KR20200088433A - 보관 안정한 효소 제제, 이것의 제조 및 용도 - Google Patents

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슈테판 휘퍼
마르코스 알레한드라 가르시아
올리버 슈판겐베르크
마티아스 켈러마이어
주잔네 볼베르츠
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바스프 에스이
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Abstract

성분 (a): 다음의 일반식 (I)에 따른 적어도 하나의 염:
(R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
상기 식에서,
n은 1 내지 12로부터 선택되고,
m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬 및 페닐로부터 선택되고,
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
X는 C2-C4-알킬렌이고,
A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다;
성분 (b): 가수분해효소 (EC 3)로부터 선택된 적어도 하나의 효소; 및
선택적으로 성분 (c): 성분 (a)와 상이한 효소 안정제, 보존제, 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유하는 액체 효소 제제.

Description

보관 안정한 효소 제제, 이것의 제조 및 용도
본 발명은
성분 (a): 다음의 일반식 (I)에 따른 적어도 하나의 염:
(R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
상기 식에서,
n은 1 내지 12로부터 선택되고,
m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬, 페닐로부터 선택되고,
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
X는 C2-C4-알킬렌이고,
A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다;
성분 (b): 가수분해효소 (EC 3)로부터 선택된 적어도 하나의 효소; 및
선택적으로 성분 (c): 성분 (a)와 상이한 효소 안정제 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유하는 효소 제제에 관한 것이다.
효소는 보통, 빈번하게는 발효액으로부터 유래한 액체 농축물로 상업적으로 생산된다. 효소는 이것이 수성 환경에 머무르면 불안정해지는 경향이 있어서, 이것을 무수 형태로 전환시키는 것이 통상적으로 실시되고 있다: 수성 농축물은 예를 들어, 캐리어 물질의 존재 하에 동결건조되거나 분무-건조되어 집합체(aggregate)를 형성할 수 있다. 보통, 고체 효소 생성물은 사용 전에 "용해"시킬 필요가 있다. 액체 생성물 내 효소를 안정시키기 위해, 효소 억제제, 바람직하게는 가역적인 효소 억제제가 사용되어, 효소 억제제가 방출될 때까지 일시적으로 효소 활성도를 억제하는 것으로 공지되어 있다.
붕산 및 보론산이 단백질분해 효소를 가역적으로 억제하는 것으로 공지되어 있다. 보론산에 의한 하나의 세린 프로테아제, 서브틸리신의 억제에 대한 논의는 문헌 [Molecular & Cellular Biochemistry 51, 1983, pp. 5-32]에 제시되어 있다. 재활성화를 위해, 이 억제제는 적용 전에 또는 적용 동안 제거될 필요가 있으며, 이러한 제거는 예를 들어, 희석에 의해 수행될 수 있다.
더욱이, 지방분해 효소의 안정성은 안정화 물질, 예컨대 보론산 유도체를 첨가하여 지방분해 효소의 활성 자리와 가역적으로 착물을 형성함으로써 개선되는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, EP0478050).
환경적인 고려 때문에, 효소 안정화를 위해 사용된 붕소 함유 화합물의 양을 적어도 감소시키는 것이 요구되고 있다. 효소의 존재하에 효소 안정제로 사용될 대안이 추구되고 있다.
본 발명에 대하여 해결되어야 하는 문제는 대안적인 효소 안정제를 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 추가 목적은 많거나 적은 물 함량을 갖는 제형으로 유연성있게 제형화될 수 있게 하는 효소 제제를 제공하는 것이었는데, 이 둘 모두는 내부에 함유된 효소(들)에 대하여 탁월한 보관 수명을 갖는다.
상기 문제는 효소 안정제로 다음의 일반식 (I)에 따른 적어도 하나의 염을 사용함에 의해서 해결되었다:
(R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
상기 식에서,
n은 1 내지 12로부터 선택되고,
m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬, 페닐로부터 선택되고,
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
X는 C2-C4-알킬렌이고,
A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다.
본 발명의 효소 안정제는 가수분해효소 (EC 3)의 군으로부터 선택된 효소를 바람직하게 안정시킨다. 효소 명은 국제 생화학 및 분자 생물학 연합 명명 위원회(IUBMB)의 권고를 기반으로 당해 분야에서의 숙련가에게 공지되어 있다. 효소 명은 다음의 것들을 포함한다: EC (효소 위원회) 번호, 권고 명, (만약 있다면) 대체 명, 촉매 활성도, 및 다른 인자; http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/ (2017년 3월 12일자로 마지막으로 업데이트됨) 참고.
한 구현예에서, 적어도 하나의 가수분해효소는 에스테르 결합에 작용하는 효소 (EC 3.1), 글리코실라제 (EC 3.2), 및 펩티다아제 (EC 3.4)의 군으로부터 선택된다.
본 발명은
성분 (a): 다음의 일반식 (I)에 따른 적어도 하나의 염:
(R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
상기 식에서,
n은 1 내지 12로부터 선택되고,
m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬, 페닐로부터 선택되고,
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
X는 C2-C4-알킬렌이고,
A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다;
성분 (b): 바람직하게는 가수분해효소 (EC 3)로부터 선택된 적어도 하나의 효소; 및
선택적으로 성분 (c): 성분 (a)와 상이한 효소 안정제 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유하는 액체 효소 제제를 제공한다.
본 발명의 효소 제제는 20℃ 및 101.3 kPa에서 액체일 수 있다. 한 구현예에서, 액체는, 효소 제제가 심지어 20일의 보관 후에도 미량의 침전물 형성 또는 탁도를 보이지 않음을 의미한다.
성분 (a)
염 (성분 (a))은 콜린의 또는 콜린 유도체의 유기 에스테르의 염이다. 염 (성분 (a))의 음이온 -반대이온-은 무기 또는 유기일 수 있으며, 유기가 바람직하다. 염 (성분 (a))의 무기 반대이온의 예는 니트레이트, 하이드록사이드, 설페이트, 포스페이트, 하이드로젠포스페이트, 디하이드로젠포스페이트, 카보네이트, 비카보네이트, 및 할라이드, 예를 들어 브로마이드 또는 클로라이드이다. 할라이드, 특히 클로라이드, 및 설페이트, 카보네이트 및 비카보네이트가 바람직하다. 유기 반대이온의 예는 락테이트, 아세테이트, 타르트레이트, 시트레이트, 및 CH3SO3 - (메탄설포네이트)이다. 2가 또는 3가 반대이온을 갖는 구현예에서, 각각의 몰 양의 양이온이 존재한다.
염 (성분 (a)) 내 질소 원자는 3개의 메틸 기 및 하이드록시에틸 기를 함유한다. 본 발명의 맥락에서 사용된 용어 콜린의 유도체는 메틸 기 이외의 적어도 하나의 알킬 기, 또는 2-하이드록시에틸 기 이외의 하이드록시알킬 기, 또는 추가의 알콕시 기를 함유하는 화합물을 지칭한다.
더욱 구체적으로, 성분 (a)는 다음의 일반식 (I)의 화합물이다:
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
상기 식에서,
n은 1 내지 12, 예를 들어 1 내지 9, 바람직하게는 1, 2, 3, 또는 4로부터 선택되고, 훨씬 더 바람직하게는 n은 1이고;
m은 0 내지 50, 예를 들어 2 내지 50으로부터 선택되고, 10 내지 25가 바람직하다. 그러나, 가장 바람직하게는, m은 0이고;
R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬, 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있다. R1의 바람직한 예는 치환되지 않은 C1-C6-알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, n-헥실, 및 치환된 C1-C10-알킬, 예컨대 -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH3, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C6H5, 파라-HO-C6H4-, o,p-디하이드록시페닐 및 3,4,5-트리하이드록시페닐이고, 바람직한 비치환된 C1-C10-알킬은 메틸 및 에틸이다. 바람직한 구현예에서, O-C(O)-R1은 함께 시트레이트를 구성한다. R1이 메틸이고; R2가 동일하거나 상이하며 페닐 및 C1-C10-알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소-펜틸, sec-펜틸, 네오-펜틸, 1,2-디메틸프로필, 이소-아밀, n-헥실, 이소-헥실, sec-헥실, n-헵틸, n-옥틸, 2-에틸헥실, n-노닐, n-데실, 2-n-프로필-헵틸, 또는 이소-데실로부터 선택되고, 선형 C1-C10-알킬이 바람직하며, 선형 C1-C4-알킬이 더욱 바람직하고, 적어도 2개의 R2 기가 CH3이고 세 번째 R2가 선형 C1-C10-알킬로부터 선택되는 경우가 훨씬 더 바람직하고, 모든 R2가 동일하고 메틸인 경우가 가장 바람직하며;
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 및 n-부틸이 바람직하고, R3 및 R4 둘 모두가 수소인 경우가 훨씬 더 바람직하다. 또 다른 구현예에서, R3은 C1-C4-알킬이고 R4는 수소이고, 바람직하게는 R3은 메틸이고 R4는 수소이고;
X는 C2-C4-알킬렌, 예를 들어 -CH2-CH2-, -CH(CH3)-CH2-, -(CH2)3-, CH2-CH(CH3)-, 또는 -(CH2)4-이고;
A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다. 염 (성분 (a))의 무기 반대이온의 예는 설페이트, 포스페이트, 하이드로젠포스페이트, 디하이드로젠포스페이트, 카보네이트, 비카보네이트, 및 할라이드, 예를 들어 브로마이드 또는 클로라이드이다. 할라이드, 특히 클로라이드, 및 설페이트, 카보네이트 및 비카보네이트가 바람직하다. 유기 반대이온의 예는 락테이트, 아세테이트, 타르트레이트, 시트레이트, CH3SO3 - (메탄설포네이트)이다.
성분 (a)는 계면활성제가 아니다. 한 구현예에서, 1000 g 물 중 5 g 성분 (a)의 용액은 20℃ 및 101.3 kPa에서 > 45 mN/m의 동적 표면 장력을 갖는다. 1000 g 물 중 5 g 성분 (a)의 용액은 20℃ 및 101.3 kPa에서 ≥ 50 mN/m의 동적 표면 장력을 가질 수 있다.
동적 표면 장력은 거품 압력 장력측정기(bubble pressure tensiometer)를 사용하여 측정할 수 있으며, 이 장력측정기에서 모세관에 의해 액체 중에서 형성되는 기체 거품의 최대 내부 압력이 측정되고; 측정된 값은 보통 특정 표면 나이, 거품 형성 시작에서부터 최대 압력이 나타날 때까지의 시간에 상응한다. 한 구현예에서, 거품 압력 장력측정기를 사용하여 20℃ 및 101.3 kPa에서 동적 표면 장력을 측정하는 동안의 표면 나이는 50 ms이다.
염 (성분 (a))의 가장 바람직한 예는 반대이온으로 타르트레이트 또는 시트레이트를 갖는 콜린 에스테르의 염, 및 아세틸 콜린, 콜린 시트레이트, 및 콜린 타르트레이트, 예를 들어, 락테이트, 아세트산염, 타르트레이트, 시트레이트의 염이다.
반대음이온 A-가 2가, 예컨대 설페이트, 타르트레이트, 카보네이트, 또는 다가, 예컨대 포스페이트 또는 시트레이트인 -또는 일 수 있는- 구현예에서, 필수적인 양 전하는 또 다른 염 (성분 (a)) 유래한 양이온에 의해, 또는 알칼리 금속 양이온, 예컨대 칼륨 또는 바람직하게는 나트륨에 의해, 또는 C1-C4-알킬 및/또는 2-하이드록시에틸로 치환되거나 치환되지 않은 암모늄에 의해 제공될 수 있다.
R1이 하나 이상의 카복실 기를 함유하는 구현예에서, 상기 카복실 기는 유리 COOH 기일 수 있거나 알칼리, 예를 들어 칼륨 또는 특히 나트륨으로 부분적으로 또는 전체적으로 중화될 수 있거나, 상기 카복실 기는 예를 들어, (R2)3N+-(CH2)n-(O-X)m-OH로 에스테르화될 수 있다. 그와 같은 구현예는, 적용된다면 각각의 디- 또는 트리카복실산의 디- 또는 트리에스테르가 얻어지게 한다. 예를 들어, 타르타르산 또는 시트르산의 모노- 및 디에스테르의 혼합물, 및 시트르산의 디- 및 트리에스테르의 혼합물이 또한 적합하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 염 (성분 (a))은 다음의 식 (II)에 따른 화합물이다:
(CH3)3N+-(CH2)2-O-C(O)-R5 (A1)- (II)
상기 식에서, (A1)-은 메탄설포네이트, 타르트레이트 및 시트레이트로부터 선택되고,
R5는 -CH2-C(OH)(COOX2)-CH2-COOX2 및 -CH(OH)-CH(OH)-COOX1로부터 선택되고,
X1은 수소, 알칼리 금속 - 특히 나트륨 - 및 (CH3)3N+-(CH2)2-로부터 선택되고,
X2는 동일하거나 상이하며 수소, 알칼리 금속 - 특히 나트륨 - 및 (CH3)3N+-(CH2)2-로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, O-C(O)-R5 및 (A1)-의 에스테르 기는 서로 상응한다.
본 발명의 한 구현예에서, 액체 효소 제제는 이 효소 제제의 총 중량에 대하여 0.1 내지 30중량% 범위의 양으로 성분 (a)를 함유한다. 상기 효소 제제는 모두 이 효소 제제의 총 중량에 대하여 0.1 내지 15중량%, 0.25 내지 10중량%, 0.5 내지 10중량%, 0.5 내지 6중량%, 또는 1 내지 3중량% 범위의 양으로 성분 (a)를 함유할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 염 (성분 (a))은 다음과 같은 화합물 (a')를 불순물로 함유한다:
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-OH R1-COO-
상기 식에서, 변수 R1, R2, X, n 및 m은 상응하는 염 (성분 (a))에서와 동일하다. 상기 불순물은 염 (성분 (a))의 최대 50몰%, 바람직하게는 0.1 내지 20몰%, 훨씬 더 바람직하게는 1 내지 10몰%에 이를 수 있다. 불순물 화합물 (a')가 염 (성분 (a))의 합성으로부터 유래할 수 있고 정제 방법으로 제거될 수 있다 하더라도, 이것을 제거하는 것은 바람직하지 않다.
성분 (b)
본 발명의 한 측면에서, 성분 (b)에 포함된 적어도 하나의 효소는 액체 효소 농축물의 일부이다. 본 명세서의 "액체 효소 농축물"은 적어도 하나의 효소를 포함하는 임의의 액체 효소-포함 생성물을 의미한다. 효소 농축물의 맥락에서 "액체"는 20℃ 및 101.3 kPa에서의 물리적 외관에 관한 것이다.
액체 효소 농축물은 용매 중의 고체 효소의 용해로부터 생성될 수 있다. 용매는 물 및 유기 용매로부터 선택될 수 있다. 용매 중의 고체 효소의 용해로부터 생성되는 액체 효소 농축물은 포화 농도까지의 효소의 양을 포함할 수 있다.
본 명세서에서의 용해는, 고체 화합물이 적어도 하나의 용매와의 접촉에 의해 액화됨을 의미한다. 용해는 특정된 용매 중에서 포화 농도가 성취될 때까지의 고체 화합물의 완전한 용해를 의미하며, 이 때 상 분리는 일어나지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 수득되는 효소 농축물의 성분 (b)는 물을 함유하지 않을 수 있으며, 이는 상당량의 물이 존재하지 않음을 의미한다. 본 명세서에서 상당량이지 않은 물은, 효소 제제가 모두 이 효소 농축물의 총 중량에 대하여 25중량% 미만, 20중량% 미만, 15중량% 미만, 10중량% 미만, 7중량% 미만, 5중량% 미만, 4중량% 미만, 3중량% 미만, 2중량% 미만의 물을 포함하거나 물을 전혀 포함하지 않음을 의미한다.
한 구현예에서, 본 발명의 효소 제제는 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올, sec-부탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판 디올, 부탄 디올, 글리세롤, 디글리콜, 프로필 디글리콜, 부틸 디글리콜, 헥실렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 메틸 에테르, 에틸렌 글리콜 에틸 에테르, 에틸렌 글리콜 프로필 에테르, 및 페녹시에탄올로부터 선택된 적어도 하나의 유기 용매를 포함하며, 에탄올, 이소프로판올 또는 프로필렌 글리콜이 바람직하다. 또한, 본 발명의 효소 제제는 화합물, 예컨대 2-부톡시에탄올, 이소프로필 알콜, 및 d-리모넨으로부터 선택된 적어도 하나의 유기 용매를 포함할 수 있다.
물을 포함하는 액체 효소 농축물은 "수성 효소 농축물"로 불릴 수 있다. 수성 효소 농축물은 효소-포함 용액일 수 있으며, 여기서 고체 효소 생성물이 물에 용해되었다. 한 구현예에서 "수성 효소 농축물"은 발효에 의해 효소 생성으로부터 수득되는 효소-포함 생성물을 의미한다.
