DE3750916T2

DE3750916T2 - Mutante einer nicht menschlichen Carbonyl-Hydrolase, für diese kodierende DNS-Sequenzen und Vektoren und durch diese Vektoren transformierte Wirte.

Info

Publication number: DE3750916T2
Application number: DE3750916T
Authority: DE
Inventors: Richard Ray Bott; Robert Mark Caldwell; Brian C Cunningham; David Aaron Estell; Scott Douglas Power; James Allen Wells
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1986-04-30
Filing date: 1987-04-28
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2007-04-29
Also published as: JPH1042876A; EP0251446A2; AU7228187A; EP0251446A3; JP2647845B2; AU614929B2; IE65767B1; SG30639G; IE871108L; DK221787D0; ATE116365T1; ES2068181T3; DK175523B1; DE3750916D1; GR3015388T3; JP2772295B2; DK221787A; JPS6485075A; EP0251446B1

Description

Die jüngste Entwicklung verschiedener in vitro-Verfahren zum Manipulieren der DNA-Sequenzen, die für natürlich vorkommende Polypeptide kodieren, sowie jüngste Entwicklungen bei der chemischen Synthese von relativ kurzen Sequenzen von ein- und doppelstrangiger DNA führten zu der Spekulation, daß derartige Vorgangsweisen angewandt werden können, um Enzyme zu modifizieren, um gewisse funktionale Eigenschaften auf vorhersagbare Weise zu verbessern. K.M. Ulmer (1983) Science 219, 666-671. Das einzige darin beschriebene Arbeitsbeispiel ist die Substitution einer einzelnen Aminosäure innerhalb der aktiven Stelle von Tyrosyl-tRNA-Synthetase (Cys35-TSer), die zu einer Verringerung der Enzymaktivität führte. Siehe G. Winter et al. (1982) Nature 299, 756-758; und A.J. Wilkinson et al. (1983) Biochemistry 22, 3581- 3586 (Cys35-TGly-Mutation führte ebenso zu verringerter Aktivität).
Beim Modifizieren derselben t-RNA-Synthetase durch Substitution eines anderen Aminosäure-Rests innerhalb der aktiven Stelle durch zwei andere Aminosäuren zeigte angeblich eine der Mutanten (Thr51-TAla) eine vorhergesagte, leichte Zunahme von kcat/Km, während eine zweite Mutante (Thr51-TPro) eine massive Zunahme von kcat/Km aufwies, was nicht mit Gewißheit erklärt werden konnte. A.H. Wilkinson et al. (1984) Nature 307, 187-188.
Ein anderes berichtetes Beispiel für eine einzelne Substitution eines Aminosäure- Rests ist die Substitution von Isoleucin durch Cystein am dritten Rest von T4-Lysozym. L.J. Perry et al. (1984) Science 226, 555-557. Das resultierende mutante Lysozym wurde schonend oxidiert, um eine Disulfidbindung zwischen dem neuen Cystein-Rest an Position 3 und dem nativen Cystein an Position 97 zu bilden. Diese vernetzte Mutante wurde vom Autor anfänglich als enzymatisch ident zum, aber thermisch stabiler als das Wild-Enzym beschrieben. In einer "zur Bestätigung hinzugefügten Notiz" gibt der Autor jedoch an, daß die beobachtete erhöhte Stabilität wahrscheinlich auf eine chemische Modifikation von Cystein an Rest 54 zurückzuführen war, da das mutante Lysozym mit einem freien Thiol an Cys54 eine zum Wild-Lysozym identische Thermostabilität besitzt.
In ähnlicher Weise wird von einer modifizierten Dihydrofolat-Reduktase aus E.coli berichtet, daß sie mittels ähnlicher Verfahren modifiziert wurde, um ein Cystein einzubringen, das mit einem natürlich vorkommenden Cystein in der Reduktase vernetzt werden konnte. D.E. Villafranca et al. (1983) Science 222, 782-788. Der Autor beschreibt, daß diese Mutante im reduzierten Zustand vollkommen reaktiv ist, im oxidierten Zustand jedoch wesentlich verringerte Aktivität besitzt. Außerdem wird von zwei anderen Substitutionen spezifischer Aminosäure-Reste berichtet, die Mutanten ergaben, die verringerte oder keine Aktivität mehr zeigten.
EP-A-0.130.756 beschreibt die Substitution spezifischer Reste innerhalb von B. amyloliquefaciens-Subtilisin durch spezifische Aminosäuren. So wurde Met222 durch alle 19 anderen Aminosäuren, Gly166 durch 9 unterschiedliche Aminosäuren und Gly169 durch Ala und Ser substituiert.
Wie später beschrieben, haben auch verschiedene Laboratorien über die Anwendung von stellengerichteter Mutagenese zum Erzeugen der Mutation von mehr als eines Aminosäure-Rests innerhalb eines Polypeptids berichtet.
Es wurde angegeben, daß der aminoterminale Bereich des Signalpeptids des Prolipoproteins der äußeren Membran von E.coli durch die Substitution oder Löschung der Reste 2 und 3 verändert wird, was in diesem Bereich eine Ladungsänderung erzeugt. S. Inouye et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3438-3441. Dasselbe Labor berichtete ebenso über die Substitution und Löschung der Aminosäure-Reste 9 und 14, um die Auswirkung derartiger Substitution auf den hydrophoben Bereich derselben Signalsequenz zu bestimmen. S. Inouye et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 3729-3733.
Es wurde auch von Doppelmutanten an der aktiven Stelle von Tyrosyl-t-RNA- Synthetase berichtet. P.J. Carter et al. (1984) Cell 38, 835-840. In diesem Bericht wurde die verbesserte Affinität der zuvor beschriebenen Thr51-TPro-Mutante zu ATP durch Erzeugen einer zweiten Mutation an der aktiven Stelle des Enzyms sondiert. Eine der Doppelmutanten, Gly35/Pro51, zeigte angeblich dadurch ein unerwartetes Ergebnis, daß er ATP im Übergangszustand besser band, als von den beiden Einfachmutanten erwartet wurde. Außerdem macht der Autor darauf aufmerksam, daß, zumindest für eine Doppelmutante, nicht einfach vorhersagbar ist, wie eine Substitution die von der anderen Substitution hervorgerufene Wirkung verändert, und daß man bei der Interpretation derartiger Substitutionen vorsichtig sein muß.
In US-A4.532.207 wird eine Mutante beschrieben, worin ein Polyarginin-Schwanz am C-terminalen Rest von β-Urogastron angehängt wurde, indem die für das Polypeptid kodierende DNA-Sequenz modifiziert wurde. Wie beschrieben, veränderte der Polyarginin-Schwanz die elektrophoretische Mobilität des Urogastron-Polyarginin- Hybrids, was selektive Reinigung zuließ. Das Polyarginin wurde, laut Patentinhaber, nachfolgend durch eine polyarginin-spezifische Exopeptidase entfernt, um das gereinigte Urogastron zu erzeugen. Richtig interpretiert beschreibt diese Literaturstelle Hybrid-Polypeptide, die die Substitution, Einfügung oder Löschung einer oder mehrerer Aminosäuren eines natürlich vorkommenden Polypeptids enthalten.
Es wurde auch von Einfach- und Doppelmutanten von Ratten-Pankreas-Trypsin berichtet. C.S. Craik et al. (1985) Science 228, 291-297. Wie berichtet wird, wurden Glycin-Reste an den Positionen 216 und 226 durch Alanin-Reste ersetzt, um drei Trypsin-Mutanten (zwei Einfachmutanten und eine Doppelmutante) herzustellen. Im Fall der Einfachmutanten war vom Autor erwartet worden, eine unterschiedliche Auswirkung auf Km zu beobachten. Anstelle dessen berichteten sie eine Änderung der Spezifität (kcat/Km), die primär das Ergebnis einer Abnahme von kcat war. Im Gegensatz dazu zeigte die Doppelmutante angeblich eine differenzielle Zunahme von Km für Lysyl- und Arginyl-Substrate im Vergleich zu Wild-Trypsin, besaß aber scheinbar keine katalytische Aktivität.
Die zuvor diskutierten Literaturstellen wurden lediglich deswegen angegeben, weil ihre Offenbarung vor dem hier betroffenen Anmeldungsdatum liegt, und nichts in dieser Anmeldung darf dahingehend ausgelegt werden, daß der Anmelder zugestehen würde, nicht mehr berechtigt zu sein, diese Offenbarungen gestützt auf frühere Erfindung oder gestützt auf die Priorität früher angemeldeter Anmeldungen unwirksam zu machen.
Basierend auf den zuvor genannten Literaturstellen ist jedoch klar ersichtlich, daß die Modifikation der Aminosäuresequenz von Wild-Enzymen oft zur Verringerung oder Zerstörung von biologischer Aktivität führt.
Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Carbonyl-Hydrolase-Mutanten bereitzustellen, die zumindest eine Eigenschaft besitzen, die sich von derselben Eigenschaft des Carbonyl-Hydrolase-Vorläufers unterscheidet, von dem die Aminosäure der Mutante abgeleitet ist.
Es ist ein weiteres Ziel, mutante DNA-Sequenzen, die für derartige Carbonyl- Hydrolase-Mutanten kodieren, sowie Expressionsvektoren bereitzustel len, die derartige mutante DNA-Sequenzen enthalten.
Außerdem ist ein weiteres Ziel der Erfindung, mit derartigen Vektoren transformierte Wirtszellen sowie Wirtszellen bereitzustellen, die zur, entweder intrazellulären oder extrazellulären, Expression derartiger Mutanten befähigt sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung umfaßt Carbonyl-Hydrolase-Mutanten, die vorzugsweise zumindest eine Eigenschaft besitzen, die sich wesentlich von derselben Eigenschaft der nicht-menschlichen Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase unterscheidet, von der die Aminosäuresequenz der Mutante abgeleitet ist. Diese Eigenschaften umfassen Oxidationsstabilität, Substratspezifität, katalytische Aktivität, Thermostabilität, Beständigkeit gegen Alkalien, pH-Aktivitätsprofil und Beständigkeit gegen proteolytischen Abbau. Die Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase kann eine in der Natur vorkommende Carbonyl-Hydrolase oder eine rekombinante Carbonyl-Hydrolase sein. Die Aminosäuresequenz der Carbonyl-Hydrolase-Mutante entstammt der Substitution, Löschung oder Einfügung von einer oder mehreren Aminosäuren der Vorläufer- Carbonyl-Hydrolase-Aminosäuresequenz.
Die Erfindung umfaßt auch mutante DNA-Sequenzen, die für derartige Carbonyl- Hydrolase-Mutanten kodieren. Weiters umfaßt die Erfindung Expressionsvektoren, die derartige mutante DNA-Sequenzen enthalten, sowie mit derartigen Vektoren transformierte Wirtzellen, die zur Expression der Carbonyl-Hydrolase-Mutanten fähig sind.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz des kodierenden Strangs, korreliert mit der Aminosäuresequenz des B. amyloliquefaciens-Subtilisin-Gens. Ebenso sind Promotor- (p)-Ribosombindungsstellen (rbs) und Terminations-(term)-bereiche der DNA-Sequenz, sowie Sequenzen dargestellt, die für die Präsequenz (PRE), die vermutliche Prosequenz (PRO) und die reife Form ("mature form", MAT) der Hydrolase kodieren.
Fig. 2 ist eine schematische grafische Darstellung der Substratbindungs-Spalte von Subtilisin zusammen mit Substrat.
Fig. 3 ist eine räumliche Ansicht der S-1-Bindungs-Substelle von B. amyloliquefaciens-Subtilisin, die ein in dieser Stelle auf zwei verschiedene Arten gebundenes Lysin-P-1-Substrat zeigt. Fig. 3A zeigt die Bindung des Lysin-P-1-Substrats unter Bildung einer Salzbrücke mit einem Glu an Position 156. Fig. 3B zeigt die Bindung des Lysin-P-1-Substrats unter Bildung einer Salzbrücke mit einem Glu an Position 166.
Fig. 4 ist eine schematische grafische Darstellung der aktiven Stelle von Subtilisin Asp32, His64 und Ser221.
Fig. 5A und 5B stellen die Aminosäureseguenz von Subtilisin aus verschiedenen Quellen dar. Die Reste direkt unterhalb jedes Rests von B. amyloliquefaciens-Subtilisin sind äquivalente Reste, die (1) in ähnlicher Weise wie für B. amyloliquefaciens- Subtilisin beschrieben mutiert werden können, oder (2) als Ersetzungs-Aminosäurerest in B. amyloliquefaciens-Subtilisin verwendet werden können. Fig. 5C zeigt konservierte Reste von B. amyloliquefaciens-Subtilisin im Vergleich zu anderen Subtilisin- Sequenzen.
Fig. 6A und 6B stellen die Inaktivierung der verschiedenen organischen Oxidationsmitteln ausgesetzten Mutanten Met222L und Met222Q dar.
Fig. 7 zeigt das UV-Spektrum von Met222F-Subtilisin und das Differenzspektrum, aufgenommen nach Inaktivierung durch Diperdodecansäure (DPDA).
Fig. 8 zeigt das Muster von Cyanogenbromid-Digesten von unbehandeltem und mit DPDA-oxidiertem Subtilisin-Met222F auf hochauflösenden SDS-Pyridin-Peptidgelen.
Fig. 9 zeigt eine Karte der Cyanogenbromid-Fragmente aus Fig. 8 und deren Übereinstimmung mit der Sequenz von Subtilisin-Met222F.
Fig. 10 stellt die Konstruktion von Mutationen zwischen den Codons 45 und 50 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin dar.
Fig. 11 stellt die Konstruktion von Mutationen zwischen den Codons 122 und 127 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin dar.
Fig. 12 zeigt die Auswirkung von DPDA auf die Aktivität von Subtilisin-Mutanten an den Positionen 50 und 124 in Subtilisin-Met222F.
Fig. 13 stellt die Konstruktion von Mutationen an Codon 166 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin dar.
Fig. 14 zeigt die Auswirkung der Hydrophobie der P-1-Substrat-Seitenkette auf die kinetischen Parameter von Wild-B. amyloliquefaciens-Subtilisin.
Fig. 15 zeigt die Auswirkung von Seitenketten-Substitutionen an Position 166 auf die P-1-Substrat-Spezifität. Fig. 15A zeigt in Position 166 mutante Subtilisine, die unverzweigte Alkyl- und aromatische Seitenkettensubstitutionen enthalten, angeordnet in der Reihenfolge ansteigenden Molekularvolumens. Fig. 15B zeigt eine Reihe mutanter Enzyme fortschreitend von β- zu γ-verzweigten aliphatischen Seitenkettensubstitutionen ansteigenden Molekularvolumens.
Fig. 16 zeigt die Auswirkung des Seitenketten-Volumens an Position 166 auf log kcat/Km für verschiedene P-1-Substrate.
Fig. 17 zeigt die Unterschiede in der Substratspezifität zwischen Ile166- und Wild-(Gly166)-B. Amyliliquefaciens-Subtilisin bei einer Reihe von aliphatischen und aromatischen Substraten dar. jeder Balken zeigt den Unterschied des log kcat/Km für Ile166-minus Wildtyp (GIy166) Subtilisin.
Fig. 18 stellt die Konstruktion von Mutationen an Codon 169 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin dar.
Fig. 19 stellt die Konstruktion von Mutationen an Codon 104 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin dar.
Fig. 20 stellt die Konstruktion von Mutationen an Codon 152 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin dar.
Fig. 21 stellt die Konstruktion von Einfachmutationen an Codon 156 und Doppelmutationen an den Codons 156 und 166 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin dar.
Fig. 22 stellt die Konstruktion von Mutationen an Codon 217 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin dar.
Fig. 23A zeigt das kcat/Km gegenüber pH-Profil für Mutationen an Codon 156 und 166 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin.
Fig. 23B zeigt das kcat/Km gegenüber pH-Profil für Mutationen an Codon 156 und 166 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin.
Fig. 24 zeigt das kcat/Km gegenüber pH-Profil für Mutationen an Codon 222 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin.
Fig. 25 stellt die Konstruktion von Mutanten an den Codons 94, 95 und 96 dar.
Fig. 26 und 27 zeigen die Substrat-Spezifität von verschiedenen Wildtyp- und mutanten Subtilisinen für verschiedene Substrate.
Fig. 28 A, B, C und D zeigen die Auswirkung der Ladung an der P-1- Bindungsstelle durch Substitutionen an Codon 156 und 166.
Fig. 29 A und B sind räumliche Ansichten der P-1-Bindungsstelle von Subtilisin- BPN' und zeigen ein auf zwei Arten an der Stelle gebundenes Lysin-P-1-Substrat. In 29A wird das Lysin-P-1-Substrat aufgebaut, um eine Salzbrücke mit einem Glu an Codon 156 zu bilden. ln 29B wird das Lysin-P-1-Substrat aufgebaut, um eine Salzbrücke mit einem Glu an Codon 166 zu bilden.
Fig. 30 stellt die Restenzymaktivität gegenüber Temperatur-Kurven für die gereinigte Wildform (Spalte A), C22/C87 (Spalte B) und C24/C87 (Spalte C) dar.
Fig. 31 zeigt die Vorgangsweise zur Herstellung von Punktmutationen in der Subtilisin-Kodiersequenz durch falschen Einbau von α-Thioldesoxynukleotid- Triphosphaten.
Fig. 32 zeigt die autolytische Stabilität von gereinigten Wildtyp- und mutanten Subtilisinen 170E, 107V, 213R und 107V/213R bei alkalischem pH.
Fig. 33 zeigt die autolytische Stabilität von gereinigten Wildtyp- und mutanten Subtilisinen V50, F50 und F50/V107/R213 bei alkalischem pH.
Fig. 34 zeigt die Vorgangsweise zur Konstruktion von Plasmiden, die Zufallsbzw. statistische Kassetten-Mutagenese unter den Resten 197 - 228 aufweisen.
Fig. 35 zeigt die für die Zufalls- bzw. statistische Kassetten-Mutagenese unter den Resten 197 - 228 verwendeten Oligodesoxynukleotide.
Fig. 36 stellt die Konstruktion von Mutanten an Codon 204 dar.
Fig. 37 zeigt die für die Synthese von Mutanten an Codon 204 verwendeten Oligodesoxynukleotide.

