ES2242963T5 - Mutantes de subtilisina. - Google Patents
Mutantes de subtilisina. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2242963T5 ES2242963T5 ES96120247T ES96120247T ES2242963T5 ES 2242963 T5 ES2242963 T5 ES 2242963T5 ES 96120247 T ES96120247 T ES 96120247T ES 96120247 T ES96120247 T ES 96120247T ES 2242963 T5 ES2242963 T5 ES 2242963T5
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- mutant
- carbonyl hydrolase
- precursor
- subtilisin
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38609—Protease or amylase in solid compositions only
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS MUTANTES DE CARBONIL HIDROLASA DERIVADOS DE LAS SECUENCIAS DE ADN DE CARBONIL HIDROLASAS NO HUMANAS, EXISTENTES EN LA NATURALEZA O RECOMBINANTES. LAS CARBONIL HIDROLASAS MUTANTES, EN GENERAL, SE OBTIENEN POR MODIFICACION IN VITRO, DE UNA SECUENCIA PRECURSORA DE ADN, QUE CODIFICA PARA LA CARBONIL HIDROLASA SILVESTRE O RECOMBINANTE, PRODUCIENDO LA SUSTITUCION DE UNO O MAS RESIDUOS AMINOACIDOS EN LA SECUENCIA AMINOACIDA DE LA CARBONIL HIDROLASA. DICHAS CARBONIL HIDROLASAS MUTANTES, TIENEN PROPIEDADES DISTINTAS DE LAS DEL PRECURSOR DE HIDROLASA, Y SON ESPECIALMENTE UTILES EN FORMULACIONES DETERGENTES. LOS AMINOACIDOS SUSTITUIDOS CORRESPONDEN A LA POSICION +123 Y/O +274, EN LA SUBTILISINA DE BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS.
Description
Mutantes de subtilisina.
La presente invención se refiere a la producción
de nuevos mutantes de carbonil hidrolasa que tienen una secuencia
de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos de una
carbonil hidrolasa precursora, concretamente los que están en una
posición correspondiente al resto +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, ha sido sustituido con un
aminoácido diferente. Tales carbonil hidrolasas mutantes se obtienen
por modificación in vitro de una secuencia de DNA precursora
que codifica una carbonil hidrolasa de origen natural o recombinante
para codificar la sustitución de este resto de aminoácido en una
secuencia de aminoácidos precursora, sola o en combinación con otra
sustitución, inserción o deleción en la secuencia de aminoácidos
precursora.
Las proteasas de serina son un subgrupo de
carbonil hidrolasas. Comprenden una clase diversa de enzimas que
tienen una amplia gama de especificidades y funciones biológicas.
Stroud, R. M. (1974), Sci. Amer., 131,
74-88. A pesar de su diversidad funcional, se ha
hecho una aproximación de la maquinaria catalítica de proteasas de
serina mediante al menos dos familias de enzimas genéticamente
distintas: las subtilisinas y las proteasas de serina relacionadas
con la quimiotripsina de mamíferos y bacterianas homólogas (p. ej.
tripsina y tripsina de S. gresius). Estas dos familias de
proteasas de serina muestran mecanismos de catálisis notablemente
similares. Kraut, J. (1977), Ann. Rev. Biochem., 46,
331-358. Además, aunque la estructura primaria es no
relacionada, la estructura terciaria de estas dos familias de
enzimas reúne una triada catalítica de aminoácidos conservada
consistente en serina, histidina y aspartato.
La subtilisina es una endoproteasa de serina (PM
27.500) que es segregada en grandes cantidades por una amplia
variedad de especies Bacillus y otros microorganismos. La
secuencia de proteína de la subtilisina ha sido determinada a
partir de al menos cuatro especies diferentes de Bacillus.
Markland, F.S. et al. (1983),
Honne-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364,
1537-1540. También se ha publicado la estructura
cristalográfica tridimensional de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens a una resolución de 2,5A. Wright, C.S. et
al. (1969), Nature, 221, 235-242;
Drenth, J. et al. (1972), Eur. J. Biochem., 26,
177-181. Estos estudios indican que, aunque la
subtilisina es genéticamente no relacionada con las proteasas de
serina de mamíferos, tiene una estructura de sitios activos
similar. Las estructuras cristalinas de rayos X de la subtilisina
que contiene inhibidores peptídicos unidos covalentemente
(Robertus, J.D. et al. (1972), Biochemistry,
11, 2439-2449) o complejos producto
(Robertus, J.D. et al. (1976), J. Biol. Chem.,
251, 1097-1103), han proporcionado también
información relativa al sitio activo y la hendidura de unión de
sustrato putativa de la subtilisina. Además, se han publicado
numerosos estudios cinéticos y de modificación química para la
subtilisina (Philipp, M. et al. (1983), Mol. Cell.
Biochem., 51, 5-32; Svendsen, B. (1976),
Carlsbera Res. Comm., 41, 237-291;
Markland, F. S. Id.) así como al menos una publicación en la que la
cadena lateral de metionina en el resto 222 de la subtilisina se
convirtió en metionina-sulfóxido mediante peróxido
de hidrógeno (Stauffer, D.C. et al. (1965), J. Biol.
Chem., 244, 5333-5338) y la cadena
lateral de serina en el resto 221 se convirtió en cisteína por
modificación química (Polgar et al. (1981), Biochimica et
Biophysica Acta, 667, 351-354).
La patente de EE.UU. nº 4.760.025 y la
Publicación EPO Nº 0 130 756 publicada el 9 de enero de 1985
describen cada una de ellas la modificación de restos de
aminoácidos de subtilisina correspondientes a posiciones en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens tirosina -1,
aspartato +32, asparagina +155, tirosina +104, metionina +222,
glicina +166, histidina +64, glicina +169, fenilalanina +189, serina
+ 33, serina +221, tirosina +217, glutamato +156 y alanina + 152. La
Publicación EPO Nº 0 251 446 publicada el 7 de enero de 1988
describe otros restos de aminoácidos en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens y sus equivalentes que pueden ser
modificados por medio de sustitución, inserción o deleción y que
pueden combinarse con modificaciones a los restos identificados en
la patente de EE.UU. nº 4.760.025 para formar mutantes de
subtilisina útiles. Sin embargo, los restos identificados en el
presente texto en particular no son identificados en estas
referencias.
Del mismo modo, la Publicación PCT Nº WO
89/09819 y la WO 89/09830, publicadas cada una de ellas el 19 de
octubre de 1989, describen enzimas de subtilisina hechas mutando una
secuencia de nucleótidos que codifica una subtilisina. En cada una
de estas publicaciones se identifican numerosos restos de
aminoácidos que pueden ser modificados así. Sin embargo, como
ocurre con las referencias anteriormente identificadas, ninguna
identifica los restos de la presente invención.
Además, el documento WO 89/06279 describe
mutantes de la subtilisina que poseen propiedades modificadas tales
como mayor estabilidad a la oxidación, actividad y capacidad de
lavado. Se describen mutantes específicos de la subtilisina de
B. lentus. Como antes, los restos de la presente invención no
son identificados en esta referencia.
La invención proporciona un método de alterar la
estabilidad de una carbonil hidrolasa que comprende:
proporcionar una secuencia de DNA precursora que
codifica una carbonil hidrolasa precursora;
\global\parskip0.930000\baselineskip
modificar dicha secuencia de DNA precursora para
que proporcione una secuencia de DNA mutante que codifica una
carbonil hidrolasa mutante que tiene una secuencia de aminoácidos
que no se encuentra en la naturaleza y que difiere de dicha
carbonil hidrolasa precursora en la sustitución de un aminoácido
diferente por el resto de aminoácido en una posición en dicho
precursor equivalente a la posición +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, en donde el mutante tiene una
estabilidad alterada en comparación con la carbonil hidrolasa
precursora, y
expresar dicha carbonil hidrolasa mutante a
partir de dicha secuencia de DNA mutante.
Así, estas secuencias de DNA mutantes son
derivadas de una secuencia de DNA precursora que codifica una enzima
precursora de origen natural o recombinante. Las secuencias de DNA
mutantes se derivan modificando la secuencia de DNA precursora para
que codifique la sustitución de un resto específico de aminoácido
codificado por la secuencia de DNA precursora correspondiente a la
posición +274 en Bacillus amyloliquefaciens.
La Fig. 1 representa la secuencia de DNA y de
aminoácidos para la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens
y un mapa de restricción parcial de este gen.
La Fig. 2 representa los restos de aminoácidos
conservados entre subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus subtilis varI168 y Bacillus licheniformis
(carlsbergensis).
Las Figuras 3A y 3B representan la secuencia de
aminoácidos de la subtilisina de Bacillus amyliquefaciens,
Bacillus subtilis varI168 y Bacillus licheniformis.
La Fig. 4 representa la secuencia de aminoácidos
de tres subtilisinas. El renglón superior representa la secuencia de
aminoácidos de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens
(también llamada a veces subtilisina BPN'). El segundo renglón
representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de
Bacillus lentus (subtilisina 309 en la Publicación PCT Nº WO
89/06279). El renglón de abajo representa la secuencia de
aminoácidos de una enzima denominada GG-RYSA. El
símbolo * denota la ausencia de restos de aminoácidos específicos en
comparación con la subtilisina BPN'.
La Fig. 5 representa la construcción del
plásmido pGG A274.
La Fig. 6 representa la construcción de
pGG-KVNA, que es un intermedio para el plásmido
pGG-RYSA.
La Fig. 7 representa el método de
oligonucleótido-duplex usado para construir un gen
sintético de la subtilisina de Bacillus lentus.
La Fig. 8 representa la estrategia para
construir un gen sintético que codifica la subtilisina de
Bacillus lentus.
La Fig. 9 representa la casete usada para hacer
sustituciones en el DNA en el codón de posición +123 por mutagénesis
de casete. XXX representa el codón modificado para codificar las
sustituciones de aminoácidos en posición +123.
