ES2328785T3 - Metodo para detectar microorganismos patogenos y agentes antimicrobianos, metodo para evaluar el efecto farmacologico de agentes antimicrobianos, y agentes antimicrobianos. - Google Patents
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Abstract
Un agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis que comprende un compuesto agente antifúngico que tiene un grupo representado por la fórmula (I): **(Ver fórmula)** en donde R 1 y R 2 son iguales o diferentes y son átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C1-C6), un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo (C 1-C 6), grupo alquenilo (C 2-C 8), grupo alquinilo (C 2-C 6), o grupo arilalquilo (C 7-C 12), m es 2 ó 3, n es 1 ó 2, o una sal del mismo como un ingrediente activo, en donde el agente terapéutico se ha de administrar tópicamente.
Description
Método para detectar microorganismos patógenos y
agentes antimicrobianos, método para evaluar el efecto farmacológico
de agentes antimicrobianos, y agentes antimicrobianos.
La presente invención se refiere a un agente
terapéutico para onicomicosis.
Se necesita un método para evaluar un efecto
farmacológico con un modelo animal con el fin de explorar un nuevo
agente antimicrobiano (de aquí en adelante mencionado
"fármaco"). Además, se necesita un método que permita que un
efecto farmacológico se evalúe con exactitud, por la gran
importancia de predecir una eficacia terapéutica clínica del
mismo.
Históricamente, se ha usado un modelo de
dermatofitosis experimental en el que el lomo, planta y zona
interdigital de una cobaya se han infectado con Trichophyton
mentagrophytes con el fin de evaluar un efecto de un agente
antifúngico en dermatofitosis. Tales modelos animales se han usado
ya para desarrollar algunos agentes antifúngicos. La evaluación del
efecto de tales agentes antifúngicos se realiza aplicando el agente
antifúngico al animal infectado, extirpando la piel tras el periodo
determinado de tiempo cortándola en varias porciones pequeñas,
cultivando las porciones de piel en el medio, y contando el número
de porciones en las que no se observa crecimiento de hongo o el
número de animales o patas en los que no se observa crecimiento de
hongo en todas las porciones de piel, como un indicador
(Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 36:
2523-2525, 1992, 39: 2353-2355,
1995). De aquí en adelante el método convencional para evaluar el
efecto farmacológico se menciona como "el método
convencional".
Aunque el fármaco que tiene una potente
actividad frente a Trichophyton in vitro, tal como
lanoconazol o amorolfina, se ha comercializado en estos días,
apenas se observa una mejora en la tasa de curaciones en un uso
clínico. Como una razón principal de ello se ha indicado una recaída
porque, como el hongo en la piel no muere completamente tras un
tratamiento, el hongo crece de nuevo.
También en experimentos animales, cuando se
evaluó un efecto de lanoconazol en modelos de tiña del pie de
cobaya usando el método convencional, aunque se observó "negativo
en hongo" en todos las patas de cada 20 patas 2 días después del
último tratamiento, se observó una recaída en 11 de cada 20 patas 30
días después del último tratamiento, y no se observó correlación
alguna entre el efecto 2 días tras el último tratamiento y el
efecto 30 días tras el último tratamiento (36ª Conferencia
Internacional sobre Agentes Antimicrobianos y Quimoterapia, New
Orleans, Louisiana, 1996, Abstr. F80).
Una razón de ello es la siguiente. Como el
lanoconazol tiene actividad antitrichophyton in vitro muy
potente, el lanoconazol persistía en la piel 2 días después del
último tratamiento a la concentración en la que se mostraba el
efecto de esterilización. Por tanto, cuando la piel se extirpa y
cultiva en el medio para detectar el hongo, el lanoconazol que
permanece en la piel se difunde en el medio y por tanto no se
detectó ningún hongo debido a la prevención del crecimiento
independientemente de la presencia de hongo viable en la piel
extirpada. Por otra parte, como la concentración del fármaco que
permanece en la piel se reduce 30 días después del último
tratamiento, el hongo en la piel puede crecer nuevamente y se puede
detectar por estudio de cultivo.
De acuerdo con esta hipótesis, se ha establecido
que el fármaco permanecía en la piel durante la inhibición del
crecimiento del hongo alrededor de los bloques de piel
completamente, cuando los bloques de piel tratados con lanoconazol
se colocaban y cultivaban en el medio que contiene dermatofitos.
Por tanto, resultó evidente que el método
convencional tiene el problema de que el efecto farmacológico no se
puede evaluar con exactitud, porque el efecto terapéutico aparente
necesita ser evaluado después de separar el fármaco que permanece en
la piel.
Mientras tanto una clase de micosis, la
dermatofitosis, es la dermatosis superficial que está causada por
dermatofitos que parasitan la queratina tal como piel (capa córnea),
la uña y el pelo. En particular, la tiña ungueal formada en las
uñas se conoce como la enfermedad intratable entre las
dermatomicosis basadas en dermatofitosis, y está acompañada por
síntomas tales como opacidad, tilosis, destrucción y deformación de
lámina ungueal. Ahora se usa la presentación oral (tal como
griseofulvina o terbinafina) para el tratamiento de tal tiña
ungueal. Sin embargo, hay muchos casos en que el paciente para de
tomar el fármaco o toma el fármaco irregularmente, porque tiene que
tomar el fármaco durante un periodo largo, por ejemplo al menos
medio año con el fin de curar completamente la tiña ungueal. Se
cree que ésta es una causa principal de la dificultad de curar
completamente la tiña ungueal. Además, tomando el fármaco durante
un período largo, la griseofulvina tiene el problema de efectos
secundarios sobre órganos internos (desorden gastrointestinal,
hepatotoxicidad) y se ha descrito hepatotoxicidad como el efecto
secundario de la terbinafina. Por tanto, con el fin de mejorar la
conformidad del paciente se desea desarrollar una preparación
tópica que cure la tiña ungueal en un periodo corto y tenga menos
efectos secundarios sistémicos que la preparación oral.
Sin embargo, en caso de la aplicación simple
sobre lámina ungueal con el agente antifúngico actual para uso
tópico, no se observó efecto antifúngico sobre el hongo de la uña
porque el fármaco no pudo impregnar suficientemente el espesor de
queratina de la lámina ungueal (Markus Niewerth and Hans C. Korting,
Management of Onychomycoses, Drugs, 58: 283-296,
1999).
Además, el efecto terapéutico de una preparación
tópica de agente antifúngico sobre el modelo experimental de
tricofitosis no se puede evaluar usando el método convencional, como
se ha mencionado anteriormente. Esta puede ser una razón por la que
el efecto farmacológico sobre el modelo de tiña ungueal de cobaya
apenas se ha descrito.
