ES2957887T3 - Preparación con el microorganismo microparásito viable pythium oligandrum para el tratamiento de dermafitosis e infecciones por levaduras en la piel y las membranas mucosas - Google Patents

Preparación con el microorganismo microparásito viable pythium oligandrum para el tratamiento de dermafitosis e infecciones por levaduras en la piel y las membranas mucosas Download PDF

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Abstract

Preparación que contiene el microorganismo micoparásito Pythium oligandrum para el tratamiento de dermatofitosis e infecciones por hongos en la piel y las membranas mucosas, obtenida a partir de una mezcla seca que contiene entre un 0,1 y un 99,9 % en peso del microorganismo micoparásito Pythium oligandrum y entre un 0,1 y un 99,9 % de sustancias auxiliares, que contiene al menos un componente. de un grupo que comprende adsorbente, tampón, humectante, desodorante y aroma. Esta preparación contiene de 1 a 10 x 106, preferiblemente de 10 a 50, células viables del microorganismo Pythium oligandrum por 1 ml de suspensión acuosa en el lugar de aplicación de la preparación, comprendiendo las células viables del microorganismo Pythium oligandrum oosporas latentes. zoosporas enquistadas y micelio cenocítico viable. Se reivindican diferentes métodos de aplicación del preparado. Los ejemplos de realización muestran la viabilidad de las células mediante pruebas genéticas y pruebas prácticas realizadas bajo la supervisión de dermatólogos, estomatólogos y veterinarios. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Preparación con el microorganismo microparásito viablepythium oligandrum parael tratamiento de dermafitosis e infecciones por levaduras en la piel y las membranas mucosas
Campo de la invención
La invención se refiere a una preparación con el microorganismo microparásitoPythium oligandrumcepa DV74 para su uso en un tratamiento médico de dermafitosis e infecciones por levaduras en la piel y las membranas mucosas. La preparación se presenta en forma de una suspensión acuosa preparada a partir de una mezcla seca que contiene del 0,1 al 99,9 % en peso del microorganismo micoparásitoPythium oligandrumcepa DV74 y del 0,1 al 99,9% de sustancias auxiliares que contienen al menos un componente del grupo que comprende adsorbente, tampón, humectante, desodorante y aroma.
Antecedentes de la Invención
Las dermafitosis son infecciones fúngicas causadas por dermatofitos, hongos queratinófilos que atacan, en particular, la piel, las uñas y el cabello, y que se caracterizan por un largo período de incubación. Esto se ve facilitado principalmente por la reacción mínima del sistema inmunitario del huésped como resultado del enmascaramiento efectivo de las superficies de estos hongos queratinófilos del reconocimiento por las moléculas de inmunidad. Los hongos queratinófilos usan la proteína queratina que se encuentra en la piel en toda la superficie del cuerpo humano como su sustento vital en virtud de la degradación enzimática efectiva y el metabolismo de los componentes digeridos. Estos mohos están representados por las especiesTrichophyton, EpidermophytonyMicrosporum,y ya se ha identificado la naturaleza molecular de los factores que permiten a estos microorganismos vivir su estilo de vida (6). Las micosis de la piel y las membranas mucosas se caracterizan por diferentes manifestaciones, que generalmente incluyen irritación, enrojecimiento, descamación o incluso áreas más grandes de la piel, la piel a veces blanca y macerada en áreas de mayor sensibilidad. Los síntomas acompañantes comunes incluyen aumento de la transpiración y síntomas de olor socialmente problemáticos que atestiguan una disbiosis avanzada en los sitios afectados.
Un sinónimo de dermafitosis es la tiña, donde, dependiendo de su localización anatómica, las formas más comunes de dermatofitosis son la tiña pedis (en los pies), la tiña ungueal (debajo de las uñas), la tiña corporis (infección fúngica en el cuerpo, principalmente la parte sin pelo del tronco y la parte proximal de las extremidades inferiores), la tiña crural (el área inguinal, más comúnmente en hombres jóvenes durante el verano después de sudar con ropa ajustada), la tiña capitis (nido redondo de cabello corto roto en el pelo, principalmente entre niños que entran en contacto con un dermatofito zoófilo comoMicrosporum canis).Aunque las dermafitosis no suelen ser enfermedades mortales, son infecciones extremadamente generalizadas que afectan a un porcentaje significativo de la población y cuyos síntomas hacen que la vida laboral y social sea desagradable para quienes las padecen.
Las infecciones por levaduras microbianas oportunistas son dolencias contemporáneas relativamente generalizadas entre los seres humanos, en las que las levaduras comensales normalmente inofensivas que viven en la piel y las membranas mucosas de un ser humano se activan como resultado del debilitamiento del sistema inmunitario durante el estrés, sobrecarga de trabajo, infecciones virales u otras situaciones estresantes, y se transforman en la forma agresiva caracterizada por una morfología y un metabolismo diferentes. La investigación se concentra predominantemente en la levadura patógena más comúnCandida albicansy sus parientes. La investigación molecular y genética ha contribuido recientemente a identificar los factores individuales responsables de este comportamiento inusual de las levaduras patógenas, que posteriormente son objetivos importantes para las terapias de nuevo desarrollo (2).
Las terapias actualmente disponibles para el tratamiento de las infecciones dermatofíticas y por hongos están dominadas por productos químicos antifúngicos del grupo de los azoles, las alilaminas y las equinocandinas, que, sin embargo, son conocidos por su baja eficacia y sus frecuentes efectos secundarios que perjudican a un amplio grupo de usuarios (personas mayores, personas con diabetes o enfermedades hepáticas, personas con inmunidad debilitada). Las terapias que usan estos productos son relativamente muy caras y solo tienen un efecto temporal. No son capaces de lidiar de ninguna manera con la disbiosis (alteración de la microflora fisiológica normal) asociada con este tipo de enfermedad. Por esta razón, el tratamiento moderno para estabilizar la microflora normal que sea eficaz a largo plazo es un gran desafío.
