DE69534875T2

DE69534875T2 - Kalziumfreie subtilisin mutanten

Info

Publication number: DE69534875T2
Application number: DE69534875T
Authority: DE
Inventors: N. Philip Silver Spring BRYAN; A. Patrick Silver Spring ALEXANDER; L. Susan Rockville STRAUSBERG
Original assignee: University of Maryland at Baltimore
Current assignee: University of Maryland at Baltimore
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2015-04-29
Also published as: AU693552B2; EP0804592B1; CA2200563A1; JPH10506277A; DE69534875D1; EP0804592A1; CN1168829C; ATE320495T1; CN1166183A; CA2200563C; HK1004150A1; MX9702038A; AU2433595A; KR100364448B1; NZ285286A; BR9508981A; US5567601A; WO1996009396A1

Description

Angaben über mit Bundesmitteln geförderte Forschungsarbeiten
Die US-Regierung verfügt über eine "paid-up"-Lizenz an dieser Erfindung und über das Recht unter bestimmten Umständen vom Patentinhaber eine Lizenzierung unter angemessenen Bedingungen gemäß Grant Nr. GM42560 des National Institute of Health zu verlangen.
Allgemeine Aufgaben der Erfindung
Eine allgemeine Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Subtilisin-Mutanten, die so mutiert worden sind, dass sie Calcium nicht binden. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von DNA-Sequenzen, die bei Expression Subtilisin-Mutanten liefern, die Calcium nicht binden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Subtilisin-Mutanten, die spezifische Kombinationen von Mutationen umfassen, die für eine erhöhte Wärmestabilität sorgen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese einer Subtilisin-Mutante, die Calcium nicht bindet, durch Expression einer Subtilisin-DNA, die eine oder mehrere Substitutions-, Deletions- oder Additionsmutationen in einer geeigneten rekombinanten Wirtszelle umfasst.
Eine spezielle Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Subtilase-Mutanten der Klasse I, insbesondere von BPN'-Mutanten, die so mutiert worden sind, dass sie Calcium nicht binden.
Eine weitere spezielle Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von DNA-Sequenzen, die bei Expression zu Subtilase-Mutanten der Klasse I und insbesondere zu BPN'-Mutanten, die Calcium nicht binden, führen.
Eine weitere spezielle Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Subtilisin I-S1- oder I-S2-Mutanten und insbesondere von BPN'-Mutanten, die Calcium nicht binden, durch Expression einer Klasse I-Subtilase-Mutante-DNA-Sequenz und insbesondere einer BPN'-DNA-Kodierungssequenz, die eine oder mehrere Substitutions-, Additions- oder Deletionsmutationen in einer geeigneten rekombinanten Wirtszelle umfasst.
Eine weitere spezielle Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von mutantem Subtilisin-I-S1- oder -I-S2 und insbesondere von BPN'-Mutanten, die Calcium nicht binden und die ferner bestimmte Kombinationen von Mutationen umfassen, die für eine erhöhte Wärmestabilität sorgen oder die die Kooperativität der Faltungsreaktion wiederherstellen.
Die erfindungsgemäßen Subtilisin-Mutanten dienen zum Einsatz für Anwendungsmöglichkeiten, bei denen Subtilisine derzeit Verwendung finden. Aufgrund der Tatsache, dass diese Mutanten Calcium nicht binden, sollten sie insbesondere zur Verwendung in industriellen Umgebungen geeignet sein, bei denen chelatbildende Mittel vorliegen, z. B. Detergenszusammensetzungen, die die Aktivität von Calcium bindenden Wildtyp-Subtilisinen erheblich verringern.
Hintergrund der Erfindung
(1) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Subtilisin-Proteine, die zur Beseitigung der Bindung von Calcium modifiziert worden sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Subtilisin I-S1- und Subtilisin I-S2-Mutanten, speziell BPN'-Mutanten, bei denen die Calcium A-Bindungsschleife deletiert worden ist, wobei insbesondere die Aminosäuren 75-83 deletiert worden sind, und die zusätzlich eine oder mehrere weitere Mutationen, z. B. Subtilisin-Modifikationen, die für eine erhöhte Wärmestabilität sorgen, und/oder Mutationen, die die Kooperativität für die Faltungsreaktion wiederherstellen, umfassen.
(2) Beschreibung des Stands der Technik
Subtilisin ist ein ungewöhnliches Beispiel für ein monomeres Protein mit einer erheblichen genetischen Barriere gegen die Faltung und Auffaltung. Ein gut bekanntes Beispiel hierfür ist Subtilisin BPN', eine Serin-protease mit 275 Aminosäuren, die von Bacillus amyloliquefaciens sezerniert wird. Dieses Enzym ist von erheblicher gewerblicher Bedeutung und war Gegenstand zahlreicher Protein-Bearbeitungsstudien (Siezen et al., Protein Engineering, Bd. 4 (1991), S. 719–737; Bryan, Pharmaceutical Biotechnology, Bd. 3(B) (1992), S. 147–181; Wells et al., Trends Biochem. Sci., Bd. 13 (1988), S. 291–297). Die Aminosäuresequenz für Subtilisin BPN' ist aus dem Stand der Technik bekannt und findet sich bei Vasantha et al., J. Bacteriol., Bd. 159 (1984), S. 811–819. Die dort beschriebene Aminosäuresequenz wird durch Verweis hier aufgenommen (SEQ ID NO: 1). In der gesamten Anmeldung bezieht sich ein Hinweis der Anmelderin auf die Aminosäuresequenz von Subtilisin BPN' oder von dessen Mutanten auf die dort aufgeführte Aminosäuresequenz.
Subtilisin ist eine Serin-Protease, die von gram-positiven Bakterien oder von Pilzen erzeugt wird. Die Aminosäuresequenzen zahlreicher Subtilisine sind bekannt (Siezen et al., Protein Engineering, Bd. 4 (1991), S. 719–737). Hierzu gehören fünf Subtilisine von Bacillus-Stämmen, z. B. Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus, und Mesenticopeptidase (Vasantha et al., "Gene for alkaline protease and neutral protease from Bacillus amyloliquefaciens contain a large open-reading frame between the regions coding for signal sequence and mature protein", J. Bacteriol., Bd. 159 (1984), S. 811–819; Jacobs et al., "Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis", Nucleic Acids Res., Bd. 13 (1985), S. 8913–8926; Nedkov et al., "Determination of the complete amino acid sequence of subtilisin DY and its comparison with the primary structures of the subtilisin BPN', Carlsberg and amylosacchariticus", Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 421–430; Kurihara et al., "Subtilisin amylosacchariticus", J. Biol. Chem, Bd. 247 (1972), S. 5619–5631; und Svendsen et al., "Complete amino acid sequence of alkaline mesentericopeptidase", FEBS Lett., Bd. 196 (1986), S. 228–232).
Die Aminosäuresequenzen von Subtilisinen von zwei fungalen Proteasen sind bekannt: Proteinase K aus Tritirachium album (Jany et al., "Proteinase K from Tritirachium album Limber", Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366 (1985), S. 485–492) und Thermomycolase aus dem thermophilen Pilz Malbranchea pulchella (Gaucher et al., "Endopeptidases: Thermomycolin", Methods Enzymol., Bd. 45 (1976), S. 415–433).
Es wurde gezeigt, dass diese Enzyme mit Subtilisin BPN' verwandt sind, nicht nur über ihre primären Sequenzen und enzymologischen Eigenschaften, sondern auch bei Vergleich durch röntgenkristallographische Daten (McPhalen et al., "Crystal and molecular structure of the inhibitor eglin from leeches in complex with subtilisin Carlsberg", FEBS Lett., Bd. 188 (1985), S. 55–58; und Pahler et al., "Three-dimensional structure of fungal proteinase K reveals similarity to bacterial subtilisin", EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 1311–1314).
Subtilisin BPN' ist ein Beispiel für ein spezielles Subtilisin-Gen, das durch Bacillus amyloliquefaciens sezerniert wird. Dieses Gen wurde kloniert, sequenziert und in hohen Konzentrationen aus ihren natürlichen Promotorsequenzen in Bacillus subtilis exprimiert. Die Subtilisin BPN'-Struktur wurde in einer Auflösung von 1,3 Å (R = 0,14) aufgeklärt und hat strukturelle Einzelheiten für zwei Ionenbindungsstellen ergeben (Finzel et al., J. Cell. Biochem. Suppl., Bd. 10A (1986), S. 272; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 8311–8317; McPhalen et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 6582–6598). Eine dieser Stellen (Stelle A) bindet Ca²⁺ mit hoher Affinität und befindet sich nahe am N-Terminus, während die andere Stelle (Stelle B) Calcium und andere Kationen wesentlich schwächer bindet und sich in einem Abstand von etwa 32 Å befindet (1). Strukturelle Beweise für zwei Calciumbindungsstellen finden sich auch bei Bode et al., Eur. J. Biochem., Bd. 166 (1987), S. 673–692, für das homologe Enzym Subtilisin Carlsberg.
Diesbezüglich wird ferner darauf hingewiesen, dass die primäre Calciumbindungsstelle bei allen diesen Subtilisinen in den Gruppen I-S1 und I-S2 (Siezen et al., (1991), Tabelle 7) aus fast identischen Schleifen mit neun Resten in der identischen Position der Helix C gebildet wird. Röntgenstrukturen der I-S1-Subtilisine BPN' und Carlsberg sowie des I-S2-Subtilisins Savinase wurden mit hoher Auflösung bestimmt. Ein Vergleich dieser Strukturen belegt, dass alle drei Enzyme fast identische Calcium A-Stellen aufweisen.
Die Röntgenstruktur der Klasse I-Subtilase Thermitase aus Thermoactinomyces vulgaris ist ebenfalls bekannt. Obgleich die Gesamthomologie von BPN' mit Thermitase wesentlich geringer ist als die Homologie von BPN' mit I-S1- und I-S2-Subtilisinen, wurde gezeigt, dass Thermitase eine analoge Calcium A-Stelle aufweist. Im Fall von Thermitase handelt es sich bei der Schleife um eine Unterbrechung mit zehn Resten an der identischen Stelle in der Helix C.
Calciumbindungsstellen sind übliche Merkmale von extrazellulären mikrobiellen Proteasen, vermutlich aufgrund ihres großen Beitrags sowohl zur thermodynamischen als auch zur kinetischen Stabilität (Matthews et al., J. Biol. Chem., Bd. 249 (1974), S. 8030–8044; Voordouw et al., Biochemistry, Bd. 15 (1976), S. 3716–3724; Betzel et al., Protein Engineering, Bd. 3 (1990), S. 161–172; Gros et al., J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 2953–2961). Es wird angenommen, dass die thermodynamische und kinetische Stabilität von Subtilisin wegen der rauen Bedingungen der extrazellulären Umgebung, in die Subtilisin sezerniert wird (diese Umgebung ist aufgrund der eigenen Anwesenheit von Subtilisin reich an Proteasen), erforderlich ist. Demzufolge können hohe Aktivierungsbarrieren gegen eine Auffaltung von wesentlicher Bedeutung sein, um die native Konformation zu arretieren und eine vorübergehende Auffaltung und Proteolyse zu verhindern.
Ungünstigerweise erfolgen die meisten gewerblichen Einsätze von Subtilisinen in Umgebungen, die hohe Konzentrationen an Metall-Chelatbildnern enthalten, die dem Subtilisin Calcium entziehen und seine Stabilität beeinträchtigen. Es wäre daher von großer praktischer Bedeutung, ein hochgradig stabiles Subtilisin zu schaffen, das von Calcium unabhängig ist.
Die Erfinder haben sich früher mehrerer Strategien bedient, um die Stabilität von Subtilisin gegen eine thermische Denaturierung zu erhöhen, wobei sie einfache thermodynamische Modelle angenommen haben, um sich dem Auffaltungsübergang anzunähern (Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 26 (1987), S. 2077–2082; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 8311–8317; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 7205–7213; Rollence et al., CRC Crit. Rev. Biotechnol., Bd. 8 (1988), S. 217–224). Jedoch sind derzeit keine verbesserten Subtilisin-Mutanten, die unter industriellen Umgebungen, die beispielsweise Metall-Chelatbildner enthalten, stabil sind und Calcium nicht binden, nicht verfügbar.
Aufgaben und zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Demzufolge ist es eine Aufgabe der Erfindung, mutierte oder modifizierte Subtilisin-Enzyme, z. B. Subtilasen der Klasse I, bereitzustellen, die modifiziert worden sind, um die Calciumbindung zu beseitigen. Der erfindungsgemäß verwendete Ausdruck "mutiertes oder modifiziertes Subtilisin" ist so zu verstehen, dass beliebige Serin-protease-Enzyme, die modifiziert worden sind, um die Calciumbindung zu beseitigen, umfasst werden. Dies schließt insbesondere Subtilisin BPN' und Serin-proteasen, die homolog zu Subtilisin BPN' sind, insbesondere Subtilasen der Klasse I, ein. Jedoch können gemäß der hier gegebenen Anwendung und im Rahmen der Definition eines mutierten oder modifizierten Subtilisin-Enzyms die erfindungsgemäßen Mutationen in beliebige Serin-proteasen eingeführt werden, die eine Identität der Aminosäuresequenz von mindestens 50% und vorzugsweise 80% mit den vorstehend für Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus, Mesenticopeptidase, Thermitase oder Savinase angegebenen Sequenzen aufweisen und daher als homolog angesehen werden können.
Die erfindungsgemäßen mutierten Subtilisin-Enzyme sind in Gegenwart von Metall-Chelatbildnern stabiler und können auch eine erhöhte Wärmestabilität aufweisen, verglichen mit nativem oder Wildtyp-Subtilisin. Die Wärmestabilität stellt einen guten Indikator für die gesamte Widerstandsfähigkeit eines Proteins dar. Proteine mit hoher Wärmestabilität sind häufig in Gegenwart von chaotropen Mitteln, Detergentien und unter anderen Bedingungen, die normalerweise tendenziell Proteine inaktivieren, stabil. Von thermisch stabilen Proteinen wird daher erwartet, dass sie sich für zahlreiche gewerbliche und therapeutische Anwendungen eignen, bei denen Beständigkeit gegen hohe Temperatur und drastische Lösungsmittel oder eine längere Lagerbeständigkeit erforderlich sind.
Ferner wurde festgestellt, dass durch Kombination von individuellen stabilisierenden Mutationen es in Subtilisin häufig zu einer in etwa additiven Steigerung der freien Stabilisierungsenergie kommt. Es wurde auch gezeigt, dass die thermodynamische Stabilität im Zusammenhang mit einer Beständigkeit gegen eine irreversible Inaktivierung bei hoher Temperatur und hohem pH-Wert steht. Die erfindungsgemäßen Änderungen an einzelnen Stellen übersteigen individuell nicht einen Beitrag von 1,5 Kcal/mol zur freien Faltungsenergie. Jedoch führen diese geringen inkrementellen Steigerungen der freien Stabilisierungsenergie zu einem drastischen Anstieg der Gesamtstabilität, wenn die Mutationen kombiniert werden, da die gesamte freie Faltungsenergie für die meisten Proteine im Bereich von 5–15 Kcal/mol liegt (Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman and Company, New York (1984)).
Eine röntgenkristallographische Analyse von mehreren Kombinationsmutanten zeigt, dass Konformationsänderungen, die mit jeder Mutation verbunden sind, zu einer hochgradigen Lokalisierung unter minimaler Verzerrung der Gerüststruktur neigen. Somit lassen sich sehr hohe Zunahmen der Stabilität ohne radikale Veränderungen der tertiären Proteinstruktur und nur mit untergeordneten unabhängigen Veränderungen in der Aminosäuresequenz erreichen. Es wurde bereits früher darauf hingewiesen (Holmes et al., J. Mol. Biol., Bd. 160 (1982), S. 623), dass Beiträge zur freien Stabilisierungsenergie auf unterschiedlichen Wegen gewonnen werden können, einschließlich verbesserte Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen in der gefalteten Form und eine verringerte Kettenentropie des aufgefalteten Enzyms. Dies ist von Bedeutung, da thermostabile Enzyme im allgemeinen längere Halbwertszeiten in breiteren Temperaturbereichen aufweisen, wodurch sich eine Verbesserung des Bioreaktors und des Lagerverhaltens ergibt.
Erfindungsgemäß wird ein neues mutantes Subtilisin-Protein mit einer im Vergleich zu einem Wildtyp ähnlichen oder erhöhten Stabilität und enzymatischen Aktivität in einer chelatbildenden, wässrigen Umgebung bereitgestellt, das zur Beseitigung der Fähigkeit zur Bindung von Calcium an einer hochgradig affinen Calcium-Bindungsstelle mutiert worden ist, wobei das mutante Subtilisin-Protein ferner eine oder mehrere zusätzliche Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfasst, die die Stabilität des mutanten Proteins in mindestens einer Region erhöhen, die einer Region des reifen Subtilisin-BPN' entspricht, die aus den folgenden reifen Subtilisin-BPN'-Regionen ausgewählt ist: die N-terminalen Aminosäuren 1-8, die ω-Schleifen-Aminosäuren 36-45 und die α-Helix-Aminosäuren 70-74, wobei die mutanten Subtilisin-Proteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht:

