WO2009081976A1 - 微生物感染症の動物感染モデル - Google Patents

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WO2009081976A1
WO2009081976A1 PCT/JP2008/073563 JP2008073563W WO2009081976A1 WO 2009081976 A1 WO2009081976 A1 WO 2009081976A1 JP 2008073563 W JP2008073563 W JP 2008073563W WO 2009081976 A1 WO2009081976 A1 WO 2009081976A1
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infection model
nail
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Nobuo Kubota
Tsuyoshi Shimamura
Saori Nagasaka
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Pola Pharma Inc.
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    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases

Definitions

  • the present invention relates to an animal infection model of microbial infection and a method for evaluating an infectious disease therapeutic drug using the animal infection model.
  • onychomycosis caused by superficial fungi. This is a mycosis caused by the growth of nails by fungi that usually cause mycosis on the skin, such as Trichophyton mentagrophytes.
  • the nail is a hard tissue composed of keratin, the antifungal agent or composition containing the antifungal agent used in dermatomycosis is absorbed into the nail.
  • the nail has no immune cells that block the bloodstream and resist infection.
  • the present invention is useful for preparing an animal infection model of a microbial infection of a tissue that is difficult to infect such as a nail, and for developing a therapeutic agent for an intractable infection such as onychomycosis using the animal infection model.
  • the purpose is to provide an evaluation method.
  • the inventors of the present invention have been diligently researching an animal model for evaluating the clinical effect of an antifungal agent. Surprisingly, by inoculating difficult tissues, it was surprisingly found that an animal infection model with good reproducibility and reflecting clinical pathology could be created in a short period of time. As a result of further research, the present invention was completed. It came.
  • the present invention is an animal infection model of microbial infection, which is obtained by inoculating and infecting a tissue that is difficult to infect an infectious disease-causing microorganism after the immunity of the animal is reduced by means of immunity reduction.
  • the infection model relates to an animal infection model in which the tissue that is difficult to infect is a nail.
  • the present invention relates to an animal infection model in which the infectious disease is onychomycosis and the infectious disease-causing microorganism is a superficial fungus.
  • the superficial fungus is Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton violaceum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton verrucosum ⁇ Trichophyton tonsurans, Microsprum canis, Microsprum gypseum, Epidermophyton floccosum, Hortaea wasneckii, Alternaria Alternate alternate , Aspergillus fumigatys, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Paecilomyces lilacin us), Fusarium solani, Scopulariopsis brevicaulis, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida parapsilosis, Candida parapsilosis, Candida parapsilosis
  • the present invention relates to an animal infection
  • the present invention relates to an animal infection model, wherein the superficial fungus is Trichophyton mentagrophytes.
  • the present invention also relates to an animal infection model, wherein the animal is one or more selected from rabbits, guinea pigs, rats, dogs and monkeys.
  • the present invention relates to an animal infection model in which the means for lowering immunity is administration of an immunosuppressant.
  • the present invention also relates to an animal infection model obtained by reducing the body weight of an animal by 1 to 30% by administration of the immunosuppressant and then inoculating and infecting an infectious disease-causing microorganism into a tissue that is difficult to infect.
  • the present invention relates to an animal infection model, wherein the immunosuppressive agent is one or more selected from methylprednisolone acetate, cyclosporine and tacrolimus.
  • the present invention also relates to an animal infection model, wherein the immunosuppressive agent is methylprednisolone acetate.
  • the present invention relates to an animal infection model, wherein the dose of methylprednisolone acetate is 0.1 to 100 mg / kg.
  • the present invention also relates to an animal infection model in which immunity is reduced within 16 weeks from the start of administration of the immunosuppressant.
  • the present invention relates to an animal infection model in which immunity is reduced within 6 weeks from the start of administration of the immunosuppressive agent.
  • the inoculation method of the infectious disease-causing microorganism is a method in which a bacterial solution containing the microorganism is applied to an animal nail and / or skin around the nail, and the infection method covers the application site and the microorganism. Relates to an animal infection model by moistening with water to facilitate growth. Furthermore, the present invention relates to an animal infection model in which the nail is infected with the superficial fungus within 16 weeks after the bacterial solution containing the superficial fungus is applied to the nail. The present invention also relates to an animal infection model in which the nail is infected with the superficial fungus within 6 weeks after the bacterial solution containing the superficial fungus is applied to the nail. Furthermore, the present invention relates to a method for evaluating a therapeutic agent for onychomycosis using the animal infection model.
  • the present invention it has become possible for the first time to produce an animal infection model of a microbial infection of a tissue which is difficult to infect such as a nail, which has good reproducibility and reflects clinical pathological conditions. It is said that tissues composed of hard keratin such as nails, which are difficult to infect, take a very long time to establish infection and are blocked from the bloodstream in the first place, and immune cells do not exist. For this reason, the fact that a decrease in immunity in vivo directly affects the microbial infection of such tissues cannot be predicted at all.
  • the animal infection model of the present invention can provide an evaluation method useful for the development of therapeutic agents for intractable infections such as onychomycosis.
  • the infectious tissue of the animal infection model of the present invention includes keratins composed of keratin such as animal hands or toenails and body surface hair, thick stratum corneum of skin, gastric mucosa exposed to strong acid, and cornea Are typically horny organs such as nails and hair that are hard and poor in nutrients, especially nails made of hard keratin.
  • Microbial infections include refractory foot tinea, onychomycosis and head tinea, gastric ulcers due to highly recurrent Helicobacter pylori, and fungal keratitis.
  • Exemplified ringworm and scalp tinea are particularly refractory onychomycosis.
  • animals that can be applied with microorganisms such as superficial fungi are used as target non-infectious tissues, preferably rodents such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits
  • rodents such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits
  • Canine animals such as primates and dogs, feline animals such as cats, livestock such as sheep, goats and cows, primates such as green monkeys, cynomolgus monkeys, and primates (excluding humans)
  • mouse, rat, guinea pig, rabbit, dog, monkey and the like are more preferable.
  • guinea pigs and rabbits are more preferable, and as a model for nail and tinea pedis, rabbits are particularly preferable because of large infection sites.
  • sex in such an animal it can be used regardless of sex. This is because there is no gender difference in the nail and the fungal infection in the nail.
  • Examples of immunity lowering means for lowering animal immunity preferably include administration of immunosuppressants, local restriction of blood flow, restriction of nutrient intake, irradiation of radiation, infection of viruses causing immunodeficiency, etc. From the viewpoint of adjusting the decrease and the ease of operation, more preferred examples include administration of an immunosuppressive agent and local restriction of blood flow, and particularly preferred is administration of an immunosuppressive agent.
  • the degree of decrease after a transient increase in body weight after administration of an immunosuppressant for example, the degree of decrease after a transient increase in body weight after administration of an immunosuppressant, change in the number of various blood cell components such as lymphoid cells, change in the CD4 / CD8 ratio, immune mechanism Changes in the amount of various cytokines involved, but from the viewpoint of reproducibility and indices independent of animal species, more preferably, the degree of decrease after a transient increase in body weight after administration of an immunosuppressant Etc. are exemplified.
  • the mechanism of change in body weight after administration of immunosuppressants is complex and not always clear, but it is a phenomenon that is observed in many animals regardless of species, and is an indirect indicator of the pharmacological effects of immunosuppressants. Can be used.
  • the degree of decrease after a transient increase in body weight after administration of an immunosuppressive agent is preferably in the range of 1-30% reduction from the body weight before administration, and sufficient immunity reduction and prevention of excessive weakness of animals Is more preferably 3 to 30%, further preferably 5 to 30%, particularly preferably 5 to 20%, the degree of immunity reduction is suitable for inoculation with infectious microorganisms. To be judged.
  • the degree of decrease after a temporary increase in the average body weight of the plurality of individuals may be used as an index for determining immunity reduction.
  • immunosuppressive agents examples include immunosuppressive agents such as cyclosporine, tacrolimus, and ISP-1 used for the purpose of suppressing immunological rejection in organ transplantation, or steroids such as methylprednisolone having immunosuppressive action as a side effect. Etc. are preferably used. These are all commercially available products and can be purchased and used. More preferably, steroids such as cyclosporine, tacrolimus, and methylprednisolone acetate are exemplified, and methylprednisolone acetate is particularly preferable among steroids. Commercially available Depot Melcoat (Fuji Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • immunosuppressive agents such as cyclosporine, tacrolimus, and ISP-1 used for the purpose of suppressing immunological rejection in organ transplantation
  • steroids such as methylprednisolone having immunosuppressive action as a side effect.
