DE69034195T2

DE69034195T2 - Subtilisinmutanten

Info

Publication number: DE69034195T2
Application number: DE69034195T
Authority: DE
Inventors: Robert Mark San Carlos Caldwell; David Aaron Mountain View Estell; Thomas Paul Pacifica Graycar
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1990-10-26
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2010-10-27
Also published as: DK0775749T3; EP0451244B1; DK0451244T3; EP0775749B2; ES2242963T5; KR970004938B1; NO912567L; AU6634190A; DE69034195D1; DE69032852D1; IE903905A1; NZ235883A; NO912567D0; ATE174961T1; EP0775749A1; WO1991006637A1; EP0775749B1; TR25991A; DE69034195T3; FI103052B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue Carbonylhydrolasemutanten mit einer Aminosäuresequenz, in der ein Aminosäurerest einer Vorläufer-Carbonylhydrolase, speziell jener an einer Position, die dem Rest +274 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin entspricht, durch eine unterschiedliche Aminosäure substituiert worden ist. Derartige mutierte Carbonylhydrolasen werden im allgemeinen durch In-vitro-Modifizierung einer Vorläufer-DNA-Sequenz erhalten, welche eine natürlich vorkommende oder rekombinante Carbonylhydrolase kodiert, damit diese die Substitution dieses Aminosäurerestes in einer Vorläufer-Aminosäuresequenz allein oder in Kombination mit weiterer Substitution, Insertion oder Deletion in der Vorläufer-Aminosäuresequenz kodiert.
Hintergrund der Erfindung
Serinproteasen sind eine Untergruppe von Carbonylhydrolasen. Sie umfassen eine vielfältige Klasse von Enzymen mit einer großen Vielzahl von Spezifitäten und biologischen Funktionen. Stroud, R. M. (1974), Sci. Amer., 131, 74–88. Trotz ihrer funktionellen Diversität wurde die katalytische Maschinerie von Serinproteasen durch mindestens zwei genetisch unterschiedliche Familien von Enzymen realisiert: durch die Subtilisine und die mit Säugetier-Chymotrypsin verwandten und homologen bakteriellen Serinproteasen (z.B. Trypsin und S. gresius-Trypsin). Diese zwei Familien von Serinproteasen zeigen bemerkenswert ähnliche Katalysemechanismen. Kraut J. (1977), Ann. Rev. Biochem., 46, 331–358. Obwohl darüber hinaus die Primärstrukturen keine Verwandtschaft zeigen, bringt die Tertiärstruktur dieser zwei Enzymfamilien eine konservierte katalytische Triade von Aminosäuren, bestehend aus Serin, Histidin und Aspartat, zusammen.
Subtilisin ist eine Serin-Endoprotease (MG 27500), die in großen Mengen von einer großen Vielzahl von Bacillus-Spezies und anderen Mikroorganismen sezerniert wird. Die Proteinsequenz von Subtilisin ist aus mindestens vier verschiedenen Bacillus-Spezies bestimmt worden. Markland, F. S., et al. (1983), Honne-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537–1540. Es ist auch die dreidimensionale Kristallstruktur von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin mit 2,5 X-Auflösung veröffentlicht worden. Wright, C. S., et al. (1969), Nature, 221, 235–242; Drenth, J., et al. (1972), Eur. J. Biochem., 26, 177–181. Diese Studien zeigen, daß, obwohl Subtilisin genetisch mit den Serinproteasen der Säugetiere nicht verwandt ist, es eine ähnliche Struktur des aktiven Zentrums aufweist. Die Röntgen-Kristailstrukturen von Subtilisin, das kovalent gebundene Peptid-Inhibitoren enthält (Robertus, J. D., et al. (1972), Biochemistry, 11, 2439–2449), oder von Komplexen mit dem Produkt (Robertus, J. D., et al. (1976), J. Biol. Chem., 251, 1097–1103) haben gleichfalls Informationen bezüglich des aktiven Zentrums und der mutmaßlichen Substratbindungsspalte von Subtilisin geliefert. Zusätzlich ist über eine große Anzahl kinetischer und chemischer Modifizierungsstudien für Subtilisin berichtet worden (Philipp, M., et al. (1983), Mol. Cell. Biochem., 51, 5–32; Svendsen, B. (1976), Carlsberg Res. Comm., 41, 237–291; Markland, F. S. Id.), wie es auch mindestens einen Bericht gab, in dem die Seitenkette von Methionin an Rest 222 von Subtilisin durch Wasserstoffperoxid in Methioninsulfoxid umgewandelt worden ist (Stauffer, B. C., et al. (1965), J. Biol. Chem., 244, 5333–5338) und die Seitenkette von Serin an Rest 221 durch chemische Modifizierung in Cystein umgewandelt worden ist (Polgar, et al. (1981), Biochimica et Biophysica Acta, 667, 351–354).
Das U.S.-Patent Nr. 4,760,025 und die EP-Veröffentlichung Nr. 0 130 756, veröffentlicht am 9. Januar 1985, offenbaren jeweils die Modifizierung von Aminosäureresten von Subtilisin entsprechend den Positionen Tyrosin –1, Aspartat +32, Asparagin +155, Tyrosin +104, Methionin +222, Glycin +166, Histidin +64, Glycin +169, Phenylalanin +189, Serin +33, Serin +221, Tyrosin +217, Glutamat +156 und Alanin +152 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin. Die EP-Veröffentlichung Nr. 0 251 446, veröffentlicht am 7. Januar 1988, offenbart andere Aminosäurereste in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin und deren Äquivalente, die mittels Substitution, Insertion oder Deletion modifiziert werden können und die mit Modifizierungen an den in dem U.S.-Patent Nr. 4,760,025 genannten Resten kombiniert werden können, um nützliche Subtilisinmutanten herzustellen. Die hier identifizierten speziellen Reste werden in diesen Druckschriften jedoch nicht genannt.
In ähnlicher Weise offenbaren die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/09819 und WO 89/09830, jeweils veröffentlicht am 19. Oktober 1989, und die PCT-Veröffentlichung WO 89/06279, veröffentlicht am 13. Juli 1989, Subtilisin-Enzyme, die durch Mutieren einer Nukleotidsequenz, die ein Subtilisin kodiert, hergestellt worden sind. Es werden zahlreiche Aminosäurereste in jeder dieser Veröffentlichungen genannt, die derart modifiziert werden können. Jedoch nennt wie bei den vorher genannten Druckschriften keine von diesen die Reste der vorliegenden Erfindung.
Weiter beschreibt die WO 89/06279 Subtilisinmutanten, die veränderte Eigenschaften, wie eins erhöhte Oxidationsstabilität, Aktivität und Waschbarkeit besitzen. Spezifische Mutanten von B. lentus-Subtilisin Varianten 247 und 309 werden beschrieben. Wie zuvor werden die Reste der vorliegenden Erfindung in dieser Druckschrift nicht angegeben.
Dementsprechend ist ein Ziel hierin, Carbonylhydrolasemutanten bereitzustellen, die die Substitution von Aminosäureresten in einer Vorläufer-Carbonylhydrolase umfassen, welche der Position +274 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin entsprechen. Derartige Mutanten haben im allgemeinen mindestens eine Eigenschaft, die sich von der gleichen Eigenschaft des Carbonylhydrolase-Vorläuferenzyms, von dem die Aminosäure der Mutante abgeleitet ist, unterscheidet.
Es ist ein weiteres Ziel, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die derartige Carbonylhydrolasemutanten kodieren, wie auch Expressionsvektoren, die derartige mutierte DNA-Sequenzen enthalten.
Es ist noch ein weiteres Ziel, Wirtszellen bereitzustellen, die mit derartigen Vektoren transformiert worden sind, wie auch Wirtszellen, die in der Lage, sind, derartige DNA zu exprimieren, um Carbonylhydrolasemutanten entweder intrazellulär oder extrazellulär zu erzeugen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfaßt natürlich nicht vorkommende Carbonylhydrolasemutanten mit einer unterschiedlichen Stabilitäts- und/oder Leistungsfähigkeitscharakteristik im Vergleich zu der Vorläufer-Carbonylhydrolase, von der die Aminosäuresequenz der Mutante abgeleitet ist. Die Vorläufer-Carbonylhydrolase kann eine natürlich vorkommende Carbonylhydrolase oder eine rekombinante Hydrolase sein. Speziell haben derartige Carbonylhydrolasemutanten eine Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht gefunden wird und die durch Ersetzen eines Aminosäurerestes einer Vorläufer-Carbonylhydrolase durch eine unterschiedliche Aminosäure abgeleitet ist. Der Aminosäurerest des Vorläuferenzyms entspricht der Position Ala +274 von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin oder äquivalenten Aminosäureresten in anderen Carbonylhydrolasen oder Subtilisinen.
