BR112018077463B1 - Preparação contendo o micro-organismo micoparasítico pythium oligandrum cepa dv74 - Google Patents
Preparação contendo o micro-organismo micoparasítico pythium oligandrum cepa dv74 Download PDFInfo
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Abstract
uma preparação contendo o micro-organismo micoparasítico pythium oligandrum para o tratamento de dermatofitoses e de infecções por leveduras sobre a pele e as membranas mucosas obtida a partir de uma mistura seca contendo de 0,1 a 99,9% em peso de micro-organismo micoparasítico pythium oligandrum e de 0,1 a 99,9% em peso de substâncias auxiliares, contendo pelo menos um componente de um grupo compreendendo absorvente, agente tamponante, agente umectante, desodorante e aroma. esta preparação contém de 1 a 10 x 106, com preferência de 10 a 50, células viáveis do micro-organismo pythium oligandrum por 1 ml de suspensão aquosa no sítio de aplicação da preparação, pela qual as células viáveis do micro-organismo pythium oligandrum compreendem oósporos dormentes, zoósporos encistados e micélio coenocítico viável. são reivindicados diferentes métodos de aplicação. modalidades exemplificadoras mostram a viabilidade de células usando testes genéticos e testes práticos conduzidos sob a supervisão de dermatologistas, estomatologistas e veterinários.
Description
[001] A invenção refere-se à preparação com o micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum para o tratamento de dermafitoses e infecções por leveduras sobre a pele e as membranas mucosas. A preparação provém sob a forma de uma suspensão aquosa preparada a partir de uma mistura seca contendo de 0,1 a 99,9% em peso de micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum e de 0,1 a 99,9% em peso de substâncias auxiliares contendo pelo menos um componente do grupo compreendendo absorvente, tampão, umectante, desodorante e aroma.
[002] Além disso, a invenção refere-se a um método de determinação da viabilidade da célula do micro-organismo Pythium oligandrum.
[003] A invenção refere-se, também, a um método de aplicação desta preparação.
[004] Dermafitoses são infecções fúngicas causadas por dermatófitos, fungos queratinofílicos que atacam, em particular, a pele, as unhas e o cabelo, e que são distinguidas por um longo período de iniciação. Este é predominantemente facilitado pela mínima reação do sistema imune do hospedeiro como resultado da ocultação eficaz das superfícies destes fungos queratinofílicos ao reconhecimento pelas moléculas de imunidade. Os fungos queratinofílicos usam a proteína queratina que ocorre em toda a superfície da pele do corpo humano como sustento vital deles devido à degradação enzimática eficaz e ao metabolismo enzimático eficaz dos componentes digeridos. Estes fungos são representados pelas espécies Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum, e a natureza molecular dos fatores que permitem que estes micro-organismos vivam seu estilo de vida já tem sido identificada (6). As micoses de pele e de membrana mucosa são distinguidas por diferentes manifestações, habitualmente incluindo irritação, vermelhidão, flocos de descamação ou mesmo áreas maiores da pele, a pele algumas vezes branqueia-se e macera-se em áreas de sensibilidade mais alta. Os sintomas acompanhantes comuns incluem sintomas de perspiração aumentada e de odor (cheiro) socialmente desagradável que testificam a disbiose avançada nos locais afetados.
[005] Um sinônimo para dermatofitoses é tinha, na qual, dependendo de sua localização anatômica, as formas mais comuns de dermatofitoses são tinha do pé (sobre os pés), tinha ungueal (sob as unhas), tinha do corpo (infecção fúngica sobre o corpo, predominantemente na parte sem pelos do tronco e na parte proximal dos membros inferiores), tinha da região genitocrural (a área inguinal, mais comumente em homens durante o verão após sudação em roupas apertadas), tinha da cabeça (infecção fúngica do couro cabeludo sobre ou no interior da haste do pelo, mais comumente em crianças que entram em contato com um dermatófito zoofílico como Microsporum canis). Embora as dermatofitoses não sejam habitualmente doenças fatais, são infecções extremamente disseminadas que afetam uma percentagem significativa da população e cujos sintomas tornam desagradável a vida de trabalho e social daquelas pessoas que sofrem das mesmas.
