CN115666512A - 用于治疗微生物感染的蛋白酶制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种稳定的蛋白酶制剂。此外，它还涉及用于医药和美容品的稳定的蛋白酶制剂，以及防止和减少生物膜形成的方法。

Description

用于治疗微生物感染的蛋白酶制剂

技术领域

本发明涉及用于治疗微生物感染的稳定的蛋白酶制剂。

背景技术

相对于威胁生命的严重感染，细菌、真菌和病毒感染可能是非敌对性的相对温和的短期感染。微生物粘附在宿主细胞膜上是在宿主体内建立感染的最常见方式。微生物表面蛋白识别细胞表面蛋白，从而通过粘附、内化、定殖(colonization)和分泌有毒分子启动微生物感染，使细菌细胞能够在宿主组织内发育和生长(Meena等人，2020年)。治疗和预防微生物感染的一个好的策略可能是减少或预防感染的第一个步骤，即微生物粘附。

暴露于外部环境的哺乳动物身体表面定殖有多种微生物，即微生物群(microbiota)。一些内源性微生物在某些情况下可以导致疾病，而一些生活在外部环境或其他动物身上的外源性病原体在我们与之接触时可以克服我们的抗微生物防御并对我们造成伤害。将致病性生物失调(dysbiotic)微生物群转化为健康的共生微生物群的一个好的策略是靶向生物膜结构和粘附机制，以减少病原体的过度生长并增加微生物多样性。数项研究鉴定了患病皮肤中的微生物相对于健康皮肤中的微生物的差异(Rosenthal等人，2011年)，并表明在许多病理中都存在微生物失衡，称为生物失调(dysbiosis)。

传统的消除动物皮肤感染的方法一直是尝试利用非特异性抗微生物剂(如氯己定(chlorhexidine))靶向攻击性物质。随着所获得的关于共生皮肤微生物组的信息越多，应该对这种非特异性方法是否理想提出疑问(Rosenthal等人)。例如，通常用于治疗脓皮病(pyoderma)的物质例如氯己定可能对核心微生物组的许多都有效，并因此可抑制致病组分和有益组分两者。

不受限制的使用抗生素已经导致抗生素耐药性增加，这是我们这个时代最紧迫的健康风险之一，导致不可治疗的人类感染不断增加(WHO，2019)。抗生素也常见于动物的兽医治疗中，其中使用的许多药物与治疗人类细菌感染的药物相同，并且抗生素耐药性与治疗失败和随后动物健康不佳有关。陪伴性动物也能够获得并与人类交换多重耐药性病原体，并可能是与人接触的抗微生物耐药性储存库(Buckland等人，2016年)。

开发能够抵抗所有细菌耐药机制的新型抗微生物剂变得越来越重要。靶向细菌的毒力特性如粘附和定殖而不是活力，被认为是抗生素治疗的一种有价值的替代策略(Asadi等人，2019年)。病原体粘附至宿主细胞或组织是细菌感染的第一步，也是产生定殖(生物膜)的第一步。据信，产生生物膜的细菌占所有细菌感染的高达80％(Bryers，2008年)。生物膜是由自合成的复合多糖(complex polysaccharides)、蛋白质、脂质和细胞外DNA层保护的微生物群落。当细菌作为生物膜作用时，它们对免疫系统和抗生素的抵抗力可增加高达1000倍(Gilbert等人，1997年)。抗粘附治疗减少了对细菌群体选择压力水平的影响，因此也不太可能产生导致耐药性的突变。

抗生素通常全身施用以抑制致病细菌的生长，并在治疗期间作用于我们的共生微生物群中对我们的健康重要的多种细菌物种(bacterial species)。这可能导致常驻群落(resident communities)的重组，包括细菌多样性的减少以及肠道和皮肤微生物群体中先前的次要贡献者的过生长(outgrowth)。例如，人皮肤和粘膜是由微生物群落之间的共生关系构成的一个复杂的屏障器官，微生物群落与宿主的先天免疫系统和适应性免疫系统持续对话，这是一个控制良好但精妙的平衡，对健康的皮肤是必需的。抗生素引起的健康微生物群的改变可在治疗后持续数月或数年(Shaw等人，2019年)。

酶，尤其是蛋白酶，非常适合于减少或抑制微生物粘附(如细菌粘附)以及在不杀死微生物的情况下溶解生物膜。蛋白酶已经在医药界使用了几十年，是一类已确认的耐受性良好的治疗剂(Craik等人，2011年)。

迫切需要开发新的高度稳定的局部抗微生物组合物，例如抗细菌组合物，其靶向微生物/细菌粘附，基于无毒化合物，不会引起耐药性并且对患者的天然微生物群没有影响或影响很小。

发明概述

本发明的发明人开发了一种新的制剂。所述制剂是一种稳定的蛋白酶制剂，能够防止和减少生物膜形成，并增加受试者中/受试者上或生物表面上的微生物多样性。此外，所述制剂不会引起微生物耐药性，因此可以代替抗生素使用。因此，本文所述的制剂具有很高的临床应用潜力，并为减少抗生素使用的挑战提供了解决方案。