Die Erfindung umfaßt auch mutierte DNA-Sequenzen, die derartige Carbonylhydrolase- oder Subtilisinmutanten kodieren.
Diese mutierten DNA-Sequenzen sind von einer Vorläufer-DNA-Sequenz abgeleitet, die ein natürlich vorkommendes oder rekombinantes Vorläuferenzym kodiert. Die mutierten DNA-Sequenzen werden abgeleitet, indem die Vorläufer-DNA-Sequenz modifiziert wird, so daß sie die Substitution von einem speziellen Aminosäurerest kodiert, der durch die Vorläufer-DNA-Sequenz kodiert wird, die der Position +274 in Bacillus amyloliquefaciens entspricht. Diese rekombinanten DNA-Sequenzen kodieren Carbonylhydrolasemutanten mit einer neuen Aminosäuresequenz und im allgemeinen mit mindestens einer Eigenschaft, die sich wesentlich von der gleichen Eigenschaft des Enzyms, das durch die Vorläufer-Carbonylhydro-lase-DNA-Sequenz kodiert wird, unterscheidet. Derartige Eigenschaften umfassen Stabilitäts- und/oder verbesserte Leistungsfahigkeitscharakteristika.
Die Erfindung umfaßt auch prokaryotische und eukaryotische Subtilisine mit einem unterschiedlichen Aminosäurerest, wie Serin, an Positionen, die zu Position +274 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent sind.
Ferner umfaßt die Erfindung Expressionsvektoren, die derartige mutierte Carbonylhydrolase-DNA-Sequenzen enthalten, wie auch Wirtszellen, die mit derartigen Vektoren, die in der Lage sind, derartige Mutanten zu erzeugen, transformiert worden sind. Die Erfindung betrifft auch Detergenszusammensetzungen, die die Carbonylhydrolasemutanten der Erfindung umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz für Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin und eine partielle Restriktionskarte dieses Gens.
2 zeigt die bei Subtilisinen aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis varI168 und Bacillus licheniformis (carlsbergensis) konservierten Aminosäurereste.
Die 3A und 3B zeigen die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis varI168 und Bacillus licheniformis.
4 zeigt die Aminosäuresequenz von drei Subtilisinen. Die obere Zeile stellt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin (manchmal auch als Subtilisin BPN' bezeichnet) dar. Die zweite Zeile zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus lentus (Subtilisin 309 in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/06279). Die untere Zeile stellt die Aminosäuresequenz einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die als GG-RYSA bezeichnet wird, dar. Das Symbol bezeichnet das Fehlen spezieller Aminosäurereste im Vergleich zu Subtilisin BPN'.
5 zeigt die Konstruktion des Plasmids pGG A274.
6 zeigt die Konstruktion von pGG-KVNA, das ein Zwischenprodukt bezüglich des Plasmids pGG-RYSA ist.
7 zeigt das zur Konstruktion eines synthetischen Bacillus lentus-Subtilisingens verwendete Oligonukleotid-Doppelstrang („oligonucleotide-duplex")-Verfahren.
8 zeigt die Strategie für die Konstruktion eines synthetischen Gens, das Bacillus lentus-Subtilisin kodiert.
9 zeigt die Kassette, die zur Erzeugung von Substitutionen in der DNA an der Codonposition +123 durch Kassetten-Mutagenese verwendet worden ist. XXX steht für das Codon, das modifiziert worden ist, so daß es die Aminosäuresubstitutionen an Position +123 kodiert.
10 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in der die DNA-Sequenz eine synthetische DNA ist. Die DNA in dieser Figur ist so modifiziert worden, daß sie Arginin an Position 27, Serin an Position 78, Tyrosin an Position 104, Serin an Position 123 und Alanin an Position 274 kodiert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es ist entdeckt worden, daß In-vitro-Mutationen in der Carbonylhydrolase Subtilisin an einem Aminosäurerest, der äquivalent ist zu +123 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, Subtilisinmutanten erzeugen, die gegenüber Vorläufer-Subtilisinen veränderte proteolytische Aktivität aufweisen.
Es ist auch entdeckt worden, daß eine In-vitro-Mutation an Resten, die äquivalent sind zu +274 in Bacillus amylolique-faciens-Subtilisin, Subtilisinmutanten erzeugen, die eine veränderte Stabilität, z.B. eine modifizierte autoproteolytische Stabilität, aufweisen. In einigen Fällen zeigen diese letztgenannten Mutanten auch eine verbesserte Leistungsfähigkeit, wenn sie in Detergenszusammensetzungen verwendet werden.
Carbonylhydrolasen sind Enyzme, die Verbindungen hydrolysieren, die
Bindungen enthalten, in denen X Sauerstoff oder Stickstoff ist. Sie umfassen natürlich vorkommende Carbonylhydrolasen und rekombinante Carbonylhydrolasen. Natürlich vorkommende Carbonylhydrolasen umfassen im Prinzip Hydrolasen, z.B. Peptidhydrolasen, wie Subtilisine oder Metalloproteasen. Peptidhydrolasen umfassen α-Aminoacylpeptidhydrolase, Peptidylaminosäurehydrolase, Acylaminohydrolase, Serincarboxypeptidase, Metallocarboxypeptidase, Thiolproteinase, Carboxylproteinase und Metalloproteinase. Serin-, Metallo-, Thiolproteasen und saure Proteanen wie auch Endo- und Exoproteasen sind mit umfaßt.
„Rekombinante Carbonylhydrolase" bezieht sich auf eine Carbonylhydrolase, bei der die DNA-Sequenz, die die natürlich vorkommende Carbonylhydrolase kodiert, unter Erzeugung einer mutierten DNA-Sequenz modifiziert ist, welche die Substitution, Insertion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Carbonylhydrolase kodiert. Geeignete Modifizierungsverfahren sind hier, in der EP-Veröffentlichung Nr. 0 130 756, veröffentlicht am 09. Januar 1985, und in der EP-Veröffentlichung Nr. 0 251 446, veröffentlicht am 07. Januar 1988, offenbart.
Subtilisine sind bakterielle oder fungale Carbonylhydrolasen, die im allgemeinen wirksam sind, indem sie Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden spalten. Wie hier verwendet, bedeutet „Subtilisin" ein natürlich vorkommendes Subtilisin oder ein rekombinantes Subtilisin. Eine Reihe natürlich vorkommender Subtilisine wird bekanntermaßen durch verschiedene mikrobielle Spezies erzeugt und oftmals sezerniert. Die Aminosäuresequenzen der Mitglieder dieser Reihe sind nicht vollständig homolog. Jedoch zeigen die Subtilisine dieser Reihe den gleichen oder einen ähnlichen Typ proteolytischer Aktivität. Dieser Klasse von Sernproteasen ist gemeinsam, daß sie eine gemeinsame Aminosäuresequenz aufweist, die eine katalytische Triade definiert, welche sie von der mit Chymotrypsin verwandten Klasse von Serinproteasen unterscheidet. Die Subtilisine und die mit Chymotrypsin verwandten Serinproteasen weisen beide eine katalytische Triade, umfassend Aspartat, Histidin und Serin, auf. Bei den mit Subtilisin verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge dieser Aminosäuren, gelesen vom Amino- zum Carboxyterminus, Aspartat-Histidin-Serin. In den mit Chymotrypsin verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge jedoch Histidin-Aspartat-Serin. Dementsprechend bezieht sich Subtilisin hier auf eine Serinprotease, die die katalytische Triade von mit Subtilisin verwandten Proteasen aufweist. Beispiele umfassen die hier in 3 aufgeführten Subtilisine und Subtilisine, wie sie in der PCT-Veröffentlichung WO 89/06276 und in der EP-Veröffentlichung Nr. 0 283 075 beschrieben werden.
„Rekombinantes Subtilisin" bezieht sich auf ein Subtilisin, in dem die das Subtilisin kodierende DNA-Sequenz modifiziert ist, um eine mutierte DNA-Sequenz zu erzeugen, die die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden Subtilisins kodiert. Geeignete Verfahren zur Erzeugung derartiger Modifikationen, welche mit den hier offenbarten kombiniert werden können, umfassen jene, die in den EP-Veröffentlichungen Nr. 0 130 756 und 0 251 446 und in den PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 89/06279, WO 89/09830 und WO 89/09819 offenbart worden sind.
