BR112020010630A2 - preparação de enzima líquida, processo para fabricar uma preparação de enzima, métodos para estabilizar pelo menos uma enzima e para remover manchas, e, formulação detergente. - Google Patents

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Abstract

Preparação de enzima líquida contendo o componente (a): pelo menos um sal de acordo com fórmula geral (I) (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50, R1 é selecionado de alquila C1-C10, linear ou ramificado e arila C6-C10 em que R1 pode portar um ou mais hidroxila ou grupos C=O ou COOH, parcial ou totalmente neutralizados, se aplicável, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1-C10, fenila, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é um contraíon inorgânico ou orgânico, componente (b): pelo menos uma enzima selecionada de hidrolases (EC 3) e opcionalmente componente (c): pelo menos um composto selecionado de estabilizantes de enzima diferentes do componente (a), conservantes e tensoativos.

Description

1 / 75 PREPARAÇÃO DE ENZIMA LÍQUIDA, PROCESSO PARA FABRICAR UMA PREPARAÇÃO DE ENZIMA, MÉTODOS PARA ESTABILIZAR PELO MENOS UMA ENZIMA E PARA REMOVER MANCHAS, E,
FORMULAÇÃO DETERGENTE
[001] A presente invenção está direcionada para uma preparação de enzima contendo o componente (a): pelo menos um sal de acordo com a fórmula geral (I) (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50, R1 é selecionado de alquila C1-C10, linear ou ramificada e arila C6-C10 em que R1 pode carregar de um ou mais hidroxila ou grupos C=O ou COOH, parcial ou totalmente neutralizados, se aplicável, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1- C10, fenila, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é um contraíon inorgânico ou orgânico, componente (b): pelo menos uma enzima selecionada de hidrolases (EC 3); e opcionalmente o componente (c): pelo menos um composto selecionado de estabilizantes de enzima diferentes do componente (a) e tensoativos.
[002] As enzimas são usualmente produzidas comercialmente como um concentrado líquido, frequentemente derivado de um caldo de
2 / 75 fermentação. A enzima tende a ser desestabilizada se a mesma permanece em um ambiente aquoso e assim é prática convencional converter a mesma a uma forma anidra: concentrados aquosos podem ser liofilizados ou secos por pulverização por exemplo na presença de um material carreador para formar agregados. Usualmente, os produtos de enzima sólida precisam ser “dissolvidos” antes do uso. Para estabilizar enzimas em produtos líquidos inibidores são conhecidos ser utilizados, preferivelmente inibidores de enzima reversíveis, para inibir a atividade de enzima temporariamente até que o inibidor de enzima seja liberado.
[003] Os ácidos bóricos e ácidos borônicos são conhecidos inibir reversivelmente as enzimas proteolíticas. Um debate da inibição de uma serina protease, subtilisina, pelo ácido borônico é provido em Molecular & Cellular Biochemistry 51, 1983, pp. 5-32. Para a reativação, este inibidor precisa ser removido antes ou durante a aplicação, que pode ser feita por exemplo pela diluição.
[004] Além disso, a estabilidade das enzimas lipolíticas é conhecida ser melhorada pela adição de um material estabilizante tal como os derivados do ácido borônico pela formação irreversivelmente de um complexo com o sítio ativo da enzima lipolítica (por exemplo EP0478050).
[005] Por causa de considerações ambientais existe uma demanda para pelo menos reduzir as quantidades de compostos contendo boro usadas para a estabilização de enzima. Existe uma procura por alternativas a serem usadas como estabilizantes de enzima na presença de enzimas.
[006] O problema a ser resolvido para a corrente invenção se refere a prover um estabilizador de enzima alternativo. Foi um objetivo adicional da presente invenção prover uma preparação de enzima que possibilitasse ser flexivelmente formulada em formulações com teor de água alto ou baixo, ambas com excelente vida de prateleira com respeito à(s) enzima(s) nela contida(s).
3 / 75
[007] O problema foi resolvido pelo uso de pelo menos um sal de acordo com a fórmula geral (I) como um estabilizante de enzima em que a fórmula geral (I) é como segue: (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que, n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50, R1 é selecionado de alquila C1-C10, linear ou ramificado e arila C6-C10 em que R1 pode portar um ou mais hidroxila ou grupos C=O ou COOH, parcial ou totalmente neutralizados, se aplicável, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1- C10, fenila, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é um contraíon inorgânico ou orgânico.
[008] O estabilizante de enzima da invenção preferivelmente estabiliza uma enzima selecionada do grupo de hidrolases (EC 3). Os nomes de enzima são conhecidos por aqueles versados na técnica com base nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Os nomes de enzima incluem: um número EC (Enzyme Commission), nome recomendado, nomes alternativos (se algum), atividade catalítica e outros fatores; ver http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/ na última versão atualizada em 12 de março de 2017.
[009] Em uma modalidade, pelo menos uma hidrolase é selecionada do grupo de enzimas atuando sobre a ligação de éster (EC 3.1), glicosilases (EC 3.2) e peptidases (EC 3.4).
4 / 75
[0010] A invenção provê uma preparação de enzima líquida contendo componente (a): pelo menos um sal de acordo com fórmula geral (I) (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50, R1 é selecionado de alquila C1-C10, linear ou ramificado e arila C6-C10 em que R1 pode portar um ou mais hidroxila ou grupos C=O ou COOH, parcial ou totalmente neutralizados, se aplicável, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1- C10, fenila, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é um contraíon inorgânico ou orgânico, componente (b): pelo menos uma enzima, preferivelmente selecionada de hidrolases (EC 3), e opcionalmente componente (c): pelo menos um composto selecionado de estabilizantes de enzima diferentes do componente (a) e tensoativos.
[0011] A preparação de enzima da invenção pode ser líquida a 20°C e 101,3 kPa. Em uma modalidade, líquida significa que a preparação de enzima não mostra traços de formação de precipitado ou turbidez mesmo depois de 20 dias de armazenagem. Componente (a)
[0012] O sal (componente (a)) é um sal de um éster orgânico de colina ou de um derivado de colina. O ânion do sal (componente (a)) – o
5 / 75 contraíon – pode ser inorgânico ou orgânico, orgânico sendo preferido. Os exemplos de contraíons inorgânicos do sal (componente (a)) são nitrato, hidróxido, sulfato, fosfato, hidrogeno fosfato, di-hidrogeno fosfato, carbonato, bicarbonato e haleto, por exemplo brometo ou cloreto. Preferidos são haleto especialmente cloreto e sulfato, carbonato e bicarbonato. Os exemplos de contraíons orgânicos são lactato, acetato, tartarato, citrato e CH3SO3- (metanossulfonato). Em modalidades com contraíons bivalentes ou trivalentes, as respectivas quantidades molares de cátion estão presentes.
[0013] O átomo de nitrogênio no sal (componente (a)) carrega três grupos metila e um grupo hidroxietila. O termo derivados de colina como usado no contexto da presente invenção se refere aos compostos que carregam pelo menos um grupo alquila outro que não um grupo metila ou um grupo hidroxialquila outro que não um grupo 2-hidroxietila ou adicionalmente grupos alcóxi.
[0014] Mais especificamente, o componente (a) é um composto da fórmula geral (I) (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, por exemplo 1 a 9, preferivelmente 1, 2, 3 ou 4 e ainda mais preferivelmente n é 1; m é selecionado de zero a 50, por exemplo 2 a 50, preferido é 10 a 25. Mais preferivelmente, entretanto, m é zero; R1 é selecionado de alquila C1-C10, linear ou ramificada e arila C6-C10 em que R1 pode carregar de um ou mais hidroxila ou C=O ou grupos COOH, parcial ou totalmente neutralizados, se aplicável. Os exemplos preferidos de R1 são alquila C1-C6 não substituída tais como metila etila, n- propila, isopropila, n-butila, isobutila, n-hexila, alquila C1-C10 não substituída preferida são metila e etila, além disso substituída tal alquila C1-C10 como - CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH3, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-
6 / 75 CH=CHCOOH, -C6H5, para-HO-C6H4-, o,p-dihidroxifenila e 3,4,5-trihidróxi -fenila. Em uma modalidade preferida, O-C(O)-R1 junto constitui um citrato. Ainda mais preferido, R1 é metila; R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de fenila e alquila C1-C10, por exemplo metila etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, sec-pentila, neo-pentila, 1,2-dimetilpropila, isoamila, n-hexila, isohexila, sec-hexila, n-heptila, n- octila, 2-etilhexila, n-nonila, n-decila, 2-n-propil-heptila ou isodecila, preferida é alquila C1-C10 linear e mais preferida é alquila C1-C4 linear, ainda mais preferido pelo menos dois grupos R2 são CH3 e o terceiro R2 é selecionado de alquila C1-C10 linear e mais preferido, todos R2 são os mesmos e metila. R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, preferidos são n- por exemplo metila etila, n- propila e n-butila e ainda mais preferidos tanto R3 quanto R4 são hidrogênio. em uma outra modalidade, R3 é alquila C1-C4 e R4 é hidrogênio, preferivelmente R3 é metila e R4 é hidrogênio. X é alquileno C2-C4, por exemplo -CH2-CH2-, -CH(CH3)-CH2- , -(CH2)3-, CH2-CH(CH3)- ou -(CH2)4- e
[0015] A- é um contraíon, inorgânico ou orgânico. Os exemplos de contraíons inorgânicos de sal (componente (a)) são sulfato, fosfato, hidrogeno fosfato, di-hidrogeno fosfato, carbonato, bicarbonato e haleto, por exemplo brometo ou cloreto. Preferidos são haleto especialmente cloreto e sulfato, carbonato e bicarbonato. Os exemplos de contraíons orgânicos são lactato, acetato, tartarato, citrato e CH3SO3- (metanossulfonato).
[0016] O componente (a) não é um tensoativo. Em uma modalidade, uma solução de 5 g do componente (a) em 1000 g de água tem uma tensão superficial dinâmica de > 45 mN/m a 20°C e 101,3 kPa. Uma solução de 5 g do componente (a) em 1000 g de água pode ter uma tensão superficial
7 / 75 dinâmica de ≥ 50 mN/m a 20°C e 101,3 kPa. A tensão superficial dinâmica pode ser medida com um tensiômetro de pressão de bolha em que a pressão interna máxima de uma bolha de gás que é formada em um líquido por meio de um capilar é medida; o valor medido habitualmente corresponde à tensão superficial em uma certa idade de superfície, o tempo do início da formação de bolha até a ocorrência do máximo da pressão. Em uma modalidade, a idade da superfície durante a medição a tensão superficial dinâmica a 20°C e 101,3 kPa com um tensiômetro de pressão de bolha é 50 ms.
[0017] O exemplo mais preferido de sais (componente (a)) são sais de ésteres de colina com tartarato ou citrato como contraíon e sais de acetil colina, citrato de colina e de tartarato de colina, por exemplo lactatos, acetatos, tartaratos, citratos.
[0018] Em modalidades nas quais o contraíon A- é – ou pode ser – bivalente tal como sulfato, tartarato, carbonato ou polivalente tal como fosfate ou citrato, a carga positiva necessária pode ser fornecida por um outro cátion derivado do sal (componente (a)) ou por cátions de metal alcalino tais como potássio ou preferivelmente sódio ou por amônio, não substituído ou substituído com alquila C1-C4 e/ou com 2-hidroxietila.
[0019] Em modalidades nas quais R1 carrega de um ou mais grupos carboxila eles podem ser grupos COOH livres ou parcial ou totalmente neutralizados com álcali, por exemplo potássio ou especialmente sódio ou eles podem ser esterificados, por exemplo com (R2)3N+-(CH2)n-(O-X)m-OH. Tais modalidades resultam no di- ou triéster, se aplicável, do respectivo ácido di ou tricarboxílico. As misturas de mono- e diésteres, por exemplo, do ácido tartárico ou ácido cítrico e as misturas de di- e triésteres do ácido cítrico também são praticáveis.
[0020] Em uma modalidade preferida da presente invenção, sal (componente (a)) é selecionado de (CH3)3N+-(CH2)2-O-C(O)-R5 (A1)- (II)
8 / 75 em que (A1)- é selecionado de metanossulfonato, tartarato e citrato e em que R5 é selecionado de -CH2-C(OH)(COOX2)-CH2- COOX2 e –CH(OH)-CH(OH)-COOX1 em que X1 é selecionado de hidrogênio, metal alcalino – especialmente sódio – e (CH3)3N+-(CH2)2- e em que X2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio, metal alcalino – especialmente sódio – e (CH3)3N+-(CH2)2-. Em uma modalidade preferida, o grupo éster de O-C(O)-R5 e (A1)- corresponde um a outro.
[0021] Em uma modalidade da presente invenção, preparações de enzima líquida contêm componente (a) em quantidades na faixa de 0,1% a 30% em peso, em relação ao peso total da preparação de enzima. A preparação de enzima pode conter o componente (a) em quantidades na faixa de 0,1% a 15% em peso, 0,25% a 10% em peso, 0,5% a 10% em peso, 0,5% a 6% em peso ou 1% a 3% em peso, todos em relação ao peso total da preparação de enzima.
[0022] Em uma modalidade da presente invenção, sal (componente (a)) contém como uma impureza o composto (a’) que é como segue: (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-OH R1-COO- em que as variáveis R1, R2, X, n e m são as mesmas como no sal (componente (a)) correspondente. A dita impureza pode atingir até 50 % em mol, preferivelmente 0,1 a 20 % em mol, ainda mais preferivelmente 1 a 10 % em mol de sal (componente (a)). Embora a impureza (A’) possa originar da síntese do sal (componente (a)) e possa ser removida pelos métodos de purificação não é preferido remove-la. Componente (b)
[0023] Em um aspecto da invenção, pelo menos uma enzima compreendida no componente (b) é parte do concentrado de enzima líquida.
9 / 75 “Concentrado de enzima líquida” aqui significa qualquer produto compreendendo enzima líquida compreendendo pelo menos uma enzima. “Líquida” no contexto de concentrado de enzima está relacionado com a aparência física a 20°C e 101,3 kPa.
[0024] O concentrado de enzima líquida pode resultar da dissolução de enzima sólida em solvente. O solvente pode ser selecionado de água e um solvente orgânico. O concentrado de enzima líquida resultante da dissolução de enzima sólida em solvente pode compreender quantidades de enzima até a concentração de saturação.
[0025] Dissolução aqui significa, que compostos sólidos são liquefeitos pelo contato com pelo menos um solvente. Dissolução significa que a dissolução completa de um composto sólido até a concentração de saturação é obtida em um solvente específico em que nenhuma separação de fase ocorra.
[0026] Em um aspecto da invenção, o componente (b) do concentrado de enzima resultante pode ser livre de água, significando que nenhuma quantidade significante de água está presente. Quantidades não significantes de água aqui significam, que uma preparação de enzima compreende menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 7%, menos do que 5%, menos do que 4%, menos do que 3%, menos do que 2% em peso de água, todos em relação ao peso total do concentrado de enzima ou nenhuma água.
[0027] Em uma modalidade, uma preparação de enzima da invenção compreende pelo menos um solvente orgânico selecionado de etanol, n- propanol, iso-propanol, n-butanol, iso-butanol, sec-butanol, etileno glicol, propileno glicol, 1,3-propano diol, butano diol, glicerol, diglicol, propil diglicol, butil diglicol, hexileno glicol, éter metílico de etileno glicol, éter etílico de etileno glicol, éter propílico de etileno glicol e fenoxietanol, preferidos são etanol, isopropanol ou propileno glicol. Adicionalmente, uma
10 / 75 preparação de enzima da invenção pode compreender pelo menos um solvente orgânico selecionado de compostos tais como 2-butoxietanol, álcool isopropílico e d-limoneno.
[0028] Os concentrados de enzima líquida compreendendo água podem ser chamadas de “concentrados de enzima aquosos”. Os concentrados de enzima aquosos podem ser soluções compreendendo enzima em que o produto de enzima sólida foi dissolvido em água. Em uma modalidade “concentrado de enzima aquoso” significa produtos compreendendo enzima resultante da produção de enzima pela fermentação.
[0029] Fermentação significa o processo de cultivar células recombinantes que expressam a enzima desejada em um meio nutriente adequado permitindo que as células hospedeiras recombinantes cresçam (este processo pode ser chamado de fermentação) e expressem a proteína desejada. No final da fermentação, o caldo de fermentação usualmente é coletado e adicionalmente processado em que o caldo de fermentação compreende uma fração líquida e uma fração sólida. Dependendo de se a enzima foi secretada dentro da fração líquida ou não, a proteína ou enzima desejadas podem ser recuperadas da fração líquida do caldo de fermentação ou dos lisados de célula. A recuperação da enzima desejada usa métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os métodos adequados para a recuperação de proteínas ou enzimas a partir do caldo de fermentação incluem, mas não são limitados à coleta, centrifugação, extração por filtração e precipitação.