Detaillierte Beschreibung

Die Autoren der vorliegenden Erfindung fanden, daß verschiedene in vitro- Einfach- und -Mehrfachmutationen, die die Substitution, Löschung oder Einfügung von einer oder mehreren Aminosäuren innerhalb einer nicht-menschlichen Carbonyl- Hydrolase-Aminosäuresequenz umfassen, derartigen Mutanten im Vergleich zur nichtmutierten Carbonyl-Hydrolase vorteilhafte Eigenschaften verleihen können. Im speziellen wurde B. amyloliquefaciens-Subtilisin, eine alkalische Bakterien- Protease, mutiert, indem die für das Subtilisin kodierende DNA so modifiziert wurde, daß sie für die Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an verschiedenen Aminosäure-Resten bei der reifen Form des Subtilisin-Moleküls kodiert. Diese in vitro- mutierten Subtilisine besitzen zumindest eine Eigenschaft, die sich im Vergleich zu derselben Eigenschaft des Vorläufer-Subtilisins von dieser unterscheidet. Diese modifizierten Eigenschaften fallen in mehrere Kategorien, die umfassen: Oxidationsstabilität, Substratspezifität, Thermostabilität, Beständigkeit gegen Alkalien, katalytische Aktivität, pH-Aktivitätsprofil, Beständigkeit gegen proteolytischen Abbau, Km, kcat und Km/kcat-Verhältnis.
Carbonyl-Hydrolasen sind Enzyme, die Verbindungen hydrolysieren, die -X Bindungen enthalten, worin X O oder N ist. Sie umfassen natürlich vorkommende und rekombinante Carbonyl-Hydrolasen. Natürlich vorkommende Carbonyl-Hydrolasen umfassen grundsätzlich Hydrolasen, z.B. Lipasen und Peptid-Hydrolasen, z.B. Subtilisine oder Metalloproteasen. Peptid-Hydrolasen umfassen α-Aminoacylpeptid- Hydrolase, Peptidylaminosäure-Hydrolase, Acylamino-Hydrolase, Serin- Carboxypeptidase, Metallocarboxy-Peptidase, Thiol-Proteinase, Carboxylproteinase und Metalloproteinase. Es sind Serin-, Metallo-, Thiol- und Säure-Proteasen, ebenso wie Endo- und Exo-Proteasen inkludiert.
"Rekombinante Carbonyl-Hydrolase" bezeichnet eine Carbonyl-Hydrolase, in der die für die natürlich vorkommende Carbonyl-Hydrolase kodierende Sequenz modifiziert ist, um eine mutante DNA-Sequenz zu produzieren, die für die Substitution, Einfügung oder Löschung einer oder mehrerer Aminosäuren in der Carbonyl-Hydrolase- Aminosäuresequenz kodiert. Geeignete Modifikations-Verfahren werden hierin und in EP-A-0-130.756, veröffentlicht am 9. Jänner 1985, beschrieben.
Subtilisine sind bakterielle Carbonyl-Hydrolasen, die im allgemeinen Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden spalten. Wie hierin verwendet, bedeutet "Subtilisin" ein natürlich vorkommendes Subtilisin oder ein rekombinantes Subtilisin. Es ist bekannt, daß eine Reihe von natürlich vorkommenden Subtilisinen produziert und häufig von verschiedenen Bakterien-Spezies ausgeschieden wird. Die Aminosäuresequenzen der Vertreter dieser Reihe sind nicht vollständig homolog. Die Subtilisine dieser Reihe weisen jedoch dieselbe oder eine ähnliche Art von proteolytischer Aktivität auf. Diese Klasse der Serin-Proteasen hat eine gemeinsame Aminosäureseguenz, die eine katalytische Triade definiert, die sie von der chymotrypsin-bezogenen Klasse der Serin-Proteasen unterscheidet. Die Subtilisine und die chymotrypsin-bezogenen Serin-Proteasen haben beide eine katalytische Triade, die Aspartat, Histidin und Serin umfaßt. In den subtilisin-bezogenen Proteasen lautet die Ordnung dieser Aminosäuren zueinander, vom Amino- zum Carboxy-Terminus, Aspartat-Histidin-Serin. In den chymotrypsin-bezogenen Proteasen lautet die Ordnung dieser Aminosäuren zueinander jedoch Histidin-Aspartat-Serin. Daher bezeichnet Subtilisin hierin eine Serin-Protease mit der katalytischen Triade von mit Subtilisin verwandten Proteasen.
"Rekombinantes Subtilisin" bezeichnet ein Subtilisin, in dem die für das Subtilisin kodierende DNA-Sequenz modifiziert ist, um eine mutante DNA-Sequenz zu produzieren, die für die Substitution, Löschung oder Einfügung einer oder mehrerer Aminosäuren in der natürlich vorkommenden Subtilisin-Aminosäuresequenz kodiert. Geeignete Verfahren zur Produktion einer derartigen Modifikation umfassen jene hierin und in EP-A-0-130.756 beschriebenen. Beispielsweise kann die Subtilisin- Mehrfachmutante hierin, die die Substitution von Methionin an den Aminosäure-Resten 50, 124 und 222 durch Phenylalanin, Isoleucin bzw. Glutamin enthält, als vom rekombinanten Substilisin stammend angesehen werden, das die Substitution von Glutamin am Rest 222 (Q222) enthält, beschrieben in EP-A-0-1 30.756. Die Mehrfachmutante wird daher durch Substitution von Phenylalanin für Methionin an Rest 50 und Isoleucin für Methionin an Rest 124 im rekombinanten Q222-Subtilisin produziert.
"Carbonyl-Hydrolasen" und deren Gene können aus vielen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen erhalten werden. Geeignete Beispiele für prokaryotische Organismen umfassen gramnegative Organismen, wie z.B. E.coli oder Pseudomonas, und grampositive Bakterien, wie z.B. Micrococcus oder Bacillus. Beispiele für eukaryotische Organismen, aus denen Carbonyl-Hydrolase und ihre Gene erhalten werden können, umfassen Hefe, wie z.B. S. cerevisiae, Pilze, wie z.B. Aspergillus sp., und nicht-menschliche Säugetierquellen, wie z.B. Rinder sp., aus dem das Gen, das für die Carbonyl-Hydrolase Chymosin kodiert, erhalten werden kann. Wie bei Subtilisinen kann eine Reihe von Carbonyl-Hydrolasen aus verschiedenen verwandten Spezien erhalten werden, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die zwischen Vertretern dieser Reihe nicht vollständig homolog sind, aber trotzdem dieselbe oder eine ähnliche Art von biologischer Aktivität aufweisen. Daher besitzt nicht-menschliche Carbonyl- Hydrolase, wie hierin verwendet, eine funktionale Definition, die sich auf Carbonyl- Hydrolasen bezieht, die, direkt oder indirekt, mit prokaryotischen und nichtmenschlichen Quellen assoziiert sind.
Eine "Carbonyl-Hydrolase-Mutante" besitzt eine Aminosäuresequenz, die von der Aminosäuresequenz einer nicht-menschlichen "Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase" abgeleitet ist. Die Vorläufer-Carbonyl-Hydrolasen umfassen natürlich vorkommende und rekombinante Carbonyl-Hydrolasen. Die Aminosäuresequenz der Carbonyl-Hydrolase- Mutante ist von der Vorläufer-Hydrolasen-Aminosäuresequenz durch Substitution, Löschung oder Einfügung einer oder mehrerer Aminosäuren der Vorläufer- Aminosäuresequenz "abgeleitet". Derartige Modifikation erfolgt eher an der "Vorläufer- DNA-Sequenz", die für die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase kodiert, als Manipulation der Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase selbst. Geeignete Verfahren für derartige Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz umfassen hierin und in EP-A-0- 130.756 beschriebene Verfahren.
Es werden spezifische Reste von B. amyloliquefaciens-Subtilisin zur Substitution, Einfügung oder Löschung identifiziert Diese Aminosäure-Positionsnummern beziehen sich auf jene, die für die in Fig. 1 dargestellte B. amyloliquefaciens-Subtilisin-Sequenz angegeben sind. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Mutation dieses besonderen Subtilisins beschränkt, sondern erstreckt sich auf Vorläufer-Carbonyl-Hydrolasen, die Aminosäure-Reste enthalten, die zu den speziellen identifizierten Resten in B. amyloliquefaciens-Subtilisin "äquivalent" sind.
Ein Rest (eine Aminosäure) einer Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase ist zu einem Rest von B. amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent, falls er entweder homolog (d.h. bezüglich der Position entweder in der Primär- oder der Tertiärstruktur entsprechend) oder analog zu einem speziellen Rest oder Abschnitt dieses Rests in B. amyloliquefaciens-Subtilisin ist (d.h., er besitzt dieselbe oder ähnliche funktionale Fähigkeit zu kombinieren, zu reagieren oder chemisch wechselzuwirken).
Um Homologie in der Primärstruktur festzustellen, wird die Aminosäuresequenz einer Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase direkt mit der Primärsequenz von B. amyloliquefaciens-Subtilisin und besonders mit einem Satz von Resten, die bekannterweise in allen Subtilisinen, deren Sequenz bekannt ist, unverändert sind, verglichen (Fig. 5C). Nach dem Abstimmen der konservierten Reste, um die zur Beibehaltung der Abstimmung notwendigen Einfügungen und Löschungen zu ermöglichen (d.h. unter Vermeidung der Entfernung von konservierten Resten durch willkürliche Löschung oder Einfügung), werden die Reste definiert, die äquivalent zu speziellen Aminosäuren in der Primärsequenz von B. amyloliquefaciens-Subtilisin sind. Das Abstimmen von konservierten Resten sollte vorzugsweise 100% derartiger Reste konservieren. Es ist jedoch auch eine Abstimmung von über 75% oder sogar von nur 50% der konservierten Reste ausreichend, um äquivalente Reste zu definieren. Es sollte die Konservierung der katalytischen Triade Asp32/His64/Ser221 beibehalten werden.
Beispielsweise werden in Fig. 5A die Aminosäuresequenz von Subtilisin der B. amyloliquefaciens, B. subtilisin var. I168 und B. lichenformis (carlsbergensis) abgestimmt, um für die maximale Homologie zwischen Aminosäuresequenzen zu sorgen. Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt, daß es eine Anzahl von in jeder Sequenz enthaltenen konservierten Resten gibt. Diese Reste werden in Fig. 5C identifiziert.
Diese konservierten Reste können daher verwendet werden, um die entsprechenden äquivalenten Aminosäure-Reste von B. amyloliquefaciens-Subtilisin in anderen Carbonyl-Hydrolasen, wie z.B. Thermitase aus Thermoactinomyces, zu definieren. Diese beiden speziellen Sequenzen werden in Fig. 5B abgestimmt, um die maximale Homologie von konservierten Resten zu ergeben. Wie zu sehen ist, gibt es im Vergleich zu B. amyloliquefaciens-Subtilisin eine Reihe von Einfügungen und Löschungen in der Thermitase-Sequenz. So ist in Thermitase die zu Tyr217 in B. amyloliquefaciens-Subtil isin äquivalente Aminosäure das spezielle unterhalb von Tyr217 gezeigte Lysin.
In Fig. 5A ist die äquivalente Aminosäure an Position 217 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin Tyr. In ähnlicher Weise ist in B. amyloliquefaciens- Subtilisin die Position 217 auch durch Tyr besetzt, in B. licheniformis ist Position 217 jedoch durch Leu besetzt.
Daher können diese speziellen Reste in Thermitase und Subtilisin aus B. subtilisin und B. licheniformis durch eine andere Aminosäure substituiert werden, um eine mutante Carbonyl-Hydrolase zu erzeugen, da sie in ihrer Primärstruktur äquivalent zu Tyr 217 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin sind. Äquivalente Aminosäuren sind natürlich nicht auf jene für Tyr217 beschränkt, sondern erstrecken sich auf jeden Rest, der zu einem Rest in B. amyloliquefaciens äquivalent ist, unabhängig davon, ob derartige Reste konserviert sind oder nicht.
Äquivalente Reste, die auf der Ebene der Tertiärstruktur für eine Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase homolog sind, deren Tertiärstruktur durch Röntgenkristallografie bestimmt wurde, sind definiert als jene, für die die Atomkoordinaten von 2 oder mehreren der Hauptkettenatome eines speziellen Aminosäure-Rests der Vorläufer- Carbonyl-Hydrolase und B. amyloliquefaciens-Subtilisin (N auf N, CA auf CA, C auf C und O auf O) nach dem Abstimmen innerhalb von 0,13 nm und vorzugsweise 0,1 nm liegen. Das Abstimmen wird erreicht, nachdem das beste Modell ausgerichtet und positioniert wurde, um die maximale Überlappung von Atomkoordinaten von Proteinatomen, die nicht Wasserstoff sind, der in Frage stehenden Carbonyl-Hydrolase mit dem B. amyloliquefaciens-Subtilisin zu ergeben. Das beste Modell ist das kristallografische Modell, das den niedrigsten R-Faktor für experimentelle Beugungsdaten mit der größtmöglichen Auflösung ergibt. R-Faktor
Äquivalente Reste, die funktional analog zu einem spezifischen Rest von B. amyloliquefaciens-Subtilisin sind, sind als jene Aminosäuren der Vorläufer-Carbonyl- Hydrolasen definiert, die eine solche Konformation annehmen können, daß sie Proteinstruktur, Substratbindung oder Katalyse auf eine derartige Weise entweder verändern, modifizieren oder dazu beitragen können, die, wie hierin beschrieben, definiert ist und einem spezifischen Rest des B. amyloliquefaciens-Subtilisins zugeschrieben wird. Weiters sind das jene Reste der Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase (für die durch Röntgenkristallografie eine Tertiärstruktur erhalten wurde), die eine analoge Position dermaßen einnehmen, daß, obwohl die Hauptkettenatome des gegebenen Rests den Kriterien der Äquivalenz auf Basis des Einnehmens einer homologen Position nicht genügen, die Atomkoordinaten von zumindest zwei Seitenkettenatomen des Rests innerhalb von 0,13 nm der entsprechenden Seitenkettenatome von B. amyloliquefaciens-Subtilisin liegen. Die dreidimensionalen Strukturen wurden wie zuvor beschrieben abgestimmt.
Manche der für Substitution, Einfügung oder Löschung identifizierten Reste sind konservierte Reste, während andere es nicht sind. Im Fall von Resten, die nicht konserviert sind, ist das Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren auf Substitutionen beschränkt, die eine Mutante ergeben, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die keiner in der Natur zu findenden entspricht. Im Fall von konservierten Resten sollte derartiger Ersatz nicht zu einer natürlich vorkommenden Sequenz führen. Die Carbonyl- Hydrolase-Mutanten der vorliegenden Erfindung umfassen die reifen Formen von Carbonyl-Hydrolase-Mutanten, sowie die Pro- und Präpro-Formen derartiger Hydrolase- Mutanten. Die Präpro-Formen stellen die bevorzugte Konstruktion dar, da dies die Expression, Sekretion und Reifung der Carbonyl-Hydrolase-Mutanten erleichtert.
"Expressionsvektor" bezeichnet ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die mit einer geeigneten Steuersequenz operabel verbunden ist, die in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Derartige Steuersequenzen umfassen einen Promotor zum Bewirken von Transkription, gegebenenfalls eine Operatorsequenz zum Steuern derartiger Transkription, eine Sequenz, die für geeignete mRNA-Ribosom-Bindungsstellen kodiert, und Sequenzen, die die Termination von Transkription und Translation steuern. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenteilchen oder einfach eine potentielle genomische Einfügung sein. Einmal in den geeigneten Wirt transformiert, kann sich der Vektor replizieren und unabhängig vom Wirtsgenom funktionieren oder in manchen Fällen in das Genom selbst integriert werden. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" manchmal austauschbar verwendet, da das Plasmid die zurzeit am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Die Erfindung soll jedoch derartige andere Formen von Expressionsvektoren umfassen, die gleiche Funktionen erfüllen und die nach dem Stand der Technik bekannt sind oder werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten "Wirtszellen" sind im allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, die vorzugsweise nach den in EP- A-0.130.756 beschriebenen Verfahren manipuliert wurden, um sie außer Lage zu setzen, enzymatisch aktive Endoprotease auszuscheiden. Eine bevorzugte Wirtszelle zum Exprimieren von Subtilisin ist der Bacillus-Stamm BG2036, dem enzymatisch aktive neutrale Protease und alkalische Protease (Subtilisin) fehlt. Die Konstruktion von Stamm BG2036 wird detailliert ind EP-A-0.130.756 und weiters von M.Y. Yang et al. (1984) J. Bacteriol. 160, 15-21, beschrieben. Andere Wirtszellen zur Subtilisin- Expression umfassen Bacillus subtilis 1168 (EP-A-0.130.756).
Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, die unter Anwendung von Vorgangsweisen mit rekombinanter DNA konstruiert wurden. Derartige transformierte Wirtszellen sind in der Lage, entweder Vektoren zu replizieren, die für die Carbonyl-Hydrolase-Mutanten kodieren, oder die gewünschte Carbonyl- Hydrolase-Mutante zu exprimieren. Im Fall von Vektoren, die für die Prä- oder Präpro-Form der Carbonyl-Hydrolase-Mutante kodieren, werden derartige Mutanten, falls exprimiert, typischerweise von der Wirtszelle in das Wirtszellen-Medium ausgeschieden.
"Operabel verbunden", falls die Beziehung zwischen zwei DNA-Bereichen beschrieben wird, bedeutet einfach, daß sie in ihrer Funktion miteinander verwandt sind. Beispielsweise ist eine Präsequenz mit einem Peptid operabel verbunden, falls sie als Signalsequenz fungiert, die an der Sekretion der reifen Form des Proteins teilnimmt, das höchstwahrscheinlich die Abspaltung der Signalsequenz einschließt. Ein Promotor ist mit einer Kodiersequenz operabel verbunden, falls er die Transkription der Sequenz steuert; eine Ribosom-Bindungsstelle ist mit einer Kodiersequenz operabel verbunden, falls sie so positioniert ist, um die Translation zuzulassen.
Die für die natürlich vorkommende Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase kodierenden Gene können nach den hierin und in EP-A-0.130.756 beschriebenen allgemeinen Verfahren erhalten werden.
Sobald das Carbonyl-Hydrolase-Gen kloniert ist, wird eine Reihe von Modifikationen vorgenommen, um den Nutzen des Gens über die Synthese der natürlich vorkommenden Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase hinaus zu steigern. Derartige Modifikationen umfassen die Produktion von rekombinanten Carbonyl-Hydrolasen, wie beschrieben in EP-A-0.130.756, und die Produktion von hierin beschriebenen Carbonyl-Hydrolase-Mutanten.
Die Carßonyl-Hydrolase-Mutanten der vorliegenden Erfindung können durch stellenspezifische Mutagenese (M. Smith (1985) Ann. Rev. Genet. 423; M.J. Zoeller et al. (1982) Nucleic Acid Res. 10, 6487-6500), Kassetten-Mutagenese (EP-A-0.130.756) oder Zufalls- bzw. statistische Mutagenese (D. Shortle et al. (1985) Genetics 110, 539; D. Shortle et al. (1986) Proteins: Structure, Function and Genetics 1, 81; D. Shortle (1986) J. Cell. Biochem. 30, 281; T. Alber et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 747; M. Matsumura et al. (1985) J. Biochem., 260, 15298; H. Liao et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 576) der klonierten Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase erzeugt werden. Kassetten-Mutagenese und das hierin beschriebene Zufalls- bzw. statistische Mutagenese-Verfahren werden bevorzugt.
Die bei Transformation von geeigneten Wirten exprimierten mutanten Carbonyl- Hydrolasen werden auf Enzyme gescreent, die eine oder mehrere Eigenschaften aufweisen, die sich wesentlich von jenen der Vorläufer-Carbonyl-Hydrolasen unterscheiden, z.B. Änderungen von Substratspezifität, Oxidationsbeständigkeit, Thermostabilität, Beständigkeit gegen Alkalien und proteolytischen Abbau, pH- Aktivitätsprofil und dergleichen.
Eine Änderung der Substratspezifität wird als Unterschied zwischen dem kcat/Km-Verhältnis der Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase und jenem der Hydrolase-Mutante definiert. Das kcat/Km-Verhältnis ist ein Maß für die katalytische Wirksamkeit. Carbonyl-Hydrolase-Mutanten mit erhöhten oder verringerten kcat/Km-Verhältnissen werden in den Beispielen beschrieben. Im allgemeinen ist es das Ziel, eine Mutante sicherzustellen, die ein höheres (zahlenmäßig größeres) kcat/Km-Verhältnis für ein gegebenes Substrat aufweist, wodurch das Enzym befähigt wird, wirksamer auf ein Zielsubstrat einzuwirken. Eine wesentliche Änderung des kcat/Km-Verhältnisses ist vorzugsweise eine zumindest 2fache Zu- oder Abnahme. Es werden jedoch auch geringere Zu- oder Abnahmen des Verhältnisses (z.B. zumindest um das 1,5fache) als wesentlich angesehen. Eine Zunahme des kcat/Km-Verhältnisses für ein Substrat kann von einer Verringerung des kcat/Km-Verhältnisses für ein anderes Substrat begleitet werden. Dies ist eine Verschiebung der Substratspezifität, und Mutanten, die derartige Verschiebungen aufweisen, sind dort brauchbar, wo die Vorläufer-Hydrolase unerwünscht ist, z.B. um unerwünschte Hydrolyse eines speziellen Substrats in einem Substratgemisch zu verhindern. Km und kcat werden nach bekannten Vorgangsweisen gemessen, wie in EP-A-0.1 30.756 oder hierin beschrieben.
Oxidationsbeständigkeit wird entweder nach bekannten Vorgangsweisen oder nach hierin nachstehend beschriebenen Verfahren gemessen. Eine wesentliche Änderung der Oxidationsbeständigkeit zeigt sich durch eine zumindest 50%-ige Zu- oder Abnahme (vorzugsweise Abnahme) der Verlustrate an Enzymaktivität beim Aussetzen gegenüber verschiedenen oxidierenden Bedingungen. Derartige oxidierende Bedingungen sind ein Aussetzen dem organischen Oxidationsmittel Diperdodecansäure (DPDA) unter den in den Beispielen beschriebenen Bedingungen.
Beständigkeit gegen Alkalien wird entweder nach bekannten Vorgangsweisen oder nach hierin beschriebenen Verfahren gemessen. Eine wesentliche Änderung der Beständigkeit gegen Alkalien zeigt sich durch eine zumindest etwa 5%-ige oder stärkere Zu- oder Abnahme (vorzugsweise Zunahme) der Halbwertszeit der Enzymaktivität einer Mutante im Vergleich zur Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase. Im Fall der Subtilisine wurde die Beständigkeit gegen Alkalien als Funktion des autoproteolytischen Abbaus von Subtilisin bei alkalischem pH gemessen, z.B. 0,1 M Natriumphosphat, pH = 12, bei 25 oder 30ºC.
Thermostabilität wird entweder nach bekannten Vorgangsweisen oder nach hierin beschriebenen Verfahren gemessen. Eine wesentliche Änderung der Thermostabilität zeigt sich durch eine zumindest etwa 5%-ige oder stärkere Zu- oder Abnahme (vorzugsweise Zunahme) der Halbwertszeit der Enzymaktivität einer Mutante beim Aussetzen einer relativ hohen Temperatur und neutralem pH, im Vergleich zur Vorläufer-Carbonyl-Hydrolase. Im Fall der Subtilisine wird die Thermostabilität durch den autoproteolytischen Abbau von Subtilisin bei höheren Temperaturen und neutralem pH gemessen, z.B. 2 mM Kalziumchlorid, 50 mM MOPS, pH = 7,0, bei 59ºC.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung produzierten mutante Subtilisine, die die Substitution der AminosäureReste von B. amyloliquefaciens-Subtilisin enthalten, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz der Wildform und die DNA-Sequenz von B. amyloliquefaciens-Subtilisin sind in Fig. 1 dargestellt. TABELLE 1 Rest Ersetzungs-Aminosäure