„Nicht-menschliche Carbonylhydrolasen" und die sie kodierende DNA können aus vielen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen erhalten werden. Geeignete Beispiele prokaryotischer Organismen umfassen gram-negative Organismen, wie E. coli oder Pseudomonas, und gram-positive Bakterien, wie Micrococcus oder Bacillus. Beispiele für eukaryotische Organismen, aus denen Carbonylhydrolase und deren Gene erhalten werden können, umfassen Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, Pilze, wie Aspergillus sp., und nicht-menschliche Säugetierquellen, wie beispielsweise Rinder sp., aus denen das die Carbonylhydrolase Chymosin kodierende Gen erhalten werden kann. Wie bei Subtilisinen kann eine Reihe von Carbonylhydrolasen aus verschiedenen verwandten Spezies erhalten werden, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die zwischen den Mitgliedern dieser Reihe nicht vollständig homolog sind, die aber nichtsdestoweniger den gleichen oder einen ähnlichen Typ biologischer Aktivität zeigen. Dementsprechend hat nicht-menschliche Carbonylhydrolase, wie hier verwendet, eine funktional Definition, die sich auf Carbonylhydrolasen bezieht, die direkt oder indirekt mit prokaryotischen und eukaryotischen Quellen assoziiert sind.
Eine „Carbonylhydrolasemutante" hat eine Aminosäuresequenz, die von der Aminosäuresequenz einer „Vorläufer-Carbonylhydrolase" abgeleitet ist. Die Vorläufer- Carbonylhydrolasen umfassen natürlich vorkommende Carbonylhydrolasen und rekombinante Carbonylhydrolasen. Die Aminosäuresequenz der Carbonylhydrolasemutante ist von der Aminosäuresequenz der Vorläufer-Hydrolase durch die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäure(n) der Vorläufer-Aminosäuresequenz „abgeleitet". Eine derartige Modifizierung erfolgt eher an der „Vorläufer-DNA-Sequenz", die die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Carbonylhydrolase kodiert, als durch Manipulation des Vorläufer-Carbonylhydrolaseenzyms per se. Geeignete Verfahren für eine derartige Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz umfassen Verfahren, die hier und in den EP-Veröffentlichungen Nr. 0 130 756 und 0 251 446 offenbart sind.
Spezielle Reste, die den Positionen +123 und +274 von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin entsprechen, werden hier für eine Substitution angegeben. Diese Aminosäurepositionsnummem beziehen sich auf jene, die der reifen Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisinsequenz, die in 1 dargestellt ist, zugeordnet wurden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Mutation dieses speziellen Subtilisins beschränkt, sondern erstreckt sich auf Vorläufer-Carbonylhydrolasen, die Aminosäurereste an Positionen enthalten, die „äquivalent" sind zu den jeweils genannten Resten in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin.
Ein Rest (Aminosäure) einer Vorläufer-Carbonylhydrolase ist äquivalent zu einem Rest von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, wenn er entweder homolog (d.h. er entspricht diesem hinsichtlich der Position entweder in der Primär- oder der Tertiärstruktur) oder analog zu einem speziellen Rest oder Teil dieses Rests in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin (d.h. er hat die gleiche oder eine ähnliche funktionale Fähigkeit, chemisch sich zu vereinigen, zu reagieren oder zu wechselwirken) ist.
Um eine Homologie hinsichtlich der Primärstruktur zu ermitteln, wird die Aminosäuresequenz einer Vorläufer-Carbonylhydrolase direkt mit der Primärsequenz des Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisins und insbesondere mit einem Satz von Resten verglichen, der bekanntermaßen in sämtlichen Subtilisinen unverändert ist, für die die Sequenz bekannt ist (2). Nach der gegenseitigen Zuordnung der konservierten Reste, wobei erforderliche Insertionen und Deletionen ermöglicht werden, um eine Zuordnung aufrechtzuerhalten (d.h. wobei die Eliminierung konservierter Rest durch willkürliche Deletion und Insertion vermieden wird), werden die zu bestimmten Aminosäuren in der Primärsequenz von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalenten Reste definiert.
Eine gegenseitige Zuordnung konservierter Reste sollte vorzugsweise 100% derartiger Reste konservieren. Jedoch ist auch eine gegenseitige Zuordnung von mehr als 75% oder von auch nur 50% der konservierten Reste gleichfalls adäquat, um äquivalente Reste zu definieren. Eine Konservierung der katalytischen Triade Asp32/His64/Ser221 sollte beibehalten werden.
Beispielsweise werden in 3 die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis var. I168 und Bacillus licheniformis (carlsbergensis) einander zugeordnet, um die größtmögliche Menge an Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen zu erzielen. Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt, daß in jeder Sequenz eine Anzahl von konservierten Resten enthalten ist. Diese sind die in 2 aufgeführten Reste.
Diese konservierten Reste können folglich verwendet werden, um die entsprechenden äquivalenten Aminosäurereste von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin in anderen Carbonylhydrolasen, wie Subtilisin aus Bacillus lentus (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/06279, veröffentlicht am 13. Juli 1989), und der hier bevorzugten Subtilisinmutante zu definieren. Diese besonderen Aminosäuresequenzen sind in 4 der Sequenz von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin in Form eines Alignment zugeordnet, um die größtmögliche Homologie konservierter Reste zu erzeugen. Wie festgestellt werden kann, gibt es eine Anzahl von Deletionen in der Sequenz von Bacillus lentus und in der bevorzugten Subtilisinmutante der Erfindung im Vergleich zu Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin. Folglich ist die äquivalente Aminosäure für Val-165 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin in den anderen Subtilisinen das jeweilige Isoleucin, das unter Val-165 aufgeführt ist.
In 4 ist die Aminosäure an Position 123 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin Asparagin. In Bacillus lentus-Subtilisin ist der äquivalente Rest das spezielle aufgeführte Asparagin. In einer Subtilisinmutante ist jedoch die zu +123 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalente Aminosäure eine andere Aminosäure als Asparagin und ist vorzugsweise das in 4 gezeigte Serin. In ähnlicher Weise ist in 4 die Aminosäure an Position +274 von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin Alanin. Wie festgestellt werden kann, ist die äquivalente Aminosäure in Bacillus lentus-Subtilisin das spezielle in 4 gezeigte Threonin. In einer besonders bevorzugten Subtilisinmutante der Erfindung wird die äquivalente Aminosäureposition 274 durch das in 4 gezeigte Alanin eingenommen.
Folglich werden die Positionen +123 und +274 durch primäre Aminosäuresequenzen in 4 für das Subtilisin aus Bacillus lentus und die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung angegeben. Jedoch können verschiedene andere Aminosäurereste modifiziert werden, die äquivalent zu speziellen Aminosäuren in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin sind. Dementsprechend entspricht in der bevorzugten Ausführungsform der Aminosäure Lysin an Position 27 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin ein äquivalentes Lysin an Position 27 in Bacillus lentus-Subtilisin. Wie in den Beispielen angegeben, wurde das eine der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfassende Subtilisin abgeleitet, indem eine Bacillus lentus-Subtilisin kodierende DNA-Sequenz modifiziert wurde. Derartige Modifizierungen der DNA umfaßten die Modifizierungen von zu den Positionen 123 und 274 von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalenten Codons. Jedoch wurden zwei andere Modifikationen an der Aminosäuresequenz aus Bacillus lentus an Positionen, äquivalent zu den Resten 27 und 104 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, vorgenommen. Wie in 4 ersehen werden kann, wurde entsprechend das zu Rest 27 in Bacillus lentus-Subtilisin äquivalente Lysin modifiziert, so daß es in der bevorzugten Ausführungsform Arginin kodiert. In ähnlicher Weise wurde auch der Valinrest an Position 104 von Bacillus lentus, der äquivalent zu Tyrosin 104 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin ist, modifiziert, so daß er Tyrosin kodiert. Folglich enthält die in 4 gezeigte bevorzugte Ausführungsform eine Aminosäuresequenz, die von Bacillus lentus-Subtilisin abgeleitet ist, indem Reste jenes Subtilisins äquivalent zu den Positionen 27, 104, 123 und 274 von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin modifiziert wurden.