因此，一方面，本公开涉及一种组合物，其包含：

i.0.01％w/w至0.2％w/w蛋白酶；

ii.50％w/w至70％w/w甘油；

iii.0.0％w/w至0.1％w/w透明质酸；和

iv.0.01％w/w至0.2％w/w含二价阳离子的盐。

另一方面，本公开涉及所述组合物，用于医药用途。

另一方面，本公开涉及一种组合物，其包含：

i.蛋白酶；

ii.甘油；

iii.透明质酸；和

iv.二价阳离子，

用于治疗哺乳动物中和/或哺乳动物上选自微生物感染、皮肤疾病和口腔疾病的疾病。

一方面，本公开涉及一种组合物，其包含：

i.蛋白酶；

ii.甘油；

iii.透明质酸；和

iv.二氯化钙，

用于哺乳动物中和/或哺乳动物上的美容用途(cosmetic use)。

另一方面，本公开涉及一种防止和/或减少生物膜的方法，其中所述方法包括施用前述权利要求中任一项所述的组合物。

另一方面，本公开涉及一种增加微生物多样性的方法，其中所述方法包括施用所述组合物。

一方面，本公开涉及制备上文所述的组合物的方法，所述方法包括在25℃按以下顺序混合组分：

i.甘油

ii.缓冲剂；

iii.透明质酸；和

iv.蛋白酶。

附图说明

图1：制剂的优化提高了胰蛋白酶在溶液中的稳定性。图中显示了在(40±2℃/100％ RH)下储存后，不同制剂对胰蛋白酶剩余活性的影响。制剂组合物(N16)包含甘油60w/w％、CaCl₂ 0.1w/w％、胶原蛋白0.3w/w％和0.04w/w％胰蛋白酶，pH 8.5。制剂组合物(N15)包含甘油50w/w％、CaCl₂ 0.1w/w％、胶原蛋白0w/w％和0.04w/w％胰蛋白酶，pH 8.5。(缓冲)溶液含有0.04w/w％胰蛋白酶，pH 7.5。使用非线性回归估计半衰期。

图2：制剂A在体外显著减少生物膜形成。条形图显示了使用阴性对照制剂(n＝12)和测试制剂A(n＝6)处理后，对来自(A)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、(B)假中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)和(C)厚皮马拉色菌(Malasseziapachydermatis)的预先形成的生物膜的影响。与对照制剂相比，制剂A显著减少了菌落形成单位(CFU)/桩(peg)的数量。将数据绘图为带有误差条的平均值(95％置信区间)。

图3：酶处理后观察到的物种数量增加。图中显示了酶治疗组(n＝7)和感染变形杆菌(Proteus)的其中一只狗中观察到的物种数量。对照组(n＝6)没有接受任何治疗。在研究结束时，观察到的物种数量最多的组是用酶处理的组。对照组中观察到的物种没有显著变化。将数据绘图为带有误差条的平均值(标准误差)。

图4：临床相关病原体的丰度与微生物多样性之间存在明显的相关性。将临床相关病原体的丰度相对于微生物多样性评分(Shannon指数)作图，Shannon指数是反映数据集中有多少不同物种的定量量度，该图显示了两个参数之间的明显相关性(r²＝0.8)。这表明临床相关病原体的低丰度与高微生物多样性评分相关。

图5：两个治疗组的临床相关病原体丰度均显著降低。图中显示了从研究期间的第0天到第28天，所有三个患者组的临床相关病原体相对丰度的变化。对照组显示临床相关病原体增加，而两个治疗组均显示减少。与接受氯己定治疗的另一治疗组(p＝0.048)相比，接受酶治疗的组显示出略微更大的减少(p＝0.028)。将数据绘图为带有误差条的平均值(标准误差)。

图6：α多样性主要在酶组中增加。图中显示了(A)第0天和(B)第28天的α多样性，即治疗区域的平均物种多样性。在第28天，酶治疗组的平均α多样性从197增加到404(中位数：从53到479)，氯己定组则观察到从359到392的小的不显著增加(中位数：从345到388)。对照组无明显差异(平均值：从300到312，中位数：从300到192)。将数据绘图为带有误差条的平均值(标准误差)。

图7：治疗组(n＝5)的牙龈炎评分和牙周评分/评级下降。图中显示了用制剂A治疗后，(A)牙龈炎评分和(B)牙周评分下降。这表明使用制剂A治疗的狗的牙龈炎有所减少，以及总体上牙齿健康有所改善。将数据绘图为带有误差条的平均值(标准误差)。

图8：用制剂A治疗的狗表现出长期的积极作用。牙龈炎状态测试在研究结束后仍继续进行，并且甚至在开始后超过60天仍然保持低评分。这种作用似乎持续了超过60天，这表明非健康微生物群已被更健康的微生物群所取代。

详细说明

定义

本文中使用的术语“蛋白酶”意指在肽键处切割任何长度(短或长)的多肽的酶，例如通过水解肽键来切割。因此，蛋白酶的底物是多肽。底物可以是天然存在的多肽或合成的多肽。

术语“生物膜”是指微生物在其中分散和/或形成菌落的细胞外基质。生物膜通常由多糖和其他大分子组成。此外，在本公开中，短语“防止生物膜”、“减少生物膜”或“降低生物膜”等类似短语意指防止生物膜生长、降低生物膜生长速率、部分去除(eradicate)现有生物膜和/或完全去除现有生物膜。

