JPH034790A - 酵素の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、タンパク質分解酵素の安定化方法に関する。

（従来の技術） 酵素は、常温で、特異的９選択的な反応を行う触媒とし
て、多くの分野で利用されている。タン、ｆり質分解酵
素も、医桑、洗剤、化粧品や絹の精練などに有効に利用
されている。しかし、こうした生体触媒は熱やｐＨ変化
などに対する安定性が低く、その応用が制限される欠点
がある。

特に、酵素を含有する形態が水を含む系であったり、水
溶液の場合、保存中にも速やかに活性が低下する問題点
があり、実際には、皿々の安定化剤を添加したり、冷蔵
保存する等の対策がとられている。

酵素の失活は、一般には熱運動による構造変化に基づく
変性失活と考えられるが、タンパク質分解酵素の場合は
、更に酵素相互の分解（自己消化）による失活も起こる
。

このような事情を考慮し、タンパク質分解酵素の安定化
を目的とした種々の方法が提案されている。例えば、タ
ンパク質分解酵素の水溶液に、カゼイン、ゼラチンなど
を添加する方法（特公昭４１−１５２号公報）、可溶性
高分子に酵素を共有結合させ、その水溶液に更にアルブ
ミン、ゼラチンなどのタンパク質を添加する方法（特開
昭５７−１２２７９５号公報）、又酵素を配合した液体
洗剤にカルシウムイオン、ギ酸ナトリウム、アルコール
などを添加する方法（特公昭５８−１１１９８号公報）
、ジカルボン酸及び還元性無機塩類を添加する方法（特
公昭５９−２１７７９９号公報）などがある。

しかるに、このような方法は目的によっては、その配合
が制限されたり、又、その効果についても成る程度は有
効性が認められるが、未だ満足すべきものがないのが実
情である。特に高温条件下での安定化効果は低く、流通
、保存過程で高温にさらされると大幅に活性が損われる
。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、上述の問題点を解決すべく鋭意研究を行
なった結果本発明を完成したものであって、その目的と
するところは、安定性、特に高温安定性に著しく優れ、
且つ適用範囲が広い酵素の安定化方法を提供する°にあ
る。

多糖類及びタンパク質様物質を添加することを特徴とす
る酵素の安定化方法により達成される。

本発明に用いられるタンパク質分解酵素は特に限定され
ないが、動物起源のペプシン。キモトリプシン、トリプ
シン、パンクレアチン等、植物起源のパパイン、微生物
起源のアスペルギス属、リゾプス属、バチルス属の産生
ずるプロテアーゼ等が挙げられる。

本発明の多糖類としては、アラビアガム、グアーガム、
ザンタンガム、ローカストビーンガム、デンプン、デキ
ストラン、プルラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、カラ
ギーナン、ペクチン、キトサンなどの天然多糖類、及び
それらの塩や誘導体、又、カルボキシメチルセルロース
、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルセルロースなどのセルロース誘導体、及びそれら
の塩などが挙げられ、水可溶のものであれば用いること
ができるが、その効果の大きさ、使い易さなどからヒア
ルロン酸、アルギン酸及びそれらの塩が特に好ましい。

用いる多糖類の濃度は大きくなる程、その効果も大きく
なる傾向があり、又その効果も多糖類の種類、分子量に
より異なるが、ｏ、ｏｓ］！量％以上であることが好ま
しい。上限は特に限定されないが、過度に添加しても効
果が飽和することや粘性などの物性、溶解度等を考慮す
ルト、好＊シ＜ハｏ、ｏ　ｓ−ｔ　Ｏ：ｌ量％、更に好
ましくは０．５〜１０重皿％の範囲で用いられる。本発
明でいうタンパク質様物質としては、タンパク質のほか
ペプチド類、ア又ノ酸エステル類等を用いることができ
る。例えば、トシルアルギニンメチルエステル、アセチ
ルチロシンエチルエステル、フィブロイン、アルブ（ン
、カゼイン、ゼラチン等が用いられるが、特に香粧品へ
の配合を目的としたり、物質生産に用いる場合、添加物
の分解に伴なう異臭や不純物の混入が問題となるので、
タンパク質分解醪素に資化されにくい物質などを適宜選
択使用することが好ましい。