Äquivalente Reste können auch definiert werden, indem die Homologie auf der Ebene der Tertiärstruktur für eine Vorläufer-Carbonylhydrolase, deren Tertiärstruktur durch Röntgenkristallographie ermittelt worden ist, bestimmt wird. Äquivalente Reste sind als jene definiert, für die sich die Atomkoordinaten von zwei oder mehreren Atomen der Hauptkette eines bestimmten Aminosäurerests der Vorläufer-Carbonylhydrolase und von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin (N an N, CA an CA, C an C und O an O) innerhalb von 0,13 nm und vorzugsweise von 0,1 nm nach einer Parallelanordnung (Alignment) befinden. Eine Parallelanordnung (Alignment) wird erzielt, nachdem das beste Modell ausgerichtet und positioniert worden ist, um die maximale Überlappung von Atomkoordinaten von Nicht-Wasserstoff-Proteinatomen der jeweiligen Carbonylhydrolase mit dem Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin zu erzielen. Das beste Modell ist das kristallographische Modell, das den niedrigsten R-Faktor für experimentelle Beugungsdaten bei der höchsten verfügbaren Auflösung liefert.
Äquivalente Reste, die funktional analog zu einem speziellen Rest von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin sind, sind als jene Aminosäuren der Vorläufer-Carbonylhydrolasen definiert, die eine derartige Konformation annehmen können, daß sie in einer definierten Weise, welche einem speziellen Rest des Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisins zugeschrieben wird, die Proteinstruktur, Substratbindung oder Katalyse entweder verändern, modifizieren oder unterstützen. Ferner sind sie jene Reste der Vorläufer-Carbonylhydrolase (für welche durch Röntgenkristallographie eine Tertiärstruktur erhalten worden ist), welche eine analoge Position in dem Ausmaß einnehmen, daß, obwohl die Hauptkettenatome des gegebenen Rests die Äquivalenzkriterien basierend auf dem Einnehmen einer homologen Position unter Umständen nicht erfüllen, die Atomkoordinaten von mindestens zwei der Seitenkettenatome des Restes innerhalb von 0,13 nm zu den entsprechenden Seitenkettenatomen von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin liegen. Die Koordinaten der dreidimensionalen Struktur von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin sind in der EP-Veröffentlichung Nr. 0 251446 angegeben und können wie vorstehend ausgeführt verwendet werden, um äquivalente Reste auf der Ebene der Tertiärstruktur zu bestimmen.
Einige der hinsichtlich einer Substitution, Insertion oder Deletion identifizierten Reste sind konservierte Reste, wohingegen andere dies nicht sind. Im Falle von Resten, die nicht konserviert sind, ist der Ersatz von einer oder mehreren Aminosäuren auf Substitutionen beschränkt, die eine Mutante erzeugen, welche eine Aminosäuresequenz hat, die nicht einer in der Natur gefundenen Aminosäuresequenz entspricht. Im Falle von konservierten Resten sollten derartige Ersetzungen nicht zu einer in der Natur vorkommenden Sequenz führen. Die Carbonylhydrolasemutanten der Erfindung umfassen die reifen Formen von Carbonylhydrolasemutanten ebenso wie die Pro- und Präpro-Formen derartiger Hydrolasemutanten. Die Präpro-Formen sind das bevorzugte Konstrukt, da diese die Expression, Sekretion und Reifung der Carbonylhydrolasemutanten vereinfachen.
„Prosequenz" bezieht sich auf eine Sequenz von Aminosäuren, die an den N-terminalen Abschnitt der reifen Form einer Carbonylhydrolase gebunden ist und die, wenn sie entfernt wird, zum Auftreten der „reifen" Form der Carbonylhydrolase führt. Viele proteolytische Enzyme werden in der Natur als translationale Proenzym-Produkte gefunden und werden in Abwesenheit einer posttranslationalen Prozessierung auf diese Weise exprimiert. Eine bevorzugte Prosequenz zum Herstellen von Carbonylhydrolasemutanten, speziell Subtilisinmutanten, ist die mutmaßliche Prosequenz von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, obwohl andere Subtilisin-Prosequenzen verwendet werden können. In den Beispielen wurde die mutmaßliche Prosequenz des Subtilisins aus Bacillus lentus (ATCC 21536) verwendet.
Eine „Signalsequenz" oder „Prösequenz" bezieht sich auf eine jede Sequenz von Aminosäuren, die an den N-terminalen Abschnitt einer Carbonylhydrolase oder an den N-terminalen Abschnitt einer Prohydrolase gebunden ist und die sich an der Sekretion der reifen Form oder von Pro-Formen der Hydrolase beteiligt. Diese Definition einer Signalsequenz ist eine funktionale, die alle jene Aminosäuresequenzen umfassen soll, die durch den N-terminalen Abschnitt des Subtilisingens oder anderer sezernierbarer Carbonylhydrolasen kodiert werden und sich an der Realisierung der Sekretion von Subtilisin oder anderen Carbonylhydrolasen unter nativen Bedingungen beteiligen. Die Erfindung nutzt derartige Sequenzen, um die Sekretion der Carbonylhydrolasemutanten, wie hier definiert, zu bewirken. Eine in den Beispielen verwendete bevorzugte Signalsequenz umfaßt die ersten sieben Aminosäurereste der Signalsequenz von Bacillus subtilis-Subtilisin, die mit dem Rest der Signalsequenz des Subtilisins aus Bacillus lentus (ATCC 21536) fusioniert sind.
Eine „Präpro"-Form einer Carbonylhydrolasemutante besteht aus der reifen Form der Hydrolase mit einer Prosequenz, die in funktionaler Weise mit dem Aminoterminus der Hydrolase verknüpft ist, und einer „Prä-" oder „Signal"sequenz, die in funktionaler Weise mit dem Aminoterminus der Prosequenz verknüpft ist.
„Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die in funktionaler Weise mit einer geeigneten Kontrollsequenz verknüpft ist, welche in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Derartige Kontrollsequenzen umfassen einen Promotor, um eine Transkription zu bewirken, eine gegebenenfalls vorhandene Operatorsequenz, um eine derartige Transkription zu kontrollieren, eine geeignete mRNA-Ribosomen-Bindungsstellen kodierende Sequenz und Sequenzen, die die Termination von Transkription und Translation kontrollieren. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenteilchen oder einfach ein potentielles genomisches Insert sein. Wenn ein geeigneter Wirt einmal damit transformiert worden ist, kann der Vektor sich unabhängig von dem Wirtsgenom replizieren und funktionieren oder kann sich in einigen Fällen in das Genom selbst integrieren. in den vorliegenden Unterlagen werden „Plasmid" und „Vektor" manchmal austauschbar verwendet, da das Plasmid gegenwärtig die am häufigsten verwendete Form von Vektoren darstellt. Jedoch soll die Erfindung solche andere Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalenten Funktionen dienen und die im Stand der Technik bekannt sind oder bekannt werden.
Die in der Erfindung verwendeten „Wirtszellen" sind im allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, die vorzugsweise durch die in der EP-Veröffentlichung Nr. 0130 756 offenbarten Methoden manipuliert worden sind, um diese unfähig zu machen, enzymatisch aktive Endoprotease zu sezernieren. Eine bevorzugte Wirtszelle zum Exprimieren von Subtilisin ist der Bacillus-Stamm BG2036, der defizient hinsichtlich enzymatisch aktiver neutraler Protease und alkalischer Protease (Subtilisin) ist. Die Konstruktion des Stammes BG2036 wird im Detail in der EP-Veröffentlichung Nr. 0 130 756 und weiter durch Yang, M. Y., et al. (1984), J. Bacteriol., 160, 15–21, beschrieben. Andere Wirtszellen zum Exprimieren von Subtilisin umfassen Bacillus subtilis I168 (EP-Veröffentlichung Nr. 0130 756).
Wirtszellen werden mit unter Einsatz von rekombinanten DNA-Techniken konstruierten Vektoren transformiert oder transfiziert. Derartige transformierte Wirtszellen sind in der Lage, entweder Vektoren zu replizieren, die die Carbonylhydrolasemutanten kodieren, oder die gewünschte Carbonylhydrolasemutante zu exprimieren. Im Falle von Vektoren, die die Prä- oder Präpro-Form der Carbonylhydrolasemutante kodieren, werden derartige Mutanten, wenn sie exprimiert werden, typisch aus der Wirtszelle in das Wirtszellmedium sezerniert.
„In funktionaler Weise verknüpft" („operably linked") bedeutet einfach, wenn es die Beziehung zwischen zwei DNA-Abschnitten beschreibt, daß diese in funktionaler Beziehung zueinander stehen. Beispielsweise ist eine Präsequenz funktional mit einem Peptid verknüpft, wenn sie als Signalsequenz wirksam wird, die sich an der Sekretion der reifen Form des Proteins beteiligt, welche höchstwahrscheinlich eine Abspaltung der Signalsequenz umfaßt. Ein Promotor ist funktional mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; eine Ribosomenbindungsstelle ist funktional mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so angeordnet ist, daß sie eine Translation ermöglicht.