Hasta ahora, el uso de productos biológicos naturales para tratar la dermafitosis y las infecciones por hongos solo se ha desarrollado en una medida mínima. El problema del uso del microorganismoPythium oligandrumpara proteger la piel es tratado en el modelo de utilidad CZ 9883U por los empleados de Biopreparaty spol. s r. o., inventores Vesely y col, con fecha de prioridad 18.11.1999. Los autores usan una suspensión de oosporas en una cantidad que no exceda de 2 x 105 por 1 g de producto para tratar ciertos problemas de la piel entre 9 grupos de pacientes. Sin embargo, aquí no se trata, como suponen erróneamente los autores de CZ 9883U, de eliminar a los causantes de dermatofitosis cuando no hay pruebas en el documento que justifiquen tal afirmación. Los autores presentan resultados de laboratorio del efecto del microorganismoPythium oligandrumsobre elScopulariopsis breviacaulis;sin embargo, este microorganismo es un microorganismo saprofito del suelo (y no un dermatofito). No se realizaron exámenes microbiológicos en ninguno de los pacientes monitorizados en CZ UV9883 y, por lo tanto, es imposible demostrar cómo se ven realmente afectados por los dermatofitos. En cuanto a los efectos curativos declarados, no se menciona en el documento que los pacientes fueran controlados médicamente y, en varios casos, es más una cuestión de sus sentimientos subjetivos referirse a los efectos descritos (cambio en el color de las uñas, desaparición del dolor). La patente CZ 302297, propiedad del solicitante de esta invención, utilizó una mayor concentración de oosporas por primera vez después de exigentes pruebas toxicológicas (más de 2 x 105 por 1 g de producto), pero no trata el tema de las dermatofitosis o infecciones por levaduras en humanos con más detalle. Por el contrario, la ventaja de esta solución es que primero aclaró la capacidad del microorganismo microparásitoPythium oligandrumpara actuar en un entorno distinto al de una suspensión acuosa, como en ungüentos, aceites y otras formas de aplicación. Además, se destacó por primera vez la importancia de las formas de células viables del microorganismoPythium oligandrumdistintas de las oosporas latentes, en particular las zoosporas enquistadas y los fragmentos viables de micelio como formas del microorganismoPythium oligandrummás eficaces en el micoparasitismo directo. El modelo de utilidad CZ 28816 U, propiedad de los solicitantes de la presente invención, trata, en detalle, el tema de las infecciones microbianas oportunistas utilizando preparaciones microbianas duales; estas, sin embargo, se caracterizan de la manera clásica utilizando unidades formadoras de colonias (UFC), cuyo uso no está exento de dificultades en el caso del microorganismoPythium oligandrum.
La desventaja de las soluciones existentes y una restricción significativa en el camino hacia el desarrollo de un medicamento es, por lo tanto, una falta de comprensión completa de la naturaleza de la sustancia efectivaPythium oligandrum,cuya cantidad en las preparaciones generalmente no se puede determinar con precisión. En consecuencia, definir la fuerza y la efectividad de tales preparaciones podría ser difícil de determinar y reproducir.
Resumen de la Invención
Las desventajas especificadas anteriormente se eliminan o se restringen significativamente mediante una preparación para su uso en tratamiento médico, que contiene el organismo micoparásitoPythium oligandrumcepa DV74 para su uso en el tratamiento de dermatofitosis e infecciones por levaduras en la piel y las membranas mucosas, cuya esencia se basa en el hecho de que la preparación en forma de suspensión acuosa en un lado de la aplicación, incluye una mezcla seca que incluye del 0,1 al 99,9 % en peso del microorganismo micoparásitoPythium oligandrumcepa DV74 y del 0,1 al 99,9 % de sustancias auxiliares, que contienen al menos un componente de un grupo que comprende adsorbente, tampón, humectante, desodorante y aroma; en donde la preparación contiene de 1 a 10 x 106, con preferencia de 1 a 500, o con preferencia de 10 a 50, células viables del microorganismoPythium oligandrumcepa DV74 por 1 ml de suspensión acuosa aplicada en el sitio de aplicación, por lo que las células viables del microorganismoPythium oligandrumcontienen oosporas latentes, zoosporas enquiadas y micelio cenocítico viable.
El siguiente microorganismo Pythium oligandrum siempre representa su cepa DV 74. Es posible determinar la viabilidad de la célula del microorganismoPythium oligandrumcepa DV74 por 1 ml de suspensión acuosa en el lateral. Por ejemplo, la viabilidad de las células del microorganismo micoparásitoPythium oligandrumse entiende como la viabilidad determinada por la prueba genética de la preparación al medir el nivel de expresión del gen para la p-tubulina del microorganismoPythium oligandrum(11), mantenido en un medio que es rico en nutrientes, en una atmósfera normal a 30 °C. o ejemplo,
Además, por ejemplo, es posible aplicar la preparación, que incluye las siguientes etapas: a) la preparación de una suspensión acuosa usando dispersión mecánica de una mezcla seca en el volumen definido de agua tibia o solución fisiológica para lograr un contenido de 1 a 10 x 106 células viables, con ventaja de 1 a 500 células viables, y con preferencia de 10 a 50 células viables, del microorganismo micoparásitoPythium oligandrumpor 1 ml de suspensión acuosa en el sitio de aplicación; b) la aplicación de la suspensión acuosa creada de esta manera dependiendo del tipo de diagnóstico que se esté tratando con el uso de la cantidad recomendada de células viables del microorganismo microparásitoPythium oligandrum;c) la colonización de las células viables del microorganismo microparásitoPythium oligandrumen el lugar de aplicación de acuerdo con el diagnóstico que se esté tratando; d) la reproducción de células viables del microorganismo microparásitoPythium oligandrumen el lugar de aplicación de acuerdo con el diagnóstico que se esté tratando para eliminar los dermatofitos o levaduras; y c) la posterior esporulación y eliminación paralela del preparado en el lugar de aplicación, facilitando la estabilización y desarrollo de la microflora normal para asegurar un efecto curativo a largo plazo.
La aplicación de la preparación según la invención en pomadas, aceites, geles, aerosoles, emplastos hidratantes o polvos se lleva a cabo de la manera conocida por los expertos en la materia, con el objetivo de colonizar el lugar de aplicación afectado con una cantidad de células viables correspondiente a los requisitos de los diagnósticos particulares.