Es deseable que se evalúe un efecto de agente
antimicrobiano tal como, en particular, agente antifúngico, después
de separar un fármaco que permanece en el sitio infectado después
del tratamiento de un animal o una biomuestra tal como piel con el
microorganismo patógeno. Se describe un método para evaluar el
efecto del agente antimicrobiano y el agente antimicrobiano
obtenido de acuerdo con el método para evaluar el efecto
farmacológico. Se describe con detalle un método para detectar el
microorganismo patógeno viable en el sitio del animal o biomuestra
mencionados anteriormente, infectados con el microorganismo
patógeno, tras separar el agente antimicrobiano que ha sido
administrado al animal o biomuestra, y un método para evaluar el
efecto del agente antimicrobiano que puede evaluar con exacitud el
efecto del agente antimicrobiano sin la influencia del agente
antimicrobiano que permanece en el sitio del animal o biomuestra
infectados con un microorganismo patógeno. Además se describe el
agente antimicrobiano obtenido de acuerdo con el método mencionado
anteriormente para evaluar el efecto farmacológico, y el método de
detección del agente antimicrobiano que comprende detectar el
agente antimicrobiano existente en el sitio infectado del animal o
biomuestra con el microorganismo patógeno a los que se administra el
agente antimicrobiano.
Más concretamente, se puede realizar una
detección de un microorganismo patógeno y una evaluación de un
efecto de un agente antimicrobiano infectando un animal o una
biomuestra con el microorganismo patógeno, administrando el agente
antimicrobiano, que comprende un compuesto que tiene un efecto
antimicrobiano o una composición del mismo, antes o después de la
infección, separando después el agente antimicrobiano, y después de
ello detectando el microorganismo patógeno viable en el sitio
infectado con el microorganismo patógeno.
Se puede realizar una detección de un agente
antimicrobiano existente infectando un animal o una biomuestra con
un microorganismo patógeno, administrando el agente antimicrobiano,
que comprende un compuesto que tiene un efecto antimicrobiano o una
composición del mismo, antes o después de la infección, extirpando
después el sitio infectado con el microorganismo patógeno,
colocándolo y cultivándolo en un medio que contiene el
microorganismo patógeno, y después de ello observar una inhibición
del crecimiento del microorganismo patógeno alrededor del sitio
infectado con el microorganismo patógeno.
Además, se proporciona un método de evaluación
de un fármaco que permite evaluar con exactitud el efecto de un
agente antifúngico en un modelo de tiña ungueal de cobaya. Un
objetivo de la presente invención es proporcionar un agente
terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis, que muestra
el efecto en la tiña ungueal por aplicación tópica y que es capaz
de curar la tiña ungueal en un periodo más corto que el de la
preparación oral comercializada debido a la buena permeabilidad,
buena capacidad de retención y conservación de alta actividad en la
lámina ungueal así como a la potente actividad antifúngica del mismo
basadas en la presente invención. Otro objetivo de la presente
invención es proporcionar el agente terapéutico eficaz para
onicomicosis que no muestra efectos secundarios incluso si
suficientemente se administran cantidades terapéuticamente eficaces
del mismo.
Más concretamente, la presente invención
proporciona un agente terapéutico para usar en el tratamiento de
onicomicosis que contiene un compuesto que tiene un grupo
representado por la fórmula (I):
en
donde
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son
átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C_{1}-C_{6}),
un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3
sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo
trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}), grupo alquenilo
(C_{2}-C_{8}), grupo alquinilo
(C_{2}-C_{6}), o grupo arilalquilo
(C_{7}-C_{12}),
m es 2 ó 3,
n es 1 ó 2,
o una sal del mismo como ingrediente activo. El
agente terapéutico se ha de administrar tópicamente.
Además, "presencia" incluye el significado
de "restante".
La Figura 1 es una copia en color de una
fotografía para identificar el agente que permanece en la piel que
se evalúa previamente por el método convencional del método de
detección del agente antimicrobiano cinco días después del último
tratamiento. La nota (a) muestra el grupo control infectado, la (b)
el grupo tratado con KP-103, la (c) el grupo tratado
con lanoconazol.
La Figura 2 es una copia en color de una
fotografía para identificar el agente que permanece en la piel que
se evalúa previamente por el método de detección del agente
antimicrobiano cinco días después del último tratamiento. La nota
(a) muestra el grupo control infectado, la (b) el grupo tratado con
KP-103, la (c) el grupo tratado con lanoconazol.
La Figura 3 es una gráfica que muestra una
distribución del número de células fúngicas en la uña de un modelo
de tiña ungueal de cobaya en cada grupo tratado de acuerdo con el
método de evaluación del efecto farmacológico de la presente
invención.
La Figura 4 es una gráfica que muestra una
distribución del número de células fúngicas en la piel de un modelo
de tiña del pie de cobaya en cada grupo tratado de acuerdo con el
método de evaluación del efecto farmacológico.
Como animal utilizado se incluye mamífero tal
como ratón, rata, cobaya o conejo. Como biomuestra se incluye una
piel de lomo o planta de pata, o una uña, que se toma de dicho
animal.
Un método para infectar tal animal o biomuestra
con un microorganismo patógeno incluye una inoculación percutánea,
oral, intravenosa, transbronquial, transnasal o intraperitoneal.
Especialmente en el caso de la piel, se incluye un método para
inocularlo en la piel, un método para inocular sobre la dermis
expuesta, el método de parche cerrado, o inyección intracutánea. En
el caso de uña, se incluye un método para inocular sobre uña, un
método en el que se infecta una piel de la pata del animal por el
método de infección de la piel mencionado anteriormente, y después
de ello la infección se traslada a la uña dejándola durante varios
meses.
El término "piel" significa un tejido que
incluye las tres capas que son epidermis, dermis y tejido
subcutáneo, acompañado por pilus (pelo), uña, glándulas sebáceas,
glándulas sudoríparas y glándulas mamarias como aditamentos. La
epidermis se separa en cinco capas, que son capa córnea, capa
lúcida, epidermis granulosa, capa espinosa, y capa basal, en orden
desde la superficie. La capa córnea, la capa lúcida y la capa
granulosa epidérmica se mencionan como una capa córnea en sentido
amplio. Aquí, sustancia queratinosa significa una parte de la capa
córnea mencionada anteriormente.
El término "uña" incluye lámina ungueal,
lecho ungueal, matriz ungueal, epidermis lateral cubridora de los
bordes de la uña, epidermis posterior cubridora de los bordes de la
uña, eponiquio e hiponiquio que constituyen un tejido a su
alrededor.
El término "microorganismo patógeno"
significa un microorganismo que causa enfermedad humana y animal de
un modo u otro. Un ejemplo del microorganismo patógeno (de aquí en
adelante mencionado como "microorganismo") es bacterias que
incluyen bacilos gram-negativos aerobios y cocos
tales como las especies Pseudomonas y Neisseriaceae;
bacilos gram-negativos anaerobios facultativos tales
como las especies Eschrichia, Salmonella y
Enterobacter; cocos gram-positivos tales como
las especies Staphylococcus y Streptococcus. Los
otros ejemplos de microorganismo son hongos que incluyen hifomicetos
tales como las especies Trichophyton, Microsporum y
Epidermophyton; blastomicetos tales como Candida y
Malassezia; ascomicetos tales como la especie
Aspergillus; zigomicetos tales como la especie Mucor;
y sus variantes. Ejemplos de tales variantes son cepas resistentes
que obtienen naturalmente resistencia farmacológica; cepa de
mutación auxotrófica que llega a tener dependencia nutritiva; cepa
de mutación artificial que se muta artificialmente por tratamiento
con agente mutagénico.
