JP2594533B2 - 変異ザブチリシンを製造する方法 - Google Patents

変異ザブチリシンを製造する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、適当な宿主中での組換え技術を用いた蛋白
質の生産およびその処置に関するものである。さらに詳
しくは、本発明はサブチリシンおよび中性プロテアーゼ
のような原核生物の(原核性)プロテアーゼを組換え微
生物宿主を用いて生産する方法、微生物宿主により外来
性蛋白質を合成させる方法、および酵素類の特性を改良
するための、該酵素の方向づけられた変異誘発法に関す
るものである。
本発明の背景 多くの細菌類は、そのライフサイクルのある時期にお
いてプロテアーゼを分泌することは知られている。桿菌
類(Bacillus)は2つの主要な細胞外プロテアーゼ、中
性プロテアーゼ(EDTAにより阻止されるメタロ(金属)
プロテアーゼ)およびアルカリ性プロテアーゼ(即ちサ
ブチリシン、セリン・エンドプロテアーゼ)を生産す
る。この両者は、その培養物が指数増殖期を過ぎ、定常
期に入って胞子形成を開始すると、最も多量に生産され
る。これらの2つのプロテアーゼの生理学的役割は明ら
かでない。それらは、胞子形成において役割を果してい
る(J.Hoch,1976,“Adv.Genet."18:69−98;P,Piggotら1
976,“Bact.Rev."40:908−962;およびF.Priest,1977,
“Bact.Rev."41:711−753)、細胞壁の改変に関与して
いる(L.Jolliffeら1980,“J.Bact"141:1199−1208)、
および捕捉酵素である(Priest,同上)などと推測され
てきた。プロテアーゼ遺伝子の発現の調整は複雑であ
る。胞子形成の初期の段階でブロックされたミュータン
トはアルカリ性および中性プロテアーゼ両者の生産量が
少ないので、それらは胞子形成と関連して協調的に調整
されていると思われる。さらに、プロテアーゼおよびそ
の他の分泌される遺伝子生産物、例えばアミラーゼおよ
びレバンサッカラーゼ(priest,前記)の発現レベルに
影響を与える多数の多形質発現ミューテーションが存在
している。
サブチリシンは工業および商業的な応用範囲が非常に
広い(英国特許第3623957およびJ.Millet,1970,“J.App
l.Bact."33:207)。例えばサブチリシンおよびその他の
プロテアーゼは通常洗剤として使用され、蛋白質に基づ
くしみを除去することができる。これらはまた、食品加
工にも使用され、食品材料中に存在する蛋白質用物質を
組成物中、所望の形にすることができる。
先行技術 照射および化学物質などの試剤および手段によって細
菌を変異誘発させる典型的な方法により、プロテアーゼ
の分泌が起る増殖期、そのタイミングおよび分泌された
プロテアーゼの活性レベルについて異なった性質を示す
多血症のミュータント株が生産される。しかし、その変
異誘発過程が基本的に不規則であり、所望の性質に近付
いた微生物を同定するのに必要な選択およびスクリーニ
ング法が冗長であるため、これらの株はその究極的な潜
在能力に近付いていない。さらにこれらのミュータント
はその親株、即ち野生型株に復帰することができる。こ
のような場合には所望の性質は失われてしまう。不規則
な変異誘発によって処理した場合、ミューテーションの
タイプや部位は解らないか、あるいはほとんど特性化で
きないので、復帰の可能性も解らない。このことは酵素
合成細菌に基づく工業的生産に著しい不安定を付与する
ことになる。最後に、古典的な変異誘発法は、過度の未
熟溶菌のような望ましくない性質を、例えばプロテアー
ゼレベルの低下のような望ましい表現形質と共に表わす
ことが多い。
桿菌類によって分泌されるプロテアーゼに関しては特
別の問題が存在している。その1つは、そのようなプロ
テアーゼは少なくとも2種存在しているので一方のみの
欠落をスクリーニングすることが難しいことである。さ
らに、胞子形成およびプロテアーゼ生産の両者に影響を
与える多数の多形質発現ミューテーションは、真のプロ
テアーゼミューテーションの分離を困難にする。
中性プロテアーゼ遺伝子の温度感受性ミュータントが
通常の変異誘発技術により得られており、Bacillus sub
tilisのクロモゾーム(染色体)中の調節および構造遺
伝子の位置を決めるのに使用されている(H.Ueharaら19
79,“J.Bact."139:583−590)。さらにアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子の推定ナンセンスミューテーションが報
告されている(C.Roitschら1983,“J.Bact."155:145−1
52)。
不活性なセリンプロテアーゼまたは非常に減少した濃
度のセリンプロテアーゼを生産する桿菌の温度感受性ミ
ュータントが単離されている。しかしこれらのミュータ
ントは無胞子性であり、約10-7〜10-8の野生型への復帰
頻度を示す(F.Priest同上719頁)。これらのミュータ
ントは外来性蛋白質の組換体による生産には不適当であ
る。と言うのは、無胞子性ミュータントは胞子形成ミュ
ータントより最少培地中でのその増殖サイクルの初期の
段階において溶菌する傾向があり、そのため細胞内容物
(細胞内プロテアーゼを含む)が培養上清中に未成熟で
放出されるからである。野生型復帰体は培養上清を、そ
れが分泌したプロテアーゼで汚染するので、復帰の可能
性を有することも望ましくない。
桿菌類(Bacillus sp.)は外来性蛋白質の発現用とい
て提案されたが、分泌されたプロテアーゼが存在し、所
望の生産物がそれによって強力に加水分解されるため、
外来性蛋白質発現のための宿主として桿菌類を商業的に
受入れることが遅れてきた。胞子形成をすることがで
き、増殖期に胞子形成に関連してプロテアーゼを発現し
ないBacillus megateriumミュータントが報告されてい
る。しかし採用された分析法は他のプロテアーゼ類の存
在を除外しなかったし、問題のプロテアーゼは胞子形成
期には発現される(C.Loshonら1982,“J.Bact."150:303
−311)。勿論これは、外来性蛋白質が培養中に蓄積
し、傷つきやすい時期である。
本発明の目的 本発明の目的は、増殖サイクルのあらゆる時点におい
て細胞外中性およびアルカリ性プロテアーゼを実質的に
含んでおらず、実質的に正常な胞子形成特性を示す桿菌
株を組立てることである。外来性(ヘテロロ−ガス)ま
たは内性(ホモローガス)の蛋白質を発現するためのコ
ピー数の高いプラスミドで形質転換し得る復帰不能の微
生物、さもなくば正常なプロテアーゼを含んでいない微
生物が要求されている。
入手し得るストックのものとは異なる性質を持った酵
素類が要求されている。特に、強力な酸化安定性を有す
る酵素類は、洗濯物に使用されるプロテアーゼの漂白適
合性および貯蔵寿命を延すのに有用であろう。同様に、
酸化安定性の低いものは、酵素活性の迅速なかつ効率的
な消滅を必要とする工業的生産において有用であろう。
酵素のpH活性プロフィルを改良することは、その酵素
を各種のプロセスにおいてより有効にするのに役立つで
あろう。例えばプロテアーゼのpH活性プロフィルを拡げ
れば、アルカリ性および中性の洗濯物の両者に適した酵
素が得られるであろう。このプロフィルを狭くすると、
特に修正した基質特異性と一緒にすると、酵素は混合物
中でより適合性のあるものとなるであろう(後述)。
原核生物のカルボニル水解酵素(原核性カルボニル水
解酵素)(基本的にはプロテアーゼであるがリバーゼも
含む)を突然変異させると、多種多様の水解酵素、特に
Km、Kcat、Km/Kcat比および基質特異性に於いて改良さ
れた特性を持ったものが得られる。これらの酵素は、例
えばペプチド製造あるいは洗濯に使用するなどの加水分
解工程において存在すると予測される特定の基質用に修
正することができる。
酵素の科学的な改変は知られている。例えばI.Scinds
en,1976.“Carlsberg Res.Commun."41(5):2327−29
1参照。しかしこれらの方法は、都合のよいアミノ酸残
基が存在していることに依存しており、共通の側鎖を持
った全ての感受性の残渣を改良するという点において非
特異的であることが多く、さらに、加工、例えば変性さ
せることなく(これは一般に活性を再設立する上におい
て完全に復帰不能である)、非感受性のアミノ酸残基に
達することができないという欠点を有している。このよ
うな方法は1つのアミノ酸残基側鎖を他の側鎖または等
価の機能体で置換えることを目的としているので、その
限りにおいては変異誘発法がこのような方法にとって代
わることができる。
cys残基をセリンに変換することからなる、tRNA合成
酵素の予定された、部位指定性の変異誘発法が報告され
ている(G.Winterら1982,“Nature"299:756−758:A.Wil
kinsonら1984,“Nature"307:187−188)。この方法は大
規模な変異誘発には実際的ではない。本発明は飽和変異
誘発(saturation mutagenesis)によりDNAを変異させ
るための簡便、迅速な方法を提供するものである。
本発明の要約 本明細書には、組換え宿主細胞中でサブチリシンおよ
び中性プロテアーゼのような原核生物のカルボニル水解
酵素(カルボニルヒドロラーゼ)を生産する方法が記載
されており、この方法はプロ、プレ、またはプレプロ型
のこれらの酵素を含む所望のサブチリシンまたは中性プ
ロテアーゼを暗号化している配列を含んだ発現ベクター
を使って宿主を形質転換し、その宿主を培養し、所望の
酵素を回収するものである。この暗号配列は後に詳述す
るように、天然のものと正確に対応している場合もあ
り、生産される蛋白質に望ましい性質を付与する改良部
分を含んでいる場合もある。
次いでこの新規な株を、このような操作をしなければ
その宿主株中で発現されないポリペプチドを暗号化して
いる少なくとも1つのDNA部分で形質転換し、その形質
転換された株を培養し、ポリペプチドをその培養物から
回収する。このDNA部分は、真核生物(酵母または哺乳
動物)の蛋白質を暗号化しているDNAであってもよい
が、通常は宿主桿菌遺伝子の方向づけられたミュータン
トである。この新規な株はまた、その宿主ゲノム以外の
起源由来の細菌性遺伝子から発現される淡白椎、あるい
はこれらの外来性遺伝子またはその宿主ゲノムからのホ
モローガス遺伝子を発言するベクターのための宿主とし
ても役立つ。後者の場合、中性プロテアーゼまたはサブ
チリシンを含んでいないアミラーゼのような酵素が得ら
れる。さらに、酵素的に活性なサブチリシンを含んでい
ない中性プロテアーゼを培養で得ることができ、またそ
の逆も可能である。
原核生物のカルボニル水解酵素のためのクローンした
遺伝子をコピー数の高いプラスミドに結合させ、親細胞
に比べてはるかに高い収率でこの酵素を合成することが
できる。本明細書においてはまた、水解酵素の改変型を
開示しており、これにはプロおよびプレプロチモーゲン
型の酵素、そのプレ型、および方向づけられたそのミュ
ーテーションが含まれている。
蛋白質の暗号領域内のあらゆる部位において多数のミ
ューテーションを迅速かつ効率的に生成させ得る飽和変
異誘発のための好適な方法は以下の工程からなる: (a)前駆体(プレカーサー)蛋白質の少なくとも一部
を暗号化しているDNA部分を得、 (b)その部分内の領域を同定し、 (c)その領域内にすでに存在しているヌクレオチドを
ヌクレオチドで置換えてその部分に特殊な少なくとも1
種の制限酵素部位を作り、これにより、発現されたとき
にその領域によって暗号化されているアミノ酸を変える
ことなく、その同定された領域に対する特殊な制限部位
を5′および3′に利用できる様にし、 (d)5′および3′末端に工程(c)で導入された制
限酵素部位とアニーリングすることができる配列を含ん
でおり、該DNA部分に結合させた場合、該前駆体蛋白質
が、その内部における少なくとも1個のアミノ酸が置
換、欠落(切除)および/または挿入された形で発現さ
れるような複数のオリゴヌクレオチドを合成し、 (e)その特異な部位を開裂し得る制限酵素で工程
(c)のDNA部分を消化し、そして、 (f)工程(d)のオリゴヌクレオチドのそれぞれを工
程(e)の消化した部分に結合させ、複数のミュータン
トDNA部分を得る。
上記の方法またはその他の既知の方法により、原核生
