-S248N-K256R-L257G、N109G-G131H-T158S-K256R-L257G、S003P-A116T-T158S-S248N-K256R、T158S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S、A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-L257G、A088T-G131H-N243V-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-L257G、A088T-N109G-A116T、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-W241R-S248N-K256R、A088T-N109G-K256R-L257G、A088T-N109G-L257G、A088T-N109G-N243V、A088T-N109G-N243V-K256R、A088T-N109G-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-S248N-K256R、A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-T158S-N243V-K256R、A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D、A088T-N109G-T158S-S248N-L257G、A088T-T158S-K256R、A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-T158S-N243V-L257G、A116T-G131H-N218S-N243V-S248N、A116T-G131H-S248N-L257G、A116T-S248N-K256R-L257G、A116T-T158S-N218S-N243V-K256R、A116T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271R、A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、G131H-S248N、G131H-T158S-I234T-N243V-K256R、G131H-W241L-N243V-S248N-K256R、N109G-A116T-G131H-A137V-T158S-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-A151S-N218S-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N、N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N、N109G-A116T-S248N、N109G-A116T-T158S-L257G、N109G-A116T-T158S-N218S-W241R-N243V、N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-T158S-S248N-L257G、N109G-G131H-N218S-L257G、N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-A274T、N109G-K256R、N109G-N243V-L257G、N109G-T158S-N218S-K256R-L257G、N109G-T158S-N218S-L257G、N109G-T158S-S248N-K256R、P014L-A015L-L016C-H017T-S018L-Q019K-G020A-Y021T-T022L-G023E、S003F-A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、V004A-A088T-A116T-T158S-N218S、V004A-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、V004L-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G、Y006H-N109G-N218S-N243V-S248N、A001T-A116T-T158S-N243V-L257G、A088T-A116T、A088T-A116T-G131H-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-A116T-K256R、A088T-A116T-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-N243V-K256R、A088T-A116T-N243V-L257G、A088T-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S、A0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在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A088T、A088T-A116T-G131H-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-A274T、A088T-A116T-G131H-N218S-K256R、A088T-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V、A088T-A116T-G131H-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-A274V、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-K256R、A088T-A116T-L257G、A088T-A116T-N218S、A088T-A116T-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-N218S-N243V-N269D、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-N218S-S248N、A088T-A116T-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-S248N、A088T-A116T-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-A216S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-S248N、A088T-G131D-T158S-N243V-S248N、A088T-G131H-A138V-N218S-L257G、A088T-G131H-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-K256R、A088T-G131H-N218S-S248N、A088T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-N218T-L257G、A088T-G131H-N243V-L257G、A088T-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-S248N、A088T-G131H-S248N-L257G、A088T-G131H-T158S-K256R、A088T-G131H-T158S-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S、A088T-G131H-T158S-N218S、A088T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G-I268V、A088T-G131H-T158S-N243V-K256R、A088T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N243V-S248N、A088T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218T-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-T158S-N218S-K256R、A088T-N109G-A116T-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-S248N、A088T-N109G-A116T-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R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变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A088T-A098S-N218S-K256R、A088T-A116T-G131H-K256R、A088T-A116T-G131H-K256R-L257G-L267M、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-N243V、A088T-A116T-G131H-S248N、A088T-A116T-G131H-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-I268V、A088T-A116T-N218S-K256R、A088T-A116T-N218S-N243V-Q271R、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-Q275R、A088T-A116T-N218S-S248N、A088T-A116T-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S、A088T-A116T-T158S-N218S-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-S248N-L257G、A088T-G131H、A088T-G131H、A088T-G131H-N218S-K237R-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-K256R、A088T-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-S248N、A088T-G131H-N243V、A088T-G131H-N243V-K256R、A088T-G131H-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-N243V-S248N、A088T-G131H-N243V-S248N、A088T-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-S248N、A088T-G131H-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-N269D、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-Q275R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G-I268V、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-W241L-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-S248N、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-A138V-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G-Q275R、A088T-N109G-G131H-N243V-S248N、A088T-N109G-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S、A088T-N109G-G131H-T158S-L233S-N243V-S248N、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-V149A-K256R-L257G、A088T-N109G-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-N243V-K256R、A088T-N109G-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S、A088T-N109G-T158S-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-S248N、A088T-N109G-T158S-S248N、A088T-N109G-T158S-S248N、A088T-N218S-N243V-K256R、A088T-N218S-N243V-L257G、A088T-N218S-N243V-S248N、A088T-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N218S-N243V-S248N-K256R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在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A015S-A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T-A098S-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-N218S-L257G、A088T-A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-K256R、A088T-G131H-N218S-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V、A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-D140G-N243V、A088T-N109G-G131H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-K141E-T158S-N218S-K256R、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-Q271R、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-V149L-T158S-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S、A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271K、A088T-N109G-T158S-N218S-L257G、A088T-N109G-T158S-S248N-K256R、A088T-N218S-S248N-L257G-Q271R、A088T-T158S-N218S-K256R-L257G、A088T-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-Y104H-A116T-G131H-N218S-N243V、A116T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G、A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G-N269D、A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-Q271R、A116T-G131H-T158S-N243V-S248N、A116T-G157E-T158S-N243V-S248N-K256R、A116T-T158S-N218S、G131H-N218S-L257G、G131H-N218S-S248N、G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、G131H-T158S-N218S-S248N-I268V、I107T-N109G-G131H-N218S-L257G、L090I-N109G-T158S-N243V、L257G、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271R、N109G-A116T-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-G131H-K141E-L257G、N109G-G131H-N218S-N243V、N109G-T158S-N218S-N243V-L257G、N109G-T158S-N218S-S248N-K256R、N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、N218S-S248N-K256R-L257G、S003P-N109G-G131H-T158S-L257G、S003P-S248N-L257G、T158S-S248N-K256R-L257G、V004A-A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、Y006H-N218S-N243V-S248N、Y104H-N109G-G131H-N243V-S248N、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-N243V、A088T-G131H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-A223G-S248N-K256R、A088T-K213N-N243V-S248N-K256R、A088T-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-A232S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-M124I-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-V148A-N218S-N243V、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G、A088T-T158S-N218S-L257G、A088T-T158S-N218S-Q245K-S248N-K256R、A088T-T158S-N218S-S248N-K256R、A116T-G131H-N218S-N243V-K256R、A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-G131H-T158S-N218S-L257G、A116T-G131H-V150A-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、I107T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-K141E-T158S-N218S-N243V-L257G、N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N、T158S-N243V-S248N-K256R、T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-G146C、A088T-A116T-N218S、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-A138E-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243F-S248N、A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G、A116T-D140G-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-T158S-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-E251K-K256R-L257G、A088T-I108T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-K141E-N218S、A088T-N109G-W241R-S248N-K256R和G065D-A088T-G131H-N243V-S248N，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G、A116T-N218S-N243V-L257G-N269S、A088T-A116T-K256R、A088T-G131H-K256R、A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T、A088T-A116T-N243V-L257G、A088T-A116T-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-N218S-S248N-L257G、A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-I268V、A088T-T158S-N218S-S248N-L257G、A116T-N218S-K256R-L257G、N109G-A116T、N109G-A116T-G131H-T158S-L257G、N109G-A116T-N243V、N109G-A116T-N243V-K256R、N109G-A116T-T158S-L257G、N109G-K256R、N109G-N243V-K256R-L257G、S003P-N109G-G131H-T158S-K256R、A088T-A116T、A088T-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-Q275R、A088T-A116T-T158S-A216S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S、A088T-A116T-T158S-N243V、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R、A088T-A116T-V147I-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-G131H-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-I107T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-N218T-K256R、A088T-N109G-A116T-N218T-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N243V、A088T-N109G-A116T-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N243V-K256R-L257G-N269D、A088T-N109G-A116T-T158S、A088T-N109G-A116T-T158S、A088T-N109G-A116T-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-A138V-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-V149A-K256R-L257G、A088T-N109G-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-N243V、A088T-N109G-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-N243V-L257G、A088T-N109G-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-K256R、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-Q275R、A088T-N109G-T158S-N243V、A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-I268V、A088T-N109G-T158S-N243V-L257G、A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N218S-N243V-L257G、A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N218S-S248N、A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-V143A-T158S-K256R、A088T-V147I-N218S-N243V-K256R-L257G、A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A116T-G131H-N243V-K256R、A116T-G131H-N243V-L257G、A116T-G131H-N243V-S248N-K256R、A116T-G131H-S248N-L257G、A116T-G131H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R、A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A116T-N218S-L257G、A116T-T158S-N218S-K256R-L257G、A116T-T158S-N218S-S248N、A116T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271R、A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A116T-T158S-S248N-L257G、G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、I107T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-A137V-T158S-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-A151S-N218S-K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G、N109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在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A015S-A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-N243V、A088T-A116T-G131H-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-N218S-I268V、A088T-A116T-N218S-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-N269D、A088T-A116T-N218S-S248N、A088T-A116T-N218S-S248N、A088T-A116T-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-S248N、A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-T158S-S248N-L257G、A088T-A116T-V143A-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-A138V-N218S-L257G、A088T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-K256R、A088T-G131H-N218S-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-S248N、A088T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-N243V-S248N、A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-S248N、A088T-G131H-