Micosis significa una enfermedad que está
causada por invasión y proliferación en el tejido de humano o
animal. Normalmente la micosis se divide en sentido amplio en
micosis superficial y micosis profunda. Un foco de la enfermedad
está situado en la piel o mucosa visible en el caso de la primera,
en órganos viscerales, sistema nervioso central, tejido subcutáneo,
músculo, hueso o articulación en el caso de la última. Ejemplo
principal de micosis superficial es la dermatofitosis, que se
produce infectando con dermatofitos tales como las especies
Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton, que
incluye las tres enfermedades tiña, tiña favosa y tiña imbricada.
Tiña se puede usar convencionalmente como un sinónimo de
dermatofitosis. Además, el dermatofito perteneciente a la especie
Trichophyton se menciona normalmente como tricofitosis.
Un agente antimicrobiano significa un compuesto
que tiene un efecto antimicrobiano o una composición que contiene el
compuesto. La composición incluye una forma de preparación que es
una composición artificial y una composición natural tal como un
producto natural.
Un método para la administración del agente
antimicrobiano en los métodos de evaluación y de detección descritos
depende de su clase e incluye aplicación tópica, administración
subcutánea, administración oral, y administración intravenosa.
Cuando se realiza el método para detectar el
microorganismo patógeno, el método para evaluar el efecto
farmacológico y el método para detectar el agente antimicrobiano,
se puede realizar en primer lugar una infección con microorganismo
o una administración del agente antimicrobiano. Especialmente, en el
método para evaluar el efecto farmacológico (de aquí en adelante
mencionado como "el presente método de evaluación") se puede
evaluar un efecto terapéutico del agente antimicrobiano en el caso
en que el agente antimicrobiano se administra tras la infección con
microorganismo, mientras que se puede evaluar un efecto del agente
antimicrobiano protector frente a la infección y su capacidad de
retención en el caso en que la infección con microorganismo se
realiza tras la administración del agente antimicrobiano. Con el
fin de evaluar la capacidad de retención del agente antimicrobiano,
se puede realizar la evaluación variando el periodo hasta la
infección con microorganismo desde la administración del agente
antimicrobiano.
Es preferible usar diálisis o ultrafiltración
para separar el agente antimicrobiano en vista de la utilidad, pero
sin limitación a ello siempre que un microorganismo como diana de
detección o un microorganismo usado en el presente método de
evaluación no estén afectados por ello.
En diálisis es conveniente una membrana de
diálisis comercializada fabricada de celulosa. Se puede usar sin
problema otra membrana fabricada de otro material, siempre que el
microorganismo a ser la diana de detección o el microorganismo a
usar en el presente método de evaluación no se pueda hacerle pasar a
través de ella pero sí el agente antimicrobiano. Como los tamaños
de la mayor parte de los hongos y bacterias son de al menos 0,2
\mum, es preferible usar una membrana que tiene menos de 0,2
\mum de tamaño de poro, en particular es adecuado usar membrana de
diálisis con peso molecular fraccionado de 1.000 a 50.000.
Como disoluciones exteriores usadas en diálisis
se incluyen disolución salina fisiológica, agua destilada,
disolución salina fisiológica tamponada con fosfato, y otros
tampones.
Al separar el agente antimicrobiano, aunque el
sitio infectado con el microorganismo es la uña, órgano además de
la piel, se puede separar eficazmente el agente antimicrobiano. Como
normalmente existe el caso en que la diálisis tarda más tiempo para
separar el agente antimicrobiano desde la uña que desde la piel, se
puede realizar el siguiente tratamiento con enzima digestiva antes
de separarlo con el fin de aumentar el efecto separador.
Las condiciones de diálisis dependen de la
variedad, concentración de dosis, periodo de la dosis y el periodo
sin medicación (el periodo hasta la evaluación desde el último día
de tratamiento) de un agente antimicrobiano. Por tanto, es
preferible investigar previamente las condiciones de diálisis que
permiten que el agente antimicrobiano sea separado de la piel
tratada sobre casos individuales usando el siguiente método de
detección del agente antimicrobiano existente en el sitio infectado
con un microorganismo (de aquí en adelante mencionado como "el
presente método para detectar un agente") para ajustar las
condiciones apropiadamente.
Usando el método siguiente se puede determinar
fácilmente si un agente antimicrobiano se ha separado.
El presente método para detectar un agente se
realiza colocando y cultivando el sitio infectado con un
microorganismo que se ha sometido al método de separación del
agente antimicrobiano (por ejemplo, una porción de piel) o una
suspensión obtenida de acuerdo con el siguiente procedimiento de
extracción del microorganismo desde el mencionado trozo de piel en
un medio de agar que contiene el microorganismo, y observando una
inhibición del crecimiento del microorganismo encontrado a su
alrededor. Cuando hay agente antimicrobiano restante, se observa la
inhibición del crecimiento del microorganismo.
El presente método de evaluación se puede
realizar colocando y cultivando, en un medio, la porción de piel en
la que se ha determinado una separación de un agente antimicrobiano
usando el presente método mencionado anteriormente para detectar el
agente tras realizar la separación apropiada del agente
antimicrobiano y observando si hay crecimiento de microorganismo o
no, o untando y cultivando una suspensión obtenida de acuerdo con el
procedimiento de extracción del microorganismo desde la porción de
piel en un medio de agar, y observando si hay crecimiento de
microorganismo o no o contando colonias emergentes en ese medio.
Se puede realizar un tratamiento con tripsina
con el fin de extraer eficazmente un microorganismo de una
biomuestra tal como piel o una uña. Otras enzimas digestivas aparte
de tripsina tales como pronasa o queratinasa, o un disolvente de
queratina tal como urea, se pueden usar también sin limitación a la
tripsina siempre que tengan un efecto de extracción. Es necesario
ajustar las concentraciones de la enzima digestiva tal como tripsina
y disolvente de queratina en una disolución de tratamiento, y el
tiempo de reacción para no afectar la extensión de un
microorganismo. Se puede realizar el tratamiento con enzima
digestiva tal como tripsina antes o después de la diálisis. Cuando
el tratamiento con tripsina se realiza antes de la diálisis, es
necesario separar suficientemente la enzima digestiva para que el
microorganismo no se afecte por la diálisis.