[006] Infecções microbianas oportunistas por leveduras são doenças contemporâneas relativamente disseminadas dentre humanos, nas quais as leveduras comensais normalmente inofensivas que vivem na pele e nas membranas mucosas de um humano são ativadas como resultado do enfraquecimento do sistema imune durante estresse, sobrecarga de trabalho, infecções virais ou outras situações estressantes, e transformam-se na forma agressiva distinguida por morfologia e metabolismo diferentes. Pesquisa concentra-se predominantemente na levedura patogênica mais comum Candida albicans e suas parentas. Pesquisa molecular e genética tem recentemente contribuído para a identificação de fatores individuais responsáveis por este comportamento incomum das leveduras patogênicas, que são objetivos subsequentemente importantes para as terapias recém- desenvolvidas (2).
[007] As terapias atualmente disponíveis para o tratamento de infecções dermatofíticas e por leveduras são dominadas por produtos químicos antifúngicos dos grupos de azóis, alilaminas e equinocandinas, que são, contudo, notórios por baixa efetividade e frequentes efeitos colaterais, o que os tornam desvantajosos para um amplo grupo de usuários (pessoas idosas, pessoas com diabetes ou doenças hepáticas, pessoas tendo imunidade enfraquecida). As terapias que usam estes produtos são relativamente muito caras e apenas têm um efeito temporário. Não são capazes de lidar em nenhuma maneira com a disbiose (disrupção da microflora fisiológica, normal) associada com este tipo de doença. Por esta razão, o tratamento moderno para estabilizar a microflora normal que é eficaz durante longo tempo é um grande desafio.
[008] O uso de produtos biológicos naturais para tratar dermafitoses e infecções por leveduras tem sido, até aqui, desenvolvido em uma extensão mínima. O problema do uso do micro-organismo Pythium oligandrum para proteger a pele tem relações comerciais com o modelo de utilidade CZ 9883U dos funcionários da Biopreparáty spol. s r. o., os inventores Vesely et al., com data de prioridade de 18/11/1999. Os autores utilizam uma suspensão de oósporos em uma quantidade que não ultrapassa 2 x 105por 1 g de produto para lidar com determinados problemas de pele dentre 9 grupos de pacientes. Entretanto, aqui não é o caso, como os autores de CZ 9883U erradamente supõem, da eliminação dos causadores de dermatofitoses onde não há evidência no documento para respaldar uma tal alegação. Os autores apresentam resultados de laboratório do efeito do micro-organismo Pythium oligandrum sobre o Scopulariopsis breviacaulis; entretanto, este micro- organismo é um micro-organismo saprofítico do solo (e não um dermatófito). Não foram conduzidos exames microbiológicos em nenhuns dos pacientes monitorados em CZ UV9883 e, portanto, é impossível provar como eles foram realmente afetados por dermatófitos. Com relação aos efeitos curativos declarados, não há menção no documento de que os pacientes foram medicamente monitorados e, em numerosos casos, é mais uma questão de sensações subjetivas deles concernentes aos efeitos descritos (alteração na cor das unhas, desaparecimento de dor). A patente CZ 302297, pertencente ao requerente desta invenção, usou uma concentração mais alta de oósporos pela primeira vez após testes toxicológicos rigorosos (mais que 2 x 105por 1 g de produto), mas não lida, de modo mais detalhado, com o problema de dermatofitoses ou infecções por leveduras em humanos. Ao contrário, a vantagem desta invenção é que é primeiro esclarecida a capacidade do micro-organismomicoparasítico Pythium oligandrum para atuar em um ambiente diferente daquele de uma suspensão aquosa, como em pomadas, óleos e outras formas de aplicação. Ainda mais, a significância de formas de células viáveis do micro-organismo Pythium oligandrum diferentes de oósporos dormentes foi enfatizada pela primeira vez, em particular zoósporos encistados e fragmentos viáveis de micélio como formas do micro-organismo Pythium oligandrum mais eficazes em micoparasitismo direto. O modelo de utilidade CZ 28816 U, pertencente aos requerentes desta invenção, lida, em detalhe, com o problema de infecções microbianas oportunistas usando preparações microbianas duais; estas, contudo, são distinguidas na maneira clássica usando unidades formadoras de colônias (UFC), cuja utilização não é isenta de seus imprevistos no caso do micro-organismo Pythium oligandrum.