Die verschiedenen substituierten Aminosäuren sind in Tabelle I in den folgenden Einbuchstaben-Bezeichnungen angegeben: Aminosäure-Rest Buchstaben-Symbol Alanin Glutamat Glutamin Aspartat Asparagin Leucin Glycin Lysin Serin Valin Arginin Threonin Prolin Isoleucin Methionin Phenylalanin Tyrosin Cystein Tryptophan Histidin
Falls im Kontext nicht anders angegeben, werden Wildtyp-Aminosäuren durch die eben angeführten Dreibuchstaben-Symbole und ersetzte Aminosäuren durch die eben angeführten Einbuchstaben-Symbole dargestellt. So kann, falls das Methionin bei Rest 50 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin durch Phenylalanin ersetzt wird, diese Mutation (Mutante) mit Met50F oder F50 bezeichnet werden. Ähnliche Bezeichnungen werden für Mehrfachmutanten verwendet.
Außer von den zum Ersetzen der Reste in Tabelle 1 beschriebenen Aminosäuren wird auch von anderen Ersetzungs-Aminosäuren an diesen Resten erwartet, daß sie mutante Subtilisine mit nützlichen Eigenschaften ergeben. Diese Reste und Ersetzungs- Aminosäuren sind in Tabelle II angeführt. TABELLE II Rest Ersetzungs-Aminosäure(n)
Jedes der mutanten Subtilisine in Tabelle 1 enthält die Ersetzung eines einzigen Rests der B. amyloliquefaciens-Aminosäuresequenz. Diese speziellen Reste wurden ausgewählt, um den Einfluß derartiger Substitutionen auf verschiedene Eigenschaften von B. amyloliquefaciens-Subtilisin zu sondieren.
So identifizierten die Autoren der vorliegenden Erfindung Met124 und Met222 als wichtige Reste, die bei Substitution durch eine andere Aminosäure ein mutantes Subtilisin mit erhöhter Oxidationsbeständigkeit ergeben. Für Met124 sind Leu und Ile bevorzugte Ersetzungs-Aminosäuren. Bevorzugte Aminosäuren für den Ersatz von Met222 werden in EP-A-0.130.756 beschrieben.
Es wurden auch verschiedene andere spezifische Reste als wichtig für die Substratspezifität identifiziert. Diese Reste umfassen Tyr104, Ala152, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189 und Tyr217, wofür die in Tabelle 1 angeführten Mutanten, die die verschiedenen Ersetzungs-Aminosäuren enthalten, bereits hergestellt wurden, sowie andere nachstehend angeführte Reste, wofür noch Mutanten hergestellt werden müssen.
Die Identifizierung dieser Reste, einschließlich jener noch zu mutierenden, basiert auf der durch die Autoren der vorliegenden Erfindung bis zu 1,8 Å hochaufgelöste Kristallstruktur von B. amyloliquefaciens-Subtilisin (siehe Tabelle III), deren Erfahrung mit in vitro-Mutagenese von Subtilisin und der Literatur über Subtilisin. Diese Arbeiten und die Röntgen-Kristallstrukturen von Subtilisin, das kovalent gebundene Peptid-Inhibitoren (J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 2439-2449), Produktkomplexe (J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 4293-4303) und Übergangszustands-Analoge enthält (D.A. Matthews et al. (1975) J. Biol. Chem. 250, 7120-7126; T.L. Poulos et al. (1976) J. Biol. Chem. 251, 1097-1103), half bei der Identifizierung einer erweiterten Peptidbindungs-Spalte in Subtilisin. Diese Substratbindungs-Spalte ist gemeinsam mit Substrat in Fig. 2 schematisch dargestellt, gemäß der Nomenklatur nach 1. Schechter et al. (1967) Biochem. Bio. Res. Commun. 27, 157. Die spaltbare Bindung im Substrat ist durch einen Pfeil angegeben. Die Bezeichnungen P und P' betreffen Aminosäuren, deren Position relativ zur spaltbaren Bindung jeweils in Richtung des Amino- bzw. Carboxy-Terminus liegt. Die Bezeichnungen S und S' betreffen Substellen in der Substratbindungs-Spalte von Subtilisin' die mit den entsprechenden Substrat-Aminosäure-Resten wechselwirken. Atomkoordinaten für die Apoenzym-Form von B. amyloliquefaciens-Subtilisin mit einer Auflösung von 1,8 Å
Die obigen Strukturuntersuchungen zeigen, zusammen mit den hierin und an anderer Stelle (M. Philipp et al. (1983) Mol. Cell. Biochem. 51, 5-32; I.B. Svendsen (1976) Carlsberg Res. Comm. 41, 237-291; S.F. Markland Id; D.G. Stauffe et al. (1965) J. Biol. Chem. 244, 5333-5338) angegebenen kinetischen Daten, daß die Substellen in der Bindungsspalte von Subtilisin befähigt sind, mit Substrat-Aminosäure-Resten von P-4 bis P-2' wechselzuwirken.
Die am genauesten untersuchten der obigen Reste sind Gly166, Gly169 und Ala152. Diese Aminosäuren wurden als Reste innerhalb der S-1-Substelle identifiziert. Wie in Fig. 3 zu sehen ist, die eine räumliche Ansicht der S-1-Substelle ist, nehmen Gly166 und Gly169 Positionen am Boden der S-1-Substelle ein, während Ala152 eine Position nahe der Oberseite von S-1, nahe des katalytischen Ser221, einnimmt.
Es wurden alle 19 Aminosäure-Substitutionen von Gly166 und Gly169 hergestellt. Wie in den nachfolgenden Beispielen angegeben, hängen die bevorzugten Ersetzungs-Aminosäuren für Gly166 und/oder Gly169 von der jeweils die P-1-Position eines gegebenen Substrats einnehmenden Aminosäure ab.
Die bisher einzigen hergestellten und analysierten Substitutionen von Ala152 umfassen den Ersatz von Ala152 durch Gly und Ser. Die Ergebnisse dieser Substitutionen auf die P-1-Spezifität werden in den Beispielen angegeben. Zusätzlich zu jenen Resten, die spezifisch mit der Spezifität für die P-1-Substrat- Aminosäure assoziiert sind, wurde festgestellt, daß Tyr104 mit der P4-Spezifität zusammenhängt. Von Substitutionen bei Phe189 und Tyr217 wird jedoch erwartet, daß sie die P-2'- bzw. P-1'-Spezifität beeinflussen.
Die katalytische Aktivität von Subtilisin wurde auch durch einzelne Aminosäure- Substitutionen bei Asn155 modifiziert. Die katalytische Triade von Subtilisin ist in Fig. 4 dargestellt. Wie zu sehen ist, sind Ser221, His64 und Asp32 so positioniert, um den nukleophilen Angriff des Serin-Hydroxylats am Carbonyl der spaltbaren Peptidbindung zu erleichtern. Kristallografische Untersuchungen von Subtilisin (Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 4293-4303; Matthews et al. (1975) J. Biol. Chem. 250, 7120-7126; Poulos et al. (1976) J. Biol. Chem. 251, 1097-1103) zeigen, daß zwei Wasserstoff- Bindungen mit dem Oxy-Anion des Substrat-Übergangszustands gebildet werden. Ein Wasserstoff-Bindungsdonor kommt vom katalytischen Ser221-Hauptkettenamid während der andere eines der NE2-Protonen der Asn155-Seitenkette ist. Siehe Fig. 4.
Asn155 wurde durch Ala, Asp, His, Glu und Thr substituiert. Diese Substitutionen erfolgten, um die Stabilisierung des geladenen tetraedrischen Zwischenprodukts des Übergangszustands-Komplexes durch die potentielle Wasserstoff- Bindung zwischen der Seitenkette von Asn155 und dem Oxy-Anion des Zwischenprodukts zu untersuchen. Diese speziellen Substitutionen verursachten starke Abnahmen bei Substratumsatz und kcat (um das 200- bis 4.00ºfache), marginale Abnahmen bei Substratbindungs-Km (bis zum 7fachen) und einen Verlust an Stabilisierungsenergie des Übergangszustands von 2,2 - 4,7 kcal/Mol. Die Retention von Km und des Abfall von kcat machen diese mutanten Enzyme als Bindungsproteine für spezifische Peptidsequenzen brauchbar, deren Natur durch die Spezifität der Vorläufer- Protease bestimmt wird.
Es wurden verschiedene andere Aminosäure-Reste identifiziert, die die Beständigkeit gegen Alkalien beeinflussen. In manchen Fällen weisen Mutanten mit veränderter Beständigkeit gegen Alkalien auch veränderte Thermostabilität auf.
In B. amyloliquefaciens-Subtilisin wurden die Reste Asp36, Ile107, Lys170, Ser204 und Lys213 als Reste identifiziert, die bei Substitution durch eine andere Aminosäure die Beständigkeit des mutierten Enzyms gegen Alkalien im Vergleich zum Vorläufer-Enzym verändern. Die Substitution von Asp36 durch Ala und die Substitution von Lys170 durch Glu führte jeweils zu einem mutierten Enzym mit einer geringeren Beständigkeit gegen Alkalien als das Wild-Subtilisin. Bei Substitution von Ile107 durch Val, Ser204 durch Cys, Arg oder Leu oder Lys213 durch Arg wies das mutante Subtilisin eine höhere Beständigkeit gegen Alkalien auf als das Wild-Subtilisin. Die Mutante Ser204P zeigte edoch eine Abnahme der Beständigkeit gegen Alkalien.
Außerdem beinflussen auch andere Reste, die als mit der Modifikation anderer Eigenschaften von Subtilisin assoziiert identifiziert wurden, die Beständigkeit gegen Alkalien. Diese Reste umfassen Ser24, Met50, Glu156, Gly166, Gly169 und Tyr217. Besonders die folgenden speziellen Substitutionen führen zu einer gesteigerten Beständigkeit gegen Alkalien: Ser24C, Met5ºF, Gly156Q oder S, Gly166A, H, K, N oder Q, Gly169S oder A und Tyr217F, K, R oder L. Die Mutante Met50V führt andererseits zu einer Abnahme der Beständigkeit des mutanten Subtilisins gegen Alkalien im Vergleich zum Wild-Subtilisin.
Andere auf Basis des Screenens auf Beständigkeit gegen Alkalien an der Beständigkeit gegen Alkalien beteiligte Reste umfassen Asp197 und Met222. Spezielle Mutanten umfassen Asp197(R oder A) und Met222 (alle anderen Aminosäuren).
Es wurden verschiedene andere Reste identifiziert die bezüglich der Thermostabilität beteiligt sind, wie durch das hierin angegebene Screenen aut Thermostabilität festgestellt wurde. Diese Reste umfassen die zuvor erwähnten Reste. die die Beständigkeit gegen Alkalien beeinflussen, und Met199 und Tyr21. Diese beiden letzteren Reste werden auch als wichtig für die Beständigkeit gegen Alkalien gehalten. Mutanten bei diesen Resten umfassen I199 und F21.
Die Aminosäuresequenz von B. amyloliquefaciens-Subtilisin wurde auch modifiziert, indem zwei oder mehrere Aminosäuren der Sequenz der Wildform substituiert wurden. Es wurden sechs Kategorien von mehrfach-substituiertem mutantem Subtilisin identifiziert. Die ersten beiden Kategorien umfassen thermostabile und oxidationsbeständige Mutanten. Die nächsten drei anderen Kategorien umfassen Mutanten, die die nützlichen Eigenschaften jeder von verschiedenen Einfachmutationen von B. amyloliquefaciens-Subtilisin kombinieren. Die letzte Kategorie umfaßt Mutanten, die eine modifizierte Beständigkeit gegen Alkalien und/oder Thermostabilität aufweisen.
Die erste Kategorie umfaßt Doppelmutanten, in denen zwei Cystein-Reste an verschiedenen Aminosäure-Positionen innerhalb des Subtilisin-Moleküls substituiert wurden. Die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den beiden substituierten Cystein- Resten führt zu mutanten Subtilisinen mit veränderter Thermostabilität und veränderter katalytischer Aktivität. Diese Mutanten umfassen A21/C22/C87 und C24/C87, die detaillierter in Beispiel 11 beschrieben werden.
Die zweite Kategorie von Subtilisin-Mehrfachmutanten umfaßt Mutanten, die in Gegenwart von verschiedenen Oxidationsmitteln, wie z.B. Wasserstoffperoxid oder Persäuren, stabil sind. Die Beispiele 1 und 2 beschreiben diese Mutanten, die F50/I124/Q222, F50/I124, F50/Q222, F50/L124/Q222, I124/Q222 und L124/Q222 umfassen.
Die dritte Kategorie von Subtilisin-Mehrfachmutanten umfaßt Mutanten mit Substitutionen an Position 222 in Kombination mit verschiedenen Substitutionen an Position 166 oder 169. Diese Mutanten kombinieren beispielsweise die Eigenschaft der Oxidationsbeständigkeit der A222-Mutation mit der veränderten Substratspezifität der verschiedenen 166- oder 169-Substitutionen. Derartige Mehrfachmutanten umfassen A166/A222, A166/C222, F166/C222, K166/A222, K166/C222, V166/A222 und V166/C222. Das K166/A222-mutierte Subtilisin weist beispielsweise ein kcat/Km- Verhältnis auf, das ungefähr 2-mal größer ist als jenes des A222-einfachmutierten Subtilisins, bei Vergleich unter Verwendung eines Substrats mit Phenylalanin als P-1- Aminosäure. Diese Kategorie von Mehrfachmutanten wird in Beispiel 12 detaillierter beschrieben.
Die vierte Kategorie von Mehrfachmutanten kombiniert Substitutionen an Position 156 (Glu zu Q oder S) mit der Substitution von Lys an Position 166. Jede dieser Einfachmutationen verbessert die Enzymwirkung bei Substraten mit Glutamat als P-1- Aminosäure. Bei Kombination dieser Einfachmutationen wirken die erhaltenen Enzym- Mehrfachmutanten besser als jeder Vorläufer. Siehe Beispiel 9.
Die fünfte Kategorie von Mehrfachmutanten enthält die Substitution von bis zu vier Aminosäuren der B. amyloliquefaciens-Subtilisin-Sequenz. Diese Mutanten besitzen besondere Eigenschaften, die augenscheinlich identisch mit den Eigenschaften des Subtilisins aus B. licheniformis sind. Das Subtilisin aus B. licheniformis unterscheidet sich von B. amyloliquefaciens-Subtilisin in 87 von 275 Aminosäuren. Die Mehrfachmutante F50/S156/A169/L217 zeigte ähnliche Substratspezifität und Kinetik wie das Licheniformis-Enzym. (Siehe Beispiel 13.) Der Grund dafür sind jedoch wahrscheinlich nur drei der Mutationen (S156, A169 und L217), die im Substratbindungs-Bereich des Enzyms liegen. Es ist ziemlich überraschend, daß durch nur drei Veränderungen von 87 unterschiedlichen Aminosäuren in der Sequenz der beiden Enzyme das B. amyloliquefaciens-Enzym in ein Enzym mit zu B. licheniformis- Enzym ähnlichen Eigenschaften umgewandelt wurde. Andere Enzyme in dieser Reihe umfassen F50/Q156/N166/L217 und F50/S156/L217.
Die sechste Kategorie von Mehrfachmutanten umfaßt die Kombination von Substitutionen an Position 107 (Ile zu V) mit der Substitution von Lys an Position 213 durch Arg und die Kombination von Substitutionen an Position 204 (vorzugsweise Ser zu C oder L, aber ebenso zu allen anderen Aminosäuren) mit der Substitution von Lys an Position 213 durch R. Andere Mehrfachmutanten mit veränderter Beständigkeit gegen Alkalien umfassen Q156/K166, Q156/N166, S156/K166, S156/N166 (bei der zuvor veränderte Substratspezifität festgestellt wurde und F50/S156/A169/L217 (die zuvor als Mutante von B. amyloliquefaciens-Subtilisin mit ähnlichen Eigenschaften wie Subtilisin aus B. licheniformis identifiziert wurde). Die Mutante F50,V107/R213 wurde auf der Basis der beobachteten Zunahme der Beständigkeit gegen Alkalien bei den Einfachmutanten F50, V107 und R213 konstruiert. Es wurde festgestellt, daß die V107/R213-Mutante eine im Vergleich zu Subtilisin der Wildform erhöhte Beständigkeit gegen Alkalien besaß. In dieser speziellen Mutante war die erhöhte Beständigkeit gegen Alkalien das Ergebnis der kumulativen Beständigkeit jeder einzelnen Mutation. In ähnlicher Weise besaß die Mutante F50/V107/R213 eine im Vergleich zur V107/R213- Mutante sogar weiter erhöhte Beständigkeit gegen Alkalien, was zeigt, daß die Zunahme der Beständigkeit gegen Alkalien durch die F50-Mutation ebenso kumulativ war.
Tabelle IV faßt die hergestellten Mehrfachmutanten zusammen, einschließlich der zuvor nicht erwähnten.
Zusätzlich wird, teilweise basierend auf den oben angegebenen Ergebnissen, erwartet, daß Substitution an den folgenden Resten in Subtilisin eine Mehrfachmutante ergibt, die erhöhte Thermostabilität und Beständigkeit gegen Alkalien aufweist: Ser24, Met50, Ile107, Glu156, Gly166, Gly169, Ser204, Lys213, Gly215 und Tyr217. TABELLE IV Doppelmutanten Dreifach-. Vierfach- oder andere Mehrfachmutanten
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen identifizierten Aminosäure-Resten werden auch andere Aminosäure-Reste von Subtilisin hinsichtlich Substratspezifität für wichtig gehalten. Von der Mutation jedes dieser Reste wird erwartet, Änderungen der Substratspezifität von Subtilisin hervorzurufen. Außerdem wird auch von Mehrfachmutationen unter diesen und den zuvor identifizierten Resten erwartet, Subtilisin-Mutanten mit neuer Substratspezifität zu ergeben
Besonders wichtige Reste sind His67, Ile107, Leu126 und Leu135. Mutation von His67 sollte die S-1'-Substelle und dadurch die Spezifität der Mutante für den P-1'- Substratrest verändern. Veränderungen an dieser Position könnten ebenso das pH- Aktivitätsprofil der Mutante beeinflussen. Dieser Rest wurde auf der Basis von Substrat-Modelling der Autoren der vorliegenden Erfindung aus Produk-Inhibitor-Komplexen identifiziert.
Ile107 ist an der P-4-Bindung beteiligt. Mutation an dieser Position sollte daher, zusätzlich zur beobachteten Auswirkung auf die Beständigkeit gegen Alkalien, die Spezifität für den P-4-Substratrest verändern. Ile107 wurde auch durch Molekular- Modeling aus Produkt-Inhibitor-Komplexen identifiziert.
Die S-2-Bindungsstelle schließt den Leu126-Rest ein. Modifikation an dieser Position sollte deshalb die P-2-Spezifität beeinflussen. Außerdem wird angenommen, daß dieser Rest wichtig für die Umwandlung von Subtilisin zu einer Aminopeptidase ist. Das pH-Aktivitätsprofil sollte ebenso durch geeignete Substitution modifizierbar sein. Diese Reste wurden durch nähere Betrachtung des verfeinerten Modells, der dreidimensionalen Struktur aus Modelling-Studien, identifiziert. Von einer längeren Seitenkette wird erwartet, daß sie die Bindung jeglicher Seitenkette an der S-2-Substelle ausschließt. Deshalb würde die Bindung auf die Substellen S-1, S-1', S-2' und S-3' beschränkt und die Spaltung dazu gezwungen werden, nach dem aminoterminalen Peptid stattzufinden.
Leu135 liegt an der S4-Substelle und sollte, falls mutiert, die Substratspezifität für P4 verändern. Dieser Rest wurde durch nähere Betrachtung der dreidimensionalen Struktur identifiziert, und das Modell basierte auf dem Produkt-lnhibitor-Komplex von F222.
Zusätzlich zu diesen Stellen werden auch spezielle Aminosäure-Reste innerhalb der Segmente 97 - 103, 126 - 129 und 213 - 215 für zur Substratbindung wichtig gehalten.
Die Segmente 97 - 103 und 126 - 129 bilden ein antiparalleles β-Faltblatt mit der Hauptkette der Substratreste P-4 bis P-2. Mutierende Reste in diesen Bereichen sollten durch Hauptketten (Enzym) - Hauptketten (Substrat) Wechselwirkungen die Substrat- Ausrichtung beeinflussen, da die Hauptkette dieser Substratreste nicht mit diesen speziellen Resten innerhalb der S-4- bis S-2-Substellen wechselwirkt. Innerhalb des Segments 97 - 103 können Gly97 und Asp99 mutiert werden, um die Position der Reste 101 - 103 innerhalb des Segments zu verändern. Veränderungen an diesen Stellen müssen jedoch kompatibel sein. In B. amyloliquefaciens-Subtilisin stabilisiert Asp99 eine Windung in der Hauptketten-Tertiärfaltung, die die Richtung der Reste 101 - 103 beeinflußt. Asp97 in B. licheniformis-Subtilisin funktioniert auf analoge Weise.
Zusätzlich zu Gly97 und Asp99 wechselwirkt Ser101 mit Asp99 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin, um dieselbe Hauptketten-Windung zu stabilisieren. Veränderungen an diesem Rest sollten die Richtung der Hauptkette bei 101 - 103 verändern.
Auch von Mutationen bei Glu103 wird erwartet, daß sie die Richtung der Hauptkette bei 101 - 103 verändern.
Die Seitenkette von Gly102 wechselwirkt mi1 der P-3-Aminosäure des Substrats. Es wird daher erwartet, daß die Seiten ketten von substituierten Aminosäuren die Spezifität für die P-3-Aminosäuren des Substrats wesentlich beeinflussen.
Alle Aminosäuren innerhalb des 127 - 129-Segments werden als wichtig für die Substratspezifität erachtet. Gly127 ist so positioniert, daß seine Seitenkette mit den Substellen S-1 und S-3 wechselwirkt. Verändern dieses Restes sollte daher die Spezifität für die P-1- und P-3-Reste des Substrats verändern.
Die Seitenkette von Gly128 umfaßt einen Teil der beiden Substellen S-2 und S-4. Von Mutation würde deshalb veränderte Spezifität für P-2 und P-4 erwartet werden. Außerdem kann eine derartige Mutation Subtilisin aus denselben Gründen in eine Aminopeptidase umwandeln, wie dieses Ergebnis von Substitutionen von Leu126 erwartet wird.
Der Pro129-Rest schränkt wahrscheinlich die Konformationsfreiheit der Sequenz 126 - 133 ein, also von Resten, die eine Hauptrolle bei der Bestimmung der P-1- Spezifität spielen. Der Ersatz von Pro kann höhere Flexibilität einbringen, wodurch der Bereich der Bindungsfähigkeit derartiger Mutanten erweitert wird.
Die Seitenkette von Lys213 befindet sich innerhalb der S-3-Substelle. Alle Aminosäuren innerhalb des 213 - 215-Segments werden auch für wichtig für Substratspezifität gehalten. Daher wird von Mutation dieses Rests veränderte Substratspezifität erwartet.
Der Tyr214-Rest wechselwitt nicht mit dem Sunstrat, liegt jedoch so, daß er die Konformation der Haarnadel-Schleife 204 - 217 beeinflussen könnte.
Schließlich sollte Mutation des Gly215-Rests die S-3'-Substelle beeinflussen und dadurch die P-3'-Spezifität verändern.
Zusätzlich zu den zuvor genannten Substitutionen von Aminosäuren kann auch die Einfügung oder Löschung einer oder mehrerer Aminosäuren innerhalb der äußeren Schleife, umfassend die Reste 152 - 172, die Spezifität beeinflussen. Dies rührt daher, daß diese Reste eine Rolle im "sekundären Kontaktbereich" spielen können, der im Modell von Streptomyces-Subtilisin-Inhibitor, komplexiert mit Subtilisin, beschrieben wird. Hirono et al. (1984) J. Mol. Biol. 178, 389-413. Thermitase K weist in diesem Bereich eine Löschung auf, die mehrere dieser "Sekundärkontakt"-Reste beseitigt. Im speziellen wird erwartet, daß Löschung der Reste 161 - 164 ein mutantes Subtilisin mit modifizierter Substratspezifität erzeugt. Außerdem sollte eine durch die Löschung induzierte Umordnung in diesem Bereich die Position vieler an der Substratbindung, hauptsächlich an P-1, beteiligten Reste verändern. Dies wiederum sollte die Gesamtaktivität gegen proteinartige Substrate beeinflussen.
Die Auswirkung von Löschung der Reste 161 - 164 wurde durch Vergleich der Aktivität des Wild-Enzyms ("wild type", WT) mit einem mutanten Enzym, das diese Löschung sowie Mehrfachsubstitutionen (d.h. S153/S156/A158/G159/S160/Δ161- 164/I165/S166/A169/R170) enthält, gezeigt. Das führte zu folgenden Ergebnissen: TABELLE V Wild-EnzymWT Löschungsmutant
Das Wild-Enzym weist das 6fache des kcat des Löschungsmutanten auf, die Substratbindung durch den Löschungsmutanten ist aber 28-mal enger. Die Gesamtwirkung des Löschungsmutanten ist daher 4,4-mal höher als jene des Wildformenzyms.
Alle diese zuvor identifizierten, noch zu substituierenden, zu löschenden oder einzufügenden Reste sind in Tabelle V angegeben. TABELLE VI Reste für die Substitution/Einfügung/Löschung
Die folgende Offenbarung hierin soll als Darstellung von Ausführungsformen und nicht als Einschränkung des Bereichs dieser Anmeldung interpretiert werden. Diese spezifischen Beispiele beschreiben die Konstruktion von bestimmten zuvor identifizierten Mutanten. Die Konstruktion der anderen Mutanten ist jedoch aus der Offenbarung hierin und jener in EP-A-0.130.756 ersichtlich.
Alle Literaturzitate sind ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.

