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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von neuen Carbonylhydrolasemutanten
mit einer Aminosäuresequenz,
in der ein Aminosäurerest
einer Vorläufer-Carbonylhydrolase,
speziell jener an einer Position, die dem Rest +274 in Bacillus
amyloliquefaciens-Subtilisin entspricht, durch eine unterschiedliche
Aminosäure
substituiert worden ist. Derartige mutierte Carbonylhydrolasen werden
durch In-vitro-Modifizierung
einer Vorläufer-DNA-Sequenz
erhalten, welche eine natürlich
vorkommende oder rekombinante Carbonylhydrolase kodiert, damit diese
die Substitution dieses Aminosäurerestes
in einer Vorläufer-Aminosäuresequenz
allein oder in Kombination mit weiterer Substitution, Insertion
oder Deletion in der Vorläufer-Aminosäuresequenz kodiert.
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Hintergrund der Erfindung
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Serinproteasen
sind eine Untergruppe von Carbonylhydrolasen. Sie umfassen eine
vielfältige
Klasse von Enzymen mit einer großen Vielzahl von Spezifitäten und
biologischen Funktionen. Stroud, R.M. (1974), Sei. Amer.. 131, 74–88. Trotz
ihrer funktionellen Diversität
wurde die katalytische Maschinerie von Serinproteasen durch mindestens
zwei genetisch unterschiedliche Familien von Enzymen realisiert:
durch die Subtilisine und die mit Säugetier-Chymotrypsin verwandten
und homologen bakteriellen Serinproteasen (z. B. Trypsin und S.
gresius-Trypsin). Diese zwei Familien von Serinproteasen zeigen
bemerkenswert ähnliche
Katalysemechanismen. Kraut J. (1977), Ann. Rev. Biochem., 46, 331–358. Obwohl
darüber
hinaus die Primärstrukturen
keine Verwandtschaft zeigen, bringt die Tertiärstruktur dieser zwei Enzymfamilien
eine konservierte katalytische Triade von Aminosäuren, bestehend aus Serin,
Histidin und Aspartat, zusammen.
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Subtilisin
ist eine Serin-Endoprotease (MG 27500), die in großen Mengen
von einer großen
Vielzahl von Bacillus-Spezies und anderen Mikroorganismen sezemiert
wird. Die Proteinsequenz von Subtilisin ist aus mindestens vier
verschiedenen Bacillus-Spezies bestimmt worden. Markland, F.S.,
et al. (1983), Honne-Sevler's
Z. Physiol. Chem.. 364, 1537–1540.
Es ist auch die dreidimensionale Kristallstruktur von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin
mit 2,5 X-Auflösung
veröffentlicht
worden. Wright, C.S., et al. (1969), Nature, 221, 235–242; Drenth,
J., et al. (1972), Eur. J. Biochem.. 26, 177–181.
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Diese
Studien zeigen, dass, obwohl Subtilisin genetisch mit den Serinproteasen
der Säugetiere
nicht verwandt ist, es eine ähnliche
Struktur des aktiven Zentrums aufweist. Die Röntgen-Kristallstrukturen von
Subtilisin, das kovalent gebundene Peptid-Inhibitoren enthält (Robertus,
J.D., et al. (1972), Biochemistry. JM, 2439–2449), oder von Komplexen
mit dem Produkt (Robertus, J.D., et al. (1976), J. Biol. Chem..
251, 1097–1103)
haben gleichfalls Informationen bezüglich des aktiven Zentrums
und der mutmaßlichen
Substratbindungsspalte von Subtilisin geliefert. Zusätzlich ist über eine
grolle Anzahl kinetischer und chemischer Modifizierungsstudien für Subtilisin
berichtet worden (Philipp, M., et al. (1983), Mol. Cell. Biochem..
51, 5–32; Svendsen,
B. (1976), Carlsberg Res. Comm., 4_1, 237–291; Markland, F.S. Jd.),
wie es auch mindestens einen Bericht gab, in dem die Seitenkette
von Methionin an Rest 222 von Subtilisin durch Wasserstoffperoxid
in Methioninsulfoxid umgewandelt worden ist (Stauffer, B.C., et
al. (1965), J. Biol. Chem., 244, 5333–5338) und die Seitenkette
von Serin an Rest 221 durch chemische Modifizierung in Cystein umgewandelt
worden ist (Polgar, et al. (1981), Biochimica et Biophvsica Acta,
667, 351–354).
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Das
U.S.-Patent Nr. 4,760,025 und
die
EP-Veröffentlichung Nr. 0 130 756 ,
veröffentlicht
am 9. Januar 1985, offenbaren jeweils die Modifizierung von Aminosäureresten
von Subtilisin entsprechend den Positionen Tyrosin –1, Aspartat
+32, Asparagin +155, Tyrosin +104, Methionin +222, Glycin +166,
Histidin +64, Glycin +169, Phenylalanin +189, Serin +33, Serin +221,
Tyrosin +217, Glutamat +156 und Alanin +152 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin.
Die
EP-Veröffentlichung Nr. 0 251 446 ,
veröffentlicht
am 7. Januar 1988, offenbart andere Aminosäurereste in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin und deren Äquivalente,
die mittels Substitution, Insertion oder Deletion modifiziert werden
können
und die mit Modifizierungen an den in dem
U.S.-Patent Nr. 4,760,025 genannten
Resten kombiniert werden können,
um nützliche
Subtilisinmutanten herzustellen. Die hier identifizierten speziellen
Reste werden in diesen Druckschriften jedoch nicht genannt.
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In ähnlicher
Weise offenbaren die PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 89/09819 und
WO 89/09830 , jeweils veröffentlicht
am 19. Oktober 1989, und die PCT-Veröffentlichung
WO 89/06279 , veröffentlicht am 13. Juli 1989,
Subtilisin-Enzyme, die durch Mutieren einer Nukleotidsequenz, die
ein Subtilisin kodiert, hergestellt worden sind. Es werden zahlreiche
Aminosäurereste
in jeder dieser Veröffentlichungen
genannt, die derart modifiziert werden können. Jedoch nennt wie bei
den vorher genannten Druckschriften keine von diesen die Reste der
vorliegenden Erfindung.
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Weiter
beschreibt die
WO 89/06279 Subtilisinmutanten,
die veränderte
Eigenschaften, wie eine erhöhte
Oxidationsstabilität,
Aktivität
und Waschbarkeit besitzen. Spezifische Mutanten von B. lentus-Subtilisin
Varianten 247 und 309 werden beschrieben. Wie zuvor werden die Reste
der vorliegenden Erfindung in dieser Druckschrift nicht angegeben.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung schafft ein Verfahren zur Veränderung der Stabilität einer
Carbonylhydrolase, umfassend:
die Bereitstellung einer Vorläufer-DNA-Sequenz,
die für
eine Vorläufer-Carbonylhydrolase
kodiert;
das Modifizieren der Vorläufer-DNA-Sequenz zur Bereitstellung
einer mutierten DNA-Sequenz,
die für
eine Carbonylhydrolase-Mutante mit einer nicht in der Natur vorkommenden
Aminosäuresequenz
kodiert, die sich von der Vorläufer-Carbonylhydrolase
dadurch unterscheidet, dass der Aminosäurerest an einer Position des Vorläufers, die
der Position +274 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin entspricht,
durch eine andere Aminosäure
substituiert ist, worin die Mutante eine im Vergleich mit der Vorläufer-Carbonylhydrolase
veränderte
Stabilität
aufweist; und
das Exprimieren der Carbonylhydrolase-Mutante
aus der mutierten DNA-Sequenz.
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So
sind mutierte DNA-Sequenzen von einer Vorläuflsr-DNA-Sequenz abgeleitet,
die ein natürlich
vorkommendes oder rekombinantes Vorläuferenzym kodiert. Die mutierten
DNA-Sequenzen werden abgeleitet, indem die Vorläufer-DNA-Sequenz modifiziert
wird, so dass sie die Substitution von einem speziellen Aminosäurerest
kodiert, der durch die Vorläufer-DNA-Sequenz
kodiert wird, die der Position +274 in Bacillus amyloliquefaciens
entspricht.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz
für Bacillus
amyloliquefaciens-Subtilisin
und eine partielle Restriktionskarte dieses Gens.
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2 zeigt
die bei Subtilisinen aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis
varl168 und Bacillus licheniformis (carlsbergensis) konservierten
Aminosäurereste.
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Die 3A und 3B zeigen
die Aminosäuresequenz
von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis
varl168 und Bacillus licheniformis.