[009] A desvantagem das soluções existentes e de uma restrição significativa sendo usada para o desenvolvimento de um produto medicinal é, portanto, uma falta de total entendimento da natureza da substância eficaz Pythium oligandrum, cuja quantidade nas preparações não pode ser habitualmente precisamente determinada. Consequentemente, a definição da concentração e da efetividade de tais preparações poderia ser de difícil averiguação e reprodução.
[0010] As desvantagens especificadas acima são eliminadas ou significativamente restringidas por uma preparação contendo o organismo micoparasítico Pythium oligandrum no tratamento de dermatofitoses e de infecções por leveduras sobre a pele e as membranas mucosas de acordo com a reivindicação 1 desta invenção, cuja essência é com base no fato de que a preparação contém 1 a 10 x 106, com preferência de 10 a 50, células viáveis do micro-organismo Pythium oligandrum por 1 mL de suspensão aquosa aplicada no sítio de aplicação, pela qual as células viáveis do microorganismo Pythium oligandrum contêm oósporos dormentes, zoósporos encistados e micélio coenocítico viável.
[0011] Além disso, o novo assunto da dita invenção é também um método de determinação da viabilidade da célula do micro-organismo Pythium oligandrum. A viabilidade das células do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum na invenção apresentada significa a viabilidade determinada pelo teste genético da preparação pela medição do nível de expressão do gene constitutivo para a β-tubulina do micro-organismo Pythium oligandrum (11), mantido em um meio que é rico em nutrientes, em uma atmosfera normal a 30°C.
[0012] A invenção apresentada também lida com o método de aplicação da preparação de acordo com esta invenção, cuja essência é com base no fato de que ele inclui as seguintes etapas: a) a preparação de uma suspensão aquosa usando uma dispersão mecânica de uma mistura seca no volume definido de água morna ou de solução fisiológica para alcançar um teor de 1 a 10 x 106células viáveis, com a vantagem de 1 a 500 células viáveis, e com preferência de 10 a 50 células viáveis, do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum por 1 mL de suspensão aquosa no sítio de aplicação; b) a aplicação da suspensão aquosa criada nesta maneira dependendo do tipo de diagnose sendo tratada com o uso da quantidade recomendada de células viáveis do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum; c) a colonização das células viáveis do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum no sítio de aplicação de acordo com a diagnose sendo tratada; d) a reprodução de células viáveis do microorganismomicoparasítico Pythium oligandrum no sítio de aplicação de acordo com a diagnose sendo tratada para eliminar dermatófitos ou leveduras; e e) as subsequentes esporulação e eliminação paralela da preparação no sítio de aplicação, facilitando a estabilização e o desenvolvimento da microflora normal para garantir um efeito curativo de longa duração.
[0013] A aplicação da preparação de acordo com a invenção em pomadas, óleos, géis, sprays, emplastros umedecidos ou pós umedecidos é realizada na maneira conhecida pelos peritos no campo, com o objetivo de colonizar o sítio afetado de aplicação com uma quantidade de células viáveis correspondendo aos requisitos das diagnoses específicas.
[0014] A solução fisiológica conhecida por um perito no campo é entendida como sendo, por exemplo, a solução mais comum de NaCl a uma concentração de 9 g por 1 litro, ou uma solução fisiológica tamponada, por exemplo, por fosfato de sódio, em uma quantidade de 10 mg por 1 litro, - a denominada SSTF (Solução Salina Tamponada com Fosfato).
