ES2242963T3 - Mutantes de subtilisina. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS MUTANTES DE CARBONIL HIDROLASA DERIVADOS DE LAS SECUENCIAS DE ADN DE CARBONIL HIDROLASAS NO HUMANAS, EXISTENTES EN LA NATURALEZA O RECOMBINANTES. LAS CARBONIL HIDROLASAS MUTANTES, EN GENERAL, SE OBTIENEN POR MODIFICACION IN VITRO, DE UNA SECUENCIA PRECURSORA DE ADN, QUE CODIFICA PARA LA CARBONIL HIDROLASA SILVESTRE O RECOMBINANTE, PRODUCIENDO LA SUSTITUCION DE UNO O MAS RESIDUOS AMINOACIDOS EN LA SECUENCIA AMINOACIDA DE LA CARBONIL HIDROLASA. DICHAS CARBONIL HIDROLASAS MUTANTES, TIENEN PROPIEDADES DISTINTAS DE LAS DEL PRECURSOR DE HIDROLASA, Y SON ESPECIALMENTE UTILES EN FORMULACIONES DETERGENTES. LOS AMINOACIDOS SUSTITUIDOS CORRESPONDEN A LA POSICION +123 Y/O +274, EN LA SUBTILISINA DE BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS.
Description
Mutantes de subtilisina.
La presente invención se refiere a nuevos
mutantes de carbonil hidrolasa que tienen una secuencia de
aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos de una
carbonil hidrolasa precursora, concretamente los que están en una
posición correspondiente al resto +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, ha sido sustituido con un
aminoácido diferente. Tales carbonil hidrolasas mutantes, en
general, se obtienen por modificación in vitro de una
secuencia de DNA precursora que codifica una carbonil hidrolasa de
origen natural o recombinante para codificar la sustitución de este
resto de aminoácido en una secuencia de aminoácidos precursora,
sola o en combinación con otra sustitución, inserción o deleción en
la secuencia de aminoácidos precursora.
Las proteasas de serina son un subgrupo de
carbonil hidrolasas. Comprenden una clase diversa de enzimas que
tienen una amplia gama de especificidades y funciones biológicas.
Stroud, R. M. (1974), Sci. Amer., 131,
74-88. A pesar de su diversidad funcional, se ha
hecho una aproximación de la maquinaria catalítica de proteasas de
serina mediante al menos dos familias de enzimas genéticamente
distintas: las subtilisinas y las proteasas de serina relacionadas
con la quimiotripsina de mamíferos y bacterianas homólogas (p. ej.
tripsina y tripsina de S. gresius). Estas dos familias de
proteasas de serina muestran mecanismos de catálisis notablemente
similares. Kraut, J. (1977), Ann. Rev. Biochem., 46,
331-358. Además, aunque la estructura primaria es no
relacionada, la estructura terciaria de estas dos familias de
enzimas reúne una triada catalítica de aminoácidos conservada
consistente en serina, histidina y aspartato.
La subtilisina es una endoproteasa de serina (PM
27.500) que es segregada en grandes cantidades por una amplia
variedad de especies Bacillus y otros microorganismos. La
secuencia de proteína de la subtilisina ha sido determinada a partir
de al menos cuatro especies diferentes de Bacillus.
Markland, F.S. et al. (1983),
Honne-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364,
1537-1540. También se ha publicado la estructura
cristalográfica tridimensional de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens a una resolución de 2,5A. Wright, C.S. et
al. (1969), Nature, 221, 235-242;
Drenth, J. et al. (1972), Eur. J. Biochem.,26,
177-181. Estos estudios indican que, aunque la
subtilisina es genéticamente no relacionada con las proteasas de
serina de mamíferos, tiene una estructura de sitios activos
similar. Las estructuras cristalinas de rayos X de la subtilisina
que contiene inhibidores peptídicos unidos covalentemente
(Robertus, J.D. et al. (1972), Biochemistry,
11, 2439-2449) o complejos producto
(Robertus, J.D. et al. (1976), J. Biol. Chem.,
251, 1097-1103), han proporcionado también
información relativa al sitio activo y la hendidura de unión de
sustrato putativa de la subtilisina. Además, se han publicado
numerosos estudios cinéticos y de modificación química para la
subtilisina (Philipp, M. et al. (1983), Mol. Cell.
Biochem., 51, 5-32; Svendsen, B. (1976),
Carlsbera Res. Comm., 41, 237-291;
Markland, F. S. Id.) así como al menos una publicación en la
que la cadena lateral de metionina en el resto 222 de la
subtilisina se convirtió en metionina-sulfóxido
mediante peróxido de hidrógeno (Stauffer, D.C. et al.
(1965), J. Biol. Chem., 244,
5333-5338) y la cadena lateral de serina en el
resto 221 se convirtió en cisteína por modificación química (Polgar
et al. (1981), Biochimica et Biophysica Acta,
667, 351-354).
La patente de EE.UU. nº 4.760.025 y la
Publicación EPO Nº 0 130 756 publicada el 9 de enero de 1985
describen cada una de ellas la modificación de restos de
aminoácidos de subtilisina correspondientes a posiciones en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens tirosina -1,
aspartato +32, asparagina +155, tirosina +104, metionina +222,
glicina +166, histidina +64, glicina +169, fenilalanina +189, serina
+ 33, serina +221, tirosina +217, glutamato +156 y alanina + 152.
La Publicación EPO Nº 0 251 446 publicada el 7 de enero de 1988
describe otros restos de aminoácidos en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens y sus equivalentes que pueden ser
modificados por medio de sustitución, inserción o deleción y que
pueden combinarse con modificaciones a los restos identificados en
la patente de EE.UU. nº 4.760.025 para formar mutantes de
subtilisina útiles. Sin embargo, los restos identificados en el
presente texto en particular no son identificados en estas
referencias.
Del mismo modo, la Publicación PCT Nº WO 89/09819
y la WO 89/09830, publicadas cada una de ellas el 19 de octubre de
1989, describen enzimas de subtilisina hechas mutando una secuencia
de nucleótidos que codifica una subtilisina. En cada una de estas
publicaciones se identifican numerosos restos de aminoácidos que
pueden ser modificados así. Sin embargo, como ocurre con las
referencias anteriormente identificadas, ninguna identifica los
restos de la presente invención. Además, el documento WO 89/06279
describe mutantes de la subtilisina que poseen propiedades
modificadas tales como mayor estabilidad a la oxidación, actividad
y capacidad de lavado. Se describen mutantes específicos de la
subtilisina de B. lentus. Como antes, los restos de la
presente invención no son identificados en esta referencia.
En consecuencia, es un objeto de la presente
invención proporcionar mutantes de carbonil hidrolasa que contienen
la sustitución de restos de aminoácidos en una carbonil hidrolasa
precursora correspondientes a la posición +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens. Tales mutantes tienen
generalmente al menos una propiedad que es diferente de la misma
propiedad del precursor de carbonil hidrolasa del que deriva el
aminoácido de dicho mutante.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar además secuencias de DNA que codifican tales mutantes
de carbonil hidrolasa así como vectores de expresión que contienen
tales secuencias de DNA mutantes.
Además, otro objeto de la presente invención es
proporcionar células hospedadoras transformadas con tales vectores
así como células hospedadoras que son capaces de expresar tal DNA
para producir mutantes de carbonil hidrolasa, bien sea
intracelularmente o extracelularmente.