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4 zeigt
die Aminosäuresequenz
von drei Subtilisinen. Die obere Zeile stellt die Aminosäuresequenz
von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin (manchmal
auch als Subtilisin BPN
1 bezeichnet) dar.
Die zweite Zeile zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus
Bacillus lentus (Subtilisin 309 in der PCT-Veröffentlichung Nr.
WO 89/06279 ). Die untere Zeile stellt
die Aminosäuresequenz
eines Enzyms, die als GG-RYSA
bezeichnet wird, dar. Das Symbol * bezeichnet das Fehlen spezieller
Aminosäurereste
im Vergleich zu Subtilisin BPN'.
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5 zeigt
die Konstruktion des Plasmids pGG A274.
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6 zeigt
die Konstruktion von pGG-KVNA, das ein Zwischenprodukt bezüglich des
Plasmids pGG-RYSA ist.
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7 zeigt
das zur Konstruktion eines synthetischen Bacillus lentus-Subtilisingens
verwendete Oiigonukleotid-Doppelstrang („oligonucleotide-duplex”)-Verfahren.
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8 zeigt
die Strategie für
die Konstruktion eines synthetischen Gens, das Bacillus lentus-Subtilisin kodiert.
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9 zeigt
die Kassette, die zur Erzeugung von Substitutionen in der DNA an
der Codonposition +123 durch Kassetten-Mutagenese verwendet worden
ist. XXX steht für
das Codon, das modifiziert worden ist, so dass es die Aminosäuresubstitutionen
an Position +123 kodiert.
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10 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz
eines Enzyms, in dem die DNA-Sequenz
eine synthetische DNA ist. Die DNA in dieser Figur ist so modifiziert
worden, dass sie Arginin an Position 27, Serin an Position 78, Tyrosin
an Position 104, Serin an Position 123 und Alanin an Position 274
kodiert.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Es
ist entdeckt worden, dass In-vitro-Mutationen in der Carbonylhydrolase
Subtilisin an einem Aminosäurerest,
der äquivalent
ist zu +123 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, Subtilisinmutanten
erzeugen, die gegenüber
Vorläufer-Subtilisinen
veränderte
proteolytische Aktivität
aufweisen.
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Es
ist auch entdeckt worden, dass eine in-vitro-Mutation an Resten,
die äquivalent
sind zu +274 in Bacillus amylolique-faciens-Subtilisin, Subtilisinmutanten
erzeugen, die eine veränderte
Stabilität,
z. B. eine modifizierte autoproteolytische Stabilität, aufweisen.
In einigen Fällen
zeigen diese letztgenannten Mutanten auch eine verbesserte Leistungsfähigkeit,
wenn sie in Detergenszusammensetzungen verwendet werden.
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Carbonylhydrolasen
sind Enyzme, die Verbindungen hydrolysieren, die
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Bindungen
enthalten, in denen X Sauerstoff oder Stickstoff ist. Sie umfassen
natürlich
vorkommende Carbonylhydrolasen und rekombinante Carbonylhydrolasen.
Natürlich
vorkommende Carbonylhydrolasen umfassen im Prinzip Hydrolasen, z.
B. Peptidhydrola-sen, wie Subtilisine oder Metalloproteasen. Peptidhydrolasen
umfassen a-Aminoacylpeptidhydrolase, Peptidyiaminosäurehydrolase,
Acylaminohydrolase, Serincarboxypeptidase, Metallocarboxypeptidase,
Thiolproteinase, Carboxylproteinase und Metalloproteinase. Serin-, Metallo-,
Thioiproteasen und saure Proteasen wie auch Endo- und Exoproteasen
sind mit umfasst.
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„Rekombinante
Carbonylhydrolase” bezieht
sich auf eine Carbonylhydrolase, bei der die DNA-Sequenz, die die
natürlich
vorkommende Carbonylhydrolase kodiert, unter Erzeugung einer mutierten
DNA-Sequenz modifiziert ist, welche die Substitution, Insertion
oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz
der Carbonylhydrolase kodiert. Geeignete Modifizierungsverfahren
sind hier, in der
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 130 756 , veröffentlicht
am 09. Januar 1985, und in der
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 251 446 , veröffentlicht
am 07. Januar 1988, offenbart.
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Subtilisine
sind bakterielle oder fungale Carbonylhydrolasen, die im allgemeinen
wirksam sind, indem sie Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden
spalten. Wie hier verwendet, bedeutet „Subtilisin” ein natürlich vorkommendes
Subtilisin oder ein rekombinantes Subtilisin. Eine Reihe natürlich vorkommender
Subtilisine wird bekanntermaßen
durch verschiedene mikrobielle Spezies erzeugt und oftmals sezerniert.
Die Aminosäuresequenzen
der Mitglieder dieser Reihe sind nicht vollständig homolog. Jedoch zeigen
die Subtilisine dieser Reihe den gleichen oder einen ähnlichen
Typ proteolytischer Aktivität.
Dieser Klasse von Serinproteasen ist gemeinsam, dass sie eine gemeinsame
Aminosäuresequenz
aufweist, die eine katalytische Triade definiert, welche sie von
der mit Chymotrypsin verwandten Klasse von Serinproteasen unterscheidet.
Die Subtilisine und die mit Chymotrypsin verwandten Serinproteasen
weisen beide eine katalytische Triade, umfassend Aspartat, Histidin
und Serin, auf. Bei den mit Subtilisin verwandten Proteasen ist
die relative Reihenfolge dieser Aminosäuren, gelesen vom Amino- zum
Carboxyterminus, Aspartat-Histidin-Serin. In den mit Chymotrypsin
verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge jedoch Histidin-Aspartat-Serin.
Dementsprechend bezieht sich Subtilisin hier auf eine Serinprotease,
die die katalytische Triade von mit Subtilisin verwandten Proteasen
aufweist. Beispiele umfassen die hier in
3 aufgeführten Subtilisine
und Subtilisine, wie sie in der PCT-Veröffentlichung
WO 89/06276 und in der
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 283 075 beschrieben werden.
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„Rekombinantes
Subtilisin” bezieht
sich auf ein Subtilisin, in dem die das Subtilisin kodierende DNA-Sequenz
modifiziert ist, um eine mutierte DNA-Sequenz zu erzeugen, die die
Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in
der Aminosäuresequenz
des natürlich
vorkommenden Subtilisins kodiert. Geeignete Verfahren zur Erzeugung
derartiger Modifikationen, welche mit den hier offenbarten kombiniert
werden können,
umfassen jene, die in den
EP-Veröffentlichungen
Nr. 0 130 756 und
0
251 446 und in den PCT-Veröffentlichungen Nr.
WO 89/06279 ,
WO 89/09830 und
WO 89/09819 offenbart worden sind.
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„Nicht-menschliche
Carbonylhydrolasen” und
die sie kodierende DNA können
aus vielen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen erhalten
werden. Geeignete Beispiele prokaryotischer Organismen umfassen
gram-negative Organismen, wie E. coli oder Pseudomonas, und gram-positive
Bakterien, wie Micrococcus oder Bacillus. Beispiele für eukaryotische
Organismen, aus denen Carbonylhydrolase und deren Gene erhalten
werden können,
umfassen Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, Pilze, wie Aspergillus
sp., und nicht-menschliche Säugetierquellen,
wie beispielsweise Rinder sp., aus denen das die Carbonylhydrolase Chymosin
kodierende Gen erhalten werden kann. Wie bei Subtilisinen kann eine
Reihe von Carbonylhydrolasen aus verschiedenen verwandten Spezies
erhalten werden, die Aminosäuresequenzen
aufweisen, die zwischen den Mitgliedern dieser Reihe nicht vollständig homolog
sind, die aber nichtsdestoweniger den gleichen oder einen ähnlichen
Typ biologischer Aktivität
zeigen. Dementsprechend hat nicht-menschliche Carbonylhydrolase,
wie hier verwendet, eine funktional Definition, die sich auf Carbonylhydrolasen
bezieht, die direkt oder indirekt mit prokaryotischen und eukaryotischen
Quellen assoziiert sind.
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Eine „Carbonylhydrolasemutante” hat eine
Aminosäuresequenz,
die von der Aminosäuresequenz
einer „Vorläufer-Carbonylhydrolase” abgeleitet
ist. Die Vorläufer-Carbonylhydrolasen
umfassen natürlich
vorkommende Carbonylhydrolasen und rekombinante Carbonylhydrolasen.
