JP3404152B2 - 抗真菌剤の評価法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、抗真菌剤の評価法に関
し、更に詳しくは、皮膚内の真菌数を正確に定量するこ
とによる正確な抗真菌剤の評価法に関する。 【０００２】 【従来の技術】本邦に於ける表在性真菌症患者は１２０
０から１８００万人と試算されている。患者が多い原因
は生活環境、生活形態、生活習慣に起因すると考えられ
る真菌の伝播力の強さと、繰り返し感染蔓延する根治の
困難さ等が考えられる。これは、有効な薬剤の開発が遅
々としているためであり、その原因はかかる真菌の生育
が皮膚内であるため、薬効発現に薬物動態が複雑に絡
み、なおかつ皮膚内に於ける真菌の適切な定量方法がな
かった為である。皮膚内の真菌の定量が正確にできない
ために適切な薬物の評価ができなかったのである。 【０００３】従来、皮膚内の真菌の定量は皮膚を採取し
て裁断し、複数の小断片を取り出し、これを培地中に植
え、これより真菌の生えてきた断片の数を計数し、全断
片数で除した値を指標として用いていた。しかしなが
ら、この方法では数値が１を断片数で除した値の倍数に
しかならず、従って不連続であり、更に、少量しか生え
てこない断片も、多量に生えた断片も同じ扱いになって
しまうので、この方法では、皮膚片に於ける真菌の有無
は判定できても、正しい定量はできなかった。したがっ
て、抗真菌剤の評価も偶然性によって揺れることが多
く、たまたま真菌の存在していない部位を採取すると優
れた抗真菌作用を有すると誤認されることも少なくなか
った。更に、実際には既存薬より優れた抗真菌作用を有
している抗真菌剤でも有意差なしと判断されて上市にい
たらなかった可能性があったことも否めない。更に、抗
真菌剤の各種のイン・ビトロの評価法も考案されている
が、強固な生体の防護壁である、皮膚内に生息する真菌
に対する抗真菌作用の評価方法としてイン・ビトロの評
価法が適していないことは言うまでもない。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は的確
な抗真菌剤の評価が行える評価法を提供することを目的
とする。 【０００５】 【課題を解決するための手段】上記実状を踏まえ、本発
明者らは的確な抗真菌作用の評価は的確な皮膚内の真菌
の定量に依存すると考え、かかる手段を求め鋭意研究を
重ねた結果、皮膚中に存在する真菌数と真菌を有する皮
膚を培地中で培養して得られたコロニーの大きさの間に
極めて良好な相関関係があることを見いだして発明を完
成させた。 【０００６】すなわち、本発明は、（ａ）ヒトを除く動
物の皮膚に表在性真菌症病原菌を移植した後、被検体を
投与し、しかる後に皮膚より採取した小断片を培養し、
当該培地上に生育したコロニーの大きさを測定し、また
（ｂ）分生子の数によって菌数をコントロールした表在
性真菌症病原菌を（ａ）と同一条件で培養し、生育した
コロニーの大きさを測定して、分生子の数とコロニーの
大きさとの相関性を示す検量線を作成し、（ａ）のコロ
ニーの大きさを（ｂ）の検量線と対比することを特徴と
する抗真菌剤の評価法を提供するものである。 【０００７】本発明において、抗真菌剤という語は、
１）抗真菌作用を有する化合物、２）１）の化合物を含
む組成物の両者を意味し、組成物には人為的な組成物で
ある剤形と天然抽出物などの人為的でない組成物とが含
まれる。 【０００８】ここで、本発明の抗真菌作用の評価法の対
象となる真菌は、表在性真菌症原因菌であるが、これを
具体的に例示するならば、トリコフィトン属（Trichoph
yton）、ミクロスポーラム属（Microsporum）、エピデ
ルモフィトン属（Epidermophyton）等の不完全糸状菌や
キャンディダ属（Candida）、マラセチア属（Malassezi
a）の不完全酵母、及びこれらの変異株が挙げられる。
この様な変異株としては、自然に薬物に対して耐性を獲
得した耐性株、栄養依存性を有するようになった栄養依
存性変異株、遺伝子導入などを行い人為的に変異させた
人工変異株等が例示できる。 【０００９】本発明方法に用いられる動物としては、哺
乳類、例えばラット、モルモット、ウサギ、マウス、ブ
タ等が挙げられる。これらの動物の皮膚への真菌の移植
方法としては、真菌を皮膚上に塗布する方法、真皮を露
出させて当該真皮上に塗布する方法、クローズドパッチ