La invención incluye mutantes de carbonil
hidrolasa no existentes en la naturaleza, que tienen diferente
estabilidad y/o características de rendimiento en comparación con
la carbonil hidrolasa precursora a partir de la cual deriva la
secuencia de aminoácidos del mutante. La carbonil hidrolasa
precursora puede ser una carbonil hidrolasa de origen natural o una
hidrolasa recombinante. Específicamente, tales mutantes de carbonil
hidrolasa tienen una secuencia de aminoácidos, que no se encuentra
en la naturaleza, que se deriva reemplazando un resto de aminoácido
de una carbonil hidrolasa precursora con un aminoácido diferente. El
resto de aminoácido de la enzima precursora corresponden a la
posición Ala +274 de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens o restos de aminoácidos equivalentes en otras
carbonil hidrolasas o subtilisinas.
La invención incluye también secuencias de DNA
mutantes que codifican tales mutantes de carbonil hidrolasa o
subtilisina.
Esta secuencias de DNA mutantes son derivadas de
una secuencia de DNA precursora que codifica una enzima precursora
de origen natural o recombinante. Las secuencias de DNA mutantes se
derivan modificando la secuencia de DNA precursora para que
codifique la sustitución de un resto específico de aminoácido
codificado por la secuencia de DNA precursora correspondiente a la
posición +274 en Bacillus amyloliquefaciens. Estas secuencias
de DNA recombinantes codifican mutantes de carbonil hidrolasa que
tienen una nueva secuencia de aminoácidos y, en general, al menos
una propiedad que es sustancialmente diferente de la misma propiedad
de la enzima codificada por la secuencia de DNA de la carbonil
hidrolasa precursora. Tales propiedades incluyen estabilidad y/o
características de rendimiento mejoradas.
La invención incluye también subtilisinas
procarióticas y eucarióticas con un resto de aminoácido diferente
tal como serina, en posiciones equivalentes a la posición +274 en
la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
Además, la invención incluye vectores de
expresión que contienen tales secuencias de DNA de carbonil
hidrolasa mutante así como células hospedadoras transformadas con
tales vectores, que son capaces de producir tales mutantes. La
invención se refiere también a composiciones detergentes que
comprenden los mutantes de carbonil hidrolasa de la invención.
La Fig. 1 representa la secuencia de DNA y de
aminoácidos para la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este
gen.
La Fig. 2 representa los restos de aminoácidos
conservados entre subtilisinas de Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus subtilis varI168 y
Bacillus licheniformis (carlsbergensis).
Las Figuras 3A y 3B representan la secuencia de
aminoácidos de la subtilisina de Bacillus amyliquefaciens,
Bacillus subtilis varI168 y Bacillus
licheniformis.
La Fig. 4 representa la secuencia de aminoácidos
de tres subtilisinas. El renglón superior representa la secuencia
de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens (también llamada a veces subtilisina BPN'). El
segundo renglón representa la secuencia de aminoácidos de la
subtilisina de Bacillus lentus (subtilisina 309 en la
Publicación PCT Nº WO 89/06279). El renglón de abajo representa la
secuencia de aminoácidos de una realización preferida de la
invención denominada GG-RYSA. El símbolo * denota
la ausencia de restos de aminoácidos específicos en comparación con
la subtilisina BPN'.
La Fig. 5 representa la construcción del plásmido
pGG A274.
La Fig. 6 representa la construcción de
pGG-KVNA, que es un intermedio para el plásmido
pGG-RYSA.
La Fig. 7 representa el método de
oligonucleótido-duplex usado para construir un gen
sintético de la subtilisina de Bacillus lentus.
La Fig. 8 representa la estrategia para construir
un gen sintético que codifica la subtilisina de Bacillus
lentus.
La Fig. 9 representa la casete usada para hacer
sustituciones en el DNA en el codón de posición +123 por
mutagénesis de casete. XXX representa el codón modificado para
codificar las sustituciones de aminoácidos en posición +123.
La Fig. 10 representa el DNA y la secuencia de
aminoácidos de una realización preferida de la invención, en la que
la secuencia de DNA es un DNA sintético. El DNA de esta Figura ha
sido modificado para que codifique arginina en la posición 27,
serina en la posición 78, tirosina en la posición 104, serina en la
posición 123 y alanina en la posición 274.
Se ha descubierto que mutaciones in vitro
en la carbonil hidrolasa subtilisina en un resto de aminoácido
equivalente a +123 en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens producen mutantes de subtilisina que muestran
actividad proteolítica alterada sobre las subtilisinas
precursoras.
También se ha descubierto que la mutación in
vitro en restos equivalentes a +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens produce mutantes de subtilisina
que muestran una estabilidad alterada, p. ej. actividad
autoproteolítica modificada. En algunos casos, estos últimos
mutantes muestran también un rendimiento mejorado cuando se usan en
composiciones detergentes.
Las carbonil hidrolasas son enzimas que
hidrolizan compuestos que contienen uniones
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---
X
en las que X es oxígeno o
nitrógeno. Incluyen carbonil hidrolasas de origen natural y
carbonil hidrolasas recombinantes. Las carbonil hidrolasas de origen
natural incluyen principalmente hidrolasas, p. ej. péptido
hidrolasas, tales como subtilisinas, o metaloproteasas. Las péptido
hidrolasas incluyen \alpha-aminoacilpéptido
hidrolasa, peptidilaminoácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serina
carboxipeptidasa, metalocarboxipeptidasa, tiol proteinasa,
carboxilproteinasa y metaloproteinasa. Se incluyen serina, metalo,
tiol y ácido proteasas, así como endo- y
exo-proteasas.
"Carbonil hidrolasa recombinante" se refiere
a una carbonil hidrolasa en la cual la secuencia de DNA que
codifica la carbonil hidrolasa de origen natural está modificada
para producir una secuencia de DNA mutante que codifica la
sustitución, la inserción o la deleción de uno o más aminoácidos en
la secuencia de aminoácidos de la carbonil hidrolasa. Los métodos
de modificación adecuados se describen en el presente texto, en la
Publicación EPO Nº 0 130 756 publicada el 9 de enero de 1985 y en la
Publicación EPO Nº 0 251 446 publicada el 7 de enero de 1988.
Las susbtilisinas son carbonil hidrolasas
bacterianas o fúngicas que actúan generalmente rompiendo uniones
peptídicas de proteínas o péptidos. Como se usa en el presente
texto, "subtilisina" significa una subtilisina de origen
natural o una subtilisina recombinante. Se conoce una serie de
subtilisinas de origen natural que son producidas y muchas veces
segregadas por varias especies microbianas. Las secuencias de
aminoácidos de los miembros de esta serie no son totalmente
homólogas. Sin embargo, las subtilisinas de esta serie muestran la
misma actividad proteolítica o un tipo de actividad similar. Esta
clase de proteasas de serina comparte una secuencia de aminoácidos
común que define una triada catalítica que la distingue de la clase
de proteasas de serina relacionadas con la quimiotripsina. Las
subtilisinas y proteasas de serina relacionadas con la
quimiotripsina tienen ambas una triada catalítica que comprende
aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con la
subtilisina el orden relativo de estos aminoácidos, leyendo desde el
término amino al carboxi, es
aspartato-histidina-serina. En las
proteasas relacionadas con la quimiotripsina el orden relativo, sin
embargo, es
histidina-aspartato-serina. Así, la
subtilisina en el presente texto se refiere a una proteasa de
serina que tiene la triada catalítica de proteasas relacionadas con
subtilisina. Los ejemplos incluyen las subtilisinas identificadas
en la Fig. 3 del presente texto y como se describen en la
Publicación PCT WO 89/06279 y en la Publicación EPO Nº 0 283
075.
