JP5863666B2 - プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許仮出願番号61/285,127(2009年12月9日出願)及び同61/392,373(2010年10月12日出願)の優先権及び利益を主張し、これら各々の開示は全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は、プロテアーゼ変異体、プロテアーゼ変異体を含む組成物、並びに、このようなプロテアーゼ変異体及びこれらの組成物を使用する方法を提供する。
a)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、
b)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S033T+N076D、
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h)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061G+N109G+N243V、
i)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+S248A、
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p)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061S+N109G+N243V、
q)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、
r)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、
s)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、
t)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、
u)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+K256R、
v)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+K256R、
w)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+K256R、
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y)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S063G、
z)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N076D、
aa)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N218S、
bb)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N076D+N218S、及び
cc)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q,からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、この変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。
特に指定しない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えDNAにおいて通常使用される従来技術を伴う。このような技術は、当業者に既知であり、当業者に周知の数多くのテキスト及び参考文献に記載されている。上記及び下記の両方で本明細書で言及される全ての特許、特許出願、論文及び刊行物は、これによって本明細書に参照により明示的に組み込まれるものとする。
本発明は、新規ポリペプチドを提供し、これは「本発明のポリペプチド」と集合的に呼ばれ得る。本発明のポリぺプチドは、単離された、組み換え体である、実質的に純粋な又は非自然発生型のプロテアーゼ変異体を含み、例えば、スブチリシンプロテアーゼ変異体ポリペプチドが挙げられ、これは酵素活性(例えば、タンパク質分解活性)及び/又は本明細書の他箇所でより詳細に説明されている追加の特性(例えば、クリーニング活性、安定性など)を有する。本発明のポリペプチドは、単離された、組み換え体である、実質的に純粋な又は自然発生した冷水プロテアーゼを含み、タンパク質分解活性、クリーニング活性、安定性、本明細書の他箇所で説明されている他の特性を有する。冷水プロテアーゼなどの本発明のこのようなポリペプチドは、既知のプロテアーゼと比較して向上した性能(例えば、向上したタンパク質分解活性、向上したクリーニング性能又は活性、向上した安定性など)を有し得る。本発明のポリぺプチドは、クリーニング用途に有用であり、クリーニングする必要のある(例えば、物品の表面の)物品又は表面をクリーニングする方法において有用であるクリーニング組成物中に組み込まれ得る。タンパク質分解活性を有する本発明のポリぺプチドは、例えば、布地ケアクリーニング組成物及びホームケアクリーニング組成物などの布地ケア製品及びホームケア製品で有用である。タンパク質活性を有する本発明の一部のポリペプチドは、パーソナルケア組成物で有用である。タンパク質活性を有する本発明のポリぺプチドはまた、非布地ケア製品及び非ホームケア製品で有用である(すなわち、布地ケア製品でもホームケア製品でもない製品が本明細書に記載される)。本発明のプロテアーゼ変異体は、スブチリシンプロテアーゼ変異体であり得る。本発明は、バチルス種プロテアーゼ変異体及びバチルス種スブチリシンプロテアーゼ変異体を含む。
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G,
S033T+N076D,
S009T+N109G+A128S+K141R+N243V,
S162G+K256R,
N109G+A116T,
N109G+L257G,
S162G+L257G,
N061G+N109G+N243V,
N109G+A128S+N243V+S248A,
S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R,
N109G+A116T+N243V+K256R,
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V,
A088T+N109G,
N109G+N243V,
T158S+L257G,
N061S+N109G+N243V,
P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R,
S009T+S018T+Y021N+N109G+A128S+K141R,
A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R,
A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G,
N109G+K256R,
N109G+A128S+N243V+K256R,
S063G+K256R,
S063G+N109G,
S063G+A128S,
S063G+N076D,
S033T+N076D+A128S+N218S,及び
N076D+N218S,からなる群から選択されるアミノ酸置換の組を含む、本発明の第二態様による単離されたポリペプチド(例えば、プロテアーゼ変異体)を提供し、
ここで、この変異体は、タンパク質分解活性を有し、変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と変異体のアミノ酸配列とのアラインメントによって決定される配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。このようなポリぺプチドは、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼと比較して向上したタンパク質分解活性又は向上したクリーニング活性を有し得る。このようなポリぺプチドは、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼのものを超える、タンパク質分解活性(例えば、AAPFアッセイ)又はクリーニングアッセイ(例えば、BMI、植物又は卵の微小標本アッセイ)における性能指数を有し得る。本発明の第二態様による変異体は、配列番号2の配列を有するBPN’プロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有し得る。本発明の第二態様による変異体は、配列番号4又は配列番号6の配列を有するプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有し得る。本発明の第二態様による変異体の親プロテアーゼは、スブチリシンプロテアーゼであり得、選択的にスブチリシンプロテアーゼはバチルス種であり得る。本発明の第二態様による変異体の親スブチリシンプロテアーゼは、バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’(配列番号2)、バチルス・ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)、枯草菌(B. subtilis)、バチルス・リケニホルミス(B. licheniformis)、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・ブレビス(B. brevis)、バチルス・ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィラス(B. alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、バチルス・クラウジイ(B. clausii)、バチルス・ハロデュランス(B. halodurans)、バチルス・メガテリウム(B. megaterium)、バチルス・コアグランス(B. coagulans)、バチルス・サーキュランス(B. circulans)、バチルス・ロータス(B. lautus)、B.species TS−23、バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、BPN’−v3(配列番号4)及びBPN’−v36(配列番号6)からなる群から選択され得る。本発明の第二態様による親プロテアーゼは、配列番号2、配列番号4又は配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
a)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、
b)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S033T+N076D、
c)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+N109G+K141R+N243V、
d)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+K256R、
e)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T、
f)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+L257G、
g)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+L257G、
h)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061G+N109G+N243V、
i)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+S248A、
j)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R、
k)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T+N243V+K256R、
l)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、
m)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G、
n)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+N243V、
o)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+T158S+L257G、
p)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061S+N109G+N243V、
q)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、
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s)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、
t)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、
u)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+K256R、
v)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+K256R、
w)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+K256R、
x)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N109G、
y)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S063G、
z)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N076D、
aa)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N218S、
bb)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N076D+N218S、及び
cc)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q,からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、この変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。本発明の第三態様による変異体は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼと比較して向上したタンパク質分解活性又は向上したクリーニング活性を有し得る。本発明の第三態様による変異体は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼのものを超える、タンパク質分解活性(例えば、AAPFアッセイ)又はクリーニングアッセイ(例えば、BMI、植物又は卵の微小標本アッセイ)における性能指数を有し得る。
(a)配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロテアーゼ変異体であって、上記変異体は、配列番号2及び/又は配列番号4のプロテアーゼと比較して増大したタンパク質分解活性及び/又は増大したクリーニング活性を有し、ここで、この変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列に対応させることにより番号付けされ、上記変異体は群(i)〜(x)から選択される配列番号2に対する少なくとも1組のアミノ酸置換を含む、プロテアーゼ変異体:
(i)G097A−G128A−P210S−Y217Q−N218A及びG097A−G128A−P210S−Y217Q、
(ii)S063T−S078N−G097A−S101A−G128A−S183T−Y217Q−T244N,N061A−S078N−G097A−G128A−Y217Q−S224A,S053G−S078N−G097A−G128A−P129T−Q185T−Y217Q,S063T−S078N−G097A−S101A−G128A−S183T−Y217Q,S063T−S078N−G097A−S101A−G128A−Y217Q,S063T−S078N−G097A−S101A−G128A−Y217Q−T244I,及びS078N−G097A−G128A−P129T−Y217Q、
(iii)S063T−S078N−G097A−S101A−G128A−S183T−Y217Q,S063T−S078N−G097A−S101A−G128A−S183T−Y217Q−T244N,S063T−S078N−G097A−S101A−G128A−Y217Q,及びS063T−S078N−G097A−S101A−G128A−Y217Q−T244I、
(iv)G097A−I111V−M124V−Y217Q,G097A−I111V−Y167A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−G097A−S101N−G128S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−S101N−G128A−V203Y−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128S−V203Y−Y217Q,及びV068A−A092G−Y217Q、
(v)N061P−G097A−S101N−G128A−P210S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−S101N−G128A−P210S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−S101N−G128S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S078N−G097A−S101N−I111V−G128S−Y217Q、
(vi)N061P−G097A−G128S−Y217Q,N061P−G097A−S101N−G128A−P210S−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−S101N−I111V−Y217Q,S024G−N025G−N061P−G097A−S101N−G128A−P210S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−S101N−G128A−P210S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−S101N−G128S−Y217Q,及びS024G−N025G−S053G−N061P−S078N−G097A−S101N−I111V−G128S−Y217Q、
(vii)N061P−G097A−S101N−G128A−P210S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S038G−S053G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S053G−N061P−S078N−G128A−Y217Q,N025G−S053G−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S053G−T055P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−T055P−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,N061P−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−G128A−Y217Q,S024G−N025G−T055P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N025G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−N061P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−S053G−N061P−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−S101N−G128A−Y217Q,S024G−T055P−N061P−G097A−G128A−Y217Q,S053G−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S053G−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q−S249N,S053G−N061P−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S053G−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S053G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S053G−T055P−N061P−S101N−G128A−Y217Q,S053G−T055P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,及びT055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q、
(viii)S024G−N025G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−T055P−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S053G−G097A−S101N−G128A−Y217Q,及びT055P−N061P−S078N−G128A−Y217Q、
(ix)N025G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N061P−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−G128A−Y217Q,S024G−N025G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S053G−N061P−S078N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S053G−N061P−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N025G−T055P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−G097A−G128A−Y217Q、並びに
(x)S024G−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S101N−G128A−Y217Q,N025G−T055P−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S053G−T055P−N061P−S101N−G128A−Y217Q,S024G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128A,S053G−T055P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S053G−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A,N061P−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S024G−T055P−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−S101N−G128A−Y217Q,N025G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,T055P−N061P−S078N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S038G−S053G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G128A−Y217Q,N025G−S053G−N061P−S078N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−S078N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S053G−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q−S249N,N025G−S053G−T055P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−T055P−G097A−G128A−Y217Q,T055P−N061P−G097A−A116S−G128A,S024G−N025G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S053G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,G097A−G128S−Y217Q,S024G−S053G−N061P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N025G−N061P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S024G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S053G−N061P−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S024G−T055P−N061P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−S038G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S053G−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−T055P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−T055P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S053G−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−T055P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−T055P−G097A−G128A−Y217Q,N025G−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−N061P−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S024G−S053G−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S078N−G097A−G128A−Y217Q,及びS024G−N025G−S053G−N061P−G097A−G128A−S130G−Y217Q、並びに
(b)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロテアーゼ変異体であって、上記変異体は、配列番号2、配列番号4及び/又は配列番号6のプロテアーゼと比較して増大したタンパク質分解活性及び/又は増大したクリーニング活性を有し、ここで、この変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列に対応させることにより番号付けされ、上記変異体は群(i)〜(xv)から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換を含む、プロテアーゼ変異体:
(i)A116V,G160S,I111L,I115V,N109S,N117M,P005G,Q059V,T164S,Y262M,A015Q,A015S,A098E,A098N,A098S,A098T,A098V,A098Y,A114S,A114T,A116G,A116L,A116S,A116T,A116W,A133G,A133H,A133T,A133V,A137G,A137I,A137L,A137S,A137T,A138S,A216E,A216F,A216V,D099S,D181E,F261A,F261Q,G024F,G024I,G024Q,G024Y,G097S,G160T,G211L,G211V,H017F,H017W,H039V,H226A,I031V,I111V,I268V,K170R,K265R,L016Q,L016T,L135M,L209T,L209V,L233M,L257T,L257V,L267A,L267V,N025A,N025I,N025Q,N025R,N025T,N025V,N101I,N101Q,N101S,N109A,N109G,N109H,N109L,N109M,N109Q,N109T,N117Q,N184A,N184L,N184T,N184W,N212G,N212L,N212V,N243P,N252G,N252M,P005T,P014S,P040G,P040L,P040Q,P129A,P129S,P172G,P172S,P194Q,P210A,P210S,Q185F,Q185G,Q185I,Q185M,Q185N,Q185S,Q275H,R186K,S009A,S009G,S009H,S009M,S018T,S130T,S132N,S145K,S159T,S161I,S161K,S161N,S161T,S162I,S162M,S162Y,S163G,S182F,S182G,S182V,S182W,S183F,S183L,S183M,S183T,S183V,S183W,S224A,S236T,S249V,T022A,T022G,T022Q,T022V,T208V,T242S,T253N,T253S,T254A,T254S,T255L,T255S,T255V,V004A,V004P,V004W,V084C,V139C,V165M,V203F,Y021K,Y021N,Y021T,Y021V,Y167F,Y171F,Y214F,Y262F,及びY262Tからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1つの置換、
(ii)A216E,L090I,A098R,A098W,A098Y,A116G,A116R,A116S,A133M,I107L,I115V,M124L,N101I,N109H,N109S,N109T,N117R,P005G,Q185L,S089V,V095A,A015Y,A029G,A098D,A098E,A098G,A098N,A098S,A098T,A098V,A114S,A114T,A116E,A116L,A116T,A116V,A133H,A133L,A133S,A137G,A137I,A137L,A137S,A137V,A138S,A144S,A144V,A176S,A176T,A187T,A216F,A216P,A216Q,A216R,A216S,A216T,A216V,A216Y,D041E,D120A,D120E,D120Q,D120R,D120S,D181S,G020A,G020S,G024A,G097A,G097D,G097S,G131Q,G160S,G166I,G211L,G215N,H039N,H238N,I111L,I111V,I122A,L075I,L075Q,L135M,L209T,L209V,L233V,L235M,L235R,L257A,M119I,N025A,N025G,N025T,N061K,N101F,N101H,N101L,N101Q,N101R,N101S,N101T,N109A,N109G,N109K,N109L,N117E,N117H,N117K,N117S,N212G,N212S,N218F,N218G,N218H,N218L,N218S,N218W,N240Q,N252M,N252R,N252S,P005T,P040A,P040G,P040T,P129D,P129S,P194S,P210R,Q019R,Q019W,Q103L,Q103W,Q185A,Q185G,Q185M,Q185R,Q185T,Q206G,Q206Y,Q217A,Q217E,Q217R,Q217S,Q217T,S003Q,S009H,S018M,S033T,S130A,S130F,S130G,S130T,S130V,S145T,S159A,S161N,S161T,S162V,S162Y,S182L,S182W,S183F,S183L,S183V,S183W,S188K,S188W,S236Q,S236T,S248L,T022H,T022K,T208C,T253H,T255V,V044I,V121I,V139C,V143H,V143Q,V143T,V143W,V143Y,Y006K,Y021A,Y104W,A001F,A001G,A001H,A001K,A001L,A001Q,A001S,A001Y,A013V,A015G,A015K,A015R,A015S,A015T,A015W,A048S,A073N,A073S,A092S,A098K,A098P,A116D,A116W,A128S,A133P,A133T,A133V,A134G,A134S,A137H,A137N,A137T,A144D,A144K,A144L,A144M,A144N,A144R,A179G,A179S,A187V,A216G,A216L,A216W,A223S,A230C,A272K,A272L,A272P,A272S,A272T,A272W,A273G,A273S,A274G,A274M,A274T,D120K,D140E,D181A,D181E,D181G,D181H,D181T,D259E,D259N,D259Q,E054D,E156D,E156T,E251L,E251T,E251V,F058Y,F189W,F261K,F261Q,F261R,G007A,G007S,G020F,G020H,G020N,G020Q,G020T,G020Y,G024F,G024Q,G024R,G024T,G024V,G024W,G024Y,G053T,G097K,G097M,G097R,G097T,G131A,G131H,G131P,G131R,G131T,G131V,G160H,G160T,G166C,G166Q,G166S,G166T,G211A,G211D,G211K,G211M,G211N,G211Q,G211R,G211V,G211W,G215S,G215T,G215W,H017T,H017W,H017Y,H039V,H226A,H226F,H226I,H226L,H226M,H226V,I035V,I079A,I079S,I108V,I205V,I234L,I234V,I268V,K012S,K043P,K136H,K136R,K141A,K141F,K141T,K141W,K170A,K170G,K170R,K213A,K213R,K213S,K237A,K237H,K237L,K237S,K237V,K256A,K256G,K256H,K256M,K256P,K256Q,K256R,L016A,L016Q,L016T,L016V,L042V,L075M,L075T,L082M,L082V,L135F,L196I,L209H,L209Q,L209R,L209S,L209W,L233A,L233M,L233Q,L235I,L235K,L250I,L257S,L257T,L257V,L267A,L267Q,L267T,L267V,M119C,M199V,N025C,N025E,N025F,N025I,N025K,N025L,N025M,N025Q,N025V,N025Y,N061F,N061P,N061S,N061T,N076G,N078S,N101A,N109M,N109Q,N109R,N117A,N117M,N117Q,N118D,N118G,N118H,N118Q,N118R,N118S,N184A,N184C,N184G,N184L,N184R,N184S,N184T,N184V,N184W,N212C,N212F,N212I,N212K,N212L,N212P,N212Q,N212R,N212V,N212W,N212Y,N218A,N218P,N218T,N240A,N240E,N240G,N240H,N240L,N240R,N240S,N240T,N243C,N243Q,N243T,N243V,N252A,N252G,N252K,N252Q,P014G,P014Q,P014R,P014S,P014T,P040F,P040L,P040Q,P040S,P040V,P086C,P086H,P086S,P129A,P129E,P129G,P129K,P129R,P172A,P172K,P172Q,P172S,P194A,P194G,P194H,P194L,P194M,P194Q,P194R,P194V,P194W,P194Y,P210A,P210G,P210L,P210S,P239K,P239R,Q002A,Q002S,Q010A,Q010N,Q010R,Q010T,Q019A,Q019C,Q019D,Q019G,Q019S,Q019T,Q019V,Q059I,Q059V,Q103S,Q185F,Q185H,Q185I,Q185K,Q185N,Q185S,Q185Y,Q206H,Q206L,Q206P,Q206W,Q217F,Q217H,Q217I,Q217K,Q217L,Q217N,Q217V,Q271G,Q271R,Q271T,Q275F,Q275P,Q275R,R186A,R186I,R186K,S003A,S003F,S003G,S003H,S003K,S003R,S003T,S009T,S018N,S018T,S037G,S037T,S037V,S038G,S038Q,S063N,S063Q,S063T,S089M,S089N,S130K,S130L,S130R,S130W,S132N,S145G,S145K,S145M,S145R,S145V,S159C,S159H,S159L,S159Q,S159R,S159T,S159W,S161A,S161C,S161G,S161H,S161I,S161K,S161P,S161Q,S161R,S162F,S162G,S162I,S162L,S162M,S162N,S162P,S162R,S163G,S173A,S173G,S182F,S182G,S182K,S182N,S182Q,S182V,S183A,S183M,S183Q,S183R,S183T,S188A,S188F,S188G,S188P,S188R,S188T,S188V,S190C,S204A,S204G,S204I,S204L,S204Q,S204R,S204V,S207G,S224A,S224T,S236C,S236D,S236E,S236G,S236N,S248A,S248F,S248K,S248M,S248T,S249A,S249R,S249T,S249V,S249W,S249Y,S260G,S260H,S260K,S260N,T022A,T022G,T022Q,T022S,T022V,T022Y,T055A,T055K,T158A,T158S,T208L,T208S,T208V,T220S,T242D,T242N,T242S,T244E,T244G,T244I,T244R,T244V,T244W,T253A,T253G,T253N,T253S,T254S,T254V,T255H,T255I,T255K,T255L,T255Q,T255R,T255S,T255Y,V004A,V004N,V004P,V004W,V008A,V008M,V026I,V045S,V045W,V051I,V081Q,V081T,V084C,V093I,V095C,V143A,V143E,V143F,V143N,V143S,V147I,V147L,V147S,V147T,V148I,V149C,V149I,V165M,V180A,V180C,V180I,V180L,V180T,V192A,V192C,V192I,V192S,V192T,V192Y,V198L,V203A,V203F,V203K,V203L,V203M,V203N,V203Y,W241Y,Y006A,Y006G,Y006H,Y006L,Y006N,Y006P,Y006Q,Y006T,Y021E,Y021K,Y021L,Y021N,Y021Q,Y021R,Y021S,Y021T,Y104F,Y104I,Y104V,Y171F,Y214F,Y214L,Y214W,Y262F,及びY262Sからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1つの置換、