法、皮内注射法等が挙げられるが、再現性の点よりクロ
ーズドパッチ法が好ましい。 【００１０】被検体の投与は、被検体の種類によって異
なり、経皮投与、経口投与、静脈内投与等が挙げられる
が、経皮投与が好ましい。 【００１１】本発明方法は、真菌の移植後に被検体の投
与をして、抗真菌剤の治療効果を評価する。 【００１２】皮膚より小断片を採取するには、必要に応
じて除毛した後、適当な大きさの皮膚を切り出した後１
断片あたり１×１〜２０×２０mmに切断すればよい。こ
の小断片は、真菌以外の細菌を除去する目的で塩化ベン
ザルコニウム、ヒビテングルコネート等の殺菌剤溶液で
洗浄するのが好ましい。 【００１３】得られた小断片の培養に用いる培地として
は、通常培養や菌分離等に用いているものであれば特に
限定はなく、例えば、サブロー培地、改変サブロー培
地、ツァペック寒天培地等が例示できる。 【００１４】培養は、１０〜４０℃、好ましくは２０〜
４０℃でコロニーが生育するのに充分な時間、例えば１
〜２０日間静置培養すればよい。 【００１５】培養後、培地上に生育したコロニーの大き
さを測定する。コロニーの大きさの測定は、長径（ｌ）
及び短径（ｓ）を計測し、その積（ｌ×ｓ）を求めて、
コントロールと対比するのが簡便で好ましい。 【００１６】真菌数の定量は、コロニーの大きさを、別
個に作成された検量線と対比して行う。この検量線はコ
ロニーの大きさと真菌数との間の相関性を示す検量線で
あり、例えば所定の菌数の真菌を前記と同一の条件で培
養し、生育したコロニーの大きさを測定することによっ
て作成する。ここで菌数の計測は、菌体と分生子を分離
し、血球計数板等で分生子を計数する方法で、これを菌
数のコントロールとする。この方法によれば、極めて簡
易に再現性良く菌数のコントロールを作ることができ
る。ここで用いるコントロール真菌は、標準株でも臨床
分離株でも良い。 【００１７】また、皮膚からの小断片の採取を経時的に
２度以上行い、それぞれの皮膚内の真菌数を定量すれ
ば、作用の持続性等の抗真菌剤投与後の動態特性を評価
することができる。更に、本発明において被検体とし
て、組成物を用いた場合には、その組成物としての評価
（例えば、基剤の評価、剤形の評価など）ができる。 【００１８】 【実施例】以下に実施例を挙げて更に詳しく本発明につ
いて説明するが、本発明がこれら実施例に何等限定され
ないことは言うまでもない。 【００１９】実施例１ 皮膚内真菌の測定例 （１）コントロール系列の作成 トリコフィトンＴＩＭＭ１１８９株（Trichophyton men
tagrophytes TIMM1189）を改変サブロー寒天スラントに
接種し、２７℃で２１日培養した。培養後、スラントに
滅菌した燐酸緩衝液（０．１重量％の界面活性剤（ツィ
ーン８０）を含む）を加え、スラント表面を白金耳で擦
り取った。次に菌液は滅菌ガーゼを通し菌糸を除き分生
子を得た。分生子は血球計算盤でカウントし２×１０⁷
ｃｆｕ／mlに調製した。この後、同じ燐酸緩衝液を用い
て菌液の１０倍希釈液列を作成した。（分生子希釈液は
サブロー寒天シャーレに１００μｌづつ播種し２７℃で
培養し、３日目、５日目、７日目にそれぞれ生菌数を算
定した。）この操作と平行してサブロー寒天平板を作成
した。本サブロー寒天にはシクロヘキシミド１００μｇ
／ml、シソマイシン５０μｇ／ml、クロラムフェニコー
ル１００μｇ／mlを溶かし込んで作成した。これら抗生
物質は細菌の生育をさせない一方、真菌の生育には支障
の無い条件で設定したが、これら以外の抗生物質の組合
せでサブロー寒天平板を作成しても構わない。次に、サ
ブロー寒天に滅菌したスパーテル等で幅２mm, 長さ１０
mmのミゾを彫った（彫った溝の寒天は平板から除い
た）。この溝に分生子希釈列液をそれぞれ１０μｌ入
れ、２７℃で５日間培養し生育コロニーを測定し長径
（ｌ）と短径（ｓ）をノギスで計測した。これらｌとｓ
を掛け合わせた値Ａ値を片対数グラフの正数座標に、そ
の溝に播種した生菌数を対数座標にプロットした。この
作業について、４回接種菌数を変え繰り返した。このう
ち２回は同一接種菌数で行った。これらの結果を図１〜
３に示す。これらは何れも直線上にプロットされてお
り、非常に相関性が良いことが明白である。更に再現性
も良好であることが分かる。 【００２０】（２）モルモット皮膚内の真菌数の定量 ハートレー系５週令雌モルモットの背部左右２カ所を電
気バリカンで徐毛後、ガムテープを用いストリッピング