Die Aminosäuresequenz
der Carbonylhydrolasemutante ist von der Aminosäuresequenz der Vorläufer-Hydrolase
durch die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren
Aminosäure(n)
der Vorläufer-Aminosäuresequenz „abgeleitet”. Eine derartige
Modifizierung erfolgt eher an der „Vorläufer-DNA-Sequenz”, die die
Aminosäuresequenz
der Vorläufer-Carbonylhydrolase
kodiert, als durch Manipulation des Vorläufer-Carbonylhydrolaseenzyms
per se.
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Spezielle
Reste, die den Positionen +123 und +274 von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin entsprechen,
werden hier für
eine Substitution angegeben. Diese Aminosäurepositionsnummern beziehen
sich auf jene, die der reifen Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisinsequenz,
die in 1 dargestellt ist, zugeordnet
wurden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Mutation dieses speziellen
Subtilisins beschränkt,
sondern erstreckt sich auf Vorläufer-Carbonylhydrolasen,
die Aminosäurereste
an Positionen enthalten, die „äquivalent” sind zu
den jeweils genannten Resten in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin.
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Ein
Rest (Aminosäure)
einer Vorläufer-Carbonylhydrolase
ist äquivalent
zu einem Rest von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, wenn er
entweder homolog (d. h. er entspricht diesem hinsichtlich der Position entweder
in der Primär-
oder der Tertiärstruktur)
oder analog zu einem speziellen Rest oder Teil dieses Rests in Bacillus
amyloliquefaciens-Subtilisin
(d. h. er hat die gleiche oder eine ähnliche funktionale Fähigkeit,
chemisch sich zu vereinigen, zu reagieren oder zu Wechselwirken)
ist.
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Um
eine Homologie hinsichtlich der Primärstruktur zu ermitteln, wird
die Aminosäuresequenz
einer Vorläufer-Carbonylhydrolase
direkt mit der Primärsequenz
des Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisins und insbesondere mit
einem Satz von Resten verglichen, der bekanntermaßen in sämtlichen
Subtilisinen unverändert ist,
für die
die Sequenz bekannt ist (2). Nach der gegenseitigen Zuordnung
der konservierten Reste, wobei erforderliche Insertionen und Deletionen
ermöglicht
werden, um eine Zuordnung aufrechtzuerhalten (d. h. wobei die Eliminierung
konservierter Rest durch willkürliche
Deletion und Insertion vermieden wird), werden die zu bestimmten
Aminosäuren
in der Primärsequenz
von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalenten Reste definiert.
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Eine
gegenseitige Zuordnung konservierter Reste sollte vorzugsweise 100%
derartiger Reste konservieren. Jedoch ist auch eine gegenseitige
Zuordnung von mehr als 75% oder von auch nur 50% der konservierten
Reste gleichfalls adäquat,
um äquivalente
Reste zu definieren. Eine Konservierung der katalytischen Triade
Asp32/His64/Ser221 sollte beibehalten werden.
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Beispielsweise
werden in 3 die Aminosäuresequenz
von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis
var. 1168 und Bacillus licheniformis (carlsbergensis) einander zugeordnet,
um die größtmögliche Menge
an Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen
zu erzielen. Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt, dass in jeder Sequenz
eine Anzahl von konservierten Resten enthalten ist. Diese sind die
in 2 aufgeführten
Reste.
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Diese
konservierten Reste können
folglich verwendet werden, um die entsprechenden äquivalenten Aminosäurereste
von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin in anderen Carbonylhydrolasen,
wie Subtilisin aus Bacillus lentus (PCT-Veröffentlichung Nr.
WO 89/06279 , veröffentlicht am 13. Juli 1989),
und der hier bevorzugten Subtilisinmutante zu definieren. Diese
besonderen Aminosäuresequenzen
sind in
4 der Sequenz von Bacillus amvloliquefaciens-Subtilisin
in Form eines Alignment zugeordnet, um die größtmögliche Homologie konservierter
Reste zu erzeugen. Wie festgestellt werden kann, gibt es eine Anzahl
von Deletionen in der Sequenz von Bacillus lentus und in der bevorzugten
Subtilisinmutante der Erfindung im Vergleich zu Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin. Folglich
ist die äquivalente
Aminosäure
für Val-165
in Bacillus amvloliquefaciens-Subtilisin in den anderen Subtilisinen
das jeweilige Isoleucin, das unter Val-165 aufgeführt ist.
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In 4 ist
die Aminosäure
an Position 123 in Bacillus amvloliquefaciens-Subtilisin Asparagin.
In Bacillus lentus-Subtilisin ist der äquivalente Rest das spezielle
aufgeführte
Asparagin. In einer Subtilisinmutante ist jedoch die zu +123 in
Bacillus amvloliquefaciens-Subtilisin äquivalente
Aminosäure
eine andere Aminosäure
als Asparagin und ist vorzugsweise das in 4 gezeigte
Serin. In ähnlicher
Weise ist in 4 die Aminosäure an Position +274 von Bacillus
amvloliquefaciens-Subtilisin Alanin. Wie festgestellt werden kann,
ist die äquivalente
Aminosäure
in Bacillus ientus-Subtilisin das spezielle in 4 gezeigte
Threonin. In einer besonders bevorzugten Subtilisinmutante der Erfindung
wird die äquivalente
Aminosäureposition
274 durch das in 4 gezeigte Alanin eingenommen.
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Folglich
werden die Positionen +123 und +274 durch primäre Aminosäuresequenzen in 4 für das Subtilisin
aus Bacilius lentus und ein Mutantenenzym, hergestellt gemäß der Erfindung,
angegeben. Jedoch können
verschiedene andere Aminosäurereste
modifiziert werden, die äquivalent
zu speziellen Aminosäuren in
Bacilius amyloliquefaciens-Subtilisin sind. Dementsprechend entspricht
das Aminosäure
Lysin an Position 27 in Bacilius amyloliquefaciens-Subtilisin ein äquivalentes
Lysin an Position 27 in Bacilius lentus-Subtilisin. Wie in den Beispielen
angegeben, wurde ein Subtilisin abgeleitet, indem eine Bacilius
lentus-Subtilisin kodierende DNA-Sequenz
modifiziert wurde. Derartige Modifizierungen der DNA umfassten die
Modifizierungen von zu den Positionen 123 und 274 von Bacilius amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalenten
Codons. Jedoch wurden zwei andere Modifikationen an der Aminosäuresequenz
aus Bacilius lentus an Positionen, äquivalent zu den Resten 27
und 104 in Bacilius amyloliquefaciens-Subtilisin, vorgenommen. Wie
in 4 ersehen werden kann, wurde entsprechend das
zu Rest 27 in Bacilius lentus-Subtilisin äquivalente Lysin modifiziert,
so dass es in der bevorzugten Ausführungsform Arginin kodiert.
In ähnlicher
Weise wurde auch der Valinrest an Position 104 von Bacilius lentus,
der äquivalent
zu Tyrosin 104 in Bacilius amyloliquefaciens-Subtilisin ist, modifiziert,
so dass er Tyrosin kodiert. Folglich enthält das in 4 gezeigte
Enzym eine Aminosäuresequenz,
die von Bacilius lentus-Subtilisin abgeleitet ist, indem Reste jenes
Subtilisins äquivalent
zu den Positionen 27, 104, 123 und 274 von Bacilius amyloliquefaciens-Subtilisin
modifiziert wurden.
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Äquivalente
Reste können
auch definiert werden, indem die Homologie auf der Ebene der Tertiärstruktur
für eine
Vorläufer-Carbonylhydrolase,
deren Tertiärstruktur
durch Röntgenkristallographie
ermittelt worden ist, bestimmt wird. Äquivalente Reste sind als jene
definiert, für
die sich die Atomkoordinaten von zwei oder mehreren Atomen der Hauptkette
eines bestimmten Aminosäurerests
der Vorläufer-Carbonylhydrolase
und von Bacilius amyloliquefaciens-Subtilisin (N an N, CA an CA,
C an C und O an O) innerhalb von 0,13 nm und vorzugsweise von 0,1
nm nach einer Parallelanordnung (Alignment) befinden. Eine Parallelanordnung
(Alignment) wird erzielt, nachdem das beste Modell ausgerichtet
und positioniert worden ist, um die maximale Überlappung von Atomkoordinaten
von Nicht-Wasserstoff-Proteinatomen
der jeweiligen Carbonylhydrolase mit dem Bacilius amyloliquefaciens-Subtilisin
zu erzielen. Das beste Modell ist das kristallographische Modell,
das den niedrigsten R-Faktor für
experimentelle Beugungsdaten bei der höchsten verfügbaren Auflösung liefert
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Äquivalente
Reste, die funktional analog zu einem speziellen Rest von Bacillus
amvloliquefaciens-Subtilisin sind, sind als jene Aminosäuren der
Vorläufer-Carbonylhydrolasen
definiert, die eine derartige Konformation annehmen können, dass
sie in einer definierten Weise, welche einem speziellen Rest des
Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisins zugeschrieben wird, die Proteinstruktur,
Substratbindung oder Katalyse entweder verändern, modifizieren oder unterstützen. Ferner
sind sie jene Reste der Vorläufer-Carbonylhydrolase (für welche
durch Röntgenkristallographie
eine Tertiärstruktur
erhalten worden ist), welche eine analoge Position in dem Ausmaß einnehmen,
dass, obwohl die Hauptkettenatome des gegebenen Rests die Äquivalenzkriterien
basierend auf dem Einnehmen einer homologen Position unter Umständen nicht
erfüllen,
die Atomkoordinaten von mindestens zwei der Seitenkettenatome des
Restes innerhalb von 0,13 nm zu den entsprechenden Seitenkettenatomen
von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin liegen. Die Koordinaten
der dreidimensionalen Struktur von Bacillus amvloliquefaciens-Subtilisin
sind in der
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 251 446 angegeben und können wie vorstehend ausgeführt verwendet
werden, um äquivalente
Reste auf der Ebene der Tertiärstruktur
zu bestimmen.
