FI103052B - Subtilisiinimutantti ja tätä sisältävä entsymaattinen puhdistusainekoo stumus - Google Patents

Subtilisiinimutantti ja tätä sisältävä entsymaattinen puhdistusainekoo stumus Download PDF

Info

Publication number
FI103052B
FI103052B FI913166A FI913166A FI103052B FI 103052 B FI103052 B FI 103052B FI 913166 A FI913166 A FI 913166A FI 913166 A FI913166 A FI 913166A FI 103052 B FI103052 B FI 103052B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
subtilisin
amino acid
bacillus
mutant
sequence
Prior art date
Application number
FI913166A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI913166A0 (fi
FI103052B1 (fi
Inventor
Thomas Paul Graycar
David Aaron Estell
Robert Mark Caldwell
Original Assignee
Genencor Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27028376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI103052(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genencor Int filed Critical Genencor Int
Publication of FI913166A0 publication Critical patent/FI913166A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI103052B publication Critical patent/FI103052B/fi
Publication of FI103052B1 publication Critical patent/FI103052B1/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38609—Protease or amylase in solid compositions only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Description

1 103052
Subtilisiinimutantti ja tätä sisältävä entsymaattinen puh-di s tusainekoostumus
Keksinnön ala 5 Tämä keksintö liittyy uusiin karbonyylihydrolaasimu- tantteihin, joiden aminohapposekvenssissä yksi tai useampi lähtömuotona olevan karbonyylihydrolaasin aminohapporyhmis-tä on korvattu toisella aminohapolla erityisesti niissä asemissa, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciens -sub-10 tilisiinissa olevia ryhmiä +123 ja/tai +274. Tällaisia kar- bonyylihydrolaasimutantteja saadaan yleensä modifioimalla in vitro -olosuhteissa lähtömuotona olevaa luonnossa esiintyvää karbonyylihydrolaasia tai yhdistelmä-karbonyylihydro-laasia koodaava DNA-sekvenssi sellaiseksi, että se koodaa 15 yhden tai molempien aminohapporyhmien substituutiota lähtö- muotona olevassa aminohapposekvenssissä siten, että substituutio esiintyy yksinään tai yhdessä toisten lähtömuotona olevaan aminohapposekvenssiin valmistettujen substituutioiden, insertioiden tai deleetioiden kanssa.
20 Keksinnön tausta
Seriiniproteaasit ovat karbonyylihydrolaasien alaryhmä. Ne muodostavat ominaisuuksiltaan vaihtelevan entsyy-miluokan, jolla on runsaasti spesifisiä ominaisuuksia ja biologisia toimintoja. Stroud, R.M., (1974) Sei. Amer. 131, :* r 25 74 - 88. Huolimatta siitä, että seriiniproteaaseilla on monia erilaisia toimintoja, niiden katalyysimekanismin muodostamaa ongelmaa on lähestytty käyttäen ainakin kahta geneettisesti erilaista entsyymiryhmää: subtilisiineja ja nisäkkäiden kymotrypsiinia muistuttavia ja niiden suhteen 30 homologisia bakteerien seriiniproteaaseja (esim. trypsiiniä • ja S. gresius -trypsiiniä). Näiden kahden seriiniprote- aasiryhmän katalyysimekanismit ovat osoittautuneet huomattavan samanlaisiksi. Kraut, J., (1977) Ann. Rev. Biochem.
46, 331 - 358. Lisäksi, vaikka näiden kahden entsyymiryhmän 35 primaarirakenteet eivät muistutakaan toisiaan, on niiden 2 103052 tertiäärirakenteiden havaittu sisältävän konservoidun (muuttumattoman),seriinistä, histidiinistä ja aspartaatista muodostuvan katalyyttisen aminohappokolmikon.
Subtilisiini on seriiniendoproteaasi (molekyylipaino 5 27 500), jota erittyy suuria määriä hyvin monista Bacillus- lajeista ja muista mikro-organismeista. Subtilisiinin pro-teiinisekvenssi on määritetty ainakin neljästä Bacillus-lajista. Markland, F.S. et ai., (1983) Honne-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364, 1537 - 1540. Bacillus 10 amyloliquefaciens -subtilisiinin kolmiulotteinen kristal- lografinen rakenne 2,5 Ä:n erotustarkkuudella on myös raportoitu. Wright, C.S. et ai., (1969) Nature 221, 235 - 242, Drenth, J. et ai., (1972) Eur. J. Biochem. 26, 177 - 181. Nämä tutkimukset osoittavat, että vaikka subti-15 lisiini ei geneettisesti muistutakaan nisäkkäiden seriinip- roteaaseja, sen aktiivisen keskuksen rakenne on samanlainen kuin näillä entsyymeillä. Kovalenttisesti sitoutuneita pep-tidi-inhibiittoreita (Robertus, J.D. et ai., (1972) Biochemistry 11, 2439 - 2449) tai tuotteen kanssa muodostettuja 20 komplekseja (Robertus, J.D. et ai., (1976), J. Biol. Chem.
251, 1097 - 1103) sisältävän subtilisiinin röntgensäde-kiderakenteesta on myös saatu tietoja subtilisiinin aktiivisesta keskuksesta ja oletetusta substraattia sitovasta uurteesta. Lisäksi on raportoitu suuri määrä subtilisiinia ;· 1 25 koskevia kineettisiä ja kemiallisia tutkimuksia (Philipp, M. et ai., (1983) Mol. Cell. Biochem. 51, 5-32, Svendsen, B., (1976) Carlsbera Res. Comm. 41, 237 - 291), Markland, F.S., Id.) sekä ainakin yksi raportti, jossa subtilisiinin ryhmässä 222 oleva metioniini muutettiin vetyperoksi-30 dilla metioniinisulfoksidiksi (Stauffer, D.C. et ai., : (1965) J. Biol. Chem. 244, 5333 - 5338) ja ryhmässä 221 olevan seriinin sivuketju muutettiin kysteiiniksi kemiallisella modifikaatiolla [Polgar et ai., (1981) Biochimica et Biophysica Acta 667, 351 - 354].
3 103052 US-patenttijulkaisu 4 760 025 ja EP-patenttijulkaisu 0 130 756, julkaistu 9. tammikuuta 1985, kuvaavat kumpikin subtilisiinin aminohapporyhmien modifikaatioita asemissa, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin 5 tyrosiinia -1, asparagiinihappoa +32, asparagiinia +155, tyrosiinia +104, metioniinia +222, glysiiniä +166, histi-diiniä +64, glysiiniä +169, fenyylialaniinia +189, seriiniä +33, seriiniä +221, tyrosiinia +217, glutamaattia +156 ja alaniinia +152 . EP-patenttijulkaisu 0 251 446, julkaistu 7. 10 tammikuuta 1988, kuvaa Bacillus amyloliquefaciens -sub- tilisiinissa olevia muita aminohapporyhmiä sekä näitä vastaavia ryhmiä, joita voidaan modifioida valmistamalla substituutioita, insertioita tai deleetioita ja jotka modifikaatiot voidaan yhdistää US-patenttijulkaisussa 15 4 760 025 identifioituihin ryhmiin kohdistuviin modifikaa tioihin käyttökelpoisten subtilisiinimutanttien valmistamiseksi. Niitä nimenomaisia ryhmiä, jotka on identifioitu tässä patenttijulkaisussa, ei näissä viitteissä kuitenkaan ole identifioitu.
20 Samoin PCT-patenttijulkaisut WO 89/09 819 ja W0 89/09 830, jotka kumpikin on julkaistu 19. lokakuuta 1989, kuvaavat subtilisiinientsyymejä, jotka on muodostettu valmistamalla mutaatioita subtilisiinia koodaavaan nukleo-tidisekvenssiin. Kummassakin näissä julkaisussa on identi-:* 25 fioitu lukuisia aminohapporyhmiä, jotka ovat tällä tavoin modifioitavissa. Kuten asianlaita oli edellistenkin viitteiden suhteen, kummassakaan näistä ei ole identifioitu tämän keksinnön mukaisia ryhmiä.
Tämän mukaisesti tämän keksinnön kohteena on saada 30 käyttöön karbonyylihydrolaasimutantteja, joissa lähtömuotoa ' ' edustavassa karbonyylihydrolaasissa oleviin aminohapporyh- miin on kohdistettu substituutio niissä asemissa, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinissa olevia asemia +123 ja/tai +274. Tällaisilla mutanttientsyy-35 meillä on yleensä ainakin yksi ominaispiirre, joka on eri- 4 103052 lainen kuin vastaava piirre siinä lähtömuotoa edustavassa karbonyylihydrolaasissa, josta mutant in aminohappoa on lähdetty muokkaamaan.
Lisäksi tämän keksinnön kohteena on saada käyttöön 5 DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat tällaisia karbonyyli- hydrolaasimutantteja sekä ilmentämisvektoreita, jotka sisältävät tällaisia mutantti-DNA-sekvenssejä.
Edelleen tämän lisäksi tämän keksinnön tarkoituksena on saada käyttöön isäntäsoluja, jotka on transformoitu tallo laisilla vektoreilla, sekä isäntäsoluja, jotka kykenevät ilmentämään tällaista DNA:ta, jotta karbonyylihydro-laasimutantteja kyettäisiin tuottamaan solunsisäisesti tai solunulkoisesti.
Keksinnön yhteenveto 15 Tämä keksintö koskee subtilisiinimutantteja, joita ei tavata luonnossa ja joiden proteolyyttinen aktiivisuus, stabiilisuus ja/tai toimintatehokkuus eroavat siitä lähtö-muotona olevasta subtilisiinista, josta mutantin aminohapposekvenssi on peräisin. Lähtömuotona oleva subtilisiini 20 voi olla luonnossa esiintyvä karbonyylihydrolaasi tai yh- distelmä-hydrolaasi. Keksinnön mukaiselle subtilisiinimu-tantille on tuunusomaista, että sen aminohapposekvenssiä ei tavata luonnossa ja se on saatu lähtömuotosubtilisiinista korvaamalla lähtömuodon asemassa, joka vastaa Bacillus amy-:· 25 loliquefaciens -subtilisiinin asemaa Asn, +123, tai Ala, +274, oleva aminohapporyhmä toisella aminohapolla, jolloin numerointi viittaa kuviossa 3 annettuun Bacillus amyloli-quefaciens -subtilisiinin sekvenssiin.
Tämä keksintö koskee myös DNA:ta, joka koodaa edellä 30 mainittua subtilisiinimutanttia.
Nämä mutantti-DNA-sekvenssit on johdettu lähtömuotona olevasta DNA-sekvenssistä, joka koodaa luonnossa esiintyvää entsyymiä tai yhdistelmä-entsyymiä . Mutantti-DNA-sek-venssit on saatu modifioimalla lähtömuotona olevaa DNA-sek-35 venssiä siten, että se koodaa lähtömuotona olevan DNA-sek- 5 103052 venssin koodaaman yhden tai useamman sellaisen spesifisen aminohapporyhmän substituutiota, joka vastaa Bacillus amy-loliquefaciensissa olevaa asemaa +123 ja/tai +274. Nämä yh-distelmä-DNA-sekvenssit koodaavat karbonyylihydrolaasimu-5 tantteja, joilla on uudenlainen aminohapposekvenssi ja yleensä ainakin yksi ominaispiirre, joka eroaa olennaisesti lähtömuotona olevan karbonyylihydrolaasin DNA-sekvenssin koodaaman entsyymin samasta piirteestä. Tällaisiin ominaisuuksiin kuuluvat proteolyyttinen aktiivisuus, stabiilisuus 10 ja/tai parantuneet toimintatehokkuusominaisuudet. Tähän keksintöön sisältyvät myös prokaryoottiset ja eukaryootti-set subtilisiinit, joissa on jokin toinen aminohapporyhmä, kuten seriini, asemissa, jotka vastaavat Bacillus amyloli-quefaciens -subtilisiinin asemaa asn +123, ja subtilisii-15 nia, jossa on joitakin toisia aminohapporyhmiä asemissa, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin asemaa +274.
Tämä keksintö koskee lisäksi ilmentämisvektoria, joka sisältää tällaisia karbonyylihydrolaasimutantti-DNA-20 sekvenssejä, sekä isäntäsoluja, jotka on transformoitu käyttäen tällaisia mutantteja tuottamaan kykeneviä vektoreita .
Tämä keksintö koskee myös entsymaattista puhdis-tusainekoostumusta, joka kykenee hajottamaan proteiineja 25 ja jolle on tunnusomaista, että se käsittää a) osan, joka on pinta-aktiivista ainetta, ja b) subtilisiinimutantin, jonka aminohapposekvenssi ei esiinny luonnossa, ja joka on johdettu lähtömuotona olevasta subtilisiinista korvaamalla aminohapporyhmä lähtömuo- 30 don asemassa, joka vastaa Bacillus amyloliquefaciens -sub- ' ‘ tilisiinin asemaa +123 tai +274, toisella aminohapolla, jolloin numerointi viittaa kuviossa 3 annettuun Bacillus amyloliquefaciens - subtilisiinin sekvenssiin.
S 103052
Piirustusten lyhyt kuvaus
Kuviossa 1 on esitetty Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin DNA- ja aminohapposekvenssit sekä tämän geenin osittainen restriktiokartta.
5 Kuviossa 2 on esitetty muuttumattomat aminohapposek venssit, jotka ovat peräisin Bacillus amyloliquefaciensin, Bacillus subtilis varI168:n ja Bacillus licheniformis (carlsbergensisin) subtilisiineista.
