JP2772295B2 - 非ヒトカルボニルヒドロラーゼ変異体をコードするｄｎａ配列およびベクター並びに前記ベクターで形質転換した宿主細胞 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、変異体のアミノ酸
を誘導するカルボニルヒドロラーゼ前駆体の同一性質と
は異なる少くとも１つの性質を有するカルボニルヒドロ
ラーゼ変異体をコードする変異体ＤＮＡ配列、およびそ
のような変異体ＤＮＡ配列を含む発現ベクター並びにそ
のようなベクターで形質転換した宿主細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】天然存在ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を操作する種々の試験管内技術の最近の発展並び
に一本鎖および二本鎖ＤＮＡの比較的短かい配列の化学
合成における最近の発展はそのような技術が酵素を修飾
して予測可能な方法で若干の機能的性質を改良するのに
使用できることを推測させた。ウルマー（Ulmer, K.
H.)、（１９８３）サイエンス（Science)、２１９、６
６６〜６７１。それに開示された唯一の研究例はチロシ
ルーｔＲＮＡシンテターゼの活性部位内の１つのアミノ
酸の置換（Ｃys３５→Ｓer）であり、それが酵素活性の
低下を生ずる。ウインター（Winter, G.）ほか、（１９
８２）ネーチャ（Nature）、２９９、７５６〜７５８；
およびウイルキンソン（Wilkinson, A.J.)ほか、（１９
８３）バイオケミストリー（Biochemistry) 、２２、３
５８１〜３５８６（Ｃys３５→Ｇly変異もまた低活性を
生じた）参照。

【０００３】活性部位内の異なるアミノ酸残基を２つの
異なるアミノ酸で置換することにより同じｔＲＮＡ合成
を修飾すると変異体の１つ（Ｔhr５１→Ａla）がKcat／
Kmの予期された穏当な上昇を示し、また第２の変異体
（Ｔhr５１→Ｐro）がKcat／Kmの大きな上昇を示し、そ
れは確信をもって説明できなかったことが報告された、
ウイルキンソン（Wilkinson, A.H.)ほか、（１９８４）
ネーチャ（Nature）、３０７、１８７〜１８８。報告さ
れたアミノ酸残基の１部位置換の他の例はＴ４リゾチー
ムの第３残基におけるイソロイシンに対するシスティン
の置換である、ペリー（Perry, L.J.)ほか、（１９８
４）サイエンス（Science)、２２６、５５５〜５５７。
生じた変異体リゾチームは穏やかに酸化して位置３にお
ける新システイン残基と位置９７における天然システイ
ンとの間にジスルフィド結合を形成した。この架橋変異
体は初めに著者により野生型酵素と酵素的に等しいがし
かしそれより熱安定性であると記載された。しかし、
「証拠中に付記された注」中に著者はＣys５４において
遊離チオールを有する変異体リゾチーム野生型リゾチー
ムに等しい熱安定性を有するので観察された高い安定性
がおそらく残基５４におけるシステインの化学修飾に基
くことを示した。

【０００４】同様に、大腸菌（E. coli)からの修飾ジヒ
ドロフォラート還元酵素を類似の方法により修飾してシ
ステインを導入し、それが還元酵素中の天然存在システ
インと架橋できたことが報告された、ビラフランカ（Vi
llafranca, D.E.)ほか、（１９８３）、サイエンス（Sc
ience)、２２２、７８２〜７８８。著者はこの変性体が
還元状態で十分反応性であるが、しかし酸化状態でかな
り低い活性を有することを示している。さらに、低活性
を有するか活性を有さない変異体を生じた特定アミノ酸
残基の他の２つの置換が報告されている。ＥＰＯ公表第
０１３０７５６号にはバシラス・アミロリクエファシエ
ンス（Bacillus amylo-liquefaciens)スブチリシン内の
特定残基の特定アミノ酸による置換が開示されている。
従って、Ｍet２２２が他の１９種のアミノ酸すべてで、
Ｇly１６６が９種の異なるアミノ酸で、Ｇly１６９がＡ
laおよびＳerで置換された。

【０００５】下記のように若干の研究室もまたポリペプ
チド内の１種より多いアミノ酸残基の変異の生成に対す
る特定部位変異誘発の使用を報告した。大腸菌（E. col
i)外層膜のプロリポタンパク質のシグナルペプチドのア
ミノ末端領域がポリペプチドの該領域中に電荷変化を生
ずる残基２および３の置換または欠失により改変される
ことが報告された、イノウエ（Inouye, S.）ほか、（１
９８２）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA)７９、３４３８〜３４４１。同研究室はまたア
ミノ酸残基９および１４を置換および欠失して同一シグ
ナル配列の疎水性領域上の置換の効果を測定したことを
報告している、イノウエ（Inouye, S.）ほか、（１９８
４）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.）、２５９、３７２９〜３７３３。

【０００６】チロシルーｔＲＮＡシンテターゼの活性部
位における２部位変異体もまた報告された、カーター
（Carter, P.J.）ほか、（１９８４）セル（Cell）、３
８、８３５〜８４０。この報告中に、ＡＴＰに対する前
記Ｔhr５１→Ｐro変異体の改良された親和性が酵素の活
性部位中の第２変異の発生により証明された。２部位変
異体の１つ、Ｇly３５／Ｐro５１はそれが２つの１部位
変異体から予想されるよりも良好な遷移状態のＡＴＰに
結合したので予想外の結果を示したと報告された。さら
に著者は少くとも１つの２部位変異体に対して１つの置
換が他の置換により起される効果をいかに変えるかを容
易に予測できないこと、およびそのような置換の解釈に
注意しなければならないことを警告している。米国特許
第4,５３2,２０７号にはポリアルギニン尾部を、ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列の修飾によりβ−ウロガ
ストロンのＣ末端残基に結合させた変異体が開示されて
いる。開示されたように、ポリアルギニン尾が選択的精
製を可能にするウロガストロン−ポリアルギニンハイブ
リッドの電気移動度を変化させた。特許権者によれば次
にポリアルギニンをポリアルギニン特異性エキソペプチ
ダーゼにより除去すると精製ウロガストロンを生じた。
適切に解釈すると、この文献は天然存在ポリペプチドの
１つまたはより多くのアミノ酸の置換、挿入または欠失
を含む変異体ポリペプチドを構成しないハイブリッドポ
リペプチドを開示している。

【０００７】膵臓トリプシンの１および２部位変異体も
また報告された、クレイク（Craik,C.S.)ほか（１９８
５）サイエンス（Science)、２２８、２９１〜２９７。
報告されたように、位置２１６および２２６におけるグ
リシン残基がアラニン残基で置換されて３つのトリプシ
ン変異体（２つの１部位変異体と１つの２部位変異体）
が生成された。１部位変異体の場合に著者はKmに対する
効果の差異を観察することを期待したと述べている。彼
らはその代りに主にKcatの低下の結果であった特異性
（Kcat／Km）の変化を報告している。対照的に２部位変
異体は野生型トリプシンと比較してリシルおよびアルギ
ニルに対するKmの異なる増加を示したが、しかし触媒活
性を事実上有しなかったと報告された。上記参照文献は
単に本出願の提出日前の開示を与え、発明者が先行発明
または先行提出出願に基く優先権によってそのような開
示に先行する資格がないことを認めるものと解すべきで
はない。

【０００８】しかし、上記文献に基くと、野生型酵素の
アミノ酸配列の修飾が生物活性をしばしば低下または破
壊することが明らかである。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は変異
体のアミノ酸を誘導するカルボニルヒドロラーゼ前駆体
の同一性質とは異なる少くとも１つの性質を有するカル
ボニルヒドロラーゼ変異体を提供することである。さら
に本発明の目的はそのようなカルボニルヒドロラーゼ変
異体をコードする変異体ＤＮＡ配列、およびそのような
変異体ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供することで
ある。さらに他の本発明の目的はそのようなベクターで
形質転換した宿主細胞、並びにそのような変異体を細胞
内または細胞外に発現できる宿主細胞を提供することで
ある。

【００１０】本発明には、好ましくは変異体のアミノ酸
配列を誘導する前駆体非ヒトカルボニルヒドロラーゼの
同性質とは実質的に異なる少くとも１つの性質を有する
カルボニルヒドロラーゼ変異体が含まれる。これらの性
質には酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、
アルカリ安定性、 pＨ活性プロフィルおよびタンパク質
分解劣化耐性が含まれる。前駆体カルボニルヒドロラー
ゼは天然存在カルボニルヒドロラーゼまたは組換え体カ
ルボニルヒドロラーゼであることができる。カルボニル
ヒドロラーゼ変異体のアミノ酸配列は前駆体カルボニル
ヒドロラーゼアミノ酸配列の１つまたはそれ以上のアミ
ノ酸の置換、欠失または挿入により誘導される。また本
発明には、そのようなカルボニルヒドロラーゼ変異体を
コードする変異体ＤＮＡ配列が含まれる。さらに本発明
は、そのような変異体ＤＮＡ配列を含む発現ベクター、
並びにそのうよなベクターで形質転換され、前記カルボ
ニルヒドロラーゼ変異体を発現できる宿主細胞が含まれ
る。

【００１１】図１はバシラス・アミロリクエファシエン
ス（B. amyloliquefaciens) スブチリシン遺伝子のアミ
ノ酸配列に関連するコーディング鎖のヌクレオチド配列
を示す。ＤＮＡ配列のプロモーター（ｐ）リボソームの
結合部位（rbs)および終結（term）領域、並びにヒドロ
ラーゼのプレシーケンス（presequence)（ＰＲＥ）、推
定プロシーケンス（prosequence)（ＰＲＯ）および成熟
形態（ＭＡＴ）をコードする配列もまた示される。図２
はスブチリシンの基質結合クレフト並びに基質を示す略
図である。図３は２つの異なる方法で部位に結合したリ
シンＰ−１基質を示すバシラス・アミロリクエファシエ
ンスのＳ−１結合サブサイトの立体図である。図３Ａは
位置１５６でＧluと結合して塩橋を形成したリシンＰ−
１基質を示す。図３Ｂは位置１６６でＧluと結合して塩
橋を形成したリシンＰ−１基質を示す。

【００１２】図４はスブチリシンＡsp３２、Ｈis６４お
よびＳer２２１の活性部位の略図である。図５〜図８は
種々の源から得られたスブチリシンのアミノ酸配列を示
す。バシラス・アミロリクエファシエンススブチリシン
の各残基の直下の残基は（１）バシラス・アミロリクエ
ファシエンススブチリシンについて記載されると同様の
方法で変異できるか、または（２）バシラス・アミロリ
クエファシエンススブチリシン中の置換アミノ酸残基と
して使用できる等価残基である。図９は他のスブチリシ
ン配列と比較したバシラス・アミロリクエファシエンス
スブチリシンの保存残基（conserved residue)を示す。
図１０および図１１は種々の有機酸化剤にさらしたとき
の変異体Ｍet２２２ＬおよびＭet２２２Ｑの失活を示
す。

【００１３】図１２はＭet２２２Ｆスブチリシンの紫外
スペクトルおよびジペルドデカン酸（diperdodecanoica
cid ）（ＤＰＤＡ）によるし失活後に生じた差スペクト
ルを示す。図１３は高分解能ＳＤＳ−ピリジンペプチド
ゲル上の未処理およびＤＰＤＡ酸化スブチリシンＭet２
２２Ｆのブロモシアン消化のパターンを示す。図１４は
図１３のブロモシアンフラグメントの地図およびスブチ
リシンＭet２２２Ｆの配列と並べた配列を示す。図１５
はバシラス・アミロリクエファシエンススブチリシンの
コドン４５〜５０間の変異の構築を示す。図１６はバシ
ラス・アミロリクエファシエンススブチリシンのコドン
１２２〜１２７間の変異の構築を示す。

【００１４】図１７はスブチリシンＭet２２２Ｆ中の位
置５０および１２４におけるスブチリシン変異体の活性
に対するＤＰＤＡの効果を示す。図１８はバシラス・ア
ミロリクエファシエンススブチリシンのコドン１６６に
おける変異の構築を示す。図１９は野生型バシラス・ア
ミロリクエファシエンススブチリシンの動力学的パラメ
ーターに及ぼすＰ−１基質側鎖の疎水性の効果を示す。
図２０はＰ−１基質特異性に及ぼす位置１６６側鎖の効
果を示す。図２０（Ａ）は分子容の増加する順序に配列
した非枝分れアルキルおよび芳香族側鎖置換を含む位置
１６６変異体スブチリシンを示す。図２０（Ｂ）は分子
容増加をβ−およびγ−枝分れ脂肪族側鎖置換により進
行させた一連の変異体酵素を示す。

【００１５】図２１は種々のＰ−１基質についてのlog
Kcat／Kmに対する位置１６６側鎖容積の効果を示す。図
２２は一連の脂肪族および芳香族基質に対するＩle１６
６および野生型（Ｇly１６６）バシラス・アミロリクエ
ファシエンススブチリシン間の基質特異性の差を示す。
各バーはＩle１６６−野生型（Ｇly１６６）スブチリシ
ンに対するlog Kcat／Kmの差を示す。図２３はバシラス
・アミロリクエファシエンススブチリシンのコドン１６
９における変異の構築を示す。図２４はバシラス・アミ
ロリクエファシエンススブチリシンのコドン１０４にお
ける変異の構築を示す。

【００１６】図２５はバシラス・アミロリクエファシエ
ンススブチリシンのコドン１５２における変異の構築を
示す。図２６はバシラス・アミロリクエファシエンスス
ブチリシンのコドン１５６における１部位変異並びにコ
ドン１５６および１６６における２部位変異の構築を示
す。図２７はバシラス・アミロリクエファシエンススブ
チリシンに対するコドン２１７における変異の構築を示
す。図２８はバシラス・アミロリクエファシエンススブ
チリシン中のコドン１５６および１６６における変異に
対するKcat／Km対 pＨプロフィルを示す。図２９はバシ
ラス・アミロリクエファシエンススブチリシン中のコド
ン２２２における変異に対するKcat／Km対 pＨプロフィ
ルを示す。

【００１７】図３０はコドン９４、９５および９６にお
ける変異体の構築を示す。図３１および図３２は種々の
野生型および変異体のスブチリシンの種々の基質に対す
る基質特異性を示す。図３３Ａ、Ｂ、および図３４Ｃ、
Ｄはコドン１５６および１６６における置換に基くＰ−
１結合部位における電荷の効果を示す。図３５はスブチ
リシンＢＰＮ′のＰ−１結合部位の立体図であり、２方
法で部位に結合したリシンＰ−１基質を示す。図３５
（Ａ）におけるリシンＰ−１基質はコドン１５６におい
てＧluと塩橋を形成する。図３５（Ｂ）においてリシン
Ｐ−１基質はコドン１６６においてＧluと塩橋を形成す
る。図３６は精製野生型（パネルＡ）、Ｃ２２／Ｃ８７
（パネルＢ）およびＣ２４／Ｃ８７（パネルＣ）に対す
る残留酵素活性対温度曲線を示す。

【００１８】図３７はα−チオールデオキシヌクレオチ
ド三リン酸の誤取込によるスブチリシンコーディング配
列における点変異を生成させる方策を示す。図３８は精
製野生型並びに変異体スブチリシン１７０Ｅ、１０７
Ｖ、２１３Ｒおよび１０７Ｖ／２１３Ｒのアルカリ性 p
Ｈにおける自己消化安定性を示す。図３９は精製野生型
並びに変異体スブチリシンＶ５０、Ｆ５０およびＦ５０
／Ｖ１０７／Ｒ２１３のアルカリ性 pＨにおける自己消
化安定性を示す。

【００１９】図４０は残基１９７〜２２８にわたるラン
ダムカセット変異誘発を含むプラスミドを構築する方策
を示す。図４１は残基１９７〜２２８にわたるランダム
カセット変異誘発に用いるオリゴデオキシヌクレオチド
を示す。図４２はコドン２０４における変異体の構築を
示す。図４３はコドン２０４における変異体の合成に用
いるオリゴデオキシヌクレオチドを示す。

【００２０】

【課題を解決するための手段】発明者は非ヒトカルボニ
ルヒドロラーゼアミノ酸配列内の１つまたはそれ以上の
アミノ酸の置換、欠失または挿入を含む種々の１または
多部位試験管内変異が非変異カルボニルヒドロラーゼに
比較すると有利な性質をそのような変異体に与えること
ができることを見出した。特定的にはバシラス・アミロ
リクエファシエンススブチリシン、アルカリ性細菌プロ
テアーゼを、スブチリシンをコードするＤＮＡをスブチ
リシン分子の成熟形態内の種々のアミノ酸残基における
１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換をコードするよう
に修飾することにより変異させた。これらの試験管内変
異体スブチリシンは前駆体スブチリシンの同一性質に比
べると異なる少なくとも１つの性質を有する。これらの
修飾された性質は酸化安定性、基質特異性、熱安定性、
アルカリ安定性、触媒活性、 pＨ活性プロフィル、タン
パク質分解劣化に対する耐性、Km、KcatおよびKm／Kcat
比を含むいくつかの範疇に属する。

【００２１】

【発明の実施の形態】カルボニルヒドロラーゼはＣＯ−
Ｘ（式中、Ｘは酸素または窒素である）結合を含む化合
物を加水分解する酵素である。それには天然存在カルボ
ニルヒドロラーゼおよび組換え体ヒドロラーゼが含まれ
る。天然存在ヒドロラーゼは主に加水分解酵素例えばリ
パーゼおよびペプチド加水分解酵素例えばスブチリシン
またはメタロプロテアーゼが含まれる。ペプチド加水分
解酵素にはα−アミノアセチルペプチド加水分解酵素、
ペプチジルアミノ−酸加水分解酵素、アシルアミノ加水
分解酵素、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカル
ボキシペプチダーゼ、チオールプロティナーゼ、カルボ
キシルプロティナーゼおよびメタロプロティナーゼが含
まれる。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアー
ゼはまたエンドおよびエキソープロテアーゼに含まれ
る。

【００２２】「組換え体カルボニルヒドロラーゼ」は天
然存在カルボニルヒドロラーゼをコードするＤＮＡ配列
を修飾されカルボニルヒドロラーゼアミノ酸配列中の１
つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を
コードする変異体ＤＮＡ配列を生成するカルボニルヒド
ロラーゼを意味する。適当な修飾法は本明細書および１
９８５年１月９日に公表されたＥＰＣ公表第０１３０７
５６号に開示されている。スブチリシンは一般にタンパ
ク質またはペプチドのペプチド結合を開裂する作用をす
る細菌カルボニルヒドロラーゼである。ここに用いる
「スブチリシン」は天然存在スブチリシンまたは組換え
体スブチリシンを示す。一連の天然存在スブチリシンが
種々の細菌種により生成され、しばしば分泌されること
が知られている。この系列のもののアミノ酸配列は完全
には相同性ではない。しかしこの系列中のスブチリシン
は同型または類似の型のタンパク質分解活性を示す。こ
の種のセリンプロテアーゼはキモトリプシン関連種のセ
リンプロテアーゼと識別される触媒３回対称軸を規定す
る普通のアミノ酸配列を共有する。スブチリシンおよび
キモトリプシン関連セリンプロテアーゼの両者はアスパ
ラギン酸、ヒスチジンおよびセリンを含む触媒３回対称
軸を有する。スブチリシン関連プロテアーゼ中のこれら
のアミノ酸の相対順序はアミノ末端からカルボキシ末端
へ読んでアスパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。
しかしキモトリプシン関連プロテアーゼにおける相対順
序はヒスチジン−アスパンギン酸−セリンである。従っ
てスブチリシンは本明細書でスブチリシン関連プロテア
ーゼの触媒３回対称軸を有するセリンプロテアーゼを示
す。

【００２３】「組換え体スブチリジン」はスブチリジン
をコードするＤＮＡ配列が修飾されて天然存在スブチリ
シンアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸の
置換、欠失または挿入をコードする変異体ＤＮＡ配列を
生成するスブチリシンを示す。そのような修飾を生ずる
適当な方法には本明細書およびＥＰＯ公表第０１３０７
５６号に開示されるものが含まれる。例えば、アミノ酸
残基５０、１２４および２２２におけるメチオニンのそ
れぞれフェニルアラニン、イソロイシンおよびグルタミ
ンによる置換を含むスブチリシン多部位変異体はＥＰＯ
公表第０１３０７５６号中に開示された残基２２２にお
けるグルタミンの置換を含む組換え体スブチリシン（Ｑ
２２２）から誘導されると考えることができる。従って
多部位変異体はＱ２２２組換え体スブチリシン中の残基
５０におけるメチオニンに対するフェニルアラニンおよ
び残基１２４におけるメチオニンに対するイソロイシン
の置換により生成される。

【００２４】「カルボニルヒドロラーゼ」およびそれら
の遺伝子は多くの原核および真核生物から得ることがで
きる。原核生物の適当な例にはグラム陰性菌例えば大腸
菌またはシュードモナス、およびグラム陽性菌例えばミ
クロコッカスまたはバシラスが含まれる。カルボニルヒ
ドロラーゼおよびそれらの遺伝子を得ることができる真
核生物の例には酵母例えばサッカロミセス・セレビシェ
（S. cerevisiae)、真菌例えばアスペルギルス・スプ
（Aspergillus sp.)および非ヒト哺乳動物源例えばカル
ボニルヒドロラーゼキモシンをコードする遺伝子を得る
ことができるボビン・スプ（Bovine sp.）が含まれる。
スブチリシンと同様に、一連のカルボニルヒドロラーゼ
はその系列の員間で完全に相同性でないアミノ酸配列を
有するが、しかし同型または類似型の生物活性を示す種
々の関連種から得ることができる。従って、用いる非ヒ
トカルボニルヒドロラーゼは原核および非ヒト真核源と
直接または間接的に関連するカルボニルヒドロラーゼを
示す機能的規定を有する。

【００２５】「カルボニルヒドロラーゼ変異体」は非ヒ
ト「前駆体カルボニルヒドロラーゼ」のアミノ酸配列か
ら誘導されるアミノ酸配列を有する。前駆体カルボニル
ヒドロラーゼには天然存在カルボニルヒドロラーゼおよ
び組換え体カルボニルヒドロラーゼが含まれる。カルボ
ニルヒドロラーゼ変異体のアミノ酸配列は前駆体ヒドロ
ラーゼアミノ酸配列から前駆体アミノ酸配列の１つまた
はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入により
「誘導」される。そのような修飾は前駆体カルボニルヒ
ドロラーゼ自体の操作よりもむしろ前駆体カルボニルヒ
ドロラーゼのアミノ酸配列をコードする「前駆体ＤＮＡ
配列」である。前駆体ＤＮＡ配列のそのような操作の適
当な方法は本明細書およびＥＰＣ公表第０１３０７５６
号に開示される方法が含まれる。バシラス・アミロリク
エファシエンススブチリシンの特定の残基は置換、挿入
または欠失について確認される。これらのアミノ酸位置
番号は図１に示すバシラス・アミロリクエファシエンス
スブチリシン配列に帰属されるものを示す。しかし本発
明はこの特定スブチリシンの変異に限定されず、バシラ
ス・アミロリクエファシエンススブチリシン中の個々の
確認された残基と「等価」のアミノ酸残基を含む前駆体
カルボニルヒドロラーゼに拡大される。

【００２６】前駆体カルボニルヒドロラーゼの残基（ア
ミノ酸）は、それがバシラス・アミロリクエファシエン
ススブチリシン中の特定残基またはその残基の部分に対
し相同性（すなわち一次または三次構造中の位置に相当
する）または類似であればバシラス・アミロリクエファ
シエンススブチリシンの残基と等価である（すなわち、
結合、反応または相互作用に対し化学的に同一または類
似の機能能力を有する）。一次構造に対する相同性を確
認するために、前駆体カルボニルヒドロラーゼのアミノ
酸配列をバシラス・アミロリクエファシエンススブチリ
シン一次配列と、殊に配列が知られたすべてのスブチリ
シン中に不変であると知られた一組の残基と直接対比す
る。保存残基を並べ、配列を維持（すなわち任意の欠失
および挿入による保存残基の排除を回避）して必要な挿
入および欠失を許した後、バシラス・アミロリクエファ
シエンスの一次配列中の個々のアミノ酸に等価の残基が
規定される。保存残基の配列は好ましくはそのような残
基の１００％を保存すべきである。しかし、７５％以上
または５０％程度の保存残基の配列もまた等価の残基を
規定するのに適する。触媒３回対称軸Ａsp３２／Ｈis６
４／Ｓer２２１の保存は維持されるべきである。

【００２７】例えば図５及び図６においてバシラス・ア
ミロリクエファシエンス、バシラス・サチシン（B. Sub
tilisin) varＩ１６８およびバシルス・リシエニフォル
ミス（B. licheniformis) (carls-bergensis）のアミノ
酸配列を並べてアミノ酸配列間に最大量の相同を与え
る。これらの配列を比較し各配列中に含まれる多くの保
存残基があることが示される。これらの残基は図９中で
確認される。従ってこれらの保存残基を用いて他のカル
ボニルヒドロラーゼ例えばサーモアクチノマイセス（Th
ermoactinomyces)から誘導されるサーミターゼ中の相当
するバシラス・アミロリクエファシエンスの等価アミノ
酸残基を規定することができる。これらの２つの特定配
列は図７及び図８に保存残基の最大相同を生ずるように
配列されている。知見できるように、バシラス・アミロ
リクエファシエンススブチリシンに比較してサーミター
ゼ配列中に多くの挿入および欠失がある。従ってサーミ
ターゼにおけるバシラス・アミロリクエファシエンスス
ブチリシン中のＴyr２１７の等価アミノ酸はＴyr２１７
の下に示される特定のリシンである。

【００２８】図５及び図６中のバシラス・アミロリクエ
ファシエンススブチリシン中の位置２１７における等価
アミノ酸はＴyrである。同様にバシラス・サチリススブ
チリシンにおいて位置２１７はまたＴyrにより占められ
ているが、しかしバシラス・リシエニフォルミスにおい
て位置２１７はＬeuにより占められている。従って、サ
ーミターゼ並びにバシラス・サチリスおよびバシラス・
リシエニフォルミスのスブチリシン中のこれらの特定残
基を、一次構造においてバシラス・アミロリクエファシ
エンススブチリシン中のＴyr２１７に等しいので異なる
アミノ酸により置換して変異体カルボニルヒドロラーゼ
を生成させることができる。等価アミノ酸はもちろん、
Ｔyr２１７に対するものに限定されず、保存であっても
なくてもバシラス・アミロリクエファシエンス中の残基
に等価の任意の残基に拡大される。

【００２９】三次構造がＸ線結晶学により決定された前
駆体カルボニルヒドロラーゼに対する三次構造の水準で
相同性の等価残基は、前駆体カルボニルヒドロラーゼお
よびバシラス・アミロリクエファシエンススブチリシン
の特定アミノ酸残基の主鎖原子（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣ
Ａ、Ｃ上のＣおよびＯ上のＯ）の２つまたはそれ以上の
原子座標が配列後0.１３nm、好ましくは0.１nm内にある
ものと規定される。配列は最良モデルを配向し、問題の
カルボニルヒドロラーゼの非水素タンパク質原子の原子
座標のバシラス・アミロリクエファシエンススブチリシ
ンに対して最大重なりを与えるように配置した後に行な
われる。最良モデルは利用できる最高分解能における試
験回折データに対する最小Ｒ因子を与える結晶学モデル
である。 Ｒ因子＝Σｈ｜Fo(h) ｜−｜Fc(h) ｜／Σｈ｜Fo(h) ｜ バシラス・アミロリクエファシエンススブチリシンの特
定残基に機能的に類似する等価残基は、記載されるバシ
ラス・アミロリクエファシエンススブチリシンの特定残
基を規定し、それに寄与するようにタンパク質構造、基
質結合または触媒作用が改変、修飾されまたはそれに寄
与するように配座を適応できる前駆体カルボニルヒドロ
ラーゼのアミノ酸と規定される。さらに、それらは前駆
体カルボニルヒドロラーゼの残基であり（その三次構造
はＸ線結晶学により得られた）、それは所与残基の主鎖
原子が相同位置を占める基準に対する等価の基準を満た
さないかもしれないが、残基の側鎖原子の少くとも２つ
の原子座標がバシラス・アミロリクエファシエンススブ
チリシンの相当する側鎖原子の0.１３nmである範囲で類
似の位置を占める。三次元構造は前記のように配列され
よう。

【００３０】置換、挿入または欠失に対して確認される
残基の若干は保存残基であり、他はそうではない。保存
されない残基の場合に、１つまたはそれ以上のアミノ酸
の置換は天然に見出されるものに相当しないアミノ酸配
列を有する変異体を生ず置換に限定される。保存残基の
場合には、そのような置換が天然存在配列を生ずるべき
ではない。本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体には
成熟形態のカルボニルヒドロラーゼ変異体並びにそのよ
うなヒドロラーゼ変異体のプロおよびプレプロ形態が含
まれる。プレプロ形態はこれがカルボニルヒドロラーゼ
変異体の発現、分泌、成熟を促進するので好ましい構造
である。カルボニルヒドロラーゼ変異体の「プレプロ」
形態はヒドロラーゼのアミノ末端に作用可能に結合され
たプロシーケンス（prosequence)を有する成熟形態のヒ
ドロラーゼおよびプロシーケンスのアミノ末端に作用可
能に結合した「プレ」または「シグナル」配列からな
る。

【００３１】「発現ベクター」は適当な宿主中の前記Ｄ
ＮＡの発現を行なうことができる適当な制御配列に作用
可能に連結したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構造を示す。そ
のような制御配列には転写を行なうプロモーター、その
ような転写を制御する適宜のオペレーター配列、適当な
ｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに
転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。ベク
ターはプラスミド、ファージ粒子または単なる潜在遺伝
子挿入体であることができる。適当な宿主中に形質転換
されると、ベクターは宿主ゲノムとは無関係に複製し、
機能することができ、あるいは若干の場合に、ゲノム自
体中へ統合することができる。本明細書において、プラ
スミドが現在最も普通に使用されるベクターの形態であ
るので、「プラスミド」および「ベクター」はときには
互換的に使用される。しかし、本発明は等価機能をな
し、技術的に知られているかまたは知られるようになる
他の形態の発現ベクターを含ませている。

【００３２】本発明に用いる「宿主細胞」は一般に、好
ましくはＥＰＯ公表第０１３０７５６号に開示された方
法により操作して酵素活性エンドプロテアーゼの分泌を
不能にした原核または真核宿主である。スブチリシンの
発現に好ましい宿主細胞は酵素活性の中性プロテアーゼ
およびアルカリ性プロテアーゼ（スブチリシン）を欠失
したバシラス株ＢＧ２０３６である。株ＢＣ２０３６の
構造はＥＰＯ公表第０１３０７５６号に詳細に記載さ
れ、さらにヤング（Yang, M.Y.）ほか、（１９８４）ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.)、
１６０、１５〜２１に記載されている。スブチリシンを
発現する他の宿主細胞にはバシラス・サチルス１１６８
が含まれる（ＥＰＯ公表第０１３０７５６号）。宿主細
胞は組換えＤＮＡ技術を用いて構築したベクターで形質
転換またはトランスフェクションされる。そのような形
質転換宿主細胞はカルボニルヒドロラーゼ変異体をコー
ドするベクターの複製または所望のカルボニルヒドロラ
ーゼ変異体を発現することができる。カルボニルヒドロ
ラーゼ変異体のプレまたはプレプロ形態をコードとする
ベクターの場合には、発現されるとそのような変異体は
典型的には宿主細胞から宿主細胞倍地中へ分泌される。

【００３３】２つのＤＮＡ領域間の関係を記載するとき
の「作用可能に結合した」という語は単にそれらが相互
に機能的に関連することを意味する。例えばプレシーケ
ンスはシグナル配列として、殊におそらくシグナル配列
の開裂を含み成熟形態のタンパク質の分泌中に機能すれ
ばペプチドに作用可能に結合している。プロモーター
は、配列の転写を制御すればコーディング配列に作用可
能に結合し、リボソーム結合部位は翻訳可能に位置すれ
ばコーディング配列に作用可能に結合している。天然存
在前駆体カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子は
ＥＰＯ公表第０１３０７５６号中のここに記載された一
般法によって得ることができる。カルボニルヒドロラー
ゼ遺伝子をクローン化した後、多くの修飾を行なって天
然存在前駆体カルボニルヒドロラーゼの合成以上に遺伝
子の使用を高める。そのような修飾にはＥＰＯ公表第０
１３0,７５６号に開示された組換え体カルボニルヒドロ
ラーゼの生成およびここに記載するカルボニルヒドロラ
ーゼ変異体の生成が含まれる。本発明のカルボニルヒド
ロラーゼ変異体はクローン化した前駆体カルボニルヒド
ロラーゼの特定部位変異誘発〔スミス（Smith, M.)、
（１９８５）アニュアル・レビュー・オブ・ジネティッ
クス（Ann. Rev. Genet.）、４２３；ゼーラー（Zoelle
r, M.J.)、ほか、（１９８２）ニュークリーク・アシッ
ド・リサーチ（Nucleic Acid Res.)、１０、６４８７〜
６５００〕、カセット変異誘発（ＥＰＯ公表第０１２0,
７５６号）またはランダム変異誘発〔ショートル（Shor
tle, D.)ほか、（１９８５）ジネティックス（Genetic
s) 、１１０、５３９；ショートル（Shortle, D.)ほ
か、（１９８６）プロテインズ：ストラクチャー・ファ
ンクション・アンド・ジネティックス（Proteins：Stru
cture, Function and Genetics)、１、８１；ショート
ル（Shortle, D.)、（１９８６） J. Cell Biochem. 、
３０、２８１；アルバー（Alber, T.)ほか、（１９８
５）プロシーデイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. of Sc
i.)、８２、７４７；マツムラ（Matsumura, M.)ほか、
（１９８５）ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（J. Biochem.)、２６０、１５２９８；リアオ（Liao,
H.）ほか、（１９８６）プロシーデイング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Na
tl. Acad. of Sci.)、８３、５７６〕により発生させる
ことができる。ここに開示されるカセット変異誘発およ
びランダム変異誘発法が好ましい。

【００３４】適当な宿主の形質転換で発現された変異体
カルボニルヒドロラーゼは前駆体カルボニルヒドロラー
ゼの性質とは実質的に異なる１つまたはそれ以上の性
質、例えば基質特異性、酸化安定性、熱安定性、アルカ
リ安定性、タンパク質分解劣化耐性、 pＨ活性プロフィ
ルなどの変化を示す酵素についてスクリーンする。基質
特異性の変化は前駆体カルボニルヒドロラーゼのKcat／
Km比とヒドロラーゼ変異体のそれとの間の差異と規定さ
れる。Kcat／Km比は触媒効率の尺度である。高または低
Kcat／Kmを有するカルボニルヒドロラーゼ変異体が実施
例に記載される。一般に、目的は所与基質に対する大き
い（数値上大きい）Kcat／Kmを有する変異体を得、それ
により標的基質に一層有効に作用する酵素の使用を可能
にすることである。Kcat／Km比の実質的な変化は、好ま
しくは少なくとも２倍の増大または減少である。しか
し、該比の小さい増大または減少（例えば少なくとも1.
５倍）もまたかなりであると思われる。１つの基質に対
するKcat／Km比の増加は他の基質に対してKcat／Km比の
低下を伴なうことができる。これは基質特異性のシフト
であり、そのようなシフトを示す変異体は前駆体ヒドロ
ラーゼが望ましくない場合に、例えば基質の混合物中の
特定基質の望ましくない加水分解を防ぐ効力を有する。
KmおよびKcatは例えばＥＰＯ公表第０１３０７５６号に
記載された公知手順に従い、またはここに記載するよう
に測定される。

【００３５】酸化安定性は公知手順または後記方法によ
り測定される。酸化安定性の実質的な変化は種々の酸化
条件にさらしたときの酵素活性の喪失速度の少なくとも
５０％の増加または低下（好ましくは低下）により証明
される。そのような酸化条件は実施例に記載される条件
下の有機酸化剤ジペルドデカン酸（ＤＰＤＡ）に対する
暴露である。アルカリ安定性は公知手順またはここに記
載する方法により測定される。アルカリ安定性の実質的
な変化は前駆体カルボニルヒドロラーゼに比較したとき
の変異体の酵素活性の半減期の少くとも約５％またはそ
れ以上の増加または低下（好ましくは増加）により証明
される。スブチリシンの場合にアルカリ安定性はアルカ
リ性 pＨ例えば0.１Ｍリン酸ナトリウム、 pＨ１２で２
５または３０℃においてスブチリシンの自己タンパク質
分解劣化の関数として測定した。

【００３６】熱安定性は公知手順またはここに記載され
る方法により測定される。熱安定性の実質的な変化は比
較的高い温度で中性 pＨにさらしたときの前駆体カルボ
ニルヒドロラーゼに比較した変異体の触媒活性の半減期
の少くとも約５％またはそれ以上の増加または低下（好
ましくは増加）により証明される。スブチリシンの場合
に熱安定性は比較的高い温度および pＨ、例えば２mM塩
化カルシウム、５０mM−ＭＯＰＳ、 pＨで、５０℃にお
けるスブチリシンの自己タンパク質分解劣化により測定
される。発明者は表Ｉに示すバシラス・アミロリクエフ
ァシエンススブチリシンのアミノ酸残基の置換を含む変
異体スブチリシンを生成させた。バシラス・アミロリク
エファシエンススブチリシンの野性型アミノ酸配列およ
びＤＮＡ配列は図１に示される。

【００３７】

【表１】 表 Ｉ 残基 置 換 ア ミ ノ 酸 Ｔyr２１ F A Ｔhr２２ C Ｓer２４ C Ａsp３２ N Q S Ｓer３３ A T Ａsp３６ A G Ｇly４６ V Ａla４８ E V R Ｓer４９ C L Ｍet５０ C F V Ａsn７７ D Ｓer８７ C Ｌys９４ C Ｖal９５ C Ｔyr１０４ A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Ｉle１０７ V Ｇly１１０ C R Ｍet１２４ I L Ａla１５２ G S Ａsn１５５ A D H Q T Ｇlu１５６ Q S Ｇly１６６ A C D E F H I K L M N P Q R S T V W Y Ｇly１６９ A C D E F H I K L M N P Q R S T V W Y Ｌys１７０ E R Ｔry１７１ F Ｐro１７２ E Q Ｐhe１８９ A C D E G H I K L M N P Q R S T V W Y Ａsp１９７ R A Ｍet１９９ I Ｓer２０４ C R L P Ｌys２１３ R T Ｔyr２１７ A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Ｓer２２１ A C Ｍet２２２ A C D E F G H I K L N P Q R S T V W Y 置換した種々のアミノ酸は次の１文字表示により表Ｉに
示されている： アミノ酸またはその残基 ３文字記号 １文字記号 アラニン Ａla Ａ グルタミン酸 Ｇlu Ｅ グルタミン Ｇln Ｑ アスパラギン酸 Ａsp Ｄ アスパラギン Ａsn Ｎ ロイシン Ｌeu Ｌ グリシン Ｇly Ｇ リシン Ｌys Ｋ セリン Ｓer Ｓ バリン Ｖal Ｖ アルギニン Ａrg Ｒ トレオニン Ｔhr Ｔ プロリン Ｐro Ｐ イソロイシン Ｉle Ｉ メチオニン Ｍet Ｍ フェニルアラニン Ｐhe Ｆ チロシン Ｔyr Ｙ システイン Ｃys Ｃ トリプトファン Ｔrp Ｗ ヒスチジン Ｈis Ｈ 文脈によって特に示される場合を除き、野生型アミノ酸
は上記３文字記号により示され、置換アミノ酸は上記１
文字記号により示される。従ってバシラス・アミロリク
エファシエンススブチリシン中の残基５０におけるメチ
オニンがフェニルアラニンにより置換されれば、この変
異（変異体）はＭet５０ＦまたはＦ５０と示すことがで
きる。同様の表示が多部位変異体に使用される。

【００３８】表Ｉ中に開示した残基の置換に用いたアミ
ノ酸に加えて、これらの残基における他のアミノ酸の置
換は有用な性質を有する変異体スブチリシンを生ずるこ
とが期待される。これらの残基および置換アミノ酸は表
IIに示される。

【００３９】

【表２】表 II 残基 置換アミノ酸 Ｔyr−２１ Ｌ Ｔhr２２ Ｋ Ｓer２４ Ａ Ａsp３２ Ｓer３３ Ｇ Ｇly４６ Ａla４８ Ｓer４９ Ｍet５０ Ｌ Ｋ Ｉ Ｖ Ａsn７７ Ｄ Ｓer８７ Ｎ Ｌys９４ Ｒ Ｑ Ｖal９５ Ｌ Ｉ Ｔyr１０４ Ｍet１２４ Ｋ Ａ Ａla１５２ Ｃ Ｌ Ｉ Ｔ Ｍ Ａsn１５５ Ｇlu１５６ Ａ Ｔ Ｍ Ｌ Ｙ Ｇly１６６ Ｇly１６９ Ｔyr１７１ Ｋ Ｒ Ｅ Ｑ Ｐro１７２ Ｄ Ｎ Ｐhe１８９ Ｔyr２１７ Ｓer２２１ Ｍet２２２ 表Ｉ中の各変異体スブチリシンはバシラス・アミロリク
エファシエンスアミノ酸配列の１部位残基の置換を含
む。これらの特定の残基はそのような置換のバシラス・
アミロリクエファシエンススブチリシンの種々の性質に
及ぼす影響を証明するために選んだ。

【００４０】従って、Ｍet１２４およびＭet２２２が他
のアミノ酸で置換すれば高い酸化安定性を有する変異体
スブチリシンを生ずる重要な残基と認められた。Ｍet１
２４の代りにＬeuおよびＩleが好ましい置換アミノ酸で
ある。Ｍet２２２の置換に対する好ましいアミノ酸はＥ
ＰＯ公表第０１３０７５６号に開示される。種々の他の
特定残基もまた基質特異性に関して重要であると確認さ
れた。これらの残基にはＴyr１０４、Ａla１５２、Ｇlu
１５６、Ｇly１６６、Ｇly１６９、Ｐhe１８９およびＴ
hy２１７が含まれ、その異性体には表Ｉに示される種々
の置換アミノ酸並びにそれに対するまだ変異体が作られ
ていない他の残基が含まれる。これらの残基の確認は変
異体がまだ作られていないものを含めて、1.８Ａまでの
バシラス・アミロリクエファシエンススブチリシンの発
明者の高分解結晶構造（表III 参照）、スブチリシンの
試験管内変異誘発による試験およびスブチリシンに関す
る文献値に基く。共有結合したペプチド阻害剤〔ロバー
タス（Robertus, J.D.) ほか、（１９７２）バイオケミ
ストリー（Biochemistry）、１１、２４３９〜２４４
９〕、生成物複合体〔ロバータス（Robertus, J.D.) ほ
か、（１９７２）バイオケミストリー（Biochemistr
y）、１１、４２９３〜４３０３〕および遷移状態類似
体〔マトーズ（Mattews, D.A.)ほか、（１９７５）ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Bio
l. Chem.）、２５０、７１２０〜７１２６；ポウロス
（Poulos, T.L.）ほか、（１９７６）ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、
２５１、１０９７〜１１０３〕を含むスブチリシンのＸ
線結晶構造はスブチリシン中の拡大ペプチド結合クレフ
トの確認に役立った。この基質結合クレフト並びに基質
はシェヒター（Schechter, I.)ほか、（１９６７）バイ
オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーションズ（Biochem. Bio. Res. Commun)、２
７、１５７の命名法に従って図２に略示される。基質中
の切断性結合（scissle bond）は矢印により確認され
る。ＰおよびＰ′表示はそれぞれ切断性結合に関するア
ミノまたはカルボキシ末端に向って位置するアミノ酸を
示す。ＳおよびＳ′表示は相応する基質アミノ酸残基と
相互作用するスブチリシンの基質結合クレフト中のサブ
サイトを示す。