"Subtilisina recombinante" se refiere a una
subtilisina en la cual la secuencia de DNA que codifica la
subtilisina está modificada para producir una secuencia de DNA
mutante que codifica la sustitución, la deleción o la inserción de
uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la
subtilisina de origen natural. Los métodos adecuados para producir
tal modificación y que pueden combinarse con los que se describen
en el presente texto, incluyen los descritos en la Publicación EPO
números 0 130 756 y Nº 0 251 446 y en la Publicación PCT números WO
89/06279, WO 89/09630 y WO 89/09819.
Las "carbonil hidrolasas no humanas" y el
DNA que las codifica pueden obtenerse a partir de muchos organismos
procariotas y eucariotas. Los ejemplos adecuados de organismos
procariotas incluyen organismos gram-negativos tales
como E. coli o Pseudomonas y bacterias
gram-positivas tales como Micrococcus o
Bacillus. Los ejemplos de organismos eucariotas a partir de
los cuales pueden obtenerse carbonil hidrolasa y sus genes incluyen
levaduras tales como Saccaromyces cerevisiae, hongos como
Aspergillus sp., y fuentes constituidas por mamíferos no
humanos como, por ejemplo, especie bovina, a partir de las cuales
pueden obtenerse los genes que codifican la carbonil hidrolasa
quimosina. Como con las subtilisinas, puede obtenerse una serie de
carbonil hidrolasas a partir de varias especies relacionadas que
tienen secuencias de aminoácidos que no son enteramente homólogas
entre los miembros de esa serie pero que, no obstante, muestran la
misma actividad biológica o una de tipo similar. Así, la carbonil
hidrolasa no humana como se usa en el presente texto tiene una
definición funcional que se refiere a carbonil hidrolasas que están
asociadas directa o indirectamente, con fuentes procariotas y
eucariotas.
Un "mutante de carbonil hidrolasa" tiene una
secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de
aminoácidos de una "carbonil hidrolasa precursora". Las
carbonil hidrolasas precursoras incluyen carbonil hidrolasas de
origen natural y carbonil hidrolasas recombinantes. La secuencia de
aminoácidos del mutante de carbonil hidrolasa se "deriva" de
la secuencia de aminoácidos de la hidrolasa precursora mediante la
sustitución, la deleción o la inserción de uno o más aminoácidos de
la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la
"secuencia de DNA precursora" que codifica la secuencia de
aminoácidos de la carbonil hidrolasa precursora, en vez de la
manipulación de la enzima carbonil hidrolasa precursora per
se. Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia
de DNA precursora incluyen métodos descritos en el presente texto y
en las Publicaciones EPO números 0 130 756 y 0 251 446.
Los restos específicos correspondientes a las
posiciones +123 y +274 de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se identifican en el presente texto para
sustitución. Estos números de posición de aminoácidos se refieren a
los asignados a la secuencia de la subtilisina del Bacillus
amyloliquefaciens madura presentada en la Fig. 1. Sin embargo,
la invención no está limitada a la mutación de esta subtilisina
concreta sino que se extiende a carbonil hidrolasas precursoras que
contienen restos de aminoácidos en posiciones que son
"equivalentes" a los restos concretos identificados en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
Un resto (aminoácido) de una carbonil hidrolasa
precursora es equivalente a un resto de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens si es homólogo (es decir, correspondiente en
posición en la estructura primaria o en la terciaria) o bien si es
análogo a un resto específico o porción de ese resto en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (es decir, que
tiene la misma capacidad funcional, o una similar, para combinarse,
reaccionar o interaccionar químicamente).
Para establecer homología respecto a la
estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una carbonil
hidrolasa precursora se compara directamente con la secuencia
primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y en
particular con un conjunto de restos que se sabe que son
invariables en todas las subtilisinas para las que se conoce la
secuencia (Fig. 2). Después de alinear los restos conservados,
permitiendo las inserciones y deleciones necesarias con el fin de
mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de restos
conservados por deleción e inserción arbitrarias), se definen los
restos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia
primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. La
alineación de restos conservados debe de conservar preferentemente
el 100% de tales restos. Sin embargo, la alineación de más del 75%
o de una porción tan baja como el 50% de los restos conservados es
también adecuada para definir restos equivalentes. La conservación
de la triada catalítica Asp32/His64/Ser221 debe mantenerse.
Por ejemplo, en la Fig. 3 la secuencia de
aminoácidos de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus subtilis var. I168 y Bacillus lichenformis
(carlsbergensis) están alineadas para proporcionar la máxima cuantía
de homología entre secuencias de aminoácidos. Una comparación de
estas secuencias muestra que hay cierto número de restos
conservados contenidos en cada secuencia. Estos son los restos
identificados en la Fig. 2.
Estos restos conservados pueden ser usados
entonces para definir los correspondientes restos de aminoácidos
equivalentes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens
en otras carbonil hidrolasas tales como la subtilisina de
Bacillus lentus (Publicación PCT Nº WO 89/06279 publicada el
13 de julio de 1989) y el mutante de subtilisana preferido del
presente texto. Estas secuencias particulares de aminoácidos están
alineadas en la Fig. 4 con la secuencia de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens para producir la máxima homología
de restos conservados. Como puede observarse, hay cierto número de
deleciones en la secuencia de Bacillus lentus y en el mutante
de subtilisina preferido de la invención, en comparación con la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Así, el
aminoácido equivalente para Val-165 en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, en las otras
subtilisinas es la isoleucina particular indicada debajo de
Val-165.
En la Fig. 4, el aminoácido de la posición 123 es
asparagina en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
En la subtilisina de Bacillus lentus, el resto equivalente
es la asparagina particular indicada. Sin embargo en un mutante de
subtilisina, el aminoácido equivalente a +123 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens es un aminoácido distinto de la
asparagina y es preferentemente la serina indicada en la Fig. 4.
Del mismo modo, en la Fig. 4, el aminoácido en posición +274 de la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens es alanina. Como
puede observarse, el aminoácido equivalente en la subtilisina de
Bacillus lentus es la treonina particular indicada en la Fig.
4. En un mutante de subtilisina particular preferido de la
invención, la posición 274 de aminoácido equivalente está ocupada
por la alanina indicada en la Fig. 4.
Así, las posiciones +123 y +274 están
identificadas por secuencias de aminoácidos primarias en la Fig. 4
para la subtilisina de Bacillus lentus y la realización
preferida de la invención. Sin embargo, pueden ser modificados otros
varios restos de aminoácidos que son equivalentes a aminoácidos
específicos en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
Así, en la realización preferida, el aminoácido lisina en posición
27 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens tiene una
lisina equivalente en posición 27 en la subtilisina de Bacillus
lentus. Como se indica en los Ejemplos, la subtilisina que
comprende una de las realizaciones preferidas de la invención fue
derivada modificando una secuencia de DNA que codifica subtilisina
de Bacillus lentus. Tales modificaciones al DNA incluían la
modificación de codones equivalentes a las posiciones 123 y 274 de
la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Sin embargo,
se hicieron otras dos modificaciones a la secuencia de aminoácidos
de Bacillus lentus en posiciones equivalentes a los restos
27 y 104 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
Así, como puede observarse en la Fig. 4, la lisina en el resto 27
equivalente en la subtilisina de Bacillus lentus fue
modificada para codificar arginina en la realización preferida. Del
mismo modo, el resto de valina en posición 104 de Bacillus
lentus, que es equivalente a tirosina 104 en subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, fue también modificado para
codificar tirosina. Así, la realización preferida indicada en la
Fig. 4 contiene una secuencia de aminoácidos derivada de la
subtilisina de Bacillus lentus modificando restos de esa
subtilisina equivalentes a las posiciones 27, 104, 123 y 274 de la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
También pueden definirse restos equivalentes
determinando homología a nivel de la estructura terciaria para una
carbonil hidrolasa precursora cuya estructura terciaria ha sido
determinada por cristalografía de rayos X. Los restos equivalentes
se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas
de dos o más de los átomos de la cadena principal de un resto de
aminoácido particular de la carbonil hidrolasa precursora y la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N sobre N, CA
sobre CA, C sobre C y O sobre O) están dentro de los 0,13 nm y
preferentemente 0,1 nm después de la alineación. La alineación se
consigue después de que el mejor modelo ha sido orientado y situado
para dar el máximo solapamiento de coordenadas atómicas de átomos
que no sean de hidrógeno de la proteína de la carbonil hidrolasa en
cuestión respecto de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. El mejor modelo es el modelo cristalográfico
que da el factor R más bajo para los datos experimentales de
difracción a la resolución más alta disponible.