物のカルボニル水解酵素を暗号化している分離したDNA
にミューテーションを導入すると、そのDNAを発現した
場合、水解酵素の予定された部位に少なくとも1個のア
ミノ酸の置換、欠落(切除)または挿入が起る。この方
法は野生型蛋白質のミュータントを作成するのに(この
場合、「前駆体」蛋白質は野生型である)またはミュー
タントを野生型に返すのに(この場合「前駆体」はミュ
ータントである)有用である。
前駆体酵素と異なる酸化安定性および/またはpH活性
プロフィルを示すミュータント酵素を回収する。このよ
うにして種々のKm、Kcat、Kcat/Km比を持ち、基質特異
性を有する原核生物カルボニル水解酵素が得られる。
本発明方法によって得られるミュータント酵素を、常
法により界面活性剤や洗浄剤と混合し、洗剤工業あるい
はその他の洗浄技術分野において有用な新規な組成物を
得ることができる。
図面の説明 第1図は機能的B.amyloliquefaciensサブチリシン遺
伝子の配列を示す模式図である。
第1図のAにおいてはB.amyloliquefaciensゲノムの
1.5kbフラグメント上に、プロモーターおよびリボソー
ム結合部位を含んだB.amyloliquefaciensのための全機
能配列が存在している。
第1図のBはその暗号鎖のヌクレオチド配列を、蛋白
質のアミノ酸配列と関連させて示している。そのDNA配
列のプロモーター(p)、リボソーム結合部位(rbs)
および終止(term)領域も示されている。
第2図はプール1(パネルA)およびプール2(パネ
ルB)でそれぞれプローブした純化陽性クローンのレプ
リカ・ニトロセルロース・フィルターの結果を示すグラ
フである。
第3図はサブチリシン発現プラスミド(pS4)の制限
分析を示している。pBS42ベクター配列(4.5kb)は実線
で、挿入配列(4.4kb)は点線で示してある。
第4図はpBS42およびpS4で形質転換した培養物からの
上清について行なったSDS−PAGEの結果を示すグラフで
ある。
第5図はシャトルベクターpBS42の構成を示してい
る。
第6図はB.stbtilisサブチリシン遺伝子を含む配列の
制限地図を示す模式図である。
第7図は機能的なB.subtilisサブチリシン遺伝子の配
列を示す模式図である。
第8図はB.subtilisサブチリシン遺伝子の欠失ミュー
タントを得るための組立法を示す模式図である。
第9図はB.subtilis中性プロテアーゼ遺伝子の制限地
図を示す模式図である。
第10図はB.subtilis中性プロテアーゼ遺伝子のヌクレ
オチド配列を示す模式図である。
第11図はB.subtilis中性プロテアーゼ遺伝子を含んで
いるベクターの組立を示す模式図である。
第12,13および16図は本発明方法による変異誘発技術
の具体例を示す模式図である。第12図中、1は野生型の
DNA配列、2はΔp 222DNA配列、3はKpn IおよびPst I
で切断されたΔp 222、4はオリゴヌクレオチドプール
と結合した切断Δp 222を示す。第13図中、1は野生型D
NA配列、2はΔp 166、3はSac IおよびXma IIIで切断
したΔp 166、4はオリゴヌクレオチドプールに結合さ
せた切断Δp 166を示す。第16図はG−169飽和変異誘発
を示しており、1は野生型DNA配列、2はΔp 169DNA配
列、3はKpn IおよびEcoRVで切断したΔp 169、4はオ
リゴヌクレオチドプールに結合させた切断Δp 169を示
す。
第14図はサブチリシンミュータントの強化された酸化
安定性を示すグラフである。図中、AはAla−222ミュー
タント、CはCys−222ミュータント、●はMet−222(W
T)を示す 第15図は野生型酵素と比較した場合のサブチリシンミ
ュータントのpH活性プロフィルの変化を示すグラフであ
る。○はC−222、●はWTである。
詳細な説明 原核生物のカルボニル水解酵素は、O=C−X結合
(Xは酵素または窒素)を含んでいる化合物を加水分解
する酵素である。これらには、基本的に加水分解酵素例
えばリパーゼ、およびペプチド加水分解酵素例えばサブ
チリシンまたはメタロプロテアーゼなどが含まれる。ペ
プチド加水分解酵素には、α−アミノアシルペプチドヒ
ドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシル
アミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、
メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナー
ゼ、カルボキシルプロテイナーゼおよびメタロプロテイ
ナーゼなどが含まれる。セリン、メタロ、チオールおよ
び酸プロテアーゼも、エンドおよびエキソプロテアーゼ
と同様に含まれる。
サブチリシンは通常、蛋白質またはペプチドの内部ペ
プチド結合を開裂させるセリンプロテイナーゼである。
メタロプロテアーゼは活性を現わすのに金属イオンのコ
ファクター(副因子)が必要なエキソまたはエンドプロ
テアーゼである サブチリシンや中性プロテアーゼには多数の天然のミ
ュータントが存在しており、これらは全て出発遺伝子材
料のソースとして同等の効果で使用することができる。
これらの酵素およびその遺伝子は多くの原核生物から
入手できる。好適な例はグラム陰性の微生物、例えばE.
coliまたはシュードモナスおよびグラム陽性菌、例えば
マイクロコッカスまたは桿菌(バチルス)である。
カルボニル水解酵素を暗号化している遺伝子は本明細
書の一般的な方法に従って得ることができる。実施例か
ら明らかなように、この方法は、問題の水解酵素領域を
暗号化している推定配列を持った標識したプローブを合
成し、この水解酵素を発現する微生物からゲノムライブ
ラリーを調製し、そしてプローブに対するハイブリダイ
ゼーションにより、問題の遺伝子についてこのライブラ
リーをスクリーニングすることからなる。次いで陽性の
ハイブリダイズしたクローンを位置づけ、配列を決定す
る。クローンした遺伝子を、宿主中での複製に必要な領
域を持った発現ベクター(これもクローニングベクター
であってよい)に結合させ、そのプラスミドを宿主にト
ランスフェクトして酵素を合成させ、その組換え宿主細
胞を酵素合成に有利な条件下で、通常抗生物質の存在に
より与えられる選択圧の下で(これに対する耐性はベク
ターにより暗号化されている)で培養する。このような
条件下で培養すると、形質転換されるのが親の微生物で
あっても、その野生型の親の微生物の酵素合成よりも遥
かに高い効率で酵素が生産される。
「発現ベクター」とは、適当な宿主中でDNAを発現さ
せ得る適当なコントロール(調節)配列に機能的に結合
している(operably linked)DNA配列を含有しているDN
A構成物を意味する。このようなコントロール配列には
転写を司るプロモータ、このような転写を調節する、場
合により存在するオペレータ配列、適当なmRNAリボソー
ム結合サイトを暗号化している配列および転写および翻
訳の終了を支配する配列などが含まれる。ベクターはプ
ラスミド、ファージ粒子または単に潜在的なゲノム挿入
物であってよい。ベクターを適当な宿主に導入すると、
このベクターは複製することができ、宿主ゲノムとは独
立に機能し、またある場合にはそのゲノム自体に組み込
まれることもある。本明細書において「プラスミド」と
「ベクター」とは交換可能に使用することがある。それ
はプラスミドは現在において最も普通に使用されるベク
ターの形態であるからである。しかし本発明は同等の機
能を営む現在知られている、あるいは将来知られるであ
ろう発現ベクターのあらゆる形をも包含するものであ
る。
「組換え宿主細胞」とは、組換えDNA技術を使って組
立てられたベクターで形質転換またはトランスフェクト
された細胞を意味する。本発明においては、組換え宿主
細胞は、原核生物のカルボニル水解酵素を暗号化してい
る発現ベクターによって形質転換されたものであるの
で、その水解酵素を種々の形で生産するものを意味す
る。この組換え宿主細胞は形質転換前に1つの形のカル
ボニル水解酵素を生産したものであってもよく、また生
産しなかったものであってもよい。
「機能的に結合」という用語を2つのDNA領域の関係
について用いる場合、それらが互いに機能的に関連し合
っていることを意味する。例えば1つのプレ配列を、も
しそれが信号配列として機能するならば、ペプチドと機
能的に結合させると、これは蛋白質の成熟型の分泌に関
与しほとんどの場合信号配列の開裂に関係する。プロモ
ーターを暗号配列に機能的に結合させると、それはその
暗号配列の転写を支配する。リボソーム結合サイトは、
それを翻訳可能なように位置づけると、それは暗号配列
と機能的に結合されたことになる。
「プロヒドロラーゼ」とは、酵素を不活性化する追加
のN末端アミノ酸残基を含んでいる水解酵素であって、
その残基が除去されたとき酵素となる水解酵素を意味す
る。多くの蛋白質分解酵素は変換性プロ酵素産物として
天然に存在し、ポスト−翻訳産物が存在しないとこの形
で発現される。
「プレ配列」とは、水解酵素の分泌に関与する、水解
酵素のN末端部分に結合したアミノ酸の信号配列を意味
する。プレ配列も、本明細書に記載した同じ方法で改変
してもよく、これには予定したミューテーションを導入
することが含まれる。水解酵素と結合すると、目的とす
る蛋白質は「プレヒドロラーゼ」になる。従って、本発
明の目的に叶うプレヒドロラーゼはプレサブチリシンお
よびプレプロサブチリシンである。プレピドロラーゼ
は、プレプロ暗号領域から、「プロ」配列(あるいは酵
素を不活性な状態に維持する、そのプロ配列の少なくと
もその部分)を削除し、次いでそのプレヒドロラーゼを
発現させることにより生産される。このようにすると生
物はプロ酵素ではなく活性酵素を分泌する。
このクローンしたカルボニルヒドロラーゼを使って、
その水解酵素を発現させるために宿主細胞を形質転換す
る。既述したように、洗濯物におけるサブチリシンのよ
うに、水解酵素がその改変されない形で工業的に使用し
得る場合には、このことは興味ある事実である。好まし
い実施態様では、ピドロラーゼ遺伝子はコピー数の高い
プラスミドに結合させる。このプラスミドは宿主中で、
それが以下に述べるようなプラスミドの複製に必要なよ
く知られた要素を含んでいるという意味において複製さ
れる:問題の遺伝子に機能的に結合したプロモーター
(これは、もしそれが認識されるならば、すなわち宿主
細胞によって転写されるならば、その遺伝子自身のホモ
ローガスプロモーターとして供給されてもよい)、転写
終了およびポリアデニル化領域(宿主細胞によって転写
されたmRNAの、そのヒドロラーゼ遺伝子に対する安定性
のために必要である)(これは外来性であるかまたはそ
のヒドロラーゼ遺伝子の内性終止領域によって供給され
る)および望ましくは抗生物質含有培地中で、プラスミ
ドで感染された宿主細胞の増殖を連続的に維持し得る抗
生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子。コピー数の多い
プラスミドは、また宿主のための複製起源を含んでお
り、これにより染色体の制限を受けることなく細胞質内
で多数のプラスミドが生成する。しかしヒドロラーゼ遺
伝子の複数のコピーを宿主ゲノムに組込むことも本発明
の範囲に含まれる。これはホモローガスな組換えに特に
感受性のある細胞株によって促進される。得られた宿主
細胞は組換え宿主細胞と呼ばれる。
カルボニルヒドロラーゼ遺伝子をクローンしたら、そ
の遺伝子の用途を野生型または前駆体酵素の合成を凌駕
して強化するために種々の改変を行なう。前駆体酵素
は、本明細書に記載した方法で改変する前の酵素であ
る。通常この前駆体は、この方法に従って改変されたDN
Aを付与した微生物によって発現される酵素である。本
発明でいう「前駆体」とは、前駆体酵素それ自体を操作
することにより生成酵素を作る時の前駆体を意味するも
のではないと解すべきである。
この改変の最初のステップとして、ホモローガス遺伝
子を含んでいる組換え陽性(rec+)微生物からその遺伝
子を削除してもよい。これはクローンした遺伝子のイン
ビトロ欠失ミューテーションを微生物のゲノムと組換え
ることにより達成することができる。E.coliや桿菌のよ
うに多くの微生物株が組換え可能であることが知られて
いる。必要なのは、候補宿主のホモローガス領域と組換