【００４１】

【表３】 表III １．８Ａ分割能に対するバシラス・アミロリクエファシエンススブチリシンの アポ酵素についての原子座標 １ ＡＬＡ Ｍ １９．４３４ ５３．１９５ −２１．７５６ １ ＡＬＡ ＣＡ １９．８１１ ５１．７７４ −２１．９６５ １ ＡＬＡ Ｃ １８．７３１ ５０．９９５ −２１．３２４ １ ＡＬＡ Ｏ １８．３７６ ５１．１９７ −２０．１７５ １ ＡＬＡ ＣＢ ２１．０９９ ５１．５１８ −２１．１８３ ２ ＧＬＮ Ｎ １８．２６８ ４９．８８６ −２２．０４１ ２ ＧＬＮ ＣＡ １７．２１９ ４９．００８ −２１．４３４ ２ ＧＬＮ Ｃ １７．８７５ ４７．７０６ −２０．９９２ ２ ＧＬＮ Ｏ １８．７６５ ４７．１６５ −２１．６９１ ２ ＧＬＮ ＣＢ １６．１２５ ４８．７６０ −２２．４４９ ２ ＧＬＮ ＣＧ １５．０２８ ４７．９０５ −２１．９２７ ２ ＧＬＮ ＣＤ １３．９１２ ４７．７６２ −２２．９３０ ２ ＧＬＮ ＤＥ１ １３．０２３ ４８．６１２ −２２．８６７ ２ ＧＬＮ ＮＥ２ １４．１１５ ４６．１１５ −２３．９２６ ３ ＳＥＲ Ｎ １７．４７７ ４７．２０５ −１９．８５２ ３ ＳＥＲ ＣＡ １７．９５０ ４５．８６８ −１９．４３７ ３ ＳＥＲ Ｃ １６．７３５ ４４．９１８ −１９．４９０ ３ ＳＥＲ Ｏ １５．５９０ ４５．３５２ −１９．２２９ ３ ＳＥＲ ＣＢ １８．５８８ ４５．８３８ −１８．０６９ ３ ＳＥＲ ＯＧ １７．６８２ ４６．２１０ −１７．０４９ ４ ＶＡＬ Ｎ １６．９９１ ４３．６４６ −１９．７２５ ４ ＶＡＬ ＣＡ １５．９４６ ４２．６１９ −１９．６３９ ４ ＶＡＬ Ｃ １６．１２９ ４１．９３４ −１８．２９０ ４ ＶＡＬ Ｏ １７．１２３ ４１．１７８ −１８．０８６ ４ ＶＡＬ ＣＢ １６．００８ ４１．６２２ −２０．８２２ ４ ＶＡＬ ＣＧ１ １４．８７４ ４０．５７２ −２０．７４１ ４ ＶＡＬ ＣＧ２ １６．０３７ ４２．２６６ −２２．１８６ ５ ＰＲＯ Ｎ １５．２３９ ４２．１０６ −１７．３３１ ５ ＰＲＯ ＣＡ １５．３８４ ４１．４１５ −１６．０２７ ５ ＰＲＯ Ｃ １５．５０１ ３９．９０５ −１６．２４９ ５ ＰＲＯ Ｏ １４．８８５ ３９．２６３ −１７．１４６ ５ ＰＲＯ ＣＢ １４．１５０ ４１．８８０ −１５．２６３ ５ ＰＲＯ ＣＧ １３．３４１ ４３．２１５ −１５．９２１ ５ ＰＲＯ ＣＤ １４．０４４ ４２．９８６ −１７．４１７ ６ ＴＹＲ Ｎ １６．３６３ ３９．２４０ −１５．４８７ ６ ＴＹＲ ＣＡ １６．６２８ ３７．８０３ −１５．７１５ ６ ＴＹＲ Ｃ １５．３５９ ３６．９７５ −１５．５２８ ６ ＴＹＲ Ｏ １５．２２４ ３５．９４３ −１６．２３５ ６ ＴＹＲ ＣＢ １７．８２４ ３７．３２３ −１４．８３４ ６ ＴＹＲ ＣＧ １８．０２１ ３５．８４７ −１５．０５５ ６ ＴＹＲ ＣＤ１ １８．４３７ ３５．４５２ −１６．３４６ ６ ＴＹＲ ＣＤ２ １７．６９６ ３４．９０８ −１４．０７１ ６ ＴＹＲ ＣＥ１ １８．５３５ ３４．０７０ −１６．６５３ ６ ＴＹＲ ＣＥ２ １７．８１５ ３３．５３９ −１４．３７９ ６ ＴＹＲ ＣＺ １８．２２２ ３３．１５４ −１５．６２８ ６ ＴＹＲ ＯＨ １８．３１２ ３１．８３８ −１５．９９６ ７ ＧＬＹ Ｎ １４．４６４ ３７．３６２ −１４．６３０ ７ ＧＬＹ ＣＡ １３．２１１ ３６．６４０ −１４．３７６ ７ ＧＬＹ Ｃ １２．４００ ３６．５３５ −１５．６７０ ７ ＧＬＹ Ｏ １１．７４７ ３５．４７８ −１５．８８３ ８ ＶＡＬ Ｎ １２．４４１ ３７．５２９ −１６．５４１ ８ ＶＡＬ ＣＡ １１．７７７ ３７．５２３ −１７．８３６ ８ ＶＡＬ Ｃ １２．３６３ ３６．４３３ −１８．７３５ ８ ＶＡＬ Ｏ １１．６３９ ３５．７１６ −１９．４７０ ８ ＶＡＬ ＣＢ １１．７６５ ３８．９００ −１８．５６７ ８ ＶＡＬ ＣＧ１ １１．１０６ ３８．８９３ −１９．９４３ ８ ＶＡＬ ＣＧ２ １０．９９１ ３９．９１９ −１７．７３３ ９ ＳＥＲ Ｎ １３．６６１ ３６．３１８ −１８．７７５ ９ ＳＥＲ ＣＡ １４．４１９ ３５．３４２ −１９．５６２ ９ ＳＥＲ Ｃ １４．１８８ ３３．９２０ −１８．９６５ ９ ＳＥＲ Ｏ １４．１１２ ３３．０１４ −１９．９０１ ９ ＳＥＲ ＣＢ １５．９２６ ３５．６３２ −１９．５０５ ９ ＳＥＲ ＯＧ １６．１６２ ３６．７４７ −２０．３５８ １０ ＧＬＮ Ｎ １４．１１５ ３３．８８７ −１７．６６２ １０ ＧＬＮ ＣＡ １３．９６４ ３２．６３６ −１６．８７６ １０ ＧＬＮ Ｃ １２．６８７ ３１．８８７ −１７．２７７ １０ ＧＬＮ Ｏ １２．７８５ ３０．６４２ −１７．４１３ １０ ＧＬＮ ＣＢ １４．１２５ ３２．８８５ −１５．４１０ １０ ＧＬＮ ＣＧ １４．２９５ ３１．６１７ −１４．５８８ １０ ＧＬＮ ＣＯ １４．４８６ ３１．９１１ −１３．１４７ １０ ＧＬＮ ＯＥ１ １４．５５４ ３３．０６８ −１２．７４４ １０ ＧＬＮ ＮＥ２ １４．５５２ ３０．９６０ −１２．２５１ １１ ＩＬＥ Ｎ １１．６２５ ３２．５７５ −１７．６７０ １１ ＩＬＥ ＣＡ １０．３７３ ３１．９０４ −１８．１０２ １１ ＩＬＥ Ｃ １０．２０９ ３１．７９２ −１９．６０５ １１ ＩＬＥ Ｏ ９．１７３ ３１．３３３ −２０．１８０ １１ ＩＬＥ ＣＢ ９．１３２ ３２．６６９ −１７．４７５ １１ ＩＬＥ ＣＧ１ ９．０６６ ３４．１１７ −１８．０４９ １１ ＩＬＥ ＣＧ２ ９．１６２ ３２．６５５ −１５．９４１ １１ ＩＬＥ ＣＯ１ ７．５８８ ３４．６４８ −１７．９２３ １２ ＬＹＳ Ｎ １１．２７２ ３２．１８５ −２０．２７７ １２ ＬＹＳ ＣＡ １１．３８８ ３２．１１９ −２１．７２２ １２ ＬＹＳ Ｃ １０．４５６ ３３．００６ −２２．５２２ １２ ＬＹＳ Ｏ １０．１７３ ３２．７０３ −２３．６８６ １２ ＬＹＳ ＣＢ １１．２５７ ３０．６４６ −２２．２１６ １２ ＬＹＳ ＣＧ １２．２８３ ２９．８３０ −２１．４２３ １２ ＬＹＳ ＣＤ １２．５４３ ２８．５１７ −２２．１５９ １２ ＬＹＳ ＣＥ １３．０２３ ２７．４６７ −２１．１６６ １２ ＬＹＳ ＮＺ １４．４７６ ２７．６８０ −２０．３３５ １３ ＡＬＡ Ｎ １０．１０９ ３４．１３８ −２１．９９１ １３ ＡＬＡ ＣＡ ９．３２５ ３５．１９８ −２２．６３１ １３ ＡＬＡ Ｃ １０．０２６ ３５．７１６ −２３．８６３ １３ ＡＬＡ Ｏ ９．３３８ ３５．８０４ −２４．９０１ １３ ＡＬＡ ＣＢ ８．８８５ ３６．１９５ −２１．５６５ １４ ＰＲＯ Ｎ １１．３３２ ３５．９５０ −２３．８９３ １４ ＰＲＯ ＣＡ １１．９８５ ３６．４３０ −２５．１２０ １４ ＰＲＯ Ｃ １１．７８６ ３５．５５７ −２６．３１７ １４ ＰＲＯ Ｏ １１．７７８ ３６．０４７ −２７．４４５ １４ ＰＲＯ ＣＢ １３．４６２ ３６．５８０ −２４．６９２ １４ ＰＲＯ ＣＧ １３．３２８ ３６．９７８ −２３．２２１ １４ ＰＲＯ ＣＤ １２．２８１ ３５．９３６ −２２．７５８ １５ ＡＬＡ Ｎ １１．５６０ ３４．２３６ −２６．１２９ １５ ＡＬＡ ＣＡ １１．３７９ ３３．４５０ −２７．３６７ １５ ＡＬＡ Ｃ １０．０８２ ３３．７９５ −２８．０３２ １５ ＡＬＡ Ｏ １０．００８ ３３．７１０ −２９．２７８ １５ ＡＬＡ ＣＢ １１．５５２ ３１．９６９ −２７．０６２ １６ ＬＥＵ Ｎ ９．０８５ ３４．１３８ −２７．２４０ １６ ＬＥＵ ＣＡ ７．７９１ ３４．５５８ −２７．８２８ １６ ＬＥＵ Ｃ ７．９１２ ３５．９２５ −２８．５２１ １６ ＬＥＵ Ｏ ７．３４２ ３６．１２６ −２９．５８８ １６ ＬＥＵ ＣＢ ６．７４６ ３４．６２３ −２６．６９８ １６ ＬＥＵ ＣＧ ５．７９０ ３３．４６５ −２６．５２２ １６ ＬＥＵ ＣＤ１ ５．００１ ３３．２３４ −２７．８０９ １６ ＬＥＵ ＣＤ２ ６．６９４ ３２．２８７ −２６．２８３ １７ ＨＩＳ Ｎ ８．６６５ ３６．８２８ −２７．９２２ １７ ＨＩＳ ＣＡ ８．８９０ ３８．１５１ −２８．５３０ １７ ＨＩＳ Ｃ ９．５１０ ３７．９８１ −２９．８９０ １７ ＨＩＳ Ｏ ９．１０７ ３８．６２２ −３０．８５６ １７ ＨＩＳ ＣＢ ９．７０８ ３９．１００ −２７．６５２ １７ ＨＩＳ ＣＧ ９．１８５ ３９．２８８ −２６．２６２ １７ ＨＩＳ ＮＤ１ ９．９３０ ３９．８８７ −２５．２７２ １７ ＨＩＳ ＣＤ２ ８．００８ ３８．９２４ −２５．６９４ １７ ＨＩＳ ＣＥ１ ９．２２６ ３９．９１４ −２４．１４４ １７ ＨＩＳ ＮＥ２ ８．０７９ ３９．３２８ −２４．３８１ １８ ＳＥＲ Ｎ １０．４４３ ３７．０３３ −３０．０２２ １８ ＳＥＲ ＣＡ １１．１０９ ３６．７３９ −３１．３２２ １８ ＳＥＲ Ｃ １０．１５９ ３６．１２３ −３２．３４３ １８ ＳＥＲ Ｏ １０．５４７ ３６．１１２ −３３．５３４ １８ ＳＥＲ ＣＢ １２．３１１ ３５．７９９ −３１．１７２ １８ ＳＥＲ ＯＳ １３．３２１ ３６．４５０ −３０．３９９ １９ ＧＬＮ Ｎ ９．０８０ ３５．４５５ −３１．９４３ １９ ＧＬＮ ＣＡ ８．０８２ ３４．９６２ −３２．８７８ １９ ＧＬＮ Ｃ ７．１４２ ３６．１１１ −３３．３０３ １９ ＧＬＮ Ｏ ６．２９７ ３５．９７２ −３４．２１９ １９ ＧＬＮ ＣＢ ７．２２１ ３３．８４９ −３２．２８０ １９ ＧＬＮ ＣＧ ７．９７５ ３２．６０２ −３１．８２３ １９ ＧＬＮ ＣＤ ６．９２３ ３１．７０７ −３１．１８１ １９ ＧＬＮ ＤＥ１ ５．７１９ ３１．８３３ −３１．４４４ １９ ＧＬＮ ＮＥ２ ７．３６２ ３０．８５２ −３０．２５６

【００４２】 ２０ ＧＬＹ Ｎ ７．２０５ ３７．２２３ −３２．５８７ ２０ ＧＬＹ ＣＡ ６．３６９ ３８．３８７ −３２．８５９ ２０ ＧＬＹ Ｃ ５．１８１ ３８．４９２ −３１．８８０ ２０ ＧＬＹ Ｏ ４．２６３ ３９．２７６ −３２．２１５ ２１ ＴＹＲ Ｎ ５．２０２ ３７．８０１ −３０．７６１ ２１ ＴＹＲ ＣＡ ４．１１８ ３７．８３１ −２９．７６３ ２１ ＴＹＲ Ｃ ４．５７９ ３８．５５２ −２８．５２５ ２１ ＴＹＲ Ｏ ５．４２２ ３８．０７４ −２７．７５６ ２１ ＴＹＲ ＣＥ ３．４９８ ３６．４３１ −２９．４４３ ２１ ＴＹＲ ＣＧ ２．９７３ ３５．７８４ −３０．７０９ ２１ ＴＹＲ ＣＤ１ １．７９５ ３６．３３２ −３１．２５８ ２１ ＴＹＲ ＣＤ２ ３．６５０ ３４．７９４ −３１．３９７ ２１ ＴＹＲ ＣＥ１ １．３０６ ３５．７９７ −３２．４４６ ２１ ＴＹＲ ＣＥ２ ３．１９３ ３４．２６１ −３２．５８８ ２１ ＴＹＲ Ｃ２ ２．００３ ３４．７５５ −３３．０６７ ２１ ＴＹＲ ＯＨ １．５０１ ３４．２４１ −３４．２５０ ２２ ＴＨＲ Ｎ ３．９０２ ３９．６８０ −２８．２８８ ２２ ＴＨＲ ＣＡ ４．２６２ ４０．５２７ −２７．１２９ ２２ ＴＨＲ Ｃ ３．０９１ ４０．９２２ −２６．２４４ ２２ ＴＨＲ Ｏ ３．２８７ ４１．７２５ −２５．３２５ ２２ ＴＨＲ ＣＥ ５．１３３ ４１．７５９ −２７．６１１ ２２ ＴＨＲ ＤＧ１ ４．３１９ ４２．４５７ −２８．５９７ ２２ ＴＨＲ ＣＧ２ ６．４７６ ４１．３２３ −２８．２２９ ２３ ＧＬＹ Ｎ １．９３９ ４０．２８５ −２６．４５３ ２３ ＧＬＹ ＣＡ ０．８０９ ４０．６００ −２５．５４２ ２３ ＧＬＹ Ｃ −０．１５７ ４１．６３１ −２６．１１８ ２３ ＧＬＹ Ｏ −１．０１３ ４２．０９５ −２５．３３０ ２４ ＳＥＲ Ｎ −０．０２３ ４１．９６７ −２７．３７１ ２４ ＳＥＲ ＣＡ −０．８９７ ４２．９５７ −２８．０１２ ２４ ＳＥＲ Ｃ −２．３８３ ４２．６２６ −２７．８６４ ２４ ＳＥＲ Ｄ −２．８１３ ４１．５０８ −２８．１６０ ２４ ＳＥＲ ＣＢ −０．７３４ ４３．１２０ −２９．５２０ ２４ ＳＥＲ ＤＧ ０．５６３ ４３．６５２ −２９．７２８ ２５ ＡＳＮ Ｎ −３．０５９ ４３．６９２ −２７．５１５ ２５ ＡＳＮ ＣＡ −４．５１９ ４３．６８７ −２７．３９３ ２５ ＡＳＮ Ｃ −５．０１５ ４２．８７５ −２６．２０５ ２５ ＡＳＮ Ｏ −６．２３３ ４２．６６８ −２６．１９０ ２５ ＡＳＮ ＣＢ −５．１６５ ４３．２２７ −２８．７００ ２５ ＡＳＮ ＣＧ −４．９６０ ４４．１７０ −２９．８８５ ２５ ＡＳＮ ＯＤ１ −４．９６５ ４３．７６７ −３１．０８３ ２５ ＡＳＮ ＮＤ２ −４．７４７ ４５．４６１ −２９．５９４ ２６ ＶＡＬ Ｎ −４．１７７ ４２．４４９ −２５．２９２ ２６ ＶＡＬ ＣＡ −４．６７４ ４１．６７９ −２４．１４３ ２６ ＶＡＬ Ｃ −４．７９２ ４２．６５２ −２２．９８７ ２６ ＶＡＬ Ｏ −３．８５８ ４３．４１９ −２２．６８９ ２６ ＶＡＬ ＣＢ −３．７１４ ４０．５０３ −２３．８２１ ２６ ＶＡＬ ＣＧ１ −４．１６０ ３９．８０２ −２２．５４８ ２６ ＶＡＬ ＣＧ２ −３．５９８ ３９．５７６ −２５．０１８ ２７ ＬＹＳ Ｎ −５．９１０ ４２．６１３ −２２．３０１ ２７ ＬＹＳ ＣＡ −６．１３３ ４３．５２４ −２１．１７５ ２７ ＬＹＳ Ｃ −５．８１５ ４２．８７２ −１９．８４１ ２７ ＬＹＳ Ｏ −６．４０５ ４１．８７３ −１９．４１３ ２７ ＬＹＳ ＣＢ −７．５９０ ４３．９８１ −２１．１４９ ２７ ＬＹＳ ＣＧ −８．０４６ ４４．５７５ −２２．４９０ ２７ ＬＹＳ ＣＤ −９．３２１ ４５．３０２ −２２．０２０ ２７ ＬＹＳ ＣＥ −１０．３０４ ４５．４９７ −２３．１３７ ２７ ＬＹＳ ＮＺ −９．９８６ ４６．２５３ −２４．２６４ ２８ ＶＡＬ Ｎ −４．８１８ ４３．４６２ −１９．２００ ２８ ＶＡＬ ＣＡ −４．４５７ ４２．９５０ −１７．８９７ ２８ ＶＡＬ Ｃ −４．７５８ ４３．９５９ −１６．８２８ ２８ ＶＡＬ Ｏ −４．２０９ ４５．０９５ −１６．８１７ ２８ ＶＡＬ ＣＢ −２．９２６ ４２．６６６ −１７．９３２ ２８ ＶＡＬ ＣＧ１ −２．４６６ ４２．１０５ −１６．５８９ ２８ ＶＡＬ ＣＧ２ −２．６６７ ４１．８０５ −１９．１７３ ２９ ＡＬＡ Ｎ −５．４８４ ４３．５２７ −１５．８１３ ２９ ＡＬＡ ＣＡ −５．７４７ ４４．３３０ −１４．６３９ ２９ ＡＬＡ Ｃ −４．７５０ ４４．０１０ −１３．５５３ ２９ ＡＬＡ Ｄ −４．６６６ ４２．８４５ −１３．１０４ ２９ ＡＬＡ ＣＢ −７．１７２ ４４．１０７ −１４．１０１

【００４３】 ３０ ＶＡＬ Ｎ −４．０５７ ４５．０３３ −１３．０７２ ３０ ＶＡＬ ＣＡ −３．１４６ ４４．９６２ −１１．９１０ ３０ ＶＡＬ Ｃ −３．９５８ ４５．４０９ −１０．６８１ ３０ ＶＡＬ Ｏ −４．１５５ ４６．６４８ −１０．５７８ ３０ ＶＡＬ ＣＢ −１．８８６ ４５．８１０ −１２．１４９ ３０ ＶＡＬ ＣＧ１ −０．９９６ ４５．９０１ −１０．９００ ３０ ＶＡＬ ＣＧ２ −１．０５３ ４５．２３６ −１３．３０７ ３１ ＩＬＥ Ｎ −４．５１４ ４４．５１５ −９．８７７ ３１ ＩＬＥ ＣＡ −５．３２８ ４４．８４６ −８．６７９ ３１ ＩＬＥ Ｃ −４．３４６ ４４．９３３ −７．５４６ ３１ ＩＬＥ Ｏ −３．８２５ ４３．９１５ −６．９９７ ３１ ＩＬＥ ＣＢ −６．４５７ ４３．７７６ −８．５０１ ３１ ＩＬＥ ＣＧ１ −７．２９８ ４３．７０７ −９．７９８ ３１ ＩＬＥ ＣＧ２ −７．２７８ ４４．０３８ −７．２２５ ３１ ＩＬＥ ＣＤ１ −８．６１７ ４２．８５６ −９．７１７ ３２ ＡＳＰ Ｎ −４．０４４ ４６．１９３ −７．２２７ ３２ ＡＳＰ ＣＡ −２．９４４ ４６．４６７ −６．２５５ ３２ ＡＳＰ Ｃ −３．０７１ ４７．８８９ −５．７０５ ３２ ＡＳＰ Ｏ −４．１９７ ４５．４１８ −５．５０２ ３２ ＡＳＰ ＣＢ −１．６９５ ４６．１２９ −７．０９２ ３２ ＡＳＰ ＣＧ −０．４８３ ４５．７０２ −６．２７３ ３２ ＡＳＰ ＤＤ１ ０．０３４ ４４．５９２ −６．５７６ ３２ ＡＳＰ ＯＤ２ −０．０１８ ４６．４２９ −５．３３０ ３３ ＳＥＲ Ｎ −１．９３１ ４８．５１２ −５．３９４ ３３ ＳＥＲ ＣＡ −１．８９５ ４６．８５７ −４．８０１ ３３ ＳＥＲ Ｃ −１．９５２ ５０．９７６ −５．８０８ ３３ ＳＥＲ Ｏ −１．７０６ ５２．１３６ −５．３６３ ３３ ＳＥＲ ＣＢ −０．６２１ ４９．９２２ −３．９３９ ３３ ＳＥＲ ＯＧ ０．５３５ ５０．０２５ −４．７７４ ３４ ＧＬＹ Ｎ −２．１７３ ５０．７４０ −７．００４ ３４ ＧＬＹ ＣＡ −２．２５５ ５１．７２８ −８．１６５ ３４ ＧＬＹ Ｃ −１．０３５ ５１．６４８ −９．０５７ ３４ ＧＬＹ Ｏ −０．１４４ ５０．８３１ −８．７６１ ３５ ＩＬＥ Ｎ −０．９６５ ５２．４９１ −１０．１０２ ３５ ＩＬＥ ＣＡ ０．２０８ ５２．４３８ −１０．９９５ ３５ ＩＬＥ Ｃ ０．５６８ ５３．９１９ −１１．２６３ ３５ ＩＬＥ Ｏ −０．３２７ ５４．６３８ −１１．７４４ ３５ ＩＬＥ ＣＢ −０．０４２ ５１．６９４ −１２．３６７ ３５ ＩＬＥ ＣＧ１ −０．５３０ ５０．２１０ −１２．０９７ ３５ ＩＬＥ ＣＧ２ １．１４９ ５１．７４１ −１３．３６２ ３５ ＩＬＥ ＣＤ１ −０．９６２ ４９．４８５ −１３．４２４ ３６ ＡＳＰ Ｎ １．８１６ ５４．２５３ −１０．９７１ ３６ ＡＳＰ ＣＡ ２．３５９ ５５．６１８ −１１．２３２ ３６ ＡＳＰ Ｃ ２．２８１ ５５．９５６ −１２．７０２ ３６ ＡＳＰ Ｏ ３．００４ ５５．４７１ −１３．５７９ ３６ ＡＳＰ ＣＢ ３．７１２ ５５．７２０ −１０．５１４ ３６ ＡＳＰ ＣＧ ４．３３９ ５７．０９９ −１０．８０４ ３６ ＡＳＰ ＯＤ１ ３．７５５ ５７．９７４ −１１．４２９ ３６ ＡＳＰ ＤＤ２ ５．４４８ ５７．２７７ −１０．２６３ ３７ ＳＥＲ Ｎ １．３０４ ５６．８２２ −１３．１１１ ３７ ＳＥＲ ＣＡ １．１８３ ５７．２２１ −１４．５１２ ３７ ＳＥＲ Ｃ ２．３７７ ５８．０９５ −１４．９４９ ３７ ＳＥＲ Ｏ ２．５４５ ５８．３０３ −１６．１５１ ３７ ＳＥＲ ＣＢ −０．０９３ ５８．０４９ −１４．７８８ ３７ ＳＥＲ ＯＧ −０．０９０ ５９．１３３ −１３．８７９ ３８ ＳＥＲ Ｎ ３．１６３ ５８．６１４ −１４．００１ ３８ ＳＥＲ ＣＡ ４．２６１ ５９．５０５ −１４．４８７ ３８ ＳＥＲ Ｃ ５．４６６ ５８．７０５ −１４．９９２ ３８ ＳＥＲ Ｏ ６．５４３ ５９．２５１ −１５．２８５ ３８ ＳＥＲ ＣＢ ４．７４２ ６０．４３５ −１３．３９８ ３８ ＳＥＲ ＯＧ ５．３７６ ５９．９６５ −１２．２３４ ３９ ＨＩＳ Ｎ ５．４５４ ５７．３９０ −１４．８９２ ３９ ＨＩＳ ＣＡ ６．６３７ ５６．５７４ −１５．２９１ ３９ ＨＩＳ Ｃ ６．６８１ ５６．４０１ −１６．７７８ ３９ ＨＩＳ Ｏ ５．７３８ ５５．８７８ −１７．４１９ ３９ ＨＩＳ ＣＢ ６．６３７ ５５．２０３ −１４．５１５ ３９ ＨＩＳ ＣＧ ８．０１４ ５４．６０９ −１４．４５６ ３９ ＨＩＳ ＮＤ１ ８．７９５ ５４．３５６ −１５．５６１ ３９ ＨＩＳ ＣＤ２ ８．７６９ ５４．３４５ −１３．３８９ ３９ ＨＩＳ ＣＥ１ ９．９７０ ５３．９３０ −１５．１３０ ３９ ＨＩＳ ＮＥ２ ９．９８６ ５３．９１０ −１３．８０８

【００４４】 ４０ ＰＲＯ Ｎ ７．８０７ ５６．８３６ −１７．３８７ ４０ ＰＲＯ ＣＡ ７．９８８ ５６．６９７ −１８．８３１ ４０ ＰＲＯ Ｃ ８．１５６ ５５．２８０ −１９．３５７ ４０ ＰＲＯ Ｏ ８．０３２ ５５．０９７ −２０．５７８ ４０ ＰＲＯ Ｃ５ ９．２４７ ５７．５３３ −１９．１６１ ４０ ＰＲＯ ＣＧ １０．０５３ ５７．４０５ −１７．９０２ ４０ ＰＲＯ ＣＤ ８．９８８ ５７．４５２ −１６．７７６ ４１ ＡＳＰ Ｎ ８．４８１ ５４．３２８ −１８．４８５ ４１ ＡＳＰ ＯＤ２ １１．１４８ ５０．３９９ −１８．６６８ ４１ ＡＳＰ ＯＤ１ １０．３２５ ５１．３９５ −２０．４２９ ４１ ＡＳＰ ＣＧ １０．４７３ ５１．３０７ −１９．２１１ ４１ ＡＳＰ ＣＢ ９．７９９ ５２．２３９ −１８．２２４ ４１ ＡＳＰ ＣＡ ８．６４５ ５２．９５９ −１８．９６６ ４１ ＡＳＰ Ｃ ７．３１１ ５２．１６３ −１８．８３９ ４１ ＡＳＰ Ｏ ７．３９６ ５０．９４７ −１８．９７７ ４２ ＬＥＵ Ｎ ６．１８５ ５２．８０３ −１８．５５８ ４２ ＬＥＵ ＣＡ ４．８９２ ５２．１４７ −１８．４６６ ４２ ＬＥＵ Ｃ ３．９２４ ５２．９０７ −１９．３７６ ４２ ＬＥＵ Ｏ ３．９９３ ５４．１６３ −１９．４９０ ４２ ＬＥＵ ＣＢ ４．４２１ ５２．１５８ −１７．００８ ４２ ＬＥＵ ＣＧ ５．１８２ ５１．３６３ −１５．９４６ ４２ ＬＥＵ ＣＤ１ ４．５３５ ５１．５４６ −１４．５８１ ４２ ＬＥＵ ＣＤ２ ５．２７３ ４９．８７７ −１６．３５０ ４３ ＬＹＳ Ｎ ３．０１８ ５２．１３５ −１９．９４６ ４３ ＬＹＳ ＣＡ １．８９３ ５２．６８５ −２０．７２１ ４３ ＬＹＳ Ｃ ０．６３７ ５２．１５６ −２０．０１８ ４３ ＬＹＳ Ｏ ０．５０４ ５０．９２０ −１９．８２０ ４３ ＬＹＳ ＣＢ ２．０２１ ５２．３８９ −２２．１６９ ４３ ＬＹＳ ＣＧ ０．６８５ ５２．４３６ −２２．９１０ ４３ ＬＹＳ ＣＤ ０．９９８ ５２．８６２ −２４．３３９ ４３ ＬＹＳ ＣＥ −０．１８０ ５２．５８４ −２５．２６０ ４３ ＬＹＳ ＮＺ ０．３３７ ５１．７５７ −２６．４１８ ４４ ＶＡＬ Ｎ −０．１９１ ５３．０３５ −１９．４９０ ４４ ＶＡＬ ＣＡ −１．４０７ ５２．６３９ −１８．７６５ ４４ ＶＡＬ Ｃ −２．５７１ ５２．８８７ −１９．７３１ ４４ ＶＡＬ Ｏ −２．６２３ ５３．９０６ −２０．４３４ ４４ ＶＡＬ ＣＢ −１．４８０ ５３．３５１ −１７．３８３ ４４ ＶＡＬ ＣＧ１ −２．７２４ ５２．９４１ −１６．５８２ ４４ ＶＡＬ ＣＧ２ −０．１９７ ５３．１９４ −１６．５５３ ４５ ＡＬＡ Ｎ −３．４９４ ５１．９５１ −１９．８７１ ４５ ＡＬＡ ＣＡ −４．６１９ ５１．９７７ −２０．８１０ ４５ ＡＬＡ Ｃ −５．８４１ ５２．５０７ −２０．０５３ ４５ ＡＬＡ Ｏ −６．７０３ ５３．０８５ −２０．７０３ ４５ ＡＬＡ ＣＢ −４．８３１ ５０．５８０ −２１．３８９ ４６ ＧＬＹ Ｎ −５．９１０ ５２．３５６ −１８．７６８ ４６ ＧＬＹ ＣＡ −７．０８２ ５２．８３７ −１８．００１ ４６ ＧＬＹ Ｃ −６．９８７ ５２．４４３ −１６．５３８ ４６ ＧＬＹ Ｏ −５．９３８ ５２．００６ −１６．０３５ ４７ ＧＬＹ Ｎ −８．０９２ ５２．６５８ −１５．７９３ ４７ ＧＬＹ ＣＡ −８．０１４ ５２．２４６ −１４．３８８ ４７ ＧＬＹ Ｃ −９．１７９ ５２．７５７ −１３．５７２ ４７ ＧＬＹ Ｏ −９．９８８ ５３．４８１ −１４．１８５ ４８ ＡＬＡ Ｎ −９．２２１ ５２．４４６ −１２．３３０ ４８ ＡＬＡ ＣＡ −１０．２５５ ５２．８７０ −１１．３８２ ４８ ＡＬＡ Ｃ −９．７９０ ５２．６７５ −９．９６８ ４８ ＡＬＡ Ｏ −９．０６６ ５１．７２０ −９．７２５ ４８ ＡＬＡ ＣＢ −１１．５５８ ５２．１００ −１１．６１７ ４９ ＳＥＲ Ｎ −１０．１４９ ５３．５４７ −９．０３７ ４９ ＳＥＲ ＣＡ −９．７５２ ５３．３５５ −７．６５２ ４９ ＳＥＲ Ｃ −１０．９４７ ５２．９８６ −６．７８３ ４９ ＳＥＲ Ｏ −１１．９７２ ５３．６７７ −６．９０８ ４９ ＳＥＲ ＣＢ −９．０９２ ５４．５８８ −７．０２９ ４９ ＳＥＲ ＯＧ −８．８７９ ５４．２５５ −５．６５０

【００４５】 ５０ ＭＥＴ Ｎ −１０．８３５ ５２．００７ −５．９３２ ５０ ＭＥＴ ＣＡ −１１．８５２ ５１．５４９ −４．９７４ ５０ ＭＥＴ Ｃ −１１．４６３ ５１．９６２ −３．５６１ ５０ ＭＥＴ Ｏ −１１．９９７ ５１．３９８ −２．５７５ ５０ ＭＥＴ ＣＢ −１２．０１２ ５０．０１８ −４．９９６ ５０ ＭＥＴ ＣＧ −１１．９１２ ４９．４６３ −６．３８９ ５０ ＭＥＴ ＳＤ −１３．４６０ ４９．８８９ −７．２５６ ５０ ＭＥＴ ＣＥ −１２．８０８ ５０．１１１ −８．９０３ ５１ ＶＡＬ Ｎ −１０．４２７ ５２．７６０ −３．４２２ ５１ ＶＡＬ ＣＡ −９．９６８ ５３．１７０ −２．０６７ ５１ ＶＡＬ Ｃ −１０．６３０ ５４．５６２ −１．９０７ ５１ ＶＡＬ Ｏ −１０．２３７ ５５．４３７ −２．６８２ ５１ ＶＡＬ ＣＢ −８．４４３ ５３．１５５ −２．０００ ５１ ＶＡＬ ＣＧ１ −７．８９２ ５３．５７９ −０．６３１ ５１ ＶＡＬ ＣＧ２ −７．７６４ ５１．８１５ −２．３０２ ５２ ＰＲＯ Ｎ −１１．６２１ ５４．６９３ −１．０５６ ５２ ＰＲＯ ＣＡ −１２．３７２ ５５．９３３ −０．３２１ ５２ ＰＲＯ Ｃ −１１．４９０ ５７．１２３ −０．４４０ ５２ ＰＲＯ Ｏ −１１．７７１ ５８．２２０ −０．９２５ ５２ ＰＲＯ ＣＢ −１３．４００ ５５．５９４ ０．２４６ ５２ ＰＲＯ ＣＧ −１３．５８３ ５４．１０３ ０．０８５ ５２ ＰＲＯ ＣＤ −１２．１６４ ５３．６２０ −０．１７５ ５３ ＳＥＲ Ｎ −１０．４４２ ５６．９０６ ０．２９９ ５３ ＳＥＲ ＣＡ −９．５３８ ５７．９８２ ０．６８２ ５３ ＳＥＲ Ｃ −８．４２０ ５８．２４５ −０．３２６ ５３ ＳＥＲ Ｏ −７．６７９ ５９．２２４ −０．０３８ ５３ ＳＥＲ ＣＢ −９．００４ ５７．７０７ ２．０６９ ５３ ＳＥＲ ＯＧ −８．２５６ ５６．５２１ ２．１２７ ５４ ＧＬＵ Ｎ −８．２５４ ５７．５２３ −１．３９３ ５４ ＧＬＵ ＣＡ −７．２０４ ５７．６４８ −２．４２１ ５４ ＧＬＵ Ｃ −７．７６７ ５７．３０３ −３．７８５ ５４ ＧＬＵ Ｏ −７．５３３ ５６．２４３ −４．３７９ ５４ ＧＬＵ ＣＢ −６．１３４ ５６．５９９ −２．１５４ ５４ ＧＬＵ ＣＧ −５．２８９ ５６．９５９ −０．９２７ ５４ ＧＬＵ ＣＤ −４．０６６ ５６．０４２ −０．９２０ ５４ ＧＬＵ ＯＥ１ −３．５４５ ５５．６９４ −１．９６８ ５４ ＧＬＵ ＯＥ２ −３．９００ ５５．７７７ ０．２７１ ５５ ＴＨＲ Ｎ −８．５７１ ５８．２５１ −４．２４９ ５５ ＴＨＲ ＣＡ −９．４３３ ５８．１２１ −５．４４１ ５５ ＴＨＲ Ｃ −８．７６４ ５８．１３９ −６．７７９ ５５ ＴＨＲ Ｄ −９．４３３ ５７．９１９ −７．８１０ ５５ ＴＨＲ ＣＢ −１０．５８６ ５９．２００ −５．３０３ ５５ ＴＨＲ ＯＧ１ −９．８８５ ６０．５１０ −５．４１８ ５５ ＴＨＲ ＣＧ２ −１１．４３２ ５９．１３４ −４．０１７ ５６ ＡＳＮ Ｎ −７．４８２ ５８．４０３ −６．８７７ ５６ ＡＳＮ ＮＤ２ −４．９３０ ６１．１７９ −９．８８１ ５６ ＡＳＮ ＤＤ１ −５．０７５ ５８．９６７ −１０．３３７ ５６ ＡＳＮ ＣＧ −５．２７３ ５９．９２５ −９．５５５ ５６ ＡＳＮ ＣＢ −５．８９８ ５９．６９４ −８．２０８ ５６ ＡＳＮ ＣＡ −６．７６２ ５８．４２５ −８．２００ ５６ ＡＳＮ Ｃ −６．０１２ ５７．０９４ −８．３０５ ５６ ＡＳＮ Ｄ −５．１０４ ５６．８６６ −７．４７０ ５７ ＰＲＯ Ｎ −６．３６２ ５６．２６１ −９．２５８ ５７ ＰＲＯ ＣＧ −７．１２３ ５５．２５７ −１１．１７７ ５７ ＰＲＯ ＣＤ −７．３８４ ５６．４３３ −１０．２７２ ５７ ＰＲＯ ＣＢ −６．６４４ ５４．１７８ −１８．２３５ ５７ ＰＲＯ ＣＡ −５．６７９ ５４．９６１ −９．３３２ ５７ ＰＲＯ Ｃ −４．３０１ ５５．０８２ −９．９６６ ５７ ＰＲＤ Ｄ −３．５０９ ５４．１２８ −９．９４５ ５８ ＰＨＥ Ｎ −３．９９８ ５６．２６２ −１０．４９１ ５８ ＰＨＥ ＣＡ −２．７４７ ５６．５７７ −１１．２２２ ５８ ＰＨＥ Ｃ −１．７１２ ５７．１２９ −１０．２５３ ５８ ＰＨＥ Ｄ −０．６３５ ５７．４９７ −１０．６８０ ５８ ＰＨＥ Ｃ５ −２．９４３ ５７．５０２ −１２．４２３ ５８ ＰＨＥ ＣＧ −３．９８３ ５６．９６８ −１３．３５７ ５８ ＰＨＥ ＣＤ１ −３．７５６ ５５．７８０ −１４．０５９ ５８ ＰＨＥ ＣＤ２ −５．２１１ ５７．６３０ −１３．４５９ ５８ ＰＨＥ ＣＥ１ −４．７２２ ５５．２５５ −１４．９２８ ５８ ＰＨＥ ＣＥ２ −６．１９４ ５７．０９５ −１４．２７６ ５８ ＰＨＥ ＣＺ −５．９４９ ５５．９３９ −１５．０５１ ５９ ＧＬＮ Ｎ −２．０４４ ５７．１１９ −８．９９０ ５９ ＧＬＮ ＣＡ −１．１７２ ５７．５８３ −７．９３４ ５９ ＧＬＮ Ｃ −０．８０７ ５６．４０３ −７．０００ ５９ ＧＬＮ Ｄ −１．６３９ ５６．０８３ −６．１１５ ５９ ＧＬＮ ＣＢ −１．８６２ ５８．６６８ −７．０８９ ５９ ＧＬＮ ＣＧ −０．９４２ ５９．２６１ −６．０３４ ５９ ＧＬＮ ＣＤ −１．７９０ ６０．１５７ −５．１５０ ５９ ＧＬＮ ＤＥ１ −１．４０４ ６１．２８８ −４．８３６ ５９ ＧＬＮ ＮＥ２ −２．９５９ ５９．６８５ −４．７４２

【００４６】 ６０ ＡＳＰ Ｎ ０．４１０ ５５．８９５ −７．２１１ ６０ ＡＳＰ ＣＡ ０．８５１ ５４．７９２ −６．３０４ ６０ ＡＳＰ Ｃ １．６３１ ５５．２６７ −５．０９０ ６０ ＡＳＰ Ｄ ２．８２７ ５５．５５０ −５．２３１ ６０ ＡＳＰ ＣＢ １．５９６ ５３．７４４ −７．１８８ ６０ ＡＳＰ ＣＧ ２．０７７ ５２．５３８ −６．３８０ ６０ ＡＳＰ ＤＤ１ １．７４６ ５２．３３７ −５．１９０ ６０ ＡＳＰ ＤＤ２ ２．９１５ ５１．８４１ −７．０３０ ６１ ＡＳＮ Ｎ ０．９５９ ５５．２６５ −３．９５０ ６１ ＡＳＮ ＮＤ２ −１．３６４ ５７．７４７ −２．３４７ ６１ ＡＳＮ ＤＤ１ ０．６６６ ５８．５６６ −２．８７５ ６１ ＡＳＮ ＣＧ −０．０４０ ５７．６７０ −２．３９９ ６１ ＡＳＮ ＣＢ ０．５３１ ５６．４０１ −１．７８４ ６１ ＡＳＮ ＣＡ １．５５７ ５５．７３４ −２．７００ ６１ ＡＳＮ Ｃ ２．２９１ ５４．６３２ −１．９４０ ６１ ＡＳＮ Ｄ ２．９３３ ５４．８６２ −０．９０２ ６２ ＡＳＮ Ｎ ２．２１０ ５３．４３４ −２．４６８ ６２ ＡＳＮ ＣＡ ２．８７７ ５２．３４８ −１．７０９ ６２ ＡＳＮ Ｃ ４．１２４ ５１．８９３ −２．４７９ ６２ ＡＳＮ Ｄ ４．９５１ ５１．３１３ −１．７７０ ６２ ＡＳＮ ＣＢ １．７８３ ５１．３１９ −１．４２１ ６２ ＡＳＮ ＣＧ ２．３７１ ５０．１０３ −０．６９７ ６２ ＡＳＮ ＤＤ１ ２．６３３ ４９．０７７ −１．３４３ ６２ ＡＳＮ ＮＤ２ ２．６２２ ５０．２０８ −０．６０１ ６３ ＳＥＲ Ｎ ４．１５２ ５２．１０４ −３．７６１ ６３ ＳＥＲ ＣＡ ５．１８９ ５１．６９６ −４．７０９ ６３ ＳＥＲ Ｃ ５．０７１ ５０．２５６ −５．２０９ ６３ ＳＥＲ Ｄ ５．５９３ ４９．７９０ −６．２６９ ６３ ＳＥＲ ＣＢ ６．５２３ ５１．９５８ −４．０１２ ６３ ＳＥＲ ＤＧ ６．８７１ ５０．６９８ −３．４１８ ６４ ＨＩＳ Ｎ ４．２０２ ４９．４７５ −４．６３９ ６４ ＨＩＳ ＣＡ ３．９９４ ４８．０５９ −４．９３５ ６４ ＨＩＳ Ｃ ３．３６６ ４７．７５９ −６．２６１ ６４ ＨＩＳ Ｄ ３．８６１ ４６．９７４ −７．１０８ ６４ ＨＩＳ ＣＢ ３．１８４ ４７．５０１ −３．７４７ ６４ ＨＩＳ ＣＧ ３．１４４ ４６．０２１ −３．７２６ ６４ ＨＩＳ ＮＤ１ ２．１０７ ４５．２４７ −４．２４１ ６４ ＨＩＳ ＣＤ２ ４．０５４ ４５．１９４ −３．１３５ ６４ ＨＩＳ ＣＥ１ ２．４１６ ４３．９６６ −４．０５４ ６４ ＨＩＳ ＮＥ２ ３．５５６ ４３．９２０ −３．３６８ ６５ ＧＬＹ Ｎ ２．２８７ ４８．４２８ −６．５８７ ６５ ＧＬＹ ＣＡ １．５５２ ４８．２６４ −７．８３０ ６５ ＧＬＹ Ｃ ２．３９２ ４８．６３６ −９．０３７ ６５ ＧＬＹ Ｄ ２．２３０ ４８．０７８ −１０．１３４ ６６ ＴＨＲ Ｎ ３．２３３ ４９．６５９ −８．８３２ ６６ ＴＨＲ ＣＡ ４．０６４ ５０．１１７ −９．９５４ ６６ ＴＨＲ Ｃ ５．０８９ ４９．００９ −１０．２９１ ６６ ＴＨＲ Ｄ ５．３３３ ４８．７８９ −１１．４６１ ６６ ＴＨＲ Ｃ５ ４．７４４ ５１．５１１ −９．６６７ ６６ ＴＨＲ ＤＧ１ ３．６３７ ５２．４２５ −９．４０６ ６６ ＴＨＲ ＣＧ２ ５．５３６ ５２．０７８ −１０．８４９ ６７ ＨＩＳ Ｎ ５．６８５ ４８．４４３ −９．２７４ ６７ ＨＩＳ ＣＡ ６．７０３ ４７．３６１ −９．４５８ ６７ ＨＩＳ Ｃ ６．０９１ ４６．１４１ −１０．１４３ ６７ ＨＩＳ Ｄ ６．６４９ ４５．６３８ −１１．１５０ ６７ ＨＩＳ ＣＢ ７．３００ ４７．０７１ −８．０６４ ６７ ＨＩＳ ＣＧ ８．５９５ ４６．２７５ −８．１４８ ６７ ＨＩＳ ＮＤＩ ８．５９０ ４４．９０７ −８．２７６ ６７ ＨＩＳ ＣＤ２ ９．９０４ ４６．６７８ −８．０７６ ６７ ＨＩＳ ＣＥ１ ９．８５７ ４４．４９１ −８．２９９ ６７ ＨＩＳ ＮＥ２ １０．６７８ ４５．５１４ −８．１８６ ６８ ＶＡＬ Ｎ ４．８９２ ４５．７４９ −９．７３１ ６８ ＶＡＬ ＣＡ ４．１４２ ４４．６０７ −１０．２６６ ６８ ＶＡＬ Ｃ ３．５５６ ４４．８６０ −１１．７４０ ６８ ＶＡＬ Ｄ ４．１１４ ４３．９４２ −１２．５３５ ６８ ＶＡＬ ＣＢ ２．９３９ ４４．２５２ −９．３８６ ６８ ＶＡＬ ＣＧ１ １．９６０ ４３．２６０ −１０．０２０ ６８ ＶＡＬ ＣＧ２ ３．３１９ ４３．７０５ −８．０００ ６９ ＡＬＡ Ｎ ３．３７３ ４６．０４９ −１２．１１３ ６９ ＡＬＡ ＣＡ ３．０３７ ４６．４６８ −１３．４２９ ６９ ＡＬＡ Ｃ ４．１９３ ４６．３９０ −１４．４１１ ６９ ＡＬＡ Ｄ ４．０２８ ４５．９１３ −１５．５６５ ６９ ＡＬＡ Ｃ５ ２．３３２ ４７．８５１ −１３．３８６

【００４７】 ７０ ＧＬＶ Ｎ ５．３４０ ４６．７８２ −１３．９１４ ７０ ＧＬＹ ＣＡ ６．５９５ ４６．８０５ −１４．６７０ ７０ ＧＬＶ Ｃ ７．０４６ ４５．３７０ −１５．０２１ ７０ ＧＬＶ Ｄ ７．６０４ ４５．１５４ −１６．１１９ ７１ ＴＨＲ Ｎ ６．８２０ ４４．４３１ −１４．１３８ ７１ ＴＭＲ ＣＡ ７．１７７ ４３．０１９ −１４．４４６ ７１ ＴＨＲ Ｃ ６．２２４ ４２．５０６ −１５．５４３ ７１ ＴＨＲ Ｄ ６．６０２ ４１．８２８ −１６．４９５ ７１ ＴＨＲ ＣＢ ７．１１９ ４２．０７０ −１３．１９１ ７１ ＴＨＲ ＤＧ１ ８．１９１ ４２．５９２ −１２．３９０ ７１ ＴＨＲ ＣＧ２ ７．２７４ ４０．５８３ −１３．５９６ ７２ ＶＡＬ Ｎ ４．９３０ ４２．８８７ −１５．４２７ ７２ ＶＡＬ ＣＡ ３．９７６ ４２．４９１ −１６．４８４ ７２ ＶＡＬ Ｃ ４．３１２ ４３．０８４ −１７．８３１ ７２ ＶＡＬ Ｄ ４．３４１ ４２．３８０ −１８．８６０ ７２ ＶＡＬ ＣＢ ２．５１６ ４２．８６７ −１６．０８５ ７２ ＶＡＬ ＣＧ１ １．５１２ ４２．４８０ −１７．１７０ ７２ ＶＡＬ ＣＧ２ ２．１４２ ４２．３２７ −１４．７２３ ７３ ＡＬＡ Ｎ ４．５０４ ４４．４１７ −１７．９８０ ７３ ＡＬＡ ＣＡ ４．５８７ ４５．０９１ −１９．１６７ ７３ ＡＬＡ Ｃ ５．４３３ ４６．３３３ −１９．３５５ ７３ ＡＬＡ Ｄ ５．０６２ ４７．１８８ −２０．２１６ ７３ ＡＬＡ ＣＢ ３．１０７ ４５．４４１ −１９．４３３ ７４ ＡＬＡ Ｎ ６．５４４ ４６．４２９ −１８．６３５ ７４ ＡＬＡ ＣＡ ７．４７０ ４７．５９１ −１８．９５９ ７４ ＡＬＡ Ｃ ７．７４０ ４７．６４８ −２０．３４２ ７４ ＡＬＡ Ｄ ７．９５９ ４６．６４０ −２１．０５４ ７４ ＡＬＡ ＣＢ ８．６５３ ４７．４４６ −１７．９２５ ７５ ＬＥＵ Ｎ ７．６５０ ４８．７８４ −２１．０３９ ７５ ＬＥＵ ＣＡ ７．８１２ ４８．９６８ −２２．４５６ ７５ ＬＥＵ Ｃ ９．１９２ ４８．５６８ −２２．９６６ ７５ ＬＥＵ Ｄ １０．１６２ ４８．７５０ −２２．２５３ ７５ ＬＥＵ ＣＢ ７．５４８ ５０．４７１ −２２．８０９ ７５ ＬＥＵ ＣＧ ６．１２３ ５０．９１３ −２２．３７９ ７５ ＬＥＵ ＣＤ１ ６．０７９ ５２．４３６ −２２．３００ ７５ ＬＥＵ ＣＤ２ ５．０９６ ５０．４４２ −２３．４０５ ７６ ＡＳＮ Ｎ ９．１４７ ４８．１０３ −２４．１６９ ７６ ＡＳＮ ＮＤ２ １２．３８５ ４６．４３２ −２６．３０４ ７６ ＡＳＮ ＤＤ１ １０．９５０ ４５．８４０ −２７．９２８ ７６ ＡＳＮ ＣＧ １１．１９５ ４６．２７４ −２６．８０２ ７６ ＡＳＮ ＣＢ １０．０１０ ４６．６５１ −２５．９０８ ７６ ＡＳＮ ＣＡ １０．３５９ ４７．７３８ −２４．９３８ ７６ ＡＳＮ Ｃ １０．７８３ ４９．０４８ −２５．６４３ ７６ ＡＳＮ Ｄ １０．１５７ ４９．４７９ −２６．６１９ ７７ ＡＳＮ Ｎ １１．８０４ ４９．６６４ −２５．０７１ ７７ ＡＳＮ ＣＡ １２．２２０ ５０．９５７ −２５．６８１ ７７ ＡＳＮ Ｃ １３．７０７ ５１．０２９ −２５．３４８ ７７ ＡＳＮ Ｄ １４．３６４ ４９．９７９ −２５．３１３ ７７ ＡＳＮ ＣＢ １１．３３５ ５２．０７６ −２５．１１７ ７７ ＡＳＮ ＣＧ １１．２５０ ５２．０２７ −２３．６１６ ７７ ＡＳＮ ＤＤ１ １２．０３２ ５１．３４６ −２２．９１７ ７７ ＡＳＮ ＮＤ２ １０．２９４ ５２．７４１ −２３．０２５ ７８ ＳＥＲ Ｎ １４．１２５ ５２．２６７ −２５．１６４ ７８ ＳＥＲ ＣＡ １５．５１３ ５２．６１４ −２４．９０６ ７８ ＳＥＲ Ｃ １５．８１０ ５２．７４２ −２３．４３６ ７８ ＳＥＲ Ｄ １６．９８２ ５３．０７１ −２３．１６４ ７８ ＳＥＲ ＣＢ １５．９０５ ５３．９４１ −２５．５８７ ７８ ＳＥＲ ＤＧ １５．９２６ ５３．８７０ −２６．９９９ ７９ ＩＬＥ Ｎ １４．８５８ ５２．５６５ −２２．５２９ ７９ ＩＬＥ ＣＡ １５．１５５ ５２．７８４ −２１．１２０ ７９ ＩＬＥ Ｃ １４．６１７ ５１．６８３ −２０．２３０ ７９ ＩＬＥ Ｄ １３．８４３ ５０．８４１ −２０．６７９ ７９ ＩＬＥ ＣＢ １４．４７１ ５４．１７４ −２０．６９７ ７９ ＩＬＥ ＣＧ１ １２．９４５ ５４．０３２ −２０．８１４ ７９ ＩＬＥ ＣＧ２ １４．９９７ ５５．３２０ −２１．６１２ ７９ ＩＬＥ ＣＤ１ １２．１３５ ５５．１７６ −２０．１５５

