KR101522042B1 - 메탈로프로테아제 세제 제제를 안정화시키기 위한 단백질 가수분해물의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 증가된 보관 안정성을 보여주는 메탈로프로테아제 효소 및 단백질 가수분해물 억제제를 포함하는 조성물 및 제제를 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 세제 제제에 단백질 가수분해물을 포함하여 안정화된, 하나 이상의 메탈로프로테아제 (예를 들어, 바실러스 sp. 중성 메탈로프로테아제) 를 포함하는 액체 세제 제제를 제공한다. 본 발명은 또한, 메탈로프로테아제 효소를 사용해 단백질 기질을 분해함으로써 세제 제제를 안정화시키기 위한 단백질 가수분해물의 제조 방법을 제공한다.

메탈로프로테아제

Description

메탈로프로테아제 세제 제제를 안정화시키기 위한 단백질 가수분해물의 용도 {USE OF PROTEIN HYDROLYSATES TO STABILIZE METALLOPROTEASE DETERGENT FORMULATIONS}

관련 출원에 관한 교차-참조문헌

본 출원은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 2007 년 4 월 30 일에 출원된 미국 가출원 제 60/914, 965 호의 이익을 주장한다.

본 발명은 보관 조건 하에 메탈로프로테아제 함유 세제 제제를 안정화시키기 위한, 단백질 가수분해물 억제제의 용도에 관한 것이다.

효소는 많은 세제 제제에서 주요 활성 성분이다. 이들은 촉매성이기 때문에, 효소는 얼룩을 분해시키는데 있어서 고도로 효과적인 성분일 수 있다. 그러나, 이들은 생물학적 생성물이라서, 효소는 또한 가장 비용이 드는 성분 중에 있을 수 있다. 결과적으로, 세제 제제의 일생을 통틀어 높은 효소 활성을 유지하는 것이 상기 세제 제제를 기반으로 한 생성물의 성공에 중요하다.

상기 제제에 사용되는 효소에는 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 만노시다아제, 뿐만 아니라 다른 효소 또는 그의 혼합물이 포함된다.

액체에서의 보관 동안 (즉, 사용 전) 효소 안정성을 유지하는 것과 관련한 문제는 잘 알려져 있다. 전형적으로, 프로테아제는 그의 촉매적 활성이 제제에서 다른 단백질을 분해하도록 작용하고, 뿐만 아니라 프로테아제 자체의 자가분해 (즉, 자가 분해) 의 과정을 통해 분해되기 때문에 더 큰 안정성 문제를 제기한다. 그러나, 세린 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신 (subtilisin)) 가 안정화될 수 있는 상대적인 용이성, 및 증가된 안정성을 위해 조작된 돌연변이의 개발로 인해, 상기 부류의 프로테아제는 세제 제제에서 광범위하게 사용되어 왔다. 실제로, 서브틸리신은 세제에서의 그의 용도로 인해, 가장 시중적으로 중요한 프로테아제 효소 중 하나이다.

반대로, 메탈로프로테아제는 세제 제제와 같은 산업 적용에서 거의 사용되지 않거나 또는 사용되지 않았다. 메탈로프로테아제는 각각 안정성 및 기능을 위한 칼슘 및 금속 이온에 대한 완전한 요구를 갖는 더욱 복잡한 단백질계를 포함한다. 세제 제제 및 다른 세정 조성물은 전형적으로 메탈로프로테아제 안정성 및 활성을 유지하는 문제를 크게 제기하는 활성 성분의 복잡한 조성물을 포함한다. 특히, 세제 제제에는 종종 칼슘 및/또는 필수 금속 이온을 킬레이트화시켜서 안정성 및 촉매적 활성의 소실의 감소를 초래하는 화합물이 포함된다.

2006 년 10 월 12 일에 출원된 미국 특허 출원 제 11/581,102 호 (본원에서 참조로써 삽입됨) 는 세제 제제에서의 메탈로프로테아제의 용도와 관련한 어려움을 일부 극복하는 중성 메탈로프로테아제를 개시한다. 특히, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) 유래의 중성 메탈로프로테아제 NprE 및 PMN 은 세제 제제 조건을 견뎌내고 15 mM 미만의 아연 이온 농도의 존재 하에 대략 4 주에 걸쳐 안정성을 나 타내는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 이들 중성 메탈로프로테아제는 심지어 더 낮은 온도에서도 양호한 세정 효과를 나타낸다. 특히, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 유래의 재조합 중성 메탈로프로테아제인 NprE 는 다른 세제 제제보다 이퀘스트 그래스 (Equest Grass, Warwick) 에서 더 양호한 세정력을 보여주는 것으로 나타났다. 따라서, 중성 메탈로프로테아제는 그것이 충분히 안정화된다면 개선된 시판의 생존가능한 산업성 세제를 만들어낼 능력을 갖고 있다.

여전히, 중성 메탈로프로테아제는 그의 활성을 빠르게 감소시켜 결과적으로, 세제 제제의 보관 안정성을 감소시키는 자가 분해라는 일반적인 프로테아제 문제점으로 인해 곤란을 겪고 있다. 메탈로프로테아제 (또는 임의의 효소) 를 사용하는 상대적인 고 비용은 사용 전에 활성이 손실되는 것을 최소화시켜, 세제 성분으로서 시판적으로도 생존가능하게 한다. 분명하게는, 메탈로프로테아제의 자가 분해를 최소화시키기 위한 임의의 조성물 및/또는 방법은 목적하는 효소 활성 (즉, 얼룩의 단백질 성분을 분해하는 등) 을 억제시키는 것으로 인해 비용을 추가로 너무 크게 증가시켜서는 안된다. 결과적으로, 사용 동안에 목적하는 활성을 감소시키지 않으면서 세제 보관 동안에 자가분해 활성을 최소화시키기 위해 섬세한 밸런스가 이루어져야 한다. 따라서, 특히 세제 제제 및 다른 세정 조성물에 혼입되는 경우, 분해에 대해 중성 메탈로프로테아제를 안정화시키는 방법, 화합물, 제제 및 조성물이 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 메탈로프로테아제 효소 및 메탈로프로테아제 억제제를 포함하여, 분해에 대해 증가된 안정성을 나타내는 조성물 및 세제 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 억제제-안정화된 세제 제제의 제조 방법을 제공한다.

본원에 개시된 세제 제제는 모두 메탈로프로테아제를 포함하고, 증가된 안정성은, 효소에 결합하여 효소의 자가 분해를 방지하는 메탈로프로테아제 억제제의 포함으로 인한 것이다. 중요하게는, 이들 억제제-안정화된 세제 제제는 상기 억제제가 결합해서 보관 동안에 메탈로프로테아제 분해를 효과적으로 약화시키나, 이어서 세제가 사용되는 경우 희석 시 활성 효소를 방출, 제공하도록 제조된다. 본 발명은 분해에 대해 안정화시키기에 특히 효과적인 메탈로프로테아제 억제제로서 단백질 가수분해물을 개시한다. 특히 바람직한 구현예에서, 단백질 가수분해물 억제제는 메탈로프로테아제 효소 자체에 의한 단백질 기질의 가수분해에 의해 제조된다. 생성 가수분해물은 단리될 수 있으며, 이를 생성한 메탈로프로테아제에 대한 특히 효과적인 경쟁적 억제제이다.

따라서, 메탈로프로테아제 억제제는 단백질 가수분해물이다. 본 발명의 단백질 가수분해물은 단백질 (예를 들어, 카제인) 범위의 가수분해 (효소 또는 비효소적) 에 의해 생성되는 펩티드 분절을 포함한다. 본 발명의 억제제로서 유용한 단백질 가수분해물에는 하기가 포함되나 이에 제한되지 않는다 : 밀 글루텐 가수분해물 (예를 들어, HyPep 4601™), 콩 단백질 산 가수분해물 (예를 들어, 아미소이 (Amisoy)), 소 젖 (소 젖) 의 카제인 산 가수분해물 (예를 들어, 아미카제 (Amicase)), 및 식물 단백질의 효소 가수분해물 (예를 들어, 프로테오스 펩톤). 또한, 본 발명은 하나 이상의 메탈로프로테아제 효소, 예를 들어 흥미있는 메탈로프로테아제 효소 자체를 사용한 가수분해/분해에 의해 생성되는 단백질 가수분해물 억제제의 용도를 교시한다.

구현예의 한 바람직한 세트에서, 본 발명은 바실러스 sp. 로부터 단리된 중성 메탈로프로테아제, 및 특히, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 유래의 재조합 중성 메탈로프로테아제인 NprE 를 포함하는 액체 세제 제제를 제공한다.

본 발명은 하기를 포함하는 액체 세제 제제를 포함한다 :

(a) 약 1 중량% 내지 약 75 중량% 의 계면활성제 ;

(b) 약 10 중량% 내지 약 95 중량% 의 물 ;

(c) 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량% 의 중성 메탈로프로테아제 ; 및

(d) 사용 전에, 억제제가 약 90% 이상의 중성 메탈로프로테아제 분자에 결합하는, 즉, 활성 부위에 결합하거나 또는 활성 부위 이외의 부위에 결합하고 기질과 활성 부위 간의 촉매적 상호작용을 방지 또는 억제하도록 하는 양의 중성 메탈로프로테아제 억제제, 여기서, 세제 제제의 적절한 희석은 결합된 중성 메탈로프로테아제 분자 중 약 25% 이상으로부터 억제제가 해리되게 한다. 전형적으로, 적절한 희석은 액체 세제 제제가 세제 제제의 200, 400, 500, 600, 또는 심지어 1000-배 희석이 되게 하는 큰 부피의 세정수에 첨가될 때 일어난다.

상기 제제의 한 구현예에서, 억제제 결합된 중성 메탈로프로테아제 효소 중 45%, 65%, 75%, 85%, 또는 심지어 95% 이상이 상기 세제의 희석 시 억제제-없는 형태로 방출된다. 한 구현예에서, 제제에 대해 선별된 억제제는 약 pH 6.5 내지 약 pH 11, 바람직하게는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.5 에서 약 5 mM 내지 약 15 mM 의 겉보기 (apparent) Ki 로 중성 메탈로프로테아제를 경쟁적으로 억제시킨다. 한 바람직한 구현예에서, 세제 제제는 약 pH 8.0 에서 겉보기 Ki 가 대략 10 mM 인 단백질 가수분해물 억제제를 포함한다.

제제에서 사용되는 억제제의 절대량이 결합 친화성, 효소 농도 및 기타 요소에 따라 다양할 수 있더라도, 전형적으로 억제제의 양은 적절한 희석 전에 액체 세제 제제의 약 0.01 중량% 내지 약 15 중량%, 약 0.05 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 2.5 중량% 이다.

한 구현예에서, 액체 세제 제제는 폴리프로필렌 글리콜 및/또는 칼슘 이온 (예를 들어, CaCl₂) 을 포함하여 다른 성분의 존재에 의해 추가로 안정화된다. 일부 구현예에서, 제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 일반적인 HDL 제형에 따라 제조된 HDL 세제이다 : DW-AA, DW-AF, DW-AK, DW-CR, DW-CS, 및 DW-CT. 일부 구현예에서, 액체 세제 제제는 붕소를 포함하지 않는다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제 조성물을 제공한다 :

(a) 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량% 의 중성 메탈로프로테아제 ; 및

(b) 경쟁적 억제제, 여기서, 경쟁적 억제제는 상기 중성 메탈로프로테아제 분자의 약 90% 이상에 결합함. 한 바람직한 구현예에서, 경쟁적 억제제는 단백질 가수분해물이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제는 바실러스 sp. 유래이고, 특히, B. 아밀로리퀴파시엔스 유래의 NprE 이다. 상기 억제제-안정화된 조성물은 액체 또는 건조 (예를 들어, 과립형) 제제일 수 있다. 한 구현예에서, 조성물은 본 발명의 상기-개시된 세제 제제의 제조에서 전구체 성분으로서 사용된다.

또다른 구현예에서, 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 캡슐화된 입자에 있다.

따라서, 또다른 구현예에서, 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 조성물을 하기와 조합하는 방법에 의해 세제 제제를 제조하는데 사용된다 :

(a) 물 ;

(b) 약 0.1 중량% 내지 약 75 중량% 의 세제 계면활성제 ;

(c) 약 5 중량% 내지 약 15 중량% 의 프로필렌 글리콜 ; 및

(d) 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM 의 Ca^{2 +} 이온.

본 발명의 또다른 구현예는 하기를 포함하는 성분을 조합하는 방법에 의해 제조되는 액체 세제 제제이다 :

(a) pH 약 6.5 내지 약 8.5 의 수성 완충액 ;

(b) 약 0.1 중량% 내지 약 75 중량% 의 세제 계면활성제 ;

(c) 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량% 의 메탈로프로테아제 ; 및

(d) 기질 단백질, 여기서, 적어도 하나, 즉, 하나 이상의 메탈로프로테아제에 의한 기질 단백질의 분해는 약 90% 이상의 메탈로프로테아제 분자에 결합하는 생성물을 생성한다. 한 구현예에서, 기질 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다 : 밀 글루텐, 카제인, 콩 단백질, 및 식물성 단백질. 한 구현예에서, 사용되는 기질 단백질은 약 0.01 중량% 내지 약 15 중량% 이다. 본원에 개시된 다른 제제와 함께, 일부 구현예에서 메탈로프로테아제는 바실러스 sp. 로부터 단리된 중성 메탈로프로테아제, 및 특히, 중성 메탈로프로테아제인 NprE 이다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 억제제-안정화된 액체 세제 제제의 제조 방법을 제공한다 :

(a) 수성 완충액 내에 적어도 하나, 즉 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 및 단백질 기질을 포함하는 혼합물을 약 pH 6.5 내지 약 pH 11 의 pH 및 약 22℃ 내지 약 37℃ 의 온도에서 인큐베이션시켜서, 적어도 하나, 즉 하나 이상의 메탈로프로테아제에 의한 기질 단백질의 분해가 가수분해 생성물을 생성하는 단계 ;

(b) 분자량이 약 5000 Da 미만인 가수분해 생성물을 단리하는 단계 ; 및

(c) 단계 (b) 의 가수분해 생성물을 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량% 의 중성 메탈로프로테아제를 포함하는 액체 세제 제제와 조합하는 단계. 또다른 구현예에서, 본 발명은 단백질 가수분해 생성물을 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량% 의 중성 메탈로프로테아제를 포함하는 액체 세제 제제와 조합하는 것을 포함하는, 억제제-안정화된 액체 세제 제제의 제조 방법을 제공하는데, 여기서, 단백질 가수분해 생성물은 적어도 하나, 즉 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 및 단백질 기질을 포함하는 혼합물을 약 pH 6.5 내지 약 pH 11 의 pH 및 약 22℃ 내지 약 37℃ 의 온도에서 수성 완충액에서 인큐베이션함으로써 제조되며, 그리하여 적어도 하나, 즉 하나 이상의 메탈로프로테아제에 의한 기질 단백질의 분해가 가수분해 생성물을 생성하며, 여기서, 분자량이 약 5000 Da 미만인 가수분해 생성물은 중성 메탈로프로테아제와 조합하기 전에 단리된다. 한 구현예에서, 인큐베이션 혼합물은 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량% 의 중성 메탈로프로테아제 및 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 의 단백질 기질을 포함한다. 한 바람직한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제는 NprE 이고, 단백질 기질은 소 젖 카제인이다.

한 구현예에서, 본 발명은 중성 메탈로프로테아제 유전자 및 단백질 기질 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는데, 여기서, 단백질 기질 유전자 생성물은 중성 메탈로프로테아제 유전자 생성물에 의해 효소적으로 전환되어 단백질 가수분해물 억제제를 생성한다. 또다른 구현예에서, 발현 벡터는 추가로 단백질 기질 유전자에 조작적으로 연결된 프로모터를 포함하는데, 여기서, 프로모터는 단백질 기질 유전자 생성물의 발현을 증진시키나 중성 메탈로프로테아제 유전자 생성물의 발현을 증진시키지는 않는다. 한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 유전자는 바실러스 sp. 의 것이고, 단백질 기질은 카제인이다. 바람직한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 유전자는 B. 아밀로리퀴파시엔스 유래의 NprE 이고, 단백질 기질은 카제인이다.