Como un medio a usar para cultivo de un
microorganismo, se puede usar cualquier medio siempre que se pueda
usar convenientemente para el cultivo y una separación del
microorganismo. Son ejemplos del medio, en el caso de hongos, medio
Sabouraud, medio Sabouraud modificado, medio agar Czapek, y medio
agar de dextrosa de patata. Por otra parte, son ejemplos del medio
en el caso de bacterias medio Mueller Hinton, medio Mueller Hinton
modificado, medio agar de infusión de corazón, medio agar de
infusión de cerebro y corazón, y medio agar normal.
Una temperatura de reacción es 10 a 40ºC,
preferentemente 20 a 40ºC. Se puede cultivar un microorganismo con
permanencia durante un tiempo suficiente cuando el microorganismo se
puede hacer crecer, por ejemplo, 1 a 20 días en caso de hongos, 1 a
5 días en bacterias.
El presente método de evaluación puede ser
utilizable como un método de evaluación de un efecto farmacológico
ex vivo, que comprende infectar una piel, una uña extirpada
de un animal con un microorganismo, después de ello administrar un
agente antimicrobiano como un compuesto de prueba, después separar
el agente antimicrobiano y detectar y determinar cantidades de
microorganismo en la muestra.
El presente método de evaluación se puede
aplicar también a una evaluación de un agente antimicrobiano tal
como un agente terapéutico para micosis profunda o un agente
antibacteriano así como a una evaluación de un efecto de un agente
terapéutico para micosis superficial. Es decir, es posible evaluar
un efecto de un agente terapéutico para micosis profunda o un
agente antibacteriano mediante administración de un agente
antimicrobiano a un animal infectado con un microorganismo tal como
un hongo o una bacteria por inoculación percutánea, oral,
intravenosa, transbronquial, transnasal, intraperitoneal, obteniendo
después una biomuestra tal como piel, riñón, pulmón o cerebro, y
detectando el microorganismo viable en la biomuestra de la que se ha
separado el agente antimicrobiano restante.
Además, el presente método de evaluación permite
una comparación cuantitativa de efectos antimicrobianos mediante
determinación del número de microorganismos viables en la biomuestra
tratada.
Es decir, se realiza una prueba de diferencias
significativas sobre el número de microorganismos en el sitio
infectado con el microorganismo para el grupo tratado con fármaco y
para el grupo infectado de referencia usando un método estadístico
tal como la Prueba de Kruskal-Wallis, y con ello se
puede hacer una comparación cuantitativa entre los grupos usando una
prueba múltiple tal como el método de Tukey.
El método descrito es útil como un método para
evaluar un efecto farmacológico o como un método para detectar los
antimicóticos en sustancia queratinosa o uña, tras administrar el
agente antifúngico al paciente infectado con hongo. Por ejemplo, se
puede evaluar un efecto de un agente antifúngico administrándolo al
paciente cuya piel o uña está infectada con hongo, obteniendo la
sustancia queratinosa o uña, separando después el agente
antifúngico mencionado anteriormente, y después de ello detectando
el hongo viable en la sustancia queratinosa o uña. Además, se puede
realizar una detección de un agente antifúngico administrándolo al
paciente cuya piel o uña está infectada con hongo, obteniendo
después la sustancia queratinosa o uña, cultivándolo en medio agar
que contiene hongo, y detectando después el agente antifúngico
existente en la sustancia queratinosa durante una inhibición de
crecimiento de hongo observado alrededor de la sustancia queratinosa
o uña. Se puede realizar tal evaluación de un agente antifúngico
administrado a un paciente con hongo y la detección del agente
antifúngico de la sustancia queratinosa o uña de la misma manera
que en el método de evaluación de un efecto farmacológico y método
de detección, mencionados anteriormente, del agente antimicrobiano
administrado a un animal o una biomuestra.
Además, el presente método de evaluación
proporciona diversos agentes antimicrobianos útiles. Como agente
antimicrobiano obtenido por el presente método de evaluación hay un
agente antimicrobiano que comprende un compuesto que tiene un
efecto erradicador para microorganismos in vivo o una
composición que contiene el compuesto para terapia de micosis
superficial, micosis profunda o infección bacteriana; un agente
antimicrobiano que tiene el verdadero efecto seleccionado mediante
demostración de un efecto estadísticamente significativo; además,
un agente antimicrobiano que tiene un excelente efecto erradicador
para microorganismos in vivo, que se selecciona mediante la
aparición de pura actividad antimicrobiana del mismo; o un agente
antimicrobiano del tipo de curación completa sin recaída. Un
ejemplo concreto es un agente terapéutico para usar en el
tratamiento de onicomicosis de acuerdo con la presente invención,
que comprende un compuesto que tiene un grupo representado por la
fórmula (I) mencionada anteriormente, en donde el agente terapéutico
se ha de administrar tópicamente. Entre ellos, un ejemplo
preferible más concreto es un agente terapéutico para usar en el
tratamiento de anicomicosis que comprende el compuesto representado
por la fórmula (II):
en
donde
Ar es un grupo fenilo no sustituido o un grupo
fenilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo
de halógeno y grupo trifluorometilo,
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son
átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C_{1}-C_{6}),
un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3
sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo
trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}), grupo alquenilo
(C_{2}-C_{8}), grupo alquinilo
(C_{2}-C_{6}), o grupo aralquilo
(C_{7}-C_{12}),
m es 2 ó 3,
n es 1 ó 2,
X es átomo de nitrógeno o CH, y
*1 y *2 significan un átomo de carbono
asimétrico, en donde el agente terapéutico se ha de administrar
tópicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En las fórmulas (I) y (II) mencionadas
anteriormente, el grupo fenilo sustituido es un grupo fenilo que
tiene 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno y
trifluorometilo, e incluye, por ejemplo,
2,4-difluorofenilo,
2,4-diclorofenilo, 4-fluorofenilo,
4-clorofenilo, 2-clorofenilo,
4-trifluorometilfenilo,
2-cloro-4-fluorofenilo
y 4-bromofenilo. El grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}) incluye, por ejemplo, una cadena
lineal, cadena ramificada o grupo cicloalquilo que tiene 1 a 6
átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo,
isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo,
terc-pentilo y ciclohexilo. El grupo arilo no sustituido
incluye, por ejemplo, fenilo, naftilo y bifenilo. El grupo arilo
sustituido incluye, por ejemplo, 2,4-difluorofenilo,
2,4-diclorofenilo, 4-fluorofenilo,
4-clorofenilo, 2-clorofenilo,
4-trifluorometilfenilo,
2-cloro-4-fluorofenilo,
4-bromofenilo, 4-terc-butilfenilo,
4-nitrofenilo o similares. El grupo alquenilo
(C_{2}-C_{8}) incluye, por ejemplo, vinilo,
1-propenilo, y estirilo. El grupo alquinilo
(C_{2}-C_{6}) incluye, por ejemplo, etinilo. El
grupo aralquilo (C_{7}-C_{12}) incluye, por
ejemplo, bencilo, naftilmetilo y 4-nitrobencilo.
Además, el compuesto más preferido entre los
agentes antimicrobianos mencionados anteriormente incluye el
compuesto que muestra la eficacia terapéutica como el siguiente
KP-103.