[0030] Os concentrados de enzima líquidos, podem compreender quantidades de enzima na faixa de 0,1% a 40% em peso ou 0,5% a 30% em peso ou 1% a 25% em peso ou 3% a 25% em peso ou 5% a 25% em peso, todos em relação ao peso total do concentrado de enzima. Em uma modalidade, os concentrados de enzima líquidos são resultantes da fermentação e são aquosos.
[0031] Os concentrados de enzima aquosos resultantes da
11 / 75 fermentação podem compreender água em quantidades de mais do que cerca de 50% em peso, mais do que cerca de 60% em peso, mais do que cerca de 70% em peso ou mais do que cerca de 80% em peso, todos em relação ao peso total do concentrado de enzima. Os concentrados de enzima aquosos que resultam da fermentação, podem compreender componentes residuais tais como sais que se originam do meio de fermentação, fragmentos de célula que se originam das células hospedeiras de produção, metabólitos produzidos pelas células hospedeiras de produção durante a fermentação. Em uma modalidade, componentes residuais podem estar compreendidos nos concentrados de enzima líquida em quantidades menores do que 30% em peso, menores do que 20% em peso menores do que 10% em peso ou menores do que 5% em peso, todos em relação ao peso total do concentrado de enzima aquoso.
[0032] Pelo menos uma enzima compreendida no componente (b) é selecionada de hidrolases (EC 3), daqui em diante também aludidas como enzima (componente (b)). As enzimas (componente (b)) preferidas são selecionadas do grupo de enzimas que atuam sobre a ligação de éster (E.C.
3.1), glicosilases (E.C. 3.2) e peptidases (E.C. 3.4). As enzimas que atuam sobre a ligação de éster (E.C. 3.1), são daqui em diante também aludidas como lipases (componente (b)), respectivamente. Glicosilases (E.C. 3.2) são daqui em diante também aludidas como amilases (componente (b)) e celulases (componente (b)). As peptidases são daqui em diante também aludidas como proteases (componente (b)).
[0033] As hidrolases (componente (b)) no contexto da presente invenção são identificadas pelas sequências de polipeptídeo (também aqui chamadas de sequências de aminoácido). A sequência de polipeptídeo especifica a estrutura tridimensional incluindo o “sítio ativo” de uma enzima que por sua vez determina a atividade catalítica da mesma. As sequências de polipeptídeo podem ser identificadas por uma SEQ ID NO. De acordo com o
12 / 75 World Intellectual Property Office (WIPO) Standard ST,25 (1998) os aminoácidos aqui são representados usando código de três letras com a primeira letra como uma letra maiúscula ou o correspondente a uma letra.
[0034] A enzima (componente (b)) de acordo com a invenção se refere às enzimas precursoras e/ou as enzimas variantes, ambas tendo atividade enzimática. As enzimas tendo atividade enzimática são enzimaticamente ativas ou exerce conversão enzimática, significa que as enzimas atuam sobre os substratos e converte os mesmos em produtos. O termo “enzima” aqui exclui variantes inativas de uma enzima.
[0035] Uma sequência “precursora” (de uma proteína ou enzima precursora, também chamada “enzima precursora”) é a sequência de partida para a introdução de mudanças, (por exemplo, pela introdução de uma ou mais substituições, inserções, deleções de aminoácido ou uma combinação das mesmas) na sequência, resultando em “variantes” das sequências precursoras. O termo enzima precursora (ou sequência precursora) inclui enzimas de tipo selvagem (sequências) e sequências geradas sinteticamente (enzimas) que são usadas como sequências de partida para introdução de mudanças (adicionais).
[0036] O termo “variante de enzima” ou “variante de sequência” ou “enzima de variante” se refere a uma enzima que difere da sua enzima precursora na sua sequência de aminoácidos a um certo grau. Se não indicado de outro modo, a enzima de variante “tendo atividade enzimática” significa que esta enzima de variante tem o mesmo tipo de atividade enzimática como a respectiva enzima precursora.
[0037] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita como segue é usada:
[0038] As substituições do aminoácido são descritas para fornecer o aminoácido original da enzima precursora seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácidos, seguido pelo aminoácido substituído.
13 / 75
[0039] As deleções de aminoácido são descritas para fornecer o aminoácido original da enzima precursora seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácidos, seguido por *.
[0040] As inserções de aminoácido são descritas para fornecer o aminoácido original da enzima precursora seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácidos, seguido pelo aminoácido original e o aminoácido adicional. Por exemplo, uma inserção na posição 180 de lisina ao lado da glicina é designada como “Gli180Glilys” ou “G180GK”.
[0041] No caso onde uma substituição e uma inserção ocorrem na mesma posição, isto pode ser indicado como S99SD+S99A ou resumidamente S99AD. No caso onde um resíduo de aminoácido idêntico ao resíduo de aminoácido existente é inserido está claro que a degeneração na nomenclatura surge. Se por exemplo uma glicina é inserida depois da glicina nos exemplos acima isto seria indicado por G180GG.
[0042] Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Arg170Tyr, Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 com tirosina ou ácido glutâmico. Alternativamente as alterações diferentes ou substituições opcionais podem ser indicadas em colchetes por exemplo, Arg170[Tyr, Gli] ou Arg170{Tyr, Gli}; ou resumidamente R170 [Y,G] ou R170 {Y, G}; ou por extenso R170Y, R170G.
[0043] As variantes de enzima podem ser definidas pela sua identidade de sequência quando comparadas a uma enzima precursora. A identidade de sequência habitualmente é provida como “% de identidade de sequência” ou “% de identidade”. Para o cálculo de identidades de sequência em uma primeira etapa um alinhamento de sequência tem que ser produzido. De acordo com esta invenção, um alinhamento global aos pares tem que ser produzido, significa que duas sequências têm de ser alinhadas no seu comprimento completo, que é habitualmente produzido usando-se uma
14 / 75 abordagem matemática, chamada algoritmo de alinhamento.
[0044] De acordo com a invenção, o alinhamento é gerado usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453). Preferivelmente, o programa “NEEDLE” (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) é usado para o propósito da invenção corrente, usando os parâmetros de default do programa (abertura do intervalo = 10,0 extensão de intervalo = 0,5 e matriz=EBLOSUM62). De acordo com esta invenção, o seguinte cálculo de % de identidade se aplica: % de identidade = (resíduos idênticos / comprimento da região de alinhamento que está mostrando a respectiva sequência desta invenção no seu comprimento completo)*100.
[0045] De acordo com esta invenção, as variantes de enzima podem ser descritas como uma sequência de aminoácidos que é pelo menos n% idêntica à sequência de aminoácidos da enzima precursora respectiva com “n” sendo um número inteiro entre 10 e 100. Em uma modalidade, as enzimas variantes são pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com o comprimento total da sequência de aminoácidos da enzima precursora em que a variante de enzima tem atividade enzimática.
[0046] As variantes de enzima podem ser definidas pela sua similaridade de sequência quando comparadas a uma enzima precursora. A similaridade de sequência habitualmente é provida como “% de similaridade de sequência” ou “% de similaridade”. % de similaridade de sequência leva em consideração que conjuntos definidos de aminoácidos compartilham propriedades similares, por exemplo, pelo seu tamanho, pela sua
15 / 75 hidrofobicidade, pela sua carga ou pelas outras características. Aqui, a mudança de um aminoácido com um aminoácido similar pode ser chamada “mutação conservativa”. Para a determinação de % de similaridade de acordo com esta invenção o seguinte se aplica: o aminoácido A é similar aos aminoácidos S; o aminoácido D é similar aos aminoácidos E e N; o aminoácido E é similar aos aminoácidos D e K e Q; o aminoácido F é similar aos aminoácidos W e Y; o aminoácido H é similar aos aminoácidos N e Y; o aminoácido I é similar aos aminoácidos L e M e V; o aminoácido K é similar aos aminoácidos E e Q e R; o aminoácido L é similar aos aminoácidos I e M e V; o aminoácido M é similar aos aminoácidos I e L e V; o aminoácido N é similar aos aminoácidos D e H e S; o aminoácido Q é similar aos aminoácidos E e K e R; o aminoácido R é similar aos aminoácidos K e Q; o aminoácido S é similar aos aminoácidos A e N e T; o aminoácido T é similar aos aminoácidos S; aminoácido V é similar aos aminoácidos I e L e M; o aminoácido W é similar aos aminoácidos F e Y; o aminoácido Y é similar aos aminoácidos F e H e W. As substituições de aminoácido conservativas podem ocorrer no comprimento total da sequência de uma sequência de polipeptídeo de uma proteína funcional tal como uma enzima. Em uma modalidade, tais mutações não pertencem aos domínios funcionais de uma enzima. Em uma modalidade, as mutações conservativas não pertencem aos centros catalíticos de uma enzima.
[0047] Levando-se as mutações conservativas em conta, um valor para a similaridade de sequência de duas sequências de aminoácido pode ser calculado a partir do mesmo alinhamento, que é usado para calcular % de identidade. De acordo com esta invenção, o seguinte cálculo de % de similaridade se aplica: % de similaridade = [(resíduos idênticos + resíduos similares) / comprimento da região de alinhamento que está mostrando a respectiva sequência (s) desta invenção no seu comprimento completo]*100.
[0048] De acordo com esta invenção, as variantes de enzima podem
16 / 75 ser descritas como uma sequência de aminoácidos que é pelo menos m% similar as respectivas sequências precursoras com “m” sendo um número inteiro entre 10 e 100. Em uma modalidade, as enzimas variantes são pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similar quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento total da enzima precursora em que a enzima de variante tem atividade enzimática.
[0049] A “atividade enzimática” significa o efeito catalítico exercido por uma enzima, que habitualmente é expressa como unidades por miligrama de enzima (atividade específica) que se referem às moléculas de substrato transformadas por minuto por molécula de enzima (atividade molecular).
[0050] As enzimas variantes podem ter atividade enzimática de acordo com a presente invenção quando as ditas variantes de enzima exibem pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% da atividade enzimática da respectiva enzima precursora.
[0051] Pelo menos uma enzima compreendida no componente (b) é selecionada do grupo de hidrolases (EC 3). Lipase
[0052] Em uma modalidade, as preparações enzimáticas inventivas compreendem pelo menos uma lipase (EC 3.1.1; componente (b)). As “lipases”, “enzima lipolítica”, “esterase lipídica”, todas se referem a uma enzima de EC classe 3.1.1 (“éster carboxílico hidrolase”). Lipase significa proteína ativa tendo atividade de lipase (ou atividade lipolítica; triacilglicerol lipase, EC 3.1.1.3), atividade de cutinase (EC 3.1.1.74; enzimas tendo
17 / 75 atividade de cutinase podem ser aqui chamadas de cutinase), atividade de esterol esterase (EC 3.1.1.13) e/ou atividade de éster ceroso hidrolase (EC
3.1.1.50).
[0053] Os métodos para determinar a atividade lipolítica são bem conhecidos na literatura (ver por exemplo, Gupta et al. (2003), Biotechnol. Appl. Biochem. 37, p. 63-71). Por exemplo, a atividade de lipase pode ser medida pela hidrólise da ligação de éster no substrato de palmitato de para- nitrofenila (pNP-Palmitato, C:16) e libera pNP que é amarela e pode ser detectada a 405 nm.
[0054] “Atividade lipolítica” significa o efeito catalítico exercido por uma lipase, que pode ser provida em unidades lipolíticas (LU). Por exemplo, 1 LU pode corresponder à quantidade de lipase que produz 1 μmol de ácido graxo titulável por minuto em um pH stat. sob as seguintes condições: temperatura 30°C.; pH = 9,0; o substrato pode ser uma emulsão de 3,3 % em peso de óleo de oliva e 3,3% de goma arábica, na presença de 13 mmol/l de Ca2+ e 20 mmol/l de NaCl em 5 mmol/l de tampão de Tris.
[0055] As lipases (componente (b)) incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Em um aspecto da invenção, uma lipase adequada (componente (b)) é selecionada das seguintes: lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como descrita na EP 258068, EP 305216, WO 92/05249 e WO 2009/109500 ou de H. insolens como descrita na WO 96/13580; lipases derivadas de Rhizomucor miehei como descrita na WO 92/05249; lipase das cepas de Pseudomonas (algumas destas agora renomeadas para Burkholderia), por exemplo de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218272, WO 94/25578, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 96/00292), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1372034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), Pseudomonas mendocina (WO 95/14783), P. glumae (WO 95/35381, WO 96/00292); lipase
18 / 75 de Streptomyces griseus (WO 2011/150157) e S. pristinaespiralis (WO 2012/137147), lipases de Streptomyces tipo GDSL (WO 2010/065455); lipase de Thermobifida fusca como descrita na WO 2011/084412; lipase de Geobacillus stearothermophilus como descrita na WO 2011/084417; lipases de Bacillus, por exemplo como descritas na WO 00/60063, lipases de B. subtilis como descritas em Dartois et al. (1992), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360 ou WO 2011/084599, B. stearothermophilus (JP S64- 074992) ou B. pumilus (WO 91/16422); lipase de Candida antarctica como descrita na WO 94/01541; cutinase de Pseudomonas mendocina (US 5389536, WO 88/09367); cutinase de Magnaporthe grisea (WO 2010/107560); cutinase de Fusarum solani pisi como descrita na WO 90/09446, WO 00/34450 e WO 01/92502; e cutinase de Humicola lanuginosa como descrita na WO 00/34450 e WO 01/92502.
[0056] As lipases (componente (b)) adequadas também incluem aquelas aludidas como aciltransferases ou perhidrolases, por exemplo aciltransferases com homologia à lipase A de Candida antarctica (WO 2010/111143), aciltransferase de Mycobacterium smegmatis (WO 2005/056782), perhidrolases da família CE7 (WO 2009/67279) e variantes da perhidrolase de M. smegmatis em particular a variante S54V (WO 2010/100028).
[0057] As lipases (componente (b)) adequadas incluem também aquelas que são variantes das lipases descritas acima que têm atividade lipolítica. Tais variantes de lipase adequadas (componente (b)) são por exemplo aquelas que são desenvolvidas pelos métodos como descritos na WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/60063, WO 2007/087508, EP 407225 e EP 260105.
[0058] As lipases (componente (b)) adequadas incluem variantes de lipase tendo atividade lipolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo
19 / 75 menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de tamanho completo da enzima precursora como descrito acima.
[0059] As lipases (componente (b)) adequadas incluem variantes de lipase tendo atividade lipolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similar quando comparada com a sequência de polipeptídeo de tamanho completo da enzima precursora.
[0060] Em uma modalidade, a lipase (componente (b)) é selecionada de triacilglicerol lipase fúngica (EC classe 3.1.1.3). Triacilglicerol lipase fúngica (componente (b)) pode ser selecionada da lipase de Thermomyces lanuginosa. Em uma modalidade, a lipase (componente (b)) de Thermomyces lanuginosa é selecionada de triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e variantes da mesma tendo atividade lipolítica. Triacilglicerol lipase de acordo com aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 pode ser aqui chamada de Lipolase.
[0061] A lipase (componente (b)) de Thermomyces lanuginosa pode ser selecionada de variantes tendo atividade lipolítica que são pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de tamanho completo dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438.
[0062] A lipase (componente (b)) de Thermomyces lanuginosa pode
20 / 75 ser selecionada de variantes tendo atividade lipolítica compreendendo apenas mutações conservativas, que entretanto não pertencem ao domínio funcional dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438. Variantes de lipase desta modalidade tendo atividade lipolítica podem ser pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similares quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de tamanho completo de aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438.
[0063] A lipase (componente (b)) de Thermomyces lanuginosa pode ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 2 da US 5869438 distinguida por ter os aminoácidos T231R e N233R. A dita lipase de Thermomyces lanuginosa pode compreender adicionalmente uma ou mais das seguintes trocas de aminoácido: Q4V, V60S, A150G, L227G, P256K.
[0064] Em uma modalidade, pelo menos uma lipase é selecionada de lipases comercialmente disponíveis que incluem mas não são limitadas aos produtos vendidos sob os nomes comerciais Lipolase®, Lipex®, Lipolex® e Lipoclean® (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente da Genencor) e Lipomax (Gist-Brocades/ agora DSM).
[0065] De acordo com a presente invenção, o componente (b) pode compreender uma combinação de pelo menos duas lipases, preferivelmente selecionadas do grupo de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3).
[0066] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma lipase selecionada de triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e variantes da mesma tendo atividade lipolítica como descrito acima.