도 1 은 더 높은 농도의 NprE 와 함께 첨가된 폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 및 CaCl₂ 가 시간 경과에 따라 증가된 AGLA 활성을 유지한다는 것을 보여주는 실험 어세이 데이타의 한 도시를 그린 것이다. 모든 샘플은 10% PPG 및 0.5 mM CaCl₂ 와 함께 열거된 농도의 NprE 를 함유하였다. 밀폐된 원모양의 데이타는 임의의 첨가된 PPG 또는 CaCl₂ 없이 625 ppm NprE 의 조절을 나타낸다.

도 2 는 NprE-생성된 카제인 가수분해 생성물이 NprE 의 경쟁적 억제제임을 보여주는 정상 상태의 반응속도 데이타를 그린 것이다. 도 2A 는 증가량의 억제제와 함께 NprE 활성의 기질 의존도를 나타낸다. 도 2B 는 보편적인 y-절편을 나타내는 이중 역수 도시를 보여준다. 도 2C 는 억제제 펩티드 농도에 대한 겉보기 Km 재도시를 보여준다. 도 2D 는 증가량의 억제제 펩티드 농도에 대한 이중 역수 경사 재도시를 보여준다. 도 2C 및 2D 에서 x-절편은 대략 10 mM 카제인 가수분해 생성물 농도의 겉보기 Ki 를 지시한다.

도 3 은 다양한 단백질 가수분해물의 존재 하에 시간 경과에 따른 NprE 활성의 실험 어세이 데이타의 도시를 보여준다.

발명의 상세한 설명

개요

본 발명은 분해에 대해 증가된 안정성을 나타내는, 메탈로프로테아제 효소 및 메탈로프로테아제 억제제를 포함하는 조성물 및 세제 제제를 제공한다. 본 발명은 또한, 이들 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물 및 세제 제제의 제조 방법을 제공한다.

본원에 개시된 조성물 및 세제 제제는 모두 메탈로프로테아제를 포함하고, 증가된 안정성은 효소에 가역적으로 결합하여 효소의 자가 분해를 방지하는 경쟁적 억제제의 포함으로 인한 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 억제제는 활성 부위에 결합할 수 있고, 활성 부위에서 효소와 기질 간의 상호작용을 직접 방해할 수 있다. 대안적으로, 억제제는 활성 부위 이외의 부위 (즉, 활성 부위에 비-특이적인 부위) 에 결합해서, 예를 들어, 활성 부위에서 기질 상호 작용을 방해 또는 훼방하는 3 차 또는 4 차 구조 변경의 도입에 의해 효소와 기질 간의 촉매적 상호작용을 방지 또는 억제할 수 있다. 중요하게는, 이들 억제제-안정화된 조성물 및 세제 제제는 억제제가 결합해서 보관 동안에 메탈로프로테아제 분해를 효과적으로 약화시키나, 이어서 조성물 또는 세제가 사용되는 경우 희석 시 활성 효소를 방출, 제공하도록 제조된다. 본 발명은 분해에 대해 안정화시키기에 특히 효과적인 메탈로프로테아제 억제제로서 단백질 가수분해물을 개시한다. 특히 바람직한 구현예에서, 단백질 가수분해물 억제제는 메탈로프로테아제 효소 자체에 의한 단백질 기질의 가수분해에 의해 제조된다. 생성 가수분해 생성물은 단리될 수 있고, 이를 생성한 메탈로프로테아제에 대해 특히 효과적인 경쟁적 억제제이다.

정의

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, [Singleton and Sainsbury, Dictionoary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley 및 Sons, NY (1994) ; 및 Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)] 은 본원에서 사용되는 일반적인 사전의 많은 용어를 당업자에게 제공한다. 본원에서 기술된 것과 유사 또는 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행에서 사용되더라도, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기술된다. 따라서, 하기 바로 정의되는 용어는 전체로서 명세서에서 참조에 의해 더욱 완전히 기술된다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 문맥에서 달리 분명하게 지시하지 않는 한, 복수를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여지고 ; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카르복실 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다. 본 발명은 기술되는 특별한 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않고, 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있음을 이해한다.

본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 최대수 제한은 모든 더 낮은 수 제한을 포함하고, 그러한 더 낮은 수 제한은 본원에서 표현적으로 나타내어졌음을 이해한다. 본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 최소수 제한은 그러한 더 높은 수가 본원에서 표현적으로 쓰여진다면, 모든 더 높은 수의 제한을 포함할 것이다. 본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 수 범위는 더 좁은 수 범위가 본원에서 표현적으로 쓰여진다면, 그러한 더 광범위한 수 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수 범위를 포함할 것이다.

언급된 모든 문서는 상대적으로, 참조로써 본원에 삽입되어 있으며 ; 임의의 문서의 언급은 본 발명에 대해 선행 기술임을 허락받은 것으로서 해석되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "효소" 는 화학 반응을 촉매하는 단백질을 말한다. 효소의 촉매 기능은 그의 "활성" 또는 "촉매적 활성" 을 구성한다. 효소는 전형적으로 그것이 수행하는 촉매 기능, 예를 들어, 펩티드 결합의 가수분해의 유형에 따라 분류된다.

본원에 사용된 바와 같이, "유효량의 효소" 는 특정 용도 (예를 들어, 개인 케어 생성물, 세정 조성물 등) 에서 요구되는 촉매적 활성을 달성하는데 필요한 효소의 양을 말한다. 상기 유효량은 당업자가 이미 이해하고 있고, 많은 요소, 예컨대 사용되는 특정 효소 변이체, 세제 적용, 세제의 특정 제제 등을 바탕으로 한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로테아제" 또는 "단백질분해효소" 는 단백질에서 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소를 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "메탈로프로테아제," "메탈로단백질분해효소," 또는 "메탈로펩티다아제" 는 촉매적 활성을 수행하기 위해서는, 결합된 금속 이온을 필요로 하는 프로테아제를 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중성 메탈로프로테아제" 는 중성 pH 에서 최적으로 활성이고 촉매적 활성을 위해 아연 이온을 필요로 하는 메탈로프로테아제를 말한다. 전형적으로, 중성 메탈로프로테아제의 크기는 30 내지 40 kDa 범위이다. 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 또한 "중성 메탈로엔도펩티다아제" 라고 하고, 부류 EC 3.4.24.4 의 효소를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기질" 은 효소가 그의 촉매적 활성을 수행하여 생성물을 생성하는 성분 (예를 들어, 화학적 화합물) 을 말한다. 메탈로프로테아제의 경우, 기질은 보통 단백질이고, 그렇더라도 메탈로프로테아제는 또한 비-단백질 화합물에서 펩티드 또는 에스테르 결합에 작용할 수 있다. 따라서, 용어 "단백질 기질" 은 단백질인 기질을 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "활성 부위" 는 기질이 결합해서 촉매적 활성이 일어나는 효소의 영역을 말한다. 일부 경우에, 효소는 하나 초과의 활성 부위를 가질 수 있다. 전형적으로, 메탈로프로테아제는 단일 활성 부위를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "억제제" 는 촉매적 활성의 속도를 감소시키는 성분을 말한다. 예를 들어, 억제제는 단백질 가수분해물, 폴리펩티드, 또는 단백질 가수분해물 또는 폴리펩티드의 천연 또는 합성 유사체를 말할 수 있다. 따라서, 억제제에는 중성 메탈로프로테아제 효소의 활성 부위에 결합하는 단백질 가수분해물의 능력의 특정 측면을 흉내내는 합성 화합물이 포함될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "경쟁적 억제제" 는 효소에 가역적으로 결합하여 기질이 결합하는 것을 방지하는 억제제를 말하는데, 즉, 억제제는 활성 부위에 결합하는 기질과 경쟁하거나 또는 억제제는 효소 분자 상 어디엔가 결합하여 촉매적 기질이 활성 부위에서 효소와 상호작용하는 것을 방지 또는 억제한다.

본원에 사용된 바와 같이, "Ki" 또는 "억제 상수" 는 효소-억제제 결합 복합 체의 해리 상수, 즉, 자유 효소 농도 (즉, "[E]") 대 억제제-결합된 효소 (즉, "[E

I]") 의 비를 말한다. Ki 는 대부분의 생화학 교과서에 기술된 바와 같은 잘-공지된 정상-상태의 효소반응 속도론 기술을 사용하여 측정될 수 있다 (예를 들어, [Fersht, "Enzyme Structure and Mechanism," W.H. Freeman, 2nd Ed., 1985] 참조). 간략하게는, 억제 상수 Ki 는 알려진 기질을 사용한 어세이에서 효소의 정상-상태의 반응속도 상수 (즉, Km 및 kcat) 에 대한 억제제의 존재 (즉, 억제제 농도) 효과를 측정함으로써 결정된다.

본원에 사용된 바와 같이, "겉보기 Ki" 는 실제 억제제 농도가 정확하게 측정될 수 없는 경우에 측정되는 Ki 값을 말한다. 예를 들어, 억제제가 가수분해 생성물 혼합물 (즉, 단백질 분절의 혼합물) 인 경우, 측정된 Ki 은 "겉보기 Ki" 일 것인데, 그 이유는 절대 억제제 농도는 예를 들어, 단지 펩티드 농도의 화학 분석을 바탕으로 해서 측정될 수 있기 때문이다. 효소 분자에 결합해서 억제를 초래하는, 혼합물 내 특정 분절(들) 의 실제 농도는 측정된 농도보다 훨씬 더 낮을 것이다. 결과적으로, "겉보기 Ki" 은 정제된 억제제를 사용하여 측정될 Ki 값보다 더 높을 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가분해" 는 조직 또는 세포 그 자체의 효소에 의한 조직 또는 세포의 분해를 말한다. 한 구현예에서, 용어 "자가분해" 는 그 자체의 폴리펩티드 사슬을 효소가 가수분해하는 것을 말하는데, 예를 들어, 프로테아제 효소에 의해 자가-단백분해이다.

본원에 사용된 바와 같이, 효소와 관련해서 용어 "안정성" 은 특정 환경 조 건 하에 시간 경과에 걸쳐서 특정 수준의 기능적 활성을 유지하는 효소의 능력을 말한다. 용어 "안정성" 은 많은 문맥에서 흥미있는 특정 환경 조건을 말하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "자가 안정성" 은 자가 분해 (즉, 자가-단백질분해) 를 견뎌내는 효소의 능력을 말한다. 실제적인 안정성 변화는 안정화제 (예를 들어, 억제제 화합물) 의 부재 하에 존재하는 촉매적 활성과 비교하여, 촉매적 활성의 반감기에서 약 5% 이상의 증가 또는 감소 (대부분의 구현예에서, 이는 바람직하게는 증가) 에 의해 증거된다. 용어가 단백질의 안정성을 평가하기 위해 특정 프로테아제를 사용하는 것이 제한되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "촉매적 전환" 은 기질 또는 중간체가 효소와 접촉함으로써 기질 또는 중간체가 생성물로 개질되는 것을 말한다. 일부 구현예에서, 접촉은 기질 또는 중간체가 적절한 효소에 직접 노출됨으로써 이루어진다. 다른 구현예에서, 노출은 각각 기질 또는 중간체를, 효소를 발현 및/또는 분비하고/거나, 또는 목적하는 기질 및/또는 중간체를 목적하는 중간체 및/또는 최종-생성물로 대사하는 개체에 노출시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분해" 는 단백질 기질이 프로테아제에 의해 생성물로 촉매적 전환되는 것을 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된" 및 "단리된" 은 성분 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드) 이 자연적으로 함께 있는 물질의 제거 및/또는 샘플로부터의 오염물의 제거를 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가수분해물" 은 가수분해에 의해 생성되는 임의의 성분을 말한다. 상기 용어는 가수분해의 특정 방법에 의해 생성되는 성분에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어는 촉매 반응뿐만 아니라 비-촉매 반응에 의해 생성되는 "가수분해물" 을 포함하는 것이다. 예를 들어, 공지된 가수분해 효소 (예를 들어, 세린 프로테아제, 메탈로프로테아제, 가수분해효소 등) 는 상기 용어가 본 출원에서 사용되는 의미 내에서 가수분해물을 생성할 수 있다. 유사하게는, 비-촉매적 방법의 가수분해 (예를 들어, 산/염기 가수분해 등) 또한 본 출원에서 사용되는 의미 내에서 가수분해물을 생성한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 가수분해물" 은 임의의 유형 또는 부류의 단백질의 가수분해에 의해 생성되는 가수분해물을 말한다. 공지된 단백질은 가수분해되어, 본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어의 의미 내에서 단백질 가수분해물을 생성할 수 있다. "단백질 가수분해물" 은 촉매적 방법뿐만 아니라 비-촉매적 방법에 의해 생성될 수 있고, 크기가 2 내지 100 개 이상의 아미노산 범위인 단백질 분절 (예를 들어, 폴리펩티드) 을 포함할 수 있다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같이, "단백질 가수분해물" 은 단일 생성물 화합물에 제한되지 않으나, 가수분해 생성물 (예를 들어, 단백질 분절) 의 비균일 분배물 또는 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 가수분해 생성물의 균일 화합물 또는 정제된 분획을 포함할 수 있다. 단백질 가수분해물의 바람직한 구현예에는 하기가 포함된다 : HyPep 4601™ (밀 글루텐의 단백질 가수분해물), 아미소이 (콩 단백질 산 가수분해물), 아미카제 (소 젖의 카제인 산 가수분해물), 프로테오스 펩톤 (식물성 단백질의 효소 가수분해물).

본원에 사용된 바와 같이, "단백질" 은 아미노산으로 이루어지고 당업자에 의해 단백질로서 인지되는 조성물을 말한다. 용어 "단백질," "펩티드" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 여기서, 펩티드가 단백질의 일부이며, 당업자는 문맥에서 용어의 사용을 이해한다. 용어 "야생형" 및 "천연" 은 자연에서 발견되는 단백질을 말한다. 일부 구현예에서, 야생형 단백질의 서열은 단백질 조작 프로젝트의 출발점이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "관련 단백질" 또는 "동종 단백질" 은 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 (즉, 유사한 작용 및/또는 구조를 갖는) 단백질을 말한다. 상기 용어는 상이한 종에서 수득되는 동일한 또는 유사한 효소(들) (즉, 구조 및 기능 면에서) 를 포함하는 것이다. 본 발명은 진화적으로 관련있는 단백질 또는 특정 기원(들) 의 단백질에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 관련 또는 동종 단백질은 3 차 구조 동종체 및 1 차 서열 동종체를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 야생형 서열에 대해 "변이체" 또는 "돌연변이체" 서열을 갖는 단백질을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세제," "세제 조성물," 및 "세제 제제" 는 오염된 물체의 세정을 위한 세정 매질에서 사용되고자 하는 혼합물을 말한다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 직물 및/또는 의복을 세탁하는데 (예를 들어, "세탁 세제") 사용된다. 다른 구현예에서, 상기 용어는 식기, 식탁용 칼붙이 등을 세정하는데 사용되는 것과 같은 세제 (예를 들어, "식기 세정제") 를 말한다. 일반적으로, 상기 용어는 예를 들어, 메탈로프로테아제 효소, 메탈로프로테아제 억제 제 예컨대 단백질 가수분해물, 효소 안정화제 예컨대 폴리프로필렌 글리콜, 계면활성제, 트랜스퍼라아제(들), 가수분해 효소, 산화환원효소, 보강제, 표백제, 표백활성화제, 청색화제 및 형광 염료, 케이킹 (caking) 억제제, 가림제 (masking agent), 효소 활성화제, 항산화제, 및 용해제를 포함하는, "중질 액체" ("HDL") 제제를 포함하여, 제제를 포함하는 것이다. 본 발명은 특정 세제 제제 또는 조성물에 제한되는 것이 아니다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "계면활성제" 는 표면 장력을 감소시키는 표면 활성 화합물을 말한다. 상기 용어는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양친매성 계면활성제, 쯔비터이온성 계면활성제, 준-극성 비이온성 계면활성제, 및 그의 혼합물을 포함하여, 모든 잘-알려진 유형의 계면활성제 및 계면활성제계를 포함하는 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 구 "세제 안정성" 은 특정 환경 조건 하에 그리고 특정 기간 동안 세정 매질에서 오염된 물체를 세정하는 능력을 유지하는 세제 조성물의 능력을 말한다. 세제 안정성은 그의 보관 기간 (즉, 사용-전) 동안의 안정성, 또는 세정 매질에서의 사용 동안의 안정성을 말하는데 사용될 수 있다. 세제 안정성은 안정성을 측정하는데 사용되는 세정 테스트의 유형에 따라 다양할 수 있다. 더욱이, 세제 안정성은 상기 특정 성분이 실질적으로 세정 테스트에 기여하는 경우 세제 제제에서 특정 활성 성분의 안정성에 밀접하게 상응할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "세정 조성물" 및 "세정 제제" 는 세정되어야 할 물품, 예컨대, 직물, 식기, 콘택트 렌즈, 기타 고체 기질, 헤어 (샴푸), 피부 (비누 및 크림), 치아 (구강세척제, 치약) 등으로부터 불필요한 화합물을 제거하는데 사용되는 조성물을 말한다. 상기 용어는 조성물이 조성물에서 사용되는 메탈로프로테아제 및 다른 효소(들) 와 융화성인 한, 목적하는 세정 조성물의 특정 유형 및 생성물 (예를 들어, 액체, 젤, 과립, 또는 스프레이 조성물) 의 형태에 대해 선택되는 임의의 물질/화합물을 포함한다. 세정 조성물 물질의 특정 선택은 세정될 표면, 물품 또는 직물, 및 사용 동안의 세정 조건에 대한 조성물의 목적하는 형태를 고려하여 당업자에 의해 쉽게 이루어진다.