えられる欠失ミュータントからの残りのDNAの領域であ
る。この欠失は暗号領域内であってもよく(酵素的に不
活性なポリペプチドを残す)あるいはまたホモローガス
な境界領域(例えばプロモーターまたは終止領域)が宿
主に存在する限りは全暗号領域を含んでいてもよい。宿
主が欠失ミュータントとの組換えを受け入れたかどうか
は、形質転換された表現形質の欠失についてスクリーニ
ングすることにより決定される。これは、カルボニルヒ
ドロラーゼの場合には、本来水解酵素によって加水分解
される染色体性の基質を開裂する能力を失っているかど
うかを宿主培養物について分析することにより容易に達
成することができる。
プロテアーゼ欠失ミュータントを含んだ形質転換宿主
は、蛋白質分解酵素と適合しない生産物を合成するのに
有用である。このような宿主は、ここに記載した欠失プ
ロテアーゼを分泌することはできないが事実上正常に胞
子形成を行なう。さらに、この形質転換体のその他の増
殖特性は親の微生物と実質的に同じである。このような
微生物は、その親細胞よりも外来性蛋白質の不活性化に
おいて活性が低く、そしてこれらの宿主は、既知のプロ
テアーゼ欠失微生物よりも優れた増殖特性を持っている
という点で有用である。しかし本発明方法に従って中性
プロテアーゼおよびサブチリシンを欠失させるというこ
とは、桿菌のすべての蛋白質分解活性を除去するという
ことではない。通常細胞外には分泌されない細胞内プロ
テアーゼは培養の後期には「漏れ」たりまたはその細胞
から拡散すると考えられている。これらの分子内プロテ
アーゼは、それらの酵素がここで定義されているよう
に、サブチリシンまたは中性プロテアーゼであってもよ
く、そうでないかもしれない。従って本発明の新規な桿
菌株は、通常その親株において細胞外に分泌されるサブ
チリシンおよび/または中性プロテアーゼ酵素を分泌す
ることができない。「できない」とは野生型に復帰しな
いことを意味する。復帰は従来知られているプロテアー
ゼを欠落した天然株に関して存在している有限の可能性
である。というのは、このような株の表現形質は容易に
復帰し得るミューテーション、例えば点変異の関数でな
いという保証はないからである。これを本発明で提供す
る極めて大きな欠失と比較すべきである。
本発明に係る欠失ミュータント−形質転換宿主細胞
は、第1図,第7図または第10図に示した遺伝子と実質
的に相同であると定義される遺伝子であって、酵素的に
活性な中性プロテアーゼまたはサブチリシンを暗号化し
ている遺伝子を含んでいない。「相同」な遺伝子は、第
1,7または10図に示した遺伝子と、極めて厳密な条件下
でハイプリダイズし得る暗号領域を含んでいる。
カルボニルヒドロラーゼ欠失ミュータントを含んでい
る微生物株は2つの基本的なプロセスにおいて有用であ
る。1つの態様では、通常宿主によって発現される、そ
の欠失遺伝子によって暗号化された蛋白質で汚染されて
いないことが望ましい生産物を発酵生産するのに好都合
である。1つの例はアミラーゼの発酵合成であり、この
場合不純物としてのプロテアーゼがアミラーゼの工業的
使用において各種の妨害をする。本発明に係る新規な株
は、このような生産物から夾雑カルボニルヒドロラーゼ
を除去するという負担を軽減させるものである。
2番目の重要な実施態様では、サブチリシンおよび中
性プロテアーゼ欠失−ミュータント株は、本来その株に
よって暗号化されていない蛋白質を合成するのに有用で
ある。これらの蛋白質は2つのクラスの何れかである。
最初のクラスは宿主のそれと実質的な形質転換前の相同
性を示さない遺伝子によって暗号化されている蛋白質か
らなる。これらはその他の原核生物からの蛋白質であっ
てもよいが、しかし通常は、酵母または高等な真核生
物、特に哺乳類からの真核性蛋白質である。発現された
ホモローガスでない蛋白質を原核生物が分解する可能性
が減少するので、本発明に係る新規な株は、そのような
蛋白質を暗号化している遺伝子を含有している発現可能
なベクターのための有用な宿主として役立つのである。
第2のグループは、宿主のそれと実質的に形質転換前
相同性を示すミュータント宿主遺伝子からなる。これに
は微生物のもの(レンニン例えばムコール属からのレン
ニン)と同様、サブチリシンおよび中性プロテアーゼの
ような原核生物のカルボニルヒドロラーゼのミューテー
ションが含まれる。これらのミュータントは、工業的に
使用するための前駆体酵素の性質を改善するために選択
される。
本発明方法はこのようなミュータントの組立ておよび
同定を行なう新規な方法を提供するものである。まずヒ
ドロラーゼを暗号化している遺伝子を得、その全部ある
いは一部の配列決定を行なう。次いでその配列を精査し
て、発現される酵素の1もしくはそれ以上のアミノ酸の
ミューテーション(削除、挿入または置換)を作成する
のに望ましい場所を決定する。この点に接している配列
に、発現されたときに各種のミュータントをコードする
ことになるオリゴヌクレオチドプールでその遺伝子の短
いセグメント(断片)を置換するための制限サイトが存
在しているかどうかを評価する。選択された点から好適
な距離(10〜15ヌクレオチド)内の場所に特異な制限部
位は通常存在しないので、その遺伝子のヌクレオチド
を、最終的な組み立て物において解読枠も暗号化されて
いるアミノ酸も変化しないように、置換することによっ
てそのような部位を生成させる。好適な隣接領域の位置
づけ、および必要な変化を評価して2つの特異な制限部
位配列に到達するための仕事は、遺伝暗号の重剰性、そ
の遺伝子の制限酵素地図および多数の異なった制限酵素
によって常法通り行なう。もし偶然に1つの隣接する特
異な制限部位が利用できるような場合には、上の方法は
その部位を含有してない隣接領域に関してのみ使用す
る。
その配列を変化させ所望の配列にするための遺伝子の
ミューテーションは、常套の方法に従ってM13プライマ
ーエクステンション(延長)によって行なう。この遺伝
子をクローンしたら、それを特異な制限酵素で消化し、
多数の最終的な末端相補性オリゴヌクレオチドカセット
をその特異な部位に結合させる。オリゴヌクレオチドは
全て同じ制限部位を持つように合成することができ、か
つ、制限部位を作成するのに合成リンカーが必要でない
ので、この方法によって変異誘発が極めて単純化され
る。
問題の遺伝子中に存在していない部位を持った市販の
制限酵素の数は非常に多い。適当なDNA配列コンピュー
ターサーチ・プログラムを使用すれば潜在的な5′およ
び3′特異隣接部位を見出すのが簡単になる。基本的な
制約は、制限部位の作成で導入されるミューテーション
は全て最終的に組立てられたアミノ酸暗号配列に対して
サイレントでなければならないということである。標的
コドンに対して5′の候補制限部位については、配列
は、その候補酵素の切断に対して5′の認識配列中に少
なくとも、1つを除く全てのヌクレオチドを含んでいる
遺伝子内に存在していなければならない。例えば、もし
近くの5′配列がNCC、CNCまたはCCNを含んでいるなら
ば、平滑切断酵素Sma I(CCC/GGG)が5′候補となるだ
ろう。さらに、もしNをCに変えなければならない場
合、この変換はアミノ酸暗号配列を無傷にしておかなけ
ればならない。制限部位を導入するのに永久的なサイレ
ントミューテーションが必要は場合、滅多に使用しない
コドンの導入を避けたいと考えるであろう。Sma Iにつ
いての同様の状況が、配列NGG、GNG、またはGGNが存在
しなければならないことを除いて3′隣接部位に適用さ
れる。候補酵素を位置づけるためのこの制限は、平滑切
断酵素については最も緩和であり、4塩基突き出し酵素
については最も厳格である。一般に多くの候補部位を利
用することができる。ここに述べたコドン−222標的に
ついては、Kpn I部位から1塩基対5′にBal I部位(TG
G/CCA)を手術することができた。3′EcoRV部位(GAT/
ATC)はPst I部位に向って11塩基対5′を使用すること
ができた。平滑末端から4縁切突き出しに渡る末端を持
ったカセットは容易に機能するであろう。回顧すると、
この仮定のEcoRV部位は使用したオリゴヌクレオチドカ
セットを極めて短くし(9および13塩基対)、かくして
純度を上げプールバイアスの問題を低くしたことであろ
う。オリゴヌクレオチドカセットの結合が一方向に保証
され得るように隣接部位はそれ自体が結合できないもの
を選択すべきである。
ミューテーション自体は予め決定する必要はない。例
えばオリゴヌクレオチドカセットまたはフラグメントは
ニトロソグアニジンあるいはその他の突然変異誘導物質
で無秩序に変異誘発させ、それを予め決められた場所で
ヒドロラーゼ遺伝子に結合させる。
適当な宿主に形質転換することによって発現されたミ
ュータントカルボニルヒドロラーゼは、所望の特性、例
えば基質特異性、酸化安定性、pH活性プロフィルなどを
示す酵素についてスクリーニング(選択)する。
基質特異性の変化は、前駆体酵素のKcat/Km比とその
ミュータントのそれとの違いによって決められる。Kcat
/Km比は触媒効率の大きさを現わしている。Kcat/Km比が
増加または減少した真核生物のカルボニルヒドロラーゼ
については実施例に記載してある。一般に目的とすると
ころは、与えられた基質に対して大きなKcat/Km比(数
字で言えば大きな比)を持ったミュータントを確保する
ことであり、これによって標的基質に対して酵素をより
効率よく使用することができるのである。ある基質に対
してKcat/Km比が増加すると別の基質に対するKcat/Km比
が減少するということがある。これは基質特異性のシフ
トであり、このようなシフトを示すミュータントは、前
駆体が望ましくない場合に利用価値があり、例えば基質
混合物中の特定の基質の望ましくない加水分解を防止す
ることができる。
KcatおよびKmは既知の方法あるいは実施例18に記載の
方法に従って測定する。
酸化安定性は、実施例に記載したミュータントによっ
て達成されるもう1つの目標である。この安定性は各種
の使用目的に応じて強化したり減少したりすることがで
きる。安定性は1もしくはそれ以上のメチオニン、トリ
プトファン、システインまたはリジン残基を削除し、場
合によりメチオニン、トリプトファン、システインまた
はリジンの1つではない他のアミノ酸残基で置換えるこ
とにより強化される。その反対の置換を行なうと酸化安
定性が減少する。置換された残基は好ましくはアラニル
であるが中性残基も好適である。
改変されたpH活性プロフィルを示すミュータントも得
られる。pH活性プロフィルは酵素活性に対するpHのプロ
ットであり、実施例19に例示したように、あるいは既知
の方法で作成することができる。より広いプロフィルを
持ったミュータント、すなわちあるpHにおいてその前駆
体よりも強い活性を有するが、如何なるpHにおいても顕
著に強い活性を示さないミュータントあるいはより鋭い
プロフィルを持ったミュータント、すなわちある一定の
pHではその前駆体と比べて強い活性を有するのがその他
のpHではより低い活性を持ったミュータントを得るのが
好ましい。
上記のミュータントは好ましくはその酵素の活性部位
内で調製する。と言うのはこれらのミューテーションは
活性に最も影響を与えそうであるからである。しかし酵
素の安定性または形態にとって重要なその他の部位での
ミュータントも有用である。桿菌のサブチリシンまたは
そのプレ、プレプロおよびプロ型の場合、チロシン−
1、アスパルテート+32、アスパラギン+155、チロシ
ン+104、メチオニン+222、グリシン+166、ヒスチジ
ン+64、グリシン+169、フェニルアラニン+189、セリ
ン+33、セリン+221、チロシン+217、クルタメート+
156および/またはアラニン+152におけるミューテーシ
ョンによって上記の特性またはその酵素のプロセシング
において変化したミュータントが得られる。これらのア
ミノ酸の位置番号は第7図から明らかなようにB.amylol
iquefaciensのサブチリシンに対して決められたもので
ある。削除または挿入を行なうと与えられた位置からN
末端方向において対応するアミノ酸の位置がシフトし、
残部はその元の位置すなわち野生型の位置番号を取らな
くなることは理解されるであろう。また、対立遺伝子の
違いおよび各種の原核生物種の中での変動によって位置
のシフトが起り、従ってそのようなサブチリシンの位置
169はグリシンでは占められなくなるであろう。このよ
うな場合グリシンの新しい位置は、グリシン+169とい