1. N218S, M50F, Y217K und P5A (S47);
2. N218S, M50F, Y217K und P5S (S68);
3. N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206V (S73);
4. N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206C (S79); und
5. N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L, Q206C und S3C (S86).

Ferner wird ein Verfahren bereitgestellt, bei dem das neue Protein exprimiert wird, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

a) Mutieren eines klonierten Subtilisin-Gens durch in vitro-Mutagenese zur Erzeugung eines DNA-Segments oder einer DNA-Sequenz, die für das mutante Subtilisin-Protein, das Calcium nicht bindet, kodieren, wobei das mutante Subtilisin-Protein ferner eine oder mehrere zusätzliche Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfasst, die die Stabilität des mutanten Proteins in mindestens einer Region erhöhen, die einer Region des reifen Subtilisin-BPN' entspricht, die aus den folgenden reifen Subtilisin-BPN'-Regionen ausgewählt ist: die N-terminalen Aminosäuren 1-8, die ω-Schleifen-Aminosäuren 36-45 und die α-Helix-Aminosäuren 70-74, wobei die mutanten Subtilisin-Proteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: k) N218S, M50F, Y217K und P5A (S47); l) N218S, M50F, Y217K und P5S (S68); m) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206V (S73); n) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206C (S79); und o) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L, Q206C und S3C (S86);
b) Transformieren einer rekombinanten Wirtszelle, der das Subtilisin-Gen fehlt, mit einem Expressionsvektor, der dieses DNA-Segment oder diese DNA-Sequenz, die für mutantes Subtilisin-Protein kodieren, umfasst;
c) Züchten dieser rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des mutanten Subtilisin-Proteins sorgen; und
d) Screening des exprimierten, mutanten Subtilisin-Proteins auf eine im Vergleich zu Wildtyp-Subtilisin ähnliche oder erhöhte enzymatische Aktivität und Stabilität in einer chelatbildenden, wässrigen Umgebung, um festzustellen, ob dieses mutante Subtilisin-Protein eine ähnliche oder erhöhte enzymatische Aktivität und Stabilität aufweist.

Wie vorstehend erwähnt, werden erfindungsgemäß Subtilisin-Mutanten bereitgestellt, die eine oder mehrere Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfassen, die für die Beseitigung der Bindung von Calcium sorgen. Dies wird durch Deletion, Substitution oder Insertion von Aminosäuren an der Calcium A-Stelle erreicht, die im Fall von Subtilasen der Klasse I neun Aminosäurereste in der Helix C umfasst. Im Fall von Subtilisin BPN' umfassen die Subtilisin-Mutanten vorzugsweise eine oder mehrere Additions-, Deletions- oder Substitutionsmutationen der Aminosäuren in den Positionen 75-83 und insbesondere die Deletion der Aminosäuren 75-83 von SEQ ID NO: 1. Es wurde festgestellt, dass die Deletion der Aminosäuren 75-83 in wirksamer Weise die Bindung von Calcium an die erhaltene Subtilisin-Mutante beseitigt, während aber doch Subtilisin BPN'-Proteine mit enzymatischer Aktivität bereitgestellt werden.
Derartige Subtilisin-Mutanten, denen die Aminosäuren 75-83 von SEQ ID NO: 1 fehlen, können ferner eine oder mehrere weitere Aminosäuremutationen in der Sequenz aufweisen, z. B. Mutationen, die für eine verringerte Proteolyse sorgen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Subtilisin-Mutanten mit fehlender Calcium-Bindungsaktivität zu erzeugen, die ferner so mutiert sind, dass die Kooperativität mit der Faltungsreaktion wiederhergestellt und dadurch die proteolytische Stabilität erhöht wird. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, thermostabile Subtilisin-Mutanten bereitzustellen, die Calcium nicht binden und spezielle Kombinationen von Mutationen umfassen, die für eine erheblich gesteigerte Wärmestabilität sorgen.
Insbesondere umfassen die erfindungsgemäßen Subtilisin-Mutanten Subtilisine von Bacillus-Stämmen, wie Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin amylosacchariticus und Subtilisin-mesenticopeptidase, die eine oder mehrere Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Röntgenkristallstruktur von S15-Subtilisin

A. Das α-Kohlenstoffdiagramm zeigt die Positionen von Mutationen gemäß der Kennzeichnung. Die Nummerierung von Wildtyp-Subtilisin ist beibehalten. Punktierte Kugeln zeigen die Position von Calcium an der schwachen Ionenbindungsstelle (B-Stelle) und die vorherige Position der Bindungsstelle von hoher Affinität (A-Stelle). Die Schleife der A-Stelle (gestrichelte Linie) fehlt bei dieser Mutante. Die N- und C-Termini sind angegeben. Der N-Terminus ist ungeordnet (punktierte Linie).
B. Vergrößerte Ansicht der Deletion der A-Stelle. Die Schleife von S12-Subtilisin ist als eine punktierte Linie mit der kontinuierlichen Helix von S15 dargestellt. Überlagert ist die 3*-sigma-Differenzelektronendichte (FO12–FO15, Phasen von S15) zur Darstellung der deletierten Schleife der A-Stelle.

2. Röntgenkristallstruktur der Region der Calcium A-Stelle von S12 Subtilisin. Calcium ist als punktierte Kugel mit der Hälfte des van der Waals-Radius dargestellt. Die gestrichelten Linien zeigen Koordinationsbindungen, während punktierte Linien Wasserstoffbrückenbindungen unter 3,2 Å darstellen.
3. Differentialscanningkalorimetrie. Die kalorimetrischen Abtastungen von apo-S12 (T_m = 63,5°C) und S15 (T_m = 63,0°C) sind dargestellt. Die Messungen wurden mit einem Hart 7707 DSC (Differentialscanningkalorimetrie)-Wärmeleitungs-Abtastmikrokalorimeter gemäß den Angaben von Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 7205–7213, durchgeführt. Probenbedingungen: 50 mM Glycin, pH-Wert 9,63, Abtastgeschwindigkeit 0,5°C/min. Die überschüssige Wärmekapazität wird in Einheiten μJ/° gemessen. Die Kalorimeterampullen enthielten 1,78 mg Protein.
4. Titrationskalorimetrie von Subtilisin S11. Die Wärme der Calciumbindung für aufeinanderfolgende Zugaben von Calcium ist gegen das Verhältnis von [Ca]/[P] aufgetragen. Die Daten sind durch eine berechnete Bindungskurve bestmöglich angepasst, wobei eine Bindungskonstante von 7 × 10⁶ und ein ΔH-Wert von 11,3 kcal/mol unter Anwendung der Gleichung (1) aus dem Text angenommen wird. Zu Vergleichszwecken sind auch berechnete Kurven mit der Annahme K_a = 1 × 10⁶ und 1 × 10⁸ dargestellt. Bei dieser Titration betrugen [P] 100 μm und die Temperatur 25°C.
5. Kinetik der Calciumdissoziation von Subtilisin S11 als Funktion der Temperatur. 1 μmM Subtilisin S11 wurde zu 10 μM Quin2 zum Zeitpunkt 0 gegeben. Calcium dissoziiert von Subtilisin und bindet an Quin2 bis ein neues Gleichgewicht erreicht ist. Die Geschwindigkeit der Calciumdissoziation wird anhand der Zunahme der Fluoreszenz von Quin2 bei Bindung an Calcium verfolgt.

A. Der Logarithmus des prozentualen Anteils des an Calcium gebundenen Proteins wird gegen die Zeit aufgetragen. Die Kinetik der Dissoziation ist bei vier Temperaturen dargestellt. Die Dissoziation folgt einer Kinetik 1. Ordnung für die ersten 25% der Reaktion. Da dies deutlich vor Erreichen des Gleichgewichtszustands ist, kann eine Reassoziation von Calcium vernachlässigt werden.
B. Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeit der Calciumdissoziation von S15-Subtilisin in Gegenwart von überschüssigem Quin2, pH-Wert 7,4, über einen Temperaturbereich von 25–45°C. Der natürliche Logarithmus der Gleichgewichtskonstanten für den Übergangszustand (berechnet aus der Eyring-Gleichung) wird gegen den Kehrwert der absoluten Temperatur aufgetragen. Die Linie wird an die Gleichung (3) im Text mit T₀ = 298 K angepasst.

6. Analyse der Subtilisin-Auffaltung bei Überwachung durch Zirkulardichroismus (CD).

A. Folgende CD-Spektren werden für S15 dargestellt: (1) S15 in 25 mM H₃PO₄ beim pH-Wert 1,85; (2) S15, denaturiert beim pH-Wert 1,85 und anschließend durch Zugabe von NaOH auf den pH-Wert 7,5 neutralisiert; (3) S15, denaturiert beim pH-Wert 1,85 und anschließend auf den pH-Wert 7,5 neutralisiert, 30 Minuten nach Zugabe von KCl in einer Konzentration von 0,6 M; und (4) natives S15-Subtilisin. Die Proteinkonzentrationen betrugen in sämtlichen Proben 1 μM.
B. Kinetik der Auffaltung von S15. Proben wurden beim pH-Wert 1,85 denaturiert und anschließend auf den pH-Wert 7,5 eingestellt. Zum Zeitpunkt 0 wurde das denaturierte Protein mit KCl versetzt. Die Wiederherstellung der nativen Struktur wurde bei 222 nm bei KCl-Konzentrationen von 0,3 M und 0,6 M verfolgt. Die 0,6 M-Probe 30 Minuten nach der Auffaltung wurde sodann zur Aufzeichnung des entsprechenden Spektrums in Teil A verwendet.