Se entiende que la solución fisiológica conocida por un experto en la materia es, por ejemplo, la solución más común de NaCl a una concentración de 9 g por 1 litro, o una solución fisiológica tamponada, por ejemplo, por fosfato de sodio en una cantidad de 10 mg por 1 litro, denominada PBS (solución salina tamponada con fosfato).
En principio, cualquier célula viable puede asegurar la colonización y reproducción del microorganismo micoparásitoPythium oligandrumen el lugar de aplicación. Las oosporas latentes que son capaces de proporcionar células viables de acuerdo con las condiciones locales en 24 - 48 horas después de la humectación de la mezcla seca están representadas en la mayor cantidad en las preparaciones de acuerdo con esta invención. Las preparaciones de acuerdo con esta invención también contienen zoosporas enquistadas y micelio cenocítico viable, que generalmente son capaces de proporcionar células viables dentro de los 20 minutos posteriores a la humectación de la mezcla seca. La colonización de las células viables del microorganismo micoparásitoPythium oligandrumen el lugar de aplicación de acuerdo con el diagnóstico que se está tratando se realiza de la manera conocida por un experto en la materia. En nuestra experiencia, todos estos procesos en las preparaciones según la invención presentadas dependen de la presencia de microorganismos diana tales como dermatofitos o levaduras en el lugar de aplicación. Si dichos microorganismos diana para el microorganismo micoparásitoPythium oligandrumestán presentes, esto conduce a la colonización de células viables dentro de una a dos horas después de su unión a estos microorganismos diana, es decir, dermatofitos o levaduras. El microorganismoPythium oligandrumse multiplica en uno o dos días con el uso de nutrientes proporcionados por los microorganismos diana. Las células viables desaparecen del lugar de aplicación dentro de las dos semanas posteriores a la eliminación de los microorganismos diana. En ese momento, a medida que se agotan los nutrientes provenientes de los microorganismos diana, vemos la transición del microorganismoPythium oligandruma la forma inactiva, es decir, la esporulación, en el lugar de aplicación. Las oosporas latentes creadas de esta manera no sobreviven por mucho tiempo en la piel y las membranas mucosas, ya que se eliminan regularmente mediante procesos dinámicos en estos lugares de aplicación, es decir, por ejemplo, mediante la separación de las células muertas del lugar afectado y la liberación de secreciones en las membranas mucosas. Se determinó empíricamente que el microorganismo micoparásitoPythium oligandrumcepa DV74 que abandona el lugar de aplicación crea las condiciones para el desarrollo y la estabilización de la microflora normal.
Al aplicar la preparación según la invención con la cantidad recomendada de células viables del microorganismo micoparásitoPythium oligandrum,el solicitante determinó empíricamente que para su uso en el tratamiento de dermatofitosis y tiña ungueal la cantidad recomendada de células viables en 1 ml de suspensión acuosa es 50, mientras que es 30 en la eliminación de levaduras en heridas que no cicatrizan y 10 en la eliminación de levaduras en la cavidad oral.
Para su uso en el tratamiento de dermatofitosis en forma de tiña ungueal de acuerdo con esta invención, se aplica una preparación que idealmente contiene 50 células viables por 1 ml de preparación en una suspensión acuosa, aplicada en una cantidad de 0,15 ml de esta suspensión por 1 cm2 del área afectada en forma de una envoltura húmeda o en forma de cremas, ungüentos, toallitas húmedas, aerosoles antimicrobianos, parches humedecidos y polvos.
Para usar para tratar infecciones por levaduras en heridas que no cicatrizan según esta invención, la preparación se aplica en forma de productos curativos húmedos usando compresas húmedas que contienen idealmente 30 células viables por 1 ml de suspensión acuosa en una solución fisiológica y el reemplazo posterior de compresas húmedas que contienen idealmente 30 células viables por 1 ml de suspensión acuosa en una solución fisiológica después de 8 horas durante un período de 4 días. La forma curativa húmeda también se puede aplicar en esta concentración en forma de cremas, ungüentos, toallitas húmedas, aerosoles antimicrobianos, parches humedecidos y la posterior aplicación de estos productos curativos húmedos después de 8 horas durante un período de 4 días.
Para usar para tratar infecciones por levaduras en la cavidad oral de acuerdo con esta invención, la aplicación se realiza enjuagando con el producto en una suspensión acuosa que contiene idealmente 10 células viables por 1 ml de suspensión acuosa de aplicación, donde los enjuagues se realizan al menos dos veces al día durante un período de 5 días consecutivos. Las células viables del microorganismoPythium oligandrumtambién se pueden usar en pastas dentales, geles o aerosoles orales o la suspensión acuosa se puede aplicar al lugar que se está tratando usando una jeringa y una aguja. Todas estas aplicaciones se realizan al menos dos veces al día durante un periodo de 5 días consecutivos.
La principal ventaja de esta invención es la viabilidad verificada de las células del microorganismo micoparásitoPythium oligandrum,el logro de un efecto terapéutico significativo y a largo plazo en los diagnósticos monitoreados, la estabilidad de la preparación, que se puede controlar y almacenar durante un período más largo, hasta 2 años, en estado seco y la posibilidad de una dosificación más precisa y controlada durante la aplicación. La capacidad probada del microorganismo micoparásitoPythium oligandrumpara suprimir y matar la levadura patógenaCandida albicanspodría actuar como punto de partida para el desarrollo de otras preparaciones para actuar contra otros diagnósticos, por ejemplo, micosis vaginales (candidiasis).
Otro mérito de la invención es, con respecto al nivel actual de tecnología y las preparaciones biológicas fungicidas aplicadas hasta ahora, que la preparación de acuerdo con esta invención para su uso en el tratamiento de denatofitosis e infecciones por levaduras en la piel y las membranas mucosas contiene una cantidad definida con precisión de sustancia biológica eficaz basada en la medición de la cantidad de células viables del microorganismo micoparásitoPythium oligandrum,para lo cual se utilizó un procedimiento molecular preciso para determinar las células viables, y los procedimientos de aplicación de la preparación, que se verificaron clínicamente.