factor R =
\frac{\Sigma _{h}|Fo \ (h)| \ - \ |Fc \ (h)|}{\Sigma _{h}|Fo \
(h)|}
Los restos equivalentes que son funcionalmente
análogos a un resto específico de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se definen como aquellos aminoácidos de las
carbonil hidrolasas precursoras, que pueden adoptar una conformación
tal que alteran, modifican o contribuyen a la estructura de la
proteína, la unión de sustrato o la catálisis en una manera
definida y atribuida a un resto específico de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens. Además, están aquellos restos de
la carbonil hidrolasa precursora (para los que se ha obtenido una
estructura terciaria mediante cristalografía de rayos X), que
ocupan una posición análoga hasta el punto de que aunque los átomos
de la cadena principal del resto dado pueden no satisfacer los
criterios de equivalencia sobre la base de ocupar una posición
homóloga, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de
la cadena lateral del resto están a 0,13 nm de los correspondientes
átomos de la cadena lateral de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. Las coordenadas de la estructura
tridimensional de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se exponen en la Publicación EPO Nº 0 251 446
y pueden ser usadas como se indicó antes para determinar restos
equivalentes a nivel de la estructura terciaria.
Algunos de los restos identificados para
sustitución, inserción o deleción, son restos conservados mientras
que otros no lo son. En el caso de restos que no son conservados,
la sustitución de uno o más aminoácidos está limitada a
sustituciones que producen un mutante que tiene una secuencia de
aminoácidos que no corresponde a una que se encuentre en la
naturaleza. En el caso de restos conservados, tales sustituciones no
deben dar por resultado una secuencia existente en la naturaleza.
Los mutantes de la carbonil hidrolasa de la presente invención
incluyen las formas maduras de mutantes de carbonil hidrolasa así
como las pro- y prepro-formas de tales mutantes de
hidrolasa. Las prepro-formas son la construcción
preferida ya que ésta facilita la expresión, la secreción y la
maduración de los mutantes de carbonil hidrolasa.
"Prosecuencia" se refiere a una secuencia de
aminoácidos unida a la porción N-terminal de la
forma madura de una carbonil hidrolasa que, cuando se elimina,
tiene por resultado la aparición de la forma "madura" de la
carbonil hidrolasa. Muchas enzimas proteolíticas se encuentran en
la naturaleza como productos de proenzima traduccionales y, en
ausencia de tratamiento post-traduccional, se
expresan de esta manera. Una prosecuencia preferida para producir
mutantes de carbonil hidrolasa, concretamente mutantes de
subtilisina, es la prosecuencia putativa de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, aunque pueden usarse otras
prosecuencias de subtilisina. En estos Ejemplos, se usó la
secuencia pro putativa de la subtilisina de Bacillus lentus
(ATCC 21536).
Una "secuencia señal" o "presecuencia"
se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos unida a la porción
N-terminal de una carbonil hidrolasa o a la porción
N-terminal de una prohidrolasa que puede participar
en la secreción de la hidrolasa madura o formas pro de la
hidrolasa. Esta definición de secuencia señal es una definición
funcional, pensada para incluir todas esas secuencias de aminoácidos
codificadas por la porción N-terminal del gen de la
subtilisina o de otras carbonil hidrolasas segregables, que
participan en la realización de la secreción de la subtilisina o de
otras carbonil hidrolasas bajo condiciones originales. La presente
invención utiliza tales secuencias para realizar la secreción de
los mutantes de carbonil hidrolasa como se definen en el presente
texto. Una secuencia señal preferida usada en los Ejemplos comprende
los siete primeros restos de aminoácidos de la secuencia original
de subtilisina de Bacillus subtilis fusionados al resto de
la secuencia señal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC
21536).
Una forma "prepro" de un mutante de carbonil
hidrolasa consiste en la forma madura de la hidrolasa que tiene una
prosecuencia unida operativamente al término amino de la hidrolasa
y una secuencia "pre" o "señal" unida operativamente al
término amino de la prosecuencia.
"Vector de expresión" se refiere a una
construcción de DNA que contiene una secuencia de DNA que está
operativamente unida a una secuencia de control adecuada capaz de
efectuar la expresión de dicho DNA en un hospedador adecuado. Tales
secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la
transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal
transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión al
ribosoma del mRNA adecuados, y secuencias que controlan la
terminación de la trascripción y de la traducción. El vector puede
ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un inserto
(fragmento insertado) genómico potencial. Una vez transformado en
un hospedador adecuado, el vector puede replicar y funcionar
independientemente del genoma hospedador o, en algunos casos, puede
integrarse en el propio genoma. En la presente memoria,
"plásmido" y "vector" se usan a veces indistintamente ya
que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada en la
actualidad. Sin embargo, se pretende que la invención incluya otras
formas de vectores de expresión que sirven funciones equivalentes y
que son o lleguen a ser conocidas en la técnica.
Las "células hospedadoras" usadas en la
presente invención son generalmente hospedadores procariotas o
eucariotas que preferentemente han sido manipulados por los métodos
descritos en la Publicación EPO Nº 130 756 para hacerlos incapaces
de segregar endoproteasa activa enzimáticamente. Una célula
hospedadora preferida para expresar subtilisina es la cepa BG2036
de Bacillus que es deficitaria en proteasa neutra
enzimáticamente activa y proteasa alcalina (subtilisina). La
construcción de la cepa BG2036 se describe con detalle en la
Publicación EPO Nº 0 130 756 y se describe además en Yang, M. Y.
et al. (1984), J. Bacteriol., 160,
15-21. Otras células hospedadoras para expresar
subtilisina incluyen Bacillus subtilis I168 (Publicación EPO
Nº 0 130 756).
Las células hospedadoras son transformadas o
transfectadas con vectores construidos usando técnicas de DNA
recombinante. Tales células hospedadoras transformadas son capaces
de replicar vectores que codifican los mutantes de carbonil
hidrolasa o bien de expresar el mutante de carbonil hidrolasa
deseado. En el caso de vectores que codifican la forma pre o prepro
del mutante de carbonil hidrolasa, tales mutantes, cuando se
expresan, son típicamente segregados de la célula hospedadora al
medio de la célula hospedadora.
"Operativamente unido", cuando describe la
relación entre dos regiones de DNA, significa simplemente que están
funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, una presecuencia
está operativamente unida a un péptido si funciona como secuencia
señal, participando en la secreción de la forma madura de la
proteína lo más probablemente implicando la segmentación de la
secuencia señal. Un promotor está operativamente unido a una
secuencia codificadora si controla la transcripción de la secuencia;
un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una
secuencia codificadora si está situado de forma que permita la
traducción.