本文中使用的术语“稳定性”是指体内稳定性和储存稳定性(例如，室温下的储存稳定性)。

如本文通常所用，“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理收益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“微生物感染”是指病原微生物在宿主生物体中的不希望的增殖或侵入的存在。这包括通常存在于哺乳动物或其他生物体身体中或哺乳动物或其他生物体身体上的微生物的过度生长。更一般地说，微生物感染可以是一种或多种微生物群体的存在对宿主哺乳动物造成损害的任何情况。因此，当哺乳动物身体中或哺乳动物身体上存在过多数量的微生物群体时，或者当一种或多种微生物群体的存在正在损害哺乳动物的细胞或其他组织时，就会存在微生物感染。

本文中使用的术语“微生物多样性”是指特定环境中(例如哺乳动物的口腔或皮肤上)存在多少不同类型的微生物物种的量度，同时考虑所述物种相对于其他物种的总体表现(overall representation)。

在本公开的上下文中，术语“w/w”是指“重量/重量”。表述“％w/w”与“wt％”或“重量百分比”同义。例如，含有50％w/w的A的10g组合物含有5g A。

在本公开的上下文中，诸如“包含X％至Y％的A的组合物”的短语意指包含X％至Y％范围内(这两个阈值都包括在内)的A的组合物。也就是说，该组合物不包含少于X％的A，并且该组合物不包含超过Y％的A，前提是X小于Y。

稳定制剂

本公开涉及用于治疗微生物感染的稳定的蛋白酶制剂。蛋白酶非常适合用于针对微生物感染、生物膜的治疗中，并且作为治疗剂无毒且耐受性好。它的另一个优点是制剂不会引起耐药性，可以代替抗生素使用。

因此，在一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含：

i.0.01％w/w至0.2％w/w蛋白酶；

ii.50％w/w至70％w/w甘油；

iii.0.0％w/w至0.1％w/w透明质酸；和

iv.0.01％w/w至0.2％w/w含有二价阳离子的盐。

在本公开的一个实施方案中，所述组合物的二价阳离子为钙。在本公开的具体实施方案中，组合物包含0.01％w/w至0.2％w/w钙盐。在本公开的具体实施方案中，组合物包含0.01％w/w至0.2％w/w氯化钙。

在另一实施方案中，组合物进一步包含0.1％w/w至0.4％w/w缓冲剂，例如pH缓冲剂。在本公开的一个实施方案中，缓冲剂可以是两个或更多个缓冲系统的混合物。

在又一实施方案中，所述组合物的缓冲剂选自Tris(2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)和MOPS(3-吗啉丙烷-1-磺酸)。本领域技术人员知晓使用其他药学上可接受的缓冲剂。

在一个实施方案中，组合物还包含单糖。例如，单糖可以是戊糖或己糖。单糖可以以其环状形式、其线状形式或两种形式的混合物存在。在本公开的一个实施方案中，组合物包含0.0％w/w至0.2％w/w单糖，例如0.01％w/w至0.2％w/w单糖。对于皮肤应用，例如对于凝胶的应用，该组合物可以有利地包含单糖。因此，在一个实施方案中，组合物是皮肤组合物，并且包含单糖，例如0.01％w/w至0.2％w/w单糖。在另一实施方案中，组合物基本上不包含单糖，例如0.0％w/w单糖。在另一实施方案中，所述组合物的单糖是甘露糖。在本公开的具体实施方案中，组合物包含0.0％w/w至0.2％w/w甘露糖，例如0.01％w/w至0.2％w/w甘露糖。

在本公开的一个实施方案中，组合物还包含胶原蛋白。胶原蛋白可以是从动物、鱼类和贝类组织中提取和纯化的任何胶原蛋白。提取和分解(decomposition)方法或所得胶原蛋白的修饰程度不受具体限制。在本公开的具体实施方案中，胶原蛋白可以是修饰的，例如化学修饰。在具体的实施方案中，胶原蛋白是明胶。在本公开的一个实施方案中，组合物包含0.0％w/w至0.3％w/w胶原蛋白，例如0.01％w/w至0.3％w/w胶原蛋白。对于美容用途，制剂可以有利地包含胶原蛋白。胶原蛋白可以提高皮肤组合物的稳定性，并可具有进一步的针对皮肤使用的有利性质。因此，在本公开的一个实施方案中，组合物包含胶原蛋白，例如0.01％w/w至0.3％胶原蛋白。在本公开的另一实施方案中，组合物基本上不包含胶原蛋白，例如0.0％w/w胶原蛋白。