Die die natürlich vorkommende Vorläufer-Carbonylhydrolase kodierenden Gene können gemäß den allgemeinen Verfahren, die in den EP-Veröffentlichungen Nr. 0 130 756 und 0 251 446 beschrieben worden sind, erhalten werden. Wie aus den darin offenbarten Beispielen ersehen werden kann, umfassen die Verfahren allgemein, markierte Sonden zu synthetisieren, die mutmaßlich Sequenzen aufweisen, welche Abschnitte der interessierenden Hydrolase kodieren, genomische Bibliotheken aus Organismen herzustellen, die die Hydrolase exprimieren, und die Bibliotheken hinsichtlich des interessierenden Gens durch Hybridisierung mit den Sonden zu screenen. Positiv hybridisierende Klone werden dann kartiert und sequenziert.
Die klonierte Carbonylhydrolase wird dann verwendet, um eine Wirtszelle zu transformieren, um die Hydrolase zu exprimieren. Das Hydrolasegen wird dann in ein „High copy number"-Plasmid ligiert. Dieses Plasmid repliziert sich in Wirten in dem Sinne, daß es die wohlbekannten, für die Plasmidreplikation erforderlichen Elemente enthält: einen funktional mit dem jeweiligen Gen verknüpften Promotor (der als der eigene homologe Promotor des Gens bereitgestellt werden kann, wenn er durch den Wirt erkannt, d.h. transkribiert wird), einen Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungsabschnitt (in bestimmten eukaryotischen Wirtszellen erforderlich für die Stabilität der durch den Wirt von dem Hydrolasegen transkribierten mRNA), der exogen ist oder durch die endogene Terminationsregion des Hydrolasegens bereitgestellt wird, und, wünschenswerterweise, ein Selektionsgen, wie ein Antibiotika-Resistenzgen, das eine kontinuierliche Züchtung oder Aufrechterhaltung Plasmid-infizierter Wirtszellen durch Züchtung in Antibiotika enthaltendem Medium ermöglicht. „High copy number"-Plasmide enthalten auch einen Replikationsursprung für den Wirt, wodurch ermöglicht wird, daß große Anzahlen von Plasmiden im Zytoplasma ohne chromosomale Beschränkungen erzeugt werden. Jedoch ist hier auch mit umfaßt, eine Mehrzahl von Kopien des Hydrolasegens in das Wirtsgenom zu integrieren. Dies wird durch prokaryotische und eukaryotische Organismen erleichtert, die besonders zu homologer Rekombination neigen.
Alternativ kann ein eine natürlich vorkommende oder mutierte Vorläufer-Carbonylhydrolase kodierendes synthetisches Gen erzeugt werden. Bei einer solchen Strategie wird die DNA-und/oder Aminosäuresequenz der Vorläufer-Hydrolase bestimmt. Eine Mehrzahl von überlappenden synthetischen einzelsträngigen DNA-Fragmenten wird danach synthetisiert, die bei Hybridisierung und Ligation eine die Vorläufer-Hydrolase kodierende synthetische DNA produzieren. Diese Strategie liefert mehrere Vorteile gegenüber einer Klonierung des natürlichen Gens, indem ohne Änderung der kodierten Aminosäuresequenz Restriktionsschnittstellen innerhalb der DNA eingebracht werden können, wodurch eine nachfolgende Modifizierung zur Bildung der mutierten Carbonylhydrolasen erleichtert wird. Ferner ermöglicht die Synthese-Strategie, die Codonenverwendung in dem synthetischen Gen anzupassen, damit sie mit den Codonenpräferenzen der jeweiligen zu verwendenden Expressionswirte übereinstimmt. Ein Beispiel einer Konstruktion eines synthetischen Gens wird in den Beispielen aufgeführt.
Ist das natürlich vorkommende oder synthetische Vorläufer-Carbonylhydrolasegen einmal kloniert, werden eine Anzahl von Modifizierungen vorgenommen, um die Verwendung des Gens über die Synthese der natürlich vorkommenden Vorläufer-Carbonylhydrolase hinaus zu verstärken. Derartige Modifikationen umfassen die Produktion von rekombinanten Carbonylhydrolasen, wie in den EP-Veröffentlichungen Nr. 0 130 756 und 0 251 446 offenbart, und die hier beschriebene Produktion von Carbonylhydrolasemutanten.
Das folgende Kassettenmutagenese-Verfahren kann verwendet werden, um die Konstruktion und Identifizierung der Carbonylhydrolasemutanten der Erfindung zu vereinfachen, obwohl andere Verfahren, einschließlich ortsgerichteter Mutagenese, verwendet werden können. Zuerst wird das natürlich vorkommende Gen, das die Hydrolase kodiert, gewonnen und vollständig oder teilweise sequenziert. Dann wird die Sequenz hinsichtlich einer Stelle durchgesehen, an der es gewünscht wird, eine Mutation (Deletion, Insertion oder Substitution) einer oder mehrerer Aminosäuren in dem kodierten Enzym vorzunehmen. Die diese Stelle flankierenden Sequenzen werden hinsichtlich des Vorliegens von Restriktionsschnittstellen zum Ersetzen eines kurzen Abschnitts des Gens durch einen Oligonukleotid-Pool, der bei einer Expression verschiedene Mutanten kodiert, ausgewertet. Derartige Restriktionsschnittstellen sind vorzugsweise einmalig vorkommende Stellen innerhalb des Hydrolasegens, um das Ersetzen des Genabschnitts zu erleichtern. Jedoch kann jede geeignete Restriktionsschnittstelle, die nicht übermäßig redundant in dem Hydrolasegen vorliegt, verwendet werden, vorausgesetzt, daß die durch Restriktionsverdau erzeugten Genfragmente in einer geeigneten Sequenz erneut zusammengefügt werden können. Wenn Restriktionsschnittstellen an Orten innerhalb einer geeigneten Entfernung von der ausgewählten Stelle (10 bis 15 Nukleotide) nicht vorliegen, werden derartige Stellen durch Substituieren von Nukleotiden in dem Gen auf solche Weise erzeugt, daß weder das Leseraster noch die kodierten Aminosäuren in dem endgültigen Konstrukt geändert werden. Eine Mutation des Gens, um dessen Sequenz zu verändern, damit sie mit der gewünschten Sequenz übereinstimmt, wird durch M13-Primer-Extension gemäß allgemein bekannten Verfahren bewerkstelligt. Die Aufgabe, geeignete flankierende Regionen zu lokalisieren und die erforderlichen Änderungen auszuwerten, um zu zwei geeigneten Restriktionsschnittstellensequenzen zu gelangen, ist aufgrund der Redundanz des genetischen Codes, einer Restriktionsenzymkarte des Gens und der großen Anzahl verschiedener Restriktionsenzyme zu einer Routinetätigkeit geworden. Es ist festzuhalten, daß, wenn eine geeignete flankierende Restriktionsschnittstelle verfügbar ist, das vorstehend angesprochene Verfahren nur in Verbindung mit dem flankierenden Bereich angewendet werden muß, der eine derartige Stelle nicht enthält.
Ist die natürlich vorkommende oder synthetische DNA einmal kloniert, werden die die zu mutierenden Positionen flankierenden Restriktionsschnittstellen mit den diese erkennenden Restriktionsenzymen verdaut und eine Mehrzahl von zu den Endtermini komplementären Oligonukleotidkassetten wird in das Gen ligiert. Die Mutagenese wird durch dieses Verfahren enorm vereinfacht, da sämtliche Oligonukleotide so synthetisiert werden können, daß sie die gleichen Restriktionsschnittstellen aufweisen, und keine synthetischen Linker erforderlich sind, um die Restriktionsschnittstellen zu erzeugen.
Wie hier verwendet, ist proteolytische Aktivität als die Hydrolyserate von Peptidbindungen pro Milligramm aktives Enzym definiert. Es existieren viele wohlbekannte Verfahren zum Messen von proteolytischer Aktivität (K. M. Kalisz, „Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Hrsg.: A. Fiechter, 1988).