발효는, 재조합 숙주 세포를 성장시킬 수 있는 적합한 영양 배지에서 원하는 효소를 발현시키고 (이 과정을 발효라 부를 수 있음) 원하는 단백질을 발현시키는, 재조합 세포를 배양하는 과정을 의미한다. 발효의 마지막에, 발효액이 보통 수집되고 추가로 가공되며, 여기서 발효액은 액체 분획 및 고체 분획을 포함한다. 효소가 액체 분획 내로 분비되었는지에 따라, 원하는 단백질 또는 효소가 발효액의 액체 분획으로부터 또는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 원하는 효소의 회수에는 당해 분야에서의 숙련가에게 공지된 방법이 사용된다. 발효액으로부터 단백질 또는 효소를 회수하기에 적합한 방법은 수집, 원심분리, 여과, 추출, 및 침전을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다.
액체 효소 농축물은 모두 이 효소 농축물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 40중량%, 또는 0.5 내지 30중량%, 또는 1 내지 25중량%, 또는 3 내지 25중량%, 또는 5 내지 25중량% 범위의 효소 양을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 액체 효소 농축물은 발효로부터 수득되며 수성이다.
발효로부터 수득되는 수성 효소 농축물은 모두 이 효소 농축물의 총 중량에 대하여 약 50중량% 초과, 약 60중량% 초과, 약 70중량% 초과, 또는 약 80중량% 초과의 양으로 물을 포함할 수 있다. 발효로부터 수득되는 수성 효소 농축물은 잔여 성분, 예컨대 발효 배지로부터 비롯되는 염, 생산 숙주 세포로부터 비롯되는 세포 파편, 발효 동안 생산 숙주 세포에 의해 생산된 대사산물을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 잔여 성분은 모두 수성 효소 농축물의 총 중량에 대하여 30중량% 미만, 20중량% 미만, 10중량% 미만, 또는 5중량% 미만의 양으로 액체 효소 농축물에 포함될 수 있다.
성분 (b)에 포함된 적어도 하나의 효소는 가수분해효소 (EC 3) (이하에서 효소 (성분 (b)로 또한 지칭됨)로부터 선택된다. 바람직한 효소 (성분 (b))는 에스테르 결합에 작용하는 효소 (E.C. 3.1), 글리코실라제 (E.C. 3.2), 및 펩티다아제 (E.C. 3.4)의 군으로부터 선택된다. 에스테르 결합에 작용하는 효소 (E.C. 3.1)는 이하에서 또한 각각 리파아제 (성분 (b))로 지칭된다. 글리코실라제 (E.C. 3.2)는 이하에서 또한 아밀라아제 (성분 (b)) 및 셀룰라아제 (성분 (b))로 지칭된다. 펩티다아제는 이하에서 또한 프로테아제 (성분 (b))로 지칭된다.
본 발명의 맥락에서 가수분해효소 (성분 (b))는 폴리펩타이드 서열 (본 명세서에서는 또한 아미노산 서열로 불림)에 의해 식별된다. 폴리펩타이드 서열은 동일한 촉매 활성도를 차례로 결정하는 효소의 "활성 자리"를 포함한 3차원 구조를 특정한다. 폴리펩타이드 서열은 SEQ ID NO.에 의해 식별될 수 있다. 세계 지적 재산국(WIPO) 표준 ST.25 (1998)에 따르면, 본 명세서에서의 아미노산은 첫 글자가 대문자이거나 상응하는 하나의 글자를 갖는 3개의 글자 코드를 사용하여 표시된다.
본 발명에 따른 효소 (성분 (b))는, 둘 모두 효소 활성도를 갖는 모 효소 및/또는 변이체 효소에 관한 것이다. 효소 활성도를 갖는 효소는 효소적으로 활성이거나 효소 전환을 나타내며, 이는 효소가 기질에 작용하여 기질을 생성물로 전환시킴을 의미한다. 본 명세서에서의 용어 "효소"는 효소의 불활성 변이체는 제외한다.
("모 효소"로 또한 불려진 모 단백질 또는 효소의) "모" 서열은, 서열에 (예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실, 또는 이들의 조합을 도입시킴으로써) 변화를 도입시켜서, 모 서열의 "변이체"를 생성시키기 위한 출발 서열이다. 용어 모 효소 (또는 모 서열)는 (추가) 변화를 도입시키기 위한 출발 서열로 사용되는 야생형 효소 (서열) 및 합성에 의해 생성된 서열 (효소)을 포함한다.
용어 "효소 변이체" 또는 "서열 변이체" 또는 "변이체 효소"는 아미노산 서열 내 모 효소와 특정 정도로 상이한 효소를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, "효소 활성도를 갖는" 변이체 효소는, 이 변이체 효소가 각각의 모 효소와 동일한 유형의 효소 활성도를 가짐을 의미한다.
본 발명의 변이체를 설명함에 있어, 다음과 같이 설명된 명명법이 사용된다:
아미노산 치환은 모 효소의 원 아미노산에 이어 아미노산 서열 내 그 위치의 숫자에 이어 치환된 아미노산을 제공함에 의해 설명된다.
아미노산 결실은 모 효소의 원 아미노산에 이어 아미노산 서열 내 그 위치의 숫자에 이어 *를 제공함에 의해 설명된다.
아미노산 삽입은 모 효소의 원 아미노산에 이어 아미노산 서열 내 그 위치의 숫자에 이어 원 아미노산 및 추가 아미노산을 제공함에 의해 설명된다. 예를 들어, 글리신에 이웃한 리신의 위치 180에서의 삽입은 "Gly180GlyLys" 또는 "G180GK"로 명명된다.
치환 및 삽입이 동일한 위치에서 일어나는 경우에, 이것은 S99SD+S99A 또는 간단히 S99AD로 표시될 수 있다. 현존하는 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기가 삽입되는 경우에, 명명법에서 변화(degeneracy)가 나타남이 명백하다. 예를 들어, 위 예에서 글리신 다음에 글리신이 삽입되면 이것은 G180GG로 표시될 것이다.
상이한 변경(alteration)이 어떤 위치에 도입될 수 있는 경우에, 상이한 변경은 쉼표에 의해 분리되는데, 예를 들어, "Arg170Tyr, Glu"는 위치 170에서의 아르기닌이 티로신 또는 글루탐산으로 치환됨을 나타낸다. 대안적으로, 상이한 변경 또는 선택적 치환은 괄호로, 예를 들어, Arg170[Tyr, Gly] 또는 Arg170{Tyr, Gly}; 또는 간단히 R170 [Y,G] 또는 R170 {Y, G}; 또는 길게는 R170Y, R170G로 표시될 수 있다.
효소 변이체는 모 효소와 비교한 이들의 서열 상동성에 의해 규정될 수 있다. 서열 상동성은 보통 "% 서열 상동성" 또는 "% 상동성"으로 제공된다. 서열 상동성의 계산을 위해서는, 제1 단계에서 서열 정렬이 생성되어야 한다. 본 발명에 따르면, 쌍 전역 정렬(pairwise global alignment)이 생성되어야 하는데, 이는 2개의 서열이 이들의 전장에 걸쳐 정렬되어야 하며 이러한 전장 정렬은 정렬 알고리즘이라 불리는 수학적 접근법을 사용함에 의해 보통 생성된다.
본 발명에 따르면, 정렬은 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453)을 사용함에 의해 생성된다. 바람직하게는, 프로그램 디폴트 파라미터 (갭 개방=10.0, 갭 연장=0.5 및 매트릭스=EBLOSUM62)를 사용하는 프로그램 "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS))이 본 발명의 목적을 위해 사용된다.
본 발명에 따르면, 다음의 %-상동성의 계산을 적용한다: %-상동성 = (동일한 잔기/전장에 걸친 본 발명의 각각의 서열을 보여주는 정렬 구역의 길이) *100.
본 발명에 따르면, 효소 변이체는 각각의 모 효소의 아미노산 서열과 적어도 n% 동일한 아미노산 서열로 설명될 수 있으며, 이때 "n"은 10 내지 100의 정수이다. 한 구현예에서, 변이체 효소는 모 효소의 전장 아미노산 서열과 비교하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하며, 여기서 효소 변이체는 효소 활성도를 갖는다.
효소 변이체는 모 효소와 비교한 이들의 서열 유사성에 의해 규정될 수 있다. 서열 유사성은 보통 "% 서열 유사성" 또는 "%-유사성"으로 제공된다. % 서열 유사성은 규정된 세트의 아미노산이 예를 들어, 이들의 크기에 의해, 이들의 소수성에 의해, 이들의 전하에 의해, 또는 다른 특징에 의해 유사한 특성을 공유함을 고려한다. 본 명세서에서, 하나의 아미노산과 유사한 아미노산의 교환은 "보존적 돌연변이"로 불릴 수 있다.
본 발명에 따른 %-유사성을 측정하기 위해서는, 다음을 적용한다: 아미노산 A는 아미노산 S와 유사하다; 아미노산 D는 아미노산 E 및 N과 유사하다; 아미노산 E는 아미노산 D 및 K 및 Q와 유사하다; 아미노산 F는 아미노산 W 및 Y와 유사하다; 아미노산 H는 아미노산 N 및 Y와 유사하다; 아미노산 I는 아미노산 L 및 M 및 V와 유사하다; 아미노산 K는 아미노산 E 및 Q 및 R과 유사하다; 아미노산 L은 아미노산 I 및 M 및 V와 유사하다; 아미노산 M은 아미노산 I 및 L 및 V와 유사하다; 아미노산 N은 아미노산 D 및 H 및 S와 유사하다; 아미노산 Q는 아미노산 E 및 K 및 R과 유사하다; 아미노산 R은 아미노산 K 및 Q와 유사하다; 아미노산 S는 아미노산 A 및 N 및 T와 유사하다; 아미노산 T는 아미노산 S와 유사하다; 아미노산 V는 아미노산 I 및 L 및 M과 유사하다; 아미노산 W는 아미노산 F 및 Y와 유사하다; 아미노산 Y는 아미노산 F 및 H 및 W와 유사하다.
보존적 아미노산 치환은 기능성 단백질, 예컨대 효소의 폴리펩타이드 서열의 전장 서열에 걸쳐 나타날 수 있다. 한 구현예에서, 그와 같은 돌연변이는 효소의 기능적 도메인에 관련되지는 않는다. 한 구현예에서, 보존적 돌연변이는 효소의 촉매 중심에 관련되지는 않는다.
보존적 돌연변이를 고려하기 위해, 2개의 아미노산 서열의 서열 유사성 값은 %-상동성을 계산하는데 사용되는 동일한 정렬로부터 계산될 수 있다.
본 발명에 따르면, %-유사성의 다음의 계산을 적용한다: %-유사성 = [ (동일한 잔기 + 유사한 잔기)/전장에 걸친 본 발명의 각각의 서열(들)을 보여주는 정렬 구역의 길이] *100.
본 발명에 따르면, 효소 변이체는 각각의 모 서열과 적어도 m% 유사한 아미노산 서열로 설명될 수 있는데, 이때 "m"은 10 내지 100의 정수이다. 한 구현예에서, 변이체 효소는 모 효소의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 유사하며, 여기서 변이체 효소는 효소 활성도를 갖는다.
"효소 활성도"는, 효소의 분자 당 분 당 변형된 기질의 분자 (분자 활성도)에 관련되는 효소 밀리그램 당 단위 (비 활성도)로 보통 표시되는, 효소에 의해 나타난 촉매 효과를 의미한다.
변이체 효소는, 상기 효소 변이체가 각각의 모 효소의 효소 활성도의 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%를 나타낼 때 본 발명에 따른 효소 활성도를 가질 수 있다.
성분 (b)에 포함된 적어도 하나의 효소는 가수분해효소 (EC 3)의 군으로부터 선택된다.
리파아제
한 구현예에서, 본 발명의 효소 제제는 적어도 하나의 리파아제 (EC 3.1.1; 성분 (b))를 포함한다. "리파아제", "지방분해 효소", "지질 에스테라제"는 모두 EC 부류 3.1.1 ("카복실산 에스테르 가수분해효소")의 효소를 지칭한다. 리파아제는 리파아제 활성도 (또는 지방분해 활성도; 트리아실글리세롤 리파아제, EC 3.1.1.3), 커티나제 활성도 (EC 3.1.1.74; 커티나제 활성도를 갖는 효소는 본 명세서에서 커티나제로 불릴 수 있음), 스테롤 에스테라제 활성도 (EC 3.1.1.13) 및/또는 왁스-에스테르 가수분해효소 활성도 (EC 3.1.1.50)를 갖는 활성 단백질을 의미한다.
지방분해 활성도를 측정하는 방법은 문헌에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gupta et al. (2003), Biotechnol. Appl. Biochem. 37, p. 63-71] 참고). 예를 들어, 리파아제 활성도는 기질 파라-니트로페닐 팔미테이트 (pNP-팔미테이트, C:16)에서 에스테르 결합 가수분해에 의해 측정될 수 있고, 황색이며 405 nm에서 검출될 수 있는 pNP를 방출한다.
"지방분해 활성도"는 리파아제에 의해 나타난 촉매 효과를 의미하며, 이것은 지방분해 단위(LU)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 1LU는 다음의 조건: 온도 30℃.; pH=9.0 하에 pH 고정장치(stat.)에서 분 당 적정가능한 1 μmol의 지방산을 생성하는 리파아제의 양에 상응할 수 있다; 기질은 5 mmol/l Tris-완충제 중 13 mmol/l Ca2+ 및 20 mmol/l NaCl의 존재 하에 3.3중량%의 올리브 오일과 3.3% 아라비아 고무의 에멀젼일 수 있다.
리파아제 (성분 (b))는 세균성 또는 진균성 기원의 것들을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 적합한 리파아제 (성분 (b))는 다음의 것들로부터 선택된다: 휴 미콜라(Humicola) (동의어 써모마이세스(Thermomyces))로부터의, 예를 들어, EP 258068, EP 305216, WO 92/05249 및 WO 2009/109500에 기재된 H. 라누기노 사(lanuginosa) (T. 라누기노서스)로부터의 또는 WO 96/13580에 기재된 H. 인솔렌 스(insolens)로부터의 리파아제; WO 92/05249에 기재된 리조뮤코르 미에헤 이(Rhizomucor miehei)로부터 유래한 리파아제; 슈도모나스( Pseudomonas) (이들 중 일부는 현재 버크홀데리아(Burkholderia)로 재명명됨)의 균주로부터의, 예를 들어, P. 알칼리게네스(alcaligenes) 또는 P. 슈도알칼리게네스(pseudoalcaligenes) (EP 218272, WO 94/25578, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 96/00292), P. 세파시 아(cepacia) (EP 331376), P. 스투체리(stutzeri) (GB 1372034), P. 플루오레센 스(fluorescens), 슈도모나스 속 균주 SD705 (WO 95/06720 및 WO 96/27002), P. 위 스콘시넨시스(wisconsinensis) (WO 96/12012), 슈도모나스 멘도시나(mendocina) (WO 95/14783), P. 글루매(glumae) (WO 95/35381, WO 96/00292)로부터의 리파아제; 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) (WO 2011/150157) 및 S. 프리스티내스피랄리스(pristinaespiralis) (WO 2012/137147)로부터의 리파아제, GDSL-유형의 스트렙토마이세스 리파아제 (WO 2010/065455); WO 2011/084412에 개시된 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca)로부터의 리파아제; 2011/084417에 개시된 지 오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)로부터의 리파아제; 예를 들어, WO 00/60063에 개시된 바실러스 리파아제, 문헌 [Dartois et al. (1992), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360] 또는 WO 2011/084599에 개시된 B. 서브틸리스(subtilis), B. 스테아로써모필러스 (JP S64-074992) 또는 B. 퍼밀러스(pumilus) (WO 91/16422)로부터의 리파아제; WO 94/01541에 개시된 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica)로부터의 리파아제; 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) (US 5389536, WO 88/09367)로부터의 커티나제; 매그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea) (WO 2010/107560)로부터의 커티나제; WO 90/09446, WO 00/34450 및 WO 01/92502에 개시된 푸사럼 솔라니 피시(Fusarum solani pisi)로부터의 커티나제; 및 WO 00/34450 및 WO 01/92502에 개시된 휴미콜라 라누기노사로부터의 커티나제.
적합한 리파아제 (성분 (b))는 또한 아실트랜스퍼라제 또는 과가수분해효소로 지칭된 것들, 예를 들어, 칸디다 안타르크티카 리파아제 A (WO 2010/111143)와 상동성을 갖는 아실트랜스퍼라제, 마이코박테리움 스메그매티스(Mycobacterium smegmatis) (WO 2005/056782)로부터의 아실트랜스퍼라제, CE7 패밀리 (WO 2009/67279)로부터의 과가수분해효소, 및 M. 스메그매티스 과가수분해효소의 변이체, 특히 S54V 변이 (WO 2010/100028)를 포함한다.
적합한 리파아제 (성분 (b))는 또한 지방분해 활성도를 갖는 상술된 리파아제의 변이체인 것들을 포함한다. 그와 같은 적합한 리파아제 변이체 (성분 (b))는 예를 들어, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/60063, WO 2007/087508, EP 407225 및 EP 260105에 개시된 방법에 의해 발육되는 것들이다.
적합한 리파아제 (성분 (b))는 위에 개시된 모 효소의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 지방분해 활성도를 갖는 리파아제 변이체를 포함한다.
적합한 리파아제 (성분 (b))는 모 효소의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 유사한 지방분해 활성도를 갖는 리파아제 변이체를 포함한다.