[0067] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma lipase, preferivelmente selecionada do grupo de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada de serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente selecionada do grupo de proteases tipo subtilisina (EC
21 / 75
3.4.21.62). Protease
[0068] Em uma modalidade, as preparações enzimáticas inventivas compreendem pelo menos uma protease (componente (b)). As proteases são membros da classe EC 3.4. As proteases (componente (b)) incluem aminopeptidases (EC 3.4.11), dipeptidases (EC 3.4.13), dipeptidil-peptidases e tripeptidil-peptidases (EC 3.4.14), peptidil-dipeptidases (EC 3.4.15), carboxipeptidases tipo serina (EC 3.4.16), metalocarboxipeptidases (EC
3.4.17), carboxipeptidases tipo cisteína (EC 3.4.18), ômega peptidases (EC
3.4.19), serina endopeptidases (EC 3.4.21), cisteína endopeptidases (EC
3.4.22), endopeptidases aspárticas (EC 3.4.23), metalo-endopeptidases (EC
3.4.24), treonina endopeptidases (EC 3.4.25) ou endopeptidases de mecanismo catalítico desconhecido (EC 3.4.99).
[0069] Em uma modalidade, pelo menos uma protease (componente (b)) é selecionada de serina proteases (EC 3.4.21). As serina proteases ou serina peptidases são distinguidas por ter uma serina no sítio cataliticamente ativo, que forma um aduto covalente com o substrato durante a reação catalítica. Uma serina protease (componente (b)) no contexto da presente invenção é selecionada do grupo consistindo de quimiotripsina (por exemplo, EC 3.4.21.1), elastase (por exemplo, EC 3.4.21.36), elastase (por exemplo, EC 3.4.21.37 ou EC 3.4.21.71), granzime (por exemplo, EC 3.4.21.78 ou EC
3.4.21.79), calicreína (por exemplo, EC 3.4.21.34, EC 3.4.21.35, EC
3.4.21.118 ou EC 3.4.21.119), plasmina (por exemplo, EC 3.4.21.7), tripsina (por exemplo, EC 3.4.21.4), trombina (por exemplo, EC 3.4.21.5) e subtilisina. A subtilisina também é conhecida como subtilopeptidase, por exemplo, EC 3.4.21.62, a última daqui em diante também sendo aludida como “subtilisina”.
[0070] Um subgrupo das serina proteases tentativamente designadas como subtilases foi proposto por Siezen et al. (1991), Protein Eng. 4: 719-737
22 / 75 e Siezen et al. (1997), Protein Science 6: 501-523. As subtilases incluem a família da subtilisina, família da termitase, a família da proteinase K, a família da peptidase lantibiótica, a família da quexina e a família da pirolisina.
[0071] Um subgrupo das subtilases são as subtilisinas que são serina proteases da família S8 como definido pela base de dados MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk). A família S8 da peptidase contém a subtilisina da serina endopeptidase e seus homólogos. Na subfamília S8A, os resíduos de sítio ativo frequentemente ocorrem nos motivos Asp-Thr/Ser-Gly (que é similar ao motivo de motivo de sequência nas famílias de endopeptidases aspárticas no clã AA), His-Gly-Thr-His e Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro.
[0072] A classe relacionada com a subtilisina de serina proteases (componente (b)) compartilha uma sequência de aminoácido comum definindo uma tríade catalítica que as distingue da classe relacionada com a quimiotripsina de serina proteases. As serina proteases relacionadas com as subtilisinas e quimiotripsina ambas têm uma tríade catalítica compreendendo aspartato, histidina e serina.
[0073] Os exemplos incluem as subtilisinas como descritas na WO 89/06276 e EP 0283075, WO 89/06279, WO 89/09830, WO 89/09819, WO 91/06637 e WO 91/02792.
[0074] As proteases são proteínas ativas exercem “atividade de protease” ou “atividade proteolítica”. A atividade proteolítica está relacionada com a taxa de degradação de proteína por uma protease ou enzima proteolítica em um curso definido de tempo.
[0075] Os métodos para analisar a atividade proteolítica são bem conhecidos na literatura (ver por exemplo Gupta et al. (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 381-395). A atividade proteolítica pode ser determinada usando-se Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida (Suc-AAPF- pNA, AAPF curta; ver por exemplo DelMar et al. (1979), Analitical Biochem 99, 316-320) como substrato. pNA é clivada da molécula de substrato pela
23 / 75 clivagem proteolítica, resultando na liberação de cor amarela de pNA livre que pode ser quantificada pela medição da OD405.
[0076] A atividade proteolítica pode ser provida em unidades por grama de enzima. Por exemplo, 1 U de protease pode corresponder à quantidade de protease que libera 1 μmol de aminoácidos e peptídeos positivos em folina (como tirosina) por minuto no pH 8,0 e 37°C (caseína como substrato).
[0077] As proteases (componente (b)) do tipo subtilisina (EC
3.4.21.62) podem ser proteases bacterianas que se originam de um microrganismo selecionado de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphilococcus, Streptococcus ou Streptomyces protease ou um polipeptídeo bacteriano Gram negativo tal como uma Campilobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.
[0078] Em um aspecto da invenção, pelo menos uma protease (componente (b)) é selecionada de Bacillus alcalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus gibsonii, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis protease.
[0079] Em uma modalidade da presente invenção, pelo menos uma protease (componente (b)) é selecionada das seguintes: subtilisina de Bacillus amiloliquefaciens BPN’ (descrita por Vasantha et al. (1984) J. Bacteriol. Volume 159, p. 811-819 e JA Wells et al. (1983) em Nucleic Acids Research, Volume 11, p. 7911-7925); subtilisina de Bacillus licheniformis (subtilisina Carlsberg; descrita em EL Smith et al. (1968) em J. Biol Chem, Volume 243, pp. 2184-2191 e Jacobs et al. (1985) em Nucl. Acids Res, Vol 13, p. 8913-
24 / 75 8926); subtilisina PB92 (sequência original da protease alcalina PB92 é descrita na EP 283075 A2); subtilisina 147 e/ou 309 (Esperase®, Savinase®, respectivamente) como descrita na WO 89/06279; subtilisina de Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792, tal como de Bacillus lentus DSM 5483 ou as variantes de Bacillus lentus DSM 5483 como descrita na WO 95/23221; subtilisina de Bacillus alcalophilus (DSM 11233) descrita na DE 10064983; subtilisina de Bacillus gibsonii (DSM 14391) como descrita na WO 2003/054184; subtilisina de Bacillus sp. (DSM 14390) descrita na WO 2003/056017; subtilisina de Bacillus sp. (DSM 14392) descrita na WO 2003/055974; subtilisina de Bacillus gibsonii (DSM 14393) descrita na WO 2003/054184; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 4 como descrita na WO 2005/063974; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 4 como descrita na WO 2005/103244; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 7 como descrita na WO 2005/103244; e subtilisina tendo a SEQ ID NO: 2 como descrita no pedido DE 102005028295.4.
[0080] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos a subtilisina 309 (que seria aqui chamada de Savinase) como descrito como sequência a) na Tabela I da WO 89/06279 ou uma variante que é pelo menos 80% idêntica a esta e tenha atividade proteolítica.
[0081] Os exemplos das proteases úteis (componente (b)) de acordo com a presente invenção compreendem as variantes descritas na: WO 92/19729, WO 95/23221, WO 96/34946, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 99/11768, WO 01/44452, WO 02/088340, WO 03/006602, WO 2004/03186, WO 2004/041979, WO 2007/006305, WO 2011/036263, WO 2011/036264 e WO 2011/072099. Os exemplos adequados compreendem especialmente variantes de protease subtilisina derivadas da SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 (que é a sequência de protease alcalina madura de Bacillus lentus DSM 5483) com substituições de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97,
25 / 75 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e 274 (de acordo com a numeração BPN’), que têm atividade proteolítica. Em uma modalidade, uma tal protease não é mutada nas posições Asp32, His64 e Ser221 (de acordo com a numeração BPN’).
[0082] As proteases adequadas (componente (b)) incluem variantes de protease tendo atividade proteolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de tamanho completo da enzima precursora como descrito acima.
[0083] As proteases adequadas (componente (b)) incluem variantes de protease tendo atividade proteolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similares quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de tamanho completo da enzima precursora.
[0084] Em uma modalidade, pelo menos uma protease (componente (b)) tem a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 ou uma protease que é pelo menos 80% idêntica a esta e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a dita protease é distinguida por ter o aminoácido ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) ou asparagina (N) ou glutamina (Q) ou alanina (A) ou glicina (G) ou serina (S) na posição 101 (de acordo com a numeração BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a dita
26 / 75 protease compreende uma ou mais substituições adicionais: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h). Pelo menos uma protease (componente (b)) pode ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e é distinguida por compreender um aminoácido (de acordo com (a)-(h)) ou combinações de acordo com (i) junto com os aminoácidos 101E, 101D, 101N, 101Q, 101A, 101G ou 101S (de acordo com a numeração BPN’) e tendo atividade proteolítica. Em uma modalidade, a dita protease é distinguida por compreender a mutação (de acordo com a numeração BPN’) R101E ou S3T + V4I + V205I ou R101E e S3T, V4I e V205I ou S3T + V4I + V199M + V205I + L217D e tendo atividade proteolítica.
[0085] Em uma modalidade, a protease de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 é distinguida por compreender a mutação (de acordo com a numeração BPN’) S3T + V4I + S9R + A15T + V68A + D99S + R101S + A103S + I104V + N218D e tendo atividade proteolítica.
[0086] Em uma modalidade, pelo menos uma protease é selecionada de enzimas de protease comercialmente disponíveis que incluem mas não são limitadas aos produtos vendidos sob os nomes comerciais Alcalase®, Blaze®, Duralase®, Durazym®, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® e Esperase® (Novozymes A/S), aqueles vendidos sob os nomes comerciais Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect® Prime, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®,
27 / 75 Eraser®, Ultimase®, Opticlean®, Effectenz®, Preferenz® e Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem® (Gist-Brocases N.V.), Protease Alcalina de Bacillus lentus (BLAP; sequência mostrada na Figura 29 da US 5.352.604) e variantes da mesma e KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus) da Kao Corp.
[0087] De acordo com a presente invenção, o componente (b) pode compreender uma combinação de pelo menos duas proteases, preferivelmente selecionadas do grupo de serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente selecionadas do grupo de proteases tipo subtilisina (EC
3.4.21.62) – todas como descritas acima.
[0088] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma lipase e pelo menos uma protease. Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma lipase selecionada de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e pelo menos uma protease selecionada do grupo de serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente selecionadas do grupo de proteases tipo subtilisina (EC
3.4.21.62).
[0089] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma lipase selecionada de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e pelo menos uma protease selecionada de proteases de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 ou variantes da mesma tendo atividade proteolítica – todas como descritas acima.
[0090] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma lipase selecionada de triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e variantes da mesma tendo atividade lipolítica e pelo menos uma protease selecionada de proteases de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 ou variantes da mesma tendo atividade proteolítica – todas como descritas acima.
[0091] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma lipase selecionada de triacilglicerol lipase de acordo com
28 / 75 aminoácidos 1-269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e variantes da mesma tendo atividade lipolítica e pelo menos uma protease selecionada da subtilisina 309 como descrita na Tabela I a) da WO 89/06279 ou variantes da mesma tendo atividade proteolítica – todas como descritas acima. Amilase
[0092] Em uma modalidade, as preparações enzimáticas inventivas compreendem pelo menos uma amilase (componente (b)). As “amilases” (componente (b)) de acordo com a invenção (alfa e/ou beta) incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica (EC 3.2.1.1 e 3.2.1.2, respectivamente). Mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos.
[0093] As amilases (componente (b)) de acordo com a invenção têm “atividade amilolítica” ou “atividade de amilase” envolvendo (endo)hidrólise de conexões glicosídicas em polissacarídeos. A atividade de α-amilase pode ser determinada pelos ensaios para a medição da atividade de α-amilase que são conhecidas por aquelas versadas na técnica. Os exemplos para ensaios medindo a atividade de α-amilase são: a atividade de α-amilase pode ser determinada por um método utilizando tabletes Phadebas como substrato (Teste de Amilase Phadebas, suprido pela Magle Life Science). O amido é hidrolisado pela α-amilase dando fragmentos azuis solúveis. A absorbância da solução azul resultante, medida espectrofotometricamente a 620 nm, é uma função da atividade de α- amilase. A absorbância medida é diretamente proporcional à atividade específica (atividade/mg de proteína de α-amilase pura) da α-amilase em questão sob o conjunto dado de condições. a atividade de α-amilase também pode ser determinada por um método utilizando a Etiliden-4-nitrofenil-α-D-maltoheptaosídeo (EPS). O D- maltoheptaosídeo é um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endoamilase. A seguir da clivagem, a α-glicosidase incluída no kit para
29 / 75 digerir o substrato para liberar uma molécula de PNP livre que tem uma cor amarela e assim pode ser medido pela espectrofotometria visível a 405 nm. Kits contendo substrato de EPS e α-glicosidase são fabricados pela Roche Costum Biotech (cat. No. 10880078103). A inclinação da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade específica (atividade por mg de enzima) da α-amilase em questão sob o conjunto dado de condições.
[0094] A atividade amilolítica pode ser provida em unidades por grama de enzima. Por exemplo, 1 unidade de α-amilase pode liberar 1,0 mg de maltose de amido em 3 min no pH 6,9 a 20°C.
[0095] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ser selecionada das seguintes: amilases de Bacillus licheniformis tendo a SEQ ID NO: 2 como descrita na WO 95/10603; amilases de B. stearothermophilus tendo a SEQ ID NO: 6 como descrita na WO 02/10355; amilases de Bacillus sp.707 tendo a SEQ ID NO: 6 como descrita na WO 99/19467; amilases de Bacillus halmapalus tendo a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 como descrita na WO 96/23872, também descrita como SP-722; amilases de Bacillus sp. DSM 12649 tendo a SEQ ID NO: 4 como descrita na WO 00/22103; amilases de Bacillus cepa TS-23 tendo a SEQ ID NO: 2 como descrita na WO 2009/061380; amilases de Cytophaga sp. tendo a SEQ ID NO: 1 como descrita na WO 2013/184577; amilases de Bacillus megaterium DSM 90 tendo a SEQ ID NO: 1 como descrita na WO 2010/104675; amilases de Bacillus sp. compreendendo os aminoácidos 1 a 485 da SEQ ID NO: 2 como descritos na WO 00/60060.
[0096] As amilases (componente (b)) adequadas incluem variantes de amilase tendo atividade de amilase que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos
30 / 75 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de tamanho completo da enzima precursora como descrito acima.
[0097] As amilases (componente (b)) adequadas incluem variantes de amilase tendo atividade de amilase que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similares quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de tamanho completo da enzima precursora.
[0098] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ter a SEQ ID NO: 12 como descrita na WO 2006/002643 ou é pelo menos 80% idêntica a esta e tem atividade amilolítica. Pelo menos uma amilase pode ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 12 e compreende as substituições nas posições Y295F e M202LITV.
[0099] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ter a SEQ ID NO: 6 como descrita na WO 2011/098531 ou é pelo menos 80% idêntica a esta e tem atividade amilolítica. Pelo menos uma amilase pode ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 6 e compreende uma substituição em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo de 193 [G, A, S, T ou M], 195 [F, W, Y, L, I ou V], 197 [F, W, Y, L, I ou V], 198 [Q ou N], 200 [F, W, Y, L, I ou V], 203 [F, W, Y, L, I ou V], 206 [F, W, Y, N, L, I, V, H, Q, D ou E], 210 [F, W, Y, L, I ou V], 212 [F, W, Y, L, I ou V], 213 [G, A, S, T ou M] e 243 [F, W, Y, L, I ou V].
[00100] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ter a SEQ ID NO: 1 como descrita na WO 2013/001078 ou é pelo menos 85% idêntica a esta e tem atividade amilolítica. Pelo menos uma amilase pode ser pelo menos
31 / 75 85% idêntica à SEQ ID NO: 1 e compreende uma alteração em duas ou mais (diversas) posições correspondendo às posições G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 e G477.
[00101] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ter a SEQ ID NO: 2 como descrita na WO 2013/001087 ou é pelo menos 85% idêntica a esta e tem atividade amilolítica. Pelo menos uma amilase pode ser pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 2 e compreende uma deleção de posições 181+182 ou 182+183 ou 183+184 e tem atividade amilolítica. Em uma modalidade, a dita amilase pode compreender uma ou duas ou mais modificações adicionais em qualquer uma das posições correspondentes à W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 e G477.
[00102] Em uma modalidade, pelo menos uma amilase é selecionada de amilases comercialmente disponíveis que incluem mas não são limitadas aos produtos vendidos sob os nomes comerciais Duramil®, Termamil®, Fungamil®, Stainzyme®, Stainzyme Plus®, Natalase®, Liquozyme X e BAN® (da Novozymes A/S) e Rapidase®, Purastar®, Powerase®, Effectenz® (M100 da DuPont), Preferenz® (S1000, S110 e F1000; da DuPont), PrimaGreen® (ALL; DuPont), Optisize® (DuPont).
[00103] De acordo com a presente invenção, uma combinação de pelo menos duas amilases (componente (b)) pode ser usada.
[00104] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma lipase e pelo menos uma amilase.
[00105] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease e/ou pelo menos uma amilase.