용어 "세정 조성물" 및 "세정 제제" 는 물체 및/또는 표면의 세정, 표백, 소독 및/또는 멸균에 적합한 임의의 조성물을 말한다. 상기 용어는 세제 조성물 (예를 들어, 액체 및/또는 고체 세탁 세제 및 미세한 직물 세제 ; 경 표면 세정 제제, 예컨대 유리, 나무, 세라믹 및 금속 카운터 탑 및 창문용 세정 제제 ; 카펫 세정제 ; 오븐 세정제 ; 직물 후레셔너 (섬유 freshener) ; 직물 유연제 ; 및 섬유 및 세탁 예비-스포터 (pre-spotter), 뿐만 아니라 식기 세제) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

더욱이, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "세정 조성물" 및 "세정 제제" 는 달리 언급되지 않는 한, 과립 또는 분말-형 범용 또는 중질 세정제, 특히 세정 제제 ; 액체, 젤 또는 페이스트-형 범용 세정제, 특히, 소위 중질 액체 (HDL) 유형 ; 액체 미세-직물 세제 ; 손 세정제 또는 경질 식기세정제, 특히 높은-포밍 (foaming) 유형의 것들 ; 가정 및 산업용 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼-보조 유형을 포함하여 식기세척기용 제제 ; 항균 손-세정 유형, 세정 바, 구강세척제, 의치 세정제, 차 또는 카펫 샴푸, 욕실 세정제를 포함하여 액체 세정 및 소독제 ; 헤어 샴푸 및 헤어-린스 ; 샤워 젤 및 폼 배쓰 및 금속 세정제 ; 뿐만 아니라 세정 보조제 예컨대 표백 보조제 및 "얼룩-스틱" 또는 예비-처리 유형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "직물" 은 임의의 섬유 물질을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 의복, 뿐만 아니라, 직물, 방적사, 섬유, 부직포, 천연 물질, 합성 물질, 및 임의의 다른 섬유 물질을 포함하는 것이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 DNA 분자" 는 분자 생물학적 기술에 의해 함께 조인된 DNA 분절로 이루어진 DNA 분자를 말한다.

용어 "재조합 올리고뉴클레오타이드" 는 폴리뉴클레오타이드 서열의 제한 효소 분해에 의해 생성되는 2 개 이상의 올리고뉴클레오타이드 서열의 연결, 올리고뉴클레오타이드의 합성 (예를 들어, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드의 합성) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 분자 생물학적 조작을 사용하여 만들어진 올리고뉴클레오타이드를 말한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "조절 원소" 는 핵산 서열의 발현의 일부 측면을 조절하는 유전적 원소를 말한다. 예를 들어, 프로모터는 조작적으로 연결된 코딩 영역의 전사의 개시를 유용하게 하는 조절 원소를 말한다. 추가의 조절 원소에는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호 및 종료 신호가 포함된다.

용어 "프로모터/인핸서" 는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 제공할 수 있 는 서열을 함유하는 (예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부분은 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 함유함) DNA 분절을 말한다. 인핸서/프로모터는 "내인성" 또는 "외인성" 또는 "이종성" 일 수 있다. 내인성 인핸서/프로모터는 게놈 내 주어진 유전자에 자연적으로 연결된 것이다. 외인성 (이종성) 인핸서/프로모터는 유전자 조작 (즉, 분자 생물학적 기술) 에 의해 유전자 옆에 위치한 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "발현 벡터" 는 적합한 숙주 내에서 DNA 의 발현에 영향을 미칠 수 있는 적합한 조절 서열에 조작적으로 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구축물을 말한다. 상기 조절 서열은 전사에 영향을 미치는 프로모터, 상기 전사를 조절하는 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 번역의 종료를 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순하게는 강력한 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과는 독립적으로 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 자체에 혼입될 수 있다.

용어 "플라스미드," "발현 플라스미드," 및 "벡터" 는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 상기 플라스미드는 현재 가장 흔히 사용되는 형태의 벡터이다. 그러나, 본 발명은 상응하는 작용을 하고 당업자에게 알려지거나 또는 알려지게 되는 그러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함하고자 한다.

핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서, 용어 "도입된" 은 형질전환 (trans포맷ion), 유전자도입 (transduction) 또는 트랜스펙션 (transfection) 을 의미한 다. 형질전환의 수단은 당업계에 알려진 바와 같이 원형질 형질전환, 염화칼슘 침전, 전기천공, 네이키드 DNA 등을 포함한다 ([Chang and Cohen, Mol. Gen. Genet., 168:111-115 [1979]; Smith 등, Appl. Env. Microbiol., 51:634 [1986]; and the review article by Ferrari 등, in Harwood, Bacillus, Plenum Publishing Corporation, pp. 57-72 [1989]] 참조).

본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포" 는 일반적으로 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축된 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주이다. 형질전환된 숙주 세포는 목적하는 단백질 변이체를 발현하거나 또는 단백질 변이체를 암호화하는 벡터를 복제할 수 있다. 단백질 변이체의 전- 또는 전전-형태를 암호화하는 벡터의 경우, 상기 변이체는, 발현되는 경우, 전형적으로 숙주 세포에서 숙주 세포 매질로 분비된다.

중성 메탈로프로테아제 효소

메탈로프로테아제는 박테리아, 진균류뿐만 아니라 더 고등 개체에서 발견되는 다양한 부류의 프로테아제이다. 메탈로프로테아제의 활성 부위에 있는 결합된 금속 이온은 물 분자의 촉매적 활성화를 가능하게 한다. 다음, 물 분자는 펩티드 결합의 카르보닐기를 절단하는 친핵체로서 작용한다. 다양한 서열 및 구조가 상기 부류에 존재하나, 큰 대다수의 메탈로프로테아제는 활성 부위에 결합된 아연 이온을 포함한다. 일부 메탈로프로테아제에서, 아연 이온은 활성 소실 없이 코발트 또는 니켈과 같은 또다른 금속 이온에 의해 대체될 수 있다. 현재 이해되는 바와 같이, 메탈로프로테아제의 촉매 기작은 효소에 의해 절단되는 카르 보닐기 상에서 아연-결합된 물 분자의 공격을 통해 형성되는 비-공유 사면체 중간체를 포함한다.

중성 메탈로프로테아제 (즉, 중성 메탈로엔도펩티다아제, EC 3.4.24.4) 는 촉매적 활성을 위해 아연 이온이 절대적으로 필요한 프로테아제 부류에 속한다. 이들 효소는 중성 pH 에서 최적으로 활성이고, 30 내지 40 kDa 크기 범위에 있다. 중성 메탈로프로테아제는 단백질의 구조적 안정성에 기여하는 2 내지 4 개의 칼슘 이온에 결합한다. 중성 메탈로프로테아제 패밀리는 박테리아 효소 서몰리신 (thermolysin), 및 기타 서몰리신-형 프로테아제 ("TLP"), 뿐만 아니라 카르복시펩티다아제 A (분해 효소), 및 조직 리모델링 및 분해에 관여하는 반응을 촉매하는 매트릭스 메탈로프로테아제를 포함한다.

아마도, 기능 및 안정성 면에서 가장 특징화된 중성 메탈로프로테아제는 서몰리신 및 TLP 이다. 많은 연구가 그의 열적 안정성을 증가시키기 위해 바실러스 서브틸리스 서몰리신을 조작하는데 초점을 맞추었다 (예를 들어, [Vriend 등, In, Tweel 등 (eds), Stability and Stabilization of Enzymes, Elsevier, pp. 93-99 [1993]] 참조). 고온에서의 자가분해 및 변성을 증진시키는 국소 풀림 과정을 방지할 수 있는, 분자 모델링을 통해 규명된, 구조적 결정체를 변형시킴으로써 TLP 의 안정성을 증가시키기 위해 많은 노력이 수행되었다 (예를 들어, [van den Burg 등, in Hopsu-Havu 등, (eds), Proteolysis in Cell Function Manipulating the Autolvtic Pathway of a Bacillus Protease. Biomedical 및 Health Research Vol. 13, IOS Press [1997] p. 576] 참조). 칼슘 이온이 중성 메탈로프로테아 제 자가분해의 방지를 도울 수 있다고 보고되었다. B. 스테아로서모필루스 (B. stearothermophilus) 중성 프로테아제는 칼슘의 첨가에 의해 자가분해 및 단백분해에 대해 안정화되었다 ([Duerrschmidt 등, FEBS J., 272:1523-1534 [2005]]참조).

개선된 특징을 갖는 NprE 를 포함하여 중성 메탈로프로테아제를 조작하기 위한 조성물 및 방법은 본원에 참조로써 삽입된 2006 년 10 월 12 일에 출원된 미국 특허 출원 제 11/581,102 호에 기술되어 있다. 다른 측면 중에서, 미국 특허 출원 제 11/581,102 호는 그의 구조적 안정성을 유지하기 위해, 칼슘과는 독립적인 중성 메탈로프로테아제의 조작에 적합한 조성물 및 방법을 제공한다. 그에 제공된 다른 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제의 조작은 단백질분해를 방지할 수 있는 특정 2 차 구조 원소에서의 국소적인 풀림을 방지한다.

미국 특허 출원 제11/581,102 호에 기술된 안정한 중성 메탈로프로테아제 중에서, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스의 야생형 메탈로프로테아제 (예를 들어, 정제된 MULTIFECT® Neutral; "PMN") 및 NprE 라고 하는 재조합 중성 메탈로프로테아제 (예를 들어, 바실러스 서브틸리스에 클로닝된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 중성 메탈로프로테아제) 가 있다.

바실러스 아밀로리퀘파시엔스의 중성 메탈로프로테아제외에도, 본 발명은 다른 기원, 특히 바실러스 sp. 기원의 관련 효소의 용도를 포함하며, 이에는 B. 세루우스 (B. cereus), B. 세루우스 E33L (B. cereus E33L), B. 칼도리티쿠스 (B. caldolyticus), B. 푸물리스 (B. pumulis), B. 메가테륨 (B. megaterium), B. 서브틸리스 아밀로사카리티쿠스 (B. Subtilis amylosacchariticus), 브레비바실러스 브 레비스 (Brevibacillus brevis), 팬니바실러스 폴리믹사 (Paenibacillus polymyxa) (바실러스 폴리 믹사), B. 스테아로서모필루스, B. 투린기엔시스 (B. thuringiensis), B. 서브틸리스 및 S. 아우레우스 (S. aureus) 로부터 수득되는 메탈로프로테아제 동종체, 뿐만 아니라 아우레오리신 (aureolysin), 세포외 엘라스타제 (extracellular elastase), 및 중성 프로테아제 B 가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구현예에 유용한 메탈로프로테아제는 메탈로프로테아제가 아닌 용액 또는 제제 내 오염성 단백질 및 다른 화합물을 제거함으로써 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 메탈로프로테아제는 박테리아 또는 진균류 숙주 세포에서 발현되고, 이들 재조합 메탈로프로테아제는 다른 숙주 세포 구성물의 제거에 의해 정제되고 ; 재조합 메탈로프로테아제 폴리펩티드의 % 는 샘플에서 증가된다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 메탈로프로테아제는 SDS-PAGE 또는 당업계에 공지된 다른 표준에 의해 측정되는 바와 같이, 실질적으로 99% 이상의 단백질 성분의 수준으로 정제된다. 대안의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 메탈로프로테아제는 조성물의 프로테아제 성분의 약 99% 이상을 포함한다. 더욱 다른 대안의 구현예에서, 메탈로프로테아제는 총 단백질 및/또는 프로테아제의 약 90 ~ 95% 이상의 범위로 존재한다.

야생형 및 변이체 메탈로프로테아제 효소의 기능적 특징화는 적합한 수단을 통해 달성될 수 있고, 바람직하게는 흥미있는 특성의 평가를 바탕으로 한다. 예를 들어, pH 및/또는 온도, 뿐만 아니라 세제 및/또는 산화 안정성은 본 발명의 일부 구현예에서 결정된다. 실제로, 이들 특징 중 하나 이상에서 다양한 정도의 안정성 (단백분해 또는 자가분해 안정성, 세제 안정성, pH, 온도, 및/또는 산화 안정성) 을 갖는 메탈로프로테아제 효소는 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다.

세제 제제 안정성을 위한 효소의 개선 접근법은 효소 자체의 구조를 변경하는 것 - 즉, 세제 제제 조건 하에 증가된 활성 및/또는 특이성을 나타내는 변이체 아미노산 서열을 가진 효소의 개발이다. 예를 들어, 많은 프로테아제 변이체가 당업계에 개시되어 있다. 예를 들어, U.S. Reissue Pat. No. 34,606 (Genencor) 에 상응하는 EP 0 130 756 ; EP 0 214 435 (Henkel) ; WO 87/04461 (Amgen) ; WO 87/05050 (Genex) ; EP 0 260 105 (Genencor) ; WO 88/08028 (Genex) ; WO 88/08033 (Amgen) ; WO 95/27049 (Solvay) ; WO 95/30011 (Procter & Gamble) ; WO 95/30010 (Procter & Gamble) ; WO 95/29979 (Procter & Gamble) ; U.S. Pat. No. 5,543,302 (Solvay) ; EP 0 251 446 (Genencor) ; WO 89/06279 (Novozymes A/S) ; WO 91/00345 (Novozymes A/S) ; EP 0 525 610 Al (Solvay) 를 참조한다.

변이체 효소는 소수의 아미노산 잔기에 의해 모 단백질과 그리고 서로 상이할 수 있다. 상이한 아미노산 잔기의 수는 하나 이상, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 개 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 바람직한 구현에에서, 변이체 간의 상이한 아미노산의 수는 1 내지 10 이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 관련 단백질 및 특히 변이체 단백질은 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 포함한다.

다수의 방법이 본 발명의 효소의 변이체를 생성하기에 적합한 것으로 당업계에 알려져 있으며, 상기 방법에는 위치-포화 돌연변이, 스캐닝 돌연변이, 삽입 돌연변이, 랜덤 돌연변이, 위치-특이적 돌연변이, 및 위치-진화, 뿐만 아니라 다양한 기타 재조합 접근법이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

중성 메탈로프로테아제 변이체 서열의 범위는 본원에 참조로써 삽입된 2006 년 10 월 12 일에 출원된 미국 출원 제 11/581,102 호에 기술되어 있다. 이들 변이체 효소는 정도를 달리하면서 야생형 효소와 기능적인 특징 면에서 상이할 수 있다. 그러나, 상기 변이체 중성 메탈로프로테아제가 자가분해 활성을 갖고 또한 단백질 가수분해물에 의해 경쟁적으로 억제되는 점에서, 이는 본원에 개시된 제제 및 방법에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 구현예의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 중 임의는 야생형 중성 메탈로프로테아제 효소뿐만 아니라 일련의 활성 돌연변이 및 다른 변이체와 함께 적용될 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 특정 단백질 가수분해물이 세제 제제에서의 개선된 안정성에 더욱 선호할만한 억제제 결합 특징을 나타낼 중성 메탈로프로테아제 활성 부위를 조작하기 위해 위치-특이적 돌연변이를 사용하는 것을 포함한다. 돌연변이의 중성 메탈로프로테아제 "위치 평가 라이브러리" (SEL) 를 생성하는 방법은 본원에 참조로써 삽입된 2006 년 10 월 12 일에 출원된 미국 출원 제 11/581,102 호에 개시되어 있다. 본 발명에 따라, 이들 SEL 은 세제 제제 및 세정 조성물에서의 자가 분해에 대해 안정화하기 위해 이들 억제제를 사용하는 능력을 향상시키는 개선된 단백질 가수분해물 (또는 다른 억제제) 결합 특징에 대해 스크리닝될 수 있는 중성 메탈로프로테아제의 활성 부위 돌연변이의 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다.