う定義であらわされ、その範囲に包含される。グリシン
+169に対する新しい位置は第7図のグリシン+169に相
同な領域について問題のサブチリシンを精査することに
より容易に同定される。
1もしくはそれ以上のアミノ酸残基、通常約10個まで
のアミノ酸残基を変異させ得る。しかし商業的な実際性
を除けばミューテーションの数に制限はない。
本発明の酵素は塩の形で得ることもできる。蛋白質の
イオン化状態は、もしそれが溶液中にある場合は、その
周囲の媒質のpHに依存し、もしそれが固状の形である場
合はそれが調製された溶液のpHに依存することは明らか
である。酸性の蛋白質は通常、例えばアンモニウム塩、
ナトリウム塩またはカリウム塩として調製され、塩基性
蛋白質は塩酸塩、硫酸塩または燐酸塩として調製され
る。従って、本発明は、カルボニルヒドロラーゼの電気
中に中性のもの、および塩の形のものの両者を含み、カ
ルボニルヒドロラーゼという用語はイオン化状態に関係
なく有機化学の基本的な構造を指すものとする。
本発明のミュータントは特に食品加工および洗浄技術
において有用である。ミュータントを包含するこのカル
ボニルヒドロラーゼは本明細書に記載した発酵法により
製造され適当な技術で回収される(例えばK.Anstrup,19
74,Industrial Aspects of Biochemistry,ed.B.Spencer
23−46頁参照)。これらは自体既知の方法で洗剤または
他の界面活性剤とともに製剤化され、工業的過程、特に
洗剤技術において使用される。後者の場合、この酵素は
蛋白質分解酵素の分野でよく知られているように洗剤、
ビルダー、漂白剤および/または螢光漂白剤と混合す
る。好適な洗剤には直鎖状アルキルベンゼンスルホネー
ト、アルキルエトキシ化サルフェート、硫酸化直鎖状ア
ルコールまたはエトキシ化直鎖状アルコールなどが含ま
れる。この組成物は粒状または液状に製剤化することが
できる(例えば米国特許3623957号、4404128号、438124
7号、4404115号4318818号、4261868号、4242219号、414
2999号、4111855号、4011169号、4090973号、3985686
号、3790482号、3749671号、3560392号、3558498号およ
び3557002号参照)。
以下に本発明の実施態様を記載するが本発明はこれに
よって限定されるものと解釈してはならない。
実験操作における用語の解説 実施例を簡単にするために、度々使用する方法は簡単
な用語によって表わす。
プラスミドは大文字および/または数値を前および/
または後に付けた小文字のpで表わす。本発明で使用す
る出発プラスミドは市販されているか、無制限に利用可
能であるか、あるいはそのような入手可能なプラスミド
から既知の方法に従って組立てることができる。
「Klenow処置」とは、2本鎖DNAの凹んだ3′末端
を、ヌクレオチドに相補的なデオキシリボヌクレオチド
で満たして、そのDNA鎖の突出した5′末端を作成する
過程を言う。この方法は通常DNAの制限酵素開裂によっ
て生成した凹んだ末端を満たすのに使われる。これによ
ってその後の結合に必要な平滑末端が作られる。Klenow
処置は、触媒的に活性な量の(通常10単位)E.coli DN
AポリメラーゼIのKlenowフラグメント(「Klenow」)
の存在下、満たすべきDNAと適当な相補的デオキシリボ
ヌクレオチドと反応させることにより(通常15℃で15分
間)達成される。Klenowおよびその他の必要な試薬は市
販されている。この方法については多数の報告がある
(後えばT.Maniatisら1982Molecular Cloning107−108
頁参照)。
DNAの「消化」とは、そのDNAのある部位だけに作用す
る酵素によってそのDNAを触媒的に開裂することを言
う。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、それぞれの酵
素に特異な部位を制限部位と呼ぶ。「部分的」消化とは
制限酵素による不完全な消化を意味し、DNA基質中の、
与えられた制限エンドヌクレアーゼの開裂部位の幾つか
が開裂されるが全てが開裂されないような条件を選んで
行なわれる。本発明で使用した各種の制限酵素は市販さ
れており、その反応条件、コファクターおよびその他の
必要な事項は、その酵素の供給者によって確立されたも
のを使用した。制限酵素は通常、大文字およびそれにつ
づくその他の文字および通常その制限酵素が初めて得ら
れた微生物を表わす番号で構成される略号によって表わ
される。通常約1μgのプラスミドまたはDNAフラグメ
ントは、約20μの緩衝液中約1単位の酵素とともに使
用される。個々の制限酵素に対する適当な緩衝液および
基質の量は製造業者によって指示されている。通常イン
キュベーション時間は37℃で約1時間であるが、製造業
者の指示に従いそれを変えることもできる。インキュベ
ーションの後、蛋白質をフェノールおよびクロロホルム
による抽出で除き、消化した核酸をエタノールを用いた
沈澱によって水性フラクションから回収する。制限酵素
で消化した場合DNAフラグメントの2つの制限開裂末端
が「環化」、すなわち閉じた環を形成するのを防ぐため
に、細菌性アルカリホスファターゼで末端の5′燐酸を
加水分解する操作を行なう。環化か起るとその制限部位
に別のDNAフラグメントが挿入するのが妨げられる。特
に指摘しない限り、プラスミドの消化は5′末端の脱燐
酸化を伴なっていないと解釈すべきである。脱燐酸化の
方法および試薬は通常のものである(T.Mniatisら前記1
33−134頁参照)。
制限消化物から、DNAのある特定のフラグメントを
「回収」または「分離」するとは、消化物を6%のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、分子量に
よって所望のフラグメントを同定し(マーカーとして分
子量の解っているDNAフラグメントを使用する)、所望
のフラグメントを含んでいるゲル断片を切り取り、DNA
からゲルを分離することを言う。この方法は一般に知ら
れている(例えばR.Lawnら1981,“Nucleic Acids Re
s."9:6103−6114およびD.Goeddelら(1980)“Nucleic
Acids Res."8:4057参照)。
「サザーン分析」とは、消化物またはDNA含有組成物
中のDNA配列の存在を、既知の標識化(ラベル)したオ
リゴヌクレオチドまたはDNAフラグメントとハイブリダ
イズさせることにより確認する方法を言う。本発明にお
いてはサザーン分析とはG.Wahlら1979,“Proc.Nat.Aca
d.Sci.U.S.A.“76:3683−3687に記載された方法により
1%アガロース上で消化物を分離して脱プリン化(depu
rination)し、E.Southern,1975,“J.Mol.Biol."98:503
−517の方法でニトロセルロースに転移させ、そしてT.M
aniatisら1978,“Cell"15:687−701に記載の方法でハイ
ブリタイゼーションを行なうことを意味する。
「形質転換」とは、DNAが染色体外要素または染色体
組込体として複製可能なように、DNAを生物に導入する
ことを意味する。特に指摘しない限り、本発明で使用し
た方法は、E.Coliの形質転換についてはMandelら1970,
“J.Mol.Biol."53:154のCaCl2法であり、桿菌について
は、Anagnostoplousら1961,“J.Bact."81:791−746の方
法による。
「結合(ライゲーション)」とは、2本鎖核酸フラグ
メントの間にホスホジエステル結合を形成させることを
言う(T.Maniatisら前記146頁)。特に指摘しない限
り、結合は既知の緩衝液および条件を使って、ほぼ当モ
ル量の結合すべきDNAフラグメント0.5μg当たり10単位
のT4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)を用いて行う。形質
転換体からプラスミドを調製し、制限地図を作成して分
析し、そして/またはMessingら1981,“Nucleic Acids
Res.",9:309の方法により配列決定する。
形質転換体からのDNAの「調製」とは、微生物培養液
からプラスミドDNAを分離することを言う。特に指摘し
ない限りManiatisら(前記、90頁)のアルカリ/SDS法を
使用した。
「オルゴヌクレオチド」とは、Creaらの方法(1980,
“Nucleic Acids Res.":2331−2348)によって化学
的に合成し(但し縮合剤としてメシチレンニトロトリア
ゾールを使用した)、次いでポリアクリルアミドゲルで
精製した短い1本鎖または2本鎖ポリデオキシヌクレオ
チドを言う。
全ての文献を参考として明細書に記載した。
実施例1 B.amyloliquefaciensからゲノムDNAライブラ
リーの調製およびサブチリシン遺伝子の分離 細胞外B.amyloliquefaciensの既知のアミノ酸配列に
より適当なプローブ混合物の組立が可能である。成熟サ
ブチリシンの配列が第1図に記載されており、これには
本発明者らにより見出されたその他の情報も含まれてい
る。117位から121位までのアミノ酸の配列に対する全て
のコドンの多義牲は以下の配列の8つのオリゴヌクレオ
チドのプールでカバーされる: J.Marmur,“J.Mol,Biol.":208により記載されてい
るB.amyloliquefaciens(ATCC No.23844)から分離し
た染色体DNAをSau 3Aで部分消化し、フラグメントを大
きさで選択し、脱燐酸化したpBS42のBamH1部位に結合さ
せた(pBS42は、E.coliおよび桿菌の両者で機能的な複
製起源を含んでいるシャトルベクターである。これは実
施例4に記載の方法で調製する)。コンピテント細胞25
0μ当り80〜400ng(ナノグラム)のライブラリーDNA
を用い、M.Mandelら1970,“J.Mol.Bio."53:154の方法に
従って、ベクターを含有するこのSau 3Aフラグメントを
E.coli K12株294(ATCC No.31446)に導入した。
形質転換混合物からの細胞を、LB培地+12.5μg/mlの
クロラムフェニコールを含有するプレート150mm当り1
〜5×103形質転換体の密度になるように置き、肉眼で
観察できるコロニーが現われるまで37℃で一夜増殖させ
た。次いでこのプレートを、LB/クロラムフェニルコー
ルプレート上に積層したBA85ニトロセルロースフィルタ
ー平板反復法でプリントした。この平板反復プレートを
37℃で10〜12時間増殖させ、フィルターをLBおよび150
μg/mlのスペクチノマイシンを含有している新しいプレ
ートに移し、プラミドプールを増殖させた。
37℃で一夜インキュベートした後、GrunsteinおよびH
ognessの方法(1975,“Proc.Natl.Acad.Sic.(USA)”7
2:3961)によりフィルターを処理した。成功した形質転
換体約20,000の内、陽性コロニーは25個であった。これ
らの陽性コロニーの内8個を画線し、個々のクローンを
純化した。各画線から24のコロニーをマイクロタイター
ウエル中で増殖させ2枚の反復フィルター上にスタンプ
し、1個のヌクレオチドだけが異なっている以下のも
の: の何れかを用いて上記した方法でプローブした。第2図
に示したように、プール1はプール2よりも遥かに高い
割合で全ての陽性クローンとハイブリダイズし、特異な
ハイブリダイゼイションを暗示した。
陽性クローンからのミニプラスミド標品(Maniatis
ら、前記)5個の内4個は、Sau 3AまたはHinc IIで消
化すると同一の制限消化物パターンを示した。Maniatis
ら(前記)の方法により、これらの4つの同一のコロニ
ーの1つから分離したプラスミドは全て正しい遺伝子配
列を持っており、これをpS4と命名した。制限分析によ
り決定したこのプラスミドの特徴を第3図に示す。
実施例2 サブチリシン遺伝子の発現 Bacillus subtilis I−168(カタログNo.1−A 1,Ba
cillus Genetic Stock Center)をpS4で形質転換し、
1個のクロラムフェニコール耐性形質転換体を最少培地
で増殖させた。24時間後培養物を遠沈し、上清(10〜20
0μ)およびペレットを、0.1M燐酸ナトリウム(pH8.