  • Etc. are preferably used. These are all commercially available products and can be purchased and used
  • the dose of the immunosuppressive agent to the animal should be determined from the viewpoint of preventing sufficient immune decline and excessive weakness of the animal. It is necessary to adjust and set appropriately while observing the influence.
  • the dose of methylprednisolone acetate is preferably in the range of 0.1 to 100 mg / kg, more preferably 1 to 10 mg / kg in view of the degree of immunity reduction and the burden on animals. Preferably, it is 2 to 5 mg / kg.
  • the dose of cyclosporine per dose is preferably in the range of 0.1 to 50 mg / kg, more preferably 1 to 25 mg / kg, more preferably considering the degree of immunity reduction and the burden on animals. 2 to 10 mg / kg.
  • the dose of tacrolimus per dose is preferably in the range of 0.001 to 10 mg / kg, more preferably 0.005 to 5 mg / kg, taking into account the degree of immunity reduction and the burden on animals. Preferably, it is 0.01 to 3 mg / kg.
  • the number of immunosuppressant administrations, administration interval, and administration period should also be adequately reduced from the viewpoint of preventing sufficient immunity decline and excessive animal weakness. It is necessary to adjust and set as appropriate while observing the effects on animals.
  • the administration frequency may be single administration or repeated administration, but in consideration of the degree of immunity reduction and the burden on the animal, it is more preferably 2 or more administrations.
  • the administration interval is preferably once every 2 to 21 days, and more preferably once every 7 to 14 days in consideration of the burden on the animal and the evaluation period.
  • the administration period from the start of administration to the reduction of immunity is preferably within 16 weeks, and more preferably within 6 weeks considering the burden on animals and the evaluation period.
  • the administration method is preferably exemplified by oral administration, intravenous administration, transdermal administration, intramuscular and subcutaneous administration, etc. From the certainty of administration, intramuscular injection and transdermal administration are more preferred.
  • methylprednisolone acetate is administered by administering a single dose of 2 to 4 mg / kg once or every 2 to 6 times at an administration interval of 7 to 14 days.
  • the administration of cyclosporine is preferably exemplified by administering a single dose of 2 to 10 mg / kg once or every 2 to 6 times at an administration interval of 1 to 14 days.
  • tacrolimus is preferably exemplified by administration of a single dose of 0.01 to 3 mg / kg once or every 2 to 6 times at an administration interval of 1 to 14 days.
  • methylprednisolone acetate when administered at 2 to 24 mg / kg, and the degree of decrease after a transient increase in body weight is 5 to 20% less than the weight before administration, It is judged to be suitable for inoculation with infectious disease microorganisms.
  • the degree of immunity is reduced by infectious microorganisms. It is judged that it is suitable for inoculation.
  • tacrolimus when administered at 0.01 to 18 mg / kg, and the degree of decrease after a transient increase in body weight is 5 to 20% less than the weight before administration, the degree of immunity is reduced by infection. It is judged that it is suitable for inoculation of microorganisms.
  • the infectious disease-causing microorganism to be inoculated and infected by an animal is preferably a disease-causing microorganism having a low therapeutic effect of the drug after infection.
  • infectious disease-causing microorganisms are superficial fungi, deep fungi and Helicobacter pylori, and superficial fungi are preferable when assuming tissues such as skin, nails and hair.
  • Superficial fungi include Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton violaceum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton lances (Trichophyton tonsurans), Microsprum canis, Microsprum gypseum, Epidermophyton floccosum, Hortaea wasneckii, Hortaea wasneckii, Altenate alternate Alternate alternate -Aspergillus fumigatys, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Paecilomyces relassinus ( Paecilomyces lilacinus, Fusarium solani, Scopulariopsis brevicaulis, Candida albicans, Candida tropicala, Candida silica parasis (Candida glabrata), Cryptococcus neoformans and Trichosporon asahii are preferably exemplified, and
  • infectious disease-causing microorganisms to be infected examples include hyphae, spores, germinated conidia, segmental conidia and small conidia, and fungal bodies and spores. In the case of fungi, local infectivity In view of the above, germinated conidia, segmental conidia and small conidia are preferable, and from the viewpoint of conidia collection, count of bacteria and ease of inoculation, segmental conidia and small conidia are more preferable.
  • the bacterial species to be infected is previously cultured in a normal agar medium, scraped with a platinum loop, and the bacterial cells themselves or a part of the bacterial cells such as conidia are taken out and added to physiological saline.
  • a bacterial solution is prepared so as to be 10 7 to 1 ⁇ 10 9 conidia / mL, and preferably a nonionic surfactant such as Triton X or Tween 80 is used in order to increase the dispersibility of the cells or a part thereof.
  • This bacterial solution is administered at 10 to 1000 ⁇ L of the infected site to animals with reduced immunity as described above.
  • 100 to 500 ⁇ L can be preferably exemplified.
  • Examples of the method for inoculating the bacterial solution include application to the surface and subcutaneous injection, but direct application to the tissue surface is preferable from the viewpoint of reliable inoculation to the target tissue and ease of operation.
  • it is also effective to apply the bacterial solution to the surrounding tissue of the target tissue in order to reliably establish infection in a short period of time.
  • Fungi enter well not only from the back side but also from the side of the nail, etc., and can sufficiently infect the nail bed in a short period of time.
  • the infectious period in which the target tissue is inoculated with the infectious disease-causing microorganism is typically 1 to 16 weeks, but an infectious period of 2 to 6 weeks is preferable in consideration of the burden on the animal and the evaluation period.
  • Such infection can be performed in an open system, but it is useful to perform the infection in a sealed state in order to prevent microbial contamination and improve the homogeneity of the infection.
  • a sealing method for example, a commercially available patch bandage or bandage can be used. Further, instead of the patch bandage, it is possible to block and infect by using a finger sack or the like.
  • the bacteria may be allowed to grow in the tissue in an open state except for a finger sack or the like, and then left unattended.
  • the standing period is preferably 1 to 8 weeks, but 2 to 6 weeks is more preferable in consideration of the burden on animals and the evaluation period.
  • the end point is determined while observing the state change of the infected site due to infection.
  • As an indicator of the end of infection it is used that the bacteria are uniformly distributed in the infected site and show different properties from the uninfected site.
  • onychomycosis it can be determined that the infection has ended when yellowish cloudiness of the nail has spread to the entire nail.
  • the degree of infection can be applied to other intractable infections such as planting Helicobacter pylori in the stomach of animals.
  • the distal subungual type (type that infects from the tip of the nail), the proximal subungual type (nail epithelium (cuticle)) Type that infects from the side), superficial type (type that infects the shallow part of the nail plate), full-layer type (type that infects the entire area of the nail), and the like.
  • the animal infection model of the present invention preferably reflects more clinical pathology. For example, in the point that it is a model similar to the classification of onychomycosis in the clinic, the upper half of the nail is deep in the nail depth direction. It is preferable that more fungi are infected on the lower nail bed side than on the back side.
  • the nail tip side, the middle nail part, and the nail mother side of the nail are all.
  • those infected with fungi are preferred.
  • those in which many fungi are distributed in a specific part such as the nail tip side or the nail mother side are preferable because they may reflect clinical pathology.
  • an infection model in which fungus sufficiently infiltrates to the nail bed side of the deep part of the nail and the entire nail is infected, or more fungi are infected at a specific site such as the tip side or the nail mother side
  • an animal infection model of onychomycosis that reflects clinical conditions such as full-thickness type, distal subnail type, and proximal subnail type.
  • the animal infection model of the present invention produced by such a procedure approximates the symptoms of intractable infections in humans, and a test substance is administered to such animal infection model so that the infected site approaches a normal site.
  • a test substance is administered to such animal infection model so that the infected site approaches a normal site.
  • the antifungal action and the like of the test substance against onychomycosis can be discriminated, which is extremely useful as an evaluation method for a therapeutic agent for onychomycosis. That is, when the test substance is administered to the animal infection model of the present invention and when it is not administered, the case of administration shows a return to the normal state, and when the case of non-administration does not show the return to normal, It can be determined that the substance has efficacy against onychomycosis.
