JP5250561B2 - 微生物感染症の動物感染モデル - Google Patents
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Description
一方、動物感染モデルの作製方法として、動物の免疫力をステロイドの投与により低下させ、感染しやすい状態にしてから真菌を感染させる方法が報告されているが(非特許文献4)、これは免疫の低下が感染に影響を与えることが明らかな、眼球および眼球周辺の粘膜組織などに感染させた動物感染モデルに限られていた。
また、トリコフィトン(Trichophyton)属菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス(Trichophyton mentagrophytes)、トリコフィトン・ルブルム(Trichophyton rubrum)、トリコフィトン・ビオラセウム(Trichophyton violaceum)、トリコフィトン・ベルコスム(Trichophyton verrucosum)およびトリコフィトン・トンスランス(Trichophyton tonsurans)からなる群より選ばれる1種または2種以上である、前記の作製方法に関する。
さらに、トリコフィトン(Trichophyton)属菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス(Trichophyton mentagrophytes)である、前記の作製方法に関する。
また、前記動物が、ウサギ、モルモット、ラット、イヌおよびサルから選ばれる1種または2種以上である、前記の作製方法に関する。
さらに、前記免疫抑制剤が、酢酸メチルプレドニゾロン、シクロスポリンおよびタクロリムスから選ばれる1種または2種以上である、前記の作製方法に関する。
また、前記免疫抑制剤が、酢酸メチルプレドニゾロンである、前記の作製方法に関する。
さらに、前記酢酸メチルプレドニゾロンの投与量が、0.1〜100mg/kgである、前記の作製方法に関する。
また、前記免疫抑制剤の投与開始から、16週間以内に免疫低下させた、前記の作製方法に関する。
さらに、前記免疫抑制剤の投与開始から、6週間以内に免疫低下させた、前記の作製方法に関する。
また、トリコフィトン(Trichophyton)属菌の接種方法が、該菌を含有する菌液を動物の爪および/または爪周辺の皮膚に塗布するものであり、感染方法が、該塗布部位を被い前記菌が増殖しやすいように水で湿潤させることによる、前記の作製方法に関する。
さらに、トリコフィトン(Trichophyton)属菌を含有する菌液を爪に塗布してから、16週間以内にトリコフィトン(Trichophyton)属菌を爪に感染させた、前記の作製方法に関する。
また、トリコフィトン(Trichophyton)属菌を含有する菌液を爪に塗布してから、6週間以内にトリコフィトン(Trichophyton)属菌を爪に感染させた、前記の作製方法に関する。
さらに、前記の作製方法によって作製された、爪真菌症の動物感染モデル(ヒトを除く)に関する。
また、前記動物感染モデル(ヒトを除く)を用いる、爪白癬症治療薬の評価方法に関する。
このことは、感染しにくい組織である爪などのハードケラチンから構成される組織は、感染が成立するのには非常に時間がかかり、そもそも血流から遮断され免疫細胞が存しないといわれていることから、生体内の免疫能低下がそのような組織の微生物感染に直接影響することは到底予測できないことからすると、驚くべき効果という外ない。
そして本発明の動物感染モデルは、爪白癬などの難治性感染症の治療薬の開発に有用な評価方法を提供することができるものである。
免疫低下の判断は、十分な免疫低下と動物の過度の衰弱を防止する観点から、動物の摂餌行動など免疫低下に伴う動物への影響を観察しながら、慎重に行う必要がある。典型的には、免疫抑制剤投与後の体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から1〜30%減の範囲が好ましく、十分な免疫低下と動物の過度の衰弱防止を考慮すると、より好ましくは3〜30%減、さらに好ましくは5〜30%減、特に好ましくは5〜20%減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
なお、複数の個体に同一の免疫低下手段を同時に行う場合には、複数の個体の平均体重の一過性増加後の減少の度合いを、免疫低下の判断の指標としてもよい。