El KP-103 mencionado
anteriormente significa un antifúngico indicado por
(2R,3R)-2-(2,4-difluorofenil)-3-(4-metilenpiperidin-1-il)-1-(1H-1,2,4-triazol-1-il)butan-2-ol.
El compuesto se puede preparar dejando reaccionar
(2R,3S)-2-(2,4-difluorofenil)-3-metil-2-[(1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]oxirano
con 4-metilenpiperidina sobre la base del Ejemplo 1
del documento WO94/26734.
La eficacia del KP-103 usado
como un agente antifúngico en el presente agente terapéutico para
usar en el tratamiento de onicomicosis no se ha confirmado, pero su
actividad antifúngica se ha conocido ya (documento
WO94/26734).
WO94/26734).
El agente antimicrobiano obtenido de dicha
manera se puede usar como una composición farmacológica, composición
farmacológica para esterilizar un microorganismo. En otras
palabras, resulta ser una composición farmacológica que cura una
enfermedad tal como la micosis completamente, e impide una
recaída.
Onicomicosis significa una clase de la micosis
superficial mencionada anteriormente, en otras palabas, una
enfermedad que está causada por invasión y proliferación en la uña
de humano o un animal. Trichophyton rubrum y Trichophyton
entagrophytes causan principalmente onicomicosis en humanos. En
casos raros la ocasionan Microsporum, Epidermophyton, Candida,
Aspergillus o Fusarium.
Como una enfermedad que es susceptible de
tratamiento con un agente terapéutico para usar en el tratamiento
de onicomicosis de la presente invención, se incluye tiña ungueal
causada por la especie Trichophyton, onicocandidasis causada
por la especie Candida u onicomicosis (en sentido estricto)
causada por otro hongo.
Un agente terapéutico para usar en el
tratamiento de onicomicosis se da como una preparación tópica. Son
ejemplos una preparación líquida, crema, ungüento o preparación de
manicura como una forma de dosificación. En este caso, se puede
preparar usando vehículo oleoso, vehículo de emulsión o similares.
La cantidad preferida de ingrediente activo es 0,1 a 10% en peso.
Se puede ajustar apropiadamente una cantidad de dosis dependiendo de
la anchura de área afectada y condición de la enfermedad.
En la presente invención, aunque la cantidad de
dosificación de un agente terapéutico para onicomicosis depende de
la edad, peso y condiciones individuales de un paciente, es
aproximadamente 10 mg a aproximadamente 10 g por día,
preferentemente alrededor de 50 mg a aproximadamente 5 g como
cantidad de ingrediente activo. El agente se puede dar en la dosis
diaria mencionada anteriormente en una vez o varias porciones
divididas.
La presente invención se explica además con
detalle sobre la base de los Ejemplos siguientes, pero no está
limitada a ellos.
\vskip1.000000\baselineskip
Pretratamiento del Ejemplo Comparativo 1 y
Ejemplos 1 a 3 (Ejemplos de Referencia).
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocó filtro Millipore (fabricado por
Millipore Corporation, HA, diámetro 47 mm, 0,45 \mum) en medio
agar de infusión de cerebro-corazón (disponible en
Nissui Pharmaceutical Co., LTD.), y sobre ello se aplicaron
10^{6} células de microconidio de cepa de Trichophyton
mentagrophytes KD-04. El cultivo se realizó a
30ºC bajo 17% de CO_{2} durante 7 días. Después del cultivo, se
vertió a gotas sobre el filtro la justa cantidad de disolución
salina fisiológica que contenía 0,05% de Tween 80 y se recogieron
artroconidios usando un lazo de platino. Después de separar una
masa hifal por una filtración con una gasa estéril, se calculó el
número de artroconidios en el filtrado por un hemocitómetro para
ajustar en concentración de 1 x 10^{8} artroconidios/ml para
obtener un inóculo fúngico.
Se preparó un modelo de cobaya de tipo
interdigital de tiña del pie de acuerdo con el método de Arika et
al. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 36:
2523-2525, 1992). Concretamente, la piel
interdigital de dos patas posteriores de cobayas macho de la
especie Hartley, de 7 semanas de edad, se frotó ligeramente con
papel abrasivo. Un disco de papel (disco AA disponible en Whatmen
International Ltd cortado en 8 x 4 mm) humedecido con la disolución
mencionada anteriormente del organismo inoculado se aplicó sobre la
región entre las pezuñas interdigitales de las patas posteriores y
se fijó usando una Almohadilla de Espuma Autoadherente (Restone
1560M; disponible en 3M) y venda estirable adhesiva (ELASTPORE;
disponible en Nichiban Co., Ltd). El disco de papel y la venda se
separaron siete días después de la infección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó como una sustancia de prueba una
disolución de lanoconazol al 1% comercializada (nombre comercial:
disolución Astat (razón social)) y una disolución en la que se
disolvió KP-103 en una concentración de 1% en
mezcla de poli(etilenglicol) #400:etanol (75:25 v/v). Cada
disolución, en una cantidad de 0,1 ml, se aplicó a la piel de la
planta de pata una vez al día a partir de 10 días después de la
infección y durante 10 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
1
El método convencional se describió como sigue.
Para el grupo control infectado sin una aplicación del fármaco, el
grupo tratado con KP-103 y el grupo tratado con
lanoconazol, se usaron respectivamente 10 cobayas (de aquí en
adelante mencionadas como "animales"). Se sacrificaron animales
de cada grupo dos días después y 30 días después del último
tratamiento. Se extirparon sus dos patas posteriores y se frotaron
con la torunda de algodón que contenía alcohol suficiente. La piel
de la planta de pata entera se extirpó y cortó en 15 porciones de
piel, incluyendo en total 12 porciones de piel de partes de la
planta de pata y 3 piezas de piel de una parte interdigital. Todas
las porciones de piel se colocaron en 20 ml de medio agar de
dextrosa Sabouraud (disponible en Difco laboratories) que contenía
50 \mug de cloranfenicol (disponible en Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.), 100 \mug de gentamicina (disponible en
Schering-Plough Corporation), 50 \mug de
5-fluorocitosina (disponible en Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.) y 1 mg de cicloheximida (disponible en Nacalai
Tesque, Inc.) por ml. Una sustancia antibiótica añadida al medio se
puso en condiciones que no permite crecer a las bacterias y que
permite a los hongos crecer sin problema. Después de 10 días de
cultivo a 30ºC, el resultado se describe como
"hongo-negativo" cuando no se observó
crecimiento de hongo en todas las porciones de piel, y se determinó
el número de patas de hongo-negativo. En la
evaluación del efecto 30 días después del último tratamiento, dos
días después del último tratamiento las patas tratadas se frotaron
con una torunda de algodón que contenía alcohol y se fijaron con la
venda con el fin de impedir una reinfección. La venda se cambió una
vez por semana. Los efectos terapéuticos de KP-103 y
lanoconazol dos días después y 30 días después del último
tratamiento se muestran en la Tabla 1.