La Fig. 10 representa el DNA y la secuencia de
aminoácidos de una enzima, en la que la secuencia de DNA es un DNA
sintético. El DNA de esta Figura ha sido modificado para que
codifique arginina en la posición 27, serina en la posición 78,
tirosina en la posición 104, serina en la posición 123 y alanina en
la posición 274.
Se ha descubierto que mutaciones in vitro
en la carbonil hidrolasa subtilisina en un resto de aminoácido
equivalente a +123 en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens producen mutantes de subtilisina que muestran
actividad proteolítica alterada sobre las subtilisinas
precursoras.
También se ha descubierto que la mutación in
vitro en restos equivalentes a +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens produce mutantes de subtilisina
que muestran una estabilidad alterada, p. ej. actividad
autoproteolítica modificada. En algunos casos, estos últimos
mutantes muestran también un rendimiento mejorado cuando se usan en
composiciones detergentes.
Las carbonil hidrolasas son enzimas que
hidrolizan compuestos que contienen uniones
en las que X es oxígeno o
nitrógeno. Incluyen carbonil hidrolasas de origen natural y carbonil
hidrolasas recombinantes. Las carbonil hidrolasas de origen natural
incluyen principalmente hidrolasas, p. ej. péptido hidrolasas,
tales como subtilisinas, o metaloproteasas. Las péptido hidrolasas
incluyen \alpha-aminoacilpéptido hidrolasa,
peptidilaminoácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serina
carboxipeptidasa, metalocarboxipeptidasa, tiol proteinasa,
carboxilproteinasa y
metaloproteinasa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se incluyen serina, metalo, tiol y ácido
proteasas, así como endo- y exo-proteasas.
"Carbonil hidrolasa recombinante" se
refiere a una carbonil hidrolasa en la cual la secuencia de DNA que
codifica la carbonil hidrolasa de origen natural está modificada
para producir una secuencia de DNA mutante que codifica la
sustitución, la inserción o la deleción de uno o más aminoácidos en
la secuencia de aminoácidos de la carbonil hidrolasa. Los métodos
de modificación adecuados se describen en el presente texto, en la
Publicación EPO Nº 0 130 756 publicada el 9 de enero de 1985 y en
la Publicación EPO Nº 0 251 446 publicada el 7 de enero de
1988.
Las susbtilisinas son carbonil hidrolasas
bacterianas o fúngicas que actúan generalmente rompiendo uniones
peptídicas de proteínas o péptidos. Como se usa en el presente
texto, "subtilisina" significa una subtilisina de origen
natural o una subtilisina recombinante. Se conoce una serie de
subtilisinas de origen natural que son producidas y muchas veces
segregadas por varias especies microbianas. Las secuencias de
aminoácidos de los miembros de esta serie no son totalmente
homólogas. Sin embargo, las subtilisinas de esta serie muestran la
misma actividad proteolítica o un tipo de actividad similar. Esta
clase de proteasas de serina comparte una secuencia de aminoácidos
común que define una triada catalítica que la distingue de la clase
de proteasas de serina relacionadas con la quimiotripsina. Las
subtilisinas y proteasas de serina relacionadas con la
quimiotripsina tienen ambas una triada catalítica que comprende
aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con la
subtilisina el orden relativo de estos aminoácidos, leyendo desde el
término amino al carboxi, es
aspartato-histidina-serina. En las
proteasas relacionadas con la quimiotripsina el orden relativo, sin
embargo, es
histidina-aspartato-serina. Así, la
subtilisina en el presente texto se refiere a una proteasa de serina
que tiene la triada catalítica de proteasas relacionadas con
subtilisina. Los ejemplos incluyen las subtilisinas identificadas en
la Fig. 3 del presente texto y como se describen en la Publicación
PCT WO 89/06279 y en la Publicación EPO Nº 0 283 075.
"Subtilisina recombinante" se refiere a una
subtilisina en la cual la secuencia de DNA que codifica la
subtilisina está modificada para producir una secuencia de DNA
mutante que codifica la sustitución, la deleción o la inserción de
uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la
subtilisina de origen natural. Los métodos adecuados para producir
tal modificación y que pueden combinarse con los que se describen en
el presente texto, incluyen los descritos en la Publicación EPO
números 0 130 756 y Nº 0 251 446 y en la Publicación PCT números WO
89/06279, WO 89/09630 y WO 89/09819.
Las "carbonil hidrolasas no humanas" y el
DNA que las codifica pueden obtenerse a partir de muchos organismos
procariotas y eucariotas. Los ejemplos adecuados de organismos
procariotas incluyen organismos gram-negativos
tales como E. coli o Pseudomonas y bacterias
gram-positivas tales como Micrococcus o
Bacillus. Los ejemplos de organismos eucariotas a partir de
los cuales pueden obtenerse carbonil hidrolasa y sus genes incluyen
levaduras tales como Saccaromyces cerevisiae, hongos como
Aspergillus sp., y fuentes constituidas por mamíferos no
humanos como, por ejemplo, especie bovina, a partir de las cuales
pueden obtenerse los genes que codifican la carbonil hidrolasa
quimosina. Como con las subtilisinas, puede obtenerse una serie de
carbonil hidrolasas a partir de varias especies relacionadas que
tienen secuencias de aminoácidos que no son enteramente homólogas
entre los miembros de esa serie pero que, no obstante, muestran la
misma actividad biológica o una de tipo similar. Así, la carbonil
hidrolasa no humana como se usa en el presente texto tiene una
definición funcional que se refiere a carbonil hidrolasas que están
asociadas directa o indirectamente, con fuentes procariotas y
eucariotas.
Un "mutante de carbonil hidrolasa" tiene
una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de
aminoácidos de una "carbonil hidrolasa precursora". Las
carbonil hidrolasas precursoras incluyen carbonil hidrolasas de
origen natural y carbonil hidrolasas recombinantes. La secuencia de
aminoácidos del mutante de carbonil hidrolasa se "deriva" de la
secuencia de aminoácidos de la hidrolasa precursora mediante la
sustitución, la deleción o la inserción de uno o más aminoácidos de
la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la
"secuencia de DNA precursora" que codifica la secuencia de
aminoácidos de la carbonil hidrolasa precursora, en vez de la
manipulación de la enzima carbonil hidrolasa precursora per
se. Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia
de DNA precursora incluyen métodos descritos en el presente texto y
en las Publicaciones EPO números 0 130 756 y 0 251 446.
Los restos específicos correspondientes a las
posiciones +123 y +274 de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se identifican en el presente texto para
sustitución. Estos números de posición de aminoácidos se refieren a
los asignados a la secuencia de la subtilisina del Bacillus
amyloliquefaciens madura presentada en la Fig. 1. Sin embargo,
la invención no está limitada a la mutación de esta subtilisina
concreta sino que se extiende a carbonil hidrolasas precursoras que
contienen restos de aminoácidos en posiciones que son
"equivalentes" a los restos concretos identificados en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
Un resto (aminoácido) de una carbonil hidrolasa
precursora es equivalente a un resto de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens si es homólogo (es decir, correspondiente en
posición en la estructura primaria o en la terciaria) o bien si es
análogo a un resto específico o porción de ese resto en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (es decir, que
tiene la misma capacidad funcional, o una similar, para combinarse,
reaccionar o interaccionar químicamente).
Para establecer homología respecto a la
estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una carbonil
hidrolasa precursora se compara directamente con la secuencia
primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y
en particular con un conjunto de restos que se sabe que son
invariables en todas las subtilisinas para las que se conoce la
secuencia (Fig. 2). Después de alinear los restos conservados,
permitiendo las inserciones y deleciones necesarias con el fin de
mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de restos
conservados por deleción e inserción arbitrarias), se definen los
restos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia
primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. La
alineación de restos conservados debe de conservar preferentemente
el 100% de tales restos. Sin embargo, la alineación de más del 75% o
de una porción tan baja como el 50% de los restos conservados es
también adecuada para definir restos equivalentes. La conservación
de la triada catalítica Asp32/His64/Ser221 debe mantenerse.
Por ejemplo, en la Fig. 3 la secuencia de
aminoácidos de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus subtilis var. I168 y Bacillus lichenformis
(carlsbergensis) están alineadas para proporcionar la máxima cuantía
de homología entre secuencias de aminoácidos. Una comparación de
estas secuencias muestra que hay cierto número de restos conservados
contenidos en cada secuencia. Estos son los restos identificados en
la Fig. 2.
Estos restos conservados pueden ser usados
entonces para definir los correspondientes restos de aminoácidos
equivalentes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens
en otras carbonil hidrolasas tales como la subtilisina de
Bacillus lentus (Publicación PCT Nº WO 89/06279 publicada el
13 de julio de 1989) y el mutante de subtilisana preferido del
presente texto. Estas secuencias particulares de aminoácidos están
alineadas en la Fig. 4 con la secuencia de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens para producir la máxima homología
de restos conservados. Como puede observarse, hay cierto número de
deleciones en la secuencia de Bacillus lentus y en el mutante
de subtilisina preferido de la invención, en comparación con la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Así, el aminoácido
equivalente para Val-165 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, en las otras subtilisinas es la
isoleucina particular indicada debajo de
Val-165.
En la Fig. 4, el aminoácido de la posición 123
es asparagina en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. En la subtilisina de Bacillus lentus,
el resto equivalente es la asparagina particular indicada. Sin
embargo en un mutante de subtilisina, el aminoácido equivalente a
+123 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens es un
aminoácido distinto de la asparagina y es preferentemente la serina
indicada en la Fig. 4. Del mismo modo, en la Fig. 4, el aminoácido
en posición +274 de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens es alanina. Como puede observarse, el
aminoácido equivalente en la subtilisina de Bacillus lentus
es la treonina particular indicada en la Fig. 4. En un mutante de
subtilisina particular, la posición 274 de aminoácido equivalente
está ocupada por la alanina indicada en la Fig. 4.