La invención facilita la creación de una nueva generación de preparaciones que usan el microorganismoPythium oligandrumcon viabilidad conocida de oosporas latentes, zoosporas enquistadas y micelio cenocítico viable a un bajo valor de contaminación microbiana. La preparación reivindicada se puede incluir en las formulaciones de preparaciones aprobadas y notificadas con los efectos curativos nuevos y reproducibles descritos en las pruebas de laboratorio y prácticas descritas en los Ejemplos. Se describe la supresión del crecimiento de dermatofitos y levaduras patógenas en una prueba de suspensión de laboratorio, al igual que los efectos durante la aplicación sobre las dermatofitosis en animales, para su uso en el tratamiento de la tiña ungueal en humanos y la supresión de levaduras patógenas en heridas no cicatrizantes en pacientes diabéticos y no diabéticos y en la cavidad oral.
En investigaciones anteriores se adoptaron varias soluciones y metodologías para determinar el parámetro de viabilidad, aunque ninguna de ellas es particularmente apropiada para este fin. Estos incluyen procedimientos basados en diferentes técnicas viables de teñido que funcionan bien para otros tipos de células, pero son conocidos en el microorganismoPythium oligandrumpor sus procedimientos complicados y resultados poco confiables. El solicitante de esta invención es consciente de la técnica de plasmólisis a altas concentraciones de osmolitos, que proporciona resultados confiables, pero que depende de la evaluación subjetiva por parte del observador bajo un microscopio. Además de esto, proporciona información sobre la integridad de la oosporaPythium oligandrumy no sobre su viabilidad.
Otro grupo de metodologías ampliamente utilizadas se basa en la siembra en placa de una preparación que contiene las células viables dePythium oligandrumen una placa de Petri y, posteriormente, el seguimiento del número de colonias formadas. Desafortunadamente, la naturaleza biológica dePythium oligandrumcon su estilo de vida activo y su alta velocidad de propagación lineal a través del micelio cenocítico no es particularmente compatible con estos procedimientos, que de otro modo son un estándar común en microbiología. A menudo, la posibilidad final para determinar la viabilidad en preparaciones de oosporas latentes del microorganismoPythium oligandrumes el monitoreo microscópico directo de las oosporas en germinación. Sin embargo, esto es, por el contrario, exigente en el tiempo y desde la perspectiva de la técnica experimental utilizada (secuencias de vídeo).
A la luz de los problemas especificados anteriormente, se depositaron grandes esperanzas en las técnicas de genética molecular para determinar la viabilidad de las células del microorganismoPythium oligandrum.En nuestro trabajo anterior, intentamos determinar la viabilidad utilizando una prueba molecular que se basó en la amplificación por qPCR de dos secuencias de genes diana independientes para este microorganismo (4). Sin embargo, este enfoque no resultó adecuado para una serie de preparaciones que contienen un alto contenido de células muertas del microorganismoPythium oligandrumcomo resultado de los antecedentes considerables del procedimiento. El monitoreo de ciertos transcritos expresados constitutivamente solo a través de células vivas del microorganismoPythium oligandrumdemostró ser una mejor solución a este respecto, y finalmente se eligió el transcrito de P-tubulina, una proteína expresada abundantemente de este microorganismo. Todo el experimento dura una semana e incluye el cultivo de oosporas latentes en un medio que contiene penicilina (para suprimir el crecimiento de bacterias contaminantes) durante un período de 4 días, con muestras tomadas cada 24 horas y analizadas mediante el procedimiento RT-PCR para la transcripción mediante transcriptasa inversa. Encontramos el valor de viabilidad extrapolando la curva linealizada, medida y exponencial de la dependencia temporal del crecimiento al punto cero.
La ventaja de este procedimiento de determinación es la determinación precisa de la cantidad de células viables en cualquier preparación de microorganismoPythium oligandrumindependientemente de su edad y procedimiento de preparación. Cabe destacar que la viabilidad de las células en preparaciones que contienen el microorganismoPythium oligandrumdepende en gran medida del procedimiento de su preparación y almacenamiento. Por esta razón, es casi imposible juzgar este parámetro a partir del número total de oosporas latentes determinadas en la preparación microscópicamente (diferentes determinaciones establecen la cantidad de células viables del microorganismoPythium oligandrumcomo 0,01 % a 30 % de la cantidad monitoreada de oosporas latentes, lo que proporciona datos altamente inciertos). De las razones especificadas anteriormente se desprende que la práctica existente de expresar la potencia biológica (dosis efectivas) del microorganismoPythium oligandrumen función del número total declarado de oosporas sin determinar su viabilidad proporciona resultados poco reproducibles que son esencialmente difíciles de usar, y a partir de los cuales no es posible determinar la dosis de aplicación óptima incluso después de la corrección de la cantidad de la sustancia aplicada. Al utilizar el procedimiento recientemente establecido, los resultados de las pruebas de laboratorio y prácticas fueron consistentes y todos apuntaron a una actividad óptima en diferentes aplicaciones prácticas en suspensiones que contienen de 10 a 50 oosporas viables por ml de mezcla de aplicación.
Además del ajuste óptimo del protocolo de aplicación, las mediciones de la viabilidad de las oosporas latentes realizadas por el solicitante y descritas a continuación en la invención presentada también son importantes para las pruebas de estabilidad en el monitoreo de lotes individuales de preparaciones. Nuestras experiencias prácticas de pruebas de eficacia demuestran inequívocamente que cuando hay una caída en el número de oosporas latentes por debajo de 330 por g de preparación (10 por ml de mezcla aplicada), hay una disminución en la eficacia en la eliminación de dermatofitos y levaduras, mientras que una disminución en este valor por debajo de 33 por g (1 por ml de mezcla aplicada) hace imposible garantizar un efecto positivo. Por el contrario, la relación de concentración y eficacia en preparaciones con un contenido muy alto de oosporas latentes no puede expresarse de manera inequívoca, dependiendo principalmente de la pureza de dicha preparación en relación con la pureza de los ingredientes de entrada y la meticulosidad de la tecnología observada. Cuando aparecen sustancias contaminantes, se puede observar una cierta disminución en la efectividad en preparaciones que contienen más de 33,000 oosporas latentes por 1 g de mezcla (1,000 por ml de mezcla aplicada), probablemente en función de la influencia interferente de impurezas desconocidas. Tal disminución en la efectividad no se observó en formas altamente purificadas del oomiceto microparásitoPythium oligandrum,aunque la experiencia con este tipo de preparación es actualmente muy limitada.