Como se muestra en la Tabla 1, en el grupo
tratado con KP-103 se observó
hongo-negativo en todas las patas dos días después
del último tratamiento, y también se observó
hongo-negativo en 16 de 20 patas 30 días después
del último tratamiento. Por otra parte, en el grupo tratado con
lanoconazol se observó hongo-negativo en todas las
patas dos días después del último tratamiento, pero se observó
hongo-negativo en solamente 9 patas 30 días después
del último tratamiento, y no hay correlación entre los efectos
terapéuticos dos días después y 30 días después del último
tratamiento. El número de patas de hongo-negativo
disminuyó 30 días después del último tratamiento. Se pensó que el
efecto terapéutico de lanoconazol observado dos días después del
último tratamiento resultó de la inhibición del crecimiento de
hongo causado por una difusión del fármaco restante en la piel
tratada en sistema de cultivo, porque el lanoconazol tenía una
potente actividad antifúngica in vitro frente a
dermatofitos, fue ocho veces más activo que KP-103
frente a Trichophyton con una concentración inhibidora de
crecimiento de 15,6 ng/ml. Se realizó la prueba de determinación del
agente restante.
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo de
Referencia)
Se preparó un modelo de acuerdo con el Ejemplo
Comparativo 1. Se usó lanoconazol que es un compuesto de prueba
para un experimento terapéutico como una disolución al 1% con el
mismo vehículo que KP-103. Para el grupo control
infectado sin una aplicación de un fármaco, el grupo tratado con
KP-103 y el grupo tratado con lanoconazol, se
utilizaron respectivamente 20 animales. Se extirparon las dos patas
posteriores de cada animal cinco días después del último
tratamiento de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 1. Se
usó un total de 20 patas adecuadas para una evaluación por el
método convencional, y en el presente método de evaluación se usó un
total de 20 patas adecuadas.
Las porciones de piel de pata adecuada se
colocaron en 20 ml de medio agar de dextrosa Sabouraud que contenía
cepa de Trichophyton mentagrophytes KD-04 (2
x 10^{4} células/ml) y la sustancia antibiótica descrita en el
Ejemplo Comparativo 1. Tras el cultivo realizado a 30ºC durante 3
días se observó una zona inhibidora de crecimiento de hongo
aparecida alrededor de la piel y se fotografió para 10 de 20 patas.
La Figura 1 es una fecha electrónica de la fotografía de la piel
tras el cultivo en la condición mencionada anteriormente. (a)
indica el grupo control infectado sin la aplicación de fármaco, (b)
el grupo tratado con KP-103 y (c) el grupo tratado
con lanoconazol. Se explicó una placa como representativa de diez
placas correspondientes a cada animal del grupo control infectado
(a). En la Figura 1, S indica una de 15 porciones de piel de planta
de pata derivada del animal y M el medio mencionado anteriormente. S
y M descritos tanto en el grupo tratado con KP-103
(b) como el grupo tratado con lanoconazol (c) son también iguales.
En el medio, la zona blanca muestra el crecimiento de hongo, por
otra parte la zona negra muestra la inhibición del crecimiento de
hongo.
Como muestra la Figura 1, se observó un buen
crecimiento de hongo alrededor de la porción de piel del grupo
control infectado sin fármaco alguno. En el grupo tratado con
KP-103 se observó el crecimiento de hongo en todas
las porciones de piel, aunque el crecimiento de hongo fue inhibido
ligeramente alrededor de las porciones de piel en comparación con
el grupo control infectado. Por otra parte, el crecimiento de hongo
fue inhibido completamente alrededor de las porciones de piel
tratadas con lanoconazol. Como resultado, el efecto terapéutico de
lanoconazol en el método convencional mostrado en la Tabla 1 se
consideró como un claro efecto terapéutico tal que el agente que
permanecía en la piel llegó a mezclarse en el sistema de cultivo
para inhibir el crecimiento de hongo.
Por tanto, parecía que el efecto farmacológico
no se pudo evaluar por el método convencional de modo preciso.
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo de
Referencia)
Como en el Ejemplo 1, se extirparon 20 patas
adecuadas de cada animal cinco días después del último tratamiento,
y se frotaron suficientemente con la torunda de algodón que contenía
alcohol. Se cortó la planta de cada pata. La piel picada con
tijeras se puso en membrana de diálisis (peso molecular
fraccionario: 12.000-14.000, fabricada de celulosa,
disponible en VISKASE SALES Corporation) junto con 4 ml de agua
destilada. La diálisis se realizó con 3 L de agua destilada a 4ºC
durante 2 días. El agua de diálisis se cambió dos veces al día, 4
veces en total. El contenido se transfirió a un homogeneizador de
vidrio. A ello se añadieron 4 ml de disolución salina, tamponada
con fosfato a doble concentración, que contenía 4% de tripsina
derivada de páncreas de cerdo (disponible en BIOZYME Laboratories
Limited) y la mezcla resultante se homogeneizó. Se dejó a 37ºC
durante una hora y se filtró con una gasa de dos capas. El filtrado
resultante se centrifugó. A un precipitado obtenido separando el
sobrenadante se añadieron 8 ml de disolución salina, tamponada con
fosfato, que contenía 2% de tripsina y además se dejó reaccionar
con agitación a 37ºC durante una hora. Después de una
centrifugación, el precipitado obtenido separando el sobrenadante
se lavó tres veces centrifugando con disolución salina tamponada con
fosfato para separar la tripsina. Al precipitado se añadieron 2 ml
de la misma disolución salina para preparar una suspensión del
mismo.
Cuando se realizó la diálisis y el tratamiento
con tripsina utilizando el mismo hongo usado en este Ejemplo, no se
pudo observar un efecto de estos procedimientos sobre una tasa de
supervivencia de hongo. Previamente se preparó un pocillo en el
centro de medio agar de dextrosa Sabouraud (20 ml) que contenía cepa
de Trichophyton mentagrophytes KD-04 (2 x
104 células/ml) y la sustancia antibiótica descrita en el Ejemplo
Comparativo 1. Se añadieron al pocillo 100 \mul de la suspensión
mencionada anteriormente para cultivar a 30ºC durante tres días.
Tras el cultivo, se observó un círculo inhibidor de crecimiento de
hongo y se fotografió para 10 de 20 patas. La Figura 2 es una fecha
electrónica de la fotografía de la piel después del cultivo en la
condición mencionada anteriormente. (a) indica el grupo control
infectado sin la aplicación de fármaco, (b) el grupo tratado con
KP-103 y (c) el grupo tratado con lanoconazol. Se
explicó una placa como representativa de diez placas
correspondientes a cada animal del grupo control infectado (a). En
la Figura 2, E indica la suspensión de piel preparada de planta de
pata del animal y M el medio mencionado anteriormente. E y M
descritos tanto en el grupo tratado con KP-103 (b)
como en el grupo tratado con lanoconazol (c) son también iguales. En
el medio global, la zona blanca muestra el crecimiento de hongo,
por otra parte la zona negra alrededor del pocillo muestra la
inhibición del crecimiento de hongo.