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Einige
der hinsichtlich einer Substitution, Insertion oder Deletion identifizierten
Reste sind konservierte Reste, wohingegen andere dies nicht sind.
Im Falle von Resten, die nicht konserviert sind, ist der Ersatz
von einer oder mehreren Aminosäuren
auf Substitutionen beschränkt,
die eine Mutante erzeugen, welche eine Aminosäuresequenz hat, die nicht einer
in der Natur gefundenen Aminosäuresequenz
entspricht. Im Falle von konservierten Resten sollten derartige
Ersetzungen nicht zu einer in der Natur vorkommenden Sequenz führen. Die
Carbonylhydrolasemutanten der Erfindung umfassen die reifen Formen
von Carbonylhydrolasemutanten ebenso wie die Pro- und Präpro-Formen
derartiger Hydrolasemutanten. Die Präpro-Formen sind das bevorzugte
Konstrukt, da diese die Expression, Sekretion und Reifung der Carbonylhydrolasemutanten
vereinfachen.
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„Prosequenz” bezieht
sich auf eine Sequenz von Aminosäuren,
die an den N-terminalen
Abschnitt der reifen Form einer Carbonylhydrolase gebunden ist und
die, wenn sie entfernt wird, zum Auftreten der „reifen” Form der Carbonylhydrolase
führt.
Viele proteolytische Enzyme werden in der Natur als translationale
Proenzym-Produkte gefunden und werden in Abwesenheit einer posttranslationaien
Prozessierung auf diese Weise exprimiert. Eine bevorzugte Prosequenz
zum Herstellen von Carbonylhydrolasemutanten, spezieil Subtilisinmutanten,
ist die mutmaßliche
Prosequenz von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, obwohl andere
Subtilisin-Prosequenzen verwendet werden können. In den Beispielen wurde
die mutmaßliche
Prosequenz des Subtilisins aus Bacillus lentus (ATCC 21536) verwendet.
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Eine „Signalsequenz” oder „Präsequenz” bezieht
sich auf eine jede Sequenz von Aminosäuren, die an den N-terminalen
Abschnitt einer Carbonylhydrolase oder an den N-terminalen Abschnitt einer Prohydrolase gebunden
ist und die sich an der Sekretion der reifen Form oder von Pro-Formen
der Hydrolase beteiligt. Diese Definition einer Signalsequenz ist
eine funktionale, die alle jene Aminosäuresequenzen umfassen soll,
die durch den N-terminalen Abschnitt des Subtilisingens oder anderer
sezemierbarer Carbonylhydrolasen kodiert werden und sich an der
Realisierung der Sekretion von Subtilisin oder anderen Carbonylhydrolasen
unter nativen Bedingungen beteiligen. Die Erfindung nutzt derartige
Sequenzen, um die Sekretion der Carbonylhydrolasemutanten, wie hier
definiert, zu bewirken. Eine in den Beispielen verwendete bevorzugte
Signalsequenz umfasst die ersten sieben Aminosäurereste der Signalsequenz
von Bacillus subtilis-Subtilisin. die mit dem Rest der Signalsequenz
des Subtilisins aus Bacillus lentus (ATCC 21536) fusioniert sind.
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Eine „Präpro”-Form einer
Carbonylhydrolasemutante besteht aus der reifen Form der Hydrolase
mit einer Prosequenz, die in funktionaler Weise mit dem Aminoterminus
der Hydrolase verknüpft
ist, und einer „Prä-” oder „Signal”sequenz,
die in funktionaler Weise mit dem Aminoterminus der Prosequenz verknüpft ist.
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„Expressionsvektor” bezieht
sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die
in funktionaler Weise mit einer geeigneten Kontrollsequenz verknüpft ist,
welche in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten
Wirt zu bewirken. Derartige Kontrollsequenzen umfassen einen Promotor,
um eine Transkription zu bewirken, eine gegebenenfalls vorhandene
Operatorsequenz, um eine derartige Transkription zu kontrollieren,
eine geeignete mRNA-Ribosomen-Bindungsstellen kodierende Sequenz
und Sequenzen, die die Termination von Transkription und Translation
kontrollieren. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenteilchen oder
einfach ein potentielles genomisches Insert sein. Wenn ein geeigneter
Wirt einmal damit transformiert worden ist, kann der Vektor sich
unabhängig
von dem Wirtsgenom replizieren und funktionieren oder kann sich
in einigen Fällen
in das Genom selbst integrieren. In den vorliegenden Unterlagen
werden „Plasmid” und „Vektor” manchmal
austauschbar verwendet, da das Plasmid gegenwärtig die am häufigsten
verwendete Form von Vektoren darstellt. Jedoch soll die Erfindung
solche andere Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalenten
Funktionen dienen und die im Stand der Technik bekannt sind oder
bekannt werden.
-
Die
in der Erfindung verwendeten „Wirtszellen” sind im
allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, die vorzugsweise
durch die in der
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 130 756 offenbarten Methoden manipuliert worden sind,
um diese unfähig
zu machen, enzymatisch aktive Endoprotease zu sezernieren. Eine
bevorzugte Wirtszelle zum Exprimieren von Subtilisin ist der Bacillus-Stamm
BG2036, der defizient hinsichtlich enzymatisch aktiver neutraler
Protease und alkalischer Protease (Subtilisin) ist. Die Konstruktion
des Stammes BG2036 wird im Detail in der
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 130 756 und weiter durch Yang, M.Y., et al. (1984),
J. Bacteriol., 160, 15–21,
beschrieben. Andere Wirtszellen zum Exprimieren von Subtilisin umfassen
Bacillus subtilis 1168 (
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 130 756 ).
-
Wirtszellen
werden mit unter Einsatz von rekombinanten DNA-Techniken konstruierten
Vektoren transformiert oder transfiziert. Derartige transformierte
Wirtszellen sind in der Lage, entweder Vektoren zu replizieren,
die die Carbonylhydrolasemutanten kodieren, oder die gewünschte Carbonylhydrolasemutante
zu exprimieren. Im Falle von Vektoren, die die Prä- oder Präpro-Form
der Carbonylhydrolasemutante kodieren, werden derartige Mutanten,
wenn sie exprimiert werden, typisch aus der Wirtszelle in das Wirtszellmedium
sezemiert.
-
„In funktionaler
Weise verknüpft” („operably
linked”)
bedeutet einfach, wenn es die Beziehung zwischen zwei DNA-Abschnitten
beschreibt, dass diese in funktionaler Beziehung zueinander stehen.
Beispielsweise ist eine Präsequenz
funktional mit einem Peptid verknüpft, wenn sie als Signalsequenz
wirksam wird, die sich an der Sekretion der reifen Form des Proteins
beteiligt, welche höchstwahrscheinlich
eine Abspaltung der Signalsequenz umfasst. Ein Promotor ist funktional
mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription
der Sequenz kontrolliert; eine Ribosomenbindungsstelle ist funktional
mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so angeordnet
ist, dass sie eine Translation ermöglicht.