(iii)A088T−L257G,A116T−A128S,N061S−N109G−A128S−N243V−S260P,S009T−N109G−A128S−K141R−N243V,S009T−S018T−Y021N−N109G−A128S−K141R,及びS162G−K256Rからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(iv)A116T,A088T−N243V,G024E−A116T,K043Y,N076D−A116T,N218S−S248N,S033T−N243V,S033T−S063G,S248N−L257G,A001E−S249A,A088T−A116T,A088T−A128S,A088T−G131H,A088T−L257G,A088T−N109G,A088T−S248N,A088T−S249A,A116T−N243V,A116T−T158S,A128S,A128S−K256R,A128S−L257G,A128S−N243V,A128S−S248N,A128S−T158S,G024E−A088T,G024E−A128S,G024E−G131H,G024E−K256R,G024E−L257G,G024E−N218S,G024E−N243V,G024E−S162G,G024E−S249A,G024E−T158S,G131H,G131H−K256R,G131H−S249A,K043Y−A088T,K043Y−A116T,K256R,N076D−K256R,N109G,N109G−A116T,N109G−A128S,N109G−A128S−N243V−K256R,N109G−A128S−N243V−S248A,N109G−G131H,N109G−K256R,N109G−L257G,N109G−N218S,N109G−N243V,N109G−S248N,N218S−L257G,N243V,N243V−K256R,N243V−L257G,N243V−S248N,N243V−S249A,Q103H−A128S,Q103H−G131H,Q103H−K256R,Q103H−L257G,Q103H−N243V,Q103H−S248N,Q103H−S249A,Q103H−T158S,Q206D−N243V,S033T−A128S,S033T−K256R,S033T−N076D,S033T−N218S,S033T−S248N,S033T−T158S,S063G−A128S,S063G−K256R,S063G−N243V,S063G−S162G,S063G−T158S,S162G−K256R,S248N−K256R,S249A,T158S−N243V,及びT158S−S249Aからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(v)A088T−L257G,G024E−K256R,G024E−L257G,N109G−A116T,N109G−L257G,N243V−K256R,S033T−N109G,S033T−T158S,S063G−L257G,A001E−L257G,A088T−A128S,A088T−G169A,A088T−K256R,A088T−N109G,A088T−N218S,A088T−N243V,A088T−S248N,A088T−T158S,A116T,A116T−A128S,A116T−G131H,A116T−K256R,A116T−L257G,A116T−N218S,A116T−S162G,A116T−T158S,A128S,A128S−G169A,A128S−K256R,A128S−L257G,A128S−N218S,G024E,G024E−A128S,G024E−G131H,G024E−N109G,G024E−N243V,G024E−S033T,G024E−S063G,G024E−S248N,G024E−S249A,G024E−T158S,G131H,G131H−G169A,G131H−K256R,G131H−N218S,G131H−S249A,G169A,G169A−L257G,G169A−N243V,K043Y−A088T,K043Y−N109G,K256R,K256R−L257G,N061G−N109G−N243V,N076D−N109G,N109G,N109G−A128S,N109G−G131H,N109G−K256R,N109G−N218S,N109G−S162G,N109G−S248N,N109G−S249A,N109G−T158S,N218S,N218S−K256R,N218S−L257G,N218S−S248N,N243V,N243V−L257G,N243V−S248N,N243V−S249A,P040A−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,Q103H−K256R,Q103H−L257G,Q103H−N109G,S009T−S018T−Y021N−N109G−A128S−K141R,S033T−A088T,S033T−A116T,S033T−A128S,S033T−G131H,S033T−K043Y,S033T−K256R,S033T−L257G,S033T−N076D,S033T−N218S,S033T−N243V,S033T−Q103H,S033T−S063G,S033T−S162G,S033T−S248N,S033T−S249A,S063G,S063G−A088T,S063G−A116T,S063G−A128S,S063G−G131H,S063G−K256R,S063G−N109G,S063G−N218S,S063G−N243V,S063G−S248N,S063G−S249A,S063G−T158S,S162G−K256R,S162G−N218S,S162G−N243V,S162G−S248N,S162G−S249A,S248N,S249A,S249A−L257G,T158S,T158S−L257G,及びT158S−N243Vからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(vi)T158S−L257G,K256R,L257G,S033T−N109G,S162G−K256R,S162G−L257G,G024E−K256R,G024E−L257G,G024E−S033T,N109G−A116T,N218S−L257G,S033T−A088T,S033T−A116T,S033T−N243V,S033T−Q103H,S162G−N218S,S162G−N243V,T158S,T158S−N218S,T158S−N243V,A088T,A088T−G169A,A088T−K256R,A088T−L257G,A088T−S162G,A088T−T158S,A116T−K256R,A116T−L257G,A116T−N243V,A128S−L257G,A128S−N218S,A128S−N243V,A128S−S248N,G024E−A116T,G024E−A128S,G024E−G131H,G024E−N243V,G024E−S248N,G024E−S249A,G024E−T158S,G131H−N243V,G131H−T158S,G169A−N218S,G169A−N243V,G169A−S248N,K256R−L257G,N109G−A128S,N109G−G131H,N109G−N218S,N109G−N243V,N109G−S249A,N218S,N218S−K256R,N218S−N243V,N218S−S249A,N243V,N243V−K256R,N243V−L257G,N243V−S248N,Q103H−N109G,Q103H−N218S,S033T−A128S,S033T−L257G,S033T−N218S,S033T−S162G,S033T−S248N,S033T−T158S,S063G−K256R,S063G−L257G,S162G,S162G−G169A,S162G−S248N,S248N,S248N−K256R,S248N−L257G,S249A,T158S−S162G,及びT158S−S248Nからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(vii)S033T−N076D−A128S−N218S,A001E−S033T−N109G−N218S,S033T−N218S,S033T−S063G−Q103H−N109Q−A128S−G131H−G169A−N243V,A128S−G169A,S033T−S063G−Q103H−N109Q−A128S−G131H−G169A−N243P,S018T−Y021N−S033T−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,S033T−A128S−G131H−N243P,P040E−N109G−A128S−G131H,S033T−A128S,S033T−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,N109G−G169A,S063G−N109G−A128S−G131H,G169A,N109G−A128S−G131H−N243V−S248N−K256R,S033T−A128S−G131H−N243V,A128S−N218S,A001E−G169A,A088T−G169A,G169A−L257G,N109G−N218S,S033T−N109G−A128S−N243P−S248N−K256R,G169A−K256R,N076D−G169A,A001E−G131H−G169A−N243V,G169A−S249A,S033T−N109G,G169A−S248N,K043Y−G169A,K043Y−N218S,N218S−L257G,N218S−N243V,S063G−G169A,A001E−A128S−G131H−N243V,A001E−S033T−N109G−N243V,A088T−N218S,G024E−N218S,G024E−S033T,G169A−Q206D,N076D−N218S,S033T−L257G,S162G−G169A,A001E−N218S,A116T−N218S,G169A−N243V,N218S,P040A−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,S033T−N076D,A001E−S033T,A128S−G131H,N218S−S248N,S018T−Y021N−N109G−A128S,S033T−K043Y,S033T−N243V,S033T−Q206D,S063G−N218S,S162G−N218S,T158S−G169A,A116T−G169A,G131H−G169A,N061S−N109G−A128S−S260P,N109G−A128S−N243V−K256R,N109G−A128S−N243V−S248A,N109G−A128S−N243V−S248A−K256R,N109G−A128S−N243V−S248N−K256R−L257G,N218S−K256R,S009T−N109G−A128S−K141R,S009T−S018T−Y021N−N109G−A128S−K141R,S033T−A088T,S033T−S063G,S033T−S162G,T158S−N218S,A001E−N076D−N109G−A128S,N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,N109G−A128S−S248N−K256R,S009T−N109G−A128S−K141R−N243V,S018T−Y021N−N061S−N109G−A128S−S260P,S033T−A116T,S033T−S248N,S033T−S249A,S033T−T158S,G131H−N218S,N109A−A128S−N243V−K256R,N109G−A128S,N109G−A128S−S162G−N243V−S248N−K256R,N109G−A128S−T158S−N243V−S248N−K256R,N218S−S249A,Q206D−N218S,S018T−Y021N−N109G−A128S−N243V,S018T−Y021N−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,S033T−K256R,A116T−A128S,N061S−N109G−A128S−N243V−S260P,N109G−A128S−N243V−S248N,S009T−N109G−A128S−K141R−N243V−S248N−K256R,G024E−A128S,N061S−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R−S260P,N109S−A128S−N243V−K256R,S033T,S033T−G131H,A001E−A128S,A128S,A128S−L257G,A128S−Q206D,N109Q−A128S−N243V−K256R,S009T−A128S−K141R−N243V,S009T−S018T−Y021N−A128S−K141R−N243V,A088T−A128S,A128S−K256R,A128S−N243V,N061P−N109G−N243V,N061S−A128S−N243V−S260P,S018T−Y021N−A128S−N243V,A128S−N243V−S248N−K256R,A128S−S248N,A128S−S249A,N076D−A128S,S063G−A128S,A128S−S162G,A128S−T158S,S018T−Y021N−N061S−A128S−N243V−S260P,S033T−Q103H−A128S−G131H,N061S−N109G−N243V,K043Y−A128S,N061P−N109G−G131H−N243V,N109G−L257G,A001E−G024E−S204E−Q206D,A001E−L257G,A088T−N109G,G024E−N109G,K043Y−N109G,N061G−N109G−N243V,N076D−N109G,N109G,N109G−A116T,N109G−K256R,N109G−N243V−K256R,N109G−N243V−S248A−K256R,N109G−Q206D,S063G−N109G,A001E−A116T,A001E−N109G,A001E−Q206D,A088T−A116T,A088T−N243V,A116T−L257G,G024E−A116T,G024E−L257G,G024E−N243V,G024E−Q206D,N109G−G131H,N109G−N243V,N109G−S162G,N109G−S248N,N109G−S248N−K256R,N109G−S249A,N109G−T158S,N243V−L257G,A001E−A088T,A001E−G024E,A001E−K256R,A001E−N076D,A001E−N243V,A088T,A088T−L257G,A088T−Q206D,A116T,A116T−K256R,A116T−N243V,G024E−A088T,G024E−K043Y,G024E−K256R,G024E−N076D,G024E−S162G,G024E−S248N,K043Y−A088T,K043Y−A116T,K043Y−L257G,K043Y−N243V,K043Y−Q206D,K256R−L257G,N076D−A116T,N076D−L257G,N076D−N243V,N076D−Q206D,N109G−N243V−S248N,N109G−N243V−S248N−K256R,N243V−K256R,Q206D,Q206D−L257G,Q206D−N243V,Q206D−S248N,S063G−K256R,S063G−L257G,T158S−L257G,A001E,A001E−K043Y,A001E−S162G,A001E−S248N,A001E−S249A,A001E−T158S,A088T−K256R,A088T−S162G,A088T−S248N,A088T−S249A,A116T−Q206D,A116T−S248N,A116T−S249A,G024E,G024E−G131H,G024E−S249A,G024E−T158S,G131H,G131H−K256R,G131H−L257G,K043Y−K256R,K043Y−N076D,K256R,L257G,N076D−A088T,N076D−K256R,N076D−S162G,N076D−S248N,N076D−S249A,N109G−N243P−S248A−K256R,N109G−N243P−S248N−K256R,N243V,Q206D−K256R,S033T−P040E−Q103H−N109G,S063G,S063G−A116T,S063G−Q206D,S162G−K256R,S162G−L257G,S162G−N243V,S162G−Q206D,S162G−S248N,S248N,S248N−L257G,S249A,S249A−L257G,T158S,T158S−N243V,及びT158S−Q206Dからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
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(ix)A088T−N109G−A116T−T158S−N243V−L257G,A116T−N218S−N243V−L257G−N269S,A088T−A116T−K256R,A088T−G131H−K256R,A088T−N109G−A116T−T158S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−A273T,A088T−A116T−N243V−L257G,A088T−A116T−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−N243V−L257G,A088T−A116T−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−K256R−L257G,A088T−N109G−N218S−S248N−L257G,A088T−T158S−N218S−N243V−K256R−I268V,A088T−T158S−N218S−S248N−L257G,A116T−N218S−K256R−L257G,N109G−A116T,N109G−A116T−G131H−T158S−L257G,N109G−A116T−N243V,N109G−A116T−N243V−K256R,N109G−A116T−T158S−L257G,N109G−K256R,N109G−N243V−K256R−L257G,S003P−N109G−G131H−T158S−K256R,A088T−A116T,A088T−A116T−G131H−N218S−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−N218S−L257G,A088T−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−A116T−G131H−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−A116T−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−S248N−L257G,A088T−A116T−N218S−N243V−L257G,A088T−A116T−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−N218S−N243V−S248N−K256R−Q275R,A088T−A116T−T158S−A216S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−K256R,A088T−A116T−T158S−N218S−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−N269S,A088T−A116T−T158S−N243V,A088T−A116T−T158S−N243V−K256R,A088T−A116T−V147I−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−G131H−K256R−L257G,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−I107T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−I107T−N109G−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−A153S−N218S−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S−N243V,A088T−N109G−A116T−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−A116T−N218T−K256R,A088T−N109G−A116T−N218T−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−N243V,A088T−N109G−A116T−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−N243V−K256R−L257G−N269D,A088T−N109G−A116T−T158S,A088T−N109G−A116T−T158S,A088T−N109G−A116T−T158S−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−A138V−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S,A088T−N109G−G131H−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−N218S−K256R,A088T−N109G−G131H−T158S−N218S−N243V,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−V149A−K256R−L257G,A088T−N109G−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−N243V,A088T−N109G−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−N243V−L257G,A088T−N109G−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S−K256R,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−K256R−Q275R,A088T−N109G−T158S−N243V,A088T−N109G−T158S−N243V−K256R−I268V,A088T−N109G−T158S−N243V−L257G,A088T−N109G−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−N218S−N243V−L257G,A088T−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N218S−S248N,A088T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−V143A−T158S−K256R,A088T−V147I−N218S−N243V−K256R−L257G,A114S−A116T−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,A116T−G131H−N243V−K256R,A116T−G131H−N243V−L257G,A116T−G131H−N243V−S248N−K256R,A116T−G131H−S248N−L257G,A116T−G131H−T158S−N218S−I234T−N243V−S248N−K256R,A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A116T−N218S−L257G,A116T−T158S−N218S−K256R−L257G,A116T−T158S−N218S−S248N,A116T−T158S−N218S−S248N−L257G−Q271R,A116T−T158S−N243V−S248N−L257G,A116T−T158S−S248N−L257G,G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,I107T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−A137V−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−A151S−N218S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−L257G,N109G−A116T−G131H−N243V−L257G,N109G−A116T−G131H−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−K256R−L257G,N109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6R,A116T−T158S−N243V−L257G,A116T−T158S−N243V−S248N,A116T−T158S−S248N−K256R−L257G,G131H−K141R−T158S−N218S−K256R,G131H−N218S,G131H−N218S−K256R,G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,G131H−N218S−N243V−S248N,G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,G131H−N243V−S248N−K256R,G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,G131H−S248N,G131H−T158S−I234T−N243V−K256R,G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−N243V,G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,G131H−T158S−N243V−K256R,G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,N109G,N109G−A116T−G131H−A144V−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−N243V−S248N,N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−S248N,N109G−A116T−G131H−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N,N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−V149A−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−N218S,N109G−A116T−N218S−K256R,N109G−A116T−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−N218S−N243V−S248N−I268V,N109G−A116T−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−N243V−S248N,N109G−A116T−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−T158S,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−T158S−Q275R,N109G−A116T−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−L257G,N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−N243V−K256R,N109G−G131H−S145F−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−K256R,N109G−G131H−T158S−N218S−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G−A274T,N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−S248N−L257G,N109G−N218S−K256R−L257G,N109G−N218S−L257G,N109G−N218S−N243V−K256R,N109G−N218S−N243V−S248N−S260F,N109G−N218S−S248N,N109G−N243V−K256R,N109G−N243V−L257G,N109G−N243V−S248N,N109G−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−S182F−S204F−S207L−N218S−S236F−S248N−L257G,N109G−S248N−K256R,N109G−T158S−K256R,N109G−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−T158S−N218S−S248N−L257G,N109G−T158S−N243V,N109G−T158S−N243V−K256R,N109G−T158S−N243V−S248N,N109G−T158S−N243V−S248N−K256R,N109G−T158S−S248N−K256R,N109G−T158S−S248N−L257G,N218S,N218S−N243V−S248N−K256R,N218S−S248N−L257G,N243V−K256R,N243V−S248N−K256R,N243V−S248N−K256R−L257G,N243V−S248N−L257G−Q271R,S003P−A116T−T158S−S248N−K256R,S248N,T158S−N218S,T158S−N218S−A272V,T158S−N218S−L257G,T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,T158S−N218S−N243V−L257G,T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,T158S−N243V−K256R,T158S−N243V−K256R−L257G,T158S−N243V−S248N−K256R,V004A−N109G−A116T−G131H−S248N−K256R−L257G,及びY006H−A116T−G131H−S248Nからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(x)S018F−S162L,S018P−D120N,P014T−S037T,S009T−K141R,及びS161P−S162Lからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(xi)I031V−S038W,P014T−S037T,S018F−S162L,S018P−D120N,及びS162L−D181Hからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(xii)Y21H−D259G,S183T−S249R,N61D−Q206R,Y262N−Q275R,K043R−N076S,A133V−D259N,及びI079V−Q217Hからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(xiii)N61P−S63G−N109Q−A128S−S224A−N243V,A88T−N109G−A114S−A116T−A128S−N243V,A88T−N109G−A114S−A116T−A128S−S183L−S224A−N243V,N109G−A128S−S183V,N109G−A128S−N243V−K256R,N109M−A128S−S224A,A88T−N109S−A116T−A128S−S224A−N243V,N109Q−A128S−S224A−N243V,A88T−N109M−A116T−A128S−S224A−N243V,N109S−A128S−S224A−N243V,A88T−N109G−A116T−N243V,N101Q−N109Q−A128S−S224A−N243V,N109G−A116T−N243V−K256R,N109G−A128S−P129S−S130T−S224A−N243V,及びA88T−N109Q−A116T−A128S−S224A−N243Vからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、
(xiv)S33T−T55P−N61P−S63G−A88T−N109G−A116T−A128S−G131H−S224A−N243V,S33T−N61G−S63G−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−S63G−N109G−A128S−N218S−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−G169A−S224A−N243V−S249Q,S33T−N61G−A88T−N109G−A116T−A128S−N218S−N243V,S33T−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−A128S−N218S,A1G−N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V−S249Q,S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−S224A−N243V,A88T−N109G−A114S−A116T−A128S−N243V,A88T−N109G−A114S−A116T−A128S−S183L−S224A−N243V,N109G−A114S−A128S,N109G−A114S−A128S−S183L−S224A,N109G−A114S−A128S−S224A,N109G−A114S−A128S−S224A−N243V,A88T−N109G−A116T−A128S−S224A−N243V,N61G−A88T−N109G−A116T−A128S−S224A−N243V,N109G−A128S−S183V,N109G−A114S−A128S−N243V,N109G−A128S−N243V−S248A,N109G−A128S−S224A−N243V,N109G−A128S−N243V−K256R,N109G−A128S−S224A,N109G−A128S−S183L−S224A,N61G−N109G−A128S−S224A,N109M−A128S−S224A,A88T−N109S−A116T−A128S−S224A−N243V,N109M−A128S−S224A−N243V,S63G−A128S,A88T−N109G−A116T−N243V,N101Q−N109Q−A128S−S224A−N243V,N109G−A116T−N243V−K256R,N109G−A116T,S63G−N109G,A88T−N109G,N109G−K256R,N61G−N109G−N243V,S33T−N109G−A128S−G169A−N218S−N243V,S33T−N109G−A128S−N218S−S224A−N243V,N109G−A128S−P129S−S130T−S224A−N243V,及びA88T−N109Q−A116T−A128S−S224A−N243Vからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換、並びに、
(xv)G24S−G53S−N78S−G97A−N101S−A128S,I31L−S33T−S63G−N109G−A128S−G169A−N218S−N243V,A1G−I31L−S33T−T55P−N61P−S63G−A88T−N109G−A116T−A128S−G131H−G169A−S224A−N243V−S249Q,S33T−N61G−S63G−N109G−A128S−G131H−G169A−N218S−N243V,S33T−S63G−N109G−A128S−G169A−N218S−N243V,S33T−T55P−N61P−S63G−A88T−N109G−A116T−A128S−G131H−S224A−N243V,S33T−T55P−N61P−S63G−A88T−N109G−A116T−A128S−G131H−S224A−N243V−S249Q,S33T−N61G−S63G−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−S63G−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−T55P−N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−G169A−S224A−N243V−S249Q,S33T−N61G−A88T−N109G−A116T−A128S−N218S−N243V,S33T−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−N76D−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−N76D−N109G−A128S−N218S−N243V−S248N−K256R,S33T−N61G−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−N76D−A128S−N218S,S33T−A128S−N218S,A1G−N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V−S249Q,N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−S224A−N243V,A88T−N109G−A114S−A116T−A128S−N243V,A88T−N109G−A114S−A116T−A128S−S183L−S224A−N243V,N109G−A114S−A128S,N109G−A114S−A128S−S183L−S224A,N109G−A114S−A128S−S224A,N109G−A114S−A128S−S224A−N243V,A88T−N109G−A116T−A128S−S224A−N243V,N61G−A88T−N109G−A116T−A128S−S224A−N243V,N109G−A128S−S183V,N109G−A114S−A128S−N243V,N109G−A128S−N243V−S248A,N109G−A128S−S224A−N243V,N109G−A128S−N243V−K256R,N109G−A128S−S224A,N109G−A128S−S183L−S224A,N61G−N109G−A128S−S224A,N76D−N109G−A128S−S224A,N109M−A128S−S224A,N109G−A128S−S183L,S33T−N76D,A88T−N109S−A116T−A128S−S224A−N243V,N109Q−A128S−S224A−N243V,N109S−A128S−S224A,A88T−N109M−A116T−A128S−S224A−N243V,N101Q−N109Q−A128S−P129S−S130T−S224A−N243V,S63G−N109Q−A128S−S224A−N243V,N109M−A128S−S224A−N243V,S63G−A128S,N109S−A128S−S224A−N243V,A88T−N109G−A116T−N243V,N61S−N109G−N243V,N101Q−N109Q−A128S−S224A−N243V,N109G−A116T−N243V−K256R,A88T−N109G−A116T−T158S−N243V−K256R,N109G−A116T,S63G−N109G,A88T−N109G,N109G−K256R,N61G−N109G−N243V,S33T−N61P−S63G−N109G−A128S−G131H−G169A−N218S−N243V,S33T−N109G−A128S−G169A−N218S−N243V,S33T−N109G−A128S−N218S−S224A−N243V,N109G−A128S−P129S−S130T−S224A−N243V,及びA88T−N109Q−A116T−A128S−S224A−N243Vからなる群から選択される配列番号6に対する少なくとも1組のアミノ酸置換;からなる群から選択される。
N,G97A−G128A−Y217Q−T55P−S78N−I115V,G97A−G128A−Y217Q−N25Y−S87G−A88V−S89A,G97A−G128A−Y217Q−A134T−N240K,G97A−G128A−Y217Q−S24R−Q59S−N61P,G97A−G128A−Y217Q−G23A−S24G−N25G−P239R,G97A−G128A−Y217Q−T55P−A116S−N117G−N118R,G97A−G128A−Y217Q−A134T−S161P,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−N61P−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−N25Y−Q59S−N61P,G97A−G128A−Y217Q−N25Y−P129Q−S130G−G131S−A137T,G97A−G128A−Y217Q−G23A−S24G−N25G−N61P−S63H,G97A−G128A−Y217Q−T55P−N61P−S78N−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−N240K,G97A−G128A−Y217Q−T55P−A134T,G97A−G128A−Y217Q−N25Y−N61P−S63H,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−P129S,G97A−G128A−Y217Q−T55P−L75H−N76G,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−T55P−I115V,G97A−G128A−Y217Q−T55P−A116N−N117S−N118G,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−A116N−N117S−N118G,G97A−G128A−Y217Q−S24R−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−G23A−S24G−N25G−G211R−N212S−K213V,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−T55P−N61P−S78N−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−T55P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N,G97A−G128A−Y217Q−I115V−A273S,G97A−G128A−Y217Q−N25Y−T55P,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−N240K,G97A−G128A−Y217Q−S161P−L267V,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−S101N,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−N61P−S101N,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−N240K,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−T55P−S101N,G97A−G128A−Y217Q−N61P−S63H−A128S−P129Q,G97A−G128A−Y217Q−S89Y−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−S130G−G131S−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−I115V−N240K,G97A−G128A−Y217Q−S53G−N61P−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S161P−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−N240K,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−P239R,G97A−G128A−Y217Q−T55P−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−I115V−A134T,G97A−G128A−Y217Q−Y6Q−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−T55P−S78N−S89Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−T55P−S78N−A88V−S101N,G97A−G128A−Y217Q−N61P−S63H−S78N−I111V−A134T,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−S78N−S101N,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S78N−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S53G−N61P−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S53G−T55P−S78N−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S53G−T55P−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N,G97A−G128A−Y217Q−N240K−A273S,G97A−G128A−Y217Q−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−S87T−A88L−S89G,G97A−G128A−Y217Q−N61P−S63H−S78N−S161P,G97A−G128A−Y217Q−N61P−S63H−S78N−I111V,G97A−G128A−Y217Q−T55P−A128S−P129Q,G97A−G128A−Y217Q−N61P−S78N−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−N61E−A144K,G97A−G128A−Y217Q−A134T−P239R,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S78N−S87T−A88L−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−N61P−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−T55P−N240K,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S87T−A88L−S89G−S101N,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−S130G−G131S−P239R,G97A−G128S−Y217Q,G97A−G128A−Y217Q−S53G−N61P−S101N,G97A−G128A−Y217Q−I111V−P129Q−G211T,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−S87G−A88V−S89A,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−S130G−G131S−S162K,G97A−G128A−Y217Q−T55P−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−T55P−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S87G−A88V−S89A−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G,G97A−G128A−Y217Q−I111V−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−I111V−A273S,G97A−G128A−Y217Q−N61P−S87T−A88L−S89G,G97A−G128A−Y217Q−T22N−S24A−N61P−S63H,G97A−G128A−Y217Q,G97A−G128A−Y217Q−S53G−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−P129S−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S159K−L267V,G97A−G128A−Y217Q−P40E−S53Y−S78Y−P86S−S87G−A88V,G97A−G128A−Y217Q−S24R−S145D,G97A−G128A−Y217Q−I111V−S159K,G97A−G128A−Y217Q−T55P−P129L,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−T55P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S78N−S101N,G97A−G128A−Y217Q−S53G−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S89Y,G97A−G128A−Y217Q−S24R−P129V,G97A−G128A−Y217Q−S87G−A88V−S89A−A116N−N117S−N118G−P172H,G97A−G128A−Y217Q−I111V−A134T,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−P5S−S87G−A88V−S89A−A116G−N117R,Y217Q−N61P−A97G−G102A−A128G−P129S,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−N61P−S78N,G97A−G128A−Y217Q−S145D−S159K−N240K−Q275E,G97A−G128A−Y217Q−T55P−A128S−P129D,G97A−G128A−Y217Q−G23A−S24G−N25G−A128S−P129D,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S78N−S87T−A88L−S89G−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−I111V−P239R,G97A−G128A−Y217Q−S87G−A88V−S89A−S162K,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−I115V,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−T55P−S78N,G97A−G128A−Y217Q−T55P−A92G,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S87T−A88L−S89G−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−T22N−S24A−T55P,G97A−G128A−Y217Q−S53G−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−S78N−S87T−A88L−S89G,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−S130G−G131S−S159K,G97A−Y217Q−N61P−N62Q−G100N−A128G,G97A−G128A−Y217Q−S24R−S78N−S182P−L267V,G97A−G128A−Y217Q−P239R−A273S,G97A−G128A−Y217Q−S53G−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−S130G−G131S−T242R,G97A−G128A−Y217Q−S3F−S87T−A88L−S89G−G211T,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−L75H−N76G,G97A−G128A−Y217Q−S53G−T55P−N61P−S78N−S87T−A88L