【００４８】 ８０ ＧＬＹ Ｎ １４．９９５ ５１．７６８ −１８．９８１ ８０ ＧＬＹ ＣＡ １４．４７６ ５０．９４０ −１７．９１３ ８０ ＧＬＹ Ｃ １４．６１２ ４９．４４８ −１８．２１９ ８０ ＧＬＹ Ｄ １５．７１９ ４８．９９４ −１８．５４４ ８１ ＶＡＬ Ｎ １３．５１３ ４８．７６６ −１７．９８０ ８１ ＶＡＬ ＣＡ １３．４１１ ４７．４１１ −１８．０６１ ８１ ＶＡＬ Ｃ １２．５１１ ４６．９１９ −１９．２１７ ８１ ＶＡＬ Ｄ １２．２６０ ４７．７３９ −２０．１１７ ８１ ＶＡＬ ＣＢ １３．００１ ４６．７５５ −１６．６７７ ８１ ＶＡＬ ＣＧ１ １４．０３０ ４７．０８４ −１５．５７３ ８１ ＶＡＬ ＣＧ２ １１．６３８ ４７．２６１ −１６．２３１ ８２ ＬＥＵ Ｎ １２．１２６ ４５．６４５ −１９．２１６ ８２ ＬＥＵ ＣＡ １１．３１２ ４５．０２０ −２０．２５６ ８２ ＬＥＵ Ｃ １０．３９０ ４４．０２８ −１９．５１０ ８２ ＬＥＵ Ｄ １０．８５８ ４３．３５６ −１８．６００ ８２ ＬＥＵ ＣＢ １２．２０６ ４４．２１９ −２１．２２９ ８２ ＬＥＵ ＣＧ １１．４３０ ４３．５６８ −２２．３６６ ８２ ＬＥＵ ＣＤ１ １０．７９６ ４４．６５７ −２３．２２３ ８２ ＬＥＵ ＣＤ２ １２．３５９ ４２．６７５ −２３．１９２ ８３ ＧＬＹ Ｎ ９．１３１ ４４．１８０ −１９．８１６ ８３ ＧＬＹ ＣＡ ８．１３３ ４３．３２１ −１９．１１４ ８３ ＧＬＹ Ｃ ８．０２７ ４２．０１１ −１９．９２５ ８３ ＧＬＹ Ｄ ８．５４６ ４１．８２２ −２１．０２６ ８４ ＶＡＬ Ｎ ７．２７２ ４１．１１２ −１９．２８３ ８４ ＶＡＬ ＣＡ ６．９７３ ３９．８０７ −１９．８８８ ８４ ＶＡＬ Ｃ ６．１６４ ４０．０３０ −２１．１４０ ８４ ＶＡＬ Ｄ ６．４２４ ３９．４７２ −２２．１９４ ８４ ＶＬＡ ＣＢ ６．２５６ ３８．９２０ −１８．８４１ ８４ ＣＡＬ ＣＧ１ ５．６８０ ３７．６７７ −１９．５５７ ８４ ＶＡＬ ＣＧ２ ７．１９０ ３８．５０７ −１７．７０５ ８５ ＡＬＡ Ｎ ５．１５６ ４０．９２６ −２１．０２４ ８５ ＡＬＡ ＣＡ ４．２１７ ４１．１９４ −２２．１５８ ８５ ＡＬＡ Ｃ ４．２１３ ４２．６８３ −２２．３９６ ８５ ＡＬＡ Ｄ ３．２６０ ４３．４０１ −２２．０３０ ８５ ＡＬＡ ＣＢ ２．８４６ ４０．６６３ −２１．７４８ ８６ ＰＲＯ Ｎ ５．２４０ ４３．１８６ −２３．０５９ ８６ ＰＲＯ ＣＡ ５．４１３ ４４．６３５ −２３．２０５ ８６ ＰＲＯ Ｃ ４．３２１ ４５．３７１ −２３．９４７ ８６ ＰＲＯ Ｄ ４．２９１ ４６．６０５ −２３．８４９ ８６ ＰＲＯ ＣＢ ６．５２２ ４４．７８４ −２３．８１３ ８６ ＰＲＯ ＣＧ ７．０３０ ４３．４６６ −２４．５４６ ８６ ＰＲＯ ＣＤ ６．３７７ ４２．４４０ −２３．６３６ ８７ ＳＥＲ Ｎ ３．５４８ ４４．６７６ −２４．７６９ ８７ ＳＥＲ ＣＡ ２．４８９ ４５．３２４ −２５．５２９ ８７ ＳＥＲ Ｃ １．１０３ ４５．１３２ −２４．８９７ ８７ ＳＥＲ Ｄ ０．１６２ ４５．５１３ −２５．６１９ ８７ ＳＥＲ ＣＢ ２．４０１ ４４．７７７ −２６．９２７ ８７ ＳＥＲ ＤＣ ３．５９１ ４５．１４３ −２７．５８３ ８８ ＡＬＡ Ｎ １．０１７ ４４．５６４ −２３．７４２ ８８ ＡＬＡ ＣＢ −０．１６３ ４３．５１０ −２１．８２８ ８８ ＡＬＡ ＣＡ −０．２７３ ４４．３５３ −２３．０８４ ８８ ＡＬＡ Ｃ −０．８９８ ４５．７１７ −２２．６９０ ８８ ＡＬＡ Ｄ −０．１７４ ４６．７１７ −２２．４３５ ８９ ＳＥＲ Ｎ −２．２１９ ４５．６９１ −２２．６７８ ８９ ＳＥＲ ＤＧ −４．１４６ ４７．１０２ −２４．２８０ ８９ ＳＥＲ Ｃ５ −４．３４３ ４６．９０３ −２２．８９８ ８９ ＳＥＲ ＣＡ −３．００１ ４６．８６７ −２２．２２７ ８９ ＳＥＲ Ｃ −３．１３６ ４６．７８０ −２０．７２７ ８９ ＳＥＲ Ｄ −３．７９３ ４５．８６４ −２０．２０９

【００４９】 ９０ ＬＥＵ Ｎ −２．４４６ ４７．６５６ −２０．０３７ ９０ ＬＥＵ ＣＡ −２．３７８ ４７．６６７ −１８．５９３ ９０ ＬＥＵ Ｃ −３．４８３ ４８．４３０ −１７．８６４ ９０ ＬＥＵ Ｄ −３．５８２ ４９．６０４ −１８．２１５ ９０ ＬＥＵ Ｃ５ −０．９５１ ４８．２７３ −１８．４２６ ９０ ＬＥＵ ＣＧ −０．２３３ ４７．８５１ −１７．１７４ ９０ ＬＥＵ ＣＤ１ −０．０２８ ４６．３４１ −１７．２１９ ９０ ＬＥＵ ＣＤ２ １．１６０ ４８．５２４ −１７．０４７ ９１ ＴＹＲ Ｎ −４．２６４ ４７．９４４ −１６．９３８ ９１ ＴＹＲ ＣＡ −５．２５８ ４８．６７８ −１６．１３７ ９１ ＴＹＲ Ｃ −４．８７３ ４８．７５０ −１６．６８５ ９１ ＴＹＲ Ｄ −４．４９６ ４７．７４９ −１４．０２３ ９１ ＴＹＲ ＣＢ −６．６８６ ４８．０９３ −１６．３１４ ９１ ＴＹＲ ＣＧ −７．０９４ ４８．２３７ −１７．７４１ ９１ ＴＹＲ ＣＤ１ −６．５９５ ４７．４１５ −１８．７５５ ９１ ＴＹＲ ＣＤ２ −７．９７１ ４９．２７５ −１８．１４９ ９１ ＴＹＲ ＣＥ１ −６．９０５ ４７．５７２ −２０．０９０ ９１ ＴＹＲ ＣＥ２ −８．３１５ ４９．４２１ −１９．４９２ ９１ ＴＹＲ Ｃ２ −７．７９４ ４８．５８２ −２０．４６３ ９１ ＴＹＲ ＤＮ −８．１８２ ４８．７５２ −２１．７６４ ９２ ＡＬＡ Ｎ −４．８９５ ４９．９５８ −１４．１０４ ９２ ＡＬＡ ＣＡ −４．５４９ ５０．１９９ −１２．７０７ ９２ ＡＬＡ Ｃ −５．８２３ ５０．０３３ −１１．９０３ ９２ ＡＬＡ Ｄ −６．７２３ ５０．８９８ −１２．０５０ ９２ ＡＬＡ Ｃ５ −３．９９７ ５１．６２１ −１２．４８８ ９３ ＶＡＬ Ｎ −５．９５９ ４８．９９３ −１１．１２９ ９３ ＶＡＬ ＣＡ −７．１８３ ４８．８５４ −１０．３２５ ９３ ＶＡＬ Ｃ −６．７０８ ４９．８１４ −８．８９９ ９３ ＶＡＬ Ｄ −６．１８１ ４７．９９３ −８．３７２ ９３ ＶＡＬ ＣＢ −７．９５７ ４７．５５５ −１０．６１１ ９３ ＶＡＬ ＣＧ１ −９．２１３ ４７．４８８ −９．７２５ ９３ ＶＡＬ ＣＧ２ −８．１９５ ４７．３７０ −１２．０７２ ９４ ＬＹＳ Ｎ −６．９０７ ５０．２１７ −８．３２７ ９４ ＬＹＳ ＣＡ −６．３７８ ５０．４６４ −６．９９９ ９４ ＬＹＳ Ｃ −７．３３１ ４９．９８５ −５．８９４ ９４ ＬＹＳ Ｄ −８．４５８ ５０．４８０ −５．７８３ ９４ ＬＹＳ ＣＢ −６．０５１ ５１．９７６ −６．８１８ ９４ ＬＹＳ ＣＧ −５．３９４ ５２．３２０ −５．４６７ ９４ ＬＹＳ ＣＤ −４．８６８ ５３．７８５ −５．５８２ ９４ ＬＹＳ ＣＥ −４．３９９ ５４．２０８ −４．１９９ ９４ ＬＹＳ ＮＺ −３．７３５ ５５．５４４ −４．３８７ ９５ ＶＡＬ Ｎ −６．９０９ ４９．０７１ −５．０２６ ９５ ＶＡＬ ＣＡ −７．６４６ ４８．４５７ −３．９２０ ９５ ＶＡＬ Ｃ −６．９１９ ４８．４９９ −２．５６８ ９５ ＶＡＬ Ｄ −７．４２５ ４８．１５６ −１．５０１ ９５ ＶＡＫ ＣＢ −８．１０４ ４７．０３０ −４．３１９ ９５ ＶＡＬ ＣＧ１ −８．８６８ ４６．８５２ −５．６１９ ９５ ＶＡＬ ＣＧ２ −６．９００ ４６．１００ −４．３３２ ９６ ＬＥＵ Ｎ −５．６７６ ４８．９７４ −２．６０４ ９６ ＬＥＵ ＣＡ −４．７８２ ４９．１０３ −１．４８６ ９６ ＬＥＵ Ｃ −４．３３１ ５０．５５９ −１．３２１ ９６ ＬＥＩ Ｄ −３．９４２ ５１．１２１ −２．３３６ ９６ ＬＥＵ ＣＢ −３．５０９ ４８．２４１ −１．５７３ ９６ ＬＥＵ ＣＧ −３．５９３ ４６．７９９ −２．０７２ ９６ ＬＥＵ ＣＤ１ −２．２０７ ４６．１８４ −２．１６３ ９６ ＬＥＵ ＣＤ２ −４．４８９ ４６．０８２ −１．０４５ ９７ ＧＬＹ Ｎ −４．３２６ ５０．９７５ −０．０８６ ９７ ＧＬＹ ＣＡ −３．８９０ ５２．３０７ ０．２８７ ９７ ＧＬＹ Ｃ −２．３６３ ５２．４３７ ０．３８５ ９７ ＧＬＹ Ｄ −１．６１９ ５１．４６３ ０．１６５ ９８ ＡＬＡ Ｎ −１．９５４ ５３．６４８ ０．７５８ ９８ ＡＬＡ ＣＢ −０．４２８ ５５．４７８ １．５１０ ９８ ＡＬＡ ＣＡ −０．５６３ ５４．０６８ ０．９６５ ９８ ＡＬＡ Ｃ ０．１８８ ５３．１１８ １．９１７ ９８ ＡＬＡ Ｄ １．３９３ ５２．９２１ １．６６３ ９９ ＡＳＰ Ｎ −０．５０４ ５２．５７３ ２．９１２ ９９ ＡＳＰ ＤＤ２ −２．６３１ ５１．０４２ ６．１５１ ９９ ＡＳＰ ＤＤ１ −２．７３０ ５０．９０２ ４．００３ ９９ ＡＳＰ ＣＧ −２．０８３ ５１．１３１ ５．０４０ ９９ ＡＳＰ ＣＢ −０．６４８ ５１．６０３ ５．１７５ ９９ ＡＳＰ ＣＡ ０．１０１ ５１．６１０ ３．８５５ ９９ ＡＳＰ Ｃ −０．１４６ ５０．１６５ ３．３２０ ９９ ＡＳＰ Ｄ ０．７３５ ４９．３１３ ４．０２９

【００５０】 １００ ＧＬＹ Ｎ −０．４２４ ４９．８８３ ２．１６８ １００ ＧＬＹ ＣＡ −０．３４３ ４８．５２１ １．６１５ １００ ＧＬＹ Ｃ −１．５２０ ４７．６５１ ２．００２ １００ ＧＬＹ Ｄ −１．６４９ ４６．５１２ １．４７９ １０１ ＳＥＲ Ｎ −２．３４２ ４８．１２８ ２．９０８ １０１ ＳＥＲ ＣＡ −３．５４２ ４７．３８８ ３．３１５ １０１ ＳＥＲ Ｃ −４．７５９ ４７．８９４ ２．５３２ １０１ ＳＥＲ Ｄ −４．７５８ ４８．９７２ １．９０７ １０１ ＳＥＲ ＣＢ −３．７１６ ４７．４４７ ４．８１７ １０１ ＳＥＲ ＤＧ −４．４１１ ４８．６３４ ５．２０９ １０２ ＧＬＹ Ｎ −５．８２１ ４７．０９２ ２．５７７ １０２ ＧＬＹ ＣＡ −７．０７７ ４７．４２２ １．８９６ １０２ ＧＬＹ Ｃ −８．１６６ ４６．５３６ ２．５２８ １０２ ＧＬＹ Ｄ −７．８８８ ４５．４３１ ３．０３０ １０３ ＧＬＮ Ｎ −９．３７７ ４７．０５８ ２．４９８ １０３ ＧＬＮ ＣＡ −１０．５３５ ４６．２９７ ３．０２０ １０３ ＧＬＮ Ｃ −１０．９６３ ４５．２３２ ２．０２２ １０３ ＧＬＮ Ｄ −１０．７７９ ４５．４８２ ０．８１７ １０３ ＧＬＮ ＣＢ −１１．６７１ ４７．３０７ ３．２７４ １０３ ＧＬＮ ＣＧ −１１．３６８ ４８．００５ ４．５８６ １０３ ＧＬＮ ＣＤ −１２．３６０ ４９．１０４ ４．９１５ １０３ ＧＬＮ ＤＥ１ −１２．１５９ ４９．８１６ ５．９０２ １０３ ＧＬＮ ＮＥ２ −１３．４１９ ４９．１９７ ４．１１２ １０４ ＴＹＲ Ｎ −１１．６１１ ４４．１４１ ２．４５１ １０４ ＴＹＲ ＣＡ −１２．０６８ ４３．１２６ １．５０８ １０４ ＴＹＲ Ｃ −１３．０３１ ４３．６９０ ０．４７３ １０４ ＴＹＲ Ｄ −１２．９３９ ４３．２７６ −０．６８７ １０４ ＴＹＲ Ｃ５ −１２．６９７ ４１．８６６ ２．１４３ １０４ ＴＹＲ ＣＧ −１１．６２９ ４０．８２９ ２．４７２ １０４ ＴＹＲ ＣＤ１ −１１．８１９ ３９．７８９ ３．３７７ １０４ ＴＹＲ ＣＤ２ −１０．３７９ ４０．９５９ １．８６０ １０４ ＴＹＲ ＣＥ１ −１０．８０５ ３８．８８５ ３．７０７ １０４ ＴＹＲ ＣＥ２ −９．３５２ ４０．０５７ ２．１７１ １０４ ＴＹＲ ＣＺ −９．５６４ ３９．０２２ ３．０８１ １０４ ＴＹＲ ＤＮ −８．４８１ ３８．１９１ ３．３２４ １０５ ＳＥＲ Ｎ −１３．９０９ ４４．５７２ ０．９０３ １０５ ＳＥＲ ＣＡ −１４．８７７ ４５．１６６ −０．０３４ １０５ ＳＥＲ Ｃ −１４．１７２ ４５．９２０ −１．１５９ １０５ ＳＥＲ Ｄ −１４．１５９ ４５．９３５ −２．２５８ １０５ ＳＥＲ ＣＢ −１５．８８０ ４６．１２１ ０．６０１ １０５ ＳＥＲ ＤＧ −１５．２０９ ４７．０３９ １．４５０ １０６ ＴＲＰ Ｎ −１３．０７９ ４６．６２５ −０．８３４ １０６ ＴＲＰ ＣＡ −１２．４２１ ４７．３９１ −１．９４８ １０６ ＴＲＰ Ｃ −１１．８９５ ４６．４３６ −３．０１２ １０６ ＴＲＰ Ｄ −１２．０２１ ４６．６４８ −４．２４５ １０６ ＴＲＰ Ｃ５ −１１．３２１ ４８．２５４ −１．３５５ １０６ ＴＲＰ ＣＧ −１１．６４５ ４３．１１１ −０．２０６ １０６ ＴＲＰ ＣＤ１ −１２．８６２ ４９．５２４ ０．２６４ １０６ ＴＲＰ ＣＤ２ −１０．６５８ ４９．８１２ ０．５８１ １０６ ＴＲＰ ＮＥ１ −１２．６９１ ５０．３５８ １．３６０ １０６ ＴＲＰ ＣＥ２ −１１．３５９ ５０．５７３ １．５６１ １０６ ＴＲＰ ＣＥ３ −９．２７５ ４９．８５２ ０．５７６ １０６ ＴＲＰ ＣＺ２ −１０．６７１ ５１．３１８ ２．５００ １０６ ＴＲＰ ＣＺ３ −８．５６８ ５０．５６３ １．５２５ １０６ ＴＲＰ ＣＭ２ −９．２９３ ５１．２９１ ２．４５５ １０７ ＩＬＥ Ｎ −１１．３３９ ４５．３３０ −２．４８１ １０７ ＩＬＥ ＣＡ −１０．７６５ ４４．２５０ −３．３２５ １０７ ＩＬＥ Ｃ −１１．９５５ ４３．５９４ −４．１９０ １０７ ＩＬＥ Ｄ −１１．６９５ ４３．４７４ −５．３９８ １０７ ＩＬＥ Ｃ５ −９．９４４ ４３．１８３ −２．５２３ １０７ ＩＬＥ ＣＧ１ −８．６３４ ４３．７６４ −１．９３６ １０７ ＩＬＥ ＣＧ２ −９．６３２ ４１．９３０ −３．３８１ １０７ ＩＬＥ ＣＤ１ −８．２３３ ４２．９９８ −０．６２７ １０８ ＩＬＥ Ｎ −１２．９９４ ４３．２９２ −３．５７７ １０８ ＩＬＥ ＣＡ −１４．１１６ ４２．７２２ −４．３２１ １０８ ＩＬＥ Ｃ −１４．６３９ ４３．６９４ −５．３８６ １０８ ＩＬＥ Ｏ −１４．８９４ ４３．３２９ −６．５５２ １０８ ＩＬＥ ＣＧ −１５．２４６ ４２．２６５ −３．３２０ １０８ ＩＬＥ ＣＧ１ −１４．７２６ ４１．０７７ −２．４８２ １０８ ＩＬＥ ＣＧ２ −１６．５６８ ４２．０２４ −４．０９５ １０８ ＩＬＥ ＣＤ１ −１５．４５２ ４０．８４５ −１．１３１ １０９ ＡＳＮ Ｎ −１４．７５１ ４４．９５８ −４．９８１ １０９ ＡＳＮ ＣＡ −１５．２０４ ４６．０１８ −５．９１６ １０９ ＡＳＮ Ｃ −１４．２３２ ４６．０６７ −７．０８４ １０９ ＡＳＮ Ｏ −１４．６６０ ４６．２７２ −８．２３５ １０９ ＡＳＮ ＣＢ −１５．２８０ ４７．３５９ −５．２０７ １０９ ＡＳＮ ＣＧ −１６．５２８ ４７．４８６ −４．３５３ １０９ ＡＳＮ ＯＤ１ −１７．４５５ ４６．６９５ −４．６４６ １０９ ＡＳＮ ＮＤ２ −１６．６３３ ４８．４４７ −３．４４２

【００５１】 １１０ ＧＬＹ Ｎ −１２．９５１ ４５．９０８ −６．７７４ １１０ ＧＬＹ ＣＡ −１１．９５２ ４５．９１７ −７．８６５ １１０ ＧＬＹ Ｃ −１２．１０８ ４４．７１２ −８．８１２ １１０ ＧＬＹ Ｏ −１１．９２９ ４４．９２９ −１０．０３４ １１１ ＩＬＥ Ｎ −１２．３７９ ４３．５３９ −８．２４６ １１１ ＩＬＥ ＣＡ −１２．６０３ ４２．３３４ −９．０９９ １１１ ＩＬＥ Ｃ −１３．８５９ ４２．５６０ −９．９４２ １１１ ＩＬＥ Ｏ −１３．９２１ ４２．３８４ −１１．１４８ １１１ ＩＬＥ ＣＢ −１２．７３４ ４０．９４８ −８．３６４ １１１ ＩＬＥ ＣＧ１ −１１．４２１ ４０．５０１ −７．６５５ １１１ ＩＬＥ ＣＧ２ −１３．１２２ ３９．７９１ −９．３４７ １１１ ＩＬＥ ＣＤ１ −１１．５８８ ３９．７０６ −６．３３６ １１２ ＧＬＵ Ｎ −１４．８９３ ４３．０７５ −９．２８０ １１２ ＧＬＵ ＣＡ −１６．１１８ ４３．３７６ −１０．０４６ １１２ ＧＬＵ Ｃ −１５．８７２ ４４．３４７ −１１．１７１ １１２ ＧＬＵ Ｏ −１６．４６７ ４４．１３０ −１２．２４６ １１２ ＧＬＵ Ｃ５ −１７．２２９ ４３．８９９ −９．１４１ １１２ ＧＬＵ ＣＧ −１７．８４７ ４２．９１７ −８．１３５ １１２ ＧＬＵ ＣＤ −１８．７２４ ４１．８２４ −８．６８５ １１２ ＧＬＵ ＤＥ１ −１９．０４１ ４０．８６６ −８．０１６ １１２ ＧＬＵ ＤＥ２ −１９．１２３ ４１．９２８ −９．８６６ １１３ ＴＲＰ Ｎ −１５．０９４ ４５．４０３ −１０．９７１ １１３ ＴＲＰ ＣＡ −１４．７５６ ４６．４００ −１２．０００ １１３ ＴＲＰ Ｃ −１４．０７６ ４５．６６３ −１３．１４０ １１３ ＴＲＰ Ｏ −１４．３１９ ４５．９３２ −１４．３３２ １１３ ＴＲＰ ＣＢ −１３．８８２ ４７．５３３ −１１．４３４ １１３ ＴＲＰ ＣＧ −１３．４８６ ４８．５５６ −１２．４８１ １１３ ＴＲＰ ＣＤ１ −１４．１４８ ４９．７３６ −１２．６８１ １１３ ＴＲＰ ＣＤ２ −１２．４４１ ４８．５５２ −１３．４６３ １１３ ＴＲＰ ＮＥ１ −１３．５９７ ５０．４４３ −１３．７２３ １１３ ＴＲＰ ＣＥ２ −１２．５４５ ４９．７６１ −１４．２１５ １１３ ＴＲＰ ＣＥ３ −１１．４５１ ４７．６４５ −１３．８０９ １１３ ＴＲＰ ＣＺ２ −１１．６９６ ５０．０４５ −１５．２７４ １１３ ＴＲＰ ＣＺ３ −１０．６１０ ４７．８９９ −１４．８７９ １１３ ＴＲＰ ＣＨ２ −１０．７５２ ４９．０７４ −１５．６０３ １１４ ＡＬＡ Ｎ −１３．０８９ ４４．８０１ −１２．８３２ １１４ ＡＬＡ ＣＡ −１２．３３３ ４４．０６５ −１３．８７４ １１４ ＡＬＡ Ｃ −１３．１９９ ４３．１７９ −１４．７５２ １１４ ＡＬＡ Ｏ −１２．９６３ ４３．０７４ −１５．９７８ １１４ ＡＬＡ ＣＢ −１１．２９９ ４３．１９２ −１３．１４０ １１５ ＩＬＥ Ｎ −１４．１７４ ４２．５４０ −１４．１１９ １１５ ＩＬＥ ＣＡ −１５．０７０ ４１．６４０ −１４．８９７ １１５ ＩＬＥ Ｃ −１５．９２８ ４２．４８５ −１５．８５６ １１５ ＩＬＥ Ｏ −１６．０７７ ４２．２２５ −１７．０７０ １１５ ＩＬＥ Ｃ５ −１６．０００ ４０．８４０ −１３．９２２ １１５ ＩＬＥ ＣＧ１ −１５．２１８ ３９．８３６ −１３．０４３ １１５ ＩＬＥ ＣＧ２ −１７．１５１ ４０．１６８ −１４．７５５ １１５ ＩＬＥ ＣＤ１ −１６．００４ ３９．４１１ −１１．７４３ １１６ ＡＬＡ Ｎ −１６．５３４ ４３．５２７ −１５．２６７ １１６ ＡＬＡ ＣＡ −１７．３９０ ４４．４４０ −１６．０５０ １１６ ＡＬＡ Ｃ −１６．７０６ ４５．０６９ −１７．２７８ １１６ ＡＬＡ Ｏ −１７．３２３ ４５．２５５ −１８．３４３ １１６ ＡＬＡ ＣＢ −１８．０１１ ４５．５１０ −１５．１５１ １１７ ＡＳＮ Ｎ −１５．４２３ ４５．３９０ −１７．１２２ １１７ ＡＳＮ ＣＡ −１４．５５３ ４５．９６７ −１８．１３９ １１７ ＡＳＮ Ｃ −１３．８２７ ４４．９７４ −１９．０３４ １１７ ＡＳＮ Ｏ −１２．９９７ ４５．４３６ −１９．８２０ １１７ ＡＳＮ ＣＢ −１３．６１５ ４６．９５８ −１７．４２６ １１７ ＡＳＮ ＣＧ −１４．４００ ４８．１７７ −１６．９３９ １１７ ＡＳＮ ＯＤ１ −１４．５６５ ４９．０８２ −１７．７７３ １１７ ＡＳＮ ＮＤ２ −１４．９３１ ４８．２４９ −１５．７３６ １１８ ＡＳＮ Ｎ −１４．２２３ ４３．７２５ −１８．９６７ １１８ ＡＳＮ ＣＡ −１３．７６０ ４２．６４２ −１９．８３２ １１８ ＡＳＮ Ｃ −１２．２４０ ４２．４４４ −１９．８４３ １１８ ＡＳＮ Ｏ −１１．６１７ ４２．３０９ −２０．９３２ １１８ ＡＳＮ ＣＢ −１４．２４７ ４２．８６３ −２１．２７９ １１８ ＡＳＮ ＣＧ −１５．７３７ ４３．０６０ −２１．３９５ １１８ ＡＳＮ ＯＤ１ −１６．５１０ ４２．３２１ −２０．７５９ １１８ ＡＳＮ ＮＤ２ −１６．１３６ ４４．０９６ −２２．１３３ １１９ ＭＥＴ Ｎ −１１．６８６ ４２．５００ −１８．６７５ １１９ ＭＥＴ ＣＡ −１０．２３２ ４２．２２２ −１８．４７８ １１９ ＭＥＴ Ｃ −１０．０２５ ４０．７３４ −１８．９２８ １１９ ＭＥＴ Ｏ −１０．８８８ ３９．８３８ −１８．７５９ １１９ ＭＥＴ ＣＢ −９．８１０ ４２．４６１ −１７．０５５ １１９ ＭＥＴ ＣＧ −９．８８０ ４３．８８３ −１６．５０２ １１９ ＭＥＴ ＳＤ −８．７８８ ４４．９４３ −１７．５２６ １１９ ＭＥＴ ＣＥ −９．９８２ ４６．０６１ −１８．２６３

【００５２】 １２０ ＡＳＰ Ｎ −８．９０４ ４０．４３７ −１９．５８４ １２０ ＡＳＰ ＣＡ −８．４８０ ３９．１１８ −２０．０３０ １２０ ＡＳＰ Ｃ −７．８２２ ３８．３９０ −１８．８５６ １２０ ＡＳＰ Ｏ −８．０３８ ３７．１８９ −１８．６９０ １２０ ＡＳＰ ＣＢ −７．５５５ ３９．１５６ −２１．２３６ １２０ ＡＳＰ ＣＧ −８．２３７ ３９．７３０ −２２．４５４ １２０ ＡＳＰ ＯＤ１ −７．８０１ ４０．７０６ −２３．０８４ １２０ ＡＳＰ ＯＤ２ −９．３２７ ３９．１３５ −２２．７３９ １２１ ＶＡＬ Ｎ −７．０２１ ３９．１１７ −１８．１１５ １２１ ＶＡＬ ＣＡ −６．２２６ ３８．６０１ −１６．９７４ １２１ ＶＡＬ Ｃ −６．２９６ ３９．５３４ −１５．７８６ １２１ ＶＡＬ Ｏ −６．２８４ ４０．７８８ −１５．９０９ １２１ ＶＡＬ ＣＢ −４．７５５ ３８．５８７ −１７．４９６ １２１ ＶＡＬ ＣＧ１ −３．７５８ ３８．１７６ −１６．４２７ １２１ ＶＡＬ ＣＧ２ −４．７０７ ３７．９１６ −１８．８４６ １２２ ＩＬＥ Ｎ −６．３１８ ３８．９７８ −１４．５９０ １２２ ＩＬＥ ＣＡ −６．２４８ ３９．７９９ −１３．３９７ １２２ ＩＬＥ Ｃ −５．０２０ ３９．２６２ −１２．６２７ １２２ ＩＬＥ Ｏ −４．８２９ ３８．０１２ −１２．４６９ １２２ ＩＬＥ ＣＢ −７．４７６ ３９．６０４ −１２．４６６ １２２ ＩＬＥ ＣＧ１ −８．６８６ ４０．３９２ −１３．０６３ １２２ ＩＬＥ ＣＧ２ −７．２２１ ３９．８８３ −１０．９５４ １２２ ＩＬＥ ＣＤ１ −９．９７６ ３９．７８８ −１２．３９３ １２３ ＡＳＮ Ｎ −４．２６３ ４０．２２２ −１２．１１０ １２３ ＡＳＮ ＣＡ −３．１４５ ３９．８５４ −１１．２３２ １２３ ＡＳＮ Ｃ −３．５０２ ４０．４０４ −９．８６１ １２３ ＡＳＮ Ｏ −３．７０８ ４１．６３１ −９．８３３ １２３ ＡＳＮ Ｃ５ −１．８２８ ４０．４７８ −１１．６９７ １２３ ＡＳＮ ＣＧ −０．６９２ ４０．０４８ −１０．７７７ １２３ ＡＳＮ ＯＤ１ −０．０６３ ３８．９９０ −１１．０１８ １２３ ＡＳＮ ＮＤ２ −０．３４６ ４０．７４７ −９．７２０ １２４ ＭＥＴ Ｎ −３．４５８ ３９．６０４ −８．８３２ １２４ ＭＥＴ ＣＡ −３．６５０ ３９．９７３ −７．４３８ １２４ ＭＥＴ Ｃ −２．４２３ ３９．６０３ −６．６１４ １２４ ＭＥＴ Ｏ −２．３０６ ３８．５０８ −６．０３０ １２４ ＭＥＴ ＣＢ −４．９４３ ３９．３８７ −６．８９０ １２４ ＭＥＴ ＣＧ −６．１５８ ４０．０８２ −７．４７３ １２４ ＭＥＴ ＳＤ −７．５８５ ３９．４７２ −６．４５０ １２４ ＭＥＴ ＣＥ −７．９４０ ３０．０９５ −７．５４２ １２５ ＳＥＲ Ｎ −１．４５４ ４０．４９６ −６．５０２ １２５ ＳＥＲ ＣＡ −０．１９３ ４０．２８７ −５．７６９ １２５ ＳＥＲ Ｃ −０．４２２ ４０．７１２ −４．３２６ １２５ ＳＥＲ Ｄ ０．２３５ ４１．６１７ −３．８０５ １２５ ＳＥＲ ＣＢ １．０２１ ４１．０２７ −６．３２８ １２５ ＳＥＲ ＤＧ １．４４４ ４０．４９６ −７．５７５ １２６ ＬＥＵ Ｎ −１．４３３ ４０．０７５ −３．７７５ １２６ ＬＥＵ ＣＡ −１．６４２ ４０．３４７ −２．３８６ １２６ ＬＥＵ Ｃ −２．４３８ ３９．０５６ −１．８０７ １２６ ＬＥＵ Ｏ −２．８４４ ３８．１３６ −２．５２９ １２６ ＬＥＵ ＣＧ −２．７９１ ４１．５６８ −２．４１０ １２６ ＬＥＵ ＣＧ −３．９８８ ４１．４４７ −３．３３３ １２６ ＭＥＴ ＣＤ１ −５．２７８ ４１．１３１ −２．５７８ １２６ ＬＥＵ ＣＤ２ −４．１７９ ４２．７６０ −４．０７３ １２７ ＧＬＹ Ｎ −２．５２２ ３９．０８２ −０．４８１ １２７ ＧＬＹ ＣＡ −３．０３５ ３７．８７１ ０．１９３ １２７ ＧＬＹ Ｃ −３．１７６ ３８．１８０ １．６８２ １２７ ＧＬＹ Ｏ −２．４４６ ３９．０３０ ２．２２０ １２８ ＧＬＹ Ｎ −４．１２１ ３７．４４３ ２．２２２ １２８ ＧＬＹ ＣＡ −４．４７５ ３７．４９６ ３．６４２ １２８ ＧＬＹ Ｃ −４．６４４ ３６．０３８ ４．１０４ １２８ ＧＬＹ Ｄ −４．９０３ ３５．１５８ ３．２７６ １２９ ＰＲＯ Ｎ −４．５１９ ３５．８５７ ５．４０２ １２９ ＰＲＯ ＣＡ −４．６７１ ３４．５２５ ５．９９８ １２９ ＰＲＯ Ｃ −６．１１６ ３４．０８６ ６．０８２ １２９ ＰＲＯ Ｄ −６．３３８ ３２．８８７ ６．３０５ １２９ ＰＲＯ ＣＢ −４．０６０ ３４．６８４ ７．３８４ １２９ ＰＲＯ ＣＧ −４．４１９ ３６．１１６ ７．７２７ １２９ ＰＲＯ ＣＤ −４．２３９ ３６．８７０ ６．４１８

【００５３】 １３０ ＳＥＲ Ｎ −７．０５１ ３５．０１５ ５．９１２ １３０ ＳＥＲ ＣＡ −８．４７０ ３４．６１１ ６．０２３ １３０ ＳＥＲ Ｃ −９．２１８ ３４．８８４ ４．７２６ １３０ ＳＥＲ Ｏ −８．９４９ ３５．８８１ ６．０２９ １３０ ＳＥＲ ＣＢ −９．０６９ ３５．３５１ ７．２１６ １３０ ＳＥＲ ＤＣ −８．７２３ ３４．６２６ ８．４０３ １３１ ＧＬＹ Ｎ −１０．０８３ ３３．９６７ ４．３４９ １３１ ＧＬＹ ＣＡ −１０．８２４ ３４．２２９ ３．０７４ １３１ ＧＬＹ Ｃ −１２．２０５ ３４．７１３ ３．５４２ １３１ ＧＬＹ Ｏ −１２．４９５ ３４．７２２ ４．７５１ １３２ ＳＥＲ Ｎ −１３．０４０ ３５．０５８ ２．５９４ １３２ ＳＥＲ ＣＡ −１４．４０７ ３５．４３３ ３．０１１ １３２ ＳＥＲ Ｃ −１５．２８９ ３４．８０５ １．９３６ １３２ ＳＥＲ Ｏ −１４．７９９ ３４．５８６ ０．８２４ １３２ ＳＥＲ ＣＢ −１４．５９０ ３６．９２７ ３．１４５ １３２ ＳＥＲ ＯＧ −１４．６９３ ３７．５３９ １．８７５ １３３ ＡＬＡ Ｎ −１６．５４７ ３４．５８８ ２．２９４ １３３ ＡＬＡ ＣＡ −１７．５０７ ３４．０５７ １．３２６ １３３ ＡＬＡ Ｃ −１７．６５０ ３４．９６５ ０．０９７ １３３ ＡＬＡ Ｄ −１７．７４３ ３４．４３７ −１．０１４ １３３ ＡＬＡ ＣＢ −１８．８６６ ３３．８２８ １．９９６ １３４ ＡＬＡ Ｎ −１７．６８３ ３６．２８８ ０．２９４ １３４ ＡＬＡ ＣＡ −１７．８７２ ３７．２５９ −０．７９２ １３４ ＡＬＡ Ｃ −１６．６３５ ３７．３６９ −１．６７４ １３４ ＡＬＡ Ｄ −１６．７８１ ３７．５８５ −２．８６９ １３４ ＡＬＡ ＣＢ −１８．２６３ ３８．６００ −０．１８７ １３５ ＬＥＵ Ｎ −１５．４７８ ３７．２２９ −１．０４６ １３５ ＬＥＵ ＣＡ −１４．１９７ ３７．２４４ −１．８０４ １３５ ＬＥＵ Ｃ −１４．１５８ ３６．００５ −２．７０５ １３５ ＬＥＵ Ｄ −１３．７９４ ３６．０２０ −３．８９０ １３５ ＬＥＵ ＣＢ −１３．０３８ ３７．３２８ −０．７９８ １３５ ＬＥＵ ＣＧ −１１．６９３ ３７．１３０ −１．５０８ １３５ ＬＥＵ ＣＤ１ −１１．４６０ ３８．４１５ −２．２９２ １３５ ＬＥＵ ＣＤ２ −１０．５８２ ３６．８０７ −０．５１９ １３６ ＬＹＳ Ｎ −１４．５０９ ３４．８２５ −２．１７３ １３６ ＬＹＳ ＣＡ −１４．５４３ ３３．５９７ −３．０１３ １３６ ＬＹＳ Ｃ −１５．５４４ ３３．７３９ −４．１５０ １３６ ＬＹＳ Ｃ −１５．２７９ ３３．４３１ −５．３０５ １３６ ＬＹＳ ＣＢ −１４．９０３ ３２．３４１ −２．１８６ １３６ ＬＹＳ ＣＧ −１４．７４３ ３１．０６７ −３．０４３ １３６ ＬＹＳ ＣＤ −１５．０８３ ２９．８９２ −２．１３４ １３６ ＬＹＳ ＣＥ −１５．７４３ ２８．７０７ −２．７７８ １３６ ＬＹＳ ＮＺ −１５．３０８ ２８．４１１ −４．１０６ １３７ ＡＬＡ Ｎ −１６．７４４ ３４．２６０ −３．８４７ １３７ ＡＬＡ ＣＡ −１７．７９５ ３４．４１６ −４．８８３ １３７ ＡＬＡ Ｃ −１７．３３８ ３５．３０３ −６．０４５ １３７ ＡＬＡ Ｏ −１７．７０５ ３５．０４９ −７．２０８ １３７ ＡＬＡ ＣＢ −１９．０９４ ３４．９４１ −４．２６３ １３８ ＡＬＡ Ｎ −１６．５２９ ３６．３０１ −５．７２９ １３８ ＡＬＡ ＣＡ −１６．００１ ３７．３１１ −６．６８５ １３８ ＡＬＡ Ｃ −１４．９０３ ３６．６９６ −７．５５７ １３８ ＡＬＡ Ｄ −１４．９８５ ３６．８４３ −８．７６２ １３８ ＡＬＡ ＣＢ −１５．５２２ ３８．５６７ −５．９３４ １３９ ＶＡＬ Ｎ −１３．９５０ ３５．９５９ −７．０２７ １３９ ＶＡＬ ＣＡ −１２．９４６ ３５．２９１ −７．８３７ １３９ ＶＡＬ Ｃ −１３．６２３ ３４．２２８ −８．７２０ １３９ ＶＡＬ Ｄ −１３．２０８ ３４．０７０ −９．８７７ １３９ ＶＡＬ ＣＢ −１１．８３０ ３４．６７１ −６．９６８ １３９ ＶＡＬ ＣＧ１ −１０．９１９ ３３．８５６ −７．８６６ １３９ ＶＡＬ ＣＧ２ −１１．０７８ ３５．７８０ −６．２５３

【００５４】 １４０ ＡＳＰ Ｎ −１４．５９３ ３３．５３６ −８．１２２ １４０ ＡＳＰ ＣＡ −１５．２７４ ３２．４９６ −８．９２９ １４０ ＡＳＰ Ｃ −１６．０２３ ３３．１３１ −１０．０８４ １４０ ＡＳＰ Ｄ −１６．０８０ ３２．５７９ −１１．１９０ １４０ ＡＳＰ ＣＢ −１６．１４９ ３１．５４９ −８．１５８ １４０ ＡＳＰ ＣＧ −１５．３８８ ３０．６４０ −７．１８６ １４０ ＡＳＰ ＤＤ１ −１４．１７８ ３０．４０３ −７．２０２ １４０ ＡＳＰ ＤＤ２ −１６．１３９ ３０．１３２ −６．３２９ １４１ ＬＹＳ Ｎ −１６．６５８ ３４．２６３ −９．８２０ １４１ ＬＹＳ ＣＡ −１７．３７３ ３５．００６ −１０．８６８ １４１ ＬＹＳ Ｃ −１６．３７３ ３５．４１５ −１１．９４６ １４１ ＬＹＳ Ｄ −１６．７００ ３５．２４８ −１３．１１１ １４１ ＬＹＳ ＣＢ −１８．０３９ ３６．２７５ −１０．３２５ １４１ ＬＹＳ ＣＧ −１８．８８４ ３７．０５６ −１１．３０６ １４１ ＬＹＳ ＣＤ −１９．５８６ ３８．１８７ −１０．５３６ １４１ ＬＹＳ ＣＥ −２０．５７２ ３９．０５１ −１１．２５０ １４１ ＬＹＳ ＮＺ −２１．１３８ ４０．０３７ −１０．２７５ １４２ ＡＬＡ Ｎ −１５．１６７ ３５．８４８ −１１．５６６ １４２ ＡＬＡ ＣＡ −１４．１７３ ３６．１９２ −１２．６１４ １４２ ＡＬＡ Ｃ −１３．８１８ ３５．０１０ −１３．５２１ １４２ ＡＬＡ Ｄ −１３．７７０ ３５．１６９ −１４．７５５ １４２ ＡＬＡ ＣＢ −１２．８７０ ３６．６９７ −１１．９４８ １４３ ＶＡＬ Ｎ −１３．５８２ ３３．８８６ −１２．８３２ １４３ ＶＡＬ ＣＡ −１３．１６８ ３２．７０５ −１３．６５０ １４３ ＶＡＬ Ｃ −１４．３４６ ３２．２３３ −１４．４９６ １４３ ＶＡＬ Ｄ −１４．１４０ ３１．８８６ −１５．６３９ １４３ ＶＡＬ ＣＢ −１２．５５１ ３１．６７３ −１２．７１４ １４３ ＶＡＬ ＣＧ１ −１２．３００ ３０．３７０ −１３．４６１ １４３ ＶＡＬ ＣＧ２ −１１．３０５ ３２．１９５ −１２．０１４ １４４ ＡＬＡ Ｎ −１５．５３１ ３２．２３８ −１３．８７５ １４４ ＡＬＡ ＣＡ −１６．７４４ ３１．８３４ −１４．６４１ １４４ ＡＬＡ Ｃ −１６．９２８ ３２．６８１ −１５．８６１ １４４ ＡＬＡ Ｄ −１７．３８０ ３２．２６３ −１６．９５３ １４４ ＡＬＡ ＣＢ −１７．９４２ ３１．９６８ −１３．７００ １４５ ＳＥＲ Ｎ −１６．５０７ ３３．９４８ −１５．７０６ １４５ ＳＥＲ ＣＡ −１６．６８２ ３４．９０７ −１６．７８６ １４５ ＳＥＲ Ｃ −１５．６０９ ３４．７７３ −１７．８２９ １４５ ＳＥＲ Ｏ −１５．９１０ ３５．３２１ −１８．８９３ １４５ ＳＥＲ ＣＢ −１７．０１６ ３６．３７６ −１６．６１４ １４５ ＳＥＲ ＯＧ −１５．８８２ ３６．９５５ −１５．８４９ １４６ ＧＬＹ Ｎ −１４．５７７ ３３．９８６ −１７．５６５ １４６ ＧＬＹ ＣＡ −１３．６１９ ３３．７９９ −１８．６７５ １４６ ＧＬＹ Ｃ −１２．２７３ ３４．４９１ −１８．３８５ １４６ ＧＬＹ Ｏ −１１．４２０ ３４．３８６ −１９．２６６ １４７ ＶＡＬ Ｎ −１２．１５０ ３５．１６２ −１７．２５４ １４７ ＶＡＬ ＣＡ −１０．８７４ ３５．８５６ −１６．９１２ １４７ ＶＡＬ Ｃ −９．８５０ ３４．８３６ −１６．３２３ １４７ ＶＡＬ Ｄ −１０．１７１ ３３．９９１ −１５．４８６ １４７ ＶＡＬ ＣＢ −１１．１５２ ３６．９７７ −１５．８８９ １４７ ＶＡＬ ＣＧ１ −９．８９６ ３７．８０３ −１５．５７０ １４７ ＶＡＬ ＣＧ２ −１２．３４０ ３７．９１５ −１６．２３０ １４８ ＶＡＬ Ｎ −８．５８３ ３５．０１８ −１６．６０３ １４８ ＶＡＬ ＣＡ −７．４８２ ３４．２３０ −１６．００８ １４８ ＶＡＬ Ｃ −７．１５７ ３４．９０７ −１４．７０１ １４８ ＶＡＬ Ｄ −６．８４０ ３６．１３３ −１４．７５０ １４８ ＶＡＬ ＣＢ −６．２７３ ３４．１２４ −１６．９５０ １４８ ＶＡＬ ＣＧ１ −５．０７９ ３３．４０３ −１６．２８１ １４８ ＶＡＬ ＣＧ２ −６．５９０ ３３．４３２ −１８．２６２ １４９ ＶＡＬ Ｎ −７．２５８ ３４．３５５ −１３．５３１ １４９ ＶＡＬ ＣＡ −６．９８７ ３４．９６５ −１２．２４９ １４９ ＶＡＬ Ｃ −５．７００ ３４．３８５ −１１．６１３ １４９ ＶＡＬ Ｄ −５．６２４ ３３．１７３ −１１．４３９ １４９ ＶＡＬ ＣＢ −８．２２４ ３４．８９０ −１１．３１５ １４９ ＶＡＬ ＣＧ１ −７．８９３ ３３．６１９ −１０．００９ １４９ ＶＡＬ ＣＧ２ −９．４５６ ３５．３８６ −１２．０９６

【００５５】 １５０ ＶＡＬ Ｎ −４．７３２ ３５．３０１ −１１．４０４ １５０ ＶＡＬ ＣＡ −３．３９３ ３４．９８７ −１０．９０１ １５０ ＶＡＬ Ｃ −３．１５７ ３５．６２５ −９．５５９ １５０ ＶＡＬ Ｏ −３．５９２ ３６．７７８ −９．４００ １５０ ＶＡＬ ＣＢ −２．２７４ ３５．３０５ −１１．９５１ １５０ ＶＡＬ ＣＧ１ −０．９７３ ３４．６３３ −１１．４６１ １５０ ＶＡＬ ＣＧ２ −２．６７５ ３４．８４３ −１３．３０１ １５１ ＡＬＡ Ｎ −２．５６８ ３４．９４６ −８．５９５ １５１ ＡＬＡ ＣＡ −２．３６１ ３５．５８２ −７．２８７ １５１ ＡＬＡ Ｃ −１．０８０ ３５．０３６ −６．６５７ １５１ ＡＬＡ Ｏ −０．６１８ ３３．８８９ −６．９０４ １５１ ＡＬＡ ＣＢ −３．５５７ ３５．３９０ −６．３０７ １５２ ＡＬＡ Ｎ −０．４９０ ３５．９０７ −５．８２２ １５２ ＡＬＡ ＣＡ ０．７１４ ３５．４３８ −５．１１２ １５２ ＡＬＡ Ｃ ０．３０４ ３４．３２０ −４．１５８ １５２ ＡＬＡ Ｏ −０．７２８ ３４．４６６ −３．４６７ １５２ ＡＬＡ ＣＢ １．２６６ ３６．６０７ −４．２９４ １５３ ＡＬＡ Ｎ １．１２５ ３３．３０２ −３．９１２ １５３ ＡＬＡ ＣＡ ０．８４０ ３２．２５０ −２．９４３ １５３ ＡＬＡ Ｃ ０．９３１ ３２．７２５ −１．５１１ １５３ ＡＬＡ Ｄ ０．３１７ ３２．１９２ −０．５９９ １５３ ＡＬＡ ＣＢ １．７５０ ３１．０３８ −３．１９５ １５４ ＧＬＹ Ｎ １．８２７ ３３．６９３ −１．２４４ １５４ ＧＬＹ ＣＡ ２．０４３ ３４．２１１ ０．１２５ １５４ ＧＬＹ Ｃ ３．５１９ ３４．０６９ ０．５５０ １５４ ＧＬＹ Ｏ ４．１８９ ３３．２６７ −０．１１８ １５５ ＡＳＮ Ｎ ３．９５８ ３４．７８８ １．５６８ １５５ ＡＳＮ ＣＡ ５．３４４ ３４．７８７ ２．０３７ １５５ ＡＳＮ Ｃ ５．３９９ ３４．２５８ ３．４６２ １５５ ＡＳＮ Ｏ ６．１０１ ３４．８２９ ４．２９５ １５５ ＡＳＮ ＣＢ ６．００８ ３６．１５８ １．９０４ １５５ ＡＳＮ ＣＧ ５．８９０ ３６．７０２ ０．５００ １５５ ＡＳＮ ＯＤ１ ６．１２３ ３６．０６５ −０．５３４ １５５ ＡＳＮ ＮＤ２ ５．４５４ ３７．９６５ ０．３５２ １５６ ＧＬＵ Ｎ ４．７１１ ３３．１６８ ３．６７５ １５６ ＧＬＵ ＣＡ ４．６３３ ３２．５３７ ４．９７０ １５６ ＧＬＵ Ｃ ５．５２２ ３１．３２８ ５．１８３ １５６ ＧＬＵ Ｄ ５．３７４ ３０．６３７ ６．２２２ １５６ ＧＬＵ ＣＢ ３．２０５ ３１．９８０ ５．１００ １５６ ＧＬＵ ＣＧ ２．４９１ ３２．４４２ ６．３６８ １５６ ＧＬＵ ＣＤ ２．３９４ ３３．９５１ ６．２７０ １５６ ＧＬＵ ＤＥ１ １．７４４ ３４．３２２ ５．３１２ １５６ ＧＬＵ ＤＥ２ ３．１０６ ３４．４５６ ７．１４６ １５７ ＧＬＹ Ｎ ６．３８９ ３１．０５７ ４．２２７ １５７ ＧＬＹ ＣＡ ７．３０６ ２９．９１７ ４．３８７ １５７ ＧＬＹ Ｃ ６．５０３ ２８．６２２ ４．５５３ １５７ ＧＬＹ Ｄ ５．４１６ ２８．３４６ ４．００９ １５８ ＴＭＲ Ｎ ７．１４７ ２７．７９３ ５．３８２ １５８ ＴＭＲ ＣＧ２ ８．０７９ ２５．３９６ ３．８５０ １５８ ＴＭＲ ＤＧ１ ８．７０７ ２５．４８７ ６．２１７ １５８ ＴＭＲ ＣＢ ７．５６４ ２５．３４６ ５．２９６ １５８ ＴＭＲ ＣＡ ６．５５２ ２６．４８７ ５．７０２ １５８ ＴＭＲ Ｃ ６．１００ ２６．４８０ ７．１５７ １５８ ＴＭＲ Ｄ ６．４７９ ２７．３３５ ７．９７７ １５９ ＳＥＲ Ｎ ５．３３８ ２５．４４１ ７．４９７ １５９ ＳＥＲ ＤＧ ３．１４１ ２５．９０４ １０．５２３ １５９ ＳＥＲ ＣＢ ３．６７３ ２６．１０５ ９．２１２ １５９ ＳＥＲ ＣＡ ４．８３５ ２５．２１０ ８．８５５ １５９ ＳＥＲ Ｃ ４．４９４ ２３．７２０ ８．９４４ １５９ ＳＥＲ Ｄ ３．３３９ ２３．２８１ ９．０３０