En la Figura 1 que muestra el método
convencional, no se observó crecimiento de hongo alrededor de la
piel del grupo tratado con lanoconazol considerado cinco días
después del último tratamiento y se determinó el fármaco
permaneciente en la piel. En cambio, en la Figura 2, aunque se
observó poco círculo inhibidor de crecimiento en 2 de 10
suspensiones de patas obtenidas separando el fármaco usando
tratamiento de diálisis del presente método para la piel del grupo
tratado con lanoconazol considerado cinco días después del último
tratamiento, nunca se observó el círculo inhibidor de crecimiento en
8 patas residuales.
Como resultó evidente que el fármaco
permaneciente en la piel tratada se pudo separar suficientemente
usando diálisis de acuerdo con el presente método, se confirmó que
la evaluación del efecto farmacológico no estuvo influida por el
fármaco permaneciente.
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo de
Referencia)
A dos medios agar de dextrosa Sabouraud (20 ml)
que contenían la sustancia antibiótica descrita en el Ejemplo
Comparativo 1 se aplicaron 100 \mul de la suspensión de una pata
adecuada de cada animal obtenida en el Ejemplo 2. Después de
realizar el cultivo a 30ºC durante 10 días, el resultado se describe
como "hongo-negativo" cuando no se observó
colonia alguna de hongo en dos placas de agar (límite de detección:
10 CFU (unidades formadoras de colonias/pata). Se contó el número
de patas de hongo-negativo. Por otra parte, se
evaluaron 20 patas de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo
1. La Tabla 2 muestra el resultado de comparar el efecto terapéutico
evaluado por el método convencional con el evaluado por el presente
método de evaluación.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso del grupo tratado con
KP-103, no se observó diferencia significativa en el
número de patas de hongo-negativo, incluso si el
número se evaluó por el método convencional o por el presente método
de evaluación, como se muestra en la Tabla 2. La proporción de
patas de hongo-negativo evaluada por el presente
método de evaluación es 85% en el caso de KP-103.
Por otra parte, en el grupo tratado con lanoconazol, aunque en todas
las patas se observó "hongo-negativo" por el
método convencional, "hongo-negativo" se
observó solamente en tres patas por el presente método de
evaluación.
Como se ha mencionado anteriormente, resultó
evidente que usando el presente método de evaluación se puede
evaluar sustancialmente un efecto farmacológico exacto sin
influencia alguna del fármaco permaneciente tras el tratamiento con
ello.
Además, un resultado del presente método de
evaluación se correlaciona con un resultado obtenido por evaluación
en el método convencional, descrito en el Ejemplo Comparativo 1, 30
días después del último tratamiento. Con ello, usando el presente
método de evaluación, se puede valorar un efecto de un agente
antimicrobiano para impedir una recaída por la evaluación en tiempo
precoz tras un tratamiento. Por tanto, usando el presente método de
evaluación se puede obtener un tipo de curación completa del agente
antimicrobiano sin la recaída.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una disolución fúngica de la misma
manera que en el pretratamiento del Ejemplo Comparativo 1, excepto
cambiando de cepa de Trichophyton mentagrophytes
KD-04 a cepa de Trichophyton mentagrophytes
SM-110.
Se preparó un modelo de cobaya de tiña ungueal y
tiña del pie de la misma manera que en la preparación mencionada
anteriormente de modelo de cobaya en tiña del pie interdigital,
excepto cambiando de cobayas macho de la especie Hartley de 7
semanas de edad a cobayas macho de la especie Hartley de 5 semanas
de edad, y excepto que el disco de papel y la venda se separaron 21
días después de la infección cambiando desde siete días después de
la infección. La invasión de dermatofitos en piel de planta de pata
y lámina ungueal se observó 60 días después de la infección.
\vskip1.000000\baselineskip
Como compuestos de prueba se prepararon
disoluciones disolviendo polvos no purificados de
KP-103 (ejemplo de acuerdo con la presente
invención), amorolfina (Ejemplo de Referencia) y terbinafina
(ejemplo de referencia) a una concentración de 1% en disolución
mezcla de poli(etilenglicol) #400:etanol (75:25 v/v),
respectivamente. Se preparó cápsula de terbinafina triturando el
comprimido comercializado, suspendiendo a concentración de 100
mg/ml en Miglyol 812 (disponible en Mitsuba trade Co., Ltd) con
uniformidad de homogeneizador de vidrio, e inyectando la suspensión
resultante en cada cápsula a la concentración de 40 mg/kg
dependiendo del peso corporal medido por día de administración. Se
aplicó una disolución de KP-103, amorolfina o
terbinafina en la cantidad de 0,1 ml a piel de planta de pata y uña
de una pata una vez al día durante 30 días consecutivos. En caso de
cápsula de terbinafina, se administró oralmente una cápsula (40
mg/kg).
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto sobre tiña ungueal se evaluó por el
método siguiente.
Se sacrificaron animales dos días después del
último tratamiento. Se extirpó una pata posterior y se frotó
suficientemente con la torunda de algodón que contenía alcohol. Se
extirparon uñas (tres en total) de una pata posterior y se picaron
con tijeras. Se transfirieron a un homogeneizador de vidrio y se
homogeneizaron añadiendo 4 ml de disolución salina tamponada con
fosfato a doble concentración (Sales Tamponadas con Fosfato,
disponibles en Takara Shuzo Co., Ltd.) que contenía 4% de tripsina
derivada de páncreas de cobaya (disponible en BIOZYME Laboratories
Limited). La reacción se realizó con agitación a 37ºC durante una
hora. Tras una centrifugación, el precipitado obtenido se lavó tres
veces centrifugando con disolución salina tamponada con fosfato con
el fin de separar la tripsina. El precipitado se suspendió con 4 ml
de agua destilada y se puso en membrana de diálisis (peso molecular
fraccionario: 12.000-14.000, fabricada de celulosa,
disponible en VISKASE SALES Corporation). Se realizó diálisis en 3
L de agua destilada a 4ºC durante 14 días. El agua de diálisis se
sustituyó dos veces al día, 28 veces en total. Tras una
centrifugación se añadió 1 ml de disolución salina tamponada con
fosfato al precipitado obtenido separando el sobrenadante para
preparar una suspensión. Esta suspensión se definió como disolución
madre y se diluyó por un factor de diez. Al medio agar de dextrosa
Sabouraud (20 ml) que contenía la sustancia antibiótica descrita en
el Ejemplo Comparativo 1 se añadieron 100 \mul de la disolución
madre o la dilución. Después de realizar el cultivo durante 10
días, el resultado se describió como
"hongo-negativo" cuando no se observó colonia
alguna de hongo en todos los medios (límite de detección: 10
CFU/patas). Se contó el número de patas de
hongo-negativo en la uña. Cuando aparecían colonias
en el medio, se contó el número de colonias (CFU) para calcular el
número de colonias en la uña de una pata por el grado de diolución.