Los genes que codifican la carbonil hidrolasa
precursora de origen natural pueden obtenerse de acuerdo con los
métodos generales descritos en las Publicaciones EPO números 0 130
756 y 0 251 446. Como puede observarse a partir de los ejemplos
descritos en el presente texto, los métodos comprenden generalmente
sintetizar sondas marcadas que tienen secuencias putativas que
codifican regiones de la hidrolasa de interés, preparar genotecas a
partir de organismos que expresan la hidrolasa, y cribar las
genotecas en relación con el gen que interesa por hibridación con
las sondas. Los clones que se hibridan positivamente son después
cartografiados y secuenciados.
La carbonil hidrolasa clonada se usa después para
transformar una célula hospedadora con el fin de expresar la
hidrolasa. El gen de la hidrolasa se liga después en un plásmido de
número de copias elevado. Este plásmido se replica en hospedadores
en el sentido de que contiene los elementos bien conocidos
necesarios para la replicación del plásmido: un promotor
operativamente unido al gen en cuestión (que puede ser suministrado
como el promotor homólogo propio del gen si es reconocido, es
decir, transcrito, por el hospedador), una región de terminación de
la transcripción y de poliadenilación (necesaria para la
estabilidad del mRNA transcrito por el hospedador a partir del gen
de la hidrolasa en ciertas células hospedadoras eucariotas) que es
exógena o es suministrada por la región terminadora endógena del gen
de la hidrolasa y, deseablemente, un gen de selección tal como un
gen de resistencia a antibióticos que permite el mantenimiento del
cultivo continuo de células hospedadoras infectadas por el plásmido
mediante el desarrollo en un medio que contiene antibiótico. Los
plásmidos con número elevado de copias contienen también un origen
de la replicación para el hospedador, permitiendo así que se generen
grandes números de plásmidos en el citoplasma sin limitaciones
cromosómicas. Sin embargo, está dentro del alcance de la presente
invención integrar múltiples copias del gen de la hidrolasa en el
genoma del hospedador. Esto viene facilitado por organismos
procariotas y eucariotas que son particularmente susceptibles a la
recombinación homóloga.
Alternativamente, puede producirse un gen
sintético que codifica una carbonil hidrolasa precursora de origen
natural o mutante. En tal planteamiento, se determina la secuencia
de DNA y/o de aminoácidos de la hidrolasa precursora. Después de
ello se sintetizan múltiples fragmentos de DNA de cadena sencilla
sintéticos solapantes, que, al hibridarse y ligarse, producen un
DNA sintético que codifica la hidrolasa precursora. Este
planteamiento proporciona varias ventajas sobre la clonación del gen
natural, en cuanto que pueden interponerse sitios de restricción
por el DNA sin cambios en la secuencia de aminoácidos codificada,
de manera que se facilita la subsiguiente modificación para formar
carbonil hidrolasas mutantes. Además, el planteamiento de síntesis
permite ajustar el uso de codón en el gen sintético para
conformarlo con la preferencia codónica para los hospedadores de
expresión particulares que han de usarse. Un ejemplo de
construcción de gen sintético se expone en los Ejemplos.
Una vez que el gen de la carbonil hidrolasa
precursora de origen natural o sintético ha sido clonado, se
realizan varias modificaciones para potenciar el uso del gen más
allá de la síntesis de la carbonil hidrolasa precursora de origen
natural. Tales modificaciones incluyen la producción de carbonil
hidrolasas recombinantes como se describe en las Publicaciones EPO
números 0 130 756 y 0 251 446 y la producción de mutantes de
carbonil hidrolasa descritos en el presente texto.
El siguiente método de mutagénesis por casete
puede ser usado para facilitar la construcción e identificación de
los mutantes de carbonil hidrolasa de la presente invención, aunque
pueden usarse otros métodos, incluyendo la mutagénesis dirigida a
un sitio. En primer lugar, se obtiene el gen de origen natural que
codifica la hidrolasa y se secuencia total o parcialmente. Después
se criba la secuencia en relación con un punto en el cual se desea
hacer una mutación (deleción, inserción o sustitución) de uno o más
aminoácidos en la enzima codificada. Las secuencias que flanquean
este punto son evaluadas en cuanto a la presencia de sitios de
restricción para reemplazar un segmento corto del gen con un
pool de oligonucleótidos que cuando se expresan codifiquen
varios mutantes. Tales sitios de restricción son preferentemente
sitios únicos dentro del gen de la hidrolasa para facilitar el
reemplazo del segmento génico. Sin embargo, puede usarse cualquier
sitio de restricción conveniente que no sea excesivamente
redundante en el gen de la hidrolasa, siempre y cuando los
fragmentos génicos generados por digestión de restricción puedan ser
reensamblados en la secuencia apropiada. Si no existen sitios de
restricción en posiciones dentro de una distancia conveniente del
punto elegido (de 10 a 15 nucleótidos), tales sitios son generados
sustituyendo nucleótidos en el gen de tal manera que ni el marco de
lectura ni los aminoácidos codificados se cambien en la
construcción final. La mutación del gen para que cambie su
secuencia para conformarse a la secuencia deseada se realiza por
extensión del cebador M13 de acuerdo con métodos generalmente
conocidos. La tarea de localizar regiones flanqueantes adecuadas y
evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de
sitio de restricción convenientes se hace rutina por la redundancia
del código genético, un mapa de enzimas de restricción del gen y el
gran número de enzimas de restricción diferentes. Se ha de observar
que si se dispone de un sitio de restricción flanqueante
conveniente, solamente se necesita usar el método anterior en
relación con la región flanqueante que no contiene un sitio.
Una vez clonado el DNA de origen natural o el DNA
sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones a
mutar son digeridos con las enzimas de restricción cognadas o
análogas y se liga en los genes una diversidad de casetes de
oligonucleótidos complementarias en términos finales. La mutagénesis
se simplifica enormemente por este método porque todos los
oligonucleótidos pueden ser sintetizados de forma que tengan los
mismos sitios de restrición, y no son necesarios enlazadores
sintéticos para crear los sitios de restricción.
Como se usa en el presente texto, la actividad
proteolítica se define como la velocidad de hidrólisis de enlaces
peptídicos por miligramo de enzima activa. Existen muchos
procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica
(K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in
Biochemial Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed.,
1988).
De acuerdo con la invención, se ha determinado
que los restos equivalentes a +274 en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens son importantes en la modulación de las
características globales del comportamiento de la enzima en
composiciones detergentes. Así, como se expone en los Ejemplos, la
treonina en la subtilisina de Bacillus lentus en posición
equivalente +274 puede ser mutada a alanina en la realización
preferida para producir un mejor comportamiento de la enzima
mutante. Como también se describe en los ejemplos, la sustitución
de este resto con un aminoácido distinto de la treonina, p. ej.
leucina, serina, valina y alanina, tiene por resultado una
disminución de la estabilidad del mutante. Se cree que tal
disminución de la estabilidad es el resultado de la degradación
autocatalítica del mutante. Así, las modificaciones de restos
equivalentes a +274 en la sutilisina de Bacillus son capaces
de mejorar el comportamiento global de la enzima en una composición
detergente y modular la estabilidad global de la enzima. En este
aspecto de la invención, el objetivo es asegurar una carbonil
hidrolasa mutante que tiene un comportamiento mejorado cuando se
usa en una composición detergente, en comparación con la carbonil
hidrolasa precursora. Como se usa en el presente texto, el
comportamiento mejorado en un detergente se define como el aumento
de la limpieza de ciertas manchas sensibles a las enzimas, tales
como las de hierba o de sangre. Esta limpieza se determina por
evaluación visual después de un ciclo de lavado estándar.