−S89G,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−A144K,G97A−G128A−Y217Q−S78N−S87T−A88L−S89G−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−A116N−N117S−N118G,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−I111V,G97A−G128A−Y217Q−S24R−S145D−P239R−Q275E,G97A−G128A−Y217Q−S145D−A273S,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−K141E−T242R,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−A116N−N117S−N118G−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−S89Y−G211T,G97A−G128A−Y217Q−S87G−A88V−S89A−A116N−N117S−N118G−A144T,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−P129V,G97A−Y217Q−N61P−A128G−P129S−S130P,G97A−G128A−Y217Q−T55P−N61P−S87T−A88L−S89G−G110C−S130P,G97A−Y217Q−N123G−A128G,G97A−G128A−Y217Q−N61P−N62Q−G100N−G102A−M124I,S78N−G97A−G128A−Y217Q,G97A−S101N−G128A−Y217Q,G97A−G128A−A137V−Y217Q,N61P−G97A−G128A−Y217Q,G97A−G128A−S130P−Y217Q,G97A−Q103N−G128A−Y217Q,S63T−G97A−G128A−Y217Q,G97A−G102A−G128A−Y217Q,G97A−N109D−G128A−Y217Q−S248R,S87R−G97A−G128A−Y217Q,G97A−G128A−S188D−Y217Q,S87D−G97A−G128A−Y217Q−S248R,G97A−G128A−S188D−S248R−Y217Q,G97A−G128A−S248D−Y217Q,S78N−G97A−G128A−Y217Q−L267V,S78N−G97A−G128A−Y217Q−S161P,S78N−G97A−G128A−Y217Q−I115V,S78N−G97A−G128A−Y217Q−A273S,S78N−G97A−G128A−Y217Q−G211T,S78N−G97A−G128A−Y217Q,S78N−G97A−G128A−Y217Q−I111V,S78N−G97A−G128A−Y217Q−V147L,S78N−G97A−G128A−Y217Q−I108V,S78N−G97A−G128A−Y217Q−S89Y,S78N−G97A−G128A−Y217Q−A138T,G97A−G128A−Y217Q−A134T−K213L,G97A−G128A−Y217Q−G23A−S24G−N25G−P129V,G97A−G128A−Y217Q−S24R−P239R,及びG97A−G128A−Y217Q−S24R−S87T−A88L−S89G,からなる群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、この変異体のアミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列に対応させることにより番号付けされる。
(a)タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体であって、この変異体は、配列番号2に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、群(i)〜(Vii)から選択される配列番号2と比較して少なくとも1組のアミノ酸置換を含む、プロテアーゼ変異体:
(i)Q059V−S078N−G097A−I108V−G128A−V147Q−G211A−Y217Q−N252Q,S078N−G097A−I108V−G128A−V147Q−G211A−Y217Q,S078N−G097A−I108V−G128A−V147Q/−G211A−Y217Q−N252Q,S078N−G097A−I108V−G128A−V147Q−Y217Q−N252Q,及びS078N−S087E−G097A−M124I−G128A−Y217Q−S224A、
(ii)Q059V−S078N−G097A−I108V−G128A−V147Q−G211A−Y217Q−N252Q,S078N−G097A−I108V−G128A−V147Q−G211A−Y217Q,S078N−G097A−I108V−G128A−V147Q−G211A−Y217Q−N252Q,S078N−G097A−I108V−G128A−V147Q−Y217Q−N252Q,及びS078N−S087E−G097A−M124I−G128A−Y217Q−S224A、
(iii)G097A−M124V−Y167A−Y217Q,V068A−Y167A−Y217Q,G097A−I111V−M124V−Y167A,I111V−M124V−Y167A−Y217Q,V068A−I111V−Y167A−Y217Q,G097A−I111V−M124V−Y167A−Y217Q,及びP052L−V068A−I111V、
(iv)G097A−N123A−Y217Q,G097A−N123V−Y217Q,N061P−G102A−G128S−Y217Q,N061P−S101N−G102A−G128S−Y217Q,Y217Q,S078N−G097A−I111V−N123Q−Y217Q,及びG102A−N123Q−Y217Q、
(v)G097A−N123A−Y217Q,G097A−N123V−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−G100D−Y217Q,N061P−S101N−G102A−G128S−Y217Q,Y217Q,N061P−G102A−G128S−Y217Q,S078N−G097A−I111V−N123Q−Y217Q,及びG102A−N123Q−Y217Q、
(vi)N061P−N062Q−G097A−G100N−Y217Q,N061P−G097A−M124I−Y217Q,G102A−N123Q−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−S101N−N123Q−Y217Q,S053G−N061P−G097A−S101N−N123Q−Y217Q,N061P−G097A−S101N−N123Q−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−G100Q−P210S−Y217Q,S053G−N061P−G102A−P129S−P210S−Y217Q,G097A−I111V−M124V−P210S−Y217Q,G097A−N123Q−P210S−Y217Q,N061P−G097A−N123Q−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−S101N−M124I−Y217Q,S053G−N061P−G097A−S101N−M124I−Y217Q,S053G−N061P−G097A−M124I−Y217Q,N061P−S078N−G097A−I111V−M124I−Y217Q,N061P−G097A−M124V−Y217Q,N061P−N062Q−G100N−G102A−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−G100Q−S101N−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−N062Q−G097A−G100N−S101N−Y217Q,S078N−G097A−I111V−N123Q−Y217Q,S053G−N061P−N062Q−G097A−G100N−S101N−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−G100N−S101N−Y217Q,N061P−N062Q−S078N−G097A−G100N−I111V−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−G100D−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−G100Q−Y217Q,N061P−S101N−G102A−G128S−Y217Q,N061P−G102A−G128S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S101N−G102A−P129S−Y217Q,S053G−N061P−S101N−G102A−P129S−Y217Q,N061P−S078N−G102A−I111V−P129S−Y217Q,G097A−N123V−Y217Q,S053G−N061P−G102A−P129S−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−N062Q−G097A−S101N−I111V−Y217Q,S053G−N061P−N062Q−G097A−S101N−I111V−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−S101N−I111V−Y217Q,N061P−N062Q−G097A−I111V−Y217Q,N062Q−S078N−G097A−I111V−Y217Q,N062Q−G097A−I111V−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−S101N−I111V−M124V−Y217Q,S053G−N061P−G097A−S101N−I111V−M124V−Y217Q,N061P−G097A−S101N−I111V−M124V−Y217Q,G097A−N123Q−Y217Q,N061P−G097A−I111V−M124V−Y217Q,S078N−G097A−I111V−M124V−Y217Q,G097A−I111V−M124I−Y217Q,S053G−S078N−G097A−I111V−G128S−Y217Q,S078N−G097A−G128S−Y217Q,S053G−N061P−G097A−G128S−Y217Q,G097A−N123A−Y217Q及びY217Q、並びに、
(vii)S101N−G128A−Y217Q,S024G−T055P−N061P−G097A−S101N−G128A,S024G−N025G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A,S024G−T055P−N061P−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S053G−N061P−G097A−S101N−G128A−Y217Q−S249N,N025G−S053G−T055P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−N025G−T055P−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−N061P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N061P−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,S024G−S053G−T055P−N061P−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S024G−T055P−N061P−G097A−G128A−Y217Q,S024G−S038G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Q,S053G−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q,N025G−S078N−G097A−G128A−Y217Q,S024G−N025G−S053G−N061P−G097A−G128A−S130G−Y217Q,及びS024G−S053G−S078N−G097A−S101N−G128A−Y217Q、並びに、
(b)タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体であって、この変異体は、配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、群(i)〜(xii)から選択される配列番号6と比較して少なくとも1組のアミノ酸置換を含む、プロテアーゼ変異体:
(i)A001C,A001D,A001E,A001F,A001H,A001K,A001L,A001M,A001N,A001P,A001Q,A001R,A001S,A001T,A001V,A013C,A013S,A015C,A015D,A015E,A015L,A015R,A048C,A048E,A048S,A073N,A073T,A074G,A074S,A085C,A085G,A085S,A085T,A085V,A088M,A088S,A092S,A098G,A114G,A133E,A133P,A133R,A137E,A137H,A137R,A142C,A144D,A144G,A144H,A144K,A144L,A144N,A144R,A152S,A153G,A153S,A153V,A176C,A179G,A187C,A187F,A187G,A187L,A187N,A187P,A187Q,A187S,A187T,A187V,A187W,A200G,A216C,A216H,A216R,A216W,A223S,A228S,A230G,A230S,A230T,A230V,A231V,A232C,A232V,A272E,A272G,A272K,A272P,A272R,A273D,A273G,A273H,A273L,A273P,A273Q,A273R,A273T,A273V,A274H,A274M,A274R,D036E,D036N,D036Q,D036S,D041C,D060G,D099A,D099H,D099Q,D120E,D181A,D181G,D181H,D181T,D197T,D259A,D259G,D259H,D259N,D259P,D259Q,D259S,D259T,E156A,E156C,E156G,E156H,E156L,E156Q,E156S,E156V,E195G,E251C,E251I,E251L,E251Q,E251T,F058Y,F189A,F189G,F189H,F189L,F189R,F189S,F189T,F189W,F189Y,F261C,F261D,F261E,F261K,F261P,G020C,G020E,G020F,G020H,G020L,G020N,G020Q,G020R,G020T,G020Y,G024A,G024D,G024P,G046D,G053A,G053D,G053E,G053F,G053L,G053M,G053Q,G053R,G053S,G053Y,G097K,G097M,G097R,G131C,G131D,G131R,G146A,G157A,G157N,G157P,G157S,G157T,G160A,G160L,G160R,G160V,G166C,G166I,G166L,G166Q,G166V,G166W,G169A,G178A,G211E,G211K,G215C,G215D,G215E,G215H,G215L,G215S,G215T,G215W,G258A,G258D,G258P,G258S,H017I,H039S,H226L,H238N,H238Y,I011L,I011T,I011V,I031C,I031F,I031L,I079E,I079F,I079K,I079L,I079M,I079Q,I079R,I107L,I111M,I175L,I205A,I205C,I205V,I268L,I268M,K012A,K012C,K012E,K012F,K012G,K012H,K012L,K012N,K012S,K012T,K012W,K027A,K027N,K027S,K027T,K043A,K043C,K043D,K043E,K043F,K043G,K043H,K043I,K043L,K043M,K043N,K043P,K043Q,K043R,K043T,K043V,K043W,K043Y,K136G,K136H,K141A,K141G,K141H,K141L,K141M,K141N,K141Q,K141R,K141T,K141V,K141W,K170A,K170C,K170G,K170Q,K170S,K213A,K213G,K213H,K213I,K213L,K213N,K213Q,K213R,K213S,K213T,K213V,K237A,K237H,K237I,K237L,K237N,K237S,K237T,K237V,K256A,K256C,K256D,K256E,K256G,K256H,K256M,K256P,K256Q,K256S,K256T,K256V,K256W,K265G,K265H,K265N,K265S,K265Y,L016E,L042C,L042F,L042M,L042V,L075G,L075H,L075I,L075T,L082A,L082E,L082F,L082H,L082R,L082S,L082T,L090M,L135F,L196M,L209A,L209C,L209E,L209G,L209H,L209R,L209S,L233E,L233G,L233S,L235M,L235R,L235V,L235W,L257C,L257D,L257E,L257G,L257P,L257R,L257W,L267E,L267F,M050L,M050Y,M119C,M119I,M124L,M222A,M222F,M222L,M222S,M222T,N025C,N025E,N025P,N056D,N056S,N061A,N061C,N061D,N061G,N061I,N061K,N061L,N061Q,N061R,N062A,N062C,N062H,N062L,N062Q,N062R,N062S,N062T,N062V,N062Y,N076A,N076D,N076E,N076L,N076M,N076P,N076Q,N076S,N076T,N076V,N078D,N078E,N078F,N078G,N078H,N078K,N078P,N078Q,N078R,N101D,N101F,N101R,N117G,N117R,N117S,N118A,N118D,N118H,N118Q,N118R,N118S,N118T,N184C,N184E,N184P,N184R,N212C,N212D,N212E,N212R,N212W,N218C,N218D,N218E,N218F,N218G,N218M,N218P,N218R,N218T,N218V,N218W,N240A,N240G,N240Q,N240S,N240W,N243C,N243G,N243S,N252D,N252E,N252V,N269C,N269H,P005A,P005D,P005M,P005Q,P005V,P005W,P014A,P014D,P014F,P014K,P014M,P014R,P014V,P040F,P040R,P040W,P057A,P057W,P129E,P129R,P129V,P172E,P172K,P172R,P194E,P194H,P194R,P194W,P201A,P201G,P201T,P210E,P210L,P239A,P239G,P239H,P239K,P239N,P239R,P239T,Q002D,Q002E,Q002G,Q002I,Q002K,Q002L,Q002P,Q002R,Q002V,Q010D,Q010R,Q010W,Q019C,Q019D,Q019E,Q019H,Q019L,Q019P,Q019R,Q059A,Q059C,Q059D,Q059E,Q059L,Q059R,Q059S,Q059T,Q059W,Q103W,Q185D,Q185E,Q185K,Q185R,Q185W,Q206D,Q206G,Q206H,Q206L,Q206V,Q206W,Q217A,Q217C,Q217E,Q217F,Q217G,Q217H,Q217K,Q217L,Q217R,Q217V,Q245A,Q245D,Q245E,Q245H,Q245M,Q245R,Q271A,Q271C,Q271D,Q271E,Q271F,Q271G,Q271L,Q271P,Q271R,Q271T,Q271W,Q271Y,Q275A,Q275F,Q275G,Q275I,Q275L,Q275P,Q275R,R186A,R186H,R186I,R186L,R186M,R186V,R186W,S003D,S003E,S003F,S003K,S003R,S009C,S009E,S009K,S018C,S018D,S018R,S037A,S037D,S037E,S037G,S037H,S037K,S037L,S037P,S037R,S037Y,S038D,S038M,S038P,S038R,S038Y,S049C,S049T,S063A,S063C,S063D,S063F,S063L,S063M,S063R,S063Y,S087C,S087D,S087K,S087L,S087M,S087N,S087R,S087Y,S089A,S089C,S089D,S089E,S089F,S089G,S089H,S089I,S089K,S089P,S089R,S089V,S089Y,S105T,S125A,S130C,S130D,S130E,S130K,S130R,S130W,S145D,S145G,S145L,S145R,S145T,S159C,S159D,S159L,S159P,S159W,S161C,S161E,S161R,S162C,S162E,S162W,S163A,S173T,S173V,S182C,S182E,S182R,S183C,S183D,S183P,S183R,S188C,S188D,S188E,S188F,S188K,S188L,S188P,S188R,S188W,S190A,S190C,S190G,S190T,S191G,S204E,S204G,S204R,S204Y,S207G,S224G,S224T,S236C,S236D,S236E,S236G,S248C,S248D,S248E,S248H,S248R,S249E,S249L,S249R,S260A,S260C,S260E,S260G,S260K,S260Q,S260R,S260V,S260Y,T022L,T022P,T055C,T055D,T055E,T055I,T055K,T055M,T055R,T055S,T055V,T055W,T055Y,T071A,T158A,T158D,T158E,T158G,T158L,T158P,T158Q,T158R,T158V,T158Y,T164A,T164G,T164K,T164Q,T164R,T208S,T220A,T242D,T242G,T244D,T244E,T244R,T253E,T253R,T253Y,T254G,T255C,T255D,T255E,T255K,T255R,V004D,V004E,V004T,V026A,V028I,V028L,V030I,V044A,V044C,V044P,V044T,V045C,V045D,V045E,V045G,V045I,V045N,V045R,V045T,V051H,V072L,V081A,V081G,V081H,V081R,V081S,V084I,V084M,V095A,V095C,V143A,V143C,V143E,V143F,V143G,V143H,V143Q,V143T,V143W,V147A,V147Q,V147S,V148I,V148L,V149C,V149I,V149L,V165C,V165L,V180A,V180C,V180M,V180S,V192C,V192F,V192G,V192I,V192Q,V192Y,V203A,V203C,V203D,V203E,V203G,V203K,V203M,V203R,V203S,V270C,V270G,V270L,V270P,W241F,W241L,Y006A,Y006C,Y006D,Y006E,Y006M,Y006N,Y006R,Y006S,Y021
C,Y091W,Y104T,Y104V,Y104W,Y214H,Y214Q,Y262C,Y262D,Y262E,Y262H,Y262I,Y262R,及びY262V、
(ii)A001C,A001E,A001P,A015C,A015E,A048C,A048E,A073T,A085C,A085G,A088I,A088M,A114G,A128H,A137R,A142C,A187C,A187F,A187L,A187N,A187P,A187W,A216C,A216H,A230G,A230S,A273D,A273H,A273P,A273Q,A273R,A273T,A274H,D036N,D036Q,D036S,D041C,D041N,D099A,D099H,D099N,D099Q,D099S,D197T,D259H,E156C,E156G,E156H,E156L,E156Q,F058G,F189A,F189G,F189H,F189L,F189R,F189S,F189T,F261C,F261D,F261E,G046D,G053E,G053L,G053M,G053Q,G053R,G131C,G131D,G146A,G157N,G157P,G157T,G160V,G178A,G215C,G215L,G258A,G258P,H039A,H039S,H067T,H238Y,I011L,I031F,I079E,I111M,I175L,I268M,K012A,K012C,K012E,K012F,K012G,K012H,K012L,K012N,K012W,K027N,K027S,K027T,K043C,K043D,K043G,K043L,K043R,K043W,K136E,K136G,K141G,K141L,K141M,K141N,K141R,K170C,K170Q,K213V,K256D,K265G,K265N,K265Q,K265S,K265Y,L042C,L042F,L075G,L075V,L082A,L082E,L082F,L082H,L082R,L082S,L090M,L090T,L126W,L233E,L233G,L233S,L235V,L257D,L257E,L257G,L257P,L257R,L257W,M050L,M222A,M222F,M222L,M222S,M222T,N025R,N056S,N062C,N062H,N062L,N062Q,N062R,N062T,N062Y,N076D,N076P,N078D,N078E,N078F,N078R,N078V,N117G,N118L,N184P,N269C,N269H,N269Q,P005V,P005W,P014K,P057A,P057W,P086F,P129V,P201T,P225G,P225S,P239A,P239G,P239H,P239N,P239T,Q002D,Q002I,Q002K,Q002L,Q002P,Q002R,Q002V,Q010W,Q019L,Q019P,Q059C,Q059D,Q059E,Q059W,Q185W,Q217C,Q245A,Q245H,Q271C,Q271D,Q271E,Q271L,Q271W,Q275A,Q275G,R186M,S009C,S009L,S018C,S018D,S037E,S037H,S037K,S037L,S037P,S038P,S038Y,S049C,S049N,S063C,S063D,S063F,S063L,S063Y,S087C,S087K,S087L,S087N,S087R,S087Y,S089D,S089E,S089F,S089G,S089P,S089W,S105T,S125A,S130C,S145D,S159D,S159P,S163A,S173V,S182P,S183P,S190A,S190G,S191G,S204E,S224G,S248E,S248H,S249E,S260V,S260Y,T022P,T055E,T055M,T055R,T055W,T158D,T158E,T164A,T164G,T164K,T164Q,T164R,T220A,T242G,T242P,T253E,T255C,T255G,V004D,V004T,V044A,V044L,V044P,V044T,V045C,V045G,V045I,V045K,V045L,V045N,V045R,V045T,V045V,V051H,V081A,V081G,V081H,V081R,V084S,V143G,V147A,V148L,V165C,V180S,V203D,V203G,V203S,V270C,V270G,V270P,V270S,W241L,Y104T,Y214H,Y214Q,Y262D,Y262E,Y262G,Y262H,Y262L,Y262N,Y263G,及びY263W、
(iii)A001E,A001E−A088T,A001E−A116T,A001E−A128S,A001E−A128S−G131H−N243V,A001E−G024E,A001E−G131H,A001E−G131H−G169A−N243V,A001E−G169A,A001E−K043Y,A001E−K256R,A001E−L257G,A001E−N076D,A001E−N076D−N109G−A128S,A001E−N109G,A001E−N218S,A001E−N243V,A001E−Q103H,A001E−Q206D,A001E−S033T,A001E−S033T−N109G−N218S,A001E−S033T−N109G−N243V,A001E−S063G,A001E−S162G,A001E−S248N,A001E−S249A,A001E−T158S,A088T−A128S,A088T−G169A,A088T−N218S,A088T−Q206D,A116T−G169A,A116T−N218S,A116T−Q206D,A128S,A128S−G131H,A128S−G169A,A128S−N218S,A128S−N243V,A128S−Q206D,G024E,G024E−A088T,G024E−A128S,G024E−G131H,G024E−K043Y,G024E−N076D,G024E−N218S,G024E−Q103H,G024E−Q206D,G024E−S033T,G024E−S063G,G024E−S162G,G024E−S248N,G024E−S249A,G131H−G169A,G131H−N218S,G131H−N243V,G131H−Q206D,G169A,G169A−K256R,G169A−L257G,G169A−N218S,G169A−N243V,G169A−Q206D,G169A−S248N,G169A−S249A,K043Y,K043Y−A116T,K043Y−A128S,K043Y−G131H,K043Y−G169A,K043Y−L257G,K043Y−N076D,K043Y−N109G,K043Y−N218S,K043Y−Q103H,K043Y−Q206D,K043Y−S063G,K043Y−S162G,K043Y−S248N,K043Y−S249A,K043Y−T158S,N076D,N076D−A088T,N076D−A116T,N076D−A128S,N076D−G131H,N076D−G169A,N076D−N218S,N076D−N243V,N076D−Q103H,N076D−Q206D,N076D−S162G,N076D−S248N,N076D−S249A,N109G−G169A,N109G−Q206D,N109G−S248N,N218S,N218S−K256R,N218S−L257G,N218S−S248N,N218S−S249A,P040E−N109G−A128S−G131H,Q103H,Q103H−G169A,Q103H−Q206D,Q206D,Q206D−K256R,Q206D−L257G,Q206D−N218S,Q206D−N243V,Q206D−S248N,Q206D−S249A,S018T−Y021N−S033T−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,S033T,S033T−A088T,S033T−A116T,S033T−A128S,S033T−A128S−G131H−N243P,S033T−G131H,S033T−G169A,S033T−K043Y,S033T−K256R,S033T−L257G,S033T−N076D,S033T−N076D−A128S−N218S,S033T−N076D−N109G−A128S−N218S−N243V−S248N−K256R,S033T−N109G,S033T−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,S033T−N218S,S033T−P040E−Q103H−N109G,S033T−Q103H−A128S−G131H,S033T−Q206D,S033T−S063G,S033T−S063G−Q103H−N109Q−A128S−G131H−G169A−N243P,S033T−S063G−Q103H−N109Q−A128S−G131H−G169A−N243V,S033T−S162G,S033T−S248N,S033T−S249A,S063G−A116T,S063G−G131H,S063G−G169A,S063G−N109G−A128S−G131H,S063G−N218S,S063G−N243V,S063G−Q206D,S063G−S249A,S162G−G169A,S162G−N218S,S162G−Q206D,S162G−S249A,S248N−K256R,S248N−S249A,S249A−K256R,S249A−L257G,T158S−G169A,T158S−K256R,T158S−Q206D,及びT158S−S162G、
(iv)A001E,A001E−A088T,A001E−A116T,A001E−A128S−G131H−N243V,A001E−G024E,A001E−G131H−G169A−N243V,A001E−G169A,A001E−K043Y,A001E−L257G,A001E−N076D,A001E−N076D−N109G−A128S,A001E−N109G,A001E−Q103H,A001E−Q206D,A001E−S033T−N109G−N218S,A001E−S033T−N109G−N243V,A001E−S248N,A001E−T158S,A088T−G169A,A088T−Q206D,A116T−G169A,A116T−N218S,A116T−Q206D,A128S−G131H,A128S−N243V−S248N−K256R,A128S−Q206D,G024E−K043Y,G024E−N076D,G024E−Q206D,G131H−G169A,G131H−N218S,G131H−N243V−K256R,G131H−Q206D,G131H−S248N,G169A−K256R,G169A−N218S,G169A−N243V,G169A−Q206D,G169A−S249A,K043Y−G169A,K043Y−N076D,K043Y−N218S,K043Y−Q206D,N061P−N109G−G131H−N243V,N061P−N109G−N243V,N061S−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R−S260P,N061S−N109G−N243V,N076D,N076D−G131H,N076D−L257G,N076D−N109G,N076D−Q103H,N076D−Q206D,N076D−S249A,N109G−A128S−N243V−S248N,N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,N109G−A128S−S248N−K256R,N109G−G169A,N109G−N243P−S248A−K256R,N109G−N243P−S248N−K256R,N109G−N243V−K256R,N109G−N243V−S248A−K256R,N109G−N243V−S248N,N109G−N243V−S248N−K256R,N109G−S248N−K256R,N218S−S249A,N243V−S248N−K256R,P040E−N109G−A128S−G131H,Q103H−Q206D,Q206D,Q206D−K256R,Q206D−L257G,Q206D−N218S,Q206D−S248N,Q206D−S249A,S009T−N109G−A128S−K141R−N243V−S248N−K256R,S009T−S018T−Y021N−A128S−K141R−N243V,S018T−Y021N−A128S−N243V,S018T−Y021N−N061S−A128S−N243V−S260P,S018T−Y021N−N061S−N109G−A128S−S260P,S018T−Y021N−S033T−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,S033T,S033T−A128S−G131H−N243P,S033T−A128S−G131H−N243V,S033T−G169A,S033T−N076D−A128S−N218S,S033T−N076D−N109G−A128S−N218S−N243V−S248N−K256R,S033T−N109G−A128S−N243P−S248N−K256R,S033T−N109G−A128S−N243V−S248N−K256R,S033T−P040E−Q103H−N109G,S033T−Q103H−A128S−G131H,S033T−S063G−Q103H−N109Q−A128S−G131H−G169A−N243P,S033T−S063G−Q103H−N109Q−A128S−G131H−G169A−N243V,S063G−G131H,S063G−G169A,S063G−N109G−A128S−G131H,S063G−Q206D,S162G−Q206D,T158S−Q206D,及びT158S−S162G、
(v)A001E−A088T,A001E−A128S,A001E−A128S−G131H−N243V,A001E−G024E,A001E−G024E−S204E−Q206D,A001E−G131H−G169A−N243V,A001E−K043Y,A001E−N076D,A001E−N076D−N109G−A128S,A001E−N218S,A001E−N243V,A001E−Q103H,A001E−Q206D,A001E−S033T,A001E−S033T−N109G−N218S,A001E−S162G,A116T−Q206D,A128S−N243V−S248N−K256R,A128S−Q206D,G024E−Q206D,G131H−Q206D,K043Y−G131H,K043Y−Q103H,K043Y−Q206D,K043Y−S162G,N061S−N109G−A128S−N243V−S260P,N076D−A128S,N076D−Q206D,N076D−S162G,N076D−S248N,N109G−A128S−S248N−K256R,N109G−A128S−T158S−N243V−S248N−K256R,N109G−N243P−S248N−K256R,N109G−Q206D,N243V−S248N−K256R,P040E−N109G−A128S−G131H,Q103H−Q206D,Q206D−K256R,Q206D−N243V,Q206D−S248N,Q206D−S249A,S018T−Y021N−N061S−A128S−N243V−S260P,S018T−Y021N−N061S−N109G−A128S−S260P,S033T−A128S−G131H−N243P,S033T−N076D−A128S−N218S,S033T−N076D−N109G−A128S−N218S−N243V−S248N−K256R,S033T−P040E−Q103H−N109G,S033T−S063G−Q103H−N109Q−A128S−G131H−G169A−N243P,S063G−Q206D,S162G−Q206D,及びT158S−Q206D、