[0015] Em princípio, quaisquer células viáveis são capazes de garantir a colonização e a reprodução do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum no sítio de aplicação. Oósporos dormentes que são capazes de fornecer células viáveis de acordo com as condições locais em 24-48 horas após a umectação da mistura seca são representados na quantidade mais alta nas preparações de acordo com esta invenção. As preparações de acordo com esta invenção contêm, também, zoósporos encistados e micélio coenocítico viável, que são habitualmente capazes de fornecer células viáveis dentro de 20 minutes da umectação da mistura seca.
[0016] A colonização das células viáveis do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum no sítio de aplicação de acordo com a diagnose sendo tratada processa-se na maneira conhecida por um perito no campo. Em nossa experiência, todos estes processos nas preparações de acordo com a invenção apresentada são dependentes da presença dos microorganismos selecionados como dermatófitos ou leveduras no sítio de aplicação. Se tais micro-organismos alvo para o micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrumestão presentes, isto resulta na colonização de células viáveis dentro de uma a duas horas após a fixação deles nestes micro-organismos selecionados, isto é, dermatófitos ou leveduras. O micro-organismo Pythium oligandrumé multiplicado dentro de um a dois dias com o uso de nutrientes fornecidos pelos micro-organismos selecionados. As células viáveis desaparecem do sítio de aplicação dentro de cerca de duas semanas da eliminação dos micro-organismos selecionados. Em tal tempo, à medida que os nutrientes provenientes dos micro-organismos selecionados têm sido esgotados, vemos a transição do micro-organismo Pythium oligandrum para a forma inativa, significando esporulação, no sítio de aplicação. Os oósporos dormentes criados nesta maneira não sobrevivem durante longo tempo sobre a pele e as membranas mucosas à medida que são regularmente removidos por processos dinâmicos nestes sítios de aplicação, isto é, por exemplo, pela separação de células mortas do sítio afetado e pela liberação de secreções sobre as membranas mucosas. Foi empiricamente investigado que o micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum saindo do sítio de aplicação cria as condições para o desenvolvimento e a estabilização da microflora normal.
[0017] Quando se aplica a preparação de acordo com a invenção com a quantidade recomendada de células viáveis do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum, o requerente averiguou que no tratamento de dermatofitoses e de tinha ungueal a quantidade recomendada de células viáveis em 1 mL de suspensão aquosa é de 50, enquanto que ela é de 30 na eliminação de leveduras em ferimentos não cicatrizados e de 10 na eliminação de leveduras na cavidade oral.
[0018] Para tratar dermatofitoses sob a forma de tinha ungueal de acordo com esta invenção, é aplicada uma preparação que idealmente contém 50 células viáveis por 1 mL de preparação em uma suspensão aquosa, aplicada em uma quantidade de 0,15 mL desta suspensão por 1 cm2da área afetada sob a forma de um envoltório úmido ou sob a forma de cremes, pomadas, lenços úmidos, sprays antimicrobianos, emplastros umedecidos e pós umedecidos.
[0019] Para tratar infecções por leveduras em ferimentos não cicatrizados de acordo com esta invenção, a preparação é aplicada sob a forma de produtos cicatrizantes úmidos usando compressas úmidas idealmente contendo 30 células viáveis por 1 mL de suspensão aquosa em uma solução fisiológica e subsequente substituição de compressas úmidas idealmente contendo 30 células viáveis por 1 mL de suspensão aquosa em uma solução fisiológica após 8 horas durante um período de 4 dias. A forma cicatrizante úmida pode ser também aplicada nesta concentração sob a forma de cremes, pomadas, lenços úmidos, sprays antimicrobianos, emplastros umedecidos e a subsequente aplicação destes produtos cicatrizantes úmidos após 8 horas durante um período de 4 dias.