0)中25℃で染色体基質サクシニル−L−ala−ala−pro
−phe−p−ニトロアニリド(0.2μM)1mlを使って412
nmにおける1分当りの吸収の変化を測定することによ
り、蛋白質分解活性を分析した。対照(コントロール)
として使用したpBS42で形質転換したB.subtilis I−1
68培養物は、pS4で形質転換した培養物の活性の1/200以
下の活性を示した。pS4培養物のプロテアーゼ活性の95
%以上が上清に存在しており、これはフェニルメチルス
ルホニルフルオライド(PMSF)で処理すると完全に阻害
されたがEDTAでは阻害を受けなかった。
上清の一部をPMSFおよびEDTAで処理し、全てのプロテ
アーゼ活性を阻害し、Laemmli,U.K.,1970“Nature",22
7:680の方法に従って、12%SDS−PAGEにより分析した。
この上清を調製するために、16μの上清を1 mMPMSF、
10 mMEDTAで10分間処理し、4μの5×濃SDS試料緩衝
液マイナスβ−メルカプトエタノールとともに煮沸し
た。
pS4、pBS42で形質転換した細胞および形質転換しなか
ったB.amyloliquefaciensの上清を使った泳動上のCooma
ssie染色の結果を第4図に示す。レーン3はB.amyloliq
uefaciensからの標準品としてのサブチリシンを示して
いる。pBS42で形質転換したB.subtilisからの上清であ
る2レーンには、pS4形質転換宿主からのレーン1によ
って示されるサブチリシンに伴っている31,000MW(分子
量)帯(バンド)がなかった。サブチリシンについての
約31,000MWのバンドは、一般に既知の分子量27,500のサ
ブチリシン標準品によって示される遅い移動率の特徴で
ある。
実施例3 B.amyloliquefaciensサブチリシン遺伝子の
配列決定 pS4のEcoR I−BamH Iフラグメント(ここでEcoR I部
位はHinc II部位の変換により組立てられた)の全配列
を、F.Sangerの方法(1977,“Proc.Batl.Acad.Sci(US
A)",74:5463)により決定した。第3図の制限地図を参
照すると、BamH I−PVU IIフラグメントはサザーン分析
によりプール1のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
することが解った。このフラグメントの配列決定により
得られたデータから残りのフラグメントの配列が決定さ
れた(例えばpvu II−Hinc IIおよびAva I−Ava I)。
この結果を第1図に示す。
この配列を調べることにより、B.amyloliquefaciens
によって分泌されたものに相当する成熟サブチリシンの
ためのコドンが存在することが確認された。
この配列のすぐ上流に−107位のGTG開始コドンから始
まる一連の107個のコドンが存在する。−107のコドンか
ら約−75のコドンまでが既知の信号配列のそれぞれに相
当する特徴を持ったアミノ酸配列を暗号化している(大
部分のこのような信号配列は長さ18〜30のアミノ酸であ
り、疏水性中心物を持っており、僅かな疏水性アミノ酸
で終っている)。従って配列決定のデータの結果は−10
7から約−75のコドンが信号配列を暗号化しており、−7
5から−1までの残りの介在コドンはたぶんプロ配列を
暗号化していると思われる。
実施例4 pBS42の組立 pBS42は、pUB110、pC194およびpBR322から導かれたフ
ラグメントの三方向ライゲーションにより調製する(第
5図)。pUB110からのフラグメントは、1900位のHpa II
部位と4500位のBamH I部位との間の約2600塩基対フラグ
メントであり、Bacillus(桿菌)中で機能する複製起源
を含んでいる(T.Grycztanら1978“J.Bacteriol.",134:
318(1978);A.Jalankoら1981“Gene",14:325)。このB
amH I部位はKlenowで試験した。pBR322部分は、2067位
のPvu II部位と3223位のSau 3A部位との間の1100塩基対
のフラグメントであり、E.coli複製起源を含んでいる
(F.Bolivarら1977.“Gene",2:95:J.Sutcliffe,198Cold
Spring Garbor Symposium43:I,77)。pC194プラグメン
トは973位のHpa II部位と2006位のSau 3A部位との間の1
200塩基対フラグメントでありE.coliおよびB.subtilis
の両方で発現し得るクロラムフェニルコール耐性のため
の遺伝子を含んでいる(S.Ehrlich,"Proc.Natl.Acad.Sc
i.(USA)",74:1680;S.Horynuchiら1982,“J.Bacterio
l."150:815)。
このようにpBS42はE.coliおよび桿菌の両者で機能す
る複製起源およびクロラムフェニルコール耐性のための
発現し得る遺伝子を含んでいる。
実施例5 B.Subtilisサブチリシン遺伝子の分離および
配列決定 B.Subtilis I168染色体DNAをEcoR Iで消化し、その
フラグメントをゲル電気泳動にかけた。1個の6kbフラ
グメントが「α−32p」CTPニック・トランスレーション
−上記のpS4のサブチリシン構造遺伝子のC末端から得
られた標識フラグメント−にハイブリダイズした。この
6kbフラグメントを電気溶出し、EcoR Iで消化し細菌性
アルカリホスファターゼで処理したpBS42に結合させ
た。この結合混合物でE.coli ATCC 31446を形質転換
し、形質転換体を、12.5μgのクロラムフェニルコール
/mlを含有しているLB寒天上で増殖させて選択した。500
0個の形質転換コロニーのプールした懸濁液からプラス
ミドDNAを調製した。このDNAを、プロテアーゼ欠落株で
あるB.subtilis BG84(この調製法は実施例8に記載し
てある)に導入した。プロテアーゼを生産するコロニー
を、LB寒天プラス1.5%(w/w)カーネーション粉末脱脂
スキムミルクおよび5μgクロラムフェニルコール/ml
(以降スキムミルク選択プレートと言う)上に置き、蛋
白分解活性を示す透明な部分を観察することによりスク
リーニングした。
プラスミドDNAをプロテアーゼ生産コロニーから調製
し、EcoR Iで消化し、B.amyloliquefaciensからのサブ
チリシン構造遺伝子の32p−標識C末端フラグメントに
ハイブリダイズさせることにより、サザーン分析によっ
て6kb EcoR I挿入体の存在についてしらべた。陽性クロ
ーンを同定し、このプラスミドをpS 168.1と命名した。
pS 168.1で形質転換したB.subtilis BG84は、B.subtil
is I168によって生産されるものよりも5倍の濃度でセ
リンプロテアーゼを分泌した。EDTAを上清に加えても分
析の結果は変らなかったがPMSF(フェニルメチルスルホ
ニルフルオライド)を上清に加えると、BG84株について
実施例8で述べた分析において検出できない濃度まで、
プロテアーゼ活性が減少した。
6.5kb EcoR I挿入体の制限地図を第6図に示した。
種々の制限酵素消化物をサブクローンし、そしてB.subt
ilis BG84中でサブチリシンの発現を試験することによ
り、サブチリシン遺伝子を2.5kb Kpn I−EcoR Iフラグ
メントの内部に位置せしめた。B.amyloliquefaciensサ
ブチリシン遺伝子のC末端からの標識フラグメントをプ
ローブとして用いたサザーン分析により、B.sbtilis遺
伝子のC末端をこのサブクローンの中央の631 bp Hinc
IIフラグメントBの内部またはその一部に位置づけた。
縦列のHinc IIフラグメントB、C、およびD並びにHin
c II−EcoR IフラグメントE(第6図)をM13ベクターm
p8またはmp9に結合させ、ジデオキシ読み終り法(F.San
gerら1977,“Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A."74:5463−546
7)を用いて既知の方法で(J.Messingら1982“Gene"19:
209−276)で配列化した。この領域の配列を第7図に示
した。最初の23アミノ酸は信号ペプチドであると考えら
れる。信号配列と成熟暗号配列の間の残りの83アミノ酸
は、推定上の「プロ」配列を構成している。この遺伝子
の3′末端のオーバーラインドヌクレオチドは転写終了
領域であると思われる。成熟開始コドンから上流の2つ
のShine−Dalgarno配列としての可能性のある配列には
下線を付した。
実施例6 B.subtilisサブチリシン遺伝子の不活性化ミ
ューテーションの製造 桿菌の染色体に組込まれる欠落遺伝子を持ったプラス
ミドを組立てるには、二段階の結合が必要であった(第
8図参照)。最初の工程で、実施例5で述べたB.subtil
isゲノムライブラリーから回収した6.5kb挿入体を含ん
でいるpS 168.1をEcoR Iで消化し、この反応生成物をKl
enowで処理し、そのDNAをHinc IIで消化し、その一部に
B.subtilisサブチリシン遺伝子の5′末端を含んでいる
800 bp EcoR I−Hinc IIフラグメントE(第6図参照)
を回収した。このフラグメントを、Hinc IIで消化し細
菌性アルカリホスファターゼで処理したpJH101に結合さ
せた(pJH101はJ.Hoch(Scripps)から入手でき、F.A.F
errariら1983,“J.Bact."134:318−329に記載されてい
る)。得られたプラスミド、pIDV1は、第8図に示した
方向にフラグメントEを含有していた。第2の工程では
pS 168.1をHinc IIで消化し、サブチリシン遺伝子の
3′末端を含んでいる700 bp Hinc IIフラグメントBを
回収した。pIDV1をその特異なHinc II部位で消化し、フ
ラグメントBをこの線状化したプラスミドに結合させ、
E.coli ATCC 31446に形質転換し、そして12.5μgの
クロラムフェニルコール/mlまたは20μgのアンピシリ
ン/mlを含有しているLBプレート上で選択した。pIDV 1.
4と命名された1つの得られたプラスミドはフラグメン
トEに関して正しい方向にフラグメントBを含有してい
た。第8図に示したこのプラスミドpIDV 1.4は、5′お
よび3′隣接配列の部分をも含でいるサブチリシン遺伝
子の欠失誘導体である。
後記実施例8で調製した部分的プロテアーゼ欠落(欠
失)ミュータント(Prt+/−)、B.subtilis BG77をp
IDV 1.4で形質転換した。2つのクラスのクロラムフェ
ニルコール耐性(Cmr)形質転換体が得られた。LB寒天
プラススキムミルクを含有しているプレート上の相当す
る位置の透明さを観察することにより、75%がBG77(Pr
t+/−)と同じレベルのプロテアーゼ活性を示したが2
5%はほとんど完全にプロテアーゼを欠失していた(Prt
-)。CmrPrt-形質転換体は、そのプラスミドのフラグメ
ントEまたはBのための相同領域における1回の交叉組
込みによるものとは考えられない。というのは、このよ
うな場合その遺伝子は中断されずそして発現形質はPrt
+/−となるであろうから。事実、フラグメントEまた
はBのいずれかを独立してpJH101に結合させ、次いでB.
subtilis BG77に導入するとプロテアーゼ欠落表現形質
は観察されなかった。CmrPrt- pIDV 1.4形質転換体のC
mrの表現形質は、CmsPrt-誘導体がCmrPrt-の培養物か
ら、抗生物質選択の非存在下に最少培地で10世代増殖さ
せた後、約0.1%の頻度でCmrPrt-培養物から分離するこ
とができたという点で不安定であった。このような誘導
体の1つを、BG2018と命名した。この欠失を、PBS1形質
導入によりIA84(サブチリシン遺伝子に隣接する(両端
に位置する)2個の栄養要求ミューテーションを持った
BGSC株)に導入した。この誘導体微生物をBG2019と命名
した。
実施例7 B.subtilisからゲノムDNAライブラリーの調
製および中性プロテアーゼ遺伝子の分離 B.subtilisの中性プロテアーゼの部分的なアミノ酸配
列はP.Levyら1975,“Proc.Nat.Acad.Sci.USA"72:4341−
4345に記載されている。発表されているこの配列から、
その領域内のアミノ酸に対する潜在的なコドンの重剰性
が最も少ない酵素の領域(Asp Gln Met Ile Tyr G
ly)を選択した。下に示すように、この潜在的な全ての
暗号配列をカバーするのに24の組み合せが必要である。
それぞれ6通りの組み合せを含む4つのプールを実施
例1に記載したようにして調製した。このプールを「γ
32p」ATPを用いて燐酸化により認識した。
B.subtilis(1A72、Bacillus Ginetic Stock Cente
r)DNAを各種の制限酵素で消化し、消化物を電気泳動ゲ
ルで分離し、その4つのプローブプールのそれぞれを、
ブロットした消化物のそれぞれに、条件を徐々に厳格に
しながら1個のバンドがハイブリダイズするのが確認さ
れるまで、ハイブリダイゼイションを行なうことにより
B.subtilisゲノム中の特異な配列に最も合致する配列を
含んだ標識プールを選択した。徐々に条件を厳格にする
ということは、ハイブリダイゼーションを起しにくい条
件にすることを言い、例えばホルムアミド濃度を増大さ
せること、塩濃度を減少させることおよび温度を上げる
ことである。5×Denhardt′s、5×SSC、50 mMNa PO4
(pH6.8)および20%ホルムアミドの溶液中、37℃でプ
ール4だけがプロットした消化物とハイブリダイズし
た。これらを中性プロテアーゼ遺伝子のために使用する
適当なハイブリダイゼーション条件として選択し、プー
ル4をプローブとして使用した。
桿菌のゲノムDNAをSau 3Aで部分消化し、その部分消
化物を電気泳動ゲル上で分子量により分離し、15〜20kb
フラグメントを溶出し(R.Lawnら1981,“Nucleic Acid
s Res.":6103−6114)、Promega Biptec.提供のPac
kageneキットを使って、そのフラグメントを、BamH Iで
消化したチャロン30ファージに結合させることにより、
常法に従ってB.subtilis株BGSC 1−A72のラムダーライ
ブラリーを調製した。
チャロンラムダーファージのための全ての既知の宿主
を使用することができるが、このファージライブラリー
の宿主としてはE.coli DP50sup Fを使用した。このE.c
oli宿主をライブラリーファージとともにプレートして
培養し、その後プラークを、ニトロセルロースに転移さ
せ、プローブプール4でスクリーニングする(Bentonお
よびDavis1977,“Science"196:180−182)ことにより中
性プロテアーゼ遺伝子の存在について分析した。陽性プ
ラークを、プラーク純化を2回行なって精製し、さらに
調査するために2つのプラークを選んだ。これらをλNP
RG1およびλNGRG2と命名した。各ファージから制限酵素
加水分解および電気泳動ゲル上の分離によりDNAを調製
した。分離したフラグメントをブロットし、標識したプ
ール4オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。こ
れにより、λNPRG1は2400bpHind IIIハイブリダイジン
グフラグメントを含んでいたが、4300bpEcoR Iフラグメ
ントは含んでおらず、一方λNPRG2は4300bpEcoR Iフラ
グメントを含んでいるが、2400bpHind IIIフラグメント
は含んでいないことが解った。
この2400bpλNPRG1フラグメントをpJH101のHind III
部位に、以下の方法でサブクローンした。λNPRG1をHin
d IIIで消化し、消化物を電気泳動により分画し、そし
て2400bpフラグメントをゲルから回収した。このフラグ
メントをアルカリホスファターゼで処理したHind III消
化pJH101に結合され、この結合混合物を使い、V.Hershf
ieldら1974,“Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)”79:3455
−3459の塩化カルシウムショック法によりE.coliATCC
31446を形質転換した。形質転換体を、BL培地プラス12.