한 구현예에서, 리파아제 (성분 (b))는 진균성 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 부류 3.1.1.3)로부터 선택된다. 진균성 트리아실글리세롤 리파아제 (성분 (b))는 써모마이세스 라누기노사의 리파아제로부터 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 써 모마이세스 라누기노사 리파아제 (성분 (b))는 US 5869438의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269에 따른 트리아실글리세롤 리파아제, 및 지방분해 활성도를 갖는 이것의 변이체로부터 선택된다. US 5869438의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269에 따른 트리아실글리세롤 리파아제는 본 명세서에서 리폴라제로 불릴 수 있다.
써모마이세스 라누기노사 리파아제 (성분 (b))는 US 5869438의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 지방분해 활성도를 갖는 변이체로부터 선택될 수 있다.
써모마이세스 라누기노사 리파아제 (성분 (b))는 US 5869438의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269의 기능성 도메인에 알맞지 않은 유일한 보존적 돌연변이를 포함하는 지방분해 활성도를 갖는 변이체로부터 선택될 수 있다. 지방분해 활성도를 갖는 이 구현예의 리파아제 변이체는 US 5869438의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 유사할 수 있다.
써모마이세스 라누기노사 리파아제 (성분 (b))는 아미노산 T231R 및 N233R을 가짐에 의해 특성규명된 US 5869438의 SEQ ID NO:2와 적어도 80% 동일할 수 있다. 상기 써모마이세스 라누기노사 리파아제는 다음의 아미노산 교환 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: Q4V, V60S, A150G, L227G, P256K.
한 구현예에서, 적어도 하나의 리파아제는 상품명 Lipolase™, Lipex™, Lipolex™ 및 Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (원래는 Genencor로부터의) 및 Lipomax (Gist-Brocades/현재는 DSM)로 판매된 제품을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는 상업적으로 입수가능한 리파아제로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 성분 (b)는 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3)의 군으로부터 선택된 적어도 2개의 리파아제의 조합체를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 US 5869438의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269에 따른 트리아실글리세롤 리파아제로부터 선택된 적어도 하나의 리파아제 및 위에 개시된 지방분해 활성도를 갖는 이것의 변이체를 포함한다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 리파아제와, 바람직하게는 세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 서브틸리신 유형의 프로테아제 (EC 3.4.21.62)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로테아제의 조합체를 포함한다.
프로테아제
한 구현예에서, 본 발명의 효소 제제는 적어도 하나의 프로테아제 (성분 (b))를 포함한다. 프로테아제는 아미노펩티다아제 (EC 3.4.11), 디펩티다아제 (EC 3.4.13), 디펩티딜-펩티다아제 및 트리펩티딜-펩티다아제 (EC 3.4.14), 펩티딜-디펩티다아제 (EC 3.4.15), 세린 유형의 카복시펩티다아제 (EC 3.4.16), 메탈로카복시펩티다아제 (EC 3.4.17), 시스테인 유형의 카복시펩티다아제 (EC 3.4.18), 오메가 펩티다아제 (EC 3.4.19), 세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21), 시스테인 엔도펩티다아제 (EC 3.4.22), 아스파르트산 엔도펩티다아제 (EC 3.4.23), 메탈로-엔도펩티다아제 (EC 3.4.24), 트레오닌 엔도펩티다아제 (EC 3.4.25), 또는 알려지지 않은 촉매 메커니즘의 엔도펩티다아제 (EC 3.4.99)를 포함하는 부류 EC 3.4. 프로테아제 (성분 (b))의 일원이다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 프로테아제 (성분 (b))는 세린 프로테아제 (EC 3.4.21)로부터 선택된다. 세린 프로테아제 또는 세린 펩티다아제는 촉매 반응 동안 기질과 공유 첨가생성물을 형성하는 세린을 촉매적 활성 자리에 가짐에 의해 특성규명된다. 본 발명의 맥락에서 세린 프로테아제 (성분 (b))는 키모트립신 (예를 들어, EC 3.4.21.1), 엘라스타제 (예를 들어, EC 3.4.21.36), 엘라스타제 (예를 들어, EC 3.4.21.37 또는 EC 3.4.21.71), 그랜자임 (예를 들어, EC 3.4.21.78 또는 EC 3.4.21.79), 칼리크레인 (예를 들어, EC 3.4.21.34, EC 3.4.21.35, EC 3.4.21.118, 또는 EC 3.4.21.119,) 플라스민 (예를 들어, EC 3.4.21.7), 트립신 (예를 들어, EC 3.4.21.4), 트롬빈 (예를 들어, EC 3.4.21.5), 및 서브틸리신으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 서브틸리신은 또한 서브틸로펩티다아제, 예를 들어, EC 3.4.21.62로 공지되어 있고, 서브틸로펩티다아제는 이하에서 또한 "서브틸리신"으로 지칭된다.
서브틸라제로 임시적으로 명명된 세린 프로테아제의 하위그룹은 문헌 [Siezen et al. (1991), Protein Eng. 4:719-737 and Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523]에서 제안되었다. 서브틸라제는 서브틸리신 패밀리, 써미타제 패밀리, 프로테이나제 K 패밀리, 란티바이오틱(lantibiotic) 펩티다아제 패밀리, 케신 패밀리 및 피롤리신 패밀리를 포함한다.
서브틸라제의 하위그룹은 MEROPS 데이터베이스 (http://merops.sanger.ac.uk)에 의해 규정된 패밀리 S8로부터의 세린 프로테아제인 서브틸리신이다. 펩티다아제 패밀리 S8은 세린 엔도펩티다아제 서브틸리신 및 이것의 동족체(homologue)를 포함한다. 서브패밀리 S8A에서, 활성 자리 잔기는 모티프 Asp-Thr/Ser-Gly (이것은 클란 AA에서 아스파르트산 엔도펩티다아제의 패밀리 내 서열 모티프와 유사하다), His-Gly-Thr-His 및 Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro에서 빈번하게 나타난다.
세린 프로테아제 (성분 (b))의 서브틸리신 관련된 부류는, 이것과 세린 프로테아제의 키모트립신 관련된 부류를 구별하는 촉매 트리아드(triad)를 규정하는 공통의 아미노산 서열을 공유한다. 서브틸리신 및 키모트립신 관련된 세린 프로테아제 둘 모두는 아스파르테이트, 히스티딘 및 세린을 포함하는 촉매 트리아드를 갖는다.
예는 WO 89/06276 및 EP 0283075, WO 89/06279, WO 89/09830, WO 89/09819, WO 91/06637 및 WO 91/02792에 기재된 서브틸리신을 포함한다.
프로테아제는 "프로테아제 활성도" 또는 "단백질분해 활성도"를 나타내는 활성 단백질이다. 단백질분해 활성도는 정해진 시간 내 프로테아제 또는 단백질분해 효소에 의한 단백질의 분해 속도에 관련된다.
단백질분해 활성도를 분석하는 방법은 문헌에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gupta et al. (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 381-395] 참고). 단백질분해 활성도는 기질로 석시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드 (Suc-AAPF-pNA, 간단히 AAPF; 예를 들어, 문헌 [DelMar et al. (1979), Analytical Biochem 99, 316-320] 참고)를 사용하여 측정될 수 있다. pNA는 단백질분해성 절단에 의해 기질 분자로부터 절단되어, 유리 pNA의 황색 색상을 방출하게 되고 이는 OD405를 측정함에 의해 정량화될 수 있다.
단백질분해 활성도는 효소 그램 당 단위로 제공될 수 있다. 예를 들어, 1 U 프로테아제는 pH 8.0 및 37℃ (기질로서 카제인)에서 분 당 1 μmol의 폴린-양성 아미노산 및 펩타이드 (티로신으로서의)를 방출하는 프로테아제의 양에 상응할 수 있다.
서브틸리신 유형 (EC 3.4.21.62)의 프로테아제 (성분 (b))는 바실러 스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로코커스(Enterococcus), 지오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 오셔노바실러스(Oceanobacillus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커 스(Streptococcus), 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 프로테아제로부터 선택된 미생물, 또는 그램-음성의 세균성 폴리펩타이드, 예컨대 캄필로박터(Campylobacter), 대장균, 플라보박테리아(Flavobacterium), 푸소박테리아(Fusobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 리오박터(llyobacter), 네이세리아(Neisseria), 슈도모나스, 살모넬라(Salmonella), 및 우레아플라즈 마(Ureaplasma)로부터 비롯되는 세균성 프로테아제일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 적어도 하나의 프로테아제 (성분 (b))는 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 써쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 피르머스(Bacillus firmus), 바실러스 기브소니(Bacillus gibsonii), 바실러스 라우터스(Bacillus lautus), 바 실러스 렌터 스(Bacillus lentus), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 스테 아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스, 또는 바실러 스 튀링겐시스(Bacillus thuringiensis) 프로테아제로부터 선택된다.
본 발명의 한 구현예에서, 적어도 하나의 프로테아제 (성분 (b))는 다음의 것들로부터 선택된다: 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 BPN'으로부터의 서브틸리신 (문헌 [Vasantha et al. (1984) J. Bacteriol. Volume 159, p. 811-819] 및 [JA wells (1983) in Nucleic Acids Research, Volume 11, p. 7911-7925)]에 기재됨; 바실러스 리체니포르미스로부터의 서브틸리신 (서브틸리신 칼스버그; 문헌 [EL Smith et al. (1968) in J. Biol Chem, Volume 243, pp. 2184-2191], 및 [Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res, Vol 13, p. 8913-8926]에 개시됨); 서브틸리신 PB92 (알칼리성 프로테아제 PB92의 원 서열은 EP 283075 A2에 기재됨); WO 89/06279에 개시된 서브틸리신 147 및/또는 309 (각각 Esperase®, Savinase®); WO 91/02792에 개시된 바실러스 렌터스로부터의, 예컨대 WO 95/23221에 개시된 바 실러스 렌터스 DSM 5483 또는 바실러스 렌터스 DSM 5483의 변이체로부터의 서브틸리신; DE 10064983에 개시된 바실러스 알칼로필러스 (DSM 11233)로부터의 서브틸리신; WO 2003/054184에 개시된 바실러스 기브소니 (DSM 14391)로부터의 서브틸리신; WO 2003/056017에 개시된 바실러스 속 (DSM 14390)으로부터의 서브틸리신; WO 2003/055974에 개시된 바실러스 속 (DSM 14392)으로부터의 서브틸리신; WO 2003/054184에 개시된 바실러스 기브소니 (DSM 14393)로부터의 서브틸리신; WO 2005/063974에 기재된 SEQ ID NO: 4를 갖는 서브틸리신; WO 2005/103244에 기재된 SEQ ID NO: 4를 갖는 서브틸리신; WO 2005/103244에 기재된 SEQ ID NO: 7을 갖는 서브틸리신; 및 출원 DE 102005028295.4에 기재된 SEQ ID NO: 2를 갖는 서브틸리신.
한 구현예에서, 성분 (b)는 WO 89/06279의 표 I에서 서열 a)로 개시된 적어도 서브틸리신 309 (이것은 본 명세서에서 Savinase 로 불릴 수 있음) 또는 이것과 적어도 80% 동일하며 단백질분해 활성도를 갖는 변이체를 포함한다.
본 발명에 따른 유용한 프로테아제 (성분 (b))의 예는 WO 92/19729, WO 95/23221, WO 96/34946, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 99/11768, WO 01/44452, WO 02/088340, WO 03/006602, WO 2004/03186, WO 2004/041979, WO 2007/006305, WO 2011/036263, WO 2011/036264, 및 WO 2011/072099에 기재된 변이체를 포함한다. 적합한 예는 특히, 단백질분해 활성도를 갖는, 다음의 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 EP 1921147에 기재된 SEQ ID NO:22 (이것은 바실러스 렌터스 DSM 5483으로부터의 성숙한 알칼리성 프로테아제의 서열임)로부터 유래한 서브틸리신 프로테아제의 변이체를 포함한다: (BPN' 넘버링에 따른) 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 및 274. 한 구현예에서, 그와 같은 프로테아제는 (BPN' 넘버링에 따른) 위치 Asp32, His64 및 Ser221에서는 돌연변이되지 않는다.
적합한 프로테아제 (성분 (b))는 위에 개시된 모 효소의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한, 단백질분해 활성도를 갖는 프로테아제 변이체를 포함한다.
적합한 프로테아제 (성분 (b))는 모 효소의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 유사한, 단백질분해 활성도를 갖는 프로테아제 변이체를 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 프로테아제 (성분 (b))는 EP 1921147에 기재된 SEQ ID NO:22, 또는 이것과 적어도 80% 동일하며 단백질분해 활성도를 갖는 프로테아제를 갖는다. 한 구현예에서, 상기 프로테아제는 (BPN' 넘버링에 따른) 위치 101에서 아미노산 글루탐산 (E), 또는 아스파르트산 (D), 또는 아스파라긴 (N), 또는 글루타민 (Q), 또는 알라닌 (A), 또는 글리신 (G), 또는 세린 (S)을 가짐에 의해 특성규명되고 단백질분해 활성도를 갖는다. 한 구현예에서, 상기 프로테아제는 다음의 하나 이상의 추가 치환을 포함한다: (a) 위치 3에서 트레오닌 (3T), (b) 위치 4에서 이소류신 (4I), (c) 위치 63에서 알라닌, 트레오닌 또는 아르기닌 (63A, 63T, 또는 63R), (d) 위치 156에서 아스파르트산 또는 글루탐산 (156D 또는 156E), (e) 위치 194에서 프롤린 (194P), (f) 위치 199에서 메티오닌 (199M), (g) 위치 205에서 이소류신 (205I), (h) 위치 217에서 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신 (217D, 217E 또는 217G), (i) (a) 내지 (h)에 따른 둘 이상의 아미노산의 조합체. 적어도 하나의 프로테아제 (성분 (b))는 EP 1921147에 기재된 SEQ ID NO:22와 적어도 80% 동일할 수 있고, ((a) 내지 (h)에 따른) 하나의 아미노산 또는 (BPN' 넘버링에 따른) 아미노산 101E, 101D, 101N, 101Q, 101A, 101G, 또는 101S와 함께 (i)에 따른 조합체를 포함하고 단백질분해 활성도를 가짐에 의해 특성규명된다. 한 구현예에서, 상기 프로테아제는 돌연변이 (BPN' 넘버링에 따른) R101E, 또는 S3T + V4I + V205I, 또는 R101E 및 S3T, V4I, 및 V205I, 또는 S3T + V4I + V199M + V205I + L217D를 포함하고 단백질분해 활성도를 가짐에 의해 특성규명된다.
한 구현예에서, EP 1921147에 기재된 SEQ ID NO:22에 따른 프로테아제는 돌연변이 (BPN' 넘버링에 따른) S3T + V4I + S9R + A15T + V68A + D99S + R101S + A103S + I104V + N218D를 포함하고 단백질분해 활성도를 가짐에 의해 특성규명된다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 프로테아제는 상품명 Alcalase®, Blaze®, Duralase™, Durazym™, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® 및 Esperase® (Novozymes A/S)로 판매된 제품; 상품명 Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect® Prime, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Eraser®, Ultimase®, Opticlean®, Effectenz®, Preferenz® 및 Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.)으로 판매된 것들; 바실러스 렌터스 알칼리성 프로테아제 (BLAP; US 5,352,604의 도 29에 도시된 서열) 및 이것의 변이체; 및 Kao Corp.로부터의 KAP (바실러스 알칼로필러스 서브틸리신)를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는 상업적으로 입수가능한 프로테아제 효소로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 성분 (b)는 - 모두 위에 개시된 - 바람직하게는 세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)의 군으로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 서브틸리신 유형의 프로테아제 (EC 3.4.21.62)의 군으로부터 선택된 적어도 2개의 프로테아제의 조합체를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 적어도 하나의 리파아제와 적어도 하나의 프로테아제의 조합체를 포함한다. 한 구현예에서, 성분 (b)는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3)로부터 선택된 적어도 하나의 리파아제, 및 세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)의 군으로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 서브틸리신 유형의 프로테아제 (EC 3.4.21.62)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로테아제를 포함한다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 - 모두 위에 개시된 - 트리아실글리세롤 리파아제(EC 3.1.1.3)로부터 선택된 적어도 하나의 리파아제, 및 EP 1921147에 기재된 SEQ ID NO:22에 따른 프로테아제 또는 단백질분해 활성도를 갖는 이것의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 프로테아제를 포함한다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 - 모두 위에 개시된 - US 5869438의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269에 따른 트리아실글리세롤 리파아제 및 지방분해 활성도를 갖는 이것의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 리파아제, 및 EP 1921147에 기재된 SEQ ID NO:22에 따른 프로테아제 또는 단백질분해 활성도를 갖는 이것의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 프로테아제를 포함한다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 - 모두 위에 개시된 - US 5869438의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-269에 따른 트리아실글리세롤 리파아제 및 지방분해 활성도를 갖는 이것의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 리파아제, 및 WO 89/06279의 표 I a)에 개시된 서브틸리신 309 또는 단백질분해 활성도를 갖는 이것의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 프로테아제를 포함한다.