【００５６】 １６０ ＧＬＹ Ｎ ５．３７４ ２２．９６７ ８．８３５ １６０ ＧＬＹ ＣＡ ５．４３４ ２１．５０４ ８．８９５ １６０ ＧＬＹ Ｃ ４．５７６ ２１．０４５ ７．７３８ １６０ ＧＬＹ Ｄ ４．８０８ ２１．３２６ ６．５５５ １６１ ＳＥＲ Ｎ ３．９２５ ２０．３１０ ８．１１６ １６１ ＳＥＲ ＣＡ ２．６５４ １９．７７７ ７．０５４ １６１ ＳＥＲ Ｃ １．４７７ ２０．７０８ ６．７８６ １６１ ＳＥＲ Ｄ ０．６９６ ２０．３４７ ５．８６９ １６１ ＳＥＲ ＣＢ ２．３４４ １８．２９３ ７．２７１ １６１ ＳＥＲ ＤＧ １．８５４ １８．０２８ ８．５８５ １６２ ＳＥＲ Ｎ １．３０３ ２１．８４１ ７．４５９ １６２ ＳＥＲ ＣＡ ０．１６７ ２２．７２５ ７．１１３ １６２ ＳＥＲ Ｃ ０．４３０ ２３．５５２ ５．８４８ １６２ ＳＥＲ Ｄ １．５３３ ２３．８４０ ５．３９４ １６２ ＳＥＲ ＣＢ −０．２１３ ２３．６６６ ８．２４２ １６２ ＳＥＲ ＤＧ ０．１８４ ２３．０９１ ９．４８０ １６３ ＳＥＲ Ｎ −０．６７９ ２３．９２１ ５．１９７ １６３ ＳＥＲ ＣＡ −０．６１１ ２４．７５０ ３．９９０ １６３ ＳＥＲ Ｃ −０．４４１ ２６．１７７ ４．５１３ １６３ ＳＥＲ Ｏ −１．０７８ ２６．５４８ ５．５０４ １６３ ＳＥＲ ＣＢ −１．８９０ ２４．６４２ ３．２１１ １６３ ＳＥＲ ＯＧ −１．９９２ ２５．７１８ ２．３３１ １６４ ＴＭＲ Ｎ ０．３８７ ２６．９５２ ３．８５２ １６４ ＴＭＲ ＣＡ ０．６０９ ２８．３４０ ４．３１２ １６４ ＴＭＲ Ｃ ０．１８５ ２９．２８６ ３．１９４ １６４ ＴＭＲ Ｄ ０．４８５ ３０．５０２ ３．２７８ １６４ ＴＭＲ ＣＢ ２．０９５ ２８．５１８ ４．８１８ １６４ ＴＭＲ ＤＧ１ ２．９８４ ２８．２８２ ３．６９２ １６４ ＴＭＲ ＣＧ２ ２．３９７ ２７．６１０ ６．００１ １６５ ＶＡＬ Ｎ −０．５１３ ２８．７４２ ２．１９０ １６５ ＶＡＬ ＣＡ −０．９５９ ２９．５４２ １．０１０ １６５ ＶＡＬ Ｃ −２．０２８ ３０．５４５ １．４９７ １６５ ＶＡＬ Ｄ −２．９２９ ３０．１３２ ２．２８０ １６５ ＶＡＬ ＣＢ −１．３３９ ２８．６２４ −０．１６１ １６５ ＶＡＬ ＣＧ１ −１．９４７ ２９．３５７ −１．３７４ １６５ ＶＡＬ ＣＧ２ −０．２１０ ２７．７１６ −０．６９９ １６６ ＧＬＹ Ｎ −１．９１０ ３１．８２１ １．１２９ １６６ ＧＬＹ ＣＡ −２．９４５ ３２．７７８ １．６２６ １６６ ＧＬＹ Ｃ −４．０９８ ３２．８５９ ０．６１７ １６６ ＧＬＹ Ｄ −４．１２４ ３２．２０６ −０．３９６ １６７ ＴＹＲ Ｎ −５．０５４ ３３．７３０ ０．９７０ １６７ ＴＹＲ ＣＡ −６．２２３ ３４．０４６ ０．１１３ １６７ ＴＹＲ Ｃ −５．９９３ ３５．３８９ −０．６０６ １６７ ＴＹＲ Ｄ −５．４７４ ３６．２８３ ０．０８４ １６７ ＴＹＲ ＣＢ −７．４６４ ３４．２５２ ０．９６４ １６７ ＴＹＲ ＣＧ −７．７９１ ３２．９８４ １．７０９ １６７ ＴＹＲ ＣＤ１ −７．２０８ ３２．７０３ ２．９４７ １６７ ＴＹＲ ＣＤ２ −８．７１０ ３２．１１６ １．１３３ １６７ ＴＹＲ ＣＥ１ −７．５６７ ３１．５２８ ３．６１５ １６７ ＴＹＲ ＣＥ２ −９．０６８ ３０．９５５ １．８０９ １６７ ＴＹＲ ＣＺ −８．４８６ ３０．６７１ ３．０４６ １６７ ＴＹＲ ＤＨ −６．８８０ ２９．４８１ ３．６５８ １６８ ＰＲＯ Ｎ −６．３８０ ３５．４９９ −１．８５０ １６８ ＰＲＯ ＣＧ −６．９４３ ３６．３７６ −３．９３８ １６８ ＰＲＯ ＣＤ −６．２７３ ３６．７５２ −２．６２４ １６８ ＰＲＯ ＣＯ −７．９６４ ３５．３４４ −３．５０５ １６８ ＰＲＯ ＣＡ −７．１３４ ３４．４５７ −２．５６０ １６８ ＰＲＯ Ｃ −６．３９８ ３３．３３６ −３．２７０ １６８ ＰＲＯ Ｄ −７．０９７ ３２．５２０ −３．９１２ １６９ ＧＬＹ Ｎ −５．０８６ ３３．１９３ −３．１８９ １６９ ＧＬＹ ＣＡ −４．４４６ ３２．０７７ −３．９２７ １６９ ＧＬＹ Ｃ −４．９３７ ３０．７０２ −３．４７０ １６９ ＧＬＹ Ｄ −４．８８０ ２９．７３３ −４．２４９

【００５７】 １７０ ＬＹＳ Ｎ −５．４０２ ３０．５７９ −２．２５５ １７０ ＬＹＳ ＣＡ −５．８５６ ２９．２６５ −１．７４５ １７０ ＬＹＳ Ｃ −７．０５５ ２８．７７３ −２．５１６ １７０ ＬＹＳ Ｄ −７．３０８ ２７．５５４ −２．５２４ １７０ ＬＹＳ ＣＢ −６．２４６ ２９．２９４ −０．２８６ １７０ ＬＹＳ ＣＧ −５．７９５ ２８．１０６ ０．５８５ １７０ ＬＹＳ ＣＤ −６．２５０ ２８．２８９ ２．０３１ １７０ ＬＹＳ ＣＥ −５．７３１ ２７．２７１ ３．０２９ １７０ ＬＹＳ Ｎ２ −４．２５９ ２７．４６３ ３．２１５ １７１ ＴＹＲ Ｎ −７．８３８ ２９．６１６ −３．１４８ １７１ ＴＹＲ ＣＡ −９．０１２ ２９．０４３ −３．８５９ １７１ ＴＹＲ Ｃ −８．６０３ ２８．３０９ −５．１１３ １７１ ＴＹＲ Ｄ −７．７６０ ２８．７１４ −５．９２８ １７１ ＴＹＲ ＣＢ −９．９６２ ３０．２２４ −４．２４２ １７１ ＴＹＲ ＣＧ −１０．４９７ ３０．９８４ −３．０４７ １７１ ＴＹＲ ＣＤ１ −１１．０６０ ３０．３０３ −１．９８２ １７１ ＴＹＲ ＣＤ２ −１０．４５６ ３２．３７４ −３．０２６ １７１ ＴＹＲ ＣＥ１ −１１．５２０ ３１．００３ −０．８６７ １７１ ＴＹＲ ＣＥ２ −１０．９４１ ３３．０８８ −１．９３６ １７１ ＴＹＲ ＣＺ −１１．５２８ ３２．３９８ −０．８８６ １７１ ＴＹＲ ＤＨ −１２．００８ ３３．１１９ ０．１７０ １７２ ＰＲＯ Ｎ −９．２９７ ２７．２０４ −５．３７４ １７２ ＰＲＯ ＣＡ −９．０９３ ２６．４１７ −６．５９６ １７２ ＰＲＯ Ｃ −９．２３３ ２７．１５６ −７．９０９ １７２ ＰＲＯ Ｄ −８．５２５ ２６．７８４ −８．８８１ １７２ ＰＲＯ ＣＢ −１０．１６７ ２５．３２９ −６．５１３ １７２ ＰＲＯ ＣＧ −１０．６００ ２５．２７１ −５．０９６ １７２ ＰＲＯ ＣＤ −１０．３６４ ２６．６６９ −４．５１４ １７３ ＳＥＲ Ｎ −１０．０９７ ２８．１６７ −８．０１９ １７３ ＳＥＲ ＣＡ −１０．２２０ ２８．８１８ −９．３３０ １７３ ＳＥＲ Ｃ −９．０２５ ２９．７７３ −９．５９５ １７３ ＳＥＲ Ｄ −８．９６６ ３０．２３３ −１０．７４２ １７３ ＳＥＲ ＣＢ −１１．５２８ ２９．６２３ −９．４８１ １７３ ＳＥＲ ＤＧ −１１．５９５ ３０．５４６ −８．４０６ １７４ ＶＡＬ Ｎ −８．１６２ ２９．９４４ −８．６１４ １７４ ＶＡＬ ＣＡ −７．０５３ ３０．８９１ −８．８５５ １７４ ＶＡＬ Ｃ −５．７５４ ３０．１３１ −９．０６８ １７４ ＶＡＬ Ｄ −５．６１２ ２９．１５２ −８．３４４ １７４ ＶＡＬ ＣＢ −６．８９９ ３１．７７５ −７．５９６ １７４ ＶＡＬ ＣＧ１ −５．７９６ ３２．８３７ −７．６１７ １７４ ＶＡＬ ＣＧ２ −８．２２０ ３２．５０３ −７．３２３ １７５ ＩＬＥ Ｎ −４．９１１ ３０．７２９ −９．８８５ １７５ ＩＬＥ ＣＡ −３．５６９ ３０．１５６ −１０．０２４ １７５ ＩＬＥ Ｃ −２．７１４ ３０．７３６ −８．８９４ １７５ ＩＬＥ Ｄ −２．４５０ ３１．９５８ −８．９５５ １７５ ＩＬＥ ＣＢ −２．９５３ ３０．５２４ −１１．４１９ １７５ ＩＬＥ ＣＧ１ −３．８５７ ２９．９７８ −１２．５２４ １７５ ＩＬＥ ＣＧ２ −１．４５１ ３０．０８９ −１１．５１２ １７５ ＩＬＥ ＣＤ１ −３．６９２ ３０．５２９ −１３．９４６ １７６ ＡＬＡ Ｎ −２．２２０ ３０．０２８ −７．９２５ １７６ ＡＬＡ ＣＡ −１．３３５ ３０．５１７ −６．８７０ １７６ ＡＬＡ Ｃ ０．１２０ ３０．３０１ −７．３１０ １７６ ＡＬＡ Ｄ ０．４５３ ２９．２１５ −７．８３８ １７６ ＡＬＡ ＣＢ −１．６３９ ２９．８３８ −５．５４１ １７７ ＶＡＬ Ｎ ０．８６４ ３１．４１０ −７．１８０ １７７ ＶＡＬ ＣＡ ２．２６１ ３１．５３４ −７．６５６ １７７ ＶＡＬ Ｃ ３．２２５ ３１．６９３ −６．４７３ １７７ ＶＡＬ Ｄ ３．１７８ ３２．６５７ −５．７２１ １７７ ＶＡＬ ＣＢ ２．４３９ ３２．６０７ −８．７５５ １７７ ＶＡＬ ＣＧ１ ３．８４２ ３２．６６７ −９．３９２ １７７ ＶＡＬ ＣＧ２ １．３７４ ３２．５５２ −９．８４５ １７８ ＧＬＹ Ｎ ４．０７７ ３０．６５４ −６．３５８ １７８ ＧＬＹ ＣＡ ５．１６８ ３０．７０３ −５．３３３ １７８ ＧＬＹ Ｃ ６．４４６ ３１．２３３ −６．０７４ １７８ ＧＬＹ Ｄ ６．４９９ ３１．４３５ −７．２８６ １７９ ＡＬＡ Ｎ ７．５１２ ３１．４４７ −５．２８７ １７９ ＡＬＡ ＣＡ ８．７１５ ３２．０３７ −５．８５９ １７９ ＡＬＡ Ｃ ９．９３９ ３１．０９９ −５．７７９ １７９ ＡＬＡ Ｄ １０．１９８ ３０．４８１ −４．７１９ １７９ ＡＬＡ ＣＢ ９．０２５ ３３．２５１ −４．９７３

【００５８】 １８０ ＶＡＬ Ｎ １０．６５９ ３１．１６２ −６．８８５ １８０ ＶＡＬ ＣＡ １１．９７０ ３０．４８２ −６．９８１ １８０ ＶＡＬ Ｃ １３．０４８ ３１．５８５ −７．１７１ １８０ ＶＡＬ Ｄ １２．７１２ ３２．６９１ −７．６２７ １８０ ＶＡＬ ＣＢ １２．０７５ ２９．５１４ −８．１６６ １８０ ＶＡＬ ＣＧ１ １１．２７１ ２８．２５１ −７．８５５ １８０ ＶＡＬ ＣＧ２ １１．６７５ ３０．１２９ −９．５００ １８１ ＡＳＰ Ｎ １４．２６７ ３１．２０３ −６．８００ １８１ ＡＳＰ ＣＡ １５．４５１ ３２．１０８ −７．０３９ １８１ ＡＳＰ Ｃ １５．９４２ ３１．８０４ −８．４６２ １８１ ＡＳＰ Ｄ １５．３３９ ３１．０９０ −９．２９２ １８１ ＡＳＰ ＣＢ １６．４４６ ３１．９２１ −５．９１４ １８１ ＡＳＰ ＣＧ １７．１２０ ３０．５３４ −５．９７１ １８１ ＡＳＰ ＤＤ１ １７．１０５ ２９．７８５ −６．９７２ １８１ ＡＳＰ ＤＤ２ １７．６８０ ３０．２５６ −４．８８７ １８２ ＳＥＲ Ｎ １７．０８７ ３２．３８６ −８．８４７ １８２ ＳＥＲ ＣＡ １７．６２２ ３２．２１４ −１０．１９１ １８２ ＳＥＲ Ｃ １８．１５３ ３０．８１７ −１０．４９４ １８２ ＳＥＲ Ｄ １８．３６５ ３０．４５２ −１１．６７０ １８２ ＳＥＲ ＣＢ １８．６７８ ３３．３１３ −１０．４６４ １８２ ＳＥＲ ＤＧ １８．０１６ ３４．５６１ −１０．４７５ １８３ ＳＥＲ Ｎ １８．２５８ ３０．０４２ −９．４２３ １８３ ＳＥＲ ＣＡ １８．７１６ ２８．６４５ −９．４４４ １８３ ＳＥＲ Ｃ １７．５８１ ２７．５８１ −９．５４７ １８３ ＳＥＲ Ｄ １７．８５９ ２６．４１５ −９．３９７ １８３ ＳＥＲ ＣＢ １９．２５６ ２８．３２３ −８．００７ １８３ ＳＥＲ ＤＧ ２０．５８９ ２８．６１５ −８．２５１ １８４ ＡＳＮ Ｎ １６．３７３ ２８．０９４ −９．６０２ １８４ ＡＳＮ ＣＡ １５．１４４ ２７．３１７ −９．５８０ １８４ ＡＳＮ Ｃ １４．９３１ ２６．７２０ −８．１９７ １８４ ＡＳＮ Ｄ １４．１３６ ２５．７５９ −８．０９７ １８４ ＡＳＮ ＣＢ １５．０１４ ２６．３４１ −１０．７２２ １８４ ＡＳＮ ＣＧ １４．９９０ ２６．９９８ −１２．０７６ １８４ ＡＳＮ ＤＤ１ １４．７００ ２８．１８４ −１２．２７７ １８４ ＡＳＮ ＮＤ２ １５．３５２ ２６．２１０ −１３．０７６ １８５ ＧＬＮ Ｎ １５．５４２ ２７．２４７ −７．１５９ １８５ ＧＬＮ ＣＡ １５．２７６ ２６．６４６ −５．８３５ １８５ ＧＬＮ Ｃ １４．２００ ２７．４９４ −５．２０３ １８５ ＧＬＮ Ｄ １４．１５９ ２８．７２６ −５．３８６ １８５ ＧＬＮ ＣＢ １６．５９９ ２６．５６８ −５．１０１ １８５ ＧＬＮ ＣＧ １６．５３９ ２６．２４２ −３．６１４ １８５ ＧＬＮ ＣＤ １８．０１１ ２６．１０２ −３．２０６ １８５ ＧＬＮ ＤＥ１ １８．３６４ ２５．７９９ −４．０６１ １８５ ＧＬＮ ＮＥ２ １８．２６６ ２６．３８６ −１．９３４ １８６ ＡＲＧ Ｎ １３．２７８ ２６．９５８ −４．４４８ １８６ ＡＲＧ ＣＡ １２．１８５ ２７．７７４ −３．８４１ １８６ ＡＲＧ Ｃ １２．７８０ ２６．７８２ −２．８６６ １８６ ＡＲＧ Ｄ １３．６９８ ２８．３８４ −２．０９３ １８６ ＡＲＧ ＣＢ １１．２１５ ２６．８４３ −３．１１６ １８６ ＡＲＧ ＣＧ １０．２１４ ２７．４７１ −２．１６１ １８６ ＡＲＧ ＣＤ ９．４６７ ２６．３３７ −１．４６８ １８６ ＡＲＧ ＮＥ ９．８６６ ２６．３３３ −０．１１７ １８６ ＡＲＧ ＣＺ ９．９６１ ２６．８７９ １．０５９ １８６ ＡＲＧ ＮＨ１ ９．３６７ ２７．８８０ １．６５８ １８６ ＡＲＧ ＮＨ２ １０．９６６ ２６．３２１ １．７８３ １８７ ＡＬＡ Ｎ １２．２９４ ３０．００９ −２．８５３ １８７ ＡＬＡ ＣＡ １２．７２８ ３１．０６４ −１．８９５ １８７ ＡＬＡ Ｃ １２．２６２ ３０．６０４ −０．５１７ １８７ ＡＬＡ Ｄ １１．１５６ ３０．０４３ −０．３８７ １８７ ＡＬＡ ＣＥ １２．１４４ ３２．４０２ −２．３４４ １８８ ＳＥＲ Ｎ １３．０５１ ３０．７７０ ０．５４９ １８８ ＳＥＲ ＣＡ １２．６７１ ３０．２８６ １．８６８ １８８ ＳＥＲ Ｃ １１．３５６ ３０．８４７ ２．４１２ １８８ ＳＥＲ Ｄ １０．７４０ ３０．１１１ ３．２１２ １８８ ＳＥＲ ＣＢ １３．７６７ ３０．４５６ ２．９３２ １８８ ＳＥＲ ＤＧ １４．１３７ ３１．８２６ ２．８４１ １８９ ＰＨＥ Ｎ １０．９４３ ３２．０１０ １．９７４ １８９ ＰＨＥ ＣＡ ９．６９７ ３２．６８８ ２．４１８ １８９ ＰＨＥ Ｃ ８．４９９ ３２．１９８ １．６０９ １８９ ＰＨＥ Ｄ ７．３８９ ３２．５５６ ２．０１１ １８９ ＰＨＥ ＣＢ ９．７８７ ３４．２１７ ２．２４３ １８９ ＰＨＥ ＣＧ １０．１１７ ３４．６９６ ０．８６７ １８９ ＰＨＥ ＣＤ１ ９．１４７ ３４．８３０ −０．１２１ １８９ ＰＨＥ ＣＤ２ １１．４１５ ３５．１１６ ０．５６７ １８９ ＰＨＥ ＣＥ１ ９．４８３ ３５．１８７ −１．４１１ １８９ ＰＨＥ ＣＥ２ １１．７６９ ３５．５４５ −０．７０１ １８９ ＰＨＥ ＣＺ １０．７８６ ３５．５８６ −１．７２５

【００５９】 １９０ ＳＥＲ Ｎ ８．７０３ ３１．５２６ ０．４９９ １９０ ＳＥＲ ＣＡ ７．６２６ ３１．０９６ −０．３９１ １９０ ＳＥＲ Ｃ ６．６６３ ３０．１６２ ０．３２８ １９０ ＳＥＲ Ｄ ７．０３４ ２９．０８３ ０．８６６ １９０ ＳＥＲ ＣＢ ８．１８１ ３０．５９０ −１．７０８ １９０ ＳＥＲ ＤＧ ７．１３６ ３０．３３７ −２．６１８ １９１ ＳＥＲ Ｎ ５．３８８ ３０．５５１ ０．３２６ １９１ ＳＥＲ ＣＡ ４．３４１ ２９．６８６ ０．９８７ １９１ ＳＥＲ Ｃ ４．２６１ ２８．３３０ ０．２２３ １９１ ＳＥＲ Ｄ ４．５４３ ２８．２６８ −０．９９５ １９１ ＳＥＲ ＣＢ ３．０１５ ３０．４１１ ０．９１１ １９１ ＳＥＲ ＤＧ ２．７２９ ３１．２８５ １．９５４ １９２ ＶＡＬ Ｎ ３．７５６ ２７．３１０ ０．９２８ １９２ ＶＡＬ ＣＡ ３．６２３ ２５．９３２ ０．３９１ １９２ ＶＡＬ Ｃ ２．２５４ ２５．２９１ ０．６８６ １９２ ＶＡＬ Ｄ １．５５９ ２５．６９８ １．９５８ １９２ ＶＡＬ ＣＢ ４．７８１ ２５．１２７ １．０８８ １９２ ＶＡＬ ＣＧ１ ６．１４４ ２５．７２７ ０．７２２ １９２ ＶＡＬ ＣＧ２ ４．６１７ ２５．１０４ ２．５９２ １９３ ＧＬＹ Ｎ １．９３８ ２４．１７２ ０．０４７ １９３ ＧＬＹ ＣＡ ０．６２９ ２３．５６４ ０．４１０ １９３ ＧＬＹ Ｃ ０．０８１ ２３．０２９ −０．９０１ １９３ ＧＬＹ Ｄ ０．５３０ ２３．２４４ −２．０１５ １９４ ＰＲＯ Ｎ −０．０２３ ２２．２８９ −０．７２２ １９４ ＰＲＯ ＣＡ −１．６６２ ２１．６５１ −１．８７３ １９４ ＰＲＯ Ｃ −２．２３７ ２２．６０５ −２．９１４ １９４ ＰＲＯ Ｄ −２．４０３ ２２．２４４ −４．０８５ １９４ ＰＲＯ ＣＢ −２．７６９ ２０．７８３ −１．２１０ １９４ ＰＲＯ ＣＧ −２．３１１ ２０．６２２ ０．２１３ １９４ ＰＲＯ ＣＤ −１．６３３ ２１．９５４ ０．５７８ １９５ ＧＬＵ Ｎ −２．５２２ ２３．７９３ −２．４３９ １９５ ＧＬＵ ＣＡ −３．１４５ ２４．８５０ −３．２５２ １９５ ＧＬＵ Ｃ −２．０９５ ２５．６３１ −４．０５８ １９５ ＧＬＵ Ｄ −２．５１６ ２６．３９８ −４．９３６ １９５ ＧＬＵ ＣＢ −４．０４３ ２５．７８６ −２．４７０ １９５ ＧＬＵ ＣＧ −４．９４２ ２５．１３４ −１．４３５ １９５ ＧＬＵ ＣＤ −４．３１５ ２４．８６０ −０．１００ １９５ ＧＬＵ ＤＥ１ −３．１１０ ２４．９６０ ０．１６５ １９５ ＧＬＵ ＤＥ２ −５．１３８ ２４．５２０ ０．７８５ １９６ ＬＥＵ Ｎ −０．８２９ ２５．２６４ −３．８７０ １９６ ＬＥＵ ＣＡ ０．２４１ ２５．９２９ −４．６６４ １９６ ＬＥＵ Ｃ ０．２２８ ２５．３７６ −６．０５９ １９６ ＬＥＵ Ｄ ０．３０５ ２４．１２１ −６．１５３ １９６ ＬＥＵ ＣＢ １．５４０ ２５．７３９ −３．８５４ １９６ ＬＥＵ ＣＧ ２．７７０ ２６．１７８ −４．６４３ １９６ ＬＥＵ ＣＤ１ ２．７３９ ２７．７１６ −４．６３９ １９６ ＬＥＵ ＣＤ２ ４．０２７ ２５．７２１ −３．９１１ １９７ ＡＳＰ Ｎ ０．１４０ ２６．２０８ −７．０９３ １９７ ＡＳＰ ＣＡ ０．０３２ ２５．７７４ −８．４８０ １９７ ＡＳＰ Ｃ １．３０７ ２５．７３８ −９．２９３ １９７ ＡＳＰ Ｄ １．６５５ ２４．７３４ −９．９１４ １９７ ＡＳＰ ＣＢ −１．０６７ ２６．５９８ −９．１９１ １９７ ＡＳＰ ＣＧ −２．４０６ ２６．３５１ −８．５４９ １９７ ＡＳＰ ＤＤ１ −２．８０４ ２５．１５５ −８．３５４ １９７ ＡＳＰ ＤＤ２ −３．０３５ ２７．３２７ −８．０８８ １９８ ＶＡＬ Ｎ ２．０１３ ２６．８８９ −９．３４４ １９８ ＶＡＬ ＣＡ ３．２０６ ２６．９７０ −１０．２０９ １９８ ＶＡＬ Ｃ ４．１５７ ２７．９５０ −９．５１４ １９８ ＶＡＬ Ｄ ３．７５２ ２８．６９９ −８．５８７ １９８ ＶＡＬ ＣＢ ２．８３４ ２７．４７６ −１１．６３７ １９８ ＶＡＬ ＣＧ１ １．９３０ ２６．７２６ −１２．５３７ １９８ ＶＡＬ ＣＧ２ ２．３３７ ２８．９１９ −１１．４８４ １９９ ＭＥＴ Ｎ ５．３７４ ２７．９０６ −１０．０１６ １９９ ＭＥＴ ＣＡ ６．４３９ ２８．８０２ −９．４９８ １９９ ＭＥＴ Ｃ ６．８４５ ２９．８１０ −１０．５７８ １９９ ＭＥＴ Ｄ ６．６３６ ２９．５１８ −１１．７９３ １９９ ＭＥＴ ＣＢ ７．６６０ ２７．９７０ −９．０７７ １９９ ＭＥＴ ＣＧ ７．３６５ ２６．８４９ −８．１３９ １９９ ＭＥＴ ＳＤ ６．７５５ ２７．４４９ −６．５６８ １９９ ＭＥＴ ＣＥ ８．２２７ ２７．７５５ −５．５８７

【００６０】 ２００ ＡＬＡ Ｎ ７．４２６ ３０．９４２ −１０．１０３ ２００ ＡＬＡ ＣＡ ７．９９１ ３１．９２９ −１１．０５５ ２００ ＡＬＡ Ｃ ９．０８８ ３２．６６６ −１０．２７２ ２００ ＡＬＡ Ｄ ９．１２７ ３２．５２４ −９．０６０ ２００ ＡＬＡ ＣＢ ６．９３２ ３２．８７０ −１１．６３８ ２０１ ＰＲＯ Ｎ ９．９２７ ３３．４５５ −１０．９５１ ２０１ ＰＲＯ ＣＡ １１．０１３ ３４．１３０ −１０．２３８ ２０１ ＰＲＯ Ｃ １０．４３０ ３５．１２７ −９．２３８ ２０１ ＰＲＯ Ｄ ９．５７９ ３５．９０７ −９．６９２ ２０１ ＰＲＯ ＣＢ １１．０１７ ３４．７２３ −１１．４００ ２０１ ＰＲＯ ＣＧ １１．３９２ ３４．０４０ −１２．６７８ ２０１ ＰＲＯ ＣＤ ９．９４１ ３３．６１６ −１２．４０５ ２０２ ＧＬＹ Ｎ １０．９２５ ３５．２０４ −８．０２１ ２０２ ＧＬＹ ＣＡ １０．４７３ ３６．２０４ −７．０４４ ２０２ ＧＬＹ Ｃ １１．５８０ ３６．６５８ −６．１１５ ２０２ ＧＬＹ Ｄ １１．３５２ ３７．１２４ −４．９７９ ２０３ ＶＡＬ Ｎ １２．８１５ ３６．５０３ −６．６１３ ２０３ ＶＡＬ ＣＡ １３．９６８ ３６．９２９ −５．７１６ ２０３ ＶＡＬ Ｃ １４．７０６ ３８．０１７ −６．４６９ ２０３ ＶＡＬ Ｃ １５．１３３ ３７．７３１ −７．５９３ ２０３ ＶＡＬ ＣＥ １４．８１４ ３５．６８８ −５．３５１ ２０３ ＶＡＬ ＣＧ１ １６．０９６ ３６．１０６ −４．６１２ ２０３ ＶＡＬ ＣＧ２ １４．０７９ ３４．７４１ −４．３７８ ２０４ ＳＥＲ Ｎ １４．８６５ ３９．１８２ −５．８５９ ２０４ ＳＥＲ ＣＡ １５．５７２ ４０．２８１ −６．４８７ ２０４ ＳＥＲ Ｃ １５．０６７ ４０．６１９ −７．８７２ ２０４ ＳＥＲ Ｄ １５．７８６ ４０．６８５ −８．８８９ ２０４ ＳＥＲ ＣＢ １７．０８７ ３９．９７６ −６．３２６ ２０４ ＳＥＲ ＤＧ １７．７５２ ４１．１８６ −６．６７２ ２０５ ＩＬＥ Ｎ １３．７７１ ４０．９６５ −８．００８ ２０５ ＩＬＥ ＣＡ １３．０６９ ４１．２３４ −９．２２５ ２０５ ＩＬＥ Ｃ １３．２０７ ４２．７４９ −９．４７８ ２０５ ＩＬＥ Ｄ １２．６７５ ４３．４９８ −８．６４８ ２０５ ＩＬＥ ＣＢ １１．５３２ ４０．８３３ −９．１４４ ２０５ ＩＬＥ ＣＧ１ １１．４３６ ３９．３３６ −８．８１０ ２０５ ＩＬＥ ＣＧ２ １０．８９９ ４１．２８１ −１０．４６７ ２０５ ＩＬＥ ＣＤ１ １２．２５７ ３８．４１２ −９．７７１ ２０６ ＧＬＮ Ｎ １３．９５６ ４３．０９５ −１０．４８９ ２０６ ＧＬＮ ＣＡ １４．２０４ ４４．５１７ −１０．８３４ ２０６ ＧＬＮ Ｃ １３．００２ ４４．９７８ −１１．６３０ ２０６ ＧＬＮ Ｄ １２．６６９ ４４．３１８ −１２．６２１ ２０６ ＧＬＮ ＣＢ １５．４５５ ４４．７０８ −１１．７４０ ２０６ ＧＬＮ ＣＧ １６．６８４ ４４．１６３ −１０．９８０ ２０６ ＧＬＮ ＣＤ １７．２８５ ４５．１４５ −１０．００７ ２０６ ＧＬＮ ＤＥ１ １８．３２８ ４４．９３６ −９．３５３ ２０６ ＧＬＮ ＮＥ２ １６．５５６ ４６．２６０ −９．８５７ ２０７ ＳＥＲ Ｎ １２．３５９ ４６．０６４ −１１．２１４ ２０７ ＳＥＲ ＣＡ １１．２１７ ４６．５７１ −１１．９８７ ２０７ ＳＥＲ Ｃ １１．０８９ ４８．０９３ −１１．７４９ ２０７ ＳＥＲ Ｄ １１．９１９ ４８．６５７ −１１．００４ ２０７ ＳＥＲ ＣＢ ９．９１８ ４５．８５３ −１１．５６９ ２０７ ＳＥＲ ＤＧ ８．９９３ ４６．０５６ −１２．６１３ ２０８ ＴＨＲ Ｎ １０．０５４ ４８．６６４ −１２．３２６ ２０８ ＴＨＲ ＣＧ２ ９．１７１ ５０．３３９ −１４．７５４ ２０８ ＴＨＲ ＤＧ１ ７．５７０ ４９．４１４ −１３．１４４ ２０８ ＴＨＲ ＣＢ ８．６２０ ５０．４１５ −１３．３５７ ２０８ ＴＨＲ ＣＡ ９．６７５ ５０．０９２ −１２．１７３ ２０８ ＴＨＲ Ｃ ９．１９７ ５０．４８８ −１０．８０３ ２０８ ＴＨＲ Ｄ ８．４２３ ４９．８０７ −１０．０４９ ２０９ ＬＥＵ Ｎ ９．６５６ ５１．６１３ −１０．２２８ ２０９ ＬＥＵ ＣＡ ９．１９２ ５２．１５８ −８．９５９ ２０９ ＬＥＵ Ｃ ８．６７３ ５３．６１０ −９．２６２ ２０９ ＬＥＵ Ｄ ９．１４０ ５４．２２７ −１０．２２２ ２０９ ＬＥＵ ＣＢ １０．３３５ ５２．１９２ −７．９５８ ２０９ ＬＥＵ ＣＧ １０．８０４ ５０．８１６ −７．４１６ ２０９ ＬＥＵ ＣＤ１ １１．９６８ ５１．１１４ −６．４７２ ２０９ ＬＥＵ ＣＤ２ ９．６０７ ５０．２８２ −６．６４９

【００６１】 ２１０ ＰＲＯ Ｎ ７．７９０ ５４．１３９ −８．４４４ ２１０ ＰＲＯ ＣＡ ７．２７３ ５５．５１７ −８．６４９ ２１０ ＰＲＯ Ｃ ８．３８３ ５６．５７３ −８．６３９ ２１０ ＰＲＯ Ｄ ９．４９１ ５６．４４５ −８．１０４ ２１０ ＰＲＯ ＣＢ ６．３０２ ５５．７３３ −７．５１７ ２１０ ＰＲＯ ＣＧ ６．００４ ５４．３７９ −６．９４４ ２１０ ＰＲＯ ＣＤ ７．１９３ ５３．４９１ −７．２７１ ２１１ ＧＬＹ Ｎ ８．０７７ ５７．６６５ −９．３５５ ２１１ ＧＬＹ ＣＡ ９．０６９ ５８．７６５ −９．４１０ ２１１ ＧＬＹ Ｃ １０．０９４ ５８．４５４ −１０．４９０ ２１１ ＧＬＹ Ｄ １１．１７６ ５９．００５ −１０．２５９ ２１２ ＡＳＮ Ｎ ９．８５１ ５７．７７０ −１１．５８７ ２１２ ＡＳＮ ＣＡ １０．９０３ ５７．４２２ −１２．６４３ ２１２ ＡＳＮ Ｃ １２．０５９ ５６．７５３ −１２．０５６ ２１２ ＡＳＮ Ｄ １３．１８８ ５７．１８１ −１２．４２０ ２１２ ＡＳＮ ＣＢ １１．２２４ ５８．５９５ −１３．４９９ ２１２ ＡＳＮ ＣＧ １１．８０３ ５８．１８５ −１４．８１４ ２１２ ＡＳＮ ＤＤ１ １１．８５３ ５７．０５４ −１５．３２３ ２１２ ＡＳＮ ＮＤ２ １２．２７３ ５９．１５９ −１５．５７６ ２１３ ＬＹＳ Ｎ １１．８０３ ５５．７４９ −１１．２４７ ２１３ ＬＹＳ ＣＡ １２．８１０ ５４．９４６ −１０．５３７ ２１３ ＬＹＳ Ｃ １２．６６８ ５３．４５９ −１０．８６６ ２１３ ＬＹＳ Ｄ １１．７７５ ５３．０３９ −１１．６１３ ２１３ ＬＹＳ ＣＢ １２．７６９ ５５．２４１ −９．０５９ ２１３ ＬＹＳ ＣＧ １３．２０６ ５６．６９４ −８．７６７ ２１３ ＬＹＳ ＣＤ １３．２４６ ５７．０３０ −７．３１２ ２１３ ＬＹＳ ＣＥ １４．１０５ ５８．２１８ −６．８７０ ２１３ ＬＹＳ ＮＺ １５．０４８ ５８．７０５ −７．９２１ ２１４ ＴＹＲ Ｎ １３．６８１ ５２．７０３ −１０．４４４ ２１４ ＴＹＲ ＣＡ １３．８００ ５１．２４６ −１０．７２２ ２１４ ＴＹＲ Ｃ １４．３８３ ５０．６００ −９．４８９ ２１４ ＴＹＲ Ｄ １５．２１１ ５１．２５３ −８．８１７ ２１４ ＴＹＲ ＣＢ １４．６４１ ５０．９８１ −１１．９８４ ２１４ ＴＹＲ ＣＧ １４．１３０ ５１．６２１ −１３．２４６ ２１４ ＴＹＲ ＣＤ１ １４．６８９ ５２．８４７ −１３．６７８ ２１４ ＴＹＲ ＣＤ２ １３．１２９ ５１．０６５ −１４．０１４ ２１４ ＴＹＲ ＣＥ１ １４．２３０ ５３．４７５ −１４．８１４ ２１４ ＴＹＲ ＣＥ２ １２．６５４ ５１．６６９ −１５．１７８ ２１４ ＴＹＲ Ｃ２ １３．２０４ ５２．８９５ −１３．５５０ ２１４ ＴＹＲ ＤＨ １２．７５６ ５３．４５８ −１６．６９６ ２１５ ＧＬＹ Ｎ １４．０５８ ４９．３４７ −９．１５８ ２１５ ＧＬＹ ＣＡ １４．６２２ ４８．７７２ −７．９０５ ２１５ ＧＬＹ Ｃ １４．１３０ ４７．３２５ −７．７４９ ２１５ ＧＬＹ Ｄ １３．２４９ ４６．９１７ −８．５２１ ２１６ ＡＬＡ Ｎ １４．３１０ ４６．６３８ −６．８３１ ２１６ ＡＬＡ ＣＡ １４．４５４ ４５．２０３ −６．７８１ ２１６ ＡＬＡ Ｃ １３．６８２ ４４．９２２ −５．５１２ ２１６ ＡＬＡ Ｄ １３．９４８ ４５．５２７ −４．４７５ ２１６ ＡＬＡ ＣＢ １５．７１５ ４４．３５４ −６．８８７ ２１７ ＴＹＲ Ｎ １２．７５８ ４３．９８２ −５．５７５ ２１７ ＴＹＲ ＣＡ １１．９６４ ４３．４８８ −４．４４０ ２１７ ＴＹＲ Ｃ １２．０３３ ４１．９２８ −４．５４７ ２１７ ＴＹＲ Ｄ １２．２０２ ４１．４４２ −５．６５６ ２１７ ＴＹＲ ＣＢ １０．４７３ ４３．８６２ −４．５７０ ２１７ ＴＹＲ ＣＧ １０．１１７ ４５．２９１ −４．２１４ ２１７ ＴＹＲ ＣＤ１ １０．８４６ ４５．９９１ −３．２３６ ２１７ ＴＹＲ ＣＤ２ ９．０１６ ４５．９３３ −４．７８５ ２１７ ＴＹＲ ＣＥ１ １０．４５９ ４７．２６７ −２．７９０ ２１７ ＴＹＲ ＣＥ２ ８．６５４ ４７．２１９ −４．３８１ ２１７ ＴＹＲ ＣＺ ９．３５８ ４７．８８２ −３．３９１ ２１７ ＴＹＲ ＤＨ ８．９５３ ４９．１６０ −２．９８８ ２１８ ＡＳＮ Ｎ １１．７５０ ４１．３８６ −３．３９１ ２１８ ＡＳＮ ＣＡ １１．６４０ ３９．９４２ −３．２２７ ２１９ ＡＳＮ Ｃ １０．２０４ ３９．６３６ −２．７４９ ２１８ ＡＳＮ Ｏ ９．７６３ ４０．３４７ −１．９１７ ２１８ ＡＳＮ ＣＢ １２．５５３ ３９．３４０ −２．１５４ ２１８ ＡＳＮ ＣＧ １４．０３２ ３９．５６６ −２．３４３ ２１８ ＡＳＮ ＯＤ１ １４．６１２ ３９．７０９ −３．４２２ ２１８ ＡＳＮ ＮＤ２ １４．６６０ ３９．６４４ −１．１６５ ２１９ ＧＬＹ Ｎ ９．６７０ ３８．５５４ −３．２０９ ２１９ ＧＬＹ ＣＡ ８．３８２ ３８．１３０ −２．６４９ ２１９ ＧＬＹ Ｃ ７．５７０ ３７．３８６ −３．６８１ ２１９ ＧＬＹ Ｏ ７．８７３ ３７．５００ −４．８７６

【００６２】 ２２０ ＴＨＲ Ｎ ６．５６１ ３６．６３８ −３．２０５ ２２０ ＴＨＲ ＣＡ ５．６９７ ３５．９３６ −４．１７９ ２２０ ＴＨＲ Ｃ ４．８７９ ３７．０４４ −４．８６４ ２２０ ＴＨＲ Ｏ ４．４１７ ３６．７４２ −５．９５８ ２２０ ＴＨＲ ＣＲ ４．８２５ ３４．８１９ −３．５２６ ２２０ ＴＨＲ ＯＧ１ ４．１３６ ３５．５４３ −２．４５１ ２２０ ＴＨＲ ＣＧ２ ５．７０４ ３３．６９６ −２．９００ ２２１ ＳＥＲ Ｎ ４．７３８ ３８．２３８ −４．３０３ ２２０ ＳＥＲ ＣＡ ３．９８４ ３９．２０１ −５．１６９ ２２１ ＳＥＲ Ｃ ４．７６０ ３９．６４１ −６．３８３ ２２１ ＳＥＲ Ｏ ４．１１７ ４０．２０８ −７．２７７ ２２１ ＳＥＲ ＣＢ ３．３２３ ４０．３８３ −４．５４６ ２２１ ＳＥＲ ＯＧ ３．４３５ ４０．２８２ −３．１４９ ２２２ ＭＥＴ Ｎ ６．０６０ ３３．３８９ −６．６８５ ２２２ ＭＥＴ ＣＥ ６．４７１ ４２．７７１ −５．１７３ ２２２ ＭＥＴ ＳＤ ７．７６８ ４１．５３３ −４．９９３ ２２２ ＭＥＴ ＣＧ ８．５０６ ４１．３９９ −６．６０２ ２２２ ＭＥＴ ＣＢ ８．３５１ ４０．０１５ −７．２１８ ２２２ ＭＥＴ ＣＡ ６．９１６ ３９．６７０ −７．６３８ ２２２ ＭＥＴ Ｃ ６．８７７ ３８．４３５ −８．５６７ ２２２ ＭＥＴ Ｏ ７．０８４ ３８．５６７ −９．７７５ ２２３ ＡＬＡ Ｎ ６．５５４ ３７．２４６ −８．０４１ ２２３ ＡＬＡ ＣＡ ６．４６９ ３６．０２０ −８．８８５ ２２３ ＡＬＡ Ｃ ５．２００ ３６．０６８ −９．７０７ ２２３ ＡＬＡ Ｏ ５．１２３ ３５．９４８ −１０．９２９ ２２３ ＡＬＡ ＣＢ ６．５０９ ３４．８０７ −７．９２３ ２２４ ＳＥＲ Ｎ ４．０７６ ３６．３６０ −９．０３８ ２２４ ＳＥＲ ＣＡ ２．７５８ ３６．４８８ −９．７００ ２２４ ＳＥＲ Ｃ ２．６６１ ３７．１６１ −１１．０３９ ２２４ ＳＥＲ Ｏ ２．１４５ ３６．５９３ −１２．０５７ ２２４ ＳＥＲ ＣＢ １．８０１ ３６．９９５ −８．６０３ ２２４ ＳＥＲ ＯＧ ０．４９２ ３６．８９９ −９．１５７ ２２５ ＰＲＯ Ｎ ３．１５６ ３８．４１１ −１１．１５９ ２２５ ＰＲＯ ＣＡ ３．０９５ ３９．１３０ −１２．４３９ ２２５ ＰＲＯ Ｃ ３．７６４ ３８．４６９ −１３．６２６ ２２５ ＰＲＯ Ｏ ３．４０６ ３８．６５０ −１４．８０４ ２２５ ＰＲＯ ＣＢ ３．６５３ ４０．５１１ −１２．０５４ ２２５ ＰＲＯ ＣＧ ４．４１１ ４０．４０２ −１０．７６４ ２２５ ＰＲＯ ＣＤ ３．７３５ ３９．２２４ −１０．０５４ ２２６ ＭＩＳ Ｎ ４．７６９ ３７．６２６ −１３．２９９ ２２６ ＭＩＳ ＣＡ ５．４４６ ３６．８７９ −１４．３６２ ２２６ ＭＩＳ Ｃ ４．４１８ ３５．９４７ −１５．０６１ ２２６ ＭＩＳ Ｏ ４．４２５ ３５．８０９ −１６．２９３ ２２６ ＭＩＳ ＣＢ ６．６０８ ３６．０４６ −１３．７６５ ２２６ ＭＩＳ ＣＧ ７．８１４ ３６．８５９ −１３．３５８ ２２６ ＭＩＳ ＮＤ１ ８．０４８ ３７．４８８ −１２．１７０ ２２６ ＭＩＳ ＣＯ２ ８．８８３ ３７．１１８ −１４．１６７ ２２６ ＭＩＳ ＣＥ１ ９．２７０ ３８．０５２ −１２．２３６ ２２６ ＭＩＳ ＮＥ２ ９．７７１ ３７．８６６ −１３．４４３ ２２７ ＶＡＬ Ｎ ３．５９３ ３５．３６６ −１４．１９９ ２２７ ＶＡＬ ＣＡ ２．５８３ ３４．３８８ −１４．７２７ ２２７ ＶＡＬ Ｃ ３．４７９ ３５．１９７ −１５．４２１ ２２７ ＶＡＬ Ｏ １．０１８ ３４．７７３ −１６．４９０ ２２７ ＶＡＬ ＣＢ ２．１０３ ３３．４４４ −１３．６１９ ２２７ ＶＡＬ ＣＧ１ １．０７６ ３２．４７６ −１４．２４６ ２２７ ＶＡＬ ＣＧ２ ３．２０４ ３２．６６５ −１２．８９１ ２２８ ＡＬＡ Ｎ １．００３ ３６．２４２ −１４．８１４ ２２８ ＡＬＡ ＣＡ ０．０１１ ３７．１０９ −１５．５１７ ２２８ ＡＬＡ Ｃ ０．５４３ ３７．５３８ −１６．８６８ ２２８ ＡＬＡ Ｏ −０．２５３ ３７．４３５ −１７．８２８ ２２８ ＡＬＡ ＣＢ −０．３０７ ３８．３５３ −１４．６６８ ２２９ ＧＬＹ Ｎ １．７９１ ３８．０２８ −１６．９４１ ２２９ ＧＬＹ ＣＡ ２．３５２ ３８．４０８ −１８．２３９ ２２９ ＧＬＹ Ｃ ２．４２０ ３７．１９７ −１９．１８７ ２２９ ＧＬＹ Ｏ ２．１８９ ３７．３７５ −２０．３８４