Gemäß der Erfindung ist bestimmt worden, daß zu +274 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalente Reste von Bedeutung sind, um die insgesamten Leistungscharakteristika des Enzyms in Detergenszusammensetzungen zu modulieren. Dementsprechend kann, wie in den Beispielen ausgeführt, das Threonin in Bacillus lentus-Subtilisin an der äquivalenten Position +274 zu Alanin in der bevorzugten Ausführungsform mutiert werden, um verbesserte Leistungseigenschaften des mutierten Enzyms zu erzeugen. Wie gleichfalls in den Beispielen offenbart ist, führt eine Substitution dieses Rests durch eine andere Aminosäure als Threonin, z.B. Leucin, Serin, Valin und Alanin, zu einer Abnahme der Stabilität der Mutante. Es wird angenommen, daß eine derartige Stabilitätsabnahme das Ergebnis eines autokatalytischen Abbaus der Mutante ist. Dementsprechend können Modifikationen von zu +274 in Bacillus-Subtilisin äquivalenten Resten die insgesamten Leistungseigenschaften des Enzyms in einer Detergenszusammensetzung verbessern und die Gesamtstabilität des Enzyms modulieren. Unter diesem Aspekt der Erfindung ist es das Ziel, eine mutierte Carbonylhydrolase mit im Vergleich zu der Vorläufer-Carbonylhydrolase verbesserter Leistung bei Verwendung in einer Detergenszusammensetzung bereitzustellen. Wie hier verwendet, ist verbesserte Leistung in einem Detergens als verstärkte Reinigung von bestimmten Enzymempfindlichen Flecken, wie Gras oder Blut, definiert. Diese Reinigung wird durch visuelle Auswertung nach einem Standard-Waschzyklus bestimmt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird in den Beispielen angegeben, in welcher Lysin an Position 27 durch Arginin, Valin an Position 104 durch Tyrosin, Asparagin an Position 123 durch Serin und Threonin an Rest 274 durch Alanin in Bacillus lentus-Subtilisin substituiert sind. Obwohl die Stabilität dieses Enzyms im Vergleich zu dem Vorläufer-Subtilisin aus Bacillus lentus etwas verringert ist, ist das Leistungsniveau dieses Enzyms in einer Detergenszusammensetzung wesentlich erhöht, so daß die gleiche Leistung dieser Bacillus lentus-Subtilisin-Mutante verglichen mit dem unmodifizierten Bacillus lentus-Subtilisin erhalten wird, wenn ungefähr die halbe Enzymmenge verwendet wird.
Beruhend auf den Ergebnissen, die mit dieser und anderen Subtilisinmutanten erhalten worden sind, ist es offensichtlich, daß zu den Positionen +123 und +274 in Bacillus amyloliquefaciens äquivalente Reste in Carbonylhydrolasen für die proteolytische Aktivität, Leistungseigenschaften und/oder Stabilität dieser Enzyme von Bedeutung sind.
Viele der Carbonylhydrolasemutanten dieser Erfindung, insbesondere Subtilisin, sind nützlich, um verschiedene Detergenszusammensetzungen zu formulieren. Eine Anzahl bekannter Verbindungen sind geeignete Tenside, die in Zusammensetzungen, welche die Carbonylhydrolasemutanten der Erfindung umfassen, nützlich sind. Diese umfassen nichtionische, anionische, kationische, anionische oder zwitterionische Detergenzien, wie sie in U.S. 4,404,128, Barry J. Anderson, und U.S. 4,261,868, Jiri Flora et al., offenbart sind. Im Stand der Technik sind die verschiedenen Formulierungen bekannt, die als Reinigungszusammensetzungen verwendet werden können. Subtilisine der Erfindung können zu bekannten pulverförmigen und flüssigen Detergenzien mit pH-Werten zwischen 6,5 und 12,0 in Konzentrationen von ungefähr 0,01 bis ungefähr 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 Gew.-% bis 0,05 Gew.-% formuliert werden. Diese Detergenzien enthaltenden Reinigungszusammensetzungen können auch andere Enzyme, wie bekannte Proteasen und Amylasen, wie auch Builder und Stabilisatoren enthalten.
Die Zugabe von Subtilisinen der Erfindung zu herkömmlichen Reinigungszusammensetzungen bewirkt keine spezielle Verwendungsbeschränkung. Mit anderen Worten ist jede für das Detergens geeignete Temperatur und jeder für das Detergens geeignete pH-Wert auch für die vorliegenden Zusammensetzungen geeignet, solange der pH-Wert innerhalb des vorstehend angegebenen Bereichs und die Temperatur unter der Denaturierungstemperatur der erfindungsgemäßen Subtilisine liegt. Zusätzlich können Subtilisine der Erfindung in einer Reinigungszusammensetzung ohne Detergenzien, wieder entweder allein oder in Kombination mit Buildern und Stabilisatoren, verwendet werden.
Das Folgende wird beispielhaft aufgeführt und soll nicht als eine Beschränkung des Umfangs der Ansprüche aufgefaßt werden.
BEISPIEL 1
Konstruktionen für eine Expression des Bacillus lentus-Subtilisingens in Bacillus subtilis
Das Plasmid pSAR, 5, trägt eine translationale Fusion über eine gemeinsame Sau3A-Restriktionsschnittstelle an dem siebten/achten Codon der Signalsequenz der Subtilisingene von B. subtilis und B. amyloliquefaciens. Wie in 5 gezeigt, wurde dieses Gen auf einem EcoRI-BamHI-Fragment von 2,0 kb in M13mp19 subkloniert, um einzelsträngige Matrizen-DNA zu isolieren, die für eine ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden sollte, um pSAR-Q275R zu bilden. Das Mutageneseprotokoll war im wesentlichen das von Zoller, M., et al. (1983), Methods Enzymol., 100, 468–500 (1) und verwendete ein synthetisches Oligonukleotid der Sequenz:
in welcher die Sternchen Änderungen gegenüber den Wildtyp-Gensequenzen angeben und die Unterstreichung für eine eingefügte PstI-Restriktionsendonuklease-Schnittstelle steht, die beim Screening auf das jeweilige mutierte Gen, das die Q275R-Änderung kodiert, verwendet wird. Diese Änderungen wurden vorgenommen, um (1) die Aminosäure an dieser Position in jene umzuwandeln, die in Bacillus lentus-Subtilisin gefunden wird, und (2) um die Anknüpfung des Terminators in pSAR an die reife kodierende Region von Bacillus lentus über eine Pst-Schnittstelle, die auf ähnliche Weise in pGG36 aus Bacillus lentus (ATCC 21536) eingeführt wurde, zu ermöglichen.
Das Plasmid pGG36, 5, enthält ein genomisches DNA-Fragment von 2,1 kb aus Bacillus lentus (ATCC 21536), das das komplette Subtilisingen kodiert, welches durch Standard-Methoden in dem Shuttle-Vektor pBS42 kloniert worden war. Band, L., et al. (1984), DNA, 3, 17–21.
Die Aminosäuresequenz für dieses Subtilisin ist die gleiche wie jene, die für Subtilisin 309 in der PCT-Veröffentlichung Nr. 89/06279 offenbart worden ist. Dieses Gen wurde, wie vorstehend für die ortsgerichtete Mutagenese ausgeführt, unter Verwendung eines Oligonukleotids der Sequenz:
in M13 subkloniert, um 1) eine PstI-Schnittstelle an der gleichen Stelle in diesem Gen entsprechend der vorstehend in pSAR eingeführten Schnittstelle einzuführen und 2) das Threonin an Position 274 durch Alanin unter Bildung von pGG36-T274A zu substituieren.
Die mutierten pSAR-Q275R- und pGG36-T274A-Gene wurden individuell zurück in pBS42 subkloniert, vor Verdauen durch PstI/BamHI, Fragmentisolierung und Ligierung zur Erzeugung des Plasmids GG-A274B.amy.term, wie in 5 gezeigt, alles durch Standardmethoden.
Ein synthetischer DNA-Linker wurde durch Hybridisieren komplementärer einzelsträngiger Oligonukleotide der Sequenzen:
5'-G-ATG-GTC-GCG-TCG-ACC-GCA-CTA-CTC-ATT-TCT-GTT-GCT-TTT-AGT-TCA-T-3'
und
5'-CGA-TGA-ACT-AAA-AGC-AAC-AGA-AAT-GAG-TAG-TGC-GGT-CGA-CGC-GAC-3'
zur Erzeugung des in 6 gezeigten doppelsträngigen DNA-Fragments #2 hergestellt. Die überhängenden Enden dieses Doppelstrang-Linkers auf der linken und rechten Seite sind komplementär zu dem Sau3A-Ende von Fragment #1 (aus pSAR) bzw. dem ClaI-Ende von Fragment #3 (aus pGG-A274B.amy.term). Diese 3 Fragmente wurden nach Restriktionsendonuklease-Verdauen der Plasmide, Fragmentisolierung und Ligation durch Standardverfahren mit Fragment 4 aus pSAR-Q275R unter Erzeugung des Plasmids pGG-KVNA kombiniert. Die Bezeichnung GG-KVNA weist darauf hin, daß dieses Subtilisin das von pGG-36 kodierte Subtilisin enthält, welches Lysin (K) an Position 27, Valin (V) an Position 104, Asparagin (N) an Position 123 und die Substitution von Threonin an Position 274 durch Alanin (A) umfaßt.