아밀라아제
한 구현예에서, 본 발명의 효소 제제는 적어도 하나의 아밀라아제 (성분 (b))를 포함한다. 본 발명에 따른 "아밀라아제" (성분 (b)) (알파 및/또는 베타)는 세균성 또는 진균성 기원의 것들 (각각 EC 3.2.1.1 및 3.2.1.2)을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다.
본 발명에 따른 아밀라아제 (성분 (b))는 다당류 내 글루코스 연결의 (내부)가수분해에 관련되는 "녹말분해 활성도" 또는 "아밀라아제 활성도"를 갖는다. α-아밀라아제 활성도는 당해 분야에서의 숙련가에게 공지되어 있는 α-아밀라아제 활성도를 측정하는 검정에 의해 측정될 수 있다. α-아밀라아제 활성도를 측정하는 검정에 대한 예는 다음과 같다:
α-아밀라아제 활성도는 기질로 파데바스(Phadebas) 정제를 사용하는 방법 (파데바스 아밀라아제 시험, Magle Life Science에 의해 공급됨)에 의해 측정될 수 있다. 전분은 α-아밀라아제에 의해 가수분해되어 가용성의 청색 단편을 제공한다. 620 nm에서 분광광도계로 측정된, 수득되는 청색 용액의 흡광도는 α-아밀라아제 활성도의 함수이다. 측정된 흡광도는 주어진 조건 세트 하에 당해 α-아밀라아제의 비 활성도 (활성도/순수 α-아밀라아제 단백질 mg)에 직접 비례한다.
α-아밀라아제 활성도는 또한 에틸리덴-4-니트로페닐-α-D-말토헵타오사이드 (EPS)를 사용하는 방법에 의해 측정될 수 있다. D-말토헵타오사이드는 엔도-아밀라아제에 의해 절단될 수 있는 블록화된 올리고당류이다. 절단 후에, 기질이 소화되어 유리 PNP 분자를 방출시키도록 α-글루코시다제를 키트에 포함시켰는데, 상기 유리 PNP 분자는 황색 색상을 가져서 405 nm에서 가시광 분광광도법에 의해 측정될 수 있다. EPS 기질 및 α-글루코시다제를 함유하는 키트는 Roche Costum Biotech에 의해 제조된다 (제품 번호 10880078103). 시간 의존적인 흡광 곡선의 기울기는 주어진 조건 세트 하에 당해 α-아밀라아제의 비 활성도 (효소 mg 당 활성도)에 직접 비례한다.
녹말분해 활성도는 효소 그램 당 단위로 제공될 수 있다. 예를 들어, 1 단위 α-아밀라아제는 20℃에서 pH 6.9에서 3분 이내에 전분으로부터 1.0 mg의 말토오스를 방출할 수 있다.
적어도 하나의 아밀라아제 (성분 (b))는 다음의 것들로부터 선택될 수 있다: WO 95/10603에 기재된 SEQ ID NO:2를 갖는 바실러스 리체니포르미스로부터의 아밀라아제; WO 02/10355에 개시된 SEQ ID NO:6을 갖는 B. 스테아로써모필러스로부터의 아밀라아제; WO 99/19467에 개시된 SEQ ID NO:6을 갖는 바실러스 속 707로부터의 아밀라아제; SP-722로 또한 기재된, WO 96/23872에 기재된 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:7을 갖는 바실러스 할마팔루스(Bacillus halmapalus)로부터의 아밀라아제; WO 00/22103에 개시된 SEQ ID NO:4를 갖는 바실러스 속 DSM 12649로부터의 아밀라아제; WO 2009/061380에 개시된 SEQ ID NO:2를 갖는 바실러스 균주 TS-23으로부터의 아밀라아제; WO 2013/184577에 개시된 SEQ ID NO:1을 갖는 사이토파가(Cytophaga) 속으로부터의 아밀라아제; WO 2010/104675에 개시된 SEQ ID NO:1을 갖는 바실러스 메가테리움 DSM 90으로부터의 아밀라아제; WO 00/60060에 기재된 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 485를 포함하는 바실러스 속으로부터의 아밀라아제.
적합한 아밀라아제 (성분 (b))는 위에 개시된 모 효소의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아밀라아제 활성도를 갖는 아밀라아제 변이체를 포함한다.
적합한 아밀라아제 (성분 (b))는 모 효소의 전장 폴리펩타이드 서열과 비교하여 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 유사한 아밀라아제 활성도를 갖는 아밀라아제 변이체를 포함한다.
적어도 하나의 아밀라아제 (성분 (b))는 WO 2006/002643에 기재된 SEQ ID NO: 12를 가질 수 있거나 이것과 적어도 80% 동일하며, 녹말분해 활성도를 갖는다. 적어도 하나의 아밀라아제는 SEQ ID NO:12와 적어도 80% 동일할 수 있고, 위치 Y295F 및 M202LITV에 치환을 포함한다.
적어도 하나의 아밀라아제 (성분 (b))는 WO 2011/098531에 기재된 SEQ ID NO:6을 가질 수 있거나 이것과 적어도 80% 동일하며, 녹말분해 활성도를 갖는다. 적어도 하나의 아밀라아제는 SEQ ID NO:6과 적어도 80% 동일할 수 있고, 193 [G,A,S,T 또는 M], 195 [F,W,Y,L,I 또는 V], 197 [F,W,Y,L,I 또는 V], 198 [Q 또는 N], 200 [F,W,Y,L,I 또는 V], 203 [F,W,Y,L,I 또는 V], 206 [F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D 또는 E], 210 [F,W,Y,L,I 또는 V], 212 [F,W,Y,L,I 또는 V], 213 [G,A,S,T 또는 M] 및 243 [F,W,Y,L,I 또는 V]으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 치환을 포함한다.
적어도 하나의 아밀라아제 (성분 (b))는 WO 2013/001078에 기재된 SEQ ID NO:1을 가질 수 있거나 이것과 적어도 85% 동일하며, 녹말분해 활성도를 갖는다. 적어도 하나의 아밀라아제는 SEQ ID NO:1과 적어도 85% 동일할 수 있고, 위치 G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476, 및 G477에 상응하는 둘 이상 (여러) 위치에 변형을 포함한다.
적어도 하나의 아밀라아제 (성분 (b))는 WO 2013/001087에 기재된 SEQ ID NO:2를 가질 수 있거나 이것과 적어도 85% 동일하며, 녹말분해 활성도를 갖는다. 적어도 하나의 아밀라아제는 SEQ ID NO:2와 적어도 85% 동일할 수 있고, 위치 181+182, 또는 182+183, 또는 183+184의 결실을 포함하고, 녹말분해 활성도를 갖는다. 한 구현예에서, 상기 아밀라아제는 W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 및 G477에 상응하는 임의의 위치에서 하나 또는 둘 이상의 추가 변형을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 아밀라아제는 상품명 Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Natalase™, Liquozyme X 및 BAN™ (Novozymes A/S로부터), 및 Rapidase™, Purastar™, PoweraseTM, Effectenz™ (DuPont으로부터 M100), Preferenz™ (S1000, S110 및 F1000; DuPont으로부터), PrimaGreen™ (모두; DuPont), Optisize™ (DuPont)로 판매된 제품을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는 상업적으로 입수가능한 아밀라아제로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 적어도 2개의 아밀라아제 (성분 (b))의 조합체가 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 적어도 하나의 리파아제와 적어도 하나의 아밀라아제의 조합체를 포함한다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 적어도 하나의 프로테아제 및/또는 적어도 하나의 아밀라아제의 조합체를 포함한다.
한 구현예에서, 성분 (b)는 적어도 하나의 리파아제와 적어도 하나의 프로테아제와 적어도 하나의 아밀라아제의 조합체를 포함한다.
셀룰라아제
본 발명의 효소 제제는 적어도 하나의 셀룰라아제 (성분 (b))를 포함할 수 있다. 3개의 주요 유형의 셀룰라아제, 즉 셀로바이오가수분해효소 (1,4-P-D-글루칸 셀로바이오가수분해효소, EC 3.2.1.91), 엔도-ss-1,4-글루카나제 (엔도-1,4-P-D-글루칸 4-글루카노-가수분해효소, EC 3.2.1.4) 및 ss-글루코시다제 (EC 3.2.1.21)가 공지되어 있다.
"셀룰라아제", "셀룰라아제 효소" 또는 "셀룰로오스분해 효소" (성분 (b))는 셀룰로오스의 가수분해에 관련된 효소이다. "셀룰라아제 활성도" 또는 "셀룰로오스분해 활성도"를 측정하는 검정은 당해 분야에서의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 셀룰로오스분해 활성도는 셀룰라아제가 카복시메틸 셀룰로오스를 환원성 탄수화물로 가수분해시킨다는 사실에 의해 측정될 수 있으며, 그 환원 능력은 문헌 [Hoffman, W. S., J. Biol. Chem. 120, 51 (1937)]에 따르면 페리시아나이드 반응에 의해 열량계로 측정된다.
셀룰로오스분해 활성도는 효소 그램 당 단위로 제공될 수 있다. 예를 들어, 1 단위는 37℃에서 pH 5.0에서 1시간 이내에 (2시간의 인큐베이션 시간) 셀룰로오스로부터 1.0 μmole의 글루코스를 방출할 수 있다.
본 발명에 따른 셀룰라아제는 세균성 또는 진균성 기원의 것들을 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 셀룰라아제 (성분 (b))는 CelluzymeTM, EndolaseTM, CarezymeTM, CellusoftTM, RenozymeTM, CellucleanTM (Novozymes A/S로부터의), EcostoneTM, BiotouchTM, EconaseTM, EcopulpTM (AB Enzymes Finland로부터의), ClazinaseTM, 및 Puradax HATM, Genencor detergent celluase L, IndiAgeTM Neutra (Genencor International Inc./DuPont으로부터의), RevitalenzTM (DuPont으로부터의 2000), PrimafastTM (DuPont) 및 KAC-500TM (Kao Corporation으로부터의)을 포함하지만 이것들로 제한되지 않는 상업적으로 입수가능한 셀룰라아제로부터 선택된다.
성분 (c)
한 구현예에서, 본 발명의 액체 효소 제제는 성분 (a)와는 상이한 효소 안정제, 보존제, 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 성분 (c)를 함유한다.
성분 (a)와 상이한 효소 안정제:
본 발명의 액체 효소 제제는 성분 (a)와 상이한 적어도 하나의 효소 안정제를 포함할 수 있다. 상기 효소 안정제 (성분 (c))는 붕소 함유 화합물, 폴리올, 펩타이드 알데하이드, 기타 안정제, 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
붕소 함유 화합물:
붕소 함유 화합물 (성분 (c))은 붕산 또는 이것의 유도체로부터 그리고 보론산 또는 이것의 유도체, 예컨대 아릴 보론산 또는 이것의 유도체로부터, 이들의 염으로부터 그리고 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에서의 붕산은 오르토붕산으로 불릴 수 있다.
한 구현예에서, 붕소 함유 화합물 (성분 (c))은 아릴 보론산 및 이것의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 붕소 함유 화합물은 페닐 보론산 (PBA)으로 또한 불리는 벤젠 보론산 (BBA), 이것의 유도체, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 페닐 보론산 유도체는 다음의 식 (IIIa) 및 식 (IIIb)의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00001
상기 식에서,
R1은 수소, 하이드록시, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 알킬, 및 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 알케닐로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 바람직한 구현예에서, R은 하이드록시, 및 치환되지 않은 C1 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
R2는 수소, 하이드록시, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 알킬, 및 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 알케닐로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 바람직한 구현예에서, R은 H, 하이드록시, 및 치환된 C1 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 페닐-보론산 유도체 (성분 (c))는 4-포르밀 페닐 보론산 (4-FPBA), 4-카복시 페닐 보론산 (4-CPBA), 4-(하이드록시메틸) 페닐 보론산 (4-HMPBA), 및 p-톨릴보론산 (p-TBA)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
다른 적합한 유도체 (성분 (c))는 다음의 것들을 포함한다: 2-티에닐 보론산, 3-티에닐 보론산, (2-아세트아미도페닐) 보론산, 2-벤조푸라닐 보론산, 1-나프틸 보론산, 2-나프틸 보론산, 2-FPBA, 3-FBPA, 1-티안트레닐 보론산, 4-디벤조푸란 보론산, 5-메틸-2-티에닐 보론산, 1-벤조티오펜-2 보론산, 2-푸라닐 보론산, 3-푸라닐 보론산, 4,4-비페닐-디보론산, 6-하이드록시-2-나프탈렌보론산, 4-(메틸티오) 페닐 보론산, 4-(트리메틸실릴) 페닐 보론산, 3-브로모티오펜 보론산, 4-메틸티오펜 보론산, 2-나프틸 보론산, 5-브로모티오펜 보론산, 5-클로로티오펜 보론산, 디메틸티오펜 보론산, 2-브로모페닐 보론산, 3-클로로페닐 보론산, 3-메톡시-2-티오펜 보론산, p-메틸-페닐에틸 보론산, 2-티안트레닐 보론산, 디-벤조티오펜 보론산, 9-안트라센 보론산, 3,5-디클로로페닐 보론산, 디페닐 보론산 무수물, o-클로로페닐 보론산, p-클로로페닐 보론산, m-브로모페닐 보론산, p-브로모페닐 보론산, p-플루오로페닐 보론산, 옥틸 보론산, 1,3,5-트리메틸페닐 보론산, 3-클로로-4-플루오로페닐 보론산, 3-아미노페닐 보론산, 3,5-비스-(트리플루오로메틸) 페닐 보론산, 2,4 디클로로페닐 보론산, 4-메톡시페닐 보론산, 및 이들의 혼합물.
폴리올:
폴리올 (성분 (c))은 2 내지 6개의 하이드록실 기를 함유하는 폴리올로부터 선택될 수 있다. 적합한 예는 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,2-프로판 디올, 1,2-부탄 디올, 에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 에리트리톨, 글루코스, 프럭토스, 락토스, 및 에리트리탄을 포함한다.
펩타이드 알데하이드 :
펩타이드 알데하이드 (성분 (c))는 디-, 트리- 또는 테트라펩타이드 알데하이드 및 알데하이드 유사체 (식 B1-BO-R, 여기서 R은 H, CH3, CX3, CHX2, 또는 CH2X (X = 할로겐)이고, BO는 단일 아미노산 잔기이고 (선택적으로 치환된 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 구현예에서); B1은 선택적으로 N 말단 보호기를 포함하거나 WO 09/118375 및 WO 98/13459에 기재된 하나 이상의 (한 구현예에서, 1개, 2개 또는 3개) 아미노산 잔기, 또는 단백질 유형의 프로테아제 억제제, 예컨대 RASI, BASI, WASI (쌀, 보리 및 밀의 이작용성 알파-아밀라아제/서브틸리신 억제제), 또는 CI2 또는 SSI로 이루어진다)로부터 선택될 수 있다.
기타 안정제:
기타 안정제 (성분 (c))는 염, 예컨대 NaCl 또는 KCl, 및 락트산 및 포름산의 알칼리 염으로부터 선택될 수 있다.
기타 안정제 (성분 (c))는 완성된 조성물 중의 아연 (II), 칼슘 (II) 및/또는 마그네슘 (II) 이온의 수용성 공급원으로부터 선택될 수 있으며, 상기 이온의 수용성 공급원은 그와 같은 이온을 효소 뿐만 아니라 다른 금속 이온 (예를 들어, 바륨 (II), 스칸듐 (II), 철 (II), 망간 (II), 알루미늄 (III), 주석 (II), 코발트 (II), 구리 (II), 니켈 (II), 및 옥소바나듐 (IV))에 제공한다.
그 자체로 액체 효소 제제를 안정시키는 화합물
그 자체로 액체 효소 제제를 안정시키는 화합물은, 보관 안정성을 보장하기에 효과적인 양으로 액체 제제의 보관 안정성을 확립시키는데 필요한 효소 안정제를 제외한 임의의 화합물을 의미한다.
당해 분야에서의 숙련가에게 공지된 액체 제제의 맥락에서의 보관 안정성은 보통 제품의 외관 및 투여형의 균일성의 측면을 포함한다.
제품의 외관은 제품의 pH에 의해 그리고 화합물, 예컨대 보존제, 산화방지제, 점도 조절제, 유화제 등의 존재에 의해 영향 받는다.
투여형의 균일성은 보통 제품의 동질성과 관련된다.
보존제:
본 발명의 액체 효소 제제는 적어도 하나의 보존제를 포함할 수 있다. 보존제는 액체 효소 제제, 바람직하게는 수성 효소 제제의 미생물 오염을 방지하기에 효과적인 양으로 첨가된다.