Kuvioissa 3A ja 3B on esitetty Bacillus amyloli-10 quefaciensista, Bacillus subtilis varI168:sta ja Bacillus licheniformisista peräisin oleva subtilisiinin aminohappo-sekvenssi .
Kuviossa 4 on esitetty kolmen subtilisiinin aminohapposekvenssi. Ylin rivi esittää aminohapposekvenssiä, 15 joka on peräisin Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinis- ta (josta myös käytetään toisinaan nimitystä BPN'). Toinen rivi kuvaa Bacillus lentuksesta peräisin olevan subtilisiinin (subtilisiini 309 PCT-patenttijulkaisussa WO 89/06 276) aminohapposekvenssiä. Alin rivi esittää tämän 20 keksinnön mukaisen edullisen sovellusmuodon mukaista aminohappojaksoa, jolle on annettu nimi GG-RYSA. Symboli * merkitsee tiettyjen aminohapporyhmien puuttumista BPN':uun verrattuna.
Kuviossa 5 on esitetty plasmidi pGG A274:n konstruk- :v. 25 tio.
Kuviossa 6 on esitetty pGG-KVNA:n, pGG-RYSA-plasmi-din valmistuksessa esiintyvän välituotteen konstruktio.
Kuviossa 7 on esitetty oligonukleotidi-dupleksi-me-netelmä, jota käytettiin synteettisen Bacillus lentus -sub-30 tilisiinigeenin konstruoimiseen.
Kuviossa 8 on esitetty strategia, jota käytettiin Bacillus lentus -subtilisiinia koodaavan synteettisen geenin konstruoimiseen.
Kuviossa 9 on esitetty kasetti, jota käytettiin 3 5 substituutioiden tekoon kodoniasemassa +123 olevaan DNA:hän 103052 7 kasettimutageneesillä. XXX edustaa kodonia, joka modifioitiin koodaamaan asemaan +123 tehtyjä aminohapposubstituuti-oita.
Kuviossa 10 on esitetty tämän keksinnön mukaisen 5 edullisen sovellusmuodon DNA- ja aminohapposekvenssi, jossa DNA-sekvenssi on synteettinen DNA. Tässä kuviossa oleva DNA on modifioitu koodaamaan asemassa 27 olevaa arginiinia, asemassa 78 olevaa seriiniä, asemassa 104 olevaa tyrosii-nia, asemassa 123 olevaa seriiniä ja asemassa 274 olevaa 10 alaniinia.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Olemme tehneet sen keksinnön, että karbonyylihydro-laasin, subtilisiinin, sen aminohapporyhmän kohtaan, joka vastaa Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin asemaa 15 +123, aiheutetut in vitro -mutaatiot tuottavat subti- lisiinimutantteja, joiden proteolyyttinen aktiivisuus on muuttunut lähtömuotoina oleviin subtilisiineihin verrattuna .
Olemme myös tehneet sen keksinnön, että Bacillus 20 amyloliquefaciens -subtilisiinin asemaa +274 vastaaviin ryhmiin tehdyt in vitro -mutaatiot tuottavat subti-lisiinimutantteja, joiden pysyvyys, esimerkiksi modifioitu autoproteolyyttinen pysyvyys, on muuttunut. Joissain tapauksissa nämä viimeksi mainitut mutanttientsyymit ovat 25 myös toimintatehokkuudeltaan parempia detergenttikoostumuk- sissa käytettyinä.
Karbonyylihydrolaasit ovat entsyymejä, jotka hydrolysoivat yhdisteitä, jotka sisältävät sidoksia
30 O
c - x jossa X on happi tai typpi. Karbonyylihydrolaaseihin lue-35 taan kuuluviksi luonnossa esiintyvät karbonyylihydrolaasit ja yhdistelmä-karbonyylihydrolaasit. Luonnossa esiintyviin s 103052 karbonyylihydrolaaseihin luetaan ensisijaisesti mukaan hyd-rolaasit, esimerkiksi peptidihydrolaasit, kuten subtilisiinit ja metalloproteaasit. Peptidihydrolaaseihin luetaan mukaan alfa-aminoasyylipeptidihydrolaasi, peptidyy-5 liaminohappohydrolaasi, asyyliaminohydrolaasi, seriini- karboksipeptidaasi, metallokarboksipeptidaasi, tiolipro-teinaasi, karboksyyliproteinaasi ja metalloproteinaasi. Seriini-, metallo-, tioli- ja happamet proteaasit sekä en-do- ja eksoproteaasit luetaan mukaan.
10 "Yhdistelmä-karbonyylihydrolaasi" tarkoittaa kar- bonyylihydrolaasia, jossa luonnossa esiintyvää karbonyyli-hydrolaasia koodaava DNA-sekvenssi on modifioitu sellaisen mutantti-DNA-sekvenssin muodostamiseksi, joka koodaa karbo-nyylihydrolaasin aminohapposekvenssissä esiintyviä yhden 15 tai useamman aminohapon substituutiota, insertiota tai de- leetiota. Käyttökelpoisia modif ikaatiomenetelmiä on kuvattu tässä patenttihakemuksessa, EP-patenttijulkaisussa 0 130 756, julkaistu 9. tammikuuta 1985 ja EP-patenttijulkaisussa 0 251 446, julkaistu 7 tammikuuta 1988.
20 Subtilisiinit ovat bakteerien tai sienten karbonyy- lihydrolaaseja, jotka tavallisesti pilkkovat proteiinien tai peptidien peptidisidoksia. Tässä yhteydessä "subti-lisiini" tarkoittaa luonnossa esiintyvää subtilisiinia tai yhdistelmä-subtilisiinia. Useiden mikrobilajien tiedetään jv, 25 tuottavan ja usein erittävän luonnossa esiintyvää subti- lisiinisarjaa. Tämän sarjan jäsenten aminohappojaksot eivät ole täysin homologisia. Tässä sarjassa olevien subtilisii-nien proteolyyttinen aktiivisuus on kuitenkin samanlaista tai samantyyppistä. Tämän seriiniproteaasien luokan erottaa 30 kymotrypsiiniä muistuttavasta seriiniproteaasiluokasta yh- teinen aminohappojakso, joka sisältää katalyyttisen kolmikon. Subtilisiineilla ja kymotrypsiiniä muistuttavilla se-riiniproteaaseilla on kummallakin katalyyttinen kolmikko, joka käsittää aspartaatin, histidiinin ja seriinin. Subti-35 lisiinia muistuttavissa proteaaseissa näiden aminohappojen 9 103052 keskinäinen järjestys aminoterminaalisesta päästä karboksi-terminaaliseen päähän lukien on aspartaatti-histidiini-se-riini. Kymotrypsiiniä muistuttavissa proteaaseissa keskinäinen järjestys on kuitenkin histidiini-aspartaatti-serii-5 ni. Tässä yhteydessä subtilisiini tarkoittaakin seriinipro- teaasia, joka sisältää subtilisiinia muistuttavien prote-aasien katalyyttisen kolmikon. Esimerkkejä näistä ovat tässä hakemuksessa kuviossa 3 identifioidut subtilisiinit ja PCT-patenttijulkaisussa WO 89/06 276 ja EP-patenttijul-10 kaisussa 0 283 075 kuvatut subtilisiinit.
"Yhdistelmä-subtilisiini" tarkoittaa subtilisiinia, jossa subtilisiinia koodaava DNA-jakso on modifioitu sellaisen mutantti-DNA-jakson muodostamiseksi, joka koodaa luonnossa esiintyvän subtilisiinin aminohappojaksoon muo-15 dostettua yhden tai useamman aminohapon substituutiota, deleetiota tai insertiota. Tällaisen modifikaation suorittamiseen käyttökelpoisia menetelmiä, joita myös voidaan yhdistää tässä patenttihakemuksessa kuvattujen menetelmien käyttöön, ovat EP-patenttijulkaisuissa 0 130 756 ja 20 0 251 446 sekä PCT-patenttijulkaisuissa WO 89/06 279, WO 89/09 830 ja WO 89/09 819 kuvatut menetelmät.
"Ei-humaaneja karbonyylihydrolaaseja" ja niitä koo-daavaa DNA:ta voidaan saada monista prokaryoottisistä ja eukaryoottisista eliöistä. Sopivia esimerkkejä prokaryoot-·'- · 25 tisista eliöistä ovat gram-negatiiviset eliöt, kuten E.
coli tai Pseudomonas ja gram-positiiviset bakteerit, kuten Micrococcus tai Bacillus. Esimerkkejä eukaryoottisista eliöistä, joista voidaan saada karbonyylihydrolaasia ja niiden geenejä, ovat hiivat, kuten Saccaromycees cerevisiae, sie-30 net, kuten Aspergillus sp., ja ei-humaanit nisäkäslähteet, ' ' kuten esimerkiksi nautaeläinlajit, joista voidaan saada karbonyylihydrolaasia, kymosiinia, koodaava geeni. Kuten subtilisiinienkin suhteen on asianlaita, monista erilaisista toisiaan muistuttavista lajeista voidaan saada karbonyy-35 lihydrolaasisarjoja, joiden aminohappojaksot eivät ole täy- 10 103052 sin homologisia sarjan jäsenten kesken, mutta joiden biologinen aktiivisuus on siitä huolimatta samanlaista tai samantyyppistä, aivan kuten subtilisiinienkin suhteen on asianlaita. Niinpä tässä yhteydessä ei-humaanilla karbonyy-5 lihydrolaasilla on toiminnallinen määritelmä, joka tarkoit taa karbonyylihydrolaaseja, jotka suoraan tai epäsuorasti kuuluvat prokaryoottisten ja eukaryoottisten lähteiden yhteyteen.
"Mutantti-karbonyylihydrolaaseilla" on aminohappo-10 jakso, joka on saatu "lähtömuotona olevan karbonyylihydro- laasin" aminohappojaksosta. Lähtömuotona oleviin karbonyyl ihydrolaaseihin kuuluvat luonnossa esiintyvät karbonyy-lihydrolaasit ja yhdistelmä-karbonyylihydrolaasit. Mutantti-karbonyylihydrolaasin aminohappojakso on "saatu" 15 lähtömuotona olevan hydrolaasin aminohappojaksosta lähtö- muotona olevaan aminohappojaksoon valmistetulla yhden tai useamman aminohapon substituutiolla, deleetiolla tai inser-tiolla. Tällainen modifikaatio tehdään mieluummin lähtömuotona olevan karbonyylihydrolaasin aminohappojaksoa koodaa-2 0 vaan "lähtömuotona olevaan DNA-jaksoon" kuin manipuloimalla lähtömuotona olevaa karbonyylihydrolaasientsyymiä per se. Käyttökelpoisia menetelmiä lähtömuotona olevan DNA -jakson manipuloimiseksi on kuvattu tässä patenttihakemuksessa ja EP-patenttijulkaisuissa 0 130 756 ja 0 251 446.
• - 25 Tässä patenttijulkaisussa on identifioitu spesifiset ryhmät, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciens-subti-lisiinin asemia +123 ja +274. Nämä aminohappojen asemien numerot viittaavat niihin numeroihin, jotka on annettu ma-turoituneen Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin ku-30 viossa 1 esitetylle jaksolle. Tämä keksintö ei kuitenkaan rajoitu mutaatioiden valmistamiseen tähän tiettyyn subtilisiinin vaan se kattaa lähtömuotona olevat karbonyyli-hydrolaasit, joissa aminohapporyhmät ovat asemissa, jot- „ 103052 11 ka "vastaavat" Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinissa identifioituja tiettyjä nimenomaisia ryhmiä.
Lähtömuotona olevan karbonyylihydrolaasin (aminohappo) ryhmä vastaa Bacillus amyloliquefaciens -subtilisii-5 nin ryhmää, jos se on joko homologinen (eli asemat ovat primääri- tai tertiäärirakenteessa toisiaan vastaavia) tai analoginen Bacillus amyloliquefaciens- subtilisiinissa olevan tietyn ryhmän tai kyseisen ryhmän osan kanssa (eli sillä on samanlainen tai samantyyppinen toiminnallinen 10 kyky liittyä, reagoida tai osallistua kemialliseen vuorovaikutukseen ).
Jotta homologia primäärirakenteen suhteen saataisiin vahvistetuksi, verrataan lähtömuotona olevan karbonyylihydrolaasin aminohappojaksoa suoraan Bacillus amylo-15 liquefaciensin subtilisiinin primäärirakenteeseen ja erityisesti joukkoon ryhmiä, joiden tiedetään olevan muuttumattomia kaikissa subtilisiineissa, joiden jaksot tunnetaan (kuvio 2). Kun muuttumattomana pysyvät ryhmät on saatu kohdistetuksi toisiinsa nähden kohdistuksen säilymiseen 20 tarvittavat insertiot ja deleetiot huomioiden (eli sattumanvaraisista deleetioista ja insertioista johtuvia muuttumattomina pysyvien ryhmien poistoja välttäen), määritetään ne ryhmät, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin primäärijakson tiettyjä amino-·' 25 happoja. Muuttumattomina pysyvien ryhmien kohdistamisen yhteydessä tällaisten ryhmien tulisi säilyä 100-prosent-tisesti. Kuitenkin muuttumattomina pysyvien ryhmien kohdistumisen yli 75-prosenttisesti tai jopa niinkin vähän kuin 50-prosenttisesti pitäisi riittää toisiaan vas-30 taavien ryhmien määrittämiseen. Katalyyttisen kolmikon Asp32/His64/Ser221 pitäisi pysyä muuttumattomana.