(vi)A001E,A001E−A128S,A001E−G024E,A001E−G131H,A001E−G169A,A001E−K043Y,A001E−K256R,A001E−L257G,A001E−N076D,A001E−N109G,A001E−N218S,A001E−N243V,A001E−Q103H,A001E−Q206D,A001E−S033T,A001E−S063G,A001E−S162G,A001E−S248N,A001E−S249A,A001E−T158S,A088T−A116T,A088T−G131H,A088T−N109G,A088T−N218S,A088T−Q206D,A116T−A128S,A116T−G131H,A116T−Q206D,A116T−S248N,A128S,A128S−G131H,A128S−Q206D,G024E,G024E−N076D,G024E−N109G,G024E−Q206D,G131H,G131H−L257G,G131H−Q206D,G169A−K256R,G169A−Q206D,K043Y,K043Y−A088T,K043Y−A116T,K043Y−A128S,K043Y−G131H,K043Y−G169A,K043Y−K256R,K043Y−L257G,K043Y−N076D,K043Y−N109G,K043Y−N218S,K043Y−N243V,K043Y−Q103H,K043Y−S063G,K043Y−S162G,K043Y−S248N,K043Y−S249A,K043Y−T158S,N076D−A088T,N076D−A116T,N076D−A128S,N076D−G131H,N076D−G169A,N076D−N109G,N076D−N218S,N076D−N243V,N076D−Q103H,N076D−Q206D,N076D−S248N,N076D−T158S,N109G,N109G−G169A,N109G−Q206D,N109G−S162G,N109G−T158S,N218S−S248N,Q103H,Q103H−A128S,Q103H−G131H,Q103H−Q206D,Q103H−S248N,Q103H−S249A,Q103H−T158S,Q206D,Q206D−K256R,Q206D−L257G,Q206D−N218S,Q206D−N243V,Q206D−S248N,Q206D−S249A,S033T,S033T−K256R,S033T−S063G,S033T−S249A,S063G−A088T,S063G−G131H,S063G−G169A,S063G−N076D,S063G−N109G,S063G−N218S,S063G−Q103H,S063G−Q206D,S162G−Q206D,S162G−S249A,S248N−S249A,S249A−K256R,T158S−Q206D,及びT158S−S249A、
(vii)G131H−S162G,G131H−S248N,G131H−T158S,K043Y−G131H,K043Y−S162G,Q103H−A128S,Q103H−N218S,S033T−Q103H,S063G−A088T,S063G−G131H,S063G−S248N,及びT158S−S162G、
(viii)A015S−A088T−N109G−G131H−T158S−N218S−S248N,A088T−A098S−G131H−S248N−K256R−L257G,A088T−A098S−N218S−K256R,A088T−A116T−G131H−G146C,A088T−A116T−G131H−K256R,A088T−A116T−G131H−K256R−L257G−L267M,A088T−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R,A088T−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N,A088T−A116T−G131H−N218S−S248N,A088T−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−G131H−N243V,A088T−A116T−G131H−S248N,A088T−A116T−G131H−S248N−L257G,A088T−A116T−G131H−S248N−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−K256R−L257G,A088T−A116T−N218S,A088T−A116T−N218S−I268V,A088T−A116T−N218S−K256R,A088T−A116T−N218S−L257G,A088T−A116T−N218S−N243V−Q271R,A088T−A116T−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−A116T−N218S−N243V−S248N−K256R−Q275R,A088T−A116T−N218S−S248N,A088T−A116T−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−N243V−S248N−K256R,A088T−A116T−T158S,A088T−A116T−T158S−K256R,A088T−A116T−T158S−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−K256R,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−E251K−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−S248N,A088T−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−S248N−L257G,A088T−A116T−T158S−N243V,A088T−A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−S248N−L257G,A088T−A138E−N218S−N243V−K256R,A088T−G131H,A088T−G131H,A088T−G131H−K141E−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−G131H−K256R,A088T−G131H−N218S−K237R−K256R−L257G,A088T−G131H−N218S−K256R,A088T−G131H−N218S−K256R,A088T−G131H−N218S−K256R−L257G,A088T−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−G131H−N218S−N243V−L257G,A088T−G131H−N218S−N243V−L257G,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−G131H−N218S−S248N,A088T−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−G131H−N243V,A088T−G131H−N243V−K256R,A088T−G131H−N243V−K256R−L257G,A088T−G131H−N243V−S248N,A088T−G131H−N243V−S248N,A088T−G131H−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−S248N,A088T−G131H−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−N218S−I234T−S248N−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−V149L−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−I107T−N109G−G131H−N218S−A223G−S248N−K256R,A088T−I107T−N109G−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−I108T−N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−K213N−N243V−S248N−K256R,A088T−K256R−L257G,A088T−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−A232S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−D140G−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−D140G−T158S−N218S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−K141E−N218S,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−N269D,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−Q275R,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−L257G−I268V,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243F−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R−I268V,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−V149A−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−W241L−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−K256R,A088T−N109G−A116T−M124I−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−N2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(ix)A088T−A098S−G131H−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−K256R,A088T−A116T−G131H−L257G,A088T−A116T−G131H−N218S−N243V,A088T−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−G131H−N218S−S248N−L257G,A088T−A116T−G131H−N243V−S248N−L257G,A088T−A116T−G131H−S248N,A088T−A116T−G131H−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−K256R,A088T−A116T−G131H−T158S−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−A116T−G131H−V150A−N218S−S248N−L257G,A088T−A116T−K256R−L257G,A088T−A116T−K256R−L257G,A088T−A116T−L257G,A088T−A116T−N218S,A088T−A116T−N218S,A088T−A116T−N218S−N243V−Q271R,A088T−A116T−N218S−N243V−S248N,A088T−A116T−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−T158S,A088T−A116T−T158S,A088T−A116T−T158S−K256R,A088T−A116T−T158S−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−A116T−T158S−N218S−S248N,A088T−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−A116T−T158S−N243V−S248N−K256R,A088T−A138E−N218S−N243V−K256R,A088T−G131D−T158S−N243V−S248N,A088T−G131H,A088T−G131H−L257G,A088T−G131H−N218S−K237R−K256R−L257G,A088T−G131H−N218S−K256R,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−G131H−N243V−K256R,A088T−G131H−N243V−L257G,A088T−G131H−N243V−S248N,A088T−G131H−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−N218S−I234T−S248N−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−S248N,A088T−G131H−T158S−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−V149L−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−I108T−N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−K213N−N243V−S248N−K256R,A088T−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−D140G−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−K141E−N218S,A088T−N109G−A116T−G131H−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−Q275R,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−L257G−I268V,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−V149A−T158S−N218S−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−W241L−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−M124I−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N212D−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−S248N,A088T−N109G−A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−T158S−S248N−L257G−Q271P,A088T−N109G−A116T−V148A−N218S−N243V,A088T−N109G−A137E−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−D140G−N243V,A088T−N109G−G131H−A152S−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−N109G−G131H−D140G−T158S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−G131H−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S,A088T−N109G−G131H−N218S−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−N243V,A088T−N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−S248N,A088T−N109G−G131H−N243V−S248N,A088T−N109G−G131H−T158S−L233S−N243V−S248N,A088T−N109G−G131H−T158S−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−N109G−G131H−T158S−N218S−W241R−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−S248N−K256R,A088T−N109G−L257G,A088T−N109G−N218S−K256R−L257G,A088T−N109G−N218S−S248N−K256R,A088T−N109G−N218S−S248N−T255K−K256R−L257G,A088T−N109G−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−T158S−N218S−S248N,A088T−N109G−T158S−N218S−S248N,A088T−N109G−T158S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−T158S−N243V−S248N−Q275R,A088T−N109G−T158S−S248N,A088T−N109G−T158S−S248N−K256R,A088T−N109G−W241R−S248N−K256R,A088T−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N218S−S248N−L257G,A088T−N243V−L257G,A088T−S248N,A088T−S248N−K256R−L257G,A088T−S248N−L257G,A088T−S248N−L257G−I268V,A088T−T158S−K256R,A088T−T158S−N218S−K256R,A088T−T158S−N218S−L257G,A088T−T158S−N218S−L257G,A088T−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−T158S−N218S−Q245K−S248N−K256R,A088T−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−T158S−N218S−S248N−L257G,A088T−T158S−N218S−S248N−L257G−Q275K,A088T−T158S−N243V−K256R,A088T−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−T158S−N243V−L257G,A088T−T158S−N243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8S−V203I−N218S−K256R−L257G,A088T−Y104H−A116T−G131H−N218S−N243V,A088T−Y104H−N109G−A116T−A153S−N218S−N243V−S248N−L257G−N269D,A088T−Y104H−N109G−G131H−A137E−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,A098S−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A116T−D140G−T158S−N218S−N243V−S248N,A116T−G131H−K141E−N218S−N243V−S248N−L257G,A116T−G131H−N218S−W241R−N243V−S248N−K256R−L257G,A116T−G131H−N243V,A116T−G131H−T158S−K256R−L257G,A116T−G131H−T158S−N218S−N243V,A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,A116T−G131H−T158S−N243V−S248N,A116T−G131H−V139I−N218S−N243V−S248N,A116T−G157E−T158S−N243V−S248N−K256R,A116T−N218S−S248N,A116T−N218S−S248N−K256R,A116T−N243V−K256R,A116T−S248N−K256R,A116T−T158S,A116T−T158S−L257G−Q271R,A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,G053S−A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−G169S−N218S−S248N−K256R−L257G,G065D−A088T−G131H−N243V−S248N,G131H−N218S−L257G,G131H−N218S−S248N,G131H−N243V−K256R,G131H−S248N−K256R,G131H−T158S,G131H−T158S−K256R,G131H−T158S−N243V−L257G,K256R,K256R−L257G,L090I−N109G−T158S−N243V,L257G,N109G−A116T−G131H,N109G−A116T−G131H−N243V,N109G−A116T−G131H−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−I234T−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−N218S−N243V−L257G,N109G−A116T−N218S−W241R−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−S248N−K256R,N109G−A116T−T158S−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−K237R−N243V−S248N,N109G−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R,N109G−A116T−T158S−N243V,N109G−A116T−T158S−S248N,N109G−A116T−T158S−S248N−K256R,N109G−G131H−A137V−T158S−N218S−S248N,N109G−G131H−K141E−L257G,N109G−G131H−T158S,N109G−G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−S248N−Q271R,N109G−N218S−S248N−K256R,N109G−N243V−S248N−L257G,N109G−S248N,N109G−T158S−K256R−L257G,N109G−T158S−N218S−N243V−L257G,N109G−T158S−N243V−K256R−L257G,N109G−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N243V,P014L−A015L−L016C−H017T−S018L−Q019K−G020A−Y021T−T022L−G023E,S003P−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−K256R,S003P−N109G−G131H−T158S−L257G,S003P−S248N−L257G,S105H−W106G−I107L−I108S−N109A−G110A−I111S−E112N−W113G−A114P,T158S−N218S−N243V−K256R,T158S−N218S−N243V−S248N,T158S−N218S−S248N−K256R,T158S−N243V−S248N,T158S−S248N,T158S−S248N−K256R,T158S−S248N−K256R−L257G,V004A−A088T−A116T−T158S−N218S,V004A−A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,V004M−A116T−V148A−T158S−N243V−S248N−K256R,Y006H−N109G−N218S−N243V−S248N,Y104H−A116T−T158S−S248N,Y104H−N109G−G131H−N243V−S248N,及びY104H−N218S−L257G、
(x)A045S−S236G,A045S−S236Y,A134T−S260G,G024A−S037W,I031V−S038W,I115T−S183T,I115V−N184Y,N025K−P129K,N025K−P129R,N025K−S037P,N061D−S260I,Q010L−S037P,Q010R−S037T,Q019L−S260N,Q019L−S260P,S037P−T254S,S161P−T253A,及びS162L−D181H、
(xi)A045S−S236G,A045S−S236Y,A133V−S260N,A134T−S260G,G024A−S037W,I031V−S038W,I115T−S183T,I115V−N184Y,N025K−P129R,N025K−S037P,N061D−S260I,Q010R−S037T,Q019L−S260N,Q019L−S260P,及びS162L−D181H、並びに、
(xii)A045S−S236G,A045S−S236Y,I115T−S183T,N025K−S037P,N061S−S260P,Q010L−S037P,Q010R−S037T,Q019L−S260N,S037P−T254S,及びS161P−S260P。ここで、この変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。
(a)1、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、33、43、76、102、109、137、141、158、169、204、210、218、243、248、249、256、257、260及び269、並びに、
(b)24、25、40、52、53、55、58、59、61、62、63、68、78、86、87、88、89、92、96、97、100、101、103、104、106、111、114、115、116、117、118、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、144、145、159、161、162、167、194、203、206、213、217、227、232、239、240、242、265、267及び275。ここで、アミノ酸位置は、配列番号2に対応させることにより番号付けされる。本発明の第二十一態様による親プロテアーゼは、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、本発明の第二十一態様による変異体は、下記の群(a)及び(b)から選択される合計で3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の変異を含み、ここで、少なくとも1つの変異は群(a)から選択される:
(a)A1E/T、S9/T、P14L,A15L,L16C,H17T,S18L/T、Q19K,G20A,Y21N/T、T22L,G23E,S33T,K43Y,N76D,G102A,N109A/S/G、A137V,K141R,T158S,G169A,S204E,P210S,N218S,N243P/V、S248N/A、S249A,K256R,L257G,S260P,及びN269D、並びに、
(b)S24G/R/E、N25G,P40A/E、P52L,S53G,T55P,F58G,Q59S,N61E/P/G/S、N62Q/R/S、S63G/H、V68A,S78N,P86S,S87D/G、A88T/V、S89Y,A92G,L96T,G97A,G100N/Q/T、S101N,Q103E/H、Y104N,W106F,I111V,A114G,I115V,A116N/T、N117S,N118G,N123A/G/Q/V、M124I/V、S125A,L126A,G128A/S、P129E/Q/S/V、S130G,G131S/H、S132N,A133V,A134T,A144K,S145D,S159K,S161P,S162G/K、Y167A,P194L,V203Y,Q206D/E、K213L,Y217Q/L/D、V227T,A232T,P239R/V、N240K,T242R,K265N,L267V,及びQ275E。本発明の第二態様による変異体及び親プロテアーゼは、成熟型であり得る。
3G−T55P−N61P−L75S−N76Y−S101N−S130P−V203Y,からなる群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含むBPN’−v3アミノ酸配列(配列番号4)を含み、ここで、アミノ酸位置は、配列番号2として記載されているバチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’のアミノ酸配列に対応させることにより番号付けされている。
,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−S130G−G131S−S162K,G97A−G128A−Y217Q−T55P−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−T55P−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S87G−A88V−S89A−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G,G97A−G128A−Y217Q−I111V−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−I111V−A273S,G97A−G128A−Y217Q−N61P−S87T−A88L−S89G,G97A−G128A−Y217Q−T22N−S24A−N61P−S63H,G97A−G128A−Y217Q,G97A−G128A−Y217Q−S53G−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−P129S−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S159K−L267V,G97A−G128A−Y217Q−P40E−S53Y−S78Y−P86S−S87G−A88V,G97A−G128A−Y217Q−S24R−S145D,G97A−G128A−Y217Q−I111V−S159K,G97A−G128A−Y217Q−T55P−P129L,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−T55P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S78N−S101N,G97A−G128A−Y217Q−S53G−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S89Y,G97A−G128A−Y217Q−S24R−P129V,G97A−G128A−Y217Q−S87G−A88V−S89A−A116N−N117S−N118G−P172H,G97A−G128A−Y217Q−I111V−A134T,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−P5S−S87G−A88V−S89A−A116G−N117R,Y217Q−N61P−A97G−G102A−A128G−P129S,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−N61P−S78N,G97A−G128A−Y217Q−S145D−S159K−N240K−Q275E,G97A−G128A−Y217Q−T55P−A128S−P129D,G97A−G128A−Y217Q−G23A−S24G−N25G−A128S−P129D,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S78N−S87T−A88L−S89G−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−I111V−P239R,G97A−G128A−Y217Q−S87G−A88V−S89A−S162K,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−I115V,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−T55P−S78N,G97A−G128A−Y217Q−T55P−A92G,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−S87T−A88L−S89G−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−T22N−S24A−T55P,G97A−G128A−Y217Q−S53G−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S53G−T55P−S78N−S87T−A88L−S89G,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−S130G−G131S−S159K,G97A−Y217Q−N61P−N62Q−G100N−A128G,G97A−G128A−Y217Q−S24R−S78N−S182P−L267V,G97A−G128A−Y217Q−P239R−A273S,G97A−G128A−Y217Q−S53G−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−P129Q−S130G−G131S−T242R,G97A−G128A−Y217Q−S3F−S87T−A88L−S89G−G211T,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−L75H−N76G,G97A−G128A−Y217Q−S53G−T55P−N61P−S78N−S87T−A88L−S89G,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−A144K,G97A−G128A−Y217Q−S78N−S87T−A88L−S89G−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−Q59S−N61P−A116N−N117S−N118G,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−I111V,G97A−G128A−Y217Q−S24R−S145D−P239R−Q275E,G97A−G128A−Y217Q−S145D−A273S,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−K141E−T242R,G97A−G128A−Y217Q−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−A116N−N117S−N118G−P129Q−S130G−G131S,G97A−G128A−Y217Q−S89Y−G211T,G97A−G128A−Y217Q−S87G−A88V−S89A−A116N−N117S−N118G−A144T,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−S78N−S87T−A88L−S89G−S101N−V203Y,G97A−G128A−Y217Q−S24G−N25G−P129V,G97A−Y217Q−N61P−A128G−P129S−S130P,G97A−G128A−Y217Q−T55P−N61P−S87T−A88L−S89G−G110C−S130P,G97A−Y217Q−N123G−A128G,G97A−G128A−Y217Q−N61P−N62Q−G100N−G102A−M124I,S78N−G97A−G128A−Y217Q,G97A−S101N−G128A−Y217Q,G97A−G128A−A137V−Y217Q,N61P−G97A−G128A−Y217Q,G97A−G128A−S130P−Y217Q,G97A−Q103N−G128A−Y217Q,S63T−G97A−G128A−Y217Q,G97A−G102A−G128A−Y217Q,G97A−N109D−G128A−Y217Q−S248R,S87R−G97A−G128A−Y217Q,G97A−G128A−S188D−Y217Q,S87D−G97A−G128A−Y217Q−S248R,G97A−G128A−S188D−S248R−Y217Q,G97A−G128A−S248D−Y217Q,S78N−G97A−G128A−Y217Q−L267V,S78N−G97A−G128A−Y217Q−S161P,S78N−G97A−G128A−Y217Q−I115V,S78N−G97A−G128A−Y217Q−A273S,S78N−G97A−G128A−Y217Q−G211T,S78N−G97A−G128A−Y217Q,S78N−G97A−G128A−Y217Q−I111V,S78N−G97A−G128A−Y217Q−V147L,S78N−G97A−G128A−Y217Q−I108V,S78N−G97A−G128A−Y217Q−S89Y,及びS78N−G97A−G128A−Y217Q−A138T,のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又はそれ以上を含む、スブチリシン変異体、特に成熟BPN’(配列番号2)の変異体などの好適な冷水プロテアーゼを提供し、ここで、変異体配列の位置は、配列番号2の位置に対応させることにより番号付けされる。
本発明は、単離された、非自然発生の又は組み換え核酸(本明細書では「ポリヌクレオチド」とも呼ぶ)を提供し、これは集合的に「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」とも呼ばれ得、これは本発明のポリペプチド(例えば、プロテアーゼ変異体)をコードする。下記全てを含む本発明の核酸は、本発明のポリペプチドの組み換え体生産(例えば、発現)に有用であり、典型的には、この生産には所望のポリペプチドをコードする配列又はその断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介する。上述のように、ポリペプチドとしては、クリーニングする必要のある物品又は表面(例えば、物品の表面)を洗浄するためのクリーニング用途及びクリーニング組成物に有用である酵素活性(例えば、タンパク質分解活性)を有するスブチリシン変異体ポリペプチドなどのプロテアーゼ変異体ポリペプチドが挙げられる。
例えば、部位特異的飽和変異誘発、走査変異誘発、挿入変異誘発、欠失変異誘発、無作為変異誘発、部位特異的変異誘発及び指向進化、並びに、様々な他の組み換え方法が挙げられるがこれらに限定されない、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする本発明の改変されたポリヌクレオチドを生産するのに好適である様々な方法が当該技術分野で既知である。改変されたポリヌクレオチド及びタンパク質(例えば、プロテアーゼ変異体)の製造方法としては、DNAシャッフリング法(例えば、Stemmer WP,Proc.Natl.Acad.Sci.USA Proc Natl.Acad.Sci.USA91(22):10747〜51(1994)を参照されたい)、遺伝子の非相同組み換えに基づく方法、例えば、ITCHY(Ostermeier et al.,Bioorg.Med.Chem.7:2139〜44[1999])、SCRATCHY(LutZ et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:11248〜53[2001])、SHIPREC(Sieber et al.,Nat.Biotechnol.19:456〜60[2001])、NRR(Bittker et al.,Nat.Biotechnol.20:1024〜9[2001]、Bittker et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA 101:7011〜6[2004])、オリゴヌクレオチドの使用に依拠してランダム及び標的変異、欠失及び/又は挿入を行なう方法(Ness et al.,Nat.Biotechnol.20:1251〜5[2002];Coco et al.,Nat.Biotechnol.20:1246〜50[2002];Zha et al.,Chembiochem.4:34〜9[2003];Glaser et al.,J.Immunol.149:3903〜13[1992])が挙げられ、Arkin and Youvan,Biotechnology 10:297〜300(1992);Reidhaar−Olson et al.,Methods EnZymol.208:564〜86(1991)も参照されたい。
一態様では、親ポリヌクレオチドの全長を適切な発現プラスミドに連結し、以下の変異誘発方法を使用して本発明の改変プロテアーゼの構築を促進するが、他の方法を使用してもよい。この方法は、Pisarchik et al.に記載のものに基づく(Pisarchik et al.,Prot.Eng.Des.Select.20:257〜265[2007])。一態様では、制限酵素がその認識配列の外側を切断する点において付加的な利点がもたらされ、これにより、任意のヌクレオチド配列の消化が実践的に可能になり、制限部位の痕の形成を防止する。
本発明は、本発明の少なくとも1つのポリペプチド(例えば、少なくとも1つのプロテアーゼ変異体)を含む組成物を含む。本発明のポリペプチドは、パートI実施例及びパートII実施例を含む下記及び上記に説明されている。このような組成物は、少なくとも1つの賦形剤、担体、添加剤成分、又は他の置換基、構成成分又は物質を含んでもよい。
例えば、クリーニング組成物などの本明細書に及び全体にわたって記載の本発明の組成物は、任意の好適な形態に配合することができ、配合者により選択される任意の好適なプロセスにより調製することができる(例えば、米国特許第5,879,584号、同第5,691,297号、同第5,574,005号、同第5,569,645号、同第5,565,422号、同第5,516,448号、同第5,489,392号、同第5,486,303号、同第4,515,705号、同第4,537,706号、同第4,515,707号、同第4,550,862号、同第4,561,998号、同第4,597,898号、同第4,968,451号、同第5,565,145号、同第5,929,022号、同第6,294,514号及び同第6,376,445号を参照されたい)。
本発明は、例えば、食卓食器物品、食卓用器具物品、布地物品、洗濯物品、パーソナルケア物品、メガネなど又はこれらに類するものをクリーニング又は洗浄する方法、並びに、例えば、物品の硬質表面などの硬質又は軟質表面をクリーニング又は洗浄するための方法が挙げられるがこれらに限定されない、洗浄の必要のある物品又は表面(例えば、硬質表面)をクリーニング又は洗浄するための方法を提供する。