적합한 보존제의 비제한적인 예는 (4차) 암모늄 화합물, 이소티아졸리논, 유기 산, 및 포름알데하이드 방출제를 포함한다. 적합한 (4차) 암모늄 화합물의 비제한적인 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 폴리헥사메틸렌 비구아나이드 (PHMB), 디데실디메틸암모늄 클로라이드(DDAC), 및 N-(3-아미노프로필)-N-도데실프로판-1,3-디아민 (디아민)을 포함한다. 적합한 이소티아졸리논의 비제한적인 예는 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온 (BIT), 2-메틸-2H-이소티아졸-3-온 (MIT), 5-클로로-2-메틸-2H-이소티아졸-3-온 (CIT), 2-옥틸-2H-이소티아졸-3-온 (OIT), 및 2-부틸-벤조[d]이소티아졸-3-온 (BBIT)을 포함한다. 적합한 유기 산의 비제한적인 예는 벤조산, 소르브산, L-(+)-락트산, 포름산, 및 살리실산을 포함한다. 적합한 포름알데하이드 방출제의 비제한적인 예는 N,N'-메틸렌비스모폴린 (MBM), 2,2',2''-(헥사하이드로-1,3,5-트리아진-1,3,5-트리일)트리에탄올 (HHT), (에틸렌디옥시)디메탄올, 알파,알파',알파''-트리메틸-1,3,5-트리아진-1,3,5(2H,4H,6H)-트리에탄올 (HPT), 3,3'-메틸렌비스[5-메틸옥사졸리딘] (MBO), 및 시스-1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄 클로라이드 (CTAC)를 포함한다.
추가의 유용한 보존제는 아이오도프로피닐 부틸카바메이트 (IPBC), 할로겐 방출 화합물, 예컨대 디클로로-디메틸-히단토인 (DCDMH), 브로모-클로로-디메틸-히단토인 (BCDMH), 및 디브로모-디메틸-히단토인 (DBDMH); 브로모-니트로 화합물, 예컨대 브로노폴 (2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올), 2,2-디브로모-2-시아노아세트아미드 (DBNPA); 알데하이드, 예컨대 글루타르알데하이드; 페녹시에탄올; 비페닐-2-올; 및 아연 또는 나트륨 피리티온을 포함한다.
계면활성제:
본 발명의 액체 효소 제제는 적어도 하나의 계면활성제 (성분 (c))를 포함할 수 있다. 계면활성제의 예는 비-이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 및 양이온성 계면활성제를 포함하며, 이들은 이하에서 또한 비-이온성 계면활성제 (성분 (c)), 양쪽성 계면활성제 (성분 (c)), 음이온성 계면활성제 (성분 (c)), 및 양이온성 계면활성제 (성분 (c))로 지칭된다. 한 구현예에서, 본 발명의 액체 효소 제제는 비-이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 그리고 음이온성 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
액체 효소 제제는 이 효소 제제의 총 중량에 대하여 0.1 내지 60중량%의 계면활성제 (성분 (c))를 함유할 수 있다. 성분 (c)는 음이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 및 아민 옥사이드 계면활성제 뿐만 아니라 전술된 것들의 적어도 2개의 조합체로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 효소 제제는 모두 이 효소 제제의 총 중량에 대하여 5 내지 30중량%의 음이온성 계면활성제, 및 예를 들어, 3 내지 20중량% 범위의 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제를 함유한다.
적어도 하나의 비-이온성 계면활성제 (성분 (c))는 알콕실화 알콜, 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 이- 및 다중블록 코폴리머, 및 소르비탄과 에틸렌 옥사이드 또는 프로필렌 옥사이드의 반응 생성물, 알킬 폴리글리코사이드 (APG), 하이드록시알킬 혼합된 에테르 및 아민 옥사이드로부터 선택될 수 있다.
알콕실화 알콜 및 알콕실화 지방 알콜의 바람직한 예는 예를 들어, 다음의 일반식 (IV)의 화합물이다:
Figure pct00002
상기 식에서,
R3은 동일하거나 상이하며 수소 및 선형 C1-C10-알킬, 바람직하게는 각각의 경우에 동일하며 에틸 및 특히 바람직하게는 수소 또는 메틸이고,
R4는 선형 또는 분지형 C8-C22-알킬, 예를 들어 n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C14H29, n-C16H33 또는 n-C18H37로부터 선택되고,
R5는 C1-C10-알킬, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, 네오펜틸, 1,2-디메틸프로필, 이소아밀, n-헥실, 이소헥실, sec-헥실, n-헵틸, n-옥틸, 2-에틸헥실, n-노닐, n-데실 또는 이소데실로부터 선택된다.
변수 m 및 n은 0 내지 300의 범위에 있으며, 여기서 n과 m의 합은 적어도 1이고, 바람직하게는 3 내지 50의 범위이다. 바람직하게는, m은 1 내지 100의 범위이고 n은 0 내지 30의 범위이다.
한 구현예에서, 일반식 (III)의 화합물은 블록 코폴리머 또는 랜덤 코폴리머이며, 블록 코폴리머가 바람직하다.
알콕실화 알콜의 다른 바람직한 예는 예를 들어, 다음의 일반식 (V)의 화합물이다:
Figure pct00003
상기 식에서,
R6은 동일하거나 상이하며, 수소 및 선형 C1-C10-알킬, 바람직하게는 각각의 경우에 동일하고, 에틸 및 특히 바람직하게는 수소 또는 메틸로부터 선택되고,
R7은 선형 또는 분지형 C6-C20-알킬, 특히 n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C13H27, n-C15H31, n-C14H29, n-C16H33, n-C18H37로부터 선택되고,
a는 0 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6 범위의 수이고,
b는 1 내지 80, 바람직하게는 4 내지 20 범위의 수이며,
c는 0 내지 50, 바람직하게는 4 내지 25 범위의 수이고.
a + b + c의 합은 바람직하게는 5 내지 100의 범위, 훨씬 더 바람직하게는 9 내지 50의 범위이다.
하이드록시알킬 혼합된 에테르에 대한 바람직한 예는 다음의 일반식 (VI)의 화합물이다:
Figure pct00004
상기 식에서, 변수는 다음과 같이 정의된다:
R8은 동일하거나 상이하며, 수소 및 선형 C1-C10-알킬로부터 선택되고, 바람직하게는 각각의 경우에 동일하고, 에틸 및 특히 바람직하게는 수소 또는 메틸이고,
R9는 선형 또는 분지형 C8-C22-알킬, 예를 들어 이소-C11H23, 이소-C13H27, n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C14H29, n-C16H33 또는 n-C18H37로부터 선택되고,
R10은 C1-C18-알킬, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, 네오펜틸, 1,2-디메틸프로필, 이소아밀, n-헥실, 이소헥실, sec-헥실, n-헵틸, n-옥틸, 2-에틸헥실, n-노닐, n-데실, 이소데실, n-도데실, n-테트라데실, n-헥사데실, 및 n-옥타데실로부터 선택된다.
변수 m 및 x는 0 내지 300의 범위이며, 여기서 n과 m의 합은 적어도 1이고, 바람직하게는 5 내지 50의 범위이다. 바람직하게는, m은 1 내지 100의 범위이고 n은 0 내지 30의 범위이다.
일반식 (V) 및 (VI)의 화합물은 블록 코폴리머 또는 랜덤 코폴리머일 수 있고, 블록 코폴리머가 바람직하다.
추가의 적합한 비-이온성 계면활성제는 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드로 구성된 이- 및 다중블록 코폴리머로부터 선택된다. 추가의 적합한 비이온성 계면활성제는 에톡실화 또는 프로폭실화 소르비탄 에스테르로부터 선택된다. 아민 옥사이드 또는 알킬 폴리글리코사이드, 특히 선형 C4-C18-알킬 폴리글루코사이드 및 분지형 C8-C18-알킬 폴리글루코사이드, 예컨대 다음의 일반 평균 식(VII)의 화합물이 마찬가지로 적합하다.
Figure pct00005
상기 식에서,
R11은 C1-C4-알킬, 특히 에틸, n-프로필 또는 이소프로필이고,
R12는 -(CH2)2-R11이고,
G1은 4 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 단당류, 특히 글루코스 및 자일로스로부터 선택되고,
y는 1.1 내지 4의 범위이고, y는 평균 수이다.
비-이온성 계면활성제의 추가 예는 다음의 일반식 (VIIIa) 및 (VIIIb)의 화합물이다:
Figure pct00006
상기 식에서,
AO는 에틸렌 옥사이드, 프로필렌 옥사이드 및 부틸렌 옥사이드로부터 선택되고,
EO는 에틸렌 옥사이드, CH2CH2-O이고,
R13은 C1-C4-알킬, 특히 에틸, n-프로필 또는 이소프로필이고,
R14는 선형 또는 분지형 C8-C18-알킬로부터 선택되고,
A3O은 프로필렌 옥사이드 및 부틸렌 옥사이드로부터 선택되고,
w는 15 내지 70, 바람직하게는 30 내지 50 범위의 수이고,
w1 및 w3은 1 내지 5 범위의 수이고,
w2는 13 내지 35 범위의 수이다.
적합한 추가의 비-이온성 계면활성제에 대한 개관은 EP A 0 851 023에서 그리고 DE-A 198 19 187에서 확인될 수 있다.
한 구현예에서, 효소 제제는 둘 이상의 상이한 비-이온성 계면활성제 (성분 (c))의 혼합물을 함유한다.
적어도 하나의 양쪽성 계면활성제 (성분 (c))는 사용 조건 하에 동일한 분자 중에 양 및 음 전하를 함유하는 계면활성제로부터 선택될 수 있다. 양쪽성 계면활성제의 바람직한 예는 소위 베타인-계면활성제이다. 베타인-계면활성제의 다수 예는 분자 당 하나의 4차화된 질소 원자 및 하나의 카복실산 기를 함유한다. 양쪽성 계면활성제의 특히 바람직한 예는 코크아미도프로필 베타인 (라우르아미도프로필 베타인)이다.
아민 옥사이드 계면활성제의 예는 다음의 일반식 (IX)의 화합물이다:
R13R14R15N→O (IX)
상기 식에서, R13, R14 및 R15는 서로 독립적으로 지방족, 사이클로지방족 또는 C2-C4-알킬렌 C10-C20-알킬아미도 모이어티로부터 선택된다. 바람직하게는, R12는 C8-C20-알킬 또는 C2-C4-알킬렌 C10-C20-알킬아미도로부터 선택되고, R13 및 R14는 둘 모두 메틸이다.
특히 바람직한 예는 라우릴 디메틸 아민옥사이드이며, 이것은 때때로 또한 라우르아민 옥사이드로 불린다. 추가의 특히 바람직한 예는 코크아미딜프로필 디메틸아민옥사이드이며, 이것은 때때로 또한 코크아미도프로필아민 옥사이드로 불린다.
적어도 하나의 음이온성 계면활성제 (성분 (c))는 C8-C18-알킬 설페이트의, C8-C18-지방 알콜 폴리에테르 설페이트의, 에톡실화 C4-C12-알킬페놀의 황산 반-에스테르 (에톡실화: 1 내지 50 mol의 에틸렌 옥사이드/mol), C12-C18 설포 지방산 알킬 에스테르, 예를 들어, C12-C18 설포 지방산 메틸 에스테르의, 더욱이 C12-C18-알킬설폰산의 그리고 C10-C18-알킬아릴설폰산의 알칼리 금속 및 암모늄 염으로부터 선택될 수 있다. 상기 언급된 화합물의 알칼리 금속 염, 특히 바람직하게는 나트륨 염이 바람직하다.
음이온성 계면활성제 (성분 (c))의 구체적인 예는 다음의 일반식 (X)에 따른 화합물이다:
CsH2s +1-O(CH2CH2O)t-SO3M (X)
상기 식에서,
s는 10 내지 18, 바람직하게는 12 내지 14 범위의 수, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 s는 12이고,
t는 1 내지 5, 바람직하게는 2 내지 4 범위의 수, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 3이고,
M은 알칼리 금속, 바람직하게는 칼륨, 및 훨씬 더 바람직하게는 나트륨으로부터 선택된다.
변수 s 및 t는 평균 수일 수 있고 따라서 이들은 반드시 정수는 아닌 반면, 식 (X)에 따른 개별 분자에서 s 및 t 둘 모두는 정수를 나타낸다.
적합한 음이온성 계면활성제 (성분 (c))의 추가 예는 비누, 예를 들어, 스테아르산, 올레산, 팔미트산, 에테르 카복실레이트, 및 알킬에테르 포스페이트의 나트륨 또는 칼륨 염이다.
한 구현예에서, 본 발명의 효소 제제는, 모두 이 효소 제제의 총 중량에 대하여 5 내지 95중량% 범위, 5 내지 30중량% 범위, 5 내지 25중량% 범위, 또는 20 내지 70중량% 범위의 양으로 물을 함유하는 수성이다. 상기 효소 제제는 이 효소 제제의 총 중량에 대하여 0 내지 20중량% 범위의 양으로 유기 용매를 함유할 수 있다. 한 구현예에서, 효소 제제는 모두 이 효소 제제의 총 중량에 대하여 5 내지 15중량% 범위의 양으로 물을, 그리고 상당량이 아닌, 예를 들어 1중량% 이하의 유기 용매를 함유한다.
본 발명의 효소 제제는 알칼리성이거나 중성 또는 약 산성의 pH 값, 예를 들어 6 내지 14, 6.5 내지 13, 8 내지 10.5, 또는 8.5 내지 9.0을 나타낼 수 있다.
효소 제형의 제조:
본 발명은 적어도 위에 개시된 성분 (a)와 위에 개시된 성분 (b)를 혼합시키는 단계를 포함하는, 효소 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
성분 (b)는 고체일 수 있다. 고체 성분 (b)는, 고체 성분 (a) 및 고체 성분 (b)를 적어도 하나의 용매와 접촉시키기 전에, 고체 성분 (a)에 첨가될 수 있다. 적어도 하나의 용매는 위에 개시되어 있다. 적어도 하나의 용매와의 접촉은 적어도 하나의 분자 성분 (a) 및 적어도 하나의 분자 성분 (b)의 가용화를 초래하여, 적어도 하나의 분자 성분 (b)의 안정화가 얻어지게 할 수 있다. 한 구현예에서, 고체 성분 (a) 및 (b)는 상 분리 없이 적어도 하나의 용매에 완전히 용해된다.
고체 성분 (a)는 고체 또는 액체 성분 (b)와 혼합시키기 전에 적어도 하나의 용매에 용해될 수 있다. 한 구현예에서, 성분 (a)는 성분 (b)와 혼합시키기 전에 적어도 하나의 용매에 완전히 용해된다. 적어도 하나의 용매는 위에 개시되어 있다.
성분 (b)는 액체일 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 효소는 위에 개시된 액체 효소 농축물에 포함될 수 있다. 액체 성분 (b)에는 고체 성분 (a)가 보충될 수 있으며, 여기서 고체 성분 (a)가 액체 성분 (b)에 용해된다. 한 구현예에서, 액체 성분 (b)는 바람직하게는 발효로부터 비롯되는 수성이다.
한 구현예에서, 위에 개시된 성분 (c)는 성분 (a) 및 (b)와 혼합되며, 여기서 혼합은 하나 이상의 단계로 수행된다는 점에서 특성규명된다.
효소 안정화
본 발명은 성분 (a)를 추가하는 단계에 의해 성분 (b)를 안정시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 성분 (a) 및 (b)는 위에 개시된 것들이다, 한 구현예에서, 성분 (b)는 액체이다. 한 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 계면활성제의 존재 하에 성분 (a)를 첨가하는 단계에 의해 성분 (b)를 안정시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 성분 (a) 및 (b), 및 적어도 하나의 계면활성제는 위에 개시된 것들이다. 한 구현예에서, 본 발명은 성분 (a)를 첨가하는 단계에 의해 성분 (b)를 안정시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 성분 (b)는 적어도 하나의 리파아제 및 적어도 하나의 프로테아제를 포함한다.
본 발명은 추가로, 위에 개시된 성분 (a) 및 (b)를 하나 이상의 단계에서 어떠한 특정된 순서 없이 혼합시키는 것을 포함하는, 액체 제형 중에서 적어도 하나의 효소를 안정시키는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 액체 제형은 세제 제형이다.
본 발명은 성분 (b)에 대한, 첨가제로서의 성분 (a)의 용도에 관한 것이다. 한 구현예에서, 성분 (a) 및 (b)는 고체이고, 성분 (b)는 고체 성분 (a)와 (b)의 혼합물을 적어도 하나의 용매와 접촉시킬 때 안정된다. 적어도 하나의 용매는 위에 개시되어 있다. 적어도 하나의 용매와의 접촉으로 적어도 하나의 분자 성분 (a) 및 적어도 하나의 분자 성분 (b)의 가용화가 초래되어, 적어도 하나의 분자 성분 (b)의 안정화가 얻어질 수 있다. 한 구현예에서, 고체 성분 (a) 및 (b)는 상 분리 없이 적어도 하나의 용매에 완전히 용해된다.
효소의 안정화는 시간 경과에 따른 안정성 (예를 들어, 보관 안정성), 열 안정성, pH 안정성, 및 화학적 안정성에 관련될 수 있다. 본 명세서에서의 용어 "효소 안정성"은 바람직하게는 시간의 함수로서의, 예를 들어, 보관 또는 작업 동안의 효소 활성도의 보유에 관한 것이다. 본 명세서에서의 용어 "보관"은, 제품 또는 조성물이 제조되는 시간에서부터 최종 적용에서 사용되는 시점까지 보관되는 사실을 나타냄을 의미한다. 보관 동안 시간의 함수로서 효소 활성도의 보유는 "보관 안정성"으로 불린다.
시간 경과에 따른 효소 활성에서의 변화를 측정하기 위해, 효소의 "초기 효소 활성"은 규정된 조건 하에 0 시간 (즉, 보관 전)에서 측정될 수 있고, "보관 후 효소 활성"은 나중의 특정 시점 (즉, 보관 후)에서 측정될 수 있다.
