DK175523B1 - Ikke-humane carbonylhydrolasemutanter, DNA-sekvenser og vektorer der koder for sådanne og værter der er transformeret med sådanne vektorer - Google Patents

Description

i DK 175523 B1

Den seneste udvikling af forskellige in-vitro-teknikker til manipulering af de DNA-sekvenser, som koder for naturligt forekommende polypeptiderf samt de seneste udviklinger i den kemiske syntese af relativt korte sekvenser af enkelt- og dob-5 beltstrenget DNA har fremkaldt den tanke, at sådanne teknikker kan anvendes til at modificere enzymer for at forbedre en eller anden funktionel egenskab på .en forudsigelig måde. K.M. Ulmer (1983) Science 219, 666-671. Det eneste deri beskrevne udførelseseksempel er substitutionen af en enkelt aminosyre i 10 det aktive sted hos tyrosyl-tRNA-syntetase (Cys35-Ser), som fører til en reduktion i enzymatisk aktivitet, se G. Winther et al. (1982) Nature 299, 756-758; og A.J. Wilkinson et al.

(1983) Biochemistry 22, 3581-3586 (Cys35-Gly-mutati on resulterede ligeledes i formindsket aktivitet).

15 Når den samme t-RNA-syntetase blev modificeret ved at substituere en anden aminosyre i det aktive sted med to forskellige aminosyrer, viste en af mutanterne (Thr51-»Ala) ifølge rapporten en forudsagt moderat forøgelse i kcat/Km, mens en anden 2Q mutant (Thr51-Pro) viste en massiv forøgelse i kcat/Km, som ikke kunne forklares med sikkerhed, A.H. Wilkinson et al., (1984) Nature 307, 187-188.

Et andet rapporteret eksempel på en enkelt substitution af en aminosyr.erest er substitutionen af isoleucin med cystein i den 25 tredje rest i T4-lyzozym. L.J. Perry et al. (1984) Science 226, 555-557. Det resulterende muterede lysozym blev oxideret mildt til dannelse af en disulfidbinding mellem den nye cyste- inrest i position 3 og den native cystein i position 97. Denne tværbundne mutant blev oprindeligt beskrevet af forfatteren 30 som værende enzymatisk identisk med, men mere termisk stabil end vi 1dtype-enzymet. I en "Note Added in Proof" angav forfatteren imidlertid, at den observerede forøgede stabilitet sandsynligvis skyldtes en kemisk modifikation af cystein ved rest 54, eftersom mutant-lysozymet med en fri thiol ved Cys54 har 35 en termisk stabilitet, som er identisk med viIdtypelysozymets stabilitet.

Tilsvarende er det blevet rapporteret, at en modificeret dihy-drofo 1atreduktase fra E. coli er blevet modificeret på tilsva-

I DK 175523 B1 I

I I

I rende måder til indførelse af en cystein, som kunne tværbindes I

I med en naturligt forekommende cystein i reduktasen, D.E. Vil- I

I lafranca et al. (1983) Science 222, 782-788. Forfatteren angi- I

I ver, at denne mutant er fuldt reaktiv i den reducerede til- I

I 5 stand, men har signifikant formindsket aktivitet i den oxide- I

I rede tilstand. Desuden rapporteres to andre substitutioner af. I

I specifikke aminosyrerester, som resulterede i mutanter, der er I

I havde formindsket eller ingen aktivitet. I

I 10 1 EP publikation nr. 0130756 beskrives substitutionen af spe- I

I cifikke rester i B. amyloliquefaciens-subti1isin med specifik- I

I ke aminosyrer. Således er Met222 blevet substitueret med alle I

I 19 andre aminosyrer, Glyl66 med 9 forskellige aminosyrer og I

I Glyl69 med Ala og Ser. I

I 15 I

I Som angivet nedenfor har flere laboratorier også rapporteret I

I om anvendelse af stedsrettet mutagenese til fremkaldelse af I

I mutationen af mere end en aminosyrerest i et polypeptid. I

I Den am inotermi na 1e region af signalpeptidet for prolipoprote-

I 20 inet i den ydre E. coli-membran blev angivet som værende an- I

I dret ved substitutionen eller deletionen af resterne 2 og 3

I til fremkaldelse af en ladningsændring i den region af poly- I

I peptidet, S. Inoyye et al. (1982) Proc. Nat. Acad. Sci.USA I

I 79, 3438-3441. Det samme laboratorium har også beskrevet sub- I

I 25 stitutionen og deletionen af am inosyreresterne 9 og 14 for at I

I bestemme virkningerne af en sådan substitution på den hydrofo- I

I be region af den samme s igna1 sekvens, S. Inouye et al. (1984) I

I J. B-iol. Chem. 259, 3729-3733. I

2q Dobbeltmutanter i det aktive sted i tyrosy1 -tRNA-syntetase er I

I også blevet rapporteret, P.J. Carter et al. (1984) Cell 38,

I 835-840. I denne rapport blev den forbedrede affinitet af den I

I tidligere beskrevne Thr51-Pro-mutant over for ATP undersøgt I

I ved frembringelse af en anden mutation i enzymets aktive sted. I

I 35 En af dobbeltmutanterne Gly35/Pro51, viste ifølge rapporten et I

I uventet resultat, idet den bandt ATP i overgangstilstanden I

I bedre end hvad der var forventet ud fra de to enkelte mutan- I

I ter. Desuden gør forfatteren opmærksom på, at det, i det mind- I

3 DK 175523 B1 ste for en dobbe 1 tcnutant, ikke nemt kan forudsiges, hvordan en substitution ændrer den virkning, der forårsages af den anden substitution, og at man må være forsigtig med at fortolke sådanne substitutioner.

5 I US patentskrift nr. 4.532.207 er beskrevet en mutant, hvor en polyargini nhale blev knyttet til den C-terminale rest af β-urogastron ved at modificere den DNA-sekvens, som koder for po1ypepti det. Som beskrevet ændrede polyargininhalen urogas-tron-polyargininhybridens elektroforetiske mobilitet, hvilket muliggjorde selektiv oprensning. Polyargininen blev derefter fjernet, ifølge patenthaveren med en polyargininspecifik- exo-peptidase til fremstilling af den oprensede urogastron. Korrekt fortolket beskrives i denne reference hybridpolypepti-der, som ikke udgør mutantpolypeptider indeholdende substitutionen, indsættelsen eller deletionen af en eller flere aminosyrer af et naturligt forekommende polypeptid.

Der er også blevet rapporteret om enkelte mutanter og dobbeltmutanter af rottepankreas-trypsin, C.S. Craik et al. (1985) 20

Science 228, 291-297. Som rapporteret blev glycinrester i positionerne 216 og 226 erstattet med alaninrester til fremstilling af tre tryps i nmutanter (to enkelte mutanter og en dobbeltmutant). Når det drejer sig om enkeltmutanterne, angav forfatterne, at man måtte forvente en differentiel virkning på 25

Km. De rapporterede i stedet en ændring i specificitet (kcat/Km), som primært var resultatet af en formindskelse af kcat. I modsætning hertil viste dobbeltmutanten ifølge rapporten en differentiel forøgelse i Km for lysyl- og arginylsub- strater sammenlignet med vi 1dtypetrypsin, men havde praktisk 30 talt ingen katalytisk aktivitet.

De ovenfor diskuterede referencer er udelukkende medtaget af hensyn til deres beskrivelse før den foreliggende sags indleveringsdato, og intet heri skal opfattes som en tilkendeg i ve 1-35 se af, at opfinderne ikke er berettiget til at foruddatere en sådan beskrivelse i form af en tidligere opfindelse eller prioritet baseret på tidligere indleverede ansøgninger.

I DK 175523 B1 I

I 4 I

I 8aseret på de ovenstående referencer fremgår det imidlertid, I

I at modifikationen af vildtype-enzymers aminosyresekvens ofte I

I resulterer i formindskelse eller ødelæggelse af biologisk ak- I

I tivitet. I

I I

I Det er derfor et formål heri at tilvejebringe carbonyIhydrola- I

I semutanter, som har mindst en egenskab, som er forskellig fra I

den samme egenskab hos det carbonylhydrolaseforstadium, hvor- I

I fra denne mutants aminosyre hidrører. I

I 10 I

Det er et yderligere formål at tilvejebringe mutant-DNA-se- |

kvenser, som koder for sådanne carbonylhydrolasemutanter samt I

ekspressionsvektorer indeholdende sådanne mutant-DNA-sekven- I

ser. I

15 Endnu et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er I

I at tilvejebringe værtsceller, som er transformeret med sådanne I

I vektorer samt værtsceller, som er i stand til at udtrykke så- I

danne mutanter enten intracellulært eller ekstracel1ulært. I

I 20 Opfindelsen omfatter carbonylhydrolasemutanter, fortrinsvis I

med mindst en egenskab, som er væsentligt forskellig fra den I

samme egenskab hos den ikke-humane forstadiecarbonylhydrolase, I

I hvorfra mutantens aminosyresekvens hidrører. Disse egenskaber I

I omfatter oxidativ stabilitet, substratspecificitet, kataly- I

25 tisk aktivitet, termisk stabilitet, alkalistabilitet, pH-akti- I

I vitetsprofil og modstandsdygtighed over for proteolytisk ned- I

I brydning. Forstadiecarbonylhydrolasen kan være naturligt fore- I

I kommende carbonylhydrolaser eller rekombinerede carbony1 hydro- I

I laser. Carbonylhydrolasemutantens aminosyresekvens er afledt I

I 2q ved substitution, deletion eller indsættelse af en eller flere I

I aminosyrer fra forstadiecarbonylhydrolaseaminosyresekvensen. I

I Opfindelsen omfatter også mutant-DNA-sekvenser, som koder for . I

I sådanne carbony1hydrolasemutanter. Opfindelsen angår endvidere I

I ekspressi onsvektorer indeholdende sådanne mutant-DNA-sekvenser I

I 35 I

samt værtsceller, som er transformeret med sådanne vektorer,

I og som er i stand til at udtrykke disse carbony!hydrolasemu- I

I tanter. I

5 DK 175523 B1

Fig. 1 viser nukleotidsekvensen af den kodende streng, korre-leret med aminosyresekvensen af B. amyloliquefaciens-subti 1 i -singenet. DNA-sekvensens promotor (p)-, ribosombindingssteds (rbs)- og terminerings (term)-regioner samt sekvenser, som ko-S der for hydrolasens prasekvens (PRE), formodede prosekvens (PRO) og fuldt udviklede form (MAT) er ligeledes vist.

Fig. 2 er et skematisk diagram, som viser subtilisins substratbindingskløft sammen med substrat.

10

Fig. 3 er et stereobillede af S-l-bindingsunderstedet hos B. amy1oliquefaciens-subtilis in, visende et lysin-P-l-substrat bundet til stedet på to forskellige måder. Fig. 3A viser lysin-P-l-substrat bundet til dannelse af en saltbro med en Glu ved position 156. Fig. 3B viser lysin-P-l-substrat bundet til 15 dannelse af en saltbro med Glu i position 166.

Fig. 4 er et skematisk diagram af det aktive sted i subtili-sin-Asp32, -His64 og -Ser221.

20 Figurerne 5A og 5B afbilder aminosyresekvensen af subtilisin, opnået fra forskellige kilder. Resterne direkte under hver rest fra B. amyloliquefaciens-subti 1isin er ækvivalente rester som (1) kan muteres på tilsvarende måde som den, der er beskrevet for B. amyloliquefaciens-subti 1 isin eller (2) kan 2g anvendes som en erstatningsaminosyrerest i B. amyloliquefaciens-subti 1 isin . Fig. 5C afbilleder bevarede rester af B. amy-loliquefaciens-subtilisin sammen1ignet med andre subtilisin-sekvenser.

Figurerne 6A og 6B afbilder inaktiveringen af mutanterne 30

Met222L og Met222Q, når de udsættes for forskellige organiske oxidationsmidler.

Fig. 7 afbilder det ultraviolette spektrum for Met222F-subti-lisin og det differensspektrum, der dannes efter inaktivering 35 med diperdodecansyre (DPDA).

Fig. 8 viser mønsteret af cyanogenbromidfordøje1 ser af ubehandlet og DPDA-oxideret subti 1 i s in-Met222F på SOS-pyridinpep-tidgeler med høj opløsningsevne.

I DK 175523 B1 I

I 6 I

I Fig. 9 afbilder et kort af cyanogenbromidfragmenterne fra fig. I

I 8 rettet ind efter sekvensen af substiti 1 i sin-Met222F, I

I Fig. 10 afbilder konstruktionen af mutationer mel 1 em'codonerne I

I 5 45 og 50 i B. amyloliquefaciens-subti 1isin. I

I Fig. li afbilder konstruktionen af mutationer mellem codonerne I

I 122 og 127 i B. amyloliquefaciens-subtilisin. I

F.ig. 12 viser DPOA's virkning på aktiviteten af subt i 1 i s i nmu- I

10 tanter i positionerne 50 og 124 i subti1isin-Met222F. I

I Fig. 13 afbilder konstruktionen af mutationer ved codon 166 af I

I B. amy1 o 1 iquefaciens-subti 1 i si η. I

I Fig. 14 afbilder virkningen af P-l-substratsidekædens hydrofo- I

15 I

bicitet på vildtype-B. amy1oliquefaciens-subti 1 i si ns kinetiske

I parametre. I

I Fig. 15 afbilder virkningen af sidekædesubstitutioner i posi- I

I tion 166 på P-l-substratspecifi c itet. Fig. 15A viser subtili- I

I 20 siner, som er muteret i position 166 indeholdende ikke-forgre- I

I nede a 1 kyl substi tut i oner og aromatiske sidekædesubstitutioner I

I arrangeret i rækkefølge med stigende molekylvolumen. Fig. 15B I

I viser en serie mutantenzymer, som går frem gennem β- og γ-for- I

I grenede alifatiske sidekædesubstitutioner med stigende mole- I

25 kylvolumen. I

I Fig. 16 afbilder virkningen af s idekædevolurnenet på position I

I 166 på log kcat/Km for forskellige P-l-substrater. I

I Fig. 17 viser substratspecificitetsforskellene mellem Ilel66- I

30 I

og vildtype (Glyl66)-B. amyloliquefaciens-subti 1isin mod en I

I serie alifatiske og aromatiske substrater. Hver stang repræ- I

I senterer forskellen i log kcat/Km for Ilel66- minus vildtype I

I (Glyl66)-subti1isin. I

I 35 Fig. 18 afbilder konstruktionen af mutationer ved codon 169 I

I fraB.amyloliquefaciens-subtilisin. I

I Fig. 19 afbilder konstruktionen af mutationer ved codon 104 I

I fraB.amyloliquefaciens-subtilisin. I

7 DK 175523 B1

Fig. 20 afbilder konstruktionen af mutationer ved codon 152 fra B. amy1 o 1iquefaciens-subti 1 i sin,

Fig. 21 afbilder konstruktionen af enkelte mutationer ved co-5 don 156 og dobbelte mutationer ved codonerne 156 og 166 fra B. amyloliquefaciens-subtilisin.

Fig. 22 afbilder konstruktionen af mutationer ved codon 217 fra B. amyloliquefaciens-subti 1isin.

10 Fig. 23 afbilder kcat/Km mod pH-profil for mutationer ved codon 156 og 166 i B. amyloliquefaciens-subtilisin.

Fig. 24 afbilder kcat/Km mod pH-profil ved mutationer ved codon 222 i B. amy1 o 1iquefaciens-subti 1 i s in.

15

Fig. 25 afbilder konstruktionen af mutanter ved codonerne 94, 95 og 96.

Fig. 26 og 27 afbilder forskellige vildtype- og mutantsubti1 i -siners substratspecificitet over for forskellige substrater.

20

Fig. 28A, B, C og D afbilder virkningen af ladning i P-l-bin-dingsstederne på grund af substitutioner ved codon 156 og 166.

Fig. 29A og B er et stereobillede af P-l-bindingsstedet i sub- tilisin-BPN' visende et lysin-P-l-substrat bundet til stedet 25 på to måder. I 29A bygges lysin-P-l-substrat til dannelse af en saltbro med en Glu ved codon 156. I 29B bygges lysin-P-l-substrat til dannelse af en saltbro med Glu ved codon 166.

Fig. 30 viser resterende enzymakt i vi tet mod temperaturkurver 30 for oprenset vildtype (panel A), C22/C87 (panel B) og C24/C87 (panel C).

Fig. 31 afbilder strategien for dannelse af punktmutationer i subti 1 i s in-kodningssekvensen ved mi s inkorporering af a-thiol- deoxynuk1eotidtriphosphater.

3 5

Fig. 32 afbilder den autolytiske stabilitet af oprenset vildtype- og mutantsubti 1 i s i η 170E, 107V, 213R og 107V/213R ved alkalisk pH-vsrdi.

I DK 175523 B1 I

I I

I Fig. 33 afbilder den autolytiske stabilitet af oprenset vild- I

I type- og mutantsubti1isin V50, F50 og F50/V107/R213 ved alka- I

I 1 i sk pH-værd i. I

I g Fig. 34 afbilder strategien for konstruktion af plasmider in- I

I deholdende tilfældig kassetteroutagenese over resterne 197 til I

I 228. I

I Fig. 35 afbilder de oligodeoxynukleotider, der anvendes til I

I tilfældig kassettemutagenese og resterne 197 til 228. I

io I

Fig. 36 afbilder konstruktionen af mutanter ved codon 204. I

I Fig. 37 afbilder de oligodeoxynukleotider, der anvendes til I

I syntese af mutanter ved codon 204. I

I 15 I

Opfinderne har opdaget, at forskellige enkelte og multiple in- I

I vitro-mutationer, som involverer substitutionen, deletionen I

eller indsættelsen af en eller flere aminosyrer i en ikke-hu- I

I man hydro!aseaminosyresekvens kan bibringe sådanne mutanter I

I fordelagtige egenskaber sammenlignet med den ikke-muterede I

I 20 I

carbonyl hydro!ase. I

I Specifikt er B. amy1oliquefaciens-subti 1 i sin, en alkalisk bak- I

I teriel protease, blevet muteret ved at modificere den DNA, som I

koder for subti 1 i si nen, til at kode for substitutionen af en I

I 25 eller flere aminosyrer ved forskellige aminosyrerester i den I

I fuldt udviklede form af subti 1 i s inmo1eky1 et. Disse in vitro- I

I mutant-subti 1 i siner har mindst en egenskab, som er anderledes, I

I sammenlignet med den samme egenskab hos forstadie-subti1isi- I

I nen. Disse modificerede egenskaber falder i flere kategorier, I

30 herunder: oxidat iv stabilitet, substratspecificitet, termisk I

I stabi1 i tet, alka1 i s tab i 1 itet, katalytisk aktivitet, pH-aktivi- I

I tetsprofil, modstandsdygtighed over for proteolytisk nedbryd- I

I ning. Km, kcat og Km/kcat-forholdet. I

I 35 Carbonyl hydro!aser er enzymer, som hydrolyserer forbindelser I

9 DK 175523 B1

O

il indeholdende C-X-bindi nger, hvori X er oxygen eller nitrogen.

De omfatter naturligt forekommende carbonyl hydro 1 aser og re-g kombinerede carbonyl hydrolaser. Naturligt forekommende carbo-nylhydrolaser omfatter principielt hydrolaser, f.eks. lipaser og peptidhydrolaser, f.eks. subtilisiner eller metalloprotea-ser. Peptidhydrolaser omfatter α-aminoacylpeptidhydrolase, peptidylaminosyrehydrolase, acy1aminohydrolase, ser incarboxy-jø peptidase, metal 1ocarboxypepti dase, thiolpro te i nase, carboxyl-proteinase og metalloproteinase. Serin-, metal lo-, thiol- og syreproteaser er inkluderet, lige så vel som endo- og exopro-teaser.

i "Rekombi neret carbony1 hydro 1 ase" refererer til en carbonylhy-15 drolase, hvori den DNA-sekvens, som koder for den naturligt forekommende carbonylhydrolase, er modificeret til fremstilling af en mutant-ONA-sekvens, som koder for substitutionen, indsættelsen eller deletionen af en eller flere aminosyrer i carbony 1 hydrolaseami nosyresekvensen. Egnede modi fi kat i onsmeto- 20 der er beskrevet heri og i EP publikation nr. 0130756 publi-seret 9. januar 1985.

Subtilisiner er bakterielle carbony1 hydro 1 aser, som sædvanligvis virker ved at spalte proteiners eller peptiders peptidbin-25 dinger. Anvendt heri betyder "subtilisin'' en naturligt forekommende subtilisin eller en rekombineret subtilisin. En serie naturligt forekommende subtilisiner vides at blive produceret og ofte udskilt af forskellige, bakteriearter. Aminosyresekven-ser af medlemmerne af denne serie er ikke fuldstændigt homo-30 loge. Subti1isinerne i denne serie udviser imidlertid den samme eller en tilsvarende type proteolytisk aktivitet. Denne klasse af ser inproteaser deler en fælles aminosyresekvens, som definerer en katalytisk trehed, som adskiller dem fra den chy-motrypsinbeslægtede klasse af ser inproteaser. Subti 1 i s i nerne 35 og chymotrypsinbeslægtede ser inproteaser har begge en katalytisk trehed omfattende aspartat, histidin og serin. I de subti 1 isinbeslægtede proteaser er den relative rækkefølge af disse aminosyrer, når man læser fra amino- til carboxyenden, as- l

I DK 175523 B1 I

I I

I partat-histidin-serin. I de chymotrypsinbeslægtede proteaser I

I er den relative rækkefølge imidlertid histidin-aspartat-serin. I

I Subtilisin referer heri således til en ser inprotease med sub- I

I ti 1 isinbeslægtede proteasers katalytiske trehed. I

I 5 I

"Rekombineret subtilisin” refererer til en subtilisin, hvori I

I den DNA-sekvens, som koder for subti1 i sinen, er modificeret I

I til fremstilling af en mutant-DNA-sekvens, som koder for sub- I

I stitutionen, deletionen eller indsættelsen af en eller flere I

I ^ q aminosyrer i den naturligt forekommende subti 1 i s inaminosyre- I

I sekvens. Egnede metoder til fremstilling af sådan modifikation I

I omfatter metoder, som er beskrevet heri og i EP publikation I

I nr. 0130756. F.eks. kan den heri beskrevne multiple subtili- I

I s i nmutant indeholdende substitutionen af methionin ved amino- I

I 15 syreresterne 50, 124 og 222 med henholdsvis phenyl a 1 an i η, iso- I

I leucin og glutamin opfattes som hidrørende fra den rekombine- I

I rede subtilisin indeholdende substitutionen af glutamin ved I

I rest 222 (Q222), som er beskrevet i EP publikation nr. I

I 0130756. Den multiple mutant er således fremstillet ved at I

I 20 erstatte methionin med phenylalanin ved rest 50 og methionin I

I med isoleucin ved rest 124 i den rekombinerede Q222-subti 1 i - I

I sin. I

I "Carbonylhydrolaser" og deres gener kan opnås fra mange proka- I

I ryote og eukaryote organismer. Egnede eksempler på prokaryote I

I 2 5 I

organismer omfatter gramnegative organismer, såsom E. coli el- I

I ler pseudomonas og grampositive bakterier, såsom mikrococcus I

eller bacillus. Eksempler på eukaryote organismer, hvorfra I

I carbonylhydrolase og deres gener kan opnås, omfatter gær, så- I

I som S. cerevisiae, svampe, såsom Aspargiliussp. og ikke-huma-

30 - I

ne pattedyrskilder som f.eks. Bovine sp., hvorfra det gen, som

I koder for carbonylhydrolasechymosin, kan opnås. Som med subti- I

I lisiner kan der opnås en serie carbonylhydrolaser ud fra for- I

I skellige beslægtede arter, som har am inosyresekvenser, som ik- I

I ke er fuldstændigt homologe mellem medlemmerne af denne serie, I

I 35 I

men som ikke desto mindre udviser samme eller tilsvarende type I biologisk aktivitet. Ikke-human carbonylhydrolase, som anvendt

I heri, har således en funktionel definition, som refererer til I

DK 175523 B1 u carbonylhydrolaser, der er forbundet, direkte eller indirekte, med prokaryote og ikke-humane, eukaryote kilder.

En "carbonylhydro 1 asemutant" har en aminosyresekvens, som hid-5 rører fra en ikke-human "forstadie-carbonylhydrolases" amino-syresekvens. Forst ad iecarbony1hydrolaserne omfatter naturligt forekommende carbonylhydrolaser og rekombinerede carbonylhydrolaser. Carbonylhydrolasemutantens aminosyresekvens "hidrører" fra forstadiehydrolaseaminosyresekvensen ved substitutio-nen, deletionen eller indsættelsen af en eller flere aminosyrer i forstadieaminosyresekvensen. En sådan modifikation sker på "forstad ie-DNA", som koder for forstadiecarbonylhydrolasens aminosyresekvens nærmere end ved manipulation af selve forsta-diecarbonylhydrolasen. Egnede metoder til sådan manipulation af forstad ie-DNA-sekvensen omfatter metoder, som er beskrevet 19 heri og i EP publikation nr. 0130756.

Der er identificeret specifikke rester i B. amyloliquefaciens-subtilisin til substitution, indsættelse eller deletion. Oisse aminosyrepositionsnumre refererer til de numre, som er tildelt 20 den i fig. 1 viste B. amy1 o 1 iquefaciens-subti 1isinsekvens. Opfindelsen er imidlertid ikke begrænset til mutationen af denne bestemte subtilisin, men strækker sig til forstadi ecarbony1hy-drolaser indeholdende aminosyrerester, som er "ækvivalente" med de bestemte identificerede rester i B.. amyloliquefaciens-25 subtilisin.

En rest (aminosyre) af en forstadiecarbonylhydrolase er ækvivalent med en rest i B. amyloliquefaciens-subtilisin, såfremt den enten er homolog (dvs. svarende i position i enten primær 30 eller tertiær struktur) eller analog med en specifik rest eller del af denne rest i B. amyloliquefaciens-subtilisin (dvs. har samme eller tilsvarende funktionel evne til at kombinere, reagere eller vekselvirke kemisk).

Med henblik på at etablere homologi til den primære struktur sammenlignes en forstadiecarbonylhydrolases aminosyresekvens direkte med den primære sekvens af B. amyloliquefaciens-subtilisin og især med et sæt rester, som vides at være invariable

I DK 175523 B1 I

I i

I i alle subti 1 i s i ner, for hvilke sekvensen er kendt (fig. 5C). I

I Efter at have rettet de bevarede rester ind, idet man tager I

I hensyn til nødvendige indsættelser og deletioner for at bibe- I

I holde denne retten ind (dvs. undgår fjernelsen af bevarede I

I 5 rester gennem vilkårlig deletion og indsættelse) defineres de I

I rester, som er ækvivalente med bestemte aminosyrer i B. amylo- I

1 iquefaciens-subti 1 i si ns primære sekvens. Når de bevarede res- I

I ter rettes ind, bør fortrinsvis 100% af sådanne rester beva- I

I res. Når mere end 75% eller så lidt som 50% af de bevarede I

I 10 rester rettes ind, er dette imidlertid også tilstrækkeligt til I

I at definere ækvivalente rester. Oer bør bibeholdes bevarelse I

I af den katalytiske trehed, Asp32/His64/Ser221. I

I I f.eks. fig. 5A er ami nosy resekvensen for subtilisin fra B. I

I 15 amy1 o 1iquefaciens , B. subtilisin var. 1168 og B. 1 icheniformis I

I (car 1sbergensi s) rettet ind til tilvejebringelse af den maksi- I

I male mængde homologi mellem amihosyresekvenser. En sammenlig- I

I ning af disse sekvenser viser, at der er et antal bevarede I

I rester indeholdt i hver sekvens. Disse rester er identificeret I

I 20 1 M9· 5C· I

I Disse bevarede rester kan således anvendes til at definerede I

I de tilsvarende ækvivalente am inosyrerester fra B. amylolique- I

I faciens-subti 1isin i andre carbonylhydrolaser, såsom thermita- I

I se hidrørende fra Thermoactinomyces. Disse to bestemte sekven- I

25 ser er rettet ind i fig. 5B til fremkaldelse af den maksimale

I homologi af bevarede rester. Som det kan ses, er der et antal I

I indsættelser og deletioner i thermitasesekvensen sammenlignet I

I med B. amyloliquefaciens-subtilisin. I thermitase er den ækvi- I

I valente aminosyre af Tyr217 i B. amyloliquefaciens-subtilisin I

30 I

den bestemte lysin, som er vist neden for Tyr217.

I I fig. 5A er den ækvivalente aminosyre i position 217 i B. a- I

I my 1 o 1 iquefaciens-subti 1 i s in Tyr. Det ses ligeledes, at i B. I

I subtilis-subtilisin er position 217 også optaget af Tyr, men i I

I 35 B. 1 icheniform i s er position 217 optaget af Leu. I

I Disse bestemte rester i thermitase, og subtilisin fra B. sub- I

I tilisin og B. 1 icheni formi s, kan således substitueres med en I

13 DK 175523 B1 anden aminosyre til fremstilling af en mutantcarbonylhydrol a-se, eftersom de er ækvivalente i primær struktur med Tyr217 i B. amyloliquefaciens-subti1isin. Ækvivalente aminosyrer er naturligvis ikke begrænset til aminosyrer for Tyr217, men stræk-5 ker sig til enhver rest, som er ækvivalent med en rest i B. amyloliquefaciens, hvad enten sådanne rester er bevarede eller ikke.

Ækvivalente rester, som er homologe på det tertiære struktur-niveau for en forstadie-carbonylhydrolase, hvis tertiære struktur er blevet bestemt ved røntgentkrystallografi , er defineret som sådanne, for hvilke atomkoordinaterne for 2 eller flere af.hovedkædeatomerne i en bestemt aminosyrerest fra for-stadiecarbonylhydrolasen og B. amyloliquefaciens-subti1isin (N på N, CA på CA, C på C og 0 på 0) er inden for 0,13 nm og foi— trinsvis 0,1 nm efter at være blevet rettet ind. Der opnås retten ind efter at den bedste model er blevet orienteret og anbragt i stilling til at give det maksimale overlap af atomkoordinater for ikke-hydrogenproteinatomer fra den pågældende carbonylhydrolase med B. amyloliquefaciensrsubti 1 isin. Den bedste model er den krystallografiske model, som giver den laveste R-faktor for eksperimentelle diffraktionsdata ved den højest tilgængelige opløsning.

Σ1 Fo(h))-)Fc(h) I 25 h R-faktor = rlFo(h)] h Ækvivalente rester, som er funktionelt analoge med en specifik 30 rest i B. amyloliquefaciens-subti 1isin, defineres som de aminosyrer i forstad i ecarbonylhydrolaserne, som kan antage en sådan konformat i on, at de enten ændrer, modificerer eller bidrager til proteinstruktur, substratbinding eller katalyse på en måde, som er defineret og tilskrevet en specifik rest i B.

35 amyloliquefaciens-subti 1isin som beskrevet heri. De er desuden de rester i forstadiecarbonylhydrolasen (for hvilken en tertiær struktur er blevet opnået ved rontgenkrystallografi), som optager en analog position i det omfang, at skønt hovedkæde-

I DK 175523 B1 I

I I

atomerne i en givet rest muligvis ikke opfylder ækvivalenskri - I

terierne på basis af optagelse af en homolog position, ligger I

I atomkoordinaterne for mindst to af sideksdeatomerne i resten I

I inden for 0,13 nm af de tilsvarende s idekædeatomer i B. amylo- I

I 5 1 iquefaciens-subti 1 is in. De tredimensionelle strukturer ville I

I blive rettet ind som angivet ovenfor. I

I Nogle af de rester, som er identificeret til substitution, I

I indsættelse eller deletion, er bevarede rester, mens andre ik- I

I 10 βΓ ^et* N**r drejer sig om ikke-bevarede rester, er er- I

I statningen af en eller flere aminosyrer begrænset til substi- I

I tutioner, som fremkalder en mutant med en aminosyresekvens, I

I der ikke svarer til en, der findes i naturen. Når det drejer I

I sig om bevarede rester, skulle sådanne erstatninger ikke re- I

sultere i en naturligt forekommende sekvens. Carbonylhydrola- I

I semutanterne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter de I

fuldt udviklede former af carbony!hydro!asemutanter samt pro- I

I og præpro-formerne af sådanne hydro 1asemutanter. Præpro-for- I

I nierne er den foretrukne konstruktion, eftersom dette letter I

I 20 ekspressionen, udski11 el sen og modni ngen af carbonyl hydrolase- I

mutanterne. I

I "Ekspressionsvektor" refererer til en DNA-konstruktion inde- I

I holdende en DNA-sekvens, som er operativt bundet til en egnet I

I kontrolsekvens, der er i stand til at bevirke ekspressionen af I

I 25 I

denne ONA i en egnet vært. Sådanne kontrolsekvenser omfatter

I en promotor til at bevirke transskription, en eventuel opera- I

torsekvens til at regulere sådan transskription, en sekvens, I

som koder for egnede mRNA-ribosombindingssteder og sekvenser, I

I som regulerer afslutning af transkripti on og translation. Vek- I

30 I

toren kan være et plasmid, en fagpartikel eller blot et muligt

genomt indsættelsesstykke. Når vektoren først er transformeret I

ind i en egnet vært, kan vektoren replikere og virke uafhæn- I

gigt af værtsgenomet eller kan i nogle tilfælde integrere ind I

i selve genomet. I den foreliggende beskrivelse anvendes I

I 3 5 I

"plasmid" og "vektor" til tider i flæng, eftersom plasmidet

for tiden er den mest almindeligt anvendte vektorform. Opfin- I

delsen skal imidlertid omfatte sådanne andre former for eks- I

15 DK 175523 B1 pressionsvektorer, som tjener ækvivalente funktioner og som er, eller bliver kendte inden for fagområdet.

De "værtsceller", som anvendes i den foreliggende opfindelse, s er sædvanligvis prokaryote eller eukaryote, værter, som fortrinsvis er blevet manipuleret ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i EP publikation nr. 0130756 for at gøre dem ude af stand til at udskille enzymatisk aktiv endoprotease. En foretrukket værtscelle til ekspression af subtilisin er Bacillus-stammen BG2036, som mangler enzymatisk aktiv, neutral protease og alkalisk protease (subtilisin). Konstruktionen af stamme BG2036 er beskrevet i detaljer i EP publikation nr. 0130756 og yderligere beskrevet af M.Y. Yang et al. (198A) 0. Bacteriol.

160, 15-21. Andre værtsceller til ekspression af subtilisin omfatter Bacillus subtilis 1168 (EP publikation nr. 0130756).

Værtsceller transformeres eller transficeres med vektorer, som er konstrueret under anvendelse af DNA-rekombineringsteknik-ker. Sådanne transformerede værtsceller er i stand til enten at replikere vektorer, som koder for carbonylhydrolasemutan- 20 terne eller udtrykke den ønskede carbonylhydrol asemutant. Når det drejer sig om vektorer, som koder for præ- eller præpro-formen af carbonyIhydrolasemutanten, udskilles sådanne mutanter, når de udtrykkes, typisk fra værtscellen i værtscellemediet.

25 Når forholdet mellem to DNA-regioner beskrives, betyder "operativt bundet" blot, at de er funktionelt relaterede til hinanden. En præsekvens er f.eks. operativt bundet til et peptid, hvis den virker som en s i gna 1 sekvens, der deltager i udskil-30 leisen af den fuldt udviklede form af proteinet, hejst sandsynligt involverende spaltning af signalsekvensen. En promotor er operativt bundet til en kodningssekvens, såfremt den regulerer transkriptionen af sekvensen, og et ribosombindingssted er operativt bundet til en kodende sekvens, såfremt det er an-35 bragt således, at det muliggør translation.

De gener, som koder for den naturligt forekommende forstadie-carbonylhydrolase, kan opnås i overensstemmelse med de gene- i

I DK 175523 B1 I

I 16 I

I relle metoder, der er beskrevet heri og i EP publikation nr. I

I 0130756. I

I Når carbonylhydrolasegenet først er blevet klonet, foretages I

I 5 der et antal modifikationer for at forbedre anvendelsen af I

genet udover syntese af den naturligt forekommende forstadie- I

I carbony1hydrolase. Sådanne modifikationer omfatter fremstil- I

I lingen af rekombinerede carbony1 hydro 1 aser som beskrevet i EP I

I publikation nr. 0130756 og fremstillingen af de heri beskrevne I

I ^ carbonylhydrolasemutanter. I

I Car bony1 hydro 1 asemu tanterne ifølge den foreliggende opfindelse I

kan dannes ved stedspecifik mutagenese (M. Smith (1985) Ann, I

I Rev. Genet. 423, M.J. Zoeller et al. (1982) Nucleic Acid Res. I

I 10, 6487-6500), cassettemutagenese (EP publikation nr. I

I 15 0130756) eller tilfældig mutagenese (D. Shortle et al. (1985) I

Genetics, 110 539; D. Shortle et al. (1986) Proteins: Structu- I

I re, Function and Genetics, 1, 81; D. Shortle (1986) J. Cell. I

I Biochem, 30, 281; T, Alber et al. (1985) Proc. Natl. Acad, of I

I Sci . , 82 , 747; M, Matsumura et al. (1985) J. Biochem., 260, I

I 20 I

15298H. Liao et al. (1986) Proc. Natl. Acad, of Sci., 83, I

I 576) af den klonende forstad iecarbony1hydrolase. Cassettemuta- I

genemetoden og metoden med tilfældig mutagenese beskrevet heri I

I foretrækkes. I

I 25 Mutantcarbony1hydrolaserne, som udtrykkes efter transformation I

I af egnede værter, screenes for enzymer, som udviser en eller I

I flere egenskaber, som er væsentligt anderledes end egenskaber- I

I ne hos forstadiecarbony1 hydro 1 aserne, f.eks. ændringer i sub- I

I stratspecificitet, oxidativ stabilitet, termisk stabilitet, I

I 30 a 1ka1 i stab i 1 itet, modstandsdygtighed over for proteolytisk I

I nedbrydning, pH-aktivitetsprofiler og lignende. I

I En ændri ng i substratspec ificitet defineres som en forskel I

I mellem forstadiecarbonylhydrolasens kcat/Km-forhold og hydro- I

I 35 1aseroutantens forhold. kcat/Km-forholdet er et mål for kataly- I

I tisk effektivitet. Carbonylhydrolasemutanter med forøgede el- I

I ler formindskede kcat/Km-forhold er beskrevet i eksemplerne. I

I Formålet vil sædvanligvis være at sikre en mutant med et stør- I

17 DK 175523 B1 re (numerisk større) kcat/Km-forhold for et givet substrat, hvorved muliggøres anvendelsen af enzymet til mere effektivt at virke på et målsubstrat. En væsentlig ændring i kcat/Km-forholdet er fortrinsvis mindst en to ganges forøgelse eller 5 formindskelse. Mindre forøgelser eller formindskelser i forholdet (f.eks. mindst 1,5 gange) betragtes imidlertid også som væsentlige. En forøgelse i kcat/Km-forhold for et substrat kan ledsages af reduktion i kcat/Km-forhold for et andet substrat. Dette er et skift i substratspecificitet, og mutanter, som ud -10 viser sådanne skift, kan anvendes, hvor forstad iehydro lasen er uønskelig, f.eks. for at forhindre uønsket hydrolyse af et bestemt substrat i en blanding af substrater. Km og kcat måles i overensstemmelse med kendte procedurer, som beskrevet i EP publikation nr. 0130756 eller som beskrevet heri.