BEISPIEL 1

Identifizierung von persäure-oxidierbaren Resten von Subtilisin Q222 und L222

Wie in Fig. 6A und 6B dargestellt, inaktivieren organische Persäure- Oxidationsmittel die mutanten Subtilisine Met222L und Met222Q (L222 und Q222).
Dieses Beispiel beschreibt die Identifizierung von persäure-oxidierbaren Stellen in diesen mutanten Subtilisinen.
Zuerst wurde die Art der an der Persäure-Oxidation beteiligten Aminosäure bestimmt. Außer unter drastischen Bedingungen (G.E. Means et al. (1971) Chemical Modifications of Proteins, S.F. Holden-Day, CA, S. 160-162) modifizieren organische Persäuren in Subtilisin nur Methionin und Tryptophan. Differenzspektren des Enzyms im Bereich von 250 - 350 nm wurden während einer Inaktivierungs-Titration aufgenommen, die das Reagens Diperdodecansäure (DPDA) als Oxidationsmittel einsetzte. Trotz quantitativer Inaktivierung des Enzyms wurde in diesem Wellenlängenbereich keine Veränderung der Absorbanz festgestellt, wie in Fig. 7A und 7B dargestellt, was zeigt, daß Tryptophan nicht oxidiert worden war. A. Fontana et al. (1980) Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis (C. Birr, Hrsg.), Elsevier, New York, S. 309. Das Fehlen von Tryptophan-Modifikation implizierte die Oxidation eines oder mehrerer der übrigen Methionine von B. amyloliquefaciens-Subtilisin. Siehe Fig. 1.
Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurde das rekombinante Subtilisin Met222F mit Bromcyan (CNBr) sowohl vor als auch nach der Oxidation mit DPDA gespalten. Die bei der CNBr-Spaltung erzeugten Peptide wurden über hochauflösende SDS-Pyridin- Peptidgele (SPG) analysiert.
Subtilisin Met222F (F222) wurde auf folgende Weise oxidiert. Gereinigtes F222 wurde in 0,1 M Natriumborat, pH = 9,5, mit 10 mg/ml erneut suspendiert und Diperdodecansäure (DPDA) zu einer Endkonzentration von 26 mg/ml zugegeben, um eine Konzentration von aktivem Sauerstoff von 30 ppm zu erzeugen. Die Probe wurde zumindest 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit 0,1 Volumsteilen 1 M Trispuffer, pH = 8,6, abgeschreckt. um eine Endkonzentration von 0,1 M Tris (pH = 8,6) zu ergeben. 3 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wurden zugefügt, und 2,5 ml der Probe wurden auf eine Pharmacia PD10-Säule, die in 10 mM Natriumphosphat, pH = 6,2, und 1 mM PMSF äquilibriert worden war aufgebracht. Es wurden 3,5 ml 10 mM Natriumphosphat, pH = 6,2, 1 mM PMSF aufgebracht und das Eluat gesammelt.
F222 und DPDA-oxidiertes F222 wurden mit 9 Volumsteilen Aceton bei -20ºC gefällt. Die Proben wurden mit 10 mg/ml in 8 M Harnstoff in 88%-iger Ameisensäure erneut suspendiert und 5 min lang abstehen gelassen. Es wurde das gleiche Volumen 200 mg/ml CNBr in 88%-iger Ameisensäure zugegeben (5 mg/ml Protein) und die Proben 2 h lang bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubiert. Vor der Gelelektrophorese wurden die Proben lyophilisiert und mit 2 - 5 mg/ml in Probenpuffer (1% Pyridin, 5% NaDodSO&sub4;, 5% Glycerin und Bromphenol-Blau) erneut suspendiert und bei 95ºC 3 min lang dissoziiert.
Die Proben wurden über diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelen elektrophoretisch getrennt (J. Kyte et al. (1983) Anal. Bioch. 133, 515-522). Die Gele wurden unter Anwendung der Pharmacia Siberfärbe-Vorgangsweise (D.I. Sammons et al. (1981) Electrophoresis 2, 135-141) gefärbt.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 8 dargestellt. Wie zu sehen ist, ergibt mit CNBr behandeltes F222 nur neun aufgelöste Bänder auf SPG. Falls F222 jedoch vor der Spaltung auch mit DPDA behandelt wird, verschwinden die Bänder X, 7 und 9, während die Bänder 5 und 6 stark an Intensität zunehmen.
Um festzustellen, welches der Methionine beeinflußt wurde, wurde jedes der CNBr-Peptide durch Umkehrphasen-HPLC isoliert und weiter charakterisiert. Das Puffersystem in beiden Lösungsmitteln A (wäßrig) und B (organisch) für alle HPLC- Trennungen war 0,05% Triethylamin/Trifluoressigsäure (TEA-TFA). Falls nicht anders angegeben, bestand Lösungsmittel A in allen Fällen aus 0,05% TEA-TFA in H&sub2;O, und Lösungsmittel B 0,05% TEA-TFA in 1-Propanol, und die Fließrate betrug 0,5 ml/min.
Bei der HPLC-Analyse wurden zwei Einspritzungen von 1 mg Enzym-Digests verwendet. Drei Proben wurden mit Aceton gefällt, gewaschen und getrocknet. Die getrockneten 1 mg-Proben wurden mit 10 mg/ml in 8 M Harnstoff in 88%-iger Ameisensäure erneut suspendiert; es wurde das gleiche Volumen von 200 mg/ml CNBr in 88%-iger Ameisensäure zugegeben (5 mg/ml Protein). Nach 2-stündiger Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur wurden die Proben auf einer 0,8 x 7 cm Säule aus grobkörnigem Tris-Acryl-GF05-Harz (IBF, Paris, Frankreich), die mit 40% Lösungsmittel A und 60% Lösungsmittel B äquilibriert worden war, entsalzt. Es wurden 200 ul-Proben mit einer Fließrate von 1 ml/min aufgebracht und durch Überwachen der Absorbanz bei 280 nm 1,0 - 1,2 ml gesammelt. Vor dem Einspritzen in die HPLC wurde jede entsalzte Probe mit 3 Volumsteilen Lösungsmittel A verdünnt. Die Proben wurden mit 1,0 ml/min (2 min) eingespritzt und der Fluß anschließend auf 0,5 ml/min (100% A) eingestellt. Nach 2 min wurde ein linearer Gradient zu 600,0 B mit 1,0% B/min gestartet. Von jedem 1 mg-Versuch wurden Proben der gepoolten Peaks gezogen und wie zuvor beschrieben durch Gelelektrophorese analysiert.
Jedes durch Umkehrphasen-HPLC isolierte Polypeptid wurde weiters mit SPG auf Homogenität analysiert. Die Position jedes Peptids in der bekannten Gensequenz (J.A. Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7924) wurde durch eine Kombination von Aminosäure-Zusammensetzungs-Analyse und, falls notwendig, aminoterminales Sequenzieren erhalten.
Vor derartiger Analyse wurden die folgenden Peptide erneut chromatografiert.
1. CNBr-Peptide aus F222, das nicht mit DPDA behandelt wurde:
Peptid 5 wurde zwei zusätzlichen Umkehrphasen-Trennungen unterzogen. Die 10 cm-C4-Säule wurde mit 80% A / 20% B äquilibriert und die gepoolte Probe aufgebracht und 2 min lang gewaschen. Als nächstes wurde ein 0,5% ml B/min- Gradient gestartet. Fraktionen dieser Trennung wurden noch einmal laufen gelassen, diesmal auf der 25 cm-C4-Säule und unter Verwendung von 0,05% TEA-TFA in Acetonitril/1-Propanol (1 : 1) statt Lösungsmittel B. Der Gradient war identisch mit dem eben beschriebenen.
Peptid "X" wurde nach der anfänglichen Chromatografie einer zusätzlichen Trennung unterzogen. Die Probe wurde aufgebracht und 2 min lang mit 0,5 ml/min (1000% A) gewaschen und ein 0,5% ml B/min-Gradient gestartet.
Die Peptide 7 und 9 wurden auf ähnliche Weise wie im ersten Wiederholungslauf von Peptid 5 erneut chromatografiert.
Peptid 8 wurde nach der anfänglichen Trennung bis zur Homogenität gereinigt.
2. CNBr-Peptide aus mit DPDA oxidiertem F222:
Die Peptide 5 und 6 aus einem CNBr-Digest des oxidierten F222 wurden auf dieselbe Weise wie Peptid 5 aus dem unbehandelten Enzym gereinigt.
Die Aminosäure-Zusammensetzungs-Analyse erfolgte wie folgt. Die Proben (etwa 1 nM jeder Aminosäure) wurden getrocknet, im Vakuum mit 100 ul 6 n HCl bei 106ºC 24 h lang hydrolysiert und anschließend in einem Speed-Vac getrocknet. Die Proben wurden auf einem Beckman 6300 AA-Analyzer mittels Ninhydrin-Nachweis analysiert.
Die aminoterminalen Sequenzdaten wurden wie zuvor beschrieben erhalten (H. Rodriguez et al. (1984) Anal. Biochem. 134, 538-547).
Die Ergebnisse sind in Tabelle VII und Fig. 9 dargestellt. TABELLE VII Amino- und COOH-Termini von CNBr-Fragmenten Terminus und Verfahren Fragment Amino, Verfahren COOH, Verfahren Sequenz Zusammensetzung
Die Peptide 5ox und 6ox bezeichnen die Peptide 5 und 6, die aus CNBr- Digesten des oxidierten Proteins isoliert wurden, wobei ihre entsprechenden Werte erhöht werden.
Aus den Daten in Tabelle VII und dem Vergleich der SPG-Bahnen der oxidierten und der nativen Protein-Digeste in Fig. 8 ist ersichtlich, daß (1) Met50 oxidiert wird, was zum Verlust der Peptide X und 9 und dem Erscheinen von 5 führt; und (2) Met124 auch oxidiert wird, was zum Verlust von Peptid 7 und Anreicherung von Peptid 6 führt, daher führt die Oxidation von B. amyloliquefaciens-Subtilisin mit der Persäure Diperdodecansäure zur spezifischen Oxidation von Methionin der Reste 50 und 124.

BEISPlEL 2

Substitution von Met50 und Met124 in Subtilisin-Met222Q

Die Auswahl der Aminosäure zur Substitution von Met50 basierte auf den zugänglichen Sequenzdaten für Subtilisine aus B. licheniformis (E.C. Smith et al. (1968) J. Biol. Chem. 243, 2184-2191), B. DY (P. Nedkov et al. (1983) Hoppe Sayler's Z. Physiol. Chem. 364, 1537-1540), B. amylosacchariticus (F.S. Markland et al. (1967) J. Biol. Chem. 242, 5198-5211) und B. subtilis (M.L. Stahl et al. (1984) J. Bacteriol. 158, 411-418). In jedem Fall ist Position 50 ein Phenylalanin. Siehe Fig. 5. Deshalb wurde Phe50 zur Konstruktion ausgewählt.
An Position 124 weisen alle bekannten Subtilisine ein Methionin auf. Siehe Fig. 5. Es erforderte daher Molekular-Modelling der mittels Röntgen aufgeklärten Proteinstruktur, um die wahrscheinlichsten Kandidaten für die Substitution zu bestimmen. Von allen 19 Kandidaten wurden Isoleucin und Leucin als die besten zu verwendenden Reste ausgewählt. Um zu testen, ob die Modifikation an einer, jedoch nicht an beiden Stellen ausreicht, um die Oxidationsbeständigkeit zu erhöhen oder nicht, wurden alle möglichen Kombinationen am Q222-Rückgrat aufgebaut (F50/Q222, I124/Q222, F50/I124/Q222).

A. Konstruktion von Mutationen zwischen den Codons 45 und 50

Alle Manipulationen zur Kassetten-Mutagenese erfolgten an pS4,5 nach Verfahren, die in EP-A-0.130.756 und von J.A. Wells et al. (1985) Gene 34, 315-323, beschrieben werden. Die pΔ50-Mutationen in Fig. 10, Zeile 4, wurden unter Verwendung des in Fig. 10, Zeile 6, dargestellten Mutagenese-Primers und Anwendung einer nachfolgend beschriebenen Vorgangsweise hergestellt, die als Restriktions- Reinigung bezeichnet wird. Kurz gesagt wurde eine M13-Schablone, die das Subtilisin- Gen enthielt, M13mp11-SUBT, zur Heteroduplex-Synthese verwendet (Adelman et al. (1983) DNA 2, 183-193). Nach Transfektion von JM101 (ATCC 33.876) wurde das 1,5 kb-EcoRI-BamHI-Fragment, das das Subtilisin-Gen enthielt, von M13mp11-SUBT-rf in ein Empfänger-Vektorfragment von pBS42 subkloniert, dessen Konstruktion in EP-A- 0.130.756 beschrieben wird. Um die mutante Sequenz (pΔ50, Zeile 4) anzureichern, wurde der erhaltene Plasmid-Pool mit Kpnl digeriert und lineare Moleküle durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt. Lineare Moleküle wurden zu einer zirkularen Form zurückligiert und in E. coli MM294-Zellen (ATCC 31.446) transformiert. Isolierte Plasmide wurden mittels Restriktionsanalyse auf die Kpnl-Stelle gescreent. Kpnl&spplus;-Plasmide wurden sequenziert, was die pΔ50-Sequenz bestätigte. Die Sternchen in Fig. 11 zeigen die gegenüber der Wild-Sequenz mutierten Basen an (Zeile 4.). pΔ50 (Zeile 4) wurde mit Stul und EcoRI gespalten und das 0,5 kb-Fragment, das die 5'-Hälfte des Subtilisin-Gens enthielt, gereinigt (Fragment 1). pΔ50 (Zeile 4.) wurde mit Kpnl und EcoRI digeriert und das die 3'-Hälfte des Subtilisin-Gens und Vektorsequenzen enthaltende 4,0 kb-Fragment gereinigt (Fragment 2). Die Fragmente 1 und 2 (Zeile 5.) und Duplex-DNA-Kassetten, die für die gewünschten Mutationen kodieren (schattierte Sequenz, Zeile 6.) wurden in einem Molverhältnis von 1 : 1 : 10 vermischt. Für die spezielle Konstruktion dieses Beispiels enthielt die DNA-Kassette das Triplett TTT als Codon 50, das für Phe kodiert. Dieses Plasmid wurde mit pF50 bezeichnet. Das mutante Subtilisin wurde mit F50 bezeichnet.

B. Konstruktion von Mutationen zwischen den Codons 122 und 127

Die Vorgangsweise aus Beispiel 2A wurde im wesentlichen wiederholt, außer daß der Mutagenese-Primer aus Fig. 11, Zeile 7, und für die EcoRV-Stelle in p-Δ124 Restriktions-Reinigung verwendet wurde. Außerdem enthielt die DNA-Kassette (schattierte Sequenz, Fig. 11, Zeile 6.) das Triplett ATT als Codon 124, das für Ile kodiert, und CTT für Leu. Jene Plasmide, die die Substitution von Ile für Met124 enthielten, wurden mit pI124 bezeichnet. Das mutante Plasmid wurde mit I124 bezeichnet.

C. Konstruktion von verschiedenen F50/I124/Q222-Mehrfachmutanten

Die Dreifachmutante F50/I124/Q222 wurde aus einer Dreiweg-Ligation konstruiert, in der jedes Fragment eine der drei Mutationen enthielt. Die Einfachmutante Q222 (pQ222) wurde durch Kassetten-Mutagenese, wie in EP-A-0.130.756 beschrieben, hergestellt. Die F50-Mutation war in einem 2,2 kb-Avall bis Pvull-Fragment von pF50 enthalten; die I124-Mutation war in einem 260 bp-Pvull bis Avall-Fragment von pI124 enthalten; und die Q222-Mutation war in einem 2,7 kb-Avall bis Avall-Fragment von pQ222 enthalten. Die drei Fragmente wurden miteinander ligiert und in E. coli MM294- Zellen transformiert. Restriktionsanalyse von Plasmiden aus isolierten Transformanten bestätigten die Konstruktion. Um die Endkonstruktion zu analysieren, war es angenehm, daß die Avall-Stelle an Position 798 im Subtilisin-Gen der Wildform durch die I124- Konstruktion entfernt worden war.
Die F50/Q222- und I124/Q222-Mutanten wurden auf ähnliche Weise konstruiert, außer daß für die Endkonstruktion das geeignete Fragment von pS4,5 verwendet wurde.

D. Oxidationsbeständigkeit von Q222-Mutanten

Die oben beschriebenen Mutanten wurden auf Beständigkeit gegen Persäure- Oxidation analysiert. Wie in Fig. 12 dargestellt, sind bei Inkubation mit Diperdodecansäure (Protein 2 mg/ml, Oxidationsmittel 75 ppm[0]) sowohl I124/Q222 als auch F50/I124/Q222 vollständig stabil, während F50/Q222 und Q222 inaktiviert werden. Das zeigt, daß die Umwandlung von Met124 zu I124 in Subtilisin Q222 ausreicht, um Beständigkeit gegen organische Persäure-Oxidationsmittel zu verleihen.

BEISPIEL 3

Subtilisin-Mutanten mit veränderter Substratspezifität - hydrophobe Substitutionen am Rest 166

Subtilisin enthält eine erweiterte Bindungsspalte, die hydrophoben Charakter besitzt. Ein konserviertes Glycin an Rest 166 wurde durch 12 nichtionische Aminosäuren ersetzt, deren Seitenketten in die S-1-Substelle ragen können. Diese Mutanten wurden konstruiert, um die Auswirkung von Veränderungen in Größe und Hydrophobie auf die Bindung von verschiedenen Substraten zu bestimmen.

A. Kinetik der Hydrolyse von Substraten mit veränderten P-1-Aminosäuren durch Subtilisin aus B. amyloliquefaciens

Wildtyp-Subtilisin wurde aus Überständen einer B. subtilis-Kultur gereinigt, die das B. amyloliquefaciens-Subtilisin-Gen exprimiert (J.A. Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7925), wie zuvor beschrieben (D.A. Estell et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518-6521). Details der Synthese von Tetrapeptid-Substraten der Form Succinyl-L-AlaL-AlaL-ProL-[X]-p-Nitroanilid (wobei X die P-1-Aminosäure ist) werden von E.G. DelMar et al. (1979) Anal. Biochem. 99, 316-320, beschrieben. Die kinetischen Parameter Km (Mol) und kcat (s&supmin;¹) wurden unter Anwendung einer modifizierten Fortschrittskurven-Analyse (D.A. Estell et al. (1985) J. Biol. Chem. 260 6518-6521) gemessen. Kurz gesagt wurden Diagramme von Rate gegenüber Produktkonzentration unter Verwendung eines nicht-linearen Regressionsalgorithmus an die differenzierte Form der Geschwindigkeits-Gleichung angepaßt. Der Fehler bei kcat und Km für alle angegebenen Werte beträgt weniger als 5%. Die in Tabelle VIII angeführten verschiedenen Substrate sind in der Reihenfolge abnehmende Hydrophobie angeordnet. Y. Nozaki (1971) J. Biol. Chem. 246, 2211-2217: C. Tanford (1978) Science 200, 1012. TABELLE VIII P-1-Substrat-Aminosäure
Das Verhältnis kcat/Km (auch als katalytischer Wirkungsgrad bezeichnet) ist die auftretende Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Umwandlung von freiem Enzym + Substrat (E + S) in Enzym + Produkte (E + P) (W.P. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology (McGraw-Hill, 1969), S. 321-436; A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism (Freeman, San Francisco, 1977), S. 226-287). Der log (kcat/Km) ist der Bindungsenergie des Übergangszustands ΔG*T proportional. Ein Diagramm von log kcat/Km gegenüber der Hydrophobie der P-1-Seitenkette (Fig. 14) zeigt einen starken Zusammenhang (r = 0,98), mit Ausnahme des Glycin-Substrats, das nicht-produktive Bindung beweist. Diese Daten zeigen, daß relative Unterschiede zwischen den Bindungsenergien des Überangszustands für die Unterschiede in der Hydrophobie der P-1-Seitenkette verantwortlich gemacht werden können. Bei Berechnung der Bindungsenergien des Überangszustands und Auftragen über ihren entsprechenden Hydrophobien der Seiten ketten beträgt der Anstieg der Geraden 1,2 (nicht dargestellt). Ein Anstieg größer als eins, was auch für Chymotrypsin der Fall ist (A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism (Freeman, San Francisco, 1977), S. 226- 287; J.W. Harper et al. (1984) Biochemistry 23, 2995-3002), legt nahe, daß die P-1- Bindungsspalte hydrophober ist als die Lösungsmittel Ethanol oder Dioxan, die verwendet wurden, um die Hydrophobie von Aminosäuren empirisch zu bestimmen (Y. Nozaki (1971) J. Biol. Chem. 246, 2211-2217; C. Tanford (1978) Science 200, 1012).
Bei Amidhydrolyse durch Subtilisin kann kcat als die Acylierungsratekonstante und Km als Dissoziationskonstante, bzw. Ks für den Michaelis-Komplex (E S) angesehen werden. H. Gutfreund et al. (1956) Biochem. J. 63, 656. Die Tatsache, daß log kcat, sowie log 1/Km, mit der Substrat-Hydrophobie übereinstimmt, entspricht den Vorhersagen (J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 2439-2449; J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 4293-4303), daß während des Acylierungsschritts die P-1- Seitenkette sich tiefer in die hydrophobe Spalte hinein bewegt wenn das Substrat vom Michaelis-Komplex (E S) in den tetraedrischen Übergangszustands-Komplex (E S*) übergeht. Diese Daten können jedoch auch dahingehend interpretiert werden, daß die Hydrophobie der P-1-Seitenkette die Ausrichtung und daher die Empfindlichkeit der spaltbaren Peptidbindung gegen nukleophilen Angriff der Hydroxylgruppe des katalytischen Ser221 beeinflußt.
Die Abhängigkeit von kcat/Km von der Hydrophobie der P-1-Seitenkette legte nahe, daß kcat/Km für hydrophobe Substrate durch Erhöhen der Hydrophobie der S-1- Bindungssubstelle erhöht werden kann. Um diese Hypothese zu testen, wurden hydrophobe Aminosäure-Substitutionen von Gly166 hergestellt.
Da die Hydrophobie von aliphtischen Seitenketten der Oberfläche der Seitenkette direkt proportional ist (G.D. Rose et al. (1985) Science 229, 834-838; J.A. Reynolds et al. (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 2825-2927), kann ein Erhöhen der Hydrophobie an der S-1-Substelle ebenso die Bindung von größeren Substraten sterisch hindern. Wegen der Schwierigkeiten bei der Vorhersage der relativen Bedeutung dieser beiden gegensätzlichen Effekte, wurde entschieden, 12 ungeladene Mutationen an Position 166 zu erzeugen, um die resultierenden Spezifitäten gegen ungeladene Substrate verschiedener Größe und Hydrophobie zu bestimmen.

B. Kassetten-Mutagenese der P-1-Bindungsspalte

Die Herstellung von mutanten Subtilisinen, die die Substitution der hydrophoben Aminosäuren Aa, Val und Phe am Rest 166 enthalten, wurde in EP-A-0.130.756 beschrieben. Es wurde dasselbe Verfahren angewandt, um die übrigen hydrophoben Mutanten am Rest 166 zu erzeugen. Unter Anwendung dieses Verfahrens wurden zweieinzelne und latente (stille) Restriktionsstellen in die Subtilisin-Gene eingeführt, um das Zielcodon 166 eng zu flankieren. Wie in Fig. 13 zu sehen ist, wurde die Wildtyp- Sequenz (Zeile 1.) durch stellengerichtete Mutagenese in M13 unter Verwendung des angegebenen 37mer-Mutagenese-Primers verändert, um eine 13 bp-Löschung (strichlierte Linie) und einzige Sacl- und Xmal-Stellen (unterstrichene Sequenzen) einzubringen, die Codon 166 eng flankieren. Das Subtilisin-Genfragment wurde zurück in das E. coli-B. Subtilis-Shuttleplasmid, pBS42, subkloniert, was das Plasmid pΔ166 ergab (Fig. 13, Zeile 2). pΔ166 wurde mit Sacl und Xmal aufgeschnitten und mit einer Spalte versehene lineare Moleküle gereinigt (Fig. 13, Zeile 3.). Pools von synthetischen Oligonukleotiden, die die interessierende Mutation enthielten, wurden anneliert, um die Duplex-DNA-Kassetten zu ergeben, die in das mit einer Spalte versehene pΔ166 ligiert werden (unterstrichene und überstrichene Sequenzen in Fig. 13, Zeile 4). Diese Konstruktion stellte die Kodiersequenzen wieder her, außer bei Position 166 (NNN; Zeile 4). Mutante Sequenzen wurden durch Didesoxy-Sequenzieren bestätigt. Sternchen bezeichnen Sequenzänderungen gegenüber der Wildtyp-Sequenz. Plasmide, die jedes mutante B. amyloliquefaciens-Subtilisin-Gen enthielten, wurden in ungefähr gleichen Mengen in einem protease-defizienten Stamm von B. subtilis, BG2036, wie zuvor beschrieben, exprimiert. EP-A-0.130.756; M.Y. Yang et al. (1984) J. Bacteriol. 160, 15- 21; D.A. Estell et al. (1985) J. Biol. Chem. 260,6518-6521.