して真皮を露出させた。次に、トリコフィトンＴＩＭＭ
１１８９株（Trichophyton mentagrophytes TIMM1189）
由来分生子を１×１０⁶ｃｆｕモルモット背部皮膚露出
部分（直径２cmの円形状）に接種した。菌接種１３日目
及び２０日目にモルモットを屠殺し患部皮膚を直径２cm
の円形状に切取り、１％殺菌剤で洗浄後、滅菌水ですす
ぎ表面の雑菌を除き、摘出皮膚はハサミで１０等分し
た。この皮膚切片は上の項で述べた別のサブロー寒天平
板に埋め込み２７℃で培養した。培養５日目にモルモッ
ト５匹左右１０カ所の菌生育域を上項で述べた方法で、
全ての切片につきＡ値を算出した。これを１部位毎１０
切片平均値を算出後、他の部位との平均値（Ａｖｇ±Ｓ
Ｄ）を求めた。モルモットに菌接種１３日の菌生育域は
１切片あたり平均１．７６４±０．２３１、２０日のそ
れは０．８４６±０．７６３であった。同時に培養した
コントロールとのＡ値の比較より、１切片当たりの菌数
は４５０ｃｆｕと算出された。 【００２１】実施例２ ケラチンの影響の確認 皮膚内の真菌の定量を行うに当たって考慮すべきこと
は、皮膚の構成蛋白であるケラチンが菌の定量に悪影響
を与えるか否かである。そこで、実施例１の（１）の作
業について、ケラチンのあり、なしでの相関性を検討し
た。結果を表１に示す。これより、本発明の定量法はケ
ラチンの有無に関わらず、植えた分生子の数と生成した
コロニーの大きさの間に極めて良い相関関係を有してい
る。従って、本発明の定量法は皮膚構成蛋白に影響され
ることなく皮膚内の真菌を定量できることが分かる。 【００２２】 【表１】 【００２３】実施例３ 剤形による抗真菌作用の違いの評価 上記の手法に則り、抗真菌作用の知られている化合物で
ある、ビフォナゾールの剤形による抗真菌作用の違いの
評価を行った。用いた２つの剤形は親水軟膏をベヒクル
としたものとエタノール溶液をベヒクルにしたものであ
った。薬物投与は感染５日後から１週間０．３ｇ／日投
与した。治療後２日に屠殺し皮膚を取り出した。動物実
験での従来法、即ち、コロニーを生じた皮膚片の出現率
を見る方法では、表２に示した結果の如く、剤形による
効果の差はもとより、抗真菌剤の抗真菌作用すら見いだ
せなかった。一方、本発明の評価方法によれば、剤形の
差による抗真菌作用は表３に示すが如く、親水軟膏ベー
スの剤形の方が優れている事が明らかに判る。更に、ビ
フォナゾールの抗真菌作用もｉｎ ｖｉｖｏで明確に確
認できる。従って、本発明の評価方法が実状を良く反映
し、的確に評価できる事が明らかである。 【００２４】 【表２】【００２５】 【表３】 【００２６】実施例４ 分画中の抗真菌成分のスクリーニング例 抗真菌作用があることで知られている微生物代謝物の分
画Ａ（ブタノール分画）と分画Ｂ（水分画）について抗
真菌作用を調べた。分画Ａは４％濃度で、分画Ｂは２％
と４％の濃度で実施例３と同様の処置をした。本評価方
法による結果を表４に示す。抗真菌作用を有する物質は
Ａ分画に多く含有されている事が如実に判る。尚、従来
の評価方法では何れも１００％の菌陽性率を示し、分画
方法をの是非や抗真菌物質の存在を知る事が出来なかっ
た。これより、本発明の評価方法が優れている事が明白
である。 【００２７】 【表４】 【００２８】 【発明の効果】本発明の評価法によれば、抗真菌作用の
定量的比較、貯留性の比較が可能なので、抗真菌剤の開
発に大変有益である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70 G01N 33/15 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴ（ＪＯＩＳ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 （ａ）ヒトを除く動物の皮膚に表在性真
   菌症病原菌を移植した後、被検体を投与し、しかる後に
   皮膚より採取した小断片を培養し、当該培地上に生育し
   たコロニーの大きさを測定し、また（ｂ）分生子の数に
   よって菌数をコントロールした表在性真菌症病原菌を
   （ａ）と同一条件で培養し、生育したコロニーの大きさ
   を測定して、分生子の数とコロニーの大きさとの相関性
   を示す検量線を作成し、（ａ）のコロニーの大きさを
   （ｂ）の検量線と対比することを特徴とする抗真菌剤の
   評価法。