たとえば、酢酸メチルプレドニゾロンの1回分の投与量は、0.1〜100mg/kgの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは1〜10mg/kgであり、さらに好ましくは2〜5mg/kgである。また、シクロスポリンの1回分の投与量は、0.1〜50mg/kgの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは1〜25mg/kgであり、さらに好ましくは2〜10mg/kgである。さらに、タクロリムスの1回分の投与量は、0.001〜10mg/kgの範囲が好ましく、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは0.005〜5mg/kgであり、さらに好ましくは0.01〜3mg/kgである。
投与回数は、単回投与でも繰り返し投与でもよいが、免疫低下の度合いおよび動物への負担を考慮すると、より好ましくは2回以上の繰り返し投与である。
投与間隔は、好ましくは2〜21日に1回であり、動物への負担および評価期間を考慮すると、より好ましくは7〜14日に1回である。
投与開始から免疫低下させるまでの投与期間は、好ましくは16週間以内であり、動物への負担および評価期間を考慮すると、より好ましくは6週間以内である。
投与方法は、好ましくは、経口投与、静脈内投与、経皮投与、筋肉内および皮下投与などが例示できるが、投与の確実性から、より好ましくは筋肉注射および経皮投与などが例示できる。
また、シクロスポリンの投与は、1回分の投与量2〜10mg/kgを、1〜14日に1回の投与間隔で、単回または2〜6回繰り返し投与することなどが好適に例示される。
さらに、タクロリムスの投与は、1回分の投与量0.01〜3mg/kgを、1〜14日に1回の投与間隔で、単回または2〜6回繰り返し投与することなどが好適に例示される。
また、シクロスポリンを2〜60mg/kg投与した後に、体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から5〜20%減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
さらに、タクロリムスを0.01〜18mg/kg投与した後に、体重の一過性増加後の減少の度合いが、投与前の体重から5〜20%減である場合に、免疫低下の度合いが感染症微生物の接種に好適であると判断される。
また、密封状態で一定期間増殖させた後、指サックなどを除いて開放状態にし、何もせずに放置した状態で続けて菌を組織中で増殖させてもよい。放置期間としては、1〜8週間が好適に例示できるが、動物への負担および評価期間を考慮すると2〜6週間がより好ましい。
上記感染期間および放置期間を適宜調整して組み合わせることにより、組織内での菌の感染部位や感染強度を制御して、種々の動物感染モデルを作製することが可能である。
本発明の動物感染モデルは、より臨床病態を反映したものであることが好ましく、たとえば、臨床における爪白癬症の分類と同様なモデルであるという点では、爪の深さ方向に上半分の爪甲側よりも下半分の爪床側により多くの真菌が感染しているものが好ましい。また同様に、臨床における爪白癬症の分類と同様なモデルであるという点では、爪を長径方向へ3等分した場合に、爪の先端側、爪の中間部および爪の爪母側の全部に、真菌が感染しているものが好ましい。また、爪の先端側もしくは爪母側など特定の部位により多くの真菌が分布しているものも、臨床病態を反映している場合があり好ましい。
本発明により、爪の深部の爪床側にまで十分に真菌が浸潤し、かつ爪の全体に真菌が感染した感染モデル、または先端側もしくは爪母側などの特定の部位により多くの真菌が感染した感染モデルの作製が可能となり、全層型、遠位爪下型および近位爪下型などの臨床病態を反映した、爪白癬の動物感染モデルの作製がはじめて可能となったものである。
(ウサギ免疫抑制)
14週齢の日本白色種兎(Kbl:JW、北山ラベス)を1週間検疫馴化させた。馴化後、免疫抑制剤として持続性酢酸メチルプレドニゾロン製剤(デポ・メルコート 富士製薬社製)を大腿筋に、1回分の投与量4mg/kgを計3回、1週間に1回の間隔で投与した。免疫抑制剤投与後の個々のウサギの体重を測定し、投与後の免疫能低下により、体重が一過性に増加し、その後減少したことを確認した。ウサギ計15匹の平均体重が投与前の体重から約6%減じた、投与開始から2週間後の時点で菌液を接種した。ウサギ計15匹の平均体重の変化を図1に示す。
4℃で保存していたトリコフィトン・メンタグロファイテス(Trichophyton mentagrophytes)を安全キャビネット中で生理食塩水1.5mLに加え、菌懸濁液を調製した。サブロー培地(FLUID SABOURAUD MEDIUM)1.8gとアガー(Bacto Agar)4.5gに300mLの水を加え、撹拌後オートクレーブにて滅菌処理し、傾斜台で静置して斜面培地を作製した。該培地に菌懸濁液を加え、28℃で培養した。培養した菌を一部採取し、ツィーン80(和光純薬社製)を0.05%含有する溶液2〜20mLに加えた。血球計算盤(東京エルマ社製)を用いて菌の分生子液中の濃度を測定し、1.1×108〜1.3×108conidia/mLになるように調製した。ツィーン80の溶液量を調整し、最終的に1.0×108conidia/mLとして感染実験に用いた。