5μgのクロラムフェニコール/mlを含有しているプレー
ト上での増殖可能なコロニーを選択することにより同定
した。
形質転換コロニーから数個のプラスミドを得た。各プ
ラスミド中の2400bpフラグメントの方向性は通常の制限
分析により決定した(方向性とは、結合させた発現ベク
ターの読み取り方法に関して遺伝子フラグメントの読み
取り方向または転写方向を意味する)。向い合った2つ
のプラスミドが得られ、これらをpNPRsub H6およびpNPR
sub H1と命名した。
λNPRG2をEcoR Iで消化することおよびプラスミドが
アルカリホスファターゼで処理したEcoR I消化pBR325で
あることを除いて、2400bpフラグメントについて上記し
た方法と同様にしてλNPRG2の4300bpEcoR Iフラグメン
トをpBR325にサブクローンした。pBR325はF.Bolivar,19
78,“Gene":121−136に記載されている。4300bp挿入
体が異なった方法で存在している2つのプラスミドを同
定した。これら2つのプラスミドをpNPRsub RIおよびpN
PRsub RIbと命名した。
実施例8 B.subtilis中性プロテアーゼ遺伝子の特性化 pNRPsub H1挿入体を種々の制限エンドヌクレアーゼで
順次消化し、標識化したプール4とプロットハイブリダ
イズさせ、その挿入体の制限地図を作成した(一般的な
制限地図の作成法についてはT.Maniatisら前記377頁参
照)。プローブプール4とハイブリダイズした最も小さ
なフラグメントは430bp Rsa Iフラグメントであった。
このRsa IフラグメントをM13 mp 8(M.Messingら1982,
“Gene"19:269−276およびM.Messing in Methods in En
zymology,1983,R,WuらEds.,101:20−78)のSma I部位に
結合させ、その配列を読み取り終りジデオキシ法(F.Sa
ngerら1977,“Proc,Nat.Acad,Sci.U.S.A."74:5463−546
7)により決定した。pNPRsub H1挿入体から他の制限フ
ラグメントをM13 mp 8またはM13 mp 9のベクターの適当
な部位に挿入し、その配列を決定した。必要に応じ、圧
縮人造構造(compression artifact)(D.Millsら1979,
“Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)”76:2232−2235)を
減少されるためにdITPを使用した。pNPRsub H1 フラグ
メントの制限地図を第9図に示す。制限酵素消化物から
の種々のフラグメントの配列を比較し、プロテアーゼの
アミノ末端およびカルボキシ末端に翻訳されるコドン配
列を含んでいるオープンリーディングフレーム(P.Levy
ら前記)を決定した。オープンリーディングフレーム
は、既知の1から始まる、リーディングフレーム(全て
の3つのヌクレオチド)中に如何なる終止コドンをも内
部に含んでいないDNA配列である。このオープンリーデ
ィングフレームは、アミノ末端から2400bp Hind IIIフ
ラグメントの末端にまで拡がっていた。1300bp Bgl II
−Hind IIIフラグメントをpNPRsub RI部位(これはλNP
RG2の4300bpEcoR Iフラグメントを含んでいた)から調
製し、M13 mp 8にクローンした。pNPRsub H1の2400bpフ
ラグメントによって暗号化されていない中性プロテアー
ゼリーダー領域の部分を含んでいるこのフラグメントの
配列を、Hind III部位から上流へ400ヌクレオチドにつ
いて決定した。
この中性プロテアーゼ遺伝子のために決定された、推
定上の分泌リーダーおよびプレプロ配列を含む全ヌクレ
オチド配列を第10図に示す。列の上の数値はアミノ酸番
号を示している。第10図において下線を引いたヌクレオ
チドはリボソーム結合部位(Shine−Dalgarno)を構成
していると考えられ、一方上に線を引いたヌクレオチド
はターミネーターであると推定される潜在的なヘアピン
構造を構成している。最初の27〜28の推定アミノ酸は中
性プロテアーゼのための信号であると考えられ、開裂点
はala−27またはala−28にある。プロ酵素構造の「プ
ロ」配列は成熟、活性酵素のアミノ末端アミノ酸(ala
−222)に至っている。
1900bpを含んでいるpNPRsub R1のBg lIIフラグメント
(第9図)を1400bpを含んでいるpNPRsub H1のPvu II−
Hind IIIフラグメントと結合させることにより、全ての
中性プロテアーゼ遺伝子を持ったコピー数の高いプラス
ミドを組立てた(第11図)。実施例4からのpBS42をBam
H Iで消化し、細菌性アルカリホスファターゼで処理し
てプラスミドの再環化を防止した。pNPRsub R1をBg lII
で消化し、1900bpフラグメントをゲル電気泳動法で分離
し、pBS42の開いたBamH I部位に結合させた。この結合
させたプラスミドを使ってE.coli ATCC 31446を、塩
化カルシウムショック法(V.Hershfieldら前記)により
形質転換し、形質転換された細腕を、12.5μg/mlのクロ
ラムフェニコールを含有するLB培地を含んだプレート上
で増殖させることによ選択した。第11図に示した方向に
Bgl IIフラグメントを持ったプラスミドを形質転換体か
ら分離し、pNPRsub B1と命名した。pNPRsub B1をEcoR I
で消化(線状化)し、Klenow処理により修復して平滑末
端とし、次いでHind IIIで消化した。Hind III消化によ
り得られる大きい方のフラグメント(アミノ末端および
上流領域を暗号化している配列を含んでいる)を回収し
た。
この遺伝子のカルボキシ末端領域は、pNPRsub H1をPv
uIIおよびHind IIIで消化し1400bpフラグメントを回収
することによって得たpNPRsub H1からのフラグメントで
供給した。この1400bpフラグメントの平滑末端Pvu IIお
よびHind III部位をそれぞれ、pNPRsub B1の平滑なEcoR
IおよびHind III部位と結合させた(第11図参照)。こ
の組立物を、後記の分析法で、本来蛋白分解活性物を分
泌しないB.subtilis株BG84に導入した。この形質転換体
を、LB培地プラス1.5%カーネーション粉末脱脂ミルク
および5μg/mlのクロラムフェニコールを含有している
プレート上で選択した。大きなかさ(halo)を清澄にし
たコロニーからのプラスミドを分析した。構造遺伝子お
よび中性プロテアーゼ遺伝子の隣接領域を挿入している
プラスミド−pNPR10を制限分析によって知らべたところ
第11図に示す構造を持っていた。
Adelbergらの一般的な方法(1965,“Biochem.Biophy
s.Res.Commun."18:788−795)に従い、B.subtilis I16
8のN−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジ
ン(NTG)による変異誘発によってB.subtilis株BG84を
作った。変異誘発された株I168をスキムミルクプレート
(抗生物質を含まず)においた。小さいかさを形成する
コロニーを拾い上げさらに分析した。各コロニーにつき
スキムミルクプレート上でプロテアーゼ生産を、デンプ
ンプレート上でアミラー生産を調べた。部分的にプロテ
アーゼ欠失であり、アミラーゼ陽性であり、そして胞子
形成し得る1つの単離物をBG77と命名した。プロテアー
ゼ欠失ミューテーションはprt−77と命名した。このprt
−77対立遺伝子を下に述べる会合によってspo OAバック
グラウンドに移動させて、胞子形成欠落株であるBG84株
を作った。
*“Mol.Gen.Genetics"173:61(1979) BG84はスキムミルクプレート上でプロテアーゼ活性を
完全に失っており、0.1Mの燐酸ナトリウム(pH8)中、2
5℃で0.2μg/mlのサクシニル(−L−ala−L−ala−L
−pro−L−phe)p−ニトロアニリド(Vega)とインキ
ュベーションし、1分当りの412mnにおける吸収の変化
を測定して分析した結果、検出可能な濃度のサブチリシ
ンも中性プロテアーゼも生産しなかった。BG84は1983年
7月21日にATCCに寄託された(寄託番号39382)。サブ
チリシン分析のための試料は、改良Schaefferの培地
(T.Leightonら1971,“J.Biol.Chem."246:3189−3195)
で増殖させた培養の後期対数増殖期の上清から採取し
た。
実施例9 中性プロテアーゼ遺伝子の発現 pNPR10で形質転換したBG84を、0.1%のカゼイン加水
分解および10μgのクロラムフェニコールを添加した最
少培地に接種し、16時間培養した。培養上清0.1mlを採
取し、10mMトリス−HCl、100mM NaCl(pH6.8)中に1.4
mg/mlのAzocoll蛋白分割基質(Sigma)を入れた懸濁液
に加え、攪拌下にインキュベートした。消化されなかっ
た基質を遠心分離により除き、505nmにおける光学密度
を測定した。Azocoll基質懸濁液のバックグラウンド値
を減じた。標準的なプロテアーゼ発現株であるBG16によ
って分泌されるプロテアーゼの量を任意に100と定め
た。BG16、および対照並びに中性プロテアーゼ遺伝子含
有プラスミドで形質転換したBG84についての結果を後記
実施例12の表Bに示す。分泌されるプロテアーゼ−欠落
B.subtilis株BG84を形質転換したものは、野生株である
BG16よりも遥かに高い濃度でプロテアーゼ活性体を分泌
することが解る。
実施例10 中性プロテアーゼ遺伝子の不活性化ミューテ
ーションの製造 pNPRsub H1の2400bp挿入体の2つのRsa Iに囲まれた
領域、全527bp、を削除し、不完全な構造遺伝子を作る
ことができる。この遺伝子の翻訳産物は酵素的に不活性
である。この欠失のあるプラスミドを以下の如くして組
立てた。pJH101をHind IIIで消化して開裂させ、細菌性
アルカリホスファターゼで処理した。線状化したpJH101
に挿入すべき中性プロテアーゼ遺伝子のフラグメント
は、pNPRsub H1をHind IIIおよびRsa Iで消化しゲル電
気泳動によって1200bpのHind III−Rsa Iおよび680bpの
Rsa I−Hind IIIフラグメントを回収することにより得
た。これらのフラグメントを線状化したpJH101に結合さ
せ、E.coli ATCC31446の形質転換に使用した。形質転
換体をLB培地および20μgのアンピシリン/ml含有プレ
ート上で選択した。この形質転換体からプラスミドを回
収し、制限酵素分析によって分析し、pNPRsub H1出発プ
ラスミドと同じ方向性に2つのフラグメントを持ったプ
ラスミドを同定した。内部のRsa Iフラグメントを失っ
たこのプラスミドをpNPRsub H1Δと命名した。
実施例11 中性プロテアーゼ遺伝子の欠失ミュータント
による置換 プラスミドpNPRsub H1ΔをB.subtilis株BG2019(実施
例6のサブチリシン欠除ミュータント)に導入し、染色
体組込み体をスキムミルクプレート上で選択した。コロ
ニーの周囲に親株と同レベルの蛋白分解を示すものと、
蛋白分解ゾーンのほとんどないものとの2つのタイプの
Cmr形質転換体が観察された。蛋白分解ゾーンのないも
のを選択し、再画線して個々のコロニーを純化し、それ
らのプロテアーゼ欠失特性をスキムミルクプレート上で
確認した。Cmrである蛋白分解欠失コロニーの1つを選
んでこれをさらに研究した(このコロニーをBG2034と命
名した)。BG2034の偶発Cms復帰突然変異体を、Cm含有L
B培地で一夜増殖させて分離し、個々のコロニーをプレ
ートし、Cmを含んだ、および含まない培地上に反復プレ
ートした。3個のCms復帰突然変異体を分離したとこ
ろ、その内の2つはプロテアーゼ能があり、残りの1は
プロテアーゼ能がなかった(これをBG2036と命名し
た)。BG2036のハイブリダイゼーション分析の結果、こ
のプラスミドは、たぶん組換えによって、この株から欠
落し、サブチリシンおよび中性プロテアーゼの欠失フラ
グメントだけが残ったことを確認した。
実施例12 機能的サブチリシンおよび中性プロテアーゼ
を欠く株の表現形質 中性またはアルカリ性のプロテアーゼあるいはその両
者の機能的遺伝子を欠く株についてその増殖、胞子形成
およびプロテアーゼの発現について試験した。プロテア
ーゼの発現はスキムミルクプレート上のコロニーの周り
の澄明化バンドおよび液体培養上清中のプロテアーゼ濃
度の測定によって調べた(表B)。サブチリシン遺伝子
欠失株(BG2035)はプロテアーゼ活性の30%の減少およ
びミルクプレート上の正常なかさ(halo)を示した。削
除された中性プロテアーゼ遺伝子および活性サブチリシ
ン遺伝子を持ち、BG2036(実施例11)のDNAでBG16(実
施例8)を形質転換することにより組立てられたBG2043
株は、プロテアーゼ活性の80%の減少およびミルクプレ
ート上の小さいかさを示した。上記の両遺伝子における
削除を有する点でBG2036(実施例11)と等価であると考
えられるBG2054株は、検出可能なプロテアーゼ活性を示
さず、ミルクプレート上の検出し得るかさも示さなかっ
た。
プロテアーゼ遺伝子群の片方または両方を削除しても
増殖または胞子形成に明らかな影響を与えなかった。こ
れらの削除(欠失)を有する株は最少グルコース培地お
よびLB培地の両者において正常な増殖速度を示した。こ
れらの株は親株BG16に匹敵する頻度の胞子形成を示し
た。これらの株を形態学的に調べたところ欠失を含まな
い株と明らかな違いを示さなかった。
実施例13 222位におけるB.amyloliquefaciensサブチリ