15

Oxidativ stabilitet måles enten ved hjælp af kendte procedurer eller ved de i det følgende beskrevne metoder. En væsentligt ændring i oxidativ stabilitet vises ved mindst ca. 50% forøgelse eller formindskelse (fortrinsvis formindskelse) af has-20 tigheden af enzymaktivitetstab ved udsættelse for forskellige oxiderende betingelser. Sådanne oxiderende betingelser er udsættelse for det organiske oxidationsmiddel diperdodecansyre (DPDA) under de i eksemplerne beskrevne betingelser.

Alkalistabilitet måles enten ved hjælp af kendte procedurer 25 eller ved hjælp af de heri beskrevne metoder. En væsentlig ændring i a 1ka1 i stab i 1 itet vises ved mindst ca. 5% eller større forøgelse eller formindskelse (fortrinsvis forøgelse) i halveringstiden for en mutants enzymaktivitet sammenlignet med for-stadiecarbonylhydrolasen. Når det drejer sig om subti1 is i ner, 30 blev alkalistabilitet målt som en funktion af autoproteolyti sk nedbrydning af subtilisin ved alkalisk pH-værdi, f.eks. 0,1 M natriumphosphat, pH-værdi 12 ved 25 eller 30°C.

Termisk stabilitet måles enten ved hjælp af kendte procedurer 35 eller ved hjælp af de heri beskrevne metoder. En væsentlig ændring i termisk stabilitet vises ved mindst ca. 5% eller større forøgelse eller formindskelse (fortrinsvis forøgelse) i halveringstiden for en mutants katalytiske aktivitet, når den

I DK 175523 B1 I

I 18 I

uds*ttes for en relativt høj temperatur og neutral pH-værdi I

H sammenlignet med forstadiecarbonylhydrolasen. Når det drejer I

I sig om subti 1 i s i ner, måles termisk stabilitet ved den autopro- I

teolytiske nedbrydning af subtilisin ved forhøjede temperatu- I

5 rer og neutral pH-værdi, f.eks. 2 mM ca 1 c i umch lor i d, 50 mM I

I MOPS pH-værdi 7,0 véd 59°C. I

I Opfinderne har fremstillet mutantsubti 1 i s i ner indeholdende I

I substitutionen af aminosyreresterne af B. amy1oliquefaciens- I

I subtilisin vist i tabel I. Vi 1dtypeaminosyresekvensen og DNA- I

sekvensen af B. amyloliquefaciens-subti 1isin er vist i fig· 1· I

I I

I 20 I

25 I

I 30 I

35 I

19 DK 175523 B1

TABEL I

Rest _Erstatning sannnosyre_

5 Tyr21 F A

Thr22 C

Ser24 C

Asp32 Q S

Ser33 A T

' 10 Asp36 A G

Gly46 V

Ala48 E V R

Ser49 C L

Met50 C F V

15 Asn77 D

Ser 87 C

Lys94 C

Val95 C

Leu96 D

20 Tyr 104 ACDEFGHIKLMNPQRSTVW

Ilel 07 V

GlyllO C R

Meti24 I L

Asnl55 A D H Q T

25 Glul56 Q S

Glyl66 CEILMPSTWY

Glyl 69 CDEFHIKLMNPQRTVWY

Lysl70 E R

Tyri 71 F

30 Prol72 E Q

Phel 89 ACDEGHIKLMNPQRSTVWY

Aspi 97 R A

Metl99 I

Ser204 C R L P

35 Lys213 R T

Tyr 217 ACDEFGHIKLMNPQRSTVW

Ser221 A C

I DK 175523 B1 I

I 20 I

De forskellige substituerede aminosyrer er angivet i tabel I I

I ved hjælp af de følgende enkeltbogstavsbetegnelser: I

I Aminosyre I

I g eller rest 3-bogstavs- 1-bogstavs- I

I deraf_ symbol symbo 1 I

I Alanin Ala A I

I Glutamat Glu E I

I Glutamin Gin Q I

I ίο I

Aspartat Asp D I

I Asparagin Asn N I

Leucin Leu L I

I Glycin Gly G I

I Lysin Lys K I

I 15 Serin Ser S I

I Valin Val V I

I Arginin Arg R I

I Threonin Thr T I

I Proli n Pro P I

I 20 I

Isoleucin Ile I I

I Methionin Met Μ I

I Phenylalanin Phe F I

'Tyrosin Tyr Y I

Cystein Cys C I

I 25 I

Tryptophan Trp W I

I Histidin His Η I

I Bortset fra hvor andet er angivet i sammenhængen, er vildtype- I

I aminosyrer angivet med de ovenstående tre-bogstavssymboler og I

I 30 erstattede aminosyrer med de ovenstående enke 11-bogstavssymbo- I

I ler. Såfremt således methionin i rest 50 i B. amy1oliquefaci - I

I ens-subti1isin erstattes med phenylalanin, kan denne mutation I

I (mutant) betegnes Met50F eller F50. Tilsvarende betegnelser I

I anvendes for multiple mutanter. I

I 35 I

I Udover de aminosyrer, der anvendes til at erstatte de i tabel I

I I beskrevne rester, forventes andre erstatninger af aminosyrer I

I ved disse rester at danne mutantsubti 1 i si ner med nyttige egen- I

21 DK 175523 B1 skaber. Oisse rester og erstatningsaminosyrer er vist i tabel 11.

TABEL II 5

Rest Erstatninqsaminosyre(r)

Tyr-2l I

Thr2 2 K

Ser24 A

Asp3 2 10

Ser33 G

G1 y4 S

Ala48

Ser49

Het50 L K I V

15

Asn77 D

Ser87 N

Lys94 R Q

Val95 LI

Tyrl04 20

Metl24 K A

Al a 152 C L I T M

Asnl55

G1Ul56 A T M L Y

Glyl66 25 Glyl69

Tyrl71 K' R E Q

Prol72 0 N

Phel89

Tyr217 30

Ser221

Met222

Hver af mutantsubti 1 i s i nerne i tabel I indeholder erstatningen af en enkelt rest i B. amylo 1 iquefaciens-aminosyresekvensen.

35 Disse bestemte rester blev valgt for at undersøge indflydelsen af sådanne substitutioner på forskellige egenskaber hos B. amyloliquefaciens-subtil i sin.

I DK 175523 B1 I

I 22 I

I Opfinderne har således identificeret Metl24 og Met222 som vig- I

I tige rester som, såfremt de substitueres med en anden aminosy- I

re, danner en mutantsubti 1 i sin med forbedret oxidativ stabili- I

I tet. For Metl24 er Leu og Ile foretrukne erstatningsaminosy- I

I 5 rer. Foretrukne aminosyrer til erstatning af Met222 er beskre- I

vet i EP publikation nr. 0130756. I

I Forskellige andre specifikke rester er også blevet identifice- I

ret som værende vigtige med hensyn til substratspecificitet. I

I jq Disse rester omfatter Tyrl04, Alal52, Qlul56, Glyl56, Glyl69, I

I Phel89 og Tyr217, for hvilke der allerede er blevet fremstil- I

I let mutanter indeholdende de forskellige i tabel I viste er- I

statningsaminosyrer samt andre rester, som er vist nedenfor, I

I for hvilke der endnu skal laves mutanter. I

I 15 I

Identifikationen af disse rester, herunder dem, som endnu skal I

muteres, er baseret på opfindernes højopløsningskrystalstruk- I

I tur af B. amylol iquef aciens-subti 1 isin til 1,8 A (se tabel I

I III), deres erfaring med in vitro-mutagenese af subtilisin og I

I litteraturen om subtilisin. Dette arbejde og røntgenkrystal- I

I 20 I

strukturerne af subtilisin indeholdende covalent bundne pep- I

I tidinhibitorer (J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, I

2439-2449), produktkomplekser (J.D. Robertus et al. (1972) I

Biochemistry 11 , 4293-4303 ) og overgangst i 1 standsanaloger I

I (D.A. Matthews et al. (1975) J. Biol. Chem. 250, 7120-7126, I

I 25 T.L. Poulos et al. (1976) J. Biol. Chem. 251, 1097-1103) har I

I hjulpet med til at identificere en forøget peptidbindingskløft I

I i subtilisin. Denne substratbindingskløft sammen med substrat I

I er vist i et skematisk diagram i fig. 2, i overensstemmelse ' I

I med I. Schechter et al.'s nomenklatur (1967) Biochem. Bio. I

I 30 I

Res. Commun. 27, 157. Den spaltelige binding i substratet er I

I identificeret med en pil. P- og P'-betegnelserne refererer til I

de aminosyrer, som er anbragt henholdsvis mod amino- eller I

I carboxyenden i forhold til den spaltelige binding. S- og S'- I

I betegnelserne refererer til understeder i substratbindings- I

I 3 5 I

kløften på subtilisin, som vekselvirker med de tilsvarende I

I substrataminosyrerester. I

23 DK 175523 B1

AtookoorcH nater for apoenzyofornen af B. amyloliquefaciens-subti1isin til 1,8 A opløsning 1 ål« H 19,414 S3.195 -21,755 1 ALA C· 15.111 51,774 -21,965 1 AL* C 11.131 50,9!5 *11,31* I *L* 0 10,176 51,151 -20,175 1 ALA CB 11.055 51,Jll -11,103 2 KLO « 10.260 45.006 -22,0*1 2 CL« C* 17,219 49,008 -21,*34 2 6LN C 17.*75 41.706 -20,992 2 CL« O 11,165 41,165 -21,691 2 CL« CB 16,125 40,760 -22,**9 2 CL« CC 15,020 47,905 -21,917 2 CL« CO 13,912 41,762 -22,530 2 CL« Oil 13,023 40,612 -22,167 2 CL« «Ε2 14,115 44,917 -23,926 3 U> « 17.477 .47,205 -19,952 3 SCO CA 17,950 45,060 -19,437 3 U* C 16,735 44,910 -19,490 3 SE· O 15,590 45,352 -19,229 3 Jf· CO 19,500 45,830 -10,069 3 SE· Ot 17,602 46,210 -17,049 4 VAL « 16,991 43,6*6 -19,725 4 VAL CA 15,946 42,619 -19,639 4 VAL C 16,129 41,934 -10,290 4 VAL 0 17,123 41,170 -10,006 4 VAL CO 16,000 41,622 -20,022 4 VAL CC1 14,074 40,572 -20,741 4 VAL CC2 16,017 42,266 -22,186 5 9B0 « 15,239 42,106 -17,331 5 rao CA 15,384 41,415 -16,027 S 9*0 C 15,501 39,905 -16,249 5 r*0 O 14,005 39,263 -17,1*6 5 OBO CB 14,150 41,080 -15,263 5 MO CC 13,0*1 43,215 -15,921 S MO CO 14,044 42,906 -17,417 6 77« « 16,363 39,240 -15,407 6 778 CA 16,628 37,003 -15,715 6 77· C 15,359 36,975 -15,528 6 77· O 15-,224 35,943 -16,235 6 7TB CO 17,024 37,323 -1*,03* 6 77B CC 10,021 35,047 -15,055 6 7TB COl 10,437 35,452 -16,346 6 7TB CD2 17,696 34,900 -14,071 6 TTB Ctl 10,535 34,070 -16.653 6 7TB CE2 17,015 33,539 -14,3T9 6 TTB Cl 10,222 33,154 -15^620 6 7TB O« 10,312 31,030 -15,996 7 CL7 N 14,464 37,362 -14,630 7 CL7 C· 13,211 36,640 -14,376 7 CLT C 12,400 36,535 -15.670 7 CLT O 11.747 35,470 -15,003 0 VAL « 12,441 37,529 -16,541 0 VAL CA 11,777 37,523 -17,036 0 VAL C 12,363 36.433 -18.735 O VAL O 11,639 35,716 -19,470 • VAL CO 11,765 36,900 -18^567 · VAL CC1 11,106 30,893 -19,943 • VAL CC2 10,991 39,919 -17,733 9 Sit « 13,661 36,310 -10,775 9 5EB CA 14,419 35,342 -19,562 9 SEB C 14,188 33,920 -10,965 9 SER 0 14,112 33,014 -19,801 9 SEB CB 15,926 35,632 -19,505 9 SEB OC 16,162 36,7*7 -20,350 10 CL« N 14,115 33,087 -17,662 10 CL« CA 13,964 32,636 -16,876 10 CL« C 12,607 31,087 -17,277 10 CL« O 12.705 30,642 -17,413 10 CL« CB 14,125 32,085 -15,410 10 CL« CC I4I295 31.617 -14,500 10 CL« CO 14.406 31,911 -13,147 10 CL« OEl 14,554 33,060 -12,744 20 CL« «Ε2 14,552 30,960 -12,251 11 ILE « 11,625 32,575 -17,670 11 ILE CA 10,373 91,904 -10,102 11 ILE C 10,209 31,792 -19,605 11 ILE 0 9,173 31,333 -20,100 11 ILE CO 9,132 32,669 -17,475 11 ILE CC1 9,066 94,117 -10,049 11 ILE CC2 9,162 32,655 -15,941 11 ILE COl 7,500 34,648 -17,923 12 LTS N 11,272 92,105 -20,277 12 LVS CA 11,380 92,119 -21,722 12 L7 5 C 10,456 33.006 -22,522 12 LTS O 10,178 32,703 -23,606 12 LTS CB 11,257 30,646 -22,216 12 LT5 CC 12,283 29,030 -21,423 12 LTS CO 12,543 20,517 -22,159 12 LVS C£ 13,023 27,467 -21,166 12 LTS M2 14,476 27,600 -20,»35 11 ALA N 10.109 14,138 -21,991 11 ALA CA 9,325 35,198 -22,631 13 ALA C 10,026 35,716 -29,063 13 ALA O 9,330 35,004 -24,901 13 ALA CO A,AA5 96,195 -21.565 14 BRO « 11,332 35,950 -23,093 14 9R0 CA 11.905 36,430 -25,120 14 OBO C 11,716 35,557 -26,317 14 MBO O 11,770 36,047 -27,44$ 14 MO CO 11,462 36,500 -24,692 |4 900 CC 13,320 36,978 -21,221 14 rao CO 12,281 35,916 -22,750 15 ALA « 11,560 94.216 -26.129 15 ALA CA 11,179 93,450 -27.367 15 ALA C 10,002 33,795 -21,032 15 ALA O 10,000 33,710 -29,271 15 ALA CO 11,552 31,969 -27,062 16 LEU H 9,005 34,110 -27,240 16 LEU CA 7,791 34,550 -27,021 16 LEU C 7,912 35,925 -20,521 16 LEU 0 7,342 36,126 -29,500 16 LEU CO 6,744 34,423 -26,498 16 LEU CC 5,790 33,465 -26,522 16 LEU CD1 5,001 31,23* -27,009 16 LEU C02 4,49* 32,287 -24,203 17 «15 0,645 34.020 -27,922 IT MIS CA 0.090 30,151 -20,530 17 «η C 9,510 37,981 -29,890 17 HIS O 0,107 31,422 -30,054 17 Hl5 CB 9,700 39,100 -27,652 17 HIS CC 9,105 39.208 -24,262 17 HIS «01 9,910 39,027 -25,272 17 RIS C02 0,008 38,92« -25,69* 17 MIS CCI 9,224 39,914 -24,1*4 17 HIS HE2 8,079 39,128 -2«,181 18 . SEA M 10,443 37,013 -10,022 IB SEOCA 11^109 34^739 -31,322

I DK 175523 B1 I

I 24 I

I I« M* C ID, 11* ll.in Οί,ΙΜ M Itl o U,**» I»,I12 «11,11* I

il Mt ci w.ni ιι,τ»* ->i,m n tu g; n,in i«,*»o -io,j«i I

i· li« μ «,οιο m,*i> -ti,**i i* c* t,oit >«,«** -ti,m I

t* II« C 1,1*1 11,111 -11.101 1* 6IN 0 *,217 >1,172 -I4.211 I

It tu Cl 1,111 )!,1*1 -11,110 1« 6LN (6 I,*7» 11,101 -11,111 I

II tu CO é,lll 11,101 -11,111 11 CLK 011 1,11« 11(111 -11,«·* I

11 tu Ml 1*141 10,111 -10*11« 10 ILT k 1,101 11,111 -11,111 I

10 ILT C« 4,1«« 10,111 -11,011 10 CL1 C lim 1I,«H -11,110 I

io K« o «,141 i*,!?* -ιι,ιιι n m « i.ioi n.iei -ιο;ι*ι I

ti 1«· C4 4,110 11,111 -11(141 ti Ilt c *,lt« >1,111 -ti,111 I

ti TTI O «,*12 11,07* -17,71» Il «VI Cl l,««l I« 411 -11,««I I

11 111 cc 1,17} >J,70* -10,701 11 TTt cøl t.TU l*,)J2 —11,110 I

ti 11« tøl 1,410 »4,7%* -11,111 11 11* ctl 1,104 »(111 -11,444 I

ti 77» C11 1(171 »*,141 -11,111 11 77» Cl 1,001 I«,711 -11,0*7 I

11 171 OK 1,101 »*,!*1 -1«,I»0 12 1« N 1,102 11,«10 -2*;iii I

ti INI C* 4,2*2 *0,127 -27(12« 22 1κ» C 1,011 40,«22 -2*,S** I

»I 1MI O 1,2*7 «1,721 -21,121 22 7»» Cl 1,111 «1,711 -27,111 I

tt TM οβί 4,110 *2i*17 -21,1*7 12 TMt CC2 *,«7* «1.121 -11,12* I

ti CL7 N 1,111 *0,211 -24«*$1 21 CL1 C* 0,10« 40.4C0 -21,1*2 I

ts 6LT c -0,117 *1,411 -2*,lll 11 Cif O -1,01) «2,00» -21,110 I

t* Ilt k -0,021 *1,1*7 -27,171 2« SU C· -0,117 *2,117 -11,012 I

t* Ilt C ->,101 *2,«2» -27'.It* 2* SO* 0 -1,011 «1,101 -21,1*0 I

I* M* Cl -0,71* *lil2C -21*120 2* ttt Ot 0,1*1 41,»12 -2·,Τ2Ι I

ti »l« « -1,011 41,411 -17,11» II ISN c* -4,11« *1,417 -niItl I

t> Mt c -1,011 42,171 -24,201 21 1U 0 -1.213 *2,1*1 -24,210 I

I* 4IN Cl -1,1*1 41,227 -20,703 21 11» Ct -«,**0 **il70 -20,101 I

21 41N C01 -4,141 *1,747 -11,011 21 AIW »31 -4,147 41,4*1 -21,114 I

24 «AL h -«,177 42,««1 -21,212 2· *4L C* -«,47« 41,*7* -2*ll*| I

24 V4L C -*,7«2 *2,412 -22,*11 24 **L O -2,151 4lr«ll -22,411 I

24 «U Cl -1,71* 40,101 -23,121 24 V*L Ctl -*,1«0 »1,102 -22,0*1 I

2* m Ctl -1,0*0 »*,17* -20,011 27 L71 N -1,110 «liftll -22,101 I

27 L7S C« -*,133 41,12« -21,171 »7 ITS C -1,011 *2,172 -11.0*1 I

27 L7S 0 -4,«01 *1,173 -1·,41) »7 LTJ CO -7/0*0 41,*11 -21,14* I

27 LTI et -1,044 44,171 -22,4*0 27 LT1 CD -*,121 «1,102 -22,020 I

27 LTI CC -10,10« , 41,4*7 -21,117 27 LTI M -«,414 «4,211 -24.244 I

<4 «*1 N -4,110 41,442 -10,203 20 **l C« *»7 «2,710 -27,117 I

20 *41 C -4,711 «1,«}« -14,021 20 ««I O -«,26* *1,0·» -14,017 I

tt **L Cl -2,124 «2.444 -17,132 || *«l Ctl -li*** 42,111 -Mill* I

ti V4L CC2 -2,4*7 *1,105 -11,171 2* til M -1,41« 41,127 -llilll I

21 41* C« -1,747 4«,110 -14,411 »I åU C -4,710 «4,010 -11,111 I

11 M-4 6 -4,444 42,141 -11,10« ti 414 Cl -lillt 44,107 -14,111 I

»C *4L N -4,017 41,033 -11,072 »O V*l C* -1,1*4 44,142 -11,110 I

>0 Y4L c -1,711 41,401 -10,411 10 *«L O -4,111 44,4*1 -10,171 I

tø «41 Cl -1, Ml 4»;ilO -12,1*1 »O **L Ctl -0,1.14 41,101 -10,100 I

>0 «Μ ctl -l.tu 41,214 -11,107 >1 Ul N -4,11« «4,111 -Ι,ΟΤΤ I

>1 Mt c« -1,221 4«,0*4 -1,47« 11 JLf C >4,1*4 ««,111 -1,1*4 I

ti Ml O -1,121 «1,111 —4,117 11 Uf Ct -4,*17 *1,77* -0,101 I

M XCI ctl -7,2*4 41,707 -1,7*1 Ji li» Ctl ·ΐ;ΐ7| 44,011 -72221 I

11 M< C01 -I,417 *2,014 -1,717 « *}» * -4,0** **,111 -7,227 I

ti Μ» C* -2,1** **,**7 -«,211 12 *1» C -»,071 47,111 >0,70» I

>2 *1» 0 -«,1*7 «*;«!« -1,102 12 «I» Cl -1,411 *4,121 -Ulli I

ti .41» Ct -0,411 41,102 -4,211 li *1» Od *,01* 44,1*2 -42174 I

ti *1» 002 -0,011 «4,42« -1,110 »} 1(1 n -1,V11 41,112 -1,114 I

ti M· C* -1,1*1 4«,117 -4,101 »| til C -l,*12 00,«74 -Ι,ΙΟΙ I

ti M« C -1,70» »2,114 -!,}*! »1 11* Ct -6,411 *1,«22 -»,«1* I

B ti M· Øt 6,11! »0,021 -4,774 1« &LT N -1,27] »0.7*0 -TjM* I

>* Mt C* -1,211 11,721 -0,1*1 »4 CLT C -1,01* »1,·«· -7,OIT I

>* 4L7 O -0,14* »0,011 -0,7*1 |S ue » -0,1*1 »li*ll -10,102 I

I t* ILI C* ,0,201 »2,411 -10,*11 >| K( C ».1*1 11,*11 -11,2*3 I

»I Hf o -0,127 !*,»]* -11,74« »I JLl Cl -0.0*1 11.*«* -12,1*7 I

I ·* XH Ctl -0,010 00,210 -11,01» »5 Kt CC2 1,1*1 11,7*1 -llilll I

I ti ne COl -0,1*2 4*,*01 -II,«2* »» 11» H 1.01« I«.211 -10,171 I

I t« «I» C« 1,11* 10,»10 -11,212 »· II» C 2^211 lljlll -12,702 I

25 - DK 175523 B1 3» 6SP O 3.004 55,471 -13.ST9 3« *5» CB 5,712 55.720 -10,51« 3· *1^ CC *,339 57,9*9 -loilO* 34 A iA ODI 5,755 57.97« -11,429 34 ål* OD2 5,4*1 57.277 -10,243 37 3(· ft 1,304 34,122 -13,111 37 SE· Cl 1,113 57,221 -14.512 37 S(R C 2,377 30,095 -14,949 37 SE· O 2,545 31,303 -14,151 37 Sfl CB -0,093 30,049 -14,711 37 Sd OS —1,030 59,133 -13,179 31 «· ft 3,113 31,414 -14,001 31 SE· C* 4,2il 39,305 -14,4·7 3· St* C 5,444 50,705 -14,992 3· SE O 4,5*3 S9,2S1 -15,215 31 SI· CB 4,742 10,435 -13.39· 3· SE· Ot 5,374 59,945 -12,234 39 MIS ft 5,454 37,390 -14,192 39 MIS C4 4,437 S«iS7* -15,291 39 MIS C 4,411 34,401 -14,77· 99 MIS O 5,731 55il7· -17,419 39 NIS CB 4,437 55.203 -14*515 99 MIS CC 0,014 54,409 -14,454 39 MIS «01 1.795 34,514 -15,541 39 HIS C02 ·,Τ»9 54,345 -13,319 39 MIS CE1 9,970 33.930 -15,130 39 Ml5 ME2 9,914 53,910 -13.«08 40 MO ft 7,107 34,134 -17,317 «0 MO C4 7,91» 54,497 -19,131 40 HO C 0,154 3S,2tO -19,357 40 MQ O 1,032 55,097 -20,571 ' 40 MO C9 9,247 37,533 -19)161 40 MD CC 10,053 57,403 -17,902 40 MO CD 1,981 37.452 -16,774 41 ASP M 1,4(1 34,328 -11,485 41 ASP 002 11,140 30,399 -18,468 41 ASP 001 10.32$ 51,395 -20,429 41 457 CC 10.473 51,307 -19,211 41 ASM Cl 9,799 52,239 -18,224 41 ASP CA lUtS 52,959 -11,966 61 ASP C 7.311 52,163 -18,139 41 ASP O 7,396 50.947 -11.977 42 LEU M 4,115 52,103 -18,SS8 42 LEU CA 4,192 32.147 -11,466 62 LEU C 3,924 52,907 -19,376 42 LEU O 31993 54,163 -19,490 42 LEU CB 4,421 52,15» -17,000 *2 LEU CG 5,112 31,363 -15,946 «2 LEU C01 4,535 >1,546 -14,511 42 LEU C02 5,273 «9,177 -16,350 «3 LTS M 3,011 52,135 -19,946 43 LTS CA 1,093 52,415 -20,721 43 LT5 C 0,637 52,156 -20,010 «3 LIS O 0,304 30,920 -191120 43 LTS CB 2,021 52,319 -22,169 «3 LTS CG 0,685 32,436 -22,910 43 LTS CD 0,991 52,862 -24,339 43 LTS CE -0,110 52,51* -25,260 43 LTS Hl 0,337 51,757 -26,411 44 TIL M -0,191 53,03$ -19,490 44 TAL CA —1,4C7 52,639 -10,765 44 VIL C -2,571 32,117 -191731 «4 T4L O -2.623 53,906 -20,434 44 VIL CB -1,410 53,351 -17,313 44 V4L CC1 -2,724 52,941 -16)*82 4« VIL C62 -0,197 53,194 -16,55) 45 ALA « -3,49* $1,951 -19,171 45 ALA CA -4,619 51,977 -20.110 45 ALA C -5,1*1 52,507 -20,053 45 III O -4,703 53,015 -20.703 45 ALA Cl -4,831 50,510 -21,319 46 GLT M -5,910 52,356 -11)768 44 CLT CA -7,012 52,837 -18,001 46 GLT C -6,917 52.443 -16,538 46 CLT O -5,931 52,106 -16,035 47 CLT N -1,092 52.658 -15.793 47 CLT CA -1,014 52,2*6 -14,388 47 CLT C -9,179 52,757 -13,572 47 CLT O -9,91» S3,411 -14,115 41 ALI M -9,221 52.446 -12,330 40 ALA CA -10,255 52,170 -11,382 41 AU C -9,790 52,475 -9.961 48 (Lå O -9,066 51,720 -9,725 41 ALA CB -11,551 52,100 -11,617 49 SE« -10,149 53,547 -9,037 49 SE» CA -9,752 »3.355 -7,452 «9 SE· C -10,94? 52,986 -6,713 49 .SE* O -11,972 53,677 -4.908 «9 SE· C· -9,092 54,51· -7,029 *9 SEt OC -Ι,ΙΤΤ 54,255 -5,450 50 MET M -10,835 52,007 -5,932 50 MET CA -11,052 51,549 -4,974 SO MET C -11,463 51.962 -3,561 50 MET 0 -11,997 51,391 -2,575 50 MET Cl -12,012 50,010 -4,996 50 MET Ci -11,912 «9,463 -6,319 50 NET SO -13,461 «9)119 -7,256 50 NET CE -12,101 50,111 -0,903 51 T4L M -10,427 52,760 -3,422 51 Vll CA -9,968 53,170 -2)947 51 TAL C -10,630 541562 -1,90? 51 VAL 0 -11,217 55,437 -2.412 51 TAL C* -1,443 53,155 -2,000 51 VAL CC1 -7,092 53,579 -0,631 51 VAL CC2 -7,764 51,015 -2,302 !2 MO M -11,621 54,693 -1)056 52 MO CA -12,372 55,933 -0,121 52 MO C -11,490 17,123 -0,440 52 MO 0 -11,771 51,220 -0,925 52 MO CO -13,400 55,59« 0)244 52 Ρ·0 CC -13,513 >«,103 0,115 52 MO CD -12,164 532421 -0,175 55 SEI ft -10,442 54,906 0,299 53 St· CA -9,558 57,982 8)412 53 IE· C -8,420 58,2*5 -0,326 53 SE· 0 -7,479 59,22* -0)038 53 SE· C> -9,01* 57,707 2,049 53 S(8 OC -1,254 56,521 2,127 54 6LU ft -1,234 57.523 -1,393 54 ClU Cl -7,204 57,641 -2)421 54 GLU C -7.747 57,303 -3,715 54 CLU 0 -7,533 56,243 -4,379 54 GLU Cl -5,134 56,599 -2,154 54 CLU CC -5,219 56,959 -1,927

44 CUl rn 44^*4» 44 Kill flM —«44 «4,««4 -lp«4A

I DK 175523 B1 I

I 26 I

I S« CLU 012 -3,900 15,777 0,271 55 IM -0,571 *1.251 -9,245 I

SS TMI Cå -5.433 31.121 -5.441 35 TMI C -·,Τ44 31.135 -4,775 I

53 TMI 0 -5,433 37,515 -7,510 55 TM« C5 -15,354 35,230 -3,303 I

S3 TMI 041 -5,113 4θ{»10 -5,4|· S3 TMI CC2 -11,432 35,143 -4,017 I

34 «5· * -7,412 35,403 -4.077 34 4SN «02 -4,530 41,175 -5{t51 I

34 »30 001 -3,073 35,747 -10,337 94 ASM CC -3,273 35,529 -5,939 I

94 »3« CO -9,595 39.494 -5,205 54 »35 C4 -4,742 55,423 -5,200 I

54 435 C -4,012 37*094 -5,303 34 »35 O -3,104 56,044 -7,470 I

37 P50 5 -4.342 54,261 -5,23« 57 PIO C6 -7,123 35,237 -llil7I I

57 PIO CO -7,3*4 54,433 -10,272 37 PtO CO -4,444 94,171 -14,235 I

57 PIO C6 -3,679 54^961 -9,332 57 PtO C -4,301 SiitAZ -ti*** I

57 PtO O -3,505 14,120 -f',945 55 PMEM -3,990 56,242 -loJ*9l I

35 PME C* -2,747 34.577 -11,222 35 Puf C -1,712 37,125 -10.233 I

51 PHI O -5,635 37,497 -10,650 55 Pné C5 -2,943 97,302 -12,423 I

55 PME CC -3,953 56,945 -13,357 35 PME COt -3,756 53,750 -14,059 I

*5 PHI C02 -5,211 37,630 -13Us9 55 PME tEl -*Il22 35,233 -14,925 I

35 PME CE2 -4,194 37,093 -14,276 53 PME C2 -5,94* 33,939 -35,531 I

59 Cl« I -2,044 *7,119 -5,990 59 CLM C* -1,172 57,353 -7,934 I

»9 Hl C -0,507 54,403 -7!000 5* CLM O -1,439 36,053 -cIllS I

39 CLI CB -1,542 53,465 -7,089 59 CLM CC -«,942 59,241 -6,534 I

59 CLM CO -1,790 40.157 -S.150 59 CLM BE1 -1,404 41,255 -4,536 I

59 CLM ME2 —2,959 59,653 -4,742 60 *SP N 0,410 55,595 -7,211 I

>0 »** C* 0,551 34,792 -6,304 40 4SP C 1,631 331247 -5,090 I

60 ASP O 2,127 35.550 -5,231 49 *SP CO 1,396 53,744 -7,150 I

*0 4** « 2,077 52,535 -6,350 60 4SP 001 li.T46 52,337 -3,190 I

I *0 0D* 2,915 31,141 -7,030 63 ASM M 0,959 55,245 -3,950 I

61 ASM M02 -1,144 37,747 -2^347 61 ASM 001 0,466 58,546 -2,575 I

61 AS« CC -0,040 $7,470 -2,399 61 ASM CB 0,531 54,401 -12704 I

61 AS« CA 1.557 55,734 -2,700 61 ASM C 2,291 54,632 -1,940 I

»s» O 2,933 54.162 -0,902 62 ASM « 2,210 53,434 -2,468 I

62 AS« CA 2,577 52,348 -1,709 62 ASM C 4,124 SlLtSS -2,479 I

** Λ*4 O 4,951 51,313 -1,770 62 6SM CO i;753 $1,319 -1,421 I

*2 »S* CC 2,371 50,103 -0,697 62 4SN 001 2,433 49,077 -1,343 I

02 4S« «02 2,622 50,205 0,601 43 SEI M 4,152 52,104 -3,741 I

*5 «5 C* 5,159 51,696 -4,709 63 SE« C 5,071 50,256 -$t209 I

*3 SES O 5,593 49,790 -6,249 63 SE« CB 4,523 51,955 -4,012 I

H 5» SE* 05 4,871 50,49» -3,41» 64 HIS M *1202 49,475 -4,639 I

44 *1* CA 3,994 48.059 -4,935 *4 HIS C 3,366 *7,759 -6,241 I

44 0 3,161 46.974 -7,10» 64 MIS CB 3,104 47,501 -3,747 I

** «I» C6 3,144 46,021 -3,726 *4 MIS KOI 2,107 45,247 -4.241 I

44 "IJ C02 4,054 45,194 -3,135 64 HIS CE1 2,416 43,966 -4,054 I

64 Mis BE2 3,556 43,920 -J,365 65 CLf M 2,257 45,42« -4,557 I

** W-t C* 1,552 45,264 -7,530 65 CLT C 2,392 45,636 -91037 I

65 CLT O 2,230 45,071 -10,134 46 TmK N 3,233 49,659 -0,032 I

*6 TMI C6 4,064 $0,117 -9,954 60 THI C 5,019. 49,009 -10,291 I

44 T"· 0 5,333 40,709 -11,461 66 THI C9 4,746 511511 -9.667 I

66 HI 061 3,637 52,423 -9,406 66 7n* CC2 5,534 $21075 -10,049 I

*7 MIS M 5,655 40.643 -9,274 67 MfS C* 6,703 *7:361 -9,655 I

67 NIS C 4,091 66,141 -10,143 *7 MIS O 6,6*9 45,63» -11,150 I

47 »H c· 7,300 *7,071 -»,064 *7 MIS CC »,395 46,275 -0,14» I

*7 MIS M01 0,590 6*1907 -1,276 67 MIS C02 5,906 46,67» -0,076 I

47 NIS CE1 9,057 44,491 -»,299 *7 MIS M«2 10,670 45,514 -0,10* I

»* *»» *,»92 45,749 -9,731 40 P*L C* 6,142 44,607 -10,266 O

I 41 t44 C 3,»56 44^865 -11,740 40 TAL O 4,114 43,942 -12,335 I

I 41 ,4L 11 2,939 44.252 -9,306 48 TAL CC1 liftt 43,240 -101520 I

I 44 ,4L Ct2 3,319 43,705 -5,000 69 *L» M 3.373 46,0*9 -12,113 I

I 41 411 C4 3,037 46,441 -13,42» 69 4L» C 6,193 44,390 -14,»11 I

*9 »Li O 4,020 45,913 -15,565 69 *L» C5 21332 47,051 -13,354 I

70 CLT M 5,3*0 46,752 -13,914 70 CLT CA 4,595 44,005 -14,470 I

70 CLT C 7,0*· 45,370 -15,021 70 CLT O 7,40« 45,154 -16,119 I

I T,u * 4«320 44,431 -1*,130 71 IMS C4 7,IT7 43,019 -14,444 I

I I* ,-4 C 6,224 42,504 -11,543 7» 7μ· O 6,602 41,020 -14,495 I

71 TMI C8 7^119 42,070 -11,191 71 TM« 0C1 0,191 42,592 -12^390 I

27 DK 175523 B1

Tt TMI CC2 1.21* «I.!» -13,576 Tt VAL 4,930 «2,007 -»».*27 T2 VAL CA 3,976 42,491 -1*1«·« T2 VAL C 4.312 «3.004 -17,131 72 VAL O 4,3*1 *2,380 -18,840 T2 VAL C· 2,51* 42,847 -16,085 T2 VAL CC1 1,112 A2,*·· -»Till· T2 VAL CC2 2.1*2 *2.327 -14,723 TS ALA M 4,S3* 4*1*17 -17,3·· 7» AL* CA 4,»·? **,071 -19,1*7 T3 ALA C *,*33 44,333 -17.355 T3 ALA O 5.0*2 *1,1« -28.216 T3 ALA Cl 3,107 «9,4*1 -19.433 7* AL* · *,»** «*,427 -11.435 7* AL4 CA 7,*70 «7,591 -11,799 74 ALA C 7,7*0 47.4*· -20,3*2 . 7« ALA 0 7,757 44,4*0 -21,09« 7« ALA CO 11453 «7,4*4 -17,725 75 LEU 7,450 41,784 -21,037 75 LEU C« 7,812 48.741 -22.454 75 LEU C 7,192 48,568 -22,766 75 LEU 0 10,162 481750 -22,253 79 LEV CB 7.9*8 50,«71 -22,809 75 LEV CC 4,123 50,913 -22.379 75 Lill CD1 *L0T9 52,434 -22,300 75 LEU C02 5,076 50.442 -231405 74 ASA M 7,147 48,103 -24,167 7* ASM M02 12,315 46,432 -24.30* 74 ASN 001 10,750 45,040 -27,728 74 ASM CC 11,175 44,27« -26.102 74 ASM CA 10,010 44,651 -25,900 76 ASM CA 10,35« 47.731 -2*,73· 74 ASM C 10,103 47,040 -25,4*3 74 ASM O 10,157 47,479 -24,417 77 ASM H llLaO« «7,464 -251071 77 ASM CA 12,220 50,757 -25,481 IT ASN C nllOT 51,029 -25,3*8 77 ASM O 14,36« «9,777 -25,313 77 ASM CB 11,335 52,076 -25,117 77 ASM CC 11,250 52,027 -23,416 77 ASM 001 12,032 51,3*6 -22,717 77 ASM M02 »0,27* 52,7*1 -23,025 70 SCI M »4,125 52,267 -25,164 78 SEI CA 15,513 52,41« -2«,«06 70 5(1 C 15,Al« 52,742 -23,436 78 SCI O 16,982 53.071 -23.16« 78 5(1 CB 15,905 53,941 -25,507 71 SEI OC 15,726 53,170 -26,797 79 ILE M 14,151 52,565 -22,529 77 tL( Cl 15,155 52,71« -21,120 7« ILE C 14,617 51,683 -20,230 79 ILE 0 13,843 50,841 -20,67« 79 ILE CO »4,471 $*,114 -20,697 79 1L( CCl »2,7*5 »*.032 -20,814 79 ILE CC2 1*,777 59,320 -21,612 77 ILE COl 12,135 59.176 -20,159 80 CLf M 14,975 51,768 -18,781 80 CL7 CA 14,476 58,7*0 -17,713 80 CLT C 14,612 «9,4*8 -18,219 BO CLT O 15,719 *8,99« -18,5«« 81 VAL H 13,513 48,766 -17,980 81 VAL CA 13,411 «7,286 -18,061 81 VAL C 12,511 *6,V19 -19.217 81 VAL 0 121260 *7,739 -20,117 81 VAL CB 13,001 «6,755 -16,677 Bl VAL CCl 14,030 «7,00« -15,573 >1 VAL CC2 11.638 47,261 -16,231 02 LEU N 12,126 *5,6*5 -19,216 B2 LEU C* 11 i,312 «5,020 -20,256 S2 LEU C 10,390 «4,021 -19,510 02 LEU O 1θ1·5ί «3,356 -18,600 82 LEU CB 12,206 ««,219 -21,229 82 LEU CC Xi;«30 «3,568 -22,366 82 LEU COl 10,796 *4,657 -23,223 82 LEU C02 12,357 «2,675 -23,192 83 CL7 M 7,131 ««,180 -17.816 83 CLT CA S,L3J «3,321 -19,11« 83 CL7 C 8,027 *2,011 -171925 83 CLT O 8,5*4 41,822 -21,026 84 VAL M 7,272 41,112 -17,283 ·« VAL CA 6,973 39,807 -19,888 84 VAL C 6,164 40,030 -21,140 0« VAL 0 4,«24 39,472 -22,17« 04 VAL CB 6,256 30,920 -10,0*1 8« VAL CCl 5,6BO 37,677 -19,557 B* VAL CC2 7,190 30,507 -17,705 >5 ALA M 5,156 40.926 -21,02« OS ALA CA 4,217 41,19« -22.150 85 ALA C 4,213 42,683 -22,374 85 AL« O 3,260 43,401 -22,030.