[0020] Para tratar infecções por leveduras na cavidade oral de acordo com esta invenção, a aplicação é realizada pelo enxágue com o produto em uma suspensão aquosa idealmente contendo 10 células viáveis por 1 mL de suspensão aquosa de aplicação, desde que as lavagens sejam realizadas pelo menos duas vezes por dia durante um período de 5 dias consecutivos. Células viáveis do micro-organismo Pythium oligandrumtambém podem ser usadas em pastas de dentes, géis ou sprays orais ou a suspensão aquosa pode ser aplicada no local sendo tratado usando uma seringa e agulha. Todas estas aplicações são realizadas pelo menos duas vezes por dia durante um período de 5 dias consecutivos.
[0021] A vantagem principal desta invenção é a viabilidade verificada das células do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum, o alcance de um efeito terapêutico significativo e de longa duração nas diagnoses monitoradas, a estabilidade da preparação, que pode ser controlada e armazenada durante um período mais longo, de até 2 anos, no estado seco e a possibilidade de dosagem mais precisa e controlada durante a aplicação. A capacidade comprovada do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum para suprimir e matar a levedura patogênica Candida albicans poderia atuar como um ponto de partida para o desenvolvimento de outras preparações para atuarem contra outras diagnoses, por exemplo, micoses vaginais (candidíases).
[0022] Outro mérito da invenção é, com relação ao nível atual de tecnologia e as preparações biológicas fungicidas aplicadas até agora, que a preparação de acordo com esta invenção para o tratamento de dermatofitoses e de infecções por leveduras sobre a pele e as membranas mucosas contém uma quantidade precisamente definida de substância biológica eficaz com base na medição da quantidade de células viáveis do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum, para a qual um método molecular preciso foi usado para determinar as células viáveis, e os métodos de aplicação da preparação, que foram clinicamente checados.
[0023] A invenção facilita a criação de uma geração nova de preparações que usam o micro-organismo Pythium oligandrum com viabilidade conhecida de oósporos dormentes, zoósporos encistados e micélio coenocítico viável em um valor baixo de contaminação microbiana. A preparação reivindicada pode ser incluída nas formulações de preparações aprovadas e notificadas com os efeitos novos curativos reproduzíveis nos testes laboratoriais e práticos nos Exemplos. A supressão do crescimento de dermatófitos e de leveduras patogênicas em um teste de suspensão de laboratório é descrita, assim como os efeitos durante a aplicação sobre dermatofitoses em animais, o tratamento de tinha ungueal em humanos e a supressão de leveduras patogênicas em ferimentos não cicatrizados em pacientes diabéticos e não diabéticos e na cavidade oral.
[0024] Várias soluções e metodologias foram adotadas em pesquisa prévia para determinar o parâmetro de viabilidade, embora nenhuma destas seja particularmente apropriada para este propósito. Estas incluem métodos com base em diferentes técnicas viáveis de coloração que funcionam bem para outros tipos de células, mas são conhecidos no micro-organismo Pythium oligandrum pelos seus procedimentos complicados e resultados nem um pouco confiáveis. O requerente desta invenção está ciente da técnica de plasmólise em concentrações altas de osmólitos, que produz resultados confiáveis, mas que é dependente da avaliação subjetiva do observador sob um microscópio. Além disso, ela fornece informação sobre a integridade do oósporo de Pythium oligandrum e não sobre a sua viabilidade.
[0025] Outro grupo de metodologias amplamente usadas é com base na plaqueação de uma preparação contendo as células viáveis de Pythium oligandrum em uma placa de Petri, e subsequente monitoração do número de colônias formadas. Infelizmente, a natureza biológica de Pythium oligandrum com seu estilo de vida ativo e alta velocidade de disseminação linear através do micélio coenocítico não é particularmente compatível com estes métodos, que são, sob outros aspectos, um padrão comum em microbiologia. Com frequência a possibilidade final para determinar a viabilidade nas preparações de oósporos dormentes do micro-organismo Pythium oligandrumé a monitoração microscópica direta de oósporos germinantes. Entretanto, isto é, ao contrário, demandante de tempo e da perspectiva da técnica experimental usada (gravação em vídeo).