억제제 및 안정화제로서의 단백질 가수분해물

중성 메탈로프로테아제, 예컨대 NprE 는 용액에서 보관되었을 때, 시간 경과에 따라 유의한 활성 소실을 겪을 수 있다. 이러한 효소 활성 소실 중 많은 것은 자가분해로 인한 것인데, 즉, 중성 메탈로프로테아제 분자는 다른 메탈로프로테아제 효소 분자 또는 심지어 그 자체를 촉매적으로 단백분해시킨다. 자가분해는 효소의 접힌 구조를 비가역적으로 손상시킬 수 있어서, 그의 기능 및 활성이 크게 약화 또는 완전히 파괴된다. 전형적으로, 이러한 자가 활성 소실은 세제 제제가 노출되는 세정 조건에 종종 사용되는 더 높은 온도에 의해 가속화된다. 결과적으로, 이러한 효소 활성 소실은 세제 안정성의 직접적인 소실을 초래한다.

이상적으로는, 자가분해를 최소화하기 위해, 각각의 중성 메탈로프로테아제는 사용 준비가 될 때까지 그의 촉매적 활성에 참여하는 것으로부터 차단되어야 할 것이다. 효소의 억제제는 그의 활성을 차단할 수 있는데 ; 그러나, 억제제가 효소의 활성 부위에 결합하는 것은 종종 극도로 타이트하고 비가역적이다. 예를 들어, 소위 "자살 억제제" 는 화학적으로 효소의 활성 부위를 변형시켜서, 임의의 촉매적 활성을 다시 얻지 못하게 한다.

붕소-기재 억제제 화합물 (예를 들어, 붕산 및 다양한 붕소산) 과 같은 억제 제를 첨가함으로써 세제 제제에서 세린 프로테아제의 보관 안정성을 향상시키는 방법이 알려져 있다. 이들 붕소-기재 억제제는 세린 프로테아제 효소를 가역적으로 억제시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 붕소산에 의한 세린 프로테아제 서브틸리신의 억제에 대한 논의는 [Molecular & Cellular Biochemistry 51, 1983, pp. 5-32] 에 제공되어 있다. 그러나, 이들 붕소-기재 억제제는 메탈로프로테아제를 강하게 억제시키지 못해서, 이는 세린 프로테아제보다 상이한 촉매적 기작에 의해 작용한다. 추가로, 조절 작용 (agency) 은 붕소-기재 화합물의 안정성에 관한 질문을 야기하기 시작하였고, 이들의 환경으로의 방출을 제한할 것을 고려하고 있다.

본 발명의 목적을 위해, 메탈로프로테아제의 억제제는 메탈로메탈로프로테아제의 자가 활성을 가역적인 방식으로 차단하는 것이 요구된다. 상기 억제제는 메탈로프로테아제가 보관되는 경우 타이트하게 그러나 가역적으로 결합한 다음, 효소 분자로부터 해리되어, 효소가 그의 촉매적 작용이 요구될 때 그의 활성을 유지할 수 있게 한다. 더욱이, 이러한 가역적 억제는 효소가 세제 제제 또는 다른 세정 조성물 내 성분인 경우, 존재하는 환경 조건과 융화성이어야 한다.

따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물을 제공한다 :

(a) 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량% 의 중성 메탈로프로테아제; 및

(b) 경쟁적 억제제, 여기서, 경쟁적 억제제는 상기 중성 메탈로프로테아제 분자 중 90% 이상에 결합함. 이러한 억제제-안정화된 조성물은 액체 또는 건성 (예를 들어, 과립) 제제일 수 있다. 한 구현예에서, 조성물은 하기 더 상세히 기술되는 본 발명의 세제 제제의 제조에서 전구체 성분으로서 사용된다. 또다른 구현예에서, 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 하기 더 상세히 기술되는 캡슐화된 입자로 있다.

세린 프로테아제 효소는 더 높은 농도에서 보관되는 경우 더 큰 활성을 유지한다고 잘 알려져 있다. 이는 효소가 더 높은 농도에 있을 때, 자가 생성물이 세린 프로테아제 활성 부위에 결합해서인 것으로 생각된다. 즉, 자가 생성물 해리 속도가 크게 감소된다. 그 결과, 더 높은 전반적인 효소 농도가 자가분해 생성물이 억제제로서 작용하도록 야기한다. 농도가 저하되는 경우 (희석에 의해), 자가분해 생성물이 쉽게 해리될 수 있고, 자가분해 반응이 재생될 수 있다.

하기 실시예 1 에서 개시된 바와 같이, 중성 메탈로프로테아제는 더 높은 농도에서 보관될 때 증가된 안정성 (즉, 시간 경과에 따라 더 큰 활성을 유지함) 을 나타낸다. 세린 프로테아제 효소로서, 농도에 따른 이러한 증가된 안정성은 메탈로프로테아제 효소의 자가 생성물이 억제제로서 작용함을 지시하는 것으로 보인다.

따라서, 한 구현예에서 본 발명은 중성 메탈로프로테아제 용액을 포함하는 안정화된 중성 메탈로프로테아제 제제를 포함하는데, 여기서, 중성 메탈로프로테아제의 농도는 약 500 ppm, 1000 ppm, 2500 ppm, 5000 ppm, 10000 ppm, 또는 그 이상이다. 한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 용액은 추가로 약 10% 이상의 프로필렌 글리콜을 포함한다. 또다른 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 용액은 추가로 약 0.5 mM 이상, 예를 들어, 약 0.5 mM 내지 약 5 mM 의 칼슘 이온 (예를 들어, 염화칼슘, 포르메이트, 시트레이트, 아스코르베이트, 아세테이트 또는 포스페이트) 을 포함한다. 한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 용액은 약 0.5 mM 내지 약 5 mM 의 CaCl₂ 를 포함한다.

중성 메탈로프로테아제, 예컨대 NprE 가 높은 농도에서 자가 분해 생성물의 억제를 수행한다는 관찰은 다른 가수분해 생성물이 억제제로서 작용하여 자가분해에 대해 안정화될 수 있음을 제안한다. 따라서, 한 구현예에서 본 발명은 중성 메탈로프로테아제 및 단백질 가수분해물을 포함하는 중성 메탈로프로테아제 함유 제제 (또는 조성물) 를 포함한다. 한 구현예에서, 단백질 가수분해물은 중성 메탈로프로테아제 자체에 의해 생성된다. 예를 들어, 하기 실시예 2 에서 개시된 바와 같이, 소 단백질, 예컨대 젖 카제인은 활성 중성 메탈로프로테아제, 예컨대 NprE 로 처리되어, 단백질 가수분해물 혼합물을 촉매적으로 생성한다. 전형적으로, 이러한 촉매적으로 생성된 단백질 가수분해물은 다양한 크기의 펩티드 생성물의 이종 혼합물로서, 예를 들어, 상기 펩티드는 카제인의 NprE 촉매화된 분해로 인한 것이다. 한 구현예에서, 이러한 촉매적으로 생성된 단백질 가수분해물 조성물은 그 자체로 억제제로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 혼합물은 추가로 단리 및/또는 정제되어, 더욱 농축된 및/또는 균질한 단백질 가수분해물 조성물을 생성할 수 있다.

본 발명의 한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 생성 단백질 가수분해물은 5000 Da MW 컷-오프 막을 통해 진행되어, 저분자량 혼합물을 생성한다. 다음, 이러한 저분자량 혼합물이 중성 메탈로프로테아제를 함유하는 제제에 첨가되어, 보관 동안의 자가 분해에 대해 안정화된다.

본 발명에 따라, 메탈로프로테아제 억제제는 경쟁적 억제제이어야 할 것이다. 가역적으로 결합하는 경쟁적 억제제를 사용함으로써, 실질적으로 적은 메탈로프로테아제가 세제 제제 또는 다른 세정 조성물에서 사용될 수 있다. 억제제-안정화된 메탈로프로테아제의 생성을 위한 경쟁적 억제제를 선택할 때 고려해야 할 요소는 하기이다 :

(1) 메탈로프로테아제 억제제는 K_i 로 선택되어야 할 것이고/거나, 또는 억제제는 세제 제제 (또는 세정 조성물) 내 효소 분자 중 약 90% 이상이 보관 동안에 (즉, 사용 전에) 억제제에 결합되도록 하는 충분한 양으로 첨가되어야 할 것임 ; 및

(2) 억제제는 또한 보관 동안에, 세제 제제 (또는 세정 조성물) 가 약 10-배 내지 약 10,000-배, 또는 약 10-배 내지 약 100,000-배로 물 (또는 다른 적절한 액체) 과 희석될 때, 약 25%, 50%, 75%, 95% 이상의 결합된 억제제가 효소 분자로부터 방출되도록 선택되어야 함.

한 구현예에서, 경쟁적 억제제는 희석 전, 및 약 10-배 내지 약 10,000-배, 또는 약 10-배 내지 약 100,000-배로 물 (또는 다른 적절한 액체) 과의 희석 시 약 90% 이상의 메탈로프로테아제 분자에 결합하는 양으로 존재하고, 억제제는 약 25%, 50%, 75%, 95% 이상의 결합된 효소 분자로부터 해리되고, 그러한 분자는 촉매적으로 활성 형태로 방출된다.

본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 구현예 중에서, 선택된 메탈로프로테아제 억제제는 단백질 가수분해물일 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 메탈로프로테아제 억제제는 메탈로프로테아제에 의한 단백질의 가수분해에 의해 제조되는 단백질 가수분해물이다. 한 구현예에서, 메탈로프로테아제는 NprE 이고, 억제제는 NprE 에 의해 생성되는 소 젖 카제인의 가수분해 생성물이다. 또다른 구현예에서, 메탈로프로테아제는 NprE 이고, 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 가수분해물이다 : 밀 글루텐 가수분해물 (예를 들어, HyPep 4601™), 콩 단백질 산 가수분해물 (예를 들어, 아미소이), 소 젖의 카제인 산 가수분해물 (예를 들어, 아미카제), 식물성 단백질의 효소 가수분해물 (예를 들어, 프로테오스 펩톤), 및 그의 혼합물.

많은 다른 단백질 가수분해물 혼합물이 시판된다. 예를 들어, 하기 단백질 가수분해물은 Sigma Chemical 카탈로그에 열거되어 있다 : 알부민 가수분해물 ; 카제인 산 가수분해물 비타민 프리 (free) ; 카제인 가수분해물 ; 카제인 가수분해물 브로스 (broth) ; 카제인 마그네슘 브로스 ; 카제인 효모 마그네슘 아가 (agar) ; 카제인 효모 마그네슘 브로스 ; Edamin® K ; 젤라틴 가수분해물 촉매 ; 옥수수의 글루텐 촉매적 가수분해물 ; Hy-Case P ; Hy-Case® M ; 락트알부민 가수분해물 ; 간 가수분해물 ; N-Z-Amine® B ; N-Z-Amine® BT ; N-Z-Amine® YTT ; 펩톤 ; 카제인의 펩톤, 산 분해물 ; 락트알부민의 분해, 촉매적 분해, 쉽게 용해성 ; 고기의 펩톤, 펩티드 분해 ; 우유 고체의 펩톤 ; 연어의 펩톤 ; 펩톤 Hy-Soy® T ; 펩톤 N-Z-Soy® BL 4 ; 프리마톤 (Primatone) ; 단백질 가수분해물 아미카제® ; 단백질 가수분해물 N-Z-Amine® AS ; 프로테오스 펩톤 ; 콩 단백질 산 가수분해물 ; 트립톤 ; 트립토스 ; 및 식물성 가수분해물 No. 2.

모든 이러한 단백질 가수분해물 혼합물은 단백질의 가수분해로 인한 펩티드 분절의 혼합물을 포함하여 공통적인 특징을 공유한다. 이러한 공통적인 특징으로 바탕으로, 당업자는 각각의 단백질 가수분해물 혼합물이 메탈로프로테아제의 강력한 억제제임을 인지하게 될 것이다. 본 발명의 교시에 따라, 당업자는 목적하는 메탈로프로테아제를 억제시키는 (및 자가분해에 대해 안정화시키는) 그의 능력에 대해 이러한 단백질 가수분해물을 스크리닝할 수 있다. 실제로, 많은 이러한 단백질 가수분해물 혼합물은 공통적인 단백질 (예를 들어, 카제인) 의 가수분해를 바탕으로 한다. 결과적으로, 상기 혼합물은 유사한 구조의 폴리펩티드 분절를 포함하는 것으로 타당하게 예상될 수 있으며, 결과적으로, 메탈로프로테아제의 억제제로서 유사한 작용을 할 수 있는 것으로 예상될 수 있다. 하기 추가로 설명될 바와 같이, 단백질 가수분해물의 작용은 효소반응 속도론의 잘-알려진 기술을 사용해 쉽게 결정된다.

한 구현예에서, 본 발명에 따라 유용한 메탈로프로테아제 억제제는 흥미있는 메탈로프로테아제를 사용하여 그의 관찰된 Ki 값을 바탕으로 선택된 경쟁적 억제제이다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 단백질 가수분해물의 겉보기 Ki 는 표준, 잘 알려진, 정상-상태의 효소반응 속도론을 사용하여 측정될 수 있다. 분자량이 약 5000 Da 미만인 NprE 생성 카제인 가수분해 생성물을 사용하여, 정상 상태의 효소반응 속도론 분석은 약 10 mM 의 겉보기 Ki 를 제공한다.

하기 실시예 2 에서 나타낸 바와 같이, 중성 메탈로프로테아제에 의해 생성된 카제인 단백질 가수분해 생성물 조성물은 효소의 경쟁적 억제제로서 작용한다. 한 구현예에서, 본 발명은 약 15 mM, 약 10 mM, 약 5 mM, 약 0.5 mM 또는 그보다 더 낮은 값의 겉보기 Ki 를 나타내는 단백질 가수분해물의 용도를 포함한다. 효소 생성 가수분해물 조성물의 성질이 펩티드의 이종 혼합물이기 때문에 겉보기 Ki 값이 측정되고, 일부 펩티드는 약한 억제제로서 작용하거나 또는 전혀 효소를 억제시키지 못하는 것으로 보인다.

상대적으로 정제된, 상대적으로 동종인 단백질 가수분해물 조성물의 경우, 측정된 Ki 는 대략 1 ~ 10 μM 의 Ki 의 범위에서 대략 100-배 내지 1000-배 미만인 것으로 예상될 것이다.

일반적으로, 본 발명은 메탈로프로테아제가 메탈로프로테아제를 사용한 억제제에 대해 측정된 Ki 값의 약 5-배 내지 약 10-배, 약 5-배 내지 약 100-배, 또는 그 이상의 배인 억제제 농도의 존재 하에 있는 경우, 최적의 억제가 발생한다.

세제 제제에서의 메탈로프로테아제의 억제제로서의 단백질 가수분해물의 유용성을 바탕으로, 본 발명은 또한 액체 세제 제제의 제조, 또는 세정 조성물을 포함하는 다른 적용에서 전구체로서 사용될 수 있는 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물을 포함한다. 상기 구현예에서, 본 발명은 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량% 의 중성 메탈로프로테아제를 포함하는 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물을 제공하는데, 여기서, 경쟁적 억제제는 상기 중성 메탈로프로테아제 분자 중 약 90% 이상에 결합한다. 이러한 억제제-안정화된 조성물은 액체 또는 건조 (예를 들어, 과립형) 제제일 수 있다. 또다른 구현예에서, 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 캡슐화된 입자로 있다.

건조 조성물의 제조는 용액 내 효소를 단백질 기질 (예를 들어, 카제인) 또는 단백질 가수분해물 (예를 들어, 아미소이) 과 접촉시킴으로써 메탈로프로테아제 분자의 약 90% 이상이 가수분해물 억제제에 결합되도록 하는 농도에서 억제제 결합된 효소를 우선 제조하는 것을 포함한다. 다음, 상기 용액을 예를 들어, 동결건조, 냉동-건조, 및/또는 단백질 제제의 분야에서 잘 알려진 다른 기술에 의해 탈수시킨다. 이러한 생성 건조된 억제제-결합된 효소 조성물은 임의로, 물 및 다른 세제 제제 성분과 재구성함으로써 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 액체 세제 제제의 제조에서 이후의 사용을 위해 보관된다.