  • test substance when two kinds of test substances are tested in the same manner and one of them has a high probability of returning to the normal state, the test substance has a superior antifungal therapeutic effect against onychomycosis. Can be determined. Moreover, the concentration dependence of the antifungal effect of the test substance can also be determined by changing the dose of the test substance and observing the reactivity thereto.
  • a part of the treatment site is collected, seeded in a culture medium, etc., and if the degree of growth is marked, the effect of the test substance is low and the degree of growth is low. If it is low, it can be determined that the effect of the test substance is high.
  • the degree of growth is determined by changing the number of conidia to be seeded separately, measuring the colony area obtained as a result of culture, and preparing a calibration curve of the number of conidia-colony area in advance from this data, Using this calibration curve, the number of surviving bacteria remaining in a part of the treated site was estimated as the number of conidia, and the smaller the estimated number of conidia, the more excellent the antifungal effect was determined.
  • the medium used for seeding contains 0.1 to 10% by mass of a phospholipid and 0.1 to 10% by mass of a nonionic surfactant such as “Tween 80” in advance, and the remaining test substance is contained. It is also preferable to inactivate and reduce noise. By such discrimination, it is possible to quantitatively compare the effects of the test substances. Particularly, intractable infections such as onychomycosis rarely completely cure in a short period of time, and thus the estimated number of surviving bacteria is an important evaluation point for the effect. This is because the antifungal effect can be compared even if it is not completely cured.
  • treatment is done in the same manner as the above-mentioned onychomycosis, animal infection models are prepared, and the therapeutic effect of the infection is observed quantitatively by administering the test substance. be able to.
  • Example 1 (Rabbit immunosuppression) A 14-week-old Japanese white varieties (Kbl: JW, Kitayama Labes) was acclimatized for one week. After acclimatization, a continuous methylprednisolone acetate preparation (Depo Melcote Fuji Pharmaceutical Co., Ltd.) as an immunosuppressant was administered to the thigh muscles at a dose of 4 mg / kg for a total of 3 times and once a week. . The body weight of individual rabbits after administration of the immunosuppressant was measured, and it was confirmed that the body weight increased transiently and then decreased due to a decrease in immune capacity after administration.
  • a continuous methylprednisolone acetate preparation (Depo Melcote Fuji Pharmaceutical Co., Ltd.) as an immunosuppressant was administered to the thigh muscles at a dose of 4 mg / kg for a total of 3 times and once a week. .
  • the bacterial solution was inoculated two weeks after the start of administration, in which the average body weight of a total of 15 rabbits was reduced by about 6% from the body weight before administration.
  • the change in the average body weight of a total of 15 rabbits is shown in FIG.
  • Trichophyton mentagrophytes stored at 4 ° C. were added to 1.5 mL of physiological saline in a safety cabinet to prepare a bacterial suspension.
  • 300 ml of water was added to 1.8 g of Sabouraud medium (FLUID SABOURAUD MEDIUM) and 4.5 g of Bacto Agar, and after stirring, sterilized by an autoclave and allowed to stand on a tilting table to prepare a slant medium.
  • the bacterial suspension was added to the medium and cultured at 28 ?. A part of the cultured bacteria was collected and added to 2 to 20 mL of a solution containing 0.05% of Tween 80 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the concentration of the fungus in the conidial solution was measured and adjusted to 1.1 ⁇ 10 8 to 1.3 ⁇ 10 8 conidia / mL.
  • the solution amount of Tween 80 was adjusted and finally used as 1.0 ⁇ 10 8 conidia / mL in the infection experiment.
  • a rabbit infection model was prepared in which the finger sack was removed after 2 weeks of the infection operation and left untreated for 2 or 6 weeks.
  • the groups were group 1, group 2, and group 3, respectively.
  • the stained specimen was evaluated using an optical microscope with an evaluation score of 0 ( ⁇ ) to 3 (++++) based on the evaluation criteria shown in Table 1 below.
  • the evaluation was performed at each of the six locations on the tip side, the middle portion, and the nail mother side in which the upper half nail plate side and the lower half nail bed side in the nail depth direction and the nail were equally divided into three in the major axis direction. It performed about the site
  • Example 1 For each of the 30 nails (for 6 x 5 animals) of the rabbit infection model of the first group to the third group, infection was confirmed in the above-mentioned 6 sites.
  • the infection rate expressed as a percentage of the number of positive infection nails having an infection score of 1 (+) or higher with the number of collected nails (30), and the average of the maximum evaluation scores in each nail It shows in Table 2.
  • Table 3 shows the infection rate by site, which is obtained by dividing the number of positive infection sites having an infection score of 1 (+) or higher by the number of confirmed sites (29 to 30) in percentage. .
  • FIG. 2 shows a photograph taken of the state of the nail of the rabbit before and after the superficial fungal infection of Example 1 Group 2.
  • the circled part in the left figure is not infected and is reddish, but the part circled in the right figure is cloudy and no redness is recognized. This cloudiness indicates fungal infection.
  • FIG. 3 shows a photograph of the specimen stained in the nail bed side middle part of the nail of the rabbit after superficial fungal infection in Example 1 magnified 40 times with an optical microscope.
  • the arrow portion is the nail portion, the portion that is stained purple by PAS staining is the mycelium, and it is shown that the fungus is widely infected in the nail.
  • the circled part is significantly infected.
  • the nail is blocked from the bloodstream and immune cells do not exist, but after immunity is lowered by administering steroids with immunosuppressive action, inoculated with superficial fungi and infected Nail that has been impossible to produce in the past, has a high infection rate and infection intensity, and the fungus has sufficiently infiltrated into the nail bed, which is the deep part of the nail. It was confirmed that a superficial fungal animal infection model can be produced in a short period of time.
  • Example 2 (Rabbit immunosuppression) A 14-week-old Japanese white varieties (Kbl: JW, Kitayama Labes) was acclimatized for one week. After acclimatization, cyclosporine preparation (manufactured by Sandymun Novartis) as an immunosuppressant was administered to the thigh muscles at a dose of 4 mg / kg for 3 times, once a week. The body weight of individual rabbits after administration of the immunosuppressant was measured, and it was confirmed that the body weight increased transiently and then decreased due to a decrease in immune capacity after administration.
  • cyclosporine preparation manufactured by Sandymun Novartis
  • Trichophyton mentagrophytes stored at 4 ° C. were added to 1.5 mL of physiological saline in a safety cabinet to prepare a bacterial suspension.
  • 300 ml of water was added to 1.8 g of Sabouraud medium (FLUID SABOURAUD MEDIUM) and 4.5 g of agar (Bacto Agar). After stirring, the mixture was sterilized by an autoclave and allowed to stand on a tilt table to prepare a slant medium.
  • the bacterial suspension was added to the medium and cultured at 28 ?.
  • the cultured fungus 10 6 conidia / mL was seeded on a membrane filter, placed on a BHI medium and cultured for 7 days in the presence of 10% CO 2 to obtain germinated conidia.
  • sample preparation and evaluation A sample was prepared by the same method as the above-described sliced and stained sample of Example 1, and the sample was evaluated by the same method as the confirmation of infection in Example 1.
  • a rabbit infection model was prepared under the same conditions as in Example 2 except that no cyclosporine preparation was administered as an immunosuppressive agent, and specimens were prepared and evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Table 4 shows the infection rate expressed as a percentage of the number of positively infected nails having an infection score of 1 (+) or higher, and the average of the maximum evaluation scores in each nail.
  • Table 5 shows the infection rate according to the site, in which the value obtained by dividing the number of positive infection sites having an infection score of 1 (+) or higher by the number of sites confirmed is expressed as a percentage.
  • FIGS. 4 and 5 show photographs of the state of the nail of the rabbit after the superficial fungal infection of Comparative Example and Example 2.
  • the whole circled nail is transparent and no fungal infection is observed
  • the middle part of the circled nail is clouded from the tip to the side and the fungus infection is observed.
  • FIG. 6 shows a photograph of a thin sliced sample stained in the middle part of the nail bed side of a rabbit nail after superficial fungal infection of a comparative example, magnified 40 times with an optical microscope.
  • FIG. 6 shows that no fungal infection is observed in the nail.