Así, las posiciones +123 y +274 están
identificadas por secuencias de aminoácidos primarias en la Fig. 4
para la subtilisina de Bacillus lentus y una enzima mutante
preparada según la invención. Sin embargo, pueden ser modificados
otros varios restos de aminoácidos que son equivalentes a
aminoácidos específicos en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. Así, el aminoácido lisina en posición 27 en
la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens tiene una lisina
equivalente en posición 27 en la subtilisina de Bacillus
lentus. Como se indica en los Ejemplos, la subtilisina fue
derivada modificando una secuencia de DNA que codifica subtilisina
de Bacillus lentus. Tales modificaciones al DNA incluían la
modificación de codones equivalentes a las posiciones 123 y 274 de
la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Sin embargo, se
hicieron otras dos modificaciones a la secuencia de aminoácidos de
Bacillus lentus en posiciones equivalentes a los restos 27 y
104 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Así,
como puede observarse en la Fig. 4, la lisina en el resto 27
equivalente en la subtilisina de Bacillus lentus fue
modificada para codificar arginina. Del mismo modo, el resto de
valina en posición 104 de Bacillus lentus, que es
equivalente a tirosina 104 en subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens, fue también modificado para codificar
tirosina. Así, la enzima mostrada en la Fig. 4 contiene una
secuencia de aminoácidos derivada de la subtilisina de Bacillus
lentus modificando restos de esa subtilisina equivalentes a las
posiciones 27, 104, 123 y 274 de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens.
También pueden definirse restos equivalentes
determinando homología a nivel de la estructura terciaria para una
carbonil hidrolasa precursora cuya estructura terciaria ha sido
determinada por cristalografía de rayos X. Los restos equivalentes
se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de
dos o más de los átomos de la cadena principal de un resto de
aminoácido particular de la carbonil hidrolasa precursora y la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N sobre N, CA
sobre CA, C sobre C y O sobre O) están dentro de los 0,13 nm y
preferentemente 0,1 nm después de la alineación. La alineación se
consigue después de que el mejor modelo ha sido orientado y situado
para dar el máximo solapamiento de coordenadas atómicas de átomos
que no sean de hidrógeno de la proteína de la carbonil hidrolasa en
cuestión respecto de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. El mejor modelo es el modelo cristalográfico
que da el factor R más bajo para los datos experimentales de
difracción a la resolución más alta disponible.
\newpage
Los restos equivalentes que son funcionalmente
análogos a un resto específico de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se definen como aquellos aminoácidos de las
carbonil hidrolasas precursoras, que pueden adoptar una conformación
tal que alteran, modifican o contribuyen a la estructura de la
proteína, la unión de sustrato o la catálisis en una manera
definida y atribuida a un resto específico de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens. Además, están aquellos restos de
la carbonil hidrolasa precursora (para los que se ha obtenido una
estructura terciaria mediante cristalografía de rayos X), que
ocupan una posición análoga hasta el punto de que aunque los átomos
de la cadena principal del resto dado pueden no satisfacer los
criterios de equivalencia sobre la base de ocupar una posición
homóloga, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de
la cadena lateral del resto están a 0,13 nm de los correspondientes
átomos de la cadena lateral de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. Las coordenadas de la estructura
tridimensional de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se exponen en la Publicación EPO Nº 0 251 446
y pueden ser usadas como se indicó antes para determinar restos
equivalentes a nivel de la estructura terciaria.
Algunos de los restos identificados para
sustitución, inserción o deleción, son restos conservados mientras
que otros no lo son. En el caso de restos que no son conservados, la
sustitución de uno o más aminoácidos está limitada a sustituciones
que producen un mutante que tiene una secuencia de aminoácidos que
no corresponde a una que se encuentre en la naturaleza. En el caso
de restos conservados, tales sustituciones no deben dar por
resultado una secuencia existente en la naturaleza. Los mutantes de
la carbonil hidrolasa de la presente invención incluyen las formas
maduras de mutantes de carbonil hidrolasa así como las pro- y
prepro-formas de tales mutantes de hidrolasa. Las
prepro-formas son la construcción preferida ya que
ésta facilita la expresión, la secreción y la maduración de los
mutantes de carbonil hidrolasa.
"Prosecuencia" se refiere a una secuencia
de aminoácidos unida a la porción N-terminal de la
forma madura de una carbonil hidrolasa que, cuando se elimina,
tiene por resultado la aparición de la forma "madura" de la
carbonil hidrolasa. Muchas enzimas proteolíticas se encuentran en la
naturaleza como productos de proenzima traduccionales y, en
ausencia de tratamiento post-traduccional, se
expresan de esta manera. Una prosecuencia preferida para producir
mutantes de carbonil hidrolasa, concretamente mutantes de
subtilisina, es la prosecuencia putativa de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, aunque pueden usarse otras
prosecuencias de subtilisina. En estos Ejemplos, se usó la secuencia
pro putativa de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC
21536).
Una "secuencia señal" o "presecuencia"
se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos unida a la porción
N-terminal de una carbonil hidrolasa o a la porción
N-terminal de una prohidrolasa que puede participar
en la secreción de la hidrolasa madura o formas pro de la
hidrolasa. Esta definición de secuencia señal es una definición
funcional, pensada para incluir todas esas secuencias de aminoácidos
codificadas por la porción N-terminal del gen de la
subtilisina o de otras carbonil hidrolasas segregables, que
participan en la realización de la secreción de la subtilisina o de
otras carbonil hidrolasas bajo condiciones originales. La presente
invención utiliza tales secuencias para realizar la secreción de los
mutantes de carbonil hidrolasa como se definen en el presente
texto. Una secuencia señal preferida usada en los Ejemplos comprende
los siete primeros restos de aminoácidos de la secuencia original
de subtilisina de Bacillus subtilis fusionados al resto de
la secuencia señal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC
21536).
Una forma "prepro" de un mutante de
carbonil hidrolasa consiste en la forma madura de la hidrolasa que
tiene una prosecuencia unida operativamente al término amino de la
hidrolasa y una secuencia "pre" o "señal" unida
operativamente al término amino de la prosecuencia.
"Vector de expresión" se refiere a una
construcción de DNA que contiene una secuencia de DNA que está
operativamente unida a una secuencia de control adecuada capaz de
efectuar la expresión de dicho DNA en un hospedador adecuado. Tales
secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la
transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal
transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión al
ribosoma del mRNA adecuados, y secuencias que controlan la
terminación de la transcripción y de la traducción. El vector puede
ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un inserto
(fragmento insertado) genómico potencial. Una vez transformado en
un hospedador adecuado, el vector puede replicar y funcionar
independientemente del genoma hospedador o, en algunos casos, puede
integrarse en el propio genoma. En la presente memoria,
"plásmido" y "vector" se usan a veces indistintamente ya
que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada en la
actualidad. Sin embargo, se pretende que la invención incluya otras
formas de vectores de expresión que sirven funciones equivalentes y
que son o lleguen a ser conocidas en la técnica.
Las "células hospedadoras" usadas en la
presente invención son generalmente hospedadores procariotas o
eucariotas que preferentemente han sido manipulados por los métodos
descritos en la Publicación EPO Nº 130 756 para hacerlos incapaces
de segregar endoproteasa activa enzimáticamente. Una célula
hospedadora preferida para expresar subtilisina es la cepa BG2036 de
Bacillus que es deficitaria en proteasa neutra
enzimáticamente activa y proteasa alcalina (subtilisina). La
construcción de la cepa BG2036 se describe con detalle en la
Publicación EPO Nº 0 130 756 y se describe además en Yang, M. Y.
et al. (1984), J. Bacteriol., 160,
15-21. Otras células hospedadoras para expresar
subtilisina incluyen Bacillus subtilis I168 (Publicación EPO
Nº 0 130 756).
Las células hospedadoras son transformadas o
transfectadas con vectores construidos usando técnicas de DNA
recombinante. Tales células hospedadoras transformadas son capaces
de replicar vectores que codifican los mutantes de carbonil
hidrolasa o bien de expresar el mutante de carbonil hidrolasa
deseado. En el caso de vectores que codifican la forma pre o prepro
del mutante de carbonil hidrolasa, tales mutantes, cuando se
expresan, son típicamente segregados de la célula hospedadora al
medio de la célula hospedadora.
"Operativamente unido", cuando describe la
relación entre dos regiones de DNA, significa simplemente que están
funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, una presecuencia
está operativamente unida a un péptido si funciona como secuencia
señal, participando en la secreción de la forma madura de la
proteína lo más probablemente implicando la segmentación de la
secuencia señal. Un promotor está operativamente unido a una
secuencia codificadora si controla la transcripción de la
secuencia; un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a
una secuencia codificadora si está situado de forma que permita la
traducción.
Los genes que codifican la carbonil hidrolasa
precursora de origen natural pueden obtenerse de acuerdo con los
métodos generales descritos en las Publicaciones EPO números 0 130
756 y 0 251 446. Como puede observarse a partir de los ejemplos
descritos en el presente texto, los métodos comprenden generalmente
sintetizar sondas marcadas que tienen secuencias putativas que
codifican regiones de la hidrolasa de interés, preparar genotecas a
partir de organismos que expresan la hidrolasa, y cribar las
genotecas en relación con el gen que interesa por hibridación con
las sondas. Los clones que se hibridan positivamente son después
cartografiados y secuenciados.
La carbonil hidrolasa clonada se usa después
para transformar una célula hospedadora con el fin de expresar la
hidrolasa. El gen de la hidrolasa se liga después en un plásmido de
número de copias elevado. Este plásmido se replica en hospedadores
en el sentido de que contiene los elementos bien conocidos
necesarios para la replicación del plásmido: un promotor
operativamente unido al gen en cuestión (que puede ser suministrado
como el promotor homólogo propio del gen si es reconocido, es
decir, transcrito, por el hospedador), una región de terminación de
la transcripción y de poliadenilación (necesaria para la estabilidad
del mRNA transcrito por el hospedador a partir del gen de la
hidrolasa en ciertas células hospedadoras eucariotas) que es exógena
o es suministrada por la región terminadora endógena del gen de la
hidrolasa y, deseablemente, un gen de selección tal como un gen de
resistencia a antibióticos que permite el mantenimiento del cultivo
continuo de células hospedadoras infectadas por el plásmido
mediante el desarrollo en un medio que contiene antibiótico. Los
plásmidos con número elevado de copias contienen también un origen
de la replicación para el hospedador, permitiendo así que se
generen grandes números de plásmidos en el citoplasma sin
limitaciones cromosómicas. Sin embargo, está dentro del alcance de
la presente invención integrar múltiples copias del gen de la
hidrolasa en el genoma del hospedador. Esto viene facilitado por
organismos procariotas y eucariotas que son particularmente
susceptibles a la recombinación homóloga.