Esimerkiksi kuviossa 3 Bacillus amyloliquefacien-sin, Bacillus subtilis var 1168:n ja Bacillus lichenifor-misin subtilisiinin aminohappojaksot on kohdistettu keske-35 nään siten, että aminohappojaksojen kesken saadaan synty- 12 103052 määri mahdollisimman suuri homologien määrä. Näiden jaksojen vertailu osoittaa, että kussakin jaksossa on tietty määrä muuttumattomina pysyviä jaksoja. Nämä jaksot on identifioitu kuviossa 2.
5 Näitä muuttumattomina pysyviä jaksoja voidaan siis käyttää vastaavien Bacillus amyloliquefaciens -subtilisii-nin kanssa ekvivalenttisten aminohapporyhmien määrittämiseen muista karbonyylihydrolaaseista, kuten Bacillus len-tuksen subtilisiinista (PCT-julkaisu nro W0 89/06 279, 10 julkaistu 13. heinäkuuta 1989) ja tässä patenttihakemuksessa kuvatusta edullisesta mutantti-subtilisiineista. Kuviossa 4 nämä tietyt nimenomaiset aminohappojaksot on kohdistettu Bacillus amyloliquefaciens-subtilisiinin jakson suhteen mahdollisimman suuren muuttumattomina pysyvien 15 ryhmien homologian aikaansaamiseksi. Kuten voidaan nähdä, Bacillus lentuksen ja tämän keksinnön mukaisen edullisen mutantti-subtilisiinin jaksoissa on useita deleetioita Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiiniin verrattuna. Niinpä Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin 20 val-165:ttä vastaava aminohappo muissa subtilisiineissa on se nimenomainen isoleusiini, joka esiintyy val-165:n alapuolella.
Kuviossa 4 on asemassa 123 oleva aminohappo Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinissa oleva asparagiini. 25 Bacillus lentus -subtilisiinissa vastaava ryhmä se nimenomainen asparagiini, joka on esitetty tässä kuviossa. Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa mutantti-subtilisii-nissa Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin asemaa +123 vastaava aminohappo on jokin muu aminohappo kuin 30 asparagiini ja tämä on edullisesti kuviossa 4 esi-' tetty seriini. Samoin kuviossa 4 Bacillus amyloli quefaciens -subtilisiinin asemassa +274 oleva aminohappo on alaniini. Kuten voidaan nähdä, vastaava aminohappo Bacillus lentus -subtilisiinissa on kuviossa 4 esitetty 35 nimenomainen treoniini. Tämän keksinnön mukaisessa erityi- 13 103052 sen edullisessa mutantti-subtilisiinissa on vastaavassa aminohappoasemassa +274 kuviossa 4 esitetty alaniini.
Asemat +123 ja +274 onkin identifioitu kuviossa 4 esitettyjen primääristen aminohappojaksojen perusteella 5 Bacillus lentuksen ja tämän keksinnön edullisen sovellus-muodon subtilisiinin kyseessä ollessa. Voidaan kuitenkin modifioida monia muita aminohapporyhmiä, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin spesifisiä aminohappoja. Niinpä edullisessa sovellusmuodossa Bacillus 10 amyloliquefaciens-subtilisiinin asemassa 27 olevalla ly-siini-aminohapolla on vastaava lysiini Bacillus lentuksen subtilisiinin asemassa 27. Kuten esimerkeistä käy ilmi, subtilisiini, joka käsittää yhden tämän keksinnön mukaisista edullisista sovellusmuodoista, saatiin Bacillus len-15 tuksen subtilisiinia koodaavaa DNA-jaksoa modifioimalla. Tällaisiin DNA:hän tehtyihin modifikaatioihin kuului Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin asemia 123 ja 274 vastaavien kodonien modifikaatio. Kuitenkin Bacillus lentuksen aminohappojaksoon tehtiin kaksi muuta modifikaa-20 tiota kohdissa, jotka vastaavat ryhmiä 27 ja 104 Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinissa. Kuten kuviosta 4 voidaankin nähdä, vastaavassa asemassa ollut Bacillus lentus-subtilisiinin ryhmä 27 modifioitiin koodaamaan edullisessa sovellusmuodossa olevaa arginiinia. Samalla tavoin Bacil-25 lus lentuksen asemassa 104 ollut valiiniryhmä, joka vastaa Bacillus amyloliquefaciens-subtilisiinissa olevaa tyrosii-nia 104, modifioitiin koodaamaan tyrosiinia. Niinpä kuviossa 4 esitetty edullinen sovellusmuoto sisältää amino-happojakson, joka on saatu Bacillus lentuksen subtilisii-30 nista modifioimalla kyseisen subtilisiinin ryhmiä, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinissa olevia asemia 27, 104, 123 ja 274.
Ekvivalentit ryhmät voidaan myös määrittää määrittämällä homologia tertiäärirakenteen tasolla sellaisten 35 lähtömuotona olevien karbonyylihydrolaasien kyseessä oi- 14 103052 lessa, joiden tertiäärirakenne on selvitetty röntgensäde-kristallografiällä. Ekvivalentit ryhmät ovat niitä ryhmiä, joilla Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin ja lähtö-muotona olevan karbonyylihydrolaasin tietyn aminohapporyh-5 män pääketjun kahden tai useamman atomin koordinaatit ovat kohdistamisen jälkeen 0,13 nm:n ja edullisesti 0,1 nm etäisyydellä toisistaan. Kohdistaminen suoritetaan sitten kun parhaan mallin orientaatio on määrätty ja asemat kohdistettu siten, että kyseessä olevan karbonyylihydrolaasin 10 niiden proteiiniatomien koordinaatit, jotka eivät ole vetyatomeja, antavat mahdollisimman tarkan kohdistuksen Bacillus amyloliquefaciens-subtilisiinin vastaaviin koordinaatteihin. Paras malli on se kristallografinen malli, joka antaa alhaisimman R-tekijän arvon kokeellisista 15 di f fraktiotuloksista suurimmalla mahdollisella erotustark- kuudella.
|-|FCH» I 3--EjF0(W|- 20 Ekvivalentit ryhmät, jotka ovat toiminnaltaan ana logisia tietyn Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin ryhmän kanssa, määritellään niiksi lähtömuotona olevan karbonyylihydrolaasin aminohapoiksi, joiden vaikutuksesta tämä entsyymi voi omaksua sellaisen konformaation, että :v 25 nämä joko muuttavat tai modifioivat proteiinin rakennetta tai substraatin sitoutumista tai katalyysin tapahtumista tai vaikuttavat näihin tekijöihin tavalla, joka voidaan määrittää ja kohdistaa tiettyyn Bacillus amylolique-faciens-subtilisiinin ryhmään. Ekvivalentteja ryhmiä ovat 30 lisäksi ne lähtömuotona olevan karbonyylihydrolaasin (jon-'« ka tertiäärirakenne on selvitetty röntgensädekristallogra- fialla) ryhmät, jotka sijaitsevat analogisissa asemissa siinä määrin, että vaikka tietyn ryhmän pääketjun atomit eivät täyttäisikään ekvivalenttisuuden arvosteluperusteita 35 homologisen asemansa perusteella, niin ainakin ryhmän 15 103052 sivuketjun kahden atomin atomikoordinaatit ovat 0,13 nm:n etäisyydellä vastaavista Bacillus amyloliquefaciens -subti-lisiinin sivuketjun atomeista. Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin kolmiulotteisen rakenteen koordinaa-5 tit on esitetty EP-patenttijulkaisussa 0 251 446 ja niitä voidaan käyttää yllä kuvatulla tavalla vastaavien ryhmien määrittämiseksi tertiäärirakenteen tasolla.
Toiset substituoitaviksi, insertoitaviksi tai dele-toitaviksi identifioidut ryhmät ovat muuttumattomina pysy-10 viä ryhmiä kun taas toiset eivät ole. Kun kyseessä olevat ryhmät eivät ole muuttumattomina pysyviä ryhmiä, yhden tai useamman aminohapon korvaaminen rajoittuu sellaisiin substituutioihin, jotka tuottavat mutantin, jolla ei ole luonnossa esiintyvää jaksoa vastaavaa aminohappojaksoa. Kun 15 kyseessä ovat muuttumattomina pysyvät ryhmät, tällaisten korvauntumisten tulokseksi ei saisi syntyä luonnossa esiintyvää jaksoa. Tämän keksinnön mukaisiin mutantti-kar-bonyylihydrolaaseihin kuuluvat mutantti-karbonyylihydro-laasien maturoituneet muodot sekä tällaisten mutantti-hyd-20 rolaasien varhais- (pro) ja esivarhais- (prepro) muodot.
Edullisia rakenteita ovat esivarhaismuodot, koska tämä helpottaa mutantti-karbonyylihydrolaasien ilmentämistä, erittymistä ja maturoitumista.
"Pro-jakso" tarkoittaa aminohappojaksoa, joka liitin 25 tyy karbonyylihydrolaasin maturoituneen muodon N-terminaa- liseen osaan, ja jonka poistamisesta seuraa karbonyylihydrolaasin "maturoituneen" muodon ilmaantuminen. Monia prote-olyyttisiä entsyymejä tavataan luonnossa translaatio-muotoisina pro-entsyymituotteina ja translaation jälkeisen 30 prosessoinnin puuttuessa ne ilmentyvät tämän muotoisina.
Mutantti-karbonyylihydrolaasien, tarkemmin sanottuna mu-tantti-subtilisiinien, tuottamisessa edullinen pro-jakso on Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin oletettu pro-jakso, vaikka muitakin subtilisiinin pro-jaksoja voidaan ie 103052 käyttää. Esimerkeissä käytettiin Bacillus lentuksen (ATCC 21 536) subtilisiinin oletettua pro-jaksoa.
"Signaalijakso" tai "pre-jakso" tarkoittaa mitä tahansa karbonyylihydrolaasin N-terminaalisen osaan tai 5 prohydrolaasin N-terminaaliseen osaan liittyvää aminohappo jaksoa, joka voi osallistua hydrolaasin maturoituneiden muotojen tai pro-muotojen erittymiseen. Tämä signaalijak-son määritelmä on toiminnallinen määritelmä ja siihen on tarkoitus sisältyä kaikki ne subtilisiinigeenin tai muiden 10 erittyvien karbonyylihydrolaasien N-terminaalisen osan koodaamat aminohappojaksot, jotka osallistuvat subtilisiinin tai muiden karbonyylihydrolaasien erittymisen aikaansaamiseen natiiveissa olosuhteissa. Tässä keksinnössä hyödynnetään tällaisia jaksoja mutantti-karbonyylihydrolaa-15 sien erittymisen aikaansaamiseksi tässä patenttihakemuksessa määritellyllä tavalla. Esimerkeissä käytetty edullinen signaalijakso käsittää Bacillus amylolique-faciens -subtilisiinin signaali jakson seitsemän ensimmäistä aminohapporyhmää, jotka on fuusioitu Bacillus lentuksen 20 (ATCC 21536) subtilisiinin signaalijakson loppuosaan.
Mutantti-karbonyylihydrolaasin "esivarhaismuoto" koostuu hydrolaasin maturoituneesta muodosta, jonka amino-terminaaliseen päähän on toimivassa muodossa liitetty pro-jakso ja pro-jakson aminoterminaaliseen päähän on toimi-• · 25 vassa muodossa liitetty pre- tai signaalijakso.
"Ilmentämisvektori" tarkoittaa DNA-konstruktiota, joka sisältää DNA-jakson, joka on liitetty toimivassa muodossa käyttökelpoiseen kontrollijaksoon, joka kykenee saamaan aikaan mainitun DNA:n ilmentymisen sopivassa isäntä-30 solussa. Tällaisiin ohjaaviin jaksoihin kuuluvat transkription aloittamiseen tarvittava promoottori, valinnainen operaattorijakso tällaisen transkription ohjaamiseksi, jakso, joka koodaa sopivia ribosomeja sitovia kohtia lä-hetti-RNA:ssa ja jaksot, jotka ohjaavat transkriptiota ja 35 translaation lopetusta. Vektori voi olla plasmidi, faagi- 17 103052 partikkeli tai yksinkertaisesti potentiaalinen genomista saatu liitosjakso (insert). Sen jälkeen kun vektori on transformoitu sopivaan isäntäsoluun, se voi replikoitua ja toimia itsenäisesti isäntägenomissa tai se voi joissakin 5 tapauksissa integroitua varsinaiseen genomiin. Tässä patenttikuvauksessa "plasmidia" ja "vektoria" käytetään toisinaan toistensa vaihtoehtoina, sillä plasmidi on nykyisin yleisimmin käytetty vektorin muoto. Tarkoituksena on kuitenkin se, että tähän keksintöön kuuluvat muutkin täl-10 laiset ilmentämisvektoreiden muodot, jotka ovat toiminnal lisesti tätä vastaavia ja jotka tunnetaan tai tullaan vastaisuudessa tuntemaan tällä alalla.
Tässä keksinnössä käytetyt "isäntäsolut" ovat yleensä prokaryoottisia tai eukaryoottisia isäntäsoluja, 15 joita on edullisesti käsitelty EP-patenttijulkaisussa 0 130 756 kuvattujen menetelmien mukaisesti siten, etteivät ne enää kykene erittämään entsymaattisesti aktiivista endo-proteaasia. Subtilisiinin ilmentämisessä edullinen isän-täsolu on Bacilluksen BG2036 -kannan solu, jolta puuttuvat 20 entsymaattisesti aktiivinen neutraali proteaasi ja alkali- nen proteaasi (subtilisiini). Kannan BG2036 konstruktio on kuvattu yksityiskohtaisesti EPO-patenttijulkaisussa nro 0 130 756 ja vielä lisäksi julkaisussa Yang, M.Y. et ai., (1984) J. Bacteriol. 160, 15 - 21. Muihin subtilisiinin 25 ilmentämisessä käytettäviin isäntäsoluihin kuuluu Bacillus subtilis 1168 (EPO-patenttijulkaisu nro 0 130 756).