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-K256R、A088T-G131H-T158S-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N、A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N243V、A088T-G131H-T158S-N243V-K256R、A088T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-A223G-S248N-K256R、A088T-L257G、A088T-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-A232S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-N269D、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243F-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218T-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-S248N、A088T-N109G-A116T-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-S248N、A088T-N109G-A116T-T158S-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G-Q275R、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-Q271R、A088T-N109G-G131H-N243V、A088T-N109G-G131H-N243V-K256R、A088T-N109G-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S、A088T-N109G-G131H-T158S、A088T-N109G-G131H-T158S-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-K256R、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-S248N、A088T-N109G-G131H-T158S-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-V149A-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-V149L-T158S-K256R-L257G、A088T-N109G-K256R、A088T-N109G-K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8S-N218S-L233S-S248N、T158S-N243V、T158S-N243V-S248N-K256R-N269D、T158S-N243V-S248N-L257G、V004L-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G和Y006H-N218S-N243V-S248N，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值以及相对于BPN’-v36具有1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A088T-A098S-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-K256R、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-S248N、A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-A116T-K256R-L257G、A088T-A116T-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S-N243V-Q271R、A088T-A116T-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-T158S、A088T-A116T-T158S、A088T-A116T-T158S-K256R、A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-G131H、A088T-G131H-L257G、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-G131H-N243V-K256R、A088T-G131H-N243V-L257G、A088T-G131H-N243V-S248N、A088T-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G、A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-G131H-T158S-S248N、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-G131H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-K141E-N218S、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-Q275R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N、A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-T158S-N218S-K256R、A088T-N109G-A116T-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A137E-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-D140G-N243V、A088T-N109G-G131H-A152S-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-G131H-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V、A088T-N109G-G131H-T158S-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-W241R-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-N109G-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-T158S、A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-Q275R、A088T-N109G-T158S-S248N、A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N243V-L257G、A088T-S248N、A088T-T158S-K256R、A088T-T158S-N218S-K256R、A088T-T158S-N218S-L257G、A088T-T158S-N218S-L257G、A088T-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-T158S-N218S-Q245K-S248N-K256R、A088T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q275K、A088T-T158S-N243V-K256R、A088T-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-T158S-S248N、A088T-T158S-S248N-K256R-L257G、A088T-T158S-S248N-L257G、A088T-T158S-S248N-L257G、A098S-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G、A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G、A116T-G131H-N243V、A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A116T-G131H-V139I-N218S-N243V-S248N、A116T-N218S-S248N-K256R、A116T-T158S-L257G-Q271R、A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G、G053S-A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-G169S-N218S-S248N-K256R-L257G、G131H-N218S-L257G、G131H-T158S、G131H-T158S-K256R、K256R、L090I-N109G-T158S-N243V、L257G、N109G-A116T-G131H、N109G-A116T-G131H-N243V、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、N109G-A116T-S248N-K256R、N109G-A116T-T158S-N218S-K237R-N243V-S248N、N109G-A116T-T158S-S248N、N109G-G131H-T158S、N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、N109G-G131H-T158S-S248N-Q271R、N109G-N218S-S248N-K256R、N109G-N243V-S248N-L257G、N109G-S248N、N109G-T158S-N218S-N243V-L257G、N109G-T158S-N243V-K256R-L257G、N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G、N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、S003P-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R、S003P-N109G-G131H-T158S-L257G、S105H-W106G-I107L-I108S-N109A-G110A-I111S-E112N-W113G-A114P、T158S-N218S-S248N-K256R、T158S-N243V-S248N、T158S-S248N、T158S-S248N-K256R-L257G、V004A-A088T-A116T-T158S-N218S、V004A-A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、Y006H-N109G-N218S-N243V-S248N、Y104H-A116T-T158S-S248N、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-A116T-N218S、A088T-G131D-T158S-N243V-S248N、A088T-G131H-N218S-K237R-K256R-L257G、A088T-G131H-N218S-K256R、A088T-K213N-N243V-S248N-K256R、A088T-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、A088T-N109G-A116T-M124I-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-S248N、A088T-N109G-G131H-K256R-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-G131H-N243V-S248N、A088T-N109G-G131H-T158S-L233S-N243V-S248N、A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-N109G-L257G、A088T-N109G-N218S-K256R-L257G、A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G、A088T-N109G-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-S248N、A088T-S248N-K256R-L257G、A088T-S248N-L257G-I268V、A088T-T158S-N243V-L257G、A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G、A088T-Y104H-A116T-G131H-N218S-N243V、A116T-D140G-T158S-N218S-N243V-S248N、A116T-G131H-T158S-K256R-L257G、A116T-G131H-T158S-N243V-S248N、A116T-G157E-T158S-N243V-S248N-K256R、A116T-S248N-K256R、G131H-N218S-S248N、G131H-N243V-K256R、G131H-T158S-N243V-L257G、K256R-L257G、N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N、N109G-A116T-N218S-N243V-L257G、N109G-A116T-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-T158S-N243V、N109G-A116T-T158S-S248N-K256R、N109G-N243V、N109G-T158S-K256R-L257G、N243V、P014L-A015L-L016C-H017T-S018L-Q019K-G020A-Y021T-T022L-G023E、S003P-S248N-L257G、T158S-N218S-N243V-S248N、T158S-S248N-K256R、Y104H-N109G-G131H-N243V-S248N、A088T-A116T-G131H-L257G、A088T-A116T-G131H-N218S-N243V、A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R、A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-A116T-L257G、A088T-A116T-N218S、A088T-A116T-N218S-N243V-S248N、A088T-A116T-T158S-N218S-S248N、A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R、A088T-A138E-N218S-N243V-K256R、A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-G131H-T158S-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G-I268V、A088T-N109G-A116T-G131H-W241L-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N、A088T-N109G-G131H-N218S-L257G、A088T-N109G-G131H-N218S-S248N、A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、A088T-N109G-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-S248N-K256R、A088T-N109G-W241R-S248N-K256R、A088T-N218S-S248N-L257G、A088T-T158S-N218S-S248N-K256R、A088T-T158S-N218S-S248N-L257G、A116T-G131H-T158S-N218S-N243V、A116T-N218S-S248N、A116T-N243V-K256R、A116T-T158S、G131H-S248N-K256R、N109G-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G、N109G-A116T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G、N109G-A116T-T158S-K256R-L257G、N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R、N109G-G131H、N109G-G131H-A137V-T158S-N218S-S248N、N109G-G131H-K141E-L257G、N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G、T158S-N218S-N243V-K256R、A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-K256R-L257G、A088T-N109G-T158S-N218S-S248N、A088T-S248N-L257G、A088T-Y104H-N109G-G131H-A137E-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R、G065D-A088T-G131H-N243V-S248N、Y104H-N218S-L257G、A088T-A116T-G131H-V150A-N218S-S248N-L257G、A088T-A116T-T158S-K256R-L257G、A088T-I108T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G、A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G-Q271P、A088T-N109G-A116T-V148A-N218S-N243V、A088T-Y104H-N109G-A116T-A153S-N218S-N243V-S248N-L257G-N269D和V004M-A116T-V148A-T158S-N243V-S248N-K256R，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本或蛋微样本清洁测定法中与BPN’-v36和/或BPN-‘v3相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v36相比具有大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X001R/T、X002R、X003F/P、X004A/L/M/P、X005S、X006H、X014L、X015L/S、X016C、X017T、X018L、X019K、X020A、X021T、X022L、X023E、X024S、X034S、X053S、X057Q、X065D、X078S、X086L、X088T、X090I、X097A、X098S、X101S、X104H、X105H/P、X106G、X107L/T、X108S/T、X109A/G/S、X110A、X111S、X112N、X113G、X114P/S、X116T、X124I、X128S、X131D/H、X137E/V、X138E/V、X139I、X140G、X141E/R、X143A/F、X144V、X145F/P/T、X146C、X147A/I、X148A、X149A/I/L、X150A、X151S、X152S、X153S、X154A、X155P、X156T、X157E/L、X158M/S、X159E、X160E、X161L、X169S、X182F、X203I、X204F、X207L、X211V、X212D、X213N、X216S、X218S/T、X223G、X231V、X232S、X233S、X234T、X235P、X236F/P、X237N/R、X240H、X241L/R、X243F/V、X245K、X248N、X251K、X255K、X256R、X257G、X260F、X267M、X268V、X269D/S、X271H/K/P/R、X272G/V、X273T、X274D/L/T/V和X275K/R/S的置换和任选至少一个选自A001R/T、Q002R、S003F/P、V004A/L/M/P、P005S、Y006H、P014L、A015L/S、L016C、H017T、S018L、Q019K、G020A、Y021T、T022L、G023E、G024S、G034S、G053S、P057Q、G065D、N078S、P086L、A088T、L090I、G097A、A098S、N101S、Y104H、S105H/P、W106G、I107L/T、I108S/T、N109A/G/S、G110A、I111S、E112N、W113G、A114P/S、A116T、M124I、A128S、G131D/H、A137E/V、A138E/V、V139I、D140G、K141E/R、V143A/F、A144V、S145F/P/T、G146C、V147A/I、V148A、V149A/I/L、V150A、A151S、A152S、A153S、G154A、N155P、E156T、G157E/L、T158M/S、S159E、G160E、S161L、G169S、S182F、V203I、S204F、S207L、G211V、N212D、K213N、A216S、N218S/T、A223G、A231V、A232S、L233S、I234T、L235P、S236F/P、K237N/R、N240H、W241L/R、N243F/V、Q245K、S248N、E251K、T255K、K256R、L257G、S260F、L267M、I268V、N269D/S、Q271H/K/P/R、A272G/V、A273T、A274D/L/T/V、Q275K/R/S的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例10
另外的BPN’-v36变体的构建及清洁性能
进一步通过易错PCR对来自BPN’-v36的位点评价文库(在实施例7中描述)的DNA进行诱变。使用TaqDNA聚合酶(Promega)用引物P4973和P4950(在实施例7中描述)扩增这些文库。每个PCR扩增反应物含有30皮摩尔的每种引物、100ng的模板DNA(BPN’-v36的SEL)和不同量的MnCl2。一开始将该PCR反应物(20μL)在95℃下加热2.5分钟，然后30个循环的：94℃下变性15秒，55℃下退火15分秒，72℃下延伸2分钟。将该DNA片段用凝胶带纯化试剂盒进行凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制酶消化并与也用相同限制酶消化的pHPLT-BPN’partialopt载体连接。在IllustraTempliphi试剂盒中根据生产商的建议用法(GEHealthcare)利用滚环扩增对连接混合物进行扩增，以产生用于转化到枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。为此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃3分钟并在冰上冷却。接着，将5μl反应缓冲液和0.2μl酶添加至每根管，接着在30℃下温育10小时。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样平板接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。
将约500,000个克隆在脱脂乳板上预先筛选。它们中有极少数形成晕圈(即指示存在功能性蛋白酶)。挑取具有晕圈的菌落，在150μl含有10μg/mL新霉素的LB培养基中温育并测序(Quintara)。通过寻找在这个克隆集合(pool)中出现多次并且可能会提供性能有益效果的突变组合来分析这些克隆的序列。为了评估这些突变组合的性能，如下所述通过PCR融合在BPN’-v36背景中产生双突变体。为此目的，通过诱变引物扩增两个或三个部分重叠的片段。用于产生各变体的引物组合在表10-1中示出，引物序列在表10-2中示出。
每个PCR扩增反应物含有30皮摩尔的每种引物和100ng的BPN’-v36亲本模板DNA(质粒pHPLT-BPN’-v36)(参见图4)。用VentDNA聚合酶(NEB)进行扩增。一开始将该PCR反应物(20μL)在95℃下加热2.5分钟，然后30个循环的：94℃下变性15秒，55℃下退火15秒，72℃下延伸40秒。扩增后，用凝胶带纯化试剂盒对5'和3'基因片段进行凝胶纯化，将其混合(50ng的每种片段)，混合并使用引物P4973和P4950再次通过PCR进行扩增，以产生全长基因片段。PCR条件与上面描述的相同，例外的是延伸阶段，其在72℃下进行2分钟。将该全长DNA片段用凝胶带纯化试剂盒进行凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制酶消化并与也用相同限制酶消化的pHPLT-BPN’partialopt载体连接。在IllustraTempliphi试剂盒中根据生产商的建议用法(GEHealthcare)利用滚环扩增对连接混合物进行扩增，以产生用于转化到枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。为此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃3分钟并在冰上冷却。接着，将5μl反应缓冲液和0.2μl酶添加至每根管，接着在30℃下温育10小时。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样平板接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。随后，将具有晕圈的菌落接种在含有10μg/mL新霉素的150μlLB培养基中。第二天，将培养物用15％甘油冷冻或如实施例2中所述在MBD培养基中培养用于生化分析。