Otra desventaja para las pruebas rápidas de la efectividad del microorganismoPythium oligandrum,en particular las pruebas de suspensión realizadas con los microconidios de dermatofitos o suspensiones de levaduras, es la lenta viabilidad de las oosporas latentes, que tardan al menos 48 horas. Por esta razón, parecería preferible reemplazar las oosporas latentes con zoosporas enquistadas preparadas de acuerdo con los procedimientos publicados para realizar tales pruebas. Determinamos en una comparación directa a modo de experimento que ambas preparaciones, es decir, las zoosporas enquistadas recién preparadas y las oosporas latentes con viabilidad determinada, exhiben capacidades idénticas para suprimir dermatofitos y levaduras patógenas. Además, en el caso de las zoosporas enquistadas, es una forma almacenable de células viables del microorganismo micoparásito.Pythium oligandrum.
La invención propuesta es altamente compatible con los requisitos impuestos a las pruebas de preparaciones médicas microbianas vivas, en las que se requieren pruebas de colonización y una descripción de las actividades biológicas, metabólicas, morfológicas y de otro tipo en el lugar de la aplicación específica. La invención ya se ha aplicado con éxito en este sentido para su uso en el tratamiento de dermatofitosis en animales, donde ha permitido, entre otras cosas, aclarar el papel del microorganismoPythium oligandrumen la eliminación de la disbiosis y el establecimiento de un equilibrio microbiano fisiológico normal en la piel y en otros lugares de aplicación, por ejemplo, las membranas mucosas (4, 9).
Breve descripción de los dibujos
La solución técnica se describe con más detalle en realizaciones ejemplares y se explica con más detalle en los dibujos esquemáticos adjuntos, en los que
La Figura 1muestra una prueba de laboratorio de la efectividad de la supresión de dermatofitos y levaduras dependiendo de la cantidad de zoosporas enquistadas viables agregadas del microorganismoPythium oligandrum,por lo que se refiere con más detalle a
La Figura 1A y la Figura 1B,representan una prueba de efectividad con el uso del dermatofitoTrichophyton interdigitatevar.menlagrophytesde la cepa de recolección DMF2374 después de 24 y 48 horas de incubación,La Figura 1C y la Figura 1D,que representan una prueba de efectividad con el uso del dermatofitoMicrosporum canisde la cepa de recolección CCM8353 después de 24 y 48 horas de incubación,
La Figura 1E y la Figura 1F,que representan una prueba de efectividad con el uso deldermatofito Epidermophylon floccosumde la cepa de recolección PL231 después de 24 y 48 horas de incubación,
La Figura 1G y la Figura 1H,que representan una prueba de efectividad con el uso de la levadura patógenaCandida albicansde la cepa de recolección CCF8261 después de 24 y 48 horas de incubación,
La Figura 2muestra los resultados clínicos para su uso en el tratamiento de la dermatofitosis experimental de conejillos de indias, en que la parte superior de la figura muestra los resultados para los conejillos de indias tratados con un placebo y la parte inferior de la figura muestra los resultados para los conejillos de indias tratados con el uso de una suspensión de acuerdo con la realización ejemplar 1 de esta invención, y con más detalle enLa Figura 2A,que muestra fotografías del dorso de un conejillo de indias bajo anestesia con la aplicación de un placebo el día 16 de tratamiento con enrojecimiento característico de la piel en los lugares infectados,
La Figura 2B,que representa una sección histológica de la piel de un animal con la aplicación de un placebo, que muestra la proliferación característica de queratinocitos en la capa superior de la piel en reacción a la irritación por dermatofitos no tratados,
La Figura 2C,que representa el índice clínico de dermatofitosis de animales con la aplicación de un placebo en los días individuales de tratamiento, marcado como el índice de enrojecimiento (la columna de color gris claro) y el índice de daño cutáneo (la columna de color gris oscuro),
La Figura 2D,que muestra una fotografía del dorso de un conejillo de indias bajo anestesia con la aplicación de una suspensión de acuerdo con la realización ejemplar 1 de esta invención en el día 16 de tratamiento con un menor nivel de enrojecimiento de la piel en las áreas infectadas,
La Figura 2E, que representa una sección histológica de la piel de un animal con la aplicación de una suspensión de acuerdo con la realización ejemplar 1 de esta invención, que muestra un nivel significativamente menor de proliferación de queratinocitos en un animal tratado con éxito,
La Figura 2F,que representa el índice clínico de dermatofitosis de animales con la aplicación de una suspensión de acuerdo con la realización ejemplar 1 de esta invención en los días individuales de tratamiento, marcado como el índice de enrojecimiento (la columna gris claro) y el índice de daño cutáneo (la columna gris oscuro).
Realizaciones ejemplares de la invención
La solución que proponemos es posible en base a análisis de laboratorio adicionales y pruebas prácticas de preparaciones para medicina humana y veterinaria según esta invención, basadas en CZ 302297, cuya formulación detallada ahora se especificó con respecto al uso en el tratamiento de dermatofitosis y tiña ungueal, la eliminación de levaduras de heridas que no cicatrizan y de la cavidad oral. La invención presentada se describe adicionalmente en detalle en las siguientes realizaciones ejemplares, pero no debe limitarse a ellas. Estas realizaciones ejemplares se presentan para garantizar que la descripción sea exhaustiva y describa la esencia de la invención en la medida de las reivindicaciones patentadas.
Ejemplo 1
La preparación de mezclas secas que contienen el microorganismo Pythium oligandrum de una viabilidad conocida determinada para su uso en el tratamiento de dermatofitosis en cobayas, tiña ungueal y la eliminación de levaduras en heridas que no cicatrizan y en la cavidad oral.
(Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3)
a) Preparación del microorganismo micoparásito Pythium oligandrum
La cepa M1 dePythium oligandrum(cepa DV74, cuyo protocolo secuencial se encuentra en la página siguiente) se mantuvo en agar y el cultivo de partida se preparó mediante un cultivo líquido. Los granos de mijo esterilizados (Panicum miliaceumL.) se inocularon con el cultivo líquido. El cultivo se llevó a cabo en condiciones estériles durante un periodo de alrededor de 7 días y la biomasa húmeda se secó posteriormente con cuidado y se molió en polvo que contenía partículas de un tamaño medio de 35 a 50 μm. La cantidad de oosporas se estimó al microscopio y la preparación se estandarizó de acuerdo con las condiciones de CZ 302297 hasta un contenido de 7 ± 1 x 106 oosporas por 1 g.
b) Medición de la viabilidad de las células del microorganismo Pythium oligandrum en 3 lotes
Para determinar el número de células viables del microorganismoPythium oligandrum,el solicitante de la invención presentada desarrolló un procedimiento original que se lleva a cabo utilizando una prueba genética de la preparación en forma de una suspensión acuosa según esta invención, midiendo el nivel de expresión del gen constitutivo para la p-tubulina del microorganismoPythium oligandrummantenido en un medio rico en nutrientes en una atmósfera estándar a 30 °C.
La cantidad de células viables en el material analizado se determinó utilizando el siguiente procedimiento: Se pesó 1 g de sustancia seca y se mezcló en 100 ml de agua en una licuadora de cocina. Se mezclaron 0,5 ml de esta suspensión con 4,5 ml de medio de cultivo en una placa de cultivo de seis pocillos incubada a 30 °C, donde se tomaron muestras de 50 ml 48 horas, 72 horas y 96 horas después del inicio de la incubación. Se extrajeron los ácidos nucleicos y el extracto se diluyó 50 x en agua libre de nucleasas. Esto fue seguido por la transcripción inversa y la amplificación por PCR de acuerdo con el protocolo estándar en una mezcla de reacción que contenía 4 ml del extracto, 1 ml de una mezcla de cebadores para la amplificación de la p-tubulina dePythium oligandrum(3) y 5 ml de mezcla enzimática. La curva exponencial obtenida se linealizó y extrapoló al tiempo cero inicial. La viabilidad determinada de esta manera fue de 41.700 por g de sustancia en el caso del lote de microorganismo micoparásitoPythium oligandrum(A), 12.500 por g de sustancia en el caso del lote de microorganismo micoparásitoPythium oligandrum(B) y 8.300 por g de sustancia en el caso del lote de microorganismo micoparásitoPythium oligandrum(C). Nota: Las letras A, B y C entre paréntesis en esta y otras realizaciones marcan los lotes individuales del microorganismo micoparásitoPythium oligandrumque tiene las viabilidades descritas anteriormente.
El protocolo secuencial del Pythium oligandrum M1 aplicado se muestra a continuación: Pythium oligandrum M1_ITS4_rRNA de la cepa probada DV74
ATCATTACCACACCTAAAAACTTTCCACGT GAACCGTTATAACTATGTT CTGTGCTTCGTCGCAAG
ACTTGAGGCTGAACGAAGGTGAGT CTGCGTCTATTTT GGATGCGGATTTGCT GAT GTTATTTT AAA
CACCTATTACTTAATACTGAACTATACTCCGAATACGAAAGTTTTT GGTTTTAACAATT AACAACT
TTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAA
TTGCAGAATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTTCGGGTTATGCCTGGAAGT
ATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGCCTTTCTTTTTTTGTGTAGTCAAAATTAGAGATG
GCAGAATGTGAGGTGTCTCGCGCTGTCTTTTTAAAGATGGTTCGAGTCCCTTTAAATGTACGTTGA
TTCTTTCTTGTGTCTGCGAATTGCGATGCTATGCTCTTTGTGATCGGTTTAGATTGCTTTGCGCTG
GTGGGCGACTTCGGTTAGGACATATGGAAGCAACCTCAATTGGCGGTATGTTCGGCTTTGCCTGAC
GTTAAGCTAAGCGAGTGTAGTTTTCTGTCTTTTCCTTGAGGTGTACCTGTCGTGTGTGAGGTTGAT
TTAGGCTATATGGTTGCTTGGTTGTGTGGTTTAGCGTTTTCAGACGCCTGCTTCGGTAGGTAAAGG
AGACAACACCAATTTGGGACTGAGAGTTTACT
Pythium oligandrum M1, citocromo oxidasa mitocondrial COXII de la cepa probada DV74
1 atggaaggta ttattaactt tcatcatgat ttagtatttt ttttaattat tgtgactgtt
61 tttgtttgtt ggttattatt tagagtaatc gtattattcg atgaaaaaaa aaacccaata
121 cctgctacat ttgtacatgg agcaactatt gaaattattt ggacaacaat tccagcatta
181 attttattaa ccgtagcagt tccatctttt gctttattat attcaatgga tgaaattatt
241 gatccaatta taactttaaa agtaataggt agtcaatggt actggagtta tgaatattct
301 gataatttag aatttgcaga tgaaccttta atttttgata gttacatggt tcaagataat
361 gacttagaaa taggacaatt taggttatta gaagtagaca accgtgttgt tgtaccaact
421 aatagccata ttagagtttt aataacagct tctgacgttt tacattcatg ggctataccc
481 tctttaggtt taaaattaga tgcttgtcca ggtcgtttaa atcaaacttc aatgtttatt
541 aaaagagaag gtgtatttta cggtcaatgt agtgaaatat gtggtataaa tcatggtttt
601 atgccaatag ttgttgaagc agtttcatta gaagattatt tagtttggtt aaaaaacaa
661 attaattttg attttaatgt ataa
c) Preparación y aplicación de la mezcla para su uso en el tratamiento de la dermatofitosis y la tiña ungueal Tabla 1 Composición de la preparación para su uso en el tratamiento de dermatofitosis y la tiña ungueal
d) Preparación y aplicación de la mezcla para eliminar levaduras en heridas no cicatrizantes Tabla 2 Composición de la preparación para eliminar levaduras en heridas que no cicatrizan
c) Preparación y aplicación de lamezcla para eliminarlas levaduras en la cavidad oral
Tabla 3 Composición de la preparación para eliminar levaduras en la cavidad oral
Ejemplo 2
Este ejemplo representa una realización no reivindicada, que sirve para aclarar la invención.