C. Einschränkung der Substratspezifität durch sterische Hinderung

Um die durch sterische Veränderungen an der S-1-Substelle verursachte Änderung der Substratspezifität zu sondieren, wurden Mutanten an Position 166 kinetisch gegenüber P-1-Substraten zunehmender Größe analysiert (d.h. Ala, Met, Phe und Tyr). Die Verhältnisse kcat/Km sind in logarithmischer Form in Fig. 15 dargestellt, um direkte Vergleiche der Bindungsenergien des Übergangszustands zwischen verschiedenen Enzymsubstratpaaren zu ermöglichen.
Nach der Übergangszustands-Theorie kann die Differenz in der freien Energie des freien Enzyms + Substrat (E + S) und des Übergangszustands-Komplexes (E 5*) aus Gleichung (1) berechnet werden,
(1) ΔG*T = -RT In kcat/Km + RT In kT/h
worin kcat die Umsatzzahl, Km die Michaelis-Konstante, R die Gaskonstante, T die Temperatur, k die Boltzmann-Konstante und h das Plancksche Wirkungsquantum ist. Spezifitätsunterschiede werden quantitativ als Differenzen der Bindungsenergien des Übergangszustands (d.h. ΔΔG*T) ausgedrückt und können aus Gleichung (2) berechnet werden.
(2) ΔΔG*T = -RT In (kcat/Km)A/(kcat/Km)B
A und B stellen entweder zwei unterschiedliche Substrate, die auf dasselbe Enzym getestet werden, oder zwei mutante Enzyme dar, die auf dasselbe Substrat getestet werden.
Wie aus Fig. 15A hervorgeht, verschiebt sich bei zunehmender Größe der Seitenkette an Position 166 die Substrat-Präferenz von großen zu kleinen P-1- Seitenketten. Ein Vergrößern der Seitenkette an Position 166 verringert kcat/Km proportional zur Größe der Seitenkette des P-1-Substrats (z.B. im Fall von Substitution von Gly166 (Wildform) durch W166 verringert sich kcat/Km für das Tyr-Substrat am stärksten, gefolgt von Phe, Met und Ala, in dieser Reihenfolge, als P-1-Substrat). Spezielle sterische Veränderungen der Seitenkette an Position 166, wie z.B. Gegenwart einer β-Hydroxylgruppe, β- oder γ-aliphatische Verzweigung, verursachen starke Abnahmen von kcat/Km bei größeren P-1-Substraten. Das Einbringen einer β- Hydroxylgruppe durch den Übergang von A166 (Fig. 15A) zu S166 (Fig. 15B) ruft eine Verringerung um das 8- bzw. 4fache von kcat/Km bei Phe- und Tyr-Substraten hervor, während die Werte für Ala- und Met-Substrate unverändert bleiben. Das Herstellen einer β-verzweigten Struktur durch Übergang von S166 zu T166 führt zu einem Abfall um das 14-bzw. 4fache von kcat für Phe bzw. Tyr. Diese Unterschiede sind für V166 leicht verstärkt, das ein wenig größer und isosterisch zu T166 ist. Vergrößern der β- verzweigten Substituenten von V166 auf I166 verursacht ein Absinken von kcat/Km um das 2- bis 6fache bei Met-, Phe- bzw. Tyr-Substraten. Das Einfügen einer γ-verzweigten Struktur durch Ersatz von M166 (Fig. 15A) durch L166 (Fig. 15B) bewirkt eine 5- bzw. 18fache Abnahme von kcat/Km für die Phe- bzw. Tyr-Substrate. γ-verzweigte Aliphaten scheinen für das Phe-P-1-Substrat eine geringere sterische Hinderung darzustellen als β- Verzweigung, was aus einer 100fachen Abnahme von kcat/Km für das Phe-Substrat beim Übergang von L166 zu I166 hervorgeht.
Die Verringerung von kcat/Km durch zunehmende Größe der Seitenkette an der S-1-Substelle oder besondere Strukturmerkmale, wie β- und γ-Verzweigungen, sind quantitativ in Fig. 16 dargestellt. Die kcat/Km-Werte für die die Position 166-Mutanten, bestimmt für Ala-, Met-, Phe- und Tyr-P-1-Substrate (von oben nach unten), sind gegenüber den Volumina der Seitenkette an Position 166 aufgetragen (C. Clothia (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 537-572). Der katalytische Wirkungsgrad für das Ala-Substrat erreicht ein Maximum für I166, für das Met-Substrat erreicht er ein Maximum zwischen V166 und L166. Das Phe-Substrat zeigt einen breiten kcat/Km-Peak, ist aber bei A166 optimal. Hier bilden die β-verzweigten Substitutionen an Position 166 eine Linie, die parallel zu den Seitenketten ähnlicher Größe verläuft, jedoch ungefähr bei einem Fünfzigstel von kcat/Km [d.h. C166 gegenüber T166, L166 gegenüber I166]. Das Tyr- Substrat wird am wirksamsten vom Wildtyp-Enzym (Gly166) genutzt, und es gibt eine stetige Abnahme beim Übergang zu großen Seitenketten an Position 166. Die β- und γ- verzweigten Substitutionen bilden eine parallele Linie unterhalb der anderen ungeladenen Substitutionen mit ähnlichem Molekül-Volumen.
Die optimale Substitution an Position 166 nimmt bei zunehmendem Volumen des P-1-Substrats an Volumen ab [z.B. I166/Ala-Substrat, L166/Met-Substrat, A166/Phe- Substrat, Gly166/Tyr-Substrat]. Die kombinierten Volumina dieser optimalen Paare können das Volumen zur produktiven Bindung an der S-1-Substelle annähern. Für die optimalen Paare, Gly166/Tyr-Substrat, A166/Phe-Substrat, L166/Met-Substrat, V166/Met- Substrat und I166/Ala-Substrat, betragen die kombinierten Volumina 266,295,313,339 bzw. 261 Å³. Durch Subtrahieren des Volumens des Peptid-Rückgrats von jedem Paar (d.h. zweimal das Volumen von Glycin) kann ein mittleres Seitenkettenvolumen von 160 ± 32 Å³ für die produktive Bindung berechnet werden.
Die Auswirkung des über das produktive Bindungsvolumen hinausgehenden Volumens auf den Abfall der Bindungsenergie des Übergangszustands kann aus der Tyr- Substrat-Kurve (Fig. 16, unterstes Diagramm) abgeschätzt werden, da diese Daten und Modelling-Studien (Fig. 2) nahelegen, daß jede Substitution abgesehen von Glycin sterische Abstoßung verursacht. Eine bezüglich aller Daten gezeichnete, am besten passende Linie (r = 0,87) weist einen Abfall auf, der einen Verlust an Bindungsenergie des Übergangszustands von ungefähr 3 kcal/Mol pro 100 Å³ überschüssiges Volumen anzeigt. (100 Å³ entspricht ungefähr dier Größe einer Leucyl-Seitenkette.)

D. Erhöhter katalytischer Wirkungsgrad korreliert mit zunehmender Hydrophobie der Substitution an Position 166

Bei Vergrößerung der Seitenkette an Position 166 treten wesentliche Zunahmen von kcat/Km auf, außer beim Tyr-P-1-Substrat (Fig. 16). Beispielsweise nimmt kcat/Km beim Übergang von Gly166 zu I166 für das Ala-Substrat (netto um das 10fache), von Gly166 zu L166 für das Met-Substrat (netto um das 10fache) und von Gly166 zu A166 für das Phe-Substrat (netto um das 2fache) zu. Die Zunahmen von kcat/Km können durch die Anziehungskräfte in der van der Waals-Funktion der potentiellen Energie wegen ihrer starken Entfernungsabhängigkeit (I / r&sup6;) und der schwachen Natur dieser Anziehungskräfte nicht vollständig erklärt werden (W.P. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology (McGraw-Hill, 1969), S. 321-436; A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism (Freeman, San Francisco, 1977), S. 226-287; M. Levitt (1976) J. Mol. Biol. 104, 59-107). Beispielsweise berechnete Levitt (M. Levitt (1976) J. Mol. Biol. 104, 59- 107), daß die van der Waals-Anziehung zwischen zwei Methionyl-Resten eine maximale Wechselwirkungsenergie von etwa -0,2 kcal/Mol ergeben würde. Diese Energie würde nur eine 1,4fache Zunahme von kcat/Km bedeuten.
Die Zunahmen des katalytischen Wirkungsgrads, die durch Seitenketten- Substitutionen an Position 166 verursacht werden, werden besser den Zunahmen der Hydrophobie der S-1-Substelle zugeschrieben. Das erhöhte kcat/Km, das bei den Ala- und Met-Substraten mit zunehmender Größe der Seitenkette an Position 166 beobachtet wurde, war zu erwarten, da die Hydrophobie der Seitenketten-Oberfläche ungefänr proportional ist (G.D. Rose et al. (1985) Science 229, 834-838; J.A. Reynolds et al. (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 2825-2927).
Ein weiteres Beispiel, das als Auswirkung von Hydrophobie interpretiert werden kann, ist beim Vergleich von kcat/Km bei isosterischen Substitutionen zu sehen, die sich in der Hydrophobie unterscheiden, wie z.B. S166 und C166 (Fig. 16). Cystein ist wesentlich hydrophober als Serin (-1,0 gegenüber +0,3 kcal/Mol) (Y. Nozaki (1971) J. Biol. Chem. 246,2211-2217; C. Tanford (1978) Science 200, 1012). Der Unterschied in der Hydrophobie korreliert mit der Beobachtung, daß C166 gegenüber Ser166 bei zunehmender Hydrophobie des Substrats (d.h. Ala < Met < Tyr < Phe) wirksamer wird. Sterische Hinderung kann diese Unterschiede nicht erklären, da Serin wesentlich kleiner als Cystein ist (99 gegenüber 118 Å³). I.C. Paul, Chemistry of the -SH Group (S. Patai, Hrsg., Wiley Interscience, New York, 1974), S. 111-149.

E. Herstellung einer elastase-ähnlichen Spezifität in Subtilisin

Die I166-Mutation zeigt besonders gut, daß große Veränderungen der Spezifität durch Veränderungen der Struktur und Hydrophobie der S-1-Substelle durch eine einzige Mutation erzeugt werden können (Fig. 17). Von den kleinen hydrophoben Substraten tritt eine maximale Verbesserung der Spezifität gegenüber der Wildform beim Val-Substrat auf (16faches kcat/Km). Bei zunehmender Größe der Seitenkette verringern sich diese Steigerungen bis zu etwa eins (d.h. bei Leu- und His-Substraten). Das I166-Enzym wird bei größeren aromatischen Substraten zunehmender Größe schlechter (z.B. ist I166 beim Tyr-Substrat über 1.000fach schlechter als Gly166). Die Autoren der vorliegenden Erfindung schreiben die Zunahme des katalytischen Wirkungsgrades bei kleinen hydrophoben Substraten von I166 im Vergleich zu Gly166 der stärkeren Hydrophobie von Isoleucin zu (d.h. -1,8 kcal/Mol gegenüber 0). Y. Nozaki (1971) J. Biol. Chem. 246, 2211-2217; C. Tanford (1978) Science 200, 1012. Die Abnahme des katalytischen Wirkungsgrades in Richtung der sehr großen Substrate von I166 im Vergleich zu Gly166 wird sterischer Abstoßung zugeschrieben.
Die Spezifitätsunterschiede zwischen Gly166 und I166 sind ähnlich den Spezifitätsunterschieden zwischen Chymotrypsin und der in der Entwicklung verwandten Elastase (J.W. Harper et al. (1984) Biochemistry 23 2995-3002). In Elastase blockieren die sperrigen Aminosäuren Thr und Val den Zutritt zur P-1-Bindungsstelle für große hydrophobe Substrate, die von Chymotrypsin bevorzugt werden. Außerdem sind die katalytischen Wirkungsgrade in Richtung der kleinen hydrophoben Substrate bei Elastase größer als bei Chymotrypsin, was auch bei I166 im Vergleich zu Gly166 in Subtilisin zu beobachten ist.

BElSPIEL 4

Substitution von ionischen Aminosäuren für Gly166

Die Konstruktion von Subtilisin-Mutanten, die die Substitution der ionischen Aminosäuren Asp, Asn, Gln, Lys und Arg enthalten, wird in EP-A-0.130.756 beschrieben. Das vorliegende Beispiel beschreibt die Konstruktion des mutanten Subtilisins, das Glu an Position 166 enthält (E166), und gibt Substratspezifitätsdaten für diese Mutanten an. Weitere Daten für Einfach- und Doppelmutanten an Position 166 und 156 werden später angegeben.
pΔ166, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde mit Sacl und Xmal digeriert. Die doppelstrangige DNA-Kassette (unter- und überstrichen) von Zeile 4. in Fig. 13 enthielt das Triplett GAA für das Codon 166, um die Ersetzung von Gly166 durch Glu zu kodieren. Dieses mutante Plasmid, mit pQ166 bezeichnet, wurde wie beschrieben in BG2036 vermehrt. Dieses mutante Subtilisin wurde zusammen mit den anderen Mutanten, die ionische Aminosäuren an Rest 166 enthielten, wie beschrieben isoliert und weiter auf Variationen der Substratspezifität hin analysiert.
Jede dieser Mutanten wurde mit den Tetrapeptid-Substraten Succinyl-L-AlaL- AlaProL-X-p-Nitroanilid analysiert, wobei X Phe, Ala und Glu war.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle IX angegeben. TABELLE X P-1 Substrat Position (Wildform)
Diese Ergebnisse zeigen, daß geladene Aminosäure-Substitutionen an Gly166 für entgegengesetzt geladene P-1-Substrate (sogar bis zu 500fach) verbesserte und für gleichgeladene P-1-Substrate schlechtere katalytische Wirkungsgrade aufweisen.

BEISPIEL 5

Substitution von Glycin an Position 169

Die Substitution von Gly169 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin durch Ala und Ser wird in EP-A-0.130.756 beschrieben. Es wurde dasselbe Verfahren angewandt, um die übrigen 17 Mutanten herzustellen, die alle anderen substituierten Aminosäuren an Position 169 enthielten.
Die Arbeitsvorschrift zur Konstruktion ist in Fig. 18 zusammengefaßt. Die verwendeten über- und unterstrichenen doppelstrangigen DNA-Kassetten enthielten die folgenden Tripletts, die für die Substitution der angegebenen Aminosäuren am Rest 169 kodieren.
Jedes der Plasmide, die ein substituiertes Gly169 enthielten, wurde mit pX169 bezeichnet, wobei X die substituierende Aminosäure darstellt. Die mutanten Subtilisine wurden ähnlich bezeichnet.
Zwei der obigen Subtilisine, A169 und S169, wurden auf Substratspezifität bei synthetischen Substraten analysiert, die Phe, Leu, Ala und Arg an der P-1-Position enthielten. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X angegeben. TABELLE X Auswirkungen von Serin- und Alanin-Mutationen an Position 169 auf die P-1-Substratspezifität P-1 Substrat Position (Wildform)
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Substitutionen durch Aa und Ser bei Gly169 im Vergleich zu ihren Gegenstücken an Position 166 bemerkenswert ähnliche katalytische Wirkungsgrade in einem Bereich von P-1-Substraten aufweisen. Der Grund dafür ist wahrscheinlich, daß Position 169 am Boden der P-1-Spezifitätssubstelle liegt.

BEISPIEL 6

Substitution an Position 104

Tyr104 wurde durch Ala, His, Leu, Met und Ser substituiert. Das angewandte Verfahren war eine Modifizierung des Verfahrens der stellengerichteten Mutagenese. Gemäß der Arbeitsvorschrift in Fig. 19 führte ein Primer (in Zeile 4. schattiert) eine einzelne HindIII-Stelle und eine Rahmenverschiebungs-Mutation bei Codon 104 ein. Restriktions-Reinigung hinsichtlich der einzelnen HindIII-Stelle erleichterte die Isolierung der mutanten Sequenz (Zeile 4.). Restriktions-Selektion nach dieser HindIII- Stelle unter Verwendung der Primer in Zeile 5. wurde angewandt, um die Mutanten an Position 104 zu erhalten.
Die folgenden Tripletts wurden in den Primern aus Fig. 19, Zeile 5., für das 104- Codon verwendet, das die folgenden Aminosäuren substituierte.
Die Substrate in Tabelle XI wurden verwendet, um die Substratspezifität dieser Mutanten zu analysieren. Die für H104-Subtilisin erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XI angegeben. TABELLE XI Substrat
Aus diesen Daten ist klar ersichtlich, daß die Substitution von Tyr durch His an Position 104 ein Enzym ergibt, das wirksamer ist (höheres kcat/Km), falls sich Phe an der P4-Substrat-Position befindet, als wenn sich dort Ala befindet.

BEISPIEL 7

Substitution von Ala152

Ala152 wurde durch Gly und Ser substituiert, um die Auswirkung derartiger Substitutionen auf die Substratspezifität zu bestimmen.
Die DNA-Sequenz der Wildform wurde durch den V152/P153-Primer (Fig. 20, Zeile 4.) unter Anwendung des obigen Restriktions-Reinigungsversuchs hinsichtlich der neuen Kpnl-Stelle mutiert. Andere mutante Primer (schattierte Sequenzen in Fig. 20; S152, Zeile 5. und G152, Zeile 6.) mutierten die neue Kpnl-Stelle weg, und derartige Mutanten wurden, wie zuvor beschrieben, unter Anwendung der Restriktions- Selektions-Vorgangsweise nach Verlust der Kpnl-Stelle isoliert.
Die Ergebnisse dieser Substitutionen für die obigen synthetischen Substrate, die die P-1-Aminosäuren Phe, Leu und Ala enthalten, sind in Tabelle XII dargestellt. TABELLE XII P-1 Substrat Position (Wildform)
Diese Ergebnisse zeigen, daß, im Gegensatz zu den Positionen 166 und 169, das Ersetzen von Ala152 durch Ser oder Gly bei allen getesteten Substraten eine drastische Verringerung der katalytischen Wirkungsgrade hervorruft. Das legt nahe, daß Ala152, an der Oberseite der S-1-Substelle, die optimale Aminosäure sein kann, da Ser und Gly einen homologen Ersatz für Ala darstellen.

BEISPIEL 8

Substitution an Position 156

Mutanten, die die Substitution von Glu156 durch Ser und Gln enthalten, wurden nach dem in Fig. 21 dargestellten Gesamtverfahren konstruiert. Dieses Verfahren wurde entwickelt, um die Konstruktion von Mehrfachmutanten an Position 156 und 166 zu erleichtern, wie hierin in der Folge beschrieben. Durch Wiederherstellen der Wildform Gly166 wurden jedoch Einfachmutationen an Glu156 erhalten.
Das Plasmid pΔ166 wird bereits in Fig. 13, Zeile 2., dargestellt. Die synthetischen Oligonukleotide oben rechts in Fig. 21 stellen dieselben DNA-Kassetten dar wie in Fig. 13, Zeile 4.. Das Plasmid p166 in Fig. 21 stellt daher die mutanten Plasmide der Beispiele 3 und 4 dar. In diesem speziellen Beispiel enthält p166 das Gly166 der Wildform.
Die Konstruktion der Einfachmutanten an Position 156 erfolgte durch Ligieren der drei Fragmente (1 - 3), die in Fig. 21 unten angegeben sind. Fragment 3, das den carboxyterminalen Abschnitt des Subtilisin-Gens, einschließlich des Wild-Codons für Position 166, enthielt, wurde als 610 bp-Sacl-BamHI-Fragment isoliert. Fragment 1 enthielt die Vektorsequenzen, sowie die aminoterminalen Sequenzen des Subtilisin- Gens bis Codon 151. Um Fragment 1 herzustellen, wurde eine einzelne KpnI-Stelle bei Codon 152 in die Subtilisin-Sequenz der Wildform von pS4,5 eingeführt. Stellengerichtete Mutagenese in M13 verwendete einen Primer mit der Sequenz 5'-TA- GTC-GTT-GCG-GTA-CCC-GGT-AAC-GAA-3', um die Mutation zu erzeugen. Anreicherung der mutanten Sequenz erfolgte durch Restriktion mit Kpnl, Reinigung und Selbstligation. Die die Kpnl-Stelle enthaltende mutante Sequenz wurde durch direktes Plasmid-Sequenzieren bestätigt, um pV152 zu erhalten. PV152 (etwa 1 ug) wurde mit Kpnl digeriert und mit 2 Einheiten des großen Fragments von DNA-Polymerase (Klenow-Fragment von Boehringer-Mannheim) + 50 uM Desoxynukleotid- Triphosphaten bei 37ºC 30 min lang behandelt. Das erzeugte ein stumpfes Ende, das mit Codon 151 endete. Die DNA wurde mit 1 : 1 Volumsteilen Phenol und CHCl&sub3; extrahiert, und DNA in der wäßrigen Phase wurde durch Zugabe von 0,1 Volumsteilen 5 M Ammoniumacetat und zwei Volumsteilen Ethanol gefällt. Nach dem Zentrifugieren und Waschen das DNA-Pellets mit 70%-igem Ethanol wurde die DNA lyophilisiert. Die DNA wurde mit BamHI digeriert und das 4,6 kb-Fragment (Fragment I) wurde durch Acrylamidgel-Elektrophorese gefolgt von Elektroelution gereinigt. Fragment 2 war eine synthetische Duplex-DNA-Kassette, die bei Ligation mit Fragment 1 und 3 die Kodiersequenz, außer bei Codon 156, richtig wiederherstellte. Der obere Strang wurde synthetisiert, um ein Glutamin-Codon zu enthalten. und der komplementäre untere Strang kodierte für Serin an Position 156. Ligation von heterophosphorylierten Kassetten führt zu einer starken und vorteilhaften Tendenz zur phosphorylierten gegenüber der nicht-phosphorylierten Oligonukleotid-Sequenz im abgeschiedenen Plasmid- Endprodukt. Deshalb wurde zum Erhalt von Q156 der obere Strang phosphoryliert und vor der Ligation an den nicht-phosphorylierten unteren Strang anneliert. in ähnlicher Weise wurde, um S156 zu erhalten, der untere Strang phosphoryliert und an den nichtphosphorylierten oberen Strang anneliert. Nach der Ligation und Transformation wurden mutante Sequenzen isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA- Sequenzierung wie zuvor bestätigt. Um Subtilisin-Varianten zu exprimieren, wurden Plasmide in eine subtilisin-neutrale Proteasen-Löschungsmutante von B. subtilis, BG2036, wie zuvor beschrieben, transformiert. Kulturen wurden in Schüttelkolben 24 h lang bei 37ºC in LB-Medium, das 12,5 mg/ml Chloramphenicol enthielt, fermentiert, und Subtilisin wurde aus Kulturüberständen wie beschrieben gereinigt. Die Reinheit des Subtilisins betrug, wie durch SDS-PAGE festgestellt, über 95%.
Diese mutanten Plasmide, pS156 und pQ156 genannt, und die mit S156 und Q156 bezeichneten mutanten Subtilisine wurden mit den obigen synthetischen Substraten analysiert, wobei P-1 die Aminosäuren Glu, Gln, Met und Lys umfaßte. Die Ergebnisse dieser Analysen werden Beispiel 9 angegeben.