Isäntäsolut transformoidaan tai transfektoidaan yh-distelmä-DNA-tekniikalla konstruoiduilla vektoreilla. Tällaiset transformoidut isäntäsolut kykenevät joko replikoi-30 maan mutanttikarbonyylihydrolaaseja koodaavia vektoreita : tai ilmentämään haluttua mutantti-karbonyylihydrolaasia.
Kun kyseessä ovat vektorit, jotka koodaavat mutantti-kar-bonyylihydrolaasin esi- tai esivarhaismuotoa, niin tällaiset mutanttimuodot erittyvät ilmennettyinä isäntäsolusta 35 isäntäsolujen kasvatusliuokseen.
ie 10ό O 52
Ilmaisu "liitetty toimivassa muodossa" tarkoittaa kahden DNA-alueen suhdetta kuvattaessa yksinkertaisesti sitä, että niiden välillä vallitseva suhde on toiminnallinen. Esimerkiksi pre-jakso on liitetty toimivassa muodossa 5 peptidiin, jos se toimii signaalijaksona osallistuen pro teiinin maturoituneen muodon erittämiseen, johon luultavasti sisältyy signaalijakson pilkkoutuminen. Promoottori on liitetty koodaavaan jaksoon toimivassa muodossa, jos se ohjaa jakson transkriptiota, ribosomin sitoutumiskohta on 10 liitetty koodaavaan jaksoon toimivassa muodossa, jos sen sijainti on sellainen, että translaatio on mahdollinen.
Luonnossa esiintyvää lähtömuotona olevaa karbo-nyylihydrolaasia koodaavat geenit voidaan saada käyttöön EP-patenttijulkaisuissa 0 130 756 ja 0 251 446 kuvattujen 15 yleisten menetelmien mukaisesti. Kuten tässä patentti hakemuksessa kuvatusta esimerkistä voidaan nähdä, menetelmät käsittävät yleensä sen, että syntetisoidaan leimattuja koettimia, joissa on mielenkiinnon kohteena olevaa hydro-laasia koodaavat oletetut jaksot, valmistetaan genomikir-20 jastot hydrolaasia ilmentävistä eliöistä ja seulotaan gee- nikirjastot mielenkiinnon kohteena olevan geenin löytämiseksi koettimiin tapahtuvalla hybridisoinnilla. Tämän jälkeen positiivisesti hybridisoituvat kloonit kartoitetaan ja sekvenssoidaan.
;· 2 5 Tämän jälkeen isäntäsolu transformoidaan kloonatulla karbonyylihydrolaasilla hydrolaasin ilmentämiseksi. Tämän jälkeen hydrolaasigeeni liitetään ligaasilla solussa suurina määrinä esiintyvään plasmidiin. Tämä plasmidi replikoi -tuu isäntäsoluissa siinä mielessä, että se sisältää plasmi-30 din replikaatioon tarvittavat tunnetut yksiköt: kyseessä : olevaan geeniin toimivassa muodossa liitetyn promootto rin (joka voidaan saada geenin omasta homologisesta promoottorista, jos isäntäsolu tunnistaa tämän eli suorit- α9 103052 taa siitä transkription), ulkopuolisesta lähteestä saadun tai hydrolaasigeenin endogeenisesta terminaatioalueesta saadun transkription lopetus- ja polyadenylaatioalueen (tarvitaan tietyissä eukaryoottisissa isäntäsoluissa, jot-5 ta isäntäsolun hydrolaasigeenistä transkriptoima lähetti-RNA olisi stabiili), ja haluttaessa selektiogeenin, kuten antibioottiresistenttiysgeeni, joka mahdollistaa sen, että plasmidilla infektoitujen isäntäsolujen viljelyä voidaan pitää yllä jatkuvasti kasvattamalla soluja antibiootteja 10 sisältävällä alustalla. Suurina lukumäärinä esiintyvissä plasmideissa on myös isäntäsolujen replikaation aloitus-kohtaa vastaava kohta, mikä tällä tavoin mahdollistaa suurten plasmidimäärien muodostumisen sytoplasmassa ilman kromosomista aiheutuvia rajoituksia. Tässä patenttihake-15 muksessa on kuitenkin tarkoituksena liittää useita erillisiä hydrolaasigeenejä isäntäsolun genomiin. Tätä helpottavat homologiselle rekombinaatiolle erityisen alttiiden prokaryoottisten ja eukaryoottisten eliöiden käyttö.
Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa synteettinen gee-20 ni, joka koodaa luonnossa esiintyvää karbonyylihydrolaasia tai lähtömuotona olevan karbonyylihydrolaasin mutanttimuotoa. Kun käytetään tällaista lähestymistapaa, määritetään lähtömuotona olevan hydrolaasin DNA- ja/tai amino-happojakso. Tämän jälkeen syntetisoidaan useita limittäi-v. 25 siä synteettisiä yksinauhaisia DNA-fragmentteja, jotka hybridisoinnin ja ligaation jälkeen tuottavat synteettisen DNA:n, joka koodaa lähtömuotona olevaa hydrolaasia. Tällä lähestymistavalla saadaan useita etuja luonnollisen geenin kloonaamiseen verrattuna siinä, että restriktiokohdat voi-30 daan sijoittaa DNA:n koko alueelle ilman, että tämän koo-daama aminohappojakso muuttuisi, siten, että tämä edistää mutantti-karbonyylihydrolaasien muodostamiseksi tarkoitettua myöhempää modifikaatiota. Synteettinen lähestymistapa antaa lisäksi mahdollisuuden säätää kodonien käytön syn-35 teettisessä geenissä yhdenmukaiseksi tiettyjen nimenomais- 20 1 0 3 0 5 2 ten ilmentämisisäntien toisia kodoneja suosivan kodonien käytön suhteen. Esimerkki synteettisen geenin konstruktiosta esitetään esimerkkijaksossa.
Kun luonnossa esiintyvä tai synteettinen lähtö-5 muotona oleva karbonyylihydrolaasigeeni on kloonattu, teh dään tiettyjä modifikaatioita geenin käyttömahdollisuuksien parantamiseksi niiden muutoksien lisäksi, joiden kohteena on luonnossa esiintyvän lähtömuotona olevan karbonyylihyd-rolaasin synteesi. Tällaisia modifikaatioita ovat yhdistel-10 mä-karbonyylihydrolaasien tuotanto EP-patenttijulkaisuissa 0 130 756 ja 0 251 446 kuvatulla tavalla ja tässä patenttihakemuksessa kuvattu mutantti-karbonyylihydrolaasien tuotanto .
Seuraavaa kasettimutageneesimenetelmää voidaan 15 käyttää helpottamaan tämän keksinnön mukaisten mutant- ti-karbonyylihydrolaasien konstruktiota ja identifiointia vaikka muitakin menetelmiä, kuten kohdemutageeneesiä, voidaan myös käyttää. Ensin hankitaan saataville hydrolaasia koodaava luonnossa esiintyvä geeni ja se sekvenssoidaan 20 kokonaan tai osittain. Tämän jälkeen haetaan kohta, johon tämän jakson koodaaman entsyymin yhden tai useamman aminohapon mutaatio (deleetio, insertio tai substituutio) halutaan tehdä. Tämän kohdan viereisistä jaksoista selvitetään restriktiokohtien esiintyminen lyhyen geenisegmentin kor-y 25 vaamiseksi oligonukleotidikokoelmalla, joka ilmentyessään tuottaa useita erilaisia mutantteja. Tällaiset restriktio-kohdat ovat geenisegmentin korvaamisen helpottamiseksi edullisesti hydrolaasigeenissä ainutkertaisina esiintyviä kohtia. Voidaan kuitenkin käyttää mitä tahansa sopivaa 30 restriktiokohtaa, joka ei hydrolaasigeenissä ole liian yleinen, edellyttäen että restriktiokohdista pilkkomalla aikaansaadut geenifragmentit voidaan koota uudelleen oikeassa järjestyksessä. Jos restriktiokohtia ei esiinny sopivalla etäisyydellä (10 - 15 nukleotidia) valitusta koh-35 dasta, tällaiset kohdat muodostetaan korvaamalla nuk- 2i 103052 leotidejä geenissä siten, ettei lukukehys eivätkä jakson koodaamat aminohapot lopullisessa konstruktiossa muutu. Mutaatioiden aiheuttaminen geeniin tämän jakson muuttamiseksi halutun jakson mukaiseksi suoritetaan M13-aluk-5 keenpidennysmenetelmällä yleisesti tunnettujen menetelmiä noudattaen. Tehtävänä olevat sopivien vierusalueiden paikantaminen ja niiden tarvittavien muutosten arviointi, joilla päädytään kahteen sopivaan restriktiokohtajaksoon, on rutiinitehtävä geneettisen koodin vaihtoehtoisuuden, 10 geenin restriktioentsyymikartan ja erilaisten restriktio- entsyymien suuren määrän johdosta. On huomattava, että jos saatavilla on sopiva vieressä sijaitseva restriktiokohta, yllä kuvattua menetelmää on tarpeen käyttää vain sellaisen vierusalueen yhteydessä, jossa kohtaa ei ole.
15 Kun luonnossa esiintyvä DNA tai synteettinen DNA on kloonattu, mutatoitavien kohtien viereiset restriktio-kohdat pilkotaan näitä vastaavilla restriktioentsyymeillä ja monia terminaalisten päiden suhteen komplementaarisia oligonukleotidikasetteja liitetään ligaasilla geeniin. 20 Tämä menetelmä yksinkertaistaa mutageneesiä huomattavasti, koska kaikki oligonukleotidit voidaan syntetisoida niin, että niillä on samat restriktiokohdat eikä restriktio-kohtien luomiseen tarvita synteettisiä kytkijöitä.
Tässä yhteydessä proteolyyttinen aktiivisuus määri-:· * 25 tellään peptidisidosten hydrolyysinopeutena aktiivisen entsyymin milligrammaa kohti. Proteolyyttisen aktiivisuuden mittaukseen on olemassa useita tunnettuja menetelmiä (K.M. Kalisz, (1988) "Microbial Proteases", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, toim. A. Fiechter). 30 Tämän keksinnön yhdessä kohteessa on tarkoituksena \ onnistua saamaan käyttöön mutantti-karbonyylihydrolaasi, jolla on parempi (numeerisesti suurempi) proteolyyttinen aktiivisuus lähtömuotona olevaan karbonyylihydrolaasiin verrattuna, minkä johdosta entsyymiä voidaan käyttää si-35 ten, että se vaikuttaa tehokkaammin kohteenaan olevaan 22 1Ö3Ö52 substraattiin. Esimerkeissä on esitetty spesifisiä aminohappoja, jotka ovat käyttökelpoisia tällaisten tulosten saamiseksi subtilisiini-tyyppisillä karbonyylihydrolaa-seilla niiden ryhmien kohdalla, jotka vastaavat Bacillus 5 amyloliquefaciens -subtilisiinissa olevaa asemaa +123.
Joissain tapauksissa voi heikompi proteolyyttinen aktiivisuus olla haluttua. Näissä tapauksissa proteolyyttisen aktiivisuuden alentuminen voidaan saada aikaan korvaamalla esimerkeissä identifioidut aminohapot niiden ryhmien koh-10 dalla, jotka vastaavat Bacillus amyloliquefaciens -subti-lisiinin asemaa +123.
Niiden lähtömuotona olevien subtilisiinien kyseessä ollessa, joissa seriini ei ole Bacillus amyloliquefacien-sin asemaa +123 vastaava ryhmä, saadaan paras proteolyyt-15 tinen aktiivisuus, kun lähtömuodon asemassa +123 oleva ryhmä korvataan seriinillä. Toisaalta ei tunneta sellaisia luonnossa esiintyviä subtilisiineja, jotka sisältäisivät seriinin asemassa, joka vastaa Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinin asemaa +123. Perustuen siihen kek-20 sintöön, että tässä asemassa sijaitseva seriini parantaa proteolyyttistä aktiivisuutta, alan ammattimies kykenee suorittamaan seulonnan luonnossa esiintyvän Bacillus-sub-tilisiinin suhteen sellaisen luonnosta saadun mutantin tunnistamiseksi ja kloonaamiseksi, joka sisältää seriinin :· 25 tässä asemassa. Tällaiset luonnossa esiintyvät Bacillus- subtilisiinimutantit kuuluvat tämän keksinnön suojapii-riin.
Silloin kun karbonyylihydrolaasi on peräisin muista kuin Bacillus-lajeista ja lähtömuotona olevassa entsyymis-30 sä esiintyy asemassa +123 oleva seriini, niin substituutio voi olla luonteeltaan proteolyyttistä aktiivisuutta alentava. Tämä voisi olla käyttökelpoista esimerkiksi siinä tapauksessa, että halutaan käyttää vain karbonyylihydro-laasin synteettistä aktiivisuutta (kuten peptidien synte-35 tisoimiseksi). Voidaan myös haluta vähentää proteolyyttis- 103052 23 tä aktiivisuutta, jolla on kyky hajottaa tällaisen synteesin tuote.