  • FIG. 7 shows a photograph of a sliced slice of the nail bed side intermediate part of the rabbit nail after infection with superficial fungus of Example 2 magnified 400 times with an optical microscope.
  • the part dyed purple by PAS staining surrounded by a circle is mycelia, and it is shown that the fungus is remarkably infected on the nail bed side (deepest part) of the nail.
  • the nail surface that is reproducible and reflects the clinical pathology with remarkably high infection rate and infection intensity by administering the immunosuppressant compared to the case without administration. It can be seen that the sexual fungal animal infection model can be produced in a short period of 4 weeks after administration of the immunosuppressant. From the results of Table 5 and FIG. 7, in Example 2, superficial fungal infection was observed throughout the nail, and the fungus was sufficiently infiltrated into the nail bed side, which is the deep part of the nail. I understand that.
  • the nail is blocked from the bloodstream and immune cells do not exist, but after injecting a superficial fungus after administering the immunosuppressive agent cyclosporine to reduce immunity,
  • the superficiality of the nail which has been impossible to produce in the past, has a high infection rate and infection intensity, and the fungus has sufficiently infiltrated into the nail bed, which is the deep part of the nail. It was confirmed that a fungal animal infection model can be produced in a short period of time.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in the average body weight of rabbits after administration of the immunosuppressant of Example 1.
  • FIG. It is a photograph figure which shows the state of the nail
  • 6 is a photograph showing the state of the nail of a rabbit after superficial fungal infection of Example 2.
  • FIG. It is a histopathological photograph figure of the nail bed side middle part of the nail
  • FIG. 3 is a histopathological photograph of the nail bed side middle part of the rabbit nail after superficial fungal infection of Example 2.

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Abstract

　本発明は、従来作製が困難であった、爪などの感染しにくい組織の微生物感染症の動物感染モデルの作製を可能とし、および該動物感染モデルを用いた爪白癬などの難治性感染症の治療薬の開発に有用な評価方法を提供する。 　感染症原因微生物が感染しにくい組織の動物感染モデルを作製するため、免疫抑制成分を動物に予め投与し、免疫能を低下せしめた後、感染症原因微生物を接種して感染させることにより、再現性がよくかつ臨床病態を反映した、感染症原因微生物の動物感染モデルを、短期間で作製することができる。

Description

微生物感染症の動物感染モデル
　本発明は、微生物感染症の動物感染モデル、および該動物感染モデルを用いた感染症治療薬の評価方法に関する。
　近年、高齢化が進み、免疫能など生体機能が低下している老人において、感染症の問題が注目されるようになってきている。そのひとつとして、表在性真菌を原因微生物とする爪真菌症が挙げられる。これはトリコフィトン・メンタグロファイテスなどの通常は皮膚に真菌症を起こす真菌が爪で繁殖して起こす真菌症である。このような爪真菌症においては、爪がケラチンで構成される硬い組織であるため、皮膚真菌症で使用される抗真菌剤や抗真菌剤を含有する組成物を、爪の中に吸収させることが困難であり、爪から薬剤を投与し治療することには多くの障害が存する。また、爪は血流から遮断され感染に抗する免疫細胞なども存していないと言われている。
　爪や毛髪などの感染が成立しにくい組織の抗真菌剤の開発に必要な評価は、通常の皮膚の抗真菌剤の評価とは異なっており、その的確な評価法は未だ確立されていないのが現状である。そこで、爪白癬症および頭部白癬症などにおいて、抗真菌剤の活性を精度よく測定できる、インビトロでは再現できないインビボでの抗真菌剤の評価方法が求められていた。たとえば、爪白癬症に対する抗真菌剤の効果を評価する動物感染モデルとして、動物に真菌を感染させる方法はいくつか報告されているものの（非特許文献１～３）、感染までの期間が６０日以上かかるなど非常に長く、再現性よく臨床病態を反映した感染モデルを作製するといった点では十分ではなかった。これは爪の構造と、白癬菌の宿主および寄生場所の選択特性によるものであると考えられていた。また、爪真菌症については前述のようにいくつかの課題があり、評価期間や再現性の問題があるにもかかわらず、課題を解決するための動物感染モデルの検討はほとんど行われていない。
　一方、動物感染モデルの作製方法として、動物の免疫力をステロイドの投与により低下させ、感染しやすい状態にしてから真菌を感染させる方法が報告されているが（非特許文献４）、これは免疫の低下が感染に影響を与えることが明らかな、眼球および眼球周辺の粘膜組織などに感染させた動物感染モデルに限られていた。
　このように、難治性の爪白癬症などに対して、ヒトの臨床病態を反映した動物感染モデルが切望されていたにもかかわらず、動物感染モデルが確立されていなかったために、抗真菌剤の開発も困難であり、特に経口での抗真菌剤の投与が難しい老人などに対して、簡単に使用できる外用真菌剤の開発は十分になされていないのが現状である。
特開２００１－１３３４４９号公報 特開２００２－６５６９５号公報 特開２００１－１３３４４９号公報 Antimicrobial　agents　and　chemotherapy,　46(12),　p.3797-3801　(2002) Microbiol.Immunol.,　47(2),　p143-146　(2003) Mycoses,　48,　p108-113　(2004) Jpn.　J.　Infect　Dis.,　60,　p.33-39　(2007)
　したがって、本発明は、爪などの感染しにくい組織の微生物感染症の動物感染モデルを作製すること、および該動物感染モデルを用いた爪白癬などの難治性感染症の治療薬の開発に有用な評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、抗真菌剤の臨床効果を評価するための動物モデルを求めて鋭意研究を重ねる中で、免疫低下手段により予め動物の免疫能を低下せしめた後、感染症原因微生物を感染しにくい組織に接種することで、驚くべきことに、再現性がよくかつ臨床病態を反映した動物感染モデルを、短期間に作製できることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、微生物感染症の動物感染モデルであって、免疫低下手段により動物の免疫を低下せしめた後、感染症原因微生物を感染しにくい組織に接種して感染させることにより得られる、動物感染モデルに関する。
　また、前記感染しにくい組織が、爪である、動物感染モデルに関する。
　さらに、前記感染症が爪真菌症であり、前記感染症原因微生物が表在性真菌である、動物感染モデルに関する。