BEISPIEL 9

Mehrfachmutanten mit veränderter Substratspezifität -Substitution an den Positionen 156 und 166

Einfachsubstitutionen an Position 166 werden in den Beispielen 3 und 4 beschrieben. Beispiel 8 beschreibt Einfachsubstitutionen an Position 156 sowie die Arbeitsvorschrift in Fig. 21, wodurch verschiedene Doppelmutanten hergestellt werden können, die die Substitution verschiedener Aminosäuren an Position 156 und 166 umfassen. Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion und Substratspezifität von Subtilisin, das Substitutionen an Position 156 und 166 enthält, und faßt einige Daten für Einfach- und Doppelmutanten an Position 156 und 166 bei verschiedenen Substraten zusammen.
K166 ist eine gebräuchliche Ersetzungs-Aminosäure in den hierin beschriebenen 156/166-Mutanten. Der Ersatz von Gly166 durch Lys wurde durch Verwendung der synthetischen DNA-Kassette oben rechts in Fig. 21, die das Triplett AAA statt NNN enthielt. Das führte zu Fragment 2 mit Lys statt Gly166.
Die Substituenten an 156 waren Gln und Ser. Die Gln- und Ser-Substitutionen an Gly156 sind in Fragment 3 enthalten (Fig. 21, unten rechts).
Die Mehrfachmutanten wurden durch Kombinieren der Fragmente 1, 2 und 3 wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt. Die Mutanten Q156/K166 und S156/K166 wurden selektiv durch differenzielle Phosphorylierung wie beschrieben erzeugt. Alternativ wurden die 156/166-Doppelmutanten, d.h. Q156/K166 und S156/K166, durch Ligation des 4,6 kb-Sacl-BamHI-Fragments des entsprechenden p156-Plasmids, das das 0,6 kb-Sacl-BamHI-Fragment des entsprechenden p166-Plasmids enthielt, hergestellt.
Diese Mutanten, die Einfachmutante K166 und die S156- und Q156-Mutanten aus Beispiel 8 wurden auf Substratspezifität bei synthetischen Polypeptiden analysiert, die Phe oder Glu als P-1-Substratreste enthielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIII angegeben. TABELLE XIII Substrat (Mutante) Verglichene Enzyme (b) P-1 Rest
Wie aus Tabelle XIII hervorgeht, verbessert jede dieser Einfachmutationen die Enzymwirkung bei Substraten mit Glutamat an der P-1-Enzymbindungsstelle. Bei Kombination dieser Einfachmutationen sind die resultierenden Mehrfach-Enzymmutanten besser als jeder Vorläufer. Diese Einfach- oder Mehrfachmutationen verändern auch die pH-Aktivitätsprofile der Enzyme, wie in Fig. 23 dargestellt. Um den Beitrag der Elektrostatik zur Substratspezifität von anderen chemischen Bindungskräften zu isolieren, wurden diese verschiedenen Einfach- und Doppelmutanten auf ihre Fähigkeit analysiert, synthetische Substrate, die Glu, Gln, Met und Lys als P-1-Substrat-Aminosäure enthielten, zu binden uind zu spalten. Das ermöglichte Vergleiche zwischen Seitenketten, die sterisch ähnlicher aber unterschiedlich geladen waren (z.B. Glu gegenüber Gln, Lys gegenüber Met). Auf ähnliche Weise wurden die mutanten Enzyme auf homologe P-1-Substrate getestet, die sterisch am ähnlichsten aber unterschiedlich geladen waren (Tabelle XIV). TABELLE XIV Kinetik von Position 156/166-Subtilisinen, bestimmt für verschiedene P1-Substrate P-1-Substrat Enzym Position (a) Netto-Ladung (b) Maximaler Unterschied:

Fußnoten zu Tabelle XIV:

(a) B. subtilis, BG2036, das die angegebenen Subtilisin-Varianten exprimiert, wurde fermentiert, und die Enzyme wurden wie zuvor beschrieben gereinigt (D.A. Estell et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518-6521). Subtilisin der Wildform ("wild type", wt), das Glu156 und Gly166 enthielt, ist mit wt bezeichnet.
(b) Die Nettoladung an der P-1-Bindungsstelle ist definiert als die Summe der Ladungen der Positionen 156 und 166 bei pH = 8,6.
(c) Die Werte für kcat (s&supmin;¹) und Km (Mol) wurden in 0,1 M Tris, pH = 8,6, bei 25ºC, wie zuvor beschrieben, bei P-1-Substraten der Form Succinyl-L-AlaL-AlaL-ProL- [X]-p-Nitroanilid, wobei X die angegebene P-1-Aminosäure ist, gemessen. Die Werte für log 1/Km sind in Klammern angegeben. Alle Fehler bei der Bestimmung von kcat/Km und 1/Km liegen unter 5%.
(d) Da die Werte für Glu156/Asp166(D166) zu klein zur genauen Bestimmung sind, ist der maximale Unterschied für Glu-P-1-Substrat auf einen Ladungsbereich einer Ladungsänderung von + 1 bis -1 beschränkt.
n. b. = nicht bestimmt
Die angegebenen kcat/Km-Verhältnisse sind die Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung für die Umwandlung von Substrat zu Produkt und stellen den katalytischen Wirkungsgrad des Enzyms dar. Da log kcat/Km der Verringerung der Aktivierungsenergie des Übergangszustands (ΔGT) proportional ist, sind diese Verhältnisse zur Einordnung der Daten in logarithmischer Form angegeben. Mutationen an Position 156 und 166 verursachen Veränderungen des katalytischen Wirkungsgrads für Glu-, Gln-, Met- und Lys-P-1-Substrate um das 3100-, 60-, 200- bzw. 20fache. Das Verstärken der positiven Ladung der P-1-Bindungsstelle [vgl. beispielsweise Gln 156/Lys166 (Q156/K166) gegenüber Glu156/Met166 (Glu156/M166)] erhöhte kcat/Km für das Glu-P-1-Substrat drastisch (bis zum 3100fachen) und verringerte den katalytischen Wirkungsgrad für das Lys-P-1-Substrat (bis um das 10fache). Außerdem zeigen die Ergebnisse, daß der katalytische Wirkungsgrad des Wildtyp-Enzyms für jedes der vier P-1-Substrate durch Mutagenese der P-1-Bindungsstelle stark verbessert werden kann.
Die Veränderungen von kcat/Km werden hauptsächlich durch Veränderungen von 1/Km hervorgerufen. Da 1/Km ungefähr gleich 1/Ks, der Enzym-Substrat- Assoziationskonstante, ist, verursachen die Mutationen in erster Linie eine Veränderung der Substratbindung. Diese Mutationen rufen geringere Wirkung auf kcat hervor, die mit den Auswirkungen auf 1/Km parallel laufen. Die Veränderungen von kcat legen entweder eine Veränderung der Bindung an der P-1-Bindungsstelle beim Übergang vom Michaelis-Komplex (E S) zum Übergangszustands-Komplex (E S*) (J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 2439-2449; J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 4293- 4303) oder eine Veränderung der Position der spaltbaren Peptidbindung gegenüber dem katalytischen Serin im E S-Komplex nahe.
Veränderungen der Substrat-Präferenz, die durch Veränderungen der Nettoladung an der P-1-Bindungsstelle entstehen, zeigen Trends, die am besten elektrostatischen Wirkungen zugeschrieben werden (Fig. 28). Bei Erhöhen der positiven Ladung der P-1- Bindungsspalte nimmt der mittlere katalytische Wirkungsgrad für das Glu-P-1-Substrat viel stärker zu als für dessen neutrales und isosterisches P-1-Homolog Gln (Fig. 28A). Weiters zeigen beim positiven Extremwert beide Substrate nahezu identische katalytische Wirkungsgrade.
Im Gegensatz dazu nimmt bei Erhöhung der positiven Ladung der P.1- Bindungsstelle der katalytische Wirkungsgrad für das Lys-P-1-Substrat ab und weicht stark von seinem neutralen und isosterischen Homolog Met ab (Fig. 28B). Der bei Erhöhung der positiven Ladung erkennbare, ähnliche und parallele Aufwärtstrend für die Met- und Glu-P-1-Substrate resultiert wahrscheinlich aus der Tatsache, daß alle Substrate an ihrem aminoterminalen Ende succinyliert sind und daher eine formale negative Ladung tragen.
Die bei log kcat/Km beobachteten Trends werden von Veränderungen des Km- Teils dominiert (Fig. 28C und 28D). Bei Erhöhung der positiven Ladung der Tasche konvergieren die log 1/Km-Werte für Glu- und Gln-P-1-Substrate (Fig. 28C) und divergieren für die Lys- und Met-P-1-Substrate. Obwohl bei log kcat weniger deutliche Auswirkungen zu sehen sind, verlaufen diese Auswirkungen der P-1-Ladung auf kcat parallel zu jenen bei log 1/Km und werden stärker, wenn die P-1-Tasche positiver geladen wird. Das kann aus der Tatsache herrühren, daß der Übergangszustand ein tetraedrisches Anion ist, und eine positive Nettoladung im Enzym kann dazu dienen, den Übergangszustand zusätzlich zu stabilisieren.
Die Auswirkung der Veränderung der P-1-Bindungsstellen-Ladung auf die Substrat-Präferenz kann aus den Differenzen der Anstiege zwischen den geladenen und neutralen isosterischen P-1-Substraten abgeschätzt werden (Fig. 28B). Die durchschnittliche Veränderung der Substrat-Präferenz (Δlog kcat/Km) zwischen geladenen und neutralen isosterischen Substraten nimmt bei Erhöhung der komplementären Ladung des Enzyms etwa um das 10fache zu (Tabelle XV). Im Vergleich von Glu mit Lys ist dieser Unterschied das 100fache, und die Veränderung der Substrat-Präferenz zeigt sich hauptsächlich im Km-Wert. TABELLE XV Differentielle Auswirkung der Bindungsstellen-Ladung auf log kcat/Km oder log 1/Km bei P-1-Substraten, die sich in ihrer Ladung unterscheiden (a) Veränderung der Ladung der P-1-Bindungstellen (b) mittlere Veränderung von log kcat/Km oder log 1/Km pro Ladungsänderungseinheit
(a) Die Anstiegsdifferenz der Kurven zwischen den P-1-Substraten wurde über das für log kcat/Km (Fig. 28A, B) und log 1/Km (Fig. 28C, D) gegebene Ladungsintervall gemessen. Die Werte stellen die differentielle Auswirkung einer Ladungsänderung auf die Unterscheidung der verglichenen Substrate dar.
(b) Die Ladung der P-1-Bindungsstelle ist definiert als die Summe der Ladungen der Positionen 156 und 166.
Die freie Energie der elektrostatischen Wechselwirkungen in der Struktur und Energetik der Salzbrücken-Bildung hängt von der Entfernung zwischen den Ladungen und dem mikroskopischen Dielektrikum des Mediums ab. Um diese strukturellen und Mikroumgebungs-Effekte voneinander zu trennen, wurden die an speziellen Salzbrücken beteiligten Energien bestimmt. Zusätzlich zu den angegebenen (Fig. 29A und 29B) möglichen Salzbrücken können vernünftige Salzbrücken zwischen einem Lys- P-1-Substrat und Asp an Position 166 und zwischen einem Glu-P-1-Substrat und Lys an Position 166 (nicht dargestellt) aufgebaut werden. Obwohl nur eine dieser Strukturen durch Röntgenkristallografie bestätigt ist (T.L. Poulos et al. (1976) J. Biol. Chem. 251, 1097-1103) weisen alle Modelle vorteilhafte Torsionswinkel auf (A.R. Sielecki et al. (1979) J. Mol. Biol. 134, 781-804) und bringen keine ungünstigen van der Waals- Kontakte ein.
Die Veränderung der Präferenz für geladene P-1-Substrate durch die Bildung der obigen Modell-Salzbrücken ist in Tabelle XVI angegeben. TABELLE XVI Auswirkung der Salzbrücken-Bildung zwischen Enzym und Substrat auf die P-1-Substrat-Präferenz(a) Verglichene Enzyme (b) Substrat Präferenz Veränderung der Substrat-Präferenz Veränderte Enzym-Position Verglichene P-1-Substrate

Fußnoten zu Tabelle XVI:

(a) Molekular-Modelling zeigt, daß es möglich ist, eine Salzbrücke zwischen dem angegebenen geladenen P-1-Substrat und einer komplementären Ladung an der P-1- Bindungsstelle des Enzyms an der angegebenen veränderten Position zu bilden.
(b) Die verglichenen Enzyme besitzen sterisch ähnliche Aminosäure- Substitutionen, die sich in der Ladung an der angegebenen Position unterscheiden.
(c) Die verglichenen P-1-Substrate sind strukturell ähnlich, unterscheiden sich jedoch in der Ladung. Das geladene P-1-Substrat ist komplementär zur Ladungsänderung an der angegebenen Position zwischen den Enzymen 1 und 2.
(d) Die Daten aus Tabelle XIV wurden verwendet, um die Differenz von 10g kcat/Km zwischen dem geladenen und dem ungeladenen P-1-Substrat (d.h., die Substrat-Präferenz) zu berechnen. Die Substrat-Präferenz ist für die Enzyme 1 und 2 getrennt dargestellt.
(e) Der Unterschied in der Substrat-Präferenz zwischen Enzym 1 (stärker geladen) und Enzym 2 (neutraler) stellt die die elektrostatische Wechselwirkung begleitende Geschwindigkeitsänderung dar.
Die Differenz in den katalytischen Wirkungsgraden (d.h. Δlog kcat/Km) für die geladenen und neutralen P-1-Substrate (z.B. Lys minus Met oder Glu minus Gln) ergeben die Substrat-Präferenz für jedes Enzym. Die Änderung der Substrat-Präferenz (ΔΔlog kcat/Km zwischen den geladenen und neutraleren Enzymhomologen (z.B. Glu156/Gly166 minus GIn 156(Q156)/Gly166) spiegelt die Änderung des katalytischen Wirkungsgrads wieder, die allein elektrostatischen Effekten zugeschrieben werden kann.
Die Ergebnisse zeigen, daß die durchschnittliche Veränderung der Substrat- Präferenz wesentlich stärker ist, falls elektrostatische Substitutionen an Position 166 (50faches kcat/Km) gegenüber Position 156 (12faches kcat/Km) erzeugt werden. Aus diesen ΔΔlog kcat/Km-Werten kann eine mittlere Änderung der Stabilisierungsenergie des Übergangszustands von -1,5 und -2,4 kcal/Mol für Substitutionen an Position 156 bzw. 166 berechnet werden. Das sollte die Stabilisierungsenergie darstellen, die von einer vorteilhaften elektrostatischen Wechselwirkung zur Bindung freies Enzym - Substrat zur Bildung des Übergangszustands-Komplexes beigetragen wird.

BEISPIEL 10

Substitutionen an Position 217

Tyr217 wurde durch alle anderen 19 Aminosäuren substituiert. Es wurde Kassetten-Mutagenese, wie in EP-A-0.130.756 beschrieben, gemäß der Arbeitsvorschrift in Fig. 22 verwendet. Die EcoRI-Restriktionsstelle wurde zur Restriktionsreinigung von pΔ217 verwendet.
Da diese Position an der Substratbindung beteiligt ist, beeinflussen Mutationen hier die kinetischen Parameter des Enzyms. Ein Beispiel dafür ist die Substitution von Tyr durch Leu an Position 217. Für das Substrat sAAPFpNa besitzt diese Mutante ein kcat von 277 5' und ein Km von 4,7 x 10&supmin;&sup4;, mit einem Verhältnis kcat/Km von 6 x 10&sup5;. Das stellt eine 5,5fache Zunahme von kcat mit einer 3fachen Zunahme von Km gegenüber dem Wildtyp-Enzym dar.
Außerdem führt der Ersatz von Tyr217 durch Lys, Arg, Phe oder Leu zu mutanten Enzymen, die bei pHs von etwa 9 - 11 stabiler sind als das Enzym in der Wildform. Andererseits führt Ersatz von Tyr217 durch Asp, Glu, Gly oder Pro zu Enzymen, die bei pHs von etwa 9 - 11 weniger stabil sind als das Wildtyp-Enzym.

BEISPIEL 11

Mehrfachmutanten mit veränderter Thermostabilität

B. amyloliquefaciens-Subtilisin enthält keinerlei Cystein-Reste. Daher erforderte jeder Versuch, Thermostabilität durch Cys-Vernetzung zu erzeugen, die Substitution von mehr als einer Aminosäure im Subtilisin durch Cys. Die folgenden Subtilisin-Reste wurden durch Cystein mehrfach-substituiert:
Thr22/Ser87
Ser24/Ser87
Mutagenese von Ser24 zu Cys erfolgte mit einem 5'-phosphorylierten Oligonukleotid-Primer mit der Sequenz
5'-pC-TAC-ACT-GGA-T -AAT-GTT-AAA-G-3'
(wobei Sternchen die Lage von Mißübereinstimmungen und die unterstrichene Sequenz die Position der veränderten Sau3A-Stelle angeben). Das B. amyloliquefaciens-Subtilisin- Gen auf einem 1,5 kb-EcoRI-BamHI-Fragment von pS4,5 wurde in M13mp11 kloniert und eine einstrangige DNA isoliert. Diese Schablone (M13mp11SUBT) wurde doppelt geprimt, nämlich mit dem 5'-phosphorylierten universellen M13-Sequenzierprimer und dem Mutagenese-Primer. Adelman et al. (1983) DNA 2, 183-193. Die Heteroduplex wurde in kompetente JM101-Zellen transfiziert, und Plaques wurden unter Anwendung einer Arbeitsvorschrift zur Tetramethylammoniumchlorid-Hybridisierung (Wood et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1585-1588) auf die mutante Sequenz sondiert (M.J. Zoller et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500; Wallace et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 3647-3656). Die Mutation Ser87 zu Cys wurde auf ähnliche Weise, unter Verwendung eines 5'-phosphorylierten Primers mit der Sequenz
5'-pGGC-GTT-GCG-CCA- GC-GCA-TCA-CT-3'
(wobei das Sternchen die Lage der Mißübereinstimmung und die unterstrichene Sequenz die Position einer neuen MstI-Stelle angeben) hergestellt. Die C24- und C87- Mutationen wurden mit einer Häufigkeit von 1 % bzw. 2% erhalten. Die mutanten Sequenzen wurden durch Didesoxy-Sequenzierung in M13 bestätigt.
Die Mutagenese von Tyr21/Thr22 zu A21/C22 erfolgte mit einem 5 phosphorylierten Primer mit der Sequenz
5'-pAC-TCT-CAA-GGC- - T-GG -TCA-AAT-GTT-3'
(wobei Sternchen die Lage der Mißübereinstimmungen gegenüber der Wildtyp-Sequenz und die unterstrichene Sequenz die Position einer veränderten Sau3A-Stelle angeben). Die Manipulationen zur Heteroduplex-Synthese waren zu jenen für C24 beschriebenen Häufigkeiten der Mutagenese ergeben kann, wurde das EcoRI-BamHI-Subtilisin- Fragment gereinigt und in pBS42 ligiert. E. coli MM294-Zellen wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert und DNA aus den isolierten Transformanten gereinigt. Plasmid-DNA wurde auf den Verlust der Sau3A-Stelle bei Codon 23 gescreent, das durch den Mutagenese-Primer entfernt worden war. 2 von 16 Plasmid-Präparaten hatten die Sau3A-Stelle der Wildform verloren. Die mutante Sequenz wurde durch Didesoxy- Sequenzierung in M13 bestätigt.
Die Doppelmutanten C22/C87 und C24/C87 wurden durch Ligieren von Fragmenten mit einer gemeinsamen Clal-Stelle konstruiert, die die einzelnen parentalen Cystein-Codons trennte. Genauer gesagt wurde das 500 bp-EcoRI-Clal-Fragment, das den 5'-Abschnitt des Subtilisin-Gens (einschließlich der Codons 22 und 24) enthielt, mit dem 4,7 kb-Clal-EcoRI-Fragment ligiert, das den 3'-Abschnitt des Subtilisin-Gens (einschließlich Codon 87) und die pBS42-Vektorsequenz enthielt. E. coli MM 294 wurde mit Ligationsgemischen transformiert und die Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten gereinigt. Die Doppel-Cystein-Plasmidkonstruktionen wurden durch Restriktionsstellen-Marker, die aus den parentalen Cystein-Mutanten (d.h. C22 und C24, Sau3A&supmin;; Cys87, Mst&spplus;) stammten, identifiziert. Die Plasmide aus E. coli wurden in B. subtilis BG2036 transformiert. Die Thermostabilität dieser Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Subtilisin ist in Fig. 30 und Tabelle XVII und XVIII dargestellt. TABELLE XVII Auswirkung von DTT auf die Halbwertszeit der autolytischen Inaktivierung von Wildform und Disulfid-Mutanten von Subtilisin* Enzym Wildform
* Die gereinigten Enzyme wurden entweder mit 25 mM DTT behandelt oder nicht und mit oder ohne 10 mM DTT in 2 mM CaCl&sub2;, 50 mM Tris (pH = 7,5) 14 h lang bei 4ºC dialysiert. Die Enzym-Konzentrationen wurden auf 80 ul Aliquote eingestellt, auf Eis abgeschreckt und auf Restaktivität getestet. Die Halbwertszeiten der autolytischen Inaktivierung wurden aus halblogarithmischen Diagrammen von log&sub1;&sub0; Restaktivität gegenüber der Zeit bestimmt. Diese Diagramme waren für über 90% Inaktivierung linear. TABELLE XVIII Auswirkung von Mutationen in Subtilisin auf die Halbwertszeit der autolytischen Inaktivierung bei 58ºC* Enzym Wildform
Die Halbwertszeiten der autolytischen Inaktivierung wurden für die Wildform und mutante Subtilisine wie in der Legende zu Tabelle III beschrieben bestimmt. Es wurden ungereinigte und nicht-reduzierte Enzyme direkt aus den B. subtilis- Kulturüberständen eingesetzt.
Die in Subtilisin eingebrachten Disulfide verbesserten die autolytische Stabilität der mutanten Enzyme im Vergleich zum Wildtyp-Enzym nicht. Die Disulfidbindungen stellten allerdings im Vergleich zu ihren entsprechenden reduzierten Doppel-Cystein- Enzymen eine Grenze der autolytischen Stabilität bereit. Genauere Untersuchung einer hochaufgelösten Röntgenstruktur von B. amyloliquefaciens-Subtilisin in der Wildform zeigt eine Wasserstoffbindung zwischen Thr22 und Ser87. Da Cystein ein schwacher Wasserstoff-Donor oder -Akzeptor ist (I.C. Paul, Chemistry of the -SH Group (S. Patai, Hrsg., Wiley Interscience, New York, 1974), S. 111-149), kann die Schwächung der 22/87-Wasserstoffbindung erklären, warum die C22- und C87-einfach-cysteinmutanten Proteine autolytisch weniger stabil sind als sowohl C24 als auch die Wildform (Tabelle XVIII). Die Tatsache, daß C22 autolytisch weniger stabil ist als C87, kann das Ergebnis der Tyr21A-Mutation sein (Tabelle XVIII). Tatsächlich zeigt die Konstruktion und Analyse von Tyr21/C22, daß das mutante Protein eine näher bei jener von C87 liegende autolytische Stabilität aufweist. Zusammengefaßt destabilisieren die C22- und C87- Einfach-Cystein-Mutationen das Protein gegenüber Autolyse, und die Bildung der Disulfidbindung erhöht die Stabilität bis zu einem Wert, der unter oder gleich jenem des Wildenzyms liegt.

BEISPIEL 12

Mehrfachmuanten, die Substitutionen an Position 222 und Position 166 oder 169 enthalten

Die Doppelmutanten 166/222 und 169/222 wurden hergestellt, indem (1) das 2,3 kb-Acall-Fragment von pS4,5, das den 5'-Abschnitt des Subtilisin-Gens und Vektorsequenzen enthält, (2) das 200 bp-Avall-Fragment, das die relevanten 166- oder 169-Mutationen der entsprechenden 166- oder 169-Plasmiden enthält, und (3) das 2,2 kb-Avall-Fragment, das die entsprechende 222-Mutation am 3'-Ende der Subtilisin-Gene und Vektorsequenzen aus dem entsprechenden p222-Plasmid enthält, miteinander ligiert wurden.
Obwohl Mutationen an Position 222 die Oxidationsbeständigkeit verbessern, neigen sie ebenso zur Erhöhung von Km. Ein Beispiel ist in Tabelle XIX angegeben. In diesem Fall wurde die A222-Mutation mit der K166-Mutation kombiniert, um ein Enzym mit mittlerem kcat und Km zwischen den beiden parentalen Enzymen zu ergeben. TABELLE XIX Wildform
Substrat: sAAPFpNa

BEISPIEL 13

Mehrfachmutationen, die Substitutionen an den Positionen 50, 156, 166 und 217 enthalten, und Kombinationen davon

Die Doppelmutante S156/A169 wurde durch Ligation von zwei Fragmenten hergestellt, die jeweils eine der entsprechenden Mutationen enthielten. Das Plasmid pS156 wurde mit Xmal geschnitten und mit S-1-Nuklease behandelt, um ein stumpfes Ende bei Codon 167 zu erzeugen. Nach Entfernung der Nuklease durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die DNA mit BamHI digeriert und das ungefähr 4 kb-Fragment, das den Vektor und den 5'-Abschnitt des Subtilisin- Gens bis Codon 167 enthielt, gereinigt.
Das pA169-Plasmid wurde mit Kpnl digeriert und mit DNA-Polymerase-Klenow- Fragment + 50 uM dNTPs behandelt, um ein Codon mit stumpfem Ende bei Codon 168 zu erzeugen. Das Klenow wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol- Fällung entfernt. Die DNA wurde mit mit BamHI digeriert und das 590 bp-Fragment, das Codon 168 bis zum Carboxyterminus des Subtilisin-Gens enthielt, isoliert. Die beiden Fragmente wurden anschließend zum Erhalt von S156/A169 ligiert.
Dreifach- und Vierfachmutanten wurden durch Ligieren (1) des 220 bp- Pvull/Haell-Fragments, das die relevanten 156-, 166- und/oder 169-Mutationen aus dem entsprechenden p156-, p166- und/oder p169 doppel- oder einfachmutierten Plasmid enthielt, (2) des 550 bp Haell/BamHI-Fragments, das die relevante 217-Mutante des entsprechenden p217-Plasmids enthielt, und (3) des 3,9 kb-Pvull/BamHI-Fragments, das die F50-Mutation und Vektorsequenzen enthielt, hergestellt.
Die Mehrfachmutante F50/S156/A169/L217, sowie B. amyloliquefaciens- Subtilisin, B. licheniformis-Subtilisin und die Einfachmutante L217 wurden mit den obigen synthetischen Polypeptiden analysiert, wobei die P-1-Aminosäure im Substrat Lys, His, Ala, Gln, Tyr, Phe, Met und Leu war. Diese Ergebnisse sind in Fig. 26 und 27 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die F50/S156/A169/L217-Mutante eine ähnliche Substratspezifität wie das B. licheniformis-Enzym besitzt und sich vom Wildtyp-Enzym drastisch unterscheidet. Obwohl nur Daten für die L217-Mutante angegeben sind, zeigte keine der Einfachmutanten (z.B. Fig.50, S156 oder A169) diesen Effekt. Obwohl sich B. licheniformis in 88 Rest-Positionen von B. amyloliquefaciens unterscheidet, können der Kombination nur dieser vier Mutationen die meisten Differenzen der Substratspezifität zwischen den beiden Enzymen zugeschrieben werden.