7. Kinetik der Auffaltung von S15 als Funktion der Ionenstärke.

A. Der Logarithmus des prozentualen Anteils von aufgefaltetem Protein wird gegen die Zeit aufgetragen. Die Kinetik der Auffaltung ist bei vier Ionenstärken dargestellt. Der Betrag der Auffaltung wurde durch Zirkulardichroismus (CD) aus dem Anstieg der negativen Elliptizität bei 222 nm bestimmt. Eine 100%ige Auffaltung wird aus dem Signal bei 222 nm für natives S15 bei der gleichen Konzentration bestimmt und die 0%ige Auffaltung wird aus dem Signal für säuredenaturiertes S15 bestimmt. Die Rückfaltung folgt in etwa einer Kinetik 1. Ordnung für die ersten 90% der Reaktion. Die Rückfaltung wurde bei 25°C durchgeführt.
B. Der Logarithmus der 1. Ordnung-Geschwindigkeitskonstanten für die Rückfaltung, die durch CD- oder Fluoreszenzmessungen bei 25°C erhalten worden waren, wurden als Funktion des Logarithmus der Ionenstärke aufgetragen. Die Ionenstärke variierte von I = 0,25 bis I = 1,5. Die Geschwindigkeit der Rückfaltung steigt linear mit dem Logarithmus l. Eine 10-fache Zunahme von l ergibt eine etwa 90-fache Zunahme der Rückfaltungsgeschwindigkeit.