[00106] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma lipase e pelo menos uma protease e pelo menos uma amilase. Celulase
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[00107] Uma preparação de enzima da invenção pode compreender pelo menos uma celulase (componente (b)). Três tipos principais de celulases são conhecidos, a saber celobiohidrolase (1,4-P-D-glucan celobiohidrolase, EC 3.2.1.91) endo-ss-1,4-glucanase (endo-1,4-P-D-glucan 4-glucano- hidrolase, EC 3.2.1.4) e ss-glicosidase (EC 3.2.1.21).
[00108] “Celulases”, “enzimas de celulase” ou “enzimas celulolíticas” (componente (b)) são enzimas envolvidas na hidrólise de celulose. Ensaios para a medição da “atividade de celulase” ou “atividade celulolítica” são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, atividade celulolítica pode ser determinada em virtude do fato de que a celulase hidrolisa a carboximetil celulose para reduzir carboidratos, a capacidade redutora da qual é determinada colorimetricamente por meio da reação de ferricianeto, de acordo com Hoffman, W. S., J. Biol. Chem. 120, 51 (1937).
[00109] A atividade celulolítica pode ser provida em unidades por grama de enzima. Por exemplo, 1 unidade pode liberar 1,0 μmol de glicose de celulose em uma hora no pH 5,0 a 37 °C (tempo de incubação de 2 horas).
[00110] Celulases de acordo com a invenção incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica.
[00111] Em uma modalidade, pelo menos uma celulase (componente (b)) é selecionada de celulases comercialmente disponíveis que incluem mas não são limitadas à Celluzyme®, Endolase®, Carezyme®, Cellusoft®, Renozyme®, Celluclean® (da Novozymes A/S), Ecostone®, Biotouch®, Econase®, Ecopulp® (da AB Enzimas Finlândia), Clazinase® e Puradax HA®, celulase detergente L da Genencor, IndiAge® Neutra (da Genencor International Inc./DuPont), Revitalenz® (2000 da DuPont), Primafast® (DuPont) e KAC-500® (da Kao Corporation). Componente (c)
[00112] Em uma modalidade, uma preparação de enzima líquida da invenção contém componente (c) que compreende pelo menos um composto
33 / 75 selecionado de estabilizantes de enzima diferente do componente (a), conservantes e tensoativos. Estabilizantes de enzima diferentes do componente (a):
[00113] Uma preparação de enzima líquida da invenção pode compreender pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a). O dito estabilizante de enzima (componente (c)) pode ser selecionado de compostos contendo boro, polióis, aldeídos peptídicos, outros estabilizantes e misturas dos mesmos. Compostos contendo boro:
[00114] Os compostos contendo boro (componente (c)) podem ser selecionados de ácido bórico ou seus derivados e de ácido borônico ou seus derivados tais como ácidos aril borônicos ou seus derivados, de sais dos mesmos e de misturas dos mesmos. O ácido bórico aqui pode ser chamado de ácido ortobórico.
[00115] Em uma modalidade, o composto contendo boro (componente (c)) é selecionado do grupo consistindo de ácidos aril borônicos e seus derivados. Em uma modalidade, composto contendo boro é selecionado do grupo consistindo de ácido benzeno borônico (BBA) que também é chamado de ácido fenil borônico (PBA), derivados dos mesmos e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, os derivados do ácido fenil borônico são selecionados do grupo consistindo dos derivados da fórmula (IIIa) e fórmula (IIIb): (IIIa) (IIIb) em que R1 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, hidróxi, alquila C1-C6 não substituída ou substituída e alquenila C1-C6 não substituída ou substituída; em uma modalidade preferida, R é selecionado do grupo
34 / 75 consistindo de hidróxi e alquila C1 não substituída; R2 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, hidróxi, alquila C1-C6 não substituída ou substituída e alquenila C1-C6 não substituída ou substituída; em uma modalidade preferida, R é selecionado do grupo consistindo de H, hidróxi e alquila C1 substituída.
[00116] Em uma modalidade derivados do ácido fenil-borônico (componente (c)) são selecionados do grupo consistindo de ácido 4-formil fenil borônico (4-FPBA), ácido 4-carbóxi fenil borônico (4-CPBA), ácido 4- (hidroximetil) fenil borônico (4-HMPBA) e ácido p-tolilborônico (p-TBA).
[00117] Outros derivados adequados (componente (c)) incluem: ácido 2-tienil borônico, ácido 3-tienil borônico, ácido (2-acetamidofenil) borônico, ácido 2-benzofuranil borônico, ácido 1-naftil borônico, ácido 2-naftil borônico, 2-FPBA, 3-FBPA, ácido 1-tiantrenil borônico, ácido 4- dibenzofuran borônico, ácido 5-metil-2-tienil borônico, ácido 1-benzotiofeno- 2 borônico, ácido 2-furanil borônico, ácido 3-furanil borônico, ácido 4,4 bifenil-diborônico, ácido 6-hidróxi-2-naftaleno borônico, ácido 4-(metiltio) fenil borônico, ácido 4-(trimetilsilil) fenil borônico, ácido 3-bromotiofeno borônico, ácido 4-metiltiofeno borônico, ácido 2-naftil borônico, ácido 5- bromotiofeno borônico, ácido 5-clorotiofeno borônico, ácido dimetiltiofeno borônico, ácido 2-bromofenil borônico, ácido 3-clorofenil borônico, ácido 3- metóxi-2-tiofeno borônico, ácido p-metil-feniletil borônico, ácido 2-tiantrenil borônico, ácido di-benzotiofeno borônico, ácido 9-antraceno borônico, ácido 3,5 diclorofenil borônico, anidrido do ácido difenil borônico, ácido o- clorofenil borônico, ácido p-clorofenil borônico, ácido m-bromofenil borônico, ácido p-bromofenil borônico, ácido p-fluorofenil borônico, ácido octil borônico, ácido 1,3,5 trimetilfenil borônico, ácido 3-cloro-4-fluorofenil borônico, ácido 3-aminofenil borônico, ácido 3,5-bis-(trifluorometil) fenil borônico, ácido 2,4 diclorofenil borônico, ácido 4-metoxifenil borônico e misturas dos mesmos.
35 / 75 Polióis:
[00118] Polióis (componente (c)) podem ser selecionados de polióis contendo de 2 a 6 grupos hidroxila. Os exemplos adequados incluem glicol, propileno glicol, 1,2-propano diol, 1,2-butano diol, etileno glicol, hexileno glicol, glicerol, sorbitol, manitol, eritriol, glicose, frutose, lactose e eritritan. Aldeídos peptídicos:
[00119] Os aldeídos peptídicos (componente (c)) podem ser selecionados de aldeídos di-, tri- ou tetrapeptídicos e análogos de aldeído (da forma B1-BO-R em que, R é H, CH3, CX3, CHX2 ou CH2X (X = halógeno), BO é um resíduo de aminoácido único (em uma modalidade com uma cadeia lateral alifática ou aromática opcionalmente substituída); e B1 consiste de um ou mais resíduos de aminoácido (em uma modalidade um, dois ou três), opcionalmente compreendendo um grupo de proteção de terminal N ou como descrito na WO 09/118375 e WO 98/13459 ou um inibidor de protease do tipo de proteína tal como RASI, BASI, WASI (inibidores bifuncionais de alfa-amilase/subtilisina de arroz, cevada e trigo) ou CI2 ou SSI. Outros estabilizantes:
[00120] Outros estabilizantes (componente (c)) podem ser selecionados de sais como NaCl ou KCl e sais alcalinos de ácido láctico e ácido fórmico.
[00121] Outros estabilizantes (componente (c)) podem ser selecionados de fontes solúveis em água de íons zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas que provêem tais íons para as enzimas, assim como outros íons metálicos (por exemplo bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), estanho (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II) e oxovanádio (IV)). Os compostos que estabilizam uma preparação de enzima líquida como tal
[00122] Os compostos que estabilizam uma preparação de enzima líquida como tal significa qualquer composto exceto estabilizantes de enzima
36 / 75 necessários para estabilizar a estabilidade na armazenagem de uma preparação líquida em quantidades eficazes para garantir a estabilidade na armazenagem.
[00123] A estabilidade na armazenagem no contexto de preparações líquidas para aqueles versados na técnica usualmente inclui aspectos de aparência dos produtos e uniformidade de dosagem.
[00124] A aparência do produto é influenciada pelo pH do produto e pela presença de compostos tais como conservantes, antioxidantes, modificadores de viscosidade, emulsificantes, etc.
[00125] A uniformidade de dosagem é usualmente relacionada com a homogeneidade de um produto. Conservantes:
[00126] Uma preparação de enzima líquida da invenção pode compreender pelo menos um conservante. Os conservantes são adicionados em quantidades eficazes na prevenção de contaminação microbiana da preparação de enzima líquida, preferivelmente da preparação de enzima aquosa.
[00127] Os exemplos não limitando de conservantes adequados incluem compostos de amônio (quaternário), isotiazolinonas, ácidos orgânicos e agentes de liberação formaldeído. Os exemplos não limitantes de compostos de amônio (quaternários) adequados incluem cloretos de benzalcônio, polihexametileno biguanida (PHMB), Cloreto de didecildimetilamônio (DDAC) e N-(3-aminopropil)-N-dodecilpropano-1,3-diamina (Diamina). Os exemplos não limitantes de isotiazolinonas adequados incluem 1,2- benzisotiazolin-3-ona (BIT), 2-metil-2H-isotiazol-3-ona (MIT), 5-cloro-2- metil-2H-isotiazol-3-ona (CIT), 2-octil-2H-isotiazol-3-ona (OIT) e 2-butil- benzo[d]isotiazol-3-ona (BBIT). Os exemplos não limitantes de ácidos orgânicos adequados incluem ácido benzóico, ácido sórbico, ácido L-(+)- láctico, ácido fórmico e ácido salicílico. Os exemplos não limitantes de agente
37 / 75 de liberação de formaldeídos adequados incluem N,N’-metilenobismorfolina (MBM), 2,2’,2”-(hexahidro-1,3,5-triazino-1,3,5-triil)trietanol (HHT), (etilenodióxi)dimetanol, .alfa.,.alfa.’,.alfa.”-trimetil-1,3,5-triazino-1,3,5- (2H,4H,6H)-trietanol (HPT), 3,3’-metilenobis[5-metiloxazolidina] (MBO) e cloreto de cis-1-(3-cloroalil)-3,5,7-triaza-1-azonioadamantano (CTAC).
[00128] Os conservantes úteis adicionais incluem butilcarbamato de iodopropinila (IPBC), compostos de liberação de halógeno tal como dicloro- dimetil-hidantoína (DCDMH), bromo-cloro-dimetil-hidantoína (BCDMH) e dibromo-dimetil-hidantoína (DBDMH); compostos de bromo-nitro tais como Bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol), 2,2-dibromo-2-cianoacetamida (DBNPA); aldeídos tais como glutaraldeído; fenoxietanol; Bifenil-2-ol; e piritiona de zinco ou sódio. Tensoativos:
[00129] Uma preparação de enzima líquida da invenção pode compreender pelo menos um tensoativo (componente (c)). Os exemplos de tensoativos incluem tensoativos não iônicos, tensoativos anfotéricos, tensoativos aniônicos e tensoativos catiônicos, daqui em diante também aludidos como tensoativos não iônico (componente (c)), tensoativos anfotéricos (componente (c)), tensoativos aniônicos (componente (c)) e tensoativos catiônicos (componente (c)). Em uma modalidade, uma preparação de enzima líquida da invenção compreende pelo menos um tensoativo selecionado de tensoativos não iônicos, de tensoativos anfotéricos e tensoativos aniônicos.
[00130] Uma preparação de enzima líquida pode conter 0,1 a 60% em peso em relação ao peso total da preparação de enzima de tensoativo (componente (c)). O componente (c) pode compreender pelo menos um composto selecionado de tensoativos aniônicos, tensoativos não iônicos, tensoativos anfotéricos e tensoativos de óxido de amina assim como combinações de pelo menos dois dos precedentes. Em uma modalidade, uma
38 / 75 preparação de enzima da invenção contém 5 a 30 % em peso de tensoativo aniônico e pelo menos um tensoativo não iônico, por exemplo na faixa de 3 a 20% em peso, todos em relação ao peso total da preparação de enzima.
[00131] Pelo menos um tensoativo não iônico (componente (c)) pode ser selecionado de álcoois alcoxilados, copolímeros de di- e multibloco de óxido de etileno e óxido de propileno e produtos de reação de sorbitano com óxido de etileno ou óxido de propileno, alquil poliglicosídeos (APG), ésteres de hidroxialquila misturados e óxidos de amina.
[00132] Os exemplos preferidos de álcoois alcoxilados e álcoois graxos alcoxilados são, por exemplo, compostos da fórmula geral (IV) (IV) em que R3 é idêntico ou diferente e selecionado de hidrogênio e alquila C1-C10 linear, preferivelmente em cada caso idênticos e etila e de modo particularmente preferível hidrogênio ou metila, R4 é selecionado de alquila C8-C22, ramificado ou linear, por exemplo n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C14H29, n-C16H33 ou n-C18H37, R5 é selecionado de alquila C1-C10, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, sec- pentila, neopentila, 1,2-dimetilpropila, isoamila, n-hexila, isohexila, sec- hexila, n-heptila, n-octila, 2-etilhexila, n-nonila, n-decila ou isodecila.
[00133] As variáveis m e n estão na faixa de zero a 300, onde a soma de n e m é pelo menos um, preferivelmente na faixa de 3 a 50. Preferivelmente, m está na faixa de 1 a 100 e n está na faixa de 0 a 30.
[00134] Em uma modalidade, os compostos da fórmula geral (III) pode ser copolímeros de bloco ou copolímeros de aleatórios, preferência sendo
39 / 75 dada aos copolímeros de bloco.
[00135] Outros exemplos preferidos de álcoois alcoxilados são, por exemplo, compostos da fórmula geral (V): (V) em que R6 é idêntico ou diferente e selecionado de hidrogênio e alquila C1-C10 linear, preferivelmente idêntico em cada caso e etila e de modo particular preferível hidrogênio ou metila, R7 é selecionado de alquila C6-C20, ramificado ou linear, em particular n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C13H27, n-C15H31, n-C14H29, n- C16H33, n-C18H37, a é um número na faixa de zero a 10, preferivelmente de 1 a 6, b é um número na faixa de 1 a 80, preferivelmente de 4 a 20, c é um número na faixa de zero a 50, preferivelmente 4 a 25.
[00136] A soma a + b + c está preferivelmente na faixa de 5 a 100 ainda mais preferivelmente na faixa de 9 a 50.
[00137] Os exemplos preferidos para os éteres mistos de hidroxialquila são compostos da fórmula geral (VI) (VI) em que as variáveis são definidas como segue: R8 é idêntico ou diferente e selecionado de hidrogênio e alquila C1-C10 linear, preferivelmente em cada caso idêntico e etila e de modo
40 / 75 particularmente preferível hidrogênio ou metila, R9 é selecionado de alquila C8-C22, ramificado ou linear, por exemplo iso-C11H23, iso-C13H27, n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C14H29, n- C16H33 ou n-C18H37, R10 é selecionado de alquila C1-C18, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, sec- pentila, neopentila, 1,2-dimetilpropila, isoamila, n-hexila, isohexila, sec- hexila, n-heptila, n-octila, 2-etilhexila, n-nonila, n-decila, isodecila, n- dodecila, n-tetradecila, n-hexadecila e n-octadecila.
[00138] As variáveis m e x estão na faixa de zero a 300, onde a soma de n e m é pelo menos um, preferivelmente na faixa de 5 a 50. Preferivelmente, m está na faixa de 1 a 100 e n está na faixa de 0 a 30.
[00139] Os compostos das fórmulas gerais (V) e (VI) podem ser copolímeros de bloco ou copolímeros aleatórios, preferência sendo dada aos copolímeros de bloco.
[00140] Os tensoativos não iônicos adequados adicionais são selecionados de copolímeros de di- e multiblocos, compostos de óxido de etileno e óxido de propileno. Os tensoativos não iônicos adequados adicionais são selecionados de ésteres de sorbitano etoxilados ou propoxilados. Óxidos de amina ou alquil poliglicosídeos especialmente alquila C4-C18 poliglicosídeos lineares e alquil C8-C18 poliglicosídeos ramificados tais como compostos da fórmula média geral (VII) são igualmente adequados.
(VII) em que: R11 é alquila C1-C4, em particular etila, n-propila ou isopropila, R12 é -(CH2)2-R11,
41 / 75 G1 é selecionado de monossacarídeos com 4 a 6 átomos de carbono especialmente de glicose e xilose, y na faixa de 1,1 a 4, y sendo um número médio.