例えば、バチルス属菌の産生ずるセリン型エンドプロテ
アーゼを用いる場合、ゼラチンを添加剤として用いると
よい。

本発明に使用するタンパク質様物質の濃度はタンパク質
の種類、酵素濃度等によって異なり一概に規定できない
が、０．０１％以上であることが好ましい。タンパク質
様物質を過度に添加しても効果が飽和することや粘性な
どの物性、溶解度等を考慮すると好ましくは０．０１〜
２０ｗｔ％、更に好ましくはｏ、ｏｉ〜ｌ　Ｑｗｔ％の
範囲で用いられる。

（発明の効果） 本発明方法により、水性溶液中の酵素は著るしく安定化
されるが、その程度は多糖類及びタンパク質様物質の種
類、濃度の他、酵素の顎類、濃度にも依存し、゛目的に
応じてこれらの条件を適宜選択することが望ましい。更
に、本発明の方法では、３０℃以上の高温領域で、その
安定化能が顕著に高いことが特長的であり、条件によっ
ては５０℃で２４時間保存しても、殆んどその活性は失
われない。

本発明の方法は、化学修飾した酵素や、不溶性担体に結
合した酵素に適用することもできる。更に他の安定化剤
と共に添加して用いることもできる。

本発明の方法は、上述した如く、水系媒体中の酵素の安
定性、特に高温安定性を大きく向上させ、その適用範囲
が広く、又、安全な方法であることから、化粧品、薬品
、洗剤などの化成品に好適に応用できるばかりでなく、
それらの商品が流通、保存の間に高温にさらされる事に
起因するトラブルを避けることができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例中、プロテアーゼ活性の測定並びに試薬及び試液
の調製は以下に記載する方法により行った。

〔活性測定〕

プロテアーゼ活性は、アンソン氏改良法に基づき、以下
の方法で測定した。

カゼイン溶液６　ｍｌ　を試験管（１８Ｘ１８０ｍｍ）
に入れ、５０±０．５℃で１ａ分間放置した後、試料溶
液１　ｍｌを正確に量って加え、直ちに振り混ぜｂｏこ
の液を３０±０．６℃で正確に１０分間放置し、トリク
ロル酢酸試液５　ｍｌ　　を加えて振り混ぜ、再び３０
±０．５℃で５０分間放置した後、濾紙１ｔｌ　３１、
φ９（ｍ）で濾過８ｈ。Ｆａ液２　ｍｌを正確に量り、
０．６６　Ｍ炭酸ナトリウム試液５ｍｌ及び、フォリン
試液１．０　ｍｌ　を加え、４０℃で５０分間放置した
後、粧原基一般試験法、吸光度測定法ｆこよりｅ　ｇ　
ｏ　ｎｍにおける吸光度Ａｔを測定ぢｂｏ 空試験として別に試験溶液ｉ　ｍｌ　　を正確に量り、
トリクロル酢酸５．０　ｍｌ　を加えて振り混ぜ１゜更
にカゼイン溶液５　ｍｌ　を加えて振り混ぜ、３０士０
．５℃で３０分間放置し、以下同様に操作して、吸光度
Ａｂを測定１に）。

プロテアーゼ力価は、次式により求め巳。なお、この条
件下で１分間に１μｆのチロシン量に相当する非蛋白性
のフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１プ
ロテア一ゼ活性単位としＬ０ブロテアーゼ力価（単位／
ｙ）＝（ムｔ　−Ａｂ）　ｘ　ｆｆ　５．５ＸＮＮ：試
料の希釈倍数（１ｇ当り） 〔試薬及び試液〕 １）カゼイン溶液 乳性カゼイン約１ｆを正確にｍす、１０５℃で２時間乾
燥し、その減量を測定すｂｏその乾燥物Ｌ２０ｊＦに対
応する乳性カゼインを正確に冷却した後１Ｎ水酸化ナト
リウム試液でｐＨ８，０に調製した後、水を加えて２０
０　ｍｌ　　と１５１’ｓ。