05 «LA CB 2,1*6 40,643 -2ll741 84 990 N 5,240 «3,106 -23,059 •6 910 CA 5,413 4*,635 -23,205 »6 910 C 4,321 45,371 -23,9*7 86 910 O 4,291 «6,605 -23,8*9 06 9*0 CB 4,822 «4,78* -23,813 86 980 CC 7.030 «3.466 -24.546 06 »10 CO 41377 42,4*0 -23,436 . 87 se* M 3,5*8 44.476 -24,767 87 SE· CA 2,*09 45,32« -25,529 87 SE* C 1.103 45,132 -2«,*97 87 SE* O 0,162 45,513 -25,617 87 SE* Cl 2,«01 «*,777 -26,927 87 SE* OS 3,591 «5,1*3 -27:513 II «Lå H 1,017 44,54« -23,7*2 89 AL« CB -0,163 41,510 -21,121 18 ALA CA -0,273 ««,353 -29,OA* ·· ALA C -0,098 45,717 -22i«90 88 ALA 0 -8,17* «6,717 -22,«3» 89 SE* N -2,219 «5,491 -22,4T* •9 SC* OC -*.1*6 *7,102 -2«,2*0 89 SE* C7 -*,3*3 «6,903 -22,8«· 17 SE* CA -3,00» «6,867 -22,227 E« SE* C -3,13« 4*1780 -20,727 17 SE* O -3,773 45.86« -20,207 10 LEU N -li*** «7,656 -20,837 «0 LEU CA -2.371 *7,467 -18157) «0 LEU C -3,483 41,«30 -17,1** 70 LEU O -3,582 47,60« -18,215 «0 LEU C9 -01751 48,273 -18,«2* 70 LEU CC -0,233 «7,851 -17,17« «0 LFU COl -0,026 46,3*1 -17,217 70 LEU CD2 1,160 4E.52« -17,0*7 71 Tf« N -«,26« 47,7** -14,738 71 TT« C« -5,258 48,678 -1*,13T 71 TT« C -4,873 48,750 -1«,485

I DK 175523 B1 I

I 28 I

*1 ΤΤ» O -«,«96 47,749 «14,123 «1 TT· Cl -4,406 «1.0*3 «14,314 I

01 TT· C4 -7,0*4 40,237 -17.741 01 Tf· C01 -4,»** 47,413 -10.755 I

oi TT· C02 —7,*7l 40,275 -10,14* 01 TT· CE1 -4,005 47,072 -20,0*0 I

01 TT· CE2 -0,315 40,421 -1«,4*2 01 TT· Cl «7,7*4 4·,302 -20.463 I

*1 TT· OH —0,1«2 40,752 -21,764 02 AL4 H -4,0*5 49,950 -141104 I

02 Oil C« -4,549 00,1*9 -12,707 02 4L4 C -5.023 50,033 -11,903 *2 4L4 fi -4,723 50,0*0 -12,050 *2 OL« CO -3,9*7 51,421 -12,401 *3 TåL · -5,95* 4B,**J -11,22* *3 *«L C« -7,113 40,054 -10.325 03 TåL C -4,70» «9,014 -0,0*9 03 TåL O -4,101 47,9*3 -0,372

«3 TåL CO -7,957 47jS5f -10,431 03 Tål CC1 -0,213 47,410 -0,725 I

05 TåL C42 -0,195 47,370 -12,072 94 LTS O -4,907 50,217 -0,327 I

*4 ITS Cå- -0,370 50,444 -4,9*9 04 L*S C -7,331 49,915 -5,094 94 LTS 0 -0,450 50,400 -3,703 94 ITS CO -4,051 5i:*76 -4,010

94 LTS CC -5,394 52,320 -5,467 94 LTS CO -4.060 53,715 -5,502 I

94 LTS CE -4.399 54.200 -4,199 94 LTS RZ -31735 55,544 -4,307

95 TåL M -4,909 49,071 -3,026 95 TåL Cå -7,646 40,457 -3,920 I

95 TAL C -4,919 4i!*99 -2,560 95 TåL O -7.425 40,156 -1,501 I

95 TåL CO -0,104 47,030 —4,319 95 TåL CC1 -0,060 46.052 -51619 95 Tål CG2 -6,TOO åållOO -4,332 96 LEO R -»Jé76 40,974 -2,604 96 LEU Cå —4,702 4*{l03 -1,406 96 LEU C -4,331 50,559 «1,321

94 LEU O -3,942 5lll21 -2l)36 96 LEU CO -3,509 41,2*1 -1,573 I

96 LEU CC -3,593 461799 -2,072 96 LEU CD1 -2,207 46,104 -2,163 96 LEU C02 -41409 46.002 -1,045 97 CLT H -4.326 50,975 -0,006 97 CLT Cå -3.090 52,307 0,207 97 CLT C -2,363 52,437 0,305

97 CLT O -1,619 51,463 0,165 90 ALI R -1,954 53,640 0,750 I

9» 6Lå CO -0,420 55,470 1,510 90 ALA Cå -0,563 54,060 0,965 90 6LA C 0,100 53,110 1.917 90 ALA O 1,393 52,921 1,663 *9 AS* R -0,504 52,573 2,912 99 AS* 002 -2,631 51,042 6,151 «9 AS* 001 -2,730 50,902 4,003 49 AS* CC -2,003 51,131 5,040 09 AS* CO -0,440 51,603 5,175 99 AS* CA 0,101 51,610 3,055 99 AS· C 0,146 50,165 3,320 99 AS* O 0,735 49,313 4,029 100 CLI H -0.424 49,003 2,160 100 CLT C« -0,343 40.521 1,615 100 CLT C -1,520 47,651 2,002 100 CLT O -1,6*9 46,512 11479 101 SE· R -2,342 41,121 21900 101 SER CA -3,542 47,31· 3,315 101 SEB C -4.759 47,094 2{532 101 SE· O -41750 40,972 1,907 101 SE· CO -3,716 47,447 4,017 101 SE· OG -4,411 41,6)4 3,209 102 CLT R -5.021 47,092 2,577 102 CLT CA -7,0T7 «7,422 1,096 102 CLT C -0.166 46,536 2,520 102 CLT O -7,000 *5,431 3,030 103 CLR R -9.377 4Τΐθ5β 2,491 103 CLR C« -10,535 «6,297 3,020 103 CLN C -10,963 45,232 2,022 103 CLR D -10,779 45,402 0,017

103 CLN CB -11.671 47,307 3;27* 103 CLR CG -11,360 40,005 4,506 I

103 CLN CO -12,360 49,104 41915 103 CLR 0E1 -12,159 49,016 5,902 103 CLN RE2 -13,419 49,197 4,112 104 TT· N -11,611 44,141 2,451 104 TT· CA -12,06· 43,126 1,500 104 TT· C -13,031 43,690 0,473

104 TTt O -12,939 43,276 -«,607 1·4 77· C* -12,697 «1,066 2.143 I

10* TTt CG -11,629 40,029 2,472 104 TT· CDl -lljoi* 39,709 3,377 104 770 C02 -10,379 40,959 1,160 104 TTR CEl -10,009 30,005 3,707

104 TT· CE2 -9,352 40,057 2,171 10* TT· C2 -9,56* 39,022 3,001 I

104 TT· OH -0,411 30,1*1 3,324 105 3ER N -13,90* 44,572 0,703

105 SEt Cå -14,077 45,166 -oioj* 10S SER C -14,172 *5,*20 -l}l5* I

105 SEt « -14,759 45,935 -21250 105 5E· CB -lSjtOO 4«{l21 0,601 105 5E· OG -15,20* *7,03* 1,450 106 T·· R -13,079 *6,625 -0.03*

I *** TOR Cå -12,421 *7,391 -11940 106 7·* C -11,095 66,436 -3,012 I

106 T·· O -12,021 46.6*0 -4,2*5 1C6 TS* C* -11,321 401254 -1,)55 *·4 7** CC -11,4*5 49,111 -0,206 106 T·* C01 -12,062 491)24 0,264

I *04 T·* CD2 -10,650 49,012 0,501 106 T·* HE 1 -12,691 *0,35» 1,360 I

TO* CE2 -11,359 50,573 1,561 106 T«* CES -9Ϊ2Τ5 49,052 0,576 I

>®å TO* C22 -10,671 51,310 2,500 106 T·* C13 -01440 30,563 1,523

I le* TOT CN2 -9.2*3 51,291 2,*ί5 107 ILE R -11,339 45,330 -21401 I

107 ILE C4 -10,765 *4.250 -3,325 107 ILE C -11,955 *1,594 -*Il90 I

107 ILE o -11,*95 43,*7* -*,J*0 107 ILE C9 -9,9*4 *ailll -2,523 I

107 Ilf CCl -0.6)4 43,76* -l,9J6 107 Kf CC2 -91632 *1,910 -3,)01

I leT HT CDl -0,2η 42|990 -0,627 109 II? H -12,994 4)^292 -3,)77 I

29 DK 175523 B1 1»· ILE (I -14.116 -4.371 a»» SLI c *1*»*W *3,494 ·*,»* »M ILE O -14.19* O »I -4,552 1·· Ut C· -1*,!»» 41.21S -3,378 IB· ILC CCt -I*:?26 4ll#77 -2,682 101 ILI CC2 -14,368 4lj024 -4,··» SO· ILI CD1 -15,652 40,»*S -lll31 10* «5· N -14.T11 44,958 -4,981 SO· «1· CA -15,204 44,01« -Sl916 10· 45* C -141232 44,04· -·,0·4 ID· DSN 0 -14,440 44,272 -8,235 10» AS* CB -15.2*0 47,35· -5,207 10« AS* CC -14,57· 47,4*4 -4,353 10» AS· 031 -17.455 44,495 -4,444 10· ASM ID2 -141433 4·,447 -3,442 11· CIV · -12,»51 45,··· -4,774 110 417 CA -11,752 45^717 -7,145 110 CLT C -12,10· 44,712 -·,·12 110 5L7 O -11,729 44,»27 -10,034. Ill 1L« -12,379 43,537 -1,244 111 ILI CA -12,403 42,334 -7,099 SU ILI C -13.859 42,540 -7,742 111 ILI 0 -13,721 42Ϊ3Β4 -llJl«8 111 ILI CO -12,734 40,74» -0,344 111 JLE C41 -11,421 «0,501 -71455 111 ILI C42 -13,122 37,771 -7,347 111 Uf C01 -11,508 39,704 -4,334 112 CLU * -14,893 43.075 -7,2·· 112 CLU CA -14,11· «3,174 -10,044 112 CLU C -15,872 44.347 -11,171 112 4LU 0 -16,447 44,130 -12.244 112 CLU CO -17,227 43,897 -9,141 112 CLU CC —17,147 «2,917 -8,135 112 CLU CD -11,724 41.824 ->,485 112 CLU 0E1 -17,841 40,864 -8,014 112 CLU 012 -17,123 41,728 -7,844 113 7*7 · -15,074 45,403 -10,771 111 T*7 C4 -14,754 44.400 -12,000 113 7*7 C -14,076 45,663 -13,140 113 787 0 -14.317 «5,732 -14,332 113 787 CB -13,882 «7,553 -11.434 113 T*7 CC -13,486 «0,556 -12,481 113 TI7 CD1 -14,148 49,734 -12,681 113 T«7 CD2 -12,441 40.552 -13,463 113 787 *11 -13,597 58,443 -13,723 113 T87 CC2 -12.545 47.761 -14.215 113 T*7 CEJ -11,451 47,64$ -13,809 113 787 C22 -11.694 50,045 -15,27« 113 T*P C23 -10,610 47,899 -14,879 113 T«7 CH2 -10,752 49,074 -15,603 114 AL> « -13,089 44,801 -12,832 114 ALt C« -12,333 44,045 -13,874 114 ALA C -13,199 43,179 -14,752 11« ALA 0 -12,963 «3,874 -15,978 114 ALA C8 -11,299 43,192 -13,140 115 2LE * -14,174 42,S«0 -14,119 115 ILE CA -15,070 41,640 -14,897 115 III C -15,928 «2,415 -15,856 115 ILI 0 -14,077 42,225 -171870 115 ILE CB -16,000 40,840 -13,922 115 ILE CC1 -15,210 39,836 -13,043 115 ILE CC2 -17,151 40,168 -14,755 115 ILE CD1 -16,004 39,411 -11,743 116 ALA N -16,534 43,527 -15,267 116 ALA CA -17,390 44,440 -16,050 116 ALA C -16,706 «5,069 -17,278 116 ALA 0 -17,323 45,255 -18,343 116 ALA CB -10,011 «5,510 -15,151 ilT AS* N -15,423 45,390 -17,122 117 ASH CA -14,553 45,967 -1*,139 117 AS* C —13,827 44,974 -19,834 117 4S* 0 -12,997 «5,436 -19,828 117 ASH CO -13,615 46,958 -17,426 117 AS* CC -14,400 48,177 -24,739 117 AS* 0D1 —14,565 491082 -171773 117 AS* *02 -»4,831 48,249 -15,736 118 ASM M -14,223 43,725 -18,967 118 AS* CA -13,760 «2,642 -19,132 118 ASH C -12,240 42,444 -19,843 118 ASM 0 -11,617 «2,309 -20,932 118 ASH C8 —14Ϊ247 42,863 -2ll279 118 ASM CC -15,737 43,060 -21.395 111 ASH 001 -16,510 42,321 -20,759 lit ASM *02 -16M36 44,096 -22,133 119 HEI M -11.606 42,500 -18,675 119 NET CA -10,232 «2,222 -18,478 119 MET C -10,025 40,734 -18.928 119 RET 0 -10,888 39,138 -18,759 119 MET CO -9.810 42,461 -17,055 119 NET CC -9,080 «3,883 -16,502 119 NET 50 -0,780 44:943 -37,526 119 NET CE -9.982 «6,061 -18,263 120 AS7 -81904 401437 -19,584 120. «57 C« -8,480 39,118 -28,030 120 «57 C -7,822 381398 -18,156 120 AS7 0 -oi038 37,119 -18,690 120 A57 CB -7,555 39,15« -21,236 120 ASP CC -8,237 39,730 -22,454 120 AS7 001 —7,001 40,706 -231004 120 «5» 002 -91327 39,135 -22,739 121 V4L « -7,021 39,117 -18,115 121 VAL CA -6,226 38,401 -16,974 121 «AL C “ —6,296 39,534 -15,786 121 VAL 0 -6,21« «0,788 -15,909 121 9AL Cl -4,755 38,587 -11,496 121 VAL CC1 -5,758 38,176 -16.427 121 VAL CC2 -4,707 371916 -181846 122 ILE * -4,318 38,978 -14,590 122 ILE C« -6,248 39,799 -13il97 122 ILE C -51028 39.262 -12,427 122 ILE 0 —4,829 38,012 -121469 122 ILE CB -7,476 39,404 -12,446 122 Kl CC1 -1.604 «0,392 -13,063 122 ILE CC2 -7,221 39,8(3 -10,954 122 ILE COl -9,976 39,708 -12,373 123 ASH H -4,243 40,222 -12jll0 123 ASH CA -3,145 37,854 -11.232 123 ASM C -3,-502 401404 -7,861 121 ASH 0 -3,708 41,631 -9,833 123 ASH C3 -1,828 40,471 -11,497 121 ASH CC -0,692 «0,040 -10,777 123 AS* 091 -0,063 31,990 -11,010 123 ASH *02 -0,346 40,747 -9,720 124 MET H -3,451 39,604 -8,132 12« NET CA —3j450 37,973 -7,431 12« NET C -2^423 39^403 -4,414

I DK 175523 B1 I

I 30 I

I |»4 al1 . .),101 10,10* -*te*9 I}* MT C· '*»·!* !ν,,? -*,··» I

I II* air ·· .*,*11» »Tf*»I is* Mt j; -»)·|» 1»|*»2 -é}«»C I

I It* (IT Cl 'T Ilt I»{e*f -Tf»*! 1IS Ilt « ·*»*·* -0,301 I

I ilt : ; [! -o!*** *0 ι»7 ·Ι|1*0 m m c ·»»* «ejtti -(Jim I

{” 5 5 ejtss 4lr417 -»r·®* 1,1 »« Cl *rH 4lteiT -<!>*· I

I III (ja |ς i{*** *0 *0» '»r,TI »** »0.» ·»)*» *0,001 -»}τ7ΐ I

I II* ! U c* *1 0*1 »Oo>*o *I|*·* m uu c -*«*>· » tot -ijoot I

I m L|u o Ί »** *«,n* -i.»*· »» nu ci »i ι»ι -i!*io I

I 121 11y »I.OM *1^**7 -1,1» II* l(U (01 *8(271 *1,131 ·)·ΗΙ I

12* UV CM -*»»” *2 »*C ·*!βΤ3 127 «ντ N *1,322 l»}ft»2 -oi*|l I

I ill il r* -iJoiS 37,»71 (I*) 117 «UT C -1,17* llJilB l*«»2 I

127 sut 0 -2 *** >· tic l I2C 12* «17 M -* III »»|**| ljm I

in I , t* ·* *’» >» *’* ».i4* »*· en c ·* »** n coi *he* I

I 121 tuf 0 »*}»*· *}*T‘ *** M® * '* »» II ur UU I

I 12* MC C* >»011 l*{>2> li·** 12* *«0 C -0)11* li'oil | ||) I

}}; mo b -*!ni izjnr «hos «2« m8 c* -*[0*0 i*;;;: ,*M* I

I II* MO C« **f*Jl 1*^11* J|»*’ 12* M3 CO ·*|2Ι* )ojo?0 «5*1· I

I IJfi lift Μ " ·Τ|βΙ1 ftletlJ »tm 1)0 tt* Cl 9**Α11 a!o2) I

I m til C -*,n. ι*(|·ι* »Jji* no to o -o',*** n(m Ι*οι* I

I SIO II* C>~ >1,0*0 11,111 7(21* ISO tt* DC · «1,723 1*1*2* t5*01 I

I 111 *UT k *10*UJ llj**7 *|l*0 111 *17 C* -10,02« >«{ltl )!«}* I

I 111 6i? C *12,201 l*,713 1,·*2 131 «17 0 «11«*** )*{f22 *!tlt I

I 212 |(| i · -13,0*0 13.011 1,3** 132 tf· C* «1*,*β7 lli*|| lloil I

I 132 II* C >11.201 I*|I03 1,*3* 132 t(· O -1*,7** |*{*|* β!|2* I

I 112 Ilt C· »i*,1*0 3*,*27 1,1** 132 ti* 06 -1*,0*1 37(,3, lltTI I

I 111 *U* V —IO,**7 1*1*11 2,2** 133 *t* C* -17.30T |4.0I? till* I

I III in c -1*1*30 !*,*«» 8,0*7 (*a ‘U 0 -17,7*3 1*ϊ*|7 ·ΐ!θ1* I

I 113 »U* C* —1*|*** 13,021 *1??* 1,4 *t4 * «17,*01 11(2,1 oil** I

11* *Lt C* -17,172 17,21» -0,7*2 II* »l* C -ί*ί*3» !*(«« .(««R I

I 11« KIS *l»»«l 17,3*1 n* *L* 60 -10,203 ,ί;„έ JjJI: I

11» UIU M -11,*71 17,22* -1|0*4 113 UV C* -l*(l*7 ll^l** -l'ae« I

ni LOU c -i*,nt i*}ooi -t}«» ni liu o -u m &οίί lltJJ* I

111 tlu CO -11,»»* *7,321 -ojTll 133 110 C« -11*0*3 *,{"« .,(*01 I

I 131 LIU COl -1I,**0 *·,*11 -2,2*2 ns Ita CD2 -10,*302 ϊ,ί;” .57;?! I

n* LT $ k -l*}»0* 1-,321 -1,173 110 L7S CO -u!l*J ϊί*1*7 IΜ I

110 LTS C -lljs** 11 717 -*|ΐΙ0 13* 173 C «13*27? ,}(!!! Ζί*Κί I

130 173 CO -1*{*0J 12,1*1 -2,11* 13» L7t C« -1**70 i,!??} Z\'IA I

11« 173 CO -13,003 l*|072 -1,13* 13* U7t C« -13*7*3 ιέ1™· Z?*??! 11* L7t NX -isjjci |||*11 -*,1*0 |S7 lul N -10*7-4 \\*Λ0 Ζί»ΙΙ!

I 137 *Lt Cft -17,7*3 1*1*10 -*fIO 137 III C -1T*U| },»„! I

137 OL* O -l»,™* ISlO*« -7}20l U7 0U4 C* -l*!?** ,!»?!? “*<·** S3« OL« N «10,327 30,301 -3,727 ISO 01« C« -10*001 «?*ί?ϊ ΖΜίί 11« OL« C -1*1*03 30,0*0 «7|**7 III OLO O „J }*(}“ Ζί’ίίί

I ni OL« CO -13.322 30,107 -»,*»* 109 *«L V -l»**»o }{*{?{ .!'»( I

n< VOL CO -il,*** *3,2*1 -TJOST u, m c -njtii :!«!?! Zl'lll I 11* 7åt O -11,20« 1*|070 -»,«77 11, ,u Cl «ii'ii? !!«!!! zyjil ni m cci -10,*1* i·}«*« -7,00« 11* m cm -ujSJ Ζί'ίί! 3*0 01· * -l*,»*3 31,330 -*}l22 1*0 01· C· «1»ί|7* ij»!!? 1*0 01* C -10,023 33,131 -Ιθ|θ»* 1*0 03· O Π',Μ Λχ'ΛΙ 1*0 oil CO -10,1** 3l|»** -·}ι*Ι 1*0 «I* C6 -1**,M ϊβ*ΙΙθ ίΜΐ! 1*0 »I* OOl -I*,1T0 10,*01 -7J102 1*0 «I* 002 -10*13, I» 1*1 L73 V -l*;*»l 3**203 -*}«20 1*1 LTI C* -17*m Si'S!» .Tί'ίί! 1*1 LTI C -10,173 33,*13 -llj·** 1*1 L*t Ο -1*ϊ,00 ίί*5!ί Γ?5!μ? I 1*1 L7i Cl -1»,03* >*,27» -10,32» 1*1 IT* CC -1|5·0* ,ϊ'ο** -ti'til 1*1 L7* CO -1* Μ* 31 107 -loj»!* I«} t7$ Ct -20*”? JJlJ}} ZW'llt 1*1 171 *2 -21,130 *0,017 -10,271 |*2 U* N .|»(l07 «‘ίϋ ϊί<ϊ!5 1*1 OL* C* -l*JlT3 30,1,2 -ujoi* 1*2 OL* C ·1>*,|}ΐ I 1*2 *L* D -13,770 33,1«, -l*|7»» 1*2 «L« CO -ll!|TO l*1**? .ίί'ίίί 1*1 VOL k -13,312 33,ti* -12(832 1*3 vil C« -1,(,., „t'J ((»((* 1*1 74L C -Uil*· >2 2Ϊ1 -1*}*** 1*3 ,»l O -U«1S {JlJ·· i'*»4»® 1*3 *01 C« -12,331 II,071 -lf,7l* 1*3 V«L C61 -lljUo !ί*!τθ ΐΐϊ'ίίί 1*1 74L C62 -11,303 llJlVS -12|01* *4« *t* N -1«!»>1 ίϊ*!,; ΖΪΪ'ίίί

34« OL« C* -10f7** 11,03* -!*,**! 1** OL* C -u},*} ZJJ*KJ

31 DK 175523 B1 lu 11« C -17.SIC K.li) -l*,**l i*« tu« tt -I7,**l »1,1*1 -11.700 i*» $i« * -i*}$ot »li*! -η.τοι i** *!» c« -u«tii it.tir ·ι*{7ΐ* |«l II« C ·1»ί*01 I«IT7| ·!!,»» I*> II« C -11,710 >1,121 *IM1> 1*1 11« Cl -17J01* J*{17« ·» tu I»» »»» 05 -1$,IU ·*,»»! -l«il*l 1*» *IT M -I« ITT »jjll* -ΙΤΐ*»» 1«* tu» C* -11,111 11,7*» -11,471 1*» tu» C ·|| 2T] |t tti -11,111 1** tu» O -11,420 14,lu -11,2»* 1*7 **U «I -12,1*0 11,142 -ΐτ{ΐ»4 1*7 »ål C« -10,IT* l*,ll« -14,*12 147 VIL C -t,tIC >4 116 -1«,121 1*7 Ul O -10.171 ll,«i -1*1*0« t*y »ti. ct -liliw **{»77 -l»|«t« l*» »*l CC1 -·,«»» *7,001 -11.170 1*7 **U Ct2 *12,1*0 17,»1 * -lt.210 1*0 *«U * -0,001 **,011 -14.401 1*0 **U C* -T,*«2 1*1110 -lllOOO 1*0 *«U C -7,117 I*,t07 -1*2701 1*0 »*U O -4,ltc 10,111 —14,710 1*1 »*l Cl -4,271 *4.114 -I4J«I0 141 *«U Ctl -S{07| *),*«* -24,201 1*1 *U CC2 -é,l»0 *»,»22 -101242 |4« V«l N -7,211 »*!ΐ11 -1»{*I1 1** *«U C* -4«»IT **,·»} -12.2*1 1*» *«U t -1,700 »4,10* -11,411 1*» *«U O -»,41* **,171 -11.41« i«t »tu t* -4,22t **;i*o -ulm i4f m cti -t,ou *».41» -10,001 14« ««l Ct2 -»,414 11,116 -12,016 110 VåU U -4,712 *».101 -11.404 1>0 »*U C« -1,1*1 ItltlT -10,101 ISO **U C -1,1*7 »1,42» -«,*»» 110 »4U O -1,Ml *«{77| -«,400 110 VOU Cl -*{tT4 *»,101 -11.«11 no v«u eci -ej*n *«{«ii -11,441 tso v«i cti -i,«7« t«.«o -ιι,ιβι 111 ti« H -2,1*1 **,**4 ·»,!«* Ill OL* C« -2,1*1 *1,112 -7,11» in ti« c -iloio »ilos« -*;*m i*i tu« o -e,(«u s»,it« -t,«o* 111 «1« Cl -l{117 II,MO -«!)0T 1*2 tU« H -O,'410 *1,107 -1.122 112 «I* Ct o{71« *1,4)1 -ihll 112 tit C 0,10* **})20 -4,111 112 tl« o -0,720 l*:*«* -1,447 112 ti« Ct 1,24» »4,407 -4,11« 111 tl« H 1,12* as,»02 -l}«12 1*1 tu« C« 0,1*0 *21210 -2,14) 111 tl* C 0,111 S2{72> -l{«ll 1*1 tl« O 0,117 llilll -0.'**» in tL* c· i,7»o si!eso -ι,ιιι n* ti» 1,127 *».tn -1,2** II« tlT c* 1,041 )t 111 e{l2l li* tL» C >t*l« >4',0«Ι 0,110 114 tl» O tjlll )1,217 -Oilll l*» «1* N »,«*· »4,701 lJltl 111 *IN c« 1,144 *4,717 2,017 11* «t« C 1,1** >*,2>l >,442 II* ttN O 4,101 »4,121 *{21* II» t*M Cl 4,000 >4,1*0 1,104 II* ·»» Ct |{|I0 »*{702 0{»00 1)1 *|N 001 till) 14,041 -0,11« II» «1Ν «02 1,4*4 >7{«4* €{1*2 114 tlU « 4,711 »1,141 1,171 11« tlU C« «{«SI 12,117 4 JlTC 114 tlU C 1.122 »l{l2l 1,101 II« ClU O >|ST4 *0,417 4,222 II* tlU Cl »,20* 11,110 1,100 114 tlU Ct 2,4*1 12,442 4,1*0 II» tUU CO 2,114 *1,1*1 4,276 1*4 tlU 001 l{?44 *4,122 l',S12 1*4 tlU 012 >,104 *4,»I« I,'1*4 117 tlT N 4,}|« *]{0IT 41227 117 tLT C« 7,104 20,117 4,107 117 61» C l{*01 20,422 *1**1 1ST tl« O *{*1* 20,144 4,00«

ISO TM « 7,147 27,71) 1,102 1*0 74» CC2 0,07« 21,11* Si ISO

III tHt Otl 0,707 2*{*«7 4,217 110 ' 74« Cl 7,1*4 21,14« IJIK

111 7HI C« 4,1*2 24,407 l{702 III »4« C 4,100 24,400 711*7 111 74« o 4.47» 27jm 7{l77 2)1 Kl « 1,1)0 21,4*1 7}*»7

Ilt SI« et ){l4i 21,104 10{>20 10» tl« C« 1,*T) 24,10* 1,212 11« «1« C* «{ill 21,210 I,Hi 2*1 Ilt C 4,414 |S,720 «,14* 1*1 SI« O lim 21,2*1 1,010 140 tl« k 1,174 22,1*7 lil)* 140 617 C* |{«1* 21,104 |{#I* 140 617 C 4,11« 21,04* 7,7)1 140 ClT O *{*01 21,124 «{*** 141 tl« H >{«21 20{ll0 0.114 141 SI« C« 2,4*4 1«{777 7{0S* 141 l(* C 1,477 20,781 tj7lé 141 IH O o;«»* 2C.MT I,OM 1»1 tl« Ct 2,1«* 11,2*1 »{271

Itl 11» Ot 1,0*4 11,021 «{so* 112 110 « lllOl 21,1*1 7,4*0 112 1(0 C* 0,147 22,721 »Jill 142 tt« C 0,*10 11.«12 l|l4l 142 St« O li*)) 23,0*0 0,114 142 II« CO *0 ill IS{44* tjlt] 142 II« 06 Oil»* 21,011 I,*10 111 ||« t -0,471 2>,I21 1.117 111 tot C« -0,411 24,7*0 ){m 141 II» c -0,4*1 24.177 4.011 1 141 It« O -1,070 24,1*1 list* 111 tt« Cl -lillO 2«,4*1 1.211 141 tl« Ot -li»»2 2l{TlI ijlll 144 tul N 0,107 24,«*2 1,112 144 TMI C* «1*0» 20,1*0 4,112 1«4 Tm* C 0,11» l«,2l« »ilt* 144 THI O 0,41* »0,102 s{27| m THI et 2.0*1 20,«II «{«10 14* 7m« Otl I,«** 2«,212 1,472 It* T«» CC2 2,1*7 ITitlC 4,001

10* V«l « -O,*11 20,742 2(210 141 VtL C« -Cjlll »ti**l liOlO

141 *«l C -2,01« JO,»*» l,4»r 141 V«l O -2,121 »o|lS2 IjlOC

I DK 175523 B1 I

I 32 I

I 111 VIL Cl -1,15* ί».O* ·1.ΙΙ1 III VIL cst -1.1*7 ».«» -1.17* I

κι vil ut *3(m li.m *t.m κ» «li « -i.ne si.itt uti I

Kl CL I Cl -1,1* $ >1.111 · 1.12» IK Cli C -4.0*1 II.IM 1,111 I

II» (LI C -4,12* >2.IB* -0.11» 1*1 11» N -1.01» 11.110 0.1TB I

1*1 TU Cl -*,22J 1*.fi** 0.111 111 IH C -1.1*1 II. 111 -0.IB* I

κι in e -·Ι»ΐ4 11.211 o.oi* m tu c* -i.*** >4.112 0.1*4 I

2*1 Til CC -1.111 12.114 1.101 141 TU CC1 -1.201 12.101 1.141 I

2*1 Til C02 -1.110 12.11* l.lll 1*1 11» Cll -1.1*1 11.121 2.«II I

Kl TU Ct2 -l.eil IB.113 l.lOI 1*1 Til C2 -1.41* 10.111 1.041

κι tu o- -*:*»c 11.401 i.*»» κι »io n -i.lie is.«τι -i.no I

2*0 »IC CC —*,141 2*.II» -l.lll 1*0 »10 CO -».211 11.112 -I.*24 I

2*1 »*0 Cl -7.144 SS.144 -S.SOS 1*1 »IS Cl -7.114 >4.411 -2.1*0 I

Kl MO C -».lis 11.12* -1.210 1*0 »10 O -1.017 22.120 -l.lll I

si* oli · -s.eii is.ns -i.in tu cl* c* -».«»» n.eii -i.iti I

111 *11 C -4,111 10.102 -2.470 Kl «11 0 -4.110 11.122 . -4.241 I

170 LT2 U -S,*02 10.171 -2.211 110 LIS Cl -1.01« 21.2*1 -1.7*1 I

270 LIS C -7,015 21.772 -2.11« 170 271 0 -7.101 21.114 -I.12* I

270 LU Cl -«,144 21.21* -0.2(4 170 LIS C« -l.lll 11.10* O.ISS I

170 LIS CD “·*210 21.211 2.031 170 Lit C( -l.lll 27.211 I.Btl I

270 Lis »2 -4:211 21.4*1 S.215 tit Til k -l.lll 2I.4K -1.1*1 I

SU TT· Cl -1,012 21.041 -l.lll 171 Til C -*.*01 21.101 -l.lll I

m tu c -ilue h.h« -s.121 m m co -1.1*2 io.ii* -4.2*2 I

171 Til C« -10,417 10.114 -1.0*7 171 TTI COl -11.0*0 SO.SOS -1.102 I

Hl TTI C02 >10,41* 12.174 -1.02» 171 TTI CCI -11.110 11.001 -0.0*7 I

Hl TTI C12 -10.141 11.eis -l.lll Hl TTI Cl -11.120 12.11* -0.0·· I

I Hl TTI 0« -12,001 >2.111 0.170 172 »10 N -l.lll 27.20« -S.174 I

Π2 »ac ci -iltn 2*.*n -i.sn ni »10 c -1.211 2i.il» -ι.ιοι I

Π2 »10 0 -0,S2S 24.1*4 -I.K1 1T2 »»O Cl -I0il«7 IS. 121 -».111 I

Π2 »10 CC -20,*JO 21.m -S.01« 172 »»O CO -10.1*4 2».*»1 -4.11* I

173 IH 4 -10,017 21.1*7 -1.011 . 173 Id Cl -10.220 21.110 -I.SSD I

ns 0(1 C -1,02* 21.77] -I.S1S 173 II» O -1.14* >0.213 -10.7*2 I

Hl II« Cl -11,121 21.123 -1.4*1 17] !(t OS -11.IIS SB.I** -1.40» I

214 VAL 4 -1,142 11.144 -l.*14 IT* VAL CA -7.053 10.*11 -I.ISS I

114 VAL C -1,714 30.131 -1.0*1 174 VAL O -l.«12 21.112 -1.1*4 I

H* »u c* -*,111 I1.7TS -l.SI« 174 VAL CS1 -5.11» 12.017 -7.»11 I

H* VAL CC2 -1,220 12.SOI -T.S2S H5 iLt H -4.111 >0.121 -I.OII I

Hl ILt C« -1,1*1 10.IS* -10.02* 175 1L( C -2.11« 10.71« -l.SI« I

HS lL( 0 -2,4SD 11.130 -I.ISS 17* ILE Cl -2.1SS >0.12« -11.411 I

HS 2k( CCI -1,517 21.17* -22.52« ITS U( CC2 -1.4S1 >0.011 -11.112 I

HS ILO CCI -1,411 10.321 -IS.*«* 17« ALA 4 -2.120 >0.021 -1.121 I

Π* OL« C* -1,113 10.317 -t.HO 17« *L* C 0.120 10.101 -7.110 I

>7« ALA O 6,«S3 21.223 -7.138 17« AL« Cl -l.lll 21.01* -1.1*1 I

>77 VAL 4 0,144 >1.410 -T.1IO 177 VAL C« 2.2*1 11,11* -7.·3» I

H7 V*L C 1,221 11.»11 -l.*73 177 VAL O 1.17« 12.«*7 -1.721 I

>77 *4L Cl 2,411 22.«07 -l.lll 177 VAL CCI >.0*2 It.ltl -l.lll I

>77 VAL CC2 1,114 >2.132 -«.0*3 HI CLI N 4.6TT 10.«5* -».III I

I Π» «Π CA 5,111 50.702 -l.lll 170 CLT C ».«** 11.213 -».074 I

>71 CLI O «,411 11.415 -7.21« 171 *L* N 7.512 11.4*7 -1.207 I

I 271 »L* CA 0,715 >2.037 -1.151 17* «14 C 1.111 11.011 -1.771 I

I 271 »Li C >0,111 20.111 -4.711 171 Al* Cl 0.025 11.212 -4.171 I

>*0 V4L * 10,11« 11.112 -«.»5 110 VAL CA 11.110 10.402 -«.111 I

I >»0 VAL C 12,0*1 11.IIS -7.171 no Val O 12.712 12.All -7.«27 I

I »0 VAL Cl 12,071 21.SI« -t.K« 110 VAL CCI 11.2T1 ti.2S1 -T.ISI I

I KO VAL CC2 11,171 10.17* -1.100 lu AS* Μ K.2IT 11.20) -«.100 I

I »·> OH CA 15,*S1 12.10« -7.011 101 AS» C 11.1*2 11.104 -1.4*2 I

I ><1 01» O 19i 111 >1.010 -1.2*2 Kl «1» Cl K.**» 11.121 -1.1K I

I >·! *** CC 17,120 10.11« -1.111 Kl 11» 051 Π.101 >1.711 -1.172 I

I *·> *1» B02 |1,*»c IB.25» -«.SIT 112 Id V 17.0*7 12.IS« -*.**7 9

I H> OH CA 17,422 12.114 -10.Kl 1|| |(l C II.MS 10.117 ·1β.**4 I

I Hl H* o 1*,KI 13.452 -1 1.»TO 112 Sf· C* II.«7* IS.IIS -10.444 I

I H> H* OC 11,01* 14.5*1 -IB.47* 113 Sd N 11.MO 20.0*2 -*.»23 I

I >·> K* C * 10,71« 21.·»* -I.**« 113 1(1 C 17.301 27.41* -1.1*7 I

I H S Κ» C 1’jlS* 21.415 -1.117 Kl Id Cl K.2S« II.IM -1.001 I

33 DK 175523 B1 in ti* e& it.in »».»i» -1.211 1»* *s« * ι*.ιτ» le.ei« ·ι.»«ι I·» 41* Ct 21.1*« 17.»1? -«.110 I·*- IS« C 14.111 »*.11« -1.M7 1·» <0 o 14.DI ».in -1.017 1·* is« c* si.oi« i*.i»i -te.tu

114 li« Cb 14.113 24.111 -12.074 14* li« 091 |4.T00 21.11* -12.27T

II» II« «02 11.1»; 24.210 -11.07» 111 bl« « ss.142 21.247 -1.114 11» bl« C* 11.214 24.4*4 -1.1)1 1·» bl« C 14.200 21.44* -9.20) 111 bL« O 14.11« 21.724 -).114 111 CL« (I 14.111 21.141 -1.101 II» bl« Cb 11.1)4 24.242 -1.414 111 Cl« CO 11.011 21.102 -1.204 III Cl« Oli 11.144 21.711 -4.041 Ilf Cl« «12 11.244 24.114 -1.1)4 114 Itb « 11.271 24.411 -4.44( 114 llb C* 12.111 27.174 -).·*! 114 41C C 12.710 24.712 -2.144 111 »*t 0 11.411 21.114 -2.II) II* ItC Cl 11.211 24.14) -1.114 114 Mb Cb 10.21* 27*471 -2.141 II» llb CO I.*41 24.))7 -1*441 til 4lb «| 1.144 U.)>> -0.11» II« 4tb Ct 1.441 24.171 1.0»1 114 4*0 «Ml «.»4» 27.110 1.411 II» llb ««2 10.144 24.721 1.71) 117 414 « 12.21* 10.001 -2.1»)

117 414 Cl 12.720 11.04* -1.141 117 Hl C 12.242 10.404 -0.I1T

117 410 O 11.1J0 >0.0«) -0.)17 117 111 Ct 22.1** 12.402 -2.I4* 101 tit N 11.011 10.770 0.141 111 SCI c* 12.471 10.214 1.141 III SU C 11.»4 10.147 2.*12 1»· SU 0 10.7*0 10.211 1.212 til SU Cl 11.747 10.414 2.1)1 111 II» Ob 14.1)7 11.124 2.141 til ImI « 10.14) 12.010 1.174 II» I«l c* 1.417 12.411 2.411 114 Mt C 1.411 12.111 1.401 111 1«t O 1.111 12.114 2.»11 111 l"f Cl 1.717 )4.217 2.2*> 2·» Mt Cb 10.117 I«.44» 0.147 111 IM| C01 1.2*7 )4.1)0 -0.121 111 *«! CD) 11.«1» ll.lil 0.147 111 iMt cil ».*»» »».117 -1.411 111 Ml CI2 11.744 11.14» -0.701 111 Ml Cl 10.714 )».»!» -1.121 140 SI· « 0.10) 11.12» 0.411 140 SU Cl 7.424 11.014 -0.1*1 110 SU C «.4») 10.142 0.)21 110 SCI 0 7.0)4 24.01) 0.144 140 SCI Cl O.lll 10.110 -1.701 110 Sil Ob 7.1)4 )0.))7 -2.411 111 SCI « 1.)11 10.1)1 0.114 141 SU Cl 4.)41 21.41» 0.417 211 SU C 4.2*1 21.1)0 0.22) 111 SU O 4.»*) 21.241 -0.11» Hl SCI Cl 1.01» 10.411 0.111 111 St* Ob 2.72» 11.21» 2.1)4 1»2 «41 « S.71* 27.110 0.121 142 *41 Cl 1.42» 21.1)2 0.)11 212 «II C 2.2»* 21.211 0.444.