　また、前記表在性真菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton　rubrum）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton　violaceum）、トリコフィトン・ベルコスム（Trichophyton　verrucosum）、トリコフィトン・トンスランス（Trichophyton　tonsurans）、ミクロスプラム・カニス（Microsprum　canis）、ミクロスプラム・ジプシウム（Microsprum　gypseum）、エピデルモフィトン・フロコッサム（Epidermophyton　floccosum）、ホルタエア・ベルネッキ（Hortaea　werneckii）、アルテナリア・アルテナーテ（Alternaria　alternate）、アスペルギルス・フミガチス（Aspergillus　fumigatys）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus　flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus　terreus）、パエチロマイセス・リラシヌス（Paecilomyces　lilacinus）、フサリウム・ソラニ（Fusarium　solani）、スコプラリオプシス・ブレビカウリス（Scopulariopsis　brevicaulis）、カンジダ・アルビカンス（Candida　albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida　tropicalis）、カンジダ・パラプシロシス（Candida　parapsilosis）、カンジダ・グラブラータ（Candida　glabrata）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus　neoformans）およびトリコスポロン・アサヒ（Trichosporon　asahii）からなる群より選ばれる1種または２種以上である、動物感染モデルに関する。
　さらに、前記表在性真菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）である、動物感染モデルに関する。
　また、前記動物が、ウサギ、モルモット、ラット、イヌおよびサルから選ばれる1種または２種以上である、動物感染モデルに関する。
　さらに、前記免疫低下手段が、免疫抑制剤の投与である、動物感染モデルに関する。
　また、前記免疫抑制剤の投与により、動物の体重を１～３０％減少せしめた後、感染症原因微生物を感染しにくい組織に接種して感染させることにより得られる、動物感染モデルに関する。
　さらに、前記免疫抑制剤が、酢酸メチルプレドニゾロン、シクロスポリンおよびタクロリムスから選ばれる1種または２種以上である、動物感染モデルに関する。
　また、前記免疫抑制剤が、酢酸メチルプレドニゾロンである、動物感染モデルに関する。
　さらに、前記酢酸メチルプレドニゾロンの投与量が、０．１～１００ｍｇ／ｋｇである、動物感染モデルに関する。
　また、前記免疫抑制剤の投与開始から、１６週間以内に免疫低下させた、動物感染モデルに関する。
　さらに、前記免疫抑制剤の投与開始から、６週間以内に免疫低下させた、動物感染モデルに関する。
　また、前記感染症原因微生物の接種方法が、該微生物を含有する菌液を動物の爪および／または爪周辺の皮膚に塗布するものであり、前記感染方法が、該塗布部位を被い前記微生物が増殖しやすいように水で湿潤させることによる、動物感染モデルに関する。
　さらに、前記表在性真菌を含有する菌液を爪に塗布してから、１６週間以内に表在性真菌を爪に感染させた、動物感染モデルに関する。
　また、前記表在性真菌を含有する菌液を爪に塗布してから、６週間以内に表在性真菌を爪に感染させた、動物感染モデルに関する。
　さらに、前記動物感染モデルを用いる、爪白癬症治療薬の評価方法に関する。
　本発明により、再現性がよくかつ臨床病態を反映した、爪などの感染しにくい組織の微生物感染症の動物感染モデルを、短期間に作製することがはじめて可能となった。
　このことは、感染しにくい組織である爪などのハードケラチンから構成される組織は、感染が成立するのには非常に時間がかかり、そもそも血流から遮断され免疫細胞が存しないといわれていることから、生体内の免疫能低下がそのような組織の微生物感染に直接影響することは到底予測できないことからすると、驚くべき効果という外ない。
　そして本発明の動物感染モデルは、爪白癬などの難治性感染症の治療薬の開発に有用な評価方法を提供することができるものである。
　本発明の動物感染モデルの感染しにくい組織としては、動物の手または足の爪および体表面の毛などのケラチンからなる角質器、皮膚の厚い角質層、強い酸性にさらされる胃粘膜、ならびに角膜などが挙げられるが、典型的には硬くて栄養分が乏しい爪および毛などの角質器であり、とくにハードケラチンからなる爪である。
　また、微生物感染症としては、難治性の足白癬症、爪白癬症および頭部白癬症、再発性の高いヘリコバクタ・ピロリによる胃潰瘍、ならびに真菌性角膜炎などが挙げられるが、典型的には爪白癬症および頭部白癬症が例示され、とくに極めて難治性の爪白癬症である。
　動物感染モデル作製に用いる動物としては、標的である感染しにくい組織に表在性真菌などの微生物を塗布可能な動物が使用され、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなどの齧歯類や犬などのイヌ科の動物、猫などのネコ科の動物、羊、山羊、牛などの家畜類、ミドリザルやカニクイザル、およびヨザル等の霊長類（但し、ヒトは除外する）などの確立された実験動物種が例示され、遺伝的な均質性、入手のしやすさおよび取扱いなどの点から、より好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌおよびサルなどが例示され、使いやすさの点から、さらに好ましくは、モルモット、ウサギが例示され、爪および足白癬症のモデルとしては、感染部位の大きいことからウサギがとくに好ましい。かかる動物における性別としては、雌雄の別なく使用することができる。これは爪や爪における真菌の感染に性差が存しないためである。
　動物の免疫を低下させる免疫低下手段としては、好ましくは、免疫抑制剤の投与、血流の局所的な制限、栄養摂取制限、放射線の照射、免疫不全を起こすウイルスの感染などが例示され、免疫低下の調整および操作の簡便性の点から、より好ましくは、免疫抑制剤の投与および血流の局所的な制限などが例示され、とくに好ましくは、免疫抑制剤の投与である。
　免疫低下の判断の指標としては、たとえば、免疫抑制剤投与後の体重の一過性増加後の減少の度合い、リンパ系細胞などの各種血球成分数の変化、ＣＤ４／ＣＤ８比の変化、免疫機構に関与する各種サイトカイン量の変化などが例示されるが、再現性や動物の種に依存しない指標の点から、より好ましくは、免疫抑制剤投与後の体重の一過性増加後の減少の度合いなどが例示される。免疫抑制剤投与後の体重変化の作用機序は複雑であり必ずしも明らかではないが、種に依存せず多くの動物に認められる現象であり、免疫抑制剤の薬理効果発現の間接的な指標として用いることができる。
　免疫低下の判断は、十分な免疫低下と動物の過度の衰弱を防止する観点から、動物の摂餌行動など免疫低下に伴う動物への影響を観察しながら、慎重に行う必要がある。典型的には、免疫抑制剤投与後の体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から１～３０％減の範囲が好ましく、十分な免疫低下と動物の過度の衰弱防止を考慮すると、より好ましくは３～３０％減、さらに好ましくは５～３０％減、特に好ましくは５～２０％減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
　なお、複数の個体に同一の免疫低下手段を同時に行う場合には、複数の個体の平均体重の一過性増加後の減少の度合いを、免疫低下の判断の指標としてもよい。
　免疫抑制剤としては、臓器移植などに際して、免疫学的拒否反応を抑制する目的で使用されるシクロスポリン、タクロリムス、ＩＳＰ－１などの免疫抑制剤、または副作用として免疫抑制作用を有するメチルプレドニゾロン等のステロイドなどを使用することが好ましい。これらは何れも市販品が存し、購入し使用することができるが、より好ましくは、シクロスポリン、タクロリムス、および酢酸メチルプレドニゾロン等のステロイドなどが例示され、ステロイドのうちさらに酢酸メチルプレドニゾロンがとくに好ましく、市販のデポ・メルコート（富士製薬社製）を使用することができる。
　免疫抑制剤の動物への投与量は、十分な免疫低下と動物の過度の衰弱を防止する観点から、前述の免疫低下の判断の指標、および動物の摂餌行動など免疫低下に伴う動物への影響を観察しながら、適宜調整して設定する必要がある。
　たとえば、酢酸メチルプレドニゾロンの１回分の投与量は、０．１～１００ｍｇ/ｋｇの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは１～１０ｍｇ/ｋｇであり、さらに好ましくは２～５ｍｇ/ｋｇである。また、シクロスポリンの１回分の投与量は、０．１～５０ｍｇ/ｋｇの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは１～２５ｍｇ/ｋｇであり、さらに好ましくは２～１０ｍｇ/ｋｇである。さらに、タクロリムスの１回分の投与量は、０．００１～１０ｍｇ/ｋｇの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは０．００５～５ｍｇ/ｋｇであり、さらに好ましくは０．０１～３ｍｇ/ｋｇである。
　免疫抑制剤の投与回数、投与間隔および投与期間は、同様に十分な免疫低下と動物の過度の衰弱を防止する観点から、前述の免疫低下の判断の指標、および動物の摂餌行動など免疫低下に伴う動物への影響を観察しながら、適宜調整して設定する必要がある。