在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用BMI微样本测定法、在16℃和pH7的洗涤剂组合物4中使用BMI微样本测定法以及在16℃和pH8的洗涤剂组合物4中使用蛋微样本测定法测试变体的清洁性能。用TCA测定法测定蛋白质含量。如实施例1中所述进行所有的测定法并计算相对于BPN'-v36(即BPN’-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)(PI值为1.0)的性能指数。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A133V-S260N、N061S-S260P、P014T-S037T、S009T-K141F、S009T-K141R、S018F-S162L、S018L-Y021S、S018P-D120N、S018T-S162P、S018T-Y021N、S018Y-K213R、S161P-S162L、S161P-S260P和T253A-S260P，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值以及相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A134T-S260G、I115V-N184Y、N025K-S037P、Q010L-S037P、Q019L-S260N、Q019L-S260P、S037P-T254S和S161P-T253A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有约0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A045S-S236G、G024A-S037W、I031V-S038W、N061D-S260I、Q010R-S037T、I115T-S183T、N025K-P129K、N025K-P129R、A045S-S236Y和S162L-D181H，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH7和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：S018F-S162L、S018P-D120N、P014T-S037T、S009T-K141R和S161P-S162L，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH7和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：N061S-S260P、Q010L-S037P、S009T-K141F、S018L-Y021S、S018T-S162P、S018T-Y021N、S018Y-K213R、S037P-T254S、S161P-S260P、S161P-T253A和T253A-S260P，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值以及相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH7和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得如下BPN’变体相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’氨基酸序列(SEQIDNO:2)：A133V-S260N、A134T-S260G、I115T-S183T、I115V-N184Y、N061D-S260I、Q019L-S260N和Q019L-S260P，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约0.9的PI值和/或与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自上面所述的群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH7和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A045S-S236G、G024A-S037W、Q010R-S037T、A045S-S236Y、I031V-S038W、N025K-S037P、S162L-D181H和N025K-P129R，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：I031V-S038W、P014T-S037T、S018F-S162L、S018P-D120N和S162L-D181H，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A133V-S260N、A134T-S260G、G024A-S037W、I115V-N184Y、N025K-P129K、N025K-P129R、N061D-S260I、Q019L-S260P、S009T-K141F、S009T-K141R、S018L-Y021S、S018T-S162P、S018T-Y021N、S018Y-K213R、S161P-S162L、S161P-T253A和T253A-S260P，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有约1.0的PI值和/或相对于BPN’-v36具有约1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.8且等于或小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：A045S-S236G、A045S-S236Y、I115T-S183T、N025K-S037P、N061S-S260P、Q010L-S037P、Q010R-S037T、Q019L-S260N、S037P-T254S和S161P-S260P，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.8且等于或小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI或蛋微样本清洁测定法中与BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v36相比具有大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X009T、X010L/R、X014T、X018F/L/P/T/Y、X019L、X021N/S、X024A、X025K、X031V、X037P/T/W、X038W、X045S、X061D/S、X115T/V、X120N、X129K/R、X133V、X134T、X141F/R、X161P、X162L/P、X181H、X183T、X184Y、X213R、X236G/Y、X253A、X254S和X260G/I/N/P的置换和任选至少一个选自S009T、Q010L/R、P014T、S018F/L/P/T/Y、Q019L、Y021N/S、G024A、N025K、I031V、S037P/T/W、S038W、A045S、N061D/S、I115T/V、D120N、P129K/R、A133V、A134T、K141F/R、S161P、S162L/P、D181H、S183T、N184Y、K213R、S236G/Y、T253A、T254S和S260G/I/N/P的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。还包括的是包含至少一种这类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种这类变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例11
1.组合文库FS1-FS3的产生
含有BPN’表达盒的pHPLT-BPN’-v3质粒充当模板DNA(亲本质粒)用于克隆。这些分别的组合文库(FS1、FS2和FS3)由DNA2.0合成并作为单独的连接反应物提供。文库和可能的置换的列表在表11-1中示出。这些文库被设计为允许在表11-1中描述的每个位点掺入野生型残基或置换。
为了有效转化枯草芽孢杆菌，将来自连接反应物的DNA用IllustraTempliphi试剂盒(GEHealthcare)通过滚环扩增(RCA)进行扩增。根据生产商的方案进行反应。将一微升的十倍稀释的经扩增的DNA用于转化50μl感受态枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将该转化混合物在37℃下振荡1小时。将转化混合物的10微升等分试样平板接种于补充有10μg/ml新霉素(Teknova)的脱脂乳(1.6％)Luria琼脂板上。
将转化株挑取到含有补充有10μg/ml新霉素的125-150μlLuria肉汤培养基的微量滴定板中。使用Enzyscreen微量滴定板盖(Enzyscreen)，以250-300rpm振荡和70-80％湿度将板在37℃下培养过夜。将来自过夜培养板的7至10微升用于接种装有190μl含10μg/ml新霉素的MBD培养基(基于MOPS的成分确定的培养基)的新微量滴定板。基本上如本领域所知(参见Neidhardt等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)119:736-747(1974))来制备MBD培养基，例外的是在基础培养基中省掉NH4Cl2、FeSO4和CaCl2，使用3mMK2HPO4，并且基础培养基补充有60mM尿素和100ml由210g/L葡萄糖和350g/L麦芽糖糊精制成的溶液。补足微量营养素，营养素为100X储备溶液，其1升含有400mgFeSO4·7H2O、100mgMnSO4·H2O、100mgZnSO4·7H2O、50mgCuCl2·2H2O、100mgCoCl2·6H2O、100mgNaMoO4·2H2O、100mgNa2B4O7·10H2O、10ml1MCaCl2和10ml0.5M柠檬酸钠。使用Enzyscreen盖(Enzyscreen)，将装有MBD培养基的微量滴定板在37℃、250-300rpm和70-80％湿度下培养60-70小时，以测定蛋白质表达。第二天，将培养物滤过微过滤器板(0.22μm；Millipore)，将所得的滤液用于生化分析。
2.产生变体来改善BPN’稳定性
为了改善BPN’的稳定性，使用均由GeneOracle合成的亲本分子pHPLT-BPN'G97A-G128A-Y217Q-S87D或pHPLT-BPN'G97A-G128A-Y217Q-P40E或使用由GeneArt合成的亲本分子pHPLT-BPN'G97A-G128A-Y217Q-S78N和pHPLT-partialoptFNA(解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L)来构建变体。
表11-2和表11-3中列出的信息汇总了所使用的亲本分子、添加的突变和用于构建本文提供的变体的引物。
将表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株划线接种至含有10ppm新霉素的1.6％脱脂乳板上，并在37℃下培养过夜。将来自所述板的单菌落在5ml含有10ppm新霉素的Luria肉汤中在37℃、250rpm震荡下培养过夜。使用Miniprep试剂盒方案，在缓冲液P1中37℃下添加1微升ReadyLyse溶菌酶(Epicentre)保持15分钟以帮助细胞裂解，由此分离质粒。对质粒进行测序以在继续进行之前确保正确的DNA序列。使用NEB的Dam甲基化酶试剂盒(DamMethylaseKit)使质粒在含有77.5μL水+10μL缓冲液10X+0.25μLSAM+2μLDAM甲基化酶+10μLMiniprepDNA(约150ng/μL)的反应物中在37℃下进行甲基化过夜。用DNA纯化与浓缩试剂盒(DNACleanandConcentratorKit,Zymo)或用PCR纯化试剂盒对甲基化的质粒DNA进行纯化。对每个DNA模板在含有2.5μL缓冲液5X+0.75μL快速溶液(QuikSolution)+0.5μL引物1(25μM)+0.5μL引物2(25μM)+1.5μLdNTP+1μL酶混合物+16.25μLH2O+2μLDNA的反应混合物中建立多位点诱变反应。使用的PCR程序为：95℃1分钟；(95℃1分钟，53℃1分钟，65℃10分钟)×29个循环；65℃10分钟，保持4℃。在所有反应中，都用MJResearchPTC-200Peltier热循环仪进行PCR。通过添加1μLDpnI至诱变试剂盒反应物37℃下过夜来除去来自PCR样品的亲本DNA。为了增加转化频率，使用IllustraTempliPhi试剂盒根据生产商的方案用滚环扩增法(RCA)来扩增经DpnI消化的反应物。用1μl的每种RCA反应物转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)并将转化的细胞平板接种至含有10ppm新霉素的LA+1.6％脱脂乳板上，并在37℃下温育过夜。选取来自过夜生长的菌落以使用“puReTaqReady-To-GoPCRBeads”(Amersham)进行菌落PCR用于测序。所使用的PCR和测序引物为pHPLTF1(SEQIDNO:54)和pHPLTseqR1(SEQIDNO:55)。将具有正确序列的克隆冷冻。通过在96孔微量滴定板中在含有尿素的基于MOPS的培养基中将枯草芽孢杆菌转化株于37℃培养68小时，来生产BPN’变体蛋白。
3.衍自五种不同的亲本质粒的BPN’变体的产生
用总共五种不同的模板构建BPN’变体：BPN’-v3(G97A-G128A-Y217Q)、BPN’-v4(G97A-N123G-Y217Q)、BPN’变体8(S87D-G97A-N109D-G128A-S188D-S248R-Y217Q)、BPN’变体16(S87D-G97A-N109D-G128A-S188D-Y217Q)和BPN’变体21(S87R-G97A-N109R-G128A-S188R-Y217Q-S248R)，如表11-4中所示。BPN’-v4和BPN’-v3的产生在2009年6月3日提交的PCT申请No.PCT/US09/46066(WO09/149144)中进行了描述，针对此类描述，以引用的方式将该申请并入本文。BPN’变体8、16、21由GeneOracle合成并充当亲本质粒来构建另外的变体。所有的变体均用诱变试剂盒产生，但两个变体(变体5和33)例外，其用如下所述的融合PCR产生。用于产生变体的引物(表11-5中列出)在IntegratedDNATechnologies公司合成。引入的突变(以粗体示出)和使用的引物和模板在表11-4中示出。
通过 诱变法来产生BPN’变体
将含有表达BPN’-v3、BPN’-v4、BPN’变体8、BPN’变体16和BPN’变体21的质粒的枯草芽孢杆菌菌株划线接种至含有10ppm新霉素的1.6％脱脂乳板上并在37℃下培养过夜。将来自所述板的单菌落在5ml含有10ppm新霉素的Luria肉汤中在37℃、250rpm震荡下培养过夜。使用Miniprep试剂盒方案，但如下细胞裂解例外：添加1微升ReadyLyse溶菌酶并在37℃下温育15分钟，来分离表达BPN’-v3、BPN’-v4、BPN’变体8、BPN’变体16和BPN’变体21的质粒。使用NEB的Dam甲基化酶试剂盒使质粒在含有77.75μLH20+10μL缓冲液10X+0.25μLSAM+2μLDAM甲基化酶+10μLMiniprepDNA的反应物中在37℃下进行甲基化过夜。用PCR纯化试剂盒纯化甲基化的DNA。表11-4中列出的变体14、18和19用QUIKCHANGELIGHTNINGTM多定点诱变试剂盒(Stratagene)在含有2.5μL缓冲液5X+0.75μL快速溶液+0.5μL引物1(25μM)+0.5μL引物2(25μM)+1.5μLdNTP+1μL酶混合物+16.25μLH2O+2μLDNA的反应混合物中产生。使用的PCR程序如下：95℃2分钟；(95℃20秒，55℃30秒，64℃2分钟30秒)×29个循环；64℃5分钟，保持4℃。
其余的变体用多定点诱变试剂盒在含有2.5μL缓冲液5X+0.75μL快速溶液+0.5μL引物1(25μM)+0.5μL引物2(25μM)+1.5μLdNTP+1μL酶混合物+16.25μLH2O+2μLDNA的反应混合物中产生。使用的PCR程序如下：95℃1分钟；(95℃1分钟，53℃1分钟，65℃10分钟)×29个循环；65℃10分钟，保持4℃。在所有反应中，用MJResearchPTC-200Peltier热循环仪进行PCR。用于Quik-Change反应的引物在表11-5中提供。
通过添加1μLDpnI至Quik-Change反应物37℃下过夜来除去来自PCR样品的亲本DNA。使用IllustraTempliPhi试剂盒根据生产商的方案用滚环扩增法(RCA)扩增一微升的经DpnI消化的反应物。用1μl的每种RCA反应物转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)并将转化的细胞平板接种至含有10ppm新霉素的LA+1.6％脱脂乳板上，并在37℃下温育过夜。选取来自过夜生长的菌落以使用“puReTaqReady-To-GoPCRBeads”(Amersham)进行菌落PCR。使用的PCR引物为pHPLTF1(SEQIDNO:54)和pHPLTseqR1(SEQIDNO:55)。将具有适当序列的克隆冷冻。通过在96孔微量滴定板中在含有尿素的基于MOPS的培养基中将枯草芽孢杆菌转化株于37℃培养68小时，来表达BPN’变体。
通过融合PCR产生BPN’变体
变体5和33用融合PCR产生，片段扩增自模板pHPLT-BPN’-v3。用于产生这些变体的PCR引物包括在表11-5中。对于变体5，BPN’基因的5'片段用正向引物pHPLTF1(SEQIDNO:54)和反向引物S248Drevfus进行扩增。BPN’基因的3'片段用含有所关注的突变的正向引物S248Dforfus和用反向引物pHPLTR1进行扩增。两种产物含有20bp的重叠序列，并通过将1μL的每种片段和融合引物(QCFUSION_For1和QCFUSION_Rev1)在最终的PCR反应中组合来进行融合。所有的PCR反应均用HerculaseIIPCR试剂盒(Stratagene)的标准条件进行。PCR混合物含有1μLDNA聚合酶、1μL质粒DNA(或用于融合的片段DNA)、0.5μLdNTP、1.25μL25μM正向引物、1.25μL25μM反向引物、10μL缓冲液5X、35μLH2O，使用的PCR程序如下：95℃2分钟，(95℃30秒，55℃30秒，72℃“X”秒)29个循环，72℃1分钟，保持4℃(“X”为15秒/1kB待扩增DNA)。
对于变体33，BPN’基因的5'片段用模板pHPLT-BPN’-v3以及引物pHPLTF1(SEQIDNO:54)和G100E_Fsrev进行扩增。包含该变体的3'片段用引物G100E_Fsfor和pHPLTR1进行扩增。两种产物含有20bp的重叠序列，并通过将1μl的每种片段和融合引物(QCFUSION_For1和QCFUSION_Rev1)在最终的PCR反应中组合来进行融合。PCR条件与上面列出的相同。
用PCR纯化柱使用生产商提供的条件纯化两种融合产物，并用BglI和HindIII酶消化过夜。用相同的酶消化质粒pHPLT-BPN’partialopt，在凝胶纯化柱上采用生产商的建议将载体带进行凝胶提取并纯化。限制酶混合物含有：10μL纯化的DNA、5μLRoche缓冲液B、0.5μLHindIII、0.5μLBglI、34μLH2O，反应在37℃下进行8小时，然后在65℃下进行20分钟。将消化物用PCR纯化柱纯化并将其用MightyMix连接酶试剂盒(Tekara)连接至切开的载体骨架在16℃下过夜。温育后，将1μL连接混合物用IllustraTempliPhi试剂盒扩增。
对于该扩增反应，将1μL连接反应混合物与来自TempliPhi试剂盒的5μL样品缓冲液混合并在95℃下加热3分钟以使DNA变性。将反应物置于冰上冷却2分钟，然后简单离心。添加来自TempliPhi试剂盒的5微升反应缓冲液和0.2μLphi29聚合酶，将反应物在MJResearchPCR机中30℃下温育4小时。通过在PCR机中65℃下温育10分钟使该反应物中的phi29酶热灭活。用1μL的该反应混合物转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)并将转化株在含有10ppm新霉素的1.6％脱脂乳板上37℃下培养过夜。选择转化株来使用“puReTaqReady-To-GoPCRBeads”(Amersham)和引物pHPLTF1(SEQIDNO:54)和pHPLTseqR1(SEQIDNO:55)进行菌落PCR和测序。
4.从文库RCL4-RCL7产生BPN’变体
RCL4文库
“RCL4”是指通过PCR融合产生的一组位点饱和文库，所述文库同时使编码BPN’-v3(BPN”-G97A-G128A-Y217Q)的基因中的三个相邻密码子随机化。对应于每个文库中的三个突变密码子的氨基酸位置在表11-6中提供。两个部分重叠、互补的诱变引物(各含有三个简并密码子)用于在每个文库内引入突变，如下面表11-6中所示。在每个引物中仅突变每个所关注的简并密码子的前面两个核苷酸(NNX，N＝A、C、T或G，X是不改变的核苷酸)(表11-6)。
为了产生每个文库，使用通用3'基因旁侧引物(P4976,CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC；(SEQIDNO:61))和诱变引物，或通用5'基因旁侧引物(P4974,GCCTCACATTTGTGCCACCTA；(SEQIDNO:60))和诱变引物进行两个PCR反应，如表11-6中针对每个文库所示的。这些PCR反应产生两种PCR片段，一种编码突变体BPN’-v3基因的5'半(5'基因片段)，另一种编码突变体BPN’-v3基因的3'半(3'基因片段)。每个PCR扩增反应物含有30皮摩尔的每种引物和100ng的BPN’-v3亲本模板DNA(质粒pHPLT-BPN’-v3)(参见图1)。用VentDNA聚合酶(NEB)进行扩增。一开始将该PCR反应物(20μL)在95℃下加热2.5分钟，然后30个循环的：94℃下变性15秒，55℃下退火15秒，72℃下延伸40秒。扩增后，用凝胶带纯化试剂盒对5'和3'基因片段进行凝胶纯化，将其混合(50ng的每种片段)，并使用引物P4973(AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC；SEQIDNO:62)和P4950(CTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAA；SEQIDNO:63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长基因片段。PCR条件与上面描述的相同，例外的是延伸阶段，其在72℃下进行2分钟。将该全长DNA片段用凝胶带纯化试剂盒进行凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制酶消化并与也用相同限制酶消化的pHPLT-BPN’partialopt载体连接。在IllustraTempliphi试剂盒中根据生产商的建议用法(GEHealthcare)利用滚环扩增对连接混合物进行扩增，以产生用于转化到枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。为此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃3分钟并在冰上冷却。接着，将5μl反应缓冲液和0.2μl酶添加至每根管，接着在30℃下温育10小时。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样平板接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。随后，将具有晕圈的菌落接种在含有10μg/mL新霉素的120μlLB培养基中。
RCL5变体
“RCL5”是指将若干BPN’突变体用作亲本(模板)分子通过PCR融合产生的一组组合变体。每个亲本质粒中引入的突变在表11-7中示出，用于产生突变体的诱变引物在表11-8中示出。
为了产生每种突变体，使用通用3'基因旁侧引物(P4976,CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC；SEQIDNO:61)和诱变引物，或通用5'基因旁侧引物(P4974,GCCTCACATTTGTGCCACCTA；SEQIDNO:60)和诱变引物进行两个PCR反应，如表11-8中针对每个文库所示的。这些PCR反应产生两种PCR片段，一种编码突变体BPN’基因的5'半(5'基因片段)，另一种编码突变体BPN’基因的3'半(3'基因片段)。每个PCR扩增反应物含有30皮摩尔的每种引物和100ng的表11-7中列出的亲本分子。用VentDNA聚合酶(NEB)进行扩增。一开始将该PCR反应物(20μL)在95℃下加热2.5分钟，然后30个循环的：94℃下变性15秒，55℃下退火15秒，72℃下延伸40秒。扩增后，用凝胶带纯化试剂盒对5'和3'基因片段进行凝胶纯化，将其混合(50ng的每种片段)，并使用引物P4973(AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC；SEQIDNO:62)和P4950(CTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAA；SEQIDNO:63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长基因片段。PCR条件与上面描述的相同，例外的是延伸阶段，其在72℃下进行2分钟。将该全长DNA片段用凝胶带纯化试剂盒进行凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制酶消化并与也用相同限制酶消化的pHPLT-BPN’partialopt连接。通过IllustraTempliphi试剂盒根据生产商的说明书(GEHealthcare)利用滚环扩增对连接混合物进行扩增，以产生用于转化到枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。为此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃3分钟并在冰上冷却。接着，将5μl反应缓冲液和0.2μl酶添加至每根管，接着在30℃下温育10小时。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样平板接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。随后，将具有晕圈的菌落接种在含有10μg/mL新霉素的120μlLB培养基中。
RCL6组合文库
“RCL6”是指将若干BPN’突变体用作亲本(模板)分子通过PCR融合产生的一组组合文库。在这些文库每一者的构建中将BPN’突变体的混合物用作模板(亲本分子)。用于产生这些文库的五种不同的亲本分子混合物在表11-9中提供，每个文库中引入的突变在表11-10中列出。
为了产生每种突变体，使用通用3'基因旁侧引物(P4976,CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC；SEQIDNO:61)和诱变引物，或通用5'基因旁侧引物(P4974,GCCTCACATTTGTGCCACCTA；SEQIDNO:60)和诱变引物进行两个PCR反应，如表11-10中针对每个文库所示的。这些PCR反应产生两种PCR片段，一种编码突变体BPN’基因的5'半(5'基因片段)，另一种编码突变体BPN’基因的3'半(3'基因片段)。每个PCR扩增反应物含有30皮摩尔的每种引物和100ng的表11-9中列出的亲本分子。用VentDNA聚合酶(NEB)进行扩增。一开始将该PCR反应物(20μL)在95℃下加热2.5分钟，然后30个循环的：94℃下变性15秒，55℃下退火15秒，72℃下延伸40秒。扩增后，用凝胶带纯化试剂盒对5'和3'基因片段进行凝胶纯化，将其混合(50ng的每种片段)，并使用引物P4973(AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC；SEQIDNO:62)和P4950(CTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAA；SEQIDNO:63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长基因片段。PCR条件与上面描述的相同，例外的是延伸阶段，其在72℃下进行2分钟。将该全长DNA片段用凝胶带纯化试剂盒进行凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制酶消化并与也用相同限制酶消化的pHPLT-BPN’partialopt载体连接。通过IllustraTempliphi试剂盒根据生产商的说明书(GEHealthcare)利用滚环扩增对连接混合物进行扩增，以产生用于转化到枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。为此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接着，将5μl反应缓冲液和0.2μl酶添加至每根管，接着在30℃下温育10小时。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样平板接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。随后，将具有晕圈的菌落接种在含有10μg/mL新霉素的120μlLB培养基中。
RCL7组合变体
“RCL7”是指将若干BPN’突变体用作亲本(模板)质粒通过PCR产生的一组组合变体。每个亲本质粒中引入的突变在表11-11中列出，用于产生突变体的诱变引物在表11-10中描述。
为了产生每种突变体，使用通用3'基因旁侧引物(P4976,CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC；SEQIDNO:61)和诱变引物，或通用5'基因旁侧引物(P4974,GCCTCACATTTGTGCCACCTA；SEQIDNO:60)和诱变引物进行两个PCR反应，如表11-10针对每个文库所示的。这些PCR反应产生两种PCR片段，一种编码突变体BPN’基因的5'半(5'基因片段)，另一种编码突变体BPN’基因的3'半(3'基因片段)。每个PCR扩增反应物含有30皮摩尔的每种引物和100ng的表11-11中列出的亲本分子。用VentDNA聚合酶(NEB)进行扩增。一开始将该PCR反应物(20μL)在95℃下加热2.5分钟，然后30个循环的：94℃下变性15秒，55℃下退火15秒，72℃下延伸40秒。扩增后，用凝胶带纯化试剂盒对5'和3'基因片段进行凝胶纯化，将其混合(50ng的每种片段)，并使用引物P4973(AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC；SEQIDNO:62)和P4950(CTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAA；SEQIDNO:63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长基因片段。PCR条件与上面描述的相同，例外的是延伸阶段，其在72℃下进行2分钟。将该全长DNA片段用凝胶带纯化试剂盒进行凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制酶消化并与也用相同限制酶消化的pHPLT-BPN’partialopt连接。通过IllustraTempliphi试剂盒根据生产商的说明书(GEHealthcare)利用滚环扩增对连接混合物进行扩增，以产生用于转化到枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。为此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃3分钟并在冰上冷却。接着，将5μl反应缓冲液和0.2μl酶添加至每根管，接着在30℃下温育10小时。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样平板接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。随后，将具有晕圈的菌落接种在含有10μg/mL新霉素的120μlLB培养基中。