Alternativamente, puede producirse un gen
sintético que codifica una carbonil hidrolasa precursora de origen
natural o mutante. En tal planteamiento, se determina la secuencia
de DNA y/o de aminoácidos de la hidrolasa precursora. Después de
ello se sintetizan múltiples fragmentos de DNA de cadena sencilla
sintéticos solapantes, que, al hibridarse y ligarse, producen un
DNA sintético que codifica la hidrolasa precursora. Este
planteamiento proporciona varias ventajas sobre la clonación del
gen natural, en cuanto que pueden interponerse sitios de
restricción por el DNA sin cambios en la secuencia de aminoácidos
codificada, de manera que se facilita la subsiguiente modificación
para formar carbonil hidrolasas mutantes. Además, el planteamiento
de síntesis permite ajustar el uso de codón en el gen sintético
para conformarlo con la preferencia codónica para los hospedadores
de expresión particulares que han de usarse. Un ejemplo de
construcción de gen sintético se expone en los Ejemplos.
Una vez que el gen de la carbonil hidrolasa
precursora de origen natural o sintético ha sido clonado, se
realizan varias modificaciones para potenciar el uso del gen más
allá de la síntesis de la carbonil hidrolasa precursora de origen
natural. Tales modificaciones incluyen la producción de carbonil
hidrolasas recombinantes como se describe en las Publicaciones EPO
números 0 130 756 y 0 251 446 y la producción de mutantes de
carbonil hidrolasa descritos en el presente texto.
El siguiente método de mutagénesis por casete
puede ser usado para facilitar la construcción e identificación de
los mutantes de carbonil hidrolasa según la presente invención,
aunque pueden usarse otros métodos, incluyendo la mutagénesis
dirigida a un sitio. En primer lugar, se obtiene el gen de origen
natural que codifica la hidrolasa y se secuencia total o
parcialmente. Después se criba la secuencia en relación con un punto
en el cual se desea hacer una mutación (deleción, inserción o
sustitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Las
secuencias que flanquean este punto son evaluadas en cuanto a la
presencia de sitios de restricción para reemplazar un segmento
corto del gen con un pool de oligonucleótidos que cuando se
expresan codifiquen varios mutantes. Tales sitios de restricción
son preferentemente sitios únicos dentro del gen de la hidrolasa
para facilitar el reemplazo del segmento génico. Sin embargo, puede
usarse cualquier sitio de restricción conveniente que no sea
excesivamente redundante en el gen de la hidrolasa, siempre y cuando
los fragmentos génicos generados por digestión de restricción
puedan ser reensamblados en la secuencia apropiada. Si no existen
sitios de restricción en posiciones dentro de una distancia
conveniente del punto elegido (de 10 a 15 nucleótidos), tales
sitios son generados sustituyendo nucleótidos en el gen de tal
manera que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados se
cambien en la construcción final. La mutación del gen para que
cambie su secuencia para conformarse a la secuencia deseada se
realiza por extensión del cebador M13 de acuerdo con métodos
generalmente conocidos. La tarea de localizar regiones flanqueantes
adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar a dos
secuencias de sitio de restricción convenientes se hace rutina por
la redundancia del código genético, un mapa de enzimas de
restricción del gen y el gran número de enzimas de restricción
diferentes. Se ha de observar que si se dispone de un sitio de
restricción flanqueante conveniente, solamente se necesita usar el
método anterior en relación con la región flanqueante que no
contiene un sitio.
Una vez clonado el DNA de origen natural o el
DNA sintético, los sitios de restricción que flanquean las
posiciones a mutar son digeridos con las enzimas de restricción
cognadas o análogas y se liga en los genes una diversidad de
casetes de oligonucleótidos complementarias en términos finales. La
mutagénesis se simplifica enormemente por este método porque todos
los oligonucleótidos pueden ser sintetizados de forma que tengan los
mismos sitios de restrición, y no son necesarios enlazadores
sintéticos para crear los sitios de restricción.
Tal como se usa en el presente texto, la
actividad proteolítica se define como la velocidad de hidrólisis de
enlaces peptídicos por miligramo de enzima activa. Existen muchos
procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica
(K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in
Biochemial Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed.,
1988).
De acuerdo con la invención, se ha determinado
que los restos equivalentes a +274 en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens son importantes en la modulación de las
características globales del comportamiento de la enzima en
composiciones detergentes. Así, como se expone en los Ejemplos, la
treonina en la subtilisina de Bacillus lentus en posición
equivalente +274 puede ser mutada a alanina en la realización
preferida para producir un mejor comportamiento de la enzima
mutante. Como también se describe en los ejemplos, la sustitución de
este resto con un aminoácido distinto de la treonina, p. ej.
leucina, serina, valina y alanina, tiene por resultado una
disminución de la estabilidad del mutante. Se cree que tal
disminución de la estabilidad es el resultado de la degradación
autocatalítica del mutante. Así, las modificaciones de restos
equivalentes a +274 en la sutilisina de Bacillus son capaces
de mejorar el comportamiento global de la enzima en una composición
detergente y modular la estabilidad global de la enzima. En este
aspecto de la invención, el objetivo es asegurar una carbonil
hidrolasa mutante que tiene un comportamiento mejorado cuando se usa
en una composición detergente, en comparación con la carbonil
hidrolasa precursora. Como se usa en el presente texto, el
comportamiento mejorado en un detergente se define como el aumento
de la limpieza de ciertas manchas sensibles a las enzimas, tales
como las de hierba o de sangre. Esta limpieza se determina por
evaluación visual después de un ciclo de lavado estándar.
En los Ejemplos se expone una realización
preferida de la invención en la que la lisina en posición 27 está
sustituida con arginina, la valina en posición 104 está sustituida
con tirosina, la asparagina en posición 123 está sustituida con
serina y la treonina en el resto 274 está sustituida con alanina en
la subtilisina de Bacillus lentus. Aunque la estabilidad de
esta enzima es algo reducida en comparación con la subtilisina
precursora de Bacillus lentus, el nivel de comportamiento de
esta enzima en una composición detergente está sustancialmente
mejorado de forma que se obtiene el mismo comportamiento de este
mutante de subtilisina de Bacillus lentus en comparación con
la subtilisina de Bacillus lentus sin modificar, que cuando
se usa aproximadamente la mitad de la cantidad de esta enzima.
Basándose en los resultados obtenidos con esta y
otras subtilisinas mutantes, es evidente que los restos en carbonil
hidrolasas equivalentes a las posiciones +123 y +274 en Bacillus
amyloliquefaciens son importantes para la actividad
proteolítica, el comportamiento y/o la estabilidad de estas
enzimas.
Muchas de las carbonil hidrolasas producidas
según la invención, especialmente la subtilisina, son útiles para
formular varias composiciones detergentes. Cierto número de
compuestos conocidos son agentes tensioactivos adecuados, útiles en
composiciones que comprenden los mutantes de carbonil hidrolasa de
la invención. Estos incluyen detergentes no iónicos, aniónicos,
catiónicos o zwitteriónicos, como se describen en la patente de
EE.UU. nº 4.404.128 de Barry J. Anderson y en la patente de EE.UU.
nº 4.261.868 de Jiri Flora et al. La técnica es familiar con
las diferentes formulaciones que pueden ser usadas como
composiciones para limpieza.
Las subtilisinas producidas según la invención
pueden ser formuladas en detergentes en polvo y líquidos conocidos,
que tienen un pH entre 6,5 y 12,0 a concentraciones de
aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5%, preferentemente de 0,1%
a 0,05% en peso. Estas composiciones detergentes para limpieza
pueden también incluir otras enzimas tales como proteasas y
amilasas conocidas, así como mejoradores y estabilizantes.
La adición de subtilisinas producidas según la
invención a composiciones para limpieza convencionales no crea
ninguna limitación especial de uso. En otras palabras, cualquier
temperatura y pH que sean adecuados para el detergente son también
adecuados para las presentes composiciones, siempre y cuando el pH
esté dentro del intervalo anterior, y la temperatura sea inferior a
la temperatura de desnaturalización de las subtilisinas de la
presente invención. Además, las subtilisinas producidas según la
invención pueden usarse en una composición para limpieza sin
detergentes, también en este caso solas o en combinación con
mejoradores y estabilizantes.
Lo que sigue se presenta a título de ejemplo y
no ha de considerarse como limitación del alcance de las
reivindicaciones.
El plásmido pSAR, Fig. 5, lleva una fusión
traduccional por medio de un sitio de restricción Sau3A común en el
codón de la secuencia señal séptimo/octavo de los genes de
subtilisina de B. subtilis y B. amyloliquefaciens.
Como se muestra en la Fig. 5, este gen, en un fragmento
EcoRI-BamHI de 2,0 kb, fue subclonado en M13mp19 con
el fin de aislar DNA molde de cadena sencilla para usarlo para la
mutagénesis dirigida al sitio para formar
pSAR-Q275R. El protocolo de mutagénesis fue
esencialmente el de Zoller, M. et al. (1983), Methods
Enzymol., 100, 468-500, (1) y usó un
oligonucleótido sintético de secuencia:
en la que los asteriscos indican
cambios respecto de las secuencias génicas de tipo silvestre, y el
subrayado representa un sitio de endonucleasa de restricción PstI
introducido, usado en el cribado para el gen mutante en particular
que codifica el cambio Q275R. Estos cambios se hicieron para (1)
convertir el aminoácido de esta posición en el encontrado en la
subtilisina de Bacillus lentus y (2) para permitir la
conexión del terminador en pSAR con la región de codificación madura
de Bacillus lentus a través de un sitio Pst introducido de la
misma forma en el pGG36 de Bacillus lentus (ATCC
21536).