보관 후 효소 활성도를 초기 효소 활성도로 나누어 100을 곱하면 "적용시 이용가능한 효소 활성도" (a%)가 얻어진다.
효소는, "적용시 이용가능한" 이것의 효소 활성도가 보관 전 초기 효소 활성도와 비교하여 100%일 때 본 발명에 따라 안정하다. 효소는, 이것의 적용시 이용가능한 효소 활성도가 보관 전 초기 효소 활성도와 비교하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이면 본 발명 내에서 안정하다 불릴 수 있다.
한 구현예에서, 30일 동안 37℃에서 보관 후 이용가능한 지방분해 활성도는 보관 전 초기 지방분해 활성도와 비교하여 적어도 60%이다.
100%에서 a%를 빼면 보관 전 초기 효소 활성도와 비교하여 "보관 동안 효소 활성도의 손실"이 얻어진다. 한 구현예에서, 효소는 보관 동안 본질적으로 효소 활성도의 손실이 없으면, 즉 보관 전 초기 효소 활성도와 비교하여 효소 활성도에서의 손실이 0%일 때 본 발명에 따라 안정하다. 본질적으로 본 발명 내에서 효소 활성도의 손실없음은, 효소 활성도의 손실이 보관 전 초기 효소 활성도와 비교하여 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만임을 의미할 수 있다.
한 구현예에서, 30일 동안 37℃에서 보관 후 지방분해 활성도의 손실은 보관 전 초기 지방분해 활성도와 비교하여 40% 미만이다.
본 발명의 한 측면에서, 성분 (a)는 액체 효소 농축물 중에 포함된 적어도 하나의 효소의 보관 동안 효소 활성도의 손실을 감소시키는데 사용된다. 본 발명 내에서 효소 활성도의 감소된 손실은, 효소 활성도의 손실이 보관 전 초기 효소 활성도와 비교하여 적어도 5%까지, 적어도 10%까지, 적어도 15%까지, 적어도 20%까지, 적어도 25%까지, 적어도 30%까지, 적어도 40%까지, 적어도 50%까지, 적어도 60%까지, 적어도 65%까지, 적어도 70%까지, 적어도 75%까지, 적어도 80%까지, 적어도 85%까지, 적어도 90%까지, 적어도 91%까지, 적어도 92%까지, 적어도 93%까지, 적어도 94%까지, 적어도 95%까지, 적어도 96%까지, 적어도 97%까지, 적어도 98%까지, 적어도 99%까지, 또는 적어도 99.5%까지 감소됨을 의미할 수 있다.
한 구현예에서, 30일 동안 37℃에서 보관 후 지방분해 활성도의 손실은, 성분 (a)에 의해, 보관 전 초기 지방분해 활성도와 비교하여 적어도 60%까지 감소된다.
한 구현예에서, 30일 동안 37℃에서 보관 후 지방분해 활성도의 손실은, 성분 (a)에 의해, 보관 전 초기 지방분해 활성도와 비교하여 적어도 20%까지 감소된다.
효소 억제제에 의해 억제된 효소는 상기 효소의 억제되지 않은 효소 활성도와 비교하여 보통 감소된 효소 활성도를 나타낸다. 효소 억제제를 첨가한 후에 측정된 효소 활성도를 초기 효소 활성도로 나누고 100을 곱하면 이것은 본 명세서에서 "잔여 효소 활성도" (b%)로 불릴 수 있다. 효소는, 이것이 보관 전 초기 효소 활성과 비교하여 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만인 잔여 효소 활성도 (b%)를 나타낼 때, 본 명세서에서 "안정된" 것으로 불릴 수 있다. 효소는, 억제제를 방출한 후 이것의 적용시 이용가능한 효소 활성도가 보관 전 초기 효소 활성도와 비교하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%이면, 안정된 것으로 불릴 수 있다. 억제제는 본 명세서에서 "효소 안정제"로 불릴 수 있다.
제형화 공정에 대한 효소 제제의 용도
본 발명은 한 측면에서 세제 제형으로 제형화되는 본 발명의 액체 효소 제제의 용도에 관한 것으로서, 여기서 성분 (a)와 (b)가 하나 이상의 단계에서 특정된 순서 없이 하나 이상의 세제 성분과 혼합된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 액체 효소 제제 및 하나 이상의 세제 성분을 함유하는 세제 제형에 관한 것이다.
세제 성분은 원하는 적용, 예컨대 세탁되는 흰색 직물, 착색된 직물, 및 모직물에 따라 세제 제형 내 양 및/또는 유형에서 가변된다. 선택된 성분(들)은 세제 제형의 물리적 형태 (파우치로 또는 정제 등으로서 제공된 액체, 고체, 겔)에 추가로 의존한다. 예를 들어, 세탁용 제형으로 선택된 성분(들)은, 이들 자체가 사용된 세탁 온도, 세탁기 (수직 vs. 수평 축 기계)의 역학(mechanics), 세탁 주기 당 물 소비 등, 및 지리학적 특징, 예컨대 물의 평균 경도와 같은 측면에 관련되는 지역적인 협약(convention)에 추가로 의존한다.
세제 제형에서 개별 세제 성분 및 사용은 당해 분야에서의 숙련가에게 공지되어 있다. 적합한 세제 성분은 그 중에서도 계면활성제, 빌더(builder), 폴리머, 알칼리성물질, 표백 시스템, 형광 증백제, 비누거품 억제제 및 안정제, 하이드로트로프(hydrotrope), 및 부식 억제제를 포함한다. 추가 예는 예를 들어, [ "complete Technology Book on Detergents with Formulations (Detergent Cake, Dishwashing Detergents, Liquid & Paste Detergents, Enzyme Detergents, Cleaning Powder & Spray Dried Washing Powder)" Engineers India Research Institute (EIRI), 6th edition (2015)]에 기재되어 있다. 당해 기술 분야에서의 숙련가를 위한 또 다른 참고용 도서는 ["Detergent Formulations Encyclopedia", Solverchem Publications, 2016]일 수 있다.
세제 성분이 본 발명의 효소 제제에 포함된 성분에 추가하여 존재함이 이해된다. 본 발명의 효소 제제에 포함된 성분이 또한 세제 성분이면, 상기 성분은 세제 제형에서 원하는 목적에 대하여 효과적이도록 조절될 필요가 있는 농도일지도 모른다.
세제 성분은 세제 제형의 최종 적용에서 하나 초과의 기능을 가질 수 있고, 따라서 본 명세서에서 특정 기능의 맥락에서 언급된 임의의 세제 성분은 또한 세제 제형의 최종 적용에서 또 다른 기능을 가질 수 있다. 세제 제형의 최종 적용에서 특정 세제 성분의 기능은 보통 세제 제형 내 이것의 양, 즉, 세제 성분의 유효량에 의존한다.
용어 "유효량"은, 효과적인 얼룩 제거 및/또는 효과적인 세정 조건 (예를 들어, pH, 거품의 양)을 제공하는 개별 성분의 양, 광학적 이점 (예를 들어, 광학적 증백, 이염 억제)을 효과적으로 제공하는 특정 성분의 양, 및/또는 가공을 효과적으로 돕는 (가공, 보관 및 사용 동안 물리적 특징을 유지하는) 특정 성분 (예를 들어, 유변학 개질제, 하이드로트로프, 건조제)의 양을 포함한다.
한 구현예에서, 세제 제형은 둘 초과 세제 성분의 제형이며, 여기서 적어도 하나의 성분은 얼룩 제거에 효과적이고, 적어도 하나의 성분은 최적의 세정 조건을 제공하는데 효과적이며, 적어도 하나의 성분은 세제의 물리적 특징을 유지하는데 효과적이다.
본 발명의 세제 제형은 용매 중에 용해될 성분 (a) 및 성분 (b)를 포함할 수 있다. "용해된"은, 전체 세제 제형 중에 용해되는 것을 의미할 수 있다. "용해된"은, 성분 (a) 및 성분 (b)가 캡슐화될 수 있는 본 발명의 액체 효소 제제의 일부임을 의미할 수 있다. 캡슐화된 액체 효소 제제는 액체 세제 제형의 일부 또는 고체 세제 제형의 일부일 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 세제 제형은 모두 액체 세제 제형의 총 중량에 대하여 0.5 내지 20중량%, 특히 1 내지 10중량%의 성분 (b), 및 0.01 내지 10중량%, 더욱 특히 0.05 내지 5중량% 및 가장 특히 0.1 내지 2중량%의 성분 (a)를 함유한다.
본 발명의 세제 제형은 빌더, 폴리머, 방향제 및 염료로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 성분 (a)는 원하는 빌더 기능을 제공하기에 효과적인 양으로 세제 제형에서 빌더로 사용된다. 성분 (a)를 빌더로 사용하면 많은 또는 적은 물 함량을 갖는 유연한 세제 제형이 허용된다. 적은 물 함량을 갖는 액체 세제 제형에 대해서는, 성분 (a) 이외에 어떠한 추가의 빌더 물질도 사용될 수 없다. 본 명세서에서의 적은 물 함량은, 모두 세제 제형의 총 중량에 대하여 적어도 ≤ 30중량%, 적어도 ≤ 20중량%, 적어도 ≤ 10중량%, 또는 적어도 ≤ 5중량%를 의미할 수 있다.
한 구현예에서, 세제 제형은 성분 (a)와 상이한 하나 이상의 빌더를 함유할 수 있다.
본 발명의 세제 제형은 1 내지 40중량%의, 성분 (a)와 상이한 세제 빌더, 예컨대, 비제한적으로 제올라이트, 포스페이트, 포스포네이트, 시트레이트, 폴리머 빌더, 또는 아미노카복실레이트, 예컨대 이미노디석시네이트의 알칼리 금속 염, 예를 들어 IDS-Na4, 더욱이 니트릴로트리아세트산 ("NTA"), 메틸글리신 디아세트산 ("MGDA"), 글루탐산 디아세트산 ("GLDA"), 에틸렌 디아민 테트라아세트산 ("EDTA") 또는 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 ("DTPA")을 함유할 수 있다. 바람직한 알칼리 금속 염은 칼륨 염 및 특히 나트륨 염이다.
세제 빌더의 추가 예는, N-원자의 20 내지 90몰%가 적어도 하나의 CH2COO- 기 및 상기 격리제의 각각의 알칼리 금속 염, 특히 이들의 나트륨 염을 함유하는, 예를 들어, 폴리에틸렌이민과 같은, 착물형성 기(complexing group)를 갖는 폴리머이다.
적합한 폴리머의 추가 예는 폴리알킬렌이민, 예를 들어 폴리에틸렌이민 및 폴리프로필렌 이민이다. 폴리알킬렌이민은 그 자체로 또는 폴리알콕실화, 예를 들어, 에톡실화 또는 프로폭실화 유도체로 사용될 수 있다. 폴리알킬렌이민은 분자 당 적어도 3개의 알킬렌이민 단위를 함유한다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 알킬렌이민 단위는 C2-C10-알킬렌디아민 단위, 예를 들어, 1,2-프로필렌디아민, 바람직하게는 α,ω-C2-C10-알킬렌디아민, 예를 들어 1,2-에틸렌디아민, 1,3-프로필렌디아민, 1,4-부틸렌디아민, 1,5-펜틸렌디아민, 1,6-헥산디아민 (이것은 또한 1,6-헥실렌디아민으로 지칭됨), 1,8-디아민 또는 1,10-데칸디아민이고, 훨씬 더 바람직하게는 1,2-에틸렌디아민, 1,3-프로필렌디아민, 1,4-부틸렌디아민, 및 1,6-헥산디아민이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 폴리알킬렌이민은 폴리알킬렌이민 단위, 바람직하게는 폴리에틸렌이민 또는 폴리프로필렌이민 단위로부터 선택된다.
본 발명의 맥락에서 용어 "폴리에틸렌이민"은 폴리에틸렌이민 호모폴리머 뿐만 아니라, 다른 알킬렌 디아민 구조 요소, 예를 들어 NH-CH2-CH2-CH2-NH 구조 요소, NH-CH2-CH(CH3)-NH 구조 요소, NH-(CH2)4-NH 구조 요소, NH-(CH2)6-NH 구조 요소 또는 (NH-(CH2)8-NH 구조 요소와 함께 NH-CH2-CH2-NH 구조 요소를 함유하는 폴리알킬렌이민을 지칭하지만, 상기 NH-CH2-CH2-NH 구조 요소는 몰 량(molar share)에 대해서는 다량으로 존재한다. 바람직한 폴리에틸렌이민은, 몰 량에 대해서는 다량으로 존재하는, 예를 들어, 모든 알킬렌이민 구조 요소를 기준으로 60몰% 이상에 이르는, 더욱 바람직하게는 적어도 70몰%에 이르는 NH-CH2-CH2-NH 구조 요소를 함유한다. 특별한 구현예에서, 용어 폴리에틸렌이민은 NH-CH2-CH2-NH와 상이한, 폴리에틸렌이민 단위 당 단 하나 또는 0개의 알킬렌이민 구조 요소를 함유하는 그러한 폴리알킬렌이민을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "폴리프로필렌이민"은 폴리프로필렌이민 호모폴리머 뿐만 아니라, 다른 알킬렌 디아민 구조 요소, 예를 들어 NH-CH2-CH2-CH2-NH 구조 요소, NH-CH2-CH2-NH 구조 요소, NH-(CH2)4-NH 구조 요소, NH-(CH2)6-NH 구조 요소 또는 (NH-(CH2)8-NH 구조 요소와 함께 NH-CH2-CH(CH3)-NH 구조 요소를 함유하는 폴리알킬렌이민을 지칭하지만, 상기 NH-CH2-CH(CH3)-NH 구조 요소는 몰 량에 대하여 다량으로 존재한다. 바람직한 폴리프로필렌이민은 몰 양에 대하여 다량으로 존재하는, 예를 들어, 모든 알킬렌이민 구조 요소를 기준으로 60몰% 이상에 이르는, 더욱 바람직하게는 적어도 70몰%에 이르는 NH-CH2-CH(CH3)-NH 구조 요소를 함유한다. 특별한 구현예에서, 용어 폴리프로필렌이민은 NH-CH2-CH(CH3)-NH와 상이한, 폴리프로필렌이민 단위 당 단 하나 또는 0개의 알킬렌이민 구조 요소를 함유하는 그러한 폴리알킬렌이민을 지칭한다.
분지는 알킬렌아미노 기, 예컨대, 비제한적으로 -CH2-CH2-NH2 기 또는 (CH2)3-NH2- 기일 수 있다. 더욱 긴 분지는, 예를 들어, -(CH2)3-N(CH2CH2CH2NH2)2 또는 -(CH2)2-N(CH2CH2NH2)2 기일 수 있다. 고도로 분지된 폴리에틸렌이민은 예를 들어, 0.25 내지 0.95 범위의, 바람직하게는 0.30 내지 0.80 범위의 그리고 특히 바람직하게는 적어도 0.5의 분지도를 갖는 폴리에틸렌이민 덴드리머(dendrimer) 또는 관련된 분자이다. 분지도는 예를 들어, 13C-NMR 또는 15N-NMR 분광법에 의해, 바람직하게는 D2O으로 측정될 수 있으며, 이는 다음과 같이 정의된다:
DB = D+T/D+T+L
여기서, D (수지상)는 3차 아미노 기 분율에 상응하며, L (선형)은 2차 아미노기 분율에 상응하며, T (말단)는 1차 아미노 기의 분율에 상응한다.
본 발명의 맥락 내에서, 분지형 폴리에틸렌이민 단위는 DB가 0.25 내지 0.95의 범위, 특히 바람직하게는 0.30 내지 0.90의 범위 그리고 매우 특히 바람직하게는 적어도 0.5인 폴리에틸렌이민 단위이다. 바람직한 폴리에틸렌이민 단위는 분지를 거의 또는 전혀 나타내지 않는 것들, 따라서 주로 선형 또는 선형 폴리에틸렌이민 단위이다.
본 발명의 맥락에서, CH3-기는 분지로 간주되지 않는다.
본 발명의 한 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 1 내지 1000 mg KOH/g, 바람직하게는 10 내지 500 mg KOH/g, 가장 바람직하게는 50 내지 300 mg KOH/g 범위의 1차 아민 값을 가질 수 있다. 1차 아민 값은 ASTM D2074-07에 따라 측정될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 10 내지 1000 mg KOH/g, 바람직하게는 50 내지 500 mg KOH/g, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg KOH/g 범위의 2차 아민 값을 가질 수 있다. 2차 아민 값은 ASTM D2074-07에 따라 측정될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 1 내지 300 mg KOH/g, 바람직하게는 5 내지 200 mg KOH/g, 가장 바람직하게는 10 내지 100 mg KOH/g 범위의 3차 아민 값을 가질 수 있다. 3차 아민 값은 ASTM D2074-07에 따라 측정될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 3차 N 원자의 몰 량은 15N-NMR 분광법에 의해 측정된다. 13C-NMR 분광법에 따른 3차 아민 값 및 결과가 일관되지 않는 경우에, 13C-NMR 분광법에 의해 얻어진 결과가 바람직할 것이다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 폴리알킬렌이민의 평균 분자량 Mw은 250 내지 100,000 g/mol의 범위, 바람직하게는 최대 50,000 g/mol 및 더욱 바람직하게는 800 내지 25,000 g/mol이다. 폴리알킬렌이민의 평균 분자량 Mw는 용리제로 1.5중량% 수성 포름산 및 정지 상으로 가교결합된 폴리-하이드록시에틸 메타크릴레이트를 사용하여 중간체인 각각의 폴리알킬렌이민의 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 측정될 수 있다.