8. Temperaturabhängigkeit der Rückfaltungsgeschwindigkeit von S15-Subtilisin in 0,6 M KCl, 23 nM KPO₄, pH-Wert 7,3. Der natürliche Logarithmus der Gleichgewichtskonstanten für den Übergangszustand (berechnet aus der Eyring-Gleichung) wird gegen den Kehrwert der absoluten Temperatur aufgetragen. Die Linie wird an die Gleichung 3 im Text bei T₀ = 298 K angepasst.
9. Röntgenkristallstruktur der Region mit schwacher Ionenbindung von S15-Subtilisin. Koordinationsbindungen sind als gestrichelte Linien dargestellt. Geladene Aminosäuren überwiegen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wie vorstehend erörtert, trägt die Calciumbindung in wesentlichem Umfang zur thermodynamischen und kinetischen Stabilität von extrazellulären mikrobiellen Proteasen bei. Außerdem können bei Subtilisin hohe Aktivierungsbarrieren gegen eine Auffaltung von wesentlicher Bedeutung sein, um die native Konformation aufrechtzuerhalten und eine vorübergehende Auffaltung und Proteolyse, die in einer mit Protease gefüllten Umgebung, in der Subtilisin sezerniert wird und sich eine Autodegradation ergibt, gegeben ist, zu verhindern. Die Auffaltungsreaktion von Subtilisin lässt sich in die beiden folgenden Abschnitte einteilen: N(Ca)↔N↔U wobei N(Ca) die native Form von Subtilisin bedeutet, bei der Calcium an die Calciumbindungsstelle A von hoher Affinität gebunden ist (Finzel et al., J. Cell. Biochem. Suppl., Bd. 10A (1986), S. 272; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 8311–8317; McPhalen et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 6582– 6598); N das gefaltete Protein ohne gebundenes Calcium bedeutet; und U das aufgefaltete Protein bedeutet. Subtilisin ist ein relativ stabiles Protein, dessen Stabilität großenteils durch die Calciumstelle von hoher Affinität vermittelt wird (Voordouw et al., Biochemistry, Bd. 15 (1976), S. 3716–3724; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 8311–8317). Die Schmelztemperatur von Subtilisin beim pH-Wert 8,0 in Gegenwart von mikromolaren Konzentrationen von Calcium beträgt etwa 75°C und in Gegenwart von überschüssigem EDTA etwa 56°C (Takehashi et al., Biochemistry, Bd. 20 (1981), S. 6185–6190; Bryan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986b), S. 3743–3745). Frühere kalorimetrische Untersuchungen der calciumfreien Form von Subtilisin (Apoenzym, d. h. Proteinteil des Enzyms) zeigten, dass diese Form bei 25°C nur eine unbedeutende Stabilität mit einem ΔG-Wert der Auffaltung von < 5 kcal/mol aufweist (Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 7205–7213). Da Calcium somit ein integrierender Bestandteil der Subtilisin-Struktur ist, wird angenommen, dass das Apoenzym ein Faltungszwischenprodukt von Subtilisin ist.
In einer Studie zur unabhängigen Prüfung der beiden Phasen des Faltungsvorgangs wurde eine Reihe von mutanten Subtilisinen konstruiert. Zunächst wurde die gesamte proteolytische Aktivität beseitigt, um das Auftreten einer Autodegradation während der Auffaltungs- und Rückfaltungsreaktionen zu verhindern. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem man das Serin 221 am aktiven Zentrum in Cystein umwandelt (Die S 221 A-Mutante wurde ursprünglich für diesen Zweck konstruiert. Die reife Form dieser Mutante war jedoch am N-Terminus heterogen, was vermutlich auf eine gewisse fehlerhafte Prozessierung des Proenzyms zurückzuführen war.) Diese Mutation weist nur einen geringen Einfluss auf die thermische Denaturierungstemperatur von Subtilisin auf, verringert aber die Peptidase-Aktivität von Subtilisin um einen Faktor von etwa 3 × 10⁴ (Abrahmsen et al., Biochemistry, Bd. 30 (1991), S. 4151–4159). Diese Mutante ermöglicht somit die Untersuchung der Faltung von Subtilisin ohne die Komplikationen mit der Proteolyse. In der vorliegenden Beschreibung bedient man sich für die Kurzbezeichnung der Aminosäuresubstitutionen des einbuchstabigen Aminosäurecodes der zu substituierenden Aminosäure, wonach sich die Nummer zur Bezeichnung der Position in der Aminosäuresequenz, wo die Substitution vorgenommen wird, anschließt und schließlich der einbuchstabige Code für die zu inserierende Aminosäure folgt. Beispielsweise bezeichnet S221 C die Substitution des Serin 221 durch Cystein. Die Subtilisin-Mutante mit dieser einzigen Aminosäuresubstitution wird mit Subtilisin S221 C bezeichnet. Die erhaltene S221C-Subtilisin-Mutante erhält die Bezeichnung S1.
Das Subtilisin kann weiter mutiert werden, um das relativ instabile Apoenzym leichter herstellen und reinigen zu können. Versionen von S1 mit drei oder vier zusätzlichen Mutationen, z. B. M50F, Q206I, Y217K und N218S können ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren herangezogen werden. Derartige weitere Mutationen erhöhen in kumulativer Weise die freie Energie der Auffaltung um 3,0 kcal/mol und erhöhen die Wärmedenaturierungstemperatur des Apoenzyms um 11,5°C (Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 7205–7213). Die Mutante, die die M50F-, Q206I-, Y217K-, N218S- und S221C-Mutationen enthält, wird mit S11 bezeichnet und die Mutante mit M50F, Y217K, N218S und S221C wird mit S12 bezeichnet (Die spezifischen Aktivitäten von S11, S12 und S15 gegenüber dem synthetischen Substrat SAAPFna sind gleich (S.A. = 0,0024 U/mg bei 25°C, pH-Wert 8,0). Diese Messungen wurden mit einem Protein durchgeführt, das frisch an einer Quecksilber-Affinitätssäule gereinigt worden war.)
Um ein Subtilisin BPN'-Protein ohne Calciumbindungsaktivität herzustellen, trafen die Erfinder die Wahl, die Bindungsschleife in der Calcium A-Stelle zu deletieren, um ein neuartiges, calciumfreies Subtilisin-Protein zu bauen. Diese Schleife umfasst eine Unterbrechung in der Subtilisin BPN'-α-Helix, an der die Aminosäuren 63-85 von SEQ ID NO: 1 beteiligt sind (McPhalen und James, 1988). Die Reste 75-83 des Subtilisin BPN'-Proteins bilden eine Schleife, die die letzte Windung der α-Helix mit 14 Resten unter Beteiligung der Aminosäuren 63-85 unterbricht (SEQ ID NO: 1). (Dieser Satz von neun Resten wurde für die Deletion ausgewählt, und nicht die Reste 74-82 (die tatsächlich zur Schleife gehören), die wegen Ala 74 anstelle von Gly 83 in der sich ergebenden kontinuierlichen Helix nicht bevorzugt sind. Alanin zeigt eine höhere statistische Wahrscheinlichkeit für sein Auftreten in einer α-Helix, was darauf zurückzuführen ist, dass Glycin einen breiteren Bereich für zugängliche Gerüstkonformationen bietet.) Vier der Carbonyl-Sauerstoffliganden für das Calcium werden von einer Schleife, die aus den Aminosäuren 75-83 zusammengesetzt ist, bereitgestellt (SEQ ID NO: 1). Die Geometrie der Liganden entspricht einer pentagonalen Bipyramide, deren Achse durch die Carbonylgruppen der Aminosäuren 75 und 79 läuft. Eine Seite der Schleife ist der zweizähnige Carboxylatrest (D41), während sich auf der anderen Seite der N-Terminus des Proteins und die Seitenkette von Q2 befinden. Die sieben Koordinationsabstände liegen im Bereich von 2,3 bis 2,6 Å, wobei das Aspartyl-Carboxylat den kürzesten Abstand zeigt. Drei Wasserstoffbrückenbindungen verknüpfen das N-terminate Segment mit den Schleifenresten 78-82 in einer parallelen beta-Anordnung. Eine Calciumbindungsstelle von hoher Affinität stellt ein gemeinsames Merkmal von Subtilisinen dar, wobei diese Stelle einen großen Beitrag zu ihrer hohen Stabilität leistet. Durch Bindung an spezifischen Stellen in der Subtilisin-Tertiärstruktur trägt Calcium mit seiner freien Bindungsenergie zur Stabilität des nativen Zustands bei. Erfindungsgemäß wurde eine positionsgerichtete Mutagenese dazu herangezogen, die Aminosäuren 75-83 von SEQ ID NO: 1 zu deletieren, wodurch eine ununterbrochene Helix entsteht und das Calcium-Bindungspotential an der Stelle A beseitigt wird (1A und 1B).
Die Erfinder nehmen an, dass eine Stabilisierungsstrategie auf der Grundlage der Calciumbindung ein Überleben in der extrazellulären Umgebung ermöglicht. Da die meisten gewerblichen Anwendungen von Subtilisinen in Umgebungen erfolgen, die hohe Konzentrationen an Metall-Chelatbildnern enthalten, war es für die Erfinder von großer praktischer Bedeutung, ein stabiles Subtilisin zu erzeugen, das von Calcium unabhängig ist und daher durch die Anwesenheit von Metall-Chelatbildnern nicht beeinflusst wird.
Obgleich die Erfinder die Möglichkeit wählten, die Calciumbindung durch Entfernung dieser Aminosäuren zu beseitigen, sollte es möglich sein, die Calciumbindung auch durch andere Mutationen zu beseitigen, z. B. durch Substitution von einer oder mehreren der Aminosäuren in den Positionen 75-83 durch alternative Aminosäuren und durch Insertion, Substitution und/oder Deletion von Aminosäuren in der Nähe der Positionen 75-83. Dies kann ebenfalls durch eine positionsspezifische Mutagenese erfolgen.
Da ferner diese Schleife ein gemeinsames Merkmal von Subtilisinen ist, wird erwartet, dass gleichwertige Mutationen für andere Subtilisine, insbesondere für Subtilasen der Klasse I, z. B. durch positionsspezifische Mutagenese gleichermaßen die Calciumbindung beseitigen und enzymatisch aktive Mutanten liefern.
Insbesondere synthetisierten die Erfinder durch positionsspezifische Mutagenese drei Subtilisin BPN'-DNA's, die so mutiert wurden, dass die Aminosäuren 75-83, die an der Calciumbindung beteiligt sind, mutiert sind und die zusätzliche Substitutionsmutationen umfassen. Diese mutierten Subtilisin BPN'-DNA's liefern bei Expression der DNA Subtilisin-Proteine mit erhöhter Wärmestabilität und/oder Beständigkeit gegen Proteolyse.
Die synthetisierten spezifischen Subtilisin BPN'-Mutanten werden in der vorliegenden Anmeldung mit S15, S39 (Mutanten von geringer Aktivität), S46, S47, S68, S73, S79 und S86 (erfindungsgemäße aktive Mutanten) bezeichnet. Die in der vorliegenden Anmeldung angegebenen spezifischen Punktmutationen identifizieren die speziellen Aminosäuren in der Subtilisin BPN'-Aminosäuresequenz gemäß Darstellung in SEQ ID NO: 1, die erfindungsgemäß mutiert worden sind. Beispielsweise umfasst die S15-Mutante eine Deletion der Aminosäuren 75-83 und zusätzlich die folgenden Substitutionsmutationen: S221C, N218S, M50F und Y217K. Die S39-Mutante umfasst gleichermaßen eine Deletion der Aminosäuren 75-83 und zusätzlich die folgenden Substitutionsmutationen: S221 C, P5A, N218S, M50F und Y217K. Die S46-Mutante umfasst eine Deletion der Aminosäuren 75-83 und zusätzlich die folgenden Substitutionsmutationen: M50F, Y217K und N218S. Die S47-Mutante umfasst gleichermaßen eine Deletion der Aminosäuren 75-83 und zusätzlich die folgenden Substitutionsmutationen: P5A, N218S, M50F und Y217K. Die S68-Mutante umfasst eine Deletion der Aminosäuren 75-83 und zusätzlich die folgenden Substitutionsmutationen: P5S, N218S, M50F und Y217K. Die S73-Mutante umfasst eine Deletion der Aminosäuren 75-83 sowie die folgenden Substitutionsmutationen: Q2K, M50F, A73L, Q206V, Y217K und N218S. Die S79-Mutante umfasst eine Deletion der Aminosäuren 75-83 und zusätzlich die folgenden Substitutionsmutationen: Q2K, M50F, A73L, Q206C, Y217K und N218S. Schließlich umfasst die S86-Mutante eine Deletion der Aminosäuren 75-83 sowie die folgenden Substitutionsmutationen: Q2K, S3C, M50F, A73L, Q206C, Y217K und N218S. Die spezifischen Aktivitäten der proteolytisch aktiven S46-, S47-, S68-, S73-, S79- und S86-Subtilisine waren im Vergleich zum Wildtyp-Enzym ähnlich oder erhöht.
Die verschiedenen Δ75-83-Subtilisine, die von den Erfindern synthetisiert wurden, sind in der nachstehenden Tabelle I aufgeführt. Die speziellen Punkte der Mutation in der Aminosäuresequenz von Subtilisin BPN' gemäß Darstellung in SEQ ID NO: 1 sind identifiziert. Die Synthese dieser Mutanten wird nachstehend ausführlich beschrieben.
Um den Beitrag der Calcium-Bindung zur Stabilität von Subtilisin kennen zu lernen, wurden die Thermodynamik und die Kinetik der Calcium-Bindung der Calcium A-Stelle von hoher Affinität durch Mikrokalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Die Calcium-Bindung stellt einen von der Enthalpie getriebenen Vorgang mit einer Assoziationskonstanten (K_a) von 7 × 10⁶ M^–1 dar. Die kinetische Barriere zur Entfernung von Calcium von der A-Stelle (23 kcal/mol) ist erheblich größer als die übliche freie Bindungsenergie (9,3 kcal/mol). Die Kinetik der Calcium-Dissoziation von Subtilisin (z. B. bei einem Überschuss von EDTA) ist demzufolge sehr langsam. Beispielsweise beträgt die Halbwertszeit (t_1l2) der Calcium-Dissoziation von Subtilisin, d. h. die Zeitspanne, bis die Hälfte des Calciums von Subtilisin dissoziiert, bei 25°C 1,3 Stunden.