112 «41 O 1.11« 2).411 l.lll 112 «41 Cl 4.711 21.127 1.011 112 «41 CS1 ».l»* 21.727 0.722 112 «41 CC2 4.417 21.10« 2.112 11) bil « 1.1)1 24.172 0.047 II) CLT Cl 0.421 21.1*4 0.410 11) blT C 0.011 21.021 -0.401 14) bl« O O.S20 21.2*4 -2.01» 11» μ: « -1.02) 22.211 -0.722 21* MO Cl -1.4*2 21.411 -1.17) II» Ile C -2.2)7 22.40» -2.11* 1*4 MO O -l.*OJ 22.2*4 -*.011 11» 110 Cl -2.741 20.71) -1.210 1*4 MO CC -2.SU 20.422 0.21) II» MO CO -1.4)3 21.1)4 0.111 II» CLU N -2.122 21.74) -2.4)1 II» CLU Cl ->.!*» 24.1)0 -1.212 211 SlU C -2.01» »».4)1 -4.0)1 11» CLU O -2.114 24.111 -4.1)4 21» SlU Cl -4.0*1 21.714 -2.470 11) ClU Cb -4.1*2 21.1)» -1.4)1 11» ClU CO -4.»1» 14.140 -0.110 111 CLU Oil -1.110 24.1*0 0.11) II» SlU 0)2 -l.lll 24.S20 0.71» 111 llU « -0.121 21.244 -».170 11» ICU C4 0.2*1 21.421 -4.44» 11» ilu C 0.221 21.17» -4.0)1 11» UV O O.H> 24.121 -4.11) 11» LlU C· 2.»*0 2).7)1 -S.I*» II« LIV Cb 2.770 24.111 -4.4*1 144 llU C01 2.7)1 27.71* -«.4)1 11» LIV COt 4.027 21.721 -1.111- 147 IS* N 0.1*0 24.201 -7.01) 1*7 4|l Cl 0.0)2 21.774 -1.410 217 411 C 2.107 21.7)1 -0.21) 117 4)1 O 1.41» I*·7)4 -1.11» 117 IS* Cl -1.047 24.111 -1.211 117 4)1 Cb -2.40* 24.))1 -1.1*1

117 4S* 001 -2.104 2).1)) -1.)14 117 4|t 092 -).0)) 27.127 -I.OII

111 «41 « 2.01) 2«.»11 -I.)*« 111 VIL Ci S.20« 24.470 -10.201 111 VIL C 4.117 27.1)0 -4.114 111 «II O S.7S2 21.111 -l.lll

Hl VIL ca 2.114 27.*1« -11.4)7 111 VIL Cbl 1.1)0 24.72* -12.1)7

Hl «41 Cbl 2.1)7 21.111 -11.41* 14» «11 N 1.)74 27.11* -10.014 111 «17 Cl 4.411 21.102 -».»Il Hl «17 C 0.14» 11.110 -10.111 11» «II O 4.41» 21.ni -11.711 114 «11 Cl 1.4*0 27.170 -1.077 111 «17 Cb 7.111 24.141 -1.1)1 111 «17 SO O.TSS 27.4*1 -4.111 11« Ml Cl 1.227 27.71» -S.»17 200 4L4 « 7.42« 20.1*2 -10.10) 200 41» Cl 7.111 >1.111 -11.0») 200 41» C 1.014 »2.»4» -10.272 200 II* O 1.117 12.12* -1.040 20C *1« Cl 4.1)2 12.070 -11.4)1

I DK 175523 B1 I

I 34 I

I 201 MC k I.IIT D.tM 101 Mi C· 11*019 >4.110 -JO.Ill I

I 1DJ 900 C 10.490 11.117 -1.11» 101 MC 9 9.119 11.901 -9.112 I

>01 MC (I 11.111 >4.12) -11.400 >01 MC CC 11.192 >*.0*0 -12.171 I

101 MO CO 9.1*1 11.111 -12.401 102 CL* k 10.121 >1.20» -0.021 I

I 102 CL* Cl >0.*7» >1.23* -1.0*4 102 CL* C 11.»00 ll.ltl -1.111 I

102 Cl* 0 11.112 >7.12* -4.9T9 10) VIL k 12.01) )1.)0) -1.111 I

20) *»l Cl I).»*) >1.12* -1.711 10) VIL C 14.701 >1.017 -1.419 I

20) vil C 1).1)) >7,7)1 -7.Ml 20) *»L CO 14.11* >1.1)0 -t.)ll I

>0) Vil CC1 11.091 >1.101 -4.112 101 VIL CC2 14.07* >4.74] -4.)71 I

I 20« II» k ]*.»»» >*.112 -).117 20« >t· Cl 1).)72 «0.2)1 -1.4)7 I

I 204 )(· C 21.017 40.11« -7.172 204 )|t c 11.7)1 40.11) -1.«»« I

20« II· Cl 17.0)7 >7.*7* -1.12» 20* 12» 01 >7.7)2 41.1)1 -1.172 I

I 20) )L( k 11.771 «e.t«) -0.001 20) iLl Cl 11.019 41.2)4 -9.221 I

20) Uf C 11.207 42.7** -9.471 20) ILl O 12.1*1 41.191 -1.1«» I

20) IL) Cl 21.))2 *0.1)1 -9.14* 20) Ul CC1 11.4)1 >«.>)* -1.110 I

I 20) Ut 02 10.1*1 *].{)) -10.417 20) Ilt CO] 12.217 >1.412 -9.77] |

I 20* Cl* k 1).791 42.0«) -20.41) 201 Cl* Cl 14.20* 44.)17 -10.1)4 I

I 201 Cl* C 11.002 44.771 -11.1)0 20* Clk O 12.119 44.>10 -12.121 I

I 201 Clk Cl 1).4)1 44.701 -11.740 204 Clk CC 11.11« 44.11) -10.910 I

I 201 Clk CO 17.211 4).l«) -10.007 201 Clk 0(1 11.121 44.9)1 ·*.))) I

I 204 Clk kt2 11.))1 41.210 -9.1)7 20* it· k 12.))* 41.014 -11.22* I

207 1!« Cl 11.217 41.)71 -11.917 207 >(* C 11.01« 41.09) -11.7*9 I

I 207 lt* 0 11.71* 41.4)7 -11.00* 207 >( CO 0.911 «!.·>) -11.9*1 I

I 207 >!> 06 1.7*1 «1.0)4 -12.11) 201 Τη» k 10.01« 40.41« -12.)21 I

201 7kl CC2 *.171 )0.))t -14.7)4 201 7K> 0C1 7.)TC 10.414 -1).144 I

I 201 7k* Cl 0.120 10.41) -1).))7 201 TH* Cl 9.47) >0.092 -12.1*1 I

I 20) Tkt C 9.197 )0.411 -10.10) 201 TmI 8 1.42) 41.007 -10.0*9 I

I 20« LIU V 1.1)1 11.11) -10.221 20* Ku Cl 9.1*2 12.111 -1.9)9 I

I 101 LIU C «.»*) )). *10 -9.241 201 KU O 9.1*0 14.227 -10.222 I

I 201 LIU C* 10.11) 11.192 -7.9)1 20* LIU CC 10.10* 10.014 -7.411 I

I 20* KU C01 11.*11 11.11* -*.«72 20* LlU C32 9.107 »0.202 -1.1*1 I

210 MO k 7.7*0 »4.11« -I.*** 210 »»O C* 7.27) »1.117 -1.1*9 I

I 210 MO C 1.111 )t.)T] -I.*)* 210 MC O 9.491 11.4*1 -0.104 I

I 210 M3 CO 4.132 11.7» -7.117 210 MC CC 4.004 >4.>7* -*.*** I

I 210 »»0 CO 7.19) 11.491 -7.271 211 SIV k 0.077 >7.11) -*.))> I

I 211 CLV c* 9.019 II,ri) -1.410 111 ClV C 10.0*4 >«.«)* -10.470 I

I 211 ClT o 11.171 H.ODI -10.2)7 212 4Sk k 9.171 17.770 -11.)17 I

I 112 41k Cl 10.10) 17.422 -12.»*) 2)2 »Sk C 12.0)) 11.7») -12.1)1 I

I 112 Hk O 11.111 17.111 -12.420 212 Ml. Cl »1.22« 11.19) -1).*«* I

I 212 4Jh CC 11.10) 11.11) -14.11« 212 4>k 031 11.11) »7.0)4 -1).)2) I

112 41k k02 >2.27) I*. Ill -11.)74 21) LVS k 11.10) 11.74* -11.247 I

I 11) Kl C* 12.110 14.*41 -10.3)7 21) LV1 C 12.111 i).*)* -10.111 I

I 11) 171 O 11.77» 1).0)7 -11.11) 21) LVS Cl 12.7*7 11.2*1 -9.0)7 I

I 21) LT1 CC I).20* )1.174 -I.TIT 21) LVS CO 1).2*1 17.0)0 -7.)12 I

I 11) LVS Cl 1*.131 11.21« -1.1*0 11) LV) VI 11.0*1 11.70) -7.721 I

I 21* 7V* k 11.*11 12.70) -10.444 21* TV· Cl 11.103 11.2*4 -10.722 I

I 21« TV« c 14.11) I0.4QQ -7.MV 214 TW 0 11.211 11.2)) >1.117 I

I 21« TVt c» 14.141 )0.)11 -11.714 214 Tv· C5 14.1)0 11.121 -11.7*1 I

I 21* 7VI (31 14.11* )2.)*T -11.171 21« TV· CC2 11.127 11.0») -)4.014 I

I 11* vil C(1 14.2)0 f).4T) -14.114 214 TV· 02 12.«U 11.1*7 -1).)71 I

I 21« 7vt Cl 13.20« 12.17) -».DO 21* Vr· Cm 22.7)4 »3.4)1 -11.4*1 I

I 11) CLV k 14.0)1 41.141 -7.111 21» CLT C* >*.122 «1.772 -7.70» I

I 21» ClV C 14.1)0 47.12) -7.7*7 21) CLV O 1).2«7 *1.717 -1.121 I

I 111 «L* k 14.110 4*. 1)1 -1.0) 111 IL* (4 l*.*l* 41.20) -1.7)1 I

I 111 Ul C 11.112 «4.922 -1.)12 214 IL« 0 1).«*) *1.127 -4.471 I

I 11* »l* O 11.71* 4«.))« -1.1*7 2>T ΤΤΙ k 12.7)1 1).912 -).)T) I

I 117 7VI C4 11.*1« 4).«t) -4.440 1)7 TV· C 12.0)1 «1.921 -4.1*7 I

I 217 *V· O 12.202 «1.4*2 -1.1)1 21* TV· C! 20.47) «1.012 -4.)70 I

I 117 TVI CC 10.117 «1.2*1 -4.21* 21* TV« CD1 10.1*1 «1.9*1 -).2)1 I

I 117 Tv* (02 9.Dll 4I.IJJ -4.70) 117 7V1 CC 10.«)* «7.217 -2.790 I

I 117 TVI Ct2 0.0* 47.21» -4.111 217 Tvi C2 9.111 *7.0)2 -).)»! I

I 217 TTI 0« 0.9)3 «7.110 -2.711 211 «Sk k 11.00 11.Ill -).)71 I

I Cl C* C* 11.1*0 )».*«{ -).127 217 Mk C 10.20« II.*)« -2.7*7 I

35 DK 175523 B1 <>· tt« s t.rtj 43.»*·» -i.nt ni tt* c» it.tn »*.»*o -i.n* au ti« cc i*.o»i »i.itt -i.ni <n au ooi i*.*u »«.το· *i.ui tu ti« ndi n.tto »».»** -i.ui ti» *i* * i.«to »i.n* ->.ti« <n ti» c« ι.»·2 u.m -2.**· li· tu c t.in snu« ->.*»i <n oli o ».»τι »».»o: -*.»n uo t« n *.»n i«.di *».2βι <21 Tu· C* ».**7 »I.»)« —*,1 TI <20 tul I *.|T« 17.0** -*.l** <20 Tu* D 4.417 lå.7*1 -».*!! I2C 7«* Cl *.»21 »«.11* ->.»2å <20 1«l 011 4«1»4 »I.»*» -2.*11 12O TR* (02 1.70* >».*** *2.«09 <21 »|l « 4.T2I »l.t»l —4·»CJ 221 11' C* ».*»« »«.201 ·».!** <21 »t< C 4.740 »«.**1 -«.»II 121 IM D 4.117 40.201 -7.277 <21 »ta Cl ».»2» 40.)1) -*.)** 221 »I« 0» ).41) 40.212 ->.14| <22 RIT N 1.0*0 )f*)lt -l.åll 222 RI* Cl «.«71 *2.771 -».17» <22 RIT »0 7.741 «1.»») -4.11) 222 RIT (C 1.10« 41.»«* -t.*02 <22 *t7 Cl ·.»»} 40.02» -7.211 <22 HfT C* *.»1» »*.»70 -T.«»t <22 RIT C «.»77 »I.*»» -I.I4T <22 «17 O 7.01* <1.1*7 -*.77» 22) *Lå « *.114 »7.2** -|.0«l 12» AL* C* *.**» »1.020 -l.lll <21 IH C «.200 »4.041 -I.TOT 22» AL* O 1.1») »l.*«l -10.721 12! 411 Cl «.»O* »4.107 -7.12» 22* *2» K 4.07* »*.)«0 -7.0)1 <|4 »ft (å 2.7»» >*.*11 -1.709 <2* Id C 2.*41 »7.1*1 -11.0»« <2* »ft O 2.1*1 »*.!*) -12.OST 22* <M Cl 1.201 »4.Ill -».40» SI* »tt 00 0.4*2 )*.Ill -*.l)T 22) M3 A ».11* »l.«U -11.11* <21 M3 C* >.0*1 »*.1»0 -12.4)7 12» »H C 1.7*4 »1.41» -»».*2« <21 **0 O ».404 >».**0 -I*.10* <21 7« Cl ».*»> 40.111 -12.0)4 221 MC CO 4.411 40.402 -10.74* 221 I« CO ».7)1 >0.22« -IC.«»* <2* RIS N 4.7*1 »?.*<» -1).277 <2* M2» Cå ).«** >*.17* -l«.l*2 224 RIS C 4.41» »1.1*7 -11.0*1 22* M2» O 4.421 ll.lt* -»«.21» 12* RU Cl 4.40» 24.0*« -12.7*1 <2* «1 CO 7.114 »«.·)) -i).»»· 22* NU *01 1.04« »7.*ll -12.170 224 NIS C32 »«111 »7.111 -14.1*7 22* RU Cll *.270 31.0)2 -12.234 22* NIS WI2 1.771 »7.1*4 -13.44) 227 tu « ».111 >1.1*4 -I4.m 22? TIL Cl I.IU »*·»11 -14.727 127 m C 1.471 11.117 -11.*11 227 741 O 1.01» >*.77) -1».*«0 227 «41 Cl 2.103 >).*** —1J.4J* 227 VIL CCl 1.074 »2.47« -14.24* <27 V*L CS2 S.204 »2.*41 -12.111 221 AL* h 2.00) l*.2«l -14.il« 221 4L4 C* 0.011 »7.10* -11.117 221 AL« C 0.1«) »7.1)1 -l«.t«l 221 414 O -0.21» 17.4)1 -17.121 221 AL« Cl -0.107 II.»11 -14.40 <1* Cl« μ 1.711 SI.Oil -14.«*1 121 (IT Cl t.112 »A.*OI -II.22« *21 ClT C 2.420 »T.XIT -11.117 22* Ol« O 2.11* »7.371 -10.»1* 21C 4L4 N 2.711 21.*tl -11.4*4 2)0 ILI C« 2.714 I*.»01 -14.1*4 2>C IL* C 1.424 »*.100 -29.11) 2»0 At* O 1.)13 »4.20) -21.3«)

2JC ILI Cl 3.2*1 32.424 -JI.7C7 231 IH R 0.31) »4.42» -1».»2I

2)1 4L4 Cl -1.010 »4.414 -14.7*4 2)1 *L« C -1.2*4 >».«2» -20.1*4 2)1 «II 0 -1.tot 31.0)4 -2).»12 *31 AL* Cl -l.«)2 »*.»** -21.1*4 2)2 »L4 N -0.T7I »4.4)7 -2C.721 2)2 AL« C* -1.01) »7.441 -21.7*2 til 4L* C -0.211 »7.21* -*».071 IS* AL« O -0.»*1 »7.101 -24.117 til 4L« Cl -1.7*2 ll.ltl -11.)77 - 2») LIU N 0.*»» »4.72* -12.*47 2)) LIU Cl 3.417 »4.2«) -24.20« 29» LfU C 0.121 »1.14* -2*.»10 <)) LAU O 0.474 »».2)1 -24.111 2») LIU CS 1.04) »1.177 -2».*07 2») LtU CO ».1*4 »«.ft* -2».*»» 293 LIV COl ».21« »».»«2 -22.«21 2)> LtU C02 4.2*1 »7.(1) -24.4IC 2)4 »Lt k (.1)7 >*.1*1 -24.047 21* 2Lt C Dl 0.104 90.444 -21.4)7 21« It! CCl O.«*« 11.22) -2).10) 21* SU Cl -0.111 »2.014 -2).170 I»* ILI CCS -1.10» »0.400 -24.0*1 U* lul Ci -0.404 »2.07* -24.144 2)4 Ilt C -1.121 92.1*7 -2».*)* 22* til O -2.113 »2.1*4 -24.1*4 21) LfU k -2.1*0 I*.««) -24.77» 2)1 LtU Cl ->.ltt »S.021 -21.42) 2») LfU C -I.IM »».»*) -24.472 2)1 LfU O -4.101 II.*1* -27.119 2)1 UV Ct -4.1)2 )).741 -*4.171' 2)1 LfU CC -1.1*0 >4.)«1 -2).»*: 2»» LtU COl -1.4)2 J1.4M -22.1*1 2)4 LfU COl -4.212 I*.1)1 -2*.123 23» SI* k -2.0·* )«.«>f -t*.T4l 1) » SI* Cl -1.7*4 »7.2)7 -27.11* 2»· )d C -1.4*1 »*.2*2 -2*.X** 21* SI· O -1.7** »*.*)* -)0.|*C »»· SI· C* -0.*»» 11.2)4 -27.71) 2) · SI· OS 0.1*1 )7.)71 -IT.112 2)7 LTS u -1.0*· »».0*7 -21.112 2)7 LTS Cl -C.I4I »4.011 -2*.*12 217 LTS C -2.111 I1.27T -10.2«· 2IT LT) O ->.)T| »2.*11 -U.44« 2JT LTS C* 0.272 »1.112 -21.Ml tit LT1 CC e.*T7 »2.2*0 -»0.T14 2>T LTS () 2.020 »l.»»l -20.**t

I DK 175523 B1 I

I 36 I

I 11T Lft Ct 2.)«) 16.7*2 -11.721 >37 m «I 7.72» 2«.7*0 -)1.774 I

I III Mit il -1.711 12.711 -I*.»: 111 MXt Cl -4.1«! 12.14) -27.171 I

I 1)1 Mil c -).))4 12.1*1 -)).471 1)1 Mt) 0 -1.71) 12.77* -)7.)42 I

1)1 M|t (I -1.741 18.142 -21.121 2)1 Mt) CS »1.09« 17.121 -17.2)7 I

1)1 M)t MCI -1.7C7 27.471 -21.1)1 1)1 Mit C02 -1.1)7 27.271 -)8.)74 I

I 111 Mil Cd -1.674 27.7)1 -17.442 117 Mtt «12 -1.74) 17.467 -)6.)77 I

2)7 MO « -7.741 1).717 -17.)4) 2)7 Mi C4 -4.761 >4.777 -27.77) I

2)7 110 C -1.284 14.6)2 -21.1)2 2)7 «0 6 -7.747 >4.717 -27.142 I

2)7 »M C) -7.011 17.777 -27.713 2)7 MIO CC -4.444 11.174 -11.627 I

1)7 MIC CO -7.4)4 >».4)7 -10.441 248 *tN « -f.lli ».747 -27.227 I

1*0 III Cl -7.127 >2.0*1 -27.211 2*0 At« C -7.701 >1.110 -27.710 I

I 2*0 AID C -10.*40 >0.410 -27.774 240 A$n Cl -4.40) >1*247 -10.Ill I

>40 ASN CO -7.7M 10.127 -)0.717 2*0 A)N OSI -7.ODI 11.170 -)1.147 I

2*0 A7N «02 -T.470 27.)07 -)0.714 2*1 71» « -·.)!» >1.60* -)7.)04 I

241 TIM C* -A.)Qi >0.12« -24.120 2*1 TIM C -7.104 >0.4)1 -21.7)4 I

2*1 TIM O -7.0«) >2.7)) -24.47« 241 TIM Cl -4.77) 27.7)0 -II.47) I

2*1 TIM C6 -4.074 II.7C3 -14.7)7 2*1 TIM C61 -4.111 27.4» -17.717 I

2*1 TIM C02 -4.6)1 27.12« -24.11) 2*1 TIM «» -).)42 27.7*7 -27.211 I

2*1 TIM CI2 -4.414 17.47« -27.21« 2*1 TIM CO -4.0TT 27.46« -2*.Til I

I 2*1 TIM C21 -).17) 24.77« -27.174 2*1 Ti* Ct) -2.712 27.««7 -24.74) I

2*2 TIM CM2 -2.470 2«.77) -21.001 2*2 TmI n -7.727 27.771 -2*.1*2 I

242 TmI C4 -10.4)7 10.117 -22.711 242 THI C -7.447 >0.174 -21.747 I

2*2 THI 0 -7.7)) 27.474 -21.7)7 2*2 THI Cl -11.)77 27.0)2 -22.471 I

2*2 TmI 081 -10.7)7 27.77* -22.474 2*2 TMI CC2 -11.474 27.707 -2).771 I

2«) A|N N -7.744 10.AS* -20.411 2*) AtN «82 -U.777 20.40* -16.747 I

2*) 4|« 801 -11.441 >1.»7 -14.717 2«) *1N C8 -11.07) 21.1)1 -17.701 I

2«) 41« Cl -7.701 )1.7)0 -1).))2 2«) Al« CA -7.0f) >0.7)1 -17,4*4 I

I«) *t« C -1.4)7 27.$03 -17.010 2*3 AtN 0 -7.173 27.11« -17.440 I

244 TmI h -7.744 21.)42 -17.2» 244 Th· Cl -7.))1 2*.))* -17.0)7 I

<*· TMI c -1.133 24.373 -17.102 2«* T»l 0 -Τ.32* 21.7)1 -17.111 I

TmI Cl *10.44) 24.077 -17.*** 2*4 TMI 681 -11.7)1 24.iT) -17.4)4 I

2** Tmi CC2 -10.58) 24.191 -17.1)1 2*) Cl« N -7.C72 24.714 -21.07) I

*»· ClN C* -4.744 24.342 -21.742 2*S ClN C -1.4*7 27.020 -21.)20 I

<41 n* 6 —4· 17) 24.37) -21.447 |*3 Ci« CB -7.3)6 2«.»7 -23.377 I

>4) UN Ct -7.24) 27.)24 -2).)17 24) ClN CO -I.*7) 2).IT) -21.421 I

<41 CLN 071 -7.306 24.147 -27.T2T 2*7 ClN NE2 -7.74) 21.112 -24.)70 I

>4« *41 N -1.477 21.30* -21.227 2*4 »Il CA -4.477 27.040 -20.770 I

<4* *IL C -I.«31 2A.I42 -17.147 2*4 v*i 0 -2.TDI 21.227 -1).)41 I

<4* Tål C) -4.77) 30.1)7 -20.421 2*1 7*1 CS1 -3.7*4 11.272 -20.027 I

<4* «41 C62 -7.147 >1.131 *21.77« 247 Alt N -4.717 27.2*0 -17.4*2 I

<4T »C Cl -4.)70 27.71* -17.147 1*7 *18 C -).770 24.2)2 -17.)10 I

>47 «18 6 -2.70) 2).)13 -14.7*4 247 AI6 C) -7.7» 27.447 -14.14« I

<4T 416 C8 -4.717 27.0«) -14.1)2 2*7 AIC CO -4.8)4 27.17) -17.77) I

<4T AI8 N( -1.4*0 24.717 -12.3*4 2*7 4«C Cl -1.7«) 14.144 -ti.Il) I

2*7 416 N«1 -7.01* 27.41* -11.210 247 418 N«2 -3.177 2«.*21 -10.270 I

*4) til N -4.410 23.103 -11.131 241 321 Cl -4.0)7 2*.1>1 -11.424 I

<*· til C -2.417 24.01* -11.07« 2*1 l£t O -1.7*1 2).21) -11.111 I

<*» til Cl —f.0)4 2).487 -14.)72 2*| Sti 08 -4.1*4 23.770 -11.1)1 I

<47 til N -2.380 24.7)3 -20.1)4 2«) 3(1 C* -1.22) 34.77* -20.1» I

i*· IC· C -0.871 23.302 -17.7*0 2*7 1(1 O l.UI 24.70) -28.0*7 I

<47 »*» C) -1.)17 23.7)1 -22.811 2*1 321 08 -0.703 2).417 -22.71* I

06 ItU N -0.21« 24.3» -17.140 2)0 III) CD2 1.12* 21.»I* -11.222 I

l>6 LIU C01 -6.37) 30.4)3 -17.2*1 230 L«U Ct 0.772 21.4)7 -II.Ill I

<76 IIU Cl 8.17) 21.O«) -17.707 2)0 HU C* 6.71« 24.1)7 -11.211 I

06 L(U C 1.072 27.47* -17.2*1 210 LCU 6 2.2» 27.421 -17.0)2 I

<11 Cl« * 0.0*7 27.0CT -14.714 2)1 ClN N22 -2.770 21.712 -12.277 I

<» Cl« 621 -2.117 ».47* -12.7» 2)1 ClN CO -2.)*> 2*.710 -17.0)4 I

<lt ClN C8 -1.211 24.11* -1).774 271 ClN Cl -6.IIT ».*21 -14.)77 I

I <>t ClN CA 6.311 27.741 -17.7*1 291 CLN C 6.71« 22.444 -14.7*1 I

<» ClN 0 1.74) 22.01* -17.41« 132 4SN 4 0.4» ».)«* -17.710 I

1*2 4tN Ct 1.012 21.20« -11.212 2)2 å)N C 2.)«* 21.71» -17.771 I

212 At« 0 2.10« 20.4*2 -1).7*| »2 ASN Cl 0.004 20.710 -17.2)2 I

2» >tN C6 -1.874 17.72* -17.>71 272 4SN 061 -6.»* 17,77) -17.)62 I

37 DK 175523 B1 112 llh »I -2.2)4 11.11* -IV.in 253 τν· h Mil »I.»8» -II.vil «11 !«l Cl l.Itt 12.llT -1V.T11 HI V«· C !.»»> 11.2*1 -II.Ilt «11 7«» s 1.1*1 11.711 -IV.«17 211 Tul C« *·β·* «1.172 -28.112 in τ*« en 2.ns «*.νιτ -«o.*2i «11 τ»ι ccz ».1*7 n.no -«2.112 214 Tul V 1.211 «1.1 TT -17.111 «I* Tu* C« ·.«»* «1.112 -It.lll 114 IM c 7.4«* >2.798 -14.412 «I* Tul O 7.*82 21.119 -17.011.

21* tul Cl S.II* 11.SM -11.112 «I* Tt*8 OG] 1.12* «2.17« -11.0*8 «I* Tul (12 4.118 I*.J*I -14.182 >11 Thi « 1.471 «1.27* -14.87* «11 1«( Cl V.TT1 «2.17* -1S.IIT 211 t«l C V.421 «2.811 -14.414

«II Til O 7.*17 «2.71« -11.47« 25Ϊ 7-1 Cl ll.CIB *1.411 -1I.I7T

111 Ih« OCl 11.812 «1.787 -17.121 »Il T»l CC2 12.27* «2.42» -11.*8* IS* 471 * 7.*9* 28.782 -14.11* >1* 171 Cl V.Ii* 10.8*1 -11.018 21* 471 C 28.122 2C.113 -22.0*1 II* HI 9 11.4*2 18.27* -12.172 «I* 471 Cl V.82* 18.178 -11.2*7 Sti 4TI CC V.81I 17.101 -11.V21 «I* 471 CO 10.21* 14.7*1 -11.777 «14 471 Cl 10.212 11.7*8 -10.421 «I* 471 hl 7.2*1 14.1*7 -11.01* 217 4tU h 10.«12 >8.174 -18.82* 217 4(U C* 11.272 «1.01* -7.773 257 LtU C 11.219 «8.212 -8.41« 117 4IU O 12.87* 28.1*5 -7.712 . 117 4tU Cl 11.187 22.1*7 -8.122

217 LIU CG 11.117 21.420 -10.1*1 217 LtU CD2 11.2«* 21.081 -V.V2I

117 LtU CC2 12.»7* 21.4*1 -11.325 211 CL7 N 10.411 17.282 -8.278 218 Cl 7 C* 18.102 11.711 -4.IT* 211 ClI C 8.1*1 18.70) -8.17) 251 Cl7 0 1.211 28.75* -7.202 217 *1* N 7.02* 11.282 -1.110

217 117 C* 7.717 17.87* -4.11* 217 *1· C 4.457 11.741 -4.78V

257 11» 0 4.117 10.037 -4.21« 217 41» C« 7.71* 17.1*0 -1.01) 217 41» CG 4.781 17.121 -2.2*1 257 *1» 001 8.411 17.827 -2.11« 257 «5» OS2 7.071 14.2*7 -2.321 2*0 Sf> N 8.1*0 )8.410 -8.312 2*0 II* C* «.»Il 17.177 -1.127 2*8 tf* C 4,04» 20.1*2 -4.287 2*0 8(7 0 8.100 «1.581 ·*.«** 2*0 II» Cl 8.3*5 II.*11 -4.21* 2*8 Sit OC 2.7*5 17.117 -5.4*1 2*1 »»C N 4.2*1 17.778 -1.112 2*1 »h| C* 3.1)1 «0.4*1 -1.115 2*1 »«( C *.5*4 21.0*4 -1.8(1 2*1 f*I 0 3.7** 22.1*1 -1.4)2 2*1 »»I Cl 4.05) 17.747 -0.14) 1*1 »Hl CG 3.1*7 20.))T 0.711 241 »»( C01 2.20* 20.1*3 1.121 2*1 »Hl C02 «.*01 «1.0*8 l.SII 2*1 »"t CC1 2.7)7 28.717 2.311 2(1 »Hl C(2 3.7*5 21.*02 «.7*1 2*1 »Hl C2 2.405 21.*41 3.11« 2*2 178 h l.TTI «1.711 -2.305 2*2 7»» c* *.*l* 22.11* -2.251 2*2 17» C 4.126 13.411 -3.1*5 2*2 Til O 7.281 H.IS3 -3.313 2*2 771 Cl 1.12! 22.«55 -1.853 2*2 TTI CC 8.1«* 21.172 -0.45« 212 Tt« CC1 1.014 20.41* -0.)«* 2*2 TTI C02 8.1*1 22.4*1 0.411 2*2 771 Cll 1.6*2 17.873 0.112 2*2 778 CI2 8.11* 22.0*7 1.7*2 2*2 718 C2 1.6*1 20.472 1.811 2*2 778 Oh 7,7*5 26.027 8.281 2*1 718 * 4.12* 21.10« -4.411 241 77» C· 4.812 21.411 -4.022 2*3 718 C 8.*2* 23.410 -4.15« 24) Til O 8.711 >*.117 -8.111 2*1 778 Cl 7.121 22.7*1 -4.411 2«) 77* CC V.2H 21.031 -4.0*8 «*) 7ft C01 10.6*4 24.044 -4.45T 2«) 778 C92 7.866 22.3*2 -4.711 24) 718 Cll 11.115 24.321 -4.141 2(3 778 C(2 11.0*2 22.4*0 -*.*71 2«) 718 CZ 21.1)1 23.411 -8.10* 2*1 77» 0" 17.8*5 21.7*7 -4.117 2** CL7 h 4.471 23.1*1 -4.11* 24* GLT C* 1.381 21.0·* -7.*12 «4» GLT C 1.I4T 22.11* -8.33* 2** Cd O 4.4*7 21.274 -8.3*5 2*1 L75 h S.«)» 22.«ΤΤ -7.75* 245 L7| C* 3.83« 21.778 -10.171 2*1 L13 C 8.111 «2.2)2 -II.*4« >45 LTS O I.*** 21.1*3 -12.31· 2*5 LIS Cl 2.755 22.071 -12.0*4 245 LT1 CC 1.488 21.1*3 -11.IC* 241 LU CO 0.718 20.8*1 -12.071 245 LTS Cl -0.412 20.41» -11.311 2*5 LT1 kl -).«71 23.757 -12.»II 2*4 GLT N S.TIT 21.22* -10.817 24« CL1 C* 7.126 23.412 -11.325 2*4 GLT C 7.155 25.052 -11.818.

244 CL1 O 4.177 25.71) -11.4*1 247 LfU N 1.2*2 25.11* -12.410 2(7 LCU C* l.*ie 24.440 -13.017 2*7 LtU C 7.804 2*.771 -14.4)7 2*7 Lill O 7.111 21.VOV -11.218 247 LtU CB 10.010 2*.Ill -13.21* 147 LtU CG 10.4)2 2I.04C -1*.0)I «47 HU C01 18.01* 21.1)1 -11.250 2*7 LIU C02 11.12« «7.121 -1*.3ZT 248 2Lt N 7.0*4 >7.1*3 -14.432 >41 2L1 C« 4.40» 21.035 -II.V«* 241 ILI C 7.424 2».2*1 -17.0«) >48 ILI O 8.1)7 21.71) -14.112 241 ILI Cl 1.1*1 21.218 -11.111 24* Ut CC1 4.011 80.1*1 -11.442 2*8 Kt CG2 4.1·) 21.121 -14.8*7 141 XLt C01 8.117 31.7*4 -14.2*2 2*1 «IV II 7.007 27.8*3 -11.2)7

I DK 175523 B1 I

I 38 I

I **' *»« Cl M« M.»tJ *1*.·»» 241 UK C *.114 11.11» ·>Β.*Η I

I *·* »»" o i.i*s ;mi: -2β.·ο tn u« ct ·.*>> ii.iii -u.it» I

i*» ui c* i.i*j *«.·:* -».m tn is* ooi i.mi 21.124 .n.m I

I "02 IB.DU 21.7*4 «11.«11 IU m * 4.181 11.1*1 *10.11» I

I >io i*i c« ».in i:.*ii *u.*i« uo m c *.oit )o.oo7 -ii.bi* I

I *10 1*1- 6 I.01T 11.1*4 -il.m tic 1U Cl f.tl* 11.110 *11.*u I

I *10 *41 CH 4.1*1 11.111 *11.114 |lo >11 CC1 *.*10 ti.1*2 *21.111 I

I *li " l.m 21.101 *21.141 211 6LN C* 1.401 24.210 ·2».1»» I

I *1i 0 *·**♦ IT.41* *21.011 Hl Si* 0 4.211 21.10» *24.111 I

I *11 ti" Cl 1.10» 21.220 *2».14* 271 61* CC 1.«04 21.411 >24.111 I

I *T> ti* CC 10.101 21.»IS -24.Sil »TI 61« 011 11.144 11.111 -21.111 I

I *T> ti* «(2 11.702 21.Ill *24.110 212 4i* W 4.177 24.141 *2».»12 I

I >7* »i* C* 4.12« 21.712 *2».20 Hl II i C ».701 21.111 -2*.14« I

I *12 41* O 1.114 21.105 *21.001 »72 *1« CB 4.7*1 2».7*2 *21.172 I

I >T* 414 « 4.2*7 24.441 -21.114 IT] 414 C4 2.4*0 24.121 *12.111 I

I *T* 4L4 C 2.011 27.121 . *2«.020 »TJ 414 O 0. 144 27.211 -24.211 I

*7> 414 Cl 2.714 27.773 *21.111 27* 414 N 2.711 <1.40* *24.742 I

I |T* 414 Cl 2.112 »0.111 *24.210 27* 414 C4 2.181 21.1*4 ·)|.|47 I

r *u *14 C 1.110 11.141 -21.040 «1* »1» O 0.140 »1.4*1 *27.121 I

I *TJ ti« * 2.110 27.11« -27.11* 271 61« C4 2.0*1 24.lt· -21.127 I

*T1 »I" C 2.1*7 21.241 *21.771 27» 61« O 1.240 »7,101 *24.424 I

I *TJ tiN OT i.}·) 27.141 -10.110 27» 61« Cl 0.444 21.71* -2B.12B I

I m ti« C6 1.451 2*.»** -27.*11 |7» 6l« CO -0.121 »3.11* -27.»11 I

I *T* ti« 0(1 *1.174 21.14» *21.721 271 61« N(2 *1.171 »1.411 *24.111 I

39 DK 175523 B1

Oe ovenstående strukturelle studier sammen med de heri og andetsteds viste kinetiske data (M. Philipp et al. (1983) Mol. Cell. Biochem. 51, 5-32, I.B. Svendsen (1976) Carlsberg Res. Comm. 41 , 237-291 ,- S.F. Markland Id; D.C. Stauffe et al.