实施例12
洗涤剂片
用于第I部分实施例12的测定法中的洗涤剂的组成在表12-1中示出。如第I部分实施例1中所述将BPN’变体蛋白样品添加至洗涤剂组合物以测定各种所列的特性。
1“无规接枝共聚物”是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不超过1个接枝点。
2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物是聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个–NH具有24个乙氧基化基团，每个–NH具有16个丙氧基化基团。
BPN’组合变体的去污性能
用BMI染污发微样本进行评价如实施例11中所述产生的BPN’组合变体的去污性能的实验。该测定法如实施例1(BMI微样本测定法)中所述进行。表12-2提供了在pH8和16℃的洗涤剂组合物1中和在pH8和32℃的洗涤剂组合物1中使用BMI微样本测定法以及在16℃和pH8的热灭活商业2XCold(Procter&Gamble)洗涤剂中使用BMI微样本测定法，从RCL4文库产生的变体的性能指数(PI)值。商业洗涤剂制剂的热灭活用于破坏任何蛋白质组分的内源性酶活性而同时保留非酶组分的特性。洗涤剂的热灭活通过将预称数量的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)置于95℃水浴中2小时来进行。2XCold洗涤剂购自本地超市。未加热的和加热过的洗涤剂二者均在溶解该洗涤剂5分钟内测定，以便精确地测定灭活百分比。通过AAPF测定法测试酶活性。工作溶液从热灭活储备液制备。将适当量的水硬度和缓冲液添加至洗涤剂溶液以匹配所需的条件(表12-2)。通过涡旋或倒转瓶子来混合溶液。
表12-3中所列变体的序列是相对于BPN'-v3:G97A-G128A-Y217Q的。相对于BPN'-v3计算PI值。这个列表中所有的突变体对于至少一种所测试的特性具有等于或大于0.5的PI截止值(cutoff)。
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自表12-3中的那些氨基酸置换的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。所述蛋白酶变体的蛋白水解活性可大于BPN’或BPN’-v3蛋白酶的蛋白水解活性。每种所述蛋白酶变体可以是分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体。还包括的是包含至少一种所述蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
表12-4提供了在16℃和pH8的洗涤剂组合物1中使用BMI微样本测定法、在16℃和pH8的洗涤剂组合物2使用BMI微样本测定法测得的从RCL5-7和FS1-3产生的变体的性能指数(PI)值以及在洗涤剂组合物3中测量的稳定性。还测定了AAPF水解比活性的PI(比AAPFPI)。所有测定法均如实施例1中所述进行。所列出的变体的序列是相对于BPN'-v3:G97A-G128A-Y217Q的。相对于BPN’-v3计算PI值。这个列表中所有的突变体对于至少一种测试的特性具有等于或大于0.5的PI截止值。将小于0.01的PI值修改成以粗斜体显示0.01。
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自表12-4中所列的那些氨基酸置换的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。每种所述蛋白酶变体可以是分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体。还包括的是包含至少一种所述蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
表12-5提供了在16℃和pH8下的洗涤剂组合物1中用BMI微样本测定法测得的BPN’变体(如“产生变体来改善BPN’稳定性”中所述产生；参见表11-3)的去污性能指数(PI)值(洗涤剂组合物1,pH8,16℃,BMIPI)和在LAS/EDTA中该变体的稳定性性能PI值(LAS/EDTA稳定性PI)。测定法如实施例1(BMI微样本测定法，LAS/EDTA稳定性测定法)中所述进行。变体的序列是相对于BPN’和FNA二者示出。即，每个变体序列是具有指定的变体氨基酸置换的BPN’或FNA序列。PI值是相对于FNA亲本示出，FNA亲本为BPN’-Y217L。
本发明包括具有蛋白水解活性和/或相对于FNA具有改善的稳定性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自表12-5中所列的那些氨基酸置换的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。所述蛋白酶变体可具有大于BPN’或BPN’-v3的蛋白水解活性。每种所述蛋白酶变体可以是分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体。还包括的是包含至少一种所述蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
表12-6提供了从文库亲本：BPN’-v3:G97A-G128A-Y217Q产生的BPN’变体(如“产生变体来改善BPN’稳定性”中所述产生；参见表11-3)的在16℃和pH8的洗涤剂组合物1中用BMI微样本测定法测得的去污性能指数(PI)值和在LAS/EDTA中测得的稳定性性能指数。测定法如实施例1(BMI微样本测定法和LAS/EDTA稳定性测定法)中所述进行。相对于BPN'-v3:G97A-G128A-Y217Q计算性能指数。这个列表中所有的突变体对于至少一种测试的特性具有等于或大于0.5的PI截止值。
本发明包括具有蛋白水解活性和相对于BPN’-v3具有改善的稳定性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自表12-6中所列的那些氨基酸置换的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。每种所述蛋白酶变体可以是分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体。还包括的是包含至少一种所述蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
表12-7提供了BPN’变体(如在“从五种不同的质粒产生BPN’变体”中所述产生；参见表11-4)的在16℃和pH8的洗涤剂组合物1中用BMI微样本测定法测得的去污性能指数(PI)值。如实施例1(BMI微样本测定法)所述进行测定法。相对于BPN'-v3:G97A-G128A-Y217Q计算每种变体的性能指数。这个列表中所有的突变体对于至少一种测试的特性具有等于或大于0.5的PI截止值。
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自表12-7中所列的那些氨基酸置换的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。每种所述蛋白酶变体可以是分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体。还包括的是包含至少一种所述蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
表12-8提供了BPN’变体(如实施例3所述的“BPN’-v3+S78N的组合文库和变体的产生”中所述产生)的在16℃和pH8的洗涤剂组合物1使用BMI微样本测定法测得的去污性能指数(PI)值。如实施例1(BMI微样本测定法)所述进行测定法。相对于BPN'-S78N-G97A-G128A-Y217Q计算每种变体的性能指数。修改小于0.01的PI值并以粗斜体表示为“0.01”。
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一组选自表12-8中所列的那些氨基酸置换的氨基酸置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。每种所述蛋白酶变体可以是分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体。还包括的是包含至少一种所述蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
表12-9提供了BPN’单变体(用如2009年6月3日提交的PCT申请No.PCT/US09/46156中所述的PCR融合法构建，对于所述描述将该申请以引用的方式并入本文)的在16℃和pH8的洗涤剂组合物2中使用BMI微样本测定法测得的去污性能指数(PI)值和在洗涤剂组合物3中测得的稳定性性能指数值。测定了AAPF水解比活性的PI(PI比AAPF)。所有测定法均如实施例1中所述进行。相对于BPN野生型计算性能指数值。小于0.01的PI值以粗斜体表示为“0.01”。
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列和至少一个选自表12-9中所列的那些置换的置换，其中该变体的位置通过与SEQIDNO:2序列的位置的对应关系进行编号。每种所述蛋白酶变体可以是分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的蛋白酶变体。还包括的是包含至少一种所述蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例13
液体衣物洗涤剂组合物
在这个实施例中，提供了液体衣物洗涤剂组合物的各种制剂。以下的本发明液体衣物洗涤剂组合物如下所示制备。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配制人员可根据他们的需要确定。
#1：添加1NHCl水溶液来调节制剂的净pH处于约3至约5的范围内。
表13-1中的制剂(I)-(II)的pH为约5至约7，表13-1中的制剂(III)-(V)的pH为约7.5至约8.5。
实施例14
手动餐具液体洗涤剂组合物
在这个实施例中，提供了各种手动餐具液体洗涤剂制剂。以下的本发明手动餐具液体洗涤剂组合物在下面提供。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
表14-1中的制剂(I)-(VI)的pH为约8至约11。
实施例15
液体自动餐具洗涤剂组合物
在这个实施例中，提供了各种液体自动餐具洗涤剂制剂。以下的本发明手动餐具液体洗涤剂组合物在下面提供。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
实施例16
颗粒状和/或片状洗衣组合物
这个实施例提供了颗粒状和/或片状洗衣洗涤剂的各种制剂。以下的本发明洗衣组合物在下面提供，该洗衣组合物可以是颗粒或片剂的形式。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
*香料、染料、增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
实施例17
液体衣物洗涤剂
这个实施例提供了液体衣物洗涤剂的各种制剂。以下的本发明液体衣物洗涤剂制剂在下文提供。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
实施例18
高密度餐具洗涤剂
这个实施例提供了高密度餐具洗涤剂的各种制剂。以下的本发明紧凑型高密度餐具洗涤剂在下文提供。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
*增白剂/染料/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
表18-1中的制剂(I)至(VI)的pH为约9.6至约11.3。
实施例19
片状洗涤剂组合物
这个实施例提供了各种片状洗涤剂制剂。通过用标准的12头旋转压片机以13KN/cm2的压力压制颗粒状餐具洗涤剂组合物，制备以下的本发明片状洗涤剂组合物。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
*增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂//高分子PEG/粘土。
表19-1中的制剂(I)至(VII)的pH为约10至约11.5，表19-1中的制剂(VIII)的pH为8-10。表19-1中的制剂(I)至(VIII)的片重为约20克至约30克。
实施例20
液体硬质表面清洁洗涤剂
这个实施例提供了液体硬质表面清洁洗涤剂的各种制剂。以下的本发明液体硬质表面清洁洗涤剂组合物在下文提供。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
表20-1中的制剂(I)至(VII)的pH为约7.4至约9.5。
实施例21
BPN'-v36多肽变体的清洁性能
将BPN’-v36变体用作骨架或亲本序列通过标准的PCR融合构建了包含两个氨基酸置换的BPN’-v36多肽变体。为此目的，通过诱变引物扩增两个或三个部分重叠的片段，所述诱变引物被制备成使得引物编码所需的置换。如上文第I部分的实施例7中所述进行PCR扩增反应。构建了以下BPN’-v36双突变型变体(即具有以下两个氨基酸置换的BPN’-v36)：Q019R-N025D、A001Y-Q275R、V004A-S249N、V004E-S260P、V004A-T55A、Y006F-S249C、Y006D-T55A、V008L-Q275R、Q010R-Q275K、L016Q-Q217H、H017R-T158A、S183D-Q206R、P210S-N212D、S018Y-V203A、S018K-V203I、Y021H-D259G、Y021H-D259R、K027R-N269D、K027R-N269T、S037P-S260F、S037T-S260P、D041E-N077D、D041G-N077E、G166V-S183T、N252S-L257H、V044A-Q206H、V044A-Q206K、V044A-Q206R、N076T-N212D、N076P-N212S、N077D-N252D、N077D-N252T、K141I-S248N、T158I-D259N、T158A-D259P、S161E-Q185H、K237M-H238R、G160A-D259G、G160R-D259V、G215R-D259R、G215D-D259V、N061D-Q206R、N061L-Q206H、S009L-N218S、S161E-S260T、Q019A-N109S、T022S-G166V、Y021H-N252H、P129S-K136R、T022S-T242S、N025K-H238R、N025D-Q185R、S037G-Q275H、K043R-N076S、K043N-Q217R、K043N-S163T、T055A-V147A、N061K-N252K、N062Y-G097D、Y021H-V084E、Y021H-S037E、N062Y-T244A、K027E-Y091F、A074S-P129Q、S249R-Q275R、I079V-Q217H、A098T-T158A、K027R-D120H、Q019R-Q185R、G131S-K265N、A133V-D259N、A144H-T244A、I035V-K043N、G160R-T244A、S161P-T253A、S163T-Q245L、K170R-D259G、S183T-S249R、N184Y-Y262N、V198L-D259G、A200T-H226L、Q206R-S260P、G211V-T244A、Q217R-T244A、L75I-N76D、S260P-Q275L、S260P-Q275R、Y262N-Q275R、V004A-Y006F、H017L-Q019A、N025D-V026A、N118G-V121A、V072F-L075I、S183T-R186K、V203A-Q217R和S249R-Y262H。如第I部分的实施例1中所述，在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中用BMI微样本清洁测定法以及在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中用蛋微样本清洁测定法，测试了这些变体每一者的清洁性能。结果在下面提供。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’蛋白酶变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.9并且等于或小于1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：S183T-S249R、N61D-Q206R、Y262N-Q275R、K43R-N76S、K170R-D259G、Y6F-S249C、Q19A-N109S、H17L-Q19A、Q19R-Q185R、S18Y-V203A、S161E-S260T、S18K-V203I、V4A-T55A、N252S-L257H、S249R-Y262H、N61L-Q206H、N184Y-Y262N、Q19R-N25D、A74S-P129Q、K27R-D120H、Y21H-N252H、K27R-N269D、A98T-T158A、I79V-Q217H、S9L-N218S、V4A-Y6F、S161P-T253A、V203A-Q217R、T22S-T242S、N76P-N212S、S37T-S260P、T55A-V147A、G160R-T244A、N25D-Q185R、G211V-T244A、A144H-T244A、Y21H-N252H、A1Y-Q275R、V198L-D259G、K141I-S248N、S183T-R186K、S161E-Q185H、P129S-K136R、K43N-S163T、S37G-Q275H、N62Y-T244A和S260P-Q275R，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性并且具有高于BPN’的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v36具有等于或大于0.9且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X1Y、X4A、X6F、X9L、X17L、X18K/Y、X19A/R、X21H、X22S、X25D、X27R、X37G/T、X43N/R、X55A、X61D/L、X62Y、X74S、X76P/S、X79V、X98T、X109S、X120H、X129Q/S、X136R、X141I、X144H、X147A、X158A、X160R、X161E/P、X163T、X170R、X183T、X184Y、X185H/R、X186K、X198L、X203A/I、X206H/R、X211V、X212S、X217H/R、X218S、X242S、X244A、X248N、X249C/R、X252H/S、X253A、X257H、X259G、X260P/T、X262H/N、X269D和X275H/R的置换和任选至少一个选自A1Y、V4A、Y6F、S9L、H17L、S18K/Y、Q19A/R、Y21H、T22S、N25D、K27R、S37G/T、K43N/R、T55A、N61D/L、N62Y、A74S、N76P/S、I79V、A98T、N109S、D120H、P129Q/S、K136R、K141I、A144H、V147A、T158A、G160R、S161E/P、S163T、K170R、S183T、N184Y、Q185H/R、R186K、V198L、V203A/I、Q206H/R、G211V、N212S、Q217H/R、N218S、T242S、T244A、S248N、S249C/R、N252H/S、T253A、L257H、D259G、S260P/T、Y262H/N、N269D和Q275H/R的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和大于BPN’的PI值。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’枯草杆菌蛋白酶变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：Y21H-D259G、A133V-D259N、I79V-Q217H、S18K-V203I、T158A-D259P、N61K-N252K、K43N-Q217R、T158A-D259P、Q206R-S260P、A133V-D259N、V198L-D259G、N61K-N252K、S161E-S260T、G160A-D259G、K43N-Q217R、A1Y-Q275R、A200T-H226L、Q217R-T244A、S260P-Q275R、Q206R-S260P、T158I-D259N、Q217R-T244A、L75I-N76D、S161E-Q185H、Y21H-S37E、S249R-Q275R、T158I-D259N、Y21H-S37E、N76T-N212D、S260P-Q275L、G131S-K265N、V4A-S249N、N25D-Q185R、K43R-N76S、S183D-Q206R、Q10R-Q275K、K43N-S163T、Q10R-Q275K、N25D-V26A、G131S-K265N、S260P-Q275L、K141I-S248N、L16Q-Q217H、S249R-Q275R、K27R-N269T、P210S-N212D、L75I-N76D、S183D-Q206R、N118G-V121A、G215D-D259V、N76T-N212D、K27R-N269T、N62Y-G97D、V4E-S260P、G215D-D259V、K27E-Y91F、Y6D-T55A、N77D-N252T、V4E-S260P、Y6D-T55A、N25K-H238R、V44A-Q206H、L16Q-Q217H、V44A-Q206R、V44A-Q206H和S37P-S260F，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、具有大于BPN’的增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：Y21H-D259G、S183T-S249R、N61D-Q206R、Y262N-Q275R、K043R-N076S、A133V-D259N和I079V-Q217H，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X021H、X043R、X061D、X076S、X079V、X133V、X183T、X206R、X217H、X249R、X259G/N、X262N和X275R的置换和任选至少一个选自Y021H、K043R、N061D、N076S、I079V、A133V、S183T、Q206R、Q217H、S249R、D259G/N、Y262N和Q275R的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性和大于BPN’的PI值。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5且小于或等于1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：K170R-D259G、S18K-V203I、Y6F-S249C、Q19A-N109S、H17L-Q19A、Q19R-Q185R、S18Y-V203A、N61D-Q206R、S161E-S260T、S18K-V203I、V4A-T55A、N252S-L257H、S249R-Y262H、N61L-Q206H、N184Y-Y262N、Q19R-N25D、S249R-Y262H、A74S-P129Q、T158A-D259P、H17L-Q19A、K27R-D120H、V4A-T55A、N61K-N252K、Y21H-N252H、K27R-N269D、K43N-Q217R、T158A-D259P、Q206R-S260P、K27R-N269D、A98T-T158A、I79V-Q217H、S9L-N218S、V4A-Y6F、S161P-T253A、V203A-Q217R、T22S-T242S、N76P-N212S、A133V-D259N、S37T-S260P、T55A-V147A、V198L-D259G、Q19R-Q185R、V4A-Y6F、Q19A-N109S、Y262N-Q275R、G160R-T244A、Q19R-N25D、N25D-Q185R、N61K-N252K、S161E-S260T、A98T-T158A、N61L-Q206H、G211V-T244A、S9L-N218S、A144H-T244A、A144H-T244A、S18Y-V203A、Y21H-N252H、A74S-P129Q、G160A-D259G、K43N-Q217R、A1Y-Q275R、A1Y-Q275R、A200T-H226L、Q217R-T244A、S260P-Q275R、Q206R-S260P、K141I-S248N、S183T-R186K、T158I-D259N、S37T-S260P、K27R-D120H、T22S-T242S、Q217R-T244A、S161E-Q185H、P129S-K136R、G211V-T244A、N76P-N212S、L75I-N76D、S161E-Q185H、Y21H-S37E、S249R-Q275R、G160A-D259G、K43N-S163T、T158I-D259N、Y21H-S37E、S37G-Q275H、S161P-T253A、N76T-N212D、S260P-Q275L、Y6F-S249C、N184Y-Y262N、G131S-K265N、V4A-S249N、N25D-Q185R、N252S-L257H、K43R-N76S、S183D-Q206R、G160R-T244A、Q10R-Q275K、S37G-Q275H、K43N-S163T、Q10R-Q275K、N25D-V26A、P129S-K136R、G131S-K265N、S260P-Q275L、K141I-S248N、T22S-G166V、N62Y-T244A、L16Q-Q217H、S249R-Q275R、S260P-Q275R、K27R-N269T、P210S-N212D、L75I-N76D、S183D-Q206R、N118G-V121A、G215D-D259V、N76T-N212D、V4A-S249N、K27R-N269T、G166V-S183T、N62Y-G97D、V4E-S260P、G215D-D259V、K27E-Y91F、Y21H-D259R、Y6D-T55A、N77D-N252T、V4E-S260P、Y6D-T55A、N77D-N252T、Y21H-D259R、N25K-H238R、N77D-N252D、V44A-Q206H、L16Q-Q217H、V72F-L75I、S37P-S260F、V72F-L75I、N77D-N252D、V44A-Q206R、S163T-Q245L、V44A-Q206H、V44A-Q206R、S37P-S260F、G215R-D259R、V44A-Q206K和V44A-Q206K，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例22
另外的BPN'-v36多肽变体的清洁性能
将含有充当用于克隆的模板DNA(亲本质粒)的BPN’表达盒的pHPLT-BPN’-v36质粒，在DNA2.0(MenloPark,CA)合成以下BPN’-v36变体：N109G-A128S-S224A、N109G-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N61G-N109G-A128S-S224A、N61G-N109G-A128S-S224A-N243V、N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N109Q-A128S-S224A、N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V、N109S-A128S-S224A、N109S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V、N109M-A128S-S224A、N109M-A128S-S224A-N243V、A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V、N109G-A114S-A128S、N109G-A114S-A128S-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V、N109G-A114S-A128S-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-S183V、N109G-A128S-S183L、N109G-A128S-S183L-S224A、N109G-A114S-A128S-S183L-S224A、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V、N76D-N109G-A128S-S224A、N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V、N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V、N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V、S33T-A128S-N218S、S33T-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V、S33T-N61P-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V、S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、I31L-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q和A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q。