Die Röntgenkristallographie zeigt, dass, abgesehen von der Region der deletierten Calcium-Bindungsschleife, die Strukturen der Subtilisin-Mutanten und des Wildtyp-Proteins sehr ähnlich sind. Der N-Terminus des Wildtyp-Proteins liegt neben der Schleife der Stelle A und liefert einen Calcium-Koordinationsliganden, den Seitenketten-Sauerstoff von Q2. Bei Δ75-83-Subtilisin ist die Schleife beseitigt, wobei die Reste 1-4 ungeordnet zurückbleiben. Diese ersten vier Reste sind in der Röntgenstruktur ungeordnet, da alle ihre Wechselwirkungen mit der Calcium-Schleife erfolgten. Die N-terminate Sequenzierung bestätigt, dass die ersten vier Aminosäuren vorhanden sind, was bestätigt, dass die Prozessierung an der normalen Stelle erfolgt. Die Helix erweist sich als ununterbrochen und zeigt über ihre gesamte Länge hinweg eine normale helikale Geometrie. Die Röntgenkristallographie zeigt ferner, dass die Strukturen von Subtilisin mit und ohne die Deletion sich mit einem quadratischen Mittelwert (r. m. s.) der Differenz zwischen den Positionen von 261 α-Kohlenstoff von 0,17 Å überlagern und angesichts der Größe der Deletion von bemerkenswerter Ähnlichkeit sind. Eine diffuse Differenzdichte und höhere Temperaturfaktoren geben jedoch einen Hinweis auf eine gewisse Unordnung in den nunmehr exponierten Resten neben der Deletion.
Obgleich die Beseitigung der Calcium-Bindung vorteilhaft ist, da sie Proteine erzeugt, die in Gegenwart von Metall-Chelatbildnern stabiler sind, erweist sie sich in mindestens einer Hinsicht als nachteilig. Die Beseitigung der Calcium-Schleife ohne irgendwelche anderen ausgleichenden Mutationen führt nämlich zu einer Destabilisierung des nativen Zustands im Vergleich zu partiell gefalteten Zuständen und daher zu einem Verlust der Kooperativität bei der Faltung. Die Erfinder waren daher bestrebt, das Subtilisin S15 BPN'-Protein, dem die Aminosäuren 75-83 fehlen, weiter gentechnisch zu bearbeiten, um die Kooperativität bei der Faltungsreaktion wieder herzustellen. Bei den meisten gut konzipierten Proteinen sind sämtliche Teile des Moleküls voneinander abhängig, was eine hohe Kooperativität der Auffaltungsreaktion bewirkt. Die Kooperativität der Auffaltungsreaktion ermöglicht es den Proteinen, ausreichende Stabilitäten des nativen Zustands zu erreichen, um eine einwandfreie Funktion auszuüben, da die Gesamtstabilität der nativen Konformation grob der Summe sämtlicher lokalen Wechselwirkungen entspricht.
Obgleich somit Δ75-83-Subtilisin ein Beispiel für ein manipuliertes Subtilisin ist, das in Abwesenheit von Calcium aktiv und stabil ist, haben die Erfinder versucht, dieses Protein durch weitere Mutation zu verbessern. Die Konstruktion eines besonders hochgradig stabilen, calciumfreien Subtilisins stützt sich auf einen iterativen Manipulationszyklus. Die Erfinder haben festgestellt, dass die notwendige erste Stufe im Zyklus in einer starken Verringerung der proteolytischen Aktivität von Subtilisin bestand. Dies ist erforderlich, da Calcium in hohem Maße zur Konformationsstabilität von Subtilisin beiträgt und die frühen Versionen von calciumfreien Subtilisin gegenüber einer Proteolyse empfindlich sind. Nach Verringerung der Empfindlichkeit gegen eine Proteolyse bestand die nächste Stufe im Zyklus in der Beseitigung von Sequenzen, die für die Calcium-Bindung wesentlich sind, d. h. der A-Stelle. Obgleich das S15 Δ75-83-Subtilisin im Vergleich zum Wildtyp-Subtilisin in Gegenwart von Calcium eine wesentlich geringere Stabilität zeigt, ist diese Mutante stabiler als Wildtyp-Subtilisin in Gegenwart des Metall-Chelatbildners EDTA.
Demzufolge bestand die dritte Stufe in einer Verbesserung der Stabilität des calciumfreien Subtilisin-Proteins. Zur Verbesserung der Stabilität von calciumfreiem Subtilisin versuchten die Erfinder anschließend einen Ort für die Aufnahme der ungeordneten N-terminalen Reste zu schaffen. Um ein hochgradig stabiles, calciumfreies Subtilisin zu erzeugen, kann der N-terminale Teil des Proteins, der durch die Deletion der Calcium A-Schleife destabilisiert ist, modifiziert werden. Beispielsweise kann der N-Terminus, der ungeordnet ist, deletiert oder erweitert werden. Dies ist jedoch problematisch, da die Anforderungen für die Prozessierung des Propeptids aus dem reifen Protein nicht bekannt sind. Es ist jedoch bekannt, dass die Prozessierungsstelle nicht durch die Aminosäuresequenz festgelegt wird, da bei den Mutanten Y1A (der C-Terminus des Propeptids), A1C und Q2R die Spaltungsstelle nicht verändert ist. Ferner ist bekannt, dass die native Struktur des N-Terminus in Subtilisin nicht die Spaltungsstelle festlegt, da die Δ75-83-Varianten korrekt prozessiert werden. Da noch nicht bekannt ist, wie die Prozessierungsstelle zu verändern ist, können Wechselwirkungen mit dem vorhandenen N-Terminus optimiert werden.
Eine Prüfung der Struktur von S15-Subtilisin ergab zahlreiche Möglichkeiten für eine Verbesserung der Stabilität des mutanten Enzyms. Die Regionen der Struktur, die durch die Deletion am meisten betroffen sind, sind die N-terminalen Aminosäuren 1-8, die 36-45-ω-Schleife, die 70-74-α-Helix, die 84-89-Helixwindung und das 202-219-β-Band. Wie vorstehend ausgeführt, sind die ersten vier Reste in Δ75-83-Subtilisin in der Röntgenstruktur ungeordnet, da alle seine Wechselwirkungen mit der Calcium-Schleife erfolgten. Eine N-terminale Sequenzierung zeigt jedoch, dass die ersten vier Aminosäuren vorhanden sind, was bestätigt, dass die Prozessierung an der normalen Stelle erfolgt. Abgesehen von N-Terminus gibt es drei weitere Reste, deren Seitenkettenkonformationen sich deutlich vom Wildtyp unterscheiden. Y6 schwingt aus einer Oberflächennische in eine stärker gegenüber dem Lösungsmittel exponierte Position, was ein indirekter Einfluss der Destabilisierung des N-Terminus ist. D41, ein früherer Calcium-Ligand, und Y214 unterliegen einer koordinierten Umordnung unter Ausbildung einer neuen Wasserstoffbrückenbindung. Die B-Faktoren aller drei Reste steigen aufgrund der Deletion der Aminosäuren 75-83 deutlich an. Ferner verändern S87 und A88 die Konformation nicht, weisen aber erheblich erhöhte B-Faktoren auf. P86 schließt die α-Helix ab, aus der die Calcium-Schleife deletiert worden ist. Angesichts dieses Sachverhalts ergeben weitere Mutationen an einer oder mehreren der vorerwähnten Stellen oder an den hierzu benachbarten Aminosäuren Subtilisin BPN'-Mutanten, die eine größere enzymatische Aktivität oder eine erhöhte Stabilität aufweisen.
Es gibt mehrere logische Strategien zur Remodellierung dieser Region des Proteins, um Subtilisin BPN'-Mutanten zu erzeugen, die eine höhere enzymatische Aktivität oder eine erhöhte Stabilität aufweisen. Da die N-terminalen vier Aminosäuren in der Röntgenstruktur ungeordnet sind, besteht ein möglicher Weg darin, sie aus dem Protein zu deletieren. Die Erfordernisse für eine Prozessierung des Propeptids aus dem reifen Protein sind jedoch nicht bekannt. Eine Insertion oder eine Deletion von Aminosäuren aus der N-terminalen Region ist daher problematisch. Aus diesem Grund wurden Insertionen und Deletionen in der N-terminalen Region zu Gunsten von Aminosäuresubstitutionen vermieden. Von zahlreichen der ursprünglichen Aminosäuren in den vorstehend beschriebenen Regionen von Subtilisin, die mit den Aminosäuren 75-83 der Schleife in Wechselwirkung traten, kann angenommen werden, dass sie nicht mehr optimal sind. Es war daher möglich, die Stabilität des Moleküls zu erhöhen, indem man mindestens eine Aminosäure in den Positionen, deren Umgebung durch die 75-83-Deletion verändert worden war, substituierte, deletierte oder addierte.
Der erste Versuch bestand in einer Mutation des Prolins in Position 5 zu Alanin, um in Position 5 eine höhere Flexibilität zu erzeugen. Diese erhöhte Flexibilität ermöglicht es dem N-Terminus, versuchsweise eine besondere Position entlang der neuen Oberfläche des Proteins, die durch die Deletion der Calcium-Schleife entstanden ist, zu finden. Nachdem der N-Terminus eine besondere Position angenommen hat, können seine lokalen Wechselwirkungen im Anschluss daran optimiert werden.
Die P5A-Mutation wurde durchgeführt, um versuchsweise eine höhere Flexibilität für den N-Terminus zu erzeugen und ihm das Auffinden einer besonderen Position entlang der neuen Oberfläche des Proteins, die durch die Deletion der Calciumschleife entstanden war, zu ermöglichen. In der nativen Struktur befinden sich die ersten 5 Aminosäuren in einer ausgebreiteten Konformation und bilden β-Paar-Wasserstoffbrückenbindungen mit der Calciumschleife sowie eine Q2-Seitenketten-Wechselwirkung mit dem Calcium. Das Prolin in Position 5, das bei sieben bakteriellen Subtilisinen, die eine homologe Calcium A-Stelle aufweisen, konserviert ist, kann die Stabilisierung der ausgebreiteten Konformation unterstützen. Die P5A-Mutation in Δ75-83-Subtilisin sollte somit zu einer Erhöhung der Kooperativität der Auffaltungsreaktion führen. Die Röntgenstruktur dieser Variante wurde mit 1,8 Å bestimmt.
Insgesamt wählten die Erfinder Aminosäuren an zehn verschiedenen Positionen, deren Umgebung sich wesentlich geändert hatte, für die Substitution aus. Ein Mutagenese- und Screening-Verfahren wurde entwickelt, um sämtliche möglichen Substitutionen an einer bestimmten Stelle einem Screening zu unterwerfen. Die Technik zur Erzeugung und zum Screening von Subtilisin-Varianten beinhaltet die in vitro-Mutagenese des klonierten Subtilisin-Gens, die Expression der mutierten Gene in B. subtilis und das Screening auf eine erhöhte Stabilität.
Beispielsweise wurde eine positionsgerichtete Mutagenese am S46-Subtilisin-Gen unter Verwendung von Oligonucleotiden, die an einem Codon degeneriert waren, durchgeführt. Das degenerierte Codon enthielt sämtliche Kombinationen der Sequenz NNB, wobei N eines der vier Nucleotide bedeutet und B die Bedeutung T, C oder G hat. Die in dieser Population wiedergegebenen 48 Codons kodieren für sämtliche 20 Aminosäuren, schließen jedoch die "ochre"- und "umber"-Terminationscodons aus. Die mutagenisierten Gene wurden zur Transformation von B. subtilis verwendet. Beispiele für spezielle Mutationen sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.
Um eine 98%ige Chance zum Auffinden von Tryptophan, Glutamin, Glutamat oder Methionin in der mutanten Population zu haben, muss man etwa 200 mutante Klone absuchen. Jedes dieser Codons wird durch nur eines der 48 Codons, die in der Population von NNB-Sequenzen enthalten sind, repräsentiert. Codons für sämtliche übrigen Aminosäuren werden durch mindestens zwei Codons in der Population repräsentiert und würden ein Screening von etwa 100 mutanten Klonen benötigen, um eine 98%ige Chance für die Repräsentation in der mutanten Population zu haben.
Um die optimale Aminosäure an einer Position zu identifizieren, wurden Mutanten auf die Retention der enzymatischen Aktivität bei hohen Temperaturen abgesucht. In jede der 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden 100 μl Medium gegeben. Die einzelnen Vertiefungen wurden mit einer Bacillus-Transformante inokuliert und unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nach 18-stündigem Wachstum wurden 20 μl Kultur in einer zweiten Mikrotiterplatte mit 80 μl 100 mM Tris-HCl vom pH-Wert 8,0 verdünnt. Diese Platte wurde sodann 1 Stunde bei 65°C inkubiert. Anschließend ließ man die Platte auf Raumtemperatur abkühlen, wonach sich eine Inkubation bei hoher Temperatur anschloss. Sodann wurden 100 μl 1 mM SAAPF-pNA in jede Vertiefung gegeben. Es wurde angenommen, dass die Vertiefungen, bei denen das pNA (Gelbfärbung) am raschesten gespalten wurde, die wärmebeständigste Subtilisin-Mutante enthielten. Nachdem eine vorläufige Identifizierung einer stabilen Mutante in der zweiten Mikrotiterplatte vorgenommen worden war, wurde der Bacillus-Klon in der entsprechenden Vertiefung in der ersten Mikrotiterplatte für eine weitere Analyse gezüchtet.
Das Screening-Verfahren identifizierte stabilisierende Mutationen an sieben der zehn Positionen, die untersucht worden waren. Wie erwähnt, wurden diese Aminosäurepositionen an Positionen des Proteins ausgewählt, deren Umgebung aufgrund der Deletion der Calciumdomäne sich wesentlich verändert hatte. Keine Mutationen wurden in den Positionen 4, 74 und 214 identifiziert, die von sich aus in erheblichem Maße die Halbwertszeit der Mutante im Vergleich zum Ausgangssubtilisin erhöhten. Jedoch wurde in Position 214 nur der Einfluss von hydrophoben Aminosäuren einem Screening unterworfen. Es wurden keine Mutationen in den Positionen 5, 41 und 43 gefunden, die zu einer messbaren, jedoch mäßigen Zunahme der Stabilität führten. Außerdem wurden mehrere Mutationen in den Positionen 2, 3, 73 und 206 gefunden, die in signifikanter Weise die Halbwertszeit der Mutante relativ zum Ausgangssubtilisin erhöhten. Diese stabilisierenden Mutationen sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.
Tabelle III Stabilisierende Mutationen
Stabilisierende Aminosäuremodifikationen in den Positionen 2(K), 73(L) und 206(V) wurden sodann zur Erzeugung von Subtilisin S73 kombiniert. Die Eigenschaften von S73-Subtilisin sowie von S46, S79 und S86 sind in Tabelle IV zusammengestellt. Tabelle IV