在一个实施方案中，所述组合物的蛋白酶是胰蛋白酶。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其主要切割氨基酸赖氨酸和精氨酸羧基侧的肽链。在本公开的一个实施方案中，组合物包含0.01％w/w至0.2％w/w蛋白酶，例如0.01％w/w至0.2％w/w胰蛋白酶。在本公开的又一实施方案中，组合物包含0.02％w/w至0.09％w/w蛋白酶，例如0.02％w/w至0.09％w/w胰蛋白酶。在本公开的具体实施方案中，组合物基本上包含0.04％w/w蛋白酶，例如0.04％w/w蛋白酶。

在本公开的一个实施方案中，组合物包含一种或多种二醇、三醇或多元醇，例如甘油、丙二醇或糖醇。在一个实施方案中，组合物包含二醇。在具体实施方案中，本公开的组合物包含50％w/w至80％w/w二醇，例如50％w/w至75％w/w，例如50％w/w至70％w/w，例如50％w/w至62％w/w。在具体实施方案中，组合物包含50％w/w至80％w/w甘油，例如50％w/w至75％w/w，例如50％w/w至70％w/w，例如50％w/w至62％w/w。在本公开的另一具体实施方案中，组合物基本上包含60％二醇，例如甘油。二醇、三醇和/或多元醇的作用部分地是降低组合物中的水活性。降低水活性进而使蛋白酶失活。蛋白酶的失活提高了其在组合物中的稳定性。

在本公开的一个实施方案中，组合物包含糖胺聚糖，例如透明质酸。如本文所用，“透明质酸”涵盖透明质酸及其透明质酸盐，包括但不限于透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁和透明质酸钙。在具体实施方案中，组合物包含0.0％w/w至0.1％w/w糖胺聚糖，例如透明质酸。在另一具体实施方案中，组合物包含0.002％w/w至0.1％w/w糖胺聚糖，例如透明质酸。在另一具体实施方案中，组合物包含0.0％w/w至0.04％w/w糖胺聚糖，例如透明质酸。在另一具体实施方案中，组合物包含0.002％w/w至0.04％w/w糖胺聚糖，例如透明质酸。在另一具体实施方案中，组合物基本上包含0.02％w/w糖胺聚糖，例如透明质酸。在本公开的一个实施方案中，组合物包含0.0％w/w至0.1％w/w透明质酸，例如0.002％w/w至0.1％w/w。

在本公开的另一实施方案中，组合物包含以下或基本上由以下组成：

i.0.02％w/w至0.09％w/w蛋白酶；

ii.50％w/w至62％w/w甘油；

iii.0.0％w/w至0.04％w/w透明质酸；

iv.0.01％w/w至0.1％w/w CaCl₂；

v.0.1％w/w至0.4％w/w Tris或MOPS；

vi.0.0％w/w至0.2％w/w甘露糖；和

vii.0.0％w/w至0.3％w/w胶原蛋白。

在本公开的另一实施方案中，所述组合物包含以下或基本上由以下组成：

i.0.04％w/w蛋白酶；

ii.60％w/w甘油；

iii.0.2％w/w透明质酸；

iv.0.01％w/w二氯化钙；和

v.0.1％w/w Tris或MOPS。

在本公开的另一实施方案中，所述组合物包含以下或基本上由以下组成：

i.0.04％w/w蛋白酶；

ii.60％w/w甘油；

iii.0.02％w/w透明质酸；

iv.0.01％w/w二氯化钙；和

v.0.1％w/w Tris或MOPS。

在本公开的又一个实施方案中，所述组合物的组分的组合不超过100％。

在另一实施方案中，所述组合物的pH值为6.0至7.5，例如6.2至7.4。溶液的pH值可以通过多种方式进行评估。例如，pH值可以使用pH电极或pH指示剂评估。

在一个实施方案中，组合物还包含水。在本公开的具体实施方案中，组合物的至少一部分水来源于缓冲剂。游离水的存在会激活蛋白酶和/或使蛋白酶去稳定。组合物中的水可被其他组分(例如，本文所述的甘油和其他醇)去活化。因此，在一个实施方案中，组合物包含小于50％w/w水，例如20％w/w至50％w/w水。为了提高蛋白酶的稳定性，重要的是组合物中的水活性低。将组合物应用至例如伤口、皮肤或口腔中时，来自所述伤口、皮肤或者口腔的水与组合物混合，增加了水活性。这进而激活了蛋白酶。

在另一实施方案中，组合物为喷雾(spray)、凝胶(gel)、乳膏(cream)、洗剂(lotion)、软膏(ointment)、泡沫(foam)或牙齿咀嚼物(dental chew)的形式。

在一个实施方案中，本公开涉及所述组合物用于医药用途。具体而言，一个实施方案提供了所公开的组合物以用于医药用途。

在另一实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含：

i.蛋白酶；

ii.甘油；

iii.透明质酸；和

iv.二价阳离子，

用于治疗哺乳动物中或哺乳动物上选自微生物感染、皮肤疾病和口腔疾病的疾病，或用于哺乳动物中或哺乳动物上的美容用途。

在一个实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含：

i.蛋白酶；

ii.甘油；

iii.透明质酸；和

iv.二价阳离子，

用于治疗哺乳动物中的选自微生物感染、皮肤疾病和口腔疾病的疾病。

在本公开的一个实施方案中，微生物感染选自细菌感染、真菌感染、酵母感染和病毒感染。

在另一实施方案中，皮肤疾病是皮肤感染。在另一实施方案中，皮肤疾病是炎性皮肤病。在另一实施方案中，炎性皮肤病选自特应性皮炎、银屑病、酒槽鼻(rosacea)和痤疮。