-
Die
die natürlich
vorkommende Vorläufer-Carbonylhydrolase
kodierenden Gene können
gemäß der allgemeinen
Verfahren, die in den
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 130 756 und
0
251 446 beschrieben worden sind, erhalten werden. Wie aus
den darin offenbarten Beispielen ersehen werden kann, umfassen die
Verfahren allgemein, markierte Sonden zu synthetisieren, die mutmaßlich Sequenzen
aufweisen, welche Abschnitte der interessierenden Hydrolase kodieren,
genomische Bibliotheken aus Organismen herzustellen, die die Hydrolase exprimieren,
und die Bibliotheken hinsichtlich des interessierenden Gens durch
Hybridisierung mit den Sonden zu screenen. Positiv hybridisierende
Klone werden dann kartiert und sequenziert.
-
Die
klonierte Carbonylhydrolase wird dann verwendet, um eine Wirtszelle
zu transformieren, um die Hydrolase zu exprimieren. Das Hydrolasegen
wird dann in ein „High
copy number”-Plasmid
ligiert. Dieses Plasmid repliziert sich in Wirten in dem Sinne,
dass es die wohlbekannten, für
die Plasmidreplikation erforderlichen Elemente enthält: einen
funktional mit dem jeweiligen Gen verknüpften Promotor (der als der
eigene homologe Promotor des Gens bereitgestellt werden kann, wenn
er durch den Wirt erkannt, d. h. transkribiert wird), einen Transkriptionsterminations-
und Polyadenylierungsabschnitt (in bestimmten eukaryotischen Wirtszellen
erforderlich für
die Stabilität
der durch den Wirt von dem Hydrolasegen transkribierten mRNA), der
exogen ist oder durch die endogene Terminationsregion des Hydrolasegens
bereitgestellt wird, und, wünschenswerterweise, ein
Selektionsgen, wie ein Antibiotika-Resistenzgen, das eine kontinuierliche
Züchtung
oder Aufrechterhaltung Plasmid-infizierter Wirtszellen durch Züchtung in
Antibiotika enthaltendem Medium ermöglicht. „High copy number'-Plasmide enthalten
auch einen Replikationsursprung für den Wirt, wodurch ermöglicht wird,
dass große
Anzahlen von Plasmiden im Zytoplasma ohne chromosomale Beschränkungen
erzeugt werden. Jedoch ist hier auch mit umfasst, eine Mehrzahl
von Kopien des Hydrolasegens in das Wirtsgenom zu integrieren. Dies wird
durch prokaryotische und eukaryotische Organismen erleichtert, die
besonders zu homologer Rekombination neigen.
-
Alternativ
kann ein eine natürlich
vorkommende oder mutierte Vorläufer-Carbonylhydrolase
kodierendes synthetisches Gen erzeugt werden. Bei einer solchen
Strategie wird die DNA- und/oder Aminosäuresequenz der Vorläufer-Hydrolase
bestimmt. Eine Mehrzahl von überlappenden
synthetischen einzelsträngigen DNA-Fragmenten
wird danach synthetisiert, die bei Hybridisierung und Ligation eine
die Vorläufer-Hydrolase kodierende
synthetische DNA produzieren. Diese Strategie liefert mehrere Vorteile
gegenüber
einer Klonierung des natürlichen
Gens, indem ohne Änderung
der kodierten Aminosäuresequenz
Restriktionsschnittstellen innerhalb der DNA eingebracht werden
können,
wodurch eine nachfolgende Modifizierung zur Bildung der mutierten
Carbonylhydrolasen erleichtert wird. Ferner ermöglicht die Synthese-Strategie,
die Codonenverwendung in dem synthetischen Gen anzupassen, damit
sie mit den Codonenpräferenzen
der jeweiligen zu verwendenden Expressionswirte übereinstimmt. Ein Beispiel
einer Konstruktion eines synthetischen Gens wird in den Beispielen
aufgeführt.
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Ist
das natürlich
vorkommende oder synthetische Vorläufer-Carbonylhydrolasegen einmal
kloniert, werden eine Anzahl von Modifizierungen vorgenommen, um
die Verwendung des Gens über
die Synthese der natürlich
vorkommenden Vorläufer-Carbonylhydrolase
hinaus zu verstärken.
Derartige Modifikationen umfassen die Produktion von rekombinanten
Carbonylhydrolasen, wie in den
EP-Veröffentlichung
Nr. 0 130 756 und
0
251 446 offenbart, und die hier beschriebene Produktion
von Carbonylhydrolasemutanten.
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Das
folgende Kassettenmutagenese-Verfahren kann verwendet werden, um
die Konstruktion und Identifizierung der Carbonylhydrolasemutanten
gemäß der Erfindung
zu vereinfachen, obwohl andere Verfahren, einschließlich ortsgerichteter
Mutagenese, verwendet werden können.
Zuerst wird das natürlich
vorkommende Gen, das die Hydrolase kodiert, gewonnen und vollständig oder
teilweise sequenziert. Dann wird die Sequenz hinsichtlich einer
Stelle durchgesehen, an der es gewünscht wird, eine Mutation (Deletion,
Insertion oder Substitution) einer oder mehrerer Aminosäuren in
dem kodierten Enzym vorzunehmen. Die diese Stelle flankierenden
Sequenzen werden hinsichtlich des Vorliegens von Restriktionsschnittstellen
zum Ersetzen eines kurzen Abschnitts des Gens durch einen Oligonukleotid-Pool,
der bei einer Expression verschiedene Mutanten kodiert, ausgewertet.
Derartige Restriktionsschnittstellen sind vorzugsweise einmalig
vorkommende Stellen innerhalb des Hydrolasegens, um das Ersetzen
des Genabschnitts zu erleichtern. Jedoch kann jede geeignete Restriktionsschnittstelle,
die nicht übermäßig redundant
in dem Hydrolasegen vorliegt, verwendet werden, vorausgesetzt, dass
die durch Restriktionsverdau erzeugten Genfragmente in einer geeigneten
Sequenz erneut zusammengefügt
werden können.
Wenn Restriktionsschnittstellen an Orten innerhalb einer geeigneten
Entfernung von der ausgewählten
Stelle (10 bis 15 Nukleotide) nicht vorliegen, werden derartige
Stellen durch Substituieren von Nukleotiden in dem Gen auf solche
Weise erzeugt, dass weder das Leseraster noch die kodierten Aminosäuren in
dem endgültigen
Konstrukt geändert
werden. Eine Mutation des Gens, um dessen Sequenz zu verändern, damit
sie mit der gewünschten
Sequenz übereinstimmt,
wird durch M13-Primer-Extension gemäß allgemein bekannten Verfahren
bewerkstelligt. Die Aufgabe, geeignete flankierende Regionen zu
lokalisieren und die erforderlichen Änderungen auszuwerten, um zu
zwei geeigneten Restriktionsschnittstellensequenzen zu gelangen,
ist aufgrund der Redundanz des genetischen Codes, einer Restriktionsenzymkarte
des Gens und der großen
Anzahl verschiedener Restriktionsenzyme zu einer Routinetätigkeit geworden.
Es ist festzuhalten, dass, wenn eine geeignete flankierende Restriktionsschnittstelle
verfügbar
ist, das vorstehend angesprochene Verfahren nur in Verbindung mit
dem flankierenden Bereich angewendet werden muss, der eine derartige
Stelle nicht enthält.
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Ist
die natürlich
vorkommende oder synthetische DNA einmal kloniert, werden die die
zu mutierenden Positionen flankierenden Restriktionsschnittstellen
mit den diese erkennenden Restriktionsenzymen verdaut und eine Mehrzahl
von zu den Endtermini komplementären
Oligonukleotidkassetten wird in das Gen ligiert. Die Mutagenese
wird durch dieses Verfahren enorm vereinfacht, da sämtliche
Oligonukleotide so synthetisiert werden können, dass sie die gleichen
Restriktionsschnittstellen aufweisen, und keine synthetischen Linker
erforderlich sind, um die Restriktionsschnittstellen zu erzeugen.
-
Wie
hier verwendet, ist proteolytische Aktivität als die Hydrolyserate von
Peptidbindungen pro Milligramm aktives Enzym definiert. Es existieren
viele wohlbekannte Verfahren zum Messen von proteolytischer Aktivität (K.M.
Kalisz, „Microbial
Proteinases”,
Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Hrsg.: A. Fiechter,
1988).
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Gemäß der Erfindung
ist bestimmt worden, dass zu +274 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalente
Reste von Bedeutung sind, um die insgesamten Leistungscha-rakteristika
des Enzyms in Detergenszusammensetzungen zu modulieren. Dementsprechend
kann, wie in den Beispielen ausgeführt, das Threonin in Bacillus
lentus-Subtilisin an der äquivalenten
Position +274 zu Alanin in der bevorzugten Ausführungsform mutiert werden,
um verbesserte Leistungseigenschaften des mutierten Enzyms zu erzeugen.