２）トリクロル酢酸試液 トリクロル酢酸１．８１および無水酢酸ナトリウム１．
８１に６Ｎ酢酸６．５ｍｌおよび水を加えて１００　ｍ
ｌ　　とサー。

３）０．５５Ｍ炭酸ナトリウム試液 無水炭酸ナトリウム５８．５１に水を加えて溶かし、ｔ
　ｏ　ｏ　ｏ　ｍｌ　　とＳａ。

４）フォリン試液 フェノール試薬（和光紬薬製）を２倍希釈して用いｂｏ 実施例１ バチルス・リケニホルｉスの産生ずるタンパク質分解酵
素エスペラーゼ（ノボ社製）を精製して調製した酵素の
溶液（Ｑ、　Ｉ　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７）にゼラチン、
ヒアルロン酸を添加し、５０℃における安定性を測定し
た。結果を第１表に示す。

第１表 但し、活性残存率はｐＨ７，５０″ｃ　５０時間保存後
の値を示す。

実施例２ 実施例１と同様にして得た酵素の溶液（４０単位／ｍｌ
、０．１／’Ｉリン酸緩衝液、ｐＨ７）について６０℃
安定性に対するゼラチン、アルギン酸の濃度効果を検討
した。結果を第２表に示す。

（以下・余Ｐ） 第２表 但し、活性残存率は５０℃で４０時間保存した後の値で
ある。

実施例３ 実施例１と同様にして得た酵素の溶液（４０単位／ｍｌ
　、　０．　Ｉ　Ｍリン酸緩衝液ｐＨｒ）について、３
７℃安定性におけるゼラチン、ヒアルロン酸の添加効果
を検討した結果を第３表に示す。

第５表 ％とした。

第４表 実施例４ 実施例１と同様にして得た酵素の溶液（４０単位／ｍＬ
　ｏ、１　、Ｍリン酸’１’ＢＱ　、　ｐＨ７）の５０
℃安定性に対するゼラチン及び各渾添加物の添加効果を
検討した。結果を第４表に示す。

但し、ゼラチン及び他の添加物は、それぞれ１但し、５
０℃、４０時間後の残存活性を示す。

実施例５ バチルス属菌の産生ずる９９ビオブラーゼ（ナガセ生化
学社製）を精製して得た酵素の溶液（４０単位／１１？
、Ｏ，ＩＭリン酸緩衝！ｐＨ７）の５０℃安定性に対す
るゼラチン、ヒアルロン酸の効果を検討した結果を第６
表に示す。

第 表 但し、６０℃　１５時間後の残存活性を示す。

以上の結果から明らかな如く、タンパク質分解酵素水溶
液に多糖類と、タンパク質様物質とを併用添加すること
により、それぞれを単独で用いた場合に比較して、ｌ！
！！素を相乗的ｌζ安定化することが明らかである。

又、この安定化効果は、多糖類がヒドロキシプロピルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸
、アルギン酸などである場合に大きく、特にヒアルロン
酸やアルギン酸では著しい安定化が認められた。

こうした安定化効果は、特に高温頭載で顕著であり、本
発明の方法は酵素水溶液から成る製品の製造、保存、流
通に有用性の高い方法であることがわかる。

実施例６ 実施例５と同様の系について３７℃における安定性を検
討した。結果を第６表（こ示す。

第６表 但し、 ３７℃ ０口後の残存活性を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）タンパク質分解酵素の水溶液にタンパク質様物質
   及び多糖類を添加することを特徴とする酵素の安定化法
   。