BEISPIEL 14

Subtilisin-Mutanten mit veränderter Beständigkeit gegen Alkalien

Es wurde eine Zufalls-Mutagenese-Vorgangsweise angewandt, um Einfach- und Mehrfachmutationen innerhalb des B. amyloliquefaciens-Subtilisin-Gens zu erzeugen. Derartige Mutanten wurden auf veränderte Beständigkeit gegen Alkalien gescreent. Klone mit erhöhter (positiver) Beständigkeit gegen Alkalien und verringerter (negativer) Beständigkeit gegen Alkalien wurden isoliert und sequenziert, um die Mutationen innerhalb des Subtilisin-Gens zu identifizieren. Unter den pdsitiven Klons wurden die Mutanten V107 und R213 identifiziert. Diese Einfachmutanten wurden in der Folge zum Erhalt der Mutante V107/R213 kombiniert.
Einer der negativen Klons (V50) aus den Zufalls-Mutagenese-Versuchen führte zu einer bemerkenswerten Abnahme der Beständigkeit gegen Alkalien. Eine andere Mutante (P50) wurde auf Beständigkeit gegen Alkalien analysiert, um die Auswirkung einer unterschiedlichen Substitution an Position 50 zu bestimmen. Die F50-Mutante zeigte eine höhere Beständigkeit gegen Alkalien als Subtilisin der Wildform und führte bei Kombination mit der Doppelmutante V107/R213 zu einer Mutante, die die Summe der Beständigkeiten gegen Alkalien jeder der einzelnen Mutanten wiedergab.
Die Einfachmutante R204 und die Doppelmutante C204/R213 wurden durch alkalisches Screening nach Zufalls-Kassetten-Mutagenese des Bereichs von Position 197 bis 228 identifiziert. Die C204/R213-Mutante wurde danach modifiziert, um Mutanten zu erzeugen, die die einzelnen Mutationen C204 und R213 enthielten, um den Beitrag jeder einzelnen Mutation zu bestimmen. Kassetten-Mutagenese unter Verwendung von gepoolten Oligonukleotiden zur Substitution aller Aminosäuren an Position 204 wurde angewandt, um festzustellen, welche Substitution an Position 204 die Zunahme der Beständigkeiten gegen Alkalien maximierte. Die Mutation von Lys213 zu Arg wurde bei jeder dieser Substitutionen an Position 204 konstant beibehalten.

A. Konstruktion von pBO180 einem E. coli-B. Subtilis-Shuttleplasmid

Das 2,9 kb-EcoRI-BamHI-Fragment aus pBR327 (L. Covarrubias et al. (1981) Gene 13, 25-35) wurde an das 3,7 kb-EcoRI-BamHI-Fragment von pBD64 (T. Gryczan et al. (1980) J. Bacteriol. 141, 246-253) ligiert, um das rekombinante Plasmid pBO153 zu ergeben. Die einzige EcoRI-Erkennungssequenz in pBD64 wurde durch Digestion mit EcoRI, gefolgt von Behandlung mit Klenow und Desoxynukleotid-Triphosphaten entfernt (T. Maniatis et al. (Hrsg.) (1982) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Ligation der stumpfen Enden und Transformation ergaben pBO154. Die einzige EcoRI-Erkennungssequenz in pBO154 wurde auf ähnliche Weise entfernt, um pBO171 zu ergeben. PBO171 wurde mit BamHI und Pvull digeriert und mit Klenow und Desoxynukleotid-Triphosphaten behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen. Das 6,4 kb-Fragment wurde gereinigt, ligiert und in LE392- Zellen transformiert (L.W. Enquest et al. (1977) J. Mol. Biol. 111, 97-120), um pBO172 zu ergeben, das die einzige BamHI-Stelle beibehielt. Um das Subklonieren von Subtilisin-Mutanten zu erleichtern, wurde eine einzige und latente (stille) KpnI-Stelle, beginnend bei Codon 166, durch stellengerichtete Mutagenese in das Subtilisin-Gen aus pS4,5 eingeführt (I.A. Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7925). Das KpnI&spplus;- Plasmid wurde mit EcoRI digeriert und mit Klenow und Desoxynukleotid-Triphosphaten behandelt, um ein stumpfes Ende zu erzeugen. Das Klenow wurde durch 20-minütiges Erwärmen auf 68ºC inaktiviert und die DNA mit BamHI digeriert. Das stumpfe 1,5 kb- EcoRI-BamHI-Fragment, das das vollständige Subtilisin enthielt, wurde mit dem 5,8 kb- NruI-BamHI-Fragment aus pBO172 ligiert, um pBO180 zu ergeben. Die Ligation des stumpfen NruI-Endes an das stumpfe EcoRI-Ende stellte eine EcoRI-Stelle wieder her. Bei Betrachtung von pBO180 im Uhrzeigersinn, beginnend an der EcoRI-Stelle am 5'- Ende des Subtilisin-Gens folgen die einzige BamHI-Stelle am 3'-Ende des Subtilisin- Gens, die Chloramphenicol- und Neomycin-Resistenz-Gene und der grampositive UB110-Replikationsursprung aus pBD64, das Ampicillin-Resistenz-Gen und der gramnegative Replikationsursprung aus pBR327.

B. Konstruktion der Zufalls-Mutagenese-Sammlung

Das 1,5 kb-EcoRI-BamHI-Fragment, das das B. amyloliquefaciens-Subtilisin-Gen (Wells et al., 1983) aus pBO180 enthielt, wurde in M13mp11 kloniert, um M13mp11SUBT, im wesentlichen wie zuvor beschrieben, zu ergeben (J.A. Wells et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 6564-6570). Desoxyuridin enthaltende Schablonen DNA wurde nach Kunkel hergestellt (T.A. Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488- 492). Uridin enthaltende Schablonen DNA (Kunkel, 1985) wurde durch CsCl- Dichtegradienten gereinigt (T. Maniatis et al. (Hrsg.) (1982) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Es wurde ein Primer (Aval&supmin;) mit der Sequenz
5'GAAAAAAGACCC AGCGTCGCTTA
die bei Codon -11 endete, verwendet, um die einzige Aval-Erkennungssequenz des Subtilisin-Gens zu verändern. (Das Sternchen gibt die Lage der Mißübereinstimmung gegenüber der Wildtyp-Sequenz und die unterstrichene Sequenz die Position der veränderten Aval-Stelle an.)
Der 5'-phosphorylierte Aval-Primer (etwa 320 pMol) und etwa 40 pMol (etwa 120 ug) uridinhaltige M13mp11SUBT-Schablone wurden in 1,88 ml 53 mM NaCl, 7,4 mM MgCl&sub2; und 7,4 mM Tris-HCl (pH = 7,5) durch Erwärmen auf 90ºC über 2 min und 15 min Kühlen bei 24ºC anneliert (Fig. 31). Die Primer-Extension bei 24ºC wurde durch Zugabe von 100 ul mit 1 mM aller vier Desoxynukleotid-Trisphosphate und 20 ul Klenow-Fragment (5 Einheiten/l) gestartet. Die Extensionsreaktion wurde alle 15 s 10 min lang durch Zugabe von 10 ul 0,25 M EDTA (pH = 8) zu 50 ul Aliquoten des Reaktionsgemischs abgebrochen. Proben wurden gepoolt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA zweimal durch Zugabe von 2,5 Volumsteilen 100%-igem Ethanol gefällt und zweimal mit 70%-igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde getrocknet und in 0,4 ml 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8) erneut gelöst.
Der Fehleinbau von α-Thiodesoxynukleotiden an den 3'-Enden des Pools der zufallsterminierten Schablone erfolgte durch Inkubieren von vier 0,2 ml Lösungen, die jeweils ein Viertel des Gemischs der zufallsterminierten Schablone (etwa 20 ug), 0,25 mM eines gegebenen α-Thiodesoxynukleotid-Triphosphats, 100 Einheiten AMV- Polymerase, 50 mM Kcl, 10 mM MgCl&sub2;, 0,4 mM Dithiothreitol und 50 mM Tris (pH = 8,3) enthielt (J.J. Champoux (1984) Genetics 2, 454-464). Nach Inkubation bei 37ºC über 90 min wurden die Fehleinbau-Reaktionen durch Inkubation über 5 min bei 37ºC mit 50 mM aller vier Desoxynukleotid-Triphosphate (pH = 8) und 50 Einheiten AMV- Polymerase abgeschlossen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 25 mM EDTA (am Ende) abgebrochen und 10 min lang auf 68ºC erwärmt, um AMV-Polymerase zu inaktivieren. Nach Ethanol-Fällung und erneuter Suspension erfolgte die Synthese von geschlossenen zirkularen Heteroduplices über 2 d bei 14ºC unter denselben Bedingungen wie für die obigen zeitlich gesteuerten Extensionsreaktionen, außer daß die Reaktionen auch 1.000 Einheiten T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP und 1 mM βMercaptoethanol enthielten. Gleichzeitige Restriktion jedes Heteroduplex-Pools mit Kpnl, BamHI und EcoRI bestätigte, daß Extensionsreaktionen nahezu quantitativ waren. Die Heteroduplex-DNA in jedem Reaktionsgemisch wurde durch Inkubation mit 80 uM S-Adenosylmethionin und 150 Einheiten dam-Methylase über 1 h bei 37ºC methyliert Die Methylierungsreaktionen wurden durch Erwärmen auf 68ºC über 15 min abgebrochen.
Eine Hälfte jeder der vier methylierten Heteroduplex-Reaktionen wurde in 2,5 ml kompetente E. coli JM101 transformiert (J. Messing (1979) Recombinant DNA Tech. Bull. 2, 43-48). Die Anzahl der unabhängigen Transformanten jeder der vier Transformationen lag im Bereich von 0,4 - 2,0 x 10&sup5;. Nach dem Vermehren von Phagenpools wurde RF-DNA jeder der vier Transformationen isoliert und durch Zentrifugation durch CsCl-Dichtegradienten gereinigt. Ungefähr 2 ug RF-DNA jedes der vier Pools wurde mit EcoRI, BamHI und Aval digeriert. Das 1,5 kb-EcoRI-BamHI- Fragment (d.h. Aval-resistent) wurde auf Agarose mit niedriger Geltemperatur gereinigt und in das 5,5 kb-EcoRI-BamHI-Vektorfragment von pBO180 ligiert. Die Gesamtanzahl von unabhängigen Transformanten jeder α-Thiodesoxynukleotid-Fehleinbau- Plasmidsammlung wurde in 200 ml LB-Medium, das 12,5 ug/ml cmp enthielt, vermehrt und Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugation durch CsCl-Dichtegradienten gereinigt.

C. Expression und Screening von Subtilisin-Punktmutanten

Plasmid-DNA aus jedem der vier Fehleinbau-Pools wurde in BG2036 transformiert (C. Anagnostopoulos et al. (1967) J. Bacteriol. 81, 741-746). Bei jeder Transformation erzeugten 5 ug DNA ungefähr 2,5 x 10&sup5; unabhängige BG2036- Transformanten, und flüssige Kultur-Aliquote jeder der vier Sammlungen wurden in 10% Glycerin bei -70ºC gelagert. Aufgetaute Aliquote der tiefgefrorenen Kulturen wurden auf LB/5ug/ml cmp/1,6% Magermilch-Platten plattiert (J.A. Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7925) und frische Kolonien auf Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen, die pro Napf 150 u1 LB-Medium + 12,5 kg/ml cmp enthielten, angeordnet. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde (unter Verwendung eines passenden 96-Dorn- Stempels) eine Replik auf ein 132 mm BA 85-Nitrozellulose-Filter (Schleicher und Schuell) gestempelt, das auf eine LB/cmp/Magermilch-Platte mit 140 mm Durchmesser aufgelegt wurde. Die Zellen wurden etwa 16 h lang bei 30ºC vermehrt, bis die Ringe der Proteolyse etwa 5 - 7 mm im Durchmesser betrugen, und die Filter wurde direkt auf eine frisch präparierte Agarplatte mit 37ºC transferiert, die nur 1,6% Magermilch und 50 mM Natriumphosphat, pH = 11,5, enthielt. Die Filter wurden auf den Platten 3 - 6 h lang bei 37ºC inkubiert, um Ringe von etwa 5 mm bei Wildtyp-Subtilisin zu erzeugen, und verworfen. Die Patten wurden 10 min lang bei 24ºC mit Coomassie-Blau-Lösung gefärbt (0,25% Coomassie-Blau (R-250), 25% Ethanol) und mit 25% Ethanol, 10% Essigsäure in 20 min entfärbt. Die Zonen von Proteolyse erschienen als blaue Ringe auf weißem Hintergrund an der Unterseite der Platte und wurden mit der ursprünglichen Wachstumsplatte verglichen, die als Vergleich auf ähnliche Weise gefärbt und entfärbt worden war. Es galten Klons als positiv, die im Vergleich zur ursprünglichen Wachstumsplatte größere Zonen von Proteolyse auf den Platten mit hohem pH erzeugten. Negative Klons ergaben unter alkalischen Bedingungen kleinere Ringe. Die positiven und negativen Klons wurden erneut in Strichkulturen vermehrt, gereinigt und wiederum jeweils dreifach gescreent, um die Ergebnisse bei alkalischem pH zu bestätigen.

D. Identifizierung und Analyse mutanter Subtilisine

Plasmid-DNA aus 5 ml-Über-Nacht-Kulturen alkalisch aktiverer B. subtilis-Klone wurde nach Birnboim und Doly (H.C. Birnboim et al. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513) hergestellt, ausgenommen daß die Inkubation mit 2 mg/ml Lysozym bei 37ºC 5 min lang dauerte, um Zell-Lysis sicherzustellen, und eine zusätzliche Phenol/CHCl&sub3;- Extraktion erfolgte, um Verunreinigungen zu entfernen. Das 1,5 kb-EcoRI-BamHI- Fragment, das das Subtilisin-Gen enthielt, wurde in M13mp11 ligiert und Schablonen-DNA zur DNA-Sequenzierung hergestellt (J. Messing et al., (1982) Gene 19, 269-276). Drei DNA-Sequenzier-Primer, die bei Codon 26, +95 und +155 endeten, wurden synthetisiert, um der Subtilisin-Kodiersequenz zu entsprechen. Zur einleitenden Sequenz-Identifizierung wurde eine einzelne Spur DNA-Sequenz, die der dNTPaS- Fehleinbau-Sammlung entsprach, aus der die Mutante hervorgegangen war, wurde auf die gesamte Kodiersequenz des reifen Proteins angewandt (d.h., es wurde eine einzelne Didesoxyguanosin-Sequenz-Spur verwendet, um eine Mutante aus der dGTPas- Sammlung zu identifizieren). Eine vollständige DNA-Sequenz-Vierfachspur wurde 200 bp über der Mutagenese-Stelle vorgeformt, um die mutante Sequenz zu bestätigen und zu identifizieren (F. Sanger et al. (1980) J. Mol. Biol. 143, 161-178). Es wurden bestätigte positive und negative Bacillus-Klone in LB-Medium kultiviert, das 12,5 ug/ml cmp enthielt, und aus Kulturüberständen, wie zuvor beschrieben, gereinigt (D.A. Estell et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518-6521). Analyse mittels Polyacrylamidgel- Elektrophorese ergab, daß die Enzyme zu mehr als 98% rein waren (U.K. Laemmli (1970) Nature 227, 680-685), und die Protein-Konzentrationen wurden aus der Absorbanz bei 280 nm berechnet, &epsi;&sub2;&sub8;&sub0;0,1% = 1,17 (H. Maturbara et al. (1965) J. Biol. Chem. 240, 1125-1130).
Die Enzym-Aktivität wurde mit 200 ug/ml Succinyl-L-AlaL-AlaL-ProL-Phe-p- Nitroanilid (Sigma) in 0,1 M Tris, pH = 8,6, oder 0,1 M CAPS, pH 10.8, bei 25ºC gemessen. Die spezifische Aktivität (uMol Produkt/min-mg) wurde aus der Absorbanz- Änderung bei 410 nm durch die Produktion von p-Nitroanilin mit der Zeit pro mg Enzym berechnet (E&sub4;&sub1;&sub0; = 8,480 Mol&supmin;¹cm¹; E.G. DelMar et al. (1979) Anal. Biochem. 99, 316-320). Die Untersuchungen der autolytischen Beständigkeit gegen Alkalien erfolgten an den gereinigten Enzymen (200 ug/ml) in 0,1 M Kaliumphosphat (pH = 12,0) bei 37ºC. Zu verschiedenen Zeiten wurden Aliqote auf Restenzymaktivität getestet (J.A. Wells et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 6564-6570)..