Vielä yksi tämän keksinnön kohteista on se, että on määritetty se, että Bacillus amyloliquefaciens -subtili-5 siinin asemaa +274 vastaavat ryhmät ovat tärkeitä deter-genttikoostumuksessa olevan entsyymin yleisen toiminta-tehokkuuden muunteluun. Kuten esimerkeissä on esitetty, voidaan edullisessa sovellusmuodossa Bacillus lentuksen asemaa +274 vastaava treoniini mutatoida alaniiniksi 10 mutanttientsyymin suorituskyvyn lisäämiseksi, Kuten esimerkeissä on myös esitetty, tämän ryhmän korvaaminen jollakin muulla aminohapolla kuin treoniinilla, esimerkiksi leusiinilla, seriinillä, valiinilla tai alaniinilla, saa aikaan mutantin pysyvyyden vähenemisen. Tämän pysyvyyden 15 vähenemisen uskotaan olevan tulosta mutantin autokatalyyt-tisesta hajoamisesta. Modifikaatiot Bacillus-subtilisiinin asemaa +274 vastaavissa ryhmissä kykenevätkin parantamaan entsyymin kokonaistoimintatehokkuutta detergenttikoostu-muksessa ja muuntamaan entsyymin kokonaispysyvyyttä. Tässä 20 tämän keksinnön kohteessa tarkoituksena on onnistua saamaan aikaan mutantti-karbonyylihydrolaasi, jonka suorituskyky detergenttikoostumuksessa on parantunut lähtömuotona olevaan karbonyylihydrolaasiin verrattuna. Tässä yhteydessä käytettynä parantuneella toimintatehokkuudella tarkoi-25 tetaan tiettyjen entsyymeille herkkien tahrojen, kuten ruohon tai veren, puhdistumisen paranemista. Tämä puhdistuskyky arvioidaan visuaalisesti normaalin pesusyklin jälkeen.
Tämän keksinnön mukainen edullinen sovellutusmuoto 30 esitetään esimerkeissä, joissa Bacillus lentus -subtili-siinissa asemassa 27 oleva lysiini on korvattu arginiinil-la, asemassa 104 oleva väliini on korvattu tyrosiinilla, asemassa 123 oleva asparagiini on korvattu seriinillä ja ryhmässä 274 oleva treoniini on korvattu alaniinilla. 35 Vaikka tämän entsyymin pysyvyys on jonkin verran huonontu- 24 103052 nut lähtömuotona olevaan Bacillus lentus -subtilisiiniin verrattuna, niin tämän entsyymin toimintatehokkuus deter-genttikoostumuksessa on parantunut olennaisesti siinä määrin, että modifioimattomaan Bacillus lentus -subtilisii-5 niin verrattaessa päästään samaan tulokseen käyttämällä tätä Bacillus lentus -mutantti-subtilisiinia noin puolet tästä entsyymimäärästä.
Tästä ja muista mutantti-subtilisiineista saatujen tulosten perusteella on ilmeistä, että karbonyylihydrolaa-10 seissa esiintyvät Bacillus amyloliquefaciensin asemia +123 ja +274 vastaavat ryhmät ovat tärkeitä näiden entsyymien proteolyyttiselle aktiivisuudelle, toimintatehokkuudelle ja/tai pysyvyydelle.
Monet tämän keksinnön mukaisista mutantti-karbo-15 nyylihydrolaaseista, erityisesti subtilisiineista, ovat käyttökelpoisia monia erilaisia pesuainekoostumuksia formuloitaessa. Monet tunnetut yhdisteet ovat sopivia pinta-aktiivisia aineita, jotka ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön mukaisia mutantti-karbonyylihydrolaaseja käsittä-20 vissä koostumuksissa. Näitä ovat Barry J. Andersonille myönnetyssä yhdysvaltalaisessa patentissa 4 404 128 ja Jiri Flora et al.'ille myönnetyssä yhdysvaltalaisessa patentissa 4 261 868 kuvatut ionittomat, anioniset, kationi-set, anioniset tai kahtaisioniset detergentit. Tällä alal-; 25 la tunnetaan erilaisia formulaatioita, joita voidaan käyt tää puhdistusainekoostumuksissa.
Tämän keksinnön mukaiset subtilisiinit voidaan formuloida tunnettuihin jauhemaisiin tai nestemäisiin deter-gentteihin, joiden pH on välillä 6,5 - 12,0, siten että 30 niiden osuus on noin 0,01 - 5 paino-% (edullisesti ·. 0,1 - 0,05 paino-%). Nämä detergenttipuhdistusainekoostu- mukset voivat sisältää myös muita entsyymejä, kuten pro-teaaseja ja amylaaseja sekä tehoaineita ja stabiloivia aineita.
25 103052 Tämän keksinnön mukaisten subtilisiinien lisäys tavanomaisiin puhdistusainekoostumuksiin ei aiheuta mitään erityistä rajoitusta niiden käytölle. Toisin sanottuna mikä tahansa detergentille sopiva lämpötila tai pH sopii 5 myös tämän keksinnön mukaisille koostumuksille, kunhan pH pysyy yllämainituissa rajoissa ja lämpötila on alhaisempi kuin tämän keksinnön mukaisten subtilisiinien denaturoitu-mislämpötila. Tämän keksinnön mukaisia subtilisiineja voidaan lisäksi käyttää detergentittömässä puhdistusaine-10 koostumuksessa taaskin yksinään tai yhdessä tehoaineiden ja stabilioivien aineiden kanssa.
Seuraavaksi tätä keksintöä esitellään esimerkein, eikä tätä tule pitää patenttivaatimusten suojapiiriä rajoittavana.
15 Esimerkki 1
Bacillus lentuksen subtilisiinigeenin Bacillus sub-tiliksessa tapahtuvaan ilmentämiseen tarkoitetut konstruktiot
Plasmidissa pSAR, kuvio 5, on Bacillus subtiliksen 20 ja B. amyloliquefaciensin subtilisiinigeenien signaali-jakson seitsemännen/kahdeksannen kodonin kohdalla olevan yhteisen Sau3A- restriktiokohdan välityksellä aikaansaatu translationaalinen fuusio. Kuten kuviossa 5 on esitetty, tämä 2,0 ke:n suuruinen EcoRI-BamHI-fragmentissa oleva :·,· 25 geeni jatkokloonattiin M13mpl9:ään sellaisen yksinauhaisen templaatti-DNA:n eristämiseksi, jota käytetään kohdemuta-geneesissä pSAR-Q275R:n muodostamiseksi. Mutageneesissa käytetyt toimenpiteet olivat olennaisilta osiltaan julkaisun Zoller, M. et ai., (1983) Methods Enzymol. 100, 30 468 - 500, mukaisia, (1) ja siinä käytettiin synteettistä oligonukleotidiä, jolla oli jakso: * ** 5'-C-AAC-GTA-CAG-GCT-GCA-GCT-CGC-TAA-AAC-ATA-A-3'
Q275R
26 103052 jossa asteriskit tarkoittavat muutoksia villityyppisen geenin jaksoihin ja alleviivaus tarkoittaa lisättyä Pstl-restriktioendonukleaasikohtaa, jota käytettiin Q275R-muu-tosta koodaavan tietyn nimenomaisen mutanttigeenin seulon-5 taan. Nämä muutokset tehtiin (1) tässä asemassa olevan aminohapon muuntamiseksi Bacillus lentuksen subtilisiinis-sa esiintyväksi aminohapoksi ja (2) pSARrssa olevan lopetus jakson liittämiseksi Bacillus lentuksen maturoitunee-seen koodaavaan alueeseen sellaisen Pst-kohdan välitykselle) lä, joka oli muodostettu samalla tavoin Bacillus lentuk-sesta (ATCC 21536) saatuun pGG36:een.
Plasmidi pGG36, kuvio 5, sisältää 2,1 ke:n suuruisen Bacillus lentuksesta peräisin olevan täydellistä sub-tilisiinigeeniä koodaavan genomin DNA-fragmentin, joka 15 kloonattiin standardimenetelmiä käyttäen sukkulavektoriin pBS42. Band, L. et ai., (1984) DNA 3, 17 - 21.
Tätä subtilisiinia vastaava aminohappojakso on sama kuin PCT-patenttijulkaisussa nro 89/06279 subtilisiinille 309 esitetty aminohappojakso. Kohdemutageneesin suoritta-20 miseksi tämä geeni jatkokloonattiin M13:een yllä kuvatulla tavalla käyttäen oligonukleotidia, jolla on jakso * * * 5’-C-AAT-GCA-GAA-GCT-GCA-GCT-AGA-TAA-TCA-A-3'
T274A
;· 25 jotta saataisiin 1) lisätyksi Pstl-kohta siihen kohtaan, joka tässä geenissä vastaa kohtaa, joka edellä lisättiin pSARrään ja 2) korvatuksi asemassa 274 oleva treoniini alaniinilla pGG36-T274A:n muodostamiseksi.
30 pSAR-Q275R- ja pGG36-T274A-mutanttigeenit jatko- kloonattiin kumpikin erikseen takaisin pBS42:een ennen Pstl/BamHI:11a suoritettua pilkkomista, fragmenttien eristämistä ja ligaatiota, plasmidin GG-A274B.amy.term, tuottamiseksi kuvion 5 mukaisesti käyttäen standardimenetelmiä 35 kaikissa vaiheissa.
27 103052
Synteettinen DNA-kytkijä valmistettiin antamalla komplementaaristen yksinauhaisten oligonukleotidien, joilla oli jaksot 5 5'-G-ACT-GTC-GCG-TCG-ACC-CGA-CTA-CTC-ATT-TCT-GTT-
Gct-TTT-AGT-TCA-T-3'
Ja 10 5 ' -CGA-TGA-ACT-AAA-AGC-AAC-AGA-AAT-GAG-TAG-TGC-GGT- CGA-CGC-GAC-3' liittyä toisiinsa pitkittäin kaksinauhaisen kuviossa 6 esitetyn DNA-fragmentin #2 muodostamiseksi. Tämän duplek-15 simuotoisen kytkijämolekyylin tasaamattomat oikean- ja vasemmanpuoleiset päät ovat komplementaarisia fragmentin #1 Sau3A-pään (peräisin pSARlista) ja fragmentin #3 Clal-pään (peräisin pGG-A274 B.amy.termistä) suhteen, tässä järjestyksessä mainittuna. Plasmidi pGG-KVNA:n tuottami-20 seksi nämä kolme fragmenttia yhdistettiin pSAR-Q275R:stä peräisin olevaan fragmenttiin 4 sen jälkeen, kun plasmidit oli pilkottu restriktioendonukleaaseilla, fragmentit oli eristetty ja liitetty ligaasilla standardimenetelmin. Merkintä GG-KVNA tarkoittaa sitä, että tämä subtilisiini si-t*.- 25 sältää pGG-36:n koodaaman subtilisiinin, johon sisältyy asemassa 27 oleva lysiini (K), asemassa 104 oleva väliini (V), asemassa 123 oleva asparagiini (N) ja asemassa 274 olevan treoniinin substituutio alaniinilla (A).
Esimerkki 2 30 PGG-KVNA:n modifikaatio
Kuten kuviossa 6 on esitetty, GG-KVNA-geeni (2,1 kein suuruinen EcoRI-BamHI-fragmentti) jatkokloonattiin Ml3:een kolmen peräkkäisen kohdemutageneesikierroksen suorittamiseksi käyttäen oligonukleotidejä, joilla oli jak-35 sot: 28 1 0 3 0 5 2 * * *
(a) 5' -GT-TCT-GGT-GTA-AGA-GTT-CCT-C1Xi£I£i<i£AT-ACA-CGT-3' , S
K27R
* ★* 5 (b) 5 *-A-GTA-TTA-GCG-CCT»ACC-CGT »TCA-GCT-TCC-TAC-AGC-TCC-ATT-3' VIOAy ja ** (c) 5'-CGG-AAC-AAT-CCA-ATC-CAC-CTT-CCT-AGC-TTG-ACT-TTA-3 *
N123S
10
Asteriskit merkitsevät villityypin geenijaksoon tehtyjä muutoksia. Alleviivaukset esittävät (a):ssa muodostettua Xbal-kohtaa ja (b):ssä ja (c):ssä muodostettuja Nhel-kohtia, joita käytettiin liitettyjen R27-, Y104- ja 15 S123-mutaatioiden seulomiseen, tässä järjestyksessä mai nittuna. Lisäksi yläpuolisella viivalla varustettu alue kohdassa (c) merkitsee tuhoutunutta Sphl-kohtaa. Lopuksi 2,1 ke:n suuruinen GG-RYSA-geeni jatkokloonattiin takaisin pBS42:een B. subtilis -isäntäsoluissa tapahtuvaa ilmentä-. 20 mistä varten.
Tulokseksi saadulle plasmidille annettiin nimitys pGG-RYSA. Tämä merkintä osoittaa, että pGG-KVNA-plasmidis-sa modifioitiin neljä ryhmää. Asemassa 27 oleva lysiini (K) arginiiniksi, asemassa 104 oleva väliini (V) tyrosii-... 25 niksi (Y) ja asemassa 123 oleva asparagiini (N) seriiniksi (S). Tämän suorituksen yhteydessä ei modifioitu asemassa 274 aikaisemmin korvattua alaniinia. Asemassa 27 oleva lysiini korvattiin arginiinilla subtilisiini 309:n amino-happosekvenssoinnin perusteella. Kuten PCT-patenttijul-30 kaisussa nro W0 89/06 279 on esitetty, lysiini on asemassa 27. Kun tämä subtilisiiniproteiini oli sekvenssoitu aikaisemmista suorituksista riippumattomalla tavalla, osoittivat alustavat koetulokset kuitenkin sen, että asemassa 27 oleva ryhmä oli arginiini. Kun kyseessä oli tapaus, jossa 35 ryhmässä 104 oleva väliini korvattiin tyrosiinilla, kor- 29 103052 vaus tehtiin pH-aktiivisuusprofiilin alentamiseksi ja entsyymin toimintatehokkuuden parantamiseksi aikaisemmin Bacillus amyloliquefaciens -subtilisiinista (jota toisinaan kutsutaan BPN':ksi) saatujen tulosten perusteella.