　投与回数は、単回投与でも繰り返し投与でもよいが、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは２回以上の繰り返し投与である。
　投与間隔は、好ましくは２～２１日に１回であり、動物への負担および評価期間を考慮すると、より好ましくは７～１４日に１回である。
　投与開始から免疫低下させるまでの投与期間は、好ましくは１６週間以内であり、動物への負担および評価期間を考慮すると、より好ましくは６週間以内である。
　投与方法は、好ましくは、経口投与、静脈内投与、経皮投与、筋肉および皮下投与などが例示できるが、投与の確実性から、より好ましくは筋肉注射および経皮投与などが例示できる。
　具体的には、たとえば、酢酸メチルプレドニゾロンの投与は、１回分の投与量２～４ｍｇ/ｋｇを、７～１４日に１回の投与間隔で、単回または２～６回繰り返し投与することなどが好適に例示される。
　また、シクロスポリンの投与は、１回分の投与量２～１０ｍｇ/ｋｇを、１～１４日に１回の投与間隔で、単回または２～６回繰り返し投与することなどが好適に例示される。
　さらに、タクロリムスの投与は、１回分の投与量０．０１～３ｍｇ/ｋｇを、１～１４日に１回の投与間隔で、単回または２～６回繰り返し投与することなどが好適に例示される。
　また、たとえば、酢酸メチルプレドニゾロンを２～２４ｍｇ/ｋｇ投与した後に、体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から５～２０％減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
　また、シクロスポリンを２～６０ｍｇ/ｋｇ投与した後に、体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から５～２０％減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
　さらに、タクロリムスを０．０１～１８ｍｇ/ｋｇ投与した後に、体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から５～２０％減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
　本発明の動物感染モデルにおいて、動物に接種し、感染させるべき感染症原因微生物としては、感染後において薬剤の治療効果の低い疾病の原因微生物が好ましい。このような感染症原因微生物としては、表在性真菌、深在性真菌およびヘリコバクタ・ピロリなどが例示され、皮膚、爪および毛髪といった組織を想定した場合は、表在性真菌が好ましい。表在性真菌としては、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton　rubrum）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton　violaceum）、トリコフィトン・ベルコスム（Trichophyton　verrucosum）、トリコフィトン・トンスランス（Trichophyton　tonsurans）、ミクロスプラム・カニス（Microsprum　canis）、ミクロスプラム・ジプシウム（Microsprum　gypseum）、エピデルモフィトン・フロコッサム（Epidermophyton　floccosum）、ホルタエア・ベルネッキ（Hortaea　werneckii）、アルテナリア・アルテナーテ（Alternaria　alternate）、アスペルギルス・フミガチス（Aspergillus　fumigatys）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus　flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus　terreus）、パエチロマイセス・リラシヌス（Paecilomyces　lilacinus）、フサリウム・ソラニ（Fusarium　solani）、スコプラリオプシス・ブレビカウリス（Scopulariopsis　brevicaulis）、カンジダ・アルビカンス（Candida　albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida　tropicalis）、カンジダ・パラプシロシス（Candida　parapsilosis）、カンジダ・グラブラータ（Candida　glabrata）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus　neoformans）およびトリコスポロン・アサヒ（Trichosporon　asahii）から選択されるものが好ましく例示され、皮膚や爪白癬症の評価には原因菌として有望なTrichophyton属がより好ましく、さらに発芽分生子、分節分生子および小分生子などの分生子、とくに分節分生子および小分生子の形成しやすさなどを考慮するとトリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）がとくに好ましい。
　感染させる感染症原因微生物の形態としては、菌糸、胞子、発芽分生子、分節分生子および小分生子、ならびに菌体および芽胞などが例示されるが、真菌の場合は、局所での易感染性の点から、発芽分生子、分節分生子および小分生子が好ましく、分生子の採取、菌数カウントおよび接種のしやすさの点から、分節分生子および小分生子がより好ましい。
　前記前処置を行った動物に前記感染症原因微生物を感染させ、本発明の動物感染モデルを作製するが、かかる感染においては、感染を微生物の用量としてコントロールすることが好ましく、具体的には、感染させたい菌種を予め通常の寒天培地で培養し、これを白金耳でかき取り、菌体自身或いは分生子などの菌体の一部を取り出して、これを生理食塩水に加え、１×１０７～１×１０９conidia/ｍLとなるように菌液を調製し、好ましくは菌体乃至はその一部の分散性を高めるために、非イオン界面活性剤、たとえば、トリトンＸ或いはツィーン８０（和光純薬社製）を０．０１～０．１％加える。この菌液を前記のように免疫能の低下した動物に１０～１０００μL感染部位に投与する。投与部位の大きさにあわせ、菌液の投与量を調整し、ウサギやモルモットの爪や足底部に投与する場合は、１００～５００μLが好適に例示できる。
　菌液の接種方法としては、表面への塗布や皮下注射などが例示できるが、標的の組織への確実な接種や操作の簡便性の点から、組織表面へ直接塗布することが好ましい。菌液を塗布する部位としては、標的の組織のほかに、標的の組織の周辺組織へ塗布することも、短期間で確実に感染を成立させる点で有効である。たとえば、爪への真菌の菌液の塗布では、爪甲への塗布のみならず、爪と皮膚の境目にある側爪郭、後爪郭および爪上皮（甘皮）へも塗布することにより、爪甲側のみならず、爪の側面側などからも真菌がうまく入り込み、短期間で爪床側へも十分に感染させることができる。
　感染症原因微生物を標的組織に接種して増殖させる感染期間としては、典型的には１～１６週間であるが、動物への負担および評価期間を考慮すると２～６週間の感染期間が好ましい。このような感染は開放系でも行うことができるが、微生物汚染の防止と、感染の均質性を向上させるために、密封状態で行うことが有用である。このような密封方法としては、たとえば、市販のパッチ絆創膏、包帯などを用いることができる。また、パッチ絆創膏に代えて、指サックなどを用いて閉塞し、感染させることも可能である。指サックなどで閉塞する場合には、適宜水分を患部に補給して、湿潤状態に保っておくことは、感染を促進するので好ましい。
　また、密封状態で一定期間増殖させた後、指サックなどを除いて開放状態にし、何もせずに放置した状態で続けて菌を組織中で増殖させてもよい。放置期間としては、１～８週間が好適に例示できるが、動物への負担および評価期間を考慮すると２～６週間がより好ましい。
　上記感染期間および放置期間を適宜調整して組み合わせることにより、組織内での菌の感染部位や感染強度を制御して、種々の動物感染モデルを作製することが可能である。
　このような感染工程は、感染による感染部位の状態変化を観察しながら、そのエンドポイントを決定する。感染終了の指標としては、感染部位に菌が一様に分布し、感染していない部位と異なった性状を示すことを用いる。爪白癬の場合には、爪の黄色がかった白濁が爪全体に及んだことを以て感染終了と判断することができる。勿論、顕微鏡や拡大鏡により観察して、組織における増殖状態や菌数を目視で確認することや、組織の一部を採取し、培地に播種し、そこからの菌の生育を見ることによって、感染の度合いを判別することも可能である。これは動物の胃に、ヘリコバクタ・ピロリを植えるなどのように、他の難治性感染症にも応用することができる。
　微生物感染症における組織中の菌の局在は様々であり、たとえば、爪白癬症においては、遠位爪下型（爪の先端から感染するタイプ）、近位爪下型（爪上皮（甘皮）側から感染するタイプ）、表在性型（爪甲側の浅い部分に感染しているタイプ）、全層型（爪の全域に感染しているタイプ）などが挙げられる。
　本発明の動物感染モデルは、より臨床病態を反映したものであることが好ましく、たとえば、臨床における爪白癬症の分類と同様なモデルであるという点では、爪の深さ方向に上半分の爪甲側よりも下半分の爪床側により多くの真菌が感染しているものが好ましい。また同様に、臨床における爪白癬症の分類と同様なモデルであるという点では、爪を長径方向へ３等分した場合に、爪の先端側、爪の中間部および爪の爪母側の全部に、真菌が感染しているものが好ましい。また、爪の先端側もしくは爪母側など特定の部位により多くの真菌が分布しているものも、臨床病態を反映している場合があり好ましい。