在一个实施方案中，口腔疾病是口腔感染。在一个实施方案中，口腔疾病是牙齿感染。在另一实施方案中，哺乳动物是狗、猫、马或人。

在一个实施方案中，所述组合物的蛋白酶是胰蛋白酶。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物的二价阳离子为钙。

在另一实施方案中，组合物还包含0.1％w/w至0.4％w/w缓冲剂。

在又一个实施方案中，所述组合物的缓冲剂选自Tris和MOPS。

在一个实施方案中，组合物还包含单糖。

在另一实施方案中，所述组合物的单糖是甘露糖。

在本发明的一个实施方案中，组合物还包含胶原蛋白。

在另一实施方案中，所述组合物的pH为6.0至7.5，例如6.2至7.4。

在一个实施方案中，组合物还包含水。

在另一实施方案中，组合物为喷雾、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、泡沫或牙齿咀嚼物的形式。

在本公开的一个实施方案中，组合物用于局部使用。

在另一个实施方案中，本公开涉及一种防止和/或减少生物膜的方法，其中该方法包括施用上述权利要求中任一项所述的组合物。

在一个实施方案中，生物膜是哺乳动物中或哺乳动物上的生物膜。

在另一实施方案中，生物膜是生物表面(biological surface)的生物膜。

在一个实施方案中，本公开涉及一种增加微生物多样性的方法，其中该方法包括施用所述组合物。

本领域已知，皮肤屏障和皮肤微生物群对于保护身体免受外部侵袭至关重要，并且改变皮肤微生物群组成和皮肤屏障功能的因素会导致生物失调状态(不平衡状态)，这在一些慢性炎性皮肤病(如特应性皮炎、银屑病、酒槽鼻或痤疮)中已证实(Schommer等人，2013)。因此，刺激皮肤微生物组和微生物多样性的组合物可以在治疗此类疾病和美容方面发挥巨大作用。

此外，发现本公开的稳定制剂与氯己定在减少临床相关病原体方面具有类似的积极作用。然而，本领域已知氯己定可引起过敏反应(尤其是对于湿疹患者)，已报道有对抗生素的交叉耐药性，并且对真菌和分枝杆菌的作用有限。此外，氯己定用于牙科用途会引起副作用，如牙齿染色、增加结石形成以及对口腔(健康)微生物组的负面影响。因此，本领域技术人员理解，使用本公开的制剂将比使用氯己定更有益。

在另一实施方案中，本公开涉及一种制备所述组合物的方法，包括在25℃按以下顺序混合组分：

i.甘油

ii.缓冲剂；

iii.透明质酸；和

iv.蛋白酶。

本公开的一个实施方案提供了一种治疗哺乳动物中和/或哺乳动物上的选自微生物感染、皮肤疾病和口腔疾病的疾病，所述方法包括向有此需要的受试者施用包含以下的组合物：

i.蛋白酶；

ii.甘油；

iii.透明质酸；和

iv.二价阳离子。

实施例

实施例1：稳定性试验

方法

采用5个参数及其浓度的部分析因设计(fractional factorial design)来研究影响胰蛋白酶稳定性的最重要因素(表1)。

表1：研究胰蛋白酶稳定性时测试的组分

制剂变量	设定	单位
			甘油	50–62	wt％
CaCl<sub>2</sub>	0.01–0.1	wt％
			pH	6–8.5	pH
酶	0.02–0.09	wt％
			胶原蛋白	0–0.3	wt％

混合各个组合，并使用MOPS缓冲剂调节pH值。测试了两种不同的制剂：制剂组合物N16，其含有60w/w％甘油、0.1w/w％CaCl₂、0.3w/w％胶原蛋白和0.04w/w％胰蛋白酶，pH8.5，以及制剂组合物N15，其含有50w/w％甘油、0.1w/w％CaCl₂、0w/w％胶原蛋白和0.04w/w％胰蛋白，pH 8.5。包含0.04w/w％胰蛋白酶，pH 7.5的缓冲溶液用作对照。作为测试制剂，制剂A也在相同条件下进行评估。

将制剂混合物放入密封的聚丙烯瓶中。将每种制剂组合物的产品在应激条件下(40±2℃/100％ RH)稳定放置长达411天。在预定的时间点采集样品，并通过测量酶活性直接进行分析。使用Z-Gly-Pro-Arg-pNA作为底物，在分光光度计中于405nm处，在30℃下测量胰蛋白酶活性。每分钟吸光度的降低用作活性参数。测定相对于时间点0的半衰期或剩余活性，并用于描述稳定性。使用非线性回归估计半衰期。

结果

胰蛋白酶的半衰期从缓冲剂中的2天增加到在最稳定的制剂中的超过400天。由于在411天后仍然保持超过88％的酶活性，因此无法准确确定在最稳定的制剂中的半衰期。在40℃储存411天后，测试组合的剩余活性从20％到88％不等(图1)。制剂A也非常稳定，在40℃储存119天后，其剩余活性>90％。其在室温25-30℃下的保质期(shelf life)估计超过3年。