Wie gleichfalls in den Beispielen offenbart ist, führt eine
Substitution dieses Rests durch eine andere Aminosäure als
Threonin, z. B. Leucin, Serin, Valin und Alanin, zu einer Abnahme
der Stabilität
der Mutante. Es wird angenommen, dass eine derartige Stabilitätsabnahme
das Ergebnis eines autokatalytischen Abbaus der Mutante ist. Dementsprechend
können
Modifikationen von zu +274 in Bacillus-Subtilisin äquivalenten
Resten die insgesamten Leistungseigenschaften des Enzyms in einer
Detergenszusammensetzung verbessern und die Gesamtstabilität des Enzyms
modulieren. Unter diesem Aspekt der Erfindung ist es das Ziel, eine
mutierte Carbonylhydrolase mit im Vergleich zu der Vorläufer-Carbonylhydrolase
verbesserter Leistung bei Verwendung in einer Detergenszusammensetzung
bereitzustellen. Wie hier verwendet, ist verbesserte Leistung in
einem Detergens als verstärkte
Reinigung von bestimmten Enzymempfindlichen Flecken, wie Gras oder
Blut, definiert. Diese Reinigung wird durch visuelle Auswertung
nach einem Standard-Waschzyklus bestimmt.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung wird in den Beispielen angegeben, in welcher Lysin an
Position 27 durch Arginin, Valin an Position 104 durch Tyrosin,
Asparagin an Position 123 durch Serin und Threonin an Rest 274 durch
Alanin in Bacillus lentus-Subtilisin substituiert sind. Obwohl die
Stabilität
dieses Enzyms im Vergleich zu dem Vorläufer-Subtilisin aus Bacillus
lentus etwas verringert ist, ist das Leistungsniveau dieses Enzyms
in einer Detergenszusammensetzung wesentlich erhöht, so dass die gleiche Leistung dieser
Bacillus lentus-Subtilisin-Mutante verglichen mit dem unmodifizierten
Bacillus lentus-Subtilisin erhalten wird, wenn ungefähr die halbe
Enzymmenge verwendet wird.
-
Beruhend
auf den Ergebnissen, die mit dieser und anderen Subtilisinmutanten
erhalten worden sind, ist es offensichtlich, dass zu den Positionen
+123 und +274 in Bacillus amvloliquefaciens äquivalente Reste in Carbonylhydrolasen
für die
proteolytische Aktivität,
Leistungseigenschaften und/oder Stabilität dieser Enzyme von Bedeutung
sind.
-
Viele
der gemäß der Erfindung
hergestellten Carbonylhydrolasemutanten, insbesondere Subtilisin, sind
nützlich,
um verschiedene Detergenszusammensetzungen zu formulieren. Eine
Anzahl bekannter Verbindungen sind geeignete Tenside, die in Zusammensetzungen,
welche die Carbonylhydrolasemutanten der Erfindung umfassen, nützlich sind.
Diese umfassen nichtionische, anionische, kationische, anionische
oder zwitterionische Detergenzien, wie sie in
U.S. 4,404,128 , Barry J. Anderson,
und
U.S. 4,261,868 ,
Jiri Flora et al., offenbart sind. Im Stand der Technik sind die
verschiedenen Formulierungen bekannt, die als Reinigungszusammensetzungen
verwendet werden können.
Gemäß der Erfindung
hergestellte Subtilisine können
zu bekannten pulverförmigen
und flüssigen
Detergenzien mit pH-Werten zwischen 6,5 und 12,0 in Konzentrationen von
ungefähr
0,01 bis ungefähr
5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 Gew.-% bis 0,05 Gew.-% formuliert werden.
Diese Detergenzien enthaltenden Reinigungszusammensetzungen können auch
andere Enzyme, wie bekannte Proteasen und Amylasen, wie auch Builder
und Stabilisatoren enthalten.
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Die
Zugabe von gemäß der Erfindung
hergestellten Subtilisinen zu herkömmlichen Reinigungszusammensetzungen
bewirkt keine spezielle Verwendungsbeschränkung. Mit anderen Worten ist
jede für
das Detergens geeignete Temperatur und jeder für das Detergens geeignete pH-Wert
auch für
die vorliegenden Zusammensetzungen geeignet, solange der pH-Wert
innerhalb des vorstehend angegebenen Bereichs und die Temperatur
unter der Denaturierungstemperatur der erfindungsgemäßen Subtilisine
liegt. Zusätzlich
können
gemäß der Erfindung
hergestellte Subtilisine in einer Reinigungszusammensetzung ohne
Detergenzien, wieder entweder allein oder in Kombination mit Buildern
und Stabilisatoren, verwendet werden.
-
Das
Folgende wird beispielhaft aufgeführt und soll nicht als eine
Beschränkung
des Umfangs der Ansprüche
aufgefasst werden.
-
BEISPIEL 1
-
Konstruktionen für eine Expression des Bacillus
lentus-Subtilisingens in Bacillus subtilis
-
Das
Plasmid pSAR,
5, trägt eine translationale Fusion über eine
gemeinsame Sau3A-Restriktionsschnittstelle an dem siebten/achten
Codon der Signalsequenz der Subtilisingene von B. subtilis und B. amyloliquefaciens.
Wie in
5 gezeigt, wurde dieses Gen auf einem EcoRI-BamHI-Fragment
von 2,0 kb in M13mp19 subkloniert, um einzelsträngige Matrizen-DNA zu isolieren,
die für
eine ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden sollte, um pSAR-Q275R
zu bilden. Das Mutageneseprotokoll war im wesentlichen das von Zoller,
M., et al. (1983), Methods EnzvmoL 100, 468–500 (1) und verwendete ein
synthetisches Oligonukleotid der Sequenz:
in welcher
die Sternchen Änderungen
gegenüber
den Wildtyp-Gensequenzen angeben und die Unterstreichung für eine eingefügte PstI-Restriktionsendonuklease-Schnittstelle
steht, die beim Screening auf das jeweilige mutierte Gen, das die
Q275R-Änderung
kodiert, verwendet wird. Diese Änderungen
wurden vorgenommen, um (1) die Aminosäure an dieser Position in jene
umzuwandeln, die in Bacillus lentus-Subtilisin gefunden wird, und
(2) um die Anknüpfung
des Terminators in pSAR an die reife kodierende Region von Bacillus
lentus über
eine Pst-Schnittstelle, die auf ähnliche
Weise in pGG36 aus Bacillus lentus (ATCC 21536) eingeführt wurde,
zu ermöglichen.
-
Das
Plasmid pGG36, 5, enthält ein genomisches DNA-Fragment
von 2,1 kb aus Bacillus lentus (ATCC 21536), das das komplette Subtilisingen
kodiert, welches durch Standard-Methoden in dem Shuttle-Vektor pBS42
kloniert worden war. Band, L, et al. (1984), DNA, 3, 17–21.
-
Die
Aminosäuresequenz
für dieses
Subtilisin ist die gleiche wie jene, die für Subtilisin 309 in der
PCT-Veröffentlichung Nr. 89/06279 offenbart
worden ist. Dieses Gen wurde, wie vorstehend für die ortsgerichtete Mutagenese
ausgeführt,
unter Verwendung eines Oligonukleotids der Sequenz:
in M13 subkloniert, um 1)
eine PstI-Schnittstelle an der gleichen Stelle in diesem Gen entsprechend
der vorstehend in pSAR eingeführten
Schnittstelle einzuführen
und 2) das Threonin an Position 274 durch Alanin unter Bildung von
pGG36-T274A zu substituieren.
-
Die
mutierten pSAR-Q275R- und pGG36-T274A-Gene wurden individuell zurück in pBS42
subkloniert, vor Verdauen durch PstI/BamHI, Fragmentisolierung und
Ligierung zur Erzeugung des Plasmids GG-A274B.amy.term, wie in 5 gezeigt,
alles durch Standardmethoden.
-
Ein
synthetischer DNA-Linker wurde durch Hybridisieren komplementärer einzelsträngiger Oligonukleotide
der Sequenzen:
zur Erzeugung
des in
6 gezeigten doppelsträngigen DNA-Fragments #2 hergestellt.