如第I部分的实施例11所述培养变体以进行蛋白质表达。如第I部分的实施例1中所述，在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中用BMI微样本清洁测定法、在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中用蛋微样本清洁测定法以及用AAPF测定法测试这些变体的性能。结果在下面提供。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V、N109G-A128S-S183V、N109G-A128S-N243V-K256R、N109M-A128S-S224A、A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V、N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V、N109S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-N243V、N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109G-A116T-N243V-K256R、N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中与BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v36相比具有等于或大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNON:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X61G/P/S、X63G、X88T、X101Q、X109G/M/Q/S、X114S、X116T、X128S、X129S、X130T、X158S、X183L/V、X224A、X243V、X248A和X256R的置换和任选至少一个选自N61G/P/S、S63G、A88T、N101Q、N109G/M/Q/S、A114S、A116T、A128S、P129S、S130T、T158S、S183L/V、S224A、N243V、S248A和K256R的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.9并且等于或小于1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：G24S-G53S-N78S-G97A-N101S-A128S、G24S-G53S-N78S-G97A-N101S、S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-A128S-N218S、A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N109G-A114S-A128S、N109G-A114S-A128S-S183L-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N109G-A114S-A128S-N243V、N109G-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-S224A、N109G-A128S-S183L-S224A、N61G-N109G-A128S-S224A、N109G-A128S-S183L、S33T-N76D、N109S-A128S-S224A、N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V、S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109M-A128S-S224A-N243V、S63G-N109G、N109G-K256R、S63G-N76D、S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V和S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性、与BPN’相比具有增强的蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.9并且小于或等于1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、S33T-N76D-A128S-N218S、N76D-N109G-A128S-S224A和S33T-N61P-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-A128S-N218S、A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V、N109G-A114S-A128S、N109G-A114S-A128S-S183L-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-S183V、N109G-A114S-A128S-N243V、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-S224A、N109G-A128S-S183L-S224A、N61G-N109G-A128S-S224A、N109M-A128S-S224A、A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V、N109M-A128S-S224A-N243V、S63G-A128S、A88T-N109G-A116T-N243V、N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109G-A116T-N243V-K256R、N109G-A116T、S63G-N109G、A88T-N109G、N109G-K256R、N61G-N109G-N243V、S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V、N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在蛋微样本清洁测定法中与BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v36相比具有大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X1G、X33T、X55P、X61G/P/S、X63G、X76D、X88T、X101Q、X109G/M/Q/S、X114S、X116T、X128S、X129S、X130T、X131H、X158S、X169A、X183L/V、X218S、X224A、X243V、X248A/N、X249Q、X256R的置换和任选至少一个选自A1G、S33T、T55P、N61G/P/S、S63G、N76D、A88T、N101Q、N109G/M/Q/S、A114S、A116T、A128S、P129S、S130T、G131H、T158S、G169A、S183L/V、N218S、S224A、N243V、S248A/N、S249Q、K256R的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在卵BMI微样本清洁测定法中测出以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值：包含选自如下置换的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：S33T-N76D-A128S-N218S、N76D-N109G-A128S-S224A和S063G-N76D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列且包含选自S33T-N76D-A128S-N218S、N76D-N109G-A128S-S224A和S063G-N076D的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
以下BPN’-v36变体在AAPF蛋白水解测定法中测出相对于BPN’-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：G24S-G53S-N78S-G97A-N101S-A128S、I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q、S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R、S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V、S33T-N76D-A128S-N218S、S33T-A128S-N218S、A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q、N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V、N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V、A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V、N109G-A114S-A128S、N109G-A114S-A128S-S183L-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A、N109G-A114S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-S183V、N109G-A114S-A128S-N243V、N109G-A128S-N243V-S248A、N109G-A128S-S224A-N243V、N109G-A128S-N243V-K256R、N109G-A128S-S224A、N109G-A128S-S183L-S224A、N61G-N109G-A128S-S224A、N76D-N109G-A128S-S224A、N109M-A128S-S224A、N109G-A128S-S183L、S33T-N76D、A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V、N109Q-A128S-S224A-N243V、N109S-A128S-S224A、A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V、N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V、S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109M-A128S-S224A-N243V、S63G-A128S、N109S-A128S-S224A-N243V、A88T-N109G-A116T-N243V、N61S-N109G-N243V、N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V、N109G-A116T-N243V-K256R、A88T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R、N109G-A116T、S63G-N109G、A88T-N109G、N109G-K256R、N61G-N109G-N243V、S33T-N61P-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V、S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V、N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。本发明包括在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)相比具有增强的蛋白水解活性、与BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性、相对于BPN’-v3具有大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN’-v36具有大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
还提供的是在AAPF蛋白水解测定法中与BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性和/或与BPN’-v36相比具有大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该变体包含至少一个选自X1G、X31L、X33T、X55P、X61G/P/S、X63G、X76D、X88T、X101Q、X109G/M/Q/S、X114S、X116T、X128S、X129S、X130T、X131H、X158S、X169A、X183L/V、X218S、X224A、X243V、X248A/N、X249Q和X256R的置换和任选至少一个选自A1G、I31L、S33T、T55P、N61G/P/S、S63G、N76D、A88T、N101Q、N109G/M/Q/S、A114S、A116T、A128S、P129S、S130T、G131H、T158S、G169A、S183L/V、N218S、S224A、N243V、S248A/N、S249Q和K256R的置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的位置的对应关系进行编号。这类变体在这个测定法中与BPN’(SEQIDNO:2)、BPN’-v3和BPN’-v36相比具有增强的蛋白水解活性并且具有大于BPN’、BPN’-v3和BPN’-v36的PI值。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
以下BPN’-v36变体在AAPF蛋白水解测定法中测出相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值：包含氨基酸置换G24S-G53S-N78S-G97A-N101S或S063G-N76D的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含置换G24S-G53S-N78S-G97A-N101S或S063G-N76D，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
实施例23
来自基于BPN'-v36多肽的组合文库的多肽BPN'-v36多肽变体的清洁性 能
两个分别的组合文库(AJ1和AJ2)由DNA2.0(MenloPark,CA)合成并作为单独的连接反应物提供。含有BPN’表达盒的pHPLT-BPN’-v36质粒(图4)充当模板DNA(亲本质粒)用于文库构建。每个文库的可能的氨基酸位置和置换的列表在表23-1中示出。将每个文库的连接反应物用于转化枯草芽孢杆菌，并如实施例11所述培养文库变体以进行蛋白质表达。如第I部分实施例1中所述，在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中用BMI微样本清洁测定法测试变体的性能。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5且小于或等于1.0的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：G024S-G053S-N078S-G097A-N101S(即BPN’-v3)、G024S-G053S-N078S-G097A-N101S-A128S(即BPN’-v12)、N062L、N062L-S063G、N062S、N062S-S063G-Q217L、N062S-S063L-Q217L、N062S-S063N、N062S-S063R、Q217E、S063G、S063G-Q217L、S063G-Q217L-M222S、S063L-Q217L、S063N、S063N-Q217L、D099N-K141Y-K213Q、D099N-K141Y-K256Q、K043T、K043T-K141Y-E156Q、N062L-Q217E、N062L-Q217L、N062L-S063G-Q217E、N062L-S063L、N062L-S063N-Q217L、N062S-Q217L、N062S-S063G、N062S-S063L、N062S-S063N-Q217L、N062S-S063R-Q217E、Q217L、S063G-Q217E、S063N-Q217E、S063R、S063R-Q217E、S063R-Q217L、)、D099N-K141Y-K213Q、D099N-K141Y-K256Q、K043T、K043T-K141Y-E156Q、N062L-Q217E、N062L-Q217L、N062L-S063G-Q217E、N062L-S063L、N062S-Q217L、N062S-S063G、N062S-S063L、N062S-S063N-Q217L、Q217L、S063G-Q217E、S063N-Q217E、S063R、S063R-Q217E和S063R-Q217L，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。注意，作为包含氨基酸置换G024S-G053S-N078S-G097A-N101S的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)的蛋白酶变体是BPN’-v3(SEQIDNO:4)，因为SEQIDNO:6的位置24处的G、位置53处的G、位置78处的N和位置101处的N已在SEQIDNO:6的位置24、53、78和101中的每一位置处用S置换。另外，SEQIDNO:6的位置97处的G已用A置换。因而，所得的序列为SEQIDNO:4。
在pH8和16℃的洗涤剂组合物4中，在BMI微样本清洁测定法中测得以下BPN’-v36变体相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值：包含至少一组选自如下的氨基酸置换的BPN’-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQIDNO:6)：D099N、K141Y-E156Q、N062L-S063L-Q217L、N062L-S063N、N062L-S063N-Q217E、N062L-S063R、N062L-S063R-Q217L、N062S-Q217E、N062S-S063G-Q217E、N062S-S063G-Q217R、N062S-S063N-Q217R、S063G-S125A、D060G-Q217L、D120N-K141Y-K213Q、K043T-D099N-D120N-K141Y、K043T-D099N-K141Y-K256Q、K043T-K237A、N062L-S063G-Q217R、N062L-S063G-S125A、N062L-S063L-Q217E、N062L-S063N-S125A-Q217L、N062S-Q217R、N062S-S063L-Q217E、N062S-S063R-Q217L、S063G-M222S、S063G-Q217R、D120N-E156Q-K256Q、K141Y-D197N、N062L-Q217R、N062L-S063G-Q217L-M222S、N062L-S063L-Q217R、N062L-S063N-Q217R、N062S-Q217G、N062S-S063G-Q217G、N062S-S063G-Q217L-M222L、N062S-S063G-S125A-Q217L、N062S-S063N-Q217E、Q217G、S033G-N062S-S063G、S063G-Q217G、S063G-Q217L-M222L、S063G-S125A-Q217R、S063L-Q217R、S063N-M222S、S063N-Q217R、S063N-S125A-Q217L、S063R-Q217R、S063R-S125A-Q217L、D099N-E156Q-K256Q、E156Q、K012T-D099N-K213Q、K012T-K256Q、K043T-D099N-K141Y-K213Q、K043T-E156Q、K141Y-K213Q、N062L-Q217G、N062L-Q217L-M222L、N062L-Q217L-M222S、N062L-S063G-M222S、N062L-S063G-Q217L-M222L、N062L-S063G-Q217R-M222S、N062L-S063N-Q217L-M222S、N062L-S063N-S125A、N062L-S063R-S125A、N062L-S125A、N062S-S063G-M222S、N062S-S063G-Q217G-M222S、N062S-S063G-S125A、N062S-S063N-Q217L-M222L、N062S-S063N-S125A-Q217L、N062S-S063R-Q217G、N062S-S063R-Q217L-M222S、Q217G-M222S、Q217L-M222S、Q217R、S033G-S063G-Q217R、S063G-Q217E-M222S、S063G-S125A-Q217G、S063L-Q217E、S063N-Q217G、S063N-Q217G-M222S、S063N-Q217L-M222S、S063R-Q217L-M222S和S063R-S125A，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的对应关系进行编号。这类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这个测定法中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN’-v36具有等于或大于0.5并且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，该变体包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且包含至少一组选自上面所述群组的氨基酸置换，其中该变体的氨基酸位置通过与SEQIDNO:2序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。还包括的是包含至少一种所述变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种所述蛋白酶变体的清洁方法，如本文其他地方更详细描述的。
第II部分
系列IGG36冷水蛋白酶变体
野生型成熟迟缓芽孢杆菌GG36蛋白酶的氨基酸序列为：
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQIDNO:755)
如本文所指出，合适的系列IGG36冷水蛋白酶变体包括衍自亲本蛋白酶的酶变体，所述亲本蛋白酶的序列与SEQIDNO:755的氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性，所述蛋白酶变体具有如下特性中的一者或多者：
a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；
b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；
c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法4性能指数。
测试方法2、测试方法3和测试方法4在第II部分实施例1的“测试方法”小节中明确地进行了描述。本文提及的所有突变均利用如图5所示的BPN’编号方案。在一些方面，本文提及的变体指具有利用BPN’编号方案与SEQIDNO:755的氨基酸序列相比较的氨基酸序列的变体。
合适的系列IGG36冷水蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶的变体或衍自枯草杆菌蛋白酶，特别是衍自SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36的那些，并且在一些方面，包含如下突变中的一者或多者：A1R、Q2S、V4R、V4S、S9A、R10S、P14K、A16S、H17R、N18R、G20R、T22A、T22R、S24R、S24W、G25R、G25V、V26F、L42I、N43R、N43A、G46R、P52F、P52E、P52N、T57R、Q59A、N62E、N62Q、V68A、V68C、T71G、I72C、A74C、L75A、L75F、L75R、N76D、S78R、L82R、P86W、E89P、E89T、E89G、E89H、E89I、E89V、E89W、Y91N、K94N、G100S、S101A、S101N、S101G、S101D、S103G、S103N、V104L、V104I、S106V、S106G、A108I、L111V、E112V、G115K、G115R、N117F、G118I、V121F、S128D、S128F、S128L、S128N、P129E、S144R、L148I、A158E、G159E、S160D、S166D、N185E、N185I、R186H、S188E、S188D、D197F、V203E、Y209S、Y209N、Y209F、Y209T、Y209E、Y209H、Y209G、P210R、S212I、S212F、Y214F、A215N、A215D、A215E、L217E、L217N、T224A、A230E、A231I、Q236F、N238R、N238K、P239K、P239G、P239R、P239S、W241R、S242R、S242L、N243R、V244R、N248I、N248V、H249R、L250I、N252R、T253R、L262D、Y263F、S265F、L267V、L267N、N269I、N269R、E271F、E271I、E271H、E271P、E271T、E271V、E271L和/或A272F，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2(BPN’)的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系是通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。