5 (1965) J. Biol. Chem. 244, 5333-5338) angiver, at understeder ne i subtilisins bindingskløft er i stand til at vekselvirke med substratam inosyrerester fra P-4 til P-2'.

De mest omfattende undersøgte af de ovenstående rester er Glyl66, Glyl69 og Ala 152. Disse aminosyrer blev identificeret som rester inden for S-l-understedet. Som det ses af f i g. 3, som er et stereobillede af S-l-understedet, optager Glyl66 og Glyl69 positioner i bunden af S-l-understedet, mens Alal52 optager en position nær toppen af S-l, nærved den katalytiske Ser221.

Alle 19 am inosyresubstitut i oner af Glyl66 og Glyl69 er blevet foretaget. Som det vil blive angivet i de følgende eksempler, vil de foretrukne erstatningsaminosyrer for Glyi66 og/eller

Glyl69 afhænge af den spec i f i kke aminosyre, som optager P -ΙΣΟ positionen i et givet substrat.

Oe eneste substitutioner af Alal52, som for tiden er foretaget og analyseret, omfatter erstatningen af Alal52 med Gly og Ser. Resultaterne af disse substitutioner på P-1-spec ifi c itet vil 25 blive vist i eksemplerne.

Udover de rester, som er specifikt forbundne med specificitet over for P-l-substrataminosyren, er Tyr 104 blevet identificeret som værende involveret i P-4-specifi c itet.. Substitutioner ved Phel89 og Tyr217 forventes imidlertid at påvirke henholds- O v vis P-2'- og P-l'-specificitet.

Subtilisins katalytiske aktivitet er også blevet modificeret ved enkelte aminosyresubsti tut ioner ved Asnl55. Den katalytiske trehed af subtilisin er vist i fig. 4. Som det kan ses, 3 5 er Ser221, His64 og Asp32 anbragt således at de letter nukleo-filt angreb af ser inhydroxy1 at på carbonylen i den spaltelige peptidbinding. Krystallografiske undersøgelser af subtilisin

I DK 175523 B1 I

I I

I (Robertus et al. (1972) Biochem. 11, 4293-4303; Matthews et I

I al. ( 1975) J. B i o 1 . Chem. 250 , 7120-7126 og Poulos et al. I

(1976) 0. Biol. Chem. 250, 1097-1103) viser, at der dannes to I

I hydrogenbindinger med oxyanionen fra substratovergangsti 1stan- I

5 den. En hydrogenbindingsdonor er fra det katalytiske serin- I

I 221-hovedkædeamid, mens den anden er fra en af NE2-protonerne I

i asparagin-155-sidekæden, se fig. 4. I

I Asnl55 blev substitueret med Ala, Asp, His, Glu og Thr. Disse I

I j0 substitutioner blev foretaget for at undersøge stabiliseringen I

af det ladede, tetraedriske mellemprodukt af overgangst i 1stan- I

dskomplekset ved hjalp af den mulige hydrogenbinding mellem I

I sidekaden i Asnl55 og mellemproduktets oxyanion. Disse bestem- I

I te substitutioner forårsagede store formindskelser i substrat- I

omsætningshastighed, kcat (200 til 4000 gange), små formind- I

I skelser i substratbinding Km (op til 7 gange) og et tab i I

overgangstilstandsstabiliseringsenergi på 2,2 til 4,7 kcal/ I

I mol. Bibeholdelsen af Km og faldet i kcat vil gøre disse mu- I

tantenzymer nyttige som bindingsproteiner for specifikke pep- I

I 20 tidsekvenser, hvis natur vil blive bestemt af forstad ieprotea- I

sens specificitet. I

Der er blevet identificeret forskellige andre aminosyrerester, I

I som påvirker a 1kalistabi1 itet. I nogle tilfælde har mutanter I

med ændret a 1kalistabi1 itet også ændret termisk stabilitet. I

25 I

I B. amyloliquefaciens-subtilisin er resterne ‘Asp36, Ilel07, I

I Lysl70, Ser204 og Lys213 blevet identificeret som rester, der I

I efter substitution med en anden aminosyre ændrer det muterede I

I enzyms a 1kalistabi1 itet sammenlignet med forstadieenzymet. I

30 Substitutionen af Asp36 med Ala og substitutionen af Lysl70 I

I med Blu resulterede hver i et mutantenzym med en lavere alka- I

I listabilitet sammenlignet med vildtypesubti 1 i sin. Når Ilel07 I

I blev substitueret med Val, Ser204 substitueret med Cys, Arg I

I eller Leu, eller Lys213 substitueret med Arg, havde mutantsub- I

I 35 tilisinen en større alkalistabilitet sammenlignet med vildty- I

I pesubti1isinen. Mutanten Ser204P udviste imidlertid en for- I

I mindskelse i a 1 ka1 i stab i 1 itet. I

41 DK 175523 B1

Desuden påvirker andre rester, som er blevet identificeret som varende forbundet med modifikationen af andre egenskaber hos subtilisin, også alka1 istabi1 itet. Disse rester omfatter Ser24, Met50, Glul56, Glyl66, Glyl69 og Tyr217. Specifikt re-5 suiterer de følgende specielle substitutioner i en forøget alka1 i stab i 1 itet: Ser24C, Met50F, Glyl56Q eller S, Glyl66A, H, K, N eller Q. Glyl69S eller A og Tyr217F, K, R eller L. Mutanten Met50V resulterer på den anden side i en formindskelse i alkalistabiliteten hos mutantsubti 1 i s inen sammenlignet med 10 vildtypesubti1isin.

Andre rester, som er involveret i alkalistabi1 itet, baseret på ( alkali stabilitetsundersøgelsen, omfatter Aspl97 og Met222.

Særlige mutanter omfatter Aspl97 (R eller A) og Met222 (alle jg andre aminosyrer).

Forskellige andre rester er blevet identificeret som værende involveret i termisk stabilitet som bestemt ved den heri beskrevne termiske stabilitetsundersøgelse. Disse rester omfatter de ovenfor identificerede rester, som påvirker alkalista- 20 biliteten og Metl99 og Tyr21. Disse sidstnævnte to rester menes også at være vigtige for alkalistabilitet. Mutanter ved disse rester omfatter 1199 og F21.

B. amyloliquefaciens-subti 1 i s i ns aminosyresekvens er også ble-25 vet modificeret ved at substituere to eller flere aminosyrer i vildtypesekvensen. Der er blevet identificeret seks kategorier af flere gange substitueret mutantsubti1 i sin. De første to kategorier omfatter termisk og oxidativt stabile mutanter. De næste tre andre kategorier omfatter mutanter, som kombinerer 30 de nyttige egenskaber af enhver af flere enkelte mutationer i B. amy 1 oliquefaciens-subti 1 i sin . Den sidste kategori omfatter mutanter, som har modificeret alkalistabilitet og/eller termisk stabilitet.

Den første kategori omfatter dobbelte mutanter, hvori to cys-teinrester er blevet substitueret ved forskellige aminosyre-restpos i t i oner i nde i subtil i si nmoleky 1 et. Dannelse af disul-fidbroer mellem de to substituerede cyste i nrester resulterer i

I DK 175523 B1 I

I I

I mutantsubti1 i s i ner med ændret termisk stabilitet og katalytisk I

I aktivitet. Disse mutanter omfatter A21/C22/C87 og C24/C87, som I

I vil blive beskrevet i flere detaljer i eksempel 11. I

I 5 Den anden kategori af multiple subti 1 i s i nmutanter omfatter mu- I

I tanter., som er stabile i nærværelse af forskellige oxidations- I

midler, såsom hydrogenperoxid eller persyrer. I eksemplerne 1 I

H og 2 beskrives disse mutanter, som omfatter F50/1124/Q222 , I

I F50/I124, F50/Q222, F50/L124/Q222, I124/Q222 og L124/Q222. I

I 10 Den tredje kategori af multiple subti1isinmutanter omfatter I

mutanter med substitutioner i position 222 kombineret med for- I

I skellige substitutioner i posi ti onerne 166 eller 169. Disse I

I mutanter kombinerer f.eks. egenskaben oxidativ stabilitet ved I

A222-mutationen med den ændrede substratspecificitet hos de I

15 I

forskellige 166- eller 169-substi tutioner. Sådanne multiple I

I mutanter omfatter A166/A222, A166/C222, F166/C222, K166/A222, I

I K166/C222, VI66/A222 og V166/C222. K166/A222-mutantsubti1isi- I

I nen har f.eks. et kcat/Km-forhold, som er ca. 2 gange større I

I end forholdet for den enkelte A222-mutantsubti1isin, når de I

20 I

sammenlignes under anvendelse af et substrat med phenylalanin I

som P-l-aminosyren. Denne kategori af multiple mutanter er be- I

skrevet i flere detaljer i eksempel 12. I

Den fjerde kategori af multiple mutanter kombinerer substitu- I

25 tioner i position 156 (GTu til Q eller S) med substitutionen I

I af Lys i position 166. Hver af disse enkelte mutationer for- , I

I bedrer enzymvirkningen på substrater med glutamat som P-l-ami- I

I nosyren. Når disse enkel te mutationer kombineres, virker de I

I resulterende multiple enzymmutanter bedre end hvert forstadi- I

30 um, se eksempel 9. I

Den femte kategori af multiple mutanter indeholder substitu- I

I tionen af op til 4 aminosyrer i B. amyloliquefaciens-subti1 i- I

sinsekvensen. Disse mutanter har specifikke egenskaber, som er I

I 25 praktisk talt identiske med egenskaberne af subtilisin fra B. I

I 1 icheniformis. Subtilisin fra B. 1 icheniformis adskiller sig I

I fra B. amyloliquefaciens-subti1isin i 87 ud af 275 aminosyrer. I

I Den multiple mutant F50/S156/A169/L217 viste sig at have til I

43 DK 175523 B1 1 icheniformis-enzymet svarende substratspecificitet og kinetik (se eksempel 13). Dette skyldes imidlertid sandsynligvis kun tre af mutationerne (S156, A169 og L217), som er til stede i enzymets substratbindingsregion. Det er ganske overraskende, 5 at ved at foretage blot tre ændringer ud af de 87 forskellige aminosyrer mellem sekvensen i de to enzymer, blev B. amyloli-quefaciens-enzymet omdannet til et enzym med egenskaber, som svarede til B. 1 icheniformis-enzymets egenskaber. Andre enzymer i denne serie omfatter F50/Q156/N166/L217 og 10 F50/S156/L217.

Den sjette kategori af multiple mutanter omfatter kombinationen af substitutioner i stilling 107 (Ile til V) med substitutionen af Lys i position 213 med Arg, og kombinationen af sub-stitutioner i position 204 (fortrinsvis Ser til C eller L, men også til alle andre aminosyrer) med substitutionen af Lys i position 213 med R. Andre multiple mutanter, som har en ændret alkalistabilitet, omfatter Q156/K166, Q156/N166, S156/K166, S156/N166 (tidligere identificeret som havende ændret sub-2Q stratspecificitet) og F50/S156/A169/L217 (tidligere identifi ceret som en B. amyloliquefaciens-subti1isinmutant med egenskaber svarende til egenskaberne hos subtilisin fra B. lichen-iformis). Mutanten F50/V107/R213 blev konstrueret på basis af den observerede forøgelse i alkalistabi1 itet for de enkelte 25 mutanter F50, V107 og R213. Det blev bestemt, at V107/R213-mu- tanten havde en forøget alkalistabilitet sammenlignet med vi 1dtypesubti 1 i sinen. I denne bestemte mutant var den forøgede alkalistabilitet resultatet af den kumulative stabilitet af hver af de individuelle mutationer. Tilsvarende havde mutanten 30 F50/V107/R213 en endnu større a 1ka1 istabi1 itet sammenlignet med V107/R213-mutanten, hvilket antyder, at forøgelsen i alkalistabilitet på grund af F50-mutationen også var kumulativ.

Tabel IV opsummerer de multiple mutanter, som er blevet fremstillet, herunder dem, som ikke er nævnt ovenfor.

Desuden skal nævnes, baseret delvis på de ovenstående resultater, at substitutionen i de følgende rester i subtilisin forventes at fremkalde en multipel mutant med forøget termisk 35

I DK 175523 B1 I

I I

I stabilitet og alkali stabilitet: Ser24, Met50, 11el0 7, GIul56, I

I Glyl66, G1yl69, Ser204, Lys213, Gly215 og Tyr217. I

I TABEL V I

I 5 I

I Tredobbelte, firedobbelte I

I Dobbelte mutanter eller andre multiple_ I

C22/C87 F50/I124/Q222 - I

I C24/C87 F50/L124/Q222 I

I V45/V48 F50/L124/A222 I

10 I

C49/C94 A21/C22/C87 I

I C49/C95 F50/S156/N166/L217 I

I C50/C95 . F50/Q156/N166/L217 I

I C50/C110 F50/S156/A169/L217 I

I F50/I124 F50/S156/L217 I

15 I

F50/Q222 F50/Q156/K166/L217 I

I I124/Q222 F50/S156/K166/L217 I

I Q156/D166 F50/Q156/Kl66/K217 I

I Q156/K166 F50/S15S/K166/K217 I

I Q156/N166 F50/V107/R213 I

20 I

S15 6/016 6 [S153/S156/A158/G159/S160/A161- I

I SI55/K166 164/I165/S166/A169/R170] I

I S156/N166 L204/R213 I

I S156/A169 R213/204A. E, Q, D, N, G, K, I

I Al66/A222 V, R. T, P, I, M, F, Y, W, I

25 I

A166/C222 eller Η I

I F166/A222 V107/R213 I

I F166/C222 I

I K166/A222 I

I K166/C222 (

30 I

V166/A222 I

I V166/C222 I

I A169/A222 I

I Al69/A222 I

I A169/C222 I

I 35 I

A21/C22 I 1

Udover de ovenfor identificerede aroinosyrerester menes andre I

I aminosyrerester i subtilisin også at være vigtige med hensyn I

45 DK 175523 B1 til substratspecificitet. Mutationen af hver af disse rester forventes at fremkalde ændringer i subtilisins substrat spec i -ficitet. Oesuden forventes multiple mutationer blandt disse rester og blandt de tidligere identificerede rester også at 5 fremkalde subti 1 is i nmutanter med hidtil ukendt substratspecificitet .

Særligt vigtige rester er His67, Ilel07, Leul26 og Leul35. Mutation af His67 skulle ændre S-l1-understedet og derved ændre jq mutantens specificitet for P-l'-substratresten. Ændringer i denne position kunne også påvirke mutantens pH-aktivitetspro-fi 1. Denne rest blev identificeret baseret på opfindernes sub-stratmodellering ud fra produkt inhi bi torkomplekser.

Ilel07 er involveret i P-4-binding. Mutation i denne position 1 5 skulle således ændre specificitet for P-4-substratresten udover den observerede virkning på alkalistabilitet. Ilel07 blev også identificeret ved mo 1eky1modeller ing fra produktinhibi-torkomp1ekser.

20 S-2-bindingsstedet omfatter Leul26-resten. Modifikation i denne position skulle derfor påvirke P-2-specificitet. Desuden menes denne rest at være vigtig for at omdanne subtilisin til en aminopeptidase. pH-aktivitetsprofi len skulle også blive modificeret yed passende substitution. Disse rester blev identi-25 ficeret ved undersøgelse af den raffinerede model, den tredi-mensionelle struktur fra modelstudier. En længere sidekæde forventes at udelukke binding af nogen sidekæde ved S-2-under-stedet. Binding ville derfor være begrænset til understederne S-l, S-l', S-2'. S-31, og spaltning ville blive tvunget til at 30 ske efter det aminoterminale peptid.

Leul35 er i S-4-understedet og skulle, såfremt den blev mutere t , ændre substratspecificitet for P-4 i tilfælde af mutation. Denne rest blev identificeret ved undersøgelse af den tre-35 dimensionel le struktur og modellering baseret på F222's produkt i nhibi torkomp1eks.

Udover disse steder menes specifikke aminosyrerester i segmenterne 97-103, 126-129 og 213-215 også at være vigtig for sub stratbinding.

I DK 175523 B1 I

I I

Segmenterne 97-103 og 126-129 danner et ant i para 1 Tel t β-lag I

I med hovedkæden af substratresterne P-4 til P-2. Muterende res- I

I ter i disse regioner skulle påvirke substratorienteringen gen- I

nem hovedkæde (enzym) - hovedkæde (substrat)-veksel virkninger , I

I 5 eftersom hovedkæden af disse substratrester ikke vekselvirker I

I med de bestemte rester i S-4-til S-2-understederne. I

I segmentet 97-103 kan Gly97 og Asp99 muteres for at ændre po- I

I sitionen af resterne 101-103 inde i segmentet. Ændringer på I

q disse steder skal imidlertid være forligelige. I B. amyloli- I

quefaciens-subti 1 i s in stabiliserer Asp99 en vending i den ter- I

I tiære foldning af hovedkæden, som påvirker retningen af res- I

I terne 101-103. B. licheniformis-subtilisin-Asp97 virker på I

I analog måde. I

lis I

Udover Gly97 og Asp99 vekselvirker SerlOl med Asp99 i B. amy- I

I loliquefaciens-subti 1isin til stabilisering af den samme ho- I

I vedkædevending. Ændringer i denne rest skulle ændre 101-103- I

I hovedkæderetni ngen. I

I 20 Mutationer i Glul03 forventes ligeledes at påvirke 101-103-ho- I

I vedkæderetningen. I

Sidekæden i Glyl02 vekselvirker med substrat-P-3-aminosyren. I

I Sidekæder i substituerede aminosyrer forventes således signi- I

26 fikant at påvirke specificiteten for P-3-substrataminosyrerne. I

I Alle aminosyrerne i 127-129-segmentet anses for at være vigti- I

I ge for substratspecificitet. Glyl27 er anbragt således, at I

I dens sidekæde vekselvirker med S-l- og S-3-understederne. Æn- I

I dringer af denne rest skulle således ændre specificiteten for j

I 30 I

substratets P-l- og P-3-rester. I 1

Sidekæden i Glyl28 omfatter en del af både S-2- og S-4-under- I

I stederne. Man ville derfor forvente ændret specificitet over I

for P-2 og P-4 efter mutation. Desuden kan en sådan mutation I

I 35 omdanne subtilisin til en aminopepti dase af de samme årsager, I

I som at man ville forvente, at substitutioner af Leul26 ville I

g ive detteresultat. I

I

47 DK 175523 B1

Prol29-resten begrænser sandsynligvis den konformationsroæssige frihed hos sekvensen 126-133, rester, som kan spille en stor rolle ved bestemmelse af P-l-specificitet. Erstatning af Pro kan muligvis indføre mere fleksibilitet og derved gøre sådanne 5 mutanters bindingsevneinterval bredere.

Sidekæden i Lys213 er anbragt inde i S-3-understedet. Alle aminosyrerne i 213-215-segmentet anses ligeledes for at være vigtige for substratspecificitet. Der forventes således ændret P-3-substratspecificitet efter mutation af denne rest.

Tyr2l4-resten vekselvirker ikke med substrat, men er anbragt således, at den kunne påvirke konformationen af hårnåleslyngningen 204-217.

15 Endelig skulle mutation af Gly215-resten påvirke S-3’-under-stedet og derved ændre P-3'-specifi c i tet.

Udover de ovennævnte substitutioner af aminosyrer, kan indsættelsen eller deletionen af en eller flere aminosyrer i den 20 eksterne slyngning omfattende resterne 152-172 også .påvirke specificiteten. Dette skyldes, at disse rester kan spille en rolle i den "sekundære kontaktregion", som er beskrevet i modellen af streptomyces subti1isininhibitoren, der er kompleksbundet med subtilisin, Hirono et al. (1984) J. Mol. Biol, 178, 25 389-413. Thermitase K har en deletion i denne region, som fjerner adskillige af disse "sekundære kontakt"-rester. Deletion af resterne 161 til 164 forventes især at fremkalde en rautantsubti1isin med modificeret substratspecificitet. Desuden skulle en omlejring i dette område induceret ved deletionen, 3Q ændre positionen af mange rester, som er involveret i sub stratbinding, hovedsageligt ved P-l. Dette skulle igen påvirke den totale aktivitet over for proteinholdige substrater.

Virkningen af deletion af resterne 162-164 er blevet vist ved at sammenligne aktiviteten af vildtypeenzymet (WT) med et mu-35 tantenzym indeholdende denne deletion samt multiple substitutioner (dvs. S153/S156/A158/G159/S160/A160-164/I165/S166/A169/ R170). Dette gav følgende resultater:

I DK 175523 B1 I

I I

I TABEL V I

I kcat Km kcat/Km I

I WT 50 1,4x1ο-4 3,6xl05 I

I 5 Deletionsmutant 8 5,0xl0"6 1,6x10s I

I WT har en kcat, som er 6 gange større end deletionsmutanten, I

I men substratbindingen er 28 gange tættere hos deletionsmutan- I

I ten. Den totale effektivitet af deletionsmutanten er således I

I 4,4 gange højere end WT-enzymet. I

I 10 I

I Alle disse ovenfor identificerede rester, som endnu skal sub- I

I stitueres, deleteres eller indsættes, er anført i tabel VI. I

I TABEL VI I

I 15 I

Substi tut ion/Indsættelse/Delet ion

I Rester I

I Hi s67 Alal52 I

I 20 Leul26 Alal53 I

I Leul35 G1y154 I

I G1y97 Asn 155 I

I Asp99 Glyl56 I

I Senoi Glyl57 I

I 25 Glyl02 G1yl60 I

I Glul03 Thr158 I

I Leul26 Ser159 I

I Glyl27 Se r161 I

I G1y12 8 Ser 162 I

I 30 P r o 12 9 Serl63 I

I Tyr 214 Thr164 I

I G1 y 215 Va1165 I

I G1yl66 G1yl69 I

I Tyr167 Lysl70 I

I 35 Prol68 Tyrl71 I

I Prol72 I

I Den følgende beskrivelse skal tjene som en fremvisning af ud- I

I førelsesformer og skal ikke opfattes som en begrænsning af den I

49 DK 175523 B1 foreliggende ansøgnings omfang. Disse specifikke eksempler omhandler konstruktionen af visse af de ovenfor identificerede mutanter. Konstruktionen af de andre mutanter fremgår imidlertid af den foreliggende beskrivelse og af EP publikation nr.

5 0130756.

Alle litteraturcitater indkorporeres udtrykkeligt heri ved , denne henvisning.

EKSEMPEL 1 10

Idenfikation af persyreoxiderbare rester af subti1 i s in-Q222 og -L222

Som vist i figurerne 6A og 68 inaktiverer organiske persyre-l5 oxidationsmidler mutantsubti 1 i s i nerne Met222L og Met222Q (L222 og Q222). I dette eksempel beskrives identifikationen af persyreoxiderbare steder i disse mutantsubtilisiner.

Først bestemtes den type aminosyre, som er involveret i persy-reoxidation. 8ortset fra under drastiske betingelser (G.E.

20

Means et al. (1971) Chemical Modifications of Proteins, Hol-den-Day, S.F., CA, side 160-162), modificerer organiske persyrer kun methionin og tryptophan i subtilisin. Differensspektre af enzymet over intervallet 250 nm til 350 nm blev bestemt under en inaktiveringstitrering ved anvendelse af reagenset di-25 perdodecansyre (DPDA) som oxidationsmiddel. På trods af kvantitativ inaktivering af enzymet blev der ikke noteret nogen ændring i absorbansen over dette bølgelængdeinterval som vist i figurerne 7A og 78, hvilket antyder, at tryptophan ikke blev oxideret, A. Fontana et al. (1980) Methods in Peptide and Pro-3 0 tein Sequence Analysis (C. 8irr ed.) Elsevier, New York, side 309. Fraværet af tryptophanmodifikation betyder, at der sker oxidation af en eller flere af de resterende methioniner i B. amyloliquefaciens-subti1isin , se fig. 1. 1

For at bekræfte dette resultat blev den rekombinerede subtilisin Met222F spaltet med cyanogenbromid (CNBr) både før og efter oxidation med DPDA. De peptider, som dannedes ved CNBr-spaltning, blev analyseret på SDS-pyridinpeptidgeler (SPG) med høj opløsningsevne.

I DK 175523 B1

I 50 I

I Subti 1 i s in-Met222 (F222) blev oxideret på følgende måde. Op- I

renset F222 blev gensuspenderet i 0,1 M natriumborat pH-værdi I

I 9,5 ved 10 mg/ml og blev tilsat til en slutkoncentration på 25 I

I diperdodecansyre (OPDA) ved 26 mg/ml til fremkaldelse af en I

I 5 effektiv koncentration af aktivt oxygen på 30 ppm. Prøven blev I

I inkuberet i mindst 30 minutter ved stuetemperatur og derefter I

I tilsat 0,1 volumen 1 M Tris-puffer, pH-værdi 8,6, til dannelse I

I af en s 1utkoncentrat i on på 0,1 M Tris, pH-værdi 8,6. Der til- I

I sattes 3 mM phenyl methylsu1fony 1f1uorid (PMSF), og 2,5 ml af I

10 prøven blev påført til en Pharmacia PDlO-søjle, akvilibreret i I

10 mM natriumphosphat, pH-værdi 6,2, 1 mM PMSF. Der tilførtes I

I 3,5 ml 10 mM natr i umphosphat, pH-værdi 6,2, 1 mM PMSF, og I

I elueringsmidlet opsamledes. I

F222 og DPDA-oxi deret F222 blev udfaldet med 9 vol urnener ace- I

15 I

I tone ved -20eC. Prøverne blev gensuspenderet med 10 mg/ml i 8 I

I M urinstof i 88% myresyre og fik lov til at henstå i 5 minut- I

I ter. Der tilsattes samme volumen 200 mg/ml CNBr i 88% myresyre I

I (5 mg/ml protein), og prøverne blev inkuberet i 2 timer ved I

I stuetemperatur i mørke. Før gelelektroforese blev prøverne I

I lyofiliseret og gensuspenderet med 2-5 mg/ml i prøvepuffer (1% I

pyridin, 5% NaDodS04, 5% glycerol og bromphenolblåt) og disso- I

I cierede ved 95°C i 3 minutter. I

Prøverne blev elektroforesebehandlet på diskontinuerte polya- I

25 crylamidgeler (J. Kyte et al. (1983) Anal. Bioch. 133, I

515-522). Gelerne blev farvet under anvendelse af Pharmacias I

sølvfarvningsteknik (D.W. Sammons et al. (1981) Electrophone- I

sis 2, 135-141). I 1 2 3 4 5 6

Resultaterne af dette eksperiment er vist i fig. 8. Som det I

2

kan ses giver F222, som er behandlet med CNBr, kun 9 opløste I

3

bånd på SPG. Når F222 imidlertid også behandles med DPDA før I

4

spaltning, forsvinder båndene X, 7 og 9, mens båndene 5 og 6 I

5

er stærkt forøgede i intensitet. I

6

For at bestemme, hvilke af methioninerne, som var påvirket, I

blev hver af CNBr-peptiderne isoleret ved HPLC med omvendt I

fase og yderligere karakteriseret. Puffersystemet i både I

51 DK 175523 B1 op losning soi iddel A (vandigt) og op 1 osn i ngsm i dde 1 B (organisk) for alle HPLC-separati oner var 0,05¾ triethylamin/trifluored-dikesyre (TEA-TFA). I alle tilfælde, med mindre andet er angivet, bestod opløsningsmiddel A af 0,05¾ TEA-TFA i H2O, opløs-5 ningsmiddel 8 var 0,05¾ TEA-TFA i 1-propanol, og strømningshastigheden var 0,5 ml/roinut.

Til HPLC-analyse anvendtes to injektioner af 1 mg enzymfordøjelsesmateriale. Tre prøver blev acetoneudfældet, vasket og tørret. Oe tørrede l mg prøver blev gensuspenderet ved 10 mg/ml i 8M urinstof, 88¾ myresyre, og der tilsættes samme volumen 200 mg/ml CNBr i 88% myresyre (5 mg/ml protein). Efter inkubation i 2 timer i mørke ved stuetemperatur blev prøverne afsaltet på en 0,8 cm x 7 cm søjle af grov Tris-acryl-GF05-harpiks (IBF, Paris, Frankrig) ækvilibreret med 40¾ opløs-ningsmiddel B og 60% opløsningsmiddel A. Der tilførtes 200 μΐ prøver ved en strøm ingshastighed på 1 ml per minut, og der opsamledes 1,0-1,2 ml ved registrering af absorbansen ved 280 nm. Før injektion på HPLC blev hver afsaltet prøve fortyndet 20 med 3 volumener opløsningsmiddel A. Prøverne blev injiceret med 1,0 ml/minut (2 minutter), og strømningen blev derefter justeret til 0,5 ml/minut (100% A). Efter 2 minutters forløb påbegyndtes en lineær gradient til 60% B ved 1,0% B/minut. Fra hver 1 mg kørsel blev de opsamlede toppe udtaget til prøve (50 μΐ) og analyseret ved gelelektroforese som beskrevet ovenfor.

2 5

Hvert polypeptid, som var isoleret ved HPLC med omvendt fase, blev yderligere analyseret for homogenitet ved SPG. Positionen af hvert peptid på den kendte gensekvens (J.A. Wells et al.

(1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7924) opnåedes gennem en 30 kombination af aminosyresammensætningsana1yse og, hvor det var nødvendigt, sekvensbestemmelse af aminoenden.

Før en sådan analyse skulle de følgende peptider kromatogra-feres igen.

35 1. CNBr-pepti der fra F222, der ikke var behandlet med DPDA:

Peptid 5 blev underkastet to yderligere adskillelser med omvendt fase. 10 cm C4-søjlen blev ækvilibreret til 80%A/20%B,

I DK 175523 B1 I

I 52 I

I og den opsamlede prøve blev påført og vasket i 2 minutter. I

I Derefter påbegyndtes en 0,5% ml B/minut-gradient. Fraktioner I

I fra denne separation blev igen kort, denne gang på 25 cm C4- I

I søjlen og under anvendelse af 0,05% TEA-TFA i acetonitri 1/1- I

I 5 propanol (1:1) for opløsningsmiddel B. Gradienten var identisk I

I med den netop beskrevne. I

I Peptid "X" blev underkastet en yderligere adskillelse efter I

den indledende kromatografi. Prøven blev påført og vasket i 2 I

I 1Q minutter ved 0,5 ml/roin (100%A), og en 0,5% ml B/mi n.-gradi - I

I ent blev påbegyndt. I

I Peptiderne 7 og 9 blev krom.atograf eret igen på tilsvarende må- I

de som den første genkørsel af peptid 5. I

15 Peptid 8 blev oprenset til homogenitet efter den indledende I

I adskillelse. I

I 2. CNBr-peptider fra DPDA-oxideret F222: I

I Peptiderne 5 og 6 fra en CNBr-fordøjeIse af det oxiderede F222 I

I 20 I

blev oprenset på samme måde som peptid 5 fra det ubehandlede I

enzym. I

I Am inosyresammensatningsana1yse opnåedes som følger. Prøver I

I (~lnM af hver aminosyre) blev tørret, hydrolyseret i vakuum I

I 25 roed 100μ1 6N HC1 ved 106° C i 24 timer og derefter tørret i en I

I Speed Vac. Prøverne blev analyseret på et Beckman 6300-amino- I

syreanalyseapparat under anvendelse af ninhydrinpåvisning. I

I Aminoterroinale sekvensdata opnåedes soro beskrevet tidligere I

I 30 (H· Rotiri9uez et al* (1984) Anal. Biochem. 134, 538-547). I

I Resulaterne er vist i tabel VII og fig. 9. I

I 35 I

TABEL VII

53 DK 175523 B1

Amino- og COOH-ender af CNBr-fragmenter

Ende og metode 5

Fragment amino, metode COOH, metode X 1, sekvens 50, sammensætning 9 51, sekvens 119, sammensætning 7 125, sekvens 199, sammensætning 10 8 200, sekvens 275, sammensætning 5ox 1, sekvens 119, sammensætning 6ox 120, sammensætning 199, sammensætning

Peptiderne 5ox og 6ox henviser til peptiderne 5 og 6, isoleret fra CNBr-fordøje1 ser af det oxiderede protein, hvor deres respektive mængder er forøget.

Fra dataene i tabel VII og sammenligningen af SPG-spor for fordøjelserne af det oxiderede og native protein i fig. 8, 20 fremgår det, at (1) Met50 oxideres, hvilket fører til tab af peptiderne X og 9 og tilsynekomsten af 5, og at (2) Metl24 også oxideres, hvilket fører til tabet af peptid 7 og akkumuleringen af peptid 6. Oxidation af B. amy1oliquefaciens-subti- lisin med persyren, diperdodecansyre, fører således til den 25 specifikke oxidation af methionin i resterne 50 og 124.

EKSEMPEL 2

Substitution ved Met50 og Metl24 30 i subtilisin Met222Q_

Valget af aminosyre til substitution ved Met50 blev baseret på de tilgængelige sekvensdata for subtilisiner fra B. licheni-formis (E.C. Smith et al. (1968) J. Biol. Chem. 243, 2184-2191), B.DY (P. Nedkov et al. (1983) Hoppe Sayler’s Z. Physi-^ ol. Chem. 364, 1537-1540), B. amy1osacchariticus (F.S. Mark

land et al. (1967) J. Biol. Chem. 242, 5198-5211) og B. subtilis (M.L. Sthal et al (1984) J. Bacteriol. 158, 411-418). I

I DK 175523 B1 I

I I

I alle tilfælde er position 50 en pheny 1 a 1 an i n, se f i g. 5. I

I Phe50 blev derfor valgt til konstruktionen. I

I I position 124 har alle kendte subti 1isiner en methionin, se I

I 5 fig. 5. Molekylmodellering af den røntgentafledte protein- I

I struktur var derfor nødvendig for at bestemme de mest sandsyn- I

I lige emner til substitution. Af alle 19 emner valgtes isoleu- I

I cin og leucin som de rester, som det var bedst at anvende. For I

I at teste, hvorvidt modifikation på det ene sted, men ikke beg- I

io 9e stec*er' var tilstrækkeligt til at forøge den oxidative sta- I

I bilitet, blev alle mulige kombinationer bygget på Q222-rygra- I

I den (F50/Q222, I124/Q222, F50/I124/Q222). I

A. Konstruktion af mutationer I

I mellem codonerne 45 og SO I

15 I

I Alle manipulationer til cassettemutagenese blev udført på I

I pS4.5 under anvendelse af metoder, som er beskrevet i EP pub- I

I likation nr. 0130756 og J.A. Wells et al. (1985) Gene 34, I

I 315-323. ρΔδΟ-mutationerne i fig. 10, linie 4, blev fremkaldt I

20 under anvendelse af den i fig. 10, linie 6 viste mutagenese- I

I primer, og der anvendtes en måde at gå frem på, som betegnes I

I restriktionsoprensning, hvilket er beskrevet nedenfor. Kort I

I fortalt anvendtes en M13-skabelon indeholdende subti 1 i s inge- I

I net, og M13mpll-SUBT anvendtes til heteroduplexsyntese (Adel- I

I 25 man et al. ( 1983), DNA 2, 183-193 ). Efter transfektion af I

I JM101 (ATCC nr. 33876) blev 1,5 kb EcoRI-BamHI-fragmentet in- I

I deholdende subti 1isingenet underklonet fra M13mpll-SUBT-rf ind I

I i et roodtagervektorfragment af pBS42, hvis konstruktion er be- I

I skrevet i EP publikation nr. 0130756. Til mutantsekvensberi - I

I 30 gelse (ρΔ50, linie 4), blev den resulterende plasmidpulje for- I

I døjet med Kpnl, og lineære molekyler blev oprenset ved polya- I

crylamidgelelektroforese. Lineære molekyler blev ligeret til- I

I bage til en cirkulær form og transformeret ind i E. coli- I

I MM294-celler (ATCC nr. 31446). Isolerede plasmider blev scree- I

I 35 net ved restriktionsanalyse for KpnI-stedet. KpnI +-p1 asm i der I

I blev sekvensbestemt og bekræftede ρΔ50-sekvensen. Stjerner i I

I fig. 11 angiver de baser, som er muteret fra vi 1dtypesekvensen I

I (linie 4). ρΔ50 (linie 4) blev skåret med Stul og EcoRI, og I

55 DK 175523 B1 0,5 kb fragmentet indeholdende δ’-halvdelen af subti 1 i si ngenet blev oprenset (fragment 1). ρΔ50 (linie 4) blev fordøjet med Kpnl og EcoRI, og 4,0 kb fragmentet indeholdende 3’-halvdelen af subti1 isingenet og vektorsekvenser blev oprenset (fragment 5 2). Fragmenterne 1 og 2 (linie 5) og duplex-DNA-cassetter ko dende for ønskede mutationer (skraveret sekvens, linie 6) blev blandet i et molært forhold på henholdsvis 1:1:10. Til den bestemte konstruktion i dette eksempel indeholdt DNA-cassetten tripletten TTT for codon 50, hvilket koder for Phe. Dette 10 plasmid blev betegnet pF50. Mutantsubti1isinen blev betegnet F50.

B. Konstruktion af mutation mellem codonerne 122 og 127 15

Fremgangsmåden fra eksempel 2A blev fulgt i væsentlige detaljer, bortset fra at der anvendtes mutageneseprimeren fra fig.

11, linie 7, og at der anvendtes restriktionsoprensning for EcoRV-stedet i ρΔ124. Desuden indeholdt DNA-cassetten (skraveret sekvens, fig. 11, linie 6) tripletten ATT for codon 124, 20 hvilket koder for Ile, og CTT for Leu. Oe plasmider, som indeholdt substitutionen af Metl24 med Ile, blev betegnet pI124. Mutantsubti1isinen blev betegnet 1124.

C. Konstruktion af forskellige 25 multiple F50/I124/Q222-mutanter

Triplemutanten, F50/I124/Q222, blev konstrueret ud fra en trevejsi igering, hvori hvert fragment indeholdt en af de tre mutationer. Enkeltmutanten Q222 (pQ222) blev fremstillet ved casse11emutagenese som beskrevet i EP publikation nr. .0130756. F50-mutationen var indeholdt på et 2,2 kb Avail- til PvuII-fragment fra pF50, 1124-mutationen var indeholdt på et 260 bp PvuII- til AvaII-fragment fra pI124, og Q222-mutationen var indeholdt på et 2,7 kb Avail- til AvalI-fragment fra pQ222. De tre fragmenter blev ligeret sammen og transformeret ind i E. coli-MM294celler. Restriktionsanalyse af plasmider fra isolerede transformanter bekræftede konstruktionen. For at analysere den endelige konstruktion var det bekvemt, at Avall-stedet

I DK 175523 B1 I

I 56 I

I i position 798 i vildtypesubtil isingenet blev fjernet af 1124- I

konstruktionen. I

I F50/Q222- og I124/Q222-niutanterne blev konstrueret på tilsva- I

g rende måde, bortset fra at der anvendtes det behorige fragment I

fra pS4.5 til den endelige konstruktion. I

I D. Q222-mutanters oxidative stabilitet I

De ovennævnte mutanter blev analyseret for stabilitet over for I

10 persyreoxidation. Som vist i fig. 12 er både I124/Q222 og F50/ I

I124/Q222 fuldstændigt stabile efter inkubation med diperdode- I

I cansyre (protein 2 mg/ml, oxidationsmiddel 75 ppm[0]), mens I

F50/Q222 og Q222 inaktiveres. Dette viser, at omdannelse af I

I Metl24 til 1124 i subtilis in Q222 er ti 1st række1ig til at bi- I

15 bringe modstandsdygtighed over for organiske persyreoxidati- I

onsmidler. I

I EKSEMPEL 3

Subti 1 is i nmutanter med ændret I

20 I

substratspecificitet-hydrofobe I

I substitutioner ved rest 166 I

Subtilisin indeholder en vidstrakt bindingskløft, som har hy- drofob karakter. En bevaret glycin i rest 166 blev erstattet 25 med 12 ikke-ioniske aminosyrer, hvis sidekæder kan rage ind i S-l-understedet. Oisse mutanter blev konstrueret for at be- stemme virkningen af ændringer i størrelse og hydrofobicitet på bindingen af forskellige substrater.