E. Ergebnisse

1. Optimierung und Analyse der Mutagenesehäufigkeit

Es wurde ein Satz von Primer-Schablonen-Molekülen, die zufällig über das Subtilisin-Gen 3'-terminiert waren (Fig. 31), durch variable Extension aus einem fixierten 5'-Primer hergestellt. (Der Primer mutierte eine einzelne Aval-Stelle bei Codon 11 im Subtilisin-Gen.) Dies wurde durch Polymerase-Stop-Reaktionen mit EDTA nach verschiedenen Extensionszeiten erreicht. Das Ausmaß und die Verteilung der Duplex-Bildung im 1 kb-Subtilisin-Genfragment wurde durch mehrfache (nicht dargestellte) Restriktionsdigestion erhalten. Beispielsweise zeigte die Produktion von neuen Hinfl-Fragmenten an, wenn die Polymerase-Extension über Ile110, Leu233 und Asp259 hinaus im Subtilisin-Gen fortgeschritten war.
Fehleinbau jedes dNTPαs an zufällig terminierten 3'-Enden durch AMV- Umkehrtranskriptase (R.A. Zakour et al. (1982) Nature 295, 708-710; R.A. Zakour et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 6615-6628) nützte die zuvor beschriebenen Bedingungen (J.J. Champoux (1984) Genetics 2, 454-464). Die Effizienz jeder Fehleinbau-Reaktion wurde durch Zugabe jedes dNTPαs zum Aval-Restriktionsprimer und Analyse durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese auf über 80% geschätzt. Die Fehlenbauten wurden durch Polymerisation mit allen vier dNTP's abgeschlossen, und zirkuläre DNA wurde durch Reaktion mit DNA-Ligase hergestellt.
Es wurden verschiedene Manipulationen angewandt, um die Ausbeute an mutanten Sequenzen im Heteroduplex zu maximieren. Diese umfaßten die Verwendung einer desoxyuridin-hältigen Schablone (T.A. Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492; P.J. Pukkila et al. (1983) Genetics 104, 571-582), die in- vitro-Methylierung des mutagenen Strangs (W. Kramer et al. (1982) Nucleic. Acids Res. 10, 6475-6485) und die Anwendung von Aval-Restriktionsselektion auf den Schablonenstrang der Wildform, der eine einzelne Aval-Stelle enthielt. Der jeweilige Beitrag jeder dieser Anreicherungs-Vorgangsweisen zur endgültigen Mutagenese- Häufigkeit wurde nicht bestimmt, außer daß vor der Aval-Restriktionsselektion etwa ein Drittel der aufgespalteten Klone in jedem der vier Pools im Subtilisin-Gen noch eine Aval-Stelle der Wildform beibehalten hatte. Nach Aval-Restriktionsselektion fehlte die Aval-Stelle der Wildform bei mehr als 98% der Plasmide.
Das 1,5 kb-EcoRI-BamHI-Subtilisin-Genfragment jedes der vier mit CsCl gereinigten M13-RF-Pools, das gegen Aval-Restriktionsselektion resistent war, wurde auf niedrig-schmelzender Agarose isoliert. Das Fragment wurde aus der Agarose in situ mit einem auf ähnliche Weise gespaltenen E. coli-B. Subtilis-Shuttlevektor, pBO180, ligiert und direkt in E. coli LE392 transformiert. Derartige direkte Ligation und Transformation von aus Agarose isolierter DNA vermied Verluste und ermöglichte große Anzahlen von erhaltenen Rekombinanten (> 100.000 pro ug-Äquivalent des M13-Ausgangspools).
Die Mutagenesehäufigkeit a (siehe Fußnote zu Tabelle XX) für jede der vier dNTPαs-Fehleinbau-Reaktionen wurde aus der Häufigkeit, mit der einzelne Restriktionsstellen entfernt wurden, abgeschätzt (Tabelle XX). Die für diese Analyse ausgewählten einzelnen Restriktionsstellen, Clal, Pvull und Kpnl, waren beginnend bei den Codons 35, 104 bzw. 166 über das Subtilisin-Gen verteilt. Zum Vegleich wurde die Mutagenese-Häufigkeit an der im β-Lactamas-Gen befindlichen Pstl-Stelle bestimmt, die außerhalb des Mutagenese-Fensters lag. Da die absolute Mutagenese-Häufigkeit in der Nähe des Prozentsatzes an undigerierter Plasmid-DNA lag, waren zwei Durchgänge der Restriktionsselektion notwendig, um den Hintergrund aus überlebender, ungespaltener Plasmid-DNA der Wildform unter dem mutanten Plasmid zu verringern (Tabelle XX). Der Hintergrund aus überlebendem Plasmid der Wildtyp-DNA stellt wahrscheinlich die Gesamtsumme aus spontanen Mutationen, ungespaltenem Wild- Plasmid und dem Wirkungsgrad der Transformation von E. coli mit linearer DNA dar. Subtrahieren der Häufigkeit für nicht-mutierte DNA (Hintergrund) von jener für mutante DNA und Normalisieren für das abgesuchte Mutagenese-Fenster durch gegebene Restriktionsanalyse (4 - 6 bp) ergibt eine grobe Schätzung des Wirkungsgrads der Mutagenese über die gesamte Kodiersequenz (etwa 1.000 bp). TABELLE XX % resistente Klone(c) α-Thiol-dNTP-Fehleinbau(b) Restriktionsstellen-Selektion Durchgang Gesamt % resistente Klone im Hintergrund(d) % Mutanten pro 1000bp(e) Keiner
(a) Die Mutagenese-Häufigkeit wird aus der Häufigkeit des Erhalts von Mutationen, die einzelne Restriktionsstellen innerhalb des mutierten Subtilisin-Gens (d.h. Clal, Pvull oder Kpnl) verändern, im Vergleich zu den Mutations-Häufigkeiten der Pstl-Stelle außerhalb des Mutagenese-Fensters abgeschätzt.
(b) Die Plasmid-DNA stammte von der Wildform ("keiner") oder war wie beschrieben durch dNTPαs-Fehleinbau mutiert.
(c) Der Prozentsatz an resistenten Klons wurde aus dem Anteil an Klons, die nach drei- oder mehrmaliger Über-Digestion des Plasmids mit dem angegebenen Restriktionsenzym erhalten wurden, im Verhältnis zu einem nicht-digerierten Vergleich berechnet. Restriktionsresistente Plasmid-DNA aus dem ersten Durchgang wurde einem zweiten Restriktionsselektionsdurchgang unterzogen. "Gesamt" stellt das Produkt der Fraktionen resistenter Klons aus beiden Selektions-Durchgängen dar und gibt den Prozentsatz an restriktionsstellen-mutierten Klons im ursprünglichen Ausgangspool an. Die Häufigkeiten resultieren aus der Zählung von zumindest 20 und üblicherweise mehr als 100 Kolonien.
(d) Der Prozentsatz an resistenten Klons wurde durch Subtrahieren des Prozentsatzes an restriktions-resisienten Klons bei Wildtyp-DNA (d.h. keine) von jenem für mutante DNA berechnet.
(e) Dies wird aus der Mutationshäufigkeit bei jeder Restriktionsstelle gegenüber jener im gesamten Subtilisin-Gen (etwa 1 kb) extrapoliert. Dies wurde für die Anzahl an möglichen Basen (4 - 6 bp) innerhalb jeder Restriktionsstelle, die durch einen gegebenen Fehleinbau mutiert werden kann, normalisiert.
Aus dieser Analyse wurde der mittlere Prozentsatz an Subtilisin-Genen, die Mutationen enthielten, die aus dem Fehleinbau von dGTPαs, dCTPαs oder dTTPαs hervorgegangen waren, auf 90, 70 bzw. 20% geschätzt. Diese hohen Mutagenese- Häufigkeiten waren im allgemeinen ziemlich variabel, je nach dem dNTPαs und den Wirkungsgraden des Fehleinbaus an dieser Stelle. Der Wirkungsgrad des Fehleinbaus wurde als abhängig sowohl von der Art der Mißübereinstimmung als auch von der Umgebung des Primers beschrieben (J.J. Champoux (1984); J.A. Skinner et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 6945-6964). Die gegenüber dTTPαs erhöhte Neigung von dGTPαs und dCTPαs zum Fehleinbau wurde bereits früher beobachtet (D. Shortle et al. (1985) Genetics 110, 539-555). Im Gegensatz zu den dGTPαs-, dCTPαs- und dTTPαs- Sammlungen konnte der Wirkungsgrad der Mutagenese für die dATPas-Fehleinbau-Sammlung nicht genau bestimmt werden, da bei 90% der analysierten restriktionsresistenten Plasmide die Subtilisin-Gen-Einfügung einfach fehlte. Dieses Problem entstand wahrscheinlich durch Selbstligation des Vektors, wenn das dATPαs-mutierte Subtilisin-Gen aus M13 in pBO180 subkloniert wurde. Beim Korrigieren bezüglich des Vektor-Hintergrunds wurde die Mutagenese-Häufigkeit in der dATPαs-Fehleinbau- Sammlung auf etwa 20 geschätzt. In einem (nicht dargestellten) getrennten Versuch wurden die Mutagenese-Wirkungsgrade für dGTPαs- und dTTPαs-Fehleinbau, basierend auf der Häufigkeit der Umkehr einer inaktivierenden Mutation bei Codon 169 auf etwa 50% bzw. 30% geschätzt.
Die Lage und Identität jeder Mutation wurde durch eine einzelne Spur der DNA- Sequenzierung, die dem Fehleinbau-α-Thiodesoxynukleotid über das gesamte Gen entsprach, gefolgt von einer vollständigen Vierspur-DNA-Sequenzierung, fokussiert über der Stelle der Mutation, bestimmt. Bei 14 identifizierten Mutanten war die Verteilung ähnlich zu jener von Shortle und Lin (1985) beschriebenen, nur daß keine Nukleotid- Einfügungs- oder Löschungsmutationen zu beobachten waren. Der Anteil an AG- Mutationen war in der G-Fehleinbau-Sammlung am größten, und es traten einige unerwartete Punktmutationen in den dTTPas- und dCTPαs-Sammlungen auf.
2. Screenen und Identifikation von alkalien-beständigen Subtilisin-Mutanten Es ist möglich, Kolonien, die Subtilisin erzeugen, durch Ringe von Casein- Digestion zu screenen (I.A. Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7925). Es gab jedoch zwei Probleme beim Screenen von Kolonien unter stark alkalischen Bedingungen (pH > 11). Zuerst vermehrt sich B. subtilis bei hohem pH nicht, und es konnte kein alkalophiler Bacillus-Stamm transformiert werden. Dieses Problem wurde gelöst, indem eine Strategie des Replik-Plattierens gewählt wurde, wobei Kolonien bei neutralem pH auf Filtern gezüchtet wurden, um Subtilisin zu produzieren, und die Filter anschließend auf Casein-Platten mit pH = 11,5 transferiert wurden, um die Subtilisin- Aktivität zu testen. Bei pH = 11,5 bildeten jedoch die Casein-Mizellen keinen trüben Hintergrund mehr, wodurch sie die klare Beobachtung der Proteolyse-Ringe verhinderten. Dieses Problem wurde durch kurzes Färben der Platte mit Coomassie-Blau zur Erweiterung der Proteolyse-Zonen und Ansäuern der Platte, um die Trübung der Casein-Mizellen zu entwickeln, gelöst. Durch Vergleich der auf der Vergleichs- Wachstumsplatte (pH = 7) produzierten Ring-Größe mit der Platte mit hohem pH (pH = 11,5) war es möglich, mutante Subtilisine zu identifizieren, die erhöhte (positive) oder verringerte (negative) Beständigkeit unter alkalischen Bedingungen zeigten. Es wurden etwa 1.000 Kolonien aus jeder der vier Fehleinbau-Sammlungen gescreent. Der Prozentsatz an Kolonien, die bei pH = 11,5 gegenüber pH = 7 einen differenziellen Aktivitätsverlust zeigten, stellte 1,4, 1,8, 1,4 und 0,6% der insgesamt gescreenten Kolonien der Thiol-dGTPαs-, -dATPαs-, -dTTPαs- bzw. -dCTPαs- Sammlungen dar. Mehrere dieser negativen Klone wurden sequenziert, und es enthielten alle eine einzige Basenänderung, wie von der Fehleinbau-Sammlung, aus der sie stammten, erwartet. Negative Mutanten umfaßten A36, E170 und V5O. Zwei positive Mutanten wurden als V107 und R213 identifiziert. Das Verhältnis von negativen zu positiven betrug etwa 50 : 1.
3. Beständigkeit und Aktivität von Subtilisin-Mutanten bei alkalischem pH Subtilisin-Mutanten wurden gereinigt und ihre autolytische Stabilitäten durch den zeitlichen Verlauf der Inaktivierung bei pH = 12,0 gemessen (Fig. 32 und 33). Die aus dem Test identifizierten positiven Mutanten (d.h. V107 und R213) waren im Vergleich zur Wildform resistenter gegen alkalisch induzierte autolytische Inaktivierung; negative Mutanten (d.h. E170 und V50) waren weniger resistent. Vorteilhafterweise wurde durch stellengerichtete Mutagenese eine weitere Mutante an Position 50 (F50) produziert. Diese Mutante war gegen alkalische autolytische Inaktivierung beständiger als das Wildenzym (Fig. 33). Bei Beendigung der Autolyse-Untersuchungen bestätigte SDS- PAGE-Analyse, daß sich jede Subtilisin-Variante bis zu einem mit der Restenzymaktivität konsistenten Maß autolysiert hatte.
Die stabilisierende Wirkung von V107, R213 und F50 ist kumulativ. Siehe Tabelle XXI. Die Doppelmutante V107/R213 (hergestellt durch Subklonieren des 920 bp-EcoRI-Kpnl-Fragments von pBO180V107 in das 6,6 kb-EcoRI-Kpnl-Fragment von pBO180R213) ist stabiler als jede Einfachmutante. Die Dreifachmutante F50/V07/R213 (hergestellt durch Subklonieren des 735 bp-EcoRI-Pvull-Fragments von pF50 (Beispiel 2) in das 6,8 kb-EcoRI-Pvull-Fragment von pBOI8O/V107) ist stabiler als die Doppelmutante V107/R213 oder F50. Die lnaktivierungskurven zeigen einen zweiphasigen Charakter, der umso stärker ausgeprägt wird, je stabiler die analysierte Mutante ist. Dies kann aus (einer) gewissen destabilisierenden chemischen Modifikation(en) (z.B. Deamidierung) während des Autolyse-Tests und/oder verringerter Stabilisierung durch vollständige Digestion von größeren Autolyse-Peptiden resultieren. Diese Untersuchungen der alkalischen Autolyse wurden an getrennt gereinigten Enzymchargen mit im wesentlichen denselben Ergebnissen wiederholt. Die Geschwindigkeiten der Autolyse sollten sowohl von der Stabilität der Konformation als auch von der spezifischen Aktivität der Subtilisin-Variante abhängen (J.A. Wells et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 6564-6570). Daher erschien es möglich, daß die Abnahmen der Geschwindigkeiten der autolytischen Inaktivierung aus Abnahmen der spezifischen Aktivität der stabileren Mutanten unter alkalischen Bedingungen resultieren. Im allgemeinen scheint jedoch das Gegenteil der Fall zu sein. Die stabileren Mutanten besitzen, falls überhaupt, eine relativ geringere spezifische Aktivität als die Wildform unter alkalischen Bedingungen und die weniger stabilen Mutanten weisen eine relativ geringere spezifische Aktivität auf. Diese subtilen Auswirkungen auf die spezifische Aktivität von V107/R213 und F50/V107/R213 sind sowohl bei pH = 8,6 als auch 10,8 kumulativ. Die Veränderungen der spezifischen Aktivität können leichte Unterschiede in der Substratspezifität wiederspiegeln, es ist jedoch bemerkenswert, daß nur die Positionen 170 und 107 innerhalb von 6Å eines gebundenen Modellsubstrats liegen (J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 2439-2449). TABELLE XXI Zusammenhang zwischen relativer spezifischer Aktivität bei pH = 8.6 oder 10.8 und alkalischer autolytischer Stabilität Relative spezifische Aktivität(a) Enzym Halbwertszeit der alkalischen Autolyse (min) b Wildform
(a) Die relative spezifische Aktivität war der Durchschnitt aus dreifachen Aktivitätsbestimmungen, dividiert durch den Wert der Wildform bei demselben pH. Die mittlere spezifische Aktivität des Wild-Enzyms bei pH = 8,6 und 10,6 betrug 70 pMol/min-mg bzw. 37 pMol/min-mg.
(b) Die Zeit bis zum Erreichen von 50% Aktivität wurde den Fig. 32 und 33 entnommen.

F. Zufalls-Kassetten-Mutagenese der Reste 197 - 228

Plasmid pΔ222 (Wells et al. (1985) Gene 34, 315-323) wurde mit PstI und BamHI digeriert und das 0,4 kb-Pstl-BamHI-Fragment (Fragment 1, siehe Fig. 34) aus einem Polyacrylamidgel durch Elektroelution gereinigt.
Das 1,5 kb-EcoRI/BamHI-Fragment von pS4,5 wurde in M13mp9 kloniert. Es erfolgte stellengerichtete Mutagenese, um die A197-Mutante zu erzeugen und gleichzeitig eine latente Sstl-Stelle bei den Codons 195 - 196 einzufügen. Das mutante EcoRI/BamHI-Fragment wurde in pBS42 zurück kloniert. Das pA197-Plasmid wurde mit BamHI und SStI digeriert und das 5,3 kb-BamHI/Sstl-Fragment (Fragment 2) wurde auf niedrig schmelzender Agarose gereinigt. Es wurden komplementäre Oligonukleotide synthetisiert, um den Bereich von Sstl (Codons 195 - 196) bis Pstl (Codons 228 - 230) zu überspannen. Diese Oligodesoxynukleotide wurden so konstruiert, um (1) Codon 197 der Wildform wiederherzustellen, (2) erneut eine latente Kpnl-Stelle, die in pΔ222 bei den Codons 219 - 220 enthalten ist, zu erzeugen, (3) eine latente Smal-Stelle bei den Codons 210 - 211 zu erzeugen und (4) die Pstl-Stelle bei den Codons 228 - 230 zu entfernen (siehe Fig. 35). Es wurden Oligodesoxynukleotide mit 2% verunreinigenden Nukleotiden bei jedem Synthesezyklus hergestellt, z.B. war dATP-Reagens mit 2% dCTP, 2% dGTP und 2% dTTP gespiked. Bei 97-meren sollte diese 2%-ige Vergiftung die folgenden Prozentsätze an nicht-mutanten Einfach- und Doppel- oder Mehrfachmutanten pro Strang mit zwei oder mehr Fehleinbauten pro Komplementärstrang ergeben: 14% nichtmutant, 28% Einfachmutant und 57% mit ≥ 2 Mutationen, gemäß der allgemeinen Formel worin u die durchschnittliche Anzahl an Mutationen und n eine Mutations-Zahlenklasse und f der Anteil des Ganzen mit dieser Anzahl an Mutationen ist. Komplementäre Oligodesoxynukleotid-Pools wurden phosphoryliert und anneliert (Fragment 3) und anschließend in 2fach-molarem Überschuß über die Fragmente 1 und 2 in einer Dreifachligation ligiert.
E. coli MM294 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert, der Transformations-Pool über Nacht kultiviert und die gepoolte Plasmid-DNA isoliert. Dieser Pool bestand aus 3,4 x 10&sup4; unabhängigen Transformanten. Dieser Plasmid-Pool wurde mit Pstl digeriert und anschließend zum erneuten Transformieren von E. coli verwendet. Es wurde ein zweiter Plasmid-Pool hergestellt und zum Transformieren von B. subtilis (BG2036) verwendet. Ungefähr 40% der BG2036-Transformanten exprimierten aktiv Subtilisin, wie durch Ring-Klärung auf Casein-Platten festgestellt wurde. Mehrere der nicht-exprimierenden Transformanten wurden sequenziert und wiesen in den synthetischen Kassetten Einfügungen oder Löschungen auf. Die exprimierenden BG2036-Mutanten wurden in Mikrotiter-Schalen mit 150 ul LB/12,5 ug/ml Chloramphenicol (cmp) pro Napf angeordnet, bei 37ºC 3 - 4 h lang inkubiert und danach jeweils zweifach auf Nitrozellulose-Filter gestempelt, die über Nacht bei 33ºC auf LB 1,5% Magermilch/5 ug/ml cmp-Platten gelegt wurden (bis die Ringe einen Durchmesser von ungefähr 4 - 8 mm aufwiesen). Die Filter wurden anschließend abgenommen und auf Stapel von Filterpapier aufgebracht, die mit 1 x Tide-Tensid handelsüblicher Qualität, 50 mM Na&sub2;CO&sub3;, pH = 11,5, gesättigt waren, und bei 65ºC 90 min lang inkubiert. Über Nacht kultivierte Platten wurden coomassie-gefärbt und entfärbt, um Basiswerte für die Expression zu erhalten. Nach dieser Behandlung wurden die Filter auf pH7/Magermilch/20 ug/ml Tetracyclin-Platten zurückgebracht und bei 37ºC 4 h lang bis zu über Nacht inkubiert.
Mutanten, die durch den Test auf Beständigkeit bei hohem pH als beständiger gegen Alkalien identifiziert worden waren, wurden gereinigt und auf autolytische Stabilität bei hohem pH oder hoher Temperatur analysiert. Die Doppelmutante C204/R213 war sowohl bei hohem pH als auch bei hoher Temperatur stabiler als die Wildform (Tabelle XXII).
Diese Mutante wurde durch Schneiden an der einzigen Smal-Restriktionsstelle (Fig. 35) und Ligieren der Wild-Sequenz entweder 3' zur 5mal-Stelle, um die C204- Einfachmutante zu erzeugen, oder 5' zur Smal-Stelle, um die R213-Einfachmutante zu erzeugen, in parentale Einfachmutanten (C204 und R213) gespalten. Von den beiden parentaien Einfachmutanten war C204 nahezu genauso beständig gegen Alkalien wie die parentale Doppelmutante (C204/R213) und etwas thermostabiler. Siehe Tabelle XXII. Die R213-Mutante war unter beiden Bedingungen nur wenig stabiler als die Wildform (nicht dargestellt).
Eine weitere aus dem Screen der 197 - 228 Zufalls-Kassetten-Mutagenese identifizierte Mutante war R204. Diese Mutante war sowohl bei hohem pH als auch bei hoher Temperatur stabiler als die Wildform, aber weniger stabil als C204.

TABELLE XXII

Stabilität von Subtilisin-Varianten

Die gereinigten Enzyme (200 ug/ml) wurden in 0,1 M Phosphat, pH = 12, bei 30ºC zur alkalischen Autolyse oder in 2 mM CaCl&sub2;, 50 mM MOPS, pH = 7,0, bei 62ºC zur thermischen Autolyse inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten wurden Proben auf Restenzymakivität getestet. Die Inaktivierungen waren Reaktionen ungefähr pseudoerster Ordnung, und t1/2 gibt die Zeit an, die benötigt wurde, um in zwei getrennten Experimenten 50% der Ausgangsaktivität zu erreichen. (Alkalische Autolyse) (Thermische Autolyse) Subtilisin-Variante Wildform

G. Zufalls-Mutagenese bei Codon 204

Basierend auf den obigen Erebnissen wurde Codon 204 zur Zufalls-Mutagenese ausgewählt. Die mutagenen DNA-Kassetten (für Codon 204) enthielten alle eine stabile R213-Mutation, die sich als die Stabilität der C204-Mutante leicht erhöhend erwiesen hatte.
Plasmid-DNA, die für die Subtilisin-Mutante C204/R213 kodierte, wurde mit Sstl und EcoRI diegeriert und ein 1,0 kb-EcoRI/Sstl-Fragment durch Elektroelution aus Polyacrylamidgel isoliert (Fragment 1, siehe Fig. 35).
C204/R213 wurde ebenso mit Smal und EcoRI digeriert, und das große 4,7 kb- Fragment, das Vektorsequenzen und den 3'-Abschnitt des Kodierbereichs enthält. wurde aus niedrig schmelzender Agarose isoliert (Fragment 2, siehe Fig. 36).
Die Fragmente 1 und 2 wurden in vier getrennten Dreifachligationen mit den heterophosphorylierten Fragmenten 3 kombiniert (siehe Fig. 36 und 37). Diese Heterophosphorylierung von synthetischen Duplexen sollte vorzugsweise den phosphorylierten Strang in das Plasmid-Ligationsprodukt treiben. Vier Plasmid-Pools, die den vier Ligationen entsprachen, wurden mit 5mal restringiert, um jegliches einfach gespaltene C204/R213, das durch Isolieren von Fragment 2 vorlag, zu linearisieren, um so den Hintergrund von C204/R213 zu verringern. Anschließend wurde E. coli erneut mit den Smal-restringierten Plasmid-Pools transformiert, um einen zweiten Satz Plasmid- Pools zu ergeben, die im wesentlichen frei von C204/R213 und jeglichem nichtabgetren nten Heteroduplex-Material sind.
Diese zweiten, angereicherten Pools wurden danach verwendet, um B. subtilis (BG2036) zu transformieren, und die erhaltenen vier Mutanten-Pools wurden auf Klons gescreent, die Subtilisin exprimierten, das gegen Inaktivierung durch hohe(n) pH/Temperatur resistent waren. Die Mutanten, die sich bei einem derartigen Test als positiv erwiesen, wurden weiter charakterisiert und durch Sequenzieren identifiziert. Die Mutante L204/R213 erwies sich als etwas stabiler als das Wildtyp-Subtilisin. Siehe Tabelle XXII.
Nachdem die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, wird dem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann klar sein, daß zahlreiche Modifikationen an den beschriebenen Ausführungsformen durchgeführt werden können, und daß derartige Modifikationen auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen.

Claims

1. Subtilisinmutante, die durch Substitution zumindest eines Aminosäurerests eines Vorläufer-Subtilisins durch eine davon verschiedene Aminosäure hergeleitet ist, sodaß die Subtilisinmutante zumindest eine Eigenschaft aufweist, die sich von der gleichen Eigenschaft des Vorläufer-Subtilisins unterscheidet, gekennzeichnet durch die Substitution an einem oder mehreren von Tyr21, Thr22, Ser24, Asp36, Ala45, Gly46, Ala48, Ser49, Met50, Asn77, Ser87, Lys94, Val95, Leu96, Ile107, Gly110, Met124, Lys170, Tyr171, Pro172, Asp197, Met199, Ser204, Lys213, His67, Leu135, Gly97, Ser101, Gly102, Glu103, Gly127, Gly128, Pro129, Tyr214 und Gly215 von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin und äquivalenten Aminosäureresten in anderen Vorläufer-Subtilisinen.

2. Subtilisinmutante mit einer Aminosäuresequenz, die aus der Aminosäuresequenz eines Vorläufer-Subtilisins durch Substitution mehr als eines Aminosäurerests der Aminosäuresequenz des Vorläufer-Subtilisins durch eine davon verschiedene Aminosäure hergeleitet ist, sodaß die Subtilisinmutante zumindest eine Eigenschaft aufweist, die sich von der gleichen Eigenschaft des Vorläufer-Subtilisins unterscheidet, gekennzeichnet durch Substitutionen an mehr als einem von Tyr21, Thr22, Ser24, Asp32, Ser33, Asp36, Ala4s, Ala48, Ser49, Met50, Ser87, Lys94, Val95, Tyr104, Ile107, Gly110, Met124, Ala152, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Lys170, Tyr171, Pro172, Phe189, Asp197, Met199, Ser204, Lys213, Tyr217, Ser221, Met222, His67, Leu135, Gly97, Ser101, Gly102, Glu103, Gly127, Gly128, Pro129, Tyr214 und Gly215 von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin und äquivalenten Aminosäureresten in anderen Vorläufer-Subtilisinen, mit der Maßgabe, daß bei einer Substitution an irgendeinem Rest in der Gruppe Asp32, Ser33, Tyr104, Ala152, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 und Met222 eine Substitution auch an zumindest einer bestimmten Position durchgeführt wird, die nicht dieser Gruppe angehört.

3. Mutante nach Anspruch 2, worin die Kombinationen aus Thr22/Ser87, Ser24/Ser87, Ala45/Ala48, Ser49/Lys94, Ser49/Val95, Met50/Val95, Met50/Gly110, Met50/Met124, Met50/Met222, Met124/Met222, Tyr21/Thr22, Met50/Met124/Met222, Tyr21/Tyr22/Ser87, Met50/Glu156/Gly166/Tyr217, Met50/Glu156/Tyr217, Ile170/Lys213, Ser204/Lys213, Met50/Ile107/Lys213 und Ser24/Met50/Ile107/Glu156/Gly166/Gly169/Ser204/Lys213/Gly215/Tyr217 ausgewählt sind.

4. Subtilisinmutante, die durch Löschung eines oder mehrerer Aminosäurereste in einem Vorläufer-Subtilisin, das 161-164 in B. amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent ist, hergeleitet ist, wobei die Löschung entweder alleine oder in Kombination mit Substitutionen in der Aminosäuresequenz des Vorläufer-Subtilisins erfolgt und zumindest eine Eigenschaft ergibt, die sich von der gleichen Eigenschaft des Vorläufer-Subtilisins unterscheidet.

5. Subtilisinmutante mit geänderter Substratspezifität im Vergleich zu einem Vorläufersubtilisin, wobei die Mutante durch Substitution einer unterschiedlichen Aminosäure am Rest, der Leu + 126 von B. amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent ist, alleine oder in Kombination mit anderen Substitutionen oder Löschungen in der Aminosäuresequenz des Vorläufer-Subtilisins hergeleitet ist.

6. Subtilisinmutante mit geänderter Substratspezifität im Vergleich zu einem Vorläufersubtilisin, wobei die Mutante durch Substitution einer unterschiedlichen Aminosäure am Rest, der Asp +99 im B. amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent ist, alleine oder in Kombination mit anderen Substitutionen oder Löschungen in der Aminosäuresequenz des Vorläufer-Subtilisins hergeleitet ist.

7. DNA-Sequenz, die für die Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.

8. Expressionsvektor, der die Mutanten-DNA-Sequenz von Anspruch 7 enthält.

9. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor von Anspruch 8 transformiert ist.