结论

在40℃的应激条件下，可以显著提高胰蛋白酶在溶液中的稳定性。优化制剂在室温下的预期保质期预计超过3年。

实施例2：抗生物膜活性

本研究的目的是根据ASTM E2799-12标准，使用MBEC^TM测定来评估作为测试制剂的制剂A(其稳定性在实施例1中进行了测试)针对预先形成的生物膜以及针对生物膜形成的作用。ASTM E2799-12是一种标准测试方法，用于使用MBEC测定来测试针对铜绿假单胞菌、假中间葡萄球菌和厚皮马拉色菌生物膜的灭菌功效。

方法

在具有非常低的剪切力(shear)(通过在回旋振荡器上轻轻旋转设备而产生)的分批条件下，在桩(peg)上建立成熟的生物膜。在24-48小时生长结束时，冲洗含有生物膜的桩，以去除浮游细胞，并将桩盖(peg lid)置于接收板中。接收板上的孔是根据实验设计填充的，其中包含适当的无菌对照(sterility control)、生长对照(growth control)和中和剂对照(neutralizer control)以及灭菌剂。在本研究中，灭菌剂为表2中描述的制剂和阴性对照，所述阴性对照为不含活性剂的载体溶液(表3)。在规定的接触时间后，将桩盖置于含有中和剂(neutralizer)的接收板中，并将整个设备置于超声波仪中，以去除生物膜并分解团块(clumps)。然后对每个孔的样品进行稀释、铺板和活细胞计数。活细胞的对数减少量是通过用未处理对照的平均对数密度减去经处理的生物膜的平均对数密度来计算的。结果测定为菌落形成单位(CFU)/桩。

表2：制剂A的组成(w/w％)

表3：实施例2中使用的实验设定的总结

CAMHB：阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤(Cation-adjusted Mueller-Hintonbroth)

结果

与对照制剂相比，在用制剂A处理后，研究中分析的所有微生物，即铜绿假单胞菌、假中间葡萄球菌和厚皮马拉色菌的CFU/桩的数量均显著减少(图2)。

结论

制剂A成功地减少了由受试微生物形成的生物膜。

实施例3：法国斗牛犬鼻褶(nasal folds)中的微生物多样性(临床研究)

本临床研究的目的是比较两种不同的溶液对狗皮肤皱褶中天然微生物群的影响。

方法

这项研究是一项随机的单盲前瞻性研究，包括19只个人所属的狗(法国斗牛犬)。测试的两种溶液为添加0.002w/w％苯甲地那铵的制剂A(酶)和2％氯己定溶液。苯甲地那铵是一种苦味剂，将其添加到制剂A中以防止狗舔伤口或治疗部位。将纳入的狗随机分为三个不同的组；一个不接受任何治疗的对照组(n＝6)和两个治疗组，即酶治疗组(n＝7)和氯己定治疗组(n＝6)。

采用以下纳入标准：

i.根据病史和临床检查初步诊断为鼻颌褶皮炎(擦烂(intertrigo))

ii.缺乏并发的系统性疾病或代谢病况，除非主要研究者认为病况稳定

iii.狗未怀孕或哺乳

iv.签署动物所有者知情同意书

使用以下排除标准：

i.与鼻褶中的深部脓皮病相一致的临床病变(如瘘、蜂窝织炎和疖)

ii.鼻褶中的溃疡

iii.狗不允许被触碰鼻褶

iv.在研究前两周或研究期间，对鼻褶进行任何其他形式的局部治疗或任何形式的抗生素治疗

v.纳入前两周和整个研究期间口服皮质类固醇持续治疗的变化

vi.在纳入前90天和整个研究期间注射皮质类固醇

第0天，狗接受了一般临床检查。细胞学样品取自双侧鼻颌褶。从狗的鼻颌褶处收集拭子，并送去根据制造商的指示进行下一代DNA测序(MiDOG，CA，USA)。第0天，宠物所有者也被告知如何每天两次(早上和晚上)在每个鼻褶上涂抹测试溶液(酶治疗溶液或氯己定)，直至诊所回访，但回访当天除外。向所有者提供了两瓶测试产品，并指示他们在室温下储存测试产品。

在第14天，进行与第0天相同的测试和评估。这次访问还发现了可能的副作用。宠物所有者被告知根据之前的介绍继续治疗再一周，并且该治疗不应在回访当天进行，并在下次回访时将所有喷雾瓶退还给诊所。

在第28天，进行了与之前诊所回访时相同的测试和评估。同样，记录了可能的副作用。记录测试溶液瓶的重量。宠物所有者被指示停止所有局部产品应用，并在两周后重新评估患者。