　本発明により、爪の深部の爪床側にまで十分に真菌が浸潤し、かつ爪の全体に真菌が感染した感染モデル、または先端側もしくは爪母側などの特定の部位により多くの真菌が感染した感染モデルの作製が可能となり、全層型、遠位爪下型および近位爪下型などの臨床病態を反映した、爪白癬の動物感染モデルの作製がはじめて可能となったものである。
　斯くの如くの手順で作製された、本発明の動物感染モデルは、人における難治性感染症の症状に近似しており、かかる動物感染モデルに被験物質を投与し、感染部位が正常部位に近づく過程を観察することにより、該被験物質の爪白癬に対する抗真菌作用などを判別することができ、爪白癬症治療薬などの評価方法として極めて有用である。即ち、本発明の動物感染モデルに被験物質を投与した場合と非投与の場合で投与の場合の方が正常状態への回帰を示し、非投与の場合が正常への回帰を示さないときには、被験物質は爪白癬に対して有効性を有すると判別できる。また、２種の被験物質を同様に試験し、一方が正常状態への回帰の度合いの蓋然性が高い場合には、爪白癬に対して、該被験物質の方が他方より優れた抗真菌治療効果を有すると判別することができる。また、被験物質の投与量を変えて、それに対する反応性を観察することにより、被験物質の抗真菌効果の濃度依存性を判別することもできる。
　このような判別に際しては、治療部位の一部を採取し、これを培地などに播種し、残存した菌の生育度合いを指標に、生育度合いが著しければ被験物質の効果は低く、生育度合いが低ければ、被験物質の効果は高いと判別することもできる。この場合、生育度合いの判別は、別途播種する分生子数を変えて、培養の結果得られるコロニー面積を計測し、このデータより、予め分生子数－コロニー面積の検量線を作製しておき、この検量線を用いて、播種した治療部位の一部に残存していた生存菌を分生子数として推定し、該推定分生子数が少ないほど優れた抗真菌効果を被験物質が奏したと判別することもできる。このような判別において定量的な抗真菌効果の比較が行える。また、播種に用いる培地には、予めリン脂質０．１～１０質量％と、「ツィーン８０」などの非イオン界面活性剤を０．１～１０質量％含有させておき、残存する被験物質を不活性化し、ノイズを減らすことも好ましい。このような判別により、定量的な被験物質の効果の比較を行うことができる。特に、爪白癬のような難治性の感染症においては、短期間では完治することが少ないため、推定生存菌数が重要な効果の評価ポイントとなる。完治状態でなくとも抗真菌効果の比較がなし得るためである。
　他の難治性感染症においても、前記の爪白癬と同様に処置し、動物感染モデルを作製し、被験物質の投与による、その感染の治癒過程を観察することにより、治療効果を定量的に知ることができる。
　以下、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で、種々の変更が可能である。
〔実施例１〕
（ウサギ免疫抑制）
　１４週齢の日本白色種兎（Kbl:JW、北山ラベス）を１週間検疫馴化させた。馴化後、免疫抑制剤として持続性酢酸メチルプレドニゾロン製剤（デポ・メルコート　富士製薬社製）を大腿筋に、１回分の投与量４ｍｇ/ｋｇを計３回、１週間に１回の間隔で投与した。免疫抑制剤投与後の個々のウサギの体重を測定し、投与後の免疫能低下により、体重が一過性に増加し、その後減少したことを確認した。ウサギ計１５匹の平均体重が投与前の体重から約６％減じた、投与開始から２週間後の時点で菌液を接種した。ウサギ計１５匹の平均体重の変化を図１に示す。
（菌液の調製）
　４℃で保存していたトリコフトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）を安全キャビネット中で生理食塩水１．５ｍLに加え、菌懸濁液を調製した。サブロー培地（FLUID　SABOURAUD　MEDIUM）１．８ｇとアガー（Bacto　Agar）４．５ｇに３００ｍLの水を加え、撹拌後オートクレーブにて滅菌処理し、傾斜台で静置して斜面培地を作製した。該培地に菌懸濁液を加え、２８?で培養した。培養した菌を一部採取し、ツィーン８０（和光純薬社製）を０．０５％含有する溶液２～２０ｍLに加えた。血球計算盤（東京エルマ社製）を用いて菌の分生子液中の濃度を測定し、１．１×１０８～１．３×１０８conidia/ｍLになるように調製した。ツィーン８０の溶液量を調整し、最終的に１.０×１０８conidia/ｍLとして感染実験に用いた。
（ウサギ感染モデル）
　前述の免疫能の低下したウサギ（日本白色種兎）に局所麻酔をかけて、前記で調製した菌液を爪の甘皮部分とカーゼに２００μL塗布し、ガーゼをウサギの爪に被せテープで固定した。さらに指サックをウサギの指にはめ、湿潤させるための水を垂らすための孔をあけた。その後、２週間毎日ウサギの状態および爪部分の乾燥状態を確認し、爪の乾燥が認められた時は精製水を滴下し湿潤させた。
　上記の２週間の感染操作をしたウサギ感染モデルの他に、２週間の感染操作後に指サックなどを外してさらに２週間または６週間何もせずに放置したウサギ感染モデルを作製した。それぞれ１群、２群、および３群とした。
（標本の薄切）
　上記の１群～３群のウサギを、麻酔下で安楽死させ、爪を含む指部を切断採取し、ホルマリン溶液（マイルドホルム２０Ｎ　和光純薬社製）に入れ固定した。その後、脱灰、中和処理を行い、パラフィン包埋を行い包埋皿に指を入れてパラフィンを流し込み冷却して固化した。これを滑走式ミクロトーム（LS-113　大和光機製）で６μｍ程度の厚さに薄切しテープによりスライドガラス上に貼付し５分間放置した後、紫外線照射器（東京インスツルメンツ社製）で２分間紫外線を照射し、ＴＰＣ液（東京インスツルメンツ社製）に浸してテープを剥がした。
（標本の染色）
　前記の薄切標本をパス（ＰＡＳ：Periodic　acid　Schiff　stain）染色した。キシレンとエタノールで洗浄し、パラフィンを除き、水で洗浄した。過ヨウ素酸溶液（武藤化学社製）で１５分間酸化処理し、流水中で３分間洗浄後、シッフ試薬（武藤化学社製）で１５分間染色した。亜硝酸水（武藤化学社製）で５分間２回処理し、流水で３分間洗浄した。マイヤー・ヘマトキシリン溶液（和光純薬社製）で４０秒染色し、流水で１５分間色だしした。エタノールで脱水後、レモゾール（和光純薬社製）で３分間３回透徹し、ソフトマウント（和光純薬社製）およびカバーグラスで封入した。
（感染の確認）
　前記の染色した標本を光学顕微鏡を用い、下記表１の評価基準を基に評価スコア０（－）～３（＋＋＋）で評価した。評価は、爪の深さ方向に上半分の爪甲側および下半分の爪床側、ならびに爪を長径方向に３等分した、先端側、中間部および爪母側の計６箇所の各々の部位について行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例１第１群～３群のウサギ感染モデルの爪３０本（６本×５匹分）の各々について、前述の計６箇所の部位について感染の確認を行った。評価スコア１（＋）以上の感染部位を有する感染陽性の爪数を、回収した爪数（３０本）で徐した値を百分率で表した感染率、および各爪中における最大評価スコアの平均を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、評価スコア１（＋）以上の感染箇所を有する感染陽性の部位数を、確認した部位数（２９～３０本）で除した値を百分率で表した部位別の感染率を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　さらに、実施例１第２群の表在性真菌感染前後のウサギの爪の状態を写真撮影したものを図２に示す。図２において、左図の丸で囲った部分は感染しておらず赤みをおびているが、右図の丸で囲った部分は白濁して赤みが認められない。この白濁が真菌の感染を示している。
　また、実施例１第２群の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した標本を、光学顕微鏡で４０倍に拡大して写真撮影したものを図３に示す。図３において、矢印の部分が爪の部分であり、ＰＡＳ染色により紫色に染色されている部分が菌糸であり、爪の中に真菌が広く感染している事が示されている。特に丸で囲った部分は顕著に感染している。
　上記表２、図２および３の結果より、感染率および感染強度が高く、再現性がよく臨床病態を反映した爪の表在性真菌動物感染モデルを、免疫抑制剤の投与後４～１０週間という短期間で作製できることが分かる。なお、感染操作後に放置期間を設けることにより、感染率および感染強度ともに徐々に高くなることが分かる。
　また、上記表３、図２および３の結果より、爪のほぼ全域にわたって表在性真菌の感染が認められ、とくに爪全体としては爪甲側よりも爪の深部である爪床側へより多くの真菌が浸潤していることが分かる。さらに、表３の結果より、１群では爪母側、２群では爪母側および爪床側全域、ならびに３群では先端側および中間部により多くの真菌の感染が認められ、放置期間を設けることにより感染率の高い部位がシフトし、爪の先端側および爪母側などの特定の部位に真菌がより多く感染した爪感染モデルとなることが分かる。
　以上の結果より、爪は血流から遮断され免疫細胞も存しないといわれているが、免疫抑制作用を有するステロイドを投与して免疫を低下せしめた後、表在性真菌を接種して感染させることにより、従来作製することが不可能であった、感染率および感染強度が高く、爪の深部である爪床側へも真菌が十分に浸潤した、再現性がよくかつ臨床病態を反映した爪の表在性真菌動物感染モデルを、短期間で作製できることを確認した。
〔実施例２〕
（ウサギ免疫抑制）
　１４週齢の日本白色種兎（Kbl:JW、北山ラベス）を１週間検疫馴化させた。馴化後、免疫抑制剤としてシクロスポリン製剤（サンディミュン　ノバルティス社製）を大腿筋に、１回分の投与量４ｍｇ/ｋｇを計３回、１週間に１回の間隔で投与した。免疫抑制剤投与後の個々のウサギの体重を測定し、投与後の免疫能低下により、体重が一過性に増加し、その後減少したことを確認した。