5 Asemassa 123 olevan asparagiinin korvaaminen seriinillä perustuu tuloksiin, jotka saatiin myöhemmin tämän keksinnön yhteydessä, kun saatiin määritetyksi se, että seriinin korvaaminen asemassa 123 maksimoi entsyymin proteolyytti-sen aktiivisuuden läheisesti sitä muistuttavassa mutan-10 tissa.
Esimerkki 3
Synteettisen Bacillus lentus-subtilisiinigeenin konstruktio
Bacillus lentuksen subtilisiinin aminohappojaksoa 15 koodaava DNA valmistettiin myös konstruoimalla synteettistä DNA-jaksoa koodaava geeni.
Sekvenssoitiin plasmidista pGG36 saatu 2,1 ke: n suuruinen Hindlll-genomifragmentti. Maturoituneen geeni-tuotteen (GG36-subtilisiinin) pääteltyä aminohappojaksoa 20 käytettiin sellaisen synteettisen maturoitunutta muotoa koodaavan jakson suunnitteluun, jolla on seuraavat ominaisuudet: (1) käytettiin yleensä niitä kodoneja, jotka esiintyivät useimmin kutakin aminohappoa vastaavina kodoneina seitsemässä erilaisessa B. subtilis -geenissä (nämä saa-25 tiin taulukoiduista kodonien käyttöasteista, taulukko 2 julkaisussa Maruyama, T. et ai., (1986) Nucl. Acids Res., liite 14, sivut rl51 - rl97), lukuun ottamatta niitä tapauksia, joissa vaihtoehtoiset kodonit saivat geenissä aikaan sopivasti sijoittuneita restriktioentsyymien tun-30 nistuskohtia, (2) * 0,8 suuruiselta maturoituneelta koo-daavalta alueelta otettiin noin 40 - 60 emäsparin välein käyttöön 2 tai 3 erityisellä tavalla valitun kodonin yhdistelmiä, josta saatiin tulokseksi melko tasaisin välein alueeseen muodostettuja ainutkertaisina esiintyviä rest-35 riktiokohtia. Nämä kohdat valittiin helpottamaan (a) myö- 30 103052 henunin tehtävää kasettimutageneesiä ja seulontatutkimuksia ja (b) sellaisten konstruktioiden tekoa, joihin tarvitaan enemmän kuin yksi mutaatio, (3) suunniteltiin ainutkertaisena esiintyvä Pst I -tunnistuskohta kattamaan kodonit 5 272 - 274, mikä mahdollistaa liittämisen näiden samojen kolmen kodonin kohdalta modifioituun Bacillus amylolique-faciensin geenin lopetusjaksoihin, ja kohdassa 274 oleva treoniini korvattiin alaniinilla, ja (4) lisättiin ainutkertaisena esiintyvä NruI-kohta kattamaan maturoituneen 10 muodon kodonien ryhmät, mikä mahdollistaa liittämisen GG36:n koodaavaan pre-pro-jaksoon lyhyen synteettisen dup-leksi-DNA-kytkijän välityksellä. Tähän suunnitelmaan perustuen syntetisoitiin sellaisia oligonukleotidejä ("oligoja"), että annettaessa koodaavien ja koodaamatto-15 mien oligojen, jotka vastaavat tiettyä * 60 emäsparin pituista koodaavaa aluetta, yhtyä pituussuunnassaan yhteen, tuloksena olevan dupleksi-DNA-fragmentin päissä tulisi olemaan yksinauhaiset alueet, jotka ovat komplementaarisia geenin seuraavan dupleksifragmentin suhteen (katso 20 kuvio 7).
Systeemissä käytettiin kaikkiaan 36 erillistä oli-goa (käsittävät 18 erillistä dupleksia), ylläkuvatulla tavalla ja tuloksena oli noin 0,8 ke:n suuruinen dupleksin muodossa oleva synteettinen maturoitunut koodaava alue y.'- 25 (fragmentti 3 kuviossa 8).
Lopuksi syntetisoitiin vielä yksi pari synteettisiä oligoja, jonka 5'-päässä sitten, kun osien on annettu liittyä pitkittäin yhteen, on Ncol-kohta (komplementaarinen GG36:n maturoituneen muodon kodoneissa 5-6 olevan 30 Ncol-kohdan suhteen) ja 3'-päässä Nrul-kohta (komplemen-·. taarinen fragmentin 3 3'-fragmenttien 5'-pään suhteen).
Lopullinen konstruktio tehtiin kuviossa 6 esitetyllä neljän osapuolen kesken suoritetulla ligaatiolla sellaisen täydellisen ilmentämisyksikön muodostamiseksi, joka 35 koostuu B. subtiliksen promoottorista sekä loppua signaa- ai 103052 lijaksoa koodaaviin GG36:n jaksoihin liitetyistä signaali-jakson seitsemästä ensimmäisestä aminohaposta, täydellisestä pro-jaksosta ja kuudesta ensimmäisestä maturoituneen muodon aminohaposta (GG-KVNA:sta peräisin oleva fragmentti 5 1), synteettisestä geenistä, joka koodaa maturoituneen muodon ryhmiä 2 - 274 (fragmentit 2+3) ja Bacillus amyloliquefaciensin terminaatioalueesta (sisältää lopullisen maturoituneen alueen geenin kodonin 279) (fragmentti 4).
10 Lopuksi tämän täysimittaisen hybridigeenin maturoi- tunutta muotoa koodaavaan alueeseen lisättiin kolme uutta erillistä mutaatiota. Ensimmäinen korvasi asemassa 27 olevan lysiinin arginiinilla. Toinen korvasi asemassa 104 olevan valiinin tyrosiinilla. Kolmas korvasi asemassa 123 15 olevan asparagiinin seriinillä. Tulokseksi saadulle plas-midille annettiin nimitys pBC3-RYSA. Seuraava esimerkki kuvaa menetelmää, jota käytettiin modifioimaan synteettisessä geenissä oleva asema 123. Samanlaisia menetelmiä käytettiin modifioimaan tässä synteettisessä geenissä ole-20 vat kohdat 27 ja 104.
Esimerkki 4
Kohdan 123 mutanttien konstruktio
Esimerkissä 3 saadun synteettisen geenin kodoneihin 111/112 muodostettiin Xhol-kohta tekemällä kohdemutageesiä 25 käyttäen kolme fenotyypiltään neutraalia mutaatiota (aluk-keen pidennysmutageneesi M13:ssa). Tulokseksi saatu plas-midi, pX123 (kuvio 9) pilkottiin Xho I:llä ja Ava Iillä ja vektorin sisältävä suuri fragmentti eristettiin agaroosi-geelistä sähkövirrassa eluoimalla. Komplementaaristen syn-30 teettisten oligonukleotidien annettiin liittyä toisiinsa pituussuunnassa, liitettiin ligaasilla pX123:n suureen fragmenttiin ja transformoitiin E. coli -kantaan MM294. Nämä kasetit koodasivat kukin erikseen kaikkia 20 luonnossa esiintyvää aminohappoa asemassa 123 ja ne sisälsivät 35 lisäksi neutraalin mutaation, joka tuhosi ainutkertaisena 32 1 0 3 0 5 2 esiintyvän SphI-kohdan, joka sijaitsi pX123:ssa XhoI- ja Aval-kohtien välissä. Transformoiduista E. coli -bakteereista saadut plasmidit seulottiin puuttuvan ainutkertaisena esiintyvän SphI-kohdan suhteen. Restriktioanalyysin 5 tuloksena olleet positiiviset (ts. Sphl-negatiiviset) plasmidit sekvenssoitiin sen varmistamiseksi, että halutut mutaatiot esiintyvät niissä asemassa 123, jatkokloonattiin sukkulavektoriin pBS42 ja transformoitiin Bacillus subti-lis BG2036 -kantaan ilmentämistä varten.
10 Esimerkki 5
Erilaisten +123-mutanttien aktiivisuus Ylläkuvattujen modifioitujen kohdan +123 mutanttien koodaamien mutantti-subtilisiinien proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin sekoittamalla 0,04 ml sentrifugoiduis-15 ta viljelmistä saadut lihaliemisupernatantit 0,56 ml:aan liuosta, jossa oli 1 paino-% kaseiinia 0,1-molaarisessa Tris-puskurissa, jonka pH oli 6,8. Kun liuoksia oli inku-boitu 20 minuuttia 37 eC:n lämpötilassa, reaktiot lopetettiin seostamalla 10-%:sella trikloorietikkahapolla (TCA). 20 Aktiivisuus määritettiin supernatantIsta 280 nm:n aallonpituudella mitatusta absorbanssista 10-%:11a etikkahapolla tapahtuneen saostuksen jälkeen.
« * 33 103052
Taulukko I
123-kodonin varianttien suhteellinen proteolyyttinen aktiivisuun vakioituna asn-123-mutanttiin 5 Kodon! 123 Proteolyyttinen aktiivisuus _prosenttia_
Ser 116
Asn 100
Cys 22 10 Gly 12
Ala 9
Thr 7
Gin 7
Vai <5 15 Glu <5
Ile <5
Trp <5
Phe <5
Asp <5 20 His <5
Leu <5
Met <5
Pro <5
Tyr <5 25 _
Entsyymiä BC3-RYSA koodaavan synteettisen geenin DNA-jakson lopullisesssa varmistusprosessissa havaittiin asemassa 78 olevan seriinin (tämän kohdan aminohappo 30 Bacillus lentuksen subtilisiinissa) asemasta proliini.
Kohdan 123 mutaatioiden alustavat ominaisuudet testattiin tätä entsyymiä, BC3-RPYA:ta (proliini asemassa 78) käyttäen. Nämä tulokset on esitetty taulukossa I. Tämän jälkeen asemassa 78 oleva aminohappo muutettiin takaisin se-35 riiniksi kuviossa 10 esitetyn DNA- ja aminohappojakson 34 103052 muodostamiseksi sijoittamalla tähän paikkaan tätä geenin osaa vastaava synteettinen DNA-dupleksi.
Kuten voidaan havaita, saa asn:n korvaaminen ser:llä asemassa +123 aikaan proteolyyttisen aktiivisuuden 5 huomattavan parantumisen. Tässä patenttihakemuksessa käsiteltyjen erilaisten subtilisiinien välisistä suhteista on tehty yhteenveto asemien 27, 78, 104, 123 ja 274 suhteen taulukossa II.
10 Taulukko II
Asema 27 78 104 123 274 15 GC36 (genominen) lys(K) ser(S) val(V) asn(N) thr(T)
Synteettinen B. lentus-geeni lys(K) pro(P) val(V) asn(N) ala(A) B. amyloliquefaciens -subtilisiini (BPN) lys(K) ser(S) tyr(Y) asn(N) ala(A) 20 Julkaistu subtilisiini 309 lys(K) ser(S) val(V) asn(N) thr(T) Tässä patenttihakemuksessa kuvattu edullinen ·.·. 25 sovellusmuoto arg(R) ser(S) tyr(Y) ser(S) ala(A)
Esimerkki 6 274-kohdan mutanttien pysyvyys 30 BC3-RPY:ssä olevien kohdan 274 mutanttien (arginii- ni asemassa 27, proliini asemassa 78 ja tyrosiini asemassa 104 Bacillus lentus -subtilisiinissa) pysyvyys on esitetty taulukossa lii. Koetulokset ovat jäljellä oleva prosentuaalinen aktiivisuus 37 °C:n lämpötilassa 50 mM EDTA-liuok-35 sessa tehdyn 60 min inkuboinnin jälkeen.
35 103052
Taulukko III
Aminohappo asemassa 274_Aktiivisuus prosentteina 5
Leusiini 2 %
Seriini 79 %
Treoniini 91 %
Vallini 42 % 10 Alaniini 43 % Tässä asemassa tapahtuvat mutaatiot vaikuttavat selvästi entsyymin aktiivisuuteen. Vaikka tässä asemassa alaniinimutaatio ei ollut yhtä pysyvä kuin seriini tai 15 treoniini, tällä entsyymillä oli ylivoimainen toiminta-tehokkuus Bacillus lentuksen subtilisiinin suhteen kuvatuissa käyttöolosuhteissa. Toisenlaisissa sovellutuksissa voidaan käyttää toisia aminohappoja asemassa 274.
« c 36 103052
Esimerkki 7
Detergenttikoostumus
Valmistettiin seuraavan koostumuksen mukainen sumu-kuivattu rakeistettu fosfaattidetergentti 5
Komponentti Paino-%
Lineaarinen natrium-C12-alkyyli-bentseenisulfonaatti 8,45
Natriumtalialkoholisulfaatti 4,23 10 Lineaarinen natrium-C14~15- alkyylisulfaatti 4,23
Natriumtolueenisulfaatti 1,00
Natriumtripolyfosfaatti 5,60
Natriumpyrofosfaatti 22,40 15 Silikaatti (1,6 r) 5,50
Natriumsulfaatti 29,83
Natriumpolyakrylaatti (MP 4500) 1,17
Kirkaste 0,22
Natriumkarbonaatti 12,30 20 Polyetyleeniglykoli (MP 8000) 0,47 C12~13-alkoholipolyetoksylaatti (6,5)* 0,50
Sekalaisia aineita sekä vettä 100 %:iin asti Proteaasi* 0,034 . 25 ‘Alkoholi ja monoetoksilaattialkoholi poistettu **mg aktiivista entsyymiä/g (2,0 mg aktiivista entsyymiä/g kantavalmistetta)
30 Tämän koostumuksen 0,1 paino-%:sen vesiliuoksen pH
oli 10,0. Koostumus, jossa oli tämän keksinnön mukaista mutantti-subtilisiinia (kuvio 7) puhdisti ylivoimaisesti entsyymeille herkät tahrat verrattuna Bacillus lentukseen koostumuksissa, joissa oli 0,068 mg aktiivista entsyymiä/g
— - — X
37 1 0 3 0 5 2 tuotetta pestäessä 35 °C:n lämpötilassa veden kovuuden ollessa 0,0171 g/1 (3:1 Ca/Mg).