[00141] Exemplos adicionais de tensoativos não iônicos são compostos das fórmulas gerais (VIIIa) e (VIIIb)
O O 3 (AO)w (AO)w1 (A O)w3 13 14 13 R O R R O (EO)w2 14
R (VIIIa) (VIIIb) em que AO é selecionado de óxido de etileno, óxido de propileno e óxido de butileno, EO é óxido de etileno, CH2CH2-O, R13 é alquila C1-C4, em particular etila, n-propila ou isopropila, R14 selecionado de alquila C8-C18, ramificado ou linear A3O é selecionado de óxido de propileno e óxido de butileno, w é um número na faixa de 15 a 70, preferivelmente 30 a 50, w1 e w3 são números na faixa de 1 a 5 e w2 é um número na faixa de 13 a 35.
[00142] Uma vista geral de tensoativos não iônico adicionais adequados podem ser encontrados na EP-A 0 851 023 e na DE-A 198 19 187.
[00143] Em uma modalidade, uma preparação de enzima contém misturas de dois ou mais tensoativos não iônicos diferentes (componente (c)).
[00144] Pelo menos um tensoativo anfotérico (componente (c)) pode ser selecionado de tensoativos que portam uma carga positiva e uma negativa na mesma molécula sob condições de uso. Os exemplos preferidos de tensoativos anfotéricos são chamados de tensoativos de betaína. Muitos exemplos de tensoativos de betaína portam um átomo de nitrogênio quaternizado e um grupo de ácido carboxílico por molécula. Um exemplo particularmente preferido de tensoativos anfotéricos é cocamidopropil betaína
42 / 75 (lauramidopropil betaína).
[00145] Os exemplos de tensoativos de óxido de amina são compostos da fórmula geral (IX) R13R14R15N→O (IX) em que R13, R14 e R15 são selecionados independentemente um do outro de porções alifáticas, cicloalifáticas ou alquileno C2-C4, alquila C10- C20 amido. Preferivelmente, R12 é selecionado de alquila C8-C20 ou alquileno C2-C4, alquilamido C10-C20 e R13 e R14 são ambos metila.
[00146] Um exemplo particularmente preferido é lauril dimetil amino óxido, algumas vezes também chamado de óxido de lauramina. Um exemplo de modo adicionalmente particular preferido é cocamidilpropil dimetilamino óxido, algumas vezes também chamado de cocamidopropilamina óxido.
[00147] Pelo menos um tensoativo aniônico (componente (c)) pode ser selecionado de sais sulfatos de metal alcalino e amônio de alquila C8-C18, de sulfatos de poliéter de álcool graxo C8-C18, de hemi-ésteres de ácido sulfúrico de alquilfenóis C4-C12 etoxilados (etoxilação: 1 a 50 moles de óxido de etileno/mol), ésteres alquílicos de sulfo ácido graxo C12-C18, por exemplo de ésteres metílicos de ácido sulfo graxo C12-C18, além disso de ácidos alquilsulfônicos C12-C18 e de ácidos alquilarilsulfônicos C10-C18. Preferência é dada aos sais de metal alcalino dos compostos anteriormente mencionados, de modo particularmente preferível os sais de sódio.
[00148] Os exemplos específicos de tensoativos aniônicos (componente (c)) são compostos de acordo com a fórmula geral (X) CsH2s+1-O(CH2CH2O)t-SO3M (X) em que s sendo um número na faixa de 10 a 18, preferivelmente 12 a 14 e ainda mais preferivelmente s = 12, t sendo um número na faixa de 1 a 5, preferivelmente 2 a 4 e ainda mais preferivelmente 3.
43 / 75 M sendo selecionado de metais alcalinos, preferivelmente potássio e ainda mais preferivelmente sódio.
[00149] As variáveis s e t podem ser números médios e, portanto, elas não são necessariamente números inteiros, enquanto nas moléculas individuais de acordo com a fórmula (X), tanto s quanto t indicam números inteiros.
[00150] Os exemplos adicionais para tensoativos aniônicos adequados (componente (c)) são sabões, por exemplo os sais de sódio ou potássio de ácido esteárico, ácido oléico, carboxilatos éteres de ácido palmítico e fosfatos de alquiléter.
[00151] Em uma modalidade, a preparação de enzima inventiva é aquosa, contendo água em quantidades na faixa de 5% a 95 % em peso, na faixa de 5% a 30% em peso, na faixa de 5% a 25% em peso ou na faixa de 20% a 70% em peso, todos em relação ao peso total da preparação de enzima. A dita preparação de enzima pode conter solventes orgânicos em quantidades na faixa de 0% a 20% em peso em relação ao peso total da preparação de enzima. Em uma modalidade, a preparação de enzima contém água em quantidades na faixa de 5% a 15% em peso e nenhuma quantidade significante de solvente orgânico, por exemplo 1% em peso ou menos, todos em relação ao peso total da preparação de enzima.
[00152] As preparações enzimáticas inventivas podem ser alcalinas ou exibir um valor de pH neutro ou levemente ácido, por exemplo 6 a 14, 6,5 a 13, 8 a 10,5 ou 8,5 a 9.0. Preparação de formulação de enzima:
[00153] Uma invenção se refere a um processo para fabricar uma preparação de enzima, o dito processo compreendendo a etapa de misturar pelo menos o componente (a) como descrito acima e o componente (b) como descrito acima.
[00154] O componente (b) pode ser sólido. O componente (b) sólido
44 / 75 pode ser adicionado ao componente (a) sólido antes do contato de ambos com pelo menos um solvente. O pelo menos um solvente é como descrito acima. O contato com pelo menos um solvente pode resultar na solubilização de pelo menos uma molécula de componente (a) e pelo menos uma molécula de componente (b), resultando na estabilização de pelo menos uma molécula de componente (b). Em uma modalidade, os componentes sólidos (a) e (b) são completamente dissolvidos em pelo menos um solvente sem separação de fase.
[00155] O componente sólido (a) pode ser dissolvido em pelo menos um solvente antes de misturar com o componente (b) sólido ou líquido. Em uma modalidade, o componente (a) é completamente dissolvido em pelo menos um solvente antes de misturar com o componente (b). Pelo menos um solvente é como descrito acima.
[00156] O componente (b) pode ser líquido em que pelo menos uma enzima pode ser compreendida em um concentrado de enzima líquida como descrito acima. O componente (b) líquido pode ser suplementado com componente (a) sólido em que o componente (a) sólido dissolve no componente (b) líquido. Em uma modalidade, o componente (b) líquido é aquoso, preferivelmente resultante da fermentação.
[00157] Em uma modalidade, o componente (c) como descrito acima é misturado com os componentes (a) e (b) em que a mistura é distinguida em ser feita em uma ou mais etapas. Estabilização de enzima
[00158] A invenção se refere a um método de estabilizar o componente (b) pela etapa de adicionar o componente (a) em que os componentes (a) e (b) são aqueles descritos acima. Em uma modalidade, o componente (b) é líquida. Em uma modalidade, uma invenção se refere a um método de estabilizar o componente (b) na presença de pelo menos um tensoativo pela etapa de adicionar o componente (a) em que componentes (a) e (b) e pelo menos um
45 / 75 tensoativo são aqueles descritos acima. Em uma modalidade, a invenção se refere a um método de estabilizar o componente (b) pela etapa de adicionar o componente (a) em que o componente (b) compreende pelo menos uma lipase e pelo menos uma protease.
[00159] Uma invenção adicionalmente se refere a um método de estabilizar pelo menos uma enzima em formulações líquidas compreendendo a mistura sem nenhuma ordem especificada em uma ou mais etapas dos componentes (a) e (b) como descrito acima com um ou mais componentes de formulação. Em uma modalidade, as formulações líquidas são formulações de detergente.
[00160] Uma invenção se refere ao uso de componente (a) como aditivo para o componente (b). Em uma modalidade, os componentes (a) e (b) são sólidos e o componente (b) é estabilizado quando do contato da mistura dos componentes sólidos (a) e (b) com pelo menos um solvente. Pelo menos um solvente é como descrito acima. O contato com pelo menos um solvente pode resultar na solubilização de pelo menos uma molécula do componente (a) e pelo menos uma molécula do componente (b), resultando na estabilização de pelo menos uma molécula do componente (b). Em uma modalidade, os componentes sólidos (a) e (b) são completamente dissolvidos em pelo menos um solvente sem separação de fase.
[00161] A estabilização de uma enzima pode se referir à estabilidade no curso de tempo (por exemplo estabilidade na armazenagem), estabilidade térmica, estabilidade em pH e estabilidade química. O termo “estabilidade de enzima” aqui preferivelmente se refere à retenção da atividade enzimática como uma função de tempo por exemplo durante a armazenagem ou operação. O termo “armazenagem” aqui significa indicar o fato de produtos ou composições serem armazenadas a partir do tempo de serem fabricados até o ponto no tempo de serem usados na aplicação final. A retenção da atividade enzimática como uma função do tempo durante a armazenagem é chamada
46 / 75 “estabilidade na armazenagem”.
[00162] Para determinar mudanças na atividade enzimática com o tempo, a “atividade enzimática inicial” de uma enzima pode ser medida sob condições definidas no tempo zero (isto é, antes da armazenagem) e a “atividade enzimática depois da armazenagem” pode ser medida em um certo ponto no tempo mais tarde (isto é, depois da armazenagem).
[00163] A atividade enzimática depois da armazenagem dividida pela atividade enzimática inicial multiplicada por 100 dá a “atividade enzimática disponível na aplicação” (a%).
[00164] Uma enzima é estável de acordo com a invenção, quando a sua atividade enzimática “disponível na aplicação” é igual a 100% quando comparada com a atividade enzimática inicial antes da armazenagem. Uma enzima pode ser chamada estável dentro desta invenção se a sua atividade enzimática disponível na aplicação for pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% quando comparada com a atividade enzimática inicial antes da armazenagem.
[00165] Em uma modalidade, a atividade lipolítica disponível depois da armazenagem a 37°C durante 30 dias é pelo menos 60% quando comparada com a atividade lipolítica inicial antes da armazenagem.
[00166] Subtraindo a% de 100% dá a “perda de atividade enzimática durante a armazenagem” quando comparada com a atividade enzimática inicial antes da armazenagem. Em uma modalidade, uma enzima é estável de acordo com a invenção quando essencialmente nenhuma perda de atividade enzimática ocorre durante a armazenagem, isto é a perda na atividade enzimática é igual a 0% quando comparada com a atividade enzimática inicial antes da armazenagem. Essencialmente nenhuma perda de atividade
47 / 75 enzimática dentro desta invenção pode significar que a perda de atividade enzimática é menor do que 30%, menor do que 25%, menor do que 20%, menor do que 15%, menor do que 10%, menor do que 9%, menor do que 8%, menor do que 7%, menor do que 6%, menor do que 5%, menor do que 4%, menor do que 3%, menor do que 2% ou menor do que 1% quando comparada com a atividade enzimática inicial antes da armazenagem.
[00167] Em uma modalidade, a perda de atividade lipolítica depois da armazenagem a 37°C durante 30 dias é menor do que 40% quando comparada com a atividade lipolítica inicial antes da armazenagem.
[00168] Em um aspecto da invenção o componente (a) é usado para reduzir a perda da atividade enzimática durante a armazenagem de pelo menos uma enzima compreendida no concentrado de enzima líquida. A perda reduzida de atividade enzimática dentro desta invenção pode significar que a perda de atividade enzimática é reduzida em pelo menos 5% em pelo menos 10% em pelo menos 15% em pelo menos 20% em pelo menos 25% em pelo menos 30% em pelo menos 40% em pelo menos 50% em pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% quando comparada com a atividade enzimática inicial antes da armazenagem.
[00169] Em uma modalidade, a perda de atividade lipolítica depois da armazenagem a 37°C durante 30 dias é reduzida pelo componente (a) em pelo menos 60% quando comparada com a atividade lipolítica inicial antes da armazenagem.
[00170] Em uma modalidade, a perda de atividade proteolítica depois da armazenagem a 37°C durante 30 dias é reduzida pelo componente (a) em pelo menos 20% quando comparada com a atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.
48 / 75
[00171] As enzimas inibidas por um inibidor de enzima usualmente exibem atividade enzimática reduzida quando comparada com a atividade enzimática não inibida da dita enzima. A atividade enzimática medida depois de adicionar o inibidor de enzima dividida pela atividade enzimática inicial multiplicada por 100 pode ser chamada de “atividade enzimática residual” (b%) aqui. As enzimas podem ser chamadas de “estabilizadas” aqui quando elas exibem atividade enzimática residual (b%) que seja menor do que 50%, menor do que 45%, menor do que 40%, menor do que 35%, menor do que 30%, menor do que 25%, menor do que 20%, menor do que 15%, menor do que 10%, menor do que 5% ou menor do que 1% quando comparada com a atividade enzimática inicial antes da armazenagem. Uma enzima pode ser chamada estabilizada, se a sua atividade enzimática disponível na aplicação depois da liberação de um inibidor é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou 100% quando comparada com a atividade enzimática inicial antes da armazenagem. O inibidor pode ser chamado “estabilizante de enzima” aqui. Uso da preparação de enzima para os processos de formulação
[00172] A invenção em um aspecto se refere ao uso da preparação de enzima líquida da invenção a ser formulada em formulações detergentes em que os componentes (a) e (b) são misturados sem nenhuma ordem específica em uma ou mais etapas com um ou mais componentes detergentes.
[00173] Em um aspecto a invenção se refere à formulação detergente contendo a preparação de enzima líquida da invenção e um ou mais componentes de detergente.
[00174] Os componentes de detergente variam no tipo e/ou quantidade na formulação detergente dependendo da aplicação desejada tal como lavagem de produtos têxteis brancos, produtos têxteis coloridos e lã. O(s)
49 / 75 componente(s) escolhido(s) depende(m) adicionalmente da forma física da formulação detergente (líquida, sólida, gel, provida em bolsas ou como um tablete, etc.). O(s) componente(s) escolhido(s) por exemplo para formulações de lavagem de roupa depende(m) adicionalmente das convenções regionais que por si só são relacionadas com os aspectos como as temperaturas de lavagem usadas, mecânicas de máquina de lavagem de roupas (máquinas de eixo vertical vs. horizontal), o consumo de água por ciclo de lavagem, etc. e características geográficas como dureza média da água.
[00175] Os componentes detergentes individuais e o uso nas formulações detergentes são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os componentes detergentes adequados compreendem inter alia tensoativos, construtores, polímeros, alcalinos, sistemas de branqueamento, agentes de branqueamento fluorescente, supressores de espuma e estabilizantes, hidrótropos e inibidores de corrosão. Os exemplos adicionais são descritos por exemplo na “Technology Book on Detergents with Formulations completo (Detergent Cake, Dishwashing Detergents, Liquid & Paste Detergents, Enzyme Detergents, Cleaning Powder & Spray Dried Washing Powder)”, Engineers India Research Institute (EIRI), 6a edição (2015). Um outro livro de referência para aqueles versados na técnica pode ser “Detergent Formulations Encyclopedia”, Solverchem Publications, 2016.
[00176] É entendido que os componentes detergentes estão além dos componentes compreendidos na preparação de enzima da invenção. Se o componente compreendido na preparação de enzima da invenção também é o componente detergente, seriam as concentrações que necessitariam ser ajustadas para que o componente fosse eficaz para o propósito desejado na formulação detergente.
[00177] Os componentes detergentes podem ter mais do que uma função na aplicação final da formulação detergente, portanto qualquer componente de detergente mencionado no contexto da função específica aqui,
50 / 75 também pode ter uma outra função na aplicação final da formulação detergente. A função do componente detergente específico na aplicação final da formulação detergente usualmente depende da sua quantidade dentro da formulação de detergente, isto é a quantidade eficácia do componente de detergente.
[00178] O termo “quantidade eficaz” inclui quantidades de componentes individuais para prover remoção de mancha eficaz e/ou condições de limpeza eficazes (por exemplo pH, quantidade de espuma), quantidades de certos componentes para eficazmente prover benefícios ópticos (por exemplo abrilhantamento óptico, inibição de transferência de corante) e/ou quantidades de certos componentes para eficazmente ajudar o processamento (manter características físicas durante o processamento, armazenagem e uso; por exemplo modificadores de reologia, hidrótropos, dessecantes).
[00179] Em uma modalidade, a formulação detergente é a formulação de mais do que dois componentes detergentes em que pelo menos um componente é eficaz na remoção de manchas, pelo menos um componente é eficaz na provisão das condições de limpeza ótimas e pelo menos um componente é eficaz na manutenção das características físicas do detergente.
[00180] As formulações detergentes da invenção podem compreender componente (a) e componente (b) sendo dissolvidos em solvente. Dissolvido pode significar sendo dissolvido na formulação detergente global. Dissolvido pode significar componente (a) e componente (b) sendo parte da preparação de enzima líquida da invenção que pode ser encapsulada. A preparação de enzima líquida encapsulada pode ser parte de uma formulação detergente líquida ou parte de uma formulação detergente sólida.