【００６３】 ２３０ ＡＬＡ Ｎ ２．７１１ ３５．９８８ −１８．６４６ ２３０ ＡＬＡ ＣＡ ２．７９４ ３４．８０１ −１９．５４６ ２３０ ＡＬＡ Ｃ １．４２４ ３６．５００ −２０．１５３ ２３０ ＡＬＡ Ｏ １．３８０ ３４．２０５ −２１．３４３ ２３０ ＡＬＡ ＣＢ ３．２９８ ３３．６２４ −１８．７０９ ２３１ ＡＬＡ Ｎ ０．３８５ ３４．６２３ −１９．３２８ ２３１ ＡＬＡ ＣＡ −１．０１０ ３４．４１６ −１９．７４４ ２３１ ＡＬＡ Ｃ −１．２５６ ３５．４２３ −２０．８６４ ２３１ ＡＬＡ Ｏ −１．９０９ ３５．０５６ −２１．９５２ ２３１ ＡＬＡ ＣＢ −１．９３２ ３４．６６４ −１８．５４９ ２３２ ＡＬＡ Ｎ −０．７７８ ３６．６５７ −２０．７２１ ２３２ ＡＬＡ ＣＡ −１．０１３ ３７．６６３ −２１．７９２ ２３２ ＡＬＡ Ｃ −０．２８１ ３７．２８４ −２３．０７８ ２３２ ＡＬＡ Ｏ −０．８４１ ３７．５０１ −２４．１８７ ２３２ ＡＬＡ ＣＢ −０．７４２ ３９．１２１ −２１．３７７ ２３３ ＬＥＵ Ｎ ０．９３５ ３６．７２６ −２２．９６７ ２３３ ＬＥＵ ＣＡ １．６１７ ３６．２９３ −２４．２０９ ２３３ ＬＥＵ Ｃ ０．８２１ ３５．１６９ −２４．８８０ ２３３ ＬＥＵ Ｏ ０．６９６ ３５．２３１ −２６．１１１ ２３３ ＬＥＵ Ｃ３ ３．０６３ ３５．８７７ −２３．９０７ ２３３ ＬＥＵ ＣＧ ３．９９６ ３６．９９４ −２３．４５３ ２３３ ＬＥＵ ＣＤ１ ５．２５９ ３４．３４２ −２２．９２１ ２３３ ＬＥＵ ＣＤ２ ４．２４１ ３７．８５３ −２４．６８０ ２３４ ＩＬＥ Ｎ ０．３５７ ３６．１９９ −２４．０４７ ２３４ ＩＬＥ ＣＤ１ ０．３０６ ３０．６６４ −２１．６５７ ２３４ ＩＬＥ ＣＧ１ ０．４５４ ３１．２２３ −２３．１０５ ２３４ ＩＬＥ ＣＢ −０．８１１ ３２．０１４ −２３．５７０ ２３４ ＩＬＥ ＣＧ２ −１．８０３ ３０．９００ −２４．０９１ ２３４ ＩＬＥ ＣＡ −０．４０６ ３３．０７６ −２４．６４４ ２３４ ＩＬＥ Ｃ −１．６２１ ３３．５９７ −２５．４３４ ２３４ ＩＬＥ Ｏ −１．８８３ ３３．１４４ −２６．５４４ ２３５ ＬＥＵ Ｎ −２．３９０ ３４．４６５ −２４．７７９ ２３５ ＬＥＵ ＣＡ −３．５９６ ３５．０２８ −２５．４２３ ２３５ ＬＥＵ Ｃ −３．２５８ ３５．８４３ −２６．６７２ ２３５ ＬＥＵ Ｏ −４．１０９ ３５．９１４ −２７．５８９ ２３５ ＬＥＵ ＣＥ −４．４３２ ３５．７６５ −２４．３７８ ２３５ ＬＥＵ ＣＧ −５．１４０ ３４．８９９ −２３．３４２ ２３５ ＬＥＵ ＣＤ１ −５．６５２ ３５．６８３ −２２．１４５ ２３５ ＬＥＵ ＣＤ２ −６．２５２ ３４．１３８ −２４．１２０ ２３６ ＳＥＲ Ｎ −２．０９４ ３６．４３８ −２６．７９８ ２３６ ＳＥＲ ＣＡ −１．７６４ ３７．２３７ −２７．９８６ ２３６ ＳＥＲ Ｃ −１．４９１ ３６．２９２ −２９．１４４ ２３６ ＳＥＲ Ｏ −１．７４６ ３６．６３４ −３０．２９０ ２３６ ＳＥＲ ＣＲ −０．６３３ ３８．２３４ −２７．７３３ ２３６ ＳＥＲ ＯＧ ０．５９９ ３７．５７１ −２７．５８２ ２３７ ＬＹＳ Ｎ −１．０４６ ３５．０６７ −２８．８８２ ２３７ ＬＹＳ ＣＡ −０．８４６ ３４．０８５ −２９．９５２ ２３７ ＬＹＳ Ｃ −２．１１３ ３３．２７７ −３０．２６８ ２３７ ＬＹＳ Ｏ −２．３７８ ３２．９５１ −３１．４４４ ２３７ ＬＹＳ ＣＢ ０．２７２ ３３．１１２ −２９．５５１ ２３７ ＬＹＳ ＣＧ ０．６７７ ３２．２４０ −３０．７１６ ２３７ ＬＹＳ ＣＤ ２．０２０ ３１．５３５ −３０．４４２ ２３７ ＬＹＳ ＣＥ −２．３４５ ３０．７６２ −３１．７２９ ２３７ ＬＹＳ ＮＺ ３．５２５ ２９．８４８ −３１．５９６ ２３８ ＭＩＳ Ｎ −２．９５１ ３２．９８９ −２９．３１０ ２３８ ＭＩＳ ＣＡ −４．１６８ ３２．１６３ −２９．３７９ ２３８ ＭＩＳ Ｃ −５．３３４ ３２．８９９ −２８．６９７ ２３８ ＭＩＳ Ｏ −５．１７３ ３２．５０４ −２７．５６２ ２３８ ＭＩＳ ＣＢ −３．９４８ ３０．８６２ −２８．５５１ ２３８ ＭＩＳ ＣＧ −３．００９ ２９．９２１ −２９．２３７ ２３８ ＭＩＳ ＮＤ１ −１．７０７ ２９．６７９ −２８．８３５ ２３８ ＭＩＳ ＣＤ２ −３．１３７ ２９．２５８ −３０．３９４ ２３８ ＭＩＳ ＣＥ１ −１．０８６ ２８．８５１ −２９．６４２ ２３８ ＭＩＳ ＮＥ２ −１．９４８ ２８．６００ −３０．５９９ ２３９ ＰＲＯ Ｎ −５．８４８ ３３．９１７ −２９．３６５ ２３９ ＰＲＯ ＣＡ −６．９０８ ３６．７７９ −２８．７７３ ２３９ ＰＲＯ Ｃ −８．２０４ ３４．０５２ −２８．５３２ ２３９ ＰＲＯ Ｏ −８．９４９ ３４．９１９ −２７．６６２ ２３９ ＰＲＯ ＣＢ −７．０１８ ３５．９７７ −２９．７１３ ２３９ ＰＲＯ ＣＧ −６．６６６ ３５．２９４ −３１．０２７ ２３９ ＰＲＯ ＣＤ −５．４３６ ３４．４３９ −３０．６６８

【００６４】 ２４０ ＡＳＮ Ｎ −８．３８６ ３２．９６９ −２９．２２７ ２４０ ＡＳＮ ＣＡ −９．５２９ ３２．０４１ −２９．２１６ ２４０ ＡＳＮ Ｃ −９．５０８ ３１．１８０ −２７．９８０ ２４０ ＡＳＮ Ｏ −１０．５４０ ３０．６１０ −２７．５７６ ２４０ ＡＳＮ ＣＢ −９．４０３ ３１．２４９ −３０．５３５ ２４０ ＡＳＮ ＣＧ −７．９７１ ３０．８２７ −３０．８８９ ２４０ ＡＳＮ ＯＤ１ −７．００８ ３１．５９０ −３１．１４７ ２４０ ＡＳＮ ＮＤ２ −７．６７０ ２９．５０９ −３０．９２６ ２４１ ＴＲＰ Ｎ −８．３５４ ３１．００６ −２７．３０４ ２４１ ＴＲＰ ＣＡ −８．３０４ ３０．１２４ −２６．１２０ ２４１ ＴＲＰ Ｃ −９．１０６ ３０．６３８ −２４．９３６ ２４１ ＴＲＰ Ｏ −９．０４３ ３１．８３３ −２４．６８６ ２４１ ＴＲＰ ＣＢ −６．８７９ ２９．８３０ −２５．６７９ ２４１ ＴＲＰ ＣＧ −６．０９４ ２８．９０３ −２６．５５７ ２４１ ＴＲＰ ＣＤ１ −６．３３８ ２８．４３３ −２７．８１８ ２４１ ＴＲＰ ＣＤ２ −４．８３９ ２８．３２４ −２６．１５５ ２４１ ＴＲＰ ＮＥ１ −５．３６２ ２７．５４７ −２８．２１１ ２４１ ＴＲＰ ＣＥ２ −４．４１４ ２７．４７６ −２７．２１６ ２４１ ＴＲＰ ＣＥ３ −４．０９７ ２８．４０６ −２４．９８１ ２４１ ＴＲＰ ＣＺ２ −３．１９５ ２６．７８６ −２７．１７４ ２４１ ＴＲＰ ＣＺ３ −２．９１２ ２７．６６７ −２４．９４３ ２４１ ＴＲＰ ＣＨ２ −２．４７０ ２６．８７３ −２６．００５ ２４２ ＴＨＲ Ｎ −９．７２７ ２９．７８１ −２４．１４２ ２４２ ＴＨＲ ＣＡ −１０．４５８ ３０．１１９ −２２．９１１ ２４２ ＴＨＲ Ｃ −９．４６９ ３０．１７６ −２１．７４７ ２４２ ＴＨＲ Ｏ −８．３３５ ２９．６７４ −２１．９３７ ２４２ ＴＨＲ ＣＢ −１１．５７９ ２９．０３２ −２２．６７５ ２４２ ＴＨＲ ＯＧ１ −１０．８３７ ２７．７８６ −２２．４７６ ２４２ ＴＨＲ ＣＧ２ −１２．４９４ ２８．９０７ −２３．８９５ ２４３ ＡＳＮ Ｎ −９．９４６ ３０．６５９ −２０．６１１ ２４３ ＡＳＮ ＮＤ２ −１１．７０７ ３０．４０４ −１８．７４７ ２４３ ＡＳＮ ＯＤ１ −１１．４６５ ３１．５１８ −１６．７６８ ２４３ ＡＳＮ ＣＧ −１１．０９３ ３１．１３１ −１７．９０５ ２４３ ＡＳＮ ＣＢ −９．７０８ ３１．５３０ −１８．３３２ ２４３ ＡＳＮ ＣＡ −９．０５３ ３０．７３１ −１９．４４４ ２４３ ＡＳＮ Ｃ −８．６５７ ２９．３０３ −１９．０１０ ２４３ ＡＳＮ Ｏ −７．５９３ ２９．１３６ −１８．４４０ ２４４ ＴＨＲ Ｎ −９．５６４ ２８．３６２ −１９．２８３ ２４４ ＴＨＲ ＣＡ −９．３８１ ２６．９３４ −１９．０５９ ２４４ ＴＨＲ Ｃ −８．１３３ ２６．３９３ −１９．８０２ ２４４ ＴＨＲ Ｏ −７．３２４ ２５．７５７ −１９．１１１ ２４４ ＴＨＲ ＣＢ −１０．６６５ ２６．０８８ −１９．４９４ ２４４ ＴＨＲ ＯＧ１ −１１．７３５ ２６．６７５ −１８．６８４ ２４４ ＴＨＲ ＣＧ２ −１０．５０３ ２４．５９５ −１９．１５８ ２４５ ＧＬＮ Ｎ −８．０８２ ２６．７１６ −２１．０７３ ２４５ ＧＬＮ ＣＡ −６．９６４ ２６．３６２ −２１．９６２ ２４５ ＧＬＮ Ｃ −５．６４７ ２７．０２０ −２１．５２０ ２４５ ＧＬＮ Ｏ −４．５７３ ２６．３９３ −２１．４４７ ２４５ ＧＬＮ ＣＢ −７．３３０ ２６．５９９ −２３．３９７ ２４５ ＧＬＮ ＣＧ −８．２６５ ２５．５２６ −２３．９８９ ２４５ ＧＬＮ ＣＤ −８．４９３ ２５．８７３ −２５．４２８ ２４５ ＧＬＮ ＯＥ１ −９．３０６ ２６．７６９ −２５．７２７ ２４５ ＧＬＮ ＮＥ２ −７．７４５ ２５．３１２ −２６．３７０ ２４６ ＶＡＬ Ｎ −５．６９７ ２８．３０４ −２１．２１８ ２４６ ＶＡＬ ＣＡ −４．４７７ ２９．０４０ −２０．７７０ ２４６ ＶＡＬ Ｃ −３．９３６ ２８．４６２ −１９．４６７ ２４６ ＶＡＬ Ｏ −２．７０５ ２８．２２７ −１９．３６１ ２４６ ＶＡＬ ＣＢ −４．７７９ ３０．５５５ −２０．６２１ ２４６ ＶＡＬ ＣＧ１ −３．５４４ ３１．２７２ −２０．０２７ ２４６ ＶＡＬ ＣＧ２ −５．１６９ ３１．１３８ −２１．９５９ ２４７ ＡＲＧ Ｎ −４．７６７ ２８．２４０ −１８．４６２ ２４７ ＡＲＧ ＣＡ −４．３８０ ２７．７１４ −１７．１６８ ２４７ ＡＲＧ Ｃ −３．７７０ ２６．２９２ −１７．３４０ ２４７ ＡＲＧ Ｏ −２．７０５ ２５．９８５ −１６．７６４ ２４７ ＡＲＧ ＣＢ −５．５３３ ２７．６６７ −１６．１４９ ２４７ ＡＲＧ ＣＧ −４．９８７ ２７．０９５ −１４．８５２ ２４７ ＡＲＧ ＣＤ −６．０５６ ２７．１７９ −１３．７９３ ２４７ ＡＲＧ ＮＥ −５．４４０ ２６．７５７ −１２．５４６ ２４７ ＡＲＧ ＣＺ −５．８９３ ２６．８６６ −１１．３１５ ２４７ ＡＲＧ ＮＨ１ −７．０６４ ２７．４８４ −１１．２１０ ２４７ ＡＲＧ ＮＨ２ −５．１７７ ２６．４２８ −１０．２７０ ２４８ ＳＥＲ Ｎ −４．４８０ ２５．５０５ −１８．１３１ ２４８ ＳＥＲ ＣＡ −４．０３９ ２４．１３１ −１８．４２６ ２４８ ＳＥＲ Ｃ −２．６５７ ２４．０８６ −１９．０７３ ２４８ ＳＥＲ Ｏ −１．８４８ ２３．２９３ −１８．５８３ ２４８ ＳＥＲ ＣＢ −５．０３４ ２３．４０８ −１９．３７２ ２４８ ＳＥＲ ＯＧ −６．１４６ ２３．０９０ −１８．５３２ ２４９ ＳＥＲ Ｎ −２．５００ ２４．８５３ −２０．１３６ ２４９ ＳＥＲ ＣＡ −１．２２３ ２４．８７４ −２０．８５１ ２４９ ＳＥＲ Ｃ −０．０７１ ２５．３０２ −１９．９４０ ２４９ ＳＥＲ Ｏ １．０２６ ２４．７０５ −２０．０４９ ２４９ ＳＥＲ ＣＢ −１．３６９ ２５．７５８ −２２．０６８ ２４９ ＳＥＲ ＯＧ −０．３００ ２５．４１９ −２２．９５６

【００６５】 ２５０ ＬＥＵ Ｎ −０．２８９ ２６．３３３ −１９．１６０ ２５０ ＬＥＵ ＣＤ２ １．８２４ ２９．８１４ −１８．２２２ ２５０ ＬＥＵ ＣＤ１ −０．３７３ ３０．４５３ −１７．２６８ ２５０ ＬＥＵ ＣＧ ０．３５２ ２９．４３８ −１８．１５１ ２５０ ＬＥＵ ＣＢ ０．１７８ ２８．０６３ −１７．５０５ ２５０ ＬＥＵ ＣＡ ０．７１８ ２６．８３７ −１８．２１６ ２５０ ＬＥＵ Ｃ １．０９２ ２５．６９４ −１７．２６５ ２５０ ＬＥＵ Ｃ ２．２８３ ２５．４２１ −１７．０３２ ２５１ ＧＬＮ Ｎ ０．０６８ ２５．００７ −１６．７１４ ２５１ ＧＬＮ ＮＥ２ −２．７５０ ２５．５１２ −１２．２３７ ２５１ ＧＬＮ ＤＥ１ −２．８１９ ２３．４２４ −１２．９３５ ２５１ ＧＬＮ ＣＤ −２．３４５ ２４．５５０ −１３．０３４ ２５１ ＧＬＮ ＣＧ −１．２１８ ２４．８１４ −１３．９９４ ２５１ ＧＬＮ ＣＢ −０．８５７ ２３．６２１ −１４．８７７ ２５１ ＧＬＮ ＣＡ ０．３８１ ２３．９４１ −１５．７４５ ２５１ ＧＬＮ Ｃ ０．９５９ ２２．６６４ −１６．３６１ ２５１ ＧＬＮ Ｏ １．７４３ ２２．０１４ −１５．６１６ ２５２ ＡＳＮ Ｎ ０．６３３ ２２．３９４ −１７．３９０ ２５２ ＡＳＮ ＣＡ １．０８２ ２１．２０６ −１８．２８２ ２５２ ＡＳＮ Ｃ ２．３９４ ２１．３５９ −１８．９９１ ２５２ ＡＳＮ Ｏ ２．８０９ ２０．４４２ −１９．７６８ ２５２ ＡＳＮ ＣＢ ０．００４ ２０．７８０ −１９．２９２ ２５２ ＡＳＮ ＣＧ −１．０３６ １９．９２６ −１９．５７３ ２５２ ＡＳＮ ＯＤ１ −０．８３６ １９．３５５ −１７．５０２ ２５２ ＡＳＮ ＮＤ２ −２．２３４ １９．８３４ −１９．１６１ ２５３ ＴＨＲ Ｎ ３．０１８ ２２．５０５ −１８．９２３ ２５３ ＴＨＲ ＣＡ ６．２５６ ２２．７１７ −１９．７１３ ２５３ ＴＨＲ Ｃ ５．３８１ ２３．２４７ −１８．８１８ ２５３ ＴＨＲ Ｏ ６．３４６ ２３．７３３ −１９．４２７ ２５３ ＴＨＲ ＣＢ ４．０８６ ２３．６７２ −２０．９５２ ２５３ ＴＨＲ ＯＧ１ ３．５９５ ２４．９５７ −２０．４２８ ２５３ ＴＨＲ ＣＧ２ ３．１４７ ２３．１３０ −２２．０３２ ２５４ ＴＨＲ Ｎ ５．２１８ ２３．１７７ −１７．５５１ ２５４ ＴＨＲ ＣＡ ６．２１６ ２３．６１２ −１６．５８８ ２５４ ＴＨＲ Ｃ ７．４６６ ２２．７００ −１６．６１２ ２５４ ＴＨＲ Ｏ ７．４０２ ２１．５８０ −１７．０９５ ２５４ ＴＨＲ ＣＢ ５．６６４ ２３．５５８ −１５．１３２ ２５４ ＴＨＲ ＯＧ１ ５．１２９ ２２．１７８ −１５．０４０ ２５４ ＴＨＲ ＣＧ２ ４．５３０ ２４．５４９ −１４．８０２ ２５５ ＴＨＲ Ｎ ８．４９９ ２３．２９６ −１６．０７６ ２５５ ＴＨＲ ＣＡ ９．７７１ ２２．５９４ −１５．８１７ ２５５ ＴＨＲ Ｃ ９．６２１ ２２．０３１ −１４．４１４ ２５５ ＴＨＲ Ｏ ９．４３９ ２２．７８６ −１３．４７４ ２５５ ＴＨＲ ＣＢ １１．０８０ ２３．４５５ −１５．８９７ ２５５ ＴＨＲ ＯＧ１ １１．０８２ ２３．７０９ −１７．３２１ ２５５ ＴＨＲ ＣＧ２ １２．２８６ ２２．６２８ −１５．４０６ ２５６ ＬＹＳ Ｎ ９．６０６ ２０．７０２ −１４．３１４ ２５６ ＬＹＳ ＣＡ ９．３６４ ２０．０６３ −１３．０１０ ２５６ ＬＹＳ Ｃ １０．５２２ ２０．３３３ −１２．０６３ ２５６ ＬＹＳ Ｏ １１．６６２ ２０．２７４ −１２．５９２ ２５６ ＬＹＳ ＣＢ ９．０２４ １８．５９０ −１３．２４９ ２５６ ＬＹＳ ＣＧ ９．０１８ １７．８０５ −１１．９２１ ２５６ ＬＹＳ ＣＤ １０．２８６ １６．９４８ −１１．７７７ ２５６ ＬＹＳ ＣＥ １０．２１２ １５．９４０ −１０．６２３ ２５６ ＬＹＳ ＮＺ ９．２４３ １４．５６９ −１１．０５４ ２５７ ＬＥＵ Ｎ １０．２１２ ２０．６７４ −１０．８２４ ２５７ ＬＥＵ ＣＡ １１．２７２ ２１．０３６ −９．８９３ ２５７ ＬＥＵ Ｃ １１．２５０ ２０．２３２ −８．６１４ ２５７ ＬＥＵ Ｏ １２．０９６ ２０．５６５ −７．７３２ ２５７ ＬＥＵ Ｃ３ １１．１８７ ２２．５４７ −９．５２２ ２５７ ＬＥＵ ＣＧ １１．３５７ ２３．６２０ −１０．５６８ ２５７ ＬＥＵ ＣＤ１ １１．２４５ ２５．００３ −９．９２１ ２５７ ＬＥＵ ＣＤ２ １２．６７８ ２３．４６８ −１１．３２５ ２５８ ＧＬＹ Ｎ １０．４３１ １９．２８２ −８．２９８ ２５８ ＧＬＹ ＣＡ １０．６０２ １８．７９３ −６．８７９ ２５８ ＧＬＹ Ｃ ９．１６８ １８．７０３ −６．３７３ ２５８ ＧＬＹ Ｏ ８．２８３ １８．９５６ −７．２０２ ２５９ ＡＳＰ Ｎ ９．０２４ １８．２８２ −５．１５０ ２５９ ＡＳＰ ＣＡ ７．７５７ １７．８９６ −４．５１６ ２５９ ＡＳＰ Ｃ ６．６５９ １８．９４１ −４．７０９ ２５９ ＡＳＰ Ｏ ６．８５９ ２０．０３９ −４．２１４ ２５９ ＡＳＰ ＣＢ ７．９９６ １７．５４０ −３．０５３ ２５９ ＡＳＰ ＣＧ ６．７８１ １７．１２８ −２．２４１ ２５９ ＡＳＰ ＯＤ１ ５．６１１ １７．５２７ −２．３５４ ２５９ ＡＳＰ ＯＤ２ ７．０９８ １６．２９９ −１．３２１

【００６６】 ２６０ ＳＥＲ Ｎ ５．５６０ １８．６１０ −５．３１２ ２６０ ＳＥＲ ＣＡ ４．４８１ １９．５８７ −５．５２９ ２６０ ＳＥＲ Ｃ ４．０４６ ２０．３６２ −４．２８９ ２６０ ＳＥＲ Ｏ ３．５００ ２１．５０３ −４．４４６ ２６０ ＳＥＲ ＣＢ ３．３４５ １８．９１９ −６．２８９ ２６０ ＳＥＲ ＯＧ ２．７４５ １７．９３７ −５．４４８ ２６１ ＰＨＥ Ｎ ４．２４１ １９．７７８ −３．１１２ ２６１ ＰＨＥ ＣＡ ３．８３１ ２０．４６８ −１．８８５ ２６１ ＰＨＥ Ｃ ４．５４４ ２１．８４６ −１．８６３ ２６１ ＰＨＥ Ｏ ３．９４４ ２２．８４８ −１．４３２ ２６１ ＰＨＥ ＣＢ ４．０５３ １９．７４９ −０．５６３ ２６１ ＰＨＥ ＣＧ ３．５４９ ２０．３３７ ０．７１５ ２６１ ＰＨＥ ＣＤ１ ２．２０６ ２０．１６３ １．１２５ ２６１ ＰＨＥ ＣＤ２ ４．４０１ ２１．０６０ １．５５８ ２６１ ＰＨＥ ＣＥ１ １．７３７ ２０．７１７ ２．３１５ ２６１ ＰＨＥ ＣＥ２ ３．９４５ ２１．６０２ ２．７４８ ２６１ ＰＨＥ ＣＺ ２．６０５ ２１．４６５ ３．１１４ ２６２ ＴＹＲ Ｎ ５．７７８ ２１．７５８ −２．３０５ ２６２ ＴＹＲ ＣＡ ６．６８８ ２２．９１４ −２．２５１ ２６２ ＴＹＲ Ｃ ６．８２０ ２３．６８９ −３．５４５ ２６２ ＴＹＲ Ｏ ７．２０１ ２４．８５３ −３．３９３ ２６２ ＴＹＲ ＣＢ ８．１２３ ２２．４５５ −１．８５１ ２６２ ＴＹＲ ＣＧ ８．１４６ ２１．８９２ −０．４５４ ２６２ ＴＹＲ ＣＤ１ ８．０８４ ２０．４８４ −０．３６４ ２６２ ＴＹＲ ＣＤ２ ８．１４９ ２２．６６９ ０．６９３ ２６２ ＴＹＲ ＣＥ１ ８．０６２ １９．８７３ ０．８８２ ２６２ ＴＹＲ ＣＥ２ ８．１１４ ２２．０６９ １．９６２ ２６２ ＴＹＲ ＣＺ ８．０６９ ２０．６７２ ２．０１８ ２６２ ＴＹＲ ＯＨ ７．９６５ ２０．０２９ ３．２０５ ２６３ ＴＹＲ Ｎ ６．６２６ ２３．１０４ −４．６９３ ２６３ ＴＹＲ ＣＡ ６．８１２ ２３．６５５ −６．０２２ ２６３ ＴＹＲ Ｃ ５．６２６ ２３．６８０ −６．９５６ ２６３ ＴＹＲ Ｏ ５．７８１ ２４．１１７ −８．１１１ ２６３ ＴＹＲ ＣＢ ７．９２８ ２２．７６５ −６．６８１ ２６３ ＴＹＲ ＣＧ ９．２７９ ２３．０３５ −６．０６８ ２６３ ＴＹＲ ＣＤ１ １０．０６４ ２４．０４６ −６．６５７ ２６３ ＴＹＲ ＣＤ２ ９．８００ ２２．３４２ −４．９９５ ２６３ ＴＹＲ ＣＥ１ １１．３３５ ２４．３２６ −６．１６８ ２６３ ＴＹＲ ＣＥ２ １１．０６２ ２２．６４０ −４．４９１ ２６３ ＴＹＲ ＣＺ １１．８３８ ２３．６１８ −５．１０６ ２６３ ＴＹＲ ＯＨ １１．０６５ ２３．９４９ −４．５９７ ２６４ ＧＬＹ Ｎ ４．４７１ ２３．１６１ −６．５１６ ２６４ ＧＬＹ ＣＡ ３．３０１ ２３．０６４ −７．４１２ ２６４ ＧＬＹ Ｃ ３．８４７ ２２．１９６ −８．５５６ ２６４ ＧＬＹ Ｏ ４．６４７ ２１．２７４ −８．３６５ ２６５ ＬＹＳ Ｎ ３．４３６ ２２．４７７ −９．７５４ ２６５ ＬＹＳ ＣＡ ３．８３４ ２１．７９８ −１０．９７１ ２６５ ＬＹＳ Ｃ ５．１８８ ２２．２３２ −１１．４６４ ２６５ ＬＹＳ Ｏ ５．６８４ ２１．５６３ −１２．３８６ ２６５ ＬＹＳ ＣＢ ２．７５５ ２２．０７１ −１２．０４４ ２６５ ＬＹＳ ＣＧ １．４９０ ２１．５６３ −１１．３０５ ２６５ ＬＹＳ ＣＤ ０．７１０ ２０．５４８ −１２．０７９ ２６５ ＬＹＳ ＣＥ −０．６９２ ２０．４９６ −１１．３９１ ２６５ ＬＹＳ ＮＺ −１．６７８ ２０．７５７ −１２．４８９ ２６６ ＧＬＹ Ｎ ５．７８７ ２３．２２６ −１０．８１７ ２６６ ＧＬＹ ＣＡ ７．１２０ ２３．６１２ −１１．３２５ ２６６ ＧＬＹ Ｃ ７．１５５ ２５．０５２ −１１．８１８ ２６６ ＧＬＹ Ｏ ６．１７７ ２５．７９３ −１１．６４８ ２６７ ＬＥＵ Ｎ ８．２６２ ２５．３３６ −１２．４８０ ２６７ ＬＥＵ ＣＡ ８．４９０ ２６．６６０ −１３．０９７ ２６７ ＬＥＵ Ｃ ７．８０４ ２６．７７１ −１４．４３７ ２６７ ＬＥＵ Ｏ ７．９５３ ２５．９０９ −１５．２９８ ２６７ ＬＥＵ ＣＢ １０．０１０ ２６．８５５ −１３．２１４ ２６７ ＬＥＵ ＣＧ １０．４３２ ２８．０６０ −１４．０５８ ２６７ ＬＥＵ ＣＤ１ １０．０９６ ２９．３３１ −１３．２５０ ２６７ ＬＥＵ ＣＤ２ １１．９２４ ２７．９２１ −１４．３２７ ２６８ ＩＬＥ Ｎ ７．０６４ ２７．８６３ −１４．６３２ ２６８ ＩＬＥ ＣＡ ６．４０６ ２８．０３５ −１５．９４４ ２６８ ＩＬＥ Ｃ ７．４２６ ２８．２４６ −１７．０６５ ２６８ ＩＬＥ Ｏ ８．５３９ ２８．７９３ −１６．９１２ ２６８ ＩＬＥ ＣＢ ５．３６９ ２９．２１０ −１５．８９９ ２６８ ＩＬＥ ＣＧ１ ６．０９９ ３０．５４１ −１５．５９２ ２６８ ＩＬＥ ＣＧ２ ４．２４３ ２８．９２５ −１４．８６７ ２６８ ＩＬＥ ＣＤ１ ５．３９９ ３１．７６５ −１６．２６２ ２６９ ＡＳＮ Ｎ ７．００７ ２７．８４３ −１８．２３７ ２６９ ＡＳＮ ＣＡ ７．８０２ ２７．９７５ −１９．４５７ ２６９ ＡＳＮ Ｃ ６．８３９ ２８．５５４ −２０．４８５ ２６９ ＡＳＮ Ｏ ５．９６５ ２７．７６０ −２０．９４３ ２６９ ＡＳＮ ＣＢ ８．４３２ ２６．６５３ −１９．８９５ ２６９ ＡＳＮ ＣＧ ９．１６３ ２６．８０６ −２１．２１０ ２６９ ＡＳＮ ＯＤ１ ８．９９３ ２７．６２６ −２２．１２２ ２６９ ＡＳＮ ＮＤ２ １０．０１１ ２５．７９６ −２１．４７２

【００６７】 ２７０ ＶＡＬ Ｎ ６．９０８ ２９．８６８ −２０．７２４ ２７０ ＶＡＬ ＣＡ ５．８６３ ３０．４１８ −２１．６１４ ２７０ ＶＡＬ Ｃ ６．０５９ ３０．００７ −２３．０５４ ２７０ ＶＡＬ Ｏ ５．０９７ ２９．９６９ −２３．５７２ ２７０ ＶＡＬ ＣＢ ５．６５６ ３１．９５０ −２１．４２２ ２７０ ＶＡＬ ＣＧ１ ６．８４９ ３２．７９７ −２１．８７９ ２７０ ＶＡＬ ＣＧ２ ４．４２０ ３２．３６２ −２２．２３２ ２７１ ＧＬＮ Ｎ ７．３２５ ２９．７０１ −２３．３５２ ２７１ ＧＬＮ ＣＡ ７．６０３ ２９．２７０ −２４．７４４ ２７１ ＧＬＮ Ｃ ６．８６９ ２７．９３４ −２５．０３１ ２７１ ＧＬＮ Ｏ ６．２１３ ２７．８０６ −２６．０９１ ２７１ ＧＬＮ ＣＢ ９．１０４ ２９．２２０ −２４．９６４ ２７１ ＧＬＮ ＣＧ ９．４０６ ２８．６１８ −２６．３３８ ２７１ ＧＬＮ ＣＤ １０．９０１ ２８．５６５ −２６．５８２ ２７１ ＧＬＮ ＤＥ１ １１．３６９ ２８．５７９ −２７．７１６ ２７１ ＧＬＮ ＮＥ２ １１．７０２ ２８．５５３ −２５．５１０ ２７２ ＡＬＡ Ｎ ６．９７７ ２６．９９９ −２４．０９２ ２７２ ＡＬＡ ＣＡ ６．２２４ ２５．７１２ −２４．２４０ ２７２ ＡＬＡ Ｃ ４．７０１ ２５．９５８ −２４．１６４ ２７２ ＡＬＡ Ｏ ３．８９５ ２５．５０５ −２５．００１ ２７２ ＡＬＡ ＣＢ ６．７４３ ２４．７４２ −２３．１７２ ２７３ ＡＬＡ Ｎ ４．２４７ ２６．６６１ −２３．１３５ ２７３ ＡＬＡ ＣＡ ２．８４０ ２６．９２１ −２２．８５９ ２７３ ＡＬＡ Ｃ ２．０８１ ２７．５２８ −２４．０２０ ２７３ ＡＬＡ Ｏ ０．８９９ ２７．２１９ −２４．２５５ ２７３ ＡＬＡ ＣＢ ２．７３６ ２７．７７３ −２１．５８５ ２７４ ＡＬＡ Ｎ ２．７５５ ２８．４０４ −２４．７６２ ２７４ ＡＬＡ ＣＢ ２．９５２ ３０．３９１ −２６．２１０ ２７４ ＡＬＡ ＣＡ ２．１０９ ２９．１４４ −２５．８４７ ２７４ ＡＬＡ Ｃ １．７３０ ２８．３６７ −２７．０９０ ２７４ ＡＬＡ Ｏ ０．９８０ ２８．９４９ −２７．９２１ ２７５ ＧＬＮ Ｎ ２．３５０ ２７．１９４ −２７．３１４ ２７５ ＧＬＮ ＣＡ ２．０４８ ２６．３８９ −２８．５２７ ２７５ ＧＬＮ Ｃ ２．１４７ ２７．２６１ −２９．７７７ ２７５ ＧＬＮ Ｏ ３．２６０ ２７．８０７ −２９．９１６ ２７５ ＧＬＮ ＯＴ １．１９３ ２７．３６１ −３０．５９０ ２７５ ＧＬＮ ＣＢ ０．６６６ ２５．７３４ −２８．５２０ ２７５ ＧＬＮ ＣＧ ０．５０１ ２４．６６４ −２７．４４７ ２７５ ＧＬＮ ＣＤ −０．８２３ ２３．９３６ −２７．６３１ ２７５ ＧＬＮ ＤＥ１ −１．３７６ ２３．８９５ −２８．７２９ ２７５ ＧＬＮ ＮＥ２ −１．３７３ ２３．４１１ −２６．５３８ 上記構造研究並びに本明細書および他所〔フィリップ
（Philipp, M〕ほか、（１９８３）モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオケミストリー（Mol, CellBioche
m.) 、５１、５〜３２；スベンセン（Svendsen, I.B.)
、（１９７６）、カースルベルグ・リサーチ・コミュ
ニケーション（Carlsberg Res. Comm.) 、４１、２３７
〜２９１；マークランド（Markland, S.F.) 、同上；ス
トゥフェ（Stauffe, D.C.)ほか、（１９６５）ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. C
hem.) 、２４４、５３３３〜５３３８〕に示された動力
学的データはスブチリシンの結合クレフト中のサブサイ
トがＰ−４〜Ｐ−２′のサブサイトアミノ酸残基と相互
作用できることを示す。

【００６８】上記残基の最も広く研究されたものはＧly
１６６、Ｇly１６９およびＡla１５２である。これらの
アミノ酸はＳ−１サブサイト内の残基として確認され
た。Ｓ−１サブサイトの立体図である図３で知見される
ように、Ｇly１６６およびＧly１６９はＳ−１サブサイ
トの底部の位置を占め、Ａla１５２は触媒Ｓer２２１に
接近するＳ−１の上部付近の位置を占める。Ｇly１６６
およびＧly１６９の１９アミノ酸置換をすべて行なっ
た。実施例に示すように、Ｇly１６６および（または）
Ｇly１６９に対する好ましい置換アミノ酸は所与基質の
Ｐ−１位置を占める特定アミノ酸に依存する。現在行な
って分析したＡla１５２の単なる置換にはＡla１５２の
ＧlyおよびＳerによる置換が含まれる。Ｐ−１特異性に
対するこれらの置換の結果は実施例に示される。

【００６９】Ｐ−１置換アミノ酸に対する特異性に特異
的に関連するこれらの残基に加えて、Ｔyr１０４はＰ−
４特異性で包含されると確認された。しかしＰhe１８９
およびＴyr２１７における置換はそれぞれＰ−２′およ
びＰ−１′特異性に影響を及ぼすと予想される。スブチ
リシンの触媒活性はまたＡsn１５５における１部位アミ
ノ酸置換により修飾された。知見できるようにＳer２２
１、Ｈis６４及びＡsp３２は切断性ペプチド結合のカル
ボニル上のセリンヒドロキシラートによる求核結合を容
易にする位置にある。スブチリシンの結晶学的研究〔ロ
バータス（Robertus) ほか、（１９７２）バイオケミス
トリー（Biochem.）、１１、４２９３〜４３０３；マト
ース（Mattews)ほか、（１９７５）ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) 、２
５０、７１２０〜７１２６；ポウロス（Poulos) ほか、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol. Chem.) 、２５０、１０９７〜１１０３〕は２つ
の水素結合が基質遷移状態のオキシアニオンで形成され
ることを示す。１水素結合供与体は触媒セリン２２１主
鎖アミドからであり、他はアスパラギン−１５５側鎖の
ＮＥ２プロトンの１つからである、図４参照。

【００７０】Ａsn１５５をＡla、Ａsp、Ｈis、Ｃluおよ
びＴhrで置換した。これらの置換は、Ａsn１５５の側鎖
と中間体のオキシアニオンとの間の可能な水素結合によ
る遷移状態複合体の荷電四面体中間体の安定化を調べる
ために行なった。生じたこれらの個々の置換は基質代謝
回転、kcatの大きな低下（２００〜4,０００倍）、基質
結合Ｋｍの周縁低下（７倍まで）および2.２〜4.７kcat
／モルの遷移状態安定化エネルギー減を生じた。Ｋｍの
保持およびkcatの低下はこれらの変異体酵素を特異的ペ
プチド配列に対する結合タンパク質として有用になし、
その性質は前駆体プロテアーゼの特異性により決定され
る。アルカリ安定性に影響を及ぼす種々の他のアミノ酸
残基が確認された。若干の場合に、アルカリ安定性の改
変された特異体はまた改変された熱安定性を有する。

【００７１】バシラス・アミロリクエフアシエンススブ
チリシンにおける残基Ａsp３６、Ｉle１０７、Ｌys１７
０、Ｓer２０４およびＬys２１３が種々のアミノ酸で置
換すると前駆体酵素に比べて変異体酵素のアルカリ安定
性を改変する残基として確認された。Ａsp３６のＡlaに
よる置換およびＬys１７０のＣluによる置換はそれぞれ
野生型スブチリシンに比べて低いアルカリ安定性を有す
る変異体酵素を生じた。Ｉle１０７をＶalで、Ｓer２０
４をＣys、ＡrgまたはＬeuで、あるいはＬys２１３をＡ
rgで置換したときに変異体スブチリシンは野生型スブチ
リシンに比べて大きいアルカリ安定性を有した。しかし
変異体Ｓer２０４Ｐはアルカリ安定性の低下を示した。
さらに、スブチリシンの他の性質の修飾に関連すると認
められた他の酸基もまたアルカリ安定性に影響を及ぼ
す。これらの残基にはＳer２４、Ｍet５０、Ｃlu１５
６、Ｃlu１６６、Ｇly１６９およびＴyr２１７が含まれ
る。殊に次の特定置換基：Ｓer２４Ｃ、Ｍet５０Ｆ、Ｇ
ly１５６ＱまたはＳ、Ｇly１６６Ａ，Ｈ，Ｋ，Ｎまたは
Ｑ、Ｇly１６９ＳまたはＡおよびＴyr２１７Ｆ，Ｋ，Ｒ
またはＬ、は高いアルカリ安定性を生ずる。一方変異体
Ｍet５０Ｖは野生型スブチリシンに比べて変異体スブチ
リシンのアルカリ安定性の低下を生ずる。

【００７２】アルカリ安定性スクリーニングを基にした
アルカリ安定性に含まれる他の残基にはＡsp１９７およ
びＭet２２２が含まれる。特定の変異体にはＡsp１９７
（ＲまたはＡ）およびＭet２２２（すべての他のアミノ
酸）が含まれる。種々の他の残基がこの熱安定性スクリ
ーニングにより測定して熱安定性に含まれると確認され
た。これらの残基にはアルカリ安定性を与える前記の残
基およびＭet１９９およびＴyr２１が含まれる。この後
者の２つの残基はまたアルカリ安定性に重要であると思
われる。これらの残基における変異体にはＩ１９９およ
びＦ２１が含まれる。バシラス・アミロリクエフアシエ
ンススブチリシンのアミノ酸配列はまた野生型配列の２
つまたはそれ以上のアミノ酸の置換により修飾された。
６範疇の多部位置換異性体スブチリシンが確認された。
初めの２つの範疇には熱および酸化安定変異体が含まれ
る。次の３つの他の範疇にはバシラス・アミロリクエフ
アシエンススブチリシンの若干の１部位変異の有用な性
質を組合せた異性体が含まれる。最後の範疇にはアルカ
リおよび（または）熱安定性の修飾された変異体が含ま
れる。

【００７３】最初の範疇には２つのシステイン残基がス
ブチリシン分子内の種々のアミノ酸残基位置において置
換された２部位変異体が含まれる。２つの置換システイ
ン残基間のジスルフィド橋の形成が改変された熱安定性
および触媒活性を有する変異体スブチリシンを生ずる。
これらの変異体にはＡ２１／Ｃ２２／Ｃ８７およびＣ２
４／Ｃ８７が含まれ、それらは実施例１１に詳細に記載
される。多部位スブチリシン変異体の第２の範疇には種
々の酸化剤例えば過酸化水素または過酸の存在下で安定
である変異体が含まれる。実施例１および２にはこれら
の変異体が記載され、それにはＦ５０／Ｉ１２４／Ｑ２
２２、Ｆ５０／Ｌ１２４、Ｆ５０／Ｑ２２２、Ｆ５０／
Ｌ１２４、Ｉ１２４／Ｑ２２２およびＬ１２４／Ｑ２２
２が含まれる。

【００７４】多部位スブチリシン変異体の第３の範疇に
は位置１６６または１６９における種々の置換と組合せ
た位置２２２における置換を有する変異体が含まれる。
例えばこれらの変異体はＡ２２２変異の酸化安定性の性
質と種々の１６６または１６９置換の改変基質特異性と
を組合せる。そのような多部位変異体にはＡ１６６／Ａ
２２２、Ａ１６６／Ｃ２２２、Ｆ１６６／Ｃ２２２、Ｋ
１６６／Ａ２２２、Ｋ１６６／Ｃ２２２、Ｖ１６６／Ａ
２２２およびＶ１６６／Ｃ２２２が含まれる。例えばＫ
１６６／Ａ２２２変異体スブチリシンはＰ−１アミノ酸
としてフェニルアラニンを有する基質を用いて比較した
ときに１部位Ａ２２２変異体スブチリシンより約２倍の
大きいkcat／Ｋｍ比を有する。この範疇の多部位変異体
は実施例１２に詳細に記載される。

【００７５】第４の範疇の多部位変異体は位置１５６に
おける置換（ＧluをＱまたはＳに）と位置１６６におけ
るＬysの置換とを組合せる。これらの１部位変異体はい
ずれもＰ−１アミノ酸としてグルタミン酸を有する基質
に対する酵素性能を改良する。これらの１部位変異体を
組合せると生ずる多部位酵素変異体はどちらの前駆体よ
りもよい性能を有する（実施例９参照）。第５の範疇の
多部位変異体はバシラス・アミロリクエフアシエンスス
ブチリシン配列の４個までのアミノ酸の置換を含む。こ
れらの変異体はバシラス・リシエニフォルミスからのス
ブチリシンの性質に事実上等しい特異的性質を有する。
バシラス・リシエニフォルミスのスブチリシンはバシラ
ス・アミロリクエフアシエンススブチリシンと２７５個
のアミノ酸中８７個において異なる。多部位変異体Ｆ５
０／Ｓ１５６／Ａ１６６／Ｌ２１７はリシエニフォルミ
ス酵素に類似する基質特異性および動力学を有すると認
められた（実施例１３参照）。しかし、これはおそらく
酵素の基質結合領域中に存在する単に３つの変異（Ｓ１
５６、Ａ１６９およびＬ２１７）のためである。２酵素
の配列間の８７個の異なるアミノ酸の中で単に３つを変
えることによりバシラス・アミロリクエフアシエンス酵
素がバシラス・リシエニフォルミス酵素に類似の性質を
有する酵素に転化されたことは全く意外である。この系
列中の他の酵素にはＦ５０／Ｑ１５６／Ｎ１６６／Ｌ２
１７およびＦ５０／Ｓ１５６／Ｌ２１７が含まれる。

【００７６】第６の範疇の多部位変異体には幾１０７の
置換（ＩleをＶに）と位置２１３におけるＬysのＡrgに
よる置換との組合せ、および位置２０４の置換（好まし
くはＳerをＣまたはＬに、しかしまたすべての他のアミ
ノ酸に）と２１３におけるＬsyのＲによる置換との組合
せが含まれる。改変アルカリ安定性を有する他の多部位
変異体にはＱ１５６／Ｋ１６６、Ｑ１５６／Ｎ１６６、
Ｓ１５６／Ｋ１６６、Ｓ１５６／Ｎ１６６（前に改変基
質特異性を有すると確認された）、およびＦ５０／Ｓ１
５６／Ａ１６９／Ｌ２１７（前にバシラス・リシエニフ
ォルミスのスブチリシンに類似する性質を有するバシラ
ス・アミロリクエフアシエンススブチリシンの変異体と
して確認された）が含まれる。変異体Ｆ５０／Ｖ１０７
／Ｒ２１３は１部位変異体Ｆ５０、Ｖ１０７およびＲ２
１３に対するアルカリ安定性の増大の観察に基いて構築
した。Ｖ１０７／Ｒ２１３変異体は野生型スブチリシン
に比べて高いアルカリ安定性を有したことが測定され
た。この特定変異体における高いアルカリ安定性は個々
の変異それぞれの累加安定性の結果であった。同様に変
異体Ｆ５０／Ｖ１０７／Ｒ２１３はＶ１０７／Ｒ２１３
に比べてさらに高いアルカリ安定性を有し、Ｆ５０変異
体に基くアルカリ安定性の上昇もまた累加性であること
を示した。

【００７７】表ＩＶは上に言及しなかったものを含め、
行なった多部位変異体の要約である。さらに、一部は上
記結果を基にしてスブチリシン中の次の残基：Ｓer２
４、Ｍet５０、Ｉle１０７、Ｇlu１５６、Ｇly１６６、
Ｇly１６９、Ｓer２０４、Ｌys２１３、Ｇly２１５およ
びＴyr２１７、における置換が高い熱およびアルカリ安
定性を有する多部位変異体を生ずると予想される。

【００７８】

【表４】 表 ＩＶ ２部位変異体 ３部位、４部位または他の多部位変異体 Ｃ２２／Ｃ８７ Ｆ５０／Ｉ１２４／Ｑ２２２ Ｃ２２／Ｃ８７ Ｆ５０／Ｉ１２４／Ｑ２２２ Ｖ４５／Ｖ４８ Ｆ５０／Ｉ１２４／Ｑ２２２ Ｃ４９／Ｃ９４ Ａ２１／Ｃ２２／Ｃ８７ Ｃ４９／Ｃ９５ Ｆ５０／Ｓ１５６／Ｎ１６６／Ｌ２１７ Ｃ５０／Ｃ９５ Ｆ５０／Ｑ１５６／Ｎ１６６／Ｌ２１７ Ｃ５０／Ｃ１１０ Ｆ５０／Ｓ１５６／Ａ１６９／Ｌ２１７ Ｆ５０／Ｉ１２４ Ｆ５０／Ｓ１５６／Ｌ２１７ Ｆ５０／Ｑ２２２ Ｆ５０／Ｑ１５６／Ｋ１６６／Ｌ２１７ Ｉ１２４／Ｑ２２２ Ｆ５０／Ｓ１５６／Ｋ１６６／Ｌ２１７ Ｑ１５６／Ｄ１６６ Ｆ５０／Ｑ１５６／Ｋ１６６／Ｌ２１７ Ｑ１５６／Ｋ１６６ Ｆ５０／Ｓ１５６／Ｋ１６６／Ｌ２１７ Ｑ１５６／Ｎ１６６ Ｆ５０／Ｖ１０７／Ｒ２１３ Ｓ１５６／Ｄ１６６ 〔S153／S156／A158／G159／S160／Δ Ｓ１５６／Ｋ１６６ 161-164／I165／S166／A169／R170〕 Ｓ１５６／Ｎ１６６ Ｌ２０４／Ｒ２１３ Ｓ１５６／Ａ１６９ Ｒ２１３／２０４Ａ，Ｅ，Ｑ，Ｄ，Ｎ，Ｇ，Ｋ， Ａ１６６／Ａ２２２ Ｖ，Ｒ，Ｔ，Ｐ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｙ，Ｗ Ａ１６６／Ｃ２２２ またはＨ Ｆ１６６／Ａ２２２ Ｖ１０７／Ｒ２１３ Ｆ１６６／Ｃ２２２ Ｋ１６６／Ａ２２２ Ｋ１６６／Ｃ２２２ Ｖ１６６／Ａ２２２ Ｖ１６６／Ｃ２２２ Ａ１６９／Ａ２２２ Ａ１６９／Ａ２２２ Ａ１６９／Ｃ２２２ Ａ２１／Ｃ２２ 上に確認したアミノ酸残基に加えて、スブチリシンの他
のアミノ酸残基もまた基質特異性に関して重要であると
思われる。これらの残基のそれぞれの変異はスブチリシ
ンの基質特異性に変化を生ずると予想される。さらに、
これらの残基間および前記残基間の多部位変異もまた新
規な基質特異性を有するスブチリシン変異体を生ずると
予想される。