Tässä patenttihakemuksessa on viitattu erilaisiin aminohappoihin yleisiä kolmikirjaimisia koodeja käyttäen.
5 Nämä koodit on identifioitu teoksessa Thomas E. Creighton, toim., Proteins: Structures and Molecular Proteases, W.N. Freeman, N.Y., N.Y. (1983), sivu 3.
Vaikka tämän keksinnön mukainen edullinen muoto on kuvattu yllä, tätä keksintöä koskevan alan ammattimiehille 10 on ilmeistä, että saatuaan keksinnöstä kokonaiskäsityksen siihen voidaan tehdä useita erilaisia muutoksia ja muunnelmia patenttivaatimusten määrittelemästä keksinnön suojapiiristä poikkeamatta.
Kaikki julkaisut on nimenomaisesti liitetty tähän 15 patenttihakemukseen tähän oikeuttavien sopimusten nojalla.

Claims (12)

103052
1. Subtilisiinimutantti, tunnettu siitä, että sen aminohapposekvenssiä ei tavata luonnossa ja se on 5 saatu lähtömuotosubtilisiinista korvaamalla lähtömuodon asemassa, joka vastaa Bacillus amyloliquefaciens -subtili-siinin asemaa Asn, +123, tai Ala, +274, oleva aminohappo-ryhmä toisella aminohapolla, jolloin numerointi viittaa kuviossa 3 annettuun Bacillus amyloliquefaciens -subti- 10 lisiinin sekvenssiin.
2. AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVRVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGE PSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSYSSIA QGLEWAGNNGMHVASLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSI SYPARYANAMAVGATDQNNNRAS F S QYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLN GTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAE 25 AAAR.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiinimutantti, tunnettu siitä, että korvaus tapahtuu se-riinillä Bacillus amyloliquefaciensin asemaa Asn, +123, vastaavassa asemassa.
3. QGLEWAGNNGMHVAS LS LGS PS P SATLEQAVNSAT SRGVLWAASGNS GAGSI : SYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLN GTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAE AAAR.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen subtilisiinimu tantti, tunnettu siitä, että se on muodostettu Bacillus-subtilisiinista.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen Bacillus-subtili-siinimutantti, tunnettu siitä, että sillä on pa- 2. rantunut proteolyyttinen aktiivisuus, ja että se on johdet tu luonnossa esiintyvästä tai mutatoidusta lähtömuotona olevasta Bacillus-subtilisiinista, jossa Bacillus amyloli-quefaciens -subtilisiinin asemaa +123 vastaavassa asemassa oleva aminohappo on muutettu seriiniksi. I*r 25
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen Bacillus-subtili- siinimutantti, tunnettu siitä, että sillä on aminohapposekvenssi : AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVRVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGE PSTQDGNGHGTHVAGTIAALNWSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSYSSIA
6. DNA, tunnettu siitä, että se koodaa pa- 35 tenttivaatimuksen 1 mukaista subtilisiinimutanttia. 103052
7. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 6 mukaista DNA:ta.
8. Prokaryootti- tai eukaryootti-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patentti - 5 vaatimuksen 7 mukaisella ilmentämisvektorilla.
9. Entsymaattinen puhdistusainekoostumus, joka kykenee hajottamaan proteiineja, tunnettu siitä, että se käsittää a) osan, joka on pinta-aktiivista ainetta, ja 10 b) subtilisiinimutantin, jonka aminohapposekvenssi ei esiinny luonnossa, ja joka on johdettu lähtömuotona olevasta subtilisiinista korvaamalla aminohapporyhmä lähtömuo-don asemassa, joka vastaa Bacillus amyloliquefaciens -sub-tilisiinin asemaa +123 tai +274, toisella aminohapolla, 15 jolloin numerointi viittaa kuviossa 3 annettuun Bacillus amyloliquefaciens - subtilisiinin sekvenssiin.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että subtilisiinilla on aminohappo-sekvenssi :
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että pinta-aktiivinen aine käsittää detergentin.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen koostumus, 30 tunnettu siitä, että se käsittää rakeistetun sumu- '· kuivatun detergentin. 40 103052
FI913166A 1989-10-31 1991-06-28 Subtilisiinimutantti ja tätä sisältävä entsymaattinen puhdistusainekoostumus FI103052B1 (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42988289A 1989-10-31 1989-10-31
US42988289 1989-10-31
US60043090 1990-10-19
US07/600,430 US5185258A (en) 1984-05-29 1990-10-19 Subtilisin mutants
US9006084 1990-10-26
PCT/US1990/006084 WO1991006637A1 (en) 1989-10-31 1990-10-26 Subtilisin mutants

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI913166A0 FI913166A0 (fi) 1991-06-28
FI103052B true FI103052B (fi) 1999-04-15
FI103052B1 FI103052B1 (fi) 1999-04-15

Family

ID=27028376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI913166A FI103052B1 (fi) 1989-10-31 1991-06-28 Subtilisiinimutantti ja tätä sisältävä entsymaattinen puhdistusainekoostumus

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5185258A (fi)
EP (2) EP0451244B9 (fi)
JP (1) JP3335623B2 (fi)
KR (1) KR970004938B1 (fi)
CN (1) CN1052897A (fi)
AR (1) AR244339A1 (fi)
AT (2) ATE297997T1 (fi)
AU (1) AU633376B2 (fi)
BR (1) BR9006993A (fi)
CA (1) CA2044630C (fi)
DE (2) DE69032852T2 (fi)
DK (2) DK0775749T4 (fi)
ES (2) ES2125224T3 (fi)
FI (1) FI103052B1 (fi)
IE (1) IE62771B1 (fi)
MA (1) MA22573A1 (fi)
NO (1) NO301081B1 (fi)
NZ (1) NZ235883A (fi)
PT (1) PT95741B (fi)
TR (1) TR25991A (fi)
WO (1) WO1991006637A1 (fi)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6287841B1 (en) * 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
US5665587A (en) * 1989-06-26 1997-09-09 Novo Nordisk A/S Modified subtilisins and detergent compositions containing same
US5352603A (en) * 1989-08-31 1994-10-04 Kali-Chemie Ag Highly alkaline proteases
DK271490D0 (da) * 1990-11-14 1990-11-14 Novo Nordisk As Detergentkomposition
WO1992011357A1 (en) * 1990-12-21 1992-07-09 Novo Nordisk A/S ENZYME MUTANTS HAVING A LOW DEGREE OF VARIATION OF THE MOLECULAR CHARGE OVER A pH RANGE
US5482849A (en) * 1990-12-21 1996-01-09 Novo Nordisk A/S Subtilisin mutants
EP0583339B1 (en) * 1991-05-01 1998-07-08 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes and detergent compositions
US5340735A (en) * 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
EP0525610A3 (en) * 1991-07-27 1993-03-24 Solvay Enzymes Gmbh & Co. Kg Process for increasing the stability of enzymes and stabilized enzymes
US6300122B1 (en) 1991-12-20 2001-10-09 Genencor International Method for applying enzyme to non-finished cellulosic-containing fabrics to improve appearance and feel characteristics
DE69333463D1 (de) * 1992-05-18 2004-05-06 Genencor Int Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen
US6251144B1 (en) 1992-06-12 2001-06-26 Genencor International, Inc. Enzymatic compositions and methods for producing stonewashed look on indigo-dyed denim fabric and garments
KR950702633A (ko) * 1992-07-17 1995-07-29 한스 발터 라벤 고알칼리성 세린 프로테아제(high alkaline serine proteases)
US5567601A (en) * 1993-06-01 1996-10-22 University Of Maryland Subtilisin mutants lacking a primary calcium binding site
US5470733A (en) * 1993-06-01 1995-11-28 University Of Maryland Calcium free subtilisin mutants
US6440717B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-27 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6436690B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-20 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
MA23346A1 (fr) * 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
US5932532A (en) * 1993-10-14 1999-08-03 Procter & Gamble Company Bleach compositions comprising protease enzyme
CN1088102C (zh) * 1993-10-14 2002-07-24 普罗格特-甘布尔公司 含有蛋白酶的漂白组合物
AU8079794A (en) * 1993-10-14 1995-05-04 Procter & Gamble Company, The Protease-containing cleaning compositions
US6187579B1 (en) 1993-10-28 2001-02-13 Carlsberg A/S Customized proteases
ES2364774T3 (es) * 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG &amp; CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
US6599730B1 (en) * 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
EP0687733A1 (en) * 1994-06-16 1995-12-20 The Procter & Gamble Company Detergent composition containing wool compatible high alkaline proteases
US5922082A (en) 1994-06-16 1999-07-13 Procter & Gamble Company Detergent composition containing wool compatible high alkaline proteases
PL318209A1 (en) * 1994-08-11 1997-05-26 Genencor Int Improved cleaning composition
GB9416841D0 (en) 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
US5578136A (en) 1994-08-31 1996-11-26 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing compositions comprising quaternary substituted bleach activators
US6066611A (en) * 1994-10-13 2000-05-23 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising protease enzymes
US6455295B1 (en) * 1995-03-08 2002-09-24 The Procter & Gamble Company Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
IL117350A0 (en) * 1995-03-09 1996-07-23 Procter & Gamble Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) * 1995-03-09 2002-11-05 Procter & Gamble Company Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6682924B1 (en) * 1995-05-05 2004-01-27 Novozymes A/S Protease variants and compositions
US5837517A (en) * 1995-05-05 1998-11-17 Novo Nordisk A/S Protease variants and compositions
US6946280B1 (en) * 1996-03-29 2005-09-20 Genencor International, Inc. Enzyme multimer and process of producing same
US5985627A (en) * 1997-02-28 1999-11-16 Carlsberg Laboratory Modified carboxypeptidase
US6284246B1 (en) 1997-07-30 2001-09-04 The Procter & Gamble Co. Modified polypeptides with high activity and reduced allergenicity
ES2367505T3 (es) 1997-10-23 2011-11-04 Danisco Us Inc. Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes.
WO1999032612A1 (en) 1997-12-20 1999-07-01 Genencor International, Inc. Fluidized bed matrix granule
WO1999031959A2 (en) 1997-12-20 1999-07-01 Genencor International, Inc. Accelerated stability test for granulated protein
DE69836098T3 (de) 1997-12-20 2014-04-30 Genencor International, Inc. In einem wirbelschichtbett hergestelltes matrixgranulat
US6602841B1 (en) 1997-12-20 2003-08-05 Genencor International, Inc. Granule with hydrated barrier material
CA2313950A1 (en) 1997-12-24 1999-07-08 James T. Kellis, Jr. An improved method of assaying for a preferred enzyme and /or preferred detergent composition
US6835550B1 (en) 1998-04-15 2004-12-28 Genencor International, Inc. Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins
US6642011B2 (en) 1998-04-15 2003-11-04 Genencor International, Inc. Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins
US6936249B1 (en) * 1998-04-15 2005-08-30 Genencor International, Inc. Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
EP2287318B1 (en) 1998-06-10 2014-01-22 Novozymes A/S Mannanases
US6831053B1 (en) 1998-10-23 2004-12-14 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants
US6376450B1 (en) * 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
NZ510838A (en) 1998-10-27 2003-03-28 Genencor Int Matrix granule containing a protein and a starch admixture layered over an inert particle
AU1622300A (en) 1998-11-13 2000-06-05 Douglas A. Dale Fluidized bed low density granule
US6579841B1 (en) 1998-12-18 2003-06-17 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
MXPA01006944A (es) 1999-01-08 2003-09-10 Genencor Int Composiciones de baja densidad y materiales particulados que incluyen las mismas.
ES2348461T3 (es) 1999-10-15 2010-12-07 Danisco Us Inc. Gránulos que contienen proteínas y formulaciones de gránulos.
MXPA02010643A (es) * 2000-04-26 2004-05-17 Land O Lakes Inc Un metodo de tratamiento de proteinas de soya y un producto de proteina de soya producido mediante este metodo.
WO2002010183A1 (en) * 2000-07-31 2002-02-07 Menzel, Rolf Compositions and methods for directed gene assembly
US6623949B1 (en) * 2000-08-04 2003-09-23 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US6635465B1 (en) 2000-08-04 2003-10-21 Genencor International, Inc. Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
US7303907B2 (en) 2001-01-08 2007-12-04 Health Protection Agency Degradation and detection of TSE infectivity
EP1241112A3 (en) 2001-03-15 2003-02-26 The Procter & Gamble Company Flexible multiple compartment pouch
AU2002254374A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-08 Genencor International, Inc. Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
US8076113B2 (en) * 2001-04-02 2011-12-13 Danisco Us Inc. Method for producing granules with reduced dust potential comprising an antifoam agent
ATE376587T1 (de) 2001-06-22 2007-11-15 Genencor Int Granulat mit hoher schlagfestigkeit
US7157416B2 (en) * 2001-07-20 2007-01-02 Genencor International, Inc. Stabilization of enzymes
US7332320B2 (en) * 2001-12-31 2008-02-19 Genencor International, Inc. Protease producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
AU2002353178C1 (en) * 2001-12-31 2011-02-03 Genencor International, Inc. Proteases producing an altered immunological response and methods of making and using the same
ES2336092T3 (es) * 2002-01-16 2010-04-08 Genencor International, Inc. Variantes de proteasas con multiples sustituciones.