在一个方面，合适的系列IGG36冷水蛋白酶变体包括枯草杆菌蛋白酶，特别是衍自SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌GG36的那些，其包含如下置换组中的一个或多个：T022R-S024R、S009A-E271L、N018R-W241R、N018R-G115R、N043R-H249R、G020R-H249R、V004R-H249R、G020R-S024R、N018R-H249R、S009A-G020R、G020R-W241R、S009A-S078R、G020R-G115R、N018R-S024R、S024R-S242R、T022R-G115R、N018R-N043R、G020R-N043R、N018R-S242R、S242R-N269R、N018R-V244R、S024R-N269R、G020R-E271L、S024R-E271L、V004R-S009A、G020R-N269R、A001R-S024R、V244R-E271L、S009A-N018R、W241R-E271L、V004R-S024R、S009A-H249R、S009A-T022R、N062E-P129E、N062E-G159E、A016S-L148I、A158E-H249R、A016S-N062E、L111V-S188D、T022A-N062E、N062E-L148I、T022A-P129E、N062E-E271F、N062E-A158E、A016S-G159E、N062E-R186H、S128N-G159E、N062E-S188D、N062E-S128N、L148I-G159E、S103G-A158E、L111V-G159E、A158E-E271F、A016S-S188D、T022A-L111V、S128N-A158E、A016S-A158E、V104L-A158E、S128N-R186H、G159E-Y209E、N062E-S101A、L111V-Y209E、L148I-S188D、S101A-Y209E、T022A-S188D、A016S-T022A、S128N-P129E、A016S-Y209E、A016S-S128N、T022A-E089P、S128N-Y209E、E089P-A158E、N062E-S103G、R186H-E271F、A016S-P129E、E089P-G159E、L111V-H249R、S101A-P129E、L148I-Y209E、T022A-G159E、P129E-H249R、P129E-Y209E、V104L-P129E、S128N-S188D、L111V-A158E、T022A-A158E、N062E-Y209E、N062E-H249R、S101A-R186H、E089P-P129E、P129E-E271、T22A-L111V-G159E、S101A-S103G-V104L-Y209E、S101A-S103G-V104L-G159E、S101A-S103G-V104L-S188D、S101G-S103A-V104I-G159D、T22A-S103G-G159E、T22A-S128N-E271F-Y209E、T22A-Y209E-E271F、T22A-S101A-Y209E、S101A-Y209E-E271F、T22A-L111V-S128N、T22A-S101A-G159E、S101A-S103G-V104L、T22A-S101A-S103G-V104L、S101A-S103G-V104L、S101G-S103A-V104I、S101A-S103G-V104L-S128N、S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D、N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R、T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R、T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D和/或S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2(BPN’)的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系是通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。
在另一个方面，合适的系列IGG36冷水蛋白酶变体包括枯草杆菌蛋白酶的变体，特别是衍自SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌GG36的那些，其中该变体在包括位置1、2、4、9、10、14、16、17、18、20、22、24、25、26、42、43、46、52、57、59、62、68、71、72、74、75、76、78、82、86、89、91、94、100、101、103、104、106、108、111、112、115、117、118、121、128、129、144、148、158、159、160、166、185、186、188、197、203、209、210、212、214、215、217、224、230、231、236、238、239、241、242、243、244、248、249、250、252、253、262、263、265、267、269、271和272的一组位置内包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1415、16、17、18、19,20、21、22、23、24或甚至25个突变。
在另一个方面，合适的系列IGG36冷水蛋白酶变体包括枯草杆菌蛋白酶的变体，特别是衍自SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌GG36的那些，其中所述变体包含总共3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或甚至25个选自A1R、Q2S、V4R、V4S、S9A、R10S、P14K、A16S、H17R、N18R、G20R、T22A、T22R、S24R、S24W、G25R、G25V、V26F、L42I、N43R、N43A、G46R、P52F、P52E、P52N、T57R、Q59A、N62E、N62Q、V68A、V68C、T71G、I72C、A74C、L75A、L75F、L75R、N76D、S78R、L82R、P86W、E89P、E89T、E89G、E89H、E89I、E89V、E89W、Y91N、K94N、G100S、S101A、S101N、S101G、S101D、S103G、S103N、V104L、V104I、S106V、S106G、A108I、L111V、E112V、G115K、G115R、N117F、G118I、V121F、S128D、S128F、S128L、S128N、P129E、S144R、L148I、A158E、G159E、S160D、S166D、N185E、N185I、R186H、S188E、S188D、D197F、V203E、Y209S、Y209N、Y209F、Y209T、Y209E、Y209H、Y209G、P210R、S212I、S212F、Y214F、A215N、A215D、A215E、L217E、L217N、T224A、A230E、A231I、Q236F、N238R、N238K、P239K、P239G、P239R、P239S、W241R、S242R、S242L、N243R、V244R、N248I、N248V、H249R、L250I、N252R、T253R、L262D、Y263F、S265F、L267V、L267N、N269I、N269R、E271F、E271I、E271H、E271P、E271T、E271V、E271L和A272F的突变；以及任选如下突变中的一者或多者：S103A、G159D、Q236H、Q245R、N248D和N252K，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2(BPN’)的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系是通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。
在一些方面，系列IGG36冷水蛋白酶变体包含一个或多个突变，并且相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36野生型(SEQIDNO:755)具有-5、-4、-3、-2、-1或0的总净电荷。
在另一个方面，系列IGG36冷水蛋白酶变体是低离子强度系列IGG36冷水蛋白酶变体。这类低离子强度系列IGG36冷水蛋白酶变体包含一个或多个突变，并且相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶野生型(SEQIDNO:755)具有-5、-4、-3、-2、-1或0的总净电荷。这些突变可选自：(a)如下突变中的两个或更多个：A1R、Q2S、V4R、V4S、S9A、R10S、P14K、A16S、T22A、T22R、S24R、G25V、V26F、L42I、P52F、P52E、P52N、N62E、N62Q、V68A、V68C、T71G、I72C、A74C.L75A、L75F、S78R、E89P、E89T、E89G、E89H、E89W、Y91N、K94N、G100S、S101A、S101N、S101G、S101D、S103G、S103N、V104L、V104I、A108I、L111V、E112V、G115K、N117F、V121F、S128D、S128F、S128L、S128N、P129E、L148I、A158E.G159E、S160D、S166D、N185E、R186H、S188E、S188D、V203E、Y209S、Y209N、Y209F、Y209T、Y209E、Y209H、Y209G、P210R、S212I、S212F、Y214F、A215N、A215D、A215E、L217E、L217N、T224A、A230E、A231I、Q236F、N238R、N238K、P239K、P239G、P239R、N248V、H249R、L250I、L262D、Y263F、S265F、L267V、L267N.N269I、N269R、E271F、E271I、E271H和A272F；和/或(b)如下突变组中的一个或多个：N062E-P129E、N062E-G159E、A016S-L148I、A158E-H249R、A016S-N062E、L111V-S188D、T022A-N062E、N062E-L148I、T022A-P129E、N062E-E271F、N062E-A158E、A016S-G159E、N062E-R186H、S128N-G159E、N062E-S188D、N062E-S128N、L148I-G159E、S103G-A158E、L111V-G159E、A158E-E271F、A016S-S188D、T022A-L111V、S128N-A158E、A016S-A158E、V104L-A158E、S128N-R186H、G159E-Y209E、N062E-S101A、L111V-Y209E、L148I-S188D、S101A-Y209E、T022A-S188D、A016S-T022A、S128N-P129E、A016S-Y209E、A016S-S128N、T022A-E089P、S128N-Y209E、E089P-A158E、N062E-S103G、R186H-E271F、A016S-P129E、E089P-G159E、L111V-H249R、S101A-P129E、L148I-Y209E、T022A-G159E、P129E-H249R、P129E-Y209E、V104L-P129E、S128N-S188D、L111V-A158E、T022A-A158E、N062E-Y209E、N062E-H249R、S101A-R186H、E089P-P129E、P129E-E271F、T22A-L111V-G159E、S101A-S103G-V104L-Y209E、S101A-S103G-V104L-G159E、S101A-S103G-V104L-S188D、S101G-S103A-V104I-G159D、T22A-S103G-G159E、T22A-S128N-E271F-Y209E、T22A-Y209E-E271F、T22A-S101A-Y209E、S101A-Y209E-E271F、T22A-L111V-S128N、T22A-S101A-G159E、S101A-S103G-V104L、T22A-S101A-S103G-V104L、S101A-S103G-V104L、S101G-S103A-V104I、S101A-S103G-V104L-S128N、S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D、N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R、T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R、T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D和S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2(BPN’)的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在另一个方面，上述的低离子强度系列IGG36冷水蛋白酶变体构成洗涤剂组合物的一部分，将该洗涤剂组合物稀释于水中，通常是洗衣机内的水中，以形成衣物洗涤剂洗液，其电导率为约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm。
在另一个方面，系列IGG36冷水蛋白酶变体是高离子强度系列IGG36冷水蛋白酶变体。这类高离子强度系列IGG36冷水蛋白酶变体包含两个或更多个突变，并且相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶野生型(SEQIDNO:755)具有+5、+4、+3、+2、+1或0的总净电荷。这些突变可选自：(a)如下突变中的两个或更多个：V4R、H17R、N18R、G20R、T22R、S24R、S24W、G25R、N43R、N43A、G46R、P52F、P52N、T57R、Q59A、N62Q、T71G、L75R、N76D、S78R、L82R、P86W、E89P、E89W、E89T、E89I、E89H、E89V、V104L、S106V、S106G、G115R、G118I、V121F、S144R、N185I、D197F、Y209N、Y209S、L217E、A231I、P239R、P239S、W241R、S242R、S242L、N243R、V244R、N248I、H249R、N252R、T253R、E271T、E271V、E271L、E271H、E271F、E271P、A1R、S9A、S212F和N269R；和/或(b)如下突变组中的一个或更多个：T022R-S024R、S009A-E271L、N018R-W241R、N018R-G115R、N043R-H249R、G020R-H249R、V004R-H249R、G020R-S024R、N018R-H249R、S009A-G020R、G020R-W241R、S009A-S078R、G020R-G115R、N018R-S024R、S024R-S242R、T022R-G115R、N018R-N043R、G020R-N043R、N018R-S242R、S242R-N269R、N018R-V244R、S024R-N269R、G020R-E271L、S024R-E271L、V004R-S009A、G020R-N269R、A001R-S024R、V244R-E271L、S009A-N018R、W241R-E271L、V004R-S024R、S009A-H249R、S009A-T022R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F、S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R、S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K、S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，其中该变体具有蛋白水解活性并且该变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2(BPN’)的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号。
在另一个方面，上述的高离子强度系列IGG36冷水蛋白酶变体构成洗涤剂组合物的一部分，将该洗涤剂组合物稀释于水中，通常是洗衣机内的水中，以形成衣物洗涤剂洗液，其电导率为约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。
系列IGG36冷水蛋白酶变体的电荷是相对于具有SEQIDNO:755的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶野生型来表示的。赋予单个负电荷的氨基酸是D和E，赋予单个正电荷的氨基酸是R、H和K。将可改变电荷的任何相对于SEQIDNO:755的氨基酸变化用于计算系列IGG36冷水蛋白酶变体的电荷。例如，从野生型中性位置引入负电荷突变将给系列IGG36冷水蛋白酶变体添加净电荷-1，而从野生型正电荷氨基酸残基(R、H或K)引入负电荷突变(D或E)将添加净电荷-2。将系列IGG36冷水蛋白酶变体的相对于具有SEQIDNO:755的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶野生型而言不同的所有氨基酸残基的电荷变化进行加和，可得到系列IGG36冷水蛋白酶变体的电荷变化。不希望受理论束缚，但认为：(a)对于待用于低电导率衣物洗涤剂溶液中的系列IGG36冷水蛋白酶变体，优选电荷范围是-5、-4、-3、-2、-1、0，特别是-2、-1；以及(b)对于待用于高电导率衣物洗涤剂溶液中的系列IGG36冷水蛋白酶变体，优选电荷范围是+5、+4、+3、+2、+1、0，特别是+2、+1。通过正确选择电荷，可获得水平得到出乎意料改善的冷水清洁性能。“低电导率衣物洗涤剂溶液”定义为具有约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm的电导率。“高电导率衣物洗涤剂溶液”定义为具有约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm或甚至约4mS/cm至约10mS/cm的电导率。意图到，上述例子是非限制性的。一旦将突变进行组合来优化冷水性能时，还可以通过在另外的位置的突变来平衡酶电荷。
用于制备GG36冷水蛋白酶变体的方法
多种适于产生本发明的编码GG36冷水蛋白酶变体的经修饰的多核苷酸的方法是本领域已知的，包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及各种其他重组方法。
制备系列IGG36冷水蛋白酶变体的非限制性示例性方法在上面的标题为“制备本发明的蛋白酶变体多肽的载体、细胞和方法”的小节中提供。
为了测试在热灭活洗涤剂中的酶活性，从热灭活的储备液制备洗涤剂的工作溶液。添加适当量的水硬度(例如6gpg或12gpg)和缓冲液至洗涤剂溶液以匹配所需的条件。通过涡旋或倒转瓶子来混合溶液。下表提供了关于本文所用的一些市售洗涤剂和测试条件的信息。在一些实验中，另外的和/或其他的市售洗涤剂可用于以下实施例。
在一些另外的实施例中，可使用如下溶液：
表C提供了根据本发明制备的适于洗涤织物的颗粒状衣物洗涤剂组合物。
1无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不超过1个接枝点。
2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物是聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个–NH具有24个乙氧基化基团，每个–NH具有16个丙氧基化基团
4如下结构的可逆蛋白酶抑制剂：
5乙氧基化的噻吩调色染料是如US7,208,459B2中描述的。
在表C中，所有酶水平以酶原料的百分比表示，(本发明的)冷水蛋白酶变体除外，其以添加至产品的活性蛋白质的百分比表示。表D提供了适用于顶开式自动洗衣机的颗粒状衣物洗涤剂组合物(洗涤剂组合物7-9)和前开式洗衣机的颗粒状衣物洗涤剂组合物(洗涤剂组合物10-11)。将测试的GG36蛋白酶变体和/或本发明的冷水蛋白酶变体分别添加至这些制剂。
在表D中，表面活性剂成分可获自任何合适的供应商，包括但不限于BASF(例如)、ShellChemicals、Stepan、Huntsman和Clariant(例如)。沸石可获自诸如IndustrialZeolite的来源。柠檬酸和柠檬酸钠可获自诸如Jungbunzlauer的来源。过碳酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠和倍半碳酸钠可获自诸如Solvay的来源。丙烯酸系/马来酸系共聚物可获自诸如BASF的来源。羧甲基纤维素和疏水改性的羧甲基纤维素可获自诸如CPKelco的来源。C.I.荧光增白剂260可获自3VSigma(例如2M/G、2MG/LTExtra或Ecobright。S,S-乙二胺二琥珀酸四钠可获自诸如Innospec的来源。对苯二甲酸酯共聚物可获自Clariant(例如REPELOTEXSF2)。另外，1-羟基乙烷-1,1-二膦酸可获自Thermphos。基于哑嗪鎓盐的漂白增强剂具有如下结构，其中R1＝2-丁基辛基，并根据US2006/0089284A1制备。
酶STAINZYME 和可从Novozymes获得。四磺酸基酞菁锌可从CibaSpecialtyChemicals获得(例如BMC)。抑泡剂颗粒可从DowCorning获得。在这些洗涤剂组合物中，无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不超过1个接枝点。
第II部分实施例
实施例1
测定法和测试方法
这个实施例描述用于开发这些实施例中描述的变体的各种测试方法和测定法。任何偏离于所提供的方案的地方均在相关的实施例中指出。这些测定法用BiomekFXRobot(BeckmanCoulter)或多通道通道移液器(例如RaininPipetLite,Mettler-Toledo)和SpectraMAXMTP读板机(340型；MolecularDevices)进行。
A.测试方法
测试方法1
下面提供了确定染料或颜料是否是用于本发明目的的织物调色剂的方案：
1)向两个tergotometer去污机罐中装入800ml英国泰恩河畔纽卡斯尔城市用水(NewcastleuponTyne,UK,CityWater)(约12格令/美加仑总硬度，由英国达勒姆郡PityMe城诺森伯兰水务公司供应(NorthumbrianWater,PityMe,Durham,Co.Durham,UK))。
2)将罐插入tergotometer去污机中，在实验期间水温控制在30℃并且搅拌设定在40rpm。
3)向每个罐添加4.8g的IEC-B洗涤剂(B型IEC60456洗衣机参考基础洗涤剂(IEC60456WashingMachineReferenceBaseDetergentTypeB)，由德国Brüggen-Bracht的wfk公司提供)。
4)两分钟后，向第一个罐添加2.0mg活性着色剂。
5)一分钟后，向每个罐添加切成5cm×5cm样本的50g扁平棉背心(由英国达勒姆郡康塞特(Consett,CountyDurham,UK)的WarwickEquest公司提供)。
6)10分钟后，将罐中水排出并重新装上水硬度为14.4英式克拉克(Clark)度硬度的冷水(16℃)，钙镁摩尔比为3:1。
7)2分钟漂洗后，移出织物。
8)使用相同的处理再重复步骤3-7三个循环。
9)收集织物并在室内挂干12小时。
10)用装配有D65光源和UVA减光滤光片的HunterMiniscan光谱仪分析样片，以获得Huntera(红绿轴)和Hunterb(黄蓝轴)值。
11)将每组的织物的Huntera值和Hunterb值取平均值。如果用评估的着色剂处理过的织物在a轴或b轴上显示出大于0.2个单位的平均色调差异，则其被认为是用于本发明目的的织物调色剂。
测试方法2
对于测试方法2，用颗粒状洗涤剂组合物10(见上面的表D)进行下面提供的BMI微样本测定法。将衣物洗涤剂溶解于硬度为12gpg且调节至温度为16℃的水中，添加所关注的蛋白酶变体酶。然后按照所述的BMI微样本测定法测定蛋白酶变体酶的性能。通过将蛋白酶变体酶的性能与具有SEQIDNO:755的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌GG36枯草杆菌蛋白酶的性能相比较来确定性能指数，在所有情况中，酶剂量为1.6ppm。性能指数为1.1或更大的蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶变体。
测试方法3
对于测试方法3，用颗粒状衣物洗涤剂组合物7(见上面的表D)进行下面提供的BMI微样本测定法。将衣物洗涤剂溶解于硬度为6gpg且调节至温度为16℃的水中，添加所关注的GG36蛋白酶变体酶。然后按照所述的BMI微样本测定法测定GG36蛋白酶变体酶的性能。通过将GG36蛋白酶变体酶的性能与具有SEQIDNO:755的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌GG36枯草杆菌蛋白酶的性能相比较来确定性能指数，在所有情况中，酶剂量为4ppm。性能指数为1.1或更大的GG36蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶变体。
测试方法4
对于测试方法4，用颗粒状衣物洗涤剂组合物7(见上面的表D)进行下面提供的BMI微样本测定法。将衣物洗涤剂溶解于硬度为6gpg且调节至温度为16℃的水中，添加所关注的GG36蛋白酶变体酶。然后按照所述的BMI微样本测定法测定GG36蛋白酶变体酶的性能。通过将GG36蛋白酶变体酶的性能与参考酶GG36-A158E的性能相比较来测定性能指数，所述GG36-A158E参考酶由在位置158处具有丙氨酸置换为谷氨酸的单一置换(即A158E突变)的SEQIDNO:755的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶氨基酸序列组成，在所有情况中酶剂量为4ppm。性能指数为1.0或更大的GG36蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶变体。
测试方法5
根据标准方法ASTMD1125测定水溶液的电导率并以毫西门子/厘米单位(本文缩写为mS/cm)报道。
B.测定法
96孔微量滴定板中测定蛋白质含量的TCA测定法
对于GG36和GG36变体，这个测定法使用过滤过的枯草芽孢杆菌培养上清液来开始，该上清液来自在37℃下以250rpm振荡和增湿通气的条件下培养2-3天的微量滴定板。将新的96孔平底微量滴定板(MTP；Costar9017中结合力透明聚苯乙烯板)用于该测定法。首先，将100μL/孔的0.25NHCl置于每孔中。然后，添加20-25μL过滤过的培养上清液并将溶液在桌面混合器(例如LablineInstruments公司的4825型滴定板振荡器(Titerplateshaker))上混合5-10秒。然后测定405nm处的光散射/吸光度，以提供“空白”读数。对于“测试”读数，将100μL/孔的30％(w/v)三氯乙酸(TCA)添加至每个装有HCl和培养上清液的混合物的孔，将板在室温下温育10分钟。在桌面混合器上简单混合该溶液不超过2-3秒后，测定405nm处的光散射/吸光度。样品中浊度/光散射的增加与培养上清液中可沉淀蛋白质的总量相关。通过从“测试”读数(在添加TCA后获得，如上所述)减去“空白”读数(在仅添加HCl，无TCA时获得)进行计算，以提供样品中蛋白质含量的相对量度。如果需要，可通过用具有已知转换因子的克隆的AAPF测定法校准TCA读数来产生标准曲线。然而，TCA结果对于50至500份每一百万份(ppm)的蛋白质(其中1ppm对应于1mg/L)的蛋白质浓度而言是线性的，因而可相对于酶性能直接绘图以选择具有所需性能的变体。
96孔微量滴定板中的AAPF蛋白酶测定法
为了测定丝氨酸蛋白酶变体的蛋白酶活性，对N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解进行了测量。使用的试剂溶液是：100mMTris/HCl，pH8.6，含有0.005％(Tris稀释缓冲液)；100mMTris缓冲液，pH8.6，含有1mMCaCl2和0.005％(Tris/Ca缓冲液)；和DMSO中的160mMsuc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA储备溶液)(Sigma:S-7388)。为了制备suc-AAPF-pNA工作溶液，将1mlsuc-AAPF-pNA储备溶液添加至100mlTris/Ca缓冲液并充分混合至少10秒。通过添加10μl的稀释蛋白酶溶液至96孔MTP的每个孔，随即添加190μL的1mg/mlsuc-AAPF-pNA工作溶液来进行该测定法。将溶液混合5秒，25℃下在MTP读板机中在405nm处读取动力学模式的吸光度变化(5分钟内25个读数)。蛋白酶活性以AU表示(活性＝ΔOD·min-1ml- 1)。
水蛭抑制剂C抑制测定法
如本文所描述，通过用称为水蛭抑制剂c的抑制剂滴定来测定丝氨酸蛋白酶浓度和比活性。来自医用水蛭(Hirudomedicinalis)的水蛭抑制剂c是枯草杆菌蛋白酶和ASP蛋白酶的紧密结合蛋白质抑制剂(Heinz等人，Biochemistry,31:8755-66[1992])，因而可用于测量蛋白酶浓度，继而可以计算比活力。通过标准方法合成了水蛭抑制剂c的基因并在大肠杆菌中进行了表达。其特性和抑制效力与购自Sigma的水蛭抑制剂c相同。
(i)水蛭抑制剂C储备溶液的浓度测定
将已知比活性的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的样品稀释于含有1mMCaCl2和0.005％(Tris/Ca缓冲液)的100mMTris缓冲液(pH8.6)中，至适于上述AAPF蛋白酶测定法的浓度。也在该Tris/Ca缓冲液中制备了水蛭抑制剂c储备溶液的若干稀释液。将每种稀释的水蛭抑制剂c溶液的等分试样与等体积的稀释的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶溶液混合。将仅Tris/Ca而无水蛭抑制剂c的等分试样与等体积的稀释的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶溶液混合，以测量在不存在水蛭抑制剂c的情况下未受抑制的枯草杆菌蛋白酶活性。将混合的溶液在室温下温育15-30分钟，然后通过上述AAPF测定法测量每份样品的蛋白酶活性。利用迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的已知比活性，测定每份样品中活性蛋白酶的浓度。然后根据与仅与Tris/Ca缓冲液(无水蛭抑制剂c)混合的未受抑制的枯草杆菌蛋白酶样品相比较所观察到的蛋白酶活性的下降，计算每份样品中水蛭抑制剂c的浓度。因而，利用已知稀释度和体积的水蛭抑制剂c溶液，储备溶液中水蛭抑制剂c的浓度得以测定。