【００７９】殊に重要な残基はＨis６７、Ｉle１０７、
Ｌeu１２６およびＬeu１３５である。Ｈis６７の変異は
Ｓ−１′サブサイトを改変してそれによりＰ−１′基質
残基に対する変異体の特異性を改変するであろう。この
位置における変化はまた変異体のpH活性プロフィルに影
響を及ぼすことができよう。この残基は生成物阻害剤複
合体からの発明者の基質モデリングに基いて確認され
た。Ｉle１０７はＰ−４結合に含まれる。従ってこの位
置における変異はアルカリ安定性に対する観察効果に加
えてＰ−４基質残基に対する特異性を改変しよう。Ｉle
１０７はまた生成物阻害剤複合体からの分子モデリング
により確認された。Ｓ−２結合部位はＬeu１２６残基を
含む。この部位における修飾は従ってＰ−２特異性に影
響を及ぼすであろう。さらにこの残基はスブチリシンを
アミノペプチダーゼに転化するのに有用であると思われ
る。pH活性プロフィルもまた適当な置換により修飾され
よう。これらの残基は精密モデル、モデリング研究から
の三次元構造の精査から確認された。長い側鎖はＳ−２
サブサイトにおける側鎖の結合を妨げると予想される。
従って結合はサブサイトＳ−１、Ｓ−１′、Ｓ−２′、
Ｓ−３′に制限され、開裂はアミノ末端ペプチドの後に
生ずるように強制されよう。

【００８０】Ｌeu１３５はＳ−サブサイト中にあり、変
異されればＰ−４に対する基質特異性が改変されるであ
ろう。この残基はＦ２２２の生成物阻害剤複合体に基く
三次元構造およびモデリングの精査により確認された。
これらの部位に加えて、セグメント９７〜１０３、１２
６〜１２９および２１３〜２１５内の特定アミノ酸残基
もまた基質結合に重要であると思われる。セグメント９
７〜１０３および１２６〜１２９は基質残基Ｐ−４〜Ｐ
−２の主鎖と逆平行βシートを形成する。これらの領域
中の残基の変異はこれらの基質残基の主鎖がＳ−４〜Ｓ
−２サブサイト内のこれらの特定残基と相互作用しない
ので、主鎖（酵素）−主鎖（基質）相互作用により基質
配向に影響を及ぼすであろう。

【００８１】セグメント９７〜１０３内のＧly９７およ
びＡsp９９を変異してセグメント内の残基１０１〜１０
３の位置を改変することができる。しかしこれらの部位
におてる変化は相容性でなければならない。バシラス・
アミロリクエフアシエンススブチリシン中のＡsp９９は
残基１０１〜１０３の方向に影響を及ぼす主鎖三次折り
たたみ中の反転を安定化する。バシラス・リシエニフォ
ルミススブチリシンＡsp９７は類似の方法で機能する。
Ｇly９７およびＡsp９９に加えて、Ｓer１０１は、バシ
ラス・アミロリクエフアシエンススブチリシン中のＡsp
９９と相互作用してこの主鎖の反転を安定化する。この
残基の改変は１０１〜１０３主鎖の方向を改変するであ
ろう。Ｃlu１０３における変異もまた１０１〜１０３主
鎖の方向に影響を及ぼすと予想される。

【００８２】Ｇly１０２の側鎖は基質Ｐ−３アミノ酸と
相互作用する。従って置換アミノ酸の側鎖はＰ−３基質
アミノ酸に対する特異性にかなり影響を及ぼすと予想さ
れる。１２７〜１２９セグメントの内のすべてのアミノ
酸は基質特異性に重要であると思われる。Ｇly１２７は
その側鎖がＳ−１およびＳ−３サブサイトと相互作用す
るような位置にある。従ってこの残基の改変は基質のＰ
−１およびＰ−３残基に対する特異性を改変するであろ
う。Ｇly１２８の側鎖はＳ−２およびＳ−４サブサイト
の両方の一部を構成する。従って、Ｐ−２および、Ｐ−
４に対する改変された特異性が変異で期待されよう。さ
らにそのような変異はスブチリシンをアミノペプチダー
ゼに転化でき、同じ理由でＬeu１２６の置換はその結果
を生ずると期待されよう。

【００８３】Ｐro１２９残基は配列１２６〜１３３の配
座の自由を制限すると思われ、その残基はＰ−１特異性
の決定に主要な役割を演ずることができる。Ｐroの置換
は一層のたわみ性を導入し、それによりそのような変異
体の結合能力の範囲を広くすることができよう。Ｌes２
１３の側鎖はＳ−３サブサイト内に配置される。２１３
〜２１５セグメント内のすべてのアミノ酸もまた基質特
異性に重要であると思われる。従ってこの残基の変異で
改変されたＰ−基質特異性が予想される。Ｔyr２１４残
基は基質と相互作用しないが、しかしヘアピンループ２
０４〜２１７の配座に影響を及ぼすことができるような
位置にある。最後に、Ｇly２１５残基はＳ−３′サブサ
イトに影響を及ぼしてそれによりＰ−３′特異性を改変
するであろう。

【００８４】アミノ酸の前記置換に加えて、残基１５２
〜１７２を含む外側ループ内の１つまたはそれ以上のア
ミノ酸の挿入または欠失もまた特異性に影響を及ぼすこ
とができる。これはこれらの残基がスブチリシンと複合
体化したストレプトマイセスブチリシン阻害剤のモデル
に記載された「二次接触領域」中で役害を果すことがで
きる、ヒロノ（Hirono) ほか、（１９８４）ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Bio
l.)、１７８、３８９〜４１３。サーミターゼＫはこの
領域中に欠失を有し、それがこの「二次接触」残基の若
干を排除する。ことに残基１６１〜１６４の欠失は基質
特異性を修飾された変異体スブチリシンを生ずると予想
される。さらに欠失により誘発されるこの領域中の転位
が基質結合に含まれる多くの残基の位置を主にＰ−１で
改変するであろう。次いでこれがタンパク質基質に対す
る全体の活性に影響を及ぼすであろう。

【００８５】残基１６１〜１６４の欠失の効果の効果は
野生型（ＷＴ）酵素の活性を、この欠失並びに多部位置
換（すなわちＳ１５３／Ｓ１５６／Ａ１５８／Ｇ１５９
／Ｓ１６０／△１６１〜１６４／１１６５／Ｓ１６６／
Ａ１６９／Ｒ１７０）を含む変異体酵素と比較すること
により示された。これは次の結果を生じた：

【００８６】

【表５】 表 Ｖ kcat Km kcat／Km ＷＴ ５０ 1.4 × 1０^-4 3.6 × 1０⁵ 欠失変異体 ８ 5.0 × 1０^-6 1.6 × 1０⁶ ＷＴは欠失変異体よりも６倍も大きいkcatを有するが基
質結合は欠質変異体よりも２８倍も強固である。従って
欠失変異体の全効率はＷＴ酵素よりも4.４倍も高い。ま
だ置換、欠失または挿入の行なわれていない前記残基の
すべてが表VIに示される。

【００８７】

【表６】 表 VI 置換／挿入／欠失 残 基 Ｈis６７ Ａla１５２ Ｌeu１２６ Ａla１５３ Ｌeu１３５ Ｇly１５４ Ｇly９７ Ａsn１５５ Ａsp９９ Ｇly１５６ Ｓer１０１ Ｇly１５７ Ｇly１０２ Ｇly１６０ Ｇlu１０３ Ｔhr１５８ Ｌeu１２６ Ｓer１５９ Ｇly１２７ Ｓer１６１ Ｇly１２８ Ｓer１６２ Ｐro１２９ Ｓer１６３ Ｔhr２１４ Ｔhr１６４ Ｇly２１５ Ｖall １６５ Ｇly１６６ Ｔhr１６７ Ｐro１６８ Ｇly１６９ Ｌys１７０ Ｔyr１７１ Ｐro１７２ 以下の開示は本発明の態様の代表として役立たせるもの
であり、本出願の範囲を限定すると解すべきではない。
これらの特定の実施例は一定の前記変異体の構築を開示
する。しかし他の変異体の構築はこの開示およびＥＰＯ
公表０１３０７５６号中に与えられるものから明らかで
あろう。

【００８８】参照した文献はすべて参照により特に加入
される。

【００８９】

【実施例】

実施例１ スブチリシンＱ２２２及びＬ２２２の過酸酸化性残基の
同定 図１０及び図１１に示したように、有機性の過酸酸化剤
は、スブチリシンのＭet２２２Ｌ及びＭet２２２Ｑ変異
体（Ｌ２２２及びＱ２２２）を不活性化する。本実施例
は、これらスブチリシン変異体中の過酸酸化性部位の同
定について記述してある。第１に、過酸酸化に関係する
アミノ酸のタイプを決定した。非常に激しい条件下のも
のは別として（Ｇ．Ｅ．ミーンズ（Means)等、（１９７
１年）“タンパク質の化学修飾”ＣＡ、Ｓ．Ｆ．ホール
デン・ディ（Holden-Day）、１６０〜１６２頁）、有機
性過酸は、スブチリシン中のメチオニン及びトリプトフ
ァンのみを酸化する。酸化剤として、ジペルドデカン酸
（ＤＰＤＡ）を用いた不活性化滴定において、その酵素
の２５０nmから３５０nmの範囲での差スペクトルを測定
した。酵素の定量的不活性化が起こっているにもかかわ
らず、この波長域での吸光度変化が、図７に示すとおり
認められず、トリプトファンが酸化されていないことを
示した。

【００９０】（Ａ．フォンタナ（Fontana)等、（１９８
０年）、“ペプチド及びタンパク質の配列分析法”
（Ｃ．バー(Birr)編）、ニューヨーク、エルスバイア(E
lsevier)、３０９頁）トリプトファンの修飾がないこと
は、アミロリクェファシェンス（amyloliquefaciens)の
ズブシリシン中の残りのメチオニンの１つ以上が酸化さ
れていることを意味している。図１を参照せよ。この結
果を確かめるために、スブチリシンの組換え体Ｍet２２
２ＦをＤＰＤＡによる酸化の前後で臭化シアン（ＣＮＢ
ｒ）で切断した。ＣＮＢｒ切断により生じたペプチドを
高分解能ＳＤＳ−ピリジンペプチドゲル（ＳＰＧ）によ
り分析した。スブチリシンＭet２２２Ｆ（Ｆ２２２）を
次に示す方法により酸化した。精製したＦ２２２を、0.
１Ｍホウ酸ナトリウム溶液（pH9.５）に１０mg／mlの濃
度となるよう懸濁し、ジペルドデカン酸を最終濃度２６
mg／mlとなるよう加えて、実効活性酸素が３０ppm 生ず
るようにした。その試料を室温で少なくとも３０分イン
キュベートし、それから0.１Ｍトリス（pH8.６）となる
ように、１Ｍトリスバッファ（pH8.６）を１０分の１容
量加えて酸化を押えた。３mMのフェニルメチルスルフォ
ニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を加え、2.５mlの試料
を、１０mMリン酸ナトリウム（pH6.２）、１mMＰＭＳＦ
で平衡化したファルマシアのＰＤ１０カラムにかけた。
3.５mlの１０mMリン酸ナトリウム（pH6.２）、１mMＰＭ
ＳＦで溶出し、溶出液を採集した。

【００９１】Ｆ２２２及びＤＰＤＡで酸化したＦ２２２
を９倍容のアセトンを用い、−２０℃で沈殿化した。そ
の試料を８８％ギ酸中８Ｍ尿素溶液に１０mg／mlとなる
よう懸濁し、５分間放置した。８８％ギ酸中２００mg／
mlのＣＮＢｒ溶液を等容量加え（５mg／mlタンパク
質）、その試料を暗所、室温で２時間インキュベートし
た。ゲル電気泳動の前に、その試料を凍結乾燥し、試料
バッフア（１％ピリジン、５％ドデシル硫酸ナトリウ
ム、５％グリセリン及びブロモフェノールブルー）に、
２〜５mg／mlとなるように懸濁し、９５℃、３分間で解
離させた。その試料を不連続ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動した（Ｊ．カイト(Kyte)等、（１９８３年）、
アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Bioche
m.)、１３３巻、５１５〜５３２頁）。そのゲルはファル
マシアの銀染色技術を使って染色した（Ｄ．Ｗ．サモン
ズ（Sammons)等、１９８１年）、エレクトロフォレシス
（Electrophoresis)、２巻、１３５〜１４１頁）。

【００９２】ひこの実験結果は図１３に示した。見ても
分かるように、ＣＮＢｒだけで処理したＦ２２２は、Ｓ
ＰＧ上に９個の分離したバンドを与えた。しかし、切断
前にＦ２２２をＤＰＤＡで処理した場合は、バンドＸ、
７、及び９は消え、一方バンド５及び６の強度が非常に
増加した。影響をうけるメチオニンがどれか決定するた
めに、各々のＣＮＢｒペプチドを逆相のＨＰＬＣで単離
し、特性を調べた。全てのＨＰＬＣによる分離のため
の、溶媒Ａ（水溶性）及び溶媒Ｂ（有機性）の両方とも
バッファ系は0.０５％トリエルアミン／トリフルオロ酢
酸（ＴＥＡ−ＴＦＡ）を用いた。断わらない限り、溶媒
Ａは水中に0.０５％ＴＥＡ−ＴＦＡを含み、溶媒Ｂは１
−プロパノール中に0.０５％ＴＥＡ−ＴＦＡを含む。そ
して、流速は0.５ml／分で行った。

【００９３】ＨＰＬＣ分析においては、２回の１mg酵素
消化物の注入で行った。３個の試料をアセトン沈殿し、
洗浄し、そして乾燥した。乾燥した１mgの試料を、８８
％ギ酸８Ｍ尿素中に１０mg／mlになるよう懸濁した。８
８％ギ酸中、２００mg／mlのＣＮＢｒ溶液等容量をこれ
に加えた（５mg／mlタンパク質）。室温、暗所で２時間
インキュベーション後、その試料を、４０％溶媒Ｂ、６
０％溶媒Ａで平衡化した。0.８cm×７cmのトリスアクリ
ルＧＦ０５コースレジン（coarse resin）（フランス、
パリＩＢＦ）のカラムで脱塩した。２００μl の試料を
毎分１mlの流速でこのカラムに通し、２８０nmの吸光度
をモニターすることにより、1.０〜1.２ml採集した。Ｈ
ＰＬＣに注入する前、各脱塩試料を３倍容の溶媒Ａで希
釈した。試料を毎分1.０ml（２分間）で注入し、その後
流速を0.５ml／min に調整した（溶媒Ａ）。２分後、1.
０％Ｂ／分の勾配で６０％Ｂへの直線勾配を開始した。
各１mgの運転からのピークを合わせ、上述のゲル電気泳
動で分析した。

【００９４】逆相のＨＰＬＣで単離した各ポリペプチド
をＳＰＧにより均一性に対するチェックを行った。既知
遺伝子配列の各ペプチドの位置（Ｊ．Ａ．ウェルズ（We
lls)等（１９８３年）、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.)１１巻、７９１１〜７９２
４頁）は、アミノ酸組成分析及び、必要ならば、アミノ
末端配列分析を組合せることにより得られる。そのよう
な分析に先立ち、次のペプチドを再度クロマトグラフィ
ーにかけなければならない。 1. ＤＰＤＡで処理していないＦ２２２のＣＮＢｒペプ
チド ペプチド５を、さらに２回の逆相の分離にかけた。８０
％Ａ／２０％Ｂで平衡化した１０cmＣ４カラムに合せた
試料をかけ、２分間洗浄した。次に、毎分0.５％mlＢの
勾配をかけ、この分離から得られた画分を今度は、溶媒
Ｂの代りに、アセトニトリル／１−プロパノール（１：
１）中に0.０５％ＴＥＡ−ＴＦＡを含むものを用い、２
５cmＣ４カラムにかけた。勾配も同様に行った。

【００９５】ペプチド“Ｘ”は、最初のクロマトグラフ
ィーの後にもう１度別の分離を行った。その試料をのせ
た後、0.５ml／分（１００％Ａ）で２分間洗い、さらに
毎分0.５％mlＢの勾配を開始した。ペプチド７及び９
は、ペプチド５の最初の再分離と同じ方法で再びクロマ
トグラフィーにかけた。ペプチド８は、最初の分離で、
均一に精製されていた。 2. ＤＰＤＡで酸化したＦ２２２のＣＮＢｒペプチド 酸化したＦ２２２のＣＮＢｒ消化から得られたペプチド
５及び６を、未処理酵素からのペプチド５と同様の方法
により精製した。アミノ酸組成は次の方法で分析した。
試料（各アミノ酸〜ＩnM) を乾燥し、減圧下、１００μ
l ６NHClを用いて、１０６℃、２４時間で加水分解し、
さらにスピード・バク（Sped Vac) 中で乾燥した。その
試料をニンヒドリン検出を採用したベックマン（Beckma
nn) ６３００ＡＡアナライザで分析した。

【００９６】アミノ末端配列データは、従来法により得
た（Ｈ．ロドリゲス（Rodriguez)等、（１９８４年）、
アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Bioche
m.）、１３４巻、５３８〜５４７頁）。結果を表VII 及
び図１４に示した。

【００９７】

【表７】 表 VII ＣＮＢｒフラグメントのアミノ及び カルボキシル末端 フラグ 末 端 及 び 方 法 メント アミノ末端、方法 カルボキシル末端、方法 ｘ １、配列 ５０、組成 ９ ５１、配列 １１９、組成 ７ １２５、配列 １９９、組成 ８ ２００、配列 ２７５、組成 ５ox １、配列 １１９、組成 ６ox １２０、配列 １９９、組成 ペプチド５ox及び６oxは、酸化タンパク質のＣＮＢｒ消
化から単離した、各フラグメントレベルが強調されたペ
プチド５及び６のことである。

【００９８】表VII 中のデータ及び、図１３中の、酸化
されたタンパク質及び本来のものに対するＳＰＧトラッ
クの比較から、(1) Ｍet５０の酸化は、ペプチドＸ及び
９の消失とペプチド５の出現を誘導する。そして(2) Ｍ
et１２４の酸化もペプチド７の消失と、ペプチド６の蓄
積を誘導する。このように、過酸、ジベルドデカン酸に
よるＢ．アミロリクィファシエンス（amyloliquefacien
s)の酸化は、残基５０及び１２４の位置のメチオニンの
特異的なものである。 実施例２ スブチリシンＭet２２２Ｑ中のＭet５０及びＭet１２４
の置換。 Ｍet５０の位置の置換に対するアミノ酸の選択は、Ｂ．
リチェニホルミス（Iicheniformis)（Ｅ．Ｃ．スミス
（Smith)等（１９６８年）、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) 、２４３
巻、２１８４−２１９１頁）、Ｂ．ＤＹ（Ｐ．ネドコフ
（Nedkov) 等、（１９８３年）ホープ・セイラーズＺ．
フィジオロジカル・ケミストリー（Hoppe Sayler's. Z.
Plysiol. Chem.)３６４巻、１５３７−１５４０頁）、
Ｂ．アミロサッカリティカス（amylosachcariticus)(F.
S. マークランド（Markiand) 等、（１９６７年）、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. B
iol. Chem.) ２４２巻、５１９８−５２１１頁）及び枯
草菌（B. subtilis)（Ｍ．Ｌ．ストール（Stahl)等、
（１９８４年）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（J. Bacteriol.)１５８巻、４１１〜４１８頁）由来の
スブチリシンに対する入手可能な配列データに基づいて
いる。全ての場合において、５０の位置はフェニルアラ
ニンであった。図５〜９参照。それ故、構築にあたって
は、Ｐhe５０が選ばれた。

【００９９】１２４の位置は、全ての既知のスブチリシ
ンについて、メチオニンである。図５〜９参照。Ｘ線解
析によるタンパク質の構造の分子モデル化は置換のため
の最も適した候補者を決定するのに必要である。１９の
全ての候補者からイソロイシンとロイシンが最適の残基
として選ばれた。両方でなく１つの部位での修飾が酸化
安定性を増すのに十分かどうかをテストするために、Ｑ
２２２バックボーンについて全ての可能な組合せのもの
を作った（Ｆ５０／Ｑ２２２、１１２４／Ｑ２２２、Ｆ
５０／１１２４／Ｑ２２２）。 Ａ．コドン４５及び５０の間における突然変異の構築 カセット・ミュータジェネシス（Cassette mutagenesi
s) に対する全ての取扱いは、ＥＰＯ公表第０１３０７
５６号及び、Ｊ．Ａ．ウェルス（Wells)等（１９８５
年）、ジーン（Gene）、３４巻、３１５−３２３頁中に
開示されている方法を用い、ｐＳ4.５に関して行った。
図１５、４行目のｐ△５０の突然変異は、図１５、６行
目に示した変異誘発プライマリーを用いて起こされ、以
下に述べる制限精製（restriction-purification) と命
名した方法がとられた。簡単にいえば、スブチリシン遺
伝子を含むＭ１３テンプレート、Ｍ１３mp１１−ＳＵＢ
Ｔをヘテロ二重鎖の合成のために用いた（アデルマン
（Adelman)等、（１９８３年）、ＤＮＡ・２巻、１８３
−１９３頁）。ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ ３３８７６号）
へのトランスフェクション後、スブチリシン遺伝子を含
む1.５kbのＥcoＲ１−ＢamＨＩフラグメントを、Ｍ１３
mp１１ＳＵＢＴ rf から、ＥＰＯ公表第０１３０７５６
号に、その構築法が詳述されているｐＢＳ４２の受容ベ
クターフラグメントヘサブクローンした。変異配列を増
やすために、生じたプラスミドプールをＫpnＩで消化
し、線状分子をポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によ
り精製した。線状分子を再び環状型に連結し、大腸菌Ｍ
Ｍ２９４細胞（ＡＣＴＴ３１４４６）にトランスフォー
ムした。単離したプラスミドを、ＫpnＩ部位の制限分析
によりスクリーニングした。ＫpnＩ⁺ プラスミドの配列
決定を行ないｐ△５０配列を確認した。図１６中のアス
テリスクと野生型配列から変異した塩基を示している
（４行目）。ｐ△５０（４行目）をＳtuＩ及びＥcoＲＩ
で切り出し、スブチリシン遺伝子の５′側半分を含む0.
５kbフラグメントを精製した（フラグメント１）。ｐ△
５０（４行目）ＫpnＩ及びＥcoＲＩで消化し、スブチリ
シン遺伝子の３′側半分とベクター配列を含む4.０kbフ
ラグメントを精製した（フラグメント２）。フラグメン
ト１及び２（５行目）、及び望ましい異変をコードした
２本鎖ＤＮＡカセットを各々、１：１：１０のモル比で
混合した。この実施例の特別な構築に対し、Ｐheをコー
ドするコドン５０としてこのＤＮＡカセットはトリプレ
ットＴＴＴを含んでいる。このプラスミドをｐＦ５０と
名付けた。このスブチリシン突然変異体をＦ５０と名付
けた。 Ｂ．コドン１２２と１２７の間における突然変異の構築 実施例２Ａの操作を、図１６、７行目の変異誘発プライ
マーの使用及び、ｐ△１２４におけるＥcoＲＶ部位に対
する制限−精製の使用以外は実質的に詳細に遂行した。
さらに、ＤＮＡカセット（図１６、６行目の影付き配
列）はコドン１２４に対し、Ｉleをコードするトリプレ
ットＡＴＴ及びＬeuをコードするＣＴＴを含んでいる。
Ｍet１２４をＩleで置換したプラスミドをｐＩ１２４と
命名し、そのスブチリシン突然変異体をＩ１２４と命名
した。 Ｃ．種々のＦ５０／Ｉ１２４／Ｑ２２２多部位突然変異
体の構築 三部位突然変異体、Ｆ５０／Ｉ１２４／Ｑ２２２を、各
フラグメントが、それらの三つの突然変異体の一つを含
むものの、三種類の連結から構築した。１つの突然変異
体Ｑ２２２（ｐＱ２２２）をＥＰＯ公表第０１３０７５
６号に詳述されているカセット・ミュータジエネシスに
より調製した。そのＦ５０突然変異は、ｐＦ５０由来の
2.２kbのＡva II-Ｐvu II フラグメント中に含まれてい
る。Ｉ１２４突然変異は、pl１２４由来の２６０bpのＰ
vu II −Ａva II に含まれる。そしてＱ２２２突然変異
は、ｐＱ２２２由来の、2.７kbのＡva II −Ａva II フ
ラグメント中に含まれている。その三つのフラグメント
を一緒に連結し、大腸菌ＭＭ２９４細胞にトランスフォ
ームした。単離したトランスフォーマント由来のプラス
ミドの制限分析で、その構築を確認した。その最終的な
構築を分析するためには、野生型のスブチリシン遺伝子
中の７９８の位置のＡvaII部位を、Ｉ１２４構築により
除外することが便利である。 Ｄ．Ｑ２２２突然変異体の酸化安定性。

【０１００】上述の突然変異体の過酸の酸化に対する安
定性を分析した。図１７に示したとおり、ジペルドデカ
ン酸とのインキュベーションに対し（タンパク質２mg／
ml、酸化剤７５ppm

〔０〕）、Ｉ１２４／Ｑ２２２及び
Ｆ５０／Ｉ１２４／Ｑ２２２の両方とも完全に安定であ
るが、一方、Ｆ５０／Ｑ２２２及びＱ２２２は不活性化
した。これは、スブチリシンＱ２２２のＭet１２４から
Ｉ１２４への転換が有機性過酸酸化剤に対する耐性を与
えることを示している。 実施例３ 基質特異性が変化し、残基１６６が、疎水的置換を起こ
したスブチリシン突然変異体 スブチリシンは、疎水的な性質をもつ、長い結合のため
の裂け目をもっている。１６６番目の残基に維持される
グリシンを、その側鎖が、Ｓ−１サブサイトへ突き出て
いる１２種の非イオン性アミノ酸に置換した。大きさ及
び疎水性の変化の、種々の基質の結合に関する影響を測
定するようこれらの突然変異体を作った。

【０１０１】Ａ．Ｂ．アミロリクエファシエンス（Amyl
oliquefaciens)由来のスブチリシンによる、Ｐ−１アミ
ノ酸を変化させた基質の加水分解の速度論。 野生型スブチリシンを、Ｂ．アミロリクエファシエンス
（Amyloliquefaciens)のスブチリシン遺伝子を発現する
枯草菌（B. subtilis)培養液上清から精製した（Ｊ．
Ａ．ウェルズ（wells)等（１９８３年）、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res)、１１巻、
７９１１−７９２５頁）（Ｄ．Ａ．エステル（Estell)
等、（１９８５年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) ２６０巻、６５１
８−６５２１頁）。スクシニル−Ｌ−ＡlaＬ−ＡlaＬ−
ＰroＬ−〔Ｘ〕−ｐ−ニトロアニリド（ＸはＰ１アミノ
酸）の形をもつテトラペプチド基質の合成の詳細は、
Ｅ．Ｇ．デルマー(DelMar)等、（１９７９年）、アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.) ９９
巻、３１６−３２０頁に述べられている。

【０１０２】速度論パラメータkm（Ｍ）及びkcat
（Ｓ^-1）は、修正プログレス・カーブ・アナリシス（mo
difiedprogress curve analysis)（Ｄ．Ａ．エステル(E
stell)等、（１９８５年）ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) ２６０巻、６
５１８−６５２１頁）を用いて測定した。簡単にいう
と、生成物濃度に対する速度のプロットを非線型回帰ア
ルゴリズムを用いて、速度式の微分型にフィットさせ
た。報告される全てのkcat及びkmの値の誤差は５パーセ
ント以下であった。表VIIIにおける種々の基質は疎水性
の大きい順に並べてある。（Ｙ．ノザキ（Nozaki) 、
（１９７１年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J. Biol. Chem.) ２４６巻、２２１１−
２２１７頁；Ｃ．タンフォード（Tanford)、（１９７８
年）、サイエンス（Science)、２００巻、１０１２
頁）。

【０１０３】

【表８】 表 VIII ＰＩ基質 Kcat/Km アミノ酸 kcat(S^-1) 1/Km(M^-1) (S^-1 M^-1） Ｐhe 50 7,100 360,000 Ｔyr 28 40,000 1,100,000 Ｌeu 24 3,100 75,000 Ｍet 13 9,400 120,000 Ｈis 7.9 1,600 13,000 Ａla 1.9 5,500 11,000 Ｇly 0.003 8,300 21 Ｇln 3.2 2,200 7,100 Ｓer 2.8 1,500 4,200 Ｇlu 0.54 32 16 比kcat／km（また、触媒効率とも呼ばれる）は、フリー
の（酵素＋基質）（Ｅ＋Ｓ）の（酵素＋生成物）（Ｅ＋
Ｐ）への転換に対する見かけの二次速度定数である
（Ｗ．Ｐ．ジェンクス（Jencks) 、化学及び酵素学にお
ける触媒（Catalysis in Chemistry and Enzymology)
（マグローヒル（McGrow-Hill)、１９６９年）、３２１
−４３６頁；Ａ．ファーシュ（Fersht) 、酵素の構造と
機構（EnzymeStructure and Mechanism)（フリーマン
（Freeman)、サンフランシスコ、１９７７年）、２２６
−２８７頁）。log (kcat/Km─は遷移状態の結合エネル
ギー

【０１０４】

【外１】 に比例する。Ｐ１の側鎖の疎水性に対するlog kcat/Km
のプロット（図１９）は、非生産的結合の証拠を示すグ
リシン基質は別として、非常に良い相関を示している。
これらのデータは、遷移状態の結合エネルギー間の相対
的差が、Ｐ−１の側鎖の疎水性の差で説明ができること
を示している。その遷移状態の結合エネルギーをこれら
の基質について計算し、各々の側鎖の疎水性に対し、プ
ロットすると、その線の勾配は1.２である（データは示
していない）。キモトリプシンの場合にみられるように
（Ａ．ファーシュ（Fersht）、酵素の構造と機構（フリ
ーマン、サンフランシスコ、１９７７年）、２２６−２
８７頁；Ｊ．Ｗ．ハーバー（Herper) 等、（１９８４
年）、バイオケミストリー（Biochemistry）、２３巻、
２９９５−３００２頁）、１以上の勾配は、Ｐ１結合溝
は、アミノ酸の疎水性を測定するのに実験的に用いるエ
タノール又はジオキサンよりも、より疎水的であること
を示している（Ｙ．ノザキ（Nozaki) 等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.) （１９７１年）、２４６巻、２２１１−２２１７
頁；Ｃ．タンフォード（Tanford)（１９７８年）、サイ
エンス（Science)２００巻、１０１２頁）。

【０１０５】スブチリシンによるアミドの加水分解に対
し、kcatはアシル化速度として説明することができる
し、kmは、ミカエリス複合体（Ｅ．Ｓ）に対する解離定
数Ksとして説明しうる（Ｈ．ガットフレンド（Gutfren
d) 等、（１９５６年）、バイオケミカルジャーナル（B
iochem. J.)６３巻、６５６頁）。log(1/Km) と同様、l
og(kcat）が基質の疎水性と相関を示すことは、アシル
化段階において、基質がミカエリス複合体（Ｅ．Ｓ）か
ら、四面体型の遷移状態複

【０１０６】

【外２】 へと進行するにつれ、Ｐ−１側鎖が疎水性の裂け目のよ
り深い所に移動するという主張（Ｊ．Ｄ．ロバータス
（Robertus) 等、（１９７２年）、バイオケミストリー
（Biochemistry）、１１巻、２４３９−２４４９頁；
Ｊ．Ｄ．ロバータス（Robertus) 等、（１９７２年）、
バイオケミストリー（Biochemistry）、１１巻、２４９
３−４３０３頁）と一致している。しかし、これらのデ
ータはまた、Ｐ−１側鎖の疎水性がその配向に影響を与
え、切断されやすいペプチド結合が、触媒性のＳer２２
１の水酸基による親核的攻撃に対する受容性を変えると
いう説明も成り立つ。kcat／kmの、Ｐ−１側鎖の疎水性
に対する依存性は、疎水的基質に対するkcat／km値が、
Ｓ−１結合サブサイトの疎水性を増加させることにより
上昇することを暗示している。この仮説を試すために、
Ｇly１６６の疎水性アミノ酸による置換体を作った。

【０１０７】脂肪族側鎖の疎水性は、直接、その側鎖の
表面積に比例するので、（Ｇ．Ｄ．ローズ（Rose) 等、
（１９８５年）、サイエンス（Science)２２９巻、８３
４−８３８頁）、Ｊ．Ａ．レイノルズ（Reynols)等、
（１９７４年）、プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro. Nat. Acad. Sc
i.) USA 、７１巻、２８２５〜２９２７頁）、Ｓ−１サ
ブサイトにおける疎水性の増加は、より大きな基質の結
合を立体的に妨害するであろう。これら２つの相反する
効果の相対的な重要性を予想する困難さのために、我々
は、種々の大きさと疎水性の非電荷性の基質に対し、生
成する特異性を決定するために、１６６の位置での１２
種の非電荷性の突然変異体を作ることにした。 Ｂ．Ｐ−１結合溝のカセット・ミュータジェネシス（Ca
ssette Mutagenesis) 残基１６６の、疎水性のアミノ酸Ａla、Ｖal及びＰheに
よる置換を含むスブチリシン突然変異体の調製は、ＥＰ
Ｏ公表０１３０７５６号に記述されている。残基１６６
におけるその他の疎水性突然変異体の生成にも同様の方
法を用いた。この方法を採用するのに、２つの独立で、
サイレントな制限部位を、スブチリシン遺伝子中の、目
的とするコドン１６６のすぐとなりに導入した。図１８
に示されているように、野生型の配列（１行目）に、指
示された３７mev の突然変異体プライマーを用いた、Ｍ
１３のサイト・ディレクテド・ミュタジェネシスによ
り、１３bpの欠失（点線部）と、コドン１６６のすぐと
なりへの独立するＳacＩ及びＸmaＩ部位（下線配列）の
導入という変化を与えた。スブチリシン遺伝子フラグメ
ントを大腸菌−枯草菌のシャトルプラスミドｐＢＳ４２
にサブクローンし、プラスミドｐ△１６６を得る（図１
８、２行目）。ｐ△１６６をＳacＩ及びＸmaＩで切断し
て開き、ギャップをもつ線状分子を精製した（図１８、
３行目）。目指す突然変異を含む合成オリゴマーの集合
物を、アニールさせて二本鎖のＤＮＡカセットを与え、
ギャップをもつｐ△１６６に結合する（図１８、４行目
の下線及び上線の配列）。この構造物は１６６番の位置
（ＮＮＮ；４行目）以外のコード配列を保持している。
突然変異体配列を、ダイデオキシ配列決定法により確認
した。アステリスクは、野生型配列から変化した配列を
示している。Ｂ．アミロリクェファシエンス（amiloliq
uefaciens)の各突然変異体スブチリシン遺伝子を含むプ
ラスミドは、以前に述べられているように、枯草菌
（Ｂ．subtilis) のプロテアーゼ欠損株（ＢＧ２０３
６）の中で、ほぼ同レベルで発現した。ＥＰＯ公表第０
１３０７５６号、Ｍ．ヤング（Yang) 等、（１９８４
年）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacte
riol) １６０巻１５〜２１頁、Ｄ．Ａ．エステル（Estr
ll) 等、（１９８５年）、ジャーナル・オブ・バイオケ
ミカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) 、２６０巻、
６５１８〜６５２１頁）。 Ｃ．立体障害による基質特異性の制限化 Ｓ−１サブサイトにおける立体的変化による基質特異性
の変化をさぐるために、部位１６６の突然変異体を、大
きさ（例えばＡla、Ｍet、Ｐhe及びＴyr）の増すＰ１基
質に対して速度論的に解析した。比（kcat／km）は図２
０中でlog の形で表わされ、種々の酵素基質ペア間の遷
移状態結合エネルギーを直接の比較ができる。

【０１０８】遷移状態理論に従がい、（フリーの酵素＋
基質）（Ｅ＋Ｓ）と、遷移状態複合

【０１０９】

【外３】 ここで、kcatは、ターンオーバー数、kmはミカエリス定
数、Ｒは気体定数、Ｔは温度、ｋはボルツマン定数、ｈ
はプランク定数である。特異性の差は、遷移状態

【０１１０】

【外４】 Ａ及びＢは同じ酵素に対して使われた２つの異なる基質
もしくは、同じ基質に対する２つの酵素の突然変異体を
表わしている。図２０（Ａ）にみられるように、部位１
６６における側鎖の大きさが増加するにつれ、基質選択
性は大きいＰ−１側鎖から小さいものへと変化する。部
位１６６の側鎖を大きくするとＰ−１基質側鎖の大きさ
に比例してkcat／km値が減少する（例えば、Ｗ１６６を
通して、Ｇly１６６から野生型）、Ｐhe、Ｍet及びＡla
Ｐ−１基質の順で、Ｔyr基質に対するkcat／km値は減少
する。部位１６６の側鎖における特異的な立体的変化、
例えばβ−ヒドロキシル基、β−脂肪族の枝又はα−脂
肪族の枝等は、より大きいＰ１基質に対するkcat／km値
の大きな減少を引き起こす。

【０１１１】Ａ１６６（図２０Ａ）からＳ１６６（図２
０Ｂ）にして、β−ヒドロキシル基を導入することは、
Ｐhe基質及びＴyr基質に対し、各々kcat／KE値は、８倍
及び４倍減少するが、一方Ａla及びＭet基質に対する値
は変らない。Ｓ１６６からＴ１６６にすることによるβ
−枝分れ構造の生成は、Ｐhe及びＴyr基質に対し、それ
ぞれkcat／KE値は１４倍及び４倍減少する。これらの差
は、若干大きく、Ｔ１６６と同じ立体型をもつＶ１６６
に対しては、わずかに大きくなる。Ｖ１６６からＩ１６
６へとβ−枝別れ置換を大きくしていくと、Ｍet、Ｐhe
及びＴyr基質に対し、２から６倍低い値にkcat／KW値が
減少する。Ｍ１６６（図２０Ａ）をＬ１６６（図２０
Ｂ）で置換することにより、γ−枝分れ構造を挿入する
と、Ｐhe及びＴyr基質に対し、各々kcat／km値の５倍及
び18倍の減少をもたらす。

【０１１２】Ｌ１６６からＩ１６６へとしたときのＰhe
基質に対するkcat／kmの１００倍の減少によっても確か
められる様に、脂肪族のγ−枝分れ構造は、β−枝分れ
よりも、ＰheＰ−１基質に対する立体障害効果は小さい
ようだ。Ｓ−１サブサイトにおける側鎖の大きさの増
加、又はβ−及びγ−枝分れのような特殊な構造から生
ずるkcat／kmの減少は、図２１で定量的に説明されてい
る。Ａla、Ｍet、Ｐhe及びＴyrＰ−１基質に対して測定
された部位１６６突然変異体に対するkcat／km値（各
々、上から下のパネルへ）を、部位１６６の側鎖体積に
対しプロットした（Ｃ．チョシア（Chothia)（１９８４
年）アニュアル・レヴュー・オブ・バイオケミストリー
（Ann. Rev. Biochem.) ５３巻、５３７−５７２頁）。
Ａla基質に対する触媒効率は、１１６６で最高値に達
し、Ｍet基質に対しては、Ｖ１６６とＬ１６６の間で最
高値に達した。Ｐhe基質はブロードなkcat／km値ピーク
を示したが、Ａ１６６で最高値をとった。ここで、部位
１６６でのβ−枝分れ置換は、同サイズの側鎖よりはほ
ぼ５０倍小さいkcat／km値ではあるが、それと平行な線
をたどっている。（Ｃ１６６とＴ１６６、Ｌ１６６とＩ
１６６）、Ｔyr基質は、野生型酵素（Ｇly１６６）によ
り非常に効率的に利用され、そして、部位１６６の側鎖
を大きくするにつれ、効率は徐々に低下していくβ−枝
分れ、及びδ−枝分れ置換は同じ分子体積の非電荷置換
よりも低い値の平行線をたどる。

【０１１３】部位１６６における至適置換はＰ１基質の
体積の増加を伴う、その体積の減少である〔すなわち、
Ｉ１６６／Ａla基質、Ｌ１６６／Ｍet基質、Ａ１６６／
Ｐhe基質、Ｇly１６６／Ｔyr基質〕。これら至適ペアを
合せて体積は、Ｓ−１サブサイトにおける生産的結合の
ための体積にほぼ等しい。その至適ペア（Ｇly１６６／
Ｔyr基質、Ａ１６６／Ｐhe基質、Ｌ１６６／Ｍet基質、
Ｖ１６６／Ｍet基質及びＩ１６６／Ａla基質）に対し、
その合計体積は、それぞれ、２６６、２９５、３１３、
３３９及び２６１Ａ³ であった。各ペアから、ペプチド
バックボーンの体積を引くと（すなわち、グリシンの体
積の２倍）、生産的結合のための平均的側鎖体積は１６
０±３２Ａ³ と計算することができる。これらのデータ
及びモデル研究（図２）は、グリシン以外のいかなる置
換も、立体的な反発を起こすことを示しているので、生
産的総合体積以上の、遷移状態結合エネルギーに関する
体積の影響を、Ｔyr基質曲線（下のパネル、図２１）か
ら見積もることができる。全てのデータ（ｒ＝0.８７に
ついて描かれた最適化曲線は、過剰体積１００Ａ³ 当
り、およそ、３kcat／mol の遷移状態結合エネルギーの
損失を示す勾配を与えた。（１００Ａ³ はおよそ側鎖の
大きさである。） Ｄ．触媒効率の促進は、部位１６６の置換における疎水
性の増加と相関がある。

【０１１４】ＴyrＰ−１基質は別として、kcat／kmの実
質的増加は、部位１６６側鎖の大型化に伴い起こる（図
２１）。例えば、Ａla基質に対し、Ｇly１６６からＩ１
６６からＬ１６６へ（正味１０倍）、Ｍet基質に対しＧ
ly１６６からＬ１６６へ（正味１０倍）、Ｐhe基質に対
し、Ｇly１６６からＡ１６６へ（正味２倍）の増加によ
りkcat／km値が増加する。kcat／km値の増加は、それら
の強い距離依存性（１／ｒ⁶ ）と、それらの弱い吸引力
のために、ファン・デル・ワールスのポテンシャル・エ
ネルギーの作用という魅力的言葉だけで全て説明するこ
とはできない。（Ｗ．Ｐ．ジェンクス（Jencks) 、化学
と酵素学における触媒（Catalysis in Chemistry and E
nzymology)（マグローヒル（McGRow-Hill)、１９６９
年）３２１−４３６頁、Ａ．フアーシュ（Fersht) 、酵
素の構造と機構（Enzyme Structureand Mechanism)
（フリーマン、サンフランシスコ、１９７７年）、２２
６−２８７頁、Ｍ．レビット（Levitt) （１９７９
年）、ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー
（J. Mol. Biol.)、１０４巻、５９−１０７頁）。例え
ばレビット（Levitt) （Ｍ．レビット（Levitt) （１９
７６年）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（J. Mol. Biol.)、１０４巻、５９−１０７頁）は
２個のメチオニン残基の間のファン・デル・ワールスの
吸引力は、およそ−0.２kcat／mol の最高相互作用エネ
ルギー値を生ずると計算した。このエネルギーはkcat／
km値に直すとたった1.４倍の増加にしかならない。部位
１６６における側鎖置換による触媒効果の増加は、Ｓ−
１サブサイトの疎水性の増加によるということでよりう
まく説明される。部位１６６の側鎖のサイズの増加に伴
う、Ａla及びＭet基質に対して観察されるkcat／km値の
増加は、疎水性が、側鎖の表面積にほぼ比例するという
ことで予想されるであろう（C. G.A.ローズ（Rose)
等、（１９８５年）、サイエンス（Science)２２９巻、
８３４−８３８頁；Ｊ．Ａ．レイノルズ（Reynklds)
等、（１９７４年）プロシーディング・イン・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro. Natl. Acad.
Sei.) （ＳＡ、７１巻、２８２５−２９２７頁）。疎水
性効果として説明できる他の例は、Ｓ１６６とＣ１６６
（図２１）のような疎水性は異なるが、立体的に等しい
置換体のkcat／km値を比較したときに見られる。

【０１１５】システインは、セリンよりもかなり疎水性
が強い（−1.０対＋0.３kcat／km）（Ｙ．ノザキ（Noza
ki) 等、（１９７１年）、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) ２４６巻、２
２１１−２２１７頁；Ｃ．タンフォード（Tanford)（１
９７８年）、サイエンス（Science)２００巻、１０１２
頁）。その疎水性の差は、Ｃ１６６がその基質の疎水性
が増加するにつれて、Ｓer１６６に対して、より効率的
になるという観測と一致している（すなわちＡla＜Ｍet
＜Ｔyr＜Ｐhe）。セリンは、システィンよりもかなり小
さいので（99対１１８Ａ³ ）立体障害でこれらの差を説
明することはできない。Ｉ．Ｃ．ポール（Paul) 、ＳＨ
基の化学（Chemistuy of the -SH group)(S.パタイ（Pa
tai)編、ウィリー・インターサイエンス Wiley Intersc
ience)、ニューヨーク、１９７４年）１１１−１４９
頁。 Ｅ．スブチリシンにおけるエラスターゼ様活性の生成 特異性の大きな変化が、唯一の突然変異による、Ｓ−１
サブサイトの構造及び疎水性の変化により起こること
を、Ｉ１６６の突然変異で特によく説明できる（図２
２）。

【０１１６】小さな疎水性基質を使ってみると、Ｖal基
質に対して野生型のもの以上の最高の特異性の改良がな
された（kcat／km値で１６倍）。その基質の側鎖の大き
さが増すにつれて、それらの向上がほぼ均一に縮小して
しまう（即ちＬeu及びＨis基質）。Ｉ１６６酵素は、大
きさを増した、より大きい芳香族基質に対しては、より
活性がなくなる（例えば、Ｉ１６６は、Ｔyr基質に対
し、Ｇly１６６の１０００倍以上も活性が低い）。Ｉ１
６６の小さな疎水性基質に対する触媒効率の増加を、よ
り疎水性の大きいイソロイシンに対するＧly１６６と比
較して説明する（すなわち、−1.８kcal／mol 対０）。
Ｙ．ノザキ（Nozaki) 等、（１９７１年）、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.) ２４６巻、２２１１−２２１７頁；Ｃ．タンフォー
ド（Tanford)（１９７８年）、サイエンス（Science)２
００巻、１０１２頁。Ｇ１６６に対するＩ１６６の、非
常に大きい基質に対する触媒効率の減少は、立体的反発
力によるものである。

【０１１７】Ｇly１６６とＩ１６６の特異性の差は、キ
モトリプシンと進化的関係物、エラスターゼとの特異性
の差に等しい（Ｊ．Ｗ．ハーパー（Harper) 等、（１９
８４年）、バイオケミストリー（Biochemistry）、２３
巻、２９９５−３００２頁）。エラスターゼの場合、か
さ高いアミノ酸、Ｔhr及びＶal、キモトリプシンに選択
的な、大きな疎水的基質のためのＰ−１結合部位への接
近を妨害する。さらに、小さな疎水性基質に対する触媒
効率は、スブチリシンにおけるＧly１６６に対するＩ１
６６にも見られるように、キモトリプシンよりもエラス
ターゼの方が大きい。 実施例４ Ｇly１６６のイオン性アミノ酸による置換 イオン性アミノ酸、Ａsp、Ａsn、Ｇln、 lys及びＡngの
置換を含むスブチリシン突然変異体の構築は、ＥＰＯ公
表第０１３０７５６号に開示されている。本実施例は、
部位１６６にＧluを含むスブチリシン突然変異体（Ｅ１
６６）の構築について記述し、これらの突然変異体に関
する基質特異性のデータを示している。さらに部位１６
６及び１５６の単一及び二重の突然変異体に関するデー
タを下に示した。

【０１１８】実施例３で述べた、ｐ△１６６をＳacＩ及
びＸmaＩで消化した。図１８、４行目の二本鎖ＤＮＡカ
セット（下線及び上線）は、コドン１６６にトリプレッ
トＧＡＡをもちＧly１６６のＧluによる置換を含んでい
る。このｐＱ１６６と命名したプラスミド突然変異体を
先に述べたようにＢＧ２０３６中で増殖した。残基１６
６にイオン性アミノ酸置換を含む他の突然変異体と一緒
に、このスブチリシン突然変異体を先に述べた方法で単
離し、さらに基質特異性の変化について分析した。これ
ら突然変異体の各々を、テトラペプチド基質、スクシニ
ル−Ｌ−ＡlaＬ−AlaProＬ−Ｘ−ｐ−ニトロアニリド
（ＸはＰhe、Ａla及びＧlu）を用いて分析した。