前述の免疫能の低下したウサギ(日本白色種兎)に局所麻酔をかけて、前記で調製した菌液を爪の甘皮部分とカーゼに200μL塗布し、ガーゼをウサギの爪に被せテープで固定した。さらに指サックをウサギの指にはめ、湿潤させるための水を垂らすための孔をあけた。その後、2週間毎日ウサギの状態および爪部分の乾燥状態を確認し、爪の乾燥が認められた時は精製水を滴下し湿潤させた。
上記の2週間の感染操作をしたウサギ感染モデルの他に、2週間の感染操作後に指サックなどを外してさらに2週間または6週間何もせずに放置したウサギ感染モデルを作製した。それぞれ1群、2群、および3群とした。
上記の1群〜3群のウサギを、麻酔下で安楽死させ、爪を含む指部を切断採取し、ホルマリン溶液(マイルドホルム20N 和光純薬社製)に入れ固定した。その後、脱灰、中和処理を行い、パラフィン包埋を行い包埋皿に指を入れてパラフィンを流し込み冷却して固化した。これを滑走式ミクロトーム(LS-113 大和光機製)で6μm程度の厚さに薄切しテープによりスライドガラス上に貼付し5分間放置した後、紫外線照射器(東京インスツルメンツ社製)で2分間紫外線を照射し、TPC液(東京インスツルメンツ社製)に浸してテープを剥がした。
前記の薄切標本をパス(PAS:Periodic acid Schiff stain)染色した。キシレンとエタノールで洗浄し、パラフィンを除き、水で洗浄した。過ヨウ素酸溶液(武藤化学社製)で15分間酸化処理し、流水中で3分間洗浄後、シッフ試薬(武藤化学社製)で15分間染色した。亜硝酸水(武藤化学社製)で5分間2回処理し、流水で3分間洗浄した。マイヤー・ヘマトキシリン溶液(和光純薬社製)で40秒染色し、流水で15分間色だしした。エタノールで脱水後、レモゾール(和光純薬社製)で3分間3回透徹し、ソフトマウント(和光純薬社製)およびカバーグラスで封入した。
前記の染色した標本を光学顕微鏡を用い、下記表1の評価基準を基に評価スコア0(−)〜3(+++)で評価した。評価は、爪の深さ方向に上半分の爪甲側および下半分の爪床側、ならびに爪を長径方向に3等分した、先端側、中間部および爪母側の計6箇所の各々の部位について行った。
また、実施例1第2群の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した標本を、光学顕微鏡で40倍に拡大して写真撮影したものを図3に示す。図3において、矢印の部分が爪の部分であり、PAS染色により紫色に染色されている部分が菌糸であり、爪の中に真菌が広く感染している事が示されている。特に丸で囲った部分は顕著に感染している。
また、上記表3、図2および3の結果より、爪のほぼ全域にわたって表在性真菌の感染が認められ、とくに爪全体としては爪甲側よりも爪の深部である爪床側へより多くの真菌が浸潤していることが分かる。さらに、表3の結果より、1群では爪母側、2群では爪母側および爪床側全域、ならびに3群では先端側および中間部により多くの真菌の感染が認められ、放置期間を設けることにより感染率の高い部位がシフトし、爪の先端側および爪母側などの特定の部位に真菌がより多く感染した爪感染モデルとなることが分かる。
以上の結果より、爪は血流から遮断され免疫細胞も存しないといわれているが、免疫抑制作用を有するステロイドを投与して免疫を低下せしめた後、表在性真菌を接種して感染させることにより、従来作製することが不可能であった、感染率および感染強度が高く、爪の深部である爪床側へも真菌が十分に浸潤した、再現性がよくかつ臨床病態を反映した爪の表在性真菌動物感染モデルを、短期間で作製できることを確認した。
(ウサギ免疫抑制)
14週齢の日本白色種兎(Kbl:JW、北山ラベス)を1週間検疫馴化させた。馴化後、免疫抑制剤としてシクロスポリン製剤(サンディミュン ノバルティス社製)を大腿筋に、1回分の投与量4mg/kgを計3回、1週間に1回の間隔で投与した。免疫抑制剤投与後の個々のウサギの体重を測定し、投与後の免疫能低下により、体重が一過性に増加し、その後減少したことを確認した。
4℃で保存していたトリコフィトン・メンタグロファイテス(Trichophyton mentagrophytes)を安全キャビネット中で生理食塩水1.5mLに加え、菌懸濁液を調製した。サブロー培地(FLUID SABOURAUD MEDIUM)1.8gとアガー(Bacto Agar)4.5gに300mLの水を加え、撹拌後オートクレーブにて滅菌処理し、傾斜台で静置して斜面培地を作製した。該培地に菌懸濁液を加え、28℃で培養した。培養した菌106conidia/mLをメンブランフィルタ上に播種しBHI培地の上にのせて10%CO2存在下で7日間培養し発芽分生子とした。
前述の免疫能の低下したウサギ(日本白色種兎)に局所麻酔をかけて、前記で調製した発芽分生子をフィルターごとウサギの爪に被せテープで固定した。さらに指サックをウサギの指にはめ固定した。その後、2週間後に指サックを取り外し、外見から爪の白濁度を確認した。