1) Die Subtilisine S46, S73, S79 und S86 enthalten alle die Mutationen M50F, Y217K und N218S sowie Q271E.
2) Die spezifische Aktivität wird gegen Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid (SAAPF-pNA) in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, bei 25°C gemessen.
3) Die Halbwertszeit wird bei 60°C und 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 50 mM NaCl und 10 mM EDTA gemessen.
4) Nicht bestimmt.
5) Eine Disulfidbindung wurde zwischen den Cysteinen in den Positionen 3 und 206 gebildet. Die Bildung einer Disulfidbindung wurde durch Messen des Radius der Drehung des denaturierten Proteins aufgrund von Gelelektrophorese bestätigt.

In zahlreichen Fällen wird die Wahl einer Aminosäure in einer bestimmten Position durch die Aminosäuren in benachbarten Positionen beeinflusst. Um daher die besten Kombinationen und stabilisierenden Aminosäuren aufzufinden, ist es in einigen Fällen erforderlich, die Aminosäuren an zwei oder mehr Positionen gleichzeitig zu variieren. Insbesondere wurde dies in den Positionen 3 und 206 mit Aminosäuren durchgeführt, deren Seitenketten potentiell in Wechselwirkung treten können. Es wurde festgestellt, dass die beste Kombination von Modifikationen in Cystein-Modifikationen in den Positionen 3 und 206 bestand. Diese Modifikation wurde als S86 bezeichnet. Aufgrund der engen Nachbarschaft und der geeigneten Geometrie zwischen den Cysteinen in diesen beiden Positionen bildet sich spontan eine Disulfid-Vernetzung zwischen diesen beiden Resten.
Die Stabilität des S86-Subtilisins im Vergleich zu S73 wurde untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Halbwertszeit von S86 bei 60°C in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 50 mM NaCl und 10 mM EDTA 80 Minuten beträgt, was eine 3,2-fache Steigerung im Vergleich zu S73-Subtilisin bedeutet. Im Gegensatz dazu ist eine 3-206-Disulfidvernetzung nicht zur Bildung von nativen Subtilisinen befähigt, die die Calcium A-Stelle enthalten, da die 75-83-Bindungsschleife die N-terminalen Aminosäuren vom 202-219-β-Band trennt. Daher wird die Verstärkung der Stabilität, die in der erfindungsgemäßen S86-Mutante ohne die 75-83-Bindungsschleife auftritt, vermutlich nicht bei nativen Subtilisinen beobachtet, bei denen in ähnlicher Weise das Cystein in diesen Positionen modifiziert ist.
Es ist zu erwarten, dass eine ähnliche Verstärkung der Stabilität bei anderen Subtilisinen der I-S1- und I-S2-Gruppe gegeben ist, wenn ihre Calciumschleifen deletiert werden (vergl. Siezen et al., Protein Engineering, Bd. 4, S. 719–737, 7). Diese Erwartung ist vernünftig aufgrund der Tatsache, dass die primäre Calciumstelle in diesen unterschiedlichen Subtilisinen aus fast identischen Schleifen mit neun Resten, die in identischer Position der Helix C enthalten sind, gebildet wird.
Röntgenstrukturen der I-S1-Subtilisine BPN und Carlsberg sowie von I-S2-Subtilisin (Savinase) wurden mit hoher Auflösung ermittelt. Ein Vergleich dieser Strukturen zeigt, dass alle drei fast identische Calcium A-Stellen aufweisen.
Die Röntgenstruktur der Subtilase der Klasse I, nämlich Thermitase aus Thermoactinomyces vulgaris, ist ebenfalls bekannt. Obgleich die Gesamthomologie von BPN' mit Thermitase wesentlich kleiner ist als die Homologie von BPN' mit I-S1- und I-S2-Subtilisinen, wurde gezeigt, dass Thermitase eine analoge Calcium A-Stelle aufweist. Im Fall von Thermitase handelt es sich bei der Schleife um eine Unterbrechung mit 10 Resten an der identischen Stelle in der Helix C.
Somit ist zu erwarten, dass die stabilisierenden Mutationen, die hier beispielhaft aufgeführt werden, ähnliche günstige Eigenschaften auf die Stabilität der Versionen mit deletierter Calciumschleife von anderen Subtilasen der Klasse I ausüben.
Die Stabilität von S73-, S76- und S86-Subtilisinen im Vergleich zu S46-Subtilisin wurde verglichen, indem ihre Beständigkeit gegen eine Wärmeinaktivierung bei 60°C in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 50 mM NaCl und 10 mM EDTA gemessen wurde. Aliquotanteile wurden in zeitlichen Abständen entnommen und die in jedem Aliquotaneil verbleibende Aktivität wurde bestimmt. Unter diesen Bedingungen beträgt die Halbwertszeit von S46-Subtilisin 2,3 Minuten und die Halbwertszeit von S73 beträgt 25 Minuten (Tabelle IV).
Um andere Mutanten mit einer erhöhten Stabilität zu identifizieren, können beliebige Mutagenesetechniken, die dem Fachmann geläufig sind, herangezogen werden. Ein Beispiel für eine derartige Technik zum Erzeugen und zum Absuchen von Subtilisin-Varianten umfasst drei Stufen: 1) in vitro-Mutagenese des klonierten Subtilisin-Gens; 2) Expression von mutierten Genen in B. subtilis und 3) Screening auf erhöhte Stabilität. Das Schlüsselelement beim Verfahren der willkürlichen Mutagenese besteht in der Möglichkeit, eine große Anzahl von Varianten abzusuchen.
Obgleich eine willkürliche Mutagenese eingesetzt werden kann, ermöglicht es das vorstehend beschriebene Mutageneseverfahren, die Mutationen auf lokalisierte Regionen des Proteins (z. B. die N-terminale Region) zu richten. Wie vorstehend erwähnt, wurde festgestellt, dass die S46-, S47-, S68-, S73-, S79- und S86-Mutanten (die die aktive Stelle S221 umfassen) enzymatisch aktiv sind. Es ist zu erwarten, dass andere Substitutionen identifiziert werden können, die für eine gleichwertige oder eine noch höhere Stabilität und Aktivität sorgen.
Die Aktivitäten von Beispielen der calciumfreien Subtilisin-Mutanten der Erfindung gegenüber dem Substrat SAAPF-pNA in Tris-HCl, pH-Wert 8,0, bei 25°C sind in der folgenden Tabelle V aufgeführt. Tabelle V

1) Die Halbwertszeiten wurden für inaktive Subtilisine nicht bestimmt.