【０１１９】この分析の結果を表IXに示す。

【０１２０】

【表９】 表 IX Ｐ−１基質 （kcat／km×１０^-4） 部位１６６ Ｐhe Ａla Ｇln Ｇlu（野生型） 36. 0 1. 4 0. 002 Ａsp（Ｄ） 0. 5 0. 4 ＜0. 001 Ｇlu（Ｅ） 3. 5 0. 4 ＜0. 001 Ａsn（Ｎ） 18. 0 1. 2 0. 004 Ｇln（Ｑ） 57. 0 2. 6 0. 002 Ｌys（Ｋ） 52. 0 2. 8 1. 2 Ａrg（Ｒ） 42. 0 5. 0 0. 008 これらの結果は、Ｇly１６６部位の荷電アミノ酸による
置換は、反対に荷電したＰ−１基質に対して触媒効率
（kcat／km）を改善し（５００倍ほど）、同電荷に帯電
しているＰ−１基質に対しては触媒効率は低下する。 実施例５ 部位１６９のギリシンの置換 Ｂ．アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens)の
スブチリシンのＧly１６９のＡla及びＳerによる置換が
ＥＰＯ公表第０１３０７５６号に記述されている。部位
１６９における全ての他のアミノ酸置換を含む残りの１
７種の突然変異体を作るのにも同じ方法を使った。

【０１２１】その構築のプロトコロールを図２３にまと
めた。使用した、上下に印の付いた二本鎖ＤＮＡカセッ
トは、残基１６９を、示されているアミノ酸での置換を
コードする次のトリプレットを含んでいる。 ＧＣＴ Ａ ＡＴＧ Ｍ ＴＧＴ Ｃ ＡＡＣ Ｎ ＧＡＴ Ｄ ＣＣＴ Ｐ ＧＡＡ Ｅ ＣＡＡ Ｑ ＴＴＣ Ｆ ＡＧＡ Ｒ ＧＧＣ Ｇ ＡＧＣ Ｓ ＣＡＣ Ｈ ＡＣＡ Ｔ ＡＴＣ Ｉ ＧＴＴ Ｖ ＡＡＡ Ｋ ＴＧＧ Ｗ ＣＴＴ Ｌ ＴＡＣ Ｙ Ｇly１６９を置換したものを含む各プラスミドはｐＸ１
６９と命名した。ここでＸはその置換アミノ酸を表わし
ている。その置換突然変異体も同様に命名した。

【０１２２】上記の置換突然変異体２つ、Ａ１６９及び
Ｓ１６９について、Ｐ−１部位にＰhe、Ｌeu、Ａla及び
Ａrgを含む合成基質に対する基質特異性の分析を行っ
た。その結果を表Ｘに示した。

【０１２３】

【表10】 表 Ｘ Ｐ−１基質特性に関する、部位１６９における セリン及びアラニン突然変異体の影響 Ｐ−１基質（kcat／km×１０^-4) 部位１６９ Ｐhe Ｌeu Ａla Ａng Ｇly（野生型） 40 10 1 0.4 Ａ１６９ 120 20 1 0.9 Ｓ１６９ 50 10 1 0.6 これらの結果は、Ｇly１６９のＡla及びＳerによる置換
は、それらの部位１６６対照物と比較して、一連のＰ−
１基質に対する触媒活性が著しく類似している。これ
は、部位１６９がＰ−特異性サブサイトの底にあること
によるのであろう。 実施例６ 部位１０４の置換 Ｔyr１０４を、Ａla、Ｈis、Ｌeu、Ｍet及びＳerで置換
した。その方法は特定部位の突然変異誘発法を修正して
行った。図２４のプロトコロールに従って、プライマー
（４行目の影部分）を唯一のＨind III 部位に導入し、
コドン１０４にフレーム・シフト突然変異を起こした。
唯一のＨind III 部位に対する制限−精製は突然変異配
列（４行目）の単離を可能にした。５行目のプライマー
を用いた、このＨind III 部位に対する制限−精製を、
部位１０４の突然変異体を得るのに用いた。

【０１２４】次にあげるアミノ酸で置換した１０４コド
ンに対する、図２４、５行目のプライマー中では、次の
トリプレットを用いた。 ＧＣＴ Ａ ＴＴＣ Ｆ ＡＴＧ Ｍ ＣＣＴ Ｐ ＣＴＴ Ｌ ＡＣＡ Ｔ ＡＧＣ Ｓ ＴＧＧ Ｗ ＣＡＣ Ｈ ＴＡＣ Ｙ ＣＡＡ Ｑ ＧＴＴ Ｖ ＧＡＡ Ｅ ＡＧＡ Ｒ ＧＧＣ Ｇ ＡＡＣ Ｎ ＡＴＣ Ｉ ＧＡＴ Ｄ ＡＡＡ Ｋ ＴＧＴ Ｃ 表XI中の基質を、これら突然変異体の基質特異性を分析
するのに用いた。Ｈ１０４スブチリシンに対して得られ
た結果を表XIに示した。

【０１２５】

【表11】 表 XI kcat km kcat／km 基 質 WT H104 WT H104 WT H104 sAAPFpNA 50.0 22.0 1.4×10^-4 7.1×10^-4 3.6×10⁵ 3.1×10⁵ sAAPApNA 3.2 2.0 2.3×10^-4 1.9×10^-3 1.4×10⁴ 1×10⁴ sFAPFpNA 26.0 38.0 1.8×10^-4 4.1×10^-4 1.5×10⁵ 9.1×10⁴ sFAPApNA 0.32 2.4 7.3×10^-5 1.5×10^-4 4.4×10³ 1.6×10⁴ これらのデータから、部位１０４でのＴyrに対するＨis
の置換は、Ｐ−４の基質部位がＡlaのときよりも、Ｐhe
のときの方がより効率的（より高いkcat／km値）である
酸素を作ることが明らかである。 実施例７ Ａla１５２の置換 基質特異性に関する置換の影響を調べるために、Ａla１
５２をＧly及びＳerで置換した。

【０１２６】野生型ＤＮＡ配列は、新しいＫpnＩ部位に
上記の制限−精製法を用い、Ｖ１５２／Ｐ１５３プライ
マー（図２５、４行目）により突然変異を起こした。そ
の他の突然変異プライマーは（図２５の影付配列、Ｓ１
５２、５行目及び、Ｇ１５２、６行目）、新しいＫpnＩ
部位を変異により取除き、そのような突然変異体は、そ
のＫpnＩ部位の欠失に対して、上述の制限−精製操作を
用いて単離した。Ｐ−１アミノ酸として、Ｐhe、Ｌeu及
びＡlaを含む上述の合成基質のためのこれらの置換の結
果を表XII に示した。

【０１２７】

【表12】 表 XII Ｐ−１基質 （kcat／km×10^-4) 部位１５２ Ｐhe Ｌeu Ａla Ｇly（Ｇ） 0. 2 0. 4 ＜0. 04 Ａla (wild type) 40. 0 10. 0 1. 0 Ｓer（Ｓ） 1. 0 0. 5 0. 2 これらの結果は、部位１６６及び１６９と対照的に、Ｓ
er又はＧlyでのＡla１５２の置換は、テストした全ての
基質を通して、触媒効率を劇的に減少させることを示し
ている。このことは、Ｓ−１サブサイトの上のＡla１５
２は、Ｓer及びＧlyが等価なＡlaの置換体であることか
ら、至適アミノ酸であることを暗示している。 実施例８ 部位１５６の置換 Ｇlu１５６のＳer及びＧlnによる置換を含む突然変異体
を、図２６に述べた全方法に従って構築した。この方法
は、今後述べられるように、部位１５６及び１６６の多
部位突然変異体の構築ができるよう設計されている。し
かし、野生型のＧly１６６を再生することにより、Ｇlu
１５６での１部位突然変異体は得られる。

【０１２８】すでに、プラスミドｐ△１６６は、図１
８、２行目に記述した。図２６の右上の合成オリゴヌク
レオチドは、図１８、４行目に記述したのと同じＤＮＡ
カセットを示している。このように図２６中のプラスミ
ドｐ１６６は、実施例３及び４のプラスミド突然変異体
を表わしている。この実施例においてはｐ１６６は野生
型Ｇly１６６を含んでいる。部位１５６の１部位突然変
異体の構築は、図２６の下に示した三つのフラグメント
（１−３）の連結によって行った。野生型の部位１６６
コドンを含むスブチリシン遺伝子のカルボキシル末端領
域を含むフラグメント３は、６１０bpのＳacＩ−ＢamＨ
Ｉフラグメントとして単離した。フラグメント１はコド
ン１５１を通って、スブチリシン遺伝子のアミノ末端配
列と同様に、ベクター配列を含んでいる。フラグメント
１を作るために、コドン１５２に唯一のＫpnＩ部位をｐ
Ｓ4.５由来の野生型スブチリシン配列の中に導入した。
Ｍ１３の特定部位の突然変異誘発には、突然変異を生じ
させるために、 ５′-TA-GTC-GTT-GCG-GTA-CCC-GGT-AAC-GAA-３′ 配列をもつプライマーを使った。

【０１２９】突然変異体配列の増殖は、ＫpnＩによる制
限処理、精製及び自己連結により行った。ＫpnＩ部位を
もつ突然変異体配列は、直接プラスミドの配列決定によ
り確認し、ｐＶ１５２を与えた。ｐＶ１５２（〜１μg
）をＫpnＩで消化し、２ユニットのＤＮＡポリメラー
ゼＩのラージ・フラグメント（ベーリンガー・マノンハ
イム（Boeringer Mannheim) のクレト・フラグメント）
と、５０μM のデオキシヌクレオチド・三リン酸ととも
に３７℃、３０分間処理した。これは、コドン１５１で
終止しているプラント・エンドを生じる。そのＤＮＡを
１対１の容積比のフェノール及びCH₃Cl₃で抽出し、水層
のＤＮＡを0.１容の５Ｍ酢酸アンモニウムと、２倍容の
エタノールの添加により沈殿させた。遠心及び７０％エ
タノールでのＤＮＡペレットの洗浄の後、そのＤＮＡを
凍結乾燥した。ＤＮＡをＢamＨＩで消化し、4.６kbのフ
ラグメント（フラグメント１）をアクリルアミドゲル電
気泳動で精製し、電気溶出により採集した。フラグメン
ト２は、フラグメント１及び３と連結した時に、コドン
１５６の部位以外にコード配列を適正に保持する２本鎖
の合成ＤＮＡカセットである。上の鎖はグルタミンコド
ンを含むように合成され、そして、その相補的下の鎖
は、１５６部位にセリンをコードしている。異種リン酸
化カセットの連結は、最終的に分離したプラスミド生成
物において、非リン酸化オリゴヌクレオチド配列以上の
リン酸化オリゴヌクレオチドに対する大きくそして好ま
しいバイアスへと導く。それ故、Ｑ１５６を得るため
に、上の鎖はリン酸化し、連結前に非リン酸化の下側鎖
ヘアニールする。同様に、Ｓ１５６を得るには、下側の
鎖をリン酸化し、非リン酸化の上の鎖にアニールする。
突然変異体配列は、連結及びトランスフォーメーション
後単離し、以前と同様に、制限分析及びＤＮＡ配列決定
により確認した。種々のスブチリシンを発現するため
に、以前に述べられたように、プラスミドを枯草菌（B.
subtilis)のスブチリシン・ニュートラルプロテアーゼ
欠失突然変異体（ＢＧ２０３６）にトランスフォームし
た。培養は、１2.５mg／mlのクロラムフェニコールを含
むＬＢ培地で振盪フラスコ中、３７℃、２４時間培養
し、スブチリシンを、先に述べた方法で、培養液上清か
ら精製した。スブチリシンの純度は、SDSPAGE による判
定では、９５％以上であった。

【０１３０】これらの突然変異プラスミドをｐＳ１５６
及びｐＱ１５６と命名し、そしてＳ１５６及びＱ１５６
と命名した突然変異スブチリシンを、Ｐ−１がアミノ
酸、Ｇlu、Ｇln、Ｍet及びＬysを含む上述の合成基質を
使って分析した。その分析結果を実施例９に示す。 実施例９ 部位１５６及び１６６の置換−基質特異性の修正をもつ
多部突然変異体。 部位１６６の単一の置換は実施例３及び４に述べた。実
施例８は、部位１５６及び１６６の種々のアミノ酸置換
を含む種々の２部位突然変異体を作った。図２６のプロ
トコールと同様に、部位１５６の単一の置換について述
べている。この実施例は部位１５６及び１６６における
置換を含むスブチリシンの構築及び基質特異性について
記述し、そして、種々の基質を用いた、部位１５６及び
１６６における１部位及び２部位突然変異体に対するい
くつかのデータをまとめてある。

【０１３１】Ｋ１６６は、ここで述べられる１５６／１
６６突然変異体における共通した置換アミノ酸である。
Ｇly１６６のＬysによる置換は、ＮＮＮにトリプレット
ＡＡＡを含む、図２６の右上の合成ＤＮＡカセットを用
いることにより行なわれる。これにより、Ｇly１６６を
Ｌysで置換したフラグメント２が生成する。１５６置換
体はＧln及びＳerである。Ｇly１５６のＧln及びＳer置
換体は、フラグメント３の中に含まれる（図２６、右
下）。多部位突然変異体は、実施例８で述べたように、
フラグメント１、２及び３を結合することにより生成す
る。先に述べたように、突然変異体Ｑ１５６／Ｋ１６６
及びＳ１５６／Ｋ１６６は、異種のリン酸化によって、
選択的に生成させる。一方、２部位１５６／１６６突然
変異体、例えば、Ｑ１５６／Ｋ１６６及びＳ１５６／Ｋ
１６６、は関連するｐ１６６プラスミド由来の0.６kbの
ＳacＩ−ＢamＨＩフラグメントと関連するｐ１５６プラ
スミド由来の4.６kbのＳacＩ−ＢamＨＩフラグメントを
連結することにより調製した。

【０１３２】これらの突然変異体、１部位突然変異体Ｋ
１６６、及び実施例８のＳ１５６及びＱ１５６突然変異
体について、Ｐ−１基質残基として、Ｐhe又はＧluを含
む合成ポリペプチドに対する置換特異性を分析した。そ
の結果を表XIIIに示した。

【０１３３】

【表13】 表 XIII 基質 Ｐ−１ kcat/km(突然変異体） 比較した酵素^(b) 残基 kcat km kcat／km kcat／km(wt) Glu156/Gly166(WT) Phe 50.0 1.4×10^-4 3.6×10⁵ (1) Glu 0.54 3.4×10^-2 3.6×10¹ (1) K166 Phe 20.00 4.0×10^-5 5.2×10⁵ 1.4 Glu 0.70 5.6×10^-5 1.2×10⁴ 750 Q156/K166 Phe 30.00 1.9×10^-5 1.6×10⁶ 4.4 Glu 1.60 3.1×10^-5 5.0×10⁴ 3100 S156/K166 Phe 30.00 1.8×10^-5 1.6×10⁶ 4.4 Glu 0.60 3.9×10^-5 1.6×10⁴ 1000 S156 Phe 34.00 4.7×10^-5 7.3×10⁵ 2.0 Glu 0.40 1.8×10^-3 1.1×10³ 6.9 E156 Phe 48.00 4.5×10^-5 1.1×10⁶ 3.1 Glu 0.90 3.3×10^-3 2.7×10² 17 表XIV に見ることができるように、いずれの、これら１
部位突然変異体もＰ−１酵素結合部位にグルタミン酸を
もつ基質に対しては、酵素の性能をあげた。これら１部
位突然変異を組合せると、生じた多部位酵素突然変異体
は、各々の本来のものよりも良い結果を示す。また、こ
れら１部位又は多部位突然変異体は、図２８に示したよ
うな酵素の相対的なpH活性をも変える。

【０１３４】基質特異性への静電作用の寄与をその他の
化学結合力から分離するために、これらの種々の１部位
及び２部位突然変異体についてＰ−１基質アミノ酸とし
て、Ｇlu、Ｇln、Ｍet及びＬysを含む合成基質を結合及
び切断するそれらの能力を分析した。このことは立体的
には小さいが、荷電の異なる側鎖間の比較を可能にする
（例えばＧluとＧln、ＬysとＭet）。同様に、突然変異
体酵素を、立体的には等しいが、荷電の異なる等価なＰ
−１基質に対して検定を行った。（表XIV)

【０１３５】

【表14】 表 XIV 異なるＰ−１基質に対する部位１５６／１６６スブチリシンの速度論 酵素の部位^(a) 正味の電荷^(b) Glu 156 166 Glu Asp −２ n. d. Glu Glu −２ n. d. Glu Asn −１ 1.62(2.22) Glu Gln −１ 1.20(2.12) Gln Asp −１ 1.30(1.79) Ser Asp −１ 1.23(2.13) Glu Met −１ 1.20(2.30) Glu Ala −１ n. d. Glu Gly(wt) −１ 1.20(1.47) Gln Gly ０ 2.42(2.48) Ser Gly ０ 2.31(2.73) Gln Asn ０ 2.04(2.72) Ser Asn ０ 1.91(2.78) Glu Arg ０ 2.91(3.30) Glu Lys ０ 4.09(4.25) Gln Lys ＋１ 4.70(4.50) Ser Lys ＋１ 4.21(4.40) ─────────────────────────────────── 最高相違値 log kcat／km(log 1/Km)^(d) 3.5 (3.0) 表 XIV （つづき） Ｐ−１基質 log kcat／km (log 1/km)^(c) 酵素の部位^(a) Gln Met Lys 156 166 Glu Asp 3.02(2.56) 3.93(2.74) 4.23(3.00) Glu Glu 3.06(2.91) 3.86(3.28) 4.48(3.69) Glu Asn 3.85(3.14) 4.99(3.85) 4.15(2.88) Glu Gln 4.36(3.64) 5.43(4.36) 4.10(3.15) Gln Asp 3.40(3.08) 4.94(3.87) 4.41(3.22) Ser Asp 3.41(3.09) 4.67(3.68) 4.24(3.07) Glu Met 3.89(3.19) 5.64(4.83) 4.70(3.89) Glu Ala 4.34(3.55) 5.65(4.46) 4.90(3.24) Glu Gly(wt) 3.85(3.35) 5.07(3.97) 4.60(3.13) Gln Gly 4.53(3.81) 5.77(4.61) 3.76(2.82) Ser Gly 4.09(3.68) 5.61(4.55) 3.46(2.74) Gln Asn 4.51(3.76) 5.79(4.66) 3.75(2.74) Ser Asn 4.57(3.82) 5.72(4.64) 3.68(2.80) Glu Arg 4.26(3.50) 5.32(4.22) 3.19(2.80) Glu Lys 4.70(3.88) 6.15(4.45) 4.23(2.93) Gln Lys 4.64(3.68) 5.97(4.68) 3.23(2.75) Ser Lys 4.84(3.94) 6.16(4.90) 3.73(2.84) ──────────────────────────────────── 最高相違値 log kcat／km(log 1/Km)^(d) 1.8 (1.4) 2.3(2.2) −1.3(−1.0) 表XIV の脚注 (a) 指示されるスブチリシン変異体を発現する枯草菌
（B. Subtilis)ＢＧ２０３６を培養し、酵素を従来法
（エステル（Estell) 等、（１９８５年）、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.) ２６０巻、６５１８−６５２１頁）により精製し
た。野生型スブチリシンはＧlu１５６とＧly１６６を含
み、（wt) で示されている。 (b) Ｐ−１結合部位の正味の電荷は、pH8.６における部
位１５６及び１６６の電荷の合計として定義した。 (c) kcat(S^-1) 及びkm(M) の値は、スクシニル−Ｌ−Ａ
laＬ−ＡlaＬ−ＰroＬ−〔ｘ〕−ｐ−ニトロアニリド
（ｘは指示されるＰ−１アミノ酸）の形をとるＰ−１基
質に対して、以前述べたような方法で、0.１Ｍトリス
（pH8.６）、２５℃で測定した。 (d) Ｇlu１５６／Ａsp１６６（Ｄ１６６）に対する値
は、正確に測定するには小さすぎるので、ＧluＰ−１基
質に対して得られる最も大きい差は、＋１から−１の荷
電変化の範囲に限定した。

【０１３６】ｎ．ｄ＝測定せず。 示されている（kcat／km）比は、生成物への基質の転換
に対する二次速度定数であり、その酵素の触媒効率を表
わしている。これらの比は、対数型で表わし、そのデー
タを目盛ってある。というのは、log(kcat／km）が、遷
移状態活性化エネルギー（△Ｇ_r ）の低下に比例するか
らである。部位１５６及び１６６における突然変異は、
Ｇlu、Ｇln、Ｍet及びＬysＰ−１基質に対する触媒効率
を各々３１００、６０、２００及び２０倍変化させる。
Ｐ−１結合部位をより正に荷電させることは〔例えばＧ
ln１５６／Ｍ１６６（Ｑ１５６／Ｋ１６６）と、Ｇlu１
５６／Ｍet１６６（Ｇlu１５６／Ｍ１６６）を比較す
る〕、ＧluＰ−１基質に対し、kcat／km値を大幅に増大
させ（３１００倍程）、そしてＬysＰ−１基質に対する
その触媒効率を減少させる（１０倍程）。さらに、その
結果は、野生型の触媒効率は、Ｐ−１結合部位の突然変
異により、４種のＰ−１基質のいずれに対しても非常に
改善されることを示している。

【０１３７】kcat／km値の変化は、ほとんど１／kmの変
化に帰因する。１／kmが１／KS、（酵素−基質の会合定
数）とほぼ等しいことから、その突然変異は、まず、基
質の結合に変化を起こす。これらの突然変異は、kcatに
対しては、１／kmへの影響と平行に進むがその影響はよ
り小さい。kcatの変化は、以前提唱されているように
（Ｊ．Ｄ．ロバータス（Robertus) 等（１９７２年）、
バイオケミストリー（Biochemistry）、１１巻、２４３
９−２４４９頁、Ｊ．Ｄ．ロバータス（Robertus) 等
（１９７２年）、バイオケミストリー（Biochemistr
y）、１１巻、４２９３−４３０３頁、ミカエリス−複
合体から遷移状態複合体に進む際にＰ−１結合部位での
結合の変化、又はＥ．Ｓ．複合体における触媒的Ｓer上
の切られるべきペプチド結合の位置の変化を示してい
る。

【０１３８】Ｐ−１結合部位における正味の電荷の変化
から生じる基質選択性の変化は、静電的効果により、最
もうまく説明できる動向を示している（図３３及び図３
４）。Ｐ−１結合溝がより正に帯電するにつれ、その平
均触媒効率は、ＧlnＰ−１基質に対しては、その中性で
立体的に等しいＰ−１類似物、Ｇlnよりも増加する（図
３３Ａ）。さらに、極端に正に帯電すると、両基質はほ
ぼ等しい触媒効率を示す。一方、Ｐ−１部位をより正に
帯電するにつれ、ＬysＰ−１基質に対する触媒効率は減
少し、そしてその中性で立体的に等しい類似物、Ｍetの
ものから鋭くそれてくる（図３３Ｂ）。Ｍet及びＧluＰ
−１基質に対して正電荷を増加するにつれてみられる同
様の、平行上昇傾向は、すべての基質がそれらのアミノ
末端でスクシニル化されており、そのため、形式的に負
の電荷をもつようになるという事実から生ずるのであろ
う。

【０１３９】log(kcat／km）にみられる傾向は、kmの変
化によるものが主である（図３４Ｃ及び３４Ｄ）。その
ポケットがより正に帯電するにつれ、log(１／km）値は
Ｇlu及びＧlnＰ−１基質に対して輻合し（図３４Ｃ）、
そしてＬys及びＭetＰ−１基質に対しては、それてくる
（図３４Ｄ）。log kcatについては、あまり顕著な効果
はみられないが、log kcatに関するＰ−１電荷の効果は
log(１／km）にみられるものと平行であり、つまり、Ｐ
−１ポケットがより正に帯電するに応じて大きくなる。
これは、遷移状態が四面体型アニオンであるという事実
からくるものらしく、酵素中の正味の正電荷が、その遷
移状態に、さらにいくらかの安定性を提供するのに役立
っているらしい。基質依存性に関する、Ｐ−１結合部位
電荷の変化の影響は、荷電及び中性の立体的に等しいＰ
−１基質の間の勾配の差から見積ることができる。（図
３３Ｂ）、荷電及び中性の立体的に等しい基質間の基質
依存性の平均変化量（△log kcat/km)は、その酵素の反
対電荷の増加に従い、およそ１０倍増加する（表XV) 。
ＧluとＬysを比較するとき、その差は１００倍もあり、
基質依存性の変化は主にkmに帰因するらしい。

【０１４０】

【表15】 表 XV 電荷の異なるＰ−１に基質^(a) に対する log kcat／km 又は（log １／km）に関する結合部位電荷の差の影響 Ｐ−１結合部位電 △ log kcat／km （△log １／km）荷における変化 Ｇlu Ｇln Ｍet Ｌys Ｇlu Ｌys −２〜−１ n. d 1.2 (1.2) n. d −１〜０ 0.7 (0.6) 1.3 (0.8) 2.1 (1.4) ０〜＋１ 1.5 (1.3) 0.5 (0.3) 2.0 (1.5) 単位電荷変化当りの log kcat／km 又は (log 1/km)^m の 平 均 変 化 1.1 (1.0) 1.0 (0.8) 2.1 (1.5) (a) 曲約の勾配の差は、log(kcat／km）（図３３Ａ、Ｂ）及びlog(1/km) （図３４Ｃ、Ｄ）に対して与えられた電荷間隔にわたる、Ｐ−１基質の間で 計測した。値は、電荷の変化が比較する基質を区別する効果の差を示して いる。 (b) Ｐ−１結合部位における電荷は部位１５６及び１６６由来の電荷の合計と 定義した。

【０１４１】塩橋形成の構造及びエネルギー論における
静電相互作用の自由エネルギーは、その電荷及び微視的
な媒体の誘電体との距離に依存する。これらの構造及び
微環境の効果を切り離すために、特異的な塩橋に関連す
るエネルギー値を求めた。示されている可能な塩橋に加
えて（図３５（Ａ）、及び３５（Ｂ））ＬysＰ−１基質
と部位１６６のＡsp及びＧluＰ−１基質と部位１６６の
Ｌys（示していない）の間で、合理的な塩橋を作ること
ができる。これらの構造のうちの唯１つがＸ線結晶解析
により確かめられているにもかかわらず（Ｔ．Ｌ．ポウ
ロス（Poulos)等、（１９７６年）ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（J. Mol.Biol.)２５７
巻、１０９７〜１１０３頁）、全てのモデルは、都合の
よいねじれ角をもち（Ａ．Ｒ．シェレキ（Sielecki)
等、（１９７９年）、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（J. Mol. Biol.)１３４巻、７８１〜８
０４頁）、そして不都合なファン・デル・ワールス的接
触は起こらなかった。

【０１４２】モデルである塩橋の形成によりもたらされ
る荷電Ｐ−１基質依存性の変化を、表XVI に示した。

【０１４３】

【表16】 表 XVI Ｐ−１基質依存性に関する酵素と基質間の塩橋形成の影響^(a) 変化した酵素 比較した酵素^(b) 部 位 1 2 Ｇlu 156／Ａsp 166 Ｇln 156／Ａsp 166 156 Ｇlu 156／Ａsn 166 Ｇln 156／Ａsn 166 156 Ｇlu 156／Ｇly 166 Ｇln 156／Ｇly 166 156 Ｇlu 156／Ｌsy 166 Ｇln 156／Ｌsy 166 156 Ｇlu 156／Ａsp 166 Ｇlu 156／Ａsn 166 166 Ｇlu 156／Ｇlu 166 Ｇlu 156／Ｇlu 166 166 Ｇln 156／Ａsp 166 Ｇln 156／Ａsn 166 166 Ｓer 156／Ａsp 166 Ｓer 156／Ａsn 166 166 Ｇlu 156／Ｌsy 166 Ｇlu 156／Ｍet 166 166 ────────────────────── 表 XVI （つづき） Ｐ−１基質依存性に関する酵素と基質間の塩橋形成の影響^(a) 比較したＰ−１ 基質依存性^(d) 基質依存性の変化 基 質 △log(kcat／km） △△log(kcat／km） １ ２ （１−２） Ｌys Ｍet ＋0.30 −0.53 0.83 Ｌys Ｍet −0.84 −2.04 1.20 Ｌys Ｍet −0.47 −2.10 1.63 Ｌys Ｍet −1.92 −2.74 0.82 Ａve△△log(kcat／km） 1.10 ± 0.3 Ｌys Ｍet ＋0.30 −0.84 1.14 Ｌys Ｍet ＋0.62 −1.33 1.95 Ｌys Ｍet −0.53 −2.04 1.51 Ｌys Ｍet −0.43 −2.04 1.61 Ｇlu Ｇln −0.63 −2.69 2/06 Ａve△△log(kcat／km） 1.70 ± 0.3 表XVI の脚註 けた酵素のＰ−１結合部位における反対荷電との間の塩橋の形成が可能である ことを示している。 (b) 比較した酵素は、指示された位置の電荷が異なる立体的には等しいアミノ酸 置換を有している。 (c) 比較したＰ−１基質は構造的には等しいが、電荷が異なる。その荷電Ｐ−１ 基質は、酵素１及び２の間で指示された位置の電荷変化は相補的である。 (d) 表XIV からのデータは、荷電及び非荷電Ｐ−１基質の間のlog(kcat／km）値 の差（すなわち、基質依存性）を計算するのに用いた。 (e) 酵素１（より高電荷）及び酵素２（より中性）の間の基質依存性の差は、静 電相互作用に伴う速度の変化を表わしている。

【０１４４】荷電及び中性Ｐ−１基質（例えば、Ｌysマ
イナスＭet、又はＧluマイナスＧln）に対する触媒効率
（すなわち、△log kcat／km）の差は、各酵素に対する
基質依存性を与える。荷電及びより中性の酵素類似物間
の基質依存性の変化は（例えば、Ｇlu１５６／Ｇly１６
６マイナスＧln１５６（Ｑ１５６）／Ｇly１６６）、単
に静電的効果に帰することができる触媒効率中の変化を
反映している。これらの結果は、基質依存性の平均的変
化が、部位１５６（kcat／kmで１２倍）に対して、部位
１６６（kcat／kmで５０倍）に静電的置換が起こったと
きに、かなり大きくなることを示している。これらの△
△log(kcat／km）値から遷移状態の安定化エネルギーの
平均的変化は、部位１５６及び１６６の各々の置換に対
して、それぞれ−1.５及び−2.４kcal／mol と計算でき
る。これは、遷移状態複合体を形成する、フリーの酵素
と基質の結合のために都合のよい静電的相互作用に帰因
する安定化エネルギーを表わしている。 実施例１０ 部位２１７の置換 Ｔyr２１７を他の全ての１９種のアミノ酸で置換した。
ＥＰＯ刊行物第０１３０７５６号に述べられているカセ
ット・ミュタジェネシスを、図２７のプロトコールに従
って使用した。ｐ△２１７の制限−精製には、ＥcoＲＶ
制限部位を使用した。

【０１４５】この部位は、基質結合に関与しているの
で、ここの突然変異は、酵素の速度論的パラメータに影
響を与える。一つの例としては、部位２１７のＬenのＴ
yrによる置換である。基質sAAPFpNAに対して、この突然
変異体はkat/km比６×１０⁵ であるkcat２２７及び km
4.７×１０^-4の値を示す。これは、野生型酵素と比べ、
kcat値で5.５倍、km値で３倍の増加を示している。さら
に、Ｔyr２１７のＬys、Ａrg、Ｐhe又はＬeuでの置換は
野生型酵素よりもpH約９〜１１の範囲でよりよい安定性
を示す突然変異体酵素を生ずる。逆に、Ｔyr２１７のＡ
sp、Ｇln、Ｇly又はＰroでの置換は、野生型酵素に比べ
pH約９−１１の範囲でより不安定な酵素を生じる。 実施例１１ 熱安定性が変化した多部位突然変異体 Ｂ．アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens)の
スブチリシンはシステイン残基を全く含まない。それ
故、Ｃys橋かけ結合による熱安定性の増加を企てるため
には、スブチリシン中の１つ以上のＣysによる置換が必
要である。次のスブチリシンの残基をシスティンで多部
位置換した； Ｔyr ２２／Ｓer ８７ Ｓer ２４／Ｓer ８７ Ｓer２４のＣysへの突然変異誘発を、

【０１４６】

【外５】 の配列をもつ５′リン酸化したオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて行った。（アステリスクはミスマッチの
位置を示し、下線配列は、修正したＳan３Ａ部位を示し
ている。）ｐＳ4.５由来の1.５ kb のＥcoＲＩ−ＢamＨ
Ｉフラグメント上のＢ．アミロリクエファシエンス（am
yloliquefaciens)のスブチリシン遺伝子をＭ１３mp１１
にクローン化し、一本鎖ＤＮＡを単離した。このテンプ
レート（Ｍ１３mp１１ＳＵＢＴ）を、５′リン酸化した
Ｍ１３ユニバーサル・シークエンシング・プライマー及
び突然変異誘発プライマーを用いて二本鎖とした。アデ
ルマン（Adelman)等、（１９８３年）ＤＮＡ、２巻、１
８３−１９３頁。そのヘテロ二重鎖を、ＪＭ１０１コン
ピテント細胞にトランスフェクトし、そのプラークをテ
トラメチルアンモニウム・クロライド・ハイブリダイゼ
ーション・プロトコールを用いて（ウッド（wood）等、
（１９８５年）プロシーディング・イン・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.) USA 、８２巻、１５８５−１５８８頁）。その突然
変異体配列により調べた（Ｍ．Ｊ．ゾラー（Zoller)
等、（１９８２年）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（NucleicAcids Res.）１０巻、６４８７−６５００
頁）、ワラス（Wallace)等、（１９８１年）、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）９
巻、３６４７−３６５６頁）。Ｓer８７のＣysへの突然
変異は

【０１４７】

【外６】 の配列をもつ５′リン酸化プライマーを用いた同様の方
法で調製した。（アステリスクはミスマッチの位置を示
し、下線配列は新しいＭstＩ部位の位置を示してい
る。）Ｃ２４及びＣ８７の突然変異は各々１％及び２％
の頻度で得られた。突然変異体配列はＭ１３のディデオ
キシ法により確認した。Ｔyr２１／Ｔhr２２のＡ２１／
Ｃ２２への突然変異誘発は、

【０１４８】

【外７】 の配列をもつ５′リン酸化オリゴヌクレオチドプライマ
ーで行った（アステリスクは野生型配列に対するミスマ
ッチを示し、下線配列は修正したＳanＡ部位の位置を示
している。）ヘテロ二重鎖合成の操作はＣ２４に対して
述べられたものと同様である。ヘテロ二重鎖ＤＮＡフラ
グメントの直接クローニングは突然変異誘発頻度を増加
するのでＥcoＲＩ−ＢamＨＩスブチリシンフラグメント
を精製し、ｐＢＳ４２に連結した。大腸菌ＭＭ２９４細
胞に連結混合物をトランスフォームし、プラスミドＤＮ
Ａを個々のトランスフォーマントから精製した。プラス
ミドＤＮＡを、突然変異誘発プライマーにより取除かれ
るコドン２３のＳan３Ａ部位の欠失によりスクリーニン
グした。１６個のプラスミド調製物のうちの２個が野生
型Ｓan３Ａ部位を失っていた。その突然変異体配列はＭ
１３のディデオキシ配列決定法により確認された。

【０１４９】２部位突然変異体、Ｃ２２／Ｃ８７及びＣ
２４／Ｃ８７、は本来の単一のシステインコドンを分離
する１つの共通するＣlaＩ部位を分ち持つフラグメント
を連結することにより構築した。特に、スブチリシン遺
伝子の５′側領域を含む５００bpのＥcoＲＩ−ＣlaＩフ
ラグメントを、スブチリシン遺伝子の３′側領域（コド
ン８７を含む）とｐＢＳ４２ベクター配列を含む4.７kb
のＣlaＩ−ＥcoＲＩフラグメントと連結した。大腸菌Ｍ
Ｍ２９４を連結混合物でトランスフォームし、そのプラ
スミドＤＮＡを個々のトランスフォーマントから精製し
た。二重システインプラスミド構築物は、元のシステイ
ン突然変異体由来の制限部位マーカーにより同定した
（すなわち、Ｃ２２とＣ２４、Ｓan３Ａマイナス；Ｃys
８７、ＭstＩプラス）。大腸菌由来のプラスミドを枯草
菌（B. subtilis)ＢＧ２０３６にトランスフォームし
た。野生器スブチリシンと比較して、これら突然変異体
の熱安定性は、図３６、表XVII及びXVIII に示した。

【０１５０】

【表17】 表 XVII スブチリシン^* の野生型及びジスルフィド突然変異体 の自己分解による活性の半減期に関するＤＴＴの効果 ｔ_1/2 酵 素 −ＤＤＴ ＋ＤＤＴ −ＤＴＴ／＋ＤＴＴ 分 野生型 95 85 1.1 Ｃ22／Ｃ87 44 25 1.8 Ｃ22／Ｃ87 92 62 1.5 （＊）精製酵素は一方では２５ｍＭＤＴＴ処理し、１０ｍＭＤＴＴ、２ｍＭ CaCl₂ 、５０ｍＭ Tris （pH 7.5）で１４時間透析し、他方では、ＤＴＴ処理 及び透析は行なわなかった。酵素濃度を氷冷した80μl 部分標本へと調製し、 残存する活性を検定した。自己分解の活性の半減期は、時間に対して、log₁₀ （残存活性）の片対数プロットより測定した。これらのプロットは、９０％以 上の不活性化まで直線性を示した。

【０１５１】

【表18】 表 XVIII ５８℃^* における自己分解による活性化の半減期に関する スブチリシンの突然変異の影響 酵 素 ｔ_1/2 分 野生型 １２０ Ｃ２２ ２２ Ｃ２４ １２０ Ｃ８７ １０４ Ｃ２２／Ｃ８７ ４３ Ｃ２４／Ｃ８７ １１５ （＊） 自己分解による活性の半減期は、表III の脚註で述べたように、野生型 及び突然変異体スブチリシンに対し測定した。未精製及び非還元酵素は、枯草 菌培養上清からのものを直接使用した。

【０１５２】スブチリシンに導入したジスルフィドは、
野生型酵素と比較して、突然変異体酵素の自己分解安定
性を改良しなかった。しかし、ジスルフィド結合は、対
応する還元したダブル・システイン酵素と比較したと
き、自己分解安定性に余裕を与えた。野生型のＢ．アミ
ロリクエファシエンス（amyloliquefaciens)のスブチリ
シンの高精度Ｘ線構造の解析は、Ｔhr２２及びＳer８７
の間の水素結合を明らかにした。システインは、水素の
供与体又は受容体としては有効に働かないので（I.Ｃ．
ポール（Paul)(１９７４年）“ＳＨ基の化学”（Ｓ．パ
タィ（Patai)編）、１１１−１４９頁、ウィリー・イン
ターサイエンス（Wiley Interscience) 、ニューヨー
ク）２２／８７水素結合が弱まることが、Ｃ２２及びＣ
８７単一システイン突然変異体タンパク質がＣ２４もし
くは野生型のものより、自己分解的に不安定な理由を説
明することができる（表XVIII ) 。Ｃ２２がＣ８７に比
べ自己分解的に不安定であるという事実はＴyr２１Ａ突
然変異の結果である（表XVIII)。事実Ｔyr２１／Ｃ２２
の構築及び分析は、その突然変異体タンパク質はＣ８７
のものに近い自己分解的安定性を有している。まとめる
と、単一システイン突然変異のＣ２２及びＣ８７は自己
分解に対してタンパク質を不安定化し、そしてジスルフ
ィド結合の形成は、野生型のものと同じか、それよりも
低いレベルまでに安定性は増加させる。 実施例１２ 部位２２２及び部位１６６又は１６９に置換を含む多部
位突然変異体。

【０１５３】２部位突然変異体１６６／２２２及び１６
９／２２２を、(1) スブチリシン遺伝子の５′側領域を
含むｐＳ4.５由来の2.３kbのＡca II フラグメント及び
ベクター配列、(2) １６６又は１６９の突然変異体プラ
スミドからの、各々の１６６又は１６９突然変異を含む
２００bpＡva II フラグメント、(3) スブチリシン遺伝
子の３′側、関連する２２２突然変異を含む、2.２kbの
Ａva II フラグメント及び対応するｐ２２２プラスミド
からのベクター配列、を一緒に連結することにより調製
した。部位２２２の突然変異は酸化安定性を改善したに
もかかわらず、それらはまたkm値も増加した。一例を表
XIX に示した。この場合において、Ａ２２２突然変異は
Ｋ４６６と組合せると、２つのそれぞれの元の酵素の中
間のkcat及びkm値を示す酵素となった。

【０１５４】

【表19】 表 XIX kcat km ＷＴ ５０ 1.４×１０^-4 Ａ２２２ ４２ 9.９×１０^-4 Ｋ１６６ ２１ 3.７×１０^-5 Ｋ１６６／Ａ２２２ ２９ 2.０×１０^-4 基質 ｓＡＡＰＥｐＮａ 実施例１３ 部位５０、１５６、１６６、２１７とそれらを組合せた
置換を含む多部位突然変異体。

【０１５５】Ｓ１５６／Ａ１６９の２部位突然変異体
を、その対応する突然変異を各々含むフラグメントを連
結することにより調製した。プラスミドｐＳ１５６をＸ
maＩで切断し、さらにＳ１ヌクレアーゼで処理し、コド
ン１６７の部位にブラント・エンドを生じた。フェノー
ル／クロロホルム抽出とエタノール沈殿によるヌクレア
ーゼの除去の後、そのＤＮＡをＢamＨＩで消化し、ベク
ターにコドン１６７を通してスブチリシンの５′領域が
加わった、およそ４kbのフラグメントを精製した。ｐＡ
１６９プラスミドをＫpnＩで消化し、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ・クレノ−フラグメントと５０μM ｄＮＴＰｓで処
理し、コドン１６８の部位にブラント・エンドを生成し
た。

【０１５６】フェノール／クロロホルム抽出及びエタノ
ール沈殿により、クレノーを除去した。そのＤＮＡをＢ
amＨＩで消化し、スブチリシン遺伝子のカルボキシル末
端を通じて、コドン１６８を含む５９０bpフラグメント
を精製した。この２つのフラグメントを連結し、Ｓ１５
６／Ａ１６９を得た。３部位及び４部位突然変異体は、
（1)１部位突然変異体プラスミドのｐ１５６、ｐ１６６
および、又はｐ１６９からの各々の１５６、１６６およ
び、または１６９突然変異を含む２２０bp Ｐvu II ／
Ｈae II フラグメント、（2)ｐ２１７プラスミド由来の
対応する２１７突然変異を含む５５０bpのＨae II ／Ｂ
amＨＩフラグメントおよび（3)Ｆ５０突然変異とベクタ
ー配列を含む3.９kbのＰvu II／ＢamＨＩフラグメン
ト、を一緒に連結することにより調製した。

【０１５７】Ｂ．アミロリクエファシエンス（amyloliq
uefaciens)のスブチリシン、Ｂ．リチェニホルミス（Ii
cheniformis)のスブチリシンと同様に多部位突然変異体
Ｆ50／Ｓ１５６／Ａ１６９／２２１７を、基質中のＰ−
１アミノ酸がＬys、Ｈys、Ａla、Ｇln、Ｔyr、Ｐhr、Ｍ
et、及びＬeuである上述の合成ポリペプチドを用いて分
析した。それらの結果を図３１と図３２に示した。これ
らの結果は、Ｆ５０／Ｓ１５６／Ａ１６９／Ｌ２１７突
然変異体が、Ｂ．リチェニルホルミス（licheniformis)
の酵素と同様の基質特異性をもち、野生型酵素と著しく
異なることを示している。Ｌ２１７突然変異体のデータ
だけを示したが、１部位突然変異体（例えば、Ｆ５０、
Ｓ１５６、またはＡ１６９）のどれもがこの効果を示さ
なかった。Ｂ．リチェニルホルミス（licheniformis)
は、B.アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens)
と、部位８８残基が異なるにもかかわらず、これら４つ
の突然変異の組合せで、両酵素間の基質特異性の差をほ
とんど説明できる。 実施例１４ アルカリ安定性を修正したスブチリシン突然変異体Ｂ．
アミロリクエファシエンス（amyloliquefaciens)のスブ
チリシン遺伝子内に１部位及び多部位突然変異体を起こ
すのに、ランダムミュータジェネシステクニック（rand
om mutagenesistechnique) を用いた。そのような突然
変異体を、変化したアルカリ安定性に対してスクリーニ
ングした。アルカリ安定性が増加した（正）クローン及
び低下したもの（負）を単離し、配列を決定すること
で、スブチリシン遺伝子内の突然変異を同定した。正の
クローンの中から、突然変異体Ｖ１０７及びＲ２１３を
同定した。これらの１部位突然変異体をさらに結合し、
突然変異体Ｖ１０７／Ｒ２１３をつくった。

【０１５８】ランダム・ミュータジェネシス実験からの
負のクローンの１つ（Ｖ５０）は、アルカリ安定性が著
しく低下していた。別の突然変異体（ｐ５０）につい
て、アルカリ安定性に対する部位５０の異なる置換の影
響を測定する分析を行った。そのＦ５０突然変異体は、
野生型のスブチリシンよりも、大きいアルカリ安定性を
もつことが分り、そして２部位突然変異体（Ｖ１０７／
Ｒ２１３）と結合させると、その個々の突然変異体の各
々に対するアルカリ安定性を集合させたものを反映する
アルカリ安定性を有する突然変異体を生じた。１部位突
然変異体Ｒ２０４及び２部位突然変異体Ｃ２０４／Ｒ２
１３は、部位１９７から２２８の領域にわたるランダム
・カセット・ミュータジェネシス後に、アルカリスクリ
ーニングにより同定した。Ｃ／２０４／Ｒ２１３突然変
異体はその後、その個々の突然変異Ｃ２０４及びＲ２１
３を含む突然変異体を生成させるべく修正され、個々の
突然変異の寄与を測定した。部位２０４での全てのアミ
ノ酸の置換するために、集めたオリゴヌクレオチドを用
いたカセット突然変異誘発は、部位２０４での置換がア
ルカリ安定性を最適化するかどうかを決定するのに用い
た。Ｌys２１３のＡrgへの突然変異は、部位２０４のこ
れらの置換体の各々に一定に維持された。 Ａ．大腸菌−枯草菌シャトルプラスミドｐＢ０１８０の
構築 ｐＢＲ３２７由来の2.９kbのＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグ
メント（Ｌ．コバルビアス（Covarrubias)等、（１９８
１年）、ジーン（Gene) １３巻、２５−３５頁）をｐＢ
Ｄ６４の3.７kbＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメント（Ｔ．
グリクザン（Gryczan)等（１９８０年）ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol)、１４１巻、２
４６−２５３頁）と連結し、組換えプラスミドｐＢＯ１
５３を作った。ｐＢＤ６４中の唯一のＥcoＲ１制限配列
を、ＥcoＲ１による消化で除き、クレノー及びデオキシ
ヌクレオチド三リン酸による処理を行った。（Ｔ．マニ
アチス（Maniatis) 等、（eds)、（１９８２年）モレキ
ュラークローニング（Molecular Cloning)、ラボラトリ
ー・マニュアル（A Laboratory Manual)、Ｎ．Ｙ．コー
ルド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harvor) 、
コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Harvor Loboratory)。ブラント・エンド・ライゲ
ーション及びトランスフォーメーションでｐＢＯ１５４
を生成した。ｐＢＯ１５４中の唯一のＡvaＩ制限配列を
同様の方法で除きｐＢＯ１７１を作った。ｐＢＯ１７１
をＢamＨ１及びＰvu II で消化し、クレノー及びデオキ
シヌクレオチド三リン酸で処理して、ブラント・エンド
を生成した。その6.４kbのフラグメントを精製し、連結
し、ＬＥ３９２細胞にトランスフォームして（Ｌ．Ｗ．
エンクエスト（Enquest)等（１９７７年）ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.)、
１１１巻、９７−１２０頁）、唯一のＢamＨＩ部位をも
つｐＢＯ１７２を生成した。スブチリシン突然変異体を
サブクローニングするために、コドン１６６の最初にあ
る唯一のサイレントなＫpnＩ部位を、特定部位の突然変
異誘発により、ｐＳ4.５由来のスブチリシン遺伝子に導
入した（J.A. ウェルズ（Wells)等、（１９８３年）、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Re
s.）１１巻、７９１１−７９２５頁）。ＫpnＩｔプラス
ミドをＥcoＲ１で消化し、クレノー及びデオキシヌクレ
オチド三リン酸で処理して、ブラント・エンドを得た。
そのクレノーを６８℃で２０分加熱することにより不活
性化し、そのＤＮＡを、ＢamＨ１で消化した。全スブチ
リシン遺伝子を含む1.５kbのブラントエンドのＥcoＲＩ
−ＢamＨ１フラグメントをｐＢＯ由来の5.８kbのＮruＩ
−ＢamＨ１フラグメントと連結し、ｐＢＯ１８０を得
た。ブラントなＥcoＲ１エントへのブラントなＮru１エ
ンドの連結はＥcoＲ１部位を再び形成する。スブチリシ
ン遺伝子の５′末端のＥcoＲ１部位からｐＢＯ１８０を
時計回りに進むと、スブチリシン遺伝子の３′末端の唯
一のＢamＨＩ部位、ｐＢＤ６４由来のクロラムフェニコ
ール及びネオマイシン耐性遺伝子及びＵＢ１１０グラム
陽性複製オリジン、ｐＢＲ３２７由来のアンピシリン耐
性遺伝子及びグラム陰性複製オリジンが存在する。 Ｂ．ランダム・ミュータジェネシス・ライブラリーの作
成 ｐＢＯ１８０由来のＢ．アミロリクエファシエンス（am
yloliquefaciens)のスブチリシン遺伝子（ウェルズ（We
lls)等（１９８３年））を含む1.５kbのＥcoＲ１−Ｂam
Ｈ１フラグメントをＭ１３mp１１にクローン化し、基本
的に以前に述べたようにＭ１３mp１１ＳＵＢＴを作成し
た。（Ｊ．Ａ．ウェルズ（Wells)等、（１９８６年）ジ
ャーナル・オブ・バイケミジカル・ケミストリー（J. B
iol. Chem.) ２６１巻、６５６４−６５７０頁）。デオ
キシウリジンを含むテンプレートＤＮＡをクンケル（Ku
nkel) の方法に従って調製した（Ｔ．Ａ．クンケル（Ku
nkel) 、（１９８５）プロシーディング・イン・ナショ
ナル・アカデミーオブサイエンス（Proc. Natl. Acad.
Sci)ＵＳＡ、８２巻、４８８−４９２頁）。ウリジンを
含むテンプレートＤＮＡ（クンケル（Kunkel) （１９８
５年））をCsCl密度勾配（Ｔ．マニアチス（Maniatis)
等、（編）１９８２年）モレキュラー・クローニング・
ラボラトリー・マニュアル、Ｎ．Ｙ．コールド・スプリ
ング・ハーバー（Cold Spring Harbor) 、コールド・ス
プリング・ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory)。コドン−１１で終る、配列