在第42天(停止治疗后14天)，进行最后一次测试样品收集和评估。

结果

所有的狗在细菌和真菌门水平上均表现出低的多样性，但在物种水平上表现出高的细菌多样性和低的真菌多样性。栖居于19只狗的皮肤褶中的主要皮肤细菌门为厚壁菌(Firmicutes)、放线菌(Actinobacteria)和变形菌(Proteobacteria)。主要的皮肤真菌门为子囊菌(Ascomycota)和担子菌(Basidiomycota)。随着时间的推移，局部治疗增加了细菌和真菌组成的多样性，显示为微生物多样性评分提高(图3)。酶治疗组(制剂A)增加38％，氯己定组增加11％，对照组增加<5％。临床相关病原体的丰度与微生物多样性之间可见明显的相关性(r²＝0.8)，表明临床相关病原体的低丰度与高的微生物多样性评分(Shannon指数)相关，Shannon指数是反映数据集中有多少不同物种的定量量度(图4)。与对照组相比，在两个治疗组中，临床相关病原体的丰度显著降低(酶治疗组：p＝0.028，氯己定组：p＝0.048)(图5)。从第0天(图6A)到第28天(图6B)，α多样性，即治疗区域的平均物种多样性主要在酶治疗组中增加。

结论

根据这项研究的结果，我们得出结论，使用制剂A的局部治疗既降低了法国斗牛犬鼻褶中临床相关病原体的相对丰度，又增加了法国斗牛犬鼻褶中的微生物多样性。这表明制剂A可以替代氯己定。

实施例4：狗的牙齿健康(临床研究)

本研究旨在评估制剂A的治疗效果，以改善狗的牙齿状况。

方法

这项临床研究是对5只个人所属狗的开放标签(open label)的前瞻性研究。采用以下纳入标准：

i.

牙科诊断测试评分(牙龈炎评分)≥3(意指中度至重度活跃性牙周病(active periodontal disease)的风险≥97％)

ii.良好至优秀的健康状况

iii.无疾病或感染

iv.最近的牙科治疗(recent dental)>6-8周前

v.签署动物所有者知情同意书

牙科诊断测试(CET OraStrip，Virbac，Ft.Worth，TX)是一种可在诊所进行的检测牙周病并评估中度至重度牙周病风险的测试。诊断测试确定了与牙周病相关的细菌产生的一种有机硫化合物硫醇的水平，并作为牙龈炎水平的量度，其中0表示未检测到硫醇(无牙龈炎)，1-5表示活跃且加剧的牙龈炎。

研究中使用以下排除标准：

i.多次拔牙

ii.大型牙科手术(Major dental procedures)

iii.日常用药

iv.研究期间任何其他形式的牙齿健康治疗

v.不遵从研究方案

vi.记录数据后的治疗副作用。可能的副作用由医生处理

第0天，狗在诊所接受了相关的临床检查。临床检查包括根据制造商的说明使用(对唾液的)

牙科诊断测试进行牙齿状态评估。还进行了牙周评分，以评估牙龈炎和牙周炎的程度(表4)。拍摄了狗的牙齿和牙龈的照片。宠物所有者被告知制剂A应如何每天使用两次(早上和晚上)直到回访，并提供了说明文件。向每位所有者提供一瓶制剂A，并告知其应在室温下储存。

表4：狗的牙周评分。

*通过探测临床附着水平或放射学测定牙槽缘与牙骨质-牙釉质交界(cemento-enamel junction)相对于牙根长度的距离来测量

在第14天，按照与第0天相同的方式进行并记录牙周评级和

牙科诊断测试。再次拍摄了狗的牙齿和牙龈的照片，并告知所有者按照之前的说明继续治疗。

在第28天，进行了与之前回访相同的测试和评级。在这次回访中，还发现了可能的副作用，并记录了瓶的重量。

结果

在治疗期的第28天，

测试显示用制剂A治疗的组的牙龈炎水平降低，这表明患更严重牙周病的风险降低(图7A)。用制剂A治疗的狗的牙周评分也降低，这表明在所治疗狗中牙齿健康状况有所改善(图7B)。在治疗期结束后，还对牙龈炎水平进行了测试，甚至在停止治疗后超过60天，该评分仍然保持低评分(图8)。

结论

制剂A似乎提高了狗的牙齿健康，降低了牙龈炎和牙周评分。此外，这种作用似乎持续了超过60天。这表明，非健康微生物群已被更健康的微生物群所取代。

参考文献

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Shaw,Liam P.,et al."Modelling microbiome recovery after antibioticsusing a stability landscape framework."The ISME journal 13.7(2019):1845-1856.

Claims (54)

1.一种组合物，其包含：

i.0.01％w/w至0.2％w/w蛋白酶；

ii.50％w/w至70％w/w甘油；

iii.0.0％w/w至0.1％w/w透明质酸；和

iv.0.01％w/w至0.2％w/w含有二价阳离子的盐。

2.根据权利要求1所述的组合物，其包含0.002％w/w至0.1％w/w透明质酸。

3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二价阳离子为钙。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含0.1％w/w至0.4％w/w缓冲剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述缓冲剂选自Tris和MOPS。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含单糖。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述单糖为甘露糖。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含胶原蛋白。