I 3Q A. Kinetik for hydrolyse af substrater med ændrede P-l-aminosyrer hos sub- I tilisin fra B. amyloliquefaciens

Vildtypesubtilisin blev oprenset fra B. subtiliskultursuper- I natanter, som udtrykte B. amy1 o 1 iquefaciens-subti 1 i s i ngenet | I 35 (J.A. Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7925) I som beskrevet tidligere (D.A. Estell et al. (1985) J. Biol.

I Chem. 260, 6518-6521). Detaljer af syntesen af tetrapeptid- 57 DK 175523 B1 substrater med formen succinyl-L-AlaL-AlaL-ProL-[X]-P-nitro-anilid (hvor X er PI-aminosyren) er beskrevet af E.G. DelMar et al. (1979) Anal. Biochem. 99, 316-320. Ki net ikparametre,

Km(M) og kcat(s”1) blev målt under anvendelse af en mod i f ice-5 ret forlobskurveanalyse (D.A. Estell et al. (1985) J. Biol.

Chem. 260, 6518-6521). Kort fortalt passede afbildninger af hastighed mod produktkoncentration til den differentielle form af hastighedsligningen under anvendelse af en ikke-lineær regressionsalgoritme. Fejl i kcat og Km for alle rapporterede 10 værdier er mindre end 5%. De forskellige substrater i tabel VIII er anbragt i rækkefølge efter faldende hydrofobicitet. Y. Nozaki (1971), J. Biol. Chem. 246, 2211-2217, C. Tanford (1978) Science 200, 1012).

15 TABEL VIII

Pl-substrat kcat/Km aminosyre kcat(S~l) l/Km(M~l) (s-*Μ-1)

Phe 50 7.100 360.000 20 Tyr 28 40.000 1.100.000

Leu 24 3.100 75.000

Met 13 9.400 120.000

His 7,9 1.600 13.000

Ala 1,9 5.500 11.000 25 Gly 0,003 8.300 21

Gin 3,2 2.200 7.100

Ser 2,8 1.500 4.200

Glu 0,54 32 16 2 3 4 5 6 7 2 kcat/Km-forholdet (som også omtales som katalytisk effektivi 3 tet) er den tilsyneladende anden ordens hastighedskonstant for 4 omdannelsen af frit enzym plus substrat (E+S) til enzym plus 5 produkter (E+P) (W.P. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzy- 6 mology (McGraw-Hill, 1969) side 321-436; A. Fersht, Enzyme 7

Structure and Mechanism (Freeman, San Francisco, 1977) side 226-2Θ7). log (kcat/Km) er proportional med overgangstilstandsbindingsenergien, åG-j·^ En afbildning af log kcat/Km mod hydrofobiciteten af Pl-sidekaden (fig. 14) viser en stærk kor-

I DK 175523 B1 I

I 58 I

relation (r =0,98) bortset fra glycinsubstratet, som viser I

I tegn på ikke-produktiv binding. Disse data viser, at relative I

forskelle mellem overgangstilstandsbindingsenergier kan for- I

I klares ved forskelle i P-l-sidekædehydrofobicitet. Når over- I

5 gangstilstandsbindingsenergierne beregnes for disse substrater I

I og afbildes mod deres respektive sidekædehydrofobi c iteter, er I

I liniens haldning 1,2 (ikke vist). En haldning på mere end en, I

hvilket også gælder for chymotrypsin (A. Fersht, Enzyme Struc- I

I ture and Mechanism (Freeman, San Francisco, 1977) side I

I . 10 226-287; J.V. Harper et al. (1984) Biochemistry, 23, 2995- I

3002), antyder, at Pl-bindingskløften er mere hydrofob end et- I

I hanol- eller dioxanopløsningsmidler, som anvendtes til empi- I

I risk at bestemme aminosyrers hydrofobicitet (Y. Nozaki et al. I

I 0. Biol ., Chem. (1971) 246, 2211-2217 og C. Tanford (1978) I

I 15 Science 200, 1012). I

I For amidhydrolyse med subtilisin kan kcat fortolkes som acyle- I

ringshastighedskonstanten og Km som dissociationskonstanten I

I for Michael is-komplekset (E*S), Ks. H. Gutfreund et al (1956) I

20 Biochem. J. 63, 656. Den kendsgerning, at log kcat-samt log I

I l/Km korrelerer med substrathydrofobicitet, er i overensstem- I

melse med forslag (J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry I

I 11, 2439-2449, J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, I

I 4293-4303), at under acyleringstrinnet bevæger P-l-sidekæden I

25 si9 dybere ind i den hydrofobe kløft, når substratets skrider I

I frem fra Michae1 is-komp1 ekset (E*S) til det tetraedriske over- I

M gangstilstandskompleks (E*S$). Disse data kan imidlertid også I

fortolkes som, at hydrofobi c i teten af Pl-sidekæden påvirker I

I orienteringen og dermed den spaltelige peptidbindings tilbøje- I

I 30 lighed til nukleofilt angreb af hydroxy 1 gruppen i den kataly- I

I tiske Ser221. I

Afhængigheden af kcat/Km på P-l-sidekædehydrofobicitet antyde- I

I de, at kcat/Km for hydrofobe substrater kan forøges ved at I

I forøge hydrofobiciteten af S-1-bi ndings-understedet. For at I

I 35 I

teste denne hypotese fremstilledes hydrofobe aminosyresubsti- I

tutioner af Glyl66. I 1

Eftersom alifatiske sidekæders hydrofobicitet er direkte pro- I

I portional med sidekædeoverfladeareal (G.D. Rose et al. (1985) I

59 DK 175523 B1

Science 229, 834-838, J.A, Reynolds et al. (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 2825-2927) kan en forøgelse af hydrofobici-teten i S-l-understedet også sterisk hindre binding af større substrater. På grund af vanskeligheder ved at forudsige den 5 relative vigtighed af disse to modsatrettede virkninger, valgte man at fremkalde 12 ikke-ladede mutationer i position 166 for at bestemme de resulterende specificiteter mod ikke-ladede substrater med forskellig størrelse og hydrofobi c itet.

10 8. Cassettemutagenese af P-l-bindinqskloften

Fremstillingen af mutantsubti 1 i s i ner indeholdende substitutionen af de hydrofobe aminosyrer Ala, Val og Phe i rest 166 er blevet beskrevet i EP publikation nr. 0130756. Den samme meto-15 de anvendtes ti) at fremstille de resterende hydrofobe mutanter ved rest 166. Ved anvendelse af denne metode indførtes to unikke og stille restriktionssteder i subti 1 isingenerne for at flankere målcodonen 166 tæt. Som det ses af fig. 13 blev vild-typesekvensen (linie 1) ændret ved stedsrettet mutagenese i 20 M13 under anvendelse af den angivne 37mer mutageneseprimer til indførelse af en 13 bp deletion (stiplet linie) og unikke SacI- og Xmal-steder (understregede sekvenser), som flankerer codon 166 tæt. Subti 1 i s ingenfragmentet blev underklonet tilbage i E. coli-B. subti1 is-pendulpiasmidet, pBS42, til opnåelse 25 af plasmidet ρΔ166 (fig. 13, linie 2). ρΔ166 blev skåret åben med SacI og Xmal, og der oprensedes lineære molekyler med hul (fig. 13, linie 3). Puljer af syntetiske oligonukleotider indeholdende den pågældende mutation blev sammenføjet til opnåelse af duplex-ONA-cassetter, som blev ligeret ind i ρΔ166 med 30 hul (understregede og overstregede sekvenser i fig. 13, linie 4). Denne konstruktion genetablerede kodningssekvensen bortset fra over position 166 (NNN, linie 4). Mutantsekvenser blev bekræftet ved dideoxysekvensbestemmelse. Stjerner angiver se- kvensændr i nger i forhold til vildtypesekvensen. Plasmider, som 35 hver indeholdt mutant B. amy1oliquefaciens-subti 1 i s i ngen, blev udtrykt i groft taget ækvivalente niveauer i en proteaseuti 1-strækkelig stamme af B. subtilis, BG2036 som beskrevet tidli-

I DK 175523 B1 I

I 60 I

gere. EP publikation nr. 013075$, M. Yang et al. (1984) J. I

I Bacteriol. 160, 15-21 og D.A. Estell et al (1985) J. Biol. I

I Chem. 260 (6518-6521). I

I 5 C. Indsnævring af substratspecificitet I

ved sterisk hindring_ I

I For at undersøge den ændring i substratsspecificitet, der for- I

årsages af steriske ændringer i S-l-understedet, blev position I

166-mutanter kinetisk analyseret rood Pl-substrater ned stigen- I

10 I

de størrelse (dvs. Ala, Met, Phe og Tyr). Forholdet kcat/Km I

vistes i log-form i fig. 15 for at muliggøre direkte sammen- I

ligninger~ af overgangsti 1standsbindingsénergier mellem for- I

I skellige enzymsubstratpar. I

Ifølge overgangst i 1 s tandsteori en kan ændringen i fri energi I

I mellem det frie enzym + substrat (E+S) og overgangstilstands- I

I komplekset (E*S$) beregnes ud fra ligning (1), I

(1) AGTt = -RT ln kcat/Km + RT In kT/h I

I 20 I

hvori kcat er omsætningstal let. Km er Michael is-konstanten, R I

I er gaskohstanten, T er temperaturen, k er Boltzmann's kon- I

I stant, og h er Planck’s konstant. Specificitetsforskelle ud- I

trykkes kvantitativt som forskelle mellem overgangstilstan- I

dsbindingsenergi er (dvs. A&Gt$) og kan beregnes ud fra ligning I

I 25 (2)·

(2) = -RT ln (kcat/Km)A/(kcat/Km)B

I A og B angiver enten to forskellige substrater, der analyseres I 20 moc* det samme enzym, eller to mutantenzymer, som analyseres I mod det samme substrat.

Som det fremgår af fig. 15A, skifter substratpræferencen fra I store til små P-l-sidekæder, når størrelsen af sidekæden i po- I sition 166 forøges. En forøgelse af sidekæden i position 166 I 3 5 forårsager, at kcat/Km falder i forhold til størrelsen af I P-l-substratsidekæden (f.eks. fra Glyl66 (vildtype) til W166 I falder kcat/Km for Tyr-substratet mest efterfulgt i rækkefølge I af Phe-, Met- og Ala-P-l-substrater).

61 DK 175523 B1

Specifikke steriske ændringer i sidekæden i position 166, såsom tilstedeværelsen af en β-hydroxy1 gruppe eller β- eller γ-alifatisk forgrening, forårsager store formindskelser i kcat/Km for større P-l-substrater. Indførelse af en β-hydrox-5 ylgruppe ved at gå fra A166 (fig. 15A) til S166 (fig. 15B) forårsager henholdsvis en 8 ganges og 4 ganges reduktion i kcat/Km for henholdsvis Phe- og Tyr-substrater, mens værdierne for Ala- og Met-substraterne er uændrede. Ved dannelse af en β-forgrenet struktur og ved at gå fra S166 til Π66 opnås et 10 fald på henholdsvis 14 og 4 gange i kcat/Km for henholdsvis

Phe og Tyr. Disse forskelle forstørres lidt for V166, som er lidt større og isosterisk med T166. Ved at forstørre de β-forgrenede substi tuenter fra V166 til 1166 forårsages en formindskelse af kcat/Km på mellem 2 og 6 gange mod Met-, Phe- og 15 Tyr-substrater. Ved indsættelse af en γ-forgrenet struktur ved erstatning af M166 (fig. 15A) med L166 (fig. 15B) fremkaldes henholdsvis en 5 ganges og en 18 ganges formindskelse i kcat/Km for Phe- og Tyr-substrater. Alifatisk γ-forgrening ser ud til inducere mindre sterisk hindring mod Phe-P-l-substratet 20 end β-forgrening, hvilket ses af den 100-ganges formindskelse i kcat/Km for Phe-substratet ved at gå fra L166 til 1166.

Reduktioner i kcat/Km som et resultat af forøgelser i sidekædestørrelse i S-1-understedet, eller specifikke strukturelle 25 træk, såsom β- og γ-forgrening, illustreres kvantitativt i fig. 16. kcat/Km-værdi erne for mutanterne i position 166, bestemt for Ala-, Met-, Phe- og Tyr-P-l-substraterne (fra det øverste felt til det nederste felt) er afbildet mod sidekæde-volumerne i position 166 (C. Chothia (1984) Ann. Rev. Biochem.

2q 53, 537-572). Katalytisk effektivitet for A1a-substratet når et maksimum for 1166, og for Met-substratet, når den et maksimum mellem V166 og L166. Phe-substratet viser en bred kcat/Km-top, men er optimal med A166. Her danner de β-forgrenede substitutioner i position 166 en linie, som er parallel med, men 35 groft taget 50 gange lavere i kcat/Km end sidekæder med tilsvarende størrelse (dvs. C166 mod T166, L166 mod 1166). Tyr- substratet anvendes mest effektivt af vi 1dtypeenzym (Glyl66), og der er en stadig formindskelse, når man går frem mod store ----- I DK 175523 B1 I 62 sidekæder i position 166. De β-forgrenede og γ-forgrenede sub- stitutioner danner en parallel linie under de andre ikke-lade- de substitutioner med tilsvarende mo 1eky1vo1 umen.

g Den optimale substitution i position 166 falder i volumen med stigende volumen af P-1-substratet (dvs. I166/Ala-substrat, LI66/Met-substrat, Al65/Phe-substrat, Glyl66/Tyr-substrat). De kombinerede volumener for disse optimale par kan nærme sig vo- lumenet for produktiv binding i S-l-understedet. For de opti- 1Q male par, GIyl66/Tyr-substrat, A166/Phe-substrat, L166/Met- substrat, V166/Met-substrat og 1166/Ala-substrat er de kombi- nerede volumener henholdsvis 266, 295, 313, 339 og 261 A3. Ved at trække volumenet af peptidrygraden fra hvert par (dvs. to gange volumenet af glycin) kan der beregnes et gennemsnitligt 15 sidekædevolumen på 160t32A3 for produktiv binding.

Virkningen af volumen, udover det produktive bindingsvolumen, på tabet i overgangsbindingsenergi, kan vurderes ud fra Tyr- I substratkurven (nederste felt, fig. 16), fordi disse data samt I modeller ingsundersøge1 ser (fig. 2) antyder, at enhver substi- H 20 tu ti on udover glycin forårsager sterisk frastødning. Den bed- ste linie, der kan trækkes mellem alle dataene (r=0,87) giver I en hældning, som angiver et tab på groft taget 3 kcal/mol i j overgangstilstandsbindingsenergi per 100 A3 overskydende vo- lumen (100A3 er ca. størrelsen af en leucylsidekæde).

25 I D. Forøget katalytisk effektivitet korrelerer med stigende hydrofobicitet ! hos substitutionen i position 166_ I 30 Der forekommer væsentlige forøgelser i kcat/Km med forstørrel- se af sidekæden i position 166, bortset fra for Tyr-P-l-sub- stratet (fig. 16). F.eks. stiger kcat/Km ved at gå fra Glyl66 I til 1166 for Ala-substratet (netto 10 gange), fra Glyl66 til I L166 for Met-substratet (netto 10 gange) og fra Glyl66 til 35 A166 for Phe-substratet (netto 2 gange). Forøgelserne i kcat/ I Km kan ikke fuldstændigt forklares ved tiltrækningsudtrykkene I i van der Waals potentielle energi-funktion på grund af deres I stærke afstandsafhængighed (1/r6) og på grund af disse til- 63 DK 175523 B1 trækningskræfters svage natur (W.P. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology (McGraw-Hill, 1969) side 321-436, A.

Fersht, Enzyme Structure and Mechanism (Freeman, San Francisco 1977) side 226-287, M. Levitt (1976) J. M01. Biol. 104, 5 59-107). F.eks. har Levitt (M. Levitt (1976) J. Mol. Biol.

104, 59-107) beregnet, at van der Waals-tiltrækningen mellem to methionylrester ville give en maksimal vekselvirkningsenergi på groft taget -0,2 kcal/mol. Denne energi ville blive oversat til kun 1,4 ganges forøgelse i kcat/Km.

10

De forøgelser i katalytisk effektivitet, som forårsages af si-dekædesubstitutioner i position 166, forklares bedre ved forøgelser i hydrofobiciteten hos S-l-understedet. Forøgelsen i kcat/Km, der ses for Ala- og Met-substraterne med stigende si- _ dekædestørrelse i position 166, ville blive forventet, fordi 1 b hydrofobicitet groft taget er proportionalt med sidekædeover-fladeareal (G.D. Rose et al. (1985) Science 229, 834-838, J.A. Reynolds et al. (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 2825-2927).

20

Et andet eksempel, som kan fortolkes som en hydrofob virkning, ses, når man sammenligner kcat/Km for isosteriske substitutioner, som adskiller sig i hydrofobicitet, såsom S166 og C166 (fig. 16). Cystein er betragteligt mere hydrofob end serin (-1,0 mod +0,3 kcal/mol) (Y. Nozaki et al. (1971) J. Biol.

25 Chem. 246, 2211-2217; C. Tanford (1978) Science 200, 1012).

Forskellen i hydrofobicitet korrelerer med den observation, at C166 bliver mere effektiv i forhold til Serl66, når substraternes hydrofobicitet forøges (dvs. Ala < Met < Tyr < Phe).

Sterisk hindring kan ikke forklare disse forskelle, fordi se- 30 , nn er betragteligt mindre end cystein (99 mod 118A3), I.C.

Paul, Chemistry of the -SH Group (ed. S. Patai, Wiley Inter- science, New York, 1974) side 111-149.

E. Fremstilling af en el astase 1 ignende 35 specificitet i subtilisin_ 1166-mutationen illustrerer særligt godt, at der kan fremkal- | des store ændringer i specificitet ved at ændre strukturen og

I DK 175523 B1 I

I 64 I

I hydrofobic i teten af S-l-understedet ved hjælp af en enkelt rou- I

I tation (fig. 17). Ved at gå gennem de små hydrofobe substrater I

I sker der en maksimal specificitetsforbedring i forhold til I

vildtypen for Va1-substratet (16 gange i kcat/Km). Når sub- I

I 5 stratsidekædestorrelsen forøges falder disse forbedringer til I

I næsten en (dvs. Leu- og His-substrater). 1166-enzymet bliver I

I dårligere mod større aromatiske substrater med stigende stør- I

I relse (f.eks. er 1166 over 1000 gange dårlige mod Tyr-substra- I

I tet end Glyl66 er). Man fortolker denne forøgelse i katalytisk I

I 10 effektivitet over for de små hydrofobe substrater for 1166 I

I sammenlignet med Glyl66 som den større hydrofobicitet hos iso- I

I leucin (dvs. -1,8 kcal/mol mod 0), Y. Nozaki et al. (1971) J. I

I Biol. Chera. 246, 2211-2217, C. Tanford (1978) Science 200, I

I 2012. Formindskelsen i katalytisk effektivitet over for de me- I

15 get store substrater for 1166 mod Glyl66 tilskrives sterisk I

I frastødning. I

Spec ificitetsforskellene mellem 61yl66 og 1166 svarer til spe- I

I cificitetsforskellene mellem chymotrypsin og den evolutionære I

I 2Q slægtning elastase (J.W. Harbor et al. (1984) Biochemistry 23, I

I 2995-3002). I elastase blokerer de fyldige aminosyrer Thr og I

I Val adgang til P-l-bindingsstedet for store, hydrofobe sub- I

I strater, som foretrækkes af chymotrypsin. Desuden er de kata- I

I lytiske effektiviteter mod små hydrofobe substrater større for I

25 elastase end for chymotrypsin, således som det observeres for I

I 1166 mod Glyl66 i subtilis in. I

I EKSEMPEL 4 I

I Substitution af Glvl66 med ioniske aminosyrer I

I 30 I

I Konstruktionen af subti1isinmutanter indeholdende substitutio- I

I nen med de ioniske aminosyrer Asp, Asn, Gin, Lys og Ang er be- I

I skrevet i EP publikation nr. 0130756. Det foreliggende eksem- I

I pel beskriver konstruktionen af mutantsubti 1 is inen indeholden- I

I 35 de Glu i position 166 (E166) og viser substratspecificitets- I

I data for disse mutanter. Yderligere data for enkelte og dob- I

I belte mutanter i position 166 og 156 er vist nedenfor. I

65 DK 175523 B1 ρΔΙ66, beskrevet i eksempel 3, blev fordøjet med SacI og Xmal.

Den dobbeltstrengede DNA-cassette (understreget og overstreget) i linie 4 i fig. 13 indeholdt tripletten GAA for codonen 166 for at kode for erstatningen af Glyl66 med Glu. Dette mu-5 tantplasmid, der betegnes pQ166, blev opformeret i BG2036 som beskrevet. Denne mutantsubti 1 is in blev, sammen med de andre mutanter indeholdende ioniske substitutentaminosyrer i rest 166, isoleret som beskrevet og yderligere analyseret for variationer i substratspecificitet.

10

Hver af disse mutanter blev analyseret med tetrapeptidsubstra-terne, subci.ny 1 - L-Al aL-ΑΊ aProl-X-p-n i t roan i 1 i d, hvor X var Phe, Ala og Glu.

Resultaterne af denne analyse er vist i tabel IX.

15

TABEL IX

P-l-substrat (kcat/Km x 10"4) 2o Position 166 Phe Ala Glu

Gly (vildtype) 36,0 1,4 0,002

Asp (0) 0,5 0,4 <0,001

Glu (E) 3,5 0,4 <0,001

Asn (N) 18,0 1,2 0,004 25 Gin (Q) 57,0 2,6 0,002

Lys (K) 52,0' 2,8 1,2

Arg (R) 42,0 5,0 0,08

Disse resultater viser, at substitutioner med ladede aminosy-30 rer ved Glyl66 har forbedrede katalytiske effektiviteter (kcat/Km) for modsat ladede P-l-substrater (så meget som 500 gange) og dårligere katalytisk effektivitet for P-l-substrater med samme ladning.

35

I DK 175523 B1 I

I I

I EKSEMPEL 5 I

Substitution af give in i position 169 I

Substitutionen af Glyl69 i B. amyloliquefaciens-subtilisin med I

I 5 I

Ala og Ser er beskrevet i EP publikation nr. 0130756. Den sam- I

I me metode anvendtes til at fremstille de resterende 17 mutan- I

B ter indeholdende alle andre substituentaminosyrer for position I

I 169. I

B 10 Konstruktionsprotokollen er opsummeret i fig. 18. De anvendte I

B overstregede og understregede dobbeltstrengede DNA-cassetter I

B indeholdt følgende triplet, som koder for substitutionen af I

B den angivne aminosyre ved rest 169. I

I 15 GCT A ATG Μ I

I TGT C AAC N I

B GAT D CCT P I

I GAA E CAA Q I

I TTC F AGA R I

B 20 GGC G AGC S I

I CAC H ACA T I

I ATC I GTT V I

B AAA K TGG W. I

I CTT L TAC Y I

B 25 I

Hvert af plasmiderne indeholdende en substitueret Glyl69 blev I

B betegnet pX169, hvor X betegner substituentaminosyren. Mu- I

B tantsubti1isinerne blev betegnet tilsvarende. I

B To af de ovennavnte mutantsubtilisiner, A169 og S169 blev ana- I

B 30 lyseret for substratspecificitet mod syntetiske substrater in- I

B deholdende Phe, leu, Ala og Arg i P-l-positionen. De følgende I

resultater er vist i tabel X. I

35 I

TABEL X

67 DK 175523 B1

Virkning af serin- og alaninmutationer i position 169 pé P-l-substratspecificitet 5 „ P-l-substrat (kcat/Km x 10~c)

Position 169 Phe Leu Ala Arg

Gly (vildtype) 40 10 1 0,4

Al 69 120 20 1 0,9 10 SI 69 50 10 1 0,6

Disse resultater viser, at substitutioner af Ala og Ser ved Glyl69 har bemærkelsesværdigt tilsvarende katalytiske effektiviteter mod en række P-l-substrater sammenlignet med deres modparter i position 166. Dette skyldes sandsynligvis, at position 169 er i bunden af P-l-specificitetsunderstedet.

EKSEMPEL 6

Substitution ved position 104 20

Tyri04 er blevet substitueret med Ala, His, Leu, Met og Ser. Den anvendte metode var én modifikation af den stedrettede mu-tagenesemetode. Ifølge protokollen fra fig. 19 indforte en primer (skraveret i linie 4) et unikt Hindlll-sted og en ram-meskiftsmutation ved codon 104. Restriktionsoprensning for det unikke Hindlll-sted lettede isoleringen af mutantsekvensen (linie 4). Restriktionsudvælgelse mod dette Hindlll-sted under anvendelse af primere i linie 5 anvendtes til opnåelse af position 104-mutanter.

30 Følgende tripletter anvendtes i primerne fra fig. 19, linie 5 for 104-codonen, som substituerede de følgende aminosyrer.

GCT A TTC F

ATG M CCT P

35 CTT L ACA T

AGC S TGG W

CAC H TAC Y

CAA Q GTT V

I DK 175523 B1 I

I 68 I

I GAA E AGA R I

I GGC G AAC N I

I ATC I GAT O I

I AAA K TGT C I

I 5 I

I Substraterne i tabel XI anvendtes til at analysere disse mu- I

I tanters substratspecificitet. De for H104-subti1 i s in opnåede I

I resultater er vist i tabel XI. I

I TABEL XI I

I 10 I

I kcat _Km_._ Kcat/Km I

I Substrat MT H104 WT H104 WT H104 I

I sAAPFpNA 50,0 22,0 l,4xl0~4 7,lxl0“4 3,6xl05 3,lxl04 I

I 15 sAAPApNA 3,2 2,0 2,3xl0~4 l,9xl0-3 l,4xl04 lxlO3 I

I sFAPFpNA 26,0 38,0 l,8xl0"4 4,lxl0~4 l,5xl05 9,lxl04 I

I sFAPApNA 0,32 2,4 7,3xl0~5 l,5xl0"4 4,4κ103 1,6χ104 I

I Fra disse data er det klart, at erstatningen af Tyr med His i I

I position 104 giver et enzym, som er mere effektivt (højere I

I 20 I

kcat/Km), når Phe er i P-4-substratpositionen, end når Ala er I

i P-4-substratpositionen. I

I EKSEMPEL 7 I

I 25 Substitution af AlalS2 I

' Alal52 er blevet substitueret med Gly og Ser for at bestemme I

virkningen af sådanne substitutioner på substratspecificitet. ]

V i 1dtype-DNA-sekvensen blev muteret med V152/P153-primeren I

30 (fig. 20, linie 4) under anvendelse af den ovenstående re- I

striktionsoprensningsmetode for det nye KpnI-sted. Andre mu- I

tantprimerer (skraverede sekvenser i fig. 20, S152, linie 5 og I

G152, linie 6) muterede det nye Knpl-sted bort, og sådanne mu- I

tanter blev isoleret under anvendelse af restriktionsudvælgel-35 sesprocedure som beskrevet ovenfor som tab af Knpl-stedet.

Resultatet af disse substitutioner for de ovenstående syntetiske substrater indeholdende P-l-aminosyrerne, Phe, Leu og Ala, er vist i tabel XII.

69 DK 175523 B1

TABEL XII

P-l-substraterne (kcat/KmxlO-4) 5 Position 152 Phe Leu Al a

Gly (G) 0,2 0,4 <0,04

Ala (vildtype) 40,0 10,0 1,0

Ser (S) 1,0 0,5 0,2 10 Disse resultater viser, at, i modsætning til positionerne 166 og 169, forårsager erstatning af Alal52 med Ser eller Gly en dramatisk reduktion i katalytisk effektivitet over for alle undersøgte substrater. Dette antyder, at Alal52, i toppen af S-l-understedet, kan være den optimale aminosyre, fordi Ser og 15 Gly er homologe Ala-substi tutter.

EKSEMPEL 8

Substitution i position 156 20 Mutanter indeholdende substitutionen af Glul56 med Ser og Gin er blevet konstrueret i overensstemmelse med den i fig. 21 afbildede helhedsmetode. Denne metode blev opbygget for at lette konstruktionen af multiple mutanter i position 156 og 166 som beskrevet i det følgende. Ved imidlertid at regenerere vildty-25 pe-Glyl66 opnåedes enkeltmutationer ved Glul56.

Plasmidet ρΔ166 er allerede afbildet i linie 2 i fig. 13. De syntetiske oligonukleotider for oven til højre i fig. 21 angiver de samme DNA-cassetter, som afbildet i linie 4 i fig. 13. Plasmidet pl66 i fig. 21 repræsenterer således mutantpi asmi -derne fra eksemplerne 3 og 4. I dette bestemte eksempel indeholder pi66 viIdtype-Glyl66.

Konstruktion af enkeltmutanter i position 156 blev fremstillet ved at ligere de tre fragmenter (1-3), som er angivet forneden 3 5 i fig. 21. Fragment 3, indeholdende den carboxyterminåle del af subti1 isingenet inklusive vildtype-position 166-codonen, isoleredes som 610 bp Sad-BamHI-fragment. Fragment 1 inde-

I DK 175523 B1 I

I 70 I

I holdt vektorsekvenserne samt de am i notermi nåle sekvenser af I

subti1 i si ngenet til codon 151. Til fremstilling af fragment 1 I

indfortes et unikt KpnI-sted ved codon 152 i vi 1dtypesubti 1 i - I

sinsekvensen fra pS4.5. Ved stedrettet mutagenese i M13 an- I

5 vendtes en primer med sekvensen 5'-TA-GTC-GTT-GCG-GTA-CCC-GGT- I

AAC-GAA-3’ til dannelse af mutationen. Berigelse for mutant- I

sekvensen opnåedes ved restriktion med Kpnl, oprensning og I

selviigering. Mutantsekvensen indeholdende Kpnl-stedet blev I

bekræftet ved direkte plasmidsekvensbestemmelse til opnåelse I

I 10 af pV152. pVl52 (-1 pg) blev fordøjet med Kpnl og behandlet I

med to enheder ONA-polymerase I-fragment (Klenow-fragment fra I

Boehringer Mannheim) plus 50 μΜ deoxynukleotidtriphosphater I

ved 370 C i 30 minutter. Dette fremkaldte en stump ende, som I

endte med codon 151. DNA'en blev ekstraheret med 1 .· 1 -volurnener I

15 phenol og CHCI3, og DNA i den vandige fase blev udfældet ved I

tilsætning af 0,1 volumen 5M ammoniumacetat og to volumener I

ethanol. Efter centrifugering og vask af DNA-pellet med 70% I

ethanol blev DNA'en 1yofi 1 i seret. ONA blev fordøjet med BamHl, I

og 4,6 kb stykket (fragment 1) blev oprenset ved acrylamidgel- I

20 e1ektroforese efterfulgt af elektroeluering. Fragment 2 var en I

syntetisk duplex-DNA-cassette, som, når den blev ligeret med I

fragmenterne 1 og 3, genetablerede kodningssekvensen korrekt, I

bortset fra ved codon 156. Den øverste streng blev syntetise- I

ret til at indeholde en g 1utamincodon, og den komplementære I

I 25 nederste streng kodede for serin ved 156. Ligering af hetero- I

I phosphylerede cassetter fører til en stor og favorabel præfé- I

H rence for den phosphorylerede i forhold til den ikke-phospho- I

rylerede oligonukleotidsekvens i det endelige segregerede I

I plasroidprodukt. For at opnå Q166 blev den øverste streng der- ! I 30 for phosphoryleret og sammenføjet med den ikke-phosphorylerede I nederste streng før ligering. Tilsvarende blev den nederste streng phosphory1eret og saramenføjet med den ikke-phosphoryle- rede øverste streng til opnåelse af S156. Mutantsekvenser iso- I leredes efter ligering og transformation og bekræftet ved re- I 35 striktionsanalyse og DNA-sekvensbestemmelse som tidligere. Til I ekspression af variantsubti1isiner blev plasmider transforme- I ret ind i en subti1isinneutral proteasedeletionsmutant af B.

I subtilis, BG2036, som beskrevet tidligere. Der dyrkedes kultu- 71 DK 175523 B1 rer i rystekolber i 2 4 timer ved 37 e C i LB-medier indeholdende 12,5 uig/ml chloramphenicol, og subtilisin oprensedes fra kultur supernatanter som beskrevet. Subti 1 i si nrenheden var storre end 95%, bedomt ved SDS-PAGE.

5

Disse mutantplasmider, betegnet pS156 og pQ156, og mutantsub-tilisiner betegnet S156 og Q156 blev analyseret med de ovenstående syntetiske substrater, hvor P-l omfattede aminosyrerne Glu, Gin, Met og Lys. Resultaterne af denne analyse er vist i 1Q eksempel 9.

EKSEMPEL 9

Multiple mutanter med ændret substratspecificitet - substitution i positionerne 156 og 166_ 15

Enkeltsubstitutioner af position 156 er beskrevet i eksemplerne 3 og 4. I eksempel 8 beskrives enkeltmutationer i position 156 samt protokollen fra fig. 21, hvorved forskellige dobbeltmutanter omfattende substitutionen af forskellige aminosyrer i 2Φ positionerne 156 og 166 kan fremstilles. I dette eksempel beskrives konstruktionen og substratspecificiteten hos subtilisin indeholdende substitutioner i position 156 og 166 og opsummerer nogle af dataene for enkelt- og dobbeltmutanter i positionerne 156 og 166 med forskellige substrater.

2 5 K166 er en almindelig erstatningsaminosyre i de heri beskrevne 156/166-mutanter. Erstatningen af Glyl66 med Lys opnåedes ved anvendelse af den syntetiske DNA-cassette for oven til højre i fig. 21, som indeholdt tripletten AAA i stedet for NNN.-Dette gav fragment 2, idet Lys erstattede Glyl66, 30 156-substituenterne var Gin og Ser. Gin- og Ser-substitutio-nerne ved Glyl56 er indeholdt i fragment 3 {forneden til hojre i fig. 21). 1 2 3

De multiple mutanter blev fremstillet ved at kombinere fragmenterne 1, 2 og 3, som beskrevet i eksempel 8. Mutanterne 2 Q156/K166 og S156/K166 blev dannet selektivt ved differentiel 3 phosphorylering som beskrevet. Alternativt fremstilledes de

I DK 175523 B1 I

I 72 1

dobbelte 156/166-mutanter, sammenlign Q156/K166 og S156/K166 I

ved ligering af 4,6 kb SacI-BamHI-fragmentet fra det relevante I

I pi66 plasmid indeholdende 0,6 kb SacI-BamHI-fragmentet fra det I

I relevante pl66-plasmid. I

I 5 I

I Disse mutanter, den enkelte mutant K166 og S156- og Ql56-mu- I

I tanterne fra eksempel 8, analyseredes for substi tutspec ifi c i - I

I tet mod syntetiske polypeptider indeholdende Phe eller Glu som I

I P-l-substratresten. Resultaterne er vist i tabel XIII. I

I 10 I

I 15 I

I 20 I

I 25 I

30 I 1 73 DK 175523 B1

·· 4J

C

te —-4J 4J 3 S

- 6

X —- —.^TO'a’O'^rootrvrH

ε Ή. rH I—I ~ in *» O — O *··—·* Ρ-

'-'-'rHt'-^rHrs'OCNtvDro.H — as ro rH

Μ ϋ <0 .* t) λ:

E

X inHi/t'f\0'ivo'iinMO(N

\ o oo o oooooooo

4-* »—* ιΗ rH i—I rH i—I 1-4 rH rH rH rH fH

ro χκχχχκχχκκχκ

Cj vovD<NfMvooOvom«HiHr«-

Π rH 1Λ »—i rH LA rH fH Γ— rH tH <N

-^αιιαιαιαιαιλιαιαγοιαγο' i i i i i i i i i i i i oooooooooooo

ε rHrHrHfHiHrHrHrHrHrHiHrH

χ κκκχχ χχ κκχχχ 'cr-^rovoLTirHCOCTNr-oomn

^ . rHCOrTtA.HfO.HrO''3,rH'3<rO

H

X

ω

2 4J OH-OOOOOOOOOO

S (fl ΟιΛΟΓ"©ΐΛΟνΟΟ«3·θσι H o — ooooorHOO^roajo la γμ ro η n <3·

4J

ro , J rH^, 0)30)30)30)30)303

TI ITT XlrH^rHXJrHÆrHXrHXrH

Jj ^OJ ftOarfOOiUCuO&iOOrO

3 W

(Λ

I- I

JO A

u u £ a> a> ^ Ό c ? ^ rH VO M>

H - W « S

IS'« 5 2 F Ϊ, U0 \ v

rvg iH VD VO LO VD VD

C« 3 LO IA LA LA LA

mm tHfHrHrHiHrH

ww o x σ w w ω

I DK 175523 B1 I

I I

I Som det kan ses i tabel XIV forbedrer hver af disse enkelte I

I mutationer enzymydeevnen på substrater med glutamat ved P-l- I

I enzymbindingsstedet. Når disse enkelte mutationer blev kombi- I

I neret, er de resulterende multiple enzymmutanter bedre end I

I 5 hver af mødrene. Disse enkelte eller multiple mutationer ®n- I

I drer også enzymernes relative pH-akti vitetsprofi ler, som vist I

i f i g. 23. I

H For at isolere det elektrostatiske bidrag til substratspecifi - I

citet fra andre kemiske bindingskræfter blev disse forskellige I

enkelte og dobbelte mutanter analyseret for deres evne til at I

binde og spalte syntetiske substrater indeholdende Glu, Gin, I

Met og Lys som P-l-substrataminosyren. Dette muliggjorde sam- I

menligninger mellem sidekæder, som var mere sterisk ensartede, I

I men som adskilte sig i ladning (f.eks. Glu mod Gin, Lys mod I

H *· ® I

I Met). Tilsvarende analyseredes mutantenzymer mod homologe P-l- I

substrater, som sterisk svarede mest til hinanden, men adskil- I

I te sig i ladning (tabel XIV). I

I 20 I

I I

I 30 i

I 35 I

75 DK 175523 B1

O0'00 incNr'cr>'TP0CN'^,'<a,oo«wiin'^· O

ovooofHCNOoo<N^Hcor-r~cococ^r-oo *"

Mk ^ 9* te «Μ «Μ ·>* #·. ^ ^ ·— Μ M M W « ΤΗ

t/ι ronrsironnrocororMONrNirNr'jojfNCn I

— S

O rooouoorH^roooNovouoooaNroroco — rsi'srrHrHTrJNr^o^vot^'a’r'VOrHCMCMC^ co

C ^^^^^^^^^0000000000-^0000 rH

sc ·

rH

Cr «a'Comvoi^oooovof-'f-iinvo^rNin ooo —- u o ^.«MCorocovooO'roivotrivovocN'^rvoo* cn^

~ — +-> <N

g -g- J2JrJ X ηΐθσ\ΟΟΗ·Γ^Η·ΙΟί^Γ^ίΗ(Τι<ΜΓΜυ1Γ^υ5 12] _μ . >v o^æcrt'irON VOvovoor'. ioc~'i>-mHCJv.H m .u2 rom 'τιΛ^τΗ'ΐηΐΛΐηιηΐίΐιίΐι/ιιηιοίΛίΐ) <n

Λ 4J H

3 tn x j. 3 O lOrHNr-a-cocyiO'uiin.-HCOioC'JOcocO'» — [j i .H in<^iHVDOOrHtnrooovor^cotnco'x>. σι v .