El plásmido pGG36, Fig. 5, contiene un fragmento
de DNA genómico de 2,1 kb de Bacillus lentus (ATCC 21536)
que codifica el gen completo de la subtilisina que fue clonado por
métodos estándar en el vector lanzadera pBS42. Band, L., et
al. (1984), DNA, 3, 17-21.
La secuencia de aminoácidos para esta
subtilisina es la misma que la descrita para la subtilisina 309 en
la Publicación PCT Nº 89/06279. Este gen fue subclonado en M13 como
anteriormente para mutagénesis dirigida al sitio usando un
oligonucleótido de secuencia:
con el fin de 1) introducir un
sitio PstI en la misma situación de este gen que corresponde al
sitio introducido en pSAR anteriormente y 2) para sustituir la
treonina en posición 274 con alanina, para formar
pGG36-T274A.
Los genes mutantes pSAR-Q275R y
pGG36-T274A fueron subclonados individualmente de
nuevo en pBS42 antes de las digestiones con PstI/BamHI, el
aislamiento del fragmento y la ligación, para producir el plásmido
GG-A274B.amy.term. como se muestra en la Fig. 5,
todo ello por métodos estándar.
Se preparó un enlazador de DNA sintético
mediante reasociación de oligonucleótidos de cadena sencilla
complementarios de secuencias:
para dar el fragmento nº 2 de DNA
de cadena doble que se muestra en la Fig. 6. Los extremos ahuecados
de la izquierda y de la derecha de este enlazador dúplex son
complementarios al extremo Sau3A del fragmento nº 1 (de pSAR) y el
extremo ClaI del fragmento nº 3 (de pGG-A274
B.amy.term), respectivamente. Estos 3 fragmentos se combinaron con
el fragmento 4 de pSAR-Q275R después de las
digestiones con endonucleasa de restricción de los plásmidos, el
aislamiento del fragmento y la ligación por métodos estándar, para
producir el plásmido pGG-KVNA. La designación
GG-KVNA indica que esta subtilisina contiene la
subtilisina codificada por pGG-36 que incluye
lisina (K) en la posición 27, valina (V) en la posición 104,
asparagina (N) en la posición 123 y la sustitución de treonina en
la posición 274 por alanina
(A).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se indica en la Fig. 6, el gen
GG-KVNA (fragmento EcoRI-BamHI de
2,1 kb) fue subclonado en M13 durante tres rondas sucesivas de
mutagénesis dirigida al sitio usando oligonucleótidos que tienen la
secuencia:
Los asteriscos indican cambios respecto de la
secuencia del gen de tipo silvestre. Los subrayados representan en
(a) un sitio XbaI introducido y en (b) y (c) sitios NheI
introducidos usados para cribar la presencia de las mutaciones R27,
Y104 y S123 unidas, respectivamente. Además, en (c), el sobrerrayado
indica un sitio SphI destruido. Finalmente, el gen
GG-RYSA de 2,1 kb fue vuelto a subclonar en pBS42
para la expresión en hospedadores B. subtilis.
El plásmido resultante se designó
pGG-RYSA. Esta designación indica que se modificaron
cuatro restos en el plásmido pGG-KVNA. Lisina (K)
en posición 27 a arginina (R), valina (V) a tirosina (Y) en posición
104 y asparagina (N) en posición 123 a serina (S). La alanina
anteriormente sustituida en el resto 274 no se modificó en este
procedimiento.
La lisina en posición 27 fue sustituida con
arginina basándose en la secuenciación de aminoácidos de la
subtilisina 309. Como se indica en la Publicación PCT nº WO
89/06279, la lisina está situada en posición 27. Sin embargo,
después de secuenciar independientemente esta proteína de
subtilisina, los datos iniciales indicaron que la arginina era el
resto en posición 27. En el caso de la sustitución de tirosina por
valina en el resto 104, la sustitución se hizo para reducir el
perfil de actividad de pH y para aumentar el rendimiento de la
enzima basándose en resultados anteriormente obtenidos para la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (a veces
denominada BPN'). La sustitución de asparagina en posición 123 con
serina se basa en los resultados obtenidos más adelante en los que
se determinó que la sustitución de serina en posición 123 maximizaba
la actividad proteolítica de la enzima en un mutante estrechamente
relacionado.
El DNA que codifica la secuencia de aminoácidos
de la subtilisina de Bacillus lentus fue también preparado
construyendo un gen que codifica una secuencia de DNA sintética.
Se secuenció el fragmento genómico HindIII de
2,1 kb del plásmido pGG36. La secuencia de aminoácidos deducida del
producto génico maduro (subtilisina GG36) se usó para diseñar una
secuencia de codificación madura sintética con las propiedades
siguientes: (1) En general, se utilizaron los codones más
frecuentemente encontrados para cada aminoácido en siete genes de
B. subtilis diferentes (de una tabulación de usos de codón,
Tabla 2 de Maruyama, T. et al., (1986), Nucl. Acids
Res., Supplement 14, pág. r151-r197),
excepto en los casos en los que codones alternativos tenían por
resultado sitios de reconocimiento de enzima de restricción dentro
del gen localizados convenientemente. (2) Aproximadamente cada
40-60 p. b. de la región de codificación madura de
\sim0,8 kb, se utilizaron combinaciones de 2 ó 3 codones elegidos
específicamente que dieron por resultado la introducción de sitios
de restricción únicos bastante igualmente espaciados. Estos sitios
fueron elegidos para facilitar (a) mutagénesis en casete
posteriores y estudios de cribado y (b) construcciones que implican
más de una mutación. (3) Se diseñó un sitio de reconocimiento de
PsT I único para cubrir los codones 272-274
permitiendo la conexión a las secuencias terminadoras de un gen de
Bacillus amyloliquefaciens modificado de modo similar sobre
los mismos tres codones y sustituyendo la treonina en posición 274
con alanina. Y (4) se introdujo un único sitio NruI para cubrir los
restos 9-10 de codones maduros permitiendo la
conexión a la secuencia codificadora de pre-pro de
GG36 mediante un enlazador de DNA duplex sintético corto. Basándose
en este diseño, se sintetizaron oligonucleótidos ("oligos") de
forma que al reasociarse los oligos codificadores y no codificadores
para una región de codificación de \sim60 p. b. dada, el
fragmento de DNA duplex resultante tuviese en sus extremos regiones
de cadena simple complementarias con el extremo del siguiente
fragmento duplex del gen (véase la Fig. 7).
Un total de 36 oligos diferentes (que comprenden
18 duplex individuales) fueron usados en el esquema, como se señaló
antes, dando por resultado una región de codificación madura
sintética duplex de \sim0,8 kb (Fragmento 3 en la Fig. 8).
Finalmente, se sintetizó un par adicional de
oligos sintéticos que al reasociarse (para dar el fragmento 2 en la
Fig. 8) tiene un sitio NcoI en su extremo 5' (complementario al
sitio NcoI de GG36 en los codones maduros 5-6) y un
sitio NruI en su extremo 3' (complementario al extremo 3' 5' del
fragmento 3).
La construcción final para dar una unidad de
expresión completa consistente en promotor de B. subtilis y
los siete primeros aminoácidos de la secuencia señal conectados a
secuencias de GG36 que codifican el resto de la secuencia señal, la
secuencia pro completa y los seis primeros aminoácidos maduros
(Fragmento 1 de GG-KVNA), el gen sintético que
codifica los restos 7-274 maduros (Fragmentos 2+3) y
la región terminadora (incluyendo el codón 279 del gen maduro final)
de Bacillus amyloliquefaciens (fragmento 4), se hizo como
ligación en cuatro vías como se expone en la Figura 6.
Finalmente, se introdujeron otras tres
mutaciones distintas en la región de codificación madura de este gen
híbrido de longitud completa. La primera sustituyó la lisina en
posición 27 con arginina. La segunda sustituyó la valina en
posición 104 con tirosina. La tercera sustituyó la asparagina en
posición 123 con serina. El plásmido resultante se designa
pBC3-RYSA. El ejemplo siguiente describe el método
usado para modificar la posición 123 en el gen sintético. Métodos
similares fueron usados para modificar las posiciones 27 y 104 en
este gen sintético.
Se introdujo un sitio XhoI sobre los codones
111/112 en el gen sintético del Ejemplo 3 haciendo tres mutaciones
fenotípicamente silenciosas por medio de una mutagénesis dirigida al
sitio (mutagénesis de extensión del cebador en M13). El plásmido
resultante, pX123 (Fig. 9), fue digerido con Xho I y Ava I y el
fragmento grande que contiene el vector se aisló mediante
electroelución en gel de agarosa. Los oligonucleótidos sintéticos
complementarios fueron reasociados, ligados con el fragmento grande
de pX123 y transformados en la cepa MM294 de E. coli. Estas
casetes codificaban, individualmente, los 20 aminoácidos naturales
en posición 123, y además contenían una mutación silenciosa que
destruía un sitio Sph I único situado entre los sitios Xho I y Ava I
en pX123. Los plásmidos resultantes a partir de transformantes de
E. coli fueron cribados en relación con la pérdida del sitio
Sph I único. Los positivos por análisis de restricción (es decir,
negativos para Sph I) se secuenciaron para confirmar la presencia de
las mutaciones en posición 123 deseadas, se subclonaron en el vector
lanzadera pBS42 y se transformaron en Bacillus subtilis
BG2036 para expresión.
La actividad proteolítica de cada uno de los
mutantes de subtilisina codificados por los mutantes en posición
+123 anteriormente modificados fue ensayada mezclando 0,04 mL de
sobrenadante de caldos de cultivo centrifugados, con 0,56 mL de
caseína al 1% p/v en Tris 0,1 M pH 8,60. Después de 20 minutos de
incubación a 37ºC, las reacciones se apagaron por precipitación con
ácido tricloroacético (TCA) al 10%. La actividad se determinó a
partir de la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm para el
sobrenadante después de la precipitación con TCA al 10%.