シン遺伝子の部位特異性飽和変異誘発、カセット挿入の
ための遺伝子の調製 Wellらの方法(Nucleic Acids Res.1983,11:7911−
7924)に従って調製したpS4の誘導体であるpS4−5をEc
oR IおよびBamH Iで消化し、1.5kbEcoR I−BamH Iフラ
グメントを回収した。このフラグメントをEcoR Iおよび
BamH Iで消化した複製型のM−13 mp9に結合させた(sa
ngerら,1980“J.Mol.Biol."143,161−178;Messingら,19
81,“Nucleic Acids Research"9,304−321;Messing,
J.およびVieira,J.(1982)Gene 19,269−276)。M−1
3 mp9SUBTと命名したこのM−13 mp9ファージ結合体を
つかってE.coli株JM101を形質転換し、2mlの終夜培養物
から1本鎖ファージDNAを調製した。以下の配列を持た
オリゴヌクレオチドプライマーを合成した: 5′−GTACAACGGTACCTCAC−GCACGCTGCAGGAGCGGCTGC−
3′ このプライマーは222−225位のアミノ酸に対する10bp
のコドンが削除されており、met−222コドンにKpn I部
位(5′)を、met+222コドンにPst I部位(3′)を
導入するためにアミノ酸220、227および228に対するコ
ドンが変異されていることを除けば、アミノ酸216−232
を暗号化しているサブチリス遺伝子フラグメントの配列
に符合している(第12図参照)。置換したヌクレオチド
は星印で示してあり、ライン2の下線を引いたコドンは
新しい制限部位を示しており、ライン4の線を引いた部
分は挿入されたオリゴヌクレオチドを表わしている。こ
のプライマー(約15μM)を以下の如くして「32p」で
ラベルした:「r32p」−ATP(20μのの反応液中10μ
)(Amersham 5000Ci/mmol,10218)およびT4ポリヌク
レオチドキナーゼ(10単位)、次いで非放射性ATP(100
μM)とともにインキュベートしこの変異誘発プライマ
ーを完全に燐酸化した。この燐酸化混合物を68℃で15分
間加熱してキナーゼを不活性化した。
Norrisらの改良法(1983,“Nucleic Acids Res."1
1,5103−5112)に従い、5μのラベルした変異誘発プ
ライマー(〜3μM)、約1μgM−13 mp9SUBT鋳型、1
μの1μM M−13塩基配列プライマー(17−mer)
および2.5μの緩衝液(0.3Mトリス(pH8)、40 mM M
gCl2,12 mMEDTA,10 mM DTT,0.5mg/ml BSA)を混合す
ることにより、このプライマーをM−13 mp9SUBTにハイ
ブリダイズした。この混合物を68℃で10分間加熱し、室
温で10分間冷却した。このアニリング混合物に3.6μ
の0.25 mM dGTP,dCTP,dATPおよびdTTP、1.25μの10mM
ATP、1μのリガーゼ(4単位)および1μのKle
now(5単位)を添加した。このプライマーの延長およ
びライゲーション反応(全量25μ)は14℃で2時間行
なった。68℃で20分間加熱してKlenowおよびリガーゼを
不活性化した。この加熱した反応混合物をBamH Iおよび
EcoR Iで消化し、その消化物の一部を6%ポリアクリル
アミドゲルに適用し、放射活性フラグメントをオートラ
ジオグラフィーにより検出した。その結果「32p」変異
誘発プライマーが、今や変異したサブチリシン遺伝子を
含んでいるEcoR I−BamH Iフラグメントに挿入されたこ
とが解った。
消化した反応混合物の残りを、1 mM EDTAを含有する
10 mMトリス(pH8)で200μに希釈し、フェノール/
クロロホルム混合物(1:1(v:v))で1回、次いでクロ
ロホルムで1回抽出し、水相を回収した。5M酢酸アンモ
ニウム(pH8)15μを2倍容量のエタノールとともに
加え、水相からDNAを沈澱させた。マイクロフュージ
中、5分間遠心分離してDNAをペレット化し、上清を捨
てた。70%エタノール300μを加えてDNAペレットを洗
浄し、洗液を捨てペレットを凍結乾燥した。
実施例4のpBS42をBamH IおよびEcoR Iで消化し、ア
クリルアミドゲル上で精製してベクターを回収した。こ
の消化したベクター0.5μg、50μM、ATPおよび6単位
のリガーゼをライゲーション緩衝液20μに溶解した。
ライゲーション(結合)を14℃で終夜行なった。このDN
AをE.coli294 rec+に導入し、形質転換体を12.5μg/ml
のクロラムフェニコール含有LB倍地4ml中で増殖させ
た。この培養物からプラスミドDNAを調製し、Kpn I、Ec
oR IおよびBamH Iで消化した。この制限フラグメントを
分析した結果、分子の30〜50%が変異誘発プライマーに
よってプログラムされた所望のKpn I部位を含んでいる
ことが解った。Kpn I部位を含んでいないプラスミド
は、変異誘発部位の細菌による修復前にM−13複製によ
り生成したと思われ、このようにして、ある形失転換体
において、Kpn I+およびKpn I−プラスミドのヘテロジ
ーナス体が生成したと考えられる。Kpn I+プラミドの純
粋な培養を得るために、このDNAをもう1度E.coliに導
入し、新しいKpn I部位を含有するプラスミドをクロー
ンした。このような形質転換体16個からDNAを調製し、
その内6個が予想したKpn I部位を含んでいることが解
った。
これらの6個の形質転換体の内の1つ(pΔ222と命
名)からプレパラティブな量のDNAを作り、制限分析に
より予想されたKpn IおよびPst I部位が存在すること、
およびその位置を確認した。40μgのpΔ222を300μ
のKpn I緩衝液プラス30μのKpn I(300単位)中37℃
で1.5時間消化した。DNAをエタノール沈澱させ、70%エ
タノールで洗浄し凍結乾燥した。DNAペレットを200μ
のHind III緩衝液にとり、20μ(500単位)のPst Iで
37℃で1.5時間消化した。水相をフェノール/CHCl3で抽
出し、DNAをエタノール沈澱させた。このDNAを水に溶解
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製し
た。ベクターバンド(帯)を電気溶出(120v、2時間、
0℃、0.1倍のTBE(Maniatisら、前記)中)した後、DN
Aをフェノール/CHCl3抽出により精製し、エタノール沈
澱し、エタノールで洗浄した。
pΔ222はKnp IまたはPst Iによりそれぞれ別々に完
全に消化することができたが(>98%)、徹底的な二重
消化は不完全であった(<<50%)。これらの部位が非
常に近くにあるため(10bp)、Knp Iによる消化によっ
てそのPst I部位の近くのDNAが「ブリージング」、すな
わち鎖の分離、すなわちほつれを起したために、このよ
うな結果になったものと考えられる。Pst Iは2本鎖DNA
だけを開裂させるので鎖の分離によってその後のPst I
の消化が阻害されるのであろう。
実施例14 オリゴヌクレオチドカセットのサブチリシン
遺伝子への結合 5′が燐酸化されていない4つの相補性オリゴヌクレ
オチドプール(A−D、表1参照)10μMを、20μの
リガーゼ緩衝液中で5分間68℃で加熱し、次いで室温で
15分間冷却することによりアニーリングした。各アニー
リングしたオリゴヌクレオチドプール1μM、〜0.2μ
gのKpn IおよびPst Iで消化した実施例13で得たpΔ22
2、0.5 mM ATP、リガーゼ緩衝液および6単位のT4DNA
リガーゼ、の全量20μを14℃で終夜反応させ、プール
したカセットをベクターに結合させた。大過剰のカセッ
ト(pΔ222末端を越えること〜300×)をこの結合に使
用して分子内Kpn I−Kpn I結合を防止した。1 mM EDTA
を含有している10 mMトリス(pH8)25μを加えて反
応物を希釈した。この混合物を68℃で5分間加熱し、室
温で15分間冷却することにより再びアニーリングしてカ
セットのコンカテマー(concatemer)形成を防止した。
各プールからのこの結合混合物を別々にE.coli294 rec+
細胞に形質転換した。各形質転換混合物の一部をプレー
トし、それぞれの形質転換体の数を測定した。多数の形
質転換体が多変異誘発性の高い可能性を示した。形質転
換体の残り(〜200−400形質転換体)をLB培他プラス1
2.5μgのクロラムフェニコール/mlの4ml中で培養し
た。各形質転換プール(A−D)からDNAを分離した。
このDNAをKpn Iで消化し、その〜0.1μgを使って再び
E.coli rec+を形質転換し、その混合物をプレートして
各プールから個々のコロニーを分離した。遺伝子へのカ
セットの結合および形質転換時の細菌性修復によりKpn
IおよびPst I部位が破壊された。このようにして形質転
換体DNAをKpn Iで消化したときpΔ222だけが切断され
た。この切断プラスミドはE.coliを形質転換しないであ
ろう。個々の形質転換体を培養して増殖させ、直接的な
プラスミドの塩基配列決定のためにプール当り24〜26の
形質転換体からDNAを調製した。5′−GAGCTTGATGTCATG
GC−3′の配列を持った合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを使ってジデオキシ配列決定反応をプライムした。
得られたミュータントを以下の表Cに示す。
記載したスクリーニングの後2個のコドン+222ミュ
ータント(すなわちglnおよびile)は見出されなかっ
た。これらを得る目的で、第12図の上のオリゴヌクレオ
チド鎖に相当する各ミュータントのための1本鎖25mer
(25量体)オリゴヌクレオチドを構成した。それぞれを
燐酸化し、そのそれぞれの非燐酸化オリゴヌクレオチド
プール(すなわちglnに対してはプールA、ileに対して
はプールD)の下の鎖にアニーリングした。これをKpn
IよびPst I消化pΔ222に結合させ、もとのオリゴヌク
レオチドプールについて記載したようにプロセッシング
した。このようにして得られたシングルミュータントの
出現率はglnに対して2/8、ileに対しては0/7であった。
この明らかなかたよりを避けるため、上の鎖を燐酸化
し、その非燐酸化相補性プールにアニーリングした。ヘ
テロ燐酸化カセットを切断pΔ222に結合させ、前と同
様にしてプロセシングした。glnおよびileミュータント
の出現率はそれぞれ7/7および7/7となった。
表Cのデータはこのプールから得られたミュータント
の出現におけるかたよりを表わしている。これは、プー
ルにおいてオリゴヌクレオチドを等価に表わしていない
ことから起ったものと考えられる。これは特定のポリマ
ーがプールの変異誘発コドンを越えて非等価にカップリ
ングすることにより惹起されたものかもしれない。この
ようなかたよりの問題は、合成中にトリマーレベルの適
当な調節により(同じ反応を行なう)なおすことができ
た。いずれの場合も、第1次スクリーニングで単離され
なかったミュータントは所望のミューテーションを表わ
している1本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、両末端を
燐酸化し、非燐酸化相補鎖のプールにアニーリングし、
カセット部位に結合させることにより得ることができ
た。完全に非燐酸化したカセットについて観察されたか
たよったヘテロデュプレックス修復は、222位は下の鎖
の5′末端よりも上の鎖5′末端により近いという事実
から起ったものと思われる(第12図参照)。非燐酸化
5′末端にはギャップが存在し、2本鎖DNAにはミスマ
ッチバブル(bubble)が222位にあるので、上の鎖のギ
ャップの切除修復はより容易に複製可能な環状にハイブ
リダイズしたデュプレックスを維持することになる。上
の鎖は選択的5′燐酸化により完全に保持し得るという
事実はこの仮説に合致している。この場合、下の鎖だけ
が切除修復を促進し得る5′ギャップを含んでいる。こ
の方法は、変異誘発オリゴヌクレオチドカセットを使っ
た場合、合成オリゴヌクレオチド鎖のかたよった挿入を
方向づけるのに有用である。
実施例15 166位におけるサブチリシン遺伝子の部位特
異性変異誘発 変異誘発プライマーが異なっていること(第13図の37
merを使用した)、2つの制限酵素がPst IおよびKpn I
ではなくてSac IおよびXma IIIであること、および得ら
れた組立て物が異なっていることを除けば実施例13〜14
に示した操作を忠実に繰返した(第13図参照)。
166位のミュータントサブチリシンを分泌する桿菌株
を後記実施例16に記載した方法で得た。野生型残基のal
a、asp、gln、phe、his、lys、asn、arg、およびvalが
置換されているミュータントサブチリシンを回収した。
実施例16 ミュータントサブチリシン酵素の調製 実施例11の方法で得たB.subtilis株BG2036を実施例1
4,15または20のプラスミドおよび対照としてpS4−5に
より形質転換した。形質転換対をプレートまたは振盪フ
ラスコ中16〜48時間37℃でLB培地プラス12.5μg/mlのク
ロラムフェニルコール中で培養した。酵素的に活性なミ
ュータントサブチリシンを、細胞ブロスをpH6.2の0.01M
燐酸ナトリウムに対して透析することにより回収した。
透析したブロスを1N HClでpH6.2に調節し、CMセルロー
ス(CM−52ワットマン)の2.5×2cmのカラムに充填し
た。0.01M燐酸ナトリウム(pH6.2)で洗浄した後、サブ
チリシン(+222におけるミュータントを除く)をNaCl
について0.08Nとして同じ緩衝液で溶出した。+222のミ
ュータントサブチリシンは0.1M燐酸ナトリウム(pH7.