\d! 4Jc (N(n rororororororororororororororo ih > no ro — w >», £? 12 X» ]j (N^Din^DO<-Hcn^ruirocrirHr'VDo^'3· λ .η tn o o co ro h* ^ oorooomoinuoojr-vooo co £j q P rorororrrororO'=rn'3, ,^,,^,H,'T^r'3'-<J' »h

ffl H Q) M

< -U X I

^ H 1(1 ^ _ _ „ _ _ _ Ϊ i] i <ni <n σ> ro o (-"OorocMcooinoo — y cu <Ν·ΗΓ^»Ηοο u-ir'ooniNui'T o

Vil Ή ^ ^ »k.

p r\) (\ η (Μ N r-jrMCN(NCvmr?-rr^r ro Q0 rH · ' ~ ~ ~ ~ ~ ~ J ~ cn o o ro o •©{\ι«Η·=τι-ΗΉσιθ·-ι jj . . vorMrocNrM-Q(NO-rooo-icy>or~<Nj uo '2}^ 'H‘HrHI-HrHrHrH-rlrH(\l<Nr\|rHCNHl-'<a«T3> ΓΟ

tj) 4J

c tn

•H <U X XI

£ s 1 °1 P ^ N (NI Η fH H rH rH *H rH O O O O O O rH rH g

Jj'2 t I I I I I I I I + + X l QJ τι ^ 2 ro "

—_i rH

• φ O' λ; o

U) rH

H ^ — — o

ro ** uh E

C w r-H %sv looa3CCaa,4Jro>i>N>tCCO'in<nin ro *·> c.2;O<nrHmrHwmQ)rHrHrHfHininlH>i>i>i E <3 >,]]rH<u<u<;ii;2<(3Ui3<i:<JJ>J -η o n ·η tn 5i5©3333ClH333C}HC>H33C!H ro O'

q lO rH rH rH fH rH Q) rH rH rH rH fl) rH d) #H rH rH Q) S O

^HOOUOOWOOUUWOtOC^OOtO Ή

I DK 175523 B1 I

I 76 I

I Fodnoter til tabel XIV: I

I (a) B. subtilis, BG 2036, sotn udtrykker den angivne variant- I

I subtilisin, blev fermenteret og enzymer oprenset som beskrevet I

I 5 tidligere (Estell, et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518- I

I 6521). Vi 1dtype-subti 1 i s in er angivet {W T ) indeholdende Glul56 I

I og G1yl66. I

Nettoladning i P-l-bindingsstedet defineres som summen af I

I ladninger fra position 156 og 166 ved pH-værdi 8,6. I

io I

I Værdier for kcat(s~l) og Km(M) blev målt i 0,1 M Tris, I

pH-værdi 8,6, ved 25°C som beskrevet tidligere mod P-l-sub- I

stratermed formen succinyl-L-AlaL-Alal_-ProL-[X]-p-nitroani- I

lid, hvor X er den angivne P-l-aminosyre. Værdier for log 1/Km I

I 15 er vist i parenteser. Alle fejl i bestemmelsen af kcat/Km og I

I 1/Km er under 5%. I

I Fordi værdierne for GIul56/Aspi66(D166) er for små til at I

blive bestemt præcist, er den maksimale forskel, der tages for I

I 2Q GIuP-l-substratet begrænset til et ladningsinterval på +1 til I

Η -1 i ladningsændring. I

i.b. = ikke bestemt. I

25 De viste kcat/Km-forhold er anden ordens hastighedskonstanter- I

I ne for omdannelsen af substrat til· produkt og repræsenterer I

I enzymets katalytiske effektivitet. Disse forhold er vist i lo- I

I garitmisk form for at bringe dataene inden for samme målestok, I

I og fordi log kcat/Km er proportional med faldet i overgangs- I

I 30 tilstandsaktiveringsenergi (Δ6γ). Mutationer i position 156 og I

I 166 fremkalder ændringer i katalytisk effektivitet overfor I

I Glu-, Gin-, Met- og Lys-P-1-substrater på henholdsvis 3100, I

I 60, 200 og 20 gange. Ved at gore P-l-bindingsstedet mere posi- I

I tivt ladet [sammenlign f.eks. Glnl56/Lysl66 (Q156/K166) med I

35 G1u156/Met166 (G1ul5 6/M166)) forøgedes kcat/Km dramatisk over I

for Glu-P-l-substratet (op til 3100 gange), og den katalytiske I

I effektivitet over for Lys-P-1-substratet faldt (op til 10 gan- I

I ge). Desuden viser resultaterne, at vi 1dtypeenzymets kataly- I

tiske effektivitet kan forbedres meget over for ethvert af de fire P-l-substrater ved mutagenese af P-l-bindingsstedet.

DK 175523 B1 77 Ændr i ngerne i kcat/Km forårsages hovedsageligt af andringer i 5 1/Km. Fordi 1/Km ca. er lig med l/Ks, enzym-substrat-associa- ti onskonstanten, forårsager mutationerne primært en ændring i substratbinding. Disse mutationer fremkalder mindre virkninger på kcat, som løber parallelt med virkningerne på 1/Km. Ændringerne i kcat antyder enten en ændring i binding i P-l-bin-^0 dingsstedet ved at gå fra Michael is-komplekset (E*S) til overgangstilstandskomplekset (E-St) som tidligere foreslået (J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 2439-2449, J.D. Robertus et al. (1972) Biochemistry 11, 4293-4303, eller en ændring i positionen af den spaltelige peptidbinding over den katalytiske serin i E*S-komplekset.

Ændringer i substratpræference, som opstår ud fra ændringer i nettoladningen i P-l-bindingsstedet viser tendenser, som bedst forklares ved elektrostatiske virkninger (fig. 28). Når P-l-bi ndi ngsk 1 øf ten bliver mere positivt ladet stiger den gennem- 20 snitlige katalytiske effektivitet meget mere for Glu-P-l-sub-stratet end for dets neutrale og isosteriske P-l-homolog, Gin (fig. 28A). Ved den positive ydergrænse har begge substrater desuden næsten identiske katalytiske effektiviteter.

25 I modsætning hertil falder den katalytiske effektivitet over for Lys-P-l-substratet, når P-l-stedet bliver mere positivt ladet og afviger skarpt fra dets neutrale og isosteriske homolog, Met (fig. 28B). Den tilsvarende og parallelle opadgående tendens, som ses med stigende positiv ladning for Met- og Glu-30 P-l-substraterne, er sandsynligvis et resultat af den kendsgerning, at alle substraterne er succiny1erede på deres amino-terminale ende, og derfor bærer en formel negativ ladning.

Oe tendenser, der observeres i log kcat/Km, domineres af æn-35 dringer i Km-udtrykket ( f igurne 28C og 28D). Når lommen bliver mere positivt ladet, konvergerer log 1/Km-værdierne for Glu-og Gln-P-1-substrater (fig. 28C) og divergerer for Lys- og Met-P-l-substrater (fig. 280). Skønt der ses mindre udtalte v

-—-— M II, M |M

I DK 175523 B1 I

I I

I virkninger i log kcat, er virkningerne af P-l-ladning på log I

I kcat parallelle med dem, der ses i log 1/Km og bliver større, I

når P-l-lommen bliver mere positivt ladet. Dette kan være re- I

sultatet af den kendsgerning, at overgangstilstanden er en I

I 5 tetraedrisk anion og en nettopositiv ladning i enzymet kan I

tjene til at tilvejebringe nogen ekstra stabilisering til I

I overgangstilstanden. I

I Virkningen af ændringen i P-l-bindingsstedsladning på sub- I

I 10 stratpræference kan vurderes ud fra forskellene i hældninger I

I mellem de ladede og neutrale isosteriske P-l-substrater (fig. I

I 28B). Den gennemsnitlige ændring i substratpræference (Olog I

I kcat/Km) mellem ladede og neutrale isosteriske substrater sti- I

I ger groft taget 10 gange, når den komplementære ladning eller I

I 15 enzymet forøges (tabel XV). Når Glu sammenlignes med Lys, er I

I denne forskel 100 gange, og ændringen i substratpræference

I fremgår hovedsageligt af Km-udtrykket. I

I TABEL XV I

I 20 Differenciel virkning af bindingsstedsladning I

I på log kcat/Km eller (log 1/Km) for P-l-sub- I

I strater, som adskiller sig i ladning(a) I

I Ændring i P-l-bindings-^ Olog kcat/Km (Olog 1/Km) I

I 25 stedsladning(b)_ GI uGln MetLys 61 uLvs I

I -2 til -1 i.b. 1,2 (1,2) i.b. I

I '1 til 0 0,7 (0,6) 1,3 (0,8) 2,1 (1,4) I

I 0 til +1 1,5 (1,3) 0,5 (0,3) 2,0 (1,5) I

I 30 Gennemsnitlig ændring i I

I log kcat/Km eller I

I (log 1/Km) per I

I enhedsladningsændring 1,1 (1,0) 1,0 (0,8) 2,1 (1,5) I

I 35 I

I ^ Forskellen i kurvernes hældning blev taget mellem P-1- I

substraterne over 1adningsinterval 1 et, der er givet for log I

(kcat/Km) (fig. 28A, B) og (log 1/Km) (fig. 28C, D). Værdierne I

DK 175523 B1 79 repræsenterer den differentielle virkning, som en ladningsændring har på at skelne de substrater, som sammenlignes.

(b) Ladning i P-l-ladningssted defineres soro summen af lad-5 ningerne fra positionerne 156 og 166.

Den frie energi for elektrostatiske vekselvirkninger i strukturen og energitikken for sa1tbrodannelse afhænger af afstanden mellem ladningerne og mediernes mikroskopiske dielektrika.

For at analysere disse strukturelle og mikromiljømæssige virkninger vurderedes de energier, som er involveret i specifikke saltbroer. Udover de viste mulige saltbroer (figurerne 29A og 29B) kan der bygges rimelige saltbroer mellem et Lys-P-l-sub-strat og Asp i position 166 og mellem et GI u-P-l-substrat og en Lys i position 166 (ikke vist). Skønt kun en af disse 15 strukturer bekræftes af røntgenkrystallografi (T.L. Poulos et al. (1976) J. Mol. Biol. 257, 1097-1103) har alle modeller favorable torsionsvinkler (A.R. Sielecki et al. (1979) J. Mol.

Biol. 134, 781-804) og indfører ikke ufavorable van der Waals-kontakter.

20

Den ændring i præference hos ladede P-l-substrater, som fremkaldes af dannelse af de ovenstående modelsaltbroer, er vist i tabel XVI.

25 30 ί 35

I DK 175523 B1 I

I 80 I

I 1= I

u: ro ro I σ' i cu«^ ° ° '1

I -π m c o OJ Ή +1 I

U Vj ΟΙΛί i TJ -U i-j·— rH ro o ro γί o <*· in f-t <h vo o £15,(1) ^ cotNioæ r-π f-icninvoo r-' gmcr — - - · - w - - -v,

03 S O O r—) i—4 O t-4 I—I i—! 1—i i—4 IN r—I I

Or-)

-H <J —, .—. I

P o E E I

« »I

N (0 4J

5'"'l —-n'sroO’ (0 t n tf ί θ' <0 I

φ ~ Ειηοιπη-υοοηοονοϋ c V -« «(N m ^

I iinl'Dil't ONNfN - OHMINN

j" Ϊ — I o -M I I J I I I I 1 I

" 7,· 4J c io cp σ>

I ΰ £ E 2 £ ° o I

I E » «- < < I

n -Q (8 otrr^O) < o <N ro ro ro <

I ^ ΓΓ 3 J-ι. σ> ro co ο· σ' n io in « « I

I j2*WQ<0rt - _ I

I n, . . -H OOOr-l -H OOOOO

£ <J+lllr-<++ll| ·*

I c s w -π ** I

10 .Q <D P H

T3 3 - C ,n -c

O (0 ft ^ C W -I

I n i iJ 2 % s I

f?rTl,iaF. 4J4J4J-P C^4J+J4J4JC £ I

c ·— HS ajcuajiu c ai ai (!) o) h ft I * m.rt 'lni Σ 2 £ Σ (U -SSSSO f.

, iS S^JSnj'iowwwo io to »i io 3 1^ “ a 3 10 >1 >, >, >, >1 >1 >i >t Ή ^

rnvwjj α ^ α vA o I

I < to <o φ I

E-ι M 'U

O' -U

c in

Ή Λ C

I 5 I? l-2jj tDVOVOvD \T> VO VD UD VID I

7j w S4J di m m m in to io o io in I

I , >tH i-JfHrHfHrH rHi—I

* Η O« N (/) TD

I ? 0 s&§ I

I VØ VO UD U3 IO IO ID Ifl IO I

s VØ VØ vø VØ VØ VØ VØ 10 10 I

_Q i—I t—I *—I (—4 . v-4 τ—1 r-l ιΉ 1—I I

W;.Q,C>1« CDCC+D

V, in in rH >i ίο η io io οι c ™ j < u < < s cn s. \ S v. x s.

-r-t VØ VØ Vø VØ VØ Vø VØ VØ VØ

I V m m m in t n t n in m m I

I SjrHi-Hi—(r-l i—4 i—I r-4 i—| r—| I

e c c c c 3 3 c m 3 m P«Hi—(i—ir-) i—i »—i r—i’ q; ,—i «3 o o u l? ΰ o o w a .

10

I I

<u

rH UD

.Q ID lO ID U) VO ID IO IO ID

^ ^ ID ID ID rH VØVOIOVOVD

rTj *—1 ’—1 —* I r-lrHr-lrHr-l I

η 1 ft c >1 >1 ciidaaw 01 10 rH 0) 10 r—I (0 10 >1 <u<C,3

I V! ’—' — \ \ v \ n I

I X VO ID ID ID VØVDVOVOVO

I 5, in m m m uiuiminin I

N rH i—I I—I ·—I r-4 1-4 ·-) I-I I-H I

I CD333 3-3CM3 I W ·—) r-l 1-4 r-4 uuou uuowu DK 175523 B1 81

Fodnoter til tabel XVI; i®) Molekyl model ler ing viser, at det er muligt at danne en saltbro mellem det angivne ladede P-l-substrat og en komple-g mentær ladning i enzymets P-l-bindingssted ved den angivne ændrede position.

(b) øe sammenlignede enzymer har sterisk til hinanden svarende aminosyresubsti tut ioner, som adskiller sig i ladning ved den angivne position.

10 (c) De sammenlignede P-l-substrater svarer strukturelt til hinanden, men adskiller sig i ladning. Det ladede P-l-substrat er komplementært med ladningsændringen ved den angivne position mellem enzymerne 1 og 2.

15 (d) Data fra tabel XIV anvendtes til at beregne forskellen i log (kcat/Km) mellem det ladede og ikke-ladede P-l-substrat (dvs. substratpræferencen) . Substratpræferencen er vist separat for enzym 1 og 2.

20'

Forskellen i substratpræference mellem enzym 1 (mere hojtladet) og enzym (mere neutralt) repræsenterer den hastighed sændring, som ledsager den elektrostatiske vekselvirkning.

25

Forskellen mellem katalytiske effektiviteter (dvs. Alog kcat/Km) for de ladede og neutrale P-l-substrater (f.eks. Lys minus Met eller Glu minus Gin) giver substratpræferencen for hvert enzym. Ændringen i substratpræference (Δ&1 og kcat/Km) 30 mellem de ladede og mere neutrale enzymhomologer (f.eks. Glul56/Glyl66 minus Glnl56(Q156)/Glyl66) afspejler ændringen i katalytisk effektivitet, som udelukkende kan tilskrives elektrostatiske virkninger.

Disse resultater viser, at den gennemsnitlige ændring i sub-35 stratpræference er betragteligt større, når der fremkaldes elektrostatiske substitutioner i position 166 (50 gange kcat/Km) i forhold til position 156 (12 gange i kcat/Km). Fra

I DK 175523 B1 I

I I

disse ΔΔ1 og kcat/Km-værdier kan der beregnes en gennemsnitlig I

ændring i overgangstiIstandsstabi1 iseringsenérgi på henholds- I

vis -1,5 og -2,4 kcal/mol for substitutionerne i positionerne I

I 156 og 166. Dette skulle repræsentere den stabiliseringsener- I

5 gi, som skyldes en favorabel elektrostatisk vekselvirkning for I

bindingen af frit enzym og substrat til dannelse af overgangs- I

I tilstandskomplekset. I

I EKSEMPEL 10 I

I 10 I

Substitioner i position 217 I

I Tyr217 er blevet substitueret med alle andre 19 aminosyrer. I

H Der anvendtes cassettemutagenese, som beskrevet i EP publika- I

I tion nr. 0130756 i overensstemmelse med protokollen fra fig. I

I 15 22. EcoRV-restriktionsstedet anvendtes til restriktionsoprens- I

ning af ρΔ217. I

I Eftersom denne position er involveret i substratbinding påvir- I

ker mutationer her enzymets kinetiske parametre. Et eksempel I

I 20 er substitutionen af Tyr med Leu i position 217. For substra- I

I tet sAAPFpNa har denne mutant en kcat på 277 og en Km på I

I 4,7χ10~4 med et kcat/Km-forhold på 6xl05. Dette repræsenterer I

I en 5,5 ganges forøgelse i kcat med en 3 ganges forøgelse i Km I

I i forhold til vi 1dtypeenzymet. I

I 2 5 I

Desuden resulterer erstatning af Tyr217 med Lys, Arg, Phe el- I

I ler Leu i mutantenzymer, som er mere stabile ved pH-værdier på I

I ca. 9-11 end vi 1dtypeenzymet. Omvendt resulterer erstatning af I

I Tyr217 med Asp, Glu, Gly eller Pro i enzymer, som er mindre I

I stabile ved pH-værdier på ca. 9-llendvildtypeenzymet. I

I 30 I

EKSEMPEL 11 I

I Multiple mutanter med ændret termisk stabilitet I

I 8. amyloliquefaciens-subti1isin indeholder ingen cysteinres- I

I 3 5 I

ter. Ethvert forsøg på at fremkalde termisk stabilitet ved I

I hjælp af Cys-tværbinding krævede således substitutionen af roe- I

I re end en aminosyre i subtilisin med Cys. Følgende subtilisin- I

I rester blev substitueret flere gange med cystein: I

DK 175523 B1 83

Thr22/Ser87

Ser24/Ser87

Mutagenese af Ser24 til Cys blev udført med en 5'-phosphoryle-_ ret oligonukleotidprimer med sekvensen 9 5,-pc-TAC-ACT-GGA-T^t-AAT-GTT-AAA-G-3t.

(Stjerner viser placeringen af forkert matchede, og den under' stregede sekvens viser positionen af det ændrede Sau3A-sted).

B. amyloliquefaciens-subti 1 i s i ngenet på et 1,5 kb EcoRI-BamHI- fragment fra pS4,5 blev klonet ind i M13mpll og enkeltstrenget DNA isoleredes. Denne skabelon (M13mpllSUBT) blev dobbeltpri- met med den 5'-phosphory1erede universelle sekvens-M13-primer og mutageneseprimeren, Adelman et al. (1983) DNA 2, 183-193.

15

Heteroduplexen blev transficeret ind i kompetente JM101-cel-ler, og plaquer blev undersøgt for mutantsekvensen (M.J. Zol-ler et al. (1982) Nucleic Acid Res. 10, 6487-6500, Wallace et al. (1981) Nucleic Acid Res. 9, 3647-3656) under anvendelse af en tetramethylammoniumchloridhybridiseringsprotokol (Wood et 20 al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1585-1588). Ser87- til -Cysmutationen blev fremstillet på tilsvarende måde under anvendelse af en 5 ’-phosphory1eret primer med sekvensen \ " 25 5'-pGGC-GTT-GCG-CCA-tGC-GCA-TCA-CT-31 (Stjernen angiver positionen for den fejlagtige matchning, og den understregede sekvens viser positionen af et nyt Mst I-sted). C24- og C87-mutationerne blev opnået med en frekvens på henholdsvis 1 og 2%. Mutantsekvenser bekræftedes ved dideoxy-30 sekvensbestemmelse i M13.

Mutagenese af Tyr21/Thr22 til A21/C22 blev udført med en 5'~ phosphory1eret oligonukleotidprimer med sekvensen 1 5'-oAC-TCT-CAA-GGC-GCT-TGT-GGC-TCA-AAT-GTT-3’ (Stjernerne viser forkerte matchninger til viIdtypesekvensen, og den understregede sekvens viser positionen af et ændret

I DK 175523 B1 I

I 84 I

I Sau3A-$ted). Manipulationer for heteroduplexsyntese var iden- I

I tiske med dem, som er beskrevet for C24. Fordi direkte kloning I

I af heteroduplex-DNA-fragmentet kan give forøgede mutagenese- I

I frekvenser, blev EcoRI-BamHI-subti 1 i si nfragmentet oprenset og I

I 5 ligeret ind i pBS42. E. co1 i-MM294-cller blev transformeret I

I med ligeringsblandingen, og plasmid-ONA oprensedes fra isole- I

I rede transformanter. Plasmid-ONA blev screenet for tabet af I

Sau3Astedet ved codon 23, som var fjernet af mutageneseprime- I

I ren. To ud af 16 piasmidpræparater havde tabt vildtype-Sau3A- I

I 10 stedet. Mutantsekvensen blev bekræftet ved dideoxysekvensbe- I

I stemme Ise i M13. I

I Oer fremstilledes dobbelte mutanter, C22/C87 og C24/C87, ved I

I at ligere fragmenter, som delte et fælles Clal-sted, der ad- I

^5 skilte de enkelte modercystincodoner. Specifikt blev 500 bp I

I Ecorl-Clal-fragmentet indeholdende 5'-delen af subti1 isingenet I

(herunder codonerne 22 og 24) ligeret med 4,7 kb Clal-EcoRI- I

I fragmentet, som indeholdt 3'-delen af subti 1 i si ngenet (herun- I

I der codon 87) plus pBS42-vektorsekvens. E. coli-MM 294 blev I

I transformeret med li geringsbland i nger, og plasmid ONA opren- I

I sedes fra individuelle transformanter. Dobbelte cysteinplas- I

midkonstruktioner blev identificeret ved restriktionsstedsmar- I

I kører, som stammede fra modercyste i nmutanterne (dvs. C22 og I

I C24, Sau3A minus; Cys87, MstI plus). Plasmider fra E. coli I

I 25 blev transformeret ind i B. subtilis BG2036. Disse mutanters I

I termiske stabilitet sammenlignet med vildtypesubti 1 isin er I

I vist i fig. 30 og tabellerne XVII og XVIII. I

I 30 I

I I

TABEL XVII

DK 175523 B1 85

Virkning af DTT på halveringstiden for autolytisk inaktivering af vildtypesubtilisin og disu1fidmutanter af subtilisin* . 5

Enzym_-DOT + DTT_-DTT / »DTT

min

Vildtype 95 85 1,1 C22/C87 44 25 1,8 1Q C24/C87 92 62 1,5 (*) Oprensede enzymer blev enten behandlet eller ikke behandlet med 25 mM DTT og dialyseret med eller uden 10 mM DTT i 2 mM CaCl2, 50 mM Tris (pH-værdi 7,5) i 14 timer ved 4eC. Enzym-koncentrationer blev justeret til 80 μΐ . Portioner blev anbragt på is og analyseret for resterende aktivitet. Halveringstider for autolytisk inaktivering blev bestemt ud fra semi 1ogari tmi ske afbiIdninger af log^o (resterende aktivitet) mod tiden. Disse afbildninger var lineære for over 90¾ af in-aktiveringen.

TABEL XVIII

Virkning af mutationer i subtilisin på halveringstiden for autolytisk 25 inaktivering ved 58eC*

Enzym t^ min

Vildtype 120 30 C22 22 C 2 4 120 C87 104 C22/C87 · 43 C24/C87 115 35 (*) Halveringstider for autolytisk inaktivering blev bestemt for vildtypesubtilisin og mutantsubti 1 i s i ner som beskrevet i teksten til tabel III. Uoprensede og ikke-reducerede enzymer anvendtes direkte fra B. subti 1 is-ku11ursupernatanter.

I DK 175523 B1 I

I 86 I

I Disulfiderne, som indførtes i subtilisin, forbedrede ikke mu- I

I tantenzymernes autolytiske stabilitet sammenlignet med vild- I

I typeenzymet. Imidlertid gav disulfidbindingerne en margen for I

I autolytisk stabilitet sammenlignet med deres tilsvarende redu- I

I 5 cerede dobbeltcysteinenzym. Undersøgelse af en meget raffine- I

ret røntgentstruktur af vildtype-B. amyloliquefaciens-subti1 i- I

I sin afslører en hydrogenbinding mellem Thr22 og Ser87. Fordi I

I cystein er en dårlig hydrogendoner eller -acceptor (I.C. Paul I

I (1974) i Chemistry of the -SH Group (S. Patai, ed.) side I

I 10 111-149, Wiley Interscience, New York) kan en svækkelse af I

I 22/87-hydrogenbindingen forklare, hvorfor C22- og C87-enkelt- I

I cysteinmutantproteinerne er mindre autolytisk stabile end både I

I C24 og vildtype (tabel XVIII). Den kendsgerning, at C22 er I

I mindre autolytisk stabil end C87 kan være resultatet af I

I 15 Tyr21A-mutationen (tabel XVIII). Faktisk viser konstruktion og I

I analyse af Tyr21/C22, at mutantproteinet har en autolytisk I

stabilitet, som er nærmere stabiliteten hos C87. Til opsumme- I

H ring destab i 1 i serer C22 og C87 fra enkeltcysteinmutationer I

I proteinet mod autolyse, og di sulfidbindingsdanne1 se forøger I

I 20 stabiliteten til et niveau, som er mindre end eller lig med I

I viIdtypeenzymets stabilitet. I

EKSEMPEL 12 I

Multiple mutanter indeholdende substitutioner I

25 I

i position 222 og position 166 eller 169_ I

Dobbelte mutanter 166/222 og 169/222 blev fremstillet ved at I

sammenligere (1) 2,3 kb AcalI-fragmentet fra pS4.5, som inde- I

holder 5'-delen af subti lisingenet og vektorsekvenser, (2) 200 I

30 bp AvalI-fragmentet, som indeholder de relevante 166- eller I

169-mutationer fra de respektive 166- éller 169-plasmider og I

(3) 2,2 kb AvalI-fragmentet, som indeholder den relevante I

222-mutation 3' og af subti1 isingenerne samt vektorsekvens fra I

det respektive p222-plasmid.

Skønt mutationer i position 222 forbedrer oxidationsstabiliteten har de også en tendes til at foroge Km. Et eksempel er vist i tabel XIX. I dette tilfælde blev A222-mutationen kom- 35 DK 175523 B1 87 bineret med Kl66-mutationen til opnåelse af et enzym med kcat og Km liggende mellem de to moderenzymer.

TABEL XIX

5 kcat Km WT 50 1,4xl0“4 A222 42 9,9x10-4

Kl 66 21 3,7x10-5 K166/A222 29 2,0x10-4 10 substrat sAAPFpNa EKSEMPEL 13

Multiple mutanter indeholdende substitutioner i 15 position 50. 156, 166, 217 og kombinationer deraf

Den dobbelte mutant S156/A169 fremstilledes ved ligering af to fragmenter, som hver indeholdt en af de relevante mutationer. Plasmidet pS156 blev skåret med Xmal og behandlet med Sl-nu-20 klease til dannelse af en stump ende ved codon 187. Efter fjernelse af nukleasen ved phenol/chloroformekstraktion og et-hano1udfældning blev DNA'en fordøjet med BamHI, og det ca. 4 kb store fragment indeholdende vektoren samt 5'-delen af sub-tilisingenet til codon 167, oprensedes.

25 pAl69-plasmidet blev fordøjet med Kpnl og behandlet med DNA-polymerase-Klenow-fragment plus 50 μΜ dNTP'er til dannelse af en codon med stump ende ved codon 188. Klenow-fragmentet blev fjernet ved phenol/chloroformekstraktion og ethanoludfældning.

30 DNA'en blev fordøjet med BamHI, og 590 bp fragmentet inklusive codon 168 frem til carboxyenden af subti1isingenet, isolere-des. De to fragmenter blev derefter ligeret til opnåelse af S156/A169.

Tredobbelte og firedobbelte mutanter fremstilledes ved at sam-35 menligere (1) 220 bp PvuII/HaeII-fragmentet indeholdende de relevante 156-, 166- og/eller 169-mutati oner fra det respektive pl56-, pl66- og/eller pi69-dobbe1 te eller enkelte mutant-

I DK 175523 B1 I

I 88 I

I plasmid, (2) 550 bp HaelI/BamHI-fragmentet indeholdende den I

I relevante 217-mutant fra det respektive p217-plasmid og (3) I

I 3,9 kb PvulI/BamHI-fragmentet indeholdende F50-mutationen og I

I vektorsekvenser. I

I 5 I

I Den multiple mutant F50/S156/A169/L217 samt B. amyloliquefaci- I

I ens-subti1isin, B. 1 icheniformis-subti 1 i sin og den enkelte mu- I

I tant L217 blev analyseret med de ovenstående syntetiske poly- I

I peptider, hvor P-l-aminosyren i substratet var Lys, His, Ala, I

I 61n, Tyr, Phe, Met og Leu. Disse resultater er vist i figurer- I

I ne 26 og 27. I

I Disse resultater viser, at F50/S156/A169/L217-mutanten har en I

I substratspecificitet, som svarer til substratspecificiteten I

I for B. 1icheniformis-enzymet, og som adskiller sig dramatisk I

IlS I

fra vildtypeenzymets. Skønt der kun er vist data for L217-mu-

I tanten, viste ingen af de enkelte mutanter (f.eks. F50, S156 I

I eller A169) denne virkning. Skønt B. 1icheniformis adskiller I

I sig i 88 restpositioner fra B. amyloliquefaciens, forklarer I

I kombinationen af kun disse fire mutationer de fleste af foi— I

I 20 I

skellene i substratspecificitet mellem de to enzymer.

I EKSEMPEL 14 I

I Subti 1 i s i nmutanter med ændret alka1 istabi1 itet I

I 25 I

Der anvendtes en tilfældig mutageneseteknik til at frembringe

I enkelte og multiple mutationer i B. amyloliquefaciens-subtili- I

I singenet. Sådanne mutanter blev screenet for ændret alkalista- I

I bilitet. Kloner med forøget (positiv) a 1ka1 i stab i 1 itet og for- I

I mindsket (negativ) alkali stabilitet blev isoleret og sekvens- B

I 30 B

bestemt for at identificere mutationerne i subti 1 i si ngenet.

I 81andt de positive kloner identificeredes mutanterne V107 og B

I R213. Disse enkelte mutanter blev derefter kombineret til dan- B

I nelse af mutanten V107/R213. B

I 35 En af de negative kloner (V50) fra eksperimenterne med tilfæl- B

I dig mutagenese resulterede i en mærkbar formindskelse i alka- B

I 1istabi1 i teten. En anden mutant (P50) analyseredes for alka- B

I listabilitet for at bestemme virkningen af en anden substitu- B

DK 175523 B1 89 tion i position 50. F50-mutanten viste sig at have en større alkalistabilitet end vildtypesubti 1isinen og resulterede, når den blev kombineret med den dobbelte mutant V107/R213 i en mutant roed en alkalistabi1 itet, som afspejlede summen af alkali-5 stabiliteten for hver af de individuelle mutanter.

Den enkelte mutant R204 og den dobbelte mutant C204/R213 blev identificeret ved alka1 iscreening efter tilfældig cassettemu-tagense over regionen fra position 197 til 228. C204/R213-mu-jq tanten blev derefter modificeret til dannelse af mutationer indeholdende de individuelle mutationer C204 og R213 for at bestemme bidraget fra hver af de individuelle mutationer. Cas-settemutagenese under anvendelse af opsamlede oligonukleotider til erstatning af alle aminosyrer ved position 204 anvendtes til at bestemme, hvilken substitution i position 204, som ville maksimere forøgelsen i alkalistabi1itet. Mutationen fra -Lys213 til Arg blev bibeholdt konstant for hver af disse substitutioner i position 204.

A. Konstruktion af pB0180, et 20 E. coli-B. subti 1is-pendu1p1asmid 2,9 kb EcoRI-BamHI-fragmentet fra pBR327 {L, Covarrubias et al. (1981) Gene 13 , 25-35) blev ligeret til 3,7 kb EcoRI-BamHI-fragmentet fra pBD64 (T. Gryczan et al. (1980) J. Bacte-25 riol., 141, 246-253) til opnåelse af det rekombinerede plasmid pB0153. Den unikke EcoRI-genkendelsessekvens i pBD64 blev -fjernet ved fordøjelse med EcoRI efterfulgt af behandling med Klenow og deoxynukleotidtriphosphater (T. Maniatis et al. (eds.) (1982) i Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold 30 Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Ligering af stumpe ender og transformation gav pB0154. Den unikke Aval-genkendelsessekvens i pB0l54 blev fjernet på tilsvarende måde til opnåelse af p6017l. p80171 blev fordøjet med BamHI og

PvuII og behandlet med Klenow og deoxynukleotidtriphosphater 35 til dannelse af stumpe ender. 6,4 kb fragmentet blev oprenset, ligeret og transformeret ind i LE392-celler (L.W. Enquest et al. (1977) J. Mol. 8iol. 111, 97-120) til opnåelse af pB0172, som bibeholder det unikke BamHI-sted. For at lette subkloning

I DK 175523 B1 I

I 90 I

af subti 1 i s i nmutanter indførtes et unikt og stille KpnI-sted, I

som startede ved codon 166, i subti 1 is i ngenet fra pS4.5 (J.A. I

I Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 7911-7925) ved I

I stedrettet mutagenese. Kpnl+-plasmidet blev fordøjet med EcoRI I

B 5 og behandlet med Klenow og deoxynukleotidtriphosphater til I

dannelse af en stump ende. Klenow blev inaktiveret ved opvarm- I

ning i 20 minutter ved 68°C, og ONA’en blev fordøjet med I

I BamHI. Det 1,5 kb stumpe EcoRI-BamHI-fragment indeholdende he- I

B le subtilisin blev ligeret med 5,8 kb NruI-BamHI fra pB0172 I

10 til opnåelse af pB0l80. Ligeringen af den stumpe Nrul-ende til I

B den stumpe EcoRI-ende gendannede et EcoRI-sted. Ved at gå I

rundt om pB0180 med uret fra EcoRI-stedet i 5'-enden af subti- I

B lisingenet findes det unikke BamHI-sted i 3'-enden af subtili- I

singenet, chloramphenicol- og neomycinresi stensgenerne og det I

15 grampositive UBllO-repli kationsori g in hidrørende fra pB064, I

B ampiciΠi nres i s tensgenet og det gramnegative replikationsori- I

B gin hidrørende fra pBR327. I

B B. Konstruktion af tilfældig mutagenese-bibliotek I

B 20 I

1,5 kb EcoRI-8amHI-fragmentet indeholdende B. amyloliquefaci- I

B ens-subti 1 i s i ngenet (Wells et al. (1983 ) fra pB0180 blev klo- I

B net ind i M13mpll til opnåelse af M13mpll-SUBT i alt væsent- I

B ligt som beskrevet tidligere (J.A. Wells et al. (1986) J. I

B B i o 1. Chem., 261, 6564-6570). Deoxyuridinho1di g skabelon-ONA I

B 2 5 I

fremstilledes i overensstemmelse med Kunkel (T.A. Kunkel I

I (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492). Uridinholdig I

B skabelon-DNA (Kunkel, 1985) blev oprenset ved hjælp af CsCl- I

B densitetsgradienter (T. Maniatis et al. (eds.) (1982) i Mole- I

B cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- I

B 30 I

B tory. Cold Spring Harbor, N.Y.). Oer anvendtes en primer I

B (Aval'l) med sekvensen I

I 5’GAAAAAAGACCCfAGCGTCGCTTA I

fl 35 der endte ved codon -11, til at ændre den unikke Aval-genken- I

I delsessekvens i subti 1 i s i ngenet. (Stjernen angiver de forkerte I

I matchninger fra vi 1dtypesekvensen, og det understregede er det I

I ændrede Aval-sted). I

DK 175523 B1 91

Den 5'-phosphorylerede Aval-primer (-320 pmol) og -40 pmol (-120 pg) uridinholdig M13mpll-SUBT-skabelon i 1,88 ml 53 mM NaCl , 7,4 mM MgCl2 og 7,4 mM Tris.HCl (pH-værdi 7,5) blev sammenføjet ved opvarmning til 90* C i 2 minutter og afkøling i 15 5 minutter til 24°C (fig. 31). Pr i merfor 1ænge1 se ved 24eC påbegyndtes ved tilsætning af 100 pL indeholdende 1 mM i alle fire • deoxynuk1eotidtriphosphater samt 20 μΐ Klenow fragment (5 en-heder/1). Forlængelsesreaktionen blev standset hvert 15 sekund i løbet af 10 minutter ved tilsætning af 10 μΐ 0,25 M EDTA 10 (pH-værdi 8) til 50 μΐ portioner af reaktionsblandingen. Prøver blev samlet og ekstraheret med phenol-chloroform, og DNA blev udfældet to gange ved tilsætning af 2,5 vol 100% ethanol og vasket to gange med 70% ethanol. Pellets blev tørret og genopløst i 0,4 ml 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH-værdi 8).