BEISPIEL 2
Modifizierung von PGG-KVNA
Wie in 6 gezeigt, wurde das GG-KVNA-Gen (2,1 kb EcoRI-BamHI-Fragment) für drei aufeinanderfolgende Durchgänge ortsgerichteter Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden mit der Sequenz:
in M13 subkloniert.
Die Sternchen bezeichnen Änderungen gegenüber der Wildtyp-Gensequenz. Die Unterstreichungen stehen in (a) für eine eingeführte XbaI-Schnittstelle und in (b) und (c) für eingeführte NheI-Schnittstellen, die verwendet werden, um auf das Vorliegen der verbundenen R27-, Y104- bzw. S123-Mutationen zu screenen. Zusätzlich bezeichnet in (c) die Überstreichung eine zerstörte SphI-Schnittstelle. Schließlich wurde das 2,1 kb-GG-RYSA-Gen zurück in pBS42 für eine Expression in B. subtilis-Wirten subkloniert.
Das resultierende Plasmid wurde als pGG-RYSA bezeichnet. Diese Bezeichnung zeigt an, daß vier Reste in dem pGG-KVNA-Plasmid modifiziert worden sind. Lysin (K) an Position 27 zu Arginin (R), Valin (V) zu Tyrosin (Y) an Position 104 und Asparagin (N) an Position 123 zu Serin (S). Das vorher an Position 274 substituierte Alanin wurde in diesem Verfahren nicht modifiziert.
Das Lysin an Position 27 wurde durch Arginin substituiert, beruhend auf der Aminosäuresequenzierung von Subtilisin 309. Wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/06279 angegeben, ist Lysin an Position 27 lokalisiert. Nach unabhängiger Sequenzierung dieses Subtilisinproteins zeigten die anfänglich erhaltenen Daten jedoch, daß der Rest an Position 27 Arginin war. In Fall der Substitution von Valin gegen Tyrosin an Rest 104 wurde die Substitution vorgenommen, um das pH-Aktivitätsprofil zu erniedrigen und die Leistungsfähigkeit des Enzyms zu erhöhen, beruhend auf Ergebnissen, die früher für Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin (manchmal als BPN' bezeichnet) erhalten worden waren. Die Substitution von Asparagin an Position 123 durch Serin beruht auf den Ergebnissen, die nachfolgend erhalten wurden, wobei festgestellt worden war, daß die Substitution gegen Serin an Position 123 die proteolytische Aktivität des Enyzms in einer eng verwandten Mutante maximierte.
BEISPIEL 3
Konstruktion eines synthetischen Bacillus lentus-Subtilisingens
Die Aminosäuresequenz von Bacillus lentus-Subtilisin kodierende DNA wurde auch hergestellt, indem ein eine synthetische DNA-Sequenz kodierendes Gen konstruiert wurde.
Ein genomisches 2,1 kb-HindIII-Fragment aus dem Plasmid pGG36 wurde sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des reifen Genprodukts (GG36-Subtilisin) wurde verwendet, um eine synthetische reife kodierende Sequenz mit den folgenden Eigenschaften zu entwerten: (1) Im allgemeinen wurden die am häufigsten für jede Aminosäure in sieben verschiedenen B. subtilis-Genen (aus einer Auflistung von Codonenverwendungen, Tabelle 2 aus Maruyama, T., et al. (1986), Nucl. Acids Res., Supplement 14, S. r151–r197) gefundenen Codons verwendet, mit Ausnahme jener Fälle, wo alternative Codons zu geeignet lokalisierten Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme innerhalb des Gens führten; (2) ungefähr alle 40–60 Basenpaare des ~0,8 reifen kodierenden Bereichs wurden Kombination von 2 oder 3 speziell ausgewählten Codons verwendet, was zu der Einführung ziemlich gleichmäßig beabstandeter, nur einmal vorkommender Restriktionsschnittstellen führte. Diese Schnittstellen wurden ausgewählt, um (a) eine spätere Kassetten-Mutagenese und Screening-Studien und (b) Konstruktionen, die mehr als eine Mutation beinhalteten, zu vereinfachen; (3) eine einmalig vorkommende PstI-Erkennungsstelle wurde entworfen, welche die Codons 272–274 umfaßte, was ein Anhängen an die Terminatorsequenzen eines in ähnlicher Weise über die gleichen drei Codons modifizierten Bacillus amyloliqefaciens-Gens ermöglichte und Threonin an Position 274 durch Alanin ersetzte; und (4) eine einmalig vorkommende NruI-Schnittstelle wurde eingeführt, welche die reifen Codonreste 9–10 umfaßte, was ein Anhängen an die kodierenden Präpro-Sequenzen von GG36 über einen kurzen synthetischen doppelsträngigen DNA-Linker ermöglichte. Beruhend auf dieser Gestaltung wurden Oligonukleotide („Oligos") dergestalt synthetisiert, daß für eine gegebene kodierende ~60 bp-Region bei einer Hybridisierung mit den kodierenden und nichtkodierenden Oligos das resultierende doppelsträngige DNA-Fragment an seinen Enden einzelsträngige Abschnitte aufweisen würde, die zu dem Ende des nächsten doppelsträngigen Fragments des Gens komplementär sind (siehe 7).
Insgesamt 36 separate Oligos (umfassend 18 individuelle Doppelstränge) wurden in diesem Schema, wie vorstehend erläutert, verwendet, was zu einer doppelsträngigen synthetischen reifen kodierenden Region von ~0,8 kb führte (Fragment 3 in 8).
Schließlich wurde ein zusätzliches Paar synthetischer Oligos synthetisiert, welches bei einer Hybridisierung (unter Bildung des Fragments 2 in 8) eine NcoI-Schnittstelle an seinem 5'-Ende (komplementär zu der NcoI-Schnittstelle von GG36 an den reifen Codons 5–6) und eine NruI-Schnittstelle an seinem 3'-Ende (komplementär zu dem 5'-Ende von Fragment 3 von 3') aufweist.
Die letzte Konstruktion zur Bildung einer vollständigen Expressionseinheit, welche aus dem B. subtilis-Promotor und den ersten sieben Aminosäuren der Signalsequenz, angehängt an die GG36-Sequenzen, die den Rest der Signalsequenz, die vollständige Prosequenz und die ersten sechs reifen Aminosäuren kodieren, (Fragment 1 von GG-KVNA), dem die reifen Reste 7–274 kodierenden synthetischen Gen (Fragmente 2 + 3) und der Terminationsregion (einschließlich des letzten Codons 279 des reifen Gens) von Bacillus amyloliquefaciens (Fragment 4) besteht, erfolgte als Vier-Stufen-Ligation, wie in 6 dargestellt.
Schließlich wurden drei zusätzliche separate Mutationen in die reife kodierende Region dieses Vollängen-Hybridgens eingeführt. Die erste substituierte das Lysin an Position 27 durch Arginin. Die zweite substituierte das Valin an Position 104 durch Tyrosin. Die dritte substituierte das Asparagin an Position 123 durch Serin. Das resultierende Plasmid wird als pBC3-RYSA bezeichnet. Das folgende Beispiel beschreibt das zur Modifizierung von Position 123 in dem synthetischen Gen eingesetzte Verfahren. Ähnliche Verfahren wurden verwendet, um die Positionen 27 und 104 in diesem synthetischen Gen zu modifizieren.