EP2287320B1 (en) 2002-01-16 2014-10-01 Danisco US Inc. Multiply-substituted protease variants
JP4597528B2 (ja) * 2002-02-26 2010-12-15 ジェネンコー・インターナショナル・インク 免疫原性が減少したズブチリシン・カールスバーグタンパク質
EP1483581B1 (en) * 2002-02-26 2007-11-14 Genencor International, Inc. Population based assessments and means to rank the relative immunogenicity of proteins
CA2485169C (en) 2002-05-20 2013-03-26 Joseph C. Mcauliffe Peptide derivatives, and their use for the synthesis of silicon-based composite materials
JP4694966B2 (ja) * 2002-07-30 2011-06-08 ジェネンコー・インターナショナル・インク エアロゾル生成を低減する製剤
SG188669A1 (en) * 2002-10-02 2013-04-30 Catalyst Biosciences Inc Method of generating and screening for proteases with altered specificity
EP2500423B1 (en) 2003-02-26 2015-06-17 Danisco US Inc. Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
US20070025974A1 (en) * 2003-02-26 2007-02-01 Hardings Fiona A Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
DE10360805A1 (de) 2003-12-23 2005-07-28 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neue Alkalische Protease
DE102004019751A1 (de) 2004-04-23 2005-11-17 Henkel Kgaa Neue Alkalische Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Alkalischen Proteasen
US20080220450A1 (en) * 2004-04-26 2008-09-11 Danisco Us, Inc., Genencor Division Population Based Prediction Methods for Immune Response Determinations and Methods for Verifying Immunological Response Data
ATE454440T1 (de) 2004-05-17 2010-01-15 Procter & Gamble Bleichmittel mit carbohydratoxidase
US20090060933A1 (en) * 2004-06-14 2009-03-05 Estell David A Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US7686892B2 (en) 2004-11-19 2010-03-30 The Procter & Gamble Company Whiteness perception compositions
WO2007038570A1 (en) 2005-09-27 2007-04-05 The Procter & Gamble Company Microcapsule and method of producing same
GB0603775D0 (en) * 2006-02-24 2006-04-05 Health Prot Agency Infectivity assay
BRPI0709693A2 (pt) 2006-03-31 2011-07-19 Genencor Int aparelhos de filtração de fluxo tangencial, sistemas, e processos para a separação de compostos
DE102007029643A1 (de) 2006-09-08 2009-01-15 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungsmittel
KR101570546B1 (ko) 2007-09-12 2015-11-19 다니스코 유에스 인크. 내부 오염 제어에 의한 여과
EP2240579B1 (en) 2008-02-14 2017-05-03 Danisco US Inc. Small enzyme-containing granules
US8293697B2 (en) 2009-03-18 2012-10-23 The Procter & Gamble Company Structured fluid detergent compositions comprising dibenzylidene sorbitol acetal derivatives
US8153574B2 (en) 2009-03-18 2012-04-10 The Procter & Gamble Company Structured fluid detergent compositions comprising dibenzylidene polyol acetal derivatives and detersive enzymes
EP2435547A1 (en) 2009-05-26 2012-04-04 The Procter & Gamble Company Aqueous liquid composition for pre-treating soiled dishware
US20110009307A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Alan Thomas Brooker Laundry Detergent Composition Comprising Low Level of Sulphate
WO2011005623A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition comprising low level of bleach
JP5645937B2 (ja) 2009-07-31 2014-12-24 アクゾ ノーベル ナムローゼ フェンノートシャップＡｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ Ｎ．Ｖ． パーソナルケア用途のためのハイブリッドコポリマー組成物
DE102010063457A1 (de) * 2010-12-17 2012-06-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase
US8841246B2 (en) 2011-08-05 2014-09-23 Ecolab Usa Inc. Cleaning composition containing a polysaccharide hybrid polymer composition and methods of improving drainage
US8853144B2 (en) 2011-08-05 2014-10-07 Ecolab Usa Inc. Cleaning composition containing a polysaccharide graft polymer composition and methods of improving drainage
US8636918B2 (en) 2011-08-05 2014-01-28 Ecolab Usa Inc. Cleaning composition containing a polysaccharide hybrid polymer composition and methods of controlling hard water scale
US8679366B2 (en) 2011-08-05 2014-03-25 Ecolab Usa Inc. Cleaning composition containing a polysaccharide graft polymer composition and methods of controlling hard water scale
SG11201401383WA (en) 2011-11-04 2014-08-28 Akzo Nobel Chemicals Int Bv Graft dendrite copolymers, and methods for producing the same
CN103945828A (zh) 2011-11-04 2014-07-23 阿克佐诺贝尔化学国际公司 混杂树枝状共聚物、其组合物及其制备方法
US10087401B2 (en) 2012-03-16 2018-10-02 Monosol, Llc Water soluble compositions incorporating enzymes, and method of making same
US9394092B2 (en) 2012-04-16 2016-07-19 Monosol, Llc Powdered pouch and method of making same
US8945314B2 (en) 2012-07-30 2015-02-03 Ecolab Usa Inc. Biodegradable stability binding agent for a solid detergent
EP2904085B1 (en) 2012-10-04 2018-11-07 Ecolab USA Inc. Pre-soak technology for laundry and other hard surface cleaning
US9365805B2 (en) 2014-05-15 2016-06-14 Ecolab Usa Inc. Bio-based pot and pan pre-soak
WO2016001450A2 (en) 2014-07-04 2016-01-07 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
CN106661566A (zh) 2014-07-04 2017-05-10 诺维信公司 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸
AU2014401966B2 (en) 2014-08-01 2019-11-07 Ecolab Usa Inc. A method of manual surface cleaning using cleaning textiles and of washing said cleaning textiles
EP3075832B1 (en) 2015-03-30 2021-04-14 Dalli-Werke GmbH & Co. KG Manganese-amino acid compounds in cleaning compositions
EP3205393A1 (en) 2016-02-12 2017-08-16 Basf Se Process for preparation of microcapsules
EP3205392A1 (en) 2016-02-12 2017-08-16 Basf Se Microcapsules and process for preparation of microcapsules
WO2017182295A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Basf Se Liquid cleaning compositions
CN109312323B (zh) * 2016-06-09 2022-03-08 花王株式会社 突变碱性蛋白酶
JP2019524960A (ja) 2016-08-08 2019-09-05 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 液体洗濯製剤
US10577571B2 (en) 2016-11-08 2020-03-03 Ecolab Usa Inc. Non-aqueous cleaner for vegetable oil soils
CN110023475A (zh) 2016-12-01 2019-07-16 巴斯夫欧洲公司 酶在组合物中的稳定化
CA3083390A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Storage-stable enzyme preparations, their production and use
CN107937372B (zh) * 2017-12-19 2020-03-24 江南大学 一种耐酸性提高的纳豆激酶
WO2019238761A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Basf Se Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes
WO2020030623A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Basf Se Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent
EP3861116A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
US20220112479A1 (en) 2018-10-05 2022-04-14 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
CN112840021A (zh) 2018-10-05 2021-05-25 巴斯夫欧洲公司 在液体中稳定水解酶的化合物
EP3677676A1 (en) 2019-01-03 2020-07-08 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
WO2020104231A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Basf Se Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme
US11492572B2 (en) 2019-12-06 2022-11-08 Alene Candles LLC Effervescing compositions and tablets for treating toilets
WO2020229480A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
US11873465B2 (en) 2019-08-14 2024-01-16 Ecolab Usa Inc. Methods of cleaning and soil release of highly oil absorbing substrates employing optimized extended chain nonionic surfactants
BR112022006082A2 (pt) 2019-10-18 2022-06-21 Basf Se Preparação enzimática, formulação de detergente, e, uso de pelo menos um diol
WO2021115912A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Basf Se Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes
JP2023513377A (ja) 2020-02-14 2023-03-30 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア マンナナーゼバリアント
JP2023533311A (ja) 2020-07-06 2023-08-02 エコラボ ユーエスエー インコーポレイティド アルキルシロキサン及びヒドロトロープ／可溶化剤の組み合わせを含む起泡性混合アルコール／水組成物
EP4175471A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Ecolab USA Inc. Foaming mixed alcohol/water compositions comprising a structured alkoxylated siloxane
EP4176031A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Ecolab USA Inc. Peg-modified castor oil based compositions for microemulsifying and removing multiple oily soils
WO2022008732A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Basf Se Enhancing the activity of antimicrobial preservatives
WO2022243367A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Nouryon Chemicals International B.V. Polyester polyquats in cleaning applications
WO2022243533A1 (en) 2021-05-20 2022-11-24 Nouryon Chemicals International B.V. Manufactured polymers having altered oligosaccharide or polysaccharide functionality or narrowed oligosaccharide distribution, processes for preparing them, compositions containing them, and methods of using them
WO2023275269A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Nouryon Chemicals International B.V. Chelate-amphoteric surfactant liquid concentrates and use thereof in cleaning applications
WO2023057367A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Unilever Ip Holdings B.V. Laundry composition
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2024020445A1 (en) 2022-07-20 2024-01-25 Ecolab Usa Inc. Novel nonionic extended surfactants, compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4261868A (en) 1979-08-08 1981-04-14 Lever Brothers Company Stabilized enzymatic liquid detergent composition containing a polyalkanolamine and a boron compound
US4404128A (en) 1981-05-29 1983-09-13 The Procter & Gamble Company Enzyme detergent composition
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
IE81141B1 (en) 1983-06-24 2000-04-05 Genencor Int Procaryotic carbonyl hydrolases
US4990452A (en) 1986-02-12 1991-02-05 Genex Corporation Combining mutations for stabilization of subtilisin
US5013657A (en) 1988-04-12 1991-05-07 Bryan Philip N Subtilisin mutations
IE65767B1 (en) 1986-04-30 1995-11-15 Genencor Int Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors
ES2135386T3 (es) 1987-02-27 1999-11-01 Genencor Int Transformacion de cepas de bacillus alcalofilas.
US4914031A (en) * 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
AU3063389A (en) 1988-01-08 1989-08-01 Dpz Deutsches Primatenzentrum Gesellschaft M.B.H. Hiv-2-type retroviruses of primates, vaccines, diagnostic and pharmaceutical compositions
PT89702B (pt) † 1988-02-11 1994-04-29 Gist Brocades Nv Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem

Also Published As

Publication number Publication date
AR244339A1 (es) 1993-10-29
MA22573A1 (fr) 1993-04-01
DK0451244T3 (da) 1999-08-23
KR970004938B1 (ko) 1997-04-10
NO912567L (no) 1991-06-28
ES2242963T3 (es) 2005-11-16
TR25991A (tr) 1993-11-01
EP0451244B1 (en) 1998-12-23
PT95741A (pt) 1991-09-13
EP0451244B9 (en) 2005-01-26
IE903905A1 (en) 1991-05-08
WO1991006637A1 (en) 1991-05-16
DK0775749T3 (da) 2005-09-12
DE69034195T3 (de) 2009-10-22
NO301081B1 (no) 1997-09-08
DE69032852T2 (de) 1999-05-20
NZ235883A (en) 1992-09-25
AU6634190A (en) 1991-05-31
DK0775749T4 (da) 2009-07-20
EP0775749B1 (en) 2005-06-15
EP0451244A1 (en) 1991-10-16
BR9006993A (pt) 1991-11-26
FI913166A0 (fi) 1991-06-28
DE69032852D1 (de) 1999-02-04
ES2242963T5 (es) 2009-08-27
DE69034195T2 (de) 2006-03-23
FI103052B1 (fi) 1999-04-15
ATE174961T1 (de) 1999-01-15
CN1052897A (zh) 1991-07-10
IE62771B1 (en) 1995-02-22
EP0775749B2 (en) 2009-04-01
CA2044630A1 (en) 1991-05-01
EP0451244A4 (en) 1992-06-03
EP0775749A1 (en) 1997-05-28
NO912567D0 (no) 1991-06-28
JP3335623B2 (ja) 2002-10-21
ES2125224T3 (es) 1999-03-01
CA2044630C (en) 2000-05-30
DE69034195D1 (de) 2005-07-21
US5185258A (en) 1993-02-09
ATE297997T1 (de) 2005-07-15
JPH04505263A (ja) 1992-09-17
AU633376B2 (en) 1993-01-28
PT95741B (pt) 1997-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI103052B (fi) Subtilisiinimutantti ja tätä sisältävä entsymaattinen puhdistusainekoo stumus
US5204015A (en) Subtilisin mutants
RU2136756C1 (ru) Модифицированный субтилизин, днк, кодирующая модифицированный субтилизин, вектор экспрессии, кодирующий днк, и штамм культуры клетки хозяина
EP1624050B1 (en) Multiply-substituted protease variants
EP1523553B1 (en) Multiply-substituted protease variants
EP2287321B1 (en) Multiply-substituted protease variants
KR20020040665A (ko) 위치 97 및 98 사이에 적어도 하나의 추가의 아미노산잔기를 가지는 ｉ-ｓ1 및 ｉ-ｓ2 아군의 서브틸라제 효소
EP1183335A1 (en) Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 130 and 131
EP1183342A1 (en) Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 128 and 129
EP1183339A1 (en) Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 129 and 130
EP1183336A1 (en) Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 131 and 132
MXPA00003801A (en) Multiply-substituted protease variants