대안적으로, 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 캡슐화된 입자 제제를 제조하는데 사용될 수 있다.

따라서, 또다른 구현예에서, 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 조성물을 하기와 조합하는 방법에 의해 세제 제제를 제조하는데 사용된다 :

(a) 물 ;

(b) 약 0.1 중량% 내지 약 75 중량% 의 세제 계면활성제 ;

(c) 약 5 중량% 내지 약 15 중량% 의 프로필렌 글리콜 ; 및

(d) 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM 의 Ca^{2 +} 이온.

따라서, 한 구현예에서 본 발명은 중성 메탈로프로테아제 및 억제제를 포함하는 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제 제제를 제공하는데, 여기서, 억제제는 효소에 의해 생성되는 단백질 가수분해물이고, 제제 내 억제제 농도는 중성 메탈로프로테아제를 사용한 단백질 가수분해물의 겉보기 Ki 의 약 5 배이다. 한 구현예에서, 겉보기 Ki 는 약 5 mM 내지 약 15 mM 이고, 제제에서 사용되는 단백질 가수분해물 농도는 약 25 mM, 약 35 mM, 약 50 mM, 또는 그 이상이다.

본 발명의 제제 도는 조성물에서 사용되는 억제제의 절대량은 억제제 결합 친화성 (즉, Ki), 억제제 분자량, 효소 농도 및 다른 요소에 따라 다양할 수 있다. 그러나, 전형적으로, 본 발명의 액체 세제 제제 구현예에서 사용되는 억제제의 양은 세정용 제제의 사용과 관련한 임의의 희석 전의 약 0.01 중량% 내지 약 15 중량%, 약 0.05 중량% 내지 약 5 중량%, 또는 약 0.1 중량% 내지 약 2.5 중량% 이다.

대안의 구현예에서, 특정 단백질 기질은 그것이 특정 중성 메탈로프로테아제에 의한 촉매적 전환을 수행하면 더욱 선호할만한 억제 특징을 갖는 가수분해 생성물을 제공하도록 조작될 수 있다 (예를 들어, 위치-특이적 돌연변이를 사용해). 이러한 변이체 단백질 기질이 사용되어, 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제 조성물을 제조할 수 있다.

중성 메탈로프로테아제를 안정화시키기 위한 단백질 기질을 공동-발현하는 벡터 및 숙주 세포

한 구현예에서, 본 발명은 중성 메탈로프로테아제 유전자 및 단백질 기질 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는데, 여기서, 단백질 기질 유전자 생성물은 발현된 중성 메탈로프로테아제에 의해 촉매적으로 전환되어, 단백질 가수분해물 억제제를 생성한다. 다음, 중성 메탈로프로테아제 및 단백질 기질 유전자를 포함하는 클로닝된 벡터는 숙주 세포 (세포 형질전환 또는 트랜스펙션에서 잘 알려진 기술을 통해) 에 도입되어, 2 개의 단백질 유전자 생성물을 공동-발현시킨다.

단백질 기질이 중성 메탈로프로테아제와 함께 공동-발현되기 때문에, 단백질 기질은 메탈로프로테아제에 의한 촉매적 전환을 즉시 수행하여, 단백질 가수분해 생성물 (즉, 단백질 가수분해물) 을 생성할 수 있다. 다음, 본원에 기술된 바와 같이, 생성 단백질 가수분해물 생성물은 중성 메탈로프로테아제를 억제시킬 수 있고, 이는 새로 발현된 효소에 대한 자가 분해에 대해 더 큰 보호를 초래한다.

본 구현예에서, 공동-발현 벡터는 효율적인 유전자 발현에 필요한 원소 (예를 들어, 흥미있는 유전자에 조작적으로 연결된 프로모터) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 필수 원소는 인지된다면 (즉, 숙주에 의해 전사된다면) 유전자 자체의 동종 프로모터, 외인성이거나 또는 중성 메탈로프로테아제 유전자의 내인성 종결자 영역 (생물 숙주 세포용 폴리아데닐화 영역) 에 의해 제공되는 전사 종결자로서 제공된다. 일부 구현예에서, 선별 유전자 예컨대 항균제-함유 배지에서 성장함으로써 플라스미드-감염 숙주세포의 지속적인 배양 유지를 가능하게 하는 항생제 내성 유전자가 또한 포함된다.

한 바람직한 구현예에서, 단백질 기질의 생성을 조절하는 유전적 원소는 개 별 프로모터에 조작적으로 연결되어, 개별 프로모터가 단지 단백질 기질의 생성을 향상시키며, 그러나 중성 메탈로프로테아제 단백질의 생성을 향상시키지는 않는다. 결과적으로, 적합한 숙주에서의 벡터의 발현은 메탈로프로테아제보다 더 큰 양의 단백질 기질 유전자 생성물의 생성을 초래한다. 발효 브로스 내에서의 이러한 단백질 기질 대 메탈로프로테아제의 증가된 비율은 가수분해 생성물의 양의 증가를 초래하여, 메탈로프로테아제 분자에 결합하여, 자가 분해를 억제시키는 그의 능력을 향상시킨다.

또다른 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 및 단백질 기질의 생성을 조절하는 유전적 원소는 단일 숙주에서 형질전환된 개별 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 상에 있다. 본 구현예에서, 단백질 기질 유전자는 프로모터에 조작적으로 연결되어, 메탈로프로테아제보다 더 큰 양으로 생성될 수 있게 하는 것이 또한 바람직하다.

한 구현예에서, 숙주 세포 및 벡터는 공동-발현된 단백질이 세포외 발효 브로스에 분비되도록 선택된다.

일부 구현예에서, 공동-발현 벡터는 숙주 세포에서 복제하는 플라스미드이다. 상기 구현예에서, 사용되는 플라스미드는 플라스미드 복제에 필요한 잘 알려진 원소를 포함한다. 대안적으로, 플라스미드는 숙주 염색체에 혼입되도록 디자인될 수 있다.

B. 아밀로리퀴파시엔스의 중성 메탈로프로테아제인 NprE 의 B. 서브틸리스 숙주에 도입된 플라스미드 벡터로의 재조합 클로닝, 발현 및 발효 기술은 본원에 참조로써 삽입된 2006 년 10 월 12 일에 출원된 미국 특허 출원 제 11/581,102 호에 기술되어 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 이러한 NprE 발현 시스템은 NprE 효소에 대한 단백질 기질의 공동-발현에 적응되도록 되어 있다. 한 바람직한 구현예에서, 공동-발현된 단백질 기질은 카제인이다.

세제 제제 및 세정 조성물

본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 다양한 세제 제제 및 세정 조성물을 제형하는데 유용하다. 이러한 제제 및 조성물은 유리하게는 세탁 적용, 경 표면 세정, 자동 식기세척 적용, 뿐만 아니라 미용 적용 예컨대 틀니, 치아, 헤어 및 피부에서 적용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 중성 메탈로프로테아제 효소의 더 낮은 온도 용액에서의 증가된 효과 및 우수한 색상-안정성 프로파일로 인해, 억제제-안정화된 조성물은 이상적으로는 세탁 적용에 적합하다.

본원에 개시된 것 외에도, 본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제를 사용하기에 적합한 광범위한 세제 제제 및 세정 조성물이 본원에 참조로써 삽입된 2006 년 10 월 12 일에 출원된 미국 특허 출원 제 11/581,102 호에 기술되어 있다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에 제공되는 모든 성분 또는 조성물은 성분 또는 좃어물의 활성 수준을 참조로 하여 제조되고, 시판의 기원에서 존재할 수 있는 불순물, 예를 들어, 잔여 용매 또는 부산물이 제거된 것이다. 효소 성분의 중량은 총 활성 단백질을 바탕으로 한 것이다. 모든 % 및 비율은 달리 언급되지 않는 한 중량에 의해 계산된다.

예시된 세제 제제 및 세정 조성물에서, 효소 수준은 달리 언급되지 않는 한 총 조성물의 중량에 의해 순수한 효소로서 표현되고, 세제 성분은 총 조성물의 중량으로 표현된다.

한 구현예에서, 본 발명의 세제 제제 및 세정 조성물은 적어도 하기를 포함한다 :

(1) 계면활성제, 바람직하게는 비이온성 또는 음이온성 계면활성제 ; 및

(2) 중량 기준으로 약 10 중량% 내지 약 95 중량% 의 물 ; 및

(3) 메탈로프로테아제 효소 ; 및

(4) 메탈로프로테아제 억제제.

다른 구현예에서, 이러한 단순한 세제 제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 다양한 추가 성분 (즉, 보조 물질) 을 추가로 포함할 수 있다 : 추가 계면활성제, 보강제, 킬레이트제, 염료 이동 억제제, 증착 보조제, 분산제, 추가 효소, 효소 안정화제, 촉매적 물질, 표백 활성화제, 표백 증강제, 과산화수소, 과산화수소 공급원, 미리 형성된 과산, 중합체성 분산제, 흙 오염물 제거/항-재증착제, 발광제, 거품 억제제, 염료, 향, 구조 유연화제, 섬유 유연제, 담체, 하이드로트로프 (hydrotrope), 가공 보조제 및/또는 색소.

한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 액체 세제 제제를 제공한다 :

(a) 약 1 중량% 내지 약 75 중량% 의 계면활성제 ;

(b) 약 10 중량% 내지 약 95 중량% 의 물 ;

(c) 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량% 의 중성 메탈로프로테아제 ; 및

(d) 사용 전에 약 90% 이상의 중성 메탈로프로테아제 분자에 억제제가 결합 하게 되는 양의 중성 메탈로프로테아제 억제제, 여기서, 적절한 세제 제제의 희석은 결합된 중성 메탈로프로테아제 분자의 약 25% 이상으로부터 억제제가 해리되는 것을 초래함. 전형적으로, 적절한 희석은 액체 세제 제제가 큰 부피의 세정수에 첨가될 때 일어나서, 세제 제제의 200, 400, 500, 600, 또는 심지어 1000-배 희석을 초래한다.

상기 액체 세제 제제의 또다른 구현예에서, 45%, 65%, 75%, 85%, 또는 95% 이상의 억제제 결합된 중성 메탈로프로테아제 효소가 상기 세제의 희석 시 그의 억제제-없는 형태로 방출된다. 한 구현예에서, 제제에 대해 선택된 억제제는 약 pH 6.5 내지 약 pH 11, 및 바람직하게는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.5 에서 약 5 mM 내지 약 15 mM 의 겉보기 Ki 로 경쟁적으로 중성 메탈로프로테아제를 억제시킨다. 한 바람직한 구현예에서, 액체 세제 제제는 약 pH 8.0 에서 대략 10 mM 의 겉보기 Ki 로 단백질 가수분해물 억제제를 포함한다.

본 발명에 의해 제공되는 액체 세제 제제의 한 구현예에서, 선택된 메탈로프로테아제 억제제는 단백질 가수분해물이다. 바람직한 구현예에서, 메탈로프로테아제 억제제는 메탈로프로테아제에 의한 단백질의 가수분해에 의해 제조되는 단백질 가수분해물이다. 또다른 구현예에서, 메탈로프로테아제는 NprE 이고, 억제제는 NprE 에 의해 생성되는 소 젖 카제인의 가수분해 생성물이다. 또다른 구현예에서, 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 가수분해물이다 : 밀 글루텐 가수분해물 (예를 들어, HyPep 4601™), 콩 단백질 산 가수분해물 (예를 들어, 아미소이), 소 젖의 카제인 산 가수분해물 (예를 들어, 아미카제), 식 물성 단백질의 효소 가수분해물 (예를 들어, 프로테오스 펩톤), 및 그의 임의의 조합물.

본 발명의 단백질 가수분해물 억제제로 안정화된 중성 메탈로프로테아제 제제는 중질 액체 (HDL) 세제 제제에서 사용하기에 특이적으로 잘 적합하게 된다.

한 구현예에서, 본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 HDL 세제 제제에 혼입될 수 있으며, 여기서, HDL 세제 제제는 하기를 포함한다 : 각각 약 30 중량% 내지 60 중량% 의 물 ; 약 45 중량% 내지 15 중량% 의 활성물 ; 여기서, HDL 세제 제제 대 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물의 비는 약 9 대 1 부피비이다.

일부 구현예에서, HDL 제제는 약 33 중량% 내지 53 중량%, 약 35 중량% 내지 51 중량%, 또는 약 36 중량% 내지 44 중량% 의 물을 포함한다. 일부 구현예에서, HDL 제제는 약 40%, 38%, 36%, 34%, 32%, 30%, 또는 그보다 더 낮은 중량% 이하의 물을 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명의 HDL 세제 제제는 추가로 약 5% 내지 15%, 약 7.5% 내지 12.5%, 또는 약 10% 이상의 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명의 HDL 세제 제제는 약 20 중량% 내지 약 50 중량% 의 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, HDL 제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 계면활성제의 혼합물을 포함한다 : C12 에톡실레이트 (Alfonic 1012-6, Hetoxol LA7, Hetoxol LA4), 나트륨 알킬 벤젠 술포네이트 (예를 들어, Nacconol 90G), 나트륨 라우레스 술페이트 (예를 들어, Steol CS-370), 및 그의 임 의의 조합물. 일부 구현예에서, HDL 제제는 알킬벤젠 술포네이트, 알킬에테르 술페이트, 및 알콜 에톡실레이트로부터 선택되는 하나 이상의 계면활성제를 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명의 HDL 세제 제제는 약 35 중량% 내지 약 52 중량% 의 물, 및 약 24 중량% 내지 약 40 중량% 의 계면활성제를 포함하는데, 여기서, 계면활성제는 하기를 포함한다 : Nacconol 9OG, Alfonic 1012-6, 및 Steol CS-370. 또다른 구현예에서, HDL 제제 (총 90 부라고 추정함) 내 물 및 계면활성제의 특정 부피비는 약 : 30 부의 물, 17 부의 Nacconol 9OG, 13 부의 Alfonic 1012-6, 및 10 부의 Steol CS-370 이다. 당업자는 본 발명에 따라 유용한 대안의 HDL 제제는 유사한 양의 상응하는 계면활성제를 사용하여 제조될 수 있음을 즉시 알게 될 것이다.

표 1 ~ 5 (하기) 에 본 발명에 따라 사용될 수 있는 실례의 일반적인 HDL 제제의 범위에 대한 레시피가 열거되어 있다. 이들 일반적인 제제는 물 및 다른 활성 성분의 양을 다양하게 가지고 있으며, 90 부의 세제 대 10 부의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물의 비로 제형된다. 한 바람직한 구현예에서, 액체 세제 제제는 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 (바람직하게는 단백질 가수분해물 안정화된 메탈로프로테아제) 및 일반적인 HDL 세제 제제 중 하나의 성분을 표 1 ~ 5 에 열거된 레시피와 동일한 비로 포함한다.

상기 표에 개시된 일반적인 HDL 제제 레시피는 제한하려는 것은 아니다. 한 구현예에서, 이들 중 임의의 것은 다양한 추가 보조 물질을 포함하는 시판의 HDL 제제의 제조를 위한 기본으로서 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 당업계에 알려진 다른 적합한 HDL 제제에 혼입될 수 있다. 그러한 HDL 제제는 완충액, 계면활성제, 및/또는 다른 보조 물질의 상이한 조합의 범위를 포함할 수 있다.

본 발명의 세제 제제, 세정 조성물, 및 세정 보조물은 유효량의 메탈로프로테아제 효소를 필요로 한다. 일부 구현예에서, 효소의 필요한 수준은 하나 이상의 종의 메탈로프로테아제의 첨가에 의해 달성된다. 전형적으로, 본 발명의 세제 제제는 100% 활성인 효소를 기준으로 메탈로프로테아제 효소를 약 0.0001 중량% 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.001 중량% 내지 5중량%, 및 가장 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 2.0 중량% 의 예비-세정 (즉, 보관 형태의) 세제 제제의 양으로 포함하여야 할 것이다. 효소의 활성은 본 발명에 일치하는 제제의 제조 시 고려되어야 한다.