Wie vorstehend dargelegt, weisen die Subtilisin-Mutanten S46, S47, S68, S73, S79 und S86 im Vergleich zu Subtilisin BPN' eine erhöhte katalytische Aktivität auf. Veränderungen der katalytischen Wirksamkeit aufgrund der Deletion wurden nicht erwartet, und zwar aufgrund der Tatsache, dass das aktive Zentrum von Subtilisin räumlich getrennt von der Calcium A-Stelle ist.
Die Stabilität dieser mutanten Subtilisine wurden mit der Stabilität von nativem Subtilisin BPN' verglichen, indem ihre Beständigkeit gegen Wärmeinaktivierung gemessen wurde. Da die Stabilität der calciumfreien Subtilisin-Mutanten durch Metall-Chelatbildner unbeeinflusst bleiben sollte, wurde das Experiment mit 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 50 mM NaCl und 10 mM EDTA durchgeführt (die Assoziationskonstante von EDTA für Calcium beträgt 2 × 10⁸ M^–1). Die Proteine wurden in diesem Puffer gelöst und auf 55°C erwärmt. Aliquotanteile wurden in zeitlichen Abständen entnommen und die in den einzelnen Aliquotanteilen verbleibende Aktivität wurde bestimmt. Unter diesen Bedingungen erwies sich die Halbwertszeit der Subtilisin-Mutanten im Vergleich zu der von Subtilisin BPN' erheblich verbessert. Diese Ergebnisse zeigen, dass Subtilisine, die zur Beseitigung der Calcium-Bindung an der Stelle A mutiert worden sind, die volle katalytische Aktivität und eine im Vergleich zu Subtilisin BPN' verbesserte Stabilität in EDTA aufweisen. Ein vernünftiges Stabilitätsniveau in S46 wurde auch ohne zusätzliche Mutationen mit dem Ziel, verlorene Wechselwirkungen aufgrund der Deletion der Aminosäuren 75-83 auszugleichen, erreicht.
Somit haben die Erfinder überzeugend nachgewiesen, dass sich Subtilisin-Mutanten erhalten lassen, die aktiv bleiben und doch Calcium nicht binden. Es ist aber zu erwarten, dass diese Mutanten in einem gewerblichen Umfeld, in dem chelatbildende Mittel enthalten sind, verwendet werden können. Obgleich dies speziell nur für Subtilisin BPN' gezeigt wurde, sollten gleichwertige Mutationen auch bei anderen Serin-proteasen möglich sein, insbesondere bei anderen I-S1- oder I-S2-Subtilisinen, und zwar aufgrund der Tatsache, dass diese Subtilisine eine erhebliche Sequenzähnlichkeit besitzen, insbesondere an der Calcium-Bindungsstelle.
Derartige Strategien können beispielsweise einen Vergleich der Sequenz von Subtilisin BPN' mit anderen Serin-proteasen umfassen, um die Aminosäuren zu identifizieren, von denen angenommen wird, dass sie für die Calcium-Bindung notwendig sind, wonach geeignete Modifikationen vorgenommen werden, z. B. durch positionsspezifische Mutagenese. Da zahlreiche Subtilisine mit Subtilisin BPN' nicht nur aufgrund ihrer primären Sequenzen und ihrer enzymologischen Eigenschaften, sondern auch aufgrund ihrer röntgenkristallographischen Daten verwandt sind, ist zu erwarten, dass andere aktive Subtilisin-Mutanten, bei denen die Calcium-Bindung fehlt, durch positionsspezifische Mutagenese erzeugt werden können. Beispielsweise gibt es strukturelle Beweise dafür, dass das homologe Enzym Subtilisin Carlsberg ebenfalls zwei Calcium-Bindungsstellen umfasst. Gleichermaßen ist die Röntgenstruktur von Thermitase bekannt, wobei dieses Subtilisin eine analoge Calcium A-Bindungsstelle wie Subtilisin BPN' aufweist. Für Thermitase handelt es sich bei der Calcium-Bindungsschleife um eine Unterbrechung mit 10 Resten an der identischen Stelle in der Helix C. Demgemäß sollten diese Enzyme den hier beschriebenen Mutationen zugänglich sein, bei denen die Calcium-Bindungsstelle beseitigt wird und ein stabiles, aktives Enzym erzeugt wird. Außerdem führten, wie vorstehend erörtert, Siezen et al. den Nachweis, dass die primäre Calcium-Bindungsstelle bei sämtlichen Subtilisinen in der Gruppe I-S1 und I-S2 aus fast identischen Schleifen mit neun Resten in der identischen Position der Helix C gebildet wird. Somit sollten in Anbetracht der fast identischen Strukturen der Calcium A-Stellen die hier beschriebenen Verfahren auf die meisten, wenn nicht auf alle Subtilisine in den Gruppen I-S1 und I-S2, die von Siezen et al. angegeben werden, anwendbar sein.
Alternativ wird dann, wenn die Aminosäuren, die die Calcium-Bindungsstellen umfassen, für ein bestimmtes Subtilisin bereits bekannt sind, die entsprechende DNA durch positionsspezifische Mutagenese mutiert, um eine oder mehrere Aminosäuren zu deletieren oder um Substitutions-, Deletions- oder Additionsmutationen bereitzustellen, die die Calcium-Bindung beseitigen.
Die vorliegenden mutanten Subtilisine werden im allgemeinen durch rekombinante Methoden hergestellt, insbesondere durch Expression einer Subtilisin-DNA, die so mutiert worden ist, dass sie bei Expression zu einem Subtilisin-Protein führt, das enzymatisch aktiv ist und das Calcium nicht bindet.
Vorzugsweise werden die Subtilisin-DNA's in mikrobiellen Wirtszellen, insbesondere in Bacillus subtilis exprimiert, da dieses Bakterium natürlicherweise Subtilisin erzeugt, einen wirksamen Sekretor von Proteinen darstellt und zur Erzeugung des Proteins in einer aktiven Konformation befähigt ist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Expression der Subtilisin-Mutante in Bacillus beschränkt, vielmehr umfasst sie die Expression in beliebigen Wirtszellen, die für die Expression der angestrebten Subtilisin-Mutanten sorgen. Geeignete Wirtszellen für die Expression sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise bakterielle Wirtszellen, wie Escherichia coli, Bacillus, Salmonella und Pseudomonas; Hefezellen, wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces, Candida und Schizosaccharomyces; und Säugetierwirtszellen, wie CHO-Zellen. Bakterielle Wirtszellen stellen jedoch die bevorzugten Wirtszellen für die Expression dar.
Die Expression von Subtilisin-DNA wird unter Verwendung verfügbarer Vektoren und regulatorischer Sequenzen erreicht. Die tatsächliche Wahl hängt großenteils von den speziellen Wirtszellen, die für die Expression eingesetzt werden, ab. Wenn beispielsweise die DNA der Subtilisin-Mutante in Bacillus exprimiert wird, wird im allgemeinen ein Bacillus-Promotor sowie ein von Bacillus abgeleiteter Vektor verwendet. Die Erfinder verwendeten im speziellen den Expressionsvektor auf der Basis von pUB110 und den nativen Promotor aus dem Subtilisin BPN'-Gen zur Steuerung der Expression in Bacillus subtilis.
Es ist ferner darauf hinzuweisen, dass dann, wenn die Aminosäuresequenz einer bestimmten Subtilisin-Mutante, die Calcium nicht bindet, aufgeklärt worden ist, es auch möglich ist, die Subtilisin-Mutante durch Proteinsynthese, z. B. durch die Merrifield-Synthese, herzustellen. Jedoch wird die Expression der Subtilisin-Mutanten in mikrobiellen Wirtszellen im allgemeinen bevorzugt, da es diese der mikrobiellen Wirtszelle erlaubt, das Subtilisin-Protein in einer für die enzymatische Aktivität geeigneten Konformation zu erzeugen. Jedoch sollte es aufgrund der Tatsache, dass die Erfinder hier eine Lehre zur Erzielung einer in vitro-Rückfaltung der Subtilisin-Mutante vermitteln, möglich sein, nicht richtig gefaltete Subtilisin-Mutanten in eine aktive Konformation überzuführen.
Zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung und ihrer Vorteile werden nachstehend spezielle Beispiele vorgelegt. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die Beispiele nur Erläuterungszwecken dienen und keinerlei Beschränkung darstellen.
Beispiele
Beispiel 1
Klonierung und Expression.
Das Subtilisin-Gen aus Bacillus amyloliquefaciens (Subtilisin BPN') wurde aus seinen natürlichen Promotorsequenzen in Bacillus subtilis kloniert, sequenziert und in hohen Konzentrationen exprimiert (Wells et al., Nucleic Acids Res., Bd. 11 (1983), S. 7911–7925; Vasantha et al., J. Bacteriol., Bd. 159 (1984), S. 811–819). Sämtliche mutanten Gene wurden in ein Expressionsplasmid auf der Basis von pUB110 rekloniert und zur Transformation von B. subtilis verwendet. Der als Wirt verwendete B. subtilis-Stamm enthält eine chromosomale Deletion seines Subtilisin-Gens und erzeugt daher keine Hintergrund-Wildtyp (wt)-Aktivität (Fahnestock et al., Appl. Environ. Microbiol., Bd. 53 (1987), S. 379–384). Eine Oligonucleotid-Mutagenese wurde gemäß Literaturangaben durchgeführt (Zoller et al., Methods Enzymol., Bd. 100 (1983), S. 468–500; Bryan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 83 (1986b), S. 3743–3745). S221C wurde in einem 1,5 Liter fassenden New Brunswick-Fermenter in einer Konzentration von etwa 100 mg der korrekt prozessierten reifen Form pro Liter exprimiert. Die Zugabe von Wildtyp-Subtilisin zur Förderung der Erzeugung der reifen Form von S221C-Subtilisin war bei unserem Bacillus-Wirtstamm nicht erforderlich, was aber bei früheren Stämmen der Fall war (Abrahmsen et al., Biochemistry, Bd. 30 (1991), S. 4151–4159).
Protein-Reinigung und -Charakterisierung.
Wildtyp-Subtilisin und die varianten Enzyme wurden im wesentlichen gemäß den nachstehenden Literaturangaben gereinigt und auf Homogenität geprüft; Bryan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 83 (1986b), S. 3743–3745; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 26 (1987), S. 2077–2082; und Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 8311–8317. In einigen Fällen wurden die mutanten C221-Subtilisine erneut an einer Sulfhydrylspezifischen Quecksilber-Affinitätssäule (Affi-gel 501, Biorad) gereinigt. Tests auf Peptidase-Aktivität wurden durchgeführt, indem die Hydrolyse von Succinyl-(L)-Ala-(L)-Ala-(L)-Pro-(L)-Phe-p-nitroanilid (nachstehend sAAPFna) gemäß den Angaben von DelMar et al., Anal Biochem., Bd. 99 (1979), S. 316–320, überwacht wurde. Die Proteinkonzentration [P] wurde unter Verwendung von P^0,1% = 1,17 bei 280 nm bestimmt (Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 7205–7213). Für Varianten, die die Y217K-Änderung enthalten, wurde der P^0,1% bei 280 nm zu 1,15 (oder 0,96 X wt) bestimmt, und zwar auf der Grundlage des Verlustes eines Tyr-Restes (Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 7205–7213).
N-terminale Analyse.
Die ersten fünf Aminosäuren von Subtilisin S15 wurden durch sequentiellen Edman-Abbau und HPLC-Analyse bestimmt. Dabei ergab sich, dass 100% des Materials die aus der DNA-Sequenz des Gens erwartete Aminosäuresequenz aufwiesen und dass die Prozessierung des Propeptids an der gleichen Position in der Sequenz für die Mutante wie für das Wildtyp-Enzym erfolgte.
Beispiel 2
Struktur der Calcium A-Stelle von S12-Subtilisin.
Calcium an der Stelle A ist mit 5 Carbonylsauerstoff-Liganden und einer Asparaginsäure koordiniert. Vier der Carbonylsauerstoff-Liganden am Calcium werden von einer Schleife, die aus den Aminosäuren 75-83 besteht, bereitgestellt (2). Die Geometrie der Liganden entspricht einer pentagonalen Bipyramide, deren Achse durch die Carbonylgruppen von 75 und 79 läuft. Auf einer Seite der Schleife befindet sich das zweizähnige Carboxylat (D41), während sich auf der anderen Seite der N-Terminus des Proteins und die Seitenkette von Q2 befinden. Die sieben Koordinationsabstände liegen im Bereich von 2,3 bis 2,6 Å, wobei der kürzeste Abstand für das Aspartylcarboxylat gilt. Drei Wasserstoffbrückenbindungen verknüpfen das N-terminale Segment mit den Schleifenresten 78-82 in einer parallelen beta-Anordnung.
Herstellung von Aposubtilisin.
S11- und S12-Subtilisin enthalten nach Reinigung eine gleiche molare Menge an fest gebundenem Calcium. Die Röntgenkristallographie hat gezeigt, dass dieses Calcium an die A-Stelle gebunden ist (Finzel et al., J. Cell. Biochem. Suppl., Bd. 10A (1986), S. 272; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 8311–8317; McPhalen et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 6582–6598).
Die vollständige Entfernung von Calcium aus Subtilisin erfolgt sehr langsam und erfordert eine 24-stündige Dialyse gegen EDTA bei 25°C, um das gesamte Calcium aus dem Protein zu entfernen und anschließend eine weitere Dialysezeit von 48 Stunden in einer hohen Salzkonzentration (Brown et al., Biochemistry, Bd. 16 (1977), S. 3883–3896) bei 4°C, um das gesamte EDTA aus dem Protein zu entfernen. Zur Herstellung der calciumfreien Form der Subtilisine S11 und S12 wurden 20 mg lyophilisiertes Protein in 5 ml 10 mM EDTA, 10 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid (nachstehend Tris-HCl), pH-Wert 7,5, gelöst und 24 Stunden gegen den gleichen Puffer bei 25°C dialysiert. Um das EDTA, das Subtilisin bei niedriger Ionenstärke bindet, zu entfernen, wurde das Protein sodann 2-mal gegen 2 Liter 0,9 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, bei 4°C für insgesamt 24 Stunden und sodann 3-mal gegen 2 Liter 2,5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, bei 4°C für insgesamt 24 Stunden dialysiert. Chelex 100 wurde sämtlichen Puffern, die kein EDTA enthielten, zugesetzt.
Wenn Versionen von C221-Subtilisin, die keine stabilisierenden Aminosäuresubstitutionen enthielten, verwendet wurden, wurden bis zu 50% des Proteins während dieses Vorgangs ausgefällt. Es ist wesentlich, reines natives Apoenzym bei den Titrationsexperimenten zu verwenden, so dass eine störende Wärmeentwicklung aufgrund der Fällung bei Zugabe von Calcium nicht die Messung der Bindungswärme stört.
Um zu gewährleisten, dass Präparate von Aposubtilisin nicht mit Calcium oder EDTA verunreinigt waren, wurden Proben durch Titration mit Calcium in Gegenwart von Quin2 vor Durchführung der Titrationskalorimetrie geprüft.
Titrationskalorimetrische Messungen.
Die kalorimetrischen Titrationen wurden mit einem Microcal Omega-Titrationskalorimeter gemäß den ausführlichen Angaben von Wiseman et al., Analytical Biochemistry, Bd. 179 (1989), S. 131–137, durchgeführt. Das Titrationskalorimeter besteht aus einer passenden Referenzzelle, die den Puffer enthält, und einer Lösungszelle (1,374 ml), die die Proteinlösung enthält. Mikroliter-Aliquotanteile der Ligandenlösung werden in die Lösungszelle über eine rotierende Rührspritze, die mit einem mittels eines Stufenmotors angetriebenen Kolben betätigt wird, zugesetzt. Nach Erreichen einer stabilen Basislinie bei einer gegebenen Temperatur wurde mit der automatischen Einspritzung begonnen und die dabei auftretende Wärmeänderung pro Injektion wurde mit einem Thermoelement-Sensor zwischen den Zellen bestimmt. Während jeder Injektion trat ein scharfer exothermer Peak auf, der vor der nächsten Injektion, die 4 Minuten später erfolgte, zur Basislinie zurückkehrte. Die Fläche der einzelnen Peaks stellt die Wärmemenge dar, die bei der Bindung des zugefügten Liganden an das Protein auftritt. Die gesamte Wärme (Q) wurde sodann durch ein nicht-lineares Minimierungsverfahren der kleinsten Fehlerquadrate (Wiseman et al., Analytical Biochemistry, Bd. 179 (1989), S. 131–137) gemäß der folgenden Gleichung an die gesamte Ligandenkonzentration [Ca]_Gesamt angepasst: dQ/d[Ca]Gesamt = ΔH[1/2 + (1 – (1 + r)/2 – Xr/2)/Xr – 2Xr(1 – r) + 1 + r2)1/2] (1)wobei 1/r = [P]_GesamtxK_a und X_r = [Ca]_Gesamt/[P]_Gesamt
Die Bindung von Calcium an die S11- und S12-Subtilisine wurde durch Titrationskalorimetrie gemessen, da diese die Bestimmung der Bindungskonstante und der Bindungsenthalpie ermöglicht (Wiseman et al., Analytical Biochemistry, Bd. 179 (1989), S. 131–137; Schwarz et al., J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 24344–24350).
Die S11- und S12-Subtilisin-Mutanten wurden bei den Titrationsexperimenten verwendet, da die Erzeugung des Wildtyp-Apoenzyms aufgrund seiner proteolytischen Aktivität und geringen Stabilität unmöglich ist. Die Titrationen von S11 und S12 wurden bei Proteinkonzentrationen [P] = 30 μM und 100 μM durchgeführt. Die Titration des S11-Apoenzyms mit Calcium bei 25°C ist in 4 dargestellt. Die Datenpunkte entsprechen der negativen Wärme der Calciumbindung, die mit jeder Titration von Calcium verbunden ist. Der Titrationskalorimeter ist gegenüber Veränderungen des K_a-Wertes unter Bedingungen empfindlich, bei denen das Produkt von K_a × [P] zwischen 1 und 1000 liegt (Wiseman et al., Analytical Biochemistry, Bd. 179 (1989), S. 131–137). Da der K_a-Wert für Subtilisin etwa 1 × 10⁷ M^–1 beträgt, führen diese Proteinkonzentrationen zu Werten von K_a × [P] = 300 und 1000. Bei geringeren Proteinkonzentrationen ist die Menge der pro Titration erzeugten Wärme nur schwer genau zu messen.
Die Ergebnisse der Anpassung der Titrationen von S11 und S12 an eine berechnete Kurve sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Die Parameter in der Tabelle umfassen die Bindungsparameter für das stöchiometrische Verhältnis (n), die Bindungskonstante (K_a) und die Bindungsenthalpie (ΔH). Diese Parameter wurden aus der Entfaltung unter nicht-linearer Minimierung der kleinsten Fehlerquadrate (Wiseman et al., Analytical Biochemistry, Bd. 179 (1989), S. 131–137) bestimmt. Die Messungen für jeden experimentellen Zustand wurden bei 25°C im Doppelversuch durchgeführt. Die Proteinkonzentrationen lagen im Bereich von 30 bis 100 μM, während die Konzentration der Calciumlösungen etwa das 20-fache der Proteinkonzentrationen betrug. Die einzelnen Bindungskonstanten und Bindungsenthalpien beruhten auf mehreren Titrationsansätzen bei verschiedenen Konzentrationen. Die Titrationsansätze wurden durchgeführt, bis die Titrationspeaks nahe an der Basislinie lagen.
Tabelle 2 Titrationskalorimetrie der Calcium A-Stelle in den Subtilisin-Mutanten S11 und S12
Die erhaltenen Mittelwerte sind für S11 und S12 ähnlich: ΔH = ~–11 kcal/mol; K_a = 7 × 10⁶ M^–1 und eine Bindungsstöchiometrie von 1 Calciumstelle pro Molekül. Die schwache Bindungsstelle B bindet Calcium in Konzentrationen unterhalb des millimolaren Bereiches nicht und stört daher nicht die Messung der Bindung an die Bindungsstelle A. Die freie Standardenergie der Bindung bei 25°C beträgt 9,3 kcal/mol. Die Bindung von Calcium wird daher vorwiegend durch die Enthalpie angetrieben, wobei nur ein geringer Nettoverlust der Entropie gegeben ist (ΔS_Bindung = –6,7 cal/°mol).
Beispiel 3
In vitro-Auffaltung von S15-Subtilisin.