En los Ejemplos se expone una realización
preferida de la invención en la que la lisina en posición 27 está
sustituida con arginina, la valina en posición 104 está sustituida
con tirosina, la asparagina en posición 123 está sustituida con
serina y la treonina en el resto 274 está sustituida con alanina en
la subtilisina de Bacillus lentus. Aunque la estabilidad de
esta enzima es algo reducida en comparación con la subtilisina
precursora de Bacillus lentus, el nivel de comportamiento de
esta enzima en una composición detergente está sustancialmente
mejorado de forma que se obtiene el mismo comportamiento de este
mutante de subtilisina de Bacillus lentus en comparación con
la subtilisina de Bacillus lentus sin modificar, que cuando
se usa aproximadamente la mitad de la cantidad de esta enzima.
Basándose en los resultados obtenidos con esta y
otras subtilisinas mutantes, es evidente que los restos en carbonil
hidrolasas equivalentes a las posiciones +123 y +274 en Bacillus
amyloliquefaciens son importantes para la actividad
proteolítica, el comportamiento y/o la estabilidad de estas
enzimas.
Muchas de las carbonil hidrolasas de la
invención, especialmente la subtilisina, son útiles para formular
varias composiciones detergentes. Cierto número de compuestos
conocidos son agentes tensioactivos adecuados, útiles en
composiciones que comprenden los mutantes de carbonil hidrolasa de
la invención. Estos incluyen detergentes no iónicos, aniónicos,
catiónicos o zwitteriónicos, como se describen en la patente de
EE.UU. nº 4.404.128 de Barry J. Anderson y en la patente de EE.UU.
nº 4.261.868 de Jiri Flora et al. La técnica es familiar con
las diferentes formulaciones que pueden ser usadas como
composiciones para limpieza.
Las subtilisinas de la invención pueden ser
formuladas en detergentes en polvo y líquidos conocidos, que tienen
un pH entre 6,5 y 12,0 a concentraciones de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 5%, preferentemente de 0,1% a 0,05% en peso. Estas
composiciones detergentes para limpieza pueden también incluir otras
enzimas tales como proteasas y amilasas conocidas, así como
mejoradores y estabilizantes.
La adición de subtilisinas de la invención a
composiciones para limpieza convencionales no crea ninguna
limitación especial de uso. En otras palabras, cualquier
temperatura y pH que sean adecuados para el detergente son también
adecuados para las presentes composiciones, siempre y cuando el pH
esté dentro del intervalo anterior, y la temperatura sea inferior a
la temperatura de desnaturalización de las subtilisinas de la
presente invención. Además, las subtilisinas de la invención pueden
usarse en una composición para limpieza sin detergentes, también en
este caso solas o en combinación con mejoradores y
estabilizantes.
Lo que sigue se presenta a título de ejemplo y no
ha de considerarse como limitación del alcance de las
reivindicaciones.
El plásmido pSAR, Fig. 5, lleva una fusión
traduccional por medio de un sitio de restricción Sau3A común en el
codón de la secuencia señal séptimo/octavo de los genes de
subtilisina de B. subtilis y B. amyloliquefaciens.
Como se muestra en la Fig. 5, este gen, en un fragmento
EcoRI-BamHI de 2,0 kb, fue subclonado en M13mp19 con
el fin de aislar DNA molde de cadena sencilla para usarlo para la
mutagénesis dirigida al sitio para formar
pSAR-Q275R. El protocolo de mutagénesis fue
esencialmente el de Zoller, M. et al. (1983), Methods
Enzymol., 100, 468-500, (1) y usó un
oligonucleótido sintético de secuencia:
en la que los asteriscos indican
cambios respecto de las secuencias génicas de tipo silvestre, y el
subrayado representa un sitio de endonucleasa de restricción PstI
introducido, usado en el cribado para el gen mutante en particular
que codifica el cambio Q275R. Estos cambios se hicieron para (1)
convertir el aminoácido de esta posición en el encontrado en la
subtilisina de Bacillus lentus y (2) para permitir la
conexión del terminador en pSAR con la región de codificación
madura de Bacillus lentus a través de un sitio Pst
introducido de la misma forma en el pGG36 de Bacillus lentus
(ATCC
21536).
El plásmido pGG36, Fig. 5, contiene un fragmento
de DNA genómico de 2,1 kb de Bacillus lentus (ATCC 21536)
que codifica el gen completo de la subtilisina que fue clonado por
métodos estándar en el vector lanzadera pBS42. Band, L., et
al. (1984), DNA,3, 17-21.
La secuencia de aminoácidos para esta subtilisina
es la misma que la descrita para la subtilisina 309 en la
Publicación PCT Nº 89/06279. Este gen fue subclonado en M13 como
anteriormente para mutagénesis dirigida al sitio usando un
oligonucleótido de secuencia:
con el fin de 1) introducir un
sitio PstI en la misma situación de este gen que corresponde al
sitio introducido en pSAR anteriormente y 2) para sustituir la
treonina en posición 274 con alanina, para formar
pGG36-T274A.
Los genes mutantes pSAR-Q275R y
pGG36-T274A fueron subclonados individualmente de
nuevo en pBS42 antes de las digestiones con PstI/BamHI, el
aislamiento del fragmento y la ligación, para producir el plásmido
GG-A274B.amy.term. como se muestra en la Fig. 5,
todo ello por métodos estándar.
Se preparó un enlazador de DNA sintético mediante
reasociación de oligonucleótidos de cadena sencilla complementarios
de secuencias:
5'
-G-ATC-GTC-GCG-TCG-ACC-GCA-CTA-CTC-ATT-TCT-GTT-GCT-TTT-AGT-TCA-T-
3'
y
5'
-CGA-TGA-ACT-AAA-AGC-AAC-AGA-AAT-GAG-TAG-TGC-GGT-CGA-CGC-GAC-
3'
para dar el fragmento nº 2 de DNA de cadena doble
que se muestra en la Fig. 6. Los extremos ahuecados de la izquierda
y de la derecha de este enlazador dúplex son complementarios al
extremo Sau3A del fragmento nº 1 (de pSAR) y el extremo ClaI del
fragmento nº 3 (de pGG-A274 B.amy.term),
respectivamente. Estos 3 fragmentos se combinaron con el fragmento 4
de pSAR-Q275R después de las digestiones con
endonucleasa de restricción de los plásmidos, el aislamiento del
fragmento y la ligación por métodos estándar, para producir el
plásmido pGG-KVNA. La designación
GG-KVNA indica que esta subtilisina contiene la
subtilisina codificada por pGG-36 que incluye
lisina (K) en la posición 27, valina (V) en la posición 104,
asparagina (N) en la posición 123 y la sustitución de treonina en
la posición 274 por alanina (A).
Como se indica en la Fig. 6, el gen
GG-KVNA (fragmento EcoRI-BamHI de
2,1 kb) fue subclonado en M13 durante tres rondas sucesivas de
mutagénesis dirigida al sitio usando oligonucleótidos que tienen la
secuencia:
Los asteriscos indican cambios respecto de la
secuencia del gen de tipo silvestre. Los subrayados representan en
(a) un sitio XbaI introducido y en (b) y (c) sitios NheI
introducidos usados para cribar la presencia de las mutaciones R27,
Y104 y S123 unidas, respectivamente. Además, en (c), el sobrerrayado
indica un sitio SphI destruido. Finalmente, el gen
GG-RYSA de 2,1 kb fue vuelto a subclonar en pBS42
para la expresión en hospedadores B. subtilis.