(ii)枯草杆菌蛋白酶变体的浓度和比活性测定
将枯草杆菌蛋白酶变体的样品稀释于含有1mMCaCl2和0.005％的100mMTris缓冲液(pH8.6)(Tris/Ca缓冲液)中。还在该Tris/Ca缓冲液中制备已知浓度的水蛭抑制剂c储备溶液的若干稀释液。将每种稀释的水蛭抑制剂c溶液的等分试样与等体积的枯草杆菌蛋白酶变体溶液混合。将混合的溶液在室温下温育15-30分钟，然后通过AAPF测定法测量每份样品的蛋白酶活性。利用在添加每份水蛭抑制剂c样品时观察到的蛋白酶活性的降低和水蛭抑制剂c的已知浓度，完全抑制每种枯草杆菌蛋白酶变体所需的水蛭抑制剂c的浓度得以计算。这个浓度等同于样品中的酶浓度。也将仅Tris/Ca缓冲液(无水蛭抑制剂c)的等分试样与每份枯草杆菌蛋白酶变体样品混合，通过AAPF测定法测量在不存在水蛭抑制剂c的情况下的蛋白酶活性。然后利用如上面测定的酶浓度计算枯草杆菌蛋白酶变体的比活性。
BMI微样本测定法
从CFT获得具有5.5毫米圆直径的血、奶和墨(BMI)染污的微样本(EMPA116)。在一种方法中，将EMPA116BMI织物在水中预先漂洗，然后切到96孔微量滴定板(Corning3641)中，每孔一片微样本。在第二种方法中，直接将EMPA116布条切到96孔微量滴定板(Corning3641)中，然后在该板中用两次水洗涤进行漂洗。通过将200μLMilliQ水添加至每孔/样本并在桌面混合器(Lablineinstruments，4825型滴定板振荡器)上以设定值7将它们混合15分钟，来进行漂洗。移除洗涤液并再次添加200μL水至样本再进行一次15分钟漂洗。移除洗涤水，然后使样本在微量滴定板中风干。
将洗涤剂组合物7-11稀释于Milli-Q(去离子的)水中至表1-1中所述的最终工作浓度。用2mM碳酸钠(pH10.3)缓冲这些洗涤剂。另外，将水硬度组合物(3:1Ca:Mg.-CaCl2:mgCl2·6H2O)添加至每种洗涤剂溶液至表1-1中所述的最终工作浓度。将洗涤剂溶液在室温下混合0.5至2小时，在50mL聚丙烯锥形管中以3000×g离心5-10分钟，并对于32℃测定法保持在室温下或对于16℃测定法在冰水浴中预先平衡。然后，将190μl所需的洗涤剂溶液添加至MTP的每个装有BMI微样本的孔。向该混合物添加5-15μL稀释的酶母稀释溶液，从而使反应物中酶的大概浓度为0.25-2μg/ml。酶母稀释溶液从过滤过的培养上清液制备(参见上述TCA测定法)，浓度为约2.5-20μg/mL。将MTP用胶带密封并置于冰箱中的预先设定为16℃的iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)中30分钟或在台面上的预先设定为32℃的iEMS温育器/振荡器中30分钟，伴随1400rpm搅拌。在适当条件下温育后，将120-125μL来自每孔的溶液转移到新的MTP(Corning9017)中。将装有125μl的溶液/孔的新MTP用MTPSpectraMax读板机在600nm处读数(在读板机中用5秒混合模式)。还包括了装有微样本和去污剂但无任何酶的空白对照。然后针对空白值(无酶底物)校正获得的吸光度值，从而提供水解活性的度量。对每个样品(变体)计算性能指数。该性能指数将相同蛋白质浓度下变体的性能(测量值)与标准酶的性能(理论值)相比较。另外，可用标准蛋白酶的性能剂量响应曲线的参数计算理论值。大于1的性能指数(PI)(PI>1)可确定较于标准(例如野生型)更好的变体，而等于1的PI(PI＝1)可确定与标准相同的变体，小于1的PI(PI<1)可确定比标准差的变体。因而，PI可确定优胜者以及在某些情况下较不期望使用的变体。
LAS/EDTA稳定性测定法
在限定条件下温育后测量蛋白酶变体在存在代表性阴离子型表面活性剂(LAS＝直链烷基苯磺酸盐，十二烷基苯磺酸钠-DOBS)和乙二胺四乙酸二钠的情况下的稳定性，使用如上所述的AAPF测定法测定残余的活性。使用的试剂是十二烷基苯磺酸钠盐(DOBS；SigmaNo.D-2525)、(SigmaNo.P-8074)、乙二胺四乙酸二钠(SiegfriedHandelNo.164599-02)、HEPES(SigmaNo.H-7523)、非应激缓冲液(50mMHEPES(11.9g/l)+0.005％pH8.0)、应激缓冲液(50mMHEPES(11.9g/l)、0.1％(w/v)DOBS(1g/l)、10mMEDTA(3.36g/l),pH8.0)、含有200-400μg/ml蛋白质的参照蛋白酶和蛋白酶变体培养上清液。使用的设备是作为稀释板的V形或U形底MTP(分别是Greiner651101和650161)、用于非应激板、LAS/EDTA缓冲液板以及用于suc-AAPF-pNA板的F形底MTP(Corning9017)、BiomekFX(BeckmanCoulter)、SpectramaxPlus384MTP读板机(MolecularDevices)和iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)。
iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)设定为29℃。将培养上清液稀释到装有非应激缓冲液的板中至约25ppm的浓度(母稀释板)。对于该测定法，将20μL来自母稀释板的样品添加至装有180μL非应激缓冲液的板以得到2.5ppm的最终温育浓度。将内容物混合并保持在室温下，对这个板进行AAPF测定法。另外，将20μl来自母稀释板的样品也添加至装有180μl应激缓冲液(50mMHEPES(11.9g/l),0.1％(w/v)DOBS(1g/l),10mMEDTA(3.36g/l),pH8.0)的板。将溶液混合并立刻置于400rpm的29℃iEMS震荡器中30分钟。温育30分钟后，对该应激板进行AAPF测定法。如下通过计算残余和初始AAPF活性之比来测定样品的稳定性：残余活性(％)＝[mOD.min-1应激]*100/[mOD.min-1非应激]。
根据要使用的测定体系(例如北美、日本、西欧或中欧条件)测定最终的洗涤剂、水硬度和缓冲液浓度。在一些方面，在市售的洗涤剂中测定蛋白酶变体的去污性能。商业洗涤剂制剂的热灭活用于破坏任何蛋白质组分的酶活性而同时保留非酶组分的特性。因而，这个方法适于制备用于测试本发明的酶变体的商购洗涤剂。
烘蛋微量滴定测定法
对于这个测定法，从鸡蛋黄制备96孔烘蛋黄基材板。将鸡蛋黄与蛋白分离，从囊膜释放出来，用Milli-Q水稀释成20％(体积/重量)。用磁力搅拌器将稀释的蛋黄在室温下搅拌15分钟。用8通道移液管小心吸移5μL到96孔V形底板(Costar#3894)的每个孔的中央。将板在90℃下烘焙1小时并在室温下冷却。将烘蛋黄基材板在室温下保存并在制备的一周内使用。如本文所述制备自动餐具洗涤剂并预加热至50℃。用8通道移液管将190μL的等分洗涤剂添加至96孔板的每孔。用96通道移液装置将10μL稀释的酶添加至每孔。将板小心地用胶粘箔密封器密封，在振荡下于50℃温育30分钟。将120μL反应混合物转移至新的96孔平底板，在405nm处测定吸光度/光散射。405nm处的吸光度/光散射与蛋黄移除量成比例。
蛋黄微样本测定法(“CS-38微样本测定法”；或“EGG”或“餐 具”)
如本文所述制备自动餐具洗涤剂。所使用的设备包括NewBrunswickInnova4230振荡器/温育器和SpectraMAX(340型)MTP读板机。MTP获自Costar(9017型)。带有颜料的老化蛋黄样本(CS-38)获自材料测试中心(CenterforTestMaterials，荷兰费拉尔丁恩)。在切制0.25英寸圆形微样本之前，用水洗涤织物。在96孔微量滴定板的每个孔中放置一个微样本。将测试洗涤剂在50℃下平衡。将190μl洗涤剂溶液添加至MTP的每个装有微样本的孔。向这个混合物添加10μL稀释的酶溶液。用胶粘箔密封MTP，置于温育器中30分钟，同时伴随搅动。温育后，将100μL来自每个孔的溶液转移至新MTP中。用SpectraMaxMTP读板机在405nm处对这个MTP进行读数。还包括了空白对照以及装有微样本和洗涤剂但无酶的对照。
在一些方面，可使用预先洗涤过的微样本。将这个类型的微样本在环境温度下在去离子水中预先洗涤20分钟。在预洗涤步骤后，将样本置于纸巾上干燥。然后将风干的样本在冲出式压机上用-1/4"圆形冲模打孔。最后将两个微样本竖直放到96孔MTP的每个孔中以暴露整个表面积(即不平躺在孔的底部)。
待测试的蛋白酶变体的样品获自在MTP板中生长的培养物的过滤过的培养液。使用的设备是BiomekFXRobot(BeckmanCoulter)、SpectraMAXMTP读板机(340型；MolecularDevices)、iEMS温育器/振荡器(Thermo/Labsystems)；F形底MTP(Costar9017型，用于读取温育后的反应板)；和V形底MTP(Greiner651101，用于上清液的预稀释)。在这个测定法中，蛋白酶水解该基材并从该基材释放颜料和不溶性粒子。因而，浊度的速率是酶活性的量度。
在MTP规模上在市售的洗涤剂(Calgonit5in1)中测定参考丝氨酸蛋白酶及其变体对微样本的去污性能。将从CFTVlaardingen获得的CS-38微样本(带染料的蛋黄，通过加热老化)用作基材。每个孔使用两个样本。来自Calgonit5in1的ADW片剂用于制备洗涤剂溶液。为了使所述片剂中存在的蛋白酶活性失活，将21g片剂溶解于在水浴中加热至60℃温度的Milli-Q水中。使溶液冷却至室温，将水的体积调节至700ml。用水进一步稀释该溶液以达到3g/l的最终浓度。通过添加1.46ml的Ca/Mg混合物(Ca/Mg混合物[(3:1)，1.92MCaCl2＝282.3g/LCaCl2.2H20；0.64MMgCl2＝130.1g/LMgCl2·6H2O)，15000gpg]将水硬度调节至21°GH。将酶样品在10mMNaCl、0.1mMCaCl2、0.005％溶液中预先稀释，在适当浓度下测试。
将温育器设定在50℃的所需温度。将72μL的稀释缓冲液添加至空的V形底板(即“稀释板”)，然后添加8μL上清液。将来自稀释板的9μL添加至装有在171μL洗涤剂溶液中温育过的微样本的板中。将来自稀释板的9μL添加至装有所述微样本的板以得到200X的上清液总稀释度。将该微样本板(具有洗涤剂和酶)用胶带覆盖并置于温育器/振荡器中1400rpm下30分钟。温育后，将75μL反应混合物转移至空的F形底板，在用吹风机去泡后在MTP读板机中读取405nm处的吸光度。在该测试中还包括了空白对照(装有一个或两个微样本和洗涤剂但未添加含参考蛋白酶的样品)。
然后针对空白值(无酶底物)校正获得的吸光度值，从而提供水解活性的度量。对每个样品(变体)计算性能指数。该性能指数将相同蛋白质浓度下变体的性能(实际值)和标准酶的性能(理论值)相比较。另外，可用标准酶的朗缪尔方程的参数来计算理论值。
不锈钢上的蛋黄污渍
将这些实验中使用的不锈钢板(10×15cm；一侧擦刷过)在实验室用餐具洗涤机中用高碱度市售洗涤剂(例如洗涤剂；Henkel)在95℃下彻底洗涤，以提供清洁且无油脂的钢片。在第一次使用这些钢片之前对它们清理毛刺。将钢片在热柜中80℃下干燥30分钟，然后用蛋黄染污。在进行染污之前不接触待擦刷的表面。另外，在表面上不允许有水渍或尘块。在染污之前对冷却的钢片进行称重。
通过将大约10-11个蛋的蛋黄(200g蛋黄)与蛋白分离来制备蛋黄。将蛋黄用叉子在玻璃烧杯中搅拌以匀化蛋黄悬浮液。然后使蛋黄通过滤器(大约0.5mm网孔)以除去粗颗粒和任何蛋壳碎片。
用平刷(2.5")将1.0±0.1g蛋黄悬浮液尽可能均匀地涂抹在每个不锈钢板的擦刷过的侧面的140cm2面积上，留下大约1cm宽的未染污的边缘(如果需要的话，使用胶带)。将染污的钢片在室温下水平干燥(以防止在钢片的边缘形成小滴)4小时(最高24小时)。
为进行变性，将钢片浸没在煮沸的软化水中30秒(如果需要的话，使用夹持装置)。然后，将钢片在80℃下再次干燥30分钟。干燥并冷却后，对钢片进行称重。称重后，使钢片静置至少24小时(20℃，40-60％相对湿度)后再让其接受洗涤测试。为了满足测试要求，仅将具有500±100mg/140cm2(变性后的蛋黄)的钢片用于测试。在进行洗涤测试后，将钢片在热柜中80℃下干燥30分钟，冷却后再次称重。通过将(洗涤释放的蛋黄(mg)×100)除以(涂抹的变性蛋黄(mg))测定清洁性能百分数。
瓷盘上的肉糜
对于这些实验，使用符合EN50242,form1495,No.0219的直径19cm的甜点盘(Arzberg公司，白釉瓷器)。在除去可见的脂肪后，将总共225g猪瘦肉和牛肉(一样一半)切细并冷却。将混合物两次通过碎肉器。避免温度高于35℃。然后，将225g肉糜与75g蛋(蛋白和蛋黄混合在一起)混合。然后在使用前，将制备物-18℃下冷冻最多三个月。如果没有猪肉可用，则使用牛肉。
使该肉糜和鸡蛋混合物(300g)升至室温并与80ml合成水混合。然后使用厨房手动混合器将该混合物匀化2分钟。然后，使用叉子将3g肉糜/蛋/水混合物铺展在每个白色瓷盘上，在边缘周围留下大约2cm宽的未染污的空白区。涂抹的量为11.8±0.5mg/cm2。将盘在预热的热柜中120℃下干燥2小时。盘一冷却，它们即备好待用。将盘堆叠，每个盘之间放纸巾。
洗涤后，将盘喷以茚三酮溶液(1％乙醇)以更好地鉴别肉糜残余物。为了促进该颜色反应，将盘在热柜中80℃下加热10分钟。通过参照IKW图卡(photographiccatalogue)(IKW)目测观察肉糜残余物的颜色反应来进行对洗涤性能的评价。
不锈钢上的蛋/奶污渍
将这些实验中使用的不锈钢板(10×15cm；一侧擦刷过)在实验室用餐具洗涤机中用高碱度市售洗涤剂在95℃下彻底洗涤，以移除油脂和清洁钢片。用纤维素布将钢片擦亮擦干。在进行染污之前不接触待擦刷的表面。另外，在表面上不允许有水渍或尘块。在进行染污之前，将钢片置于80℃的热柜中30分钟。在进行染污之前对冷却的钢片进行称重。
将完整生鸡蛋(3-4个蛋；160g/蛋)的蛋黄和蛋白放置在碗中，用搅蛋器搅拌。然后，将50ml半脱脂UHT(1.5％脂肪，超高温，匀化的)奶添加至该混合物。在不产生泡沫的情况下将该奶和蛋混合。用平刷将1.0±0.1g蛋/奶混合物均匀分布在不锈钢板的经擦刷的一侧上，用天平检查分布。在钢片的短侧边周围留下大约1.0cm的空白区。将染污的钢片在室温下水平干燥(以防止在钢片的边缘形成小滴)4小时(最高24小时)。
然后将钢片浸没在煮沸的软化水中30秒(如果需要的话，使用夹持装置)。然后，将钢片在80℃下再次干燥30分钟。干燥并冷却后，对钢片进行称重。称重后，使钢片静置至少24小时(20℃，40-60％相对湿度)后再让其接受洗涤测试。为了满足测试要求，仅使用具有190±10mg蛋黄的钢片。
在进行洗涤测试后，将钢片在热柜中80℃下干燥30分钟，冷却后再次称重。通过将(洗涤释放的蛋/奶(mg)×100)除以(涂抹的蛋/奶(mg))测定清洁性能百分数。
瓷盘上的意大利面条混合污渍的制备
将意大利面酱(390g)与150g煮熟的意大利面、25g肉糜(改进的IKW组合物-225克无脂肪肉糜和75克蛋黄的组合)和50gGrozetteFormaggio奶酪混合。用勺子将3g的这个混合物铺展在每个白色陶瓷盘(Arzberg公司，19cm直径，白釉瓷器，符合EN50242,form1495,No.0219)上，在边缘周围留下大约2cm宽的未染污空白区。通过将盘在烘箱中120℃下烘焙2小时使盘干燥。盘一冷却，它们即准备好待用。将盘堆叠，每个盘之间放纸巾，用于保存。洗涤后，将盘喷以碘溶液(0.05N)以更好地鉴别碳水化合物残余物。通过参照IKW图卡(IKW)目视检查碳水化合物残余物的颜色反应来进行对洗涤性能的评价，并按0-10的等级(10为清洁)评分。
性能指数
性能指数将相同蛋白质浓度下变体的性能(测量值)和标准酶的性能(理论值)相比较。另外，可用标准蛋白酶的性能剂量响应曲线的参数计算理论值。下面示出的各个术语用于描述该变体：非有害变体具有PI>0.05；有害变体具有PI＝0.05；可组合的变体是变体对于至少一种特性具有大于或等于0.2的性能指数值以及对于所有性质具有>0.05的性能指数值的那些。可组合的变体是可以进行组合以提供对于一种或多种所需性质而言具有适当性能指数的蛋白质的那些。这些数据可用于对任何枯草杆菌蛋白酶进行工程改造。即使待进行工程改造的枯草杆菌蛋白酶在特定位置处具有与枯草杆菌蛋白酶GG36的氨基酸不同的氨基酸，但这些数据可用于通过鉴别置换(包括GG36野生型氨基酸的置换)的最佳选择来找到会改变所需特性的置换。
实施例2
用位点评价文库(SEL)产生GG36单突变体
本实施例中描述的GG36SEL的构建由GENEART使用他们的用于基因优化、基因合成、文库产生和分析的专有方法和技术平台(WO2004/059556A3、欧洲专利No.0200362和No.0201184；以及美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.6,472,184)进行。使用pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒(参见图6)，在本发明人预先选择的位置处产生GG36SEL。这个枯草芽孢杆菌表达质粒含有下面示出的GG36表达盒、地衣芽孢杆菌LAT启动子(Plat)和来自pUB110(McKenzie等人，Plasmid(《质粒》)，15:93-103,1986)的包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)在内的额外元件(美国专利No.6,566,112中的图4)。pHPLT-GG36质粒图谱在图6提供。GG36表达盒序列在下文提供。
GG36的DNA序列(信号序列以小写字母示出，前肽以小写带下划线的文本示出，GG36成熟序列以大写字母示出)在下面提供：
Gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagta gaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcc tgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgagctcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgc agaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAA(SEQIDNO:756)
GG36的蛋白质序列(信号序列以小写字母示出，前肽以小写带下划线的文本示出，GG36成熟蛋白酶序列以大写字母示出)在下面提供：
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhe fetipvlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQIDNO:757)。
诱变的方法是基于密码子特异性突变方法，其中使用在所关注的位点含有简并密码子NNS((A、C、T或G)、(A、C、T或G)、(C或G))的正向和反向诱变引物在所关注的特定密码子处同时产生所有可能的氨基酸置换。为了构建GG36SEL中的每一者，进行了三个PCR反应：两个诱变反应(初次PCR1和PCR2)，以利用NNS正向和反向诱变引物(长25-45个核苷酸)在成熟GG36DNA序列中引入所关注的突变密码子，和第三个反应，以将两个诱变PCR产物融合在一起来构建在成熟GG36序列中具有所需的突变密码子的pHPLT-GG36表达载体。
这个实施例中使用的引物序列在下面提供：
Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes目录号F-530L)用于所有的PCR，反应根据随同该聚合酶提供的生产商的方案执行。具体来讲，对于初次PCR1，使用1μL(10μM)的pHPLT-BglII-Fw引物和NNS反向诱变引物每一者，对于初次PCR2，使用1μL(10μM)的pHPLT-BglII-Rv引物和NNS正向诱变引物。每种反应物还包括1μL的pHPLT-GG36质粒模板DNA(0.1–1ng/μL)。用MJResearchPTC-200Peltier热循环仪进行PCR。反应产生出在所关注的GG36密码子周围具有大约30个核苷酸重叠的大约2至3kb的两个片段。所获得的片段在类似于上述PCR的第三PCR中融合，该第三PCR使用1μL初次PCR1反应混合物、1μL初次PCR2反应混合物和1μL(10μM)的正向和反向SacI-Fw和HindIII-Rv引物的每一者。将扩增的编码GG36变体基因的859bp线性片段纯化(使用QiaquickPCR纯化试剂盒)并用SacI和HindIIII限制酶消化以在融合片段的两侧产生粘性末端。约50ng的质粒pHPLT-GG36也在用SacI和HindIIII消化后进行纯化，从而得到3.9kb载体骨架片段。用T4DNA连接酶(Invitrogen)按照生产商关于粘性末端克隆的方案，将消化的载体片段与50ng消化的编码变体酶的859bp片段连接。随后，将连接混合物如所描述(WO2002/014490)用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE,ΔnprE,oppA,ΔspoIIE,degUHy32,ΔamyE::[xylR,pxylA-comK])。
为了表达变体蛋白用于进一步生化分析，将携带GG36变体质粒的枯草芽孢杆菌菌株接种到装有150μl补充有10μg/ml新霉素的Luria肉汤培养基的微量滴定板中。使用Enzyscreen微量滴定板盖(Enzyscreen)，将板在37℃下以300rpm振荡和80％湿度进行培养。将来自过夜培养板的10微升用于接种装有190μl带10ug/ml新霉素的MBD培养基(基于MOPS的成分确定的培养基)的新微量滴定板。基本上如本领域所知制备MBD培养基(参见Neidhardt等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，119:736-747[1974])，例外的是在基础培养基中省掉NH4Cl2、FeSO4和CaCl2，使用3mMK2HPO4，并且基础培养基补充有60mM尿素和100ml由210g/l葡萄糖和350g/l麦芽糖糊精制成的溶液。补足微量营养素，营养素为100X储备溶液，其1升含有400mgFeSO4·7H2O、100mgMnSO4·H2O、100mgZnSO4·7H2O、50mgCuCl2·2H2O、100mgCoCl2·6H2O、100mgNaMoO4·2H2O、100mgNa2B4O7·10H2O、10ml1MCaCl2和10ml0.5M柠檬酸钠。使用Enzyscreen盖(Enzyscreen)，将装有MBD培养基的微量滴定板在37℃、300rpm和80％湿度下培养68小时，以测定蛋白质表达。第二天，将培养物滤过微过滤器板(0.22μm；Millipore)并将所得的滤液用于生化分析。如实施例1中所述进行洗涤剂组合物7-11的TCA和BMI微样本测定法。也如实施例1中关于BMI测定法描述内容所述计算性能指数，将它们相对于GG36示于表2-2中。在下面的各表中，洗涤剂组合物与上面的表D中所示的那些相对应。另外，如所指出，氨基酸位置根据BPN’编号方式列出。
实施例3
NHJ1组和WCE1组GG36变体的构建及清洁性能
本文描述的NHJ1组和WCE1组GG36变体在DNA2.0,Inc.公司利用上述pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒(图6)构建。如实施例2中所述在枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)中表达变体，并用实施例1中所述的用于蛋白质含量测定的TCA测定法、LAS/EDTA稳定性测定法和BMI微样本清洁测定法进一步表征。这些结果在表3-1和3-2中示出。在下面的各表中，洗涤剂组合物与上面的表D中所示的那些相对应。另外，如所指出，氨基酸位置根据BPN’编号方式列出。
实施例4
NHJ4组GG36变体的构建及清洁性能
如下所述使用PCR融合或多定点诱变试剂盒(“QCMS试剂盒”；Stratagene)，利用pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒(图6)，构建下面表4-4中所述的NHJ4组GG36变体。
a)通过 多定点诱变构建NHJ4变体
利用多定点诱变产生的变体在表4-1中示出。根据生产商的说明书，使用2微克的DNA和Dam甲基化酶(NEB)对亲本质粒pHPLT-GG36(模板DNA)进行甲基化。通过多定点诱变试剂盒(“QCMS试剂盒”；Stratagene)按照生产商的方案制备定点突变体。在亲本质粒中引入如下突变：S101A-S103G-V104L、G159E、T22A、Y209E、E271F、S101A、S103G、L111V、S128N、N62E和S188D。为了有效转化枯草芽孢杆菌，使用IllustraTempliphi试剂盒(GEHealthcare)通过滚环扩增(RCA)来扩增来自QCMS反应混合物的DNA，根据生产商的方案进行该反应。用1微升10倍稀释的经扩增的DNA转化50μl感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将该转化混合物在37℃下振荡1小时。将转化混合物的10微升等分试样平板接种于补充有10μg/ml新霉素(Teknova)的脱脂乳(1.6％)Luria琼脂板上。随后，将具有晕圈的菌落接种于120μL含有10μg/mL新霉素的LB培养基中用于质粒DNA提取(QIAprepSpinMiniprep试剂盒，Qiagen)。将提取的质粒进行测序以确认所需的突变的存在。
b)通过延伸PCR构建NHJ4变体
通过延伸PCR产生GG36的10个组合突变体。pHPLT质粒中含有的GG36基因中引入的突变的名单为T22A、N62E、S103G、S103G-L111V、S101G-S103A-V104I、S101A-S103G-V104L、S101A、S128N、G159D、G159E、Y209E和L111V。为了产生每种突变体，使用诱变引物以及正向和反向引物扩增含有所需的突变的PCR片段，以扩增整个GG36变体。每个PCR扩增反应物含有30皮摩尔的每种诱变引物和100ng的DNA模板即pHPLT-GG36质粒。用VentDNA聚合酶(NEB)进行扩增。一开始将该PCR反应物(20μL)在95℃下加热2.5分钟，然后30个循环的：94℃下变性15秒，55℃下退火15分秒，72℃下延伸1分钟。扩增后，使用凝胶带纯化试剂盒对每种变体的2至4个PCR片段进行凝胶纯化并混合(50ng的每种片段)。这些混合物充当延伸PCR的DNA模板以产生全长基因片段。PCR条件与上面描述的相同，例外的是延伸阶段，其在72℃下进行2分钟。将该全长DNA片段用凝胶带纯化试剂盒进行凝胶纯化，用BamHI和HindIII限制酶消化并与用相同限制酶消化的pHPLT-GG36连接。通过IllustraTempliphi试剂盒根据生产商的说明书(GEHealthcare)利用滚环扩增对1微升的连接混合物进行扩增，以产生用于转化到枯草芽孢杆菌中的多聚体DNA。将该滚环扩增的产物稀释100倍并用于转化枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。将转化混合物的等分试样平板接种于含有1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB板上，并在37℃下温育过夜。随后，将具有晕圈的菌落接种于120μL含有10μg/mL新霉素的Luria肉汤培养基中用于质粒DNA提取(QIAprepSpinMiniprep试剂盒，Qiagen)。将提取的质粒进行测序以确认所需的突变的存在。由延伸PCR产生的变体在表4-1中示出。
为了表达NHJ4组变体蛋白用于进一步生化分析，将携带该变体质粒的枯草芽孢杆菌菌株接种到装有150μl补充有10μg/ml新霉素的Luria肉汤培养基的微量滴定板中。如实施例2中使培养物生长以用于蛋白质表达，同样如实施例2中所述将它们滤过微过滤器板(0.22μm；Millipore)。将所得的滤液用于生化分析。如实施例1中所述进行用于蛋白质含量测定的水蛭抑制剂c抑制测定法和在各种洗涤剂中测试的BMI微样本测定法。还如实施例1中关于BMI测定法描述内容所述计算性能指数。表4-1提供了关于这些多突变变体和它们所获得的结果的信息。PI值是相对于GG36而言的。在下面的各表中，洗涤剂组合物与上面的表D中所示的那些相对应。另外，如所指出，氨基酸位置根据BPN’编号方式列出。
实施例5
NHJ3组GG36变体的构建及清洁性能
本文描述的NHJ3组变体是基于含有如下突变的GG36的变体(称为GG36-9)：S101G、S103A、V104I、G159D、A232V、Q236H、Q245R、N248D和N252K(BPN’编号方式)。这些变体用快速定点诱变试剂盒(QCLDS试剂盒；Stratagene)，以pRA68质粒(参见图7)作为DNA模板产生。质粒pRA68衍自pBN3载体(参见Babé等人，Biotech.Appl.Biochem.(《生物技术与应用生物化学》)27:117-124[1998])。