[00181] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes contêm 0,5 a 20% em peso, particularmente 1 a 10% em peso de componente (b) e 0,01% a 10% de componente (a), mais particularmente 0,05
51 / 75 a 5% em peso e o mais particularmente 0,1% a 2% em peso de componente (a), todos em relação ao peso total da formulação detergente líquida.
[00182] As formulações detergentes da invenção podem compreender pelo menos um composto selecionado de construtores, polímeros, fragrâncias e corantes.
[00183] Em uma modalidade da presente invenção o componente (a) é usado como um construtor nas formulações detergentes em quantidades eficazes para prover a função de construtor desejada. Usando o componente (a) como construtor permite formulação detergente flexível com alto ou baixo teor de água. Para as formulações detergentes líquidas com baixo teor de água, nenhuma substância construtora adicional além do componente (a) pode ser usado. O baixo teor de água aqui pode significar pelo menos ≤ 30% em peso, pelo menos ≤ 20% em peso, pelo menos ≤ 10% em peso ou pelo menos ≤ 5% em peso, todos em relação ao peso total da formulação detergente.
[00184] Em uma modalidade, as formulações detergentes podem conter um ou mais construtores diferentes do componente (a).
[00185] As formulações detergentes inventivas podem conter até 40% em peso de um construtor detergente diferente do componente (a), tal como, mas não limitado a zeólito, fosfato, fosfonato, citrato, construtores poliméricos ou amino-carboxilatos tais como os sais de metal alcalino de iminodissuccinatos, por exemplo IDS-Na4, além disso ácido nitrilotriacético (“NTA”), ácido metilglicina diacético (“MGDA”), ácido glutâmico ácido diacético (“GLDA”), ácido etilenodiaminotetraacético (“EDTA”) ou ácido dietilenotriaminopentaacético (“DTPA”). Os sais de metal alcalino preferidos são os sais de potássio e especialmente os sais de sódio.
[00186] Os exemplos adicionais de construtores detergentes são polímeros com grupos de complexação como, por exemplo, polietilenoimina em que 20 a 90 % em mol dos átomos de N carregam pelo menos um grupo CH2COO- e os respectivos sais de metal alcalino dos sequestrantes acima
52 / 75 especialmente seus sais de sódio.
[00187] Os exemplos adicionais de polímeros adequados são polialquilenoiminas, por exemplo polietilenoiminas e polipropileno iminas. Os polialquilenoiminas podem ser usados como tais ou como derivados poli alcoxilados, por exemplos etoxilados ou propoxilados. As polialquilenoiminas contêm pelo menos três unidades de alquilenoimina por molécula.
[00188] Em uma modalidade da presente invenção, a dia unidade de alquilenoimina é uma unidade de alquileno C2-C10 diamina , por exemplo um 1,2-propilenodiamina, preferivelmente um α,ω-alquileno-C2-C10 diamina, por exemplo 1,2-etilenodiamina, 1,3-propilenodiamina, 1,4-butilenodiamina, 1,5- pentilenodiamina, 1,6-hexanodiamina (também sendo aludida como 1,6- hexilenodiamina), 1,8-diamina ou 1,10-decanodiamina, ainda mais preferidos são 1,2-etilenodiamina, 1,3-propilenodiamina, 1,4-butilenodiamina e 1,6- hexanodiamina.
[00189] Em uma outra modalidade da presente invenção, o dito polialquilenoimina é selecionado de unidade de polialquilenoimina, preferivelmente uma unidade polietilenoimina ou polipropilenoimina.
[00190] O termo “polietilenoimina” no contexto da presente invenção não apenas se refere aos homopolímeros de polietilenoimina mas também às polialquilenoiminas contendo elementos estruturais de NH-CH2-CH2-NH junto com outros elementos estruturais de alquileno diamina, por exemplo elementos estruturais de NH-CH2-CH2-CH2-NH elementos estruturais de NH- CH2-CH(CH3)-NH elementos estruturais de NH-(CH2)4-NH elementos estruturais de NH-(CH2)6-NH ou elementos estruturais de (NH-(CH2)8-NH mas os elementos estruturais de NH-CH2-CH2- NH sendo na maioria com respeito ao compartilhamento molar. As polietilenoiminas preferidas contêm elementos estruturais de NH-CH2-CH2-NH sendo na maioria com respeito ao compartilhamento molar, por exemplo totalizando 60 % em mol ou mais, mais preferivelmente totalizando pelo menos 70 % em mol, referindo-se a
53 / 75 todos os elementos estruturais de alquilenoimina. Em uma modalidade especial, o termo polietilenoimina se refere àqueles polialquilenoiminas que carregam apenas um ou zero elemento estrutural de alquilenoimina por unidade de polietilenoimina que é diferente de NH-CH2-CH2-NH.
[00191] O termo “polipropilenoimina” no contexto da presente invenção não apenas se refere aos homopolímeros de polipropilenoimina mas também às polialquilenoiminas contendo elementos estruturais de NH-CH2- CH(CH3)-NH junto com outros elementos estruturais de alquileno diamina, por exemplo elementos estruturais de NH-CH2-CH2-CH2-NH elementos estruturais de NH-CH2-CH2-NH elementos estruturais de NH-(CH2)4-NH elementos estruturais de NH-(CH2)6-NH ou elementos estruturais de (NH- (CH2)8-NH mas os elementos estruturais de NH-CH2-CH(CH3)-NH sendo na maioria com respeito ao compartilhamento molar. As polipropilenoiminas preferidas contêm elementos estruturais de NH-CH2-CH(CH3)-NH sendo na maioria com respeito ao compartilhamento molar, por exemplo totalizando 60 % em mol ou mais, mais preferivelmente totalizando pelo menos 70 % em mol, referindo-se a todos os elementos estruturais de alquilenoimina. Em uma modalidade especial, o termo polipropilenoimina se refere àquelas polialquilenoiminas que carregam apenas um ou zero elemento estrutural de alquilenoimina por polipropileno-imina unidade que é diferente de NH-CH2- CH(CH3)-NH.
[00192] As ramificações podem ser grupos alquilenoamino tais como, mas não limitados a grupos de -CH2-CH2-NH2 ou grupos de (CH2)3-NH2. As ramificações mais longas podem ser, por exemplos, grupos de -(CH2)3- N(CH2CH2CH2NH2)2 ou -(CH2)2-N(CH2CH2NH2)2. As polietilenoiminas altamente ramificadas são, por exemplo, dendrímeros de polietilenoimina ou moléculas relacionadas com um grau de ramificação na faixa de 0,25 a 0,95, preferivelmente na faixa de 0,30 a 0,80 e de modo particularmente preferível pelo menos 0,5. O grau de ramificação pode ser determinado por exemplo
54 / 75 13 pela espectroscopia de C-RMN ou 15N-RMN, preferivelmente em D2O e é definido como segue: DB = D+T/D+T+L com D (dendrítico) correspondendo à fração dos grupos amino terciários, L (linear) correspondendo à fração dos grupos amino secundários e T (terminal) correspondendo à fração dos grupos amino primários.
[00193] Dentro do contexto da presente invenção, as unidades de polietilenoimina ramificadas são unidades de polietilenoimina com DB na faixa de 0,25 a 0,95, de modo particularmente preferível na faixa de 0,30 a 0,90% e de modo muito particularmente preferível pelo menos 0,5. As unidades de polietilenoimina preferidas são aquelas que exibem pouca ou nenhuma ramificação, assim predominantemente lineares ou unidades de polietilenoimina lineares.
[00194] No contexto da presente invenção, grupos CH3 não estão sendo considerados como ramificados.
[00195] Em uma modalidade da presente invenção a polialquilenoimina pode ter um valor de amina primária na faixa de 1 a 1000 mg de KOH/g, preferivelmente de 10 a 500 mg de KOH/g, mais preferido de 50 a 300 mg de KOH/g. O valor de amina primária pode ser determinado de acordo com ASTM D2074-07.
[00196] Em uma modalidade da presente invenção a polialquilenoimina pode ter um valor de amina secundária na faixa de 10 a 1000 mg de KOH/g, preferivelmente de 50 a 500 mg de KOH/g, mais preferido de 50 a 500 mg de KOH/g. O valor da amina secundária pode ser determinado de acordo com ASTM D2074-07.
[00197] Em uma modalidade da presente invenção a polialquilenoimina pode ter um valor de amina terciária na faixa de 1 a 300 mg de KOH/g, preferivelmente de 5 a 200 mg de KOH/g, mais preferido de 10 a 100 mg de KOH/g. O valor da amina terciária pode ser determinado de
55 / 75 acordo com ASTM D2074-07.
[00198] Em uma modalidade da presente invenção, o compartilhamento molar de átomos N terciários é determinado pela 15 espectroscopia de N-RMN. No caso que o valor da amina terciária e o resultado de acordo com a espectrometria de 13C-RMN são inconsistentes, aos resultados obtidos pela espectroscopia de 13C-RMN será dada a preferência.
[00199] Em uma modalidade da presente invenção, o peso molecular médio Mw da dita polialquilenoimina está na faixa de 250 a 100.000 g/mol, preferivelmente até 50.000 g/mol e mais preferivelmente de 800 até 25.000 g/mol. O peso molecular médio Mw de polialquilenoimina pode ser determinado pela cromatografia de permeação de gel (GPC) do respectivo intermediário de polialquilenoimina, com 1,5 % em peso de ácido fórmico aquoso como eluente e metacrilato de poli-hidroxietila reticulado como fase estacionária.
[00200] A dita polialquilenoimina pode ser livre ou alcoxilada, a dita alcoxilação sendo selecionada de etoxilação, propoxilação, butoxilação e combinações de pelo menos dois dos precedentes. Preferência é dada ao óxido de etileno, 1,2-óxido de propileno e as misturas de óxido de etileno e 1,2- óxido de propileno. Se misturas de pelo menos dois óxidos de alquileno são aplicadas elas podem ser reagidas por etapas ou simultaneamente.
[00201] Em uma modalidade da presente invenção, uma polialquileno- imina alcoxilada carrega pelo menos 6 átomos de nitrogênio por unidade.
[00202] Em uma modalidade da presente invenção, polialquilenoimina é alcoxilada com 2 a 50 moles de óxido de alquileno por grupo NH, preferivelmente 5 a 30 moles de óxido de alquileno por grupo NH, ainda mais preferido 5 a 25 moles de óxido de etileno ou 1,2-óxido de propileno ou combinações destes por grupo NH. No contexto da presente invenção, uma unidade NH2 é contada como dois grupos NH. Preferivelmente, todos - ou quase todos – os grupos NH são alcoxilados e não existe nenhuma quantidade
56 / 75 detectável de grupos NH deixados.
[00203] Dependendo da fabricação de tal polialquilenoimina alcoxilada, a distribuição do peso molecular pode ser estreita ou ampla. Por exemplo, a polidispersividade Q = Mw/Mn na faixa de 1 a 3, preferivelmente pelo menos 2 ou pode ser maior do que 3 e até 20, por exemplo 3,5 a 15 e ainda mais preferido na faixa de 4 a 5,5.
[00204] Em uma modalidade da presente invenção, a polidispersividade Q da polialquilenoimina alcoxilada está na faixa de 2 a 10.
[00205] Em uma modalidade da presente invenção a polialquilenoimina alcoxilada é selecionada de polietilenoimina polietoxilada, polipropilenoimina etoxilada, α,ω-hexanodiaminas etoxiladas, polietilenoimina etoxiladas e propoxiladas, polipropilenoimina etoxiladas e propoxiladas e α,ω-hexanodiaminas etoxiladas e polipropoxiladas.
[00206] Em uma modalidade da presente invenção o peso molecular médio Mn (número médio) de polietilenoimina alcoxilada está na faixa de
2.500 a 1.500.000 g/mol, determinada pela GPC, preferivelmente até 500.000 g/mol.
[00207] Os exemplos de tampões são monoetanolamina e N,N,N- trietanolamina.
[00208] Os exemplos de desespumantes são silicones.
[00209] Os exemplos de fragrâncias são salicilato de benzila, 2-(4-terc- butilfenil) 2-metilpropional, comercialmente disponíveis como Lilial® e hexil cinamaldeído.
[00210] Os exemplos de corantes são Azul Ácido 9, Amarelo Ácido 3, Amarelo Ácido 23, Amarelo Ácido 73, Pigmento Amarelo 101, Verde Ácido 1, Solvente Verde 7 e Verde Ácido 25.
[00211] As formulações detergentes líquidas podem compreender pelo menos um composto selecionado de solventes orgânicos, conservantes, modificadores de viscosidade e hidrótropos.
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[00212] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes líquidas contêm quantidades de solventes orgânicos são 0,5 a 25% em peso, em relação ao peso total da formulação detergente líquida. Especialmente quando formulações detergentes líquidas inventivas são providas em bolsas ou similares, 8 a 25% em peso de solvente(s) orgânico(s) em relação ao peso total da formulação detergente líquida podem estar contidos. Os solventes orgânicos são aqueles descritos acima.
[00213] As formulações detergentes líquidas inventivas podem conter um ou mais conservantes selecionados daqueles descritos acima em quantidades eficazes em evitar a contaminação microbiana da formulação detergente líquida.
[00214] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes líquidas contêm um ou mais modificadores de viscosidade. Os exemplos não limitantes de modificadores de viscosidade adequados include ágar-ágar, carragenina, tragacanto, goma arábica, alginatos, pectinas, hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose, amido, gelatina, goma de alfarrobeira, poli(met)acrliatos reticulados, por exemplo ácido poliacrílico reticulado com bis-(met)acrilamida, além disso ácido silícico, argila tal como – mas não limitada a – montmorilonita, zeólito, dextrina e caseína. Modificadores de viscosidade podem estar contidos em quantidades eficazes na provisão da viscosidade desejada.
[00215] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes líquidas contêm um ou mais hidrótropos que podem ser solventes orgânicos tais como etanol, isopropanol, etileno glicol, 1,2-propileno glicol e solventes orgânicos adicionais que sejam miscíveis em água sob condições normais sem limitação. Exemplos adicionais de hidrótropos adequados são os sais de sódio do ácido tolueno sulfônico, do ácido xileno sulfônico e do ácido cumeno sulfônico. Hidrótropos podem estar contidos em quantidades que facilitam ou possibilitam a dissolução de compostos que exibem solubilidade
58 / 75 limitada em água.
[00216] “Formulação detergente” ou “formulação de limpeza” aqui significam formulações designadas para limpar material sujo. Limpeza inclui lavagem de roupas e limpeza de superfícies duras. Material sujo de acordo com a invenção inclui produtos têxteis e/ou superfícies duras.
[00217] O termo “lavagem de roupas” se refere tanto à lavagem de roupa doméstica quanto a lavagem de roupa industrial e significa o processo de tratar produtos têxteis com uma solução contendo uma formulação detergente da presente invenção. O processo de lavagem de roupas pode ser realizado usando-se dispositivos técnicos tais como uma máquina de lavagem doméstica ou uma industrial. Alternativamente, o processo de lavagem de roupas pode ser feito manualmente.
[00218] O termo “produto têxtil” significa qualquer material têxtil incluindo fios (linha de cozer feita de fibras naturais ou sintéticas usadas para tricô ou tecelagem), intermediários de fio, fibras, materiais não tecidos, materiais naturais, materiais sintéticos, assim como tecidos (um produto têxtil fabricado pela tecelagem, tricotagem ou feltragem de fibras) fabricados destes materiais tais como artigos de vestuário (qualquer artigo de roupa fabricado de produto têxtil), panos e outros artigos.
[00219] O termo “fibras” inclui fibras naturais, fibras sintéticas e misturas das mesmas. Os exemplos de fibras naturais são de planta (tal como linho, juta e algodão) ou origem animal, compreendendo proteínas como colágeno, queratina e fibroína (por exemplo seda, lá de ovelhas, angorá, pelo de cabra angorá, caxemira). Os exemplos para fibras de origem sintética são fibras de poliuretano tais como Spandex® ou Lycra®, fibras de poliéster, poliolefinas tais como elastofina ou fibras de poliamida tais como náilon. As fibras podem ser fibras únicas ou partes de produtos têxteis tais como roupa de malha, tecidos ou não tecidos.
[00220] O termo “limpeza de superfície dura” é definido aqui como
59 / 75 limpeza de superfícies duras em que as superfícies duras podem incluir quaisquer superfícies duras nos utensílios domésticos, tais como pisos, móveis, paredes, cerâmicas sanitárias, vidro, superfícies metálicas incluindo talheres ou louças.
[00221] O termo “lavar louças” se refere a todas as formas de lavagem de louças, por exemplo manualmente ou lava louças automática. A lavagem de louça inclui, mas não é limitada à limpeza de todas as formas de louça tais como pratos, xícaras, copos, tigelas, todas as formas de talheres tais como colheres, facas, garfos e utensílios para servir assim como cerâmicas, plásticos tais como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílicos. Uso adicional
[00222] A invenção se refere a um método para remover manchas compreendendo as etapas de contatar uma mancha com uma formulação detergente compreendendo os componentes (a) e (b) e um ou mais componentes detergentes. Em uma modalidade, a formulação detergente compreende a preparação de enzima da invenção. Em uma modalidade, o método se refere à remoção de manchas compreendendo gordura.