9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含以下或基本上由以下组成：

i.0.02％w/w至0.09％w/w蛋白酶；

ii.50％w/w至62％w/w甘油；

iii.0.0％w/w至0.04％w/w透明质酸；

iv.0.01％w/w至0.1％w/w CaCl₂；

v.0.1％w/w至0.4％w/w Tris或MOPS；

vi.0.0％w/w至0.2％w/w甘露糖；和

vii.0.0％w/w至0.3％w/w胶原蛋白。

10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含以下或基本上由以下组成：

i.0.02％w/w至0.09％w/w蛋白酶；

ii.50％w/w至62％w/w甘油

iii.0.002％w/w至0.04％w/w透明质酸；

iv.0.01％w/w至0.1％w/w CaCl₂；

v.0.1％w/w至0.4％w/w Tris或MOPS；

vi.0.01％w/w至0.2％w/w甘露糖；和

vii.0.01％w/w至0.3％w/w胶原蛋白。

11.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物包含以下或基本上由以下组成：

i.0.04％w/w蛋白酶；

ii.60％w/w甘油；

iii.0.2％w/w透明质酸；

iv.0.01％w/w二氯化钙；和

v.0.1％w/w Tris或MOPS。

12.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物包含以下或基本上由以下组成：

vi.0.04％w/w蛋白酶；

vii.60％w/w甘油；

viii.0.02％w/w透明质酸；

ix.0.01％w/w二氯化钙；和

x.0.1％w/w Tris或MOPS。

13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。

14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述制剂的pH值为6.0至7.5，例如6.2至7.4。

15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含水。

16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物为喷雾、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、泡沫或牙齿咀嚼物的形式。

17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，用于医药用途。

18.一种组合物，其包含：

v.蛋白酶；

vi.甘油；

vii.透明质酸；和

viii.二价阳离子，

用于治疗哺乳动物中和/或哺乳动物上的选自微生物感染、皮肤疾病和口腔疾病的疾病。

19.根据权利要求18所述使用的组合物，其中所述微生物感染选自细菌感染、真菌感染、酵母感染和病毒感染。

20.根据权利要求18所述使用的组合物，其中所述皮肤疾病是皮肤感染。

21.根据权利要求18所述使用的组合物，其中所述皮肤疾病是炎性皮肤病。

22.根据权利要求21所述使用的组合物，其中所述炎性皮肤病选自特应性皮炎、银屑病、酒槽鼻和痤疮。

23.根据权利要求18所述使用的组合物，其中所述口腔疾病是口腔感染。

24.根据权利要求18所述使用的组合物，其中所述口腔疾病是牙齿感染。

25.根据权利要求18所述使用的组合物，其中所述哺乳动物是狗、猫、马或人。

26.根据权利要求17至25所述使用的组合物，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。

27.根据权利要求17至26所述使用的组合物，其中所述二价阳离子为钙。

28.根据权利要求17至27所述的组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述缓冲剂选自Tris和MOPS。

30.根据权利要求17至29所述的组合物，其中所述组合物还包含单糖。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述单糖为甘露糖。

32.根据权利要求17至31所述使用的组合物，其中所述组合物还包含胶原蛋白。

33.根据权利要求17至32所述使用的组合物，其中所述制剂的pH值为6.0至7.5，例如6.2至7.4。

34.根据权利要求17至33所述的组合物，其中所述组合物还包含水。

35.根据权利要求17至34所述的组合物，其中所述组合物为喷雾、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、泡沫或牙齿咀嚼物的形式。

36.根据权利要求17至35中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物用于局部使用。

37.一种组合物，其包含：

i.蛋白酶；

ii.甘油；

iii.透明质酸；和

iv.二氯化钙，

在哺乳动物中和/或哺乳动物上用于美容用途。

38.根据权利要求37所述使用的组合物，其中所述哺乳动物是狗、猫、马或人。

39.根据权利要求37至38所述使用的组合物，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。

40.根据权利要求37至39所述使用的组合物，其中所述二价阳离子为钙。

41.根据权利要求37至40所述的组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂。

42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述缓冲剂选自Tris和MOPS。

43.根据权利要求37至42所述的组合物，其中所述组合物还包含单糖。

44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述单糖为甘露糖。

45.根据权利要求37至44所述使用的组合物，其中所述组合物还包含胶原蛋白。

46.根据权利要求37至45所述使用的组合物，其中所述制剂的pH值为6.0至7.5，例如6.2至7.4。

47.根据权利要求37至46所述的组合物，其中所述组合物还包含水。

48.根据权利要求37至47所述的组合物，其中所述组合物为喷雾、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、泡沫或牙齿咀嚼物的形式。

49.根据权利要求37至48中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物用于局部使用。

50.一种用于防止和/或减少生物膜形成的方法，其中所述方法包括施用前述权利要求中任一项所述的组合物。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述生物膜是哺乳动物中或哺乳动物上的生物膜。

52.根据权利要求50所述的方法，其中所述生物膜是生物表面的生物膜。

53.一种增加微生物多样性的方法，其中所述方法包括施用前述权利要求中任一项所述的组合物。

54.一种制备权利要求1至16中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括在25℃按以下顺序混合组分：

i.甘油

ii.缓冲剂；

iii.透明质酸；和

iv.蛋白酶。

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