Für Auffaltungsstudien wurde Subtilisin als eine Vorratslösung in 2,5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, und 50 mM KCl in einer Konzentration von etwa 100 μM gehalten. Das Protein wurde durch Verdünnen der Vorratslösung in 5 M Guanidin-hydrochlorid (Gu-HCl), pH-Wert 7,5, oder in den meisten Fällen in 25 mM H₃PO₄ oder HCl, pH-Wert 1,8–2,0, denaturiert. Die endgültige Proteinkonzentration betrug 0,1 bis 5 μM. S15 wurde unter diesen Bedingungen in weniger als 30 Sekunden vollständig denaturiert. Bei S12 dauerte es etwa 60 Minuten bis zur vollständigen Denaturierung. Säuredenaturiertes Protein wurde sodann durch Zugabe von Tris-Base (bei Denaturierung in HCl) oder 5 M NaOH (bei Denaturierung in H₃PO₄) auf den pH-Wert 7,5 neutralisiert. Die Auffaltung wurde durch Zugabe von KCl, NaCl oder CaCl₂ in der erwünschten Konzentration eingeleitet. Beispielsweise wurde KCl aus einer Vorratslösung von 4 M bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 1,5 M unter raschem Rühren zugegeben. In den meisten Fällen wurde die Renaturierung bei 25°C durchgeführt. Die Renaturierungsgeschwindigkeit wurde spektrophotometrisch durch UV-Absorption aufgrund der Zunahme der Extinktion bei λ = 286, aus der Zunahme der natürlichen Tyrosin- und Tryptophan-Fluoreszenz (Anregung λ = 282, Emission λ = 347) oder durch Zirkulardichroismus aus dem Anstieg der negativen Elliptizität bei λ = 222 nm bestimmt.
Beispiel 4
Röntgenkristallographie.
Die Züchtung eines großen Einkristalls und die Gewinnung der Röntgenbeugungsdaten wurden im wesentlichen gemäß Literaturangaben vorgenommen (Bryan et al., Proteins: Struct. Funct. Genet., Bd. 1 (1986a), S. 326–334; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 27 (1988), S. 8311–8317; Pantoliano et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 7205–7213), mit der Ausnahme, dass es nicht erforderlich war, die S221 C-Varianten mit Diisopropylfluorophosphat (DFP) zu inaktivieren, um geeignete Kristalle zu erhalten. Das Ausgangsmodell für S12 wurde aus der hyperstabilen Subtilisin-Mutante 8350 (Protein Data Bank Entry 1SO1.pdb) hergestellt. Die S12-Struktur wurde verfeinert und sodann zur Bereitstellung des Ausgangsmodells für S15 modifiziert.
Datensätze mit etwa 20 000 Reflexionen zwischen 8,0 Å und 1,8 Å Auflösung wurden zur Verfeinerung beider Modelle unter Anwendung eingeschränkter Techniken der kleinsten Fehlerquadrate verwendet (Hendrickson et al., "Computing in Crystallography", Hrsg. Diamond et al., Bangalore: Indian Institute of Science, 13.01–13.23 (1980)). Anfängliche Differenzkarten für S15, in Einklang gebracht mit der Version von S12, wobei die gesamte Region der Stelle A weggelassen wurde, zeigten klar eine kontinuierliche Dichte, die die ununterbrochene Helix wiedergibt, was die Konstruktion eines anfänglichen S15-Modells ermöglichte, wonach eine Verfeinerung einsetzte. Jede Mutante wurde von R von etwa 0,30 auf R von etwa 0,18 in etwa acht Zyklen verfeinert, wobei dazwischen Berechnungen der Elektronendichtekarten und manuelle Anpassungen unter Anwendung des Grafikmodellierprogramms FRODO (Jones, J. Appl. Crystallogr., Bd. 11 (1978), S. 268–272) durchgeführt wurden.
Mit Ausnahme der Region der deletierten Calcium-Bindungsschleife waren die Strukturen von S12 und S15 sehr ähnlich, mit einer Abweichung des quadratischen Mittelwerts (r. m. s) von 0,18 Å zwischen 262 α-Kohlenstoffatomen. Der N-Terminus von S12 (wie beim Wildtyp) liegt neben der Schleife der Stelle A, die einen Calcium-Koordinationsliganden, den Seitenketten-Sauerstoff von Q2, liefert. In S15 ist die Schleife verschwunden, wobei die Reste 1-4 in ungeordnetem Zustand verbleiben. In S12 (wie beim Wildtyp) tritt die Schleife der Stelle A als Unterbrechung in der letzten Windung der α-Helix mit 14 Resten auf. In S15 ist diese Helix nicht unterbrochen und zeigt über ihre gesamte Länge eine normale helikale Geometrie. Eine diffuse Differenzdichte und höhere Temperaturfaktoren stellen ein Anzeichen für eine gewisse Störung in den neuerdings exponierten Resten neben der Deletion dar.
Beispiel 5
Differentialscanningkalorimetrie.
Die Stabilitätseigenschaften von S12 und S15 wurden unter Anwendung von DSC (Differentialscanningkalorimetrie) untersucht. Die Δ75-83-Mutante (S15) ist in ihrer Schmelztemperatur dem Apoenzym von S12 sehr ähnlich. Die DSC-Profile von apo-S12 und S15 sind in 3 dargestellt. Die Temperatur der maximalen Wärmekapazität beim pH-Wert 9,63 beträgt für S15 63,0°C und für apo-S12 63,5°C. Die DSC-Experimente wurden bei einem hohen pH-Wert durchgeführt, um eine Aggregation während des Denaturierungsvorgangs zu vermeiden. Der Betrag der überschüssigen Wärme, die durch eine Proteinprobe bei steigender Temperatur aufgrund eines Übergangs vom gefalteten zum aufgefalteten Zustand bei konstantem Druck absorbiert wird, ergibt eine direkte Messung des ΔH-Wertes der Auffaltung (Privalov et al., Methods Enzymol., Bd. 131 (1986), S. 4–51). ΔH_cal der Auffaltung für apo-S12 und S15 beträgt etwa 140 kcal/mol. Über einem pH-Wert von 10,0 stimmt der Auffaltungsübergang für S15 gut mit einem Zweistufenmodell überein, was mit der Gleichgewichststhermodynamik gemäß der van't Hoff-Gleichung (dln K/dT = ΔH_νH/(RT²)) mit ΔH_νH (die van't Hoff-Enthalpie oder scheinbare Enthalpie) von etwa gleicher Größe wie ΔH_cal (die kalorimetrische oder echte Enthalpie) übereinstimmt. Beim pH-Wert 9,63 war jedoch das Schmelzprofil für beide Proteine asymmetrisch, was darauf hinweist, dass es sich bei der Auffaltung nicht um ein reines zweistufiges Verfahren handelt.
Beispiel 6
Messung der Kinetik der Calcium-Dissoziation.
Die Dissoziation von Calcium aus Subtilisin stellt einen langsamen Vorgang dar. Zur Messung dieser Geschwindigkeit wurde der fluoreszierende Calcium-Chelatbildner Quin 2 verwendet. Quin 2 bindet Calcium mit einem K_a-Wert von 1,8 × 10⁸ beim pH-Wert 7,5 (Linse et al., Biochemistry, Bd. 26 (1987), S. 6723–6735). Die Fluoreszenz von Quin 2 bei 495 nm nimmt bei Bindung an Calcium um einen Faktor von etwa 6 zu (Bryant, Biochem. J., Bd. 226 (1985), S. 613–616). Subtilisin S11 oder S12 enthalten in der isolierten Form ein Calciumion pro Molekül. Beim Vermischen mit einem Überschuss an Quin 2 lässt sich die Kinetik der Calcium-Freisetzung aus dem Protein anhand der Zunahme der Fluoreszenz bei 495 nm verfolgen. Es wird angenommen, dass die Reaktion folgendermaßen abläuft: N(Ca) ↔ N + Ca + Quin 2 ↔ Quin(Ca). Die Dissoziation von Calcium aus Subtilisin ist sehr langsam im Vergleich zur Calcium-Bindung durch Quin 2, so dass die Veränderung der Fluoreszenz von Quin 2 der Geschwindigkeit der Calcium-Dissoziation aus Subtilisin entspricht. Wie aus 5a ersichtlich ist, folgt die anfängliche Freisetzung von Calcium aus S11 einer einfachen Kinetik erster Ordnung.
Temperaturabhängigkeit der Calcium-Dissoziation.
Die Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung (k) für die Calcium-Dissoziation wurde von 20 bis 45°C gemessen. Das Diagramm von Ln k gegen 1/1T°K ist annähernd linear. Die Daten der Calcium-Dissoziation wurden einer Kurvenanpassung unter Anwendung der Übergangszustandstheorie gemäß der Erying-Gleichung unterzogen: ΔG⧧ = –RT ln K⧧ = –RT ln kh/kBT (2)wobei kg die Boltzman-Konstante bedeutet, h die Planck-Konstante bedeutet und k die Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung für die Faltung bedeutet. Ein Diagramm von In hk/k_BT gegen 1/T ist in 5b dargestellt.
Die Daten wurden sodann gemäß der folgenden Gleichung einer Kurvenanpassung unterzogen (Chen et al., Biochemistry, Bd. 28 (1989), S. 691–699): ln K⧧ = A + B(To/T) + C ln (To/T) (3)wobei A = [ΔCp⧧ + ΔS⧧(To)]/R; B = A – ΔG⧧(T_o)/RTo; C = ΔCp⧧/R. Die erhaltenen Daten führten zu den folgenden Ergebnissen: ΔG⧧ = 22,7 kcal/mol; ΔCp'⧧ = –0,2 kcal/°mol; ΔS'⧧ = –10 cal/°mol; und ΔH'⧧ = 19,7 kcal/mol bei einer Referenztemperatur von 25°C. Eine mögliche geringfügige Krümmung der Kurve ist auf eine Veränderung der Wärmekapazität in Verbindung mit der Bildung des Übergangszustands zurückzuführen (ΔCp'⧧ = 0,2 kcal/°mol). Es wurde gezeigt, dass ΔCp für die Proteinfaltung eng mit der Veränderung der Exposition von hydrophoben Gruppen gegenüber Wasser korreliert (Privalov et al., Adv. Protein Chem., Bd. 39 (1988), S. 191–234; Livingstone et al., Biochemistry, Bd. 30 (1991), S. 4237–4244). In Bezug auf die Wärmekapazität ist der Übergangszustand somit offenbar ähnlich wie beim nativen Protein. Die Werte für ΔS'⧧ und ΔH'⧧, die aus 5b erhalten wurden, zeigen, dass der Übergangszustand enthalpiemäßig weniger günstig als die gebundene Calciumform ist, wobei nur eine geringe Entropieänderung gegeben ist.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich für den Fachmann beim Studium der Beschreibung und der hier beschriebenen Erfindungspraxis. Die Beschreibung und die Beispiele sind nur als Beispiele anzusehen, während der wirkliche Schutzumfang und der Geist der Erfindung durch die folgenden Ansprüche definiert werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Mutantes Subtilisin-Protein mit einer im Vergleich zu einem Wildtyp ähnlichen oder erhöhten Stabilität und enzymatischen Aktivität in einer chelatbildenden, wässrigen Umgebung, das zur Beseitigung der Fähigkeit zur Bindung von Calcium an einer hochgradig affinen Calcium-Bindungsstelle mutiert worden ist, wobei das mutante Subtilisin-Protein ferner eine oder mehrere zusätzliche Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfasst, die die Stabilität des mutanten Proteins in mindestens einer Region erhöhen, die einer Region des reifen Subtilisin-BPN' entspricht, das aus den folgenden reifen Subtilisin-BPN'-Regionen ausgewählt ist: die N-terminalen Aminosäuren 1-8, die ω-Schleifen-Aminosäuren 36-45 und die α-Helix-Aminosäuren 70-74, wobei die mutanten Subtilisin-Proteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: a) N218S, M50F, Y217K und P5A; b) N218S, M50F, Y217K und P5S; c) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206V; d) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206C; und e) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L, Q206C und S3C.
Mutantes Subtilisin-Protein nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren in den Positionen 75-83 zur Beseitigung der Fähigkeit dieser Mutante zur Bindung von Calcium deletiert worden sind.
Mutantes Subtilisin-Protein nach Anspruch 2, wobei die Mutante, der die Aminosäuren 75-83 fehlen, eine oder mehrere zusätzliche Mutationen in der Aminosäuresequenz aufweist.
Subtilisin-Mutante nach Anspruch 3, wobei die Mutante eine oder mehrere zusätzliche Mutationen in den β-Band-Aminosäuren 202-219 aufweist.
Mutantes Subtilisin-Protein nach Anspruch 1, wobei die Mutante mindestens eine Substitutionsmutation von K43R, K43N, A73Q, Q206I und Q206W umfasst.
Mutantes Subtilisin-Protein nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Subtilisin aus einem Bacillus-Stamm stammt.
Subtilisin nach Anspruch 6, wobei das mutante Subtilisin-Protein eine Subtilisin-BPN'-Mutante, eine Subtilisin-Carlsberg-Mutante, eine Subtilisin-DY-Mutante, eine Subtilisin-Amylosacchariticus-Mutante oder eine Subtilisin-Mesenticopeptidase-Mutante oder eine Subtilisin-Savinase-Mutante ist und vorzugsweise eine Subtilisin-BPN'-Mutante ist.
Enzymatisch aktives Subtilisin-Protein nach Anspruch 1, das eine erhöhte thermische Stabilität im Vergleich zum mutanten Protein, das nur die Mutationen) zur Beseitigung der Calcium-Bindung enthält, aufweist.
Verfahren, das für die Expression eines mutanten Subtilisin-Proteins mit einer im Vergleich zu einem Wildtyp-Subtilisin ähnlichen oder erhöhten enzymatischen Aktivität in einer chelatbildenden, wässrigen Umgebung sorgt, wobei das Protein zur Beseitigung der Fähigkeit zur Bindung von Calcium an einer hochgradig affinen Calcium-Bindungsstelle mutiert worden ist, wobei das mutante Subtilisin-Protein ferner eine oder mehrere zusätzliche Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfasst, die die Stabilität des mutanten Proteins in mindestens einer Region erhöhen, die einer Region des reifen Subtilisin-BPN' entspricht, das aus den folgenden reifen Subtilisin-BPN'-Regionen ausgewählt ist: die N-terminalen Aminosäuren 1-8, die ω-Schleifen-Aminosäuren 36-45 und die α-Helix-Aminosäuren 70-74, wobei die mutanten Subtilisin-Proteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: f) N218S, M50F, Y217K und P5A; g) N218S, M50F, Y217K und P5S; h) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206V; i) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206C; und j) N218S, M50F, Y217K, Q27E, Q2K, A73L, Q206C und S3C; wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) Mutieren eines klonierten Subtilisin-Gens durch in vitro-Mutagenese zur Erzeugung eines DNA-Segments oder einer DNA-Sequenz, die für das mutante Subtilisin-Protein, das Calcium nicht bindet, kodieren, wobei das mutante Subtilisin-Protein ferner eine oder mehrere zusätzliche Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfasst, die die Stabilität des mutanten Proteins in mindestens einer Region erhöhen, die einer Region des reifen Subtilisin-BPN' entspricht, das aus den folgenden reifen Subtilisin-BPN'-Regionen ausgewählt ist: die N-terminalen Aminosäuren 1-8, die ω-Schleifen-Aminosäuren 36-45 und die α-Helix-Aminosäuren 70-74, wobei die mutanten Subtilisin-Proteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: k) N218S, M50F, Y217K und P5A; l) N218S, M50F, Y217K und P5S; m) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206V; n) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206C; und o) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L, Q206C und S3C; b) Transformieren einer rekombinanten Wirtszelle, der das Subtilisin-Gen fehlt, mit einem Expressionsvektor, der dieses DNA-Segment oder diese DNA-Sequenz, die für mutantes Subtilisin-Protein kodieren, umfasst; c) Züchten dieser rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des mutanten Subtilisin-Proteins sorgen; und d) Screening des exprimierten, mutanten Subtilisin-Proteins auf eine im Vergleich zu Wildtyp-Subtilisin ähnliche oder erhöhte enzymatische Aktivität und Stabilität in einer chelatbildenden, wässrigen Umgebung, um festzustellen, ob dieses mutante Subtilisin-Protein eine ähnliche oder erhöhte enzymatische Aktivität und Stabilität aufweist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei dem mutanten Subtilisin-Protein die Calcium A-Bindungsstelle fehlt.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das mutante Subtilisin-Protein das oder die Merkmale von einem der Ansprüche 2 bis 8 aufweist.
Rekombinante DNA- die für ein mutantes Subtilisin-Protein mit einer im Vergleich zu einem Wildtyp ähnlichen oder erhöhten Stabilität und enzymatischen Aktivität in einer chelatbildenden, wässrigen Umgebung kodiert, wobei das Protein so mutiert worden ist, dass die Fähigkeit dieses Subtilisin-Proteins zur Bindung von Calcium an einer hochgradig affinen Calcium-Bindungsstelle beseitigt worden ist, wobei das mutante Subtilisin-Protein ferner eine oder mehrere zusätzliche Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfasst, die die Stabilität des mutanten Proteins in mindestens einer Region erhöhen, die einer Region des reifen Subtilisin-BPN' entspricht, das aus den folgenden reifen Subtilisin-BPN'-Regionen ausgewählt ist: die N-terminalen Aminosäuren 1-8, die ω-Schleifen-Aminosäuren 36-45 und die α-Helix-Aminosäuren 70-74, wobei die mutanten Subtilisin-Proteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: p) N218S, M50F, Y217K und P5A; q) N218S, M50F, Y217K und P5S; r) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206V; s) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206C; und t) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L, Q206C und S3C; wobei das mutierte Subtilisin-Protein seine enzymatische Aktivität und Stabilität behält.
Rekombinante DNA nach Anspruch 12, wobei das mutante Subtilisin-Protein das oder die Merkmale von einem der Ansprüche 2 bis 8 aufweist.
Rekombinanter Mikroorganismus, der eine Wirtszelle umfasst, die mit einem Expressionsvektor transformiert worden ist, der eine mutante Subtilisin-DNA enthält, die bei Expression für die Expression eines mutanten Subtilisin-Proteins mit im Vergleich zu einem Wildtyp ähnlicher oder erhöhter enzymatischer Aktivität in einer chelatbildenden, wässrigen Umgebung sorgt, wobei der Mikroorganismus zur Beseitigung der Fähigkeit des Subtilisinproteins zur Bindung von Calcium an einer hochgradig affinen Calcium-Bindungsstelle mutiert worden ist, wobei das mutante Subtilisin-Protein ferner eine oder mehrere zusätzliche Deletions-, Substitutions- oder Additionsmutationen umfasst, die die Stabilität des mutanten Proteins in mindestens einer Region erhöhen, die einer Region des reifen Subtilisin-BPN' entspricht, das aus den folgenden reifen Subtilisin-BPN'-Regionen ausgewählt ist: die N-terminalen Aminosäuren 1-8, die ω-Schleifen-Aminosäuren 36-45 und die α-Helix-Aminosäuren 70-74, wobei die mutanten Subtilisin-Proteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Bestandteilen besteht: u) N218S, M50F, Y217K und P5A; v) N218S, M50F, Y217K und P5S; w) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206V; x) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L und Q206C; und y) N218S, M50F, Y217K, Q271E, Q2K, A73L, Q206C und S3C.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 21, wobei dem mutanten Subtilisin-Protein die Calcium A-Bindungsstelle fehlt.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 14 oder 15, wobei das mutante Subtilisin-Protein das oder die Merkmale nach einem der Ansprüche 2 bis 8 enthält.
Verwendung der Subtilisin-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als eine Proteinase in einer Umgebung, die ein chelatbildendes Mittel umfasst; und gegebenenfalls Calciumionen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Subtilisin-Mutante in einer Detergenszusammensetzung verwendet wird.