\vskip1.000000\baselineskip
En el proceso de confirmación final de la
secuencia de DNA del gen sintético que codifica la enzima
BC3-RYSA, se encontró que hay prolina en la
posición 78 en vez de serina (el aminoácido en esta posición en la
subtilisina de Bacillus lentus). Las propiedades iniciales de
las mutaciones en la posición 123 fueron ensayadas en esta enzima,
BC3-RPYA (prolina en posición 78). Estos resultados
se muestran en la Tabla I. El aminoácido en posición 78 fue después
cambiado de nuevo a serina para formar el DNA y la secuencia de
aminoácidos que se muestran en la Fig. 10 reemplazando el dúplex de
DNA sintético correspondiente a esa posición del gen.
Como puede observarse, la sustitución de Asn con
Ser en la posición 123 tiene por resultado un aumento sustancial de
la actividad proteolítica. La relación entre las diversas
subtilisinas discutidas en el presente texto se resumen para las
posiciones 27, 78, 104, 123 y 274 en la Tabla II.
La estabilidad de los mutantes en la posición
274 en BC3-RPY (arginina en posición 27, prolina en
posición 78 y tirosina en posición 104 en la subtilisina de
Bacillus lentus) se muestra en la Tabla III. Los datos son
porcentaje de actividad que queda después de la incubación a 37ºC en
EDTA 50 mM durante 60 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mutaciones en esta posición afectan
claramente a la estabilidad de la enzima. Aunque la mutación de
alanina no era tan estable como la serina o la treonina en esta
posición, esta enzima proporcionó un mejor rendimiento en relación
con la subtilisina de Bacillus lentus bajo las condiciones de
empleo descritas. Para diferentes aplicaciones, pueden usarse otros
aminoácidos en posición 274.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un granulado detergente de fosfato
secado por pulverización, de la composición siguiente:
\newpage
Una solución al 0,1 por ciento en peso de esta
composición en agua tenía un pH de 10,0. La composición con mutante
de subtilisina de la invención (Fig. 7) proporcionó una mejor
limpieza de manchas sensibles a enzimas en comparación con
Bacillus lentus a 0,068 mg de enzima activa/g de producto, en
un lavado a 35ºC a una dureza de 102,6 mg/L (3:1 Ca/Mg).
A lo largo de esta solicitud se hace referencia
a varios aminoácidos por medio de códigos comunes de una y tres
letras. Tales códigos se identifican en Proteins: Structures and
Molecular Proteases, Thomas E. Creighton, ed. W.N. Freeman,
N.Y., N.Y. (1983), p. 3.
Aunque la forma preferida de la invención ha
sido descrita anteriormente, será evidente para los expertos en la
técnica a la que pertenece la invención que, después de entender la
invención en su conjunto, se pueden hacer varios cambios y
modificaciones equivalentes sin apartarse del alcance de la
invención como se define mediante las reivindicaciones anexas.
Claims (11)
1. Un método de alterar la estabilidad de una
carbonil hidrolasa que comprende:
proporcionar una secuencia de DNA precursora que
codifica una carbonil hidrolasa precursora;
modificar dicha secuencia de DNA precursora para
que proporcione una secuencia de DNA mutante que codifica una
carbonil hidrolasa mutante que tiene una secuencia de aminoácidos
que no se encuentra en la naturaleza y que difiere de dicha
carbonil hidrolasa precursora en la sustitución de un aminoácido
distinto por el resto de aminoácido que está en una posición en
dicho precursor equivalente a la posición +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, en donde el mutante tiene una
estabilidad alterada en comparación con la carbonil hidrolasa
precursora, y
expresar dicha carbonil hidrolasa mutante a
partir de dicha secuencia de DNA mutante.
2. El método de la reivindicación 1ª, en el que
dicha carbonil hidrolasa precursora es una subtilisina.
3. El método dela reivindicación 2ª, en el que
dicha carbonil hidrolasa precursora es una subtilisina de
Bacillus.
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que el mutante muestra un
comportamiento mejorado cuando se usa en una composición
detergente, definido como el aumento en la capacidad de limpieza de
manchas sensibles a las enzimas, tal como se determina por
evaluación visual después de un ciclo de lavado estándar.
5. Un método de preparar una secuencia de DNA
mutante que codifica una carbonil hidrolasa mutante, que
comprende:
proporcionar una secuencia de DNA precursora que
codifica una carbonil hidrolasa precursora; y
modificar dicha secuencia de DNA precursora para
que proporcione una secuencia de DNA mutante que codifica una
carbonil hidrolasa mutante que tiene una secuencia de aminoácidos
que no se encuentra en la naturaleza y que difiere de dicha
carbonil hidrolasa precursora en la sustitución de un aminoácido
diferente por el resto de aminoácido que está en una posición en
dicho precursor equivalente a la posición +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, y además en el que el mutante
tiene una estabilidad alterada en comparación con la carbonil
hidrolasa precursora.
6. Un método de preparar un vector de expresión
que comprende preparar una secuencia de DNA mutante que codifica
una carbonil hidrolasa mutante por el método de la reivindicación 5,
e introducir la secuencia de DNA mutante en un vector de
expresión.
7. Un método de preparar células hospedadoras
que comprende preparar un vector de expresión por el método de la
reivindicación 6, y transformar las células hospedadoras con dicho
vector de expresión.
8. Un método de preparar una carbonil hidrolasa
mutante que comprende las etapas de preparar las células
hospedadoras por el método de la reivindicación 7, cultivar las
células hospedadoras y separar la carbonil hidrolasa mutante
producida, en donde la carbonil hidrolasa mutante tiene una
secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza y que
difiere de dicha carbonil hidrolasa precursora en la sustitución de
un aminoácido diferente por el resto de aminoácido que está en una
posición en dicho precursor equivalente a la posición +274 en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, en donde el
mutante tiene una estabilidad alterada en comparación con la
carbonil hidrolasa precursora.
9. Un método de preparar una composición
enzimática para limpieza capaz de degradar proteínas que comprende
un tensioactivo y un mutante de carbonil hidrolasa, comprendiendo el
método las etapas de preparar una carbonil hidrolasa mutante por el
método de la reivindicación 8 y formular dicha carbonil hidrolasa
mutante con un tensioactivo, en donde la carbonil hidrolasa mutante
tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la
naturaleza y que difiere de dicha carbonil hidrolasa precursora en
la sustitución de un aminoácido diferente por el resto de aminoácido
que está en una posición en dicho precursor equivalente a +274 en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, en donde el
mutante tiene una estabilidad alterada en comparación con la
carbonil hidrolasa precursora.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
el tensioactivo comprende un detergente.
11. El método de la reivindicación 9 o la
reivindicación 10, en el que la composición está formulada como un
gránulo detergente secado por pulverización.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US42988289A | 1989-10-31 | 1989-10-31 | |
| US429882 | 1989-10-31 | ||
| US600430 | 1990-10-19 | ||
| US07/600,430 US5185258A (en) | 1984-05-29 | 1990-10-19 | Subtilisin mutants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2242963T3 ES2242963T3 (es) | 2005-11-16 |
| ES2242963T5 true ES2242963T5 (es) | 2009-08-27 |
Family
ID=27028376
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96120247T Expired - Lifetime ES2242963T5 (es) | 1989-10-31 | 1990-10-26 | Mutantes de subtilisina. |
| ES90915958T Expired - Lifetime ES2125224T3 (es) | 1989-10-31 | 1990-10-26 | Mutantes de subtilisina. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES90915958T Expired - Lifetime ES2125224T3 (es) | 1989-10-31 | 1990-10-26 | Mutantes de subtilisina. |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5185258A (es) |
| EP (2) | EP0775749B2 (es) |
| JP (1) | JP3335623B2 (es) |
| KR (1) | KR970004938B1 (es) |
| CN (1) | CN1052897A (es) |
| AR (1) | AR244339A1 (es) |
| AT (2) | ATE174961T1 (es) |
| AU (1) | AU633376B2 (es) |
| BR (1) | BR9006993A (es) |
| CA (1) | CA2044630C (es) |
| DE (2) | DE69032852T2 (es) |
| DK (2) | DK0451244T3 (es) |
| ES (2) | ES2242963T5 (es) |
| FI (1) | FI103052B1 (es) |
| IE (1) | IE62771B1 (es) |
| MA (1) | MA22573A1 (es) |
| NO (1) | NO301081B1 (es) |
| NZ (1) | NZ235883A (es) |
| PT (1) | PT95741B (es) |
| TR (1) | TR25991A (es) |
| WO (1) | WO1991006637A1 (es) |
Families Citing this family (143)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6287841B1 (en) * | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| US5352603A (en) * | 1989-08-31 | 1994-10-04 | Kali-Chemie Ag | Highly alkaline proteases |
| DK271490D0 (da) * | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
| US5482849A (en) * | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
| DE69128094T2 (de) * | 1990-12-21 | 1998-03-19 | Novonordisk As | Enzym-mutanten mit einer geringen variation der molekularladung über einen ph-bereich |
| DK0583339T3 (da) * | 1991-05-01 | 1999-04-19 | Novo Nordisk As | Stabiliserede enzymer og detergentsammensætninger |
| US5340735A (en) * | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
| DE4224125A1 (de) * | 1991-07-27 | 1993-01-28 | Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg | Verfahren zur verbesserung der stabilitaet von enzymen und stabilisierte enzyme |
| US6300122B1 (en) | 1991-12-20 | 2001-10-09 | Genencor International | Method for applying enzyme to non-finished cellulosic-containing fabrics to improve appearance and feel characteristics |
| EP0571014B1 (en) * | 1992-05-18 | 2004-03-31 | Genencor International, Inc. | Bacteria producing alkaline proteases, and production of these alkaline proteases |
| US6251144B1 (en) | 1992-06-12 | 2001-06-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatic compositions and methods for producing stonewashed look on indigo-dyed denim fabric and garments |