[00223] As gorduras podem ser subclassificadas como gordura, graxa ou óleo dependendo da temperatura de fusão. Óleo é usualmente líquido na temperatura ambiente. Graxa tem uma viscosidade mais alta do que o óleo na temperatura ambiente e pode ser chamado de pastoso.
[00224] Em uma modalidade, a remoção de manchas compreendendo gordura é feita em temperaturas ≤ 40°C, é particularmente em temperaturas ≤ 30°C. Exemplos
[00225] A invenção será adicionalmente ilustrada pelos exemplos de trabalho.
[00226] Observações gerais: as percentagens são por cento em peso a menos que especificamente de outro modo mencionado.
60 / 75
[00227] A acetilcolina (A.12) foi adquirida da Sigma Aldrich. O contraíon foi cloreto.
[00228] O precursor de (A.14) pode ser produzido diretamente ao invés do uso de HCl na etoxilação de trimetilamina ou via reação de hidrogeno carbonato de colina com metanossulfônico, ver Constantinescu et al em Chem. Eng. Data, 2007, 52 1280-1285. I. Síntese de Sais (componente (a))
[00229] Com base nas quantidades de água separada por destilação e pela espectroscopia de IR seria mostrado as reações de esterificação foram completas.
[00230] Ácido metanossulfônico a 90% se refere a uma mistura de 10 % de água e ácido metanossulfônico a 90%. I.1 Síntese de sal inventivo (A.1):
[00231] Uma quantidade de 225 g de (1,5 mole) ácido tartárico foi dissolvida em 280 g de uma solução aquosa a 75% em peso de cloreto de colina (1,5 mole). A água foi removida dentro de 45 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 15 g de ácido metanossulfônico aquoso a 90% em peso foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 200 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 617 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 7,8 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.1) foi obtido. I.2 Síntese de sal inventivo (A.2):
[00232] Uma quantidade de 150 g de ácido tartárico (1,0 mole) foi dissolvida em 374 g de uma solução aquosa a 75% em peso de cloreto de
61 / 75 colina (2,0 moles). A água foi removida dentro de 45 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 15 g de ácido metanossulfônico a 90% em peso foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 200 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 607 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 8,7 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.2) foi obtido. I.3 Síntese de sal inventivo (A.3):
[00233] Uma quantidade de 210 g de ácido cítrico mono-hidratado (1,0 mol) foi dissolvida em 374 g de uma solução aquosa a 75% em peso de cloreto de colina (2,0 moles). A água foi removida dentro de 45 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 18 g de ácido metanossulfônico a 90% em peso foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa, a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 200 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 607 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 10,3 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.3) foi obtido. I.4 Síntese de sal inventivo (A.4):
[00234] Uma quantidade de 210 g de ácido cítrico mono-hidratado (1,0 mol) foi dissolvida em 561 g de uma solução aquosa a 75% em peso de cloreto de colina (3,0 moles). A água foi removida dentro de 45 minutos em
62 / 75 um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 18 g de ácido metanossulfônico a 90% em peso foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 270 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 868 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 9,6 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.4) foi obtido. I.5 Síntese de sal inventivo (A.5):
[00235] Uma quantidade de 210 g de ácido cítrico mono-hidratado (1,0 mol) foi dissolvida em 485 g de uma solução aquosa a 75% em peso de metanossulfonato de colina (2,0 mol). A água foi removida dentro de 45 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 18 g de ácido metanossulfônico a 90% em peso foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 200 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 663 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 12,5 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.5) foi obtido. I.6 Síntese de sal inventivo (A.6):
[00236] Uma quantidade de 98,1 g de anidrido maléico (1,0 mol) foi misturada com 363 g de metanossulfonato de colina (2,0 moles) como substância seca. A mistura foi aquecida em um evaporador rotativo a 135°C. Depois de uma hora de mistura uma quantidade de 12 g de ácido
63 / 75 metanossulfônico (puro) foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de mistura a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 200 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 653 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 8,9 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.6) foi obtido. I.7 Síntese de sal inventivo (A.7):
[00237] Uma quantidade de 210 g de ácido cítrico mono-hidratado (1,0 mol) foi dissolvida em 437 g de uma solução aquosa a 70% em peso de cloreto de beta-metil colina (HO-CH(CH3)-CH2-N(CH3)3 Cl, 2,0 moles). A água foi removida dentro de 45 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 18 g de ácido metanossulfônico a 90% em peso foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 200 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 676 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 12,3 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.7) foi obtido. I.8 Síntese de sal inventivo (A.8):
[00238] Uma quantidade de 105 g de ácido cítrico mono-hidratado (0,5 mol) foi dissolvida em 327 g de uma solução aquosa a 70% em peso de cloreto de beta-metil colina (1,5 mol). A água foi removida dentro de 45 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 13 g de ácido
64 / 75 metanossulfônico a 90% em peso foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 170 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 471 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 21,7 g de trietanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.8) foi obtido. I.9 Síntese de sal inventivo (A.9):
[00239] Uma quantidade de 210 g de ácido cítrico mono-hidratado (1,0 mol) foi dissolvida em 520 g de uma solução aquosa a 70% em peso de cloreto de beta-n-propil colina (2,0 moles). A água foi removida dentro de 45 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 18 g de ácido metanossulfônico a 90% foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 250 g de propileno glicol. Uma quantidade de 774 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 11,9 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.9) foi obtido. I.10 Síntese de sal inventivo (A.10):
[00240] Uma quantidade de 210 g de ácido cítrico mono-hidratado (1,0 mol) foi dissolvida em 520 g de uma solução aquosa de 70% de cloreto de dimetilmonobutilcolina (2,0 moles). A água foi removida dentro de 45 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 18 g de ácido metanossulfônico a 90% foi adicionada e a temperatura foi elevada para
65 / 75 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 200 g de propileno glicol. Uma quantidade de 788 g de um líquido amarelado. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 11,4 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.10) foi obtido. I.11 Síntese de sal inventivo (A.11):
[00241] Uma quantidade de 105 g de ácido cítrico mono-hidratado (0,5 mol) foi dissolvida em 397 g de uma solução aquosa a 60% em peso de cloreto de dimetil n-octilcolina (1,0 mol). A água foi removida dentro 90 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 9,5 g de ácido metanossulfônico a 90% foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 200 g de propileno glicol. Uma quantidade de 470 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 200 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 8,9 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.11) foi obtido. I.13 Síntese de sal inventivo (A.13):
[00242] Uma quantidade de 85 g ácido gálico (ácido 3,4,5-tri-hidróxi- benzóico, 0,5 mol) foi dispersa em 121 g de uma solução aquosa a 75% em peso de metanossulfonato de colina (0,5 mol). A água foi removida dentro 90 minutos em um evaporador rotativo (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 100 a 120°C, 50 a 80 mbar. Uma quantidade de 8 g de ácido metanossulfônico a 90% foi adicionada e a temperatura foi elevada para 145°C em uma pressão de 800 mbar. Depois de uma hora de evaporação
66 / 75 rotativa a pressão foi continuamente reduzida para 10 mbar enquanto a água foi removida por mais 4,5 h a 145°C. Uma substância amarelada clara foi obtida depois foi diluída com 100 g de dietileno glicol. Uma quantidade de 271 g de um líquido amarelado foi obtida. Uma alíquota de 100 g do líquido assim obtido foi neutralizada com 4,6 g de etanolamina até um valor de pH de 6 a 6,5 (10% em água). O sal inventivo (A.13) foi obtido. Sais comparativos:
[00243] C-(A.15): Cloreto de colina, solução aquosa a 75% em peso, comercialmente disponível da BASF SE
[00244] C-(A.16): Uma quantidade de 75 g (0,5 mol) de ácido tartárico foi dissolvida às porções (unidades de 15 g) em 206 g de uma solução aquosa a 80% em peso de bicarbonato de colina (1,0 mol). A solução foi agitada até que a evolução de CO2 cessasse. A água foi removida dentro de 90 minutos pela evaporação rotativa (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 120°C, 10 mbar. Uma substância clara foi obtida depois foi diluída com 150 g de dietileno glicol. 390 g de uma solução clara foram obtidos, C-(A.16). Nenhuma formação de éster pôde ser detectada.
[00245] C-(A.17): Uma quantidade de 105 g (0,5 mol) de ácido cítrico mono-hidratado foi dissolvida às porções (unidades de 20 g) em 206 g de uma solução aquosa a 80% em peso de bicarbonato de colina (1,0 mol). A solução foi agitada até que a evolução de CO2 cessasse. A água foi removida dentro de 90 minutos pela evaporação rotativa (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 120°C, 10 mbar. Uma substância clara foi obtida depois foi diluída com 150 g de dietileno glicol. 412 g de uma solução clara foram obtidos, C- (A.17). Nenhuma formação de éster pôde ser detectada.
[00246] C-(A.18): Uma quantidade de 105 g (0,5 mol) de ácido cítrico mono-hidratado foi dissolvida às porções (unidades de 20 g) em 309 g de uma solução aquosa a 80% em peso de bicarbonato de colina (1,5 mol). A solução foi agitada até que a evolução de CO2 cessasse. A água foi removida dentro
67 / 75 de 90 minutos pela evaporação rotativa (frasco de 2 l) – temperatura do banho de óleo de 120°C, 10 mbar. Uma substância clara foi obtida depois foi diluída com 150g de dietileno glicol. 497 g de uma solução viscosa clara foram obtidas, C-(A.18). Nenhuma formação de éster pôde ser detectada.
[00247] C-(A.19): ácido cítrico mono-hidratado, C-(A.20): sal monossódico do ácido cítrico, C-(A.21): sal dissódico do ácido cítrico, C- (A.22): sal trissódico do ácido cítrico. C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) e C- (A.22) são compostos construtores conhecidos usados em formulações detergentes. II. Testes de aplicação II.1 Formulações líquidas
[00248] As formulações detergentes líquidas de água baixa com glicóis como dietileno glicol ou DPG e consequentemente a solubilidade é inevitável. Os sais (A.1) a (A.11) e C-(A.16) a C-(A.18) são, cada um, solúveis em dietileno glicol e/ou dipropileno glicol e consequentemente podem ser formulados sem água.
[00249] 50 g de C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) e C-(A.22) foram cada um combinados em um frasco junto com 100 g de dietileno glicol e aquecidos a 100°C durante 30 minutos sob agitação. A fonte de aquecimento foi removida e as suspensões brancas resultantes foram esfriadas até a temperatura ambiente em um período de 10 horas. As pastas fluidas resultantes foram filtradas (filtro de papel) e as tortas de filtro lavadas duas vezes com 50 g de isopropanol. Os compostos isolados C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) e C-(A.22) foram gravimetricamente determinados, mostrando que na ausência de água C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) e C-(A.22) não podem ser usados devido à solubilidade insuficiente. As seguintes quantidades foram obtidas como tortas de filtro: C-(A.19): 44,0 g; C-(A.20): 45,8 g; C-(A.21): 47,2 g; C-(A.22): 48,2 g II.2 Estabilidade de enzima
68 / 75
[00250] A estabilidade na armazenagem de Lipase e Protease em água foi avaliada a 37°C.
[00251] As formulações de teste base foram fabricadas fabricando-se as formulações bases I a VI misturando-se os componentes de acordo com a Tabela 1.
[00252] O respectivo sal (componente (a)) ou composto comparativo foi adicionado, se aplicável, à respectiva formulação base nas quantidades como indicadas na Tabela 1.
[00253] A Enzima (componente (b)) foi adicionada, à respectiva formulação base nas quantidades como indicadas na Tabela 1. A quantidade de enzima como provida na Tabela 1 se refere à proteína ativa. Lipase ou protease foi adicionada, dependendo de qual atividade enzimática foi medida.
[00254] Lipolase® 100L (CAS-No. 9001-62-1, EC-No. 232-619-9) foi adquirida da Sigma-Aldrich.
[00255] Savinase® 16,0L (CAS-No. 9014-01-1, EC-No. 232-752-2) foi adquirida da Sigma-Aldrich.
[00256] Água foi adicionada para realizar o equilíbrio para 100. Tabela 1: formulações líquidas Ingredientes % em peso na formulação referência I. II. III. IV. V. VI. Base formulação: (B.1) 6 15 8 - 35 30 25 (B.2) - -- 6 8 - - - (B.3) 7,5 6 4 - 8 - 22 (B.4) 2 2 - - 10 12 6 (B.5) 8 4 8 4 14 - (B.6) - - 2,5 - - 5 - Sorbitol - 3 - - 3 - - PEI-EO20 - 3 5 3 5 5 - Propileno glicol 8 4 - 8 6 4 Glicerol (G) ou Etanol (E) 2,5 - - (G) 6 - (G) 6 (G) 8 (E) Formiato de Ca - 1 - 1 2 2 - Aditivos: Savinase 16,0L 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Lipolase 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 componente (a)** - 2,5 2,5 2,5 4,0 4,0 4,0 equilíbrio Água até 100 (B.1): n-alquila-C18-(OCH2CH2)25-OH (B.2): combinação alquila C10-C18 poliglicosídeo
69 / 75 (B.3): alquila C10-C12 benzenossulfonato de sódio (B.4): cumenossulfonato de sódio (B.5): lauretsulfato de sódio – n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na (B.6): n-C12H25(CH3)2N→O ** para testes comparativos sem compostos inventivos estes foram substituídos pela mesma quantidade de dietileno glicol.
Atividade de Lipase:
[00257] A atividade de lipolase em certos pontos no tempo como indicado na Tabela 2 foi determinada utilizando-se valerato de p-nitrofenol (2,4 mM de pNP-C5 em 100 mM de Tris pH 8,0, 0,01% de Triton X100) como um substrato. A absorção foi medida a 20°C a cada 30 segundos em 5 minutos a 405 nm. A inclinação (a absorbância aumenta a 405 nm por minuto) da curva de absorção dependente do tempo está diretamente proporcional à atividade da lipase.
[00258] A Tabela 2 mostra a atividade da lipase nas formulações líquidas medidas depois da armazenagem; 1 a 30 dias a 37°C. Os valores da atividade lipolítica providos na Tabela 2 foram calculados com referência ao valor de 100% determinado na formulação de referência no tempo 0.
[00259] A nomenclatura das formulações é como segue: o número em Romano antes do ponto final caracteriza a formulação base, o número em Arábico o tipo de sal. (A.# sal inventivo (componente (a)); C-(A.#) composto comparativo). Zero (“0”): nenhum sal, mas dietileno glicol. Tabela 2: atividade de lipase no curso de tempo de armazenagem a 37°C Identificador de formulação T0 1d 3d 6d 10d 15d 20d 25d 30d Formulação Composto base I. 0 95 89 77 68 53 38 30 22 16 I. (A.1) 96 96 93 94 89 85 82 64 72 I. (A.3) 101 100 98 95 91 88 85 68 78 I. (A.4) 103 100 99 96 95 93 90 86 85 I. (A.6) 97 96 94 92 89 85 80 78 75 I. (A.7) 95 95 91 85 81 76 69 65 59 I. C-(A.15) 97 95 80 67 55 41 32 22 20 I. C-(A.16) 95 90 81 68 51 40 34 25 24 I. C-(A.17) 97 90 80 70 53 42 38 33 29 I. C-(A.18) 98 91 84 72 55 45 39 32 29 II. 0 94 92 81 73 57 41 32 25 20 II. (A.2) 95 94 92 90 88 84 80 75 68 II. (A.5) 102 100 97 95 93 89 86 72 79 II. (A.6) 103 100 99 96 94 92 90 86 88 II. (A.8) 96 94 90 85 80 80 76 72 68 II. (A.9) 97 93 90 87 83 81 77 75 76
70 / 75 II. (A.10) 96 96 92 89 83 84 79 76 73 II. (A.12) 100 98 96 95 88 86 80 77 76 II. C-(A.15) 96 95 82 65 56 40 33 26 22 II. C-(A.22) 95 87 79 67 55 40 33 24 18 III. 0 96 93 83 74 63 51 42 30 24 III. (A.4) 100 98 96 93 90 85 84 82 77 III. (A.6) 104 100 101 97 94 90 89 86 82 III. (A.9) 97 95 93 88 84 80 77 73 71 III. (A.10) 96 96 91 86 82 79 76 73 69 III. (A.11) 97 96 93 84 83 76 71 70 63 III. (A.12) 102 98 97 95 91 86 80 78 74 III. C-(A.20) 100 92 79 70 51 39 30 22 16 III. C-(A.21) 101 93 78 68 50 39 31 25 20 III. C-(A.22) 98 92 76 66 48 37 28 23 19 IV. 0 88 85 81 70 60 55 46 39 33 IV. (A.1) 98 96 93 92 87 84 82 79 71 IV. (A.3) 99 100 98 95 90 88 85 80 74 IV. (A.4) 101 100 97 93 90 89 86 81 73 IV. (A.6) 96 96 91 89 86 85 81 78 75 IV. (A.7) 97 95 90 85 81 78 73 70 64 IV. C-(A.15) 94 95 82 72 59 44 36 30 23 IV. C-(A.16) 95 90 81 67 55 41 34 28 25 IV. C-(A.17) 96 93 86 74 63 51 46 38 33 IV. C-(A.18) 95 91 84 72 58 49 46 39 35 V. 0 83 80 75 68 59 50 41 36 30 V. (A.2) 97 94 90 87 84 81 78 74 69 V. (A.4) 101 98 94 90 87 84 80 76 71 V. (A.5) 101 100 98 96 94 88 84 77 74 V. (A.7) 96 95 92 88 84 80 75 70 66 V. (A.11) 97 96 91 89 85 77 73 68 60 V. (A.13) 95 96 91 87 80 70 61 52 45 V. C-(A.15) 98 95 86 74 63 54 41 39 30 V. C-(A.16) 96 92 85 70 65 58 49 37 28 VI. 0 82 79 72 63 54 47 38 30 25 VI. (A.4) 102 99 96 91 86 82 80 75 65 VI. (A.5) 99 97 95 91 83 78 73 70 63 VI. (A.6) 96 90 87 84 81 74 70 67 61 VI. (A.11) 97 92 88 84 83 78 75 72 65 VI. C-(A.18) 96 90 83 75 58 50 48 37 32 Atividade de protease:
[00260] A atividade de savinase em certos pontos no tempo como indicado na Tabela 3 foi determinada pela utilização de Succinil-Ala-Ala-Pro- Phe-p-nitroanilida (Suc-AAPF-pNA, AAPF curto) como substrato. pNA é clivado da molécula de substrato pela clivagem proteolítica, resultando em liberação de cor amarela de pNA livre que foi determinado medindo-se a OD405. A medição foi feita a 20°C.