상기 폴리알킬렌이민은 유리 또는 알콕실화될 수 있고, 상기 알콕실화는 에톡실화, 프로폭실화, 부톡실화 및 전술된 것들의 적어도 2개의 조합으로부터 선택된다. 에틸렌 옥사이드, 1,2-프로필렌 옥사이드, 및 에틸렌 옥사이드와 1,2-프로필렌 옥사이드의 혼합물이 바람직하다. 적어도 2개의 알킬렌 옥사이드의 혼합물이 적용되면, 이들은 단계적으로 또는 동시에 반응될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 알콕실화 폴리알킬렌이민은 단위 당 적어도 6개의 질소 원자를 함유한다.
본 발명의 한 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 NH 기 당 2 내지 50몰의 알킬렌 옥사이드, 바람직하게는 NH 기 당 5 내지 30몰의 알킬렌 옥사이드, 훨씬 더 바람직하게는 NH 기 당 5 내지 25몰의 에틸렌 옥사이드 또는 1,2-프로필렌 옥사이드 또는 NH 기 당 이들로부터의 조합체로 알콕실화된다. 본 발명의 맥락에서, NH2 단위는 2개의 NH 기로 계수된다. 바람직하게는, 모든 - 또는 거의 모든 - NH 기가 알콕실화되며, 검출가능한 양의 NH 기는 남아있지 않다.
그와 같은 알콕실화 폴리알킬렌이민의 제조에 따라, 분자량 분포는 좁거나 넓을 수 있다. 예를 들어, 다분산도 Q = Mw/Mn는 1 내지 3의 범위, 바람직하게는 적어도 2이거나, 이것은 3 초과 20 이하, 예를 들어 3.5 내지 15 및 훨씬 더 바람직하게는 4 내지 5.5의 범위일 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 알콕실화 폴리알킬렌이민의 다분산도 Q는 2 내지 10의 범위이다.
본 발명의 한 구현예에서, 알콕실화 폴리알킬렌이민은 폴리-에톡실화 폴리에틸렌이민, 에톡실화 폴리프로필렌이민, 에톡실화 α,ω-헥산디아민, 에톡실화 및 프로폭실화 폴리에틸렌이민, 에톡실화 및 프로폭실화 폴리프로필렌이민, 및 에톡실화 및 폴리-프로폭실화 α,ω-헥산디아민으로부터 선택된다.
본 발명의 한 구현예에서, GPC로 측정된 알콕실화 폴리에틸렌이민의 평균 분자량 Mn (수 평균)은 2,500 내지 1,500,000 g/mol의 범위, 바람직하게는 최대 500,000 g/mol이다.
본 발명의 한 구현예에서, 평균의 알콕실화 폴리알킬렌이민은 에톡실화 α,ω-헥산디아민, 및 에톡실화 및 폴리-프로폭실화 α,ω-헥산디아민으로부터 선택되며, 각각은 800 내지 500,000 g/mol 범위의 평균 분자량 Mn (수 평균)을 갖는다.
완충제의 예는 모노에탄올아민 및 N,N,N-트리에탄올아민이다.
소포제의 예는 실리콘이다.
방향제의 예는 벤질 살리실레이트, Lilial®로 상업적으로 입수가능한 2-(4-tert-부틸페닐) 2-메틸프로피온알, 및 헥실 신남알데하이드이다.
염료의 예는 애씨드 블루 9, 애씨드 옐로우 3, 애씨드 옐로우 23, 애씨드 옐로우 73, 피그먼트 옐로우 101, 애씨드 그린 1, 솔벤트 그린 7, 및 애씨드 그린 25이다.
액체 세제 제형은 유기 용매, 보존제, 점도 조절제, 및 하이드로트로프로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 액체 세제 제형은 이 액체 세제 제형의 총 중량에 대하여 0.5 내지 25중량% 양의 유기 용매를 함유한다. 특히 본 발명의 액체 세제 제형이 파우치 등으로 제공되면, 액체 세제 제형의 총 중량에 대하여 8 내지 25중량%의 유기 용매(들)가 함유될 수 있다. 유기 용매는 위에 개시된 것들이다.
본 발명의 액체 세제 제형은 액체 세제 제형의 미생물 오염을 회피하기에 효과적인 양으로 위에 개시된 것들로부터 선택된 하나 이상의 보존제를 함유할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 액체 세제 제형은 하나 이상의 점도 조절제를 함유한다. 적합한 점도 조절제의 비제한적인 예는 한천-한천, 카라긴, 트라가칸쓰, 아라비아 고무, 알기네이트, 펙틴, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 전분, 젤라틴, 로커스트 콩 고무, 가교결합된 폴리(메트)아크릴레이트, 예를 들어, 비스-(메트)아크릴아미드로 가교결합된 폴리아크릴산, 더욱이 규산, 점토, 예컨대 - 비제한적으로 - 몬트모릴로나이트, 제올라이트, 덱스트린, 및 카제인을 포함한다. 점도 조절제는 원하는 점도를 제공하기에 효과적인 양으로 함유될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 액체 세제 제형은 유기 용매, 예컨대 에탄올, 이소프로판올, 에틸렌 글리콜, 1,2-프로필렌 글리콜, 및 제한없이 정상적인 조건 하에서 물과 혼화성인 추가의 유기 용매일 수 있는 하나 이상의 하이드로트로프를 함유한다. 적합한 하이드로트로프의 추가 예는 톨루엔 설폰산의, 자일렌 설폰산의, 그리고 쿠멘 설폰산의 나트륨 염이다. 하이드로트로프는 물에서 제한된 용해도를 나타내는 화합물의 용해를 촉진시키거나 가능케 하는 양으로 함유될 수 있다.
본 명세서에서 "세제 제형" 또는 "세정 제형"은 고체 재료를 세정시키도록 지정된 제형을 의미한다. 세정은 세탁 및 경질 표면 세정을 포함한다. 본 발명에 따른 오염된 재료는 직물 및/또는 경질 표면을 포함한다.
용어 "세탁"은 가정용 세탁 및 산업용 세탁 둘 모두에 관한 것이며, 본 발명의 세제 제형을 함유하는 용액으로 직물을 처리하는 과정을 의미한다. 세탁 과정은 기술 장치, 예컨대 가정용 또는 산업용 세탁기를 사용함에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 세탁 과정은 수작업으로 수행될 수 있다.
용어 "직물"은 원사(yarn) (편직 또는 직조에 사용된 천연 또는 합성 섬유로 만들어진 실(thread)), 원사 중간체, 섬유, 비-직조된 재료, 천연 재료, 합성 재료 뿐만 아니라, 이러한 재료로 만들어진 패브릭 (섬유를 직조, 편직 또는 펠트화시켜서 만들어진 직물), 예컨대 의복 (직물로 만들어진 의류의 임의 품목), 천(cloth) 및 다른 품목을 포함한 임의의 직물 재료를 의미한다.
용어 "섬유"는 천연 섬유, 합성 섬유, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 천연 섬유의 예는 식물 (예컨대, 아마, 황마 및 면), 또는 단백질, 예컨대 콜라겐, 케라틴 및 피브로인 (예를 들어, 실크, 양모, 앙고라, 모헤어, 캐시미어)을 포함한 동물 기원의 것이다. 합성 기원의 섬유의 예는 폴리우레탄 섬유, 예컨대 Spandex® 또는 Lycra®, 폴리에스테르 섬유, 폴리올레핀, 예컨대 엘라스토핀, 또는 폴리아미드 섬유, 예컨대 나일론이다. 섬유는 단 섬유 또는 직물, 예컨대 니트웨어, 직조물, 또는 비직조물의 일부일 수 있다.
용어 "경질 표면 세정"은, 경질 표면이 가정 내 임의의 경질 표면, 예컨대 마루, 가구, 벽, 위생 도기(sanitary ceramics), 유리, 커트러리를 포함한 금속성 표면 또는 접시를 포함할 수 있는 경질 표면의 세정으로 본 명세서에서 정의된다.
용어 "설거지"는 예를 들어, 수작업 또는 자동 식기 세척에 의한 모든 형태의 접시 세정을 지칭한다. 설거지는 비제한적으로 모든 형태의 도자기, 예컨대 접시, 컵, 유리잔, 사발(bowl), 모든 형태의 커트러리, 예컨대 숟가락, 나이프, 포크 및 서빙 기구 뿐만 아니라, 도기, 플라스틱, 예컨대 멜라민, 금속, 자기, 유리 및 아크릴제품의 세정을 포함한다.
추가 용도
본 발명은 성분 (a) 및 (b), 및 하나 이상의 세제 성분을 포함하는 세제 제형과 얼룩을 접촉시키는 단계를 포함하는, 얼룩 제거 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 세제 제형은 본 발명의 효소 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 지방질을 포함하는 얼룩 제거에 관한 것이다.
지방질은 용융 온도에 따라 지방, 그리스(grease) 또는 오일로 하위 분류될 수 있다. 오일은 실온에서 보통 액체이다. 그리스는 실온에서 오일보다 높은 점도를 가지며 페이스티(pasty)로 불릴 수 있다.
한 구현예에서, 지방질을 포함한 얼룩의 제거는 온도 ≤ 40℃에서 수행되며, 특히 온도 ≤ 30℃에서 수행된다.
실시예
본 발명은 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다.
일반적 설명: 백분율은 특별히 반대로 언급되지 않는 한 중량 백분율이다.
아세틸콜린 (A.12)은 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 반대이온은 클로라이드였다.
(A.14)의 전구물질은, 트리메틸아민의 에톡실화에서 HCl을 사용하는 대신 또는 콜린 하이드로젠카보네이트와 메탄설포네이트의 반응을 통하여 직접 생산될 수 있다 (문헌[Constantinescu et al in Chem. Eng. Data, 2007, 52 1280-1285] 참고).
I. 염 (성분 (a))의 합성
증류된 물의 양을 기반으로 그리고 IR 분광법에 의해, 에스테르화 반응이 완료되었음을 확인할 수 있었다.
90% 메탄설폰산은 10% 물과 90% 메탄설폰산의 혼합물을 지칭한다.
I.1 본 발명의 염 (A.1)의 합성:
225 g (1.5 몰) 양의 타르타르산을 콜린 클로라이드 (1.5 몰)의 75중량% 수용액 280 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조(bath) 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 수성 메탄설폰산 15 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 200 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 617 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 7.8 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.1)을 얻었다.
I.2 본 발명의 염 (A.2)의 합성:
150 g 양의 타르타르산 (1.0 몰)을 콜린 클로라이드 (2.0 몰)의 75중량% 수용액 374 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 15 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 200 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 607 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 8.7 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.2)을 얻었다.
I.3 본 발명의 염 (A.3)의 합성:
210 g 양의 시트르산 일수화물 (1.0 몰)을 콜린 클로라이드 (2.0 몰)의 75중량% 수용액 374 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 18 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 200 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 607 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 10.3 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.3)을 얻었다.
I.4 본 발명의 염 (A.4)의 합성:
210 g 양의 시트르산 일수화물 (1.0 몰)을 콜린 클로라이드 (3.0 몰)의 75중량% 수용액 561 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 18 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 270 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 868 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 9.6 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.4)을 얻었다.
I.5 본 발명의 염 (A.5)의 합성:
210 g 양의 시트르산 일수화물 (1.0 몰)을 콜린 메탄설포네이트 (2.0 몰)의 75중량% 수용액 485 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 18 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 200 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 663 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 12.5 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.5)을 얻었다.
I.6 본 발명의 염 (A.6)의 합성:
98.1 g 양의 말레산 무수물 (1.0 몰)을 건조 물질인 콜린 메탄설포네이트 (2.0 몰) 363 g과 혼합시켰다. 상기 혼합물을 회전식 증발기에서 135℃로 가열하였다. 1시간의 혼합 후에, 12 g 양의 메탄설폰산 (순수)을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 혼합 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 200 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 653 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 8.9 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.6)을 얻었다.
I.7 본 발명의 염 (A.7)의 합성:
210 g 양의 시트르산 일수화물 (1.0 몰)을 베타-메틸 콜린 클로라이드 (HO-CH(CH3)-CH2-N(CH3)3Cl, 2.0몰)의 70중량% 수용액 437 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 18 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 200 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 676 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 12.3 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.7)을 얻었다.
I.8 본 발명의 염 (A.8)의 합성:
105 g 양의 시트르산 일수화물 (0.5 몰)을 베타-메틸 콜린 클로라이드 (1.5 몰)의 70중량% 수용액 327 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 13 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 170 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 471 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 21.7 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.8)을 얻었다.
I.9 본 발명의 염 (A.9)의 합성:
210 g 양의 시트르산 일수화물 (1.0 몰)을 베타-n-프로필 콜린 클로라이드 (2.0 몰)의 70중량% 수용액 520 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 18 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 250 g 프로필렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 774 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 11.9 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.9)을 얻었다.
I.10 본 발명의 염 (A.10)의 합성:
210 g 양의 시트르산 일수화물 (1.0 몰)을 디메틸모노부틸콜린 클로라이드 (2.0 몰)의 70중량% 수용액 520 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 45분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 18 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 200 g 프로필렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 788 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 11.4 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.10)을 얻었다.
I.11 본 발명의 염 (A.11)의 합성:
105 g 양의 시트르산 일수화물 (0.5 몰)을 디메틸 n-옥틸콜린 클로라이드 (1.0 몰)의 60중량% 수용액 397 g에 용해시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 90분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 9.5 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 200 g 프로필렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 470 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 200 g의 액체를 8.9 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.11)을 얻었다.
I.13 본 발명의 염 (A.13)의 합성:
85 g 양의 갈산 (3,4,5-트리하이드록시벤조산, 0.5 몰)을 콜린 메탄설포네이트 (0.5 몰)의 75중량% 수용액 121 g에 분산시켰다. 물을 회전식 증발기 (2L 플라스크)에서 90분 이내에 제거하였다 - 100 내지 120℃의 오일 조 온도, 50 내지 80 mbar. 90중량% 메탄설폰산 8 g의 양을 첨가하였고, 800 mbar의 압력에서 온도를 145℃로 증가시켰다. 1시간의 회전 증발 후에, 물을 145℃에서 다른 4.5 h 동안 제거하면서 압력을 10 mbar로 계속해서 감소시켰다. 100 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 연황색 물질을 얻었다. 271 g 양의 황색을 띤 액체를 얻었다. 이렇게 얻은 분취량의 100 g의 액체를 4.6 g 에탄올아민을 사용하여 6 내지 6.5의 pH 값으로 중화시켰다 (수 중 10%). 본 발명의 염 (A.13)을 얻었다.
비교예의 염:
C-(A.15): 콜린 클로라이드, 75중량% 수용액, BASF SE로부터 상업적으로 입수가능함.
C-(A.16): 75 g (0.5 mol) 양의 타르타르산을 콜린 비카보네이트 (1.0 mol)의 80중량% 수용액 206 g에 부분적으로 용해시켰다 (15 g 단위). CO2 방출이 중단되었을 때까지 상기 용액을 교반하였다. 물을 90분 이내에 회전 증발 (2L 플라스크)로 제거하였다- 120℃의 오일 조 온도, 10 mbar. 150 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 투명 물질을 얻었다. 390 g의 투명 용액을 얻었다, C-(A.16). 에스테르 형성이 검출될 수 없었다.
C-(A.17): 105 g (0.5 mol) 양의 시트르산 일수화물을 콜린 비카보네이트 (1.0 mol)의 80중량% 수용액 206 g에 부분적으로 용해시켰다 (20 g 단위). CO2 방출이 중단되었을 때까지 상기 용액을 교반하였다. 물을 90분 이내에 회전 증발 (2L 플라스크)로 제거하였다 - 120℃의 오일 조 온도, 10 mbar. 150 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 투명 물질을 얻었다. 412 g의 투명 용액을 얻었다, C-(A.17). 에스테르 형성이 검출될 수 없었다.
C-(A.18): 105 g (0.5 mol) 양의 시트르산 일수화물을 콜린 비카보네이트 (1.5 mol)의 80중량% 수용액 309 g에 부분적으로 용해시켰다 (20 g 단위). CO2 방출이 중단되었을 때까지 상기 용액을 교반하였다. 물을 90분 이내에 회전 증발 (2L 플라스크)로 제거하였다 - 120℃의 오일 조 온도, 10 mbar. 150 g 디에틸렌 글리콜로 희석시킨 투명 물질을 얻었다. 497 g의 투명한 점성 용액을 얻었다, C-(A.18). 에스테르 형성이 검출될 수 없었다.
C-(A.19): 시트르산 일수화물
C-(A.20): 시트르산의 일나트륨 염
C-(A.21): 시트르산의 이나트륨 염
C-(A.22): 시트르산의 삼나트륨 염
C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) 및 C-(A.22)는 세제 제형에 사용된 공지된 빌더 화합물이다.