0)で溶出した。この精製したミュータントおよび野生
型酵素を使って酸化安定性、Km、Kcat、Kcat/Km比、至
適pHおよび基質特異性における変化を調べた。
実施例17 改良された酸化安定性を示すミュータントサ
ブチリシン 野生型のメチオニンの代りに、222において置換した
システインおよびアラニンを有するサブチリシン(実施
例16)を各種の濃度の次亜塩素酸ナトリウム(Clorox B
leach)とともにインキュベートすることにより酸化に
対する抵抗性を分析した。
全量400μの0.1M NaPO4緩衝液(pH7、第14図に示
した濃度の上記の漂白剤含有)400μに、終濃度が0.0
16mg/ml(酵素)となるように充分な酵素を加えた。こ
の溶液を25℃で10分間インキュベートし、以下の如くし
酵素活性を分析した:120μのala+222または野生型、
あるいは100μのcys+222インキュベーション混合物
を890μの0.1Mトリス緩衝液(pH8.6)および10μの
sAAPF pN(実施例18)基質溶液(20mg/ml、DMSO中)と
混合した。p−ニトロアニリンの遊離に基づく410nmに
おける吸光度の増加率をモニターした(Del Mar,E.G.
ら1979“Anal.Biochem."99,316−320)。この結果を第1
4図に示す。メチオニンの代りに不安定なシステイン残
基が置換したミュータントあるいは野生型酵素の何れと
比較しても、より安定な酵素をアラニン置換体が生産し
た。驚くべきことに、このアラニン置換は、アッセイ基
質に対する酵素活性を実質的に阻害することなく、か
つ、この酵素にかなりの酸化安定性を付与した。セリン
+222ミュータントも改良された酸化安定性を示した。
実施例18 改良された動力学および基質特異性を示すミ
ュータントサブチリシン グリシン+166の各種のミュータントを、改良されたK
cat、KmおよびKcat/Km比についてスクリーニングした。
速度的パラメータは反応の進行カーブを分析することに
より得た。反応速度は基質濃度の関数として計算した。
データはMarquardtの非線形回帰アルゴリズム(Maruard
t,D.W.1963“J.soc.Ind.Appl.Math.11,431−41)を使っ
て、Michaelis−Mentonの方程式に合わせて分析した。
すべての反応は、初期濃度0.0025M〜0.00026M(問題の
酵素のKm比に依存する。濃度は各測定毎にKm比を越える
ように調節した。)のベンゾイル−L−バリル(Valy
l)−グリシル(Glycyl)−L−アルギニル(Arginyl)
−p−ニトロアニリド(BVGR pN;Vega Biochemicals)
を含有しているか、または初期濃度0.0010M〜0.00028M
(BVGR pNについての場合と同様に変化する)のサクシ
ニル−L−アラニル(Alanyl)−L−アラニル(Alany
l)−L−プロリル(Prolyl)−L−フェニルアラニル
(Phenylalanyl)−p−ニトロアニリド(sAAPF pN;Veg
a Biochemicals)を含有させ0.1Mトリス緩衝液(pH8.
6)中、25℃で行なった。
これらの実験の結果を以下に示す。
各ミュータントのKcat/Km比は野生型酵素のものと異
なっていた。触媒効率の測定の結果、これらの比率は、
本発明方法に従って、与えられた基質に対して遥かに高
い活性を有する酵素を容易に設計することができ、かつ
スクリーニングによって選択することができるというこ
とを示している。例えばA166は、sAAPF pNにおける野生
型の活性の2倍以上の活性を示す。
このデータはまた、野生型酵素のミューテーションに
よる基質特異性の変化をも示している。例えばD166およ
びE166ミュータントのKcat/Km比は、BVG pN基質に対し
ては野生型より高いが、sAAPF pNについては質的に逆の
結果が得られている。従ってD166およびE166ミュータン
トは、sAAPF pNよりもBVGR pNに対してより特異性があ
る。
実施例19 改良されたpH活性プロフィルを示すミュータ
ントサブチリシン 実施例16で得られたCys+222ミュータントのpHプロフ
ィルを野生型酵素のそれと比較した。DMSO中の10μの
60mg/ml sAAPF pN、10μのCys+222(0.18mg/ml)か
野生型(0.5mg/ml)および980μの緩衝液(pH6.6、7.
0および7.6の場合の測定については0.1M Na PO4緩衝
液;pH8.2、8.6および9.2の場合は0.1Mトリス緩衝液;お
よびpH9.6および10.0の場合は0.1Mグリシン緩衝液)を
混合した後、1分当りの410nmにおける吸光度の初期変
化率を各pHについて測定し、そのデータを第15図に示し
た。Cys+222ミュータントは野生型酵素よりも狭い至適
pHを示した。
実施例20 169位におけるサブチリシン遺伝子の部位特
異性変異誘発 変異誘発プライマーが異なっていること(第16図に示
したプライマーを使用)、2つの制限酵素がPst Iおよ
びKpn Iの代りにKpn IとEcoRVであること、および得ら
れた組立物が異なっていること(第16図に示した)を除
けば実施例13〜14と同じ操作を行なった。
169位におけるミュータントサブチリシンを分泌する
桿菌株は実施例16に記載したようにして得た。野生型の
残基を代りにalaおよびserの置換を示すミュータントサ
ブチリシンを回収し、速度論的特徴の変化を調べるため
に分析した。この分析にはpH8.6でSAAPF pNを実施例18
に示したものと同様にして使用した。結果を以下に示
す。
実施例21 蛋白質基質に対する特異活性の変化 実施例15および16で得た166位のミュータントを、天
然の蛋白質基質に対する特異活性の変化について分析し
た。これらのミュータントプロテアーゼは、変化した比
活性とともに変化した特異性をも示すことがあるので、
1つのタイプの特異性を持ったプロテアーゼの方向に分
析がかたよらないために、基質は十分な量の種々の開裂
部位、すなわち酸性、塩基性、中性および疏水性の部位
を含んでいなければならない。基質はある配列部をマス
キングすることになるデリビタイズド残基を含んでいて
はならない。ヘモグロビン、アゾコローゲン(azocollo
gen)、アゾカゼイン、ジメチルカゼインなどの広く用
いられている基質は、この理由で使用できない。牛カゼ
イン、αおよびαカゼインが好適な基質てして選ばれ
た。
100mMトリス緩衝液(pH8.0)、10mM EDTA中で1%カ
ゼイン溶液(w/v)を調製した。分析のプロトコールは
次の通りである: 790μの50mMトリス(pH8.2) 100μの1%カゼイン(Sigma)溶液 10μの試験酵素(10−200μg)。
このアッセイ混合物を混合し、室温で20分間インキュ
ベートした。100μの100%トリクロロ酢酸を添加し、
次いで室温で15分間インキュベートすることにより反応
を終結させた。沈澱した蛋白質を遠心分離によりペレッ
ト化し、上清の280nmにおける光学密度を分光光度計を
用いて測定した。光学密度は、反応混合物中の沈澱しな
かった、すなわち加水分解されたカゼインの量を表わし
ている。それぞれのミュータントプロテアーゼによって
加水分解されたカゼインの量を、種々の量の野生型プロ
テアーゼを含んでいる一連の標準物と比較し、その活性
を野生型の活性に対するパーセンテージで表わした。酵
素活性を、分析に使用した酵素溶液の280nmにおける吸
光度でカゼイン加水分解活性を割ることにより比活性に
変換した。
Asn+166を除き、分析した全てのミュータントは野生
型のものよりカゼインに対する比活性が低かった。Asn
+166は野生型よりカゼインに対する活性が26%高かっ
た。最も低い比活性を示したミュータントはile+166で
あり、野生型の活性の0.184であった。
【図面の簡単な説明】
第1図Aは機能的B.amyloliquefaciensサブチリシン遺
伝子の配列を示す模式図、第1図Bはその暗号鎖のヌク
レオチド配列を、蛋白質のアミノ酸配列と関連させて示
している模式図、第2図はプール1(パネルA)および
プール2(パネルB)でそれぞれプローブした純化陽性
クローンのレプリカ・ニトロセルロース・フィルターの
結果を示すグラフ、第3図はサブチリシン発現プラスミ
ド(pS4)の制限分析を示す模式図、第4図はpBS42およ
びpS4で形質転換した培養物からの上清について行なっ
たSDS−PAGEの結果を示すグラフ、第5図はシャトルベ
クターpBS42の構成を示す模式図、第6図はB.subtilis
サブチリシン遺伝子を含む配列の制限地図を示す模式
図、第7図は機能的なB.subtilisサブチリシン遺伝子の
配列を示す模式図、第8図はB.subtilisサブチリシン遺
伝子の欠失ミュータントを得るための組立法を示す模式
図、第9図はB.subtilis中性プロテアーゼ遺伝子の制限
地図を示す模式図、第10図はB.subtilis中性プロテアー
ゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図、第11図はB.
subtilis中性プロテアーゼ遺伝子を含んでいるベクター
の組立を示す模式図、第12,13および16図は本発明方法
による変異誘発技術の具体例を示す模式図、第14図はサ
ブチリシンミュータントの強化された酸化安定性を示す
グラフ、第15図は野生型酵素と比較した場合のサブチリ
シンミュータントのpH活性プロフィルの変化を示すグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:07) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:07) (31)優先権主張番号 614616 (32)優先日 1984年5月29日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 614617 (32)優先日 1984年5月29日 (33)優先権主張国 米国(US) (72)発明者 ユーゲニオ・フエラーリ アメリカ合衆国カリフオルニア94015、 デイリー・シテイー、モーニングサイ ド・ドライブ75番 (72)発明者 デニス・ジエイムス・ヘナー アメリカ合衆国カリフオルニア94404、 パシフイカ、エンジエリタ・アヴエニユ ー297番 (72)発明者 ジエイムス・アレン・ウエルズ アメリカ合衆国カリフオルニア94403、 サン・マテオ、オータイ・アヴエニユー 65番 (56)参考文献 Nucleic Acid Re s.,11(22)(1983).P.7911− 7925 Nature,221(January 18 1969)P.235−242 Nucleic Acid Re s.,10(1982).P.6487−6500

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】変化した活性を有する変異サブチリシンを
    製造する方法であって、バチルス・アミロリクエファシ
    エンス(Bacillus amyloliquefaciens)サブチリシンま
    たはそのプレ酵素あるいはプレプロ酵素の Asn+155、
    Tyr+104、Met+222、Gly+166、Gly+169、Glu+156、
    Ser+33、Phe+189、Tyr+217、およびAla+152に相当
    する、サブチリシン酵素、そのプレ酵素またはプレプロ
    酵素の1またはそれ以上の位置に突然変異をもたらし、
    その突然変異によって生じる酵素の望ましい活性の変化
    を調べることからなる方法。
  2. 【請求項2】該突然変異がバチルス・アミロリクエファ
    シエンス(B.amyloliquefaciens)の+222位に相当する
    位置のアミノ酸を置換することからなり、増強して酸化
    安定性および/または変化したpH活性を有する酵素を製
    造する請求項1の方法。
  3. 【請求項3】突然変異が+222位の残基をAlaまたはSer
    で置換することからなる請求項2の方法。
  4. 【請求項4】1またはそれ以上のメチオニンまたはトリ
    プトファン残基をメチオニンまたはトリプトファンでは
    ないアミノ酸残基で置換することにより突然変異をもた
    らし、酸化安定性の変化した変異サブチリシンを得る請
    求項1の方法。
  5. 【請求項5】置換アミノ酸がアラニンまたはセリンであ
    る請求項4の方法。
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Nucleic Acid Res.,11(22)(1983).P.7911−7925

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