El plásmido resultante se designó
pGG-RYSA. Esta designación indica que se modificaron
cuatro restos en el plásmido pGG-KVNA. Lisina (K) en
posición 27 a arginina (R), valina (V) a tirosina (Y) en posición
104 y asparagina (N) en posición 123 a serina (S). La alanina
anteriormente sustituida en el resto 274 no se modificó en
este
procedimiento.
procedimiento.
La lisina en posición 27 fue sustituida con
arginina basándose en la secuenciación de aminoácidos de la
subtilisina 309. Como se indica en la Publicación PCT nº WO
89/06279, la lisina está situada en posición 27. Sin embargo,
después de secuenciar independientemente esta proteína de
subtilisina, los datos iniciales indicaron que la arginina era el
resto en posición 27. En el caso de la sustitución de tirosina por
valina en el resto 104, la sustitución se hizo para reducir el
perfil de actividad de pH y para aumentar el rendimiento de la
enzima basándose en resultados anteriormente obtenidos para la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (a veces denominada
BPN'). La sustitución de asparagina en posición 123 con serina se
basa en los resultados obtenidos más adelante en los que se
determinó que la sustitución de serina en posición 123 maximizaba la
actividad proteolítica de la enzima en un mutante
estrechamente
relacionado.
relacionado.
El DNA que codifica la secuencia de aminoácidos
de la subtilisina de Bacillus lentus fue también preparado
construyendo un gen que codifica una secuencia de DNA
sintética.
Se secuenció el fragmento genómico HindIII de 2,1
kb del plásmido pGG36. La secuencia de aminoácidos deducida del
producto génico maduro (subtilisina GG36) se usó para diseñar una
secuencia de codificación madura sintética con las propiedades
siguientes: (1) En general, se utilizaron los codones más
frecuentemente encontrados para cada aminoácido en siete genes de
B. subtilis diferentes (de una tabulación de usos de codón,
Tabla 2 de Maruyama, T. et al., (1986), Nucl. Acids
Res., Supplement 14, pág. r151-r197),
excepto en los casos en los que codones alternativos tenían por
resultado sitios de reconocimiento de enzima de restricción dentro
del gen localizados convenientemente. (2) Aproximadamente cada
40-60 p. b. de la región de codificación madura de
\sim0,8 kb, se utilizaron combinaciones de 2 ó 3 codones elegidos
específicamente que dieron por resultado la introducción de sitios
de restricción únicos bastante igualmente espaciados. Estos sitios
fueron elegidos para facilitar (a) mutagénesis en casete
posteriores y estudios de cribado y (b) construcciones que implican
más de una mutación. (3) Se diseñó un sitio de reconocimiento de
PsT I único para cubrir los codones 272-274
permitiendo la conexión a las secuencias terminadoras de un gen de
Bacillus amyloliquefaciens modificado de modo similar sobre
los mismos tres codones y sustituyendo la treonina en posición 274
con alanina. Y (4) se introdujo un único sitio NruI para cubrir los
restos 9-10 de codones maduros permitiendo la
conexión a la secuencia codificadora de pre-pro de
GG36 mediante un enlazador de DNA duplex sintético corto. Basándose
en este diseño, se sintetizaron oligonucleótidos ("oligos") de
forma que al reasociarse los oligos codificadores y no
codificadores para una región de codificación de \sim60 p. b.
dada, el fragmento de DNA duplex resultante tuviese en sus extremos
regiones de cadena simple complementarias con el extremo del
siguiente fragmento duplex del gen (véase la Fig. 7).
Un total de 36 oligos diferentes (que comprenden
18 duplex individuales) fueron usados en el esquema, como se señaló
antes, dando por resultado una región de codificación madura
sintética duplex de \sim0,8 kb (Fragmento 3 en la Fig. 8).
Finalmente, se sintetizó un par adicional de
oligos sintéticos que al reasociarse (para dar el fragmento 2 en la
Fig. 8) tiene un sitio NcoI en su extremo 5' (complementario al
sitio NcoI de GG36 en los codones maduros 5-6) y un
sitio NruI en su extremo 3' (complementario al extremo 3' 5' del
fragmento 3).
La construcción final para dar una unidad de
expresión completa consistente en promotor de B. subtilis y
los siete primeros aminoácidos de la secuencia señal conectados a
secuencias de GG36 que codifican el resto de la secuencia señal, la
secuencia pro completa y los seis primeros aminoácidos maduros
(Fragmento 1 de GG-KVNA), el gen sintético que
codifica los restos 7-274 maduros (Fragmentos 2+3) y
la región terminadora (incluyendo el codón 279 del gen maduro
final) de Bacillus amyloliquefaciens (fragmento 4), se hizo
como ligación en cuatro vías como se expone en la Figura 6.
Finalmente, se introdujeron otras tres mutaciones
distintas en la región de codificación madura de este gen híbrido
de longitud completa. La primera sustituyó la lisina en posición 27
con arginina. La segunda sustituyó la valina en posición 104 con
tirosina. La tercera sustituyó la asparagina en posición 123 con
serina. El plásmido resultante se designa
pBC3-RYSA. El ejemplo siguiente describe el método
usado para modificar la posición 123 en el gen sintético. Métodos
similares fueron usados para modificar las posiciones 27 y 104 en
este gen sintético.
Se introdujo un sitio XhoI sobre los codones
111/112 en el gen sintético del Ejemplo 3 haciendo tres mutaciones
fenotípicamente silenciosas por medio de una mutagénesis dirigida al
sitio (mutagénesis de extensión del cebador en M13). El plásmido
resultante, pX123 (Fig. 9), fue digerido con Xho I y Ava I y el
fragmento grande que contiene el vector se aisló mediante
electroelución en gel de agarosa. Los oligonucleótidos sintéticos
complementarios fueron reasociados, ligados con el fragmento grande
de pX123 y transformados en la cepa MM294 de E. coli. Estas
casetes codificaban, individualmente, los 20 aminoácidos naturales
en posición 123, y además contenían una mutación silenciosa que
destruía un sitio Sph I único situado entre los sitios Xho I y Ava I
en pX123. Los plásmidos resultantes a partir de transformantes de
E. coli fueron cribados en relación con la pérdida del sitio
Sph I único. Los positivos por análisis de restricción (es decir,
negativos para Sph I) se secuenciaron para confirmar la presencia de
las mutaciones en posición 123 deseadas, se subclonaron en el
vector lanzadera pBS42 y se transformaron en Bacillus
subtilis BG2036 para expresión.
La actividad proteolítica de cada uno de los
mutantes de subtilisina codificados por los mutantes en posición
+123 anteriormente modificados fue ensayada mezclando 0,04 mL de
sobrenadante de caldos de cultivo centrifugados, con 0,56 mL de
caseína al 1% p/v en Tris 0,1 M pH 8,60. Después de 20 minutos de
incubación a 37ºC, las reacciones se apagaron por precipitación con
ácido tricloroacético (TCA) al 10%. La actividad se determinó a
partir de la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm para el
sobrenadante después de la precipitación con TCA al 10%.
| Codón 123 | % de actividad proteolítica | |
| Ser | 116 | |
| Asn | 100 | |
| Cys | 22 | |
| Gly | 12 | |
| Ala | 9 | |
| Thr | 7 | |
| Gln | 7 | |
| Val | 6 | |
| Glu | <5 | |
| Ile | <5 | |
| Trp | <5 | |
| Phe | <5 | |
| Asp | <5 | |
| His | <5 | |
| Leu | <5 | |
| Met | <5 | |
| Pro | <5 | |
| Tyr | <5 |
En el proceso de confirmación final de la
secuencia de DNA del gen sintético que codifica la enzima
BC3-RYSA, se encontró que hay prolina en la posición
78 en vez de serina (el aminoácido en esta posición en la
subtilisina de Bacillus lentus). Las propiedades iniciales
de las mutaciones en la posición 123 fueron ensayadas en esta
enzima, BC3-RPYA (prolina en posición 78). Estos
resultados se muestran en la Tabla I. El aminoácido en posición 78
fue después cambiado de nuevo a serina para formar el DNA y la
secuencia de aminoácidos que se muestran en la Fig. 10 reemplazando
el dúplex de DNA sintético correspondiente a esa posición del
gen.