일부 바람직한 구현예에서, 본원에 제공되는 세제 제제 및 세정 조성물은 전형적으로 수성 세정 조작에서 사용하는 동안에, 세정수의 pH 가 약 5.0 내지 약 11.5 이도록 제형되거나, 또는 대안적인 구현예에서, 심지어 약 6.0 내지 약 10.5 이도록 제형된다. 일부 바람직한 구현예에서, 액체 생성물 제제는 전형적으로 순 pH (neat pH) 가 약 3.0 내지 약 9.0 이도록 제형되는 한편, 일부 대안적인 구현예에서, 제제의 순 pH 는 약 3 내지 약 5 이다. 일부 구현예에서, 과립형 세탁 생성물은 전형적으로 pH 가 약 8 내지 약 11 이도록 제형된다. 권고되는 사용 수준에서 pH 를 조절하기 위한 기술은 완충액, 알칼리, 산 등의 사용을 포함하고, 당업자에게 잘 알려져 있다.

캡슐화된 입자 제제

일부 구현예에서, 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제는 과립형 조성물 또는 액체에 적용될 수 있으며, 여기서, 억제제와 복합체화된 중성 메탈로프로테아제는 캡슐화된 입자의 형태로 있어서, 보관 동안에 조성물의 다른 성분으로부터 이를 보호한다. 캡슐화는 세정 과정 동안에 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제의 이용가능성을 조절하는 추가의 수단을 제공하고, 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제의 성능을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 캡슐화된 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제는 다양한 세팅에서 사용될 것으로 생각된다. 또한, 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제는 임의의 적합한 캡슐화 물질(들) 및 당업계에 공지된 방법(들) 을 사용하여 캡슐화되고자 한다.

일부 바람직한 구현예에서, 캡슐화 물질은 전형적으로 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제의 일부 이상을 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 수용성 및/또는 수-혼화성이다. 일부 추가의 구현예에서, 캡슐화 물질의 유리 전이 온도 (Tg) 는 0℃ 이상이다 (예를 들어, 유리 전이 온도에 관한 더 많은 정보 를 위해서는 WO 97/11151, 구체적으로는 6 쪽 25 줄 내지 7 쪽 2 줄을 참조).

일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 탄수화물, 천연 또는 합성 고무, 키틴 및 키토산, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 실리케이트, 포스페이트, 보레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀 왁스 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 캡슐화 물질이 탄수화물인 일부 구현예에서, 이는 모노사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전분이다 (일부 실례의 적합한 전분에 대한 상세한 설명을 위해서는 예를 들어, EP 0 922 499; US 4,977,252, US 5,354,559, 및 US 5,935,826 참조).

추가의 구현예에서, 캡슐화 물질은 플라스틱으로 만들어진 미소구체 (마이크로sphere) (예를 들어, 열가소성물질, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 폴리아크릴로니트릴 및 그의 혼합물 ; 이용되는 시판의 미소구체에는 EXPANCEL® [Casco Products, Stockholm, Sweden], PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, 및 Q-CEL® [PQ Corp., Valley Forge, PA], LUXSIL® 및 SPHERICELI® [Potters Industries, Inc., Carlstadt, NJ and Valley Forge, PA] 가 포함되나 이에 제한되지 않음) 를 포함한다.

세정 첨가 제제

본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 또한 세정 첨가 생성물에서 사용된다. 본 발명의 하나 이상의 효소를 포함하는 세정 첨가 생성물은 이상적으로는 추가의 표백 효과가 요구되는 경우 세정 과정에서 포함되기에 적합하 다. 그러한 예에는 저온 용액 세정 적용이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 첨가 생성물은 그의 간단한 형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 하나 이상의 억제제-안정화된 중성 메탈로프로테아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 첨가는 퍼옥시겐의 공급원이 적용되고 증가된 표백 효과가 요구되는 세정 과정에 첨가될 투여 형태로 포장된다. 일부 구현예에서, 단일 투여 형태는 예비측정된 분말 및/또는 액체를 포함하여 알약, 정제, 겔캡 또는 다른 단일 투여 단위를 포함한다.

일부 구현예에서, 충진제 및/또는 담체 물질(들) 이 포함되어, 상기 조성물의 부피를 증가시킨다. 적합한 충진제 또는 담체 물질에는 술페이트, 카르보네이트 및 실리케이트의 다양한 염, 뿐만 아니라 탈크, 클레이 (clay) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 액체 조성물용 충진제 및/또는 담체 물질은 물, 및/또는 폴리올 및 디올을 포함하여 저분자량 1 차 및 2 차 알콜을 포함한다. 상기 알콜의 예에는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 상기 물질을 약 5% 내지 약 90% 포함한다. 추가의 구현예에서, 산 충진제가 사용되어 조성물의 pH 를 감소시킨다. 일부 대안의 구현예에서, 세정 첨가제에는 하기 기술되는 하나 이상의 활성화된 퍼옥시겐 공급원 및/또는 하기 더욱 상세히 기술되는 보조 성분이 포함된다.

세제 제제 및 세정 조성물의 제조 및 사용 방법

본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물은 제형자에 의해 선택 되는 적합한 방법을 사용하여 적합한 세제 제제 또는 세정 조성물에 제형될 수 있다. 예를 들어, 각각이 본원에 참조로써 삽입된 U.S. 5,879,584, U.S. 5,691,297, U.S. 5,574,005, U.S. 5,569,645, U.S. 5,565,422, U.S. 5,516,448, U.S. 5,489,392, U.S. 5,486,303, U.S. 4,515,705, U.S. 4,537,706, U.S. 4,515,707, U.S. 4,550,862, U.S. 4,561,998, U.S. 4,597,898, U.S. 4,968,451, U.S. 5,565,145, U.S. 5,929,022, U.S. 6,294,514, 및 U.S. 6,376,445 를 참조한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 세제 제제 및 세정 조성물은 섬유 및/또는 표면의 세정에 사용된다. 일부 구현예에서, 표면 및/또는 섬유의 일부 이상이 순수한 형태 또는 세정액에서 희석된 상태의 본 발명의 하나 이상의 구현예의 세정 조성물과 접촉되고, 그런 다음, 표면 및/또는 섬유가 최적으로 세정 및/또는 헹구어진다. 본 발명의 목적을 위해, "세정" 에는 문지름, 및 기계적 진탕이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 제제에 의해 세정될 수 있는 섬유는 정상적인 소비자 사용 조건에서 세탁될 수 있는 임의의 섬유를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 세제 제제 및 세정 조성물은 용액에서 약 500 ppm 내지 약 15,000 ppm 의 농도로 사용된다. 세정 용매가 물인 일부 구현예에서, 물 온도는 전형적으로 약 5℃ 내지 약 90℃ 의 범위이다. 섬유 세정에 대한 일부 바람직한 구현예에서, 물 대 섬유 질량비는 전형적으로 약 1 : 1 내지 약 30 : 1 이다.

본 발명에 따라 유용한 보조 물질

본 발명의 목적에 필수적이지 않은 한편, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-제한적 목록의 보조제가 본 발명의 세정 조성물에서 사용하기에 적합하다. 실제로, 일부 구현예에서, 보조제는 본 발명의 세정 조성물에 혼입된다. 일부 구현예에서, 보조 물질은 세정 성능을 돕고/거나 또는 이를 향상시키고, 세정되는 기질을 처리하고/거나, 또는 세정 조성물 (예를 들어, 향, 착색제, 염료 등) 의 심미성을 개질시킨다. 상기 보조제는 본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 조성물을 포함하는 제제 및 조성물에 첨가되는 것으로 이해된다. 이들 추가 성분의 정확한 성질, 및 그의 혼입 수준은 사용되는 세정 조작 성질 및 조성물의 물리적 형태에 의존한다.

적합한 보조 물질에는 계면활성제, 보강제, 킬레이트제, 염료 이동 억제제, 증착 보조제, 분산제, 추가 효소, 효소 안정화제, 촉매적 물질, 표백 활성화제, 표백 증강제, 과산화수소, 과산화수소 공급원, 미리 형성된 과산, 중합체성 분산제, 흙 오염물 제거/항-재증착제, 발광제, 거품 억제제, 염료, 향, 구조 유연화제, 섬유 유연제, 담체, 하이드로트로프 (hydrotrope), 가공 보조제 및/또는 색소가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 명백하게 제공된 것 외에도, 추가 보조 물질이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 Nos. 5,576,282, 6,306,812 B1 및 6,326,348 B1 참조). 일부 구현예에서, 상기 언급된 보조 성분은 본 발명의 제제 및 조성물의 균형을 구성한다.

계면활성제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 계면 활성제 또는 계면활성제계를 포함하며, 여기서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양친매성 계면활성제, 쯔비터이온성 계면활성제, 준-극성 비이온성 계면활성제, 및 그의 혼합물로부터 선택된다. 단독으로 또는 혼합물로서, 본 발명의 억제제-안정화된 메탈로프로테아제 세제 제제에 유용한 실례의 계면활성제에는 하기가 포함된다 : C12 에톡실레이트 (Alfonic 1012-6, Hetoxol LA7, Hetoxol LA4), 나트륨 알킬 벤젠 술포네이트 (예를 들어, Nacconol 90G), 나트륨 라우레스 술페이트 (예를 들어, Steol CS-370).

일부 낮은 pH 세정 조성물 (예를 들어, 순 pH 가 약 3 내지 약 5 인 조성물) 구현예에서, 상기 조성물은 전형적으로 알킬 에톡시화된 술페이트를 함유하지 않는데, 그 이유는 상기 유형의 계면활성제는 그러한 산 조건 하에 조성물에 의해 가수분해될 수 있기 때문이다.

일부 구현예에서, 계면활성제는 세정 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 75 중량% 의 수준으로 존재하며, 한편 대안의 구현예에서, 상기 수준은 약 1 중량% 내지 약 50 중량% 이며, 한편, 더욱 추가의 구현예에서, 상기 수준은 약 5 중량% 내지 약 40 중량% 이다.

보강제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 세제 보강제 또는 보강제계를 포함한다. 하나 이상의 세제 보강제를 혼입하는 일부 구현예에서, 세정 조성물은 세정 조성물의 약 1 중량% 이상, 약 3 중량% 내지 약 60 중량%, 또는 심지어 약 5 중량% 내지 약 40 중량% 의 보강제를 포함한다.

보강제에는 알칼리 금속, 폴리포스페이트의 암모늄 및 알카노암모늄염, 알칼 리 금속 실리케이트, 알칼리 토금속 및 알칼리 금속 카르보네이트, 알루미노실리케이트 보강제 폴리카르복실화 화합물, 에테르 히드록시폴리카르복실레이트, 말레산 무수물과 에틸렌 또는 비닐 메틸 에테르의 공중합체, 1,3,5-트리히드록시 벤젠-2,4,6-트리술폰산, 및 카르복시메틸옥시숙신산, 폴리아세트산 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 니트릴로트리아세트산의 다양한 알칼리 금속, 암모늄 및 치환 암모늄염, 뿐만 아니라 폴리카르복실레이트 예컨대 멜리트산, 숙신산, 시트르산, 옥시디숙신산, 폴리말레산, 벤젠 1,3,5-트리카르복실산, 카르복시메틸옥시숙신산, 및 그의 용해성 염이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 실제로, 임의의 적합한 보강제가 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 것으로 생각된다.

킬레이트제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 적합한 킬레이트제에는 구리, 철 및/또는 망간 킬레이트제 및 그의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 킬레이트제가 사용되는 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 목적 세정 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 15 중량% 또는 심지어 약 3.0 중량% 내지 약 10 중량% 의 킬레이트제를 포함한다.

증착 보조제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 증착 보조제를 포함한다. 적합한 증착 보조제에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리카르복실레이트, 방오 중합체 예컨대 폴리테레프탈산, 클레이 예컨대 카올리나이트, 몬모릴로나이트, 아타풀가이트, 일라이트, 벤토나이트, 할로이사이트, 및 그의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

염료 이동 억제제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 염료 이동 억제제를 포함한다. 적합한 중합체성 염료 이동 억제제에는 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-옥시드 중합체, N-비닐피롤리돈 및 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸 또는 그의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

하나 이상의 염료 이동 억제제가 사용되는 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 세정 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 또는 심지어 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 의 염료 이동 억제제를 포함한다.

분산제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 분산제를 함유한다. 적합한 수용성 유기 분산제 물질에는 단독- 또는 공-중합체성 산 또는 그의 염이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 여기서, 폴리카르복실산은 2 개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 분리되는 2 개 이상의 카르복실 라디칼을 포함한다.

효소 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 본원에서 기술된 메탈로프로테아제 외에도, 세정 성능 및/또는 섬유 케어 이점을 제공하는 하나 이상의 세제 효소를 포함한다. 적합한 효소의 예에는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스터라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 환원효소, 산화효소, 페놀록시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 타나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로티나아제, 락카아제 및 아밀라아제 또는 그의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제 및/또는 셀룰라아제와 함께 아밀라아제와 같은 통상적으로 이용가능한 효소를 포함하는 효소의 조합물 (즉, "혼화물")이 사용된다.

효소 안정화제 - 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세제 제제에서 사용되는 효소는 안정화된다. 효소 안정화를 위한 다양한 기술이 본 발명에서 사용될 것으로 생각된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에서 적용되는 효소는 효소에 아연 (II), 칼슘 (II) 및/또는 마그네슘 (II) 이온, 뿐만 아니라 다른 금속 이온 (예를 들어, 바륨 (II), 스칸듐 (II), 철 (II), 망간 (II), 알루미늄 (III), 주석 (II), 코발트 (II), 구리 (II), 니켈 (II), 및 옥소바나듐 (IV)) 을 제공하는 완성된 조성물에서 아연 (II), 칼슘 (II) 및/또는 마그네슘 (II) 이온의 수용성 공급원의 존재에 의해 안정화된다.

촉매적 금속 복합체 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 촉매적 금속 복합체를 함유한다. 일부 구현예에서, 금속-함유 표백 촉매가 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 금속 표백 촉매는 정의된 표백 촉매적 활성의 전이 금속 양이온 (예를 들어, 구리, 철, 티탄, 루테늄, 텅스텐, 몰리브덴, 또는 망간 양이온), 표백 촉매적 활성이 거의 없거나 아예 없는 보조 금속 양이온 (예를 들어, 아연 또는 알루미늄 양이온), 및 촉매적 및 보조 금속 양이온에 대한 정의된 안정성 상수를 갖는 시퀘스트레이트 (sequestrate), 구체적으로는 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라 (메틸렌포스폰산) 및 그의 수용성 염을 포함하는 촉매계를 포함한다 (예를 들어, U.S. 4,430,243 참조).

일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 망간 화합물에 의해 촉매화된다. 상기 화합물 및 용도 수준은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, U.S. 5,576,282 참조). 추가의 구현예에서, 코발트 표백 촉매가 본 발명의 세정 조성물에서 사용된다. 다양한 코발트 표백 촉매가 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, U.S. 5,597,936, 및 U.S. 5,595,967 참조). 상기 코발트 촉매는 공지된 과정에 의해 쉽게 제조된다 (예를 들어, U.S. 5,597,936, 및 U.S. 5,595,967 참조).

추가의 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 마크로폴리시클릭 강성 리간드 (macropolycyclic rigid ligand, "MRL") 의 전이 금속 복합체를 포함한다. 실용적인 문제로서, 그리고 제한 없이, 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 세정 방법은 수성 세정 매질에서 활성 MRL 종을 1 이상의 백만분율 (ppm) 의 순서로 제공하도록 조정되고, 일부 바람직한 구현예에서, 약 0.005 ppm 내지 약 25 ppm, 더욱 바람직하게는 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 ppm 내지 약 5 ppm 의 MRL 을 세정액에 제공하도록 조정된다.

본 발명의 전이-금속 표백 촉매에서 바람직한 전이-금속에는 망간, 철 및 크롬이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 MRL 에는 또한, 교차-가교되는 특수한 울트라-강성 리간드가 포함되나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 5,12-디에틸-1,5,8,12-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸). 적합한 전이 금속 MRL 은 공지된 과정에 의해 쉽게 제조된다 (예를 들어, WO 00/32601, 및 U.S. 6,225,464 참조).

하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구현예 및 측면을 설명하고 추가로 예시하기 위해 제공되며, 그의 범주를 제한하려는 것은 아니다.