[00261] A Tabela 3 exibe a atividade de protease medida em formulações líquida depois da armazenagem durante 1 a 30 dias a 37°C. Os valores da atividade proteolítica providos na Tabela 3 foram calculados
71 / 75 referindo-se à 100% do valor determinado na formulação de referência no tempo 0.
[00262] A nomenclatura das formulações é como segue: o número romano antes do ponto final caracteriza a formulação base, o número arábico o tipo de sal (A.# o sal inventivo (o componente (a)); C-(A.#) composto comparativo). Zero (“0”): nenhum sal, mas dietileno glicol. Tabela 3: Atividade de protease no curso de tempo de armazenagem a 37°C Identificador de Formulação T0 1d 3d 6d 10d 15d 20d 25d 30d Formulação composto base I. 0 98 98 86 67 49 38 30 23 8 I. (A.1) 96 94 91 75 59 48 42 36 29 I. (A.4) 100 97 95 76 60 50 45 36 32 I. (A.5) 99 96 94 73 58 49 44 38 33 I. (A.6) 96 93 87 75 59 50 45 40 29 I. C-(A.15) 98 92 85 64 47 39 31 22 8 I. C-(A.16) 98 91 84 66 49 38 30 23 10 I. C-(A.17) 98 90 81 70 49 38 30 23 12 III. 0 96 95 86 71 51 40 33 21 12 III. (A.6) 92 96 92 82 69 59 50 41 34 III. (A.8) 94 95 93 78 68 60 52 42 33 III. (A.12) 96 96 92 80 70 61 50 39 31 III. C-(A.17) 92 94 83 71 53 42 34 27 14 III. C-(A.18) 94 94 85 72 54 43 35 28 14 V. 0 83 98 86 70 49 38 30 23 13 V. (A.1) 84 93 88 80 62 54 46 38 30 V. (A.2) 87 90 90 83 66 58 50 44 36 V. (A.6) 88 91 89 84 70 60 52 43 35 V. C-(A.18) 83 90 83 64 50 40 33 25 16 VI. 0 87 93 86 70 49 38 30 23 11 VI. (A.4) 84 90 88 76 68 61 53 44 30 VI. (A.7) 85 90 84 74 66 59 50 40 31 VI. (A.9) 83 87 85 75 67 60 51 40 30 VI. (A.11) 86 91 87 77 69 58 49 42 32 VI. C-(A.15) 85 90 84 66 47 36 29 20 10 II.3 Testes de limpeza de têxteis
[00263] O desempenho detergente das formulações na limpeza de dois tipos de tecidos de teste foi realizado. As amostras de pano de teste compreenderam uma sujeira complexa contendo componentes proteináceos e graxos devido ao processo CFT assim como as amostras de pano de teste contiveram um tipo graxo/particulado de sujeira.
[00264] O teste foi realizado como segue: um monitor de multi mancha contendo 8 pedaços de tecido sujo padronizados, cada um de 2,5 x 2,5 cm no
72 / 75 tamanho e costurado nos dois lados a um carreador de poliéster foi lavado junto em um launder-O-meter com 2,5 g de pano de algodão e 5 g/L do detergente lavar roupas líquido de teste, Tabela 4.
[00265] As condições foram como segue: Dispositivo: Launder-O- Meter da SDL Atlas, Rock Hill, USA. Líquido de lavagem: 250 ml, tempo de lavagem: 60 minutos, temperatura de lavagem: 30 °C. Dureza da água: 2,5 mmol/L; Ca:Mg:HCO3 4:1:8.
[00266] A razão de tecido para líquido 1:12 depois do ciclo de lavagem, os monitores de multi mancha foram enxaguados em água, seguido pela secagem na temperatura ambiente em um período de tempo de 14 horas.
[00267] Os seguintes panos de teste pré-sujos foram usados: CFT C-S-10: manteiga em algodão CFT C-S-62: banha, colorido no algodão CFT C-S-68Ç sorvete de chocolate no algodão EMPA 112: chocolate no algodão EMPA 141/1: batom no algodão EMPA 125: monitor para tensid wfk20D: pigmento e gordura tipo sebo no pano misto de poliéster/algodão CFT C-S-70: chocolate, musse wfk = Tecidos de teste wfk GmbH, Krefeld EMPA = Swiss Federal Institute of Materials Testing CFT = Center for Test Material B.V.
[00268] O nível total de limpeza foi avaliado usando medições de cor. Os valores de reflectância das manchas sobre os monitores foram medidos usando um espectrômetro de reflectância de esfera (tipo SF 500 da Datacolor, USA, faixa de comprimento de onda de 360 a 700 nm, geometria óptica d/8°) com um filtro de corte de UV a 460 nm. Neste caso, com a ajuda da classificação do espaço de cor CIE-Lab, o brilho L *, o valor a * no eixo de
73 / 75 cor vermelha - verde e o valor b * no eixo de cor amarelo - azul, foram medidos antes e depois da lavagem e calculados em média para as 8 manchas do monitor. A mudança do valor de cor (Δ E), definido e calculado automaticamente pelas ferramentas de avaliação de cor na seguinte equação: Δ E = Δ Delta a * 2 + Δ Delta b * 2 + + Δ Delta L * 2,
[00269] Δ E é uma medida do efeito de limpeza obtido. Todas as medições foram repetidas seis vezes para produzir um número médio. Observe que valores Δ E mais altos mostram limpeza melhor. Uma diferença de 1 unidade pode ser detectada por uma pessoa habilitada. Um leigo pode detectar 2 unidades facilmente. Os resultados são mostrados na Tabela 5. Rw = reflectância da sujeira lavada Ro = reflectância pura
[00270] O aumento na detergência devido ao construtor foi calculado como: Um total de 6 réplicas de cada pano foi conduzido durante este estudo; um nível de confiança estatística de 90 a 95% foi calculado.
[00271] As formulações de teste foram fabricadas fazendo-se as formulações VII a XIII pela mistura dos componentes de acordo com a Tabela
14.
[00272] O respectivo sal (componente (a)) ou composto comparativo foi adicionado, se aplicável, à respectiva formulação base nas quantidades providas na Tabela 4.
[00273] Lipolase® 100L foi adicionada, se aplicável, à respectiva formulação base nas quantidades providas na Tabela 4.
[00274] Savinase® 16,0L foi adicionada, se aplicável, à respectiva formulação base nas quantidades providas na Tabela 4.
[00275] Água foi adicionada para realizar o equilíbrio para 100. Tabela 4: Formulações líquidas de lavagem de roupas Ingredientes % em peso na formulação
VII VIII IX X XI XII XIII Formulação base: (B.1) 8 8 8 35 35 35 35 (B.2) 6 6 6 - - - -
74 / 75 (B.3) 4 4 4 8 8 8 8 (B.4) - - - 10 10 10 10 (B.5) 4 4 4 4 4 4 4 (B.6) 2,5 2,5 2,5 - - - - Sorbitol - - - 2 2 2 2 PEI-EO20 5 5 5 5 5 5 5 Propileno glicol 4 4 4 8 8 8 8 Glicerol - - - - - - - Ca-formiato - - - 2 2 2 2 Aditivos: Savinase 16.0L - - - - - 0,5 0,5 Lipolase - - 0,4 - 0,4 0,4 0,4 componente (a)** - 2,5 2,5 - 2,5 2,5 4 Equilíbrio Água até 100 (B,1): n-alquila C18-(OCH2CH2)25-OH (B,2): Combinação de alquila C10-C18 poliglicosídeo (B,3): alquila C10-C12 benzenossulfonato de Sódio (B.4): Cumenossulfonato de Sódio (B,5): Lauretsulfato de Sódio – n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na (B.6): n-C12H25(CH3)2N→O ** para testes comparativos sem compostos inventivos estes foram substituídos pela mesma quantidade de dietileno glicol.
[00276] O aumento na detergência devido ao sal (componente (a)) foi calculado como: um total de 6 exemplos de cada pano foi conduzido durante este estudo; um nível de confidência estatística de >90% foi calculado. A Tabela 5 mostra a soma de ΔE do monitor de multimancha acima mencionado. Os testes de launder-O-meter foram executados com formulação recém preparada (para) e com armazenagem a uma temperatura de armazenagem a 37°C durante 2 meses. Como uma aproximação uma semana a 37°C é equivalente a 3½ semanas a 20°C. Tabela 5: Resultados de testes de launder-O-meter Identificador de Formulação ΔE T0 ΔE 1 ΔE 2 ΔE 4 ΔE 6 ΔE 8 Formulação Composto semana semanas semanas semanas semanas base VII. 0 158 157 159 158 158 156 VIII. C-(A.21) 161 160 159 158 160 159 VIII. (A.12) 157 160 157 158 158 157 VIII. (A.4) 162 163 161 163 161 161 VIII. (A.2) 160 159 161 158 160 158 IX. 0 183 180 174 170 166 161 IX. (A.2) 184 183 180 178 177 173 IX. (A.3) 183 184 181 179 179 175 IX. (A.4) 185 185 183 181 182 181 IX. (A.7) 181 179 180 178 179 177 X. 0 164 164 163 162 163 163 XI. 0 188 186 180 174 169 164 XI. (A.5) 191 189 188 188 184 185 XI. (A.10) 185 187 187 185 182 180 XI. (A.12) 185 186 186 187 185 185 XII. 0 190 186 181 178 172 164
75 / 75 XII. (A.12) 190 189 188 188 188 184 XII. (A.2) 191 189 186 186 184 182 XII. (A.5) 191 194 193 191 189 188 XIII. 0 194 190 184 177 171 165 XIII.
C-(A.15) 190 189 185 175 168 163 XIII. (A.8) 191 191 189 189 186 186 XIII. (A.10) 192 188 189 188 185 183 XIII. (A.12) 190 191 190 188 187 188

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Preparação de enzima líquida, caracterizada pelo fato de que contém componente (a): pelo menos um sal de acordo com a fórmula geral (I) (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50, R1 é selecionado de metila, etila, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH3, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C6H5, para-HO- C6H4-, o,p-di-hidroxifenila, e 3,4,5-tri-hidroxifenila, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1- C10 e fenila, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é um contraíon inorgânico ou orgânico, componente (b): pelo menos uma enzima selecionada de hidrolases (EC 3), preferivelmente selecionada do grupo de lipases (EC 3.1.1) e endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente do grupo de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62), e opcionalmente componente (c): pelo menos um composto selecionado de estabilizantes de enzima diferentes do componente (a), conservantes e tensoativos preferivelmente selecionados de tensoativos não iônicos, anfotéricos e aniônicos.
2. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o componente (a) tem um contraíon selecionado de haleto, sulfato, carbonato, tartarato, citrato, lactato e metanossulfonato.
3. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que R2 no composto de acordo com fórmula geral (I) são todos metila.
4. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a dita preparação de enzima contém componente (a) em quantidades na faixa de 0,1 a 30% em peso em relação ao peso total da preparação de enzima.
5. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o componente (a) contém como impureza um composto (a’): (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-OH R1-COO- (a’) em que as variáveis R1, R2, X, n e m são as mesmas como no componente (a) correspondente.
6. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a preparação de enzima contém componente (c) em que o componente (c) compreende pelo menos um estabilizante de enzima selecionado de compostos contendo boro e aldeídos peptídicos.
7. Processo para fabricar uma preparação de enzima, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende as etapas de misturar pelo menos o componente (a): pelo menos um sal que seja um composto da fórmula geral (I), (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50,
R1 é selecionado de metila, etila, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH3, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C6H5, para-HO- C6H4-, o,p-di-hidroxifenila, e 3,4,5-tri-hidroxifenila, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1- C10, fenila, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é um contraíon, inorgânico ou orgânico e componente (b): pelo menos uma enzima selecionada de hidrolases (EC 3), preferivelmente selecionada do grupo de lipases (EC 3.1.1) e endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente do grupo de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62).
8. Método para estabilizar pelo menos uma enzima selecionada de hidrolases (EC 3), preferivelmente selecionada do grupo de lipases (EC
3.1.1) e endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente do grupo de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) dentro de uma preparação de enzima líquida, caracterizado pelo fato de ser pela etapa de adicionar pelo menos um sal da fórmula geral (I), (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50, R1 é selecionado de metila, etila, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH3, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C6H5, para-HO- C6H4-, o,p-di-hidroxifenila, e 3,4,5-tri-hidroxifenila, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1- C10, fenila,
R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é a contraíon, inorgânico ou orgânico.
9. Método de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que a enzima é estabilizada na presença de pelo menos um tensoativo preferivelmente selecionado de tensoativo não iônico, tensoativo anfotérico e tensoativo aniônico.
10. Uso, caracterizado pelo fato de ser de pelo menos um sal da fórmula geral (I), (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50, R1 é selecionado de metila, etila, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH3, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C6H5, para-HO- C6H4-, o,p-di-hidroxifenila, e 3,4,5-tri-hidroxifenila, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1- C10, fenila, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é um contraíon, inorgânico ou orgânico como aditivo para pelo menos uma enzima selecionada de hidrolases (EC 3), preferivelmente selecionada do grupo de lipases (EC 3.1.1) e endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente do grupo de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) em que o dito sal e a dita enzima são sólidos e em que a estabilização da dita enzima ocorre quando o dito sal e a dita enzima são colocados em contato com pelo menos um solvente.
11. Uso da preparação de enzima líquida como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para ser formulada em formulações detergentes, , caracterizado pelo fato de que a preparação da enzima como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 é misturada em uma ou mais etapas com um ou mais componentes de detergente.
12. Formulação detergente, caracterizada pelo fato de que compreende componente (a): pelo menos um sal de acordo com a fórmula geral (I) (R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I) em que n é selecionado de 1 a 12, m é selecionado de zero a 50, R1 é selecionado de metila, etila, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH3, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C6H5, para-HO- C6H4-, o,p-di-hidroxifenila, e 3,4,5-tri-hidroxifenila, R2 são os mesmos ou diferentes e selecionados de alquila C1- C10, fenila, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes e selecionados de hidrogênio e alquila C1-C4, X é alquileno C2-C4 e A- é um contraíon inorgânico ou orgânico, componente (b): pelo menos uma enzima selecionada de hidrolases (EC 3), preferivelmente selecionada do grupo de lipases (EC 3.1.1) e endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente do grupo de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62), opcionalmente componente (c): pelo menos um estabilizador de enzima diferente do componente (a), preferivelmente selecionado de compostos contendo boro como descrito acima, mais preferivelmente selecionado de ácido fenil borônico (PBA) ou seus derivados como descritos acima, o mais preferivelmente sendo ácido 4-formil fenil borônico (4-FPBA) e pelo menos um componente de detergente.
13. Método para remover manchas compreendendo gordura, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar a mancha com uma formulação detergente como definida na reivindicação 12, em que pelo menos uma enzima compreendida no componente (b) da formulação detergente compreende pelo menos uma lipase (EC 3.1.1) preferivelmente do grupo da triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3).
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a mancha deve ser removida de um produto têxtil em uma temperatura ≤ 40°C.
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