Como puede observarse, la sustitución de Asn con
Ser en la posición 123 tiene por resultado un aumento sustancial de
la actividad proteolítica. La relación entre las diversas
subtilisinas discutidas en el presente texto se resumen para las
posiciones 27, 78, 104, 123 y 274 en la Tabla II.
| Posición | |||||
| 27 | 78 | 104 | 123 | 274 | |
| GC36 (genómico) | Lys | Ser | Val | Asn | Thr |
| (K) | S) | (V) | (N) | (T) | |
| Gen sintético de B. | Lys | Pro | Val | Asn | Ala |
| lentus | (K) | (P) | (V) | (N) | (A) |
| Subtilisina de B. | Lys | Ser | Tyr | Asn | Ala |
| amyloliquefaciens | (K) | (S) | (Y) | (N) | (A) |
| (BNP) | |||||
| Subtilisina 309 como | Lys | Ser | Val | Asn | Thr |
| se ha publicado | (K) | (S) | (V) | (N) | (T) |
| Realización preferida de | Arg | Ser | Tyr | Ser | Ala |
| la presente invención | (R) | (S) | (Y) | (S) | (A) |
\global\parskip0.900000\baselineskip
La estabilidad de los mutantes en la posición 274
en BC3-RPY (arginina en posición 27, prolina en
posición 78 y tirosina en posición 104 en la subtilisina de
Bacillus lentus) se muestra en la Tabla III. Los datos son
porcentaje de actividad que queda después de la incubación a 37ºC
en EDTA 50 mM durante 60 minutos.
| Aminoácido en la posición 274 | % de actividad | ||
| Leucina | 2% | ||
| Serina | 79% | ||
| Treonina | 91% | ||
| Valina | 42% | ||
| Alanina | 43% |
Las mutaciones en esta posición afectan
claramente a la estabilidad de la enzima. Aunque la mutación de
alanina no era tan estable como la serina o la treonina en esta
posición, esta enzima proporcionó un mejor rendimiento en relación
con la subtilisina de Bacillus lentus bajo las condiciones
de empleo descritas. Para diferentes aplicaciones, pueden usarse
otros aminoácidos en posición 274.
Se preparó un granulado detergente de fosfato
secado por pulverización, de la composición siguiente:
| Componente | % peso | |
| (Alquilo C12 lineal)bencenosulfonato sódico | 8,45 | |
| Alcohol de sebo-sulfato sódico | 4,23 | |
| (Alquilo C14-15 lineal)sulfato sódico | 4,23 | |
| Tolueno-sulfonato sódico | 1,00 | |
| Tripolifosfato sódico | 5,60 | |
| Pirofosfato sódico | 22,40 | |
| Silicato (1,6 r) | 5,50 | |
| Sulfato sódico | 29,83 | |
| Poliacrilato sódico (PM 4500) | 1,17 | |
| Abrillantador | 0,22 | |
| Carbonato sódico | 12,30 | |
| Polietilen-glicol (PM 8000) | 0,47 | |
| (Alcohol C12-13)polietoxilato (6,5)* | 0,50 | |
| Varios + agua | hasta 100% | |
| Proteasa** | 0,034 | |
| * Alcohol y monoetoxilato alcohol eliminados. | ||
| ** mg de enzima activa/g (2,0 mg de enzima activa/g de material) |
Una solución al 0,1 por ciento en peso de esta
composición en agua tenía un pH de 10,0. La composición con mutante
de subtilisina de la invención (Fig. 7) proporcionó una mejor
limpieza de manchas sensibles a enzimas en comparación con
Bacillus lentus a 0,068 mg de enzima activa/g de producto,
en un lavado a 35ºC a una dureza de 102,6 mg/L (3:1 Ca/Mg).
A lo largo de esta solicitud se hace referencia a
varios aminoácidos por medio de códigos comunes de una y tres
letras. Tales códigos se identifican en Proteins: Structures and
Molecular Proteases, Thomas E. Creighton, ed. W.N. Freeman,
N.Y., N.Y. (1983), p.3.
Aunque la forma preferida de la invención ha sido
descrita anteriormente, será evidente para los expertos en la
técnica a la que pertenece la invención que, después de entender la
invención en su conjunto, se pueden hacer varios cambios y
modificaciones equivalentes sin apartarse del alcance de la
invención como se define mediante las reivindicaciones anexas.
Todas las publicaciones se incorporan
expresamente al presente texto como referencia.
Claims (12)
1. Un mutante de carbonil hidrolasa que tiene una
secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que
se deriva de una carbonil hidrolasa precursora sustituyendo por un
aminoácido distinto el resto de aminoácido que está en una
posición, en dicho precursor, equivalente a +274 en la subtilisina
de Bacillus amyloliquefaciens, en donde el mutante tiene una
estabilidad alterada en comparación con la carbonil hidrolasa
precursora.
2. El mutante de carbonil hidrolasa según la
reivindicación 1ª, en el que dicha carbonil hidrolasa precursora es
una subtilisina.
3. El mutante de carbonil hidrolasa según la
reivindicación 2ª, en el que dicha carbonil hidrolasa precursora es
una subtilisina de Bacillus.
4. El mutante de carbonil hidrolasa según una
cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que el mutante
muestra un comportamiento mejorado cuando se usa en una composición
detergente, que se define como el aumento en la capacidad de
limpieza de manchas sensibles a las enzimas, como se determina por
evaluación visual después de un ciclo de lavado estándar.
5. El DNA que codifica un mutante de carbonil
hidrolasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª.
6. Un vector de expresión que incluye el DNA
según la reivindicación 5ª.
7. Células hospedadoras transformadas con el
vector de expresión según la reivindicación 6ª.
8. Un método para preparar un mutante de carbonil
hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que no se
encuentra en la naturaleza, que se deriva de una carbonil hidrolasa
precursora sustituyendo por un aminoácido distinto el resto de
aminoácido que está en una posición en dicho precursor equivalente a
+274 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens,
comprendiendo el método cultivar las células hospedadoras según la
reivindicación 7ª y separar el mutante de carbonil hidrolasa
producido.
9. Una composición enzimática para limpieza
capaz de degradar proteínas, que comprende:
(a) un agente tensioactivo; y
(b) un mutante de carbonil hidrolasa que tiene
una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza,
que se deriva de una carbonil hidrolasa precursora sustituyendo por
un aminoácido distinto el resto de aminoácido que está en una
posición en dicho precursor equivalente a +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, en donde el mutante tiene una
estabilidad alterada en comparación con la carbonil hidrolasa
precursora.
10. La composición según la reivindicación 9ª, en
la que dicha enzima carbonil hidrolasa es una subtilisina.
11. La composición según la reivindicación 9ª o
la reivindicación 10ª, en la que el agente tensioactivo comprende un
detergente.
12. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 9ª a 11ª formulada como gránulo detergente secado
por pulverización.
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