Die überhängenden Enden
dieses Doppelstrang-Linkers auf der linken und rechten Seite sind
komplementär
zu dem Sau3A-Ende von Fragment #1 (aus pSAR) bzw. dem ClaI-Ende
von Fragment #3 (aus pGG-A274 B.amy.term). Diese 3 Fragmente wurden
nach Restriktionsendonuklease-Verdauen der Plasmide, Fragmentisolierung
und Ligation durch Standardverfahren mit Fragment 4 aus pSAR-Q275R
unter Erzeugung des Plasmids pGG-KVNA
kombiniert. Die Bezeichnung GG-KVNA weist darauf hin, dass dieses
Subtilisin das von pGG-36 kodierte Subtilisin enthält, welches
Lysin (K) an Position 27, Valin (V) an Position 104, Asparagin (N)
an Position 123 und die Substitution von Threonin an Position 274
durch Alanin (A) umfasst.
-
BEISPIEL 2
-
Modifizierung von PGG-KVNA
-
Wie
in
6 gezeigt, wurde das GG-KVNA-Gen (2,1 kb EcoRI-BamHI-Fragment)
für drei
aufeinanderfolgende Durchgänge
ortsgerichteter Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden
mit der Sequenz:
in M13
subkloniert.
-
Die
Sternchen bezeichnen Änderungen
gegenüber
der Wildtyp-Gensequenz. Die Unterstreichungen stehen in (a) für eine eingeführte XbaI-Schnittstelle
und in (b) und (c) für
eingeführte
NheI-Schnittstellen, die verwendet werden, um auf das Vorliegen
der verbundenen R27-, Y104- bzw. S123-Mutationen zu screenen. Zusätzlich bezeichnet
in (c) die Überstreichung
eine zerstörte
SphI-Schnittstelle. Schließlich
wurde das 2,1 kb-GG-RYSA-Gen
zurück
in pBS42 für
eine Expression in B. subtilis-Wirten subkloniert.
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Das
resultierende Plasmid wurde als pGG-RYSA bezeichnet. Diese Bezeichnung
zeigt an, dass vier Reste in dem pGG-KVNA-Plasmid modifiziert worden
sind. Lysin (K) an Position 27 zu Arginin (R), Valin (V) zu Tyrosin
(Y) an Position 104 und Asparagin (N) an Position 123 zu Serin (S).
Das vorher an Position 274 substituierte Alanin wurde in diesem
Verfahren nicht modifiziert.
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Das
Lysin an Position 27 wurde durch Arginin substituiert, beruhend
auf der Aminosäuresequenzierung
von Subtilisin 309. Wie in der PCT-Veröffentlichung Nr.
WO 89/06279 angegeben, ist Lysin
an Position 27 lokalisiert. Nach unabhängiger Sequenzierung dieses
Subtilisinproteins zeigten die anfänglich erhaltenen Daten jedoch,
dass der Rest an Position 27 Arginin war. In Fall der Substitution
von Valin gegen Tyrosin an Rest 104 wurde die Substitution vorgenommen,
um das pH-Aktivitätsprofil
zu erniedrigen und die Leistungsfähigkeit des Enzyms zu erhöhen, beruhend
auf Ergebnissen, die früher
für Bacillus
amyloliquefaciens-Subtilisin (manchmal als BPN'' bezeichnet)
erhalten worden waren. Die Substitution von Asparagin an Position
123 durch Serin beruht auf den Ergebnissen, die nachfolgend erhalten
wurden, wobei festgestellt worden war, dass die Substitution gegen
Serin an Position 123 die proteolytische Aktivität des Enyzms in einer eng verwandten Mutante
maximierte.
-
BEISPIEL 3
-
Konstruktion eines synthetischen Bacillus
lentus-Subtilisingens
-
Die
Aminosäuresequenz
von Bacillus lentus-Subtilisin kodierende DNA wurde auch hergestellt,
indem ein eine synthetische DNA-Sequenz kodierendes Gen konstruiert
wurde.
-
Ein
genomisches 2,1 kb-HindIII-Fragment aus dem Plasmid pGG36 wurde
sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des reifen Genprodukts
(GG36-Subtilisin) wurde verwendet, um eine synthetische reife kodierende
Sequenz mit den folgenden Eigenschaften zu entwerfen: (1) Im allgemeinen
wurden die am häufigsten
für jede
Aminosäure
in sieben verschiedenen B. subtilis-Genen (aus einer Auflistung
von Codonenverwendungen, Tabelle 2 aus Maruyama, T., et al. (1986),
Nucl. Acids Res., Supplement 14, S. r151–r197) gefundenen Codons verwendet,
mit Ausnahme jener Fälle,
wo alternative Codons zu geeignet lokalisierten Erkennungsstellen
für Restriktionsenzyme
innerhalb des Gens führten;
(2) ungefähr
alle 40–60
Basenpaare des ~0,8 reifen kodierenden Bereichs wurden Kombination
von 2 oder 3 speziell ausgewählten
Codons verwendet, was zu der Einführung ziemlich gleichmäßig beabstandeter,
nur einmal vorkommender Restriktionsschnittstellen führte. Diese
Schnittstellen wurden ausgewählt,
um (a) eine spätere
Kassetten-Mutagenese und Screening-Studien und (b) Konstruktionen,
die mehr als eine Mutation beinhalteten, zu vereinfachen; (3) eine
einmalig vorkommende PstI-Erkennungsstelle wurde entworfen, welche
die Codons 272–274
umfasste, was ein Anhängen
an die Terminatorsequenzen eines in ähnlicher Weise über die
gleichen drei Codons modifizierten Bacillus amyloliqefaciens-Gens
ermöglichte
und Threonin an Position 274 durch Alanin ersetzte; und (4) eine einmalig
vorkommende NruI-Schnittstelle wurde eingeführt, welche die reifen Codonreste
9–10 umfasste,
was ein Anhängen
an die kodierenden Präpro-Sequenzen
von GG36 über
einen kurzen synthetischen doppelsträngigen DNA-Linker ermöglichte.
Beruhend auf dieser Gestaltung wurden Oligonukleotide („Oligos”) dergestalt synthetisiert,
dass für
eine gegebene kodierende 60 bp-Region bei einer Hybridisierung mit
den kodierenden und nichtkodierenden Oligos das resultierende doppelsträngige DNA-Fragment
an seinen Enden einzelsträngige
Abschnitte aufweisen würde,
die zu dem Ende des nächsten
doppelsträngigen
Fragments des Gens komplementär
sind (siehe 7).
-
Insgesamt
36 separate Oligos (umfassend 18 individuelle Doppelstränge) wurden
in diesem Schema, wie vorstehend erläutert, verwendet, was zu einer
doppelsträngigen
synthetischen reifen kodierenden Region von ~0,8 kb führte (Fragment
3 in 8).
-
Schließlich wurde
ein zusätzliches
Paar synthetischer Oligos synthetisiert, welches bei einer Hybridisierung
(unter Bildung des Fragments 2 in 8) eine
NcoI-Schnittstelle an seinem 5'-Ende
(komplementär zu
der NcoI-Schnittstelle von GG36 an den reifen Codons 5–6) und
eine NruI-Schnittstelle an seinem 3'-Ende (komplementär zu dem 5'-Ende von Fragment 3 von 3') aufweist.
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Die
letzte Konstruktion zur Bildung einer vollständigen Expressionseinheit,
welche aus dem B. subtilis-Promotor und den ersten sieben Aminosäuren der
Signalsequenz, angehängt
an die GG36-Sequenzen, die den Rest der Signalsequenz, die vollständige Prosequenz
und die ersten sechs reifen Aminosäuren kodieren, (Fragment 1
von GG-KVNA), dem
die reifen Reste 7–274
kodierenden synthetischen Gen (Fragmente 2 + 3) und der Terminationsregion
(einschließlich
des letzten Codons 279 des reifen Gens) von Bacillus amyloliquefaciens
(Fragment 4) besteht, erfolgte als Vier-Stufen-Ligation, wie in 6 dargestellt.
-
Schließlich wurden
drei zusätzliche
separate Mutationen in die reife kodierende Region dieses Vollängen-Hybridgens
eingeführt.
Die erste substituierte das Lysin an Position 27 durch Arginin.
Die zweite substituierte das Valin an Position 104 durch Tyrosin.
Die dritte substituierte das Asparagin an Position 123 durch Serin.
Das resultierende Plasmid wird als pBC3-RYSA bezeichnet. Das folgende
Beispiel beschreibt das zur Modifizierung von Position 123 in dem
synthetischen Gen eingesetzte Verfahren. Ähnliche Verfahren wurden verwendet,
um die Positionen 27 und 104 in diesem synthetischen Gen zu modifizieren.