（菌の調製）
　４℃で保存していたトリコフトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）を安全キャビネット中で生理食塩水１．５ｍLに加え、菌懸濁液を調製した。サブロー培地（FLUID　SABOURAUD　MEDIUM）１．８ｇとアガー（Bacto　Agar）４．５ｇに３００ｍLの水を加え、撹拌後オートクレーブにて滅菌処理し、傾斜台で静置して斜面培地を作製した。該培地に菌懸濁液を加え、２８?で培養した。培養した菌１０６conidia/ｍLをメンブランフィルタ上に播種しＢＨＩ培地の上にのせて１０％ＣＯ２存在下で７日間培養し発芽分生子とした。
（ウサギ感染モデル）
　前述の免疫能の低下したウサギ（日本白色種兎）に局所麻酔をかけて、前記で調製した発芽分生子をフィルターごとウサギの爪に被せテープで固定した。さらに指サックをウサギの指にはめ固定した。その後、２週間後に指サックを取り外し、外見から爪の白濁度を確認した。
（標本の作製と評価）
　前述の実施例１の標本の薄切および染色と同一の方法で標本を作製し、実施例１の感染の確認と同一の方法で標本を評価した。
〔比較例〕
　免疫抑制剤としてシクロスポリン製剤を投与しないこと以外は、実施例２と同一の条件でウサギの感染モデルを作製し、実施例１と同一の方法で標本を作製し評価した。
　実施例２のウサギ感染モデルの爪６本（６本×１匹）、および比較例のウサギ感染モデルの爪１８本（６本×３匹）の各々について、前述の計６箇所の部位について感染の確認を行った。評価スコア１（＋）以上の感染部位を有する感染陽性の爪数を回収した爪数で徐した値を百分率で表した感染率、および各爪中における最大評価スコアの平均を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、評価スコア１（＋）以上の感染箇所を有する感染陽性の部位数を、確認した部位数で除した値を百分率で表した部位別の感染率を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　さらに、比較例および実施例２の表在性真菌感染後のウサギの爪の状態を写真撮影したものを図４および５に示す。図４においては、丸で囲った爪全体が透き通っており真菌の感染が認められず、図５においては、丸で囲った爪の中間部から先端側で白濁しており真菌の感染が認められる。
　また、比較例の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した薄切標本を、光学顕微鏡で４０倍に拡大して写真撮影したものを図６に示す。図６において、爪内に真菌の感染が全く認められないことが示されている。
　さらに、実施例２の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した薄切標本を、光学顕微鏡で４００倍に拡大して写真撮影したものを図７に示す。図７において、丸で囲ったＰＡＳ染色により紫色に染色されている部分が菌糸であり、爪の爪床側（最深部）に真菌が顕著に感染している事が示されている。
　上記表４および図４～７の結果より、免疫抑制剤を投与することにより、投与しない場合と比較して格段に感染率および感染強度が高い、再現性がよく臨床病態を反映した爪の表在性真菌動物感染モデルを、免疫抑制剤の投与後４週間という短期間で作製できることが分かる。
　また、上記表５および図７の結果より、実施例２では、爪の全域にわたって表在性真菌の感染が認められ、とくに爪の深部である爪床側へも真菌が十分に浸潤していることが分かる。
　以上の結果より、爪は血流から遮断され免疫細胞も存しないといわれているが、免疫抑制剤であるシクロスポリンを投与して免疫を低下せしめた後、表在性真菌を接種することにより、従来作製することが不可能であった、感染率および感染強度が高く爪の深部である爪床側へも真菌が十分に浸潤した、再現性がよくかつ臨床病態を反映した爪の表在性真菌動物感染モデルを、短期間で作製できることを確認した。
実施例１の免疫抑制剤投与後のウサギの平均体重の変化を示す図である。 実施例１第２群の表在性真菌感染前後のウサギの爪の状態を示す写真図である。 実施例１第２群の表在性真菌感染後のウサギ爪の爪床側中間部の病理組織学的な写真図である。 比較例の表在性真菌感染後のウサギの爪の状態を示す写真図である。 実施例２の表在性真菌感染後のウサギの爪の状態を示す写真図である。 比較例の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の病理組織学的な写真図である。 実施例２の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の病理組織学的な写真図である。

Claims (17)

  1. 　微生物感染症の動物感染モデルであって、免疫低下手段により動物の免疫を低下せしめた後、感染症原因微生物を感染しにくい組織に接種して感染させることにより得られる、前記動物感染モデル。
  2. 　感染しにくい組織が、爪である、請求項１に記載の動物感染モデル。
  3. 　感染症が爪真菌症であり、感染症原因微生物が表在性真菌である、請求項１または２に記載の動物感染モデル。
  4. 　表在性真菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton　rubrum）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton　violaceum）、トリコフィトン・ベルコスム（Trichophyton　verrucosum）、トリコフィトン・トンスランス（Trichophyton　tonsurans）、ミクロスプラム・カニス（Microsprum　canis）、ミクロスプラム・ジプシウム（Microsprum　gypseum）、エピデルモフィトン・フロコッサム（Epidermophyton　floccosum）、ホルタエア・ベルネッキ（Hortaea　werneckii）、アルテナリア・アルテナーテ（Alternaria　alternate）、アスペルギルス・フミガチス（Aspergillus　fumigatys）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus　flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus　terreus）、パエチロマイセス・リラシヌス（Paecilomyces　lilacinus）、フサリウム・ソラニ（Fusarium　solani）、スコプラリオプシス・ブレビカウリス（Scopulariopsis　brevicaulis）、カンジダ・アルビカンス（Candida　albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida　tropicalis）、カンジダ・パラプシロシス（Candida　parapsilosis）、カンジダ・グラブラータ（Candida　glabrata）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus　neoformans）およびトリコスポロン・アサヒ（Trichosporon　asahii）からなる群より選ばれる1種または２種以上である、請求項３に記載の動物感染モデル。
  5. 　表在性真菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton　mentagrophytes）である、請求項４に記載の動物感染モデル。
  6. 　動物が、ウサギ、モルモット、ラット、イヌおよびサルから選ばれる1種または２種以上である、請求項１～５のいずれかに記載の動物感染モデル。
  7. 　免疫低下手段が、免疫抑制剤の投与である、請求項１～６のいずれかに記載の動物感染モデル。
  8. 　免疫抑制剤の投与により、動物の体重を１～３０％減少せしめた後、感染症原因微生物を感染しにくい組織に接種して感染させることにより得られる、請求項７に記載の動物感染モデル。
  9. 　免疫抑制剤が、酢酸メチルプレドニゾロン、シクロスポリンおよびタクロリムスから選ばれる1種または２種以上である、請求項７または８に記載の動物感染モデル。
  10. 　免疫抑制剤が、酢酸メチルプレドニゾロンである、請求項９に記載の動物感染モデル。
  11. 　酢酸メチルプレドニゾロンの投与量が、０．１～１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１０に記載の動物感染モデル。
  12. 　免疫抑制剤の投与開始から、１６週間以内に免疫低下させた、請求項７～１１のいずれかに記載の動物感染モデル。
  13. 　免疫抑制剤の投与開始から、６週間以内に免疫低下させた、請求項１２に記載の動物感染モデル。
  14. 　感染症原因微生物の接種方法が、該微生物を含有する菌液を動物の爪および／または爪周辺の皮膚に塗布するものであり、感染方法が、該塗布部位を被い前記微生物が増殖しやすいように水で湿潤させることによる、請求項２～１３のいずれかに記載の動物感染モデル。
  15. 　表在性真菌を含有する菌液を爪に塗布してから、１６週間以内に表在性真菌を爪に感染させた、請求項１４に記載の動物感染モデル。
  16. 　表在性真菌を含有する菌液を爪に塗布してから、６週間以内に表在性真菌を爪に感染させた、請求項１５に記載の動物感染モデル。
  17. 　請求項１～１６のいずれかに記載の動物感染モデルを用いる、爪白癬症治療薬の評価方法。
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