| CA2139928C (en) * | 1992-07-17 | 2005-09-06 | Leonardus Johannes Sofie Marie Mulleners | High alkaline serine proteases |
| US5470733A (en) * | 1993-06-01 | 1995-11-28 | University Of Maryland | Calcium free subtilisin mutants |
| US5567601A (en) * | 1993-06-01 | 1996-10-22 | University Of Maryland | Subtilisin mutants lacking a primary calcium binding site |
| US6436690B1 (en) * | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
| US6440717B1 (en) * | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| MA23346A1 (fr) * | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
| ES2199978T3 (es) * | 1993-10-14 | 2004-03-01 | THE PROCTER & GAMBLE COMPANY | Composiciones de blanqueo que comprenden enzimas proteasa. |
| EP0723579B1 (en) * | 1993-10-14 | 2007-05-02 | The Procter & Gamble Company | Protease-containing cleaning compositions |
| US5932532A (en) * | 1993-10-14 | 1999-08-03 | Procter & Gamble Company | Bleach compositions comprising protease enzyme |
| US6187579B1 (en) * | 1993-10-28 | 2001-02-13 | Carlsberg A/S | Customized proteases |
| ES2364776T3 (es) * | 1994-02-24 | 2011-09-14 | HENKEL AG & CO. KGAA | Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen. |
| US6599730B1 (en) * | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US5922082A (en) | 1994-06-16 | 1999-07-13 | Procter & Gamble Company | Detergent composition containing wool compatible high alkaline proteases |
| EP0687733A1 (en) * | 1994-06-16 | 1995-12-20 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition containing wool compatible high alkaline proteases |
| NZ291984A (en) * | 1994-08-11 | 1998-04-27 | Genencor Int | Bleach-containing cleaning composition comprising a mutant alpha-amylase and optionally a mutant protease |
| GB9416841D0 (en) | 1994-08-19 | 1994-10-12 | Finnfeeds Int Ltd | An enzyme feed additive and animal feed including it |
| US5578136A (en) | 1994-08-31 | 1996-11-26 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing compositions comprising quaternary substituted bleach activators |
| US6066611A (en) * | 1994-10-13 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
| US6455295B1 (en) * | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6475765B1 (en) * | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| IL117350A0 (en) * | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US5837517A (en) * | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
| US6946280B1 (en) * | 1996-03-29 | 2005-09-20 | Genencor International, Inc. | Enzyme multimer and process of producing same |
| US5985627A (en) * | 1997-02-28 | 1999-11-16 | Carlsberg Laboratory | Modified carboxypeptidase |
| US6284246B1 (en) | 1997-07-30 | 2001-09-04 | The Procter & Gamble Co. | Modified polypeptides with high activity and reduced allergenicity |
| ES2368718T3 (es) | 1997-10-23 | 2011-11-21 | Danisco Us Inc. | Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones. |
| PL342710A1 (en) | 1997-12-20 | 2001-07-02 | Genencor Int | Matrix granule |
| AU2089499A (en) | 1997-12-20 | 1999-07-12 | Genencor International, Inc. | Accelerated stability test |
| EP1042443B1 (en) | 1997-12-20 | 2006-11-02 | Genencor International, Inc. | Granule with hydrated barrier material |
| US6423517B2 (en) | 1997-12-20 | 2002-07-23 | Genecor International, Inc. | Granule containing protein and salt layered on an inert particle |
| WO1999034011A2 (en) | 1997-12-24 | 1999-07-08 | Genencor International, Inc. | Method of assaying for a preferred enzyme and/or detergent |
| US6835550B1 (en) | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
| US6642011B2 (en) | 1998-04-15 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins |
| US6936249B1 (en) * | 1998-04-15 | 2005-08-30 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| EP1086211B1 (en) | 1998-06-10 | 2011-10-12 | Novozymes A/S | Novel mannanases |
| US6376450B1 (en) | 1998-10-23 | 2002-04-23 | Chanchal Kumar Ghosh | Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants |
| US6831053B1 (en) | 1998-10-23 | 2004-12-14 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants |
| CA2344673A1 (en) | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Nathaniel Becker | Matrix granule |
| PT1129163E (pt) | 1998-11-13 | 2011-02-11 | Danisco Us Inc | Grânulo de baixa densidade em leito fluidizado |
| US6579841B1 (en) | 1998-12-18 | 2003-06-17 | Genencor International, Inc. | Variant EGIII-like cellulase compositions |
| JP2002534076A (ja) | 1999-01-08 | 2002-10-15 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | 低密度組成物および同組成物を包含する微粒子 |
| DE60044652D1 (de) | 1999-10-15 | 2010-08-19 | Danisco Us Inc | Proteinhaltige Körnchen und Granulatformulierungen |
| US7297354B2 (en) * | 2000-04-26 | 2007-11-20 | Land O'lakes, Inc. | Protein material |
| AU2001280968A1 (en) * | 2000-07-31 | 2002-02-13 | Menzel, Rolf | Compositions and methods for directed gene assembly |
| US6623949B1 (en) * | 2000-08-04 | 2003-09-23 | Genencor International, Inc. | Variant EGIII-like cellulase compositions |
| US6635465B1 (en) | 2000-08-04 | 2003-10-21 | Genencor International, Inc. | Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same |
| US7303907B2 (en) | 2001-01-08 | 2007-12-04 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
| EP1241112A3 (en) | 2001-03-15 | 2003-02-26 | The Procter & Gamble Company | Flexible multiple compartment pouch |
| CA2441595C (en) * | 2001-03-23 | 2012-07-03 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| US8076113B2 (en) * | 2001-04-02 | 2011-12-13 | Danisco Us Inc. | Method for producing granules with reduced dust potential comprising an antifoam agent |
| ATE376587T1 (de) | 2001-06-22 | 2007-11-15 | Genencor Int | Granulat mit hoher schlagfestigkeit |
| US7157416B2 (en) * | 2001-07-20 | 2007-01-02 | Genencor International, Inc. | Stabilization of enzymes |
| EP1554378A4 (en) * | 2001-12-31 | 2006-01-11 | Genencor Int | PROTEASES PRODUCING MODIFIED IMMUNOGEN RESPONSE AND METHODS OF PRODUCTION AND USE |
| JP2005514026A (ja) * | 2001-12-31 | 2005-05-19 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 免疫反応の変化を生じるプロテアーゼ、ならびにその製造および利用方法 |
| EP2287321B1 (en) * | 2002-01-16 | 2014-08-13 | Danisco US Inc. | Multiply-substituted protease variants |
| AU2003210552A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-09-02 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
| JP4430944B2 (ja) * | 2002-02-26 | 2010-03-10 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | タンパク質の相対免疫原性をランク付けるための集団ベースの評価及び手段 |
| ATE457352T1 (de) * | 2002-02-26 | 2010-02-15 | Genencor Int | Subtilisin-carlsberg-proteine mit verminderter immunogenität |
| WO2003099843A2 (en) | 2002-05-20 | 2003-12-04 | Dow Corning Corporation | Peptide derivatives, and their use for the synthesis of silicon-based composite materials |
| KR101211445B1 (ko) | 2002-07-30 | 2012-12-12 | 다니스코 유에스 인크. | 에어로졸 발생을 감소시킨 제형물 |
| KR101132555B1 (ko) * | 2002-10-02 | 2012-04-02 | 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법 |
| US20070025974A1 (en) * | 2003-02-26 | 2007-02-01 | Hardings Fiona A | Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| EP2500423B1 (en) | 2003-02-26 | 2015-06-17 | Danisco US Inc. | Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| DE10360805A1 (de) | 2003-12-23 | 2005-07-28 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| DE102004019751A1 (de) | 2004-04-23 | 2005-11-17 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Alkalischen Proteasen |
| EP1740952A2 (en) * | 2004-04-26 | 2007-01-10 | Genencor International, Inc. | Population based prediction methods for immune response determinations and methods for verifying immunological response data |
| JP2007536413A (ja) | 2004-05-17 | 2007-12-13 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 炭水化物オキシダーゼを含む漂白組成物 |
| US20090060933A1 (en) * | 2004-06-14 | 2009-03-05 | Estell David A | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| US20080176790A1 (en) | 2004-10-29 | 2008-07-24 | Defrees Shawn | Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf) |
| US7686892B2 (en) | 2004-11-19 | 2010-03-30 | The Procter & Gamble Company | Whiteness perception compositions |
| JP2009509750A (ja) | 2005-09-27 | 2009-03-12 | ザ・プロクター・アンド・ギャンブル・カンパニー | マイクロカプセル及びその製造方法 |
| GB0603775D0 (en) * | 2006-02-24 | 2006-04-05 | Health Prot Agency | Infectivity assay |
| DK2007506T3 (da) | 2006-03-31 | 2014-06-16 | Danisco Us Inc | Tangentialstrømningsfiltreringsapparater, -systemer og -fremgangsmådertil separering af forbindelser |
| DE102007029643A1 (de) | 2006-09-08 | 2009-01-15 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Reinigungsmittel |
| BRPI0817376B1 (pt) | 2007-09-12 | 2019-05-14 | Danisco Us Inc. | Sistema de filtração com controle interno de incrustação |
| DK3196302T3 (da) | 2008-02-14 | 2020-09-14 | Danisco Us Inc | Små enzymholdige granuler |
| US8293697B2 (en) | 2009-03-18 | 2012-10-23 | The Procter & Gamble Company | Structured fluid detergent compositions comprising dibenzylidene sorbitol acetal derivatives |
| US8153574B2 (en) | 2009-03-18 | 2012-04-10 | The Procter & Gamble Company | Structured fluid detergent compositions comprising dibenzylidene polyol acetal derivatives and detersive enzymes |
| WO2010138347A1 (en) | 2009-05-26 | 2010-12-02 | The Procter & Gamble Company | Aqueous liquid composition for pre-treating soiled dishware |
| WO2011005623A1 (en) | 2009-07-09 | 2011-01-13 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition comprising low level of bleach |
| US20110009307A1 (en) | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Alan Thomas Brooker | Laundry Detergent Composition Comprising Low Level of Sulphate |
| WO2011025624A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-03-03 | Akzo Nobel N.V. | Graft copolymers |
| DE102010063457A1 (de) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase |
| US8841246B2 (en) | 2011-08-05 | 2014-09-23 | Ecolab Usa Inc. | Cleaning composition containing a polysaccharide hybrid polymer composition and methods of improving drainage |