하기의 실험 개시물에서, 하기 약어가 적용된다 : ℃ (섭씨 온도) ; rpm 또는 RPM (분 당 회전수) ; Da (달톤), kDa (킬로달톤) ; g (그램) ; μg 및 ug (마이크로그램) ; mg (밀리그램) ; ng (나노그램) ; μl 및 ul (마이크로리터) ; ml (밀리리터) ; mm (밀리미터) ; nm (나노미터) ; μm 및 um (마이크로미터) ; M (몰) ; mM (밀리몰) ; μM 및 uM (마이크로몰) ; U (유닛) ; MW (분자량) ; sec (초) ; min (분) ; hr (시) ; OD₂₈₀ (280 nm 에서의 광학 밀도) ; OD₄₀₅ (405 nm 에서의 광학 밀도) ; OD_60O (600 nm 에서의 광학 밀도) ; PAGE (폴리아크릴아마이드 겔 전기영동) ; EtOH (에탄올) ; PBS (인산염 완충액 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 나트륨 인산염 완충액, pH 7.2]) ; SDS (나트륨 도데실 술페이트) ; Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄) ; TAED (N,N,N'N'-테트라아세틸에틸렌디아민) ; MES (2-모르폴리노에탄술폰산, 모노히드레이트 ; f.w. 195.24 ; Sigma # M-3671) ; CaCl₂ (염화칼슘, 무수물 ; f.w. 110.99 ; Sigma # C-4901) ; DMF (N,N- 디메틸포름아미드, f.w. 73.09, d = 0.95) ; w/v (중량 대 부피) ; v/v (부피 대 부피) ; NprE (중성 메탈로프로테아제) ; PMN (정제된 MULTIFECT® 메탈로프로테아제).

하기 어세이를 하기 기술되는 실시예에서 사용하였다.

A. NprE 농도 측정을 위한 96-웰 마이크로타이터 플레이트 ( MTP ) 를 사용한 브래드포드 ( Bradford ) 어세이

브래드포드 어세이는 96-웰 MTP 포맷에서 개발하였고, 이를 사용하여 하기 실시예에서 사용되는 샘플에 대한 NprE 프로테아제 농도를 측정하였다.

상기 브래드포드 어세이 시스템에서, 사용된 하기 화학 및 시약 용액은 : Quick Start 브래드포드 염료 시약 (BIO-RAD, #500-0205) ; 희석 완충액: 1O mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂, 0.005% TWEEN®-80 이었다.

사용된 장비는 Biomek FX Robot (Beckman) 및 SpectraMAX (유형 340) MTP 판독기였고 ; MTP 는 Costar (유형 9017) 제품이었다.

테스트에서, 200 μl 브래드포드 염료 시약을 각각의 웰에 파이펫팅하고, 이어서 15 μl 희석 완충액을 파이펫팅하였다. 마지막으로, 10 μl 의 여과된 배양 브로스를 웰에 첨가하였다.

완전히 혼합한 후, MTP 를 실온에서 10 분 이상 인큐베이션시켰다. 가능한 공기 방울을 불어서 제거하고, 웰의 OD 를 595 nm 에서 판독하였다.

단백질 농도를 측정하기 위해, 배경 판독결과 (즉, 대조군 웰의 것) 를 샘플 판독결과에서 제하였다. 수득된 OD₅₉₅ 값은 샘플 내 단백질 함량의 상대적인 측정을 제공하였다. 0 내지 5 μg 의 NprE 보정선의 선형 (linearity) 은 단백질 함량에 대한 상대적인 측정으로서 OD₅₉₅ nm 값을 사용할 수 있게 하였다. 상청액 내 NprE 의 예상 함량이 200 ~ 300 μg/ml 였기 때문에, 테스트에서 사용된 1O μl 의 샘플 부피는 5 μg 미만의 단백질을 함유하였고, 이는 선형 범위 내 값을 제공하였다.

B. NprE 활성 및 억제 반응속도를 결정하기 위한 AGLA 어세이

하기 기술되는 "AGLA" 어세이는 재생가능한 중성 메탈로프로테아제 활성 (예를 들어, NprE) 을 제공한다. 상기 어세이가 주어진 실험실 조건에 맞추어질 수 있는 한편, 변형된 과정을 통해 수득된 임의의 데이타는 원래의 방법에 의해 만들어지는 결과와 일치되어야 할 것이다.

중성 메탈로프로테아제는 Abz-AGLA-Nba (2-아미노벤조일-L-알라닐글리실-L-루실-L-알라니노-4-니트로벤질아미드 ; f.w. 583.65 ; BaChem AG, Bubendorf, Switzerland 사에서 # H-6675 로 이용가능, 또는 VWR 사의 카탈로그 # 100040-598)의 글리신 및 루신 간의 펩티드 결합을 절단한다. 용액 내 자유 2-아미노벤조일-L-알라닐글리실 (Abz-AG) 은 415 nm 에서 형광 방출 최대를 가지고, 340 nm 에서 여기 최대를 가진다. Abz-AG 의 형광은 본래의 Abz-AGLA-Nba 분자에서 니트로벤질아미드에 의해 켄칭 (quench) 된다.

상기 실험들에서, Abz-AGLA-Nba 의 프로테아제 절단에 의한 Abz-AG 의 유리를 형광 스펙트럼에 의해 모니터링하였다 (λ_여기 = 340 nm/λ_방출 = 415 nm). Abz-AG 의 출현 속도는 단백분해 활성의 측정값이었다. 어세이는 비-기질 제한된 초기 속도 조건 하에 수행하였다.

어세이 장비

온도 조절기가 있는 마이크로플레이트 혼합기 (예를 들어, Eppendorf Thermomixer) 는 재생가능한 어세이 결과에 필요하였다. 효소 첨가 전에, 마이크로플레이트 혼합기에서 어세이 용액을 목적하는 온도 (예를 들어, 25℃) 로 인큐베이션시켰다. 효소 용액을 혼합기에서 플레이트에 첨가하고, 격렬하게 혼합하고, 빨리 플레이트 판독기에 옮겼다.

예를 들어, SpectraMax M5, Gemini EM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)과 같은 지속적인 데이타 기록, 선형 회귀 분석의 가능성, 및 온도 조절기가 있는 스펙트럼 형광계를 사용하였다. 판독기를 항상 목적하는 온도 (예를 들어, 25℃) 에서 유지시켰다. 판독기를 상부-판독 형광 검출을 위해 세팅하였고, 컷-오프 필터를 사용하지 않고, 여기를 350 nm 로 세팅하고, 방출을 415 nm 로 세팅하였다. PMT 를 매질 민감도 및 웰 당 5 회의 판독을 위해 세팅하였다. 자동보정이 켜졌고, 뿐만 아니라, 처음의 판독 전에 보정이 이루어졌다. 상기 어세이를 모니터링될 것으로 선택된 웰의 수에 따라 최소화된 판독 간격으로 3 분 동안 측정하였다. 밀리-RFU/분 (분 당 상대적인 형광 유닛의 1/1000) 의 속도를 계산하도록 판독기를 세팅하였다. 속도를 계산하기 위해 사용된 판독기의 수 (V_최대 점) 를 판독 간격에 의해 측정되는 바와 같이, 2 분에 상응하는 수로 세팅하였다 (예를 들어, 매 10 초 당의 판독은 12 개의 점을 사용하여 속도를 계산할 것임). 최대 RFU 는 50,000 으로 세팅하였다.

효소 및 기질 스탁 용액의 모든 파이펫팅은 포지티브 교환형 파이펫 (positive displacement pipet) (Rainin Microman) 을 사용하였다. 완충액, 어세이, 및 효소 작동 용액을 튜브, 시약 보관병 또는 스탁 마이크로플레이트에서 단일 또는 다중-채널 공기-교환형 파이펫 (Rainin LTS) 에 의해 파이펫팅하였다. 반복 파이펫 (repeater pipet, Eppendorf) 을 사용하여 웰이 거의 사용되지 않은 경우 어세이 용액을 마이크로플레이트 웰에 옮겨서, 시약 손실을 최소화할 수 있다. 자동화된 파이펫팅 기구 예컨대 Beckman FX 또는 Cybio Cybi-well 을 또한 사용하여, 효소 용액을 작업 스탁 마이크로플레이트에서 어세이 마이크로플레이트로 옮겨서, 전체 마이크로플레이트를 한번에 시작할 수 있다.

시약 및 용액

스탁 MES 완충액 - 52.6 mM MES / NaOH , 2.6 mM CaCl ₂ , pH 6.5 : MES 산 (10.28 g) 및 292 mg 무수 CaCl₂ 를 대략 90O mL 의 정제수에서 용해시켰다. 상기 용액을 NaOH 를 사용해 pH 6.5 (25℃ 에서 또는 온도 조정 pH 프로브 사용) 로 적정하였다. pH-조정된 완충액을 총 부피가 1 L 가 되게 하였다. 최종 용액을 0.22 μm 멸균 필터를 통해 여과하고, 실온에서 보관하였다.

효소 희석 완충액 - 50 mM MES , 2.5 mM CaCl ₂ , pH 6.5 : 5 mL 의 정제수를 95 mL 스탁 MES 완충액에 첨가하여 상기 완충액을 제조하였다.

효소 스탁 용액 : 정제된 NprE 효소를 효소 희석 완충액과 희석시켜, 대략 1 ppm (1 μg/mL) 의 농도로 되게 하였다. MULTIFECT® 중성 메탈로프로테아제 (야생형 NprE) 를 6 ppm (6 μg/mL) 미만의 농도로 희석시켰다. 단계 희석이 바람직하였다. 상기 용액은 실온에서 1 시간 동안 안정하였으나, 더 장기간의 보관을 위해서 용액을 얼음 상에서 유지하였다.

기질 스탁 용액 - DMF 중 48 mM Abz - AGLA - Nba : 대략 28 mg 의 Abz-AGLA-Nba 를 작은 튜브에 놓았다. 이를 대략 1 mL 의 DMF (부피는 덩어리진 (massed) Abz-AGLA-Nba 에 따라 다양할 것임) 에서 용해시키고, 수 분 동안 와동시켰다. 상기 용액을 빛이 차단된 실온에서 보관하였다. Abz-AGLA-Nba 를 DMF 에 용해시키고, 같은 날 제조된 채로 사용하였다.

기질 희석 완충액 - 50 mM MES , 2.5 mM CaCl ₂ , 5% DMF , pH 6.5 : 5 mL 의 순수한 DMF 를 95 mL 의 스탁 MES 완충액에 첨가하였다. 상기 완충액을 사용하여 반응속도 파라미터를 측정하였다.

어세이 용액 - 50 mM MES , 2.5 mM CaCl ₂ , 5% DMF , 2.4 mM Abz - AGLA - Nba pH 6.5 : 1 mL 의 기질 스탁 용액을 19 mL 의 기질 희석 완충액에 첨가하고, 와동시켰다. 상기 용액을 빛이 차단된 실온에서 보관하였다.

어세이 과정

모든 완충액, 스탁, 및 작업 용액을 제조하였다. 달리 언급되지 않는 한, 각각의 효소 희석물을 삼중으로 어세이하였다. 완전히 채워지지 않는 경우, 효소 작업 용액 스탁 마이크로플레이트를 플레이트의 좌측에서 출발하는 전체 수직 칼럼에 배치하였다 (플레이트 판독기에 놔두기 위해). 상응하는 어세이 플레이트를 유사하게 세팅하였다. 마이크로플레이트 스펙트럼형광계를 이전에 기술된 바와 같이 세팅하였다.

우선, 어세이 용액 중 200 μL 의 분취물을 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 놓았다. 플레이트를 빛이 차단된 채 온도 조절된 마이크로플레이트 혼합기에서 25℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션시켰다. 스탁 마이크로플레이트에서 10 μL 의 작업 효소 용액을 혼합기 내 어세이 마이크로플레이트에 옮김으로써 어세이를 시작하였다. 최적으로는, 96-웰 파이펫팅을 사용하였거나, 또는 8-웰 멀티-채널 파이펫을 사용하여, 좌측-근접 칼럼에서 우선 옮겼다. 용액을 15 초 동안 격렬히 혼합하였다 (Eppendorf Thermomixer 에서 900 rpm). 즉시, 어세이 마이크로플레이트를 마이크로플레이트 스펙트럼형광계로 옮기고, 350 nm 의 여기 및 415 nm 의 방출에서의 형광 측정값의 기록을 시작하였다. 스펙트럼형광계 소프트웨어는 각 웰에 대한 형광의 증가의 반응 속도를 밀리-RFU/분의 선형 회귀선으로계산하였다. 일부 구현예에서, 첫번째 플레이트를 판독하는 한편, 온도 평형을 위하여 두번째 플레이트를 마이크로플레이트 혼합기에 두었다.

초기 속도는 0.3 mM 생성물 이하의 생성물 농도 (즉, 유리된 2-아미노벤조일 형광) 에 대해 선형이었으며, 이는 대략 22,000 RFU 의 배경 형광이 있는 2.3 mM Abz-AGLA-Nba 에서 출발한 용액에서 대략 50,000 RFU 에 상응하였다.

실시예 1

더 높은 보관 농도를 이용한 증가된 NprE 안정성

본 실시예는 효소가 더 높은 농도 및/또는 10% 프로필렌 글리콜 (PPG) 및 CaCl₂ 의 존재 하에서 유지되는 경우 발생하는 중성 메탈로프로테아제 안정성의 증가를 예시한다.

pH 8.0 의 10 mM HEPES (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)) 완충액에서 625 내지 10000 ppm 의 농도 범위에서 중성 메탈로프로테아제인 NprE 를 함유하도록 샘플을 제조하였다. 625 ppm NprE 농도에서의 하나의 대조군을 제외하고 모든 샘플은 10% PPG 및 0.5 mM CaCl₂ 를 포함하였다. 모든 샘플을 32℃ 의 온도에서 6 시간에 걸쳐 인큐베이션하였다. 샘플의 NprE 활성을 다양한 시점에서 AGLA 활성 어세이를 사용해 측정하였다.

결과

도 1 에서 나타낸 바와 같이, 625 ppm NprE 가 있고 PPG 또는 CaCl₂ 가 첨가되지 않은 대조군 샘플은 처음 2 시간 내에 그의 활성 중 거의 모두를 상실하였다. 반대로, 다른 샘플의 NprE 활성은 더 높은 단백질 농도와 관련하여 그의 활성 중 대부분을 유지하였다. 10,000 μg/mL (또는 ppm) NprE 농도에서, 효소는 활성 상실 전 1.5 시간 동안 대부분의 전체 활성을 유지한다. 비교로서, 625, 1250 및 2500 ppm 단백질 샘플은 감소된 활성 (1.5 시간째에 대략 60%) 을 보여주었다. 대조군 샘플과 비교해서, 높은 농도 샘플은 보관 안정성이 크게 증가된 것으로 나타났다.

증가된 농도와 증가된 NprE 안정성 간의 관계를 보여주는 이러한 결과는 생성물 억제에 의한 안정화와 일치한다.

실시예 2

카제인 가수분해 생성물에 의한 NprE 억제

본 실시예는 단백질 가수분해 생성물을 생성한 다음 경쟁적 억제를 통해 중성 메탈로프로테아제를 안정화시키는데 사용되는 중성 메탈로프로테아제의 용도를 예시한다.

물질 및 방법

100 mg/mL 의 소 젖 카제인의 카제인 (카탈로그 #C 7078 ; Sigma Chemical, St. Louis, MO) 을 32℃ 에서 세팅되어 흔들면서 밤새 인큐베이션된 10 mL 의 완충액 (5O mM MES, 2.5 mM CaCl₂, pH 6.5) 에서 0.4 mg/mL 의 중성 메탈로프로테아제인 NprE 와 함께 인큐베이션하였다. 생성 분해 혼합물을 SM-24 고정된 각 회전기가 장착된 Sorvall RC-5B Plus 원심분리기 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham MA) 를 사용해 4℃ 에서 30 분 동안 18,000 rpm 에서 원심분리하여, 미반응 입자를 제거하였다. 원심분리 후, 상청액을 Vivaspin 20 원심분리 필터 장치 (Sartorius AG, Germany) 를 사용하여 5K MWCO 막을 통해 여과하였다. 분자량이 약 5000 Da 미만인 가수분해 생성물 (또한 본원에서는 "카제인 펩티드" 라고 함) 만을 포함해야 할, 물질을 통한 흐름을 수합하였다.