以降のパートI実施例及びパートII実施例の実験についての開示では、以下の略記が適用される:PI(性能指数)、ppm(百万分率)、M(モル濃度)、mM(ミリモル濃度)、μM(マイクロモル濃度)、nM(ナノモル濃度)、mol(モル)、mmol(ミリモル)、μmol(マイクロモル)、nmol(ナノモル)、gm(グラム)、mg(ミリグラム)、μg(マイクログラム)、pg(ピコグラム)、L(リットル)、ml及びmL(ミリリットル)、μl及びμL(マイクロリットル)、cm(センチメートル)、mm(ミリメートル)、μm(マイクロメートル)、nm(ナノメートル)、U(ユニット)、V(ボルト)、MW(分子量)、sec(秒)、min(分)、h及びhr(時間)、℃(セルシウス度)、QS(十分量)、ND(実施せず)、rpm(毎分回転数)、GH(ドイツ硬度)、H2O(水)、dH2O(脱イオン水)、HCl(塩酸)、aa(アミノ酸)、bp(塩基対)、kb(キロ塩基対)、kD(キロダルトン)、cDNA(コピー又は相補的DNA)、DNA(デオキシリボ核酸)、ssDNA(単鎖DNA)、dsDNA(2本鎖DNA)、dNTP(デオキシリボヌクレオチド三リン酸)、RNA(リボ核酸)、MgCl2(塩化マグネシウム)、NaCl(塩化ナトリウム)、w/v(体積対重量)、v/v(体積対体積)、w/w(重量対重量)、g(重さ)、OD(光学密度)、ppm(百万分率)、ダルベッコリン酸緩衝溶液(DPBS)、SOC(2%バクトトリプトン、0.5%バクト酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl)、テリフィック培地(TB、12g/Lバクトトリプトン、24g/Lグリセロール、2.31g/L KH2PO4、及び12.54g/L K2HPO4)、OD280(280nmでの光学密度)、OD600(600nmでの光学密度)、A405(405nmでの吸光度)、Vmax(酵素触媒反応の飽和最大速度)、PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)、PBS(リン酸緩衝生理食塩水[150mMのNaCl、10mMのナトリウムリン酸緩衝液、pH 7.2])、PBST(PBS+0.25% TWEEN(登録商標)−20)、PEG(ポリエチレングリコール)、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、RT−PCR(逆転写PCR)、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、HEPES(N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N−[2−エタンスルホン酸])、HBS(HEPES緩衝生理食塩水)、トリス−HCl(トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン−塩酸塩)、トリシン(N−[トリス−(ヒドロキシメチル)−メチル]−グリシン)、CHES(2−(N−シクロ−ヘキシルアミノ)エタン−スルホン酸)、TAPS(3−{[トリス−(ヒドロキシメチル)−メチル]−アミノ}−プロパンスルホン酸)、CAPS(3−(シクロ−ヘキシルアミノ)−プロパン−スルホン酸、DMSO(ジメチルスルホキシド)、DTT(1,4−ジチオ−DL−トレイトール)、SA(シナピン酸(s,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシケイ皮酸)、TCA(トリクロロ酢酸)、Glut及びGSH(還元グルタチオン)、GSSG(酸化グルタチオン)、TCEP(トリス[2−カルボキシエチル]ホスフィン)、Ci(キュリー)、mCi(ミリキュリー)、μCi(マイクロキュリー)、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)、RP−HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)、TLC(薄層クロマトグラフィー)、MALDI−TOF(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化法−飛空時間型)、Ts(トシル)、Bn(ベンジル)、Ph(フェニル)、Ms(メシル)、Et(エチル)、Me(メチル)、Taq(好熱菌(Thermus aquaticus)DNAポリメラーゼ)、クレノウ(DNAポリメラーゼIラージ(クレノウ)フラグメント))、EGTA(エチレングリコール−ビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸)、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、bla(β−ラクタマーゼ又はアンピシリン耐性遺伝子)、HDL(強力液体)、HDD(強力粉末洗剤)、HSG(高起泡顆粒洗剤)、CEE(中央及び東ヨーロッパ)、WE(西ヨーロッパ)、洗剤を参照する際に使用する場合のNA(北アメリカ)、洗剤を参照する際に使用する場合の日本及びJPN(日本)、MTP(マイクロタイタープレート)、MJ Research(MJ Research,Reno,NV)、Baseclear(Baseclear BV,Inc.,Leiden,The Netherlands)、PerSeptive(PerSeptive Biosystems,Framingham,MA)、ThermoFinnigan(ThermoFinnigan,San Jose,CA)、Argo(Argo BioAnalytica,Morris Plains,NJ)、SeitZ EKS(SeitZSchenk Filtersystems GmbH,Bad KreuZnach,Germany)、Pall(Pall Corp.)(East Hills,NY及びBad KreuZnach,Germany)、Spectrum(Spectrum Laboratories,DomingueZ Rancho,CA)、Molecular Structure(Molecular Structure Corp.,Woodlands,TX)、Accelrys(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)、Chemical Computing(Chemical Computing Corp.,Montreal,Canada)、New Brunswick(New Brunswick Scientific,Co.,Edison,NJ)、CFT(Center for Test Materials,Vlaardingen,The Netherlands)、P&G及びProcter & Gamble(Procter & Gamble,Inc.,Cincinnati,OH)、GE Healthcare(GE Healthcare,Chalfont St.Giles,United Kingdom)、DNA2.0(DNA2.0,Menlo Park,CA)、OXOID(Oxoid,Basingstoke,Hampshire,UK)、MegaZyme(MegaZyme International Ireland Ltd.,Bray Business Park,Bray,Co.,Wicklow,Ireland)、FinnZymes(FinnZymes Oy,Espoo,Finland)、Kelco(CP Kelco,Wilmington,DE)、Corning(Corning Life Sciences,Corning,NY)、NEN(NEN Life Science Products,Boston,MA)、Pharma AS(Pharma AS,Oslo,Norway)、Dynal(Dynal,Oslo,Norway)、Bio−Synthesis(Bio−Synthesis,Lewisville,TX)、ATCC(American Type Culture Collection,Rockville,MD)、Gibco/BRL(Gibco/BRL,Grand Island,NY)、Sigma(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、Pharmacia(Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)、NCBI(National Center for Biotechnology Information)、Applied Biosystems(Applied Biosystems,Foster City,CA)、BD Biosciences及び/又はClontech(BD Biosciences CLONTECH Laboratories,Palo Alto,CA)、Operon Technologies(Operon Technologies,Inc.,Alameda,CA)、MWG Biotech(MWG Biotech,High Point,NC)、Oligos Etc(Oligos Etc.Inc,Wilsonville,OR)、Bachem(Bachem Bioscience,Inc.,King of Prussia,PA)、Difco(Difco Laboratories,Detroit,MI)、Mediatech(Mediatech,Herndon,VA、Santa CruZ(Santa CruZ Biotechnology,Inc.,Santa CruZ,CA)、Oxoid(Oxoid Inc.,Ogdensburg,NY)、Worthington(Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ)、GIBCO BRL又はGibco BRL(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)、Millipore(Millipore,Billerica,MA)、Bio−Rad(Bio−Rad,Hercules,CA)、Invitrogen(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)、NEB(New England Biolabs,Beverly,MA)、Sigma(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、Pierce(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)、タカラ(タカラバイオ株式会社、大津、日本)、Roche(Hoffmann−La Roche,Basel,SwitZerland)、Gene Oracle(Gene Oracle,Inc.,Mountain View,CA)、EM Science(EM Science,Gibbstown,NJ)、Qiagen(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)、Biodesign(Biodesign Intl.,Saco,Maine)、Aptagen(Aptagen,Inc.,Herndon,VA)、Sorvall(Sorvall brand,from Kendro Laboratory Products,Asheville,NC)、Molecular Devices(Molecular Devices,Corp.,Sunnyvale,CA)、R&D Systems(R&D Systems,Minneapolis,MN)、Siegfried Handel(Siegfried Handel AG,Zofingen,SwitZerland)、Stratagene(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)、Marsh(Marsh Biosciences,Rochester,NY)、Geneart(Geneart GmbH,Regensburg,Germany)、Bio−Tek(Bio−Tek Instruments,Winooski,VT)、(Biacore(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)、PeproTech(PeproTech,Rocky Hill,NJ)、SynPep(SynPep,Dublin,CA)、New Objective(New Objective brand、Scientific Instrument Services,Inc.,Ringoes,NJ)、Waters(Waters,Inc.,Milford,MA)、Matrix Science(Matrix Science,Boston,MA)、Dionex(Dionex,Corp.,Sunnyvale,CA)、Monsanto(Monsanto Co.,St.Lou
is,MO)、Wintershall(Wintershall AG,Kassel,Germany)、BASF(BASF Co.,Florham Park,NJ)、Huntsman(Huntsman Petrochemical Corp.,Salt Lake City,UT)、Shell Chemicals(Shell Chemicals,Inc.,London,UK)、Stepan(Stepan,Northfield,IL)、Clariant(Clariant,SulZbach,Germany)、Industrial Zeolite(Industrial Zeolite Ltd.,Grays,Essex,UK)、JungbunZlauer(JungbunZlauer,Basel,SwitZerland)、Solvay(Solvay,Brussels,Belgium)、3V Sigma(3V Sigma,Bergamo,Italy)、Innospec(Innospec,Ellesmere Port,UK)、Thermphos(Thermphos,Vlissiggen−Ost,The Netherlands)、Ciba Specialty(Ciba Specialty Chemicals,Basel,SwitZerland)、Dow Corning(Dow Corning,Barry,UK)、Enichem(Enichem Iberica,Barcelona,Spain)、Fluka Chemie AG(Fluka Chemie AG,Buchs,SwitZerland)、Gist−Brocades(Gist−Brocades,NV,Delft,The Netherlands)、Dow Corning(Dow Corning Corp.,Midland,MI)、Mettler−Toledo(Mettler−Toledo Inc,Columbus,OH)、RB(Reckitt−Benckiser,Slough,UK)、及びMicrosoft(Microsoft,Inc.,Redmond,WA)。
北アメリカ(NA)及び西ヨーロッパ(WE)の強力液体洗濯(HDL)洗剤に関しては、予め計量した液体洗剤(ガラス瓶内)を、95℃のウォーターバスに2時間にわたって配置することで、市販の洗剤中に存在する酵素の加熱不活性化を実施する。NA及びWEの自動食器洗浄(ADW:auto dish washing)洗剤を加熱不活性化するためのインキュベート時間は8時間である。不活性化率を正確に測定するために、未加熱及び加熱洗剤のどちらも、洗剤を溶解させて5分以内にアッセイにする。酵素活性はAAPFアッセイにより試験する。
洗剤の表
パートI実施例のアッセイで使用される洗剤の組成を表1−3に示す。BPN’変異体タンパク質サンプルを、パートI実施例1に記載のような洗剤組成物に添加して、様々な試験特性についてアッセイした。
1 ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約6000であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約40:60であり、50個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は1以下である。
アッセイ
以下に示されるような様々なアッセイを用いた。以下に提供されるプロトコルからの任意の派生が、続く実施例に示される。
本発明のプロテアーゼ及び変異体のプロテアーゼ活性を測定するために、N−スクシニル−L−アラニル−L−アラニル−L−プロリル−L−フェニル−p−ニトロアニリド(suc−AAPF−pNA)の加水分解を計測した。使用した試薬溶液は、以下のものであった:0.005%のTWEEN(登録商標)−80を含有している100mMのトリス/HCl(pH 8.6)(トリス希釈緩衝液)、10mMのCaCl2及び0.005%のTWEEN(登録商標)−80を含有している100mMトリス緩衝液(pH 8.6)(トリス/Ca緩衝液)、並びに160mMのsuc−AAPF−pNA/DMSO(suc−AAPF−pNA保存溶液)(Sigma:S−7388)。suc−AAPF−pNA希釈標準溶液を調製するために、1mLのsuc−AAPF−pNA原液を100mLのトリス/Ca緩衝液に加え、少なくとも10秒にわたってウェルをよく混合した。10μLの希釈プロテアーゼ溶液を各ウェルに加え、直ちに1mg/mLのsuc−AAPF−pNA希釈標準溶液190μLを加えてアッセイを実施した。溶液を5秒にわたって混合し、吸光度の変化を、25℃にて、405nmで、MTPリーダーの動的解析モードにより読み取りした(5分毎に25回読み取り)。プロテアーゼ活性はAUとして表記される(活性=ΔOD・min−1ml−1)。
血液、ミルク及びインク(BMI)のシミをつけた、直径5.5ミリメートルの円形微小標本をCFTから得た。標本を切りだす前に、布地(EMPA 116)を水で洗浄した。96ウェル非結合マイクロタイタープレート(Corning 3641)の各ウェルに微小標本を1つずつ配置した。アッセイに使用した洗剤には、洗剤組成物1、洗剤組成物2及び洗剤組成物4が含まれた。洗剤をミリQ(脱イオン)水で濃度0.788g/Lの使用強度に希釈した。5mMのHEPES(pH 8.2又はpH 7.2)を洗剤に加えることで、これらの洗剤をそれぞれpH 8又はpH 7に緩衝化させた。更に、ガロンあたり6グレイン(gpg)の硬度の水(3:1のCa:Mg−CaCl2:MgCl2・6H2O)を添加した。洗剤溶液を、16℃でのアッセイのためにアイスウォーターバスで(32℃でのアッセイのためには室温で)予め平衡化し、循環リザーバ(Beckman FX)に注入した。次いで、微小標本を含有しているMTPの各ウェルに所望の洗剤溶液190μLを加えた。この混合物に、酵素を希釈した10μLのマスター希釈溶液を加え、酵素濃度をおよそ0.4〜0.5μg/mLにした。マスター希釈物は培養上清から8μg/mLで調製されており、ここで、培養上清及びBPN’−v3又はBPN’−v36親対照の、およその酵素濃度は、既知の濃度の精製BPN’−v3又はBPN’−v36標準の濃度に基づいて、AAPFプロテアーゼ活性アッセイを用いて判定した。MTPをテープでシールし、冷蔵保管されるサンプルの場合16℃に予め設定した、又は卓上のサンプルの場合32℃に予め設定したiEMS恒温器/振盪機(Thermo/Labsystems)内に、1400rpmで撹拌しながら20分間定置した。適切な条件下でのインキュベーション後、各プレートからシーリングテープを取り外し、各ウェルから125μLの溶液(より少量を選別するため手作業によりピペット操作を行う場合には150μL)を新しいMTP(Corning 9017)に移した。125μL〜150μLの溶液/ウェルを含有させた新しいMTPを、MTP SpectraMaxリーダー(340型、Molecular Devices)を用い、600nmで(5秒混合モードのプレートリーダーにより)読み取りした。ブランク対照には微小標本及び洗剤は含有させたが、酵素は含有させなかった。得られた吸光度値をブランク値(酵素を除く基質)について補正し、加水分解活性を測定した。各サンプル(変異体)に関し、性能指数を以下に記載するように算出した。60°F(16℃)及びpH 8にて実施するこのBMI微小標本アッセイを、本明細書では「試験方法」として参照する。
色素含むCS38時効処理卵黄でシミを付けた直径5.5ミリメートルの円形綿微小標本をCFTから得た。これらの標本は、水で予めすすがなかった。96ウェル非結合マイクロタイタープレート(Corning 3641)の各ウェルに微小標本を1つずつ配置した。洗剤組成物4をミリQ(脱イオン)水で濃度0.788g/Lの使用強度に希釈した。5mMのHEPES(pH 8.2)を洗剤に加えることで、この洗剤をpH 8に緩衝化させた。更に、ガロンあたり6グレイン(gpg)の硬度の水(3:1のCa:Mg−CaCl2:MgCl2・6H2O)を添加した。洗剤溶液を、16℃でのアッセイのためにアイスウォーターバスで(32℃でのアッセイのためには室温で)予め平衡化し、循環リザーバ(Beckman FX)に注入した。次いで、微小標本を含有しているMTPの各ウェルに185μLの所望の洗剤溶液を添加した。この混合物に、酵素を希釈した15μLのマスター希釈溶液を加え、反応液中の酵素濃度をおよそ0.6μg/mLにした。マスター希釈物は培養上清から8μg/mLで調製されており、ここで、培養上清及びBPN’−v3又はBPN’−v36親対照の、およその酵素濃度は、既知の濃度の精製BPN’−v3又はBPN’−v36標準の濃度に基づいて、AAPFプロテアーゼ活性アッセイを用いて判定した。MTPをテープでシールし、冷蔵保管されるサンプルの場合16℃に予め設定した、又は卓上のサンプルの場合32℃に予め設定したiEMS恒温器/振盪機(Thermo/Labsystems)内に、1400rpmで撹拌しながら30分間定置した。適切な条件下でのインキュベーション後、各プレートからシーリングテープを取り外し、各ウェルから125μLの溶液(より少量を選別するため手作業によりピペット操作を行う場合には150μL)を新しいMTP(Corning 9017)に移した。125μL〜150μLの溶液/ウェルを含有させた新しいMTPを、MTP SpectraMaxリーダー(340型、Molecular Devices)を用い、405nmで(5秒混合モードのプレートリーダーにより)読み取りした。ブランク対照には微小標本及び洗剤は含有させたが、酵素は含有させなかった。得られた吸光度値をブランク値(酵素を除く基質)について補正し、加水分解活性を測定した。各サンプル(変異体)に関し、性能指数を以下に記載するように算出した。
WarwickからWarwick Equestの植物を擦りつけた織布綿標本を得た。これらの標本は、96ウェル非結合マイクロタイタープレート(Corning 3641)の各ウェルに1つの微小標本を配置する特注96ウェル押し抜き機を用いて、5.5ミリメートル直径の円形微小標本に切断された。標本の切断後、この布地を、水で希釈した50%使用強度の洗剤組成物4をウェルあたり100μL用いてウェルの中で洗浄した(予洗いした)。100μLの50%の洗剤予洗い液により20分間予洗いした後、予洗い液を手操作により注意深くピペッティングして除去した。洗剤組成物4をミリQ(脱イオン)水で濃度0.788g/Lの使用強度に希釈した。5mMのHEPES(pH 8.2)を洗剤に加えることで、これらの洗剤をpH 8に緩衝化させた。更に、ガロンあたり6グレイン(gpg)の硬度の水(3:1のCa:Mg−CaCl2:MgCl2・6H2O)を添加した。洗剤溶液を、16℃でのアッセイのためにアイスウォーターバスで(32℃でのアッセイのためには室温で)予め平衡化した。次に、予洗いの完了後、直ちに180μLの所望の洗剤溶液を、微小標本を含有するMTPの各ウェルに添加した。この混合物に、希釈した酵素のマスター希釈液を20μL加え、反応時酵素濃度をおよそ0.8μg/mLにした。マスター希釈物は培養上清から8μg/mLで調製されており、ここで、培養上清及びBPN’−v36親対照の、およその酵素濃度は、既知の濃度の精製BPN’−v36標準の濃度に基づいて、AAPFプロテアーゼ活性アッセイを用いて判定した。MTPをテープでシールし、冷蔵保管されるサンプルの場合16℃に予め設定した、又は卓上のサンプルの場合32℃に予め設定したiEMS恒温器/振盪機(Thermo/Labsystems)内に、1400rpmで撹拌しながら30分間定置した。適切な条件下でのインキュベーション後、各プレートからシーリングテープを取り外し、各ウェルから125μLの溶液(より少量を選別するため手作業によりピペット操作を行う場合には150μL)を新しいMTP(Corning 9017)に移した。125μL〜150μLの溶液/ウェルを含有させた新しいMTPを、MTP SpectraMaxリーダー(340型、Molecular Devices)を用い、430nm及び670nmの両方で(5秒混合モードのプレートリーダーにより)読み取りした。ブランク対照には微小標本及び洗剤は含有させたが、酵素は含有させなかった。得られた吸光度値をブランク値(酵素を除く基質)について補正し、加水分解活性を測定した。各サンプル(変異体)に関し、性能指数を以下に記載するように算出した。
水に希釈した40%の濃洗剤組成物3の存在下で、プロテアーゼ変異体の安定性を測定した。試薬は、ミリQ水で50%に希釈した洗剤組成物3、10mMのMES 0.01% TWEEN(登録商標)−80(pH 5.8)マスター希釈緩衝液、AAPF試薬を使用した:AAPFアッセイのプロトコルを参照されたい。装置は、希釈酵素を洗剤に希釈するための平底MTP(Corning 9017)、並びにsuc−AAPF−pNAプレート、Biomek FX(Beckman Coulter)、Spectramax Plus384 MTPリーダー(Molecular Devices)、iEMS恒温器/振盪機(1mm振幅)(Thermo Electron Corporation)、シーリングテープ:Nunc(236366)、循環リザーバ(Beckman Fx)を使用した。
代表的なアニオン性界面活性剤(LAS=直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、具体的には、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムDOBS)及びEDTA二ナトリウムの存在下でのプロテアーゼ変異体の安定性を、所定の条件下でのインキュベーション後に測定し、AAPFアッセイを用いて残効性を測定した。試薬は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩(DOBS,Sigma No.D−2525)、TWEEN(登録商標)−80(Sigma No.P−8074)、EDTA二ナトリウム(Siegfried Handel No.164599−02)、HEPES(Sigma No.H−7523)、未負荷緩衝液:50mMのHEPES(11.9g/L)+0.005% TWEEN(登録商標)−80(pH 8.0)、負荷緩衝液:50mMのHEPES(11.9g/L)、0.1%(w/v)DOBS(1g/L)、10mMのEDTA(3.36g/L)(pH 8.0)、参照プロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体培養上清(200〜400μg/mLのタンパク質を含有)を使用した。装置は、希釈プレートとしてV又はU底MTP(それぞれGreiner 651101及び650161)、未負荷及びLAS/EDTA緩衝液用平底MTP(Corning 9017)、並びにsuc−AAPF−pNAプレート、Biomek FX(Beckman Coulter)、Spectramax Plus 384 MTPリーダー(Molecular Devices)、iEMS恒温器/振盪機(1mm振幅)(Thermo Electron Corporation)、及びNuncシーリングテープ(236366)を使用した。
性能指数により、同じタンパク質濃度下での変異体の性能(実測値)と標準又は参照プロテアーゼ酵素の性能(理論値)との比較が得られる。理論値は、標準/参照プロテアーゼの性能−用量応答曲線(performance dose response curve)のパラメーターを用いて(すなわちラングミュア等式を用いて性能曲線を生成することで)算出することができる。性能指数(PI)が1超(PI>1)の場合は、標準又は参照プロテアーゼ(例えば、野生型プロテアーゼ又はその他のプロテアーゼ変異体であり得る)と比較したときに、変異体がより良好なものであることが特定され、一方でPIが1(PI=1)である場合は、変異体が標準又は参照プロテアーゼと同様に機能することが特定され、及びPIが1未満(PI<1)の場合は、変異体の機能性が標準又は参照プロテアーゼよりも悪いことが特定される。したがって、PIは、優れた変異体(例えば、標準/参照プロテアーゼと比較してタンパク質分解活性がより強い変異体)、並びに特定の状況下での使用が望ましくない変異体(例えば、標準/参照プロテアーゼよりもタンパク質分解活性が低い変異体)を特定する。
BPN’ライブラリの構築及びBPN’変異体のクリーニング性能
a)ライブラリ構築に使用されるBPN’−v3発現カセットの説明
コンビナトリアルライブラリの構築に使用されるBPN’−v3(G097A−G128A−Y217Q置換を含有するBPN’プロテアーゼ)発現カセットは、aprE−BPN’ハイブリッドリーダー配列(すなわち、シグナル配列)、バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)由来のBPN’プロ及びBPN’成熟配列を含む、BPN’発現カセットを用いて作成された。DNA配列を以下に配列番号1として示し、BPN’前駆タンパク質をコードしている配列を以下に配列番号168として示す。
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(配列番号2)
成熟BPN’−v3遺伝子のヌクレオチド配列は、以下に示される(BPN’−v3発現カセットで使用されるシグナル配列及びプロペプチド配列は、配列番号1に示されるBPN’と同様である):
GCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATTCTATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGCAGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGCACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGCAAAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAG(配列番号3)
成熟BPN’−v3プロテアーゼ変異体のタンパク質配列は、以下に示される(BPN’−v3発現カセットで使用されるシグナル配列及びプロペプチド配列は、配列番号168に示されるBPN’と同じである):
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLAADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGAPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAQNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(配列番号4)
b)pHPLT−BPN’−v3プラスミドを用いるコンビナトリアルライブラリの構築
上記のBPN’−v3発現カセットを含有しているpHPLT−BPN’−v3プラスミド(図1を参照されたい)を、クローニング用のテンプレートDNAとして使用して、BPN’−v3から誘導された変異体を得た。ベクターpHPLT(米国特許第6,566,112号、図4)は、バチルス・リケニホルミス(B. licheniformis)LATプロモーター(「Plat」)と、LATシグナルペプチドをコードしている配列(「プレLAT」)を含有する。プラスミドpUB110に由来する更なるプラスミド成分はMcKenZie et al.、Plasmid 15(2):93〜103(1986)に開示されている:「ori−pUB」はpUB110の複製起点であり「neo」はpUB110に由来するネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子であり、「終結領域」はバチルス・リケニホルミス(B. licheniformis)のアミラーゼの転写終結領域である。
コンビナトリアルライブラリの作成及び変異体BPN’−v3+S78Nのクリーニング性能
a)BPN’−v3+S78N変異体及びこの変異体から誘導される合成遺伝子配列の説明
Gene Oracleは、8つの遺伝子を合成し、pHPLT−BPN’−v3+S78N(BPN’−S78N−G97A−G128A−Y217Q)親プラスミド(図2を参照されたい)にクローン化した。これらの遺伝子のうちいくつかをテンプレート(親)として使用し、コンビナトリアルライブラリを作成した。当該技術分野において既知の標準的な分子生物学的手法を用いてBPN’−v3+S78N変異体を生成した。BPN’−v3+S78N変異体をコードするヌクレオチド配列を以下に示す。
BPN’−v3+S78N変異体のアミノ酸配列を以下に示す。
遺伝子GcM90−96及びGcM100の、ヌクレオチド配列及びタンパク質配列を以下に示す。合成された遺伝子GcM90のヌクレオチド配列は、以下の通りである。
GcM90のアミノ酸配列は以下に提供される。
合成された遺伝子GcM91のヌクレオチド配列は以下に提供される。
GcM91のアミノ酸配列は以下に提供される。
合成された遺伝子GcM92のヌクレオチド配列は以下に提供される。
GcM92のアミノ酸配列は以下に提供される。
合成された遺伝子GcM93のヌクレオチド配列は以下に提供される。
GcM93のアミノ酸配列は以下に提供される。
合成された遺伝子GcM94のヌクレオチド配列は以下に提供される。
GcM94のアミノ酸配列は以下に提供される。
合成された遺伝子GcM95のヌクレオチド配列は以下に提供される。
GcM95のアミノ酸配列は以下に提供される。
合成された遺伝子GcM96のヌクレオチド配列は以下に提供される。
GcM96のアミノ酸配列は以下に提供される。
合成された遺伝子GcM100のヌクレオチド配列は以下に提供される。
GcM100のアミノ酸配列は以下に提供される。
b)合成遺伝子GcM90〜94及びGcM100を用いるコンビナトリアルライブラリCG1〜CG5及びCG8の構築
各合成遺伝子をpHPLT−BPN’−S78N−G97A−G128A−Y217Q親分子に組み込んだ。6つの合成遺伝子GcM90−94を含有しているプラスミドを得て、GcM100をテンプレートとして用いて各位置でコンビナトリアルライブラリを作成した(表3−1)。2つの更なる遺伝子、GcM95及びGcM96も解析のため同様に合成したが、ライブラリのための親DNAとしては使用しなかった。これらの遺伝子は、pHPLT−BPN’−S78N−G97A−G128A−Y217Q親分子上に9つの変異を有する。
更なる変異体BPN’−v3+S78NをDNA2.0により合成した。以下の置換をそれぞれBPN’−v3+S78N親分子の中に導入した:Q59G,N62Q,V68A,S89Y,A92G,I108V,I115V,M124T,P129L,A138T,V147L,S161P,Y167A,P172V,G211T,L267V,及びA273S。
BPN’変異体の生産及びクリーニング性能
QUIKCHANGE(登録商標)Multi Site−Directed MutagenesisによるBPN’変異体LC1〜LC4の作製
QUIKCHANGE(登録商標)Multi Site−Directed Mutagenesis Kitを用い、異なる親プラスミドからBPN’変異体を構築した。NEB Damメチラーゼキットを用いて、親プラスミド(表4−1)を、77.5μLのH20+10μLの10X緩衝液+0.25μLのSAM+2uLのDAMメチラーゼ+10μLのミニプレップDNA(約150ng/μL)を含有させた反応液中で、37℃で一晩メチル化した。メチル化したプラスミドDNAを、QIAGEN(登録商標)PCR精製キットを用い精製した。2.5μLの5X緩衝液+0.5μLのプライマー1(25μM)+0.5μLのプライマー2(25μM)+1μLのdNTP’s+1μLの酵素ブレンド+18μLのH2O+1.5μLのDNAを含有させた反応混合液で、各DNAテンプレートに対してQUIKCHANGE(登録商標)Multi Site−Directed Mutagenesis反応を行った。使用したPCRプログラムは以下の通りであった:95℃で1分、(95℃で1分、53℃で1分、65℃で9:39分)×29サイクル、65℃で10分、4℃で保持。プライマー配列は表4−2に示される。すべての反応で、MJ Research PTC−200 Peltier thermal cyclerを用いてPCRを実施した。1μLのDpnIをQUIKCHANGE(登録商標)Multi Site−Directed Mutagenesis反応物に加え、37℃で一晩置くことでPCRサンプルから親DNAを除去した。形質転換頻度を増加させるために、製造元のプロトコルに従ってIllustra TempliPhiキットを用い、ローリング・サークル型増幅(RCA)させることで、DpnI消化した反応物を増幅させた。枯草菌(B. subtilis)細胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)を、各1μLのRCA反応物で形質転換し、形質転換させた細胞を、10ppmのネオマイシンを含有しているLA+1.6%スキムミルクプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。一晩増殖物からコロニーを選択し、「puReTaq Ready−To−Go PCR Beads」(Amersham)を用いて配列決定するためにコロニーPCRを実施した。PCR及び配列決定に使用したプライマーは、pHPLT F1(/5PHOS/TACATATGAGTTATGCAGTTTG(配列番号54))及びpHPLT seq R1(/5PHOS/TTATCCTTTACCTTGTCTC(配列番号55))であった。適切な配列を有するコロニーを凍結した。実施例2に記載のように、尿素を含有しているMOPS系培地中で、37℃で68時間にわたり、96ウェルマイクロタイタープレートで枯草菌(B. subtilis)形質転換体を増殖させることで、BPN’変異体タンパク質を生産させた。
BPN’核酸を親遺伝子として含有させた発現プラスミドpHPLT−BPN’partial opt(図3を参照されたい)を用いて、連続的にLC5〜LC37と名付けられた更に33種のBPN’変異体をDNA2.0により作成した。LC5〜LC37のBPN’変異体は、それぞれ以下の通りである:BPN’−P52L−V68A−G97A−I111V,BPN’−I111V−M124V−Y167A−Y217Q,BPN’−Y104N−G128A−Y217Q,BPN’−M124V−Y167A−Y217Q,BPN’−I111V−M124V−Y217Q,BPN’−P52L−V68A−G97A,BPN’−G97A−I111V−M124V,BPN’−V68A−A92G−G97A,BPN’−G97A−I111V−M124V−Y167A−Y217Q,BPN’−P52L−V68A−I111V−Y217Q,BPN’−P52L−V68A−I111V,BPN’−V68A−A92G−I111V,BPN’−P52L−V68A−G97A−I111V−Y217Q,BPN’−V68A−G97A−I111V,BPN’−G97A−I111V−Y217Q,BPN’−G97A−I111V−M124V−Y167A,BPN’−S89Y−I111V−M124V,BPN’−V68A−S89Y−I111V,BPN’−V68A−A92G−Y217Q,BPN’−I111V−Y167A−Y217Q,BPN’−G97A−I111V−Y167A−Y217Q,BPN’−G97A−I111V−M124V−Y217Q,BPN’−V68A−I111V−Y167A−Y217Q,BPN’−I111V−G128A−Y217Q,BPN’−G97A−M124V−Y217Q,BPN’−V68A−Y167A−Y217Q,BPN’−I111V−M124V−Y167A,BPN’−N62Q−G97A−I111V,BPN’−G97A−M124V−Y167A−Y217Q,BPN’−G97A−L126A−Y217Q,BPN’−V68A−I111V−Y217Q,BPN’−S89Y−M124V−Y217Q,及びBPN’−L96T−G97A−Y217Q。同様に、プラスミドpHPLT−BPN’partial optもDNA2.0により作成した。
BPN’変異体のクリーニング性能
親BPN’に基づく変異体をDNA2.0により作成した。実施例2に記載のように変異体を増殖させ、16℃及びpH 8での洗剤組成物1のBMI微小標本アッセイ、16℃及びpH 8での洗剤組成物4のBMI微小標本アッセイ、並びに16℃及びpH 8での洗剤組成物4の卵微小標本アッセイで、クリーニング性能について試験した。タンパク質含量はTCAアッセイを用いて測定した。実施例1に記載のようにアッセイを実施し、BPN’−v3(PI値1.0を有する)と比較して性能指数を算出した。
BPN’変異体の構築及びクリーニング性能
親BPN’に基づくBPN’コンビナトリアルライブラリはDNA2.0により作成されたものであり、ライゲーション反応物として供給された。枯草菌(B. subtilis)を効率的に形質転換させるため、形質転換前にライゲーション反応混合物中のDNAを増幅させ、形質転換体を実施例2に記載のように増殖させた。これらの変異体を、16℃及びpH 8での洗剤組成物1及び洗剤組成物4の、BMI微小標本アッセイ、並びに16℃及びpH 8での洗剤組成物4の卵微小標本アッセイを用いて、クリーニング性能について試験した。TCAアッセイを用いてタンパク質含量を測定し、AAPFアッセイを用いてプロテアーゼ活性についてアッセイした。実施例1に記載のようにアッセイを実施し、BPN’−v3(PI値1.0を有する)と比較して性能指数を算出した。
BPN’−v36の部位評価ライブラリの構築及び
BPN’−v36変異体のクリーニング性能
BPN’−v36の部位評価ライブラリの構築
BPN’−v36のアミノ酸配列は、以下の配列番号6に記載のものである。
BPN’−v36プロテアーゼ変異型をコードする核酸配列は以下のものである。
BPN’−v36のアミノ酸配列は、配列番号2のスブチリシンBPN’アミノ酸配列を参照することにより表わすことができる。すなわち、BPN’−v36は、6つのアミノ酸置換S024G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Qを有する、配列番号2のスブチリシンBPN’配列として表すことができる。アミノ酸配列BPN’−v36は、便宜上BPN’−S024G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Q又はBPN’+S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Qとして表記することもできる。本明細書を通して、特に指定のない限り、アミノ酸配列の各アミノ酸位置は、変異体のアミノ酸配列をバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’アミノ酸配列とアラインメントすることによって決定される、配列番号2に示されるバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’のアミノ酸配列における対応するアミノ酸位置の番号付けに従って番号付けされる。
16℃及びpH 8での洗剤組成物4のBMI微小標本アッセイ、並びに16℃及びpH 8での洗剤組成物4の卵微小標本アッセイを用いて、BPN’−v36SEL由来のタンパク質変異体をクリーニング性能について試験した。タンパク質含量はTCAアッセイを用いて測定した。実施例1に記載のようにアッセイを実施し、BPN’−v36(すなわち、BPN’−S24G−S53G−S78N−S101N−G128A−Y217Q)(PI値1.0を有する)と比較して性能指数を算出した。
85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6又はそれ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置と対応させることにより番号付けされる。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくともこのような1つの変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられるが、これに限定されない)、並びに、少なくとも1つのこのような変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
親BPN’−v36に基づく更なるコンビナトリアル変異体のクリーニング性能
DNA 2.0により、親BPN’−v36(BPN’−S24G−S53G−S78N−S101N−G128A−Y217Q)に基づく更なるコンビナトリアル変異体が作成され、提供された。これらの変異体を16℃及びpH 8での洗剤組成物4のBMI微小標本アッセイ、16℃及びpH 7での洗剤組成物4のBMI微小標本アッセイ、16℃及びpH 8での洗剤組成物4の卵微小標本アッセイ、並びに16℃及びpH 8での洗剤組成物4の植物微小標本アッセイで、クリーニング性能について試験した。TCAアッセイを用いてタンパク質含量を測定し、AAPFアッセイを用いてプロテアーゼ活性についてアッセイした。実施例1に記載のようにすべてのアッセイを実施し、BPN’−v36(PI値1.0を有する)と比較して性能指数を算出した。
親BPN’−v36に基づくコンビナトリアルライブラリからの変異体の構築及び変異体のクリーニング性能
BPN’−v36親分子に基づくBPN’コンビナトリアルライブラリはDNA2.0により作成されたものであり、ライゲーション反応物として供給された。枯草菌(B subtilis)を効率的に形質転換させるため、形質転換前にライゲーション反応混合物中のDNAを増幅させ、形質転換体を実施例2に記載のように増殖させた。16℃及びpH 8での洗剤組成物4のBMI微小標本アッセイ、並びに16℃及びpH 8での洗剤組成物4の卵微小標本アッセイを用いて、変異体をクリーニング性能について試験した。タンパク質含量はTCAアッセイを用いて測定した。実施例1に記載のようにアッセイを実施し、BPN’−v36(すなわち、BPN’−S24G−S53G−S78N−S101N−G128A−Y217Q)(PI値1.0を有する)と比較して性能指数を算出した。