BEISPIEL 4
Konstruktion von Position 123-Mutanten
Eine XhoI-Schnittstelle wurde über die Codons 111/112 in dem synthetischen Gen aus Beispiel 3 eingeführt, indem drei phänotypisch stille Mutationen über ortsgerichtete Mutagenese (Primer-Extension-Mutagenese in M13) vorgenommen wurden. Das resultierende Plasmid, pX123 (9) wurde mit XhoI und AvaI verdaut, und das große, Vektor enthaltende Fragment wurde durch Elektroelution aus einem Agarosegel isoliert. Es wurde eine Hybridisierung mit komplementären synthetischen Oligonukleotiden, eine Ligation mit dem großen pX123-Fragment und damit eine Transformation des E. coli-Stamms MM294 vorgenommen. Diese Kassetten kodierten individuell alle 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren an Position 123 und enthielten zusätzlich eine stille Mutation, die eine einmalig vorkommende SphI-Schnittstelle zerstörte, die zwischen der XhoI- und AvaI-Schnittstelle in pX123 lag. Resultierende Plasmide aus E. coli-Transformanten wurden auf den Verlust der einmaligen SphI-Schnittstelle gescreent. Bei einer Restriktionsanalyse positive (d.h. SphI-negative) Plasmide wurden sequenziert, um das Vorliegen der gewünschten Mutationen an Position 123 zu bestätigen, eine Subklonierung in den Shuttle-Vektor pBS42 wurde vorgenommen und Bacillus subtilis BG2036 damit für eine Expression transformiert.
BEISPIEL 5
Aktivität von verschiedenen +123-Mutanten
Die proteolytische Aktivität jeder der Subtilisin-Mutanten, die durch die wie vorstehend angegeben modifizierten Position +123-Mutanten kodiert wurden, wurde bestimmt, indem 0,04 m) Überstand von zentrifugierten Kulturbrühen mit 0,56 ml 1% (Gew./Vol.) Casein in 0,1 M Tris, pH 8,60, gemischt wurden. Nach 20-minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Umsetzungen durch Präzipitation mit 10%-iger Trichloressigsäure (TCA) gestoppt. Die Aktivität wurde nach Präzipitation mit 10%-iger TCA aus der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm für den Überstand bestimmt.
TABELLE 1 Relative proteolytische Aktivität von Codon 123-Varianten, normiert bezüglich der Asn-123-Mutante
Während der endgültigen Bestätigung der DNA-Sequenz des das Enzym BC3-RYSA kodierenden synthetischen Gens wurde festgestellt, daß sich an Position 78 Prolin anstelle von Serin (der Aminosäure in Bacillus lentus-Subtilisin an dieser Position) befand.
Die ersten Eigenschaften der Position 123-Mutationen wurden in diesem Enzym, BC3-RPYA (Prolin an Position 78) bestimmt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. Die Aminosäure an Position 78 wurde danach wieder in Serin geändert, um die in 10 gezeigte DNA- und Aminosäuresequenz zu bilden, indem der jenem Abschnitt des Gens entsprechende synthetische DNA-Doppelstrang ersetzt wurde.
Wie festgestellt werden kann, führt die Substitution von Asn durch Ser an Position +123 zu einer wesentlichen Erhöhung der proteolytischen Aktivität. Die Beziehungen zwischen den hier diskutierten verschiedenen Subtilisinen sind für die Positionen 27, 78, 104, 123 und 274 in Tabelle II zusammengefaßt.
TABELLE II Position
BEISPIEL 6
Stabilität von Position 274-Mutanten
Die Stabilität von Position 274-Mutanten in BC3-RPY (Arginin an Position 27, Prolin an Position 78 und Tyrosin an Position 104 in Bacillus lentus-Subtilisin) ist in Tabelle III gezeigt. Die Daten stellen die prozentuale verbleibende Aktivität nach einer 60-minütigen Inkubation bei 37°C in 50 mM EDTA dar. TABELLE III

Aminosäure an Position 274% Aktivität

Leucin 2%

Serin 79%

Threonin 91%

Valin 42%

Alanin 43%
Mutationen an dieser Position beeinflussen eindeutig die Stabilität des Enzyms. Obwohl die Alanin-Mutation nicht so stabil war wie Serin oder Threonin an dieser Position, stellte dieses Enzym unter den beschriebenen Verwendungsbedingungen überlegene Leistungseigenschaften verglichen mit Bacillus lentus-Subtilisin bereit. Für verschiedene Anwendungen können andere Aminosäuren an Position 274 verwendet werden.
BEISPIEL 7
Detergenszusammensetzung

Es wurde ein sprühgetrocknetes Phosphat-Detergensgranulat mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Bestandteil	Gew.-%
lineares C12-Alkylbenzolsulfonat, Natriumsalz	8,45
Talgalkoholsulfat, Natriumsalz	4,23
lineares C14-15-Alkylsulfat, Natriumsalz	4,23
Natriumtoluolsulfonat	1,00
Natriumtripolyphosphat	5,60
Natriumpyrophosphat	22,40
Silicat (1,6 r)	5,50
Natriumsulfat	29,83
Natriumpolyacrylat (MG 4500)	1,17
optischer Aufheller	0,22
Natriumcarbonat	12,30
Polyethylenglycol (MG 8000)	0,47
C12-13-Alkoholpolyethoxylat (6,5)	0,50

Diverses + Wasser	auf 100%
Protease	0,034

Eine 0,1 gew.-%ige Lösung dieser Zusammensetzung in Wasser hatte einen pH-Wert von 10,0. Die Zusammensetzung mit einer Subtilisinmutante der Erfindung (7) lieferte eine überlegene Reinigung von Enzym-empfindlichen Flecken im Vergleich zu Bacillus lentus bei 0,068 mg aktivem Enzym/g Produkt in einem Waschgang bei 95°F (35°C) bei 6 × 0,0648 g pro Gallone ("grains per Gallon" (gpg)) Härte (3:1 Ca/Mg).
In dieser ganzen Anmeldung wird mittels üblicher Ein- und Drei-Buchstaben-Codes auf verschiedene Aminosäuren Bezug genommen. Derartige Codes sind in Proteins: Structures and Molecular Proteases, Hrsg.: Thomas E. Creighton, W. N. Freeman, N.Y., N.Y. (1983), S. 3 angegeben.
Obwohl die bevorzugte Form der Erfindung vorstehend beschrieben worden ist, ist es für Fachleute auf dem Gebiet, welches diese Erfindung betrifft, selbstverständlich, daß nach Verstehen der Erfindung insgesamt verschiedene Änderungen und äquivalente Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der Erfindung, wie er durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, abzuweichen.
Sämtliche Veröffentlichungen werden ausdrücklich unter Bezugnahme in diese Unterlagen aufgenommen.

Claims

Carbonylhydrolase-Mutante mit einer nicht in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz, die von einer Vorläufer-Carbonylhydrolase abgeleitet ist, indem der Aminosäurerest an einer Position in diesem Vorläufer, die der Position +274 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin entspricht, durch eine andere Aminosäure substituiert ist, worin die Mutante eine im Vergleich mit der Vorläufer-Carbonylhydrolase veränderte Stabilität aufweist.
Carbonylhydrolase-Mutante nach Anspruch 1, worin die Vorläufer-Carbonylhydrolase ein Subtilisin ist.
Carbonylhydrolase-Mutante nach Anspruch 2, worin die Vorläufer-Carbonylhydrolase ein Bacillus-Subtilisin ist.
Carbonylhydrolase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Mutante erhöhte Leistung aufweist, wenn sie in einer Detergenszusammensetzung verwendet wird, worin diese erhöhte Leistung als verstärktes Reinigen von Enzymempfindlichen Flecken, bestimmt durch visuelle Beurteilung nach einem StandardWaschzyklus, definiert ist.
DNA, die für eine Carbonylhydrolase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
Expressionsvektor, der die DNA nach Anspruch 5 umfasst.
Wirtszellen, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert sind.
Verfahren zur Herstellung einer Carbonylhydrolase-Mutante mit einer nicht in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz, die von einer Vorläufer-Carbonylhy drolase abgeleitet ist, indem der Aminosäurerest an einer Position in diesem Vorläufer, die der Position +274 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin entspricht, durch eine andere Aminosäure substituiert ist, worin das Verfahren das Kultivieren der Wirtszellen nach Anspruch 7 und das Trennen der hergestellten Carbonylhydrolase-Mutante umfasst.
Enzymatische Reinigungszusammensetzung, die in der Lage ist, Proteine abzubauen, die: (a) ein Tensid; und (b) eine Carbonylhydrolase-Mutante mit einer nicht in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz, die von einer Vorläufer-Carbonylhydrolase abgeleitet ist, indem der Aminosäurerest an einer Position in diesem Vorläufer, die der Position +274 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin entspricht, durch eine andere Amino säure substituiert ist, worin die Mutante eine im Vergleich mit der Vorläufer-Carbonylhydrolase veränderte Stabilität aufweist, umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin das Carbonylhydrolase-Enzym ein Subtilisin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin das Tensid ein Detergens umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, die in Form eines sprühgetrockneten Detergensgranulats formuliert ist.