GG36-9变体的DNA序列(信号序列以小写字母示出，前肽以小写带下划线的文字示出，GG36-9成熟序列以大写字母示出)在下面提供：Gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtaga ggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcct gttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgc agaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGGGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACATAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAAAACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCGAAGCTGCAACTCGTTAA(SEQIDNO:762)
GG36-9变体的蛋白质序列(信号序列以小写字母示出，前肽以小写带下划线的文本示出，GG36-9成熟蛋白酶序列以大写字母示出)在下面提供：
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellh efetipvlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAVLVKHKNPSWSNVRIRDHLKKTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQIDNO:763)
为了用QCLSD试剂盒产生NHJ3变体，根据生产商的方案针对每种变体设计了诱变引物。按照生产商的说明书，每种变体的诱变反应物由如下组成：0.5μL10X缓冲液、0.5μLpRA68质粒DNA(168ng/μL)、0.5μl正向诱变引物(25μM)、0.5μL反向诱变引物(25μM)、1μLdNTP(在QCLSD试剂盒中提供)、1.5μL快速溶液(在QCLMS试剂盒中提供)、1μl酶混合物(在QCLSD试剂盒中提供)和补足至50μL反应体积的40μL蒸馏去离子水。循环程序为1个循环的95℃2分钟，18个循环的：95℃20秒，60℃10秒以及68℃3分钟22秒，以及最后一个循环的68℃5分钟。接着，用1μL的在该试剂盒中提供的DpnI限制酶消化该反应物中的质粒DNA，然后用2μL的反应物转化TOP10大肠杆菌感受态细菌(Invitrogen)。37℃下培养过夜后，在含有50μg/mL(ppm)羧苄青霉素的Luria肉汤培养基板上选择大肠杆菌转化株。使用QIAprepspinminiprep试剂盒(Qiagen)，从4-8个在含有50μg/mL(ppm)羧苄青霉素的LA培养基中培养的大肠杆菌菌落提取质粒DNA。将质粒进行测序以确认所需的突变的存在。然后如实施例2中所述将变体质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞中。如实施例2中所述培养枯草芽孢杆菌变体菌株用于进一步生化分析，如使用水蛭抑制剂c抑制测定法的蛋白质含量测定(实施例1)和BMI微样本清洁测定法(实施例1)。结果在下面的表5-1和5-2中给出。PI是相对于GG36而言的。在下面的各表中，洗涤剂组合物与上面的表D中所示的那些相对应。另外，如所指出，氨基酸位置根据BPN’编号方式列出。
实施例6
NHJ5组GG36变体的构建及清洁性能
本文描述的NHJ5组变体是基于含有如下突变的GG36的变体(称为GG36-7)：S101G、S103A、V104I、G159D、A232V、Q245R和N248D(BPN’编号方式)。这些变体用快速多定点诱变试剂盒(“QCLMS试剂盒”)，以pRA96质粒(参见图8)作为DNA模板产生。掺入的突变包括：H243R(H249R)、E265F(E271F)、D157E(D159E)、A156E(A158E)、A156E-D157G(A158E-D159E)、T22A、N60E(N62E)、N232R(N238R)、D242R(D248R)、T247R(T253R)、S24R、N74D(N76D){GG36编号方式以及BPN’编号方式在括号中显示。
使用实施例5中描述的方法产生变体。如实施例2中所述培养枯草芽孢杆菌变体菌株用于进一步生化分析，如使用水蛭抑制剂c抑制测定法的蛋白质含量测定(实施例1)和BMI微样本清洁测定法(实施例1)。结果在下面的表6-1中给出。PI值是相对于GG36而言的。在下面的各表中，洗涤剂组合物与上面的表D中所示的那些相对应。另外，如所指出，氨基酸位置根据BPN’编号方式列出。
GG36-7变体的DNA序列(信号序列以小写字母示出，前肽以小写带下划线的文本示出，GG36-7成熟蛋白酶序列以大写字母示出)在下面提供：
gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtaga ggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcct gttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgc agaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGGGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCGAAGCTGCAACTCGT(SEQIDNO:764)
GG36-7变体的蛋白质序列(信号序列以小写字母示出，前肽以小写带下划线的文本示出，GG36-7成熟蛋白酶序列以大写字母示出)在下面提供：
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhefetip vlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAVLVKQKNPSWSNVRIRDHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQIDNO:765)
实施例7
NHJ2组合文库的构建
这个实施例描述了涉及一种或多种如下突变的GG36组合文库的构建：A16S、T22A、S101A、S103G、V104L、L111V、S128N和L148I(BPN’编号方式)。将pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒提供给DNA2.0Inc.公司用于产生NHJ2组合文库。构建的NHJ2文库的连接反应物由DNA2.0Inc.公司提供用于转化到枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)中。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物测试了所产生的含有一个或若干本文所述突变的变体的冷水清洁应用。
实施例8
另外的文库和GG36变体的构建
使用如下一组突变构建了另外的文库和变体：A1R、A230E、E271L、G115R、G20R、H249R、K235F、K27V/F/L、L75E、L82R、N18R、N269R、N43D、N43R、N76D、R45T、S212F、S242R、S24R、S78R、S9A、T22R、V121E、V244R、V28E、V30E、V4R、W241R(BPN’编号方式)。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物测试了所产生的含有一个或多个这些突变的变体的冷水清洁应用。
构建了另外的GG36变体组并使用本文所述的方法和洗涤剂组合物测试了冷水清洁应用，包括：G20R-N43R-H249R、G20R-T22R-N43R、G20R-N43R-S242R、G20R-N43R-E271L、G20R-N43R-V244R、G20R-S24R-N43R-S242R、S9A-T22R-S78R-S212F-W241R、S9A-G20R-N43R-S212F、S9A-N43R-S212F、G20R-N43R-S212F、G20R-T22R-N43R-S212F、S24R-S78R-S212F、S9A-N43R-S78R、S9A-N43R-S78R-S242R、S9A-G20R-N43R-S78R、G20R-S24R-N43R-S78R-S242R、T22R-S24R-S78R-S212F、S9A-G20R-N43R-S78R-S242R、G20R-N43R-S78R-H249R、G20R-N43R-S78R、S9A-S78R-S212F、S9A-T22R-N43R-S78R、S9A-G20R-S24R-N43R、S9A-T22R-S78R-S212F、V4R-S9A-T22R-S78R-S212F、G20R-S24R-N43R、A1R-S9A-N43R、G20R-S24R-N43R-G115R、S9A-S24R-N43R、G20R-T22R-S24R-N43R、A1R-S24R-N43R、S9A-G20R-S24R-N43R-S242R、S9A-G20R-T22R-S78R-S212F、S9A-S24R-N43R-V244R、S9A-S24R-N43R-S242R、V4R-S9A-T22R-S24R-S212F和T22R-S24R-N43R(BPN’编号方式)。
实施例9
GG36文库WCE2的构建及清洁性能
WCE2组合文库由DNA2.0,Inc.公司使用pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒产生。构建的WCE2文库的连接反应物由DNA2.0,Inc.公司提供用于转化到枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK-phleo)中。用于产生WCE2文库的突变组是：A230E、G20R、H249R、N18R、N43R/D、N76D、R45T、S242R和S24R(BPN’编号方式)。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物测试了所产生的含有一个或多个这些突变的变体的冷水清洁应用。
实施例10
WCE3组GG36变体的构建及清洁性能
这个实施例描述了基于GG36变体、GG36-7(实施例5)和GG36-9(实施例4)的WCE3组突变体。这些变体是：S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R、S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D、S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R、S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R、S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R、S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R和S101G、S103A、V104I、A232V、Q236H、Q245R和N252K。它们用快速多定点诱变试剂盒(QCLMS试剂盒；Stratagene)，以pRA96质粒(参见图5)作为DNA模板产生。所产生的变体将用本申请描述的方法和洗涤剂组合物测试其冷水清洁应用。
实施例11
另外的GG36文库和变体的构建
这个实施例描述了利用枯草芽孢杆菌表达质粒(例如pHPLT-GG36；图6)，采用一种或多种如下突变构建GG36变体和文库：A16S、T22A、S24R、N62E、N76D、E89P、S101A/G、S103G/A、V104L/I、L111V、S128N、P129E、A232V、L148I、A158E、G159D/E、S166D、R186H、S188D、Y209E、Q236H、N238R、Q245R、N248D/R、H249R、N252K/R、T253R、E271F(BPN’编号方式)。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物测试了所产生的含有一个或多个这些突变的变体的冷水清洁应用。
实施例12
另外的GG36文库和变体的构建
这个实施例描述了采用一种或多种如下突变在枯草芽孢杆菌中构建GG36变体和文库(BPN’编号方式)：A1R、Q2S、Q2M、Q2A、Q2R、Q2W、S3R、V4R、V4S、V4C、I8A、S9A、S9F、S9W、R10S、R10A、R10H、R10M、Q12F、Q12R、P14K、P14F、P14Q、A15R、A15F、A16S、H17R、H17M、H17F、N18R、N18K、G20F、G20K、G20R、T22A、T22R、T22Y、T22V、T22Q、T22L、T22W、G23A、G23S、G23F、S24R、S24F、S24W、S24Q、S24H、S24L、G25V、G25F、G25R、V26F、K27L、K27F、K27R、K27V、V28A、V28N、V28E、A29T、V30E、L31F、T33S、T33G、T33D、G34P、I35M、S36T、S36F、S36R、T38L、T38F、T38R、P40N、P40L、P40T、P40W、P40H、P40R、L42I、N43A、N43F、N43I、N43S、N43R、N43M、N43W、N43D、R45T、G46R、A48R、F50C、V51W、V51F、V51H、P52F、P52E、P52N、P55Y、T57R、Q59A、Q59F、Q59R、D60P、D60Q、D60A、N62E、N62Q、G63V、G63M、G63T、G63I、G63A、G63S、G63H、G63Q、G63D、G63E、G63P、H64F、H64T、V68A、V68C、A69N、A69T、A69P、A69W、T71G、I72C、A74C、L75A、L75F、L75E、L75R、N76D、S78R、S78N、S78I、I79W、I79Q、V81R、L82F、L82T、L82V、L82R、L82M、A85M、P86W、P86L、P86I、E89P、E89T、E89G、E89H、E89L、E89V、E89W、E89F、E89I、Y91N、Y91F、A92F、K94N、S99F、S99T、S99P、S99G、S99M、G100S、G100N、G100Q、G100I、S101A、S101N、S101G、S101T、S101D、S101E、S101P、S101F、G102A、G102T、G102N、G102H、G102E、S103G、S103N、S103D、S103A、V104L、V104I、V104E、V104D、S105T、S105E、S105Q、S106G、S106T、S106E、S106D、S106A、S106V、S106F、I107M、I107F、A108I、A108G、Q109M、L111V、L111I、E112V、E112L、E112Q、A114G、G115K、G115R、N116K、N116A、N116L、N117F、G118R、G118I、M119C、H120A、H120F、H120R、V121F、V121E、N123G、N123E、L124S、S128D、S128F、S128L、S128N、S128H、S128M、S128I、S128Q、P129E、S132A、S132E、A138G、S144R、V147L、L148I、A158E、G159D、G159E、G159C、S160D、S166D、S166E、Y167W、M175V、V177C、D181A、Q182R、N183I、N183D、N183M、N183F、N183R、N185E、N185V、N185I、R186H、R186K、S188E、S188D、S188R、Y192H、Y192W、A194E、A194V、A194F、D197F、I198L、I198F、V203E、V203C、T208S、Y209S、Y209N、Y209F、Y209T、Y209E、Y209H、Y209G、Y209L、P210R、P210V、P210L、G211Q、G211R、S212I、S212M、S212F、T213A、Y214F、A215N、A215D、A215E、A215H、A215F、S216F、S216A、L217E、L217N、L217D、N218D、N218P、N218E、T224A、T224G、V227I、A230E、A231I、A231C、A232V、L233C、V234F、K235F、Q236F、Q236N、Q236H、N238R、N238K、N238L、P239K、P239G、P239R、P239H、P239T、P239N、P239S、P239F、S240R、W241R、S242L、S242R、N243F、N243R、V244R、Q245R、I246S、N248D、N248V、N248I、N248R、H249R、H249T、L250I、K251R、K251S、N252I、N252F、N252R、N252K、N252H、T253I、T253R、T253F、A254C、S256N、G258R、T260V、T260I、L262D、L262H、Y263F、S265F、L267V、L267N、L267M、N269I、N269R、A270C、E271I、E271V、E271H、E271M、E271L、E271P、E271A、E271F、E271T、A272F、A272F、A272R、A273F、A273I和T274G。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物测试了所产生的含有一个或多个这些突变的变体的冷水清洁应用。
实施例13
自动餐具洗涤性能测试
在这个实施例中，描述了用于使用一些市售餐具洗涤剂测定蛋白酶变体的洗涤性能的方法。这些蛋白酶变体中各种条件下测试。这些洗涤剂可从WFK商购获得并通过下文提供的名称来指代。下面提供了用于每种污渍类型(肉糜、蛋黄和含有奶的蛋黄)的方案。在可将各污垢类型施加至测试餐具之前，必须对餐具进行彻底洗涤。这是特别必要的，因为某些持久污渍的残余可能会仍存在于来自之前的测试的餐具上。在新餐具在测试中第一次使用前，也将其进行三次彻底洗涤。
洗涤测试通常在自动餐具洗涤机(例如Miele:G690SC)中进行，该餐具洗涤剂装配有染污的餐具和不锈钢板，如上所述。使用限定量的洗涤剂，如下面结果表中所指出的。在一些实验中，测试的温度为45℃、55℃和65℃。在一些实验中，水硬度为9°或21°GH(德国硬度)(374ppmCa)。
如上所指出，在洗涤后，利用0至10的照片等级量表对用肉糜或意大利面食/调味料/肉/奶酪染污的盘子进行视觉评估，其中“0”定为完全脏的盘子，“10”定为清洁的盘子。这些值与含酶洗涤剂的污渍或污垢移除(SR)能力相对应。
将洗涤过的污染有蛋黄和/或蛋黄奶的不锈钢板通过重量测定法进行分析，以测定洗涤后残余污渍的量。
下面提供了一些示例性的洗涤剂。
实施例14
颗粒状和/或片状洗衣组合物
这个实施例提供了颗粒状和/或片状洗衣组合物的各种制剂。下文提供了如下本发明洗衣组合物，其可以是颗粒或片剂的形式。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
*香料、染料、增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
实施例15
片状洗涤剂组合物
这个实施例提供了各种片状洗涤剂制剂。通过用标准的12头旋转压片机以13KN/cm2的压力压制颗粒状餐具洗涤剂组合物，制备如下本发明片状洗涤剂组合物。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
*增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
实施例14(I)至14(VII)的pH为约10至约11.5；14(VIII)的pH为8-10。实施例14(I)至14(VIII)的片重为约20克至约30克。
实施例16
液体衣物洗涤剂组合物
在这个实施例中，提供了液体衣物洗涤剂组合物的各种制剂。以下的本发明液体衣物洗涤剂组合物如下所示制备。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
#1：添加1NHCl水溶液来调节制剂的净pH处于约3至约5的范围内。
上面实施例15(I)-(II)的pH为约5至约7，实施例15(III)-(V)的pH为约7.5至约8.5。
实施例17
手动餐具液体洗涤剂组合物
在这个实施例中，提供了各种手动餐具液体洗涤剂制剂。下面提供了以下的本发明手动餐具液体洗涤剂组合物。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些另选的方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
实施例16(I)-(VI)的pH为约8至约11。
实施例18
液体自动餐具洗涤剂组合物
在这个实施例中，提供了各种液体自动餐具洗涤剂制剂。下面提供了以下的本发明手动餐具液体洗涤剂组合物。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
实施例19
高密度餐具洗涤剂
这个实施例提供了高密度餐具洗涤剂的各种制剂。下面提供了以下的本发明紧凑型高密度餐具洗涤剂。在每种制剂中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
*增白剂/染料/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
实施例18(I)至(VI)的pH为约9.6至约11.3。
实施例20
液体硬质表面清洁洗涤剂
这个实施例提供了液体硬质表面清洁洗涤剂的各种制剂。下面提供了如下的本发明液体硬质表面清洁洗涤剂组合物。在这些制剂的每一者中，包括浓度为约0.0001至约10重量％的至少一种本文所提供的蛋白酶变体。在某些方面，可使用其他浓度，配置人员可根据他们的需要确定。
实施例19(I)至(VII)的pH为约7.4至约9.5。
将本说明书中引述的所有出版物、专利申请和专利均以引用的方式并入本文，就如同具体且独立地表明将每篇独立的出版物、专利申请或专利以引用的方式并入本文一样。具体地讲，将本文引述的所有出版物明确地以引用的方式并入本文以描述和公开可结合本发明使用的组合物和方法。尽管以说明和实例的方式对上述发明进行了相当详细的描述以使理解透彻，但根据本发明的教导对本领域一般技术人员显而易见的是，可在不脱离随附权利要求的精神和范围的情况下对本发明进行某些改变和修改。

Claims (10)

1.亲本蛋白酶的一种分离的蛋白酶变体，所述变体包含具有三个选自X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S和X217L/Q的氨基酸置换的氨基酸序列，其中所述变体具有蛋白水解活性并且所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2比对来确定。
2.亲本蛋白酶的一种分离的蛋白酶变体，所述蛋白酶变体具有蛋白水解活性并且包含在选自位置24、53、78、97、101、128和217的一个或多个与SEQIDNO:2的氨基酸位置对应的氨基酸位置处具有变更的氨基酸序列，其中所述至少一个变更独立地是
(i)在占据所述位置的氨基酸残基的上游或下游插入一个或多个氨基酸残基，
(ii)占据所述位置的氨基酸残基缺失，或者
(iii)占据所述位置的氨基酸残基置换为另一不同的氨基酸残基，
其中每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的氨基酸位置的对应关系进行编号，所述对应关系通过所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2的比对确定。
3.亲本蛋白酶的一种分离的蛋白酶变体，其中(a)所述蛋白酶变体包含(i)与SEQ:2的序列具有至少90％同一性以及(ii)在位置24和53处具有甘氨酸置换、在位置78和101处具有天冬酰胺置换、在位置128处具有丙氨酸或丝氨酸置换以及在位置217处具有谷氨酰胺置换的氨基酸序列；(b)所述亲本蛋白酶与SEQIDNO:2具有至少90％序列同一性；(c)所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号；以及(d)所述蛋白酶变体相对于所述亲本蛋白酶具有增加的蛋白水解活性和/或清洁活性。
4.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，所述多肽包含与选自如下的多肽序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列：
a)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G；
b)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S033T+N076D；
c)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+N109G+K141R+N243V；
d)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+K256R；
e)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T；
f)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+L257G；
g)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+L257G；
h)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061G+N109G+N243V；
i)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+S248A；
j)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R；
k)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T+N243V+K256R；
l)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V；
m)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G；
n)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+N243V；
o)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+T158S+L257G；
p)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061S+N109G+N243V；
q)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R；
r)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R；
s)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R；
t)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G；
u)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+K256R；
v)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+K256R；
w)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+K256R；
x)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N109G；
y)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S063G；
z)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N076D；
aa)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N218S；
bb)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N076D+N218S；以及
cc)BPN'-S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q，其中所述变体的每个氨基酸位置通过与SEQIDNO:2的序列的氨基酸位置的对应关系进行编号。
5.一种分离的核酸，所述核酸包含编码根据权利要求1-3中任一项所述的变体或根据权利要求4所述的多肽的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。
6.一种分离的核酸，所述核酸包含与SEQIDNO:3或SEQIDNO:5中所示的多核苷酸序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列。
7.一种表达载体，所述表达载体包含至少一条根据权利要求5或6所述的核酸。
8.一种重组宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a)根据权利要求5或6所述的核酸，或(b)根据权利要求7所述的表达载体。
9.一种制备蛋白酶变体的方法，所述方法包括：
(a)将根据权利要求7所述的重组表达载体引入一群细胞中；以及
(b)在有利于制备由所述表达载体编码的蛋白酶变体的条件下在培养基中培养所述细胞。
10.一种包含根据权利要求1-3中任一项所述的变体或根据权利要求4所述的多肽的组合物，所述组合物不是织物和家庭护理产品。
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