−V147I−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−G131H−K256R−L257G,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N,A088T−G131H−N218S−S248N−L257G,A088T−G131H−S248N−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−K256R,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−G131H−T158S−N218S−S248N,A088T−G131H−T158S−N243V,A088T−G131H−T158S−N243V,A088T−G131H−T158S−N243V−S248N,A088T−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−I107T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218T−N243V,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S,A088T−N109G−A116T−N218S−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S−N243V,A088T−N109G−A116T−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−N218T−K256R,A088T−N109G−A116T−N218T−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−N243V,A088T−N109G−A116T−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−N243V−K256R−L257G−N269D,A088T−N109G−A116T−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−T158S,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N218S−S248N,A088T−N109G−A116T−T158S−N243V,A088T−N109G−A116T−T158S−N243V−K256R,A088T−N109G−A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−N243V−K256R,A088T−N109G−G131H−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−N243V,A088T−N109G−G131H−N243V−L257G,A088T−N109G−G131H−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−G131H−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−S248N−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V−K256R,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V−L257G,A088T−N109G−L257G,A088T−N109G−N218S−K256R,A088T−N109G−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−N243V−S248N−L257G−I268V,A088T−N109G−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S−N218S−K256R,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−T158S−N243V−K256R−I268V,A088T−N109G−T158S−N243V−S248N−Q275R,A088T−N218S−N243V,A088T−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A088T−N218S−S248N,A088T−N218S−S248N−L257G,A088T−N243V,A088T−N243V,A088T−N243V−K256R,A088T−N243V−L257G,A088T−S145T−T158S−S248N,A088T−T158S−L257G,A088T−T158S−N218S−S248N−L257G,A088T−T158S−N243V−K256R−L257G−Q271H,A088T−T158S−S248N,A088T−V143A−T158S−K256R,A116T−G131H−K256R,A116T−G131H−N218S,A116T−G131H−N243V,A116T−G131H−N243V−K256R,A116T−G131H−N243V−L257G,A116T−G131H−S248N−K256R,A116T−G131H−T158S−N218S−I234T−N243V−S248N−K256R,A116T−G131H−T158S−N243V−L257G,A116T−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R,A116T−G131H−V143F−T158S−N218S,A116T−L257G,A116T−N218S,A116T−N218S−L257G,A116T−N218S−N243V−L257G,A116T−N243V,A116T−N243V−K256R,A116T−N243V−S248N,A116T−N243V−S248N−K256R−L257G,A116T−S248N,A116T−T158S,A116T−T158S−N218S−N243V,A116T−T158S−N218S−S248N,A116T−T158S−N243V,A116T−T158S−N243V−K256R,A116T−T158S−N243V−L257G,A116T−T158S−N243V−S248N,A116T−T158S−S248N−K256R−L257G,A116T−V149I−T158S−N243V−S248N−K256R−Q271H,G131H−N218S−N243V−L257G,G131H−N243V,G131H−N243V−S248N−K256R,G131H−T158S,G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−N243V−L257G,N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−S248N,N109G−A116T−G131H−S248N−I268V,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−K256R,N109G−A116T−N218S,N109G−A116T−N218S−N243V−K256R,N109G−A116T−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−N218S−S248N−L257G,N109G−A116T−N243V−K256R,N109G−A116T−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−S248N−L257G,N109G−A116T−T158S−G211V−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−T158S−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L2
57G,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V,N109G−A116T−T158S−Q275R,N109G−G131H−A137V−T158S−N218S−S248N,N109G−G131H−N218S−K237N,N109G−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−N218S−S248N−K256R,N109G−G131H−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−S145F−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−S248N−K256R,N109G−G131H−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−K256R,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,N109G−G131H−T158S−N243V,N109G−G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N243V−L257G,N109G−G131H−T158S−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−S248N−Q271R,N109G−N218S−L257G,N109G−N218S−N243V,N109G−N243V−K256R−L257G,N109G−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−T158S−I268V,N109G−T158S−K256R,N109G−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−T158S−N218S−S248N−L257G,N109G−T158S−N243V,N109G−T158S−N243V−K256R−L257G,N109G−T158S−N243V−S248N,N109S−A116T−S248N,N218S,N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N218S−S248N−L257G,N243V,N243V−K256R,N243V−S248N−K256R,N243V−S248N−K256R−L257G,S105P−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,S248N,T158S−N243V−K256R,及びT158S−N243V−L257G,からなる群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含むBPN’−S024G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Qアミノ酸配列(配列番号6)は、pH 8及び16℃での洗剤組成物4のBMI微小標本クリーニングアッセイにおいて、BPN’−v36と比較して1.0超、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.9、少なくとも2、1.0超〜約10、1.0超〜約8、又は1.0超〜約5のPI値を有するものと判定されたが、ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列と対応させることにより番号付けされる。このような変異体は、本アッセイにおいて、BPN’、BPN’−v3、及びBPN’−v36と比較して向上したタンパク質分解活性を有し、BPN’、BPN’−v3及びBPN’−v36よりもPI値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、BPN’(配列番号2)と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、BPN’、BPN’−v3及びBPN’−v36と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、BPN’−v3と比較して1.0超〜約5のPI値を有する、並びに/あるいは、BPN’−v36と比較して1.0超〜約5のPI値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、この変異体は配列番号2又は配列番号6の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置と対応させることにより番号付けされる。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくともこのような1つの変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられるが、これに限定されない)、並びに、少なくとも1つのこのような変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
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243V−K256R−L257G,A116T−T158S−N218S−S248N−K256R,A116T−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,A116T−T158S−N243V−S248N−K256R,A116T−T1
58S−N243V−S248N−K256R−L257G,G024S−G053S−N078S−G097A−N101S−A128S,G131H,G131H−N218S,G131H−N218S−K256R,G131H−N218S−N243V−K256R,G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,G131H−N218S−N243V−S248N,G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,G131H−N218S−S248N−L257G,G131H−N243V−K256R,G131H−N243V−K256R−L257G,G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,G131H−S248N−K256R,G131H−T158S−K256R,G131H−T158S−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−K256R,G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,G131H−T158S−N243V−K256R,G131H−T158S−N243V−S248N−K256R,G131H−T158S−S248N−L257G,G131H−V147I−N218S−S248N−K256R,I107T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,I107T−N109G−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G,N109G−A116T−G131H,N109G−A116T−G131H−A144V−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−N243V,N109G−A116T−G131H−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N243V−S248N,N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−V147A−T158S−N218S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−V149A−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−K256R,N109G−A116T−N218S−K256R,N109G−A116T−N218S−N243V,N109G−A116T−N218S−N243V−L257G,N109G−A116T−N218S−N243V−S248N−I268V,N109G−A116T−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−N243V−S248N,N109G−A116T−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−S248N−K256R,N109G−A116T−T158S,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R,N109G−A116T−T158S−N243V−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V−S248N,N109G−A116T−T158S−S248N,N109G−A116T−T158S−S248N−K256R,N109G−G131H,N109G−G131H−K256R,N109G−G131H−N218S−K256R,N109G−G131H−N218S−K256R−L257G,N109G−G131H−N218S−N243V−L257G,N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−N218S−S248N−L257G,N109G−G131H−N243V,N109G−G131H−N243V−K256R,N109G−G131H−N243V−S248N,N109G−G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N243V−K256R−I268V,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−S248N,N109G−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−K141E−N218S−S248N−L257G,N109G−N218S,N109G−N218S−N243V−K256R,N109G−N218S−N243V−L257G,N109G−N218S−N243V−S248N−S260F,N109G−N218S−S248N,N109G−N218S−S248N−K256R,N109G−N243V−K256R,N109G−N243V−S248N,N109G−N243V−S248N−K256R,N109G−N243V−S248N−L257G,N109G−N243V−S248N−L257G−Q275R,N109G−S182F−S204F−S207L−N218S−S236F−S248N−L257G,N109G−S248N−K256R,N109G−T158S−K256R−L257G,N109G−T158S−L257G,N109G−T158S−N218S−N243V−K256R,N109G−T158S−N218S−N243V−S248N,N109G−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−T158S−N243V−K256R,N109G−T158S−N243V−S248N−K256R,N109G−T158S−N243V−S248N−L257G,N109G−T158S−S248N−L257G,N218S−N243V−L257G,N218S−N243V−S248N−K256R,N243V−K256R−L257G,N243V−S248N−L257G−Q271R,P057Q−A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N,S003P−A116T−N218S−K256R,S003P−N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,S248N−K256R−L257G,T158S−K256R−L257G,T158S−N218S−A272V,T158S−N218S−K256R−L257G,T158S−N218S−L233S,T158S−N218S−N243V,T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,T158S−N218S−N243V−L257G,T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,T158S−N218S−S248N−K256R,T158S−N243V,T158S−N243V−K256R−L257G,T158S−N243V−S248N,T158S−N243V−S248N−K256R−N269D,及びV004A−N109G−A116T−T158S−N218S−S248N−L257G,からなる群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含むBPN’−S024G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Qアミノ酸配列(配列番号6)は、pH 8及び16℃での洗剤組成物4のBMI微小標本クリーニングアッセイにおいて、BPN’−v36と比較して約1.0のPI値を有するものと判定されたが、ここで、変異体のアミノ酸位置は配列番号2の配列と対応させることにより番号付けされる。このような変異体は、本アッセイにおいて、BPN’(配列番号2)と比較して向上したタンパク質分解活性を有し、BPN’よりもPI値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、BPN’(配列番号2)と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、BPN’−v3と比較して1.0のPI値を有する、並びに、BPN’−v36と比較して約1.0のPI値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、この変異体は、配列番号2又は配列番号6の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置と対応させることにより番号付けされる。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくともこのような1つの変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられるが、これに限定されない)、並びに、少なくとも1つのこのような変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
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−N243V−K256R,A116T−T158S−N243V−L257G,A116T−T158S−N243V−S248N,A116T−T158S−S248N−K256R−L257G,G131H−K141R−T158S−N218S−K256R,G131H−N218S,G131H−N218S−K256R,G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,G131H−N218S−N243V−S248N,G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,G131H−N243V−S248N−K256R,G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,G131H−S248N,G131H−T158S−I234T−N243V−K256R,G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−N243V,G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,G131H−T158S−N243V−K256R,G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,N109G,N109G−A116T−G131H−A144V−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−N243V−S248N,N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−S248N,N109G−A116T−G131H−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N,N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−V149A−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−N218S,N109G−A116T−N218S−K256R,N109G−A116T−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−N218S−N243V−S248N−I268V,N109G−A116T−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−N243V−S248N,N109G−A116T−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−T158S,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V−S248N−L257G,N109G−A116T−T158S−Q275R,N109G−A116T−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−L257G,N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−N243V−K256R,N109G−G131H−S145F−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−K256R,N109G−G131H−T158S−N218S−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G−A274T,N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−S248N−L257G,N109G−N218S−K256R−L257G,N109G−N218S−L257G,N109G−N218S−N243V−K256R,N109G−N218S−N243V−S248N−S260F,N109G−N218S−S248N,N109G−N243V−K256R,N109G−N243V−L257G,N109G−N243V−S248N,N109G−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−S182F−S204F−S207L−N218S−S236F−S248N−L257G,N109G−S248N−K256R,N109G−T158S−K256R,N109G−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−T158S−N218S−S248N−L257G,N109G−T158S−N243V,N109G−T158S−N243V−K256R,N109G−T158S−N243V−S248N,N109G−T158S−N243V−S248N−K256R,N109G−T158S−S248N−K256R,N109G−T158S−S248N−L257G,N218S,N218S−N243V−S248N−K256R,N218S−S248N−L257G,N243V−K256R,N243V−S248N−K256R,N243V−S248N−K256R−L257G,N243V−S248N−L257G−Q271R,S003P−A116T−T158S−S248N−K256R,S248N,T158S−N218S,T158S−N218S−A272V,T158S−N218S−L257G,T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,T158S−N218S−N243V−L257G,T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,T158S−N243V−K256R,T158S−N243V−K256R−L257G,T158S−N243V−S248N−K256R,V004A−N109G−A116T−G131H−S248N−K256R−L257G,及びY006H−A116T−G131H−S248N,からなる群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含むBPN’−S024G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Qアミノ酸配列(配列番号6)は、pH 8及び16℃での洗剤組成物4の卵微小標本クリーニングアッセイにおいて、BPN’−v36と比較して1.0超、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.9、少なくとも2、1.0超〜約10、1.0超〜約8、又は1.0超〜約5のPI値を有するものと判定されたが、ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列と対応させることにより番号付けされる。このような変異体は、本アッセイにおいて、BPN’、BPN’−v3、及びBPN’−v36と比較して向上したタンパク質分解活性を有し、BPN’、BPN’−v3及びBPN’−v36よりもPI値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、BPN’(配列番号2)と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、BPN’、BPN’−v3及びBPN’−v36と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、BPN’−v3と比較して1.0超〜約5のPI値を有する、並びに/又は、BPN’−v36と比較して1.0超〜約5のPI値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、この変異体は配列番号2又は配列番号6の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置と対応させることにより番号付けされる。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくともこのような1つの変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられるが、これに限定されない)、並びに、少なくとも1つのこのような変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
−N243V−K256R,A088T−N109G−N243V−S248N−L257G−I268V,A088T−N109G−S248N,A088T−N109G−S248N−K256R,A088T−N109G−T158S−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S−N218S,A088T−N109G−T158S−N218S−K256R−Q271H,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−K256R,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−N109G−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−T158S−N218S−S248N−N269D,A088T−N109G−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S−N243V−S248N−A274D,A088T−N109G−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G−N269D,A088T−N218S−K256R,A088T−N218S−N243V,A088T−N218S−N243V−K256R,A088T−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−N218S−N243V−S248N−L257G,A088T−N218S−S248N−L257G,A088T−N243V−S248N,A088T−N243V−S248N−K256R,A088T−N243V−S248N−L257G,A088T−S145T−T158S−S248N,A088T−S248N−K256R−L257G,A088T−S248N−L257G,A088T−T158S,A088T−T158S,A088T−T158S−K256R,A088T−T158S−L257G,A088T−T158S−N218S,A088T−T158S−N218S−K256R,A088T−T158S−N218S−N243V−K256R,A088T−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,A088T−T158S−N218S−N243V−L257G,A088T−T158S−N218S−S248N,A088T−T158S−N218S−S248N,A088T−T158S−N243V,A088T−T158S−N243V−K256R,A088T−T158S−N243V−S248N−L257G,A116T,A116T−G131H−L257G,A116T−G131H−N218S−K256R,A116T−G131H−N218S−N243V−K256R,A116T−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,A116T−G131H−N218S−N243V−S248N,A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,A116T−G131H−N218S−S248N,A116T−G131H−T158S−K256R,A116T−G131H−T158S−N218S−L257G,A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−L257G,A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G−N269D,A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−Q271R,A116T−G131H−T158S−N218T−L257G,A116T−G131H−T158S−N243V−K256R,A116T−G131H−V150A−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,A116T−K141E−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,A116T−L257G,A116T−N218S−N243V−S248N,A116T−N218T−N243V−S248N,A116T−N243V−S248N−L257G,A116T−S248N,A116T−S248N−L257G,A116T−T158S−K256R,A116T−T158S−N218S−L257G,A116T−T158S−N218S−N243V−K256R,A116T−T158S−N218S−N243V−L257G,A116T−T158S−N243V,A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,A116T−T158S−N243V−S248N−K256R,A116T−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,A116T−V149I−T158S−N243V−S248N−K256R−Q271H,G024S−G053S−N078S−G097A−N101S,G024S−G053S−N078S−G097A−N101S−A128S,G131H−K256R,G131H−N218S−K256R−L257G,G131H−N218S−N243V−L257G,G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,G131H−N218S−S248N−K256R,G131H−N218S−S248N−L257G,G131H−N243V,G131H−N243V−S248N,G131H−N243V−S248N−L257G,G131H−T158S−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S,G131H−T158S−N218S−K256R,G131H−T158S−N218S−N240H−N243V−S248N−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−N243V−K256R,G131H−T158S−N218S−N243V−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,G131H−T158S−N218S−S248N−I268V,G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G−N269S,G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,G131H−T158S−N243V−S248N,G131H−T158S−N243V−S248N−K256R,G131H−T158S−S248N,G131H−T158S−S248N−L257G,G131H−W241L−N243V−S248N−K256R,I107T−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R−L257G,I107T−N109G−G131H−N218S−L257G,N109G−A116T−G131H−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−L257G,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V,N109G−A116T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−N218S−W241R−N243V−K256R,N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−S248N−I268V,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−S248N−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−S248N−L257G,N109G−A116T−K141E−T158S−N218S−N243V−L257G,N109G−A116T−K256R,N109G−A116T−N218S−N243V,N109G−A116T−N218S−N243V−S248N,N109G−A116T−N218S−S248N−L257G,N109G−A116T−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−S248N,N109G−A116T−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−A116T−T158S−N218S−W241R−N243V,N109G−A116T−T158S−N243V−S248N,N109G−A116T−T158S−S248N−L257G,N109G−G131H−K256R,N109G−G131H−N218S−K256R,N109G−G131H−N218S−N243V,N109G−G131H−N218S−N243V−K256R−L257G,N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−G131H−N218S−S248N−K256R,N109G−G131H−N243V,N109G−G131H−N243V−S248N,N109G−G131H−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−S248N,N109G−G131H−T158S−L257G,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−G131H−T158S−N243V−L257G,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−K256R,N109G−G131H−T158S−S248N−K256R,N109G−K141E−N218S−S248N−L257G,N109G−N218S−N243V,N109G−N218S−N243V−S248N−K256R,N109G−N218S−S248N−K256R−L257G,N109G−N218S−S248N−L257G,N109G−N243V−S248N−L257G−Q275R,N109G−T158S−I268V,N109G−T158S−N218S,N109G−T158S−N218S−N243V,N109G−T158S−N218S−N243V−S248N,N109G−T158S−N218S−S248N−K256R,N109S−A116T−S248N,N218S−K256R,N218S−N243V−K256R,N218S−N243V−L257G,N218S−N243V−S248N,N218S−S248N,N218S−S248N−K256R,N218S−S248N−K256R−L257G,S003P−N109G−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R−L257G,S248N−K256R−L257G,T158S−K256R,T158S−K256R−L257G,T158S−N218S−K256R−L257G,T158S−N218S−L233S−S248N,T158S−N243V,T158S−N243V−S248N−K256R−N269D,T158S−N243V−S248N−L257G,V004L−A116T−N218S−N243V−S248N−L257G,及びY006H−N218S−N243V−S248N,からなる群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含むBPN’−S024G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Qアミノ酸配列(配列番号6)は、pH 8及び16℃での洗剤組成物4の卵微小標本クリーニングアッセイにおいて、BPN’−v36と比較して約1.0のPI値を有するものと判定されたが、ここで、変異体のアミノ酸位置は配列番号2の配列と対応させることにより番号付けされる。このような変異体は、本アッセイにお
いて、BPN’(配列番号2)と比較して向上したタンパク質分解活性を有し、BPN’よりもPI値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、BPN’(配列番号2)と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、BPN’−v3と比較して約1.0のPI値を有する、並びに、BPN’−v36と比較して1.0のPI値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、この変異体は、配列番号2又は配列番号6の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置と対応させることにより番号付けされる。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくともこのような1つの変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられるが、これに限定されない)、並びに、少なくとも1つのこのような変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