II. 적용 시험
II.1 액체 제형
적은 물 액체 세제 제형에서 물을 글리콜, 예컨대 디에틸렌 글리콜 또는 DPG로 대체하여, 가용성이 필연적으로 얻어진다. 염 (A.1) 내지 (A.11) 및 C-(A.16) 내지 C-(A.18)은 각각 디에틸렌 글리콜 및/또는 디프로필렌 글리콜에 가용성이므로, 이는 물 없이 제형화될 수 있다.
50 g의 C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) 및 C-(A.22)를 각각 100 g 디에틸렌 글리콜과 함께 플라스크에서 합하였고, 교반 하에 30분 동안 100℃에서 가열하였다. 가열원을 제거하였고, 수득되는 흰색 현탁액을 10시간의 기간에 걸쳐 주위 온도로 냉각시켰다. 수득되는 슬러리를 여과하였고 (여과지), 여과 케이크를 50 g 이소프로판올로 2회 세척하였다. 분리한 화합물 C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) 및 C-(A.22)을 중량측정계로 측정하여, 물의 부재 하에서는 C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) 및 C-(A.22)가 불충분한 가용성 때문에 사용될 수 없음이 나타났다. 다음의 양을 여과 케이크로 얻었다: C-(A.19): 44.0 g; C-(A.20): 45.8 g; C-(A.21): 47.2 g; C-(A.22): 48.2 g.
II.2 효소 안정성
물에서 리파아제 및 프로테아제의 보관 안정성을 37℃에서 평가하였다.
다음의 표 1에 따른 성분을 혼합하여 기본 제형 I 내지 VI를 제조함으로써 기본 시험 제형을 제조하였다.
각각의 염 (성분 (a)) 또는 비교예의 화합물을 적용된다면 다음의 표 1에 표시된 양으로 각각의 기본 제형에 첨가하였다.
효소 (성분 (b))를 다음의 표 1에 표시된 양으로 각각의 기본 제형에 첨가하였다. 표 1에 제시된 효소의 양은 활성 단백질을 지칭한다. 어느 효소 활성도가 측정되었는지에 따라, 리파아제 또는 프로테아제를 첨가하였다.
Lipolase® 100L (CAS-No. 9001-62-1, EC-No. 232-619-9)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
Savinase® 16.0L (CAS-No. 9014-01-1, EC-No. 232-752-2)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
100에 대한 잔여량이 달성되도록 물을 첨가하였다.
표 1: 액체 제형
Figure pct00007
(B.1): n-C18-알킬-(OCH2CH2)25-OH
(B.2): C10-C18-알킬폴리글리코사이드 블렌드
(B.3): 나트륨 C10-C12-알킬 벤젠설포네이트
(B.4): 나트륨 쿠멘설포네이트
(B.5): 나트륨 라우레쓰설페이트 -n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na
(B.6): n-C12H25(CH3)2N→O
** 본 발명의 화합물이 없는 비교예의 시험을 위해, 본 발명의 화합물을 동일한 양의 디에틸렌 글리콜로 대체하였다.
리파아제 활성:
다음의 표 2에 기재된, 특정 시점에서의 Lipolase 활성도는 기질로 p니트로페놀-발레레이트 (100 mM Tris pH 8.0 중의 2.4 mM pNP-C5, 0.01% Triton X100)를 사용하여 측정하였다. 흡광도는 405 nm에서 5분에 걸쳐 30초마다 20℃에서 측정하였다. 시간 의존적인 흡광 곡선의 기울기 (흡광도는 분 당 405 nm에서 증가함)는 리파아제의 활성도에 직접 비례한다.
다음의 표 2는 보관; 37℃에서 1-30일 후에 측정된 액체 제형 내 리파아제 활성도를 보여준다. 표 2에 제시된 지방분해 활성도 값은 0 시간에서 기준 제형에서 측정된 100% 값을 기준으로 계산하였다.
제형의 명칭은 다음과 같다: 마침표(full stop) 앞의 로마자는 기본 제형을 특성규명하고, 아라비아 숫자는 염의 유형을 특성규명한다 (A.# 본 발명의 염 (성분 (a)); C-(A.#) 비교예의 화합물). 제로 ("0"): 염은 없지만 디에틸렌 글리콜은 있음.
표 2: 37℃에서 보관 시간 동안 리파아제 활성도
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
프로테아제 활성도:
다음의 표 3에 표시된 특정 지점에서의 Savinase 활성도는 기질로 석시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드 (Suc-AAPF-pNA, 간단히 AAPF)를 사용하여 측정하였다. pNA를 단백질분해성 절단에 의해 기질 분자로부터 절단하여, 유리 pNA의 황색 색상이 방출되게 하였는데, 이것은 OD405에 의해 측정하였다. 측정은 20℃에서 수행하였다.
다음의 표 3은 37℃에서 1 내지 30일 동안 보관한 후에 액체 제형에서 측정된 프로테아제 활성도를 보여준다. 표 3에 제시된 단백질분해 활성도 값은 0 시간에서 기준 제형에서 측정된 100% 값을 기준으로 계산하였다.
제형의 명칭은 다음과 같다: 마침표 앞의 로마자는 기본 제형을 특성규명하고, 아라비아 숫자는 염의 유형을 특성규명한다 (A.# 본 발명의 염 (성분 (a)); C-(A.#) 비교예의 화합물). 제로 ("0"): 염은 없지만 디에틸렌 글리콜은 있음.
표 3: 37℃에서 보관 시간 동안 프로테아제 활성도
Figure pct00011
Figure pct00012
II.3 직물 세정 시험
2개 유형의 시험 패브릭을 세정하는데 있어서 제형의 세제 성능을 수행하였다. 시험되는 천 샘플에 CFT 과정으로 인한 단백질 및 지방질 성분을 함유하는 복합적인 오염을 포함시켰을 뿐만 아니라, 시험 천 샘플에 지방질/미립자 유형의 오염을 함유시켰다.
시험은 다음과 같이 수행하였다: 각각 2.5 x 2.5 cm 크기이고 양면이 폴리에스테르 캐리어에 꿰매어진, 8개의 표준화되고 오염된 패브릭 패치를 포함하는 다중 얼룩 모니터를, 2.5 g의 면 패브릭 및 5 g/L의 액체 시험 세탁용 세제 (표 4)가 담겨있는 launder-O-meter에서 함께 세탁하였다.
조건은 다음과 같았다: 장치: USA, Rock Hill에 소재한 SDL Atlas로부터의 Launder-0-Meter. 세탁액: 250 ml, 세탁 시간: 60분, 세탁 온도: 30℃. 물 경도: 2.5 mmol/L; Ca:Mg:HCO3 4:1:8
패브릭:액체 비 1:12 세탁 주기 후에, 다중 얼룩 모니터를 물에 헹군 다음, 14시간의 기간에 걸쳐 주위 온도에서 건조시켰다.
다음의 사전 오염된 시험 패브릭을 사용하였다:
CFT C-S-10: 면 위에 버터,
CFT C-S-62: 면 위에 돼지기름(lard)으로 착색됨,
CFT C-S-68: 면 위에 초콜렛 아이스크림,
EMPA 112: 면 위에 코코아,
EMPA 141/1: 면 위에 립스틱,
EMPA 125: 텐시드(tensid)에 대한 모니터,
wfk20D: 폴리에스테르/면 혼합된 패브릭 위에 안료 및 피지(sebum) 유형의 지방질,
CFT C-S-70: 초콜렛 무쓰
wfk = wfk test fabrics GmbH, Krefeld
EMPA = Swiss Federal Institute of Materials Testing
CFT = Center for Test Material B.V.
총 세정 수준을 색상 측정을 이용하여 평가하였다. 모니터 위 얼룩의 반사율 값을 460 nm에서 UV 차단 필터를 갖는 구 반사율 분광계 (USA, Datacolor로부터의 SF 500 유형, 파장 범위 360-700nm, 광 기하학 d/8°)를 사용하여 측정하였다. 이 경우에, CIE-Lab 색 공간 분류의 도움으로, 휘도 L*, 적-녹색 축 위에서의 값 a* 및 황-청색 축 위에서의 b* 값을 세탁 전과 후에 측정하였고, 모니터의 8개 얼룩에 대하여 평균화하였다. 색상 값의 변화 (Δ E) 값은 다음의 방정식에 대해 색상 평가 도구에 의해 자동적으로 정의되고 계산되었다:
Δ E = Δ Delta a* 2 + Δ Delta b * 2 + + Δ Delta L * 2,
Δ E는 성취된 세정 효과의 척도이다. 모든 측정은 6회 반복하여 평균 수를 얻었다. 더욱 높은 Δ E 값이 더 나은 세정을 나타냄을 주목한다. 1 단위의 차가 당업자에 의해 검출될 수 있다. 비전문가는 2 단위를 용이하게 검출할 수 있다. 결과가 다음의 표 5에 나타나 있다.
Rw = 세탁된 오염물 반사율
Ro = 오염되지 않은 반사율
빌더로 인한 세정력에서의 증가를 다음과 같이 계산하였다: 이 연구 동안 각각의 천에 대한 총 6회의 반복을 수행하였다; 90-95%의 통계적 신뢰 수준이 계산되었다.
표 4에 따른 성분들을 혼합시켜서 제형 VII 내지 XIII를 제조함으로써 시험 제형을 제조하였다.
각각의 염 (성분 (a)) 또는 비교예의 화합물을, 적용된다면 다음의 표 4에 제시된 양으로 각각의 기본 제형에 첨가하였다.
Lipolase® 100L을, 적용된다면 다음의 표 4에 제시된 양으로 각각의 기본 제형에 첨가하였다.
Savinase® 16.0L을, 적용된다면 다음의 표 4에 제시된 양으로 각각의 기본 제형에 첨가하였다.
100에 대한 잔여량을 성취하도록 물을 첨가하였다.
표 4: 액체 세탁 제형
Figure pct00013
(B.1): n-C18-알킬-(OCH2CH2)25-OH
(B.2): C10-C18-알킬폴리글리코사이드 블렌드
(B.3): 나트륨 C10-C12-알킬 벤젠설포네이트
(B.4): 나트륨 쿠멘설포네이트
(B.5): 나트륨 라우레쓰설페이트 -n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na
(B.6): n-C12H25(CH3)2N→O
** 본 발명의 화합물이 없는 비교예의 시험을 위해, 본 발명의 화합물을 동일한 양의 디에틸렌 글리콜로 대체하였다.
염 (성분 (a))으로 인한 세정력에서의 증가를 다음과 같이 계산하였다: 이 연구 동안 각각의 천의 총 6개의 실시예를 수행하였다; ＞90%의 통계적 신뢰 수준이 계산되었다. 다음의 표 5에는 상기 언급된 다중-얼룩 모니터의 ΔE의 합이 나타나 있다. launder-O-meter 시험은 새로 제조된 제형을 사용하여 그리고 2개월의 보관 기간 동안 37℃에 보관한 상태에서 수행하였다. 37℃에서의 대략 1주일은 20℃에서의 3½주와 같다.
표 5: launder-O-meter 시험 결과
Figure pct00014
Figure pct00015

Claims (14)

  1. 성분 (a): 다음의 일반식 (I)에 따른 적어도 하나의 염:
    (R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
    상기 식에서,
    n은 1 내지 12로부터 선택되고,
    m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
    R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
    R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬 및 페닐로부터 선택되고,
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
    X는 C2-C4-알킬렌이고,
    A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다;
    성분 (b): 가수분해효소 (EC 3)로부터 선택된, 바람직하게는 리파아제 (EC 3.1.1) 및 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)의 군으로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3) 및 서브틸리신 유형의 프로테아제 (EC 3.4.21.62)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소; 및
    선택적으로 성분 (c): 성분 (a)와 상이한 효소 안정제, 보존제, 및 바람직하게는 비이온성, 양쪽성 및 음이온성 계면활성제로부터 선택된 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유하는 액체 효소 제제.
  2. 제1항에 있어서, 성분 (a)가 할라이드, 설페이트, 카보네이트, 타르트레이트, 시트레이트, 락테이트, 및 메탄설포네이트로부터 선택된 반대이온을 갖는 액체 효소 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식 (I)에 따른 화합물에서의 R2가 모두 메틸인 액체 효소 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 제제가 성분 (a)를 효소 제제의 총 중량에 대하여 0.1 내지 30중량% 범위의 양으로 함유하는 액체 효소 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 성분 (a)가 불순물로 다음의 화합물 (a')를 함유하는 액체 효소 제제:
    (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-OH R1-COO- (a')
    상기 식에서, 변수 R1, R2, X, n 및 m은 상응하는 성분 (a)에서와 동일하다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 제제가 성분 (c)를 함유하며, 성분 (c)가 붕소 함유 화합물 및 펩타이드 알데하이드로부터 선택된 적어도 하나의 효소 안정제를 포함하는 액체 효소 제제.
  7. 효소 제제의 제조 방법으로서,
    상기 방법이
    적어도 성분 (a): 다음의 일반식 (I)의 화합물인 적어도 하나의 염:
    (R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
    상기 식에서,
    n은 1 내지 12로부터 선택되고,
    m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
    R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
    R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬, 페닐로부터 선택되고,
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
    X는 C2-C4-알킬렌이고,
    A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다; 및
    성분 (b): 가수분해효소 (EC 3)로부터 선택된, 바람직하게는 리파아제 (EC 3.1.1) 및 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)의 군으로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3) 및 서브틸리신 유형의 프로테아제 (EC 3.4.21.62)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 혼합시키는 단계를 포함하는 효소 제제의 제조 방법.
  8. 다음의 일반식 (I)의 적어도 하나의 염을 첨가하는 단계에 의해, 액체 효소 제제 내에서, 가수분해효소 (EC 3)로부터 선택된, 바람직하게는 리파아제 (EC 3.1.1) 및 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)의 군으로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3) 및 서브틸리신 유형의 프로테아제 (EC 3.4.21.62)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 안정시키는 방법:
    (R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
    상기 식에서,
    n은 1 내지 12로부터 선택되고,
    m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
    R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
    R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬, 페닐로부터 선택되고,
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
    X는 C2-C4-알킬렌이고,
    A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다.
  9. 제8항에 있어서, 효소가 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 및 음이온성 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 계면활성제의 존재 하에 안정되는 적어도 하나의 효소를 안정시키는 방법.
  10. 가수분해효소 (EC 3)로부터 선택된, 바람직하게는 리파아제 (EC 3.1.1) 및 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)의 군으로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3) 및 서브틸리신 유형의 프로테아제 (EC 3.4.21.62)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소에 대한 첨가제로서의, 다음의 일반식 (I)의 적어도 하나의 염의 용도로서,
    상기 염 및 상기 효소가 고체이며, 상기 효소의 안정이 상기 염 및 상기 효소가 적어도 하나의 용매와 접촉될 때 일어나는 용도:
    (R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
    상기 식에서,
    n은 1 내지 12로부터 선택되고,
    m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
    R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
    R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬, 페닐로부터 선택되고,
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
    X는 C2-C4-알킬렌이고,
    A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다.
  11. 세제 제형 내로 제형화되는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 액체 효소 제제의 용도로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 효소 제제가 하나 이상의 단계에서 하나 이상의 세제 성분과 혼합되는 용도.
  12. 성분 (a): 다음의 일반식 (I)에 따른 적어도 하나의 염:
    (R2)3N+ -(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
    상기 식에서,
    n은 1 내지 12로부터 선택되고,
    m은 0 내지 50으로부터 선택되고,
    R1은 선형 또는 분지형 C1-C10-알킬 및 C6-C10-아릴로부터 선택되며, 여기서 R1은 적용된다면 부분적으로 또는 전체적으로 중화된 하나 이상의 하이드록실 또는 C=O 또는 COOH 기를 함유할 수 있으며,
    R2는 동일하거나 상이하며 C1-C10-알킬, 페닐로부터 선택되고,
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하며 수소 및 C1-C4-알킬로부터 선택되고,
    X는 C2-C4-알킬렌이고,
    A-는 무기 또는 유기 반대음이온이다;
    성분 (b): 가수분해효소 (EC 3)로부터 선택된, 바람직하게는 리파아제 (EC 3.1.1) 및 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)의 군으로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3) 및 서브틸리신 유형의 프로테아제 (EC 3.4.21.62)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소;
    선택적으로 성분 (c): 성분 (a)와 상이하며, 바람직하게는 위에 개시된 붕소 함유 화합물로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 페닐 보론산 (PBA) 또는 위에 개시된 이것의 유도체로부터 선택된, 가장 바람직하게는 4-포르밀 페닐 보론산 (4-FPBA)인 적어도 하나의 효소 안정제, 및
    적어도 하나의 세제 성분을 포함하는 세제 제형.
  13. 얼룩과 제12항에 따른 세제 제형을 접촉시키는 단계를 포함하는, 지방질(fat)을 포함하는 얼룩의 제거 방법으로서,
    세제 제형의 성분 (b)에 포함된 적어도 하나의 효소가 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제 (EC 3.1.1.3)의 군으로부터의 적어도 하나의 리파아제 (EC 3.1.1)를 포함하는 얼룩 제거 방법.
  14. 제13항에 있어서, 얼룩이 온도≤40℃에서 직물로부터 제거되어야 하는 얼룩 제거 방법.
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