【０１５９】

【外８】 を持つプライマー（ＡvaＩ）を、スブチリシン遺伝子内
の唯一のＡvaＩ制限配列を修正するのに用いた。（アス
テリスクは、野生型配列からのミスマッチを示し、下線
は修正したＡvaＩ部位を示す。５′リン酸化したＡvaＩ
プライマー（３２０pmol) 及びウリジンを含むＭ１３Ｍ
mp１１ＳＵＢＴテンプレート４０pmol（１２０μg ）
を、５３mM NaCl 、7.４mM MgCl₂及び7.４mMトリス−塩
酸（pH7.５）1.８８ml中で９０℃２分間加熱し、２４℃
で１５分熱冷却することによりアニールした（図３
７）。２４℃におけるプライマー伸長を全ての４種のデ
オキシヌクレオチド三リン酸１mM及び２０μl クレノー
フラグメント（５cmits ／リットル）を含む１００μl
溶液を添加して開始した。伸長反応を、５０μl の反応
混合物部分標本に、１０μl の0.２５Ｍ ＥＤＴＡ（pH
８）を加えることにより、１０分以後５秒毎に停止させ
た。試料を集めフェノールクロロホルム抽出し、ＤＮＡ
は2.５倍容の１００％エタノールを添加することにより
２度沈殿させ、さらに７０％エタノールで２度洗浄し
た。そのペレットを乾燥し、0.４mlの１mMＥＤＴＡ、１
０mM Tris(pH８）に溶解した。

【０１６０】ランダムに終止したテンプレートの集合体
の３′末端へのα−チオデオキシヌクレオチドのミス・
インコーポレーションは、ランダム終止テンプレート混
合物の４分の１（２０μg ）、0.２５mMの各α−チオデ
オキシヌクレオチド三リン酸、１００ユニットのＡＭＶ
ポリメラーゼ、５０mMトリス（pH8.３）を含む、各々４
つの0.２ml溶液をインキュベーションすることによって
行った（Ｊ．Ｊ．キャンポークス（Champoux) （１９８
４年）ジェネティクス（Genetics) 、２巻、４５４−４
６４頁）。３７℃、９０分のインキュベーションの後、
ミスインコーポレーション反応は、５０mMの全ての４種
のデオキシヌクレオチド三リン酸（pH８）及び５０ユニ
ットのＡＭＶポリメラーゼと共に３７℃５分間インキュ
ベーションすることにより封じた。その反応は、２５mM
ＥＤＴＡ（最終濃度）の添加により終了させ、そし
て、６８℃で１０分間加熱して、ＡＭＶポリメラーゼを
失活させた。エタノール沈殿及び再溶解の後、閉環ヘテ
ロ二重鎖の合成は、その反応が１０００ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼ、0.５mMＡＴＰ及び１mMのβ−メルカプ
トエタノールを含むこと以外は、上の経時伸長反応に用
いたのと同じ条件下、１４℃で２日間行った。各ヘテロ
二重鎖集合物のＫpnＩ、ＢamＨＩ及びＥcoＲ１による同
時制限切断によりその伸長反応がほぼ定量的に進んでい
ることが確かめられた。各反応混合物中のヘテロ二重鎖
は、８０μM のＳ−アデノシルメチオニン及び１５０ユ
ニットのdam メチラーゼと共に、３７℃、１時間でメチ
ル化した。そのメチル化反応は、６８℃、１５分間加熱
することにより停止させた。

【０１６１】各４つのメチル化ヘテロ二重鎖反応物の２
分の１を2.５mlのコンピテント大腸菌ＪＭ１０１にトラ
ンスフォームした（Ｊ．メシング（Messing)、（１９７
９年）、リコンビナントＤＮＡ・テクノロジー・ブレン
チ(Recombinant DNA・Tech.Bull.)２巻４３−４８
頁）。各４つのトランスフォーメーションからの個々の
トランスフォーマントの数は0.４〜2.０×１０⁵ の範囲
であった。ファージ集合体の増殖後、各４種のトランス
フォーメーションからのＲＦ ＤＮＡを単離し、CsCl密
度勾配遠心法により精製した。およそ２μg の各４種の
トランスフォーマントのＲＦＤＮＡをＥcoＲ１、ＢamＨ
Ｉ及びＡvaＩで消化した。1.５kbのＥcoＲ１−ＢamＨＩ
フラグメント（すなわちＡvaＩ耐性）を低融合点アガロ
ースにより精製し、ｐＢＯ１８０の5.５kb・ＥcoＲＩ−
ＢamＨＩベクターフラグメントに連結した。各α−チオ
デオキシヌクレオチド・ミスインコーポレーションプラ
スミド・ライブラリーからの個々のトランスフォーマン
トの総計は1.２〜2.４×１０⁴の範囲にあった。各４種
のトランスフォーメーションからのプラスミドの集合体
を、１2.５μg ／mlのcmp を含む２００mlのＬＢ培地で
増殖し、そのプラスミドＤＮＡをCsCl密度勾配遠心法に
より精製した。 Ｃ．スブチリシン点突然変異体の発現とスクリーニング 各４種のミスインコーポレーション集合体からのプラス
ミドＤＮＡを、ＢＧ２０３６にトランスフォームした
（Ｃ．アナグノストポロス（Anagnostopoulos)等、（１
９６７年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. B
acteriol.)８１巻７４１−７４６頁）、各トランスフォ
ーメーションに対し、５μg のＤＮＡでおよそ2.５×１
０⁵ の個々のＢＧ２０３６トランスフォーマントが生成
した。そして、その４つのライブラリーからの液体培養
部分標本は、１０％グリセリン中−７０℃で保存した。
凍結した培養物を融かした部分標本をＬＢ／５μg ／m
l、cmp ／1.６％、スキムミルクプレートにプレーティ
ングした（Ｊ．Ａ．ウェルズ（Wells)等、（１９８３
年）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids
Res. ）１１巻、７９１１−７９２５頁）、そして新鮮
なコロニーを、９６−穴のウェル当り、１５０μl のＬ
Ｂ培地（１2.５μg ／ml cmp）を含むマイクロタイター
プレートに並べて入れた。室温で１時間後、そのレプリ
カを直径１４０mmのＬＢ／cmp ／スキムミルクプレート
上に置いた。１３２mmのＢＡ８５ニトロセルロースフィ
ルター（シュレイチャー・アンド・シェウル（Schleich
er and Scheull))上にスタンプ（９６プロングスタンプ
使用）した。細胞は、タンパク質分解のハローが径約５
〜７mmになるまで３０℃で約１６時間増殖し、フィルタ
ーを、1.６％スキムミルクと５０mMリン酸ナトリウム
（pH１1.５）だけを含む新鮮な３７℃の寒天プレートに
直接移した。フィルターをそのプレート上で３７℃、３
〜６時間インキュベートし、野生型スブチリシンに対す
る約５mmのハローを作り、その後、捨てた。そのプレー
トをコマージ・ブルー溶液で２４℃、１０分間染色し
（0.２５％コマージ・ブルー（Ｒ−２５０）、２５％エ
タノール）、そして、２５％エタノール、１０％酢酸で
２０分間脱染色した。プレートの下側の白いバック上に
タンパク質分解ゾーンが青いハローとして見え、コント
ロールとして同様に染色及び脱染色した元の生育プレー
トと比較した。クローンは、元の生育プレートと比較し
て、高pHプレート上で、比例的により大きいタンパク分
解ゾーンを形成することで正と判断される。負のクロー
ンは、アルカリ条件下で小さいハローを与える。正及び
負のクローンをさらに画線培養により、純粋化し、再び
アルカリ性pHの結果を確かめるために３回スクリーニン
グを行った。 Ｄ．突然変異体スブチリシンの同定と分析 さらにアルカリ活性の高い枯草菌（B. subtilis)クロー
ンの５mlオーバナイト培養からのプラスミドＤＮＡを、
２mg／mlリゾチームを３７℃で５分間行ない溶菌を完全
にし、及び不純物の混入をさけるために、さらに、フェ
ノール／CHCl₃抽出を行ったこと以外は、バーンボィム
（Birnboim) 及びドーリー（Doly)(Ｈ．Ｃ．バーンボィ
ム（Birnboim) 等（１９７９年）ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）７巻、（５１３
頁）の方法に従って調製した。スブチリシン遺伝子を含
む1.５kbのＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントをＭ１３mp
１１に連結し、そのテンプレートＤＮＡを、ＤＮＡ配列
決定のため調製した（Ｊ．メシング（Messing)等、ジー
ン（Gene) 、１９巻、２６９−２７６頁）。コドン２
６、＋９５及び＋１５５で終る三つのＤＮＡ配列決定プ
ライマーをスブチリシンコーディング配列に一致するよ
う合成した。予備的な配列同定のために、その突然変異
体が由来するｄＮＴＰａＳミスインコーポレーション・
ライブラリーに対応する、ＤＮＡ配列の単一のトラック
が、成熟タンパク質をコードする全配列に使われた（つ
まり、単一のダイオデオキシグアノシン配列トラックが
ｄＧＴＰasライブラリー由来の突然変異体の同定に用い
られた）。ＤＮＡ配列の完全な４つのトラックは、突然
変異部位を含む２００bPについて分析し、突然変異体配
列の確認及び同定が行われた。（Ｆ．サンガー（S.サン
ガー（Sanger) 等、（１９８０年）ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.)１４３
巻、１６１−１７８頁）。確認した陽性及び陰性のバチ
ルスクローンを１2.５μg ／mlのcmp を含むＬＢ培地で
培養し、以前に報告されている方法（Ｄ．Ａ．エステル
（Estell）等（１９８５年）、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) ２６０
巻、６５１８−６５２１頁）により、培養上清から精製
した。その酵素はＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による分析で９８％以上の純度であった（Ｕ．Ｋ．
ラエムリ（Laemmli)（１９７０年）、ネイチャー（Natu
re) ２２７巻、６８０−６８５頁）。そして、タンパク
質濃度

【０１６２】

【外９】 Ｈ．マターバラ（Maturbara)等、（１９６５年）ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem.) ２４０巻、１１２５−１１３０頁）。酵素活性
は0.１Ｍトリス（pH8.６）又は0.１Ｍ ＣＡＰＳ（pH１
0.８）中２５℃で、２００μg ／mlのスクシニル−Ｌ−
ＡlaＬ−ＡlaＬ−ＰroＬ−Ｐhe−ｐ−ニトロアニリド
（シグマ）用いて測定した。比活性（生成物μmol/分−
mg）は酵素ミリグラム当りのｐ−ニトロアニリドの生産
の経時変化を４１０nmの吸光度変化から計算して求め
た。（Ｅ４１０＝8.４８Ｍ−１cm−１、Ｅ．Ｇ．デル・
マール（Del Mar)等（（１９７９年）、アナリティカル
・バイオケミストリー(Anal.Biochem.)９９巻、３１６
−３２０頁）。アルカリ自己分解安定性の研究は、精製
した酵素について（２００μg ／ml）、0.１Ｍリン酸カ
リウム（pH１2.０）中３７℃で行なった。時間経過を追
ってその部分標本を、残存する酵素活性について分析し
た（Ｊ．Ａ．ウェルス（Wells)等（１９８６年）、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Bio
l. Chem.) ２６１巻、６５６４−６５７０頁）。 Ｅ．結 果 1. 突然変異誘発の頻度の最適化と分析 スブチリシン遺伝子において、ランダムに３′側の停止
を行った一連のプライマーテンプレート分子（図３７）
は、５′側を固定したプライマーからの種々の鎖伸長に
より作った（そのプライマー（は、スブチリシン遺伝子
のコドン１１の唯一のＡvaＩ部位を突然変異させた。）
このことは、伸長反応を種々の時間行なった後、ＥＤＴ
Ａを添加することによりポリメラーゼ反応を停止して行
った。１kbのスブチリシン遺伝子フラグメント上での二
本鎖形成の程度と分布は、多重制限酵素による消化によ
り検定した（データは示していない）。例えば、ポリメ
ラーゼ伸長が、スブチリシン遺伝子中のＩle１０、Ｌeu
２３３及びＡsp２５９を過ぎて進行した時には、新しく
ＨinＦＩフラグメントの生成が確認された。

【０１６３】ＡＭＶ逆転写酵素による、ランダムに停止
した３′末端への各ｄＮＴＰαＳのミスインコーポレー
ション（Ｒ．Ａ．ザカー（Zakour）等、（１９８２年）
ネイチャー（Nature) ２９５巻、７０８−７１０頁、
Ｒ．Ａ．ザカー（Zakour）等、（１９８４年）ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）１２
巻、６６１５−６６２８頁）は以前に述べられた方法を
用いた（Ｊ．Ｊ．チャンポウクス（Champoux）、（１９
８４年）、ジュネティクス（Genetics) 、２巻、４５４
−４６４頁）。各ミスインコーポレーション反応の効率
は、ＡvaＩ制限プライマーへの各ｄＮＴＰαＳの付加及
びポリアクリルアミド電気泳動による分析から８０％以
上と見積った。ミスインコーポレーションは全ての４つ
のdNTP′sによる合成でシールされ、閉環ＤＮＡをＤＮ
Ａリガーゼの反応により作った。

【０１６４】いくつかのミスインコーポレーションは、
ヘテロ二重鎖中の突然変異体配列の収率をあげるために
用いた。これらには、デオキシウリジンを含むテンプレ
ート（Ｔ．Ａ．クンケル（Kunkel) （１９８５年）、プ
ロシーディングイン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)ＵＳＡ、８２巻、
４８８−４９２頁、Ｐ．Ｊ．プキラ（Pukkila)等、（１
９８３年）ジュネティクス（Genetics) １０４巻、５７
１−５８２頁）、突然変異鎖の試験管内メチル化（Ｗ．
クレーマー（Kramer) 等、（１９８２年）ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）１０巻、
６４７５−６４８５頁）、及び唯一のＡvaＩ部位を含む
野生型テンプレート鎖へのＡvaＩ制限選択法の使用が含
まれている。各々の最終的な突然変異誘発効率を上げる
ための操作の別々の寄与は、ＡvaＩによる制限−選択法
にかける前に、各４種の集合物中の分離したクローンの
およそ３分の１は、そのスブチリシン遺伝子内にまだ野
生型のＡvaＩ部位を維持していたこと以外は測定されて
いない。ＡvaＩ制限選択を用いた後は、そのプラスミド
の９８％以上が野生型のＡvaＩ部位を欠失していた。

【０１６５】各４種のCaCl精製Ｍ１３ＲＦ集合物からＡ
vaＩ制限消化耐性の1.５kbのＥcoＲ１−ＢamＨ１スブチ
リシン遺伝子フラグメントを低融点アガロース単離し
た。そのフラグメントは、アガロースから得られたその
ままの状態で大腸菌−枯草菌のシャクトルベクター、ｐ
ＢＯ１８０を同様に切断したものと連結し、大腸菌のＬ
Ｅ３９２に直接トランスフォームした。そのような、ア
ガロースから単離したＤＮＡの直接的連結とトランスフ
ォーメーションはロスが避けられ、多数の組換え体を得
ることが可能となる（投入したＭ１３集合体と等価なμ
g に対し、１０0,０００）各４種のｄＮＴＰαＳミスイ
ンコーポレーション反応に対する突然変異誘発の頻度
は、唯一存在する制限部位の欠除頻度から見積もられる
（表XX) 。この解析に選ばれた単一の制限部位、Ｃla
Ｉ、Ｐvu II 及びＫpnＩは、スブチリシン遺伝子上のコ
ドン３５、１０４及び１６６で各々始まる部位に分布し
ている。コントロールとして、突然変異誘発の範囲外に
あるβ−ラクタマーゼ遺伝子中に存在するＰstＩ部位で
の突然変異誘発頻度を測定した。絶対的な突然変異誘発
頻度は未消化のプラスミドＤＮＡのパーセンテージに近
いことから、二度の制限−選択が残存する未切断野生型
プラスミドＤＮＡのバックグランドを、突然変異体プラ
スミド以下にするために必要である（表XX) 。野生型Ｄ
ＮＡからの残存するプラスミドのバックグランドはおそ
らく自然突然変異、未切断野生型プラスミドの総計と、
線状ＤＮＡが大腸菌にトランスフォームする効率を表わ
している。突然変異体ＤＮＡに対する効率から、非突然
変異ＤＮＡに対する効率（バックグランド）を差くこ
と、及び与えられた制限分析により標本をとった突然変
異誘発の範囲を標準化すること（４〜６bp）は全コード
配列（１０００bp）にわたる突然変異誘発頻度の見積り
を提供する。

【０１６６】

【表20】 表 XX ミスインコーポレー ションしたαチオール 制限部位の ｄＮＴＰ^(b) 選 択 な し ＰstＩ Ｇ ＰstＩ Ｔ ＰstＩ Ｃ ＰstＩ な し ＣlaＩ Ｇ ＣlaＩ Ｔ ＣlaＩ Ｃ ＣlaＩ な し Ｐvu II Ｇ Ｐvu II Ｔ Ｐvu II Ｃ Ｐvu II な し ＫpnＩ Ｇ ＫpnＩ Ｔ ＫpnＩ Ｃ ＫpnＩ 表 XX（つづき） （％） （％） バックグラン 耐性クローン^c ド以上の耐性 1000bp当りの １回目 ２回目 総 計 クローン^d 突然変異体^e 0.32 0.7 0.002 0 − 0.33 1.0 0.003 0.001 0.2 0.32 0.5 0.002 0 0 0.43 3.0 0.013 0.011 3 0.28 5 0.014 0 − 0.26 85 1.92 0.91 380 0.48 31 0.15 0.14 35 0.55 15 0.08 0.066 17 0.08 29 0.023 0 − 0.41 90 0.37 0.35 88 0.10 67 0.067 0.044 9 0.76 53 0.40 0.38 95 0.41 3 0.012 0 − 0.98 35 0.34 0.33 83 0.36 15 0.054 0.042 8 0.47 26 0.38 0.37 93 (a) 突然変異誘発頻度は、突然変異を起こしたスブチリシン遺伝子中の単一の制 限部位（すなわちＣlaＩ、Ｒvu II またはＫpnＩ）を修正する突然変異を得る 頻度をＰstＩ部位、すなわち突然変異誘発の範囲の外の突然変異頻度と比較す ることにより見積った。 (b) プラスミドＤＮＡは野生型（無し）又は、上述のｄＮＴＰαＳミスインコー ポレーションにより突然変異をおこしたものである。 (c) 耐性クローンのパーセントは未消化コントロールと比較して、指示された制 限酵素によるプラスミドの３倍以上の過剰消化後に得られるクローンの分率か ら計算した。第１回目の制限耐性プラスミドＤＮＡを第２回目の制限選択にか けた。その総計は、２回の選択から得られた耐性クローンの分率の生成物を表 わしており、そして本来の出発集合物中の制限部位突然変異体クローンのバー セントを与える。頻度は、少なくとも２０個以上のコロニー、通常は１００個 以上の計数から誘導された。 (d) 耐性クローンのパーセントは、野生型ＤＮＡ（すなわち“無し”）に対して 得られた制限−耐性クローンのパーセントを、突然変異体ＤＮＡに対するもの から差引くことにより計算した。 (e) これは、各制限部位上の突然変異の頻度から、全スブチリシン遺伝子(1kb) へと外挿した。これは、与えられたミスインコーポレーション事象により突然 変異を起こすことができる各制限部位内の可能な塩基数（４−６bp）に標準化 した。

【０１６７】この分析から、ｄＧＴＰαＳ、ｄＣＴＰα
Ｓ又はｄＴＴＰαＳミスインコーポレーションから生じ
た突然変異を含むスブチリシン遺伝子の平均パーセント
は、それぞれ９０、７０及び２０パーセントであった。
これらの高い突然変異誘発頻度は、一般に、ｄＮＴＰα
Ｓ及びこの部位でのミスインコーポレーションの効率に
依存して全く変ってしまう。ミスインコーポレーション
効率は、ミスマッチの種類と、プライマーの中味に依存
すると報告されている（Ｊ．Ｊ．チャムポウクス（Cham
poux) （１９８４年）、Ｊ．Ａ．スキナー（Skinner)
など（１９８６年）、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Res.）１４巻、６９４５〜６９６４
頁）。ｄＴＴＰαＳ以上のｄＧＴＰαＳ及びｄＣＴＰα
Ｓの備ったミスインコーポレーション効率が、以前に観
測されている（Ｄ．ショートル（Shortle)等、（１９８
５年）、ジュネティクス（Genetics) １１０巻、５３９
〜５５５頁）。ｄＧＴＰαＳ、ｄＣＴＰαＳ及びｄＴＴ
ＰαＳのライブラリーとは異なり、ｄＡＴＰαＳミスイ
ンコーポレーションライブラリーに対する突然変異誘発
頻度は、解析された制限耐性プラスミドの９０％が単に
スブチリシン遺伝子の挿入を欠失したので正確に検定で
きなかった。この問題は、ｄＡＴＰαＳ突然変異誘発ス
ブチリシン遺伝子をＭ１３からpB０１８０にサブクロー
ンした時、そのベクターの自己連結から生じるのであろ
う。ベクターのバックグランドを補正して、ｄＡＴＰα
Ｓミスインコーポレーションライブラリー中の突然変異
誘発頻度を約２０パーセントと見積った。別々の実験で
（データは示していない）、ｄＧＴＰαＳ及びｄＴＴＰ
αＳに対する突然変異誘発頻度は、コドン１６９におけ
る不活性化突然変異の回復頻度に基づいて、各々、約５
０パーセント及び３０パーセントと見積もった。

【０１６８】各突然変異の部位及び同定は、全遺伝子上
のミスインコーポレーションを起こしたα−チオデオキ
シヌクレオチドに対応する単一トラックのＤＮＡ配列決
定とそれに引きつづく、突然変異部位を含む領域に焦点
を合せた４つのトラックのＤＮＡ配列により行なった。
同定した１４の突然変異体の分布は、ショトル（Shortl
e)及びリン（Lin)により１９８５年に報告されたもの
と、我々がヌクレオチドの挿入及び欠失突然変異を観察
できなかったもの以外、同じであった。ＡＧ突然変異の
数は、Ｇミスインコーポレーションのライブラリーで最
も高く、そして、いくつかの予測されない点突然変異が
ｄＴＴＰαＳｄＣＴＰαＳライブラリーに出現した。 2. スブチリシンのアルカリ安定性突然変異体のスクリ
ーニング及び同定 カゼインの消化によるハローにより、スブチリシンを生
産するコロニーをスクリーニングすることができる
（Ｊ．Ａ．ウェルズ（Wells)等、（１９８３年）、ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）
１１巻、７９１１〜７９２５頁）。しかし、高アルカリ
条件（＞pH１１）下でのコロニーのスクリーニングに
は、２つの問題がある。第１に、枯草菌は、高pH条件で
は生育しないし、バチルスの好アルカリ性本来のトラン
スフォームはできていない。この問題はコロニーをまず
中世pHのフィルター上で生育させ、スブチリシンを生成
し、引きつづいて、そのフィルターをpH１1.５のカゼイ
ンプレートる移して、スブチリシン活性を検定する、レ
プリカプレーティング法を採用することによって克服で
きた。しかし、pH１1.５でのカゼイン・ミセルはもはや
濁ったバックグランドを形成せず、従って、タンパク質
分解のハローを明確に観できない。この問題は、単に、
プレートをコマージ・ブルで染色し、タンパク質分解領
域を増巾し、かつプレートを酸性化することで、カゼイ
ンミセルの濁度を増すことにより克服した。高pHプレー
ト（pH１1.５）に対し、標準生育プレート（pH７）でで
きるハローの大きさを比較することにより、アルカリ条
件下での増加（正）もしくは減少（負）する突然変異体
スブチリシンを同定することが可能である。

【０１６９】およそ１０００のコロニーが、各４つのミ
スインコーポレーションライブラリーからスクリーニン
グされた。pH７に対して、pH１1.５で活性の損失を示し
たコロニーのパーセントは、各々、チオールｄＧＴＰα
Ｓ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＴＴＰαＳ及びｄＣＴＰαＳライ
ブラリーからスクリーニングされた全コロニーの1.４、
1.８、1.４及び0.６％を示した。これら負のコロニーの
うちのいくつかを、配列決定し、全てがそれらが由来す
るミスインコーポレーションライブラリーから予期され
るような単一の塩基の交換を含むことが分った。負の突
然変異体は、Ａ３６、Ｅ１７０及びＶ５０を含んでい
た。正の突然変異体は、Ａ１０７及びＲ２１３と同定さ
れた。正のものに対する負の比はおよそ５０：１であっ
た。 3. アルカリ性pHでのスブチリシン突然変異体の安定性
及び活性。

【０１７０】スブチリシン突然変異体を精製し、それら
のpH１2.０における自己分解安定性を、失活の経時変化
により測定した。（図３８及び３９）。スクリーニング
から同定した正の突然変異体（すなわち、Ｖ１０７及び
Ｒ２１３）は、野生型のものと比較して、アルカリ自己
分解による失活に対しより耐性である；負の突然変異体
（すなわちＥ１７０及びＶ５０）はより耐性が低い。我
々は、特定部位の突然変異誘発により、部位５０のもう
１つの突然変異体（Ｆ５０）をうまく作った。この突然
変異体は、アルカリ自己分解による失活に対し、野生型
酵素より安定であった。自己分解の研究の最後に、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析で、各スブチリシン変異体は、他の残
りの酵素の活性と同じ程度に自己分解することが確認さ
れた。Ｖ１０７、Ｒ２１３及びＦ５０の安定化効果は累
積的である。２部位突然変異体Ｖ１０７／Ｒ２１３（ｐ
ＢＯ１８０Ｖ１０７の９２０bpのＥcoＲ１−ＫpnＩフラ
グメントを、ｐＢＯ１８０Ｒ２１３の6.６kbのＥcoＲ１
−ＫpnＩフラグメントにサブクローニングすることによ
り作った）は、各々の１部位突然変異体よりも安定であ
る。

【０１７１】３部位突然変異体、Ｆ５０／Ｖ１０７／Ｒ
２１３（ｐＦ５０の７３５bpのＥcoＲ１−Ｐvu II フラ
グメント（実施例２）を、ｐＢＯ１８０／Ｖ１０７の6.
８kbのＥcoＲ１−Ｐvu II フラグメントにサブクローン
することにより作った）は、２部位突然変異体Ｖ１０７
／Ｒ２１３又はＦ５０よりも安定であった。その失活曲
線は、分析したより安定な突然変異体により顕著な二相
性を示した。これは、自己分解研究における、いくつか
の不安定化する、化学修飾、そして、又はより大きい自
己分解ペプチドの完全消化により起こる減少した安定性
から生ずる。これらのアルカリ自己分解の研究は、別々
に精製した酵素に関して繰りかえしたが基本的に同じ結
果を与えた。自己分解の速度は、スブチリシン変異体の
比活性と同様コンホメーション安定性に依存する（Ｊ．
Ａ．ウェルズ（Wells)等（（１９８６年）、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.) 。それ故、自己分解不活性化速度の減少は、アルカ
リ条件下におけるより安定な突然変異体の比活性の減少
からくるといえる。一般には、その反対になるように思
える。どちらかと言えば、より安定な突然変異体は、ア
ルカリ条件下では、野生型より高い比活性を有し、より
安定性の低い突然変異体は相対的により低い比活性を示
す。これらの、Ｖ１０７／Ｒ２１３及びＦ５０／Ｖ１０
７／Ｒ２１３に対する比活性に関する難解な効果は、pH
8.６及び１0.８において累積的である。この比活性の変
化は、基質特異性のわずかな差を反映している。しか
し、部位１７０及び１０７は、結合モデル基質の６Å以
内にあること注目すべきである（J.A. ロバータス（Ro
bertus) 等（１９７７年）、バイオケミストリー（Bioc
hemistry）、１１巻、２４３８−２４４９頁）。

【０１７２】

【表21】 表 XXI pH8.６又は１0.８における相対的比活性と、 アルカリ自己分解安定性とと関係。 アルカリ自己 相対的比活性 分解半減期 酵 素 pH 8.6 pH 10.8 （分）ｂ 野生型 100 ± 1 100 ± 3 86 Ｑ１７０ 46 ± 1 28 ± 2 13 Ｖ１０７ 126 ± 3 99 ± 5 102 Ｒ２１３ 97 ± 1 102 ± 1 115 Ｖ107 ／Ｒ213 116 ± 2 106 ± 3 130 Ｖ50 66 ± 4 61 ± 1 58 Ｆ50 123 ± 3 157 ± 7 131 Ｆ50／Ｖ107 ／Ｒ213 126 ± 2 152 ± 3 168 (a) 相対比活性は、同pH値の、３倍の活性測定値を野生型の値で割ることから得 られる平均値である。pH8.６及び１0.８での野生型の平均比活性はそれぞれ７ ０μmoles/分−mg及び３７μmoles/分−mgであった。 (b) ５０％活性に到達する時間は、図３８と図３９から得た。 Ｆ．残基１９７から２２８までの間のランダムカセット
・ミュータジェネシスプラスミドｐ△２２２（ウェルズ
（Wells)等、（１９８５年）、ジーン（Gene) 、３４
巻、３１５〜３２３頁）を、ＰstＩ及びＢamＨＩで消化
し、その0.４kbのＰstＩＢamＨＩ（フラグメント１、図
４０参照）をポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し
た。

【０１７３】ps4.５からの1.５kbのＥcoＲ１／ＢamＨＩ
フラグメントＭ１３mp９にクローン化した。特定部位の
突然変異誘発をＡ１９７突然変異体を作るのに用い、同
時にコドン１９５〜１９６内にサイレントなＳstＩ部位
を挿入した。その突然変異体のＥcoＲ１／ＢamＨＩフラ
グメントをpBＳ４２に再びクローン化する。pA１９７プ
ラスミドをＢamＨＩ及びＳstＩで消化し、その5.３kbの
ＢamＨＩ／ＳstＩフラグメント（フラグメント２）を低
融点アガロースで精製した。相補的なオリゴヌクレオチ
ドを、ＳstＩ（コドン１９５−１９６）とＰstＩ（コド
ン２２８〜２３０）の間の範囲に対して合成した。これ
らのオリゴヌクレオチドを（1)野生型に対してコドン１
９７を保持している、（2)コドン２１９−２２０のにｐ
△２２２に存在するサイレントなＫpnＩ部位を再び生成
する、（3)コドン２１０−２１１内にサイレントなＳma
Ｉ部位を作る、（4)コドン２２８−２３０内のＰstＩ部
位を除く、ように設計した（図４１参照）。オリゴヌク
レオチドは、合成の各サイクルに２％の汚染ヌクレオチ
ドとともに合成した。例えばｄＡＴＰ試薬は、２％ｄＣ
ＴＰ、２％ｄＧＴＰ及び２％ｄＴＴＰで妨害される。９
クマーに対し、この２％汚染は相補鎖当り、２個以上の
ミスインコーポレーションをもつ鎖につき、非突然変異
体、１部位突然変異体及び２部位突然変異体又はそれ以
上の突然変異体の割合を次のよう値とした；１４％非突
然変異体、２８％１部位突然変異体及び５７％の２部位
以上の突然変異体。これらは次の式に従って計算した。

【０１７４】 ここでμは、突然変異の平均値、ｎは、突然変異のクラ
ス数、そしてｆはその突然変異の数をもつものの全体の
中の割合である。相補的オリゴヌクレオチド集合体をリ
ン酸化し、アニールし（フラグメント３）そして、三種
の連結において、フラグメント１及び２より２倍過剰の
モル数で連結した。大腸菌ＭＭ２９４を連結反応物でト
ランスフォームし、そのトランスフォーメーション集合
物を１晩培養し、集合したプラスミドＤＮＡを単離し
た。この集合体は、3.４×１０⁴ 個の個々のトランスフ
ォーマントを与えた。このプラスミド集合物をＰstＩで
消化し、その後、大腸菌にトランスフォームするのに用
いた。第２のプラスミド集合物を調製し、枯草菌（ＢＧ
２０３６）にトランスフォームするのに用いた。ＢＧ２
０３６トランスフォーマントのおよそ４０％は、カゼイ
ン・プレート上のハロー透明化により判定される活性ス
ブチリシンを発現した。非発現トランスフォーマントの
いくつかを配列決定し、その合成カセットにおいて、挿
入及び欠失をもつと分った。発現するＢＧ２０３６突然
変異体を１５０μｌのＬＢ／１2.５μg ／mlクロラムフ
ェニコールをウェルに含む、マイクロタイタープレート
中に入れ、３７℃で３〜４時間インキュベートしたの
ち、ＬＢ1.５％スキムミルク／５μg ／ml Cmpプレート
上においたニトロセルロースフィルター上にレプリカを
スタンプし、３３℃で１晩インキュベートした（ハロー
が直径約４〜８mmになるまで）。それからフィルターを
とり上げて、１×タイド市販級洗浄剤、５０mM Na₂C
O₃ 、（pH１1.５）を飽和した濾紙上に重ね、６５℃で
９０分インキュベートした。１晩増殖したプレートをコ
マージで染色し、発現の基本レベルが成立するまで脱染
色した。この処理の後、フィルターをpH７／スキムミル
ク／２０μg ／mlテトラサイクリンプレートにもどし、
３７℃で４時間から１晩インキュベートした。

【０１７５】よりアルカリ安定であることで、高pH安定
性スクリーニングにより同定された突然変異体を精製
し、高pH又は高温での自己分解安定性について分析し
た。２部位突然変異体Ｃ２０４／Ｒ２１３は、高pH又は
高温において野生型より、安定であった（表XXII) 。こ
の突然変異体を単一のＳmaＩ制限部位による切断及びＳ
maＩ部位を野生型の３′側配列に連結し単一のＣ２０４
突然変異体を作るか又は、そのＳmaＩ部位に野生型５′
側配列を連結して単一のＲ２１３突然変異を作ることに
より、単一の突然変異体（Ｃ２０４及びＲ２１３）に分
離した。２つの１部位突然変異体のうち、Ｃ２０４は、
元の２部位突然変異体（Ｃ２０４及びＲ２１３）とほぼ
同様のアルカリ安定性をもち、それよりわずかに大きい
熱安定性を示した。表XXIIを参照せよ。Ｒ２１３突然変
異体は野生型よりも両方の条件下でわずかに安定であっ
た（データは示していない）。

【０１７６】１９７から２２８までのランダム・カセッ
ト・ミュータジェネシスのスクリーニングから単離した
もう１つの突然変異体は、Ｒ２０４である。この突然変
異体は、高pH及び高温下で、野生型のものより安定であ
るが、Ｃの２０４よりは、安定性が低い。

【０１７７】

【表22】表 XXII スブチリシン変異体の安定性 精製した酵素（２００μg ／ml）を、アルカリ自己分解
のために、0.１Ｍリン酸（pH１２）中、３０℃でインキ
ュベートかるか、又は、熱自己分解のために、２mM CaC
l₂、５０mM MOPS(pH7.０）中、６２℃でインキュベート
した。その試料を残存する酵素活性について、時間を変
えて検定した。失活は擬一次反応であり、ｔ1/2 は２回
の実験での、最初の活性が５０％に達する時間を示して
いる。 ｔ1/2(アルカリ ｔ1/2 自己分解） （熱自己分解） スブチリシン 実験 実験 実験 実験 変異型 ＃１ ＃２ ＃１ ＃２ 野生型 30 25 20 23 Ｆ50 /Ｖ107/Ｒ213 49 41 18 23 Ｒ204 35 32 24 27 Ｃ204 43 46 38 40 Ｃ204/Ｒ213 50 52 32 36 Ｌ204/Ｒ213 32 30 20 21 Ｇ．コドン２０４のランダム・ミュータジェネシス 上述の結果に基づいて、コドン２０４をランダム・ミュ
ータジェネシスの標的とした。突然変異性ＤＮＡカセッ
ト（コドン２０４に対する）はすべて、Ｃ２０４突然変
異の安定性をわずかに増すことが分っている固定したＲ
２１３突然変異を含んている。

【０１７８】スブチリシン突然変異体Ｃ２０４／Ｒ２１
３をコードするプラスミドＤＮＡをＳstＩ及びＥcoＲ１
で消化し、1.０kbのＥcoＲ１／ＳstＩフラグメントをポ
リアクリルアミドゲルからの電気泳出により単離した
（フラグメント１、図４１参照）。またＣ２０４／Ｒ２
１３をＳmaＩ及びＥcoＲ１で消化し、ベクター配列及び
コード領域の３′側部分を含む、大きい方の4.７kbのフ
ラグメントを低融点アガロースから単離した（フラグメ
ント２、図４２参照）。フラグメント１及び２をヘテロ
リン酸化したフラグメント３と４回の別々の三種連結に
より結合した（図４２及び４３参照）。合成二本鎖のこ
のヘテロリン酸化は、リン酸化した鎖をうまくプラスミ
ド連結生成物にしている。４つの連結に対応する４つの
プラスミド集合物を、フラグメント２の単離から存在す
る全ての単一切断Ｃ２０４／Ｒ２１３を線状化するため
にＳmaＩで切断し、その結果、Ｃ２０４／Ｒ２１３のバ
ックグランドを減少させている。それから、大腸菌をＳ
maＩ−制限切断したプラスミド集合物でトランスフォー
ムし、基本的にはＣ２０４／Ｒ２１３及び、非分離のヘ
テロ二重鎖物質をもたない第２のプラスミド集合物を生
成した。

【０１７９】これら第２の豊富なプラスミド集合物を枯
草菌（B. subtilis)（ＢＧ２０３６）をトランスフォー
ムするのに用い、生じた４つの突然変異体集合物を、高
pH／温度不活性化に対する耐性スブチリシンを発現する
クローンに対しスクリーニングを行なった。このスクリ
ーニングにより正と判断された突然変異体は、さらに、
配列決定により特性化及び同定を行なった。突然変異体
Ｌ２０４／Ｒ２１３は、野生型スブチリシンよりもわず
かに安定であった。表XXII参照。本発明の好ましい態様
を述べてきたが、当業者にとっては、この公開した態様
に対して種々の修正をほどこすことができ、これらの修
正が本発明の範囲内にあると考えられることは、明白で
あろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】バシラス・アミロリクエファシエンススブチリ
シン遺伝子のアミノ酸配列に関連するコーディング鎖の
ヌクレオチド配列を示す図、

【図２】スブチリシンの基質結合クレフト並びに基質を
示す略図、

【図３】２つの異なる方法で部位に結合したリシンＰ−
１基質を示すバシラス・アミロリクエフアシエンスのＳ
−１結合サブサイトの立体図で図３左図は位置１５６で
位置１５６でＧluと結合して塩橋を形成したリシンＰ−
１基質を、図３右図は位置１６６でＧluと結合して塩橋
を形成したＰ−１基質を示す図、

【図４】スブチリシンＡsp３２、Ｈis６４及びＳer２２
１の活性部位の略図、

【図５】種々の源から得られるスブチリシンのアミノ酸
配列を示す図、

【図６】種々の源から得られるスブチリシンのアミノ酸
配列を示す図、

【図７】種々の源から得られるスブチリシンのアミノ酸
配列を示す図、

【図８】種々の源から得られるスブチリシンのアミノ酸
配列を示す図、

【図９】種々の源から得られるスブチリシンのアミノ酸
配列を示す図、

【図１０】有機酸化剤にさらしたときの変異体Ｍet２２
２ＬおよびＭet２２２Ｑの失活を示すグラフ、

【図１１】有機酸化剤にさらしたときの変異体Ｍet２２
２ＬおよびＭet２２２Ｑの失活を示すグラフ、

【図１２】Ｍet２２２Ｆスブチリシンの紫外スペクトル
およびジペルドデカン酸による失活後に生じた差スペク
トル、

【図１３】高分解能ＳＤＳ−ピリジンペプチドゲル上の
未処理およびＤＰＤＡ酸化スブチリシンＭet２２２Ｆの
ブロモシアン消化のパターン、

【図１４】図１３のブロモシアンフラグメントの地図お
よびスブチリシンＭet２２Ｆの配列を示す図、

【図１５】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシンのコドン４５〜５０間の変異の構築を示す図、

【図１６】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシンのコドン１２２〜１２７間の変異の構築を示す
図、

【図１７】スブチリシンＭet２２２Ｆ中の位置５０およ
び１２４におけるスブチリシン変異体の活性に対するＤ
ＰＤＡの効果を示すグラス、

【図１８】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシンのコドン１６６における差異の構築を示す図、

【図１９】野生型バシラス・スブチリシンの動力学的パ
ラメーターに及ぼすＰ−１基質側鎖の疎水性の効果を示
すグラフ、

【図２０】Ｐ−１基質特異性に及ぼす位置１６６側鎖の
効果を示すグラフで、図２０（Ａ）は分子容の増す順序
に配列した非枝分れアルキルおよび芳香族側鎖置換を含
む位置１６６変異体スブチリシンを、図２０（Ｂ）は分
子容増加をβ−およびγ−枝分れ脂肪族側鎖置換により
進めた一連の変異体酵素を示し、

【図２１】種々のＰ−１基質についてのlog kcat／kmに
対する位置１６６側鎖容積の効果を示すグラフ、

【図２２】一連の脂肪族および芳香族基質に対するＩle
１６６および野生型（Ｇly１６６）バシラス・アミロリ
クエフアシエンススブチリシン間の基質特異性の差を示
すグラフ、

【図２３】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシンのコドン１６９における変異の構築を示す図、

【図２４】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシンのコドン１０４における変異の構築を示す図、

【図２５】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシンのコドン１５２における変異の構築を示す図、

【図２６】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシンのコドン１５６における１部位変異並びにコドン
１５６および１６６における２部位変異の構築を示す
図、

【図２７】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシンに対するコドン２１７における変異の構築を示す
図、

【図２８】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシン中のコドン１５６及び１６６における変異に対す
るkcat／km対pHプロフィルを示すグラフ、

【図２９】バシラス・アミロリクエフアシエンススブチ
リシン中のコドン２２２における変異に対するkcat／km
対pHＨプロフィルを示すグラフ、

【図３０】コドン９４、９５および９６における変異体
の構築を示す図、

【図３１】種々の野生型および変異体のスブチリシンの
種々の基質に対する基質特異性を示すグラフ、

【図３２】種々の野生型および変異体のスブチリシンの
種々の基質に対する基質特異性を示すグラフ、

【図３３】コドン５６および１６６における置換に基く
Ｐ−１結合部位における電荷の効果を示すグラフ、

【図３４】コドン５６および１６６における置換に基く
Ｐ−１結合部位における電荷の効果を示すグラフ、

【図３５】スブチリシンＢＰＮ′のＰ−１結合部位の立
体図、

【図３６】精製野生型（パネルＡ）、Ｃ２２／Ｃ８７
（パネルＢ）およびＣ２４／Ｃ８７（パネルＣ）に対す
る残留酵素活性対温度曲線を示すグラフ、

【図３７】α−チオールデオキシヌクレオチド三リン酸
の誤取込によるスブチリシンコーディング配列における
点変異の生成を示す図、

【図３８】精製野生型および変異体スブチリシンのアル
カリ性pHにおける自己消化安定性を示すグラフ、

【図３９】精製野生型および変異体スブチリシンのアル
カリ性pHにおける自己消化安定性を示すグラフ、

【図４０】残基１９７〜２２８にわたるランダムカセッ
ト変異誘発を含むプラスミドの構築を示す図、

【図４１】残基１９７〜２２８にわたるランダムカセッ
ト変異誘発に用いるオリゴデオキシヌクレオチドを示す
図、

【図４２】コドン２０４における変異体の構築を示す
図、

【図４３】コドン２０４における変異体の合成に用いる
オリゴデオキシヌクレオチドを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブライアン シー カニンガム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94611ピードモント オリーヴ アベニ ュー 24 (72)発明者 ロバート マーク コールドウェル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94109サンフランシスコ ブロードウェ イ 1828−101 (72)発明者 リチャード レイ ボット アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94010バーリンゲイム ヒルサイド ド ライヴ 3032 (72)発明者 デイヴィッド アーロン エステル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94043マウンテン ヴィュー ダイアブ ロー アベニュー 250 (72)発明者 スコット ダグラス パワー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94066サン ブルーノ オリーヴ コー ト 732 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．前駆体非ヒトカルボニルヒドロラーゼのアミノ酸配
   列から誘導されるアミノ酸配列を有するカルボニルヒド
   ロラーゼ変異体であって、Met50 、Ile107、Ser204、Ly
   s213、Met124＋Met222、Met50 ＋Met124＋Met222、Thr2
   2 ＋Ser87 、Ser24 ＋Ser87 、Met50 ＋Glu156＋Gly169
   ＋Tyr217、Ile107＋Lys213、Ser204＋Lys213及びMet50
   ＋Ile107＋Lys213から成る群から選ばれる、バシラス・
   アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens)スブ
   チリシンのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基または
   残基の組合せに対する異なるアミノ酸の置換が、部位Me
   t50 のアミノ酸置換がPhe であり、部位Ile107のアミノ
   酸置換がVal であり、部位Ser204のアミノ酸置換がCys
   、Leu 又はArg であり、部位Lys213のアミノ酸置換がA
   rg であり、部位Met124のアミノ酸置換がIle であり、
   部位Met222のアミノ酸置換がGln であり、部位Thr22 の
   アミノ酸置換がCys であり、部位Ser87 のアミノ酸置換
   がCys であり、部位Ser24 のアミノ酸置換がCys であ
   り、部位Glu156のアミノ酸置換がSer であり、部位Gly1
   69のアミノ酸置換がAla であり、部位Tyr217のアミノ酸
   置換がLeu である変異体をコードする変異体ＤＮＡ配
   列。 ２．前駆体非ヒトカルボニルヒドロラーゼのアミノ酸配
   列から誘導されるアミノ酸配列を有するカルボニルヒド
   ロラーゼ変異体であって、Met50 、Ile107、Ser204、Ly
   s213、Met124＋Met222、Met50 ＋Met124＋Met222、Thr2
   2 ＋Ser87 、Ser24 ＋Ser87 、Met50 ＋Glu156＋Gly169
   ＋Tyr217、Ile107＋Lys213、Ser204＋Lys213及びMet50
   ＋Ile107＋Lys213から成る群から選ばれる、バシラス・
   アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens)スブ
   チリシンのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基または
   残基の組合せに対する異なるアミノ酸の置換が、部位Me
   t50 のアミノ酸置換がPhe であり、部位Ile107のアミノ
   酸置換がVal であり、部位Ser204のアミノ酸置換がCys
   、Leu 又はArg であり、部位Lys213のアミノ酸置換がA
   rg であり、部位Met124のアミノ酸置換がIle であり、
   部位Met222のアミノ酸置換がGln であり、部位Thr22 の
   アミノ酸置換がCys であり、部位Ser87 のアミノ酸置換
   がCys であり、部位Ser24 のアミノ酸置換がCys であ
   り、部位Glu156のアミノ酸置換がSer であり、部位Gly1
   69のアミノ酸置換がAla であり、部位Tyr217のアミノ酸
   置換がLeu である変異体をコードする変異体ＤＮＡ配列
   を含む発現ベクター。 ３．前駆体非ヒトカルボニルヒドロラーゼのアミノ酸配
   列から誘導されるアミノ酸配列を有するカルボニルヒド
   ロラーゼ変異体であって、Met50 、Ile107、Ser204、Ly
   s213、Met124＋Met222、Met50 ＋Met124＋Met222、Thr2
   2 ＋Ser87 、Ser24 ＋Ser87 、Met50 ＋Glu156＋Gly169
   ＋Tyr217、Ile107＋Lys213、Ser204＋Lys213及びMet50
   ＋Ile107＋Lys213から成る群から選ばれる、バシラス・
   アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens)スブ
   チリシンのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基または
   残基の組合せに対する異なるアミノ酸の置換が、部位Me
   t50 のアミノ酸置換がPhe であり、部位Ile107のアミノ
   酸置換がVal であり、部位Ser204のアミノ酸置換がCys
   、Leu 又はArg であり、部位Lys213のアミノ酸置換がA
   rg であり、部位Met124のアミノ酸置換がIle であり、
   部位Met222のアミノ酸置換がGln であり、部位Thr22 の
   アミノ酸置換がCys であり、部位Ser87 のアミノ酸置換
   がCys であり、部位Ser24 のアミノ酸置換がCys であ
   り、部位Glu156のアミノ酸置換がSer であり、部位Gly1
   69のアミノ酸置換がAla であり、部位Tyr217のアミノ酸
   置換がLeu である変異体をコードする変異体ＤＮＡ配列
   を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。