| US8853144B2 (en) | 2011-08-05 | 2014-10-07 | Ecolab Usa Inc. | Cleaning composition containing a polysaccharide graft polymer composition and methods of improving drainage |
| US8636918B2 (en) | 2011-08-05 | 2014-01-28 | Ecolab Usa Inc. | Cleaning composition containing a polysaccharide hybrid polymer composition and methods of controlling hard water scale |
| US8679366B2 (en) | 2011-08-05 | 2014-03-25 | Ecolab Usa Inc. | Cleaning composition containing a polysaccharide graft polymer composition and methods of controlling hard water scale |
| EP2773320B1 (en) | 2011-11-04 | 2016-02-03 | Akzo Nobel Chemicals International B.V. | Hybrid dendrite copolymers, compositions thereof and methods for producing the same |
| MX2014005089A (es) | 2011-11-04 | 2014-08-08 | Akzo Nobel Chemicals Int Bv | Copolimeros de dendrita de injerto, y metodos para producir los mismos. |
| US10087401B2 (en) | 2012-03-16 | 2018-10-02 | Monosol, Llc | Water soluble compositions incorporating enzymes, and method of making same |
| US9394092B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-07-19 | Monosol, Llc | Powdered pouch and method of making same |
| US8945314B2 (en) | 2012-07-30 | 2015-02-03 | Ecolab Usa Inc. | Biodegradable stability binding agent for a solid detergent |
| ES2707894T3 (es) | 2012-10-04 | 2019-04-05 | Ecolab Usa Inc | Tecnología de remojo previo para lavar ropa y limpiar otras superficies duras |
| US9365805B2 (en) | 2014-05-15 | 2016-06-14 | Ecolab Usa Inc. | Bio-based pot and pan pre-soak |
| EP3327122B1 (en) | 2014-07-04 | 2021-02-17 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| US10626388B2 (en) | 2014-07-04 | 2020-04-21 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3174446B1 (en) | 2014-08-01 | 2019-01-30 | Ecolab USA Inc. | A method of manual surface cleaning using cleaning textiles and of washing said cleaning textiles |
| EP3075832B1 (en) | 2015-03-30 | 2021-04-14 | Dalli-Werke GmbH & Co. KG | Manganese-amino acid compounds in cleaning compositions |
| EP3205392A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Microcapsules and process for preparation of microcapsules |
| EP3205393A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-16 | Basf Se | Process for preparation of microcapsules |
| WO2017182295A1 (en) | 2016-04-18 | 2017-10-26 | Basf Se | Liquid cleaning compositions |
| WO2017213168A1 (ja) * | 2016-06-09 | 2017-12-14 | 花王株式会社 | 変異アルカリプロテアーゼ |
| JP2019524960A (ja) | 2016-08-08 | 2019-09-05 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ | 液体洗濯製剤 |
| US10577571B2 (en) | 2016-11-08 | 2020-03-03 | Ecolab Usa Inc. | Non-aqueous cleaner for vegetable oil soils |
| WO2018099762A1 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Basf Se | Stabilization of enzymes in compositions |
| WO2019105780A1 (en) | 2017-11-29 | 2019-06-06 | Basf Se | Compositions, their manufacture and use |
| CN107937372B (zh) * | 2017-12-19 | 2020-03-24 | 江南大学 | 一种耐酸性提高的纳豆激酶 |
| WO2019238761A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Basf Se | Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes |
| WO2020030623A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Basf Se | Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent |
| EP3677676A1 (en) | 2019-01-03 | 2020-07-08 | Basf Se | Compounds stabilizing amylases in liquids |
| BR112021005954A2 (pt) | 2018-10-05 | 2021-06-29 | Basf Se | preparação enzimática, processo para produzir uma preparação enzimática estável, métodos para reduzir perda de atividade lipolítica de pelo menos uma lipase, para preparar uma formulação de detergente, para remover manchas e para aumentar a estabilidade de armazenagem de uma formulação de detergente líquido, usos de um composto e da preparação enzimática, e, formulação de detergente. |
| MX2021003931A (es) | 2018-10-05 | 2021-06-04 | Basf Se | Compuestos estabilizadores de amilasas en liquidos. |
| CN112840021A (zh) | 2018-10-05 | 2021-05-25 | 巴斯夫欧洲公司 | 在液体中稳定水解酶的化合物 |
| WO2020104231A1 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Basf Se | Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme |
| US11492572B2 (en) | 2019-12-06 | 2022-11-08 | Alene Candles LLC | Effervescing compositions and tablets for treating toilets |
| WO2020229480A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | Basf Se | Compounds stabilizing hydrolases in liquids |
| US11873465B2 (en) | 2019-08-14 | 2024-01-16 | Ecolab Usa Inc. | Methods of cleaning and soil release of highly oil absorbing substrates employing optimized extended chain nonionic surfactants |
| EP4045625A1 (en) | 2019-10-18 | 2022-08-24 | Basf Se | Storage-stable hydrolase containing liquids |
| WO2021115912A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | Basf Se | Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes |
| EP4103707A1 (en) | 2020-02-14 | 2022-12-21 | Basf Se | Mannanase variants |
| CA3185076A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Ecolab Usa Inc. | Foaming mixed alcohol/water compositions comprising a combination of alkyl siloxane and a hydrotrope/solubilizer |
| EP4176031A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Ecolab USA Inc. | Peg-modified castor oil based compositions for microemulsifying and removing multiple oily soils |
| CN116113320A (zh) | 2020-07-06 | 2023-05-12 | 埃科莱布美国股份有限公司 | 包含结构化烷氧基化硅氧烷的发泡混合醇/水组合物 |
| WO2022008732A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Basf Se | Enhancing the activity of antimicrobial preservatives |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
| WO2022243367A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Nouryon Chemicals International B.V. | Polyester polyquats in cleaning applications |
| WO2022243533A1 (en) | 2021-05-20 | 2022-11-24 | Nouryon Chemicals International B.V. | Manufactured polymers having altered oligosaccharide or polysaccharide functionality or narrowed oligosaccharide distribution, processes for preparing them, compositions containing them, and methods of using them |
| US20240287409A1 (en) | 2021-06-30 | 2024-08-29 | Nouryon Chemicals International B.V. | Chelate-amphoteric surfactant liquid concentrates and use thereof in cleaning applications |
| WO2023057367A1 (en) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | Unilever Ip Holdings B.V. | Laundry composition |
| WO2024020445A1 (en) | 2022-07-20 | 2024-01-25 | Ecolab Usa Inc. | Novel nonionic extended surfactants, compositions and methods of use thereof |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4261868A (en) | 1979-08-08 | 1981-04-14 | Lever Brothers Company | Stabilized enzymatic liquid detergent composition containing a polyalkanolamine and a boron compound |
| US4404128A (en) | 1981-05-29 | 1983-09-13 | The Procter & Gamble Company | Enzyme detergent composition |
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| US4760025A (en) * | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| US5013657A (en) | 1988-04-12 | 1991-05-07 | Bryan Philip N | Subtilisin mutations |
| US4990452A (en) | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
| ATE116365T1 (de) | 1986-04-30 | 1995-01-15 | Genencor Int | Mutante einer nicht menschlichen carbonyl- hydrolase, für diese kodierende dns-sequenzen und vektoren und durch diese vektoren transformierte wirte. |
| EP0896062A3 (en) | 1987-02-27 | 1999-04-07 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
| US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
| DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| WO1989006276A2 (en) | 1988-01-08 | 1989-07-13 | Dpz Deutsches Primatenzentrum Gesellschaft Mbh | Hiv-2-type retroviruses of primates, vaccines, diagnostic and pharmaceutical compositions |
| CN1056187C (zh) † | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
-
1990
- 1990-10-19 US US07/600,430 patent/US5185258A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 DK DK90915958T patent/DK0451244T3/da active
- 1990-10-26 AT AT90915958T patent/ATE174961T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-26 BR BR909006993A patent/BR9006993A/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-10-26 JP JP51505890A patent/JP3335623B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 EP EP96120247A patent/EP0775749B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 CA CA002044630A patent/CA2044630C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 WO PCT/US1990/006084 patent/WO1991006637A1/en active IP Right Grant
- 1990-10-26 EP EP90915958A patent/EP0451244B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 ES ES96120247T patent/ES2242963T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 DE DE69032852T patent/DE69032852T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 AU AU66341/90A patent/AU633376B2/en not_active Expired
- 1990-10-26 AT AT96120247T patent/ATE297997T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-26 DE DE69034195T patent/DE69034195T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 KR KR1019910700677A patent/KR970004938B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-10-26 ES ES90915958T patent/ES2125224T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-26 DK DK96120247T patent/DK0775749T4/da active
- 1990-10-30 NZ NZ235883A patent/NZ235883A/en unknown
- 1990-10-30 MA MA22265A patent/MA22573A1/fr unknown
- 1990-10-30 IE IE390590A patent/IE62771B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-10-30 PT PT95741A patent/PT95741B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-10-31 AR AR90318254A patent/AR244339A1/es active
- 1990-10-31 CN CN90108892A patent/CN1052897A/zh active Pending
- 1990-11-08 TR TR90/1065A patent/TR25991A/xx unknown
-
1991
- 1991-06-28 FI FI913166A patent/FI103052B1/fi active
- 1991-06-28 NO NO912567A patent/NO301081B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2242963T5 (es) | Mutantes de subtilisina. | |
| US5204015A (en) | Subtilisin mutants | |
| JP4086207B2 (ja) | ズブチリシン変異体 | |
| ES2332915T3 (es) | Variantes de protasa con multiples sustituciones. | |
| EP1523553B1 (en) | Multiply-substituted protease variants | |
| EP2287321B1 (en) | Multiply-substituted protease variants |