Supresión del crecimiento y eliminación de dermatofitos y levaduras en una prueba de laboratorio (Figura 1)
Se eligió la aplicación del microorganismoPythium oligandrumen forma de zoosporas enquistadas preparadas según el protocolo publicado (5) para las pruebas de eficacia de laboratorio. Se eligió el procedimiento de prueba de suspensión, que se prefiere para la verificación de las actividades antimicrobianas de otras preparaciones (1). Las zoosporas se enquistaron mediante agitación en vórtice durante un período de 2 minutos y se mantuvieron en estas condiciones a 16 °C hasta el comienzo del experimento. Se prepararon suspensiones de microconidios de los dermatofitosTrichophyton interdigitalevar.mentagrophytes DMF2374, Microsporum canis CCM8353 y Epidermophyton floccosumPL231 y una suspensión de levadurasCandida albicansCCM8261 según las metodologías publicadas (7, 1). La suspensión de zoosporas y la suspensión de microconidios o células de levadura se diluyeron a la concentración requerida, y las células se cultivaron en una suspensión en placas de plástico de seis pocillos durante un período de 48 horas a 30 °C. Se tomaron muestras para la determinación del número de células vivas mediante el procedimiento de cultivo después de 24 y 48 horas.
El resultado del experimento se muestra en la Figura 1. Se muestra que en todos los casos probados, la cantidad de zoosporas enquistadas fue óptima para suprimir el crecimiento de los dermatofitos y la levadura patógenaCandida albicansque se está estudiando a entre 10 y 50 células viables por 1 ml de solución examinada con dermatofito o levadura. Si la cantidad de zoosporas enquistadas era menor, no se garantizaba la supresión efectiva del crecimiento. Sorprendentemente, ni siquiera una mayor cantidad de zoosporas condujo a mejores resultados en la supresión del crecimiento de los microorganismos diana, siendo este crecimiento idéntico o superior.
Ejemplo 3
Esta realización comparativa no reivindicada no se encuentra dentro del alcance de la invención y solo tiene el propósito de aclarar la invención.
La eliminación de dermatofitos y el establecimiento de microflora fisiológica en cobayas infectados con dermatofitos
(Figura 2)
Esta prueba se realizó de acuerdo con el protocolo publicado (4, 7) con infección por una cepa verificada deTrichophyton interdigitalevar.mentagrophytesDMF2374. Se utilizó una mezcla idéntica a la de la realización ejemplar de esta invención como placebo durante la aplicación, reemplazándose la biomasa de cultivo por agua y una sustancia fungicida de acuerdo con la realización ejemplar 1c de esta invención como sustancia experimental.
El resultado de esta prueba se describe en la Figura 2. La apariencia general de un conejillo de indias tratado en la parte inferior de la Figura 2 y la histología de la piel del animal y el valor de los índices clínicos de dermatofitosis del animal muestran claramente el efecto clínico significativo en el tratamiento de la dermatofitosis experimental en comparación con un animal tratado con un placebo del que se omitió la sustancia activaPythium oligandrum.
Ejemplo 4
Este ejemplo representa una realización no reivindicada, que sirve para aclarar la invención.
La eliminación de los dermatofitos y la mejora del estado clínico de los pacientes contiña ungueal(Tabla 4)
La Tabla 4 en la página siguiente muestra los resultados de un estudio en el que participaron 21 pacientes afectados por tiña ungueal en combinación con otras dermatofitosis. Antes de la aplicación de la preparación según esta invención, los 21 pacientes tenían hallazgos positivos por microscopía, y la aparición de al menos un dermatofito, en algunos casos dos dermatofitos, se confirmó en todos los pacientes por cultivo. La aparición de la levadura patógenaCandida albicansfue, con mucho, la más común entre la microbiología acompañante. Los más comunes en los diagnósticos adjuntos fueron diabetes, tinea pedis y tinea pedis interdigitale y, en un caso, se observó una enfermedad fúngica de la mano. Una o más uñas en el pie se vieron afectadas en una medida media de 1,5 del área de la uña. La aplicación de la preparación de acuerdo con la realización ejemplar 1c se realizó para todos los pacientes en el estudio en forma de envolturas de uñas nocturnas durante dos noches consecutivas con la aplicación repetida después de 14 días y un mes.
Se realizó una evaluación de la efectividad nueve meses después del final de la aplicación, que es 10 meses después del comienzo del estudio. La mayoría de los pacientes fueron negativos al microscopio, mientras que el cultivo reveló que dos pacientes tenían una aparición esporádica residual del dermatofitoTrichophyton rubrum,este dermatofito se produjo en mayor medida en un paciente y la levaduraCandida albicansse produjo esporádicamente en un paciente. En general, entonces, el nivel de tratamiento micológico podría evaluarse como altamente satisfactorio, con la resolución de la carga micológica en el 95 % de los pacientes y el tratamiento clínico evaluado en promedio a un nivel de 2,1 en la escala de seis puntos (1 - tratamiento completo sin malformación de las uñas, 6 - deterioro de la condición). En total, la tiña ungueal se curó en 12 pacientes sin ninguna malformación de las uñas (54.5 %), 1 paciente fue tratado con malformación residual (4.5%), la mejoría clínica de más del 50 % fue evidente en 6 pacientes (27.3 %), hubo una mejoría insignificante de hasta el 50 % en un paciente (4.5 %) y no hubo cambios en la condición clínica en dos pacientes incluso 9 meses después del final de la aplicación (9.2 %), aunque la documentación médica sugeriría una alta probabilidad de reinfección en estos casos. No hubo pacientes que sufrieran deterioro en la condición clínica.