−N218S−K256R−L257G,A088T−Y104H−A116T−G131H−N218S−N243V,A116T−D140G−T158S−N218S−N243V−S248N,A116T−G131H−T158S−K256R−L257G,A116T−G131H−T158S−N243V−S248N,A116T−G157E−T158S−N243V−S248N−K256R,A116T−S248N−K256R,G131H−N218S−S248N,G131H−N243V−K256R,G131H−T158S−N243V−L257G,K256R−L257G,N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−N243V−S248N,N109G−A116T−N218S−N243V−L257G,N109G−A116T−N218S−W241R−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N243V,N109G−A116T−T158S−S248N−K256R,N109G−N243V,N109G−T158S−K256R−L257G,N243V,P014L−A015L−L016C−H017T−S018L−Q019K−G020A−Y021T−T022L−G023E,S003P−S248N−L257G,T158S−N218S−N243V−S248N,T158S−S248N−K256R,Y104H−N109G−G131H−N243V−S248N,A088T−A116T−G131H−L257G,A088T−A116T−G131H−N218S−N243V,A088T−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R,A088T−A116T−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−A116T−L257G,A088T−A116T−N218S,A088T−A116T−N218S−N243V−S248N,A088T−A116T−T158S−N218S−S248N,A088T−A116T−T158S−N243V−S248N−K256R,A088T−A138E−N218S−N243V−K256R,A088T−G131H−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−G131H−T158S−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−G131H−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−G131H−T158S−N218S−L257G−I268V,A088T−N109G−A116T−G131H−W241L−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−N218S−N243V−S248N−K256R,A088T−N109G−A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−N243V−S248N,A088T−N109G−G131H−N218S−L257G,A088T−N109G−G131H−N218S−S248N,A088T−N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,A088T−N109G−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S−S248N−K256R,A088T−N109G−W241R−S248N−K256R,A088T−N218S−S248N−L257G,A088T−T158S−N218S−S248N−K256R,A088T−T158S−N218S−S248N−L257G,A116T−G131H−T158S−N218S−N243V,A116T−N218S−S248N,A116T−N243V−K256R,A116T−T158S,G131H−S248N−K256R,N109G−A116T−G131H−N243V−K256R−L257G,N109G−A116T−I234T−N243V−S248N−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−K256R−L257G,N109G−A116T−T158S−N218S−S248N−K256R,N109G−G131H,N109G−G131H−A137V−T158S−N218S−S248N,N109G−G131H−K141E−L257G,N109G−G131H−T158S−N243V−S248N−L257G,T158S−N218S−N243V−K256R,A088T−A116T−T158S−N243V−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−K256R−L257G,A088T−N109G−T158S−N218S−S248N,A088T−S248N−L257G,A088T−Y104H−N109G−G131H−A137E−T158S−N218S−N243V−S248N−K256R,G065D−A088T−G131H−N243V−S248N,Y104H−N218S−L257G,A088T−A116T−G131H−V150A−N218S−S248N−L257G,A088T−A116T−T158S−K256R−L257G,A088T−I108T−N109G−G131H−T158S−N218S−S248N−K256R−L257G,A088T−N109G−A116T−T158S−S248N−L257G−Q271P,A088T−N109G−A116T−V148A−N218S−N243V,A088T−Y104H−N109G−A116T−A153S−N218S−N243V−S248N−L257G−N269D,及びV004M−A116T−V148A−T158S−N243V−S248N−K256R,からなる群から選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含むBPN’−S024G−S053G−S078N−S101N−G128A−Y217Qアミノ酸配列(配列番号6)は、pH 8及び16℃での洗剤組成物4の卵微小標本クリーニングアッセイにおいて、BPN’−v36と比較して0.5以上0.9未満のPI値を有するものと判定されたが、ここで、変異体のアミノ酸位置は配列番号2の配列と対応させることにより番号付けされる。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、並びに/あるいは、BPN’−v36と比較して0.5以上0.9未満のPI値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号2又は配列番号6の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記群から選択される少なくとも1組の酸置換を含み、ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置と対応させることにより番号付けされる。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくともこのような1つの変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられるが、これに限定されない)、並びに、少なくとも1つのこのような変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
BPN’−v36の更なる変異体の構築及び変異体のクリーニング性能
BPN’−v36(実施例7に記載のもの)の部位評価ライブラリのDNAに、エラープローンPCRにより更に変異を誘発させた。Taq DNAポリメラーゼ(Promega)を用い、これらのライブラリをプライマーP4973及びP4950(実施例7に記載のもの)により増幅させた。各PCR増幅反応物には、30pmolの各プライマー、100ngのテンプレートDNA(SELsのBPN’−v36)及び様々な量のMnCl2を含有させた。PCR反応(20μL)は、まず始めに95℃で2.5分加熱した後、続いて94℃で15秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で2分の伸長を30サイクル行った。DNA断片をQIAGEN(登録商標)ゲルバンド精製用キットによりゲル精製し、制限酵素BamHI及びHindIIIで消化し、同じ制限酵素で消化したpHPLT−BPN’partial optベクターとライゲーションさせた。Illustra Templiphiキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元(GE Healthcare)の推奨に従って増幅させることで、枯草菌(Bacillus subtilis)に形質転換させるための多量体DNAを生成した。この目的のため、1μLのライゲーション混合物と5μLのサンプル緩衝液を混合し、95℃で3分間加熱し、氷中で冷却した。次に、5μLの反応緩衝液及び0.2μLの酵素を各チューブに加え、続いて30℃で10時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を100倍希釈し、枯草菌(B. subtilis)細胞の形質転換に用いた(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)。形質転換混合物のアリコートを、1.6%のスキムミルク及び10μg/mLのネオマイシンを含有しているLBプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。
各PCR増幅反応には、30pmolの各プライマー及び100ngのBPN’−v36親テンプレートDNA(pHPLT−BPN’−v36プラスミド、図4を参照されたい)を含有させた。増幅はVent DNAポリメラーゼ(NEB)を用いて実施した。PCR反応(20μL)は、まず始めに95℃で2.5分加熱した後、続いて94℃で15秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で40秒の伸長を30サイクル行った。増幅させた後、5’及び3’遺伝子断片を、QIAGEN(登録商標)ゲルバンド精製用キットによりゲル精製し、混合して(各断片につき50ng)、プライマーP4973及びP4950を用いて再度PCRで混合及び増幅させて、完全長の遺伝子断片を生成した。伸長工程を72℃で2分にわたって実施したことを除き、PCR条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のDNA断片をQIAGEN(登録商標)ゲルバンド精製用キットによりゲル精製し、制限酵素BamHI及びHindIIIで消化し、同様の制限酵素で消化したpHPLT−BPN’partial optベクターとライゲーションさせた。Illustra Templiphiキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元(GE Healthcare)の推奨に従って増幅させることで、枯草菌(Bacillus subtilis)に形質転換させるための多量体DNAを生成した。この目的のため、1μLのライゲーション混合物と5μLのサンプル緩衝液を混合し、95℃で3分間加熱し、氷中で冷却した。次に、5μLの反応緩衝液及び0.2μLの酵素を各チューブに加え、続いて30℃で10時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を100倍希釈し、枯草菌(B. subtilis)細胞の形質転換に用いた(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)。形質転換混合物のアリコートを、1.6%のスキムミルク及び10μg/mLのネオマイシンを含有しているLBプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを生じたコロニーを、10μg/mLのネオマイシンを含有している150μLのLB培地に接種した。翌日、培養物は15%のグリセロールと共に凍結させるか、あるいは実施例2に記載されるような生化学的解析のためにMDB培地で増殖させた。
1.コンビナトリアルライブラリFS1〜FS3の生成
BPN’発現カセットを含有しているpHPLT−BPN’−v3プラスミドをクローニング用テンプレートDNA(親プラスミド)として使用した。3つの別個のコンビナトリアルライブラリ(FS1、FS2、及びFS3)はDNA2.0により合成され、個々のライゲーション反応物として供給された。ライブラリ及び導入可能な置換を表11−1に示す。野生型残基又は表11−1に記載の各部位での置換のいずれかが導入できるようにライブラリを設計した。
BPN’安定性を改善するために、どちらもGene Oracleにより合成された分子pHPLT−BPN’G97A−G128A−Y217Q−S87D又はpHPLT−BPN’G97A−G128A−Y217Q−P40E,、あるいはGeneArtにより合成された親分子pHPLT−BPN’G97A−G128A−Y217Q−S78N及びpHPLT−partial opt FNA(バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’−Y217L)のいずれかを用いて変異体を構築した。
表11−4に示される、合計5種の異なるテンプレート:BPN’−v3(G97A−G128A−Y217Q)、BPN’−v4(G97A−N123G−Y217Q)、BPN’変異体8、(S87D−G97A−N109D−G128A−S188D−S248R−Y217Q)、BPN’変異体16(S87D−G97A−N109D−G128A−S188D−Y217Q)及びBPN’変異体21(S87R−G97A−N109R−G128A−S188R−Y217Q−S248R)を用い、BPN’変異体を構築した。BPN’−v4及びBPN’−v3の生成は、このような説明についての参照により本案件に組み込まれる、PCT出願番号PCT/US09/46066(国際公開第09/149144号)(2009年6月3日出願)に記載されている。BPN’変異体8、16、21はGene Oracleにより合成されたものであり、親プラスミドとして用い、更なる変異体を作成した。以下に記載するような融合PCRを用いて作成した2種の変異体(変異体5及び33)を除き、すべての変異体はQUIKCHANGE(登録商標)変異誘発キットを用いて生成した。変異体を生成するためのプライマー(表11−5に記載)はIntegrated DNA Technologiesにより合成された。導入された変異(太字で示されるもの)、並びに使用されたプライマー及びテンプレートを表11−4に示す。
QUIKCHANGE(登録商標)変異誘発によるBPN’変異体の生産
BPN’−v3、BPN’−v4、BPN’変異体8、BPN’変異体16、及びBPN’変異体21を発現するプラスミドを含有している枯草菌(Bacillus subtilis)株を、10ppmのネオマイシンを含有している1.6%のスキムミルクプレートに画線し、37℃で一晩増殖させた。プレートから単独のコロニーを、10ppmのネオマイシンを含有している5mLのルリアブロスで、37℃で250rpmで振盪させながら一晩増殖させた。BPN’−v3、BPN’−v4、BPN’変異体8、BPN’変異体16、及びBPN’変異体21を発現しているプラスミドを、1マイクロリットルのReady Lyse lysoZymeを添加しかつ37℃で15分にわたってインキュベートする細胞溶解は行わずに、QIAGEN(登録商標)ミニプレップキットプロトコルを用い単離した。NEBのDamメチラーゼキットを用いて、プラスミドを、77.75μLのH2O+10μLの10X緩衝液+0.25μLのSAM+2μLのDAMメチラーゼ+10μLのミニプレップDNAを含有させた反応液中で、37℃で一晩メチル化した。メチル化したDNAを、QIAGEN(登録商標)PCR精製キットを用い精製した。表11−4に列挙した変異体14、18、及び19を、QUIKCHANGE LIGHTNING(商標)Multi Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用い、2.5μLの5X緩衝液+0.75μLのQuik溶液+0.5μLのプライマー1(25μM)+0.5μLのプライマー2(25μM)+1.5μLのdNTP+1μLの酵素ブレンド+16.25μLのH2O+2μLのDNAを含有させた反応混合液で生成した。使用したPCRプログラムは以下の通りであった:95℃で2分、(95℃で20秒、55℃で30秒、64℃で2分30秒)×29サイクル、64℃で5分、4℃で保持。
1μLのDpnIをQuik−Change反応物に加え、37℃で一晩置くことでPCRサンプルから親DNAを除去した。製造元のプロトコルに従ってIllustra TempliPhiキットを用い、ローリング・サークル型増幅(RCA)させることで、DpnI消化した反応物1μLを増幅させた。枯草菌(B. subtilis)細胞(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)を、各1μLのRCA反応物で形質転換し、形質転換させた細胞を、10ppmのネオマイシンを含有しているLA+1.6%スキムミルクプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。一晩増殖物からコロニーを選択し、「puReTaq Ready−To−Go PCR Beads」(Amersham)を用いてコロニーPCRを実施した。使用したPCRプライマーはpHPLT F1(配列番号54)及びpHPLT seq R1(配列番号55)であった。適切な配列を有するコロニーを凍結した。尿素を含有しているMOPS系培地を用い、37℃で68時間にわたり、96ウェルマイクロタイタープレートで枯草菌(B. subtilis)形質転換体を増殖させることで、BPN’変異体を発現させた。
テンプレートpHPLT−BPN’−v3から増幅させた断片で融合PCRを用い、変異体5及び33を生成した。これらの変異体を生成するために使用したPCRプライマーは表11−5に包含される。変異体5に関しては、BPN’遺伝子の5’断片は、順方向プライマーpHPLT F1(配列番号54)、及び逆方向プライマーS248D revfusを用いて増幅させた。BPN’遺伝子の3’断片は、所望の変異を含有している順方向プライマーS248D forfus及び逆方向プライマーpHPLT R1を用いて増幅させた。20bpの重複配列を含有している2種の生成物は、1μLの各断片と、融合プライマーQC FUSION_For1及びQC FUSION_Rev1を最終的なPCR反応で組み合わせることで融合させた。PCR反応は、すべてHerculase II PCRキット(Stratagene)の標準条件を用いて実施した。PCRミックスには、1μLのDNAポリメラーゼ、1μLのプラスミドDNA(又は融合用断片DNA)、0.5μLのdNTP、1.25μLの25μMの順方向プライマー、1.25μLの25μMの逆方向プライマー、10μLの5X緩衝液、35μLのH2Oを含有させた。使用したPCRプログラムは以下の通りであった:95℃で2分、(95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で「X」秒)×29サイクル、72℃で1分、4℃保持(「X」は増幅させるDNAの1kBつき15秒)。
RCL4ライブラリ
「RCL4」は、BPN’−v3をコードしている(BPN”−G97A−G128A−Y217Q)遺伝子の、3つの隣接するコドンを同時にランダム化させる融合PCRにより作成された、部位飽和ライブラリ群を指す。各ライブラリ中で、3つの変異コドンに対応するアミノ酸位置は表11−6に提供される。それぞれ3つの縮重コドンを含有している、2種の部分的に重複している相補的な変異原性プライマーを使用して、以下表11−6に示されるように各ライブラリ内に変異を導入した。各プライマー中で、対象とする各縮重コドンの最初の2つのヌクレオチド(NNX、N=A、C、T、又はGであり、及びXは変化していないヌクレオチドである)のみを変異させた(表11−6)。
RCL5変異体
「RCL5」は、親(テンプレート)分子として数個のBPN’変異体を用いて融合PCRにより生成した1組のコンビナトリアル変異体を指す。各親プラスミドに導入した変異を表11−7に示し、変異体を生成するのに使用した変異原性プライマーを表11−8に示す。
各変異体を生成するために、共通の3’側の遺伝子に隣接するプライマー(P4976、CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC、配列番号61)及び変異原性プライマー、あるいは共通の5’側の遺伝子に隣接するプライマー(P4974、GCCTCACATTTGTGCCACCTA、配列番号60)及び表11−8で各ライブラリについて示される変異原性プライマーを用いて、2種類のPCR反応を実施した。これらのPCR反応は、2種のPCR断片を生成した。一方はBPN’変異遺伝子の5’側半分(5’遺伝子断片)をコードするものであり、他方はBPN’変異遺伝子の3’側半分(3’遺伝子断片)をコードするものである。各PCR増幅反応には、30pmolの各プライマー及び表11−7に列挙した100ngの親分子を含有させた。増幅はVent DNAポリメラーゼ(NEB)を用いて実施した。PCR反応(20μL)は、まず始めに95℃で2.5分加熱した後、続いて94℃で15秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で40秒の伸長を30サイクル行った。増幅させた後、5’及び3’遺伝子断片を、QIAGEN(登録商標)ゲルバンド精製用キットによりゲル精製し、混合して(各断片につき50ng)、プライマーP4973(AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC、配列番号62)及びP4950(CTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAA、配列番号63)を用いて再度PCRで増幅させて、完全長の遺伝子断片を生成した。伸長工程を72℃で2分にわたって実施したことを除き、PCR条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のDNA断片をQIAGEN(登録商標)ゲルバンド精製用キットによりゲル精製し、制限酵素BamHI及びHindIIIで消化し、同様の制限酵素で消化したpHPLT−BPN’partial optでライゲーションした。Illustra Templiphiキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元(GE Healthcare)からの取扱説明書に従って増幅させることで、枯草菌(Bacillus subtilis)に形質転換させるための多量体DNAを生成した。この目的のため、1μLのライゲーション混合物と5μLのサンプル緩衝液を混合し、95℃で3分間加熱し、氷中で冷却した。次に、5μLの反応緩衝液及び0.2μLの酵素を各チューブに加え、続いて30℃で10時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を100倍希釈し、枯草菌(B. subtilis)細胞の形質転換に用いた(ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)。形質転換混合物のアリコートを、1.6%のスキムミルク及び10μg/mLのネオマイシンを含有しているLBプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを生じたコロニーを、10μg/mLのネオマイシンを含有している120μLのLB培地に接種した。
「RCL6」は、親(テンプレート)分子として数個のBPN’変異体を用いて融合PCRにより生成した一群のコンビナトリアルライブラリを指す。これらの各ライブラリの構築に、BPN’変異体の混合物をテンプレート(親分子)として使用した。これらのライブラリを生成するために使用した親分子の5つの異なる混合物を表11−9に提供し、各ライブラリに導入した変異を表11−10に列挙する。
RCL7コンビナトリアル変異体
「RCL7」は、親(テンプレート)プラスミドとして数個のBPN’変異体を用いて融合PCRにより生成した1組のコンビナトリアル変異体を指す。各親プラスミドに導入した変異を表11−11に示し、変異体を生成するのに使用した変異原性プライマーを表11−10に示す。
(実施例12)
洗剤の表
パートI実施例12のアッセイで使用される洗剤の組成を表12−1に示す。BPN’変異体のタンパク質サンプルを、パートI実施例1に記載のような洗剤組成物に添加して、列挙した様々な特性についてのアッセイを行った。
1「ランダムグラフトコポリマー」は、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約6000であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約40:60であり、50個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は1以下である。
実施例11に記載のように生成したBPN’のコンビナトリアル変異体の、シミ除去性能の評価実験を、BMI染色した微小標本を用いて実施した。アッセイを実施例1に記載のように実施した(BMI微小標本アッセイ)。表12−2は、pH 8及び16℃での洗剤組成物1の、並びにpH 8及び32℃での洗剤組成物1の、BMI微小標本アッセイを用いて、並びに、16℃及びpH 8での加熱不活性化した市販のTIDE(登録商標)2X Cold(Procter & Gamble)洗剤のBMI微小標本アッセイを用いて、RCL4ライブラリから生成した変異体の性能指数(PI)値を提供する。市販の洗剤配合物の加熱不活性化は、任意のタンパク質成分の内因性の酵素活性を破壊しつつ、非酵素成分の特性は保持させる。洗剤の加熱不活性化は、予め計量した液体洗剤(ガラス瓶中)を95℃のウォーターバスに2時間にわたって配置することで行った。TIDE(登録商標)2X Cold洗剤は、地元のスーパーマーケットで購入した。不活性化率を正確に判定するために、未加熱及び加熱洗剤のどちらも、洗剤を溶解させて5分以内にアッセイを行った。酵素活性はAAPFアッセイにより試験した。希釈標準溶液は、加熱不活性化した母液から調製した。所望される条件に一致するよう適切な硬度の水及び緩衝液を洗剤溶液に加えた(表12−2)。瓶をボルテックスにかけるか反転させるかして溶液を混合した。
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号2の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表12−3のものから選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体の位置は配列番号2の配列の位置と対応させることにより番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体のタンパク質分解活性は、BPN’又はBPN’−v3プロテアーゼよりも大きくてもよい。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は天然に生じたものではないプロテアーゼ変異体であり得る。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられる)、並びに、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号2の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表12−4に列挙されるものから選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体の位置は配列番号2の配列の位置と対応させることにより番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は天然に生じたものではないプロテアーゼ変異体であり得る。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられる)、並びに、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
本発明は、タンパク質分解活性を有する、並びに/あるいは、FNAと比較して安定性が改善されている、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号2の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、又は98%の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表12−5に列挙された少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体の位置は配列番号2の配列の位置と対応させることにより番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体は、BPN’又はBPN’−v3よりも大きなタンパク質分解活性を有し得る。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は天然に生じたものではないプロテアーゼ変異体であり得る。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられる)、並びに、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
本発明は、タンパク質分解活性を有する、及びBPN’−v3と比較して安定性が改善されている、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号2に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表12−6に列挙された少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体の位置は配列番号2の配列の位置と対応させることにより番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は天然に生じたものではないプロテアーゼ変異体であり得る。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられる)、並びに、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号2の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表12−7に列挙されるものから選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体の位置は配列番号2の配列の位置と対応させることにより番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は天然に生じたものではないプロテアーゼ変異体であり得る。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられる)、並びに、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号2の配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表12−8に列挙されるものから選択される少なくとも1組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異体の位置は配列番号2の配列の位置と対応させることにより番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は天然に生じたものではないプロテアーゼ変異体であり得る。本明細書の他箇所により詳細に記載されるような、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を含む組成物(クリーニング組成物が挙げられる)、並びに、少なくとも1つのこのようなプロテアーゼ変異体を用いるクリーニング方法も含まれる。
液体洗濯洗剤組成物
この実施例では、液体洗濯洗剤組成物についての様々な配合物を提供する。本発明の以下の液体洗濯洗剤組成物は、下記に示すように調製される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
食器手洗い用液体洗剤組成物
この実施例では、様々な食器手洗い用液体洗剤配合物が提供される。以下の本発明の食器手洗い用液体洗剤組成物が、下記に提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書に提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体が約0.0001〜約10重量パーセントの濃度で含まれる。一部の代替的態様では、配合者に必要に基づいて判定されるように他の濃度の使用が見出される。
液体自動食器洗浄洗剤組成物
この実施例では、様々な液体自動食器洗浄洗剤配合物が提供される。以下の本発明の食器手洗い用液体洗剤組成物が、下記に提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
顆粒及び/又はタブレット洗濯組成物
この実施例は、顆粒及び/又はタブレット洗濯洗剤のための様々な配合物を提供する。顆粒又はタブレットの形態であり得る以下の本発明の洗濯組成物が下記に提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
液体洗濯洗剤
この実施例は、液体洗濯洗剤用の様々な配合を提供する。以降、本発明の液体洗濯洗剤配合物が提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
高密度食器洗浄洗剤
この実施例は、高密度食器洗浄洗剤についての様々な配合物を提供する。以下の本発明のコンパクト高密度食器洗浄洗剤は、下記に提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
タブレット洗剤組成物
この実施例は、様々なタブレット洗剤配合物を提供する。以下の本発明のタブレット洗剤組成物は、標準的な12ヘッドロータリープレスを用いて、13KN/cm2の圧力にて顆粒食器洗浄洗剤組成物を圧縮することにより、調製される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
液体硬質表面クリーニング洗剤
この実施例は、液体硬質表面クリーニング洗剤についての様々な配合物を提供する。以下の本発明の液体硬質表面クリーニング洗剤組成物は、下記に適用される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
BPN’−v36ポリペプチド変異体のクリーニング性能
骨格鎖若しくは親配列としてBPN’−v36変異体を用いて、アミノ酸置換を2つ含むBPN’−v36ポリペプチド変異体を標準融合PCRにより構築した。この目的のため、所望の置換をコードするように調製された変異原性プライマーにより、2つ又は3つの部分的に重複している断片を増幅させた。PCR増幅反応は、上記パートIの実施例7に記載のように実施した。以下のBPN’−v36二重変異体(すなわち、以下のアミノ酸置換を有するBPN’−v36)を構築した:Q019R−N025D,A001Y−Q275R,V004A−S249N,V004E−S260P,V004A−T55A,Y006F−S249C,Y006D−T55A,V008L−Q275R,Q010R−Q275K,L016Q−Q217H,H017R−T158A,S183D−Q206R,P210S−N212D,S018Y−V203A,S018K−V203I,Y021H−D259G,Y021H−D259R,K027R−N269D,K027R−N269T,S037P−S260F,S037T−S260P,D041E−N077D,D041G−N077E,G166V−S183T,N252S−L257H,V044A−Q206H,V044A−Q206K,V044A−Q206R,N076T−N212D,N076P−N212S,N077D−N252D,N077D−N252T,K141I−S248N,T158I−D259N,T158A−D259P,S161E−Q185H,K237M−H238R,G160A−D259G,G160R−D259V,G215R−D259R,G215D−D259V,N061D−Q206R,N061L−Q206H,S009L−N218S,S161E−S260T,Q019A−N109S,T022S−G166V,Y021H−N252H,P129S−K136R,T022S−T242S,N025K−H238R,N025D−Q185R,S037G−Q275H,K043R−N076S,K043N−Q217R,K043N−S163T,T055A−V147A,N061K−N252K,N062Y−G097D,Y021H−V084E,Y021H−S037E,N062Y−T244A,K027E−Y091F,A074S−P129Q,S249R−Q275R,I079V−Q217H,A098T−T158A,K027R−D120H,Q019R−Q185R,G131S−K265N,A133V−D259N,A144H−T244A,I035V−K043N,G160R−T244A,S161P−T253A,S163T−Q245L,K170R−D259G,S183T−S249R,N184Y−Y262N,V198L−D259G,A200T−H226L,Q206R−S260P,G211V−T244A,Q217R−T244A,L75I−N76D,S260P−Q275L,S260P−Q275R,Y262N−Q275R,V004A−Y006F,H017L−Q019A,N025D−V026A,N118G−V121A,V072F−L075I,S183T−R186K,V203A−Q217R,及びS249R−Y262H。パートIの実施例1に記載のように、これらの変異体のクリーニング性能を、pH 8及び16℃での洗剤組成物4のBMI微小標本クリーニングアッセイにおいて、並びにpH 8及び16℃での洗剤組成物4の卵微小標本クリーニングアッセイにおいて、試験した。結果は以下に提供される。
更なるBPN’−v36ポリペプチド変異体のクリーニング性能
以下のPN’−v36変異体は、クローニング用テンプレートDNA(親プラスミド)として提供されているBPN’発現カセットを含有するpHPLT−BPN’−v36を用いて、DNA2.0(Menlo Park,CA)により合成された:N109G−A128S−S224A,N109G−A128S−S224A−N243V,A88T−N109G−A116T−A128S−S224A−N243V,N61G−N109G−A128S−S224A,N61G−N109G−A128S−S224A−N243V,N61G−A88T−N109G−A116T−A128S−S224A−N243V,N109Q−A128S−S224A,N109Q−A128S−S224A−N243V,A88T−N109Q−A116T−A128S−S224A−N243V,N109S−A128S−S224A,N109S−A128S−S224A−N243V,A88T−N109S−A116T−A128S−S224A−N243V,N109M−A128S−S224A,N109M−A128S−S224A−N243V,A88T−N109M−A116T−A128S−S224A−N243V,N109G−A114S−A128S,N109G−A114S−A128S−N243V,A88T−N109G−A114S−A116T−A128S−N243V,N109G−A114S−A128S−S224A,N109G−A114S−A128S−S224A−N243V,N109G−A128S−S183V,N109G−A128S−S183L,N109G−A128S−S183L−S224A,N109G−A114S−A128S−S183L−S224A,A88T−N109G−A114S−A116T−A128S−S183L−S224A−N243V,N76D−N109G−A128S−S224A,N101Q−N109Q−A128S−S224A−N243V,N101Q−N109Q−A128S−P129S−S130T−S224A−N243V,N109G−A128S−P129S−S130T−S224A−N243V,S33T−A128S−N218S,S33T−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−N61G−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−N109G−A128S−G169A−N218S−N243V,S33T−S63G−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−N76D−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−S63G−N109G−A128S−G169A−N218S−N243V,I31L−S33T−S63G−N109G−A128S−G169A−N218S−N243V,S33T−N61G−S63G−N109G−A128S−N218S−N243V,S33T−N61G−A88T−N109G−A116T−A128S−N218S−N243V,S33T−N61G−S63G−N109G−A128S−G131H−G169A−N218S−N243V,S33T−N61P−S63G−N109G−A128S−G131H−G169A−N218S−N243V,S33T−N109G−A128S−N218S−S224A−N243V,S63G−N109Q−A128S−S224A−N243V,S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−S224A−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,A1G−N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,I31L−N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V−S249Q,S33T−T55P−N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−S224A−N243V,S33T−T55P−N61P−S63G−A88T−N109G−A116T−A128S−G131H−S224A−N243V,S33T−T55P−N61P−S63G−A88T−N109G−A116T−A128S−G131H−S224A−N243V−S249Q,A1G−I31L−S33T−T55P−N61P−S63G−A88T−N109G−A116T−A128S−G131H−S224A−N243V−S249Q,N61P−S63G−N109Q−A128S−G131H−G169A−S224A−N243V−S249Q,及びA1G−I31L−S33T−T55P−N61P−S63G−A88T−N109G−A116T−A128S−G131H−G169A−S224A−N243V−S249Q。
BPN’−v36ポリペプチドに基づくコンビナトリアルライブラリ由来の、ポリペプチドBPN’−v36のポリペプチド変異体のクリーニング性能
2つの別個のコンビナトリアルライブラリ(AJ1及びAJ2)は、DNA2.0(Menlo Park,CA)により合成されたものであり、個々のライゲーション反応物として供給された。BPN’発現カセットを含有しているpHPLT−BPN’−v36プラスミド(図4)をライブラリ構築のためのテンプレートDNA(親プラスミド)として使用した。可能なアミノ酸位置、及び各ライブラリの置換の一覧を表23−1に示す。各ライブラリについてのライゲーション反応物を用いて枯草菌(B. subtilis)を形質転換し、ライブラリ変異体は、実施例11に記載のようにタンパク質発現のために増殖させた。パートIの実施例1に記載のようにpH 8及び16℃での洗剤組成物4のBMI微小標本クリーニングアッセイにおける性能について変異体を試験した。
シリーズI GG36冷水プロテアーゼ変異体
野生型成熟バチルス・レンタス(Bacillus lentus)GG36プロテアーゼのアミノ酸配列は以下の通りである。
本明細書に示すように、好適なシリーズI GG36冷水プロテアーゼ変異体は、親プロテアーゼから誘導される酵素変異体を含み、上記親プロテアーゼは、配列番号755のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であり、上記プロテアーゼ変異体は、以下の特徴の1つ以上を有する:
a)少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.9、少なくとも2、1.1〜約10、1.1〜約8、又は更には1.1〜約5の試験方法2の性能指数、
b)少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.9、少なくとも2、1.1〜約10、1.1〜約8、又は更には1.1〜約5の試験方法3の性能指数、
c)少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.9、少なくとも2、1.0〜約10、1.1〜約8、又は更には1.1〜約5の試験方法4の性能指数。
冷水プロテアーゼ変異体GG36をコードしている本発明の改変ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、例えば、部位特異的飽和変異誘発、走査変異誘発、挿入変異誘発、欠失変異誘発、無作為変異誘発、部位特異的変異誘発及び指向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。シリーズI GG36冷水プロテアーゼ変異体を製造する非限定的な代表的方法は、上記表題「ベクター、細胞及び本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチドの製造方法」の項で提供される。