-
BEISPIEL 4
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Konstruktion von Position 123-Mutanten
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Eine
XhoI-Schnittstelle wurde über
die Codons 111/112 in dem synthetischen Gen aus Beispiel 3 eingeführt, indem
drei phänotypisch
stille Mutationen über
ortsgerichtete Mutagenese (Primer-Extension-Mutagenese in M13) vorgenommen
wurden. Das resultierende Plasmid, pX123 (9) wurde
mit XhoI und AvaI verdaut, und das große, Vektor enthaltende Fragment
wurde durch Elektroelution aus einem Agarosegel isoliert. Es wurde
eine Hybridisierung mit komplementären synthetischen Oligonukleotiden,
eine Ligation mit dem großen
pX123-Fragment und damit eine Transformation des E. coli-Stamms MM294 vorgenommen.
Diese Kassetten kodierten individuell alle 20 natürlich vorkommenden
Aminosäuren
an Position 123 und enthielten zusätzlich eine stille Mutation,
die eine einmalig vorkommende SphI-Schnittstelle zerstörte, die
zwischen der XhoI- und AvaI-Schnittstelle in pX123 lag. Resultierende
Plasmide aus E. coli-Transformanten
wurden auf den Verlust der einmaligen Sphl-Schnittstelle gescreent.
Bei einer Restriktionsanalyse positive (d. h. SphI-negative) Plasmide
wurden sequenziert, um das Vorliegen der gewünschten Mutationen an Position
123 zu bestätigen,
eine Subklonierung in den Shuttle-Vektor pBS42 wurde vorgenommen
und Bacillus subtilis BG2036 damit für eine Expression transformiert.
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BEISPIEL 5
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Aktivität von verschiedenen +123-Mutanten
-
Die
proteolytische Aktivität
jeder der Subtilisin-Mutanten, die durch die wie vorstehend angegeben
modifizierten Position +123-Mutanten kodiert wurden, wurde bestimmt,
indem 0,04 ml Überstand
von zentrifugierten Kulturbrühen
mit 0,56 ml 1% (Gew.A/ol.) Casein in 0,1 M Tris, pH 8,60, gemischt
wurden. Nach 20-minütiger
Inkubation bei 37°C
wurden die Umsetzungen durch Präzipitation
mit 10%-iger Trichloressigsäure
(TCA) gestoppt. Die Aktivität
wurde nach Präzipitation
mit 10%-iger TCA aus der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280
nm für
den Überstand
bestimmt. TABELLE 1 Relative proteolytische Aktivität von Codon
123-Varianten, normiert bezüglich
der Asn-123-Mutante
| Codon
123 | %
Proteolytische Aktivität |
| Ser | 116 |
| Asn | 100 |
| Cys | 22 |
| Gly | 12 |
| Aia | 9 |
| Thr | 7 |
| Gin | 7 |
| Val | 6 |
| Glu | <5 |
| Ile | <5 |
| Trp | <5 |
| Phe | <5 |
| Asp | <5 |
| His | <5 |
| Leu | <5 |
| Met | <5 |
| Pro | <5 |
| Tyr | <5 |
-
Während der
endgültigen
Bestätigung
der DNA-Sequenz des das Enzym BC3-RYSA kodierenden synthetischen Gens
wurde festgestellt, dass sich an Position 78 Prolin anstelle von
Serin (der Aminosäure
in Bacillus lentus-Subtilisin an dieser Position) befand.
-
Die
ersten Eigenschaften der Position 123-Mutationen wurden in diesem
Enzym, BC3-RPYA (Prolin an Position 78) bestimmt. Diese Ergebnisse
sind in Tabelle I gezeigt. Die Aminosäure an Position 78 wurde danach
wieder in Serin geändert,
um die in 10 gezeigte DNA- und Aminosäuresequenz
zu bilden, indem der jenem Abschnitt des Gens entsprechende synthetische
DNA-Doppelstrang ersetzt wurde.
-
Wie
festgestellt werden kann, führt
die Substitution von Asn durch Ser an Position +123 zu einer wesentlichen
Erhöhung
der proteolytischen Aktivität.
Die Beziehungen zwischen den hier diskutierten verschiedenen Subtilisinen
sind für
die Positionen 27, 78, 104, 123 und 274 in Tabelle II zusammengefasst. TABELLE II Position
| | 27 | 78 | 104 | 123 | 274 |
| GC36
(genomisch) | Lys(K) | Ser(S) | Val(V) | Asn(N) | Thr(T) |
| Synthetisches
B. lentus-Gen | Lys(K) | Pro(P) | Val(V) | Asn(N) | Ala(A) |
| B.
amvloliquefaciens-Subtilisin (BPN) | Lys(K) | Ser(S) | Tyr(Y) | Asn(N) | Ala(A) |
| Subtilisin
309, wie veröffentlicht | Lys(K) | Ser(S) | Val(V) | Asn(N) | Thr(T) |
| Hier
bevorzugte Ausführungsform | Arg(R) | Ser(S) | Tyr(Y) | Ser(S) | Ala(A) |
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BEISPIEL 6
-
Stabilität von Position 274-Mutanten
-
Die
Stabilität
von Position 274-Mutanten in BC3-RPY (Arginin an Position 27, Prolin
an Position 78 und Tyrosin an Position 104 in Bacillus lentus-Subtilisin)
ist in Tabelle III gezeigt. Die Daten stellen die prozentuale verbleibende
Aktivität
nach einer 60-minütigen
Inkubation bei 37°C
in 50 mM EDTA dar. TABELLE III
| Aminosäure an Position
274% | Aktivität |
| Leucin | 2% |
| Serin | 79% |
| Threonin | 91% |
| Valin | 42% |
| Alanin | 43% |
-
Mutationen
an dieser Position beeinflussen eindeutig die Stabilität des Enzyms.
Obwohl die Alanin-Mutation nicht so stabil war wie Serin oder Threonin
an dieser Position, stellte dieses Enzym unter den beschriebenen
Verwendungsbedingungen überlegene
Leistungseigenschaften verglichen mit Bacillus lentus-Subtilisin
bereit. Für
verschiedene Anwendungen können
andere Aminosäuren
an Position 274 verwendet werden.
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BEISPIEL 7
-
Detergenszusammensetzung
-
Es
wurde ein sprühgetrocknetes
Phosphat-Detergensgranulat mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
| Bestandteil | Gew.-% |
| lineares
C12-Alkylbenzolsulfonat, Natriumsalz | 8,45 |
| Talgalkoholsulfat,
Natriumsalz | 4,23 |
| lineares
C14-15-Alkylsulfat, Natriumsalz | 4,23 |
| Natriumtoluolsulfonat | 1,00 |
| Natriumtripolyphosphat | 5,60 |
| Natriumpyrophosphat | 22,40 |
| Silicat
(1,6 r) | 5,50 |
| Natriumsulfat | 29,83 |
| Natriumpolyacrylat
(MG 4500) | 1,17 |
| optischer
Aufheller | 0,22 |
| Natriumcarbonat | 12,30 |
| Polyethylenglycol
(MG 8000) | 0,47 |
| C12-13-Alkoholpolyethoxylat
(6,5)* | 0,50 |
| Diverses
+ Wasser | auf
100% |
| Protease
** | 0,034 |
- * Alkohol und Monoethoxylatalkohol entfernt;
- ** mg aktives Enzym/g (2,0 mg aktives Enzym/g Vorratslösung)
-
Eine
0,1 gew.-%ige Lösung
dieser Zusammensetzung in Wasser hatte einen pH-Wert von 10,0. Die Zusammensetzung
mit einer Subtilisinmutante der Erfindung (7) lieferte
eine überlegene
Reinigung von Enzym-empfindlichen Flecken im Vergleich zu Bacillus
lentus bei 0,068 mg aktivem Enzym/g Produkt in einem Waschgang bei
95°F (35°C) bei 6 × 0,0648
g pro Gallone (”grains
per Gallon” (gpg))
Härte (3:1
Ca/Mg).
-
In
dieser ganzen Anmeldung wird mittels üblicher Ein- und Drei-Buchstaben-Codes
auf verschiedene Aminosäuren
Bezug genommen. Derartige Codes sind in Proteins: Structures and
Molecular Proteases, Hrsg.: Thomas E. Creighton, W.N. Freeman, N.Y.,
N.Y. (1983), S. 3 angegeben.
-
Obwohl
die bevorzugte Form der Erfindung vorstehend beschrieben worden
ist, ist es für
Fachleute auf dem Gebiet, welches diese Erfindung betrifft, selbstverständlich,
dass nach Verstehen der Erfindung insgesamt verschiedene Änderungen
und äquivalente
Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der Erfindung,
wie er durch die beigefügten
Ansprüche
definiert ist, abzuweichen.