Se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para el
número de hongos en la uña, la comparación múltiple se realizó
basada en el método de Tukey para analizar la diferencia
significativa entre grupos. Esos resultados se muestran en la
Figura 3 y de ellos se hizo la Tabla 3. En la Figura 3, se
representó gráficamente el número de CFU en uñas de cada grupo
tratado y el número medio de CFU se mostró por línea horizontal y
valor numérico.
Usando la suspensión mencionada anteriormente se
determinó una separación suficiente del fármaco restante por el
presente método de evaluación de la misma manera que en el Ejemplo
2.
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo de
Referencia)
Se extirparon piezas de piel de patas
posteriores de cada animal descrito en el Ejemplo 4. Se realizó una
separación del fármaco y una determinación del fármaco permaneciente
de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que la diálisis
para separar el fármaco se realizó durante 3 días y que el agua de
diálisis se cambió seis veces en total. Se confirmó la suficiente
separación del fármaco permaneciente.
Después se evaluó el efecto farmacológico de la
misma manera que en el Ejemplo 4 (límite de detección: 20
CFU/patas). Esos resultados se muestran en la Figura 4 y de ellos se
hizo la Tabla 4. En la Figura 4 se representó gráficamente el
número de CFU en la piel de cada grupo tratado y el número medio de
CFU se mostró por línea horizontal y valor numérico.
Como se muestra en la Figura 3 y Tabla 3, no se
observó pata alguna con uña de hongo-negativo en
todos los grupos tratados con sustancia probada durante 30 días.
Pero KP-103 redujo significativamente el número de
células fúngicas en la uña en comparación con el vehículo para uso
tópico. Su efecto terapéutico fue significativamente superior a la
preparación oral de terbinafina. Por otra parte, no se vio efecto
fungicida significativo en amorolfina y terbinafina (para uso
externo, uso oral) en comparación con el vehículo. No se vio el
efecto terapéutico del mismo. Como se ha mencionado anteriormente,
se sugirió que KP-103 mostraba el efecto terapéutico
en tiña ungueal por aplicación tópica y que KP-103
pudo curar tiña ungueal más precozmente que la preparación oral de
terbinafina.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Figura 4 y Tabla 4, se vio
excelente efecto terapéutico sobre tiña del pie en todos los
fármacos, KP-103, terbinafina y amorolfina en uno u
otro caso cuando se evaluó por la proporción de
hongo-negativo o por el número de células fúngicas
en la piel. Por otra parte, resultó evidente que
KP-103 mostró el efecto fungicida excelente sobre
tiña ungueal, aunque la terbinafina y amorolfina no mostraron el
efecto terapéutico sobre tiña ungueal como se muestra en la Figura 3
y Tabla 3.
Como se ha mencionado anteriormente, fármacos
desarrollados recientemente que tienen una actividad extremadamente
potente frente a Trichophyton in vitro tal como lanoconazol
ocasionan la valoración de hongo-negativo de
acuerdo con el método convencional independientemente de la
existencia del hongo no tratado en la piel, puesto que el fármaco
permaneciente en la piel tratada inhibe un crecimiento del hongo en
la piel.
Por el contrario, de acuerdo con el presente
método, se puede evaluar con exactitud un efecto de un agente
antimicrobiano puesto que un fármaco permaneciente se puede separar
dializando el sitio infectado con un microorganismo de animal o
biomuestra, tal como la piel tratada, usando una membrana de
diálisis. Además, aunque es difícil comparar cuantitativamente un
efecto antimicrobiano tal como un efecto antifúngico en el método
convencional, el presente método de evaluación permite que los
efectos antimicrobianos se comparen cuantitativamente, puesto que
el número de hongos viables en el sitio infectado de un animal o una
biomuestra tal como piel se puede determinar con precisión. Además,
el efecto terapéutico basado en el presente método de evaluación
refleja un resultado en cuanto a recaída en el método convencional,
y por tanto se puede valorar un efecto para impedir recaída
evaluando con más anterioridad después del tratamiento de acuerdo
con el presente método de evaluación. Por tanto, en el presente
método de evaluación se puede evaluar un efecto real de un agente
antimicrobiano y es posible seleccionar un agente antimicrobiano
que tiene un efecto esterilizador excelente frente a hongos in
vivo o un agente antimicrobiano de tipo de curación completa que
no ocasiona recaída. Como se ha mencionado anteriormente, el
presente método de evaluación es muy útil como un método para
evaluar el agente antimicrobiano.
Además, es la primera vez que en onicomicosis es
posible evaluar, por el presente método de evaluación, un efecto
terapéutico frente a onicomicosis en un modelo de tiña ungueal.
Como resultado de la evaluación del efecto
terapéutico frente a onicomicosis de acuerdo con el presente método
de evaluación, resulta evidente que KP-103 muestra
el efecto terapéutico excelente frente a onicomicosis con una
aplicación simple por la que el efecto no es visible usando el
agente antifúngico tópico convencional. Por tanto,
KP-103 es un agente beneficioso para tratar
onicomicosis industrialmente.
Claims (4)
1. Un agente terapéutico para usar en el
tratamiento de onicomicosis que comprende un compuesto agente
antifúngico que tiene un grupo representado por la fórmula (I):
en
donde
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son
átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C_{1}-C_{6}),
un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3
sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo
trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}), grupo alquenilo
(C_{2}-C_{8}), grupo alquinilo
(C_{2}-C_{6}), o grupo arilalquilo
(C_{7}-C_{12}),
m es 2 ó 3,
n es 1 ó 2,
o una sal del mismo como un ingrediente
activo,
en donde el agente terapéutico se ha de
administrar tópicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso de un compuesto agente antifúngico como
se define en la reivindicación 1 o una sal del mismo para la
preparación de un agente terapéutico para el tratamiento de
onicomicosis, en donde el agente terapéutico se ha de administrar
tópicamente.
3. El agente terapéutico de la reivindicación 1
o uso de la reivindicación 2, en el que el compuesto es el compuesto
representado por la fórmula (II):
en
donde
Ar es un grupo fenilo no sustituido o un grupo
fenilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo
de halógeno y grupo trifluorometilo,
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son
átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C_{1}-C_{6}),
un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3
sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo
trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}), grupo alquenilo
(C_{2}-C_{8}), grupo alquinilo
(C_{2}-C_{6}), o grupo aralquilo
(C_{7}-C_{12}),
m es 2 ó 3,
n es 1 ó 2,
X es átomo de nitrógeno o CH, y
*1 y *2 significan un átomo de carbono
asimétrico.
\vskip1.000000\baselineskip
4. El agente terapéutico o uso de la
reivindicación 3, en el que el compuesto representado por la fórmula
(II) es
(2R,3R)-2-(2,4-difluorofenil)-3-(4-metilenpiperidin-1-il)-1-(1H-1,2,4-triazol-1-il)butan-2-ol.
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