前述の実施例1の標本の薄切および染色と同一の方法で標本を作製し、実施例1の感染の確認と同一の方法で標本を評価した。
免疫抑制剤としてシクロスポリン製剤を投与しないこと以外は、実施例2と同一の条件でウサギの感染モデルを作製し、実施例1と同一の方法で標本を作製し評価した。
また、比較例の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した薄切標本を、光学顕微鏡で40倍に拡大して写真撮影したものを図6に示す。図6において、爪内に真菌の感染が全く認められないことが示されている。
さらに、実施例2の表在性真菌感染後のウサギの爪の爪床側中間部の染色した薄切標本を、光学顕微鏡で400倍に拡大して写真撮影したものを図7に示す。図7において、丸で囲ったPAS染色により紫色に染色されている部分が菌糸であり、爪の爪床側(最深部)に真菌が顕著に感染している事が示されている。
また、上記表5および図7の結果より、実施例2では、爪の全域にわたって表在性真菌の感染が認められ、とくに爪の深部である爪床側へも真菌が十分に浸潤していることが分かる。
以上の結果より、爪は血流から遮断され免疫細胞も存しないといわれているが、免疫抑制剤であるシクロスポリンを投与して免疫を低下せしめた後、表在性真菌を接種することにより、従来作製することが不可能であった、感染率および感染強度が高く爪の深部である爪床側へも真菌が十分に浸潤した、再現性がよくかつ臨床病態を反映した爪の表在性真菌動物感染モデルを、短期間で作製できることを確認した。
Claims (14)
- 爪真菌症の動物感染モデル(ヒトを除く)の作製方法であって、免疫抑制剤の投与により動物(ヒトを除く)の体重を1〜30%減少せしめ、免疫を低下せしめた後、トリコフィトン(Trichophyton)属菌を爪に接種して感染させることにより動物感染モデルを得る、前記作製方法。
- トリコフィトン(Trichophyton)属菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス(Trichophyton mentagrophytes)、トリコフィトン・ルブルム(Trichophyton rubrum)、トリコフィトン・ビオラセウム(Trichophyton violaceum)、トリコフィトン・ベルコスム(Trichophyton verrucosum)およびトリコフィトン・トンスランス(Trichophyton tonsurans)からなる群より選ばれる1種または2種以上である、請求項1に記載の作製方法。
- トリコフィトン(Trichophyton)属菌が、トリコフィトン・メンタグロファイテス(Trichophyton mentagrophytes)である、請求項2に記載の作製方法。
- 動物が、ウサギ、モルモット、ラット、イヌおよびサルから選ばれる1種または2種以上である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の作製方法。
- 免疫抑制剤が、酢酸メチルプレドニゾロン、シクロスポリンおよびタクロリムスから選ばれる1種または2種以上である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の作製方法。
- 免疫抑制剤が、酢酸メチルプレドニゾロンである、請求項5に記載の作製方法。
- 酢酸メチルプレドニゾロンの投与量が、0.1〜100mg/kgである、請求項6に記載の作製方法。
- 免疫抑制剤の投与開始から、16週間以内に免疫低下させた、請求項1〜7のいずれか一項に記載の作製方法。
- 免疫抑制剤の投与開始から、6週間以内に免疫低下させた、請求項8に記載の作製方法。
- トリコフィトン(Trichophyton)属菌の接種方法が、該菌を含有する菌液を動物の爪および/または爪周辺の皮膚に塗布するものであり、感染方法が、該塗布部位を被い前記菌が増殖しやすいように水で湿潤させることによる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の作製方法。
- トリコフィトン(Trichophyton)属菌を含有する菌液を爪に塗布してから、16週間以内にトリコフィトン(Trichophyton)属菌を爪に感染させた、請求項10に記載の作製方法。
- トリコフィトン(Trichophyton)属菌を含有する菌液を爪に塗布してから、6週間以内にトリコフィトン(Trichophyton)属菌を爪に感染させた、請求項11に記載の作製方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の作製方法によって作製された、爪真菌症の動物感染モデル(ヒトを除く)。
- 請求項13に記載の動物感染モデル(ヒトを除く)を用いる、爪白癬症治療薬の評価方法。
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