카제인 가수분해 생성물의 정량 어세이를 트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) 어세이를 사용하여 수행하였는데, 이는 표준으로서 자유 아미노산을 사용하여 혼합물의 펩티드에 존재하는 자유 아민을 색도계로 측정한다. 전형적으로, 10 μL 샘 플을 120 mM 보레이트 완충액, pH 9 내 1.2 mg/mL TNBS 중 60 μL 와 혼합하고, 50℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 다음, 반응 혼합물을 500 mM 포스페이트 완충액, pH 7.5 중 140 μL 를 사용하여 중성화시켰다. 색상 변화를 420 nm 에서 모니터링하였고, 아미노산 표준 (카탈로그 #AAS18; Sigma Chemical, St. Louis, MO) 에 대해 보정하였다. 정량화된 카제인 가수분해 생성물 혼합물을 사용하여 하기 NprE 억제 반응속도 연구를 수행하는데 사용되는 스탁 용액을 생성하였다.

카제인 가수분해 생성물 혼합물에 의한 NprE 억제의 반응속도를 상기 기술된 일반적인 AGLA 활성 어세이를 사용하여 수행하였으나, 어세이 혼합물에 존재하는 카제인 가수분해 생성물의 농도를 다양하게 하였다. 표준 Michaelis-Menten 촉매 속도 도시를 만들었고, 이를 사용하여 카제인 가수분해 생성물에 대한 겉보기 Ki 를 포함하여 다양한 반응속도 상수를 유도하였다. 어세이 용액은 pH 6.5, 실온에서 2.5 mM CaCl₂ 및 0.005% Tween 80 이 있는 50 mM MES 완충액이었다.

결과

도 2 는 상기 기술된 바와 같이 생성되고 단리된 카제인 가수분해 생성물에 의한 NprE 의 억제를 보여준다. 도 2A ~ 2D 는 형광생성 (fluorogenic) AGLA 기질에 대한 카제인 가수분해 생성물 억제에 대한 표준 Michaelis-Menten 반응속도 도시를 보여준다.

도 2B 는 이중 역수 도시가 가수분해 생성물이 NprE 의 경쟁적 억제제로서 작용함을 지시하는 보편적인 y-절편을 공유한다. 도 2C 및 2D 는 각각 겉보기 Km 및 이중 역수 도시 경사 재도시를 보여준다.

이러한 결과는 NprE 에 의한 젖 카제인의 분해에 의해 생성된 카제인 가수분해 생성물 혼합물이 또한 대략 10 mM 의 겉보기 Ki 값을 가진 NprE 의 단백질 가수분해물 억제제임을 보여준다.

실시예 3

액체 세제 제제에서의 증가된 NprE 안정성

상기 실시예는 세제 제제를 함유하는 중성 메탈로프로테아제를 안정화시키기 위한 단백질 가수분해물의 용도를 예시한다.

물질

하기 단백질 가수분해물을 Sigma Chemical (St. Louis, MO) 로부터 수득하였고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다 : 밀 글루텐의 HyPep 4601™ 단백질 가수분해물 (카탈로그 #H 6784), 아미소이, 콩 단백질 산 가수분해물 (카탈로그 # S 1674), 아미카제, 소 젖 카제인 산 가수분해물 (카탈로그 # A 2427), 및 프로테오스 펩톤, 식물성 단백질의 촉매적 가수분해물 (카탈로그 # P 0431). 소 젖의 카제인 (카탈로그 # C7078; Sigma Chemical, St. Louis, MO) 을 NprE 에 의한 가수분해에 사용하였다.

단백질 가수분해물 스탁 용액

pH 8.0, 10 mM HEPES 완충액 내 70 mg/ml 농도에서 시판의 수득되는 시약을 사용해 단백질 가수분해물 스탁 용액을 제조하였다.

pH 6.5, 37℃ 에서, 2.5 mM CaCl₂ 가 있는 50 mM MES 완충액 내 8 mg/mL NprE 를 사용해 카제인을 분해하여 소 젖 카제인 가수분해물을 생성하였다. 분해되지 않은 물질을 원심분리에 의해 제거하고, 이어서 MWCO 5 kDa 막을 사용해 투석하였다. 물질을 통한 흐름을 수합하였고, 분취하였고, 이후의 사용을 위해 -2O℃ 에서 보관하였다. 카제인 가수분해물 생성물은 트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) 펩티드 어세이에 의해 대략 90 mM 펩티드인 것으로 측정되었다 (실시예 2 에서).

중질 액체 ( HDL ) 세제 제조

본 실시예에서 사용되는 HDL 세제 제제는 DW-CT 였다. 본 제제는 37% 의 물 함량을 가지고, 안정화제 또는 효소와 같은 성분이 첨가되도록, 10% 의 공간 (부피에 의해) 이 있는 90% 부피 이하로 만들어지도록 디자인되었다. 상기 표 1 에서 나타낸 레시피에 따라 제조하였다.

5 mL 의 DW-CT (표 1 에서 제조됨), pH 8.0 의 1 mL 의 500 mM HEPES 및 44 mL 의 증류수를 혼합하여 제조된 10% DW-CT 세제 제제를 사용하여 어세이를 수행하였다.

안정성 어세이 샘플 제조

5 개의 상이한 후보 단백질 가수분해물, 뿐만 아니라억제제가 첨가되지 않은 대조군을 사용하여 안정성 어세이 샘플을 제조하였다.

일반적으로, 20 μL 의 억제제 스탁 용액을 10 μL 의 50 mg/mL NprE 스탁 용액과 미리 혼합하였다. 다음, 10 mM HEPES 중 10% DW-CT 세제 제제 220 μL 를 각각의 샘플에 첨가하여, 최종 NprE 농도가 2 mg/mL 가 되게 하였다. 샘플을 Thermomixer (Eppendorf) 에서 마이크로타이터 플레이트에서 32℃ 에서 인큐베이션하였다.

각 샘플 내 효소의 최종 농도는 2 mg/mL NprE 였다. 그의 각각의 샘플 내 최종 억제제 농도는 : 각각 5.6 mg/mL 의 아미소이, 아미카제, HyPep 4601, 또는 프로테오스 펩톤 ; 또는 7.2 mM 의 카제인 가수분해 생성물 혼합물 (12.5-배 희석 기준) 이었다. DW-CT 세제 제제의 최종 희석은 9% 였다.

남은 AGLA 활성 어세이

사용된 어세이 용액이 pH 6.5 에서 50 mM MES, 2.5 mM CaCl₂, 0.005% Tween 80 이라는 점을 제외하고는, 안정성 어세이 샘플 (상기에서 제조) 중 각각의 남은 NprE 활성을 일반적인 AGLA 활성 어세이를 사용하여 다양한 시점에서 측정하였다. 남은 AGLA 활성 어세이는 9000-배 희석 범위에 걸쳐 선형인 것으로 나타났다.

안정성 어세이 샘플의 SDS - PAGE

억제제에 의해 제공되는 NprE 자가분해에 대한 보호의 수준에 대한 독립적인 측정으로서, SDS-PAGE 분석을 각각의 안정성 어세이 샘플에 대해 수행하여, 남은 본래의 NprE 대 자가분해 생성물의 상대적인 양을 측정하였다.

안정성 어세이 인큐베이션 기간 (t = 200 분) 의 종료 시, 10 μL 의 각각의 샘플을 취하고, 200 μL 1 N HCl 로 켄칭하였다. 즉시, 200 μL 의 5% TCA 를 첨가하였다. TCA 침전을 20 분 동안 얼음 위에서 수행하였다. 펠렛을 원심분리에 의해 수합하고, 추가로 얼음 냉각 90% 아세톤으로 세정하였다. 다음, 펠렛을 1.5 X 샘플 로딩 완충액에서 재현탁시키고, 95℃ 로 5 분 동안 가열하였다. 다음, 샘플을 4 ~ 12% SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 전기영동 및 젤 가시화를 수행하였고, 당업계에 잘 알려진 SDS-PAGE 표준 프로토콜을 사용하여 코마시 블루 염색을 수행하였다.

결과

도 3 에서 나타낸 바와 같이, 메탈로프로테아제 NprE 는 HDL 세제 제제인 DW-CT 에서 인큐베이션되었을 때 약 1 시간 내에 그의 본래의 활성 중 80% 초과를 상실한다. 단백질 가수분해물 억제제를 동일한 NprE 세제 제제에 첨가하면 효소의 안정성을 유의하게 향상시켰다. 예를 들어, 아미소이 (콩 단백질 산 가수분해물), NprE 분해된 카제인 가수분해물, HyPep 4601™ (밀 글루텐 가수분해물), 아미카제 (카제인 산 가수분해물), 및 프로테오스 펩톤 (식물성 단백질 가수분해물) 를 함유하는 세제 제제는 모두 유의한 남은 NprE 활성을 나타내었다. 아미소이는 3 시간 후에 50% 초과의 활성이 남은 가장 안정한 NprE HDL 세제 제제를 초래하였다. 카제인 가수분해 생성물이 첨가된 제제는 또한 매우 잘 수행하였는데, 여전히 3 시간 후에도 40% 의 활성을 보여주었다.

200 분째의 안정성 어세이 샘플의 SDS-PAGE 결과는 단백질 가수분해물 아미소이 및 카제인 가수분해 생성물이 세제 제제에서 NprE 자가분해에 대해 가장 강한 보호를 제공함을 지시하였다. 이러한 단백질 가수분해물이 안정화시키는 능력 은 이들 샘플에 대한 SDS-PAGE 가 자가분해 생성물을 지시하는 검출가능한 저분자량 밴드가 없는 단일의 강한 NprE 밴드를 보여주는 사실에 의해 증거되었다. 실제로, NprE 밴드의 강도는 인큐베이션되지 않은 대조군 NprE 샘플에 유사하였다. 비교로서, 억제제가 없이 인큐베이션된 NprE 샘플의 SDS-PAGE 는 검출가능한 NprE 밴드를 거의 나타내지 않았으며, 이는 비보호된 NprE 는 세제 제제에서 200 분 후에 거의 완전히 분해되었다. HyPep 4601 단백질 가수분해물 샘플은 또한, 가시적인 저분자량 생성물이 거의 없거나 또는 아예 없는 단일의 강한 NprE 밴드를 보여주었으며, 그렇더라도 상기 밴드는 아미소이 및 카제인 가수분해 생성물에 대한 것만큼 강하지는 않았다. 단백질 가수분해물 아미카제 및 프로테오스 펩톤은 SDS-PAGE 에서 NprE 밴드를 보여주었으나, 억제제 없이 인큐베이션된 샘플 내 NprE 밴드보다 단지 약간 더 밝았다. 따라서, SDS-PAGE 결과는 AGLA 어세이를 사용해 측정된 남은 NprE 활성과 일치한다 (도 3 에서 나타남).

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속한 당업자의 수준의 지표이다. 모든 특허 및 공개물은 각각의 개별 공개물이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로써 지시되는 동일한 범위로 참조로써 본원에 삽입된다.

본 발명의 특정 구현예가 예시 및 기술되는 한편, 당업자는 다양한 다른 변화 및 변형이 본 발명의 취지 및 범주에서 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 범주 내의 모든 그러한 변화 및 변형을 첨부된 청구항에서 포함하고자 한다.

본원에서 예시적으로 기술된 본 발명은 임의의 원소 또는 원소들의 부재, 본 원에서 구체적으로 개시되지 않은 제한 또는 제한점의 부재 하에 실행될 수 있다. 적용된 용어 및 표현은 상세한 설명의 면에서 그리고 제한 없이 사용되고, 나타내고 기술된 특징의 해당부분 또는 그의 부분을 제외하는 상기 용어 및 표현의 사용에 있어서 의도는 없으나, 다양한 변형이 청구하는 본 발명의 범주 내에서 가능함이 인지된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예 및 최적의 특징에 의해 구체적으로 개시되었다 하더라도, 본원에서 개시된 개념의 변형 및 변화는 당업자에게 의지될 수 있으며, 그러한 변형 및 변화는 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범주 내에서 고려되어야함을 이해해야 할 것이다.

본 발명은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시물에 속하는 더 좁은 종 및 하위종 그룹의 각각 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 종의 대상체를 제거하는 단서 또는 부정적인 제한과 함께 본 발명의 일반적인 상세한 설명을 포함하며, 삭제된 물질이 구체적으로 본원에서 언급되는지와는 상관이 없다.

Claims (30)

1. 하기를 포함하는 액체 세제 제제 :

   (a) 1 중량% 내지 75 중량% 의 계면활성제 ;

   (b) 10 중량% 내지 95 중량% 의 물 ;

   (c) 0.01 중량% 내지 5 중량% 의 중성 메탈로프로테아제 ; 및

   (d) 사용 전에, 억제제가 90% 내지 100% 의 중성 메탈로프로테아제 분자에 결합하도록 하는 양의 중성 메탈로프로테아제 억제제, 여기서, 세제 제제의 희석은 억제제가 결합된 중성 메탈로프로테아제 분자 중 25% 내지 100% 로부터 억제제가 해리되게 하고, 상기 중성 메탈로프로테아제 억제제가 단백질 가수분해물임.
2. 제 1 항에 있어서, 단백질 가수분해물이 밀 글루텐 가수분해물, 콩 단백질 산 가수분해물, 소 젖의 카제인 산 가수분해물, 식물성 단백질의 효소 가수분해물, 및 그의 임의의 조합물로부터 선택되는 제제.
3. 제 1 항에 있어서, 억제제의 양이 0.01 중량% 내지 15 중량% 인 제제.
4. 제 1 항에 있어서, 세제 제제가 중질 액체 (HDL) 제제를 포함하는 제제.
5. 제 1 항에 있어서, 액체 세제 제제가 추가로 5 중량% 내지 10 중량% 의 폴리프로필렌 글리콜, 0.5 mM 내지 5 mM 의 칼슘 이온 또는 양쪽 모두를 포함하는 제제.
6. 제 1 항에 있어서, 액체 세제 제제가 붕소를 포함하지 않는 제제.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 메탈로프로테아제가 바실러스 sp. (Bacillus sp.) 로부터 단리되는 제제.
8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 메탈로프로테아제가 B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 세루우스 (B. cereus), B. 세루우스 E33L (B. cereus E33L), B. 칼도리티쿠스 (B. caldolyticus), B. 푸물리스 (B. pumulis), B. 메가테륨 (B. megaterium), B. 서브틸리스 아밀로사카리티쿠스 (B. subtilis var. amylosacchariticus), 브레비바실러스 브레비스 (Brevibacillus brevis), 팬니바실러스 폴리믹사 (Paenibacillus polymyxa) (바실러스 폴리 믹사), B. 스테아로서모필루스, B. 투린기엔시스 (B. thuringiensis), B. 서브틸리스 또는 S. 아우레우스 (S. aureus) 인 제제.
9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 메탈로프로테아제가 NprE, 아우레오리신, 세포외 엘라스타제 (extracellular elastase), 또는 중성 프로테아제 B 인 제제.
10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 가수분해물이 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제를 사용한 단백질의 분해에 의해 생성되는 제제.
11. 제 10 항에 있어서, 단백질 가수분해물이 세제 제제에 존재하는 것과 동일한 중성 메탈로프로테아제에 의해 생성되는 제제.
12. 제 10 항에 있어서, 가수분해 생성물이 5000 Da 미만의 단백질 분절을 포함하는 제제.
13. 제 10 항에 있어서, 단백질이 카제인인 제제.
14. 제 1 항에 있어서, 제제가 캡슐화된 입자인 제제.
15. 하기 단계를 포함하는, 억제제-안정화된 액체 세제 제제의 제조 방법 :

    (a) pH 6.5 내지 pH 11 의 pH 및 22℃ 내지 37℃ 의 온도에서 수성 완충액 내에 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 및 단백질 기질을 포함하는 혼합물을 인큐베이션시켜서, 메탈로프로테아제에 의한 기질 단백질의 분해가 가수분해 생성물을 생성하는 단계 ;

    (b) 분자량이 5000 Da 미만인 가수분해 생성물을 단리하는 단계 ; 및

    (c) 단계 (b) 의 가수분해 생성물을 0.001 중량% 내지 10 중량% 의 중성 메탈로프로테아제를 포함하는 액체 세제 제제와 조합하는 단계.
16. 제 15 항에 있어서, 인큐베이션 혼합물이 0.001 중량% 내지 10 중량% 의 중성 메탈로프로테아제 및 5 중량% 내지 20 중량% 의 단백질 기질을 포함하는 방법.
17. 제 15 항에 있어서, 가수분해 생성물이 세제 제제에 존재하는 것과 동일한 중성 메탈로프로테아제에 의해 생성되는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 중성 메탈로프로테아제가 NprE 이고 단백질 기질이 카제인인 방법.
19. 제 15 항에 있어서, 세제 제제가 중질 액체 (HDL) 세제 제제를 포함하는 방법.
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