15

Forkert inkorporering af α-thiodeoxynukleoti der på 3'-enderne af puljen af tilfældigt afsluttet skabelon blev udført ved inkubation af fire 0,2 ml opløsninger hver indeholdende en fjerdedel af den tilfældigt afsluttede skabelonblanding (20 pg), 20 0,25 mM af et givet α-thiodeoxynukleotidtriphosphat, 100 enhe der AMV-polymerase, 50 mM KC1, 10 mM MgCl2. 0,4 mM dithiothre-itol og 50 mM Tris (pH-værdi 8,3) (J.J. Champoux (1984) Genetics, 2, 454-464). Efter inkubation ved 37eC i 90 minutter forsegledes misinkorporeringsreaktioner ved inkubation i 5 mi-25 nutter ved 37eC med 50 mM af alle fire deoxynukleotidtriphos-phater (pH-værdi 8) og 50 enhder AMV-polymerase. Reaktionerne blev standset ved tilsætning af 25 mM Ε0ΤΑ (endelig) og opvarmet til 68*0 i 10 minutter for at inaktivere AMV-polymerase. Efter ethanoludfældning og gensuspension udførtes syntese af 3Q lukkede, cirkulære heteroduplexer i to dage ved 14eC under de samme betingelser, som anvendtes til de ovenfor beskrevne tidstagne forlængelsesreaktioner, bortset fra at alle reakti-onsblandinger også indeholdt 1000 enheder T4-DNA-1 i gase, 0,5 mM ATP og 1 mM Ø-mercaptoethanol. Samtidig restriktionsbehand-35 ling af hver heteroduplexpu 1 je med Kpnl, BamHl og EcoRI bekræftede, at for længe 1 sesreakt ionerne næsten var kvantitative. Heteroduplex DNA i hver reaktionsblanding blev methyleret ved inkubation med 80 pM S-adenosy1methi on in og 150 enheder dam-

I DK 175523 B1 I

92 I

I methylase i 1 time ved 37 °C. Methyleringsreaktioner standsedes I

I ved opvarmning til 68°C i 15 minutter. I

Halvdelen af hver af de fire methylerede heteroduplexreaktio- I

I 5 ner blev transformeret ind i 2,5 ml kompetent E. col i JM101 I

I (J. Messing (1979) Recombinant DNA Tech. Bull., 2, 43-48). An- I

I tallet af uafhængige transformanter fra hver af de fire trans- I

I formationer varierede fra 0,4 til 2,0 x ΐθ5. Efter at fagpul- I

I jer var vokset ud, i soleredes RF-DNA fra hver af de fire I

I transformationer og oprensedes ved centrifugering gennem I

I CsC 1-dens itetsgradi enter. Ca. 2 ug RF-DNA fra hver af de fire I

I puljer blev fordøjet med EcoRI, BamHI og Aval. 1,5 kb EcoRI- I

BamHI-fragmentet (dvs. Aval-resistent) blev oprenset på agaro- I

se med lav gel temperatur og ligeret ind i 5,5 kb EcoRI-BamHI- I

I vektorfragmentet fra p80180. De totale antal uafhængige trans- I

formanter fra hvert a-thiodeoxynukleotidmisinkorporeringsplas- I

I midbibliotek varierede fra 1,2 til 2,4xl04. Puljen af plasmi- I

I der fra hver af de fire transformationer blev dyrket ud i 200 I

I ml LB-medier indeholdende 12,5 ug/ml cmp, og plasmid-DNA op- I

I 2Q rensedes ved centrifugering gennem CsCl-densitetsgradienter. I

I C. Ekspression og screening af subtilisinpunktmutanter I

I Plasmid-ONA fra hver af de fire misinkorporeringspuljer blev I

I transformeret (C. Anagnostopou1 os et al. (1967), J. Bacteri- I

25 ol., 81, 741-746) ind i 8G2036. For hver transformation produ- I

I cerede 5 ug DNA ca. 2,5 x 105 uafhængige BG2036-transforman- I

ter, og væskekul turport ioner fra de fire biblioteker blev lag- I

ret i 10% glycerol ved 70*c. Optøede portioner af frosne kul- I

turer blev udpladet på LB/5 ug/ml cmp/1,6% skummetmælksplader I

I 30 (J.A. Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 7911-7925), I

og friske kolonier blev anbragt i række på 96 brøndes mikroti- I

I terplader indeholdende 150 1 per brønd-medier plus 12,5 ug/ml I

cmp. Efter 1 times forløb ved stuetemperatur blev et replika I

I præget (ved anvendelse af et tilpasset 96-grenet stempel) på I

I 35 et 132 mm BA 85-nitrocel 1ulosefi 1 ter (Schleicher and Scheull), I

I som blev lagt på en LB/cmp/skummetmæl kspl ade med en diameter I

I på 140 mm. Celler blev dyrket i ca. 16 timer ved 30eC, indtil I

I proteolyseringene var ca. 5-7 mm i diameter, og filtrene blev I

DK 175523 B1 93 overfort direkte til en frisk fremstillet agarplade ved 37eC, som kun indeholdt 1,6% skummetmælk og 50 mM natriumphosphat, pH-værdi 11,5. Filtrene blev inkuberet på plader i 3-6 timer ved 37eC til dannelse af ringe på ca. 5 mm for vildtypesubti-5 lis in og blev kasseret. Pladerne blev farvet i 10 minutter ved 2 4 ° C med Coomassieblå-opløsning (0,25% Coomassieblå (R-250), 25% ethanol) og affarvedes med 25% ethanol og 10% eddikesyre i 10 minutter. Proteolysezoner fremkom som blå ringe på en hvid baggrund på undersiden af pladen og blev sammenlignet med den 10 oprindelige vækstplade, som på tilsvarende måde var farvet og affarvet som en kontrol. De kloner blev betragtet som positive, som dannede forholdsmæssigt større proteolysezoner på pladerne med høj pH-værdi i forhold til den oprindelige vækstplade. Negative kloner gav mindre ringe under alkaliske betingel-15 ser. Positive og negative kloner blev igen udstreget som stregkultur for at oprense kolonierne og screenet i tre versioner for at bekræfte resultaterne med alkalisk pH-v«rdi.

D. Idenfikation og analyse af mutantsubti1 i s i ner 20

Plasmid-DNA fra 5 ml kulturer, der havde stået natten over og bestod af mere alkalisk aktive 8. subti1is-kloner, fremstilledes i overensstemmelse med Birnboira og Ooly (H.C. Birn-boim et al. (1979) Nucleic Acid Res. 7, 1513), bortset fra at der fortages inkubation med 2 mg/ml lysozym i 5 minutter ved 25 37 eC forud for at sikre cellelyse, og at der anvendtes en yderligere phenol/CHC13-ekstrakti on for at fjerne forureninger. 1,5 kb EcoRI-8amHI-fragmentet indeholdende subti1 isingenet blev ligeret ind i Ml3mpll, og skabelon-DNA fremstilledes til DNA-sekvensbestemmelse (J. Messing et al. (1982) Gene, 19, 30 269-276). Tre DNA-sekvensbestemmelsesprimere, som endte ved codon 26, +95 og +155 syntetiseredes til at matche med subti- 1 isinkodningssekvensen. Til indledende sekvens identifi kat i on blev et enkelt ONA-sekvensspor, svarende til det dNTPaS-mis in- korporeringsbibliotek, hvorfra mutanten kom, anbragt over hele 3 5 det fuldt udviklede proteins kodningssekvens (dvs. et enkelt dideoxyguanosinsekvensspor anvendtes til at identificere en mutant fra dGTPaS-biblioteket). Der udførtes en komplet fire-

I DK 175523 B1 I

94 I

I spors DNA-sekvens 200 bp over mutagenesestedet for at bekræfte I

og identificere mutantsekvensen (F. Sanger et al, (1980) J. I

I Mol. Biol., 143, 161-178). Bekræftede positive og negative ba- I

I cillikloner blev dyrket i LB-medier indeholdende 12,5 pg/ml I

I 5 cmp og oprenset fra kultursupernatanter som beskrevet tidlige- I

re (D.A. Estell et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518-6521). I

I Enzymer, som var mere end 98% rene ved analyse ved SDS-polya- I

I crylamidgelelektroforese (U.K. Laemmli (1979), Nature, 227, I

680-685) og proteinkoncentrationer blev beregnet ud fra absor- I

10 bansen ved 280 nm, I

I 0,1% I

I €280 = (H. Maturbara et al. (1965) J. Biol. Chem., I

240, 1125-1130). I

15 - I

Enzymaktiviteten blev målt med 200 pg/ml succinyl-L-AlaL- I

Alal-ProL-Phe-p-nitroan i 1 id (Sigma) i 0,1 M Tris pH-værdi 8,6 I

I eller 0,1 M CÅPS pH-værdi 10,8 ved 25eC. Den specifikke akti- I

vitet (μπιοί produkt/min·mg) blev beregnet ud fra absorbansæn- I

dringen ved 410 nm fra produktionen af p-nitroani1 in med tiden I

I 20 per mg enzym (E410 = 8480 M-lcm-1; E.G. Del Mar et al. (1979), I

I Anal. Biochem., 99, 316-320). Der udførtes alkalisk autolytisk I

stabilitetsundersøgelser på oprensede enzymer (200 pg/ml) i I

I 0,1 M kaliumphosphat (pH-værdi 12,0) ved 37eC. På forskellige I

tidspunkter analyseredes portioner for resterende enzymaktivi- I

25 tet (J.A. Wells et al. (1986) J. Biol. Chem., 261, 6564-6570). I

I E. Resultater I

I 1. Optimering og analyse af mutaqenesefrekvens I

I 30 I

Oer fremstilledes et sæt af primer-skabelonmolekyler, som var I

tilfældigt 3'-afsluttede over subti1isingenet (fig. 31) ved I

I variabel forlængelse fra en fast 5'-primer (primeren muterede I

I et unikt Aval-sted i codon 11 i subti 1 i s i ngenet). Dette opnåe- I

des ved at standse polymerasereaktioner med Ε0ΤΑ efter for- I

I 3 5 I

skellige forlængelsestidsrum. Omfanget og fordelingen af du- I

I plexdannelse over 1 kb subti 1 i singenfragmentet vurderes ved I

I multipel restriktions-fordøjelse (ikke vist). F.eks. identifi- I

DK 175523 B1 95 ceredes fremstilling af nye Hindl-fragmenter, når polymerase-forlængelsen var gået forbi IlellO, Leu233 og Asp259 i subti-lisingenet.

5 Til misinkorporering af hver dNTPas ved tilfældigt afsluttede 3'-ender ved hjælp af omvendt AMV-transkriptase (R.A. Zakour et al. (1982), Nature, 295, 708-710, R.A. Zakour et al.

(1984), Nucleic Acids Res., 12, 6615-6628) anvendtes tidligere beskrevne betingelser (J.J. Champoux (1984), Genetics, 2, jø 454-464). Virkningen af hver mi s inkorporer ingsreakti on blev vurderet til at være større end 80% ved tilsætning af hver dNTPas til AvaI-restriktionspr i meren og analyse ved polyacryl-amidgelelektroforese. Misinkorporeringer blev forseglet ved polymerisering ved alle fire dNTP'er, og lukket, cirkulær DNA fremstilledes ved omsætning med DNA-ligase.

Der anvendtes adskillige manipulationer for at maksimere udbyttet af mutantsekvenserne i heteroduplexen. Oisse omfattede brugen af en deoxyuridinholdig skabelon (T.A. Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 82, 488-492; P.J. Pukkila et al.

20 (1983) Genetics, 104, 571-582), in vitro-methylering af den mutagene streng (W. Kramer et al. (1982) Nucleic Acids Res, 10, 6475-6485) og anvendelsen af Aval-restriktionsudvælgelse mod vi 1dtypeskabelonstrengen, som indeholdt et unikt Aval- sted. Det separate bidrag fra hver af disse berigelsesproce-25 durer til den endelige mutagenesefrekvens blev ikke bestemt, bortset fra at før Aval-restriktionsudvælgelsen indeholdt groft taget 1/3 af de segregerede kloner i hver af de fire puljer stadig et vildtype-Aval-sted i subtilis ingenet. Efter

Aval-restriktionsudvælgelse manglede mere end 98% af pi asm i -30 derne vi 1dtype-Aval-stedet.

1,5 kb EcoRl-BamHI-subti1 i s i ngen fragmentet, som var resistent over for Aval-rest r i kt i onsf ordø jel se , fra hver af de fire CsCl-oprensede M13 RF-puljer, isoleredes på 1avtsme1 tende aga-35 rose. Fragmentet blev ligeret in situ fra agarosen med en tilsvarende skåret E.. coli-B. subti 1 is-pendu 1 vektor, pB0180, og transformeret direkte ind i E. coli LE392. Ved en sådan direkte ligering og transformation fra agaroseisoleret DNA undgik

I DK 175523 B1 I

I I

I man tab og muliggjorde opnåelse af et stort antal rekombinan- I

I ter (100.000 per pg ækvivalent af tilført M13-pulje). I

I Mutagenesefrekvensen for hver af de fire dNTPas-mi s i nkorpore- I

I 5 ringsreaktioner blev vurderet ud fra den frekvens, hvormed I

I unikke restrikti onssteder blev fjernet (tabel XX). Oe unikke I

I restriktionssteder, som valgtes til denne analyse, Clal, Pvull I

I og Kpnl, var fordelt over subti1 isingenet og startede ved hen- I

I holdsvis codonerne 35, 104 og 166. Som en kontrol blev mutage- I

I nesefrekvensen bestemt ved Pstl-stedet, som er placeret i 0- I

lactamase-genet, der var uden for mutagenesevinduet. Fordi den I

absolutte mutagenesefrekvens var tæt på procentsatsen af ufor- I

I døjet plasmid-ONA, var det nødvendigt med to runder restrikti- I

I onsudvælgelse for at reducere baggrunden af overlevende, uskå- I

I ret vi 1dtypeplasmid-DNA under mutantplasmidet (tabel XX). Bag- I

I grunden af overlevende plasmid fra en vildtype-DNA repræsente- I

rer sandsynligvis den totale sum af spontane mutationer, uskå- I

ret vildtypeplasmid og den effektivitet, med hvilken lineær I

I 0ΝΑ kan transformere E. coli. Ved at trække frekvensen for I

I 20 umutageniseret 0ΝΑ (baggrund) fra frekvensen for mutant-ONA og I

I normalisere for det mutagenesevindue, som var udtaget til prø- I

I ve ved en given restriktionsanalyse (4-6 bp) opnås et estimat I

I af mutageneseeffekti vi teten over hele kodningssekvensen (1000 I

I bp)· I

I I

I 30 - I

I 35 i DK 175523 B1 97

TABEL XX

a-thiol % dNTP Restrik- % resistente klonerc % resistente mutanter 5 misin- tions- Første Anden kloner over per korpo- sted- reretb udvælgelse runde runde Total baqqrundd 1000 bpe

Ingen PstI 0,32 0,7 0,002 0 G PstI 0,33 1,0 0,003 0,001 0,2 10 T PstI 0,32 -0,5 -0,002 0 0 C PstI 0,43 3,0 0,013 0,011 3

Ingen Clal 0,28 5 0,014 0 G Clal 2,26 85 1.92 1,91 380 15 T Clal 0,48 31 0,15 0,14 35 C Clal 0,55 15 0,08 0,066 17

Ingen PvuII 0,08 29 0,023 0 G PvuII 0,41 90 0,37 0,35 88 20 T PvuII 0,10 67 0,067 0,044 9 C PvuII 0,76 53 0,40 0,38 95

Ingen Knpl 0,41 3 0,012 0 G Knpl 0,98 35 0,34 0,33 83 T Knpl 0,36 15 0,054 0,042 8 25 C Knpl 1,47 26 0,38 0,37 93

Mutagenesefrekvensen vurderes ud fra frekvensen for opnåelse af mutationer, som ændrer unikke restriktionssteder i det 30 mutageniserede subti 1 i si ngen (dvs. Clal, PvuII eller Kpnl) sammenlignet med mutationsfrekvenser for Pstl-stedet, som ligger uden for mutagenesevinduet.

(k) Plasmid-DNA var fra vildtype (ingen) eller var mutageni-35 seret ved hjælp af dNTPas-mis inkorporering som beskrevet.

S

Procent resistente kloner blev beregnet ud fra den fraktion af kloner, som opnåedes efter 3 gange eller flere over-

I DK 175523 B1 I

I 98 I

I fordøjelse af plasmidet med det angivne restriktionsenzym sam- I

menlignet med en ikke-fordojet kontrol. Restriktionsresistens- I

plasmid-DNA fra den første runde blev underkastet en anden I

I runde med restriktionsudvælgelse. Totalen repræsenterer pro- I

5 duktet af fraktionerne af resistente kloner, som opnåedes fra I

begge udvalgel sesrunder og giver procentsatsen af restrikti- I

onsstedmutantkloner i den oprindelige udgangspulje. Frekven- I

. serne udledtes ved at tælle mindst 20 kolonier og sædvanligvis I

I flere end 100. I

I 10 I

Procent resistente kloner blev beregnet ved at trække I

H procentsatsen af restriktionsresistente kloner, opnået fra I

vildtype-DNA (dvs. ingen) fra den procentsats, der opnåedes I

for mutant-ONA. I

I I

»e> Denne ekstrapolerer fra mutationsfrekvensen over hvert I

I restriktionssted til hele subti1isingenet (1 kb). Dette er I

I blevet normaliseret til antallet af mulige baser (4-6 bp) i I

hvert restriktionssted, som kan mutageniseres af en given mis- I

inkorporeringsbegivenhed. I

20 I

H Fra denne analyse vurderedes den gennemsnitlige procent af I

subti1isingener indeholdende mutationer, som er et resultat af I

I dGTPas-, dCTPas- eller dTTPas-mis inkorporering til at være I

m zo i

henholdsvis 90, 70 og 20%. Disse høje mutagenesefrekvenser var I

I sædvanligvis ganske variable afhængigt af dNTPas og misinkor- I

I poreringseffektiviteterne på dette sted. Misinkorporeringsef- I

I fektivitet er blevet rapporteret til at være afhængig både af I

arten af den forkerte matchning og primersammenhængen (J.J. I

I Champoux (1984), J.A. Skinner et al. (1986) Nucleic Acids I

I Res., 14, 6945-6964). En tendentiøs mis inkorporeringseffekti - I

vitet hos dGTPos 0g dCTPas i forhold til dTTPas er tidligere I

I blevet observeret (0. Shortle et al. (1985), Genetics, 110, I

I 35 539-555). Ulig dGTPas-, dCTPas- og dTTPas-bibl i otekerne kunne I

I mutageneseeffektiviteten for dATPas-misinkorporeringsbiblio- I

I teket ikke blive vurderet præcist, fordi 90% af de analyserede I

I restr iktionsresi stente plasm ider simpelthen manglede det ind- I

DK 175523 B1 99 satte subti1 isingenstykke. Dette problem skyldtes sandsynlig* vis selvligering af vektoren, når det dATPas-mutageniserede subti1 isingen blev subklonet fra M13 i p80180. Ved at korrigere for vektorbaggrunden vurderes mutagenesefrekvensen til at 5 være omkring 20% i dATPas-misinkorporeringsbiblioteket. I et separat eksperiment (ikke vist) blev mutageneseeffektiviteten for dGTPas- og dTTPas-misinkorporering vurderet til at være omkring henholdsvis 50 og 30%, baseret på frekvensen for reversering af en i nakt i verende mutation i codon 169.

10

Placeringen og identiteten af hver mutation blev bestemt ved et enkelt spor af DNA-sekvensbestemmelse svarende til det mis-^ inkorporerede a-thiodeoxynuk1eotid over Hele genet efterfulgt af en komplet firespors DNA-sekvensbestemmelse, som var foku-jg seret over mutationsstedet. Af 14 identif icerede mutanter svarede fordelingen til den, der er rapporteret af Shortle og Lin (1985) bortset fra, at man ikke observerede nukleotidindsæt-telse eller deletionsmutationer. Andelen af AG-mutationer var højest i 6-mis inkorporeringsbiblioteket, og der fremkom nogle 2(J uventede punktmutationer i dTTPas- og dCTPas-bibl iotekerne.

2. Screening og identifikation af alkalistabilitetsmutanter af subtilisin

Det er muligt at screene kolonier, som producerer subtilisin 25 ved hjælp af ringe ved caseinfordøjelse (J.A. Wells et al. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 7911-7925). Der var imidlertid to problemer ved at screene kolonier under stærkt alkaliske betingelser (> pH 11). For det første vil B. subtilis ikke vokse ved høj pH-værdi, og man har været ude af stand til at 30 transformere en alkylofil baci 11usstamme. Dette problem blev overvundet ved at anvende en rep 1 ikaudp1adningsstrategi, hvori kolonier blev dyrket på filtre ved neutral pH-værdi til fremstilling af subtilisin, og filtrene derefter blev overført til caseinplader ved pH-værdi 11,5 for at analysere subti 1 i s inak-35 tivitet. Ved pH-værdi 11,5 dannede caseinmicellerne imidlertid ikke længere en uklar baggrund og forhindrede dermed en klar observation af proteolyseringe. Problemet blev overvundet ved at farve pladen kort med Coomassie-blå for at forstærke pro-

I DK 175523 B1 I

I 100 I

I teolyse2oner og syrne pladerne til udvikling af caseinmicelle- I

I turbiditet. Ved sammenligning af ringstcrrelsen, der fremstil- I

I ledes på referencevækstp1aden (pH-værdi 7) med pladen med høj I

I pH-værdi (pH-værdi 11,5) var det muligt at identificere mu- I

I 5 tantsubti 1 i si ner, som havde forøget (positive) eller formind- I

I sket (negative) stabilitet under alkaliske betingelser. I

I Oer screenedes omkring 1000 kolonier fra hvert af de fire mis- I

I inkorporeringsbibiioteker. Procentsatsen af kolonier, som vis- I

I j0 te et differentielt aktivitetstab ved pH-værdi 11,5 mod pH- I

værdi 7, var 1,4, 1,8, 1,4 og 0,6% af de totale kolonier, som I

I screenedes fra henholdsvis thiol-dGTPas-, -dATPas-, -dTTPas- I

I og -dCTPas-bibliotekerne. Flere af disse negative kloner blev I

I sekvensbestemte og alle viste sig at indeholde en enkelt base- I

ændring, som forventet ud fra det mi s inkorporeringsbi bl iotek, I

I hvorfra de kom. Negative mutanter omfattede A36, £170 og V50. I

I To positive mutanter identificeredes som V107 og R213. Forhol- I

I det mellem negative og positive var omkring 50:1. I

I 3. Stabilitet og aktivitet af I

20 I

subti1isinmutanter ved alkalisk pH-værdi

Subti1isinmutanter oprensedes, og deres autolytiske stabilite- I

I ter blev målt ved tidsforløbet for inaktivering ved pH-værdi I

I 12,0 (fig. 32 og 33). Fra screeningen identificerede positive I

25 mutanter (dvs. V107 og R213) var mere modstandsdygtige over I

for alkalisk induceret autolytisk inaktivering sammenlignet I

I med vildtypen, og negative mutanter (dvs. E170 og V50) var I

I mindre modstandsdygtige. Der fremkaldtes fordelagtigt en anden I

mutant i position 50 (F50) ved stedrettet mutagenese. Denne I

I 30 mutant var mere stabil end viIdtypeenzymet over for alkalisk I

I autolytisk inaktivering (fig. 33). Ved afslutningen af autoly- I

I seundersøgelsen bekræftede SDS-PAGE-ana1yse, at hver subtili- I

I sinvariant var autolyseret i et omfang, som var i overensstem- I

I raelse med den resterende enzymaktivitet. I

I 35 I

I De stabiliserende virkninger af V107, R213 og F50 er kumulati- I

I ve, se tabel XXI. Dobbeltmutanten, V107/R213, (fremstillet ved I

I subkloning af en 920 bp EcoRI-KpnI-fragmentet fra pB0l80V107 I

DK 175523 B1 101 ind i 6,6 kb EcoRI-KnpI-fragmentet fra p80180R213), er mere stabil end hver af enkeltmutanterne. Tri pi emutanten, F50/V107/ R213 (fremstillet ved subkloning af 735 bp EcoRI-PvuII-fragmentet fra pF50 (eksempel 2) ind i 6,8 kb EcoRI-PvuII-fragmen-5 tet fra p80180/V107), er mere stabilt end dobbeltmutanten V107/R213 eller F50. Inaktiveringskurverne viser en tofaset karakter, som bliver mere udtalt, jo mere stabil den analyserede mutant er. Dette kan skyldes nogen destabi1 i serende kemiskte) modifikation(er) (f.eks. deamidering) under autolyse-10 undersøgelsen og/eller reduceret stabilitet forårsaget af fuldstændig fordøjelse af større autolysepeptider. Oisse alkali autolyseundersøgelser er blevet gentaget på separat oprense-de enzymcharger med i alt væsentligt samme resultater. Autoly-sehastigheder skulle både afhænge af konformationsstabi1 i teten 15 samt subti1 i si nvariantens specifikke aktivitet (J.A. Wells et al. (1986), J. Biol. Chem., 261, 6564-6570). Det var derfor muligt, at formindskelserne i autolytisk inaktiveringshastigheder kunne være et resultat af formindskelser i specifik aktivitet af den mere stabilie mutant under alkaliske betingel-20 ser. Generelt ser det modsatte ud til at være tilfældet. De mere stabile mutanter, om nogen, har en relativt højere specifik aktivitet end vildtypen under alkaliske betingelser, og de mindre stabilie mutanter har en relativt lavere spec i fik aktivitet. Disse raffinerede virkninger på specifik aktivitet for 25 V107/R213 og F50/V107/R213 er kumulative både ved pH-værdi 8,6 og 10,8. Ændr i ngerne i specif ik aktivitet kan afspejle små forskelle i substratspecificitet, men det er imidlertid værd at bemærke, at kun positionerne 170 og 107 er inden for 6A af et bundet model-substrat (J.D. Robertus et al. (1972) Bioche-30 mistry 11, 2438-2449).

i 35

I DK 175523 B1 I

102 I

I TABEL XXI I

I Forhold mellem relativ specifik aktivitet ved I

I pH-værdi 8,6 eller 10,8 og alkaliautolvsestabi1 itet I

I 5 Alkalisk I

Relativ specifikaktivitet autolyse- I

halveringstid I

I Enzym pH 8,6 pH 10,8 (min)b_ I

I 10 Vildtype 100tl 100i3 86 I

Q170 46 il 28 ±2 13 I

V107 126 ±3 99 ±5 102 I

I R213 97 il 102 ±1 115 I

I VI07/R213 116i2 106±3 130 I

15 V50 66±4 6U1 58 I

I F50 123±3 157 ±7 131 I

F50/V107/R213 126i2 152i3 168 I

I 20 Relativ specifik aktivitet var gennemsnittet fra tre ak- I

tivitetsbestemmelser divideret med viIdtypeværdien ved den I

I samme pH-værdi. Den gennemsnitlige specifikke aktivitet hos I

I vi 1dtypeenzymet ved pH-værdi 8,6 og 10,8 var henholdsvis 70 I

I pmol/min*mg og 37 μιηοΐ/mi n »mg. I

I 2 g I

I Tiden til at nå 50% aktivitet blev taget fra fig. 32 og I

I 33.

I 30 F. Tilfældig cassettemutaqenese af resterne 197 til 228 I Plasmid ρΔ222 (Wells et al. (1985) Gene 34, 315-323) blev for- I dejet med PstI og 8amHI og 0,4 kb Pstl/BamHI-fragmentet (frag- ment 1, se fig. 34) oprenset fra en polyacrylamidgel ved elek- 35 troeluering.

I 1,5 kb EcoRI-BamHI-fragmentet fra pS4.5 blev klonet ind i I M13mp9. Der udførtes stedrettet mutagenese for at danne A197- DK 175523 B1 103 mutanten og samtidig indsætte et. stille Sstl-sted over codo-nerne 195-196. Mutant-EcoRI-BamHI-fragmentet blev klonet tilbage i pBS42. pA197-plasmidet blev fordøjet med BamHl og SstI, og 5,3 kb BamHI/Sstl-fragmentet (fragment 2) blev opren-5 set fra 1 avtsme1 tende agarose.

Der syntetiseredes komplementære oligonukleoti der til at spænde over regionen af SstI (codonerne 195-196) til PstI (codo-nerne 228-230). Disse oligodeoxynukleotider blev konstrueret-for at (1) genetablere codon 197 til vildtypen, (2) gendanne et stille Knpl-sted, som er til stede i ρΔ222 ved codonerne 219-220, (3) danne et sti 11e.Smal-sted over codonerne 210-211 og (4) fjerne Pstl-stedet over codonerne 228-230 (se fig. 35).

Der syntetiseredes oligodeoxynukleotider med 2¾ forurenende nukleotider ved hver syntesecyklus, og f.eks. blev dATP-rea-gens forsynet med 2% dCTP, 2% dGTP og 2% dTTP. For 97-merer skulle denne 2%’s forgiftning give følgende procentsatser af ikke-mutanter, enkelte mutanter og dobbelte eller højere mutanter per streng med to eller flere misinkorporeringer per 20 komplementærstreng: 14% ikke-mutant, 28% enkelt mutant og 57% med £2 mutanter, i overensstemmelse med den almene formel

Pn f = - e - μ

η I

25 hvor μ er det gennemsnitlige antal mutationer, og n er et mutationsklasseantal, og f brøkdelen af de totale med dette antal mutationer. Komplementære ol igodeoxynukleotidpul jer blev phosphory1eret og sammenføjet (fragment 3) og derefter ligeret i et to gange molært overskud i forhold til fragmenterne 1 og 30 2 i en trevejs1igering.

E. coli MM294 blev transformeret med ligeringsreaktionsblandingen, transformat i onspuljen voksede op natten over, og puljepi asm i d-DNA ’ en isoleredes. Denne pulje repræsenterede 35 3 ,4x10* uafhængige transformanter. Denne plasm idpulje blev fordøjet med PstI og derefter anvendt til at gentransformere E. coli. En anden plasmidpulje fremstilledes og anvendtes til at transformere B. subtilis (BG2036). Ca. 40% af BG2036-trans-

I DK 175523 B1 I

I 104 I

H formanterne udtrykte aktivt subtilisin, bedømt ved ringklaring I

I på caseinplader. Flere af de ikke-udtrykkende transformanter I

I blev sekvensbestemte og viste sig at have indsættelser eller I

deletioner i de syntetiske cassetter. Udtrykkene BG2036-mutan- I

5 ter blev anbragt på række i mi krot iterskå1e med 150 μΐ I

LB/12,5pg/ml chloramphenicol (cmp) per brønd, inkuberet ved I

37eC i 3-4 timer og derefter præget to gange på nitrocellulo- I

sefiltre, som var lagt på LB 1,5% skummetmælk/Bpg/ml cmp-pla- I

H der og inkuberet natten over ved 37*C (indtil ringene var ca. I

10 4-8 mm i diameter). Filterne blev derefter løftet over på I

bunker af filtrerpapir, som var mættet med 1 x Tide-detergent I

I af kommerciel kvalitet, 50 roM Na2C03, pH-værdi 11,5 og inku- I

I beret ved 6 5° C i 90 minutter. Plader, som var vokset natten I

over, blev Commassie-farvet og affarvet for at etablere basis- I

15 ekspressionsniveauer. Efter denne behandling blev filterne I

lagt tilbage på pH-værdi 7/skummetmælk/20pg/ml tetracyklinpla- I

der og inkuberet ved 37°C i 4 timer natten over. I

Mutanter, som ved screeningen for stabilitet ved høj pH-værdi, I

I 20 var b^evet identificeret som værende mere alkalisk stabile, I

H blev oprenset og analyseret for autolytisk stabilitet ved høj I

I pHværdi eller høj temperatur. Dobbeltmutanten C204/R213 var I

I mere stabil end vildtypen ved både høj pH-værdi og høj tempe- I

I ratur (tabel XXII). I

I 25 I

Denne mutant blev optrevlet i enkeltmutantophav (C204 og R213) I

I ved at skære ved det unikke Smal-restriktionssted (fig. 35) og I

enten ligere vildtypesekvensen 3' for Smal-stedet til dannelse I

af den enkelte C204-mutant eller ligere vi 1dtypesekvensen 5' I

for Smal-stedet til dannelse af den enkelte R213-mutant. Af de I

I 30 -I

to enkelte ophav, var C204 næsten lige så alkalisk stabil som I

I den dobbelte modermutant (C04/R213) og lidt mere termisk sta- I

I bil, se tabel XXII. R213-mutanten var kun lidt mere stabil end I

vildtypen under begge betingelser (ikke vist). I

I 35 En anden mutant, som var identificeret fra screeningen af den I

I tilfældige cassettemutagenese ved 197-228, var R204. Denne nu- I

tant var mere stabil end vildtypen ved både høj pH-værdi og I

temperatur, men mindre stabil end C204. I

DK 175523 B1 105

TABEL XXII

Subtilisinvarianters stabilitet

Oprensede enzymer (200 pg/ml) blev inkuberet i 0,1 M phosphat, 5 pH-værdi 12 ved 30®C til alkalisk autolyse eller i 2 mM CaCl2· 50 mM MOPS, pH-værdi 7,0 ved 62°C til termisk autolyse. PS forskellige tidspunkter analyseredes prøver for resterende enzymaktivitet. Inaktiveringerne var groft taget pseudo-første ordens, og t 1/2 angiver den tid, som det tog at nå 50¾ af ud-gangsaktiviteten i to separate eksperimenter.

t 1/2 t 1/2 (alkalisk (termisk autolyse) autolyse) 15 Eksp. Eksp. Eksp. Eksp.

Subt i 1 i s i nvariant # 1 tt 2 # 1 tt 2

Vildtype 30 25 20 23 F50/V107/R213 49 41 18 23 20 R204 35 32 24 27 C204 43 46 38 40 C204/R213 50 52 32 36 L204/R213 32 30 20 21 25 G. Tilfældig mutaqenese ved codon 204

Baseret på de ovenstående resultater blev codon 204 målet for tilfældig mutagenese. Mutagene DNA-cassetter (for codon ved 20 204) indeholdt alle en fikseret R213-mutat i on, som viste sig at foroge C204-mutantens stabilitet lidt.

Plasmid-DNA, som koder for subti 1 i si nmutanten C204/R213, blev fordøjet med SstX og EcoRI, og et 1,0 kb EcoRI/SstI-fragment isoleredes ved elektroeluering fra polyacrylamidgel (fragment 35 1, se fig. 35).

C204/R213 blev også fordøjet med Smal og EcoRI, og det 4,7 kb store fragment, indeholdende vektorsekvenser og 3'-delen af

I DK 175523 B1 I

i 106 I

I den kodende region, isoleredes fra 1avtsme1 tende agarose I

I (fragment 2, se fig. 36). I

Fragmenterne 1 og 2 blev kombineret i fire separate trevejsli- I

I g geringer med heterophosphorylerede fragmenter 3 (se figurerne I

I 36 og 37). Denne heterophosphory1 er ing af syntetiske duplexer I

I skulle fortrinsvis drive den phosphorylerede streng ind i I

I plasmidligeringsproduktet. Fire plasmidpuljer, svarende til de I

I fire ligeringer, blev restriktionsbehandlet med Smal for at I

I 10 linearisere enhver enkeltskåret C204/R213, som var til stede I

fra fragment 2-isolering, hvorved baggrunden for C204/R213 I

I reduceredes. E. coli blev derefter gentransformeret med Smal- I

restriktionsbehandlede plasmidpuljer til opnåelse af et andet I

sæt plasmidpul jer, som i alt væsentligt er fri for C204/R213 I

I 15 °9 ethvert ikke-segregeret heteroduplex materiale. I

Disse andengangsberigede plasmidpuljer anvendtes derefter til I

I at transformere B. subtilis (8G2036), og de resulterende fire I

I mutantpuljer blev screenet for kloner, som udtrykte subtili- I

sin, der var modstandsdygtig over for inaktivering ved høj I

I 20 I

pH-værdi/temperatur. Mutanter, som blev fundet positive ved en I

sådan screening, blev yderligere karakteriseret og identifice- I

M ret ved sekvensbestemmelse. I

I Mutanten L204/R213 viste sig at være lidt mere stabil end I

M 25 viIdtypesubti1isinen, se tabel XXII. I

I Efter have beskrevet de foretrukne udfore 1 sesformer af den fo- I

I religgende opfindelse vil det fremgå for fagfolk inden for om- I

rådet, at der kan foretages forskellige modifikationer af de I

I 3Φ beskrevne udførelsesformer og at sådanne modifikationer skal I

I opfattes som værende inden for omfanget af den foreliggende I

I opfindelse. I

I 35 I

Claims (11)

1. Subtilisinmutant, som hidrører fra substitution af mindst én aminosyrerest i en for-5 stadiesubtilisin med en anden aminosyre, således at subtilisinmutanten har mindst en egenskab, som er forskellig fra den samme egenskab hos forstadiesubtilisinen, kendetegnet ved substitutionen ved en eller flere af Tyr21, Thr22, Ser24, Asp36, A!a45, Gly46, Ala48, Ser49, Met50, Asn77, Ser87, Lys94, Val95, Leu96, Ilel 07, GlyllO, Metl24, Lysl70, Tyri71, Prol72, Aspl97, Metl99, Ser204, Lys213, His67, Leul35,

10 Gly97, Seri01, Glyl02, Glul03, Glyl27, Glyl28, Prol29, Tyr214 og Gly215 af Bacib lus amvloliquefaciens-subtilisin og ækvivalente aminosyrerester i andre forsta-diesubtilisiner.

2. Subtilisinmutant, der har en aminosyresekvens, som er afledt fra aminosyresekven-15 sen af en forstadiesubtilisin ved substitution af mere end en aminosyrerest i forstadie- subtilisinens aminosyresekvens med en anden aminosyre, således at subtilisinmutanten har mindst én egenskab, som er forskellig fra den samme egenskab hos forstadiesubtilisinen, kendetegnet ved substitutioner ved mere end én af Tyr21, Thr22, Ser24, Asp32, Ser33, Asp36, Ala45, Ala48, Ser49, Met50, Ser87, Lys94, Val95, Tyri04, Del07,

20 GlyllO, Metl24, Alal52, Asnl55, Glul56, Glyl66, Glyl69, Lysl70, Tyri71, Prol72, Phel89, Aspl97, Metl99, Ser204, Lys213, Tyr217, Ser221, Met222, His67, Leul35, Gly97, Seri01, Glyl02, Glul03, Glyl27, Glyl28, Prol29, Tyr214 og Gly21S af Bacillus amvloliquefaciens-subtilisin og ækvivalente aminosyrerester i andre forstadiesubti-lisiner med det forbehold, at når substitutionen foretages ved enhver rest i gruppen 25 Asp32, Ser 33, Tyr 104, Alal52, Asnl55, Glul56, Glyl66, Glyl69, Phel89, Tyr 217 og Met222, foretages der ligeledes en substitution ved mindst én specificeret stilling, som ikke er i denne gruppe.

3. Mutant ifølge krav 2, hvori kombinationerne er valgt blandt Thr22/Ser87, Ser24/-30 Ser87, Ala45/Ala48, Ser49/Lys94, Ser49/Val95, Met50/Val95, Met50/Gly 110, Met50/- Metl24, Met50/Met222, Metl24/Met222, Tyr21/Thr22, Met50/Metl24/Met222, I DK 175523 B1 I I 108 I I Tyr21 /Thr22/Ser87, Met50/G)ul56/Gly166/ Tyr217, Met50/Glul56/Tyr217, Ilel 70/· I I Lys213, Ser204/Lys213, Met50/Ilel07/Lys213 og Ser24/Met50/Ilel07/Glul56/- I I Gly 166/Gly 169/Ser204/Lys213/Gly215/Tyr217. I I 5 4. Subtilisinmutant hidrørende fra deletion af en eller flere aminosyrerester i en for- I I stadiesubtilisin, der er ækvivalent med 161-164 i B. amvloliquefaciens-subtilisin. hvil- I I ken deletion foretages alene eller i kombination med substitutioner i forstadiesubtilisi- I I nens aminosyresekvens og frembringer mindst én egenskab, som er forskellig fra den I I samme egenskab i forstadiesubtilisinen. I I 10 I

5. Subtilisinmutant med ændret substratspecificitet i sammenligning med en forstadie- I I subtilisin, hvilken mutant hidrører fra substitution af en anden aminosyre i resten sva- I I rende til Leu+126 i B. amvloliquefaciens-subtilisin. alene eller i kombination med an- I dre substitutioner eller deletioner i forstadiesubtilisinens aminosyresekvens. I I 15 I

6. Subtilisinmutant med ændret substratspecificitet i sammenligning med en forstadie- I I subtilisin, hvilken mutant hidrører fra substitution af en anden aminosyre ved resten I svarende til Asp + 99 i B. amvloliquefaciens-subtilisin. alene eller i kombination med I andre substitutioner eller deletioner i forstadiesubtilisinens aminisyresekvens. I

20 I

7. DNA-sekvens, der koder for mutanten ifølge et af de foregående krav. I

8. Ekspressi ons vektor, der indeholder mutant-DNA-sekvensen ifølge krav 7. I 25 9. Værtscelle, der er transformeret med ekspressionsvektoren ifølge krav 8. I

30 I