表Dにおいて、界面活性剤成分は、限定するものではないがBASF(例えば、LUTENSOL(登録商標))、Shell Chemicals、Stepan、Huntsman、及びClariant(例えば、PRAEPAGEN(登録商標))が挙げられる、任意の好適な供給元から得ることができる。ゼオライトはIndustrial Zeoliteなどの供給元から得ることができる。クエン酸及びクエン酸ナトリウムは、Jungbunzlauerなどの供給元から得ることができる。過炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム及びセスキ炭酸ナトリウムは、Solvayなどの供給元から得ることができる。アクリル酸/マレエートコポリマーは、BASFなどの供給元から得ることができる。カルボキシメチルセルロース及び疎水変性カルボキシメチルセルロースは、CPKelcoなどの供給元から得ることができる。C.I.蛍光増白剤260は、3v Sigmaから得ることができる(例えば、OPTIBLANC(登録商標)、OPTIBLANC(登録商標)2M/G、OPTIBLANC(登録商標)2MG/LT Extra、又はOPTIBLANC(登録商標)Ecobright)。S,S−エチレンジアミン二コハク酸四ナトリウムは、Innospecなどの供給元から得ることができる。テレフタレートコポリマーは、Clariant(例えば、REPELOTEX SF 2)から得ることができる。加えて、1−ヒドロキシエタン−1,1−ジホスホン酸は、Thermphosから得ることができる。オキサジリジン系漂白増進剤は、式中、R1=2−ブチルオクチルである以下の構造を有するものであり、米国特許第2006/0089284(A1)号に従って製造される。
(実施例1)
アッセイ及び試験方法
本実施例は、これらの実施例に記載される変異体の顕色において使用される様々な試験方法及びアッセイを記載する。提供されるプロトコルからの任意の変更は、関連実施例において示される。アッセイは、Biomek FX Robot(Beckman Coulter)又は多チャンネルピペッター(例えば、Rainin PipetLite(Mettler−Toledo))及びSpectraMAX MTP Reader(340型、Molecular Devices)を用いて、行われた。
試験方法1
染料又は顔料物質が本発明の意図する布地色調剤であるかどうかを明らかにするための手順プロトコルを以下に提供する。
試験方法2のために、以下に提供されるBMI微小標本アッセイは、顆粒洗剤組成物10(上記表Dを参照されたい)を用いて行われる。洗濯洗剤を、12gpgの硬度を有する水に溶解させ、16℃の温度に調整し、所望のプロテアーゼ変異体酵素を添加する。次いで、記載されるBMI微小標本アッセイ毎にプロテアーゼ変異体酵素の性能を測定する。性能指数は、配列番号755のアミノ酸配列を有するB.レンタス(B. lentus)GG36スブチリシン酵素の性能とプロテアーゼ変異体酵素の性能を比較することにより判定され、全ての場合で酵素投与量は1.6ppmである。1.1以上の性能指数を有するプロテアーゼ変異体酵素は、冷水プロテアーゼ変異体であるとみなされる。
試験方法3のために、以下に提供されるBMI微小標本アッセイは、顆粒洗濯洗剤組成物7(上記表Dを参照されたい)を用いて行われる。洗濯洗剤を、6gpgの硬度を有する水に溶解させ、16℃の温度に調整し、所望のGG36プロテアーゼ変異体酵素を添加する。次いで、記載されるBMI微小標本アッセイ毎にGG36プロテアーゼ変異体酵素の性能を測定する。性能指数は、配列番号755のアミノ酸配列を有するB.レンタス(B. lentus)GG36スブチリシン酵素の性能とGG36プロテアーゼ変異体酵素の性能を比較することにより判定され、全ての場合で酵素投与量は4ppmである。1.1以上の性能指数を有するGG36プロテアーゼ変異型酵素は、冷水プロテアーゼ変異体であるとみなされる。
試験方法4のために、以下に提供されるBMI微小標本アッセイは、顆粒洗濯洗剤組成物7(上記表Dを参照されたい)を用いて行われる。洗濯洗剤を、6gpgの硬度を有する水に溶解させ、16℃の温度に調整し、所望のGG36プロテアーゼ変異体酵素を添加する。次いで、記載されるBMI微小標本アッセイ毎にGG36プロテアーゼ変異体酵素の性能を測定する。性能指数は、参照酵素GG36−A158E,の性能とGG36プロテアーゼ変異体酵素の性能を比較することにより判定され、上記GG36−A158E参照酵素は、位置158にてアラニンをグルタミン酸に単一置換した(すなわち、A158E変異)配列番号755のB.レンタススブチリシン(B. lentus subtilisin)GG36プロテアーゼアミノ酸配列からなり、すべての場合で酵素投与量は4ppmである。1.0以上の性能指数を有するGG36プロテアーゼ変異型酵素は、冷水プロテアーゼ変異体であるとみなされる。
水溶液の伝導度をASTM D1125標準法に従ってアッセイし、単位ミリジーメンス/cm(本明細書ではmS/cmと略記)で報告する。
96ウェルマイクロタイタープレートでタンパク質含量を測定するためのTCAアッセイ。
セリンプロテアーゼ変異体のプロテアーゼ活性を測定するために、N−スクシニル−L−アラニル−L−アラニル−L−プロリル−L−フェニル−p−ニトロアニリド(suc−AAPF−pNA)の加水分解を計測した。使用した試薬溶液は、以下のものであった:0.005%のTWEEN(登録商標)−80を含有している100mMのトリス/HCl(pH 8.6)(トリス希釈緩衝液)、1mMのCaCl2及び0.005%のTWEEN(登録商標)−80を含有している100mMトリス緩衝液(pH 8.6)(トリス/Ca緩衝液)、並びに160mMのsuc−AAPF−pNA/DMSO(suc−AAPF−pNA保存溶液)(Sigma:S−7388)。suc−AAPF−pNA希釈標準溶液を調製するために、1mLのsuc−AAPF−pNA原液を100mLのトリス/Ca緩衝液に加え、少なくとも10秒にわたってウェルをよく混合した。10μLの希釈プロテアーゼ溶液を96ウェルMTPの各ウェルに加え、直ちに1mg/mLのsuc−AAPF−pNA希釈標準溶液190μLを加えてアッセイを実施した。溶液を5秒にわたって混合し、吸光度の変化を、25℃にて、405nmで、MTPリーダーの動的解析モードにより読み取りした(5分毎に25回読み取り)。プロテアーゼ活性はAUとして表記される(活性=ΔOD・min−1 ml−1)。
本明細書に記載のセリンプロテアーゼ濃度及び比活性を、エグリンcと呼ばれる阻害剤による滴定で測定した。エグリンc(leech Hirudo medicinalis)は、スブチリシン及びASPプロテアーゼとの相互作用が強いタンパク質阻害剤であり(HeinZ et al.,Biochemistry,31:8755〜66[1992])、それゆえプロテアーゼ酵素濃度を測定するのに使用することができ、ひいては比活性の算出が可能になる。エグリンc遺伝子を合成し、標準法により大腸菌(E. coli)で発現させた。特性及び阻害強度はSigmaから購入したエグリンcと同じであった。
既知の比活性を有するバチルス・レンタス(Bacillus Lentus)スブチリシンのサンプルを、1mMのCaCl2及び0.005% TWEEN(登録商標)−80(トリス/Ca緩衝液)を含有している100mMのトリス緩衝液(pH 8.6)で、上記のAAPFプロテアーゼアッセイに適切な濃度に希釈した。トリス/Ca緩衝液で、エグリンc原液の希釈物もいくつか調製した。各希釈エグリンc溶液のアリコートを、等量のバチルス・レンタス(Bacillus Lentus)スブチリシン希釈溶液と混合した。エグリンcの非存在下での、阻害されていないスブチリシンの活性を測定するために、エグリンcを含まないトリス/Ca緩衝液のみのアリコートも、等量のバチルス・レンタス(Bacillus Lentus)スブチリシン希釈溶液と混合した。混合溶液を室温で15〜30分インキュベートし、次いで各サンプルのプロテアーゼ活性を上記のAAPFアッセイにより測定した。既知の比活性を有するバチルス・レンタス(Bacillus Lentus)のスブチリシンを用いて、各サンプル中の活性プロテアーゼ濃度を測定した。次いで各サンプル中のエグリンc濃度を、トリス/Ca緩衝液のみ(エグリンcを含まない)と混合した未阻害のスブチリシンサンプルと比較したときに観察されるプロテアーゼ活性の減少度に基づいて算出した。したがって、希釈度及び容量が既知のエグリンc溶液を用い、原液中のエグリンcの濃度を測定した。
スブチリシン変異体サンプルを、1mMのCaCl2及び0.005% TWEEN(登録商標)−80(トリス/Ca緩衝液)を含有している100mMのトリス緩衝液(pH 8.6)で希釈した。トリス/Ca緩衝液で、既知の濃度のエグリンc原液の希釈物もいくつか調製した。各希釈エグリンc溶液のアリコートを、等量のスブチリシン変異体溶液と混合した。混合溶液を室温で15〜30分インキュベートし、次いで各サンプルのプロテアーゼ活性をAAPFアッセイにより測定した。各エグリンcサンプル及び既知の濃度のエグリンcの添加に基づくプロテアーゼ活性の減少を観察することで、各スブチリシン酵素変異体を完全に阻害するのに必要とされるエグリンc濃度を算出した。この濃度はサンプル中の酵素濃度と等価である。同様に、エグリンcを含まない、トリス/Ca緩衝液のみのアリコートを各スブチリシン変異体サンプルと混合し、エグリンcの非存在下でのプロテアーゼ活性をAAPFアッセイにより測定した。次いでスブチリシン変異体の比活性を、上記のように測定した酵素濃度を用い算出した。
血液ミルク及びインク(BMI)染色した、直径5.5ミリメートルの円形微小標本(EMPA116)をCFTから得た。一方法では、EMPA116 BMI布を水で予めすすぎ、その後、裁断して、96ウェルのマイクロタイタープレート(Corning 3641)中に1ウェルにつき1標本入れる。第二の方法では、EMPA116布を裁断して直接96ウェルマイクロタイタープレート(Corning 3641)に入れ、ここで、標本を水で2度すすぐ。更に200μLのミリQ水を各ウェル/標本に加え、7に設定した卓上ミキサー(Lab line instruments、タイタープレート震盪機、4825型)で15分にわたって混合することですすぎを行った。洗浄液を除去し、標本に再度200μLの水を加え、更に15分すすぐ。洗浄水を除去し、次いで標本をマイクロタイタープレートで風乾させる。
代表的なアニオン性界面活性剤(LAS=直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムDOBS)及びEDTA二ナトリウムの存在下でのプロテアーゼ変異体の安定性を、所定の条件下でのインキュベーション後に測定し、上記AAPFアッセイを用いて残効性を測定した。試薬は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩(DOBS,Sigma No.D−2525)、TWEEN(登録商標)−80(Sigma No.P−8074)、EDTA二ナトリウム(Siegfried Handel No.164599−02)、HEPES(Sigma No.H−7523)、未負荷緩衝液:50mMのHEPES(11.9g/L)+0.005% TWEEN(登録商標)−80(pH 8.0)、負荷緩衝液:50mMのHEPES(11.9g/L)、0.1%(w/v)DOBS(1g/L)、10mMのEDTA(3.36g/L)(pH 8.0)、参照プロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体培養上清(200〜400μg/mLのタンパク質を含有)を使用した。装置は、希釈プレートとしてV又はU底MTP(それぞれGreiner 651101及び650161)、未負荷及びLAS/EDTA緩衝液用平底MTP(Corning 9017)、並びにsuc−AAPF−pNAプレート、Biomek FX(Beckman Coulter)、Spectramax Plus 384MTPリーダー(Molecular Devices)及びiEMS恒温器/振盪機(Thermo Electron Corporation)を使用した。
このアッセイに関し、鶏卵黄を用い、卵黄を焼き付けた96ウェルの基材プレートを調製する。鶏卵黄を白身から取り分け、膜嚢から出し、ミリQ水で20%(体積/重量)に希釈した。希釈した黄身を、電磁撹拌器を用い室温で15分にわたって撹拌する。8チャンネルのピペットを用い、96ウェルのV底プレート(Costar#3894)の各ウェルの中央に、注意深く5μLずつ分取する。プレートを90℃で1時間にわたって焼付け、室温に放冷する。卵黄基材を焼き付けたプレートを室温で保管し、調製の一週間以内に使用した。自動食器洗浄用洗剤を本明細書に記載のように調製し、50℃に予熱する。8チャンネルのピペットを用い、洗剤の190μLのアリコートを96ウェルプレートの各ウェルに加える。96チャンネルのピペット装置を用い、希釈酵素を各ウェルに10μL加える。接着箔シーラーによりプレートを注意深くシールし、50℃で30分にわたって振盪した。120μLの反応混合物を新しい96ウェル平底プレートに移し、405nmで吸光度/光散乱を測定した。405nmでの吸光度/光散乱は、卵黄除去度に比例する。
自動食器洗浄用洗剤を本明細書に記載のように調製する。使用する装置としては、New Brunswick Innova 4230振盪機/恒温機及びSpectraMAX(340型)MTP読み取り機が挙げられる。MTPは、Costar(9017型)から入手する。色素を加えた時効処理卵黄標本(CS−38)をCenter for Test Materials(Vlaardingen,Netherlands)から入手する。0.25インチ(0.64cm)の微小標本に裁断する前に、布地を水で洗浄する。96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに微小標本を1つずつ配置する。試験洗剤を50℃にて平衡化させる。微小標本を含有しているMTPの各ウェルに190μLの所望の洗剤溶液を添加する。この混合物に10μLの希釈酵素溶液を添加する。MTPを接着箔でシールし、撹拌しながら30分間インキュベーターに配置する。インキュベーションに続いて、各ウェルから100μLの溶液を新たなMTPに移す。このMTPを、SpectraMax MTP読み取り機を用いて、405nmにて読み取りする。ブランク対照、並びに微小標本及び洗剤を含有しているが酵素は含有しない対照も包含させた。
これらの実験に使用されるステンレス鋼シート(10×15cm、片面ブラッシング処理)を、高アルカリ性の市販の洗剤(例えば、ECOLAB(登録商標)洗剤、Henkelを用)いてラボラトリー食器洗浄機で95℃にて十分に洗浄して、きれいでグリースのないシートを得る。第一回目の使用に先立って、これらのシートは、まくれを取り除いておく。シートを熱キャビネットにおいて80℃にて30分にわたって乾燥させ、その後、卵黄で汚す。ブラッシング処理される表面は、汚れを付ける前には触れない。また、表面上にいかなる水シミ又は毛羽立ちも許容しない。冷却したシートを汚れを付ける前に計量する。
これらの実験のために、EN 50242、基準1495、第0219に従う直径19cmのデザート皿(Arzberg、白色施釉磁器)を使用する。豚肉及び牛肉(半分ずつ)の赤身225gを、目に見える脂肪を除去した後に細かく刻み、冷却する。この混合物を肉挽き機に2回かける。温度が35℃以上に上昇させることは避ける。次に、225gの挽肉を75gの卵(卵白及び卵黄は一緒に混合した)と共に混合する。調製物を、使用に先立って、最大三カ月−18℃にて冷凍する。豚肉が入手できない場合には、牛肉を使用する。
これらの実験に使用されるステンレス鋼シート(10×15cm、片面ブラッシング処理)を、高アルカリ性の市販の洗剤を用いてラボラトリー食器洗浄機で95℃にて十分に洗浄して、グリースを除去してシートをクリーニングする。シートをセルロース布で磨き、乾燥させる。ブラッシング処理される表面は、汚れを付ける前には触れない。また、表面上にいかなる水シミ又は毛羽立ちも許容しない。汚れを付ける前に、シートを熱キャビネット内に80℃にて30分にわたって置いておく。汚れを付ける前に冷却したシートを計量する。
パスタソース(390g)を150gのゆでたスパゲッティパスタ、25gの挽肉(改善されたIKW組成−225グラムの無脂肪挽肉及び75グラム卵黄)並びに50gのGrozette Formaggioチーズと混合する。スプーンを使用して、周縁部付近の約2cm幅の汚れのない辺縁を残して、この混合物3gを各白色磁器プレート(Arzberg、直径19cm、白色、施釉磁器、EN 50242、基準1495、第0219に従う)上に広げる。これらをオーブン内で120℃にて2時間にわたって焼くことにより、プレートを乾燥させる。プレートは冷却されればすぐに使用可能である。プレートは、保管する際各プレート間に紙タオルを挟んで積み重ねる。洗浄後、炭水化物残渣の同定を良好に行うために、プレートにヨウ素溶液(0.05N)を噴霧する。IKW写真カタログ(IKW)を参照しながら炭水化物残渣の色反応を目視することにより、洗浄性能の評価を行い、0〜10の尺度で評価する(10がきれいである)。
性能指数は、同じタンパク質濃度下で変異体性能(実測値)と標準酵素性能(理論値)とを比較する。加えて、理論値は、標準プロテアーゼの性能用量応答曲線(performance dose response curve)のパラメーターを用いて算出することができる。以下に示される様々な用語は変異体を記載するために使用される:有害でない変異体はPI>0.05であり、有害な変異体はPI=0.05であり、組み合わせ可能な変異体は少なくとも1つの特性について性能指数が0.2以上であり、かつすべての特性について>0.05である変異体である。組み合わせ可能な変異体は、1つ以上の所望の特性について適切な性能指数を有する送達タンパク質と組み合わせることができる。これらのデータは、任意のスブチリシン/サブチラーゼを設計するために使用される。サブチラーゼが、特定の位置でスブチリシンGG36と異なるアミノ酸を有するように設計された場合でさえも、これらのデータは、GG36野生型のアミノ酸の置換を含む最良の置換の選択を特定することにより、所望の特性を変更する置換を発見するのに使用される。
部位評価ライブラリ(SEL)を用いるGG36単独変異体の生産
本実施例に記載のGG36SELの構築は、その適切な方法、並びに遺伝子最適化、遺伝子合成、ライブラリ作成、及び解析のための技術基盤を用いGENEARTにより実施された(国際公開第2004/059556(A3)号、欧州特許番号第0 200 362号及び同第0 201 184号、並びに米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号及び同第6,472,184号)。GG36 SELは、枯草菌(B. subtilis)発現プラスミドpHPLT−GG36(図6を参照)を用い、本発明者らにより予め選択された位置で作成した。この枯草菌(B. subtilis)発現プラスミドは、以下に示すGG36発現カセットを含有する:バチルス・リケニホルミス(B. licheniformis)のLATプロモーター(Plat)、並びにレプリカーゼ遺伝子(reppUB)、ネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子(neo)及びブレオマイシン耐性マーカー(bleo)が挙げられる、pUB110由来の更なる要素(McKenzie et al.,Plasmid,15:93〜103,1986)(米国特許第6,566,112号、図4)。pHPLT−GG36プラスミドマップを図6に提供する。GG36発現カセット配列は以下に提供されるものである。
GG36変異体のNHJ1及びWCE1のセットの構築及びクリーニング性能
本明細書に記載の、上記の枯草菌(B. subtilis)発現プラスミドpHPLT−GG36(図6)を用い、GG36変異体のNHJ1及びWCE1セットをDNA2.0により構築した。変異体を実施例2に記載のように枯草菌(B. subtilis)細胞で発現させ(遺伝子型:ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)、更に、実施例1に記載のようにタンパク質含量を測定するためのTCAアッセイ、LAS/EDTA安定性アッセイ、及びBMI微小標本クリーニングアッセイを用いて特徴付けした。結果を表3−1及び3−2に示す。以下の表中で、洗剤組成物は、上記表Dに示されるものと対応する。同様に、記載のように、アミノ酸位置はBPN’の番号付けに従って列挙される。
(実施例4)
GG36変異体のNHJ4セットの構築及びクリーニング性能
下表4−4に記載のGG36変異体のNHJ4セットを、以下に記載するように、融合PCR又はQUIKCHANGE(登録商標)Multi Site−Directed Mutagenesis Kit(「QCMSキット」、Stratagene)を使用し、枯草菌(B. subtilis)発現プラスミドpHPLT−GG36(図6)を用い構築した。
QUIKCHANGE(登録商標)Multi Site−Directed Mutagenesisを用いて生成した変異体を表4−1に示す。製造元からの取扱説明書に従って、2マイクログラムのDNA及びDamメチラーゼ(NEB)を用い、親プラスミドpHPLT−GG36(テンプレートDNA)をメチル化した。部位特異的な変異体を、製造元のプロトコルに従って、QuikChange(登録商標)Multi Site−Directed Mutagenesis Kit(「QCMSキット」、Stratagene)により作成した。以下の変異を親プラスミドに導入した:S101A−S103G−V104L,G159E,T22A,Y209E,E271F,S101A,S103G,L111V,S128N,N62E,及びS188D,。枯草菌(B. subtilis)を効率的に形質転換するため、Illustra Templiphiキット(GE Healthcare)を用い、ローリング・サークル型増幅(RCA)によりQCMS反応混合物からDNAを増幅させ、製造元のプロトコルに従い反応を実施した。1マイクロリットルの、10倍希釈した増幅DNAを使用して、コンピテントな枯草菌(B. subtilis)細胞(遺伝子型:ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)50μLを形質転換させた。形質転換混合物を37℃にて1時間にわたって振盪した。形質転換混合物の10マイクロリットルアリコートを、10μg/mLのネオマイシン(Teknova)を添加したスキムミルク(1.6%)Luria寒天プレートに蒔いた。続いて、プラスミドDNAを抽出するため(QIAprep Spinミニプレップキット、Qiagen)、ハローを生じたコロニーを10μg/mLのネオマイシンを含有している120μLのLB培地に接種した。抽出したプラスミドを配列決定して、所望の変異が存在しているか確認した。
伸長PCRにより、GG36のコンビナトリアル変異体を10種作成した。pHPLTプラスミドに含有させたGG36遺伝子に導入した変異のリストは、T22A,N62E,S103G,S103G−L111V,S101G−S103A−V104I,S101A−S103G−V104L,S101A,S128N,G159D,G159E,Y209E,及びL111Vであった。各変異を生成するために、変異原性プライマー並びに順方向及び逆方向プライマーを用い、所望の変異を含有しているPCR断片を増幅させることでGG36変異体全体を増幅させた。各PCR増幅反応物には、30pmolの各変異原性プライマー及び100ngのDNAテンプレート、pHPLT−GG36プラスミドを含有させた。増幅はVent DNAポリメラーゼ(NEB)を用いて実施した。PCR反応(20μL)は、まず始めに95℃で2.5分加熱した後、続いて94℃で15秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で1分の伸長を30サイクル行った。増幅させた後、各変異体につき2〜4種のPCR断片をQIAGEN(登録商標)ゲルバンド精製用キットを用いゲル精製し、混合した(各断片につき50ng)。これらの混合物は、完全長の遺伝子フラグメントを生成するための伸長PCR用のDNAテンプレートとして用いた。伸長工程を72℃で2分にわたって実施したことを除き、PCR条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のDNAフラグメントをQIAGEN(登録商標)ゲルバンド精製用キットを用いてゲル精製し、制限酵素BamHI及びHindIIIを用いて消化し、同様の制限酵素で消化したpHPLT−GG36とライゲーションした。Illustra Templiphiキットでローリング・サークル型増幅法を用い、1マイクロリットルのライゲーション混合物を製造元(GE Healthcare)からの取扱説明書に従って増幅させることで、枯草菌(Bacillus subtilis)に形質転換させるための多量体DNAを生成した。ローリング・サークル型増幅産物を100倍希釈し、B.subtilis細胞の形質転換に用いた(遺伝子型:ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)。形質転換混合物のアリコートを、1.6%のスキムミルク及び10μg/mLのネオマイシンを含有しているLBプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。続いて、プラスミドDNAを抽出するため(QIAprep Spinミニプレップキット、Qiagen)、ハローを生じたコロニーを10μg/mLのネオマイシンを含有している120μLのルリアブロス培地に接種した。抽出したプラスミドを配列決定して、所望の変異が存在しているか確認した。伸長PCRにより生成される変異体は、表4−1に示される。
GG36変異体のNHJ3セットの構築及びクリーニング性能
本明細書に記載の変異体のNHJ3セットは、次の変異:S101G,S103A,V104I,G159D,A232V,Q236H,Q245R,N248D,及びN252K(BPN’番号付け)、を含有しているGG36の変異体(GG36−9として参照)に基づく。これらの変異は、DNAテンプレートとしてpRA68プラスミド(図7を参照)を使用し、QUIKCHANGE(登録商標)Lightning Multi Site−Directed Mutagenesis(QCLDSキット、Stratagene)を用いることで生成した。プラスミドpRA68は、pBN3ベクター(Babe et al.,Biotech.Appl.Biochem.27:117〜124[1998]を参照)から誘導した。
GG36変異体のNHJ5セットの構築及びクリーニング性能
本明細書に記載の変異体のNHJ5セットは、次の変異:S101G,S103A,V104I,G159D,A232V,Q245R,N248D,及び(BPN’番号付け)、を含有しているGG36の変異体(GG36−7として参照)に基づく。pRA96プラスミド(図8を参照)をDNAテンプレートとして使用し、部位特異的な変異導入キットQUIKCHANGE(登録商標)Lightning Multi Site−Directed Mutagenesis Kit(QCLMSキット)を用いることで、これらの変異を生成した。組み込まれた変異としては、H243R(H249R)、E265F(E271F)、D157E(D159E)、A156E(A158E)、A156E−D157G(A158E−D159E)、T22A,N60E(N62E)、N232R(N238R)、D242R(D248R)、T247R(T253R)、S24R,N74D(N76D)が挙げられ、GG36番号付け及びBPN’番号付けを括弧付して示す。
NHJ2コンビナトリアルライブラリの構築
本実施例は、次の変異:A16S,T22A,S101A,S103G,V104L,L111V,S128N,及びL148I(BPN’番号付け)のうちの1つ以上を伴うGG36コンビナトリアルライブラリの構築を記述する。NHJ2コンビナトリアルライブラリの作成のため、pHPLT−GG36枯草菌(B. subtilis)発現プラスミドをDNA 2.0Inc.に提供した。枯草菌(B. subtilis)株(遺伝子型:ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)で形質転換するために、構築済みのNHJ2ライブラリのライゲーション反応物が、DNA 2.0,Inc.から提供された。これらの変異を1つ以上含有するよう生成された変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
更なるライブラリ及びGG36変異体の構築
次の組の変異:A1R,A230E,E271L,G115R,G20R,H249R,K235F,K27V/F/L、L75E,L82R,N18R,N269R,N43D,N43R,N76D,R45T,S212F,S242R,S24R,S78R,S9A,T22R,V121E,V244R,V28E,V30E,V4R,W241R(BPN’番号付け)を用いて、更なるライブラリ及び変異体を構築する。これらの変異を1つ以上含有するよう生成された変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
GG36ライブラリWCE2の構築及びクリーニング性能
WCE2コンビナトリアルライブラリは、pHPLT−GG36枯草菌(B. subtilis)発現プラスミドを用い、DNA2.0,Inc.により生成されたものである。枯草菌(B. subtilis)株(遺伝子型:ΔaprE,ΔnprE,amyE::xylRPxylAcomK−phleo)で形質転換するために、構築済みWCE2ライブラリのライゲーション反応物が、DNA 2.0,Inc.から提供された。WCE2ライブラリを生成するために使用される変異の組は、A230E,G20R,H249R,N18R,N43R/D、N76D,R45T,S242R,及びS24R(BPN’番号付け)である。これらの変異を1つ以上含有するよう生成された変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
GG36変異体のWCE3セットの構築及びクリーニング性能
本実施例は、GG36変異体、GG36−7(実施例5)及びGG36−9(実施例4)に基づく変異のWCE3セットを記述する。これらの変異は、S101G−S103A−V104I−A232V−Q245R−N248D,S101G−S103A−V104I−G159D−A232V−Q245R,S101G−S103A−V104I−G159R−A232V−Q245R−N248D,S101G−S103A−V104I−G159D−A232V−Q245R−N248R,S101G−S103A−V104I−A232V−Q245R,S101G−S103A−V104I−A232V−Q245R−N248R,S101G−S103A−V104I−G159R−A232V−Q245R−N248R,、並びに、S101G,S103A,V104I,A232V,Q236H,Q245R,及びN252Kである。pRA96プラスミドを実施例5に記載のDNAテンプレートとして使用し、QuikChange(登録商標)Lightning Multi Site−Directed Mutagenesis Kit(QCLMSキット、Stratagene)を用いて、これらを生成した。生成した変異体は、本案件に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
GG36の更なるライブラリ及び変異体の構築
本実施例は、枯草菌(B. subtilis)発現プラスミド(例えば、pHPLT−GG36、図6)を用い、次の変異:A16S,T22A,S24R,N62E,N76D,E89P,S101A/G、S103G/A、V104L/I、L111V,S128N,P129E,A232V,L148I,A158E,G159D/E、S166D,R186H,S188D,Y209E,Q236H,N238R,Q245R,N248D/R、H249R,N252K/R、T253R,E271F(BPN’番号付け)の1つ以上を使用してGG36変異体及びライブラリを構築することを記述する。これらの変異を1つ以上含有するよう生成された変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
GG36の更なるライブラリ及び変異体の構築
本実施例は、次の変異:A1R,Q2S,Q2M,Q2A,Q2R,Q2W,S3R,V4R,V4S,V4C,I8A,S9A,S9F,S9W,R10S,R10A,R10H,R10M,Q12F,Q12R,P14K,P14F,P14Q,A15R,A15F,A16S,H17R,H17M,H17F,N18R,N18K,G20F,G20K,G20R,T22A,T22R,T22Y,T22V,T22Q,T22L,T22W,G23A,G23S,G23F,S24R,S24F,S24W,S24Q,S24H,S24L,G25V,G25F,G25R,V26F,K27L,K27F,K27R,K27V,V28A,V28N,V28E,A29T,V30E,L31F,T33S,T33G,T33D,G34P,I35M,S36T,S36F,S36R,T38L,T38F,T38R,P40N,P40L,P40T,P40W,P40H,P40R,L42I,N43A,N43F,N43I,N43S,N43R,N43M,N43W,N43D,R45T,G46R,A48R,F50C,V51W,V51F,V51H,P52F,P52E,P52N,P55Y,T57R,Q59A,Q59F,Q59R,D60P,D60Q,D60A,N62E,N62Q,G63V,G63M,G63T,G63I,G63A,G63S,G63H,G63Q,G63D,G63E,G63P,H64F,H64T,V68A,V68C,A69N,A69T,A69P,A69W,T71G,I72C,A74C,L75A,L75F,L75E,L75R,N76D,S78R,S78N,S78I,I79W,I79Q,V81R,L82F,L82T,L82V,L82R,L82M,A85M,P86W,P86L,P86I,E89P,E89T,E89G,E89H,E89L,E89V,E89W,E89F,E89I,Y91N,Y91F,A92F,K94N,S99F,S99T,S99P,S99G,S99M,G100S,G100N,G100Q,G100I,S101A,S101N,S101G,S101T,S101D,S101E,S101P,S101F,G102A,G102T,G102N,G102H,G102E,S103G,S103N,S103D,S103A,V104L,V104I,V104E,V104D,S105T,S105E,S105Q,S106G,S106T,S106E,S106D,S106A,S106V,S106F,I107M,I107F,A108I,A108G,Q109M,L111V,L111I,E112V,E112L,E112Q,A114G,G115K,G115R,N116K,N116A,N116L,N117F,G118R,G118I,M119C,H120A,H120F,H120R,V121F,V121E,N123G,N123E,L124S,S128D,S128F,S128L,S128N,S128H,S128M,S128I,S128Q,P129E,S132A,S132E,A138G,S144R,V147L,L148I,A158E,G159D,G159E,G159C,S160D,S166D,S166E,Y167W,M175V,V177C,D181A,Q182R,N183I,N183D,N183M,N183F,N183R,N185E,N185V,N185I,R186H,R186K,S188E,S188D,S188R,Y192H,Y192W,A194E,A194V,A194F,D197F,I198L,I198F,V203E,V203C,T208S,Y209S,Y209N,Y209F,Y209T,Y209E,Y209H,Y209G,Y209L,P210R,P210V,P210L,G211Q,G211R,S212I,S212M,S212F,T213A,Y214F,A215N,A215D,A215E,A215H,A215F,S216F,S216A,L217E,L217N,L217D,N218D,N218P,N218E,T224A,T224G,V227I,A230E,A231I,A231C,A232V,L233C,V234F,K235F,Q236F,Q236N,Q236H,N238R,N238K,N238L,P239K,P239G,P239R,P239H,P239T,P239N,P239S,P239F,S240R,W241R,S242L,S242R,N243F,N243R,V244R,Q245R,I246S,N248D,N248V,N248I,N248R,H249R,H249T,L250I,K251R,K251S,N252I,N252F,N252R,N252K,N252H,T253I,T253R,T253F,A254C,S256N,G258R,T260V,T260I,L262D,L262H,Y263F,S265F,L267V,L267N,L267M,N269I,N269R,A270C,E271I,E271V,E271H,E271M,E271L,E271P,E271A,E271F,E271T,A272F,A272F,A272R,A273F,A273I,及びT274G(BPN’番号付け)の1つ以上を使用して枯草菌(B. subtilis)のGG36変異体及びライブラリを構築することを記述する。これらの変異を1つ以上含有するよう生成された変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
自動食器洗浄性能試験
本実施例では、一部の市販の食器洗剤を用いてプロテアーゼの洗浄性能を判定するために使用される方法を説明する。これらのプロテアーゼ変異体を様々な条件下で試験する。これらの洗剤はWFKから市販されており、以下に提供される名称により呼ぶ。シミのタイプの各々についてのプロトコル(挽肉、卵黄及びミルクと一緒の卵黄)は下記に提供される。それぞれのタイプの汚れを試験食器に塗布する前に、食器は十分に洗浄しなければならない。前回の試験から特定のこびりついたシミの残渣が依然として食器上に存在する場合があることから、この洗浄は特に必要である。新しい食器も、試験での第一回目に使用される前に三回十分な洗浄にかけられた。
顆粒及び/又はタブレット洗濯組成物
この実施例は、顆粒及び/又はタブレット洗濯洗剤のための様々な配合物を提供する。顆粒又はタブレットの形態であり得る以下の本発明の洗濯組成物が下記に提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
タブレット洗剤組成物
この実施例は、様々なタブレット洗剤配合物を提供する。以下の本発明のタブレット洗剤組成物は、標準的な12ヘッドロータリープレスを用いて、13KN/cm2の圧力にて顆粒食器洗浄洗剤組成物を圧縮することにより、調製される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
液体洗濯洗剤組成物
この実施例では、液体洗濯洗剤組成物についての様々な配合物を提供する。本発明の以下の液体洗濯洗剤組成物は、下記に示すように調製される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
食器手洗い用液体洗剤組成物
この実施例では、様々な食器手洗い用液体洗剤配合物が提供される。以下の本発明の食器手洗い用液体洗剤組成物が、下記に提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
液体自動食器洗浄洗剤組成物
この実施例では、様々な液体自動食器洗浄洗剤配合物が提供される。以下の本発明の食器手洗い用液体洗剤組成物が、下記に提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
高密度食器洗浄洗剤
この実施例は、高密度食器洗浄洗剤についての様々な配合物を提供する。以下の本発明のコンパクト高密度洗剤が、下記に提供される。各配合物において、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
液体硬質表面クリーニング洗剤
この実施例は、液体硬質表面クリーニング洗剤用の様々な配合物を提供する。以下の本発明の液体硬質表面クリーニング洗剤組成物は、下記に提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも1つのプロテアーゼ変異体は、約0.0001〜約10重量%の濃度で含まれる。一部の態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
Claims (12)
- 親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体であって、前記変異体は、X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S及びX217L/Qのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体は配列番号2のアミノ酸配を有するBPN’プロテアーゼのものと比較して高められたタンパク質分解活性および/または洗浄活性を有し、親プロテアーゼは配列番号2のアミノ酸配列からなり、前記変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と前記変異体のアミノ酸配列とのアラインメントによって決定される、配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる、変異体。
- 前記変異体のアミノ酸配列がアミノ酸置換X097Aを更に含む、請求項1に記載の変異体。
- 前記変異体のアミノ酸配列がアミノ酸置換S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q又はS024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Qを含む、請求項1に記載の変異体。
- 更に、(i)N109G、N076D、S033T、N243V、S248A、A088T、及びS063Gからなる群から選択される置換を含むか、又は
(ii)以下のもの:
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、
S033T+N076D、
S009T+N109G+K141R+N243V、
S162G+K256R、
N109G+A116T、
N109G+L257G、
S162G+L257G、
N061G+N109G+N243V、
N109G+N243V+S248A、
S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R、
N109G+A116T+N243V+K256R、
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、
A088T+N109G、
N109G+N243V、
T158S+L257G、
N061S+N109G+N243V、
P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、
S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、
A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、
A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、
N109G+K256R、
N109G+N243V+K256R、
S063G+K256R、
S063G+N109G、
S063G、
S063G+N076D、
S033T+N076D+N218S、及び
N076D+N218Sからなる群から選択される1組のアミノ酸置換を更に含む、請求項3に記載の変異体。 - 前記変異体のアミノ酸配列が、配列番号2又は配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するか、又は少なくとも85%の配列同一性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異体。
- 前記変異体が配列番号6のアミノ酸配列を有するか、またはBPN’S024G−S053G−S078N−S101N−G128S−Y217Qの配列を有する、請求項1に記載の変異体。
- 前記変異体が、配列番号6の配列を有するプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の変異体。
- 配列番号3若しくは配列番号5に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
- 請求項8に記載の少なくとも1つの核酸を含み、前記少なくとも1つの核酸がプロモーターに作用可能に連結されている、発現ベクター。
- (a)請求項8に記載の核酸、あるいは、(b)請求項9に記載の発現ベクターを含み、前記宿主細胞が細菌細胞である、組み換え宿主細胞。
- プロテアーゼ変異体の製造方法であって、前記方法が、前記変異体の生産を促進する条件下で請求項10に記載の組み換え宿主細胞を培養すること、および前記細胞培養物から前記変異体を回収することを更に含む、方法。
- クリーニングの必要のある物品又は表面をクリーニングするための方法であって、前記方法が、前記物品又は表面を、請求項1〜7のいずれか一項に記載の変異体と接触させることを含み、任意で前記物品又は表面を水ですすぐことを更に含む、方法。
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