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Ejemplo 5
Este ejemplo representa una realización comparativa no reivindicada, que sirve para aclarar la invención.
La supresión y eliminación de levaduras patógenasenheridas no cicatrizantes en pacientes
(Tabla 5)
La influencia de la aplicación de la preparación de acuerdo con esta invención en un grupo de 12 pacientes con heridas no cicatrizantes complicadas por infección por levaduras con las levaduras patógenasCandida albicansse controló en un estudio práctico preliminar. Seis de los pacientes sufrían de diabetes, seis no. La edad media de los pacientes en el grupo diabético fue de 77,5 años y en el grupo no diabético de 57,2 años. Hay un predominio de mujeres, que se sabe que tienen una mayor susceptibilidad a la aparición de úlceras varicosas y heridas que no cicatrizan. Además, de la anamnesis de los pacientes se desprende que no ha habido avances en el tratamiento de heridas que no cicatrizan durante un período mínimo de 6 meses después del inicio del tratamiento con preparaciones médicas de uso común, incluidos los antibióticos, y durante un período aún más largo para algunos pacientes (hasta 2 años). Se proporcionó tratamiento húmedo para pacientes con el uso de una suspensión preparada usando preparaciones de acuerdo con la realización ejemplar ld como parte de la cicatrización húmeda. Los apósitos de aplicación se reemplazaron cada 8 horas durante un periodo total de 4 días. La aplicación descrita redujo la carga microbiológica de manera muy significativa, ya que la aparición de la levadura patógena se redujo en un 95,3 % en el caso de pacientes diabéticos y en un 75,3 % en pacientes no diabéticos, observándose una reducción del 85,3 % para todo el estudio. Hubo una mejora en el cuadro clínico de la infección basada en la evaluación de los médicos participantes que evaluaron la extensión del proceso inflamatorio, la intensidad de la descarga de pus, etc., del 78,3 % en pacientes diabéticos y del 67,2 % en pacientes no diabéticos, lo que significa una mejora del 72,8 % en total para todo el estudio. Se encontró una correlación altamente significativa entre la reducción de la carga microbiana y la mejora del cuadro clínico de la infección microbiana, que es un hallazgo muy significativo dentro del contexto de la bibliografía médica publicada.
Tabla 5
Ejemplo 6
Este ejemplo representa una realización comparativa no reivindicada, que sirve para aclarar la invención.
La supresión y eliminación de levaduras patógenas en la cavidad oral
(Tabla 6)
Se realizó un estudio entre 12 pacientes con presencia de levaduras patógenas en la cavidad bucal en ambulancias de higiene dental bajo la supervisión de los estomatólogos.
Después del muestreo microbiológico y la aclaración de la naturaleza del diagnóstico, se informó a los pacientes y se les proporcionó un paquete de la preparación para eliminar las levaduras patógenas en la cavidad bucal que contenía 5 comprimidos efervescentes de acuerdo con la realización ejemplar Id. Después de la higiene bucal nocturna, los pacientes lavaron cuidadosamente la cavidad bucal y luego enjuagaron con la preparación durante al menos cinco minutos con la condición de que contuviera un promedio de 10 oosporas viables del microorganismoPythium oligandrumdespués de la activación previa en agua tibia. La cavidad oral no se enjuagó después de esto para que el resto de la solución de aplicación permaneciera allí durante la noche. La aplicación se repitió por la mañana y los pacientes continuaron de esta manera durante un período de 5 días, utilizando los 5 comprimidos efervescentes del envase.
El seguimiento clínico posterior y la evaluación de la eficacia continuaron alrededor de 6 meses después de la aplicación. La levadura patógena se eliminó de la cavidad bucal en el 67,1% de los casos, esto acompañado de una mejora media en el estado clínico de los pacientes afectados en un 66,8%. Los pacientes sufrieron principalmente inflamaciones repetidas de la cavidad oral y enfermedades periodontales. Una vez más se identificó una correlación entre la reducción en la aparición de levaduras en la cavidad oral y una mejora en la condición clínica.
Tabla 6
Correlación de la mejora de la carga microbiológica y una mejora en la condición clínica de 10 pacientes con infección por levaduras en la cavidad oraL_________________________________________________________
Aplicación Industrial
La preparación para el tratamiento de dermatofitosis e infecciones por levaduras en la piel y las membranas mucosas podría usarse para suprimir los síntomas asociados con la infección por dermatofitos o levaduras en la piel y las membranas mucosas, tales como síntomas de olor socialmente molestos, transpiración excesiva del pie, irritación y ardor, y para la supresión y eliminación de la aparición de dermatofitos y levaduras en heridas que no cicatrizan, en la cavidad bucal, en la piel, en las membranas mucosas urogenitales, en el cabello y en otros lugares afectados por estos microorganismos.
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Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Una preparación, que contiene el microorganismo micoparásitoPythium oligandrumcepa DV74, para su uso en el tratamiento de dermatofitosis e infecciones por levaduras en la piel y las membranas mucosas, donde la preparación en forma de suspensión acuosa en un sitio de aplicación,
obtenida a partir de una mezcla seca que contiene del 0,1 al 99,9 % en peso del microorganismomicoparásito Pythium oligandrumcepa DV74 y del 0,1 al 99,9% en peso de sustancias auxiliares, que contiene al menos un componente de un grupo que comprende adsorbente, tampón, humectante, desodorante y aroma,
donde la preparación contiene de
1 a 10 x 106 células viables de dicho microorganismoPythium oligandrumcepa DV74 por 1 ml de suspensión acuosa en el sitio de aplicación, y donde las células viables del microorganismoPythium oligandrumcomprenden oosporas latentes, zoosporas enquistadas y micelio cenocítico viable.
2. La preparación para su uso según la reivindicación 1, donde la preparación contiene de 1 a 500 células viables del microorganismoPythium oligandrumcepa DV74 por 1 ml de preparación aplicada en una suspensión acuosa.
3. La preparación para su uso según la reivindicación 1, donde la preparación contiene de 10 a 50 células viables del microorganismoPythium oligandrumcepa DV74 por 1 ml de preparación aplicada en una suspensión acuosa.
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