[0026] Considerando-se os problemas especificados acima, grandes esperanças para determinar a viabilidade de células do micro-organismo Pythium oligandrumsão postas nas técnicas de genética molecular. Em nosso trabalho prévio, tentamos determinar a viabilidade usando um teste molecular que foi com base na amplificação por qPCR de duas sequências de gene alvo independentes para este micro-organismo (4). Contudo, foi comprovado que esta abordagem não foi adequada para numerosas preparações contendo um teor alto de células perecidas do micro-organismo Pythium oligandrum como resultado do background de tamanho considerável do método. Foi comprovado que a monitoração de determinados transcritos constitutivamente expressados apenas mediante células vivas do micro-organismo Pythium oligandrumé uma solução melhor sob esse aspecto, com o transcrito para β- tubulina, uma proteína abundantemente expressada deste micro-organismo, sendo enfim escolhido. O experimento inteiro demora uma semana, e inclui a cultura de oósporos dormentes em um meio contendo penicilina (para suprimir o crescimento de bactérias contaminantes) durante um período de 4 dias, com amostras coletadas a cada 24 horas e analisadas usando o método de RT-PCR para transcrição por meio de transcriptase reversa. Verificamos o valor da viabilidade pela extrapolação da curva exponencial, medida, linearizada da dependência do tempo de crescimento até o ponto zero.
[0027] A vantagem deste método de determinação é a determinação precisa da quantidade de células viáveis em qualquer preparação de micro-organismoPythium oligandrum independente de sua idade e do método de preparação. Precisa ser enfatizado que a viabilidade de células em preparações contendo micro-organismo Pythium oligandrum depende enormemente do método de sua preparação e de seu armazenamento. Por esta razão é quase impossível julgar este parâmetro a partir do número total de oósporos dormentes determinado microscopicamente na preparação (determinações diferentes relatam a quantidade de células viáveis do micro-organismoPythium oligandrum como de 0,01% a 30% da quantidade monitorada de oósporos dormentes, o que fornece dados altamente incertos). É evidente a partir das razões especificadas acima que a prática existente de expressar a potência biológica (doses eficazes) do micro-organismo Pythium oligandrum com base no número total declarado de oósporos sem determinar a viabilidade deles fornece resultados insatisfatoriamente reproduzíveis que são essencialmente difíceis de usar, e dos quais não é possível determinar a dosagem de aplicação ótima mesmo após correção da quantidade da substância aplicada. Quando se usa o método recentemente comprovado, os resultados dos testes laboratoriais e práticos foram consistentes e todos apontaram para a atividade ótima em diferentes aplicações práticas em suspensões contendo de 10 a 50 oósporos viáveis por mL de mistura de aplicação.
[0028] Sem considerar o ajuste ótimo do protocolo de aplicação, as medições da viabilidade de oósporos dormentes conduzidas pelo requerente, e descritas aqui adiante na invenção apresentada são também importantes para os testes de estabilidade na monitoração de lotes individuais de preparações. Nossas experiências práticas de testes de efetividade comprovam de modo inequívoco que quando há uma queda no número de oósporos dormentes abaixo de 330 por g de preparação (10 por mL de mistura aplicada), há um declínio em efetividade na eliminação de dermatófitos e leveduras, enquanto que um declínio neste valor abaixo de 33 por g (1 por mL de mistura aplicada) torna impossível garantir um efeito positivo. Ao contrário, a relação de concentração e efetividade nas preparações com um teor muito alto de oósporos dormentes não pode ser expressada de modo inequívoco, dependendo predominantemente da pureza de uma tal preparação em relação à pureza dos ingredientes de entrada e da meticulosidade da tecnologia observada. Quando substâncias contaminantes aparecem, um determinado declínio em efetividade pode ser observado nas preparações contendo mais que 33.000 oósporos dormentes por 1 g de mistura (1.000 por mL de mistura aplicada), provavelmente com base na influência interferente de impurezas desconhecidas. Um tal declínio em efetividade não foi observado em formas altamente puras do oomiceto micoparasítico Pythium oligandrum, embora experiência com este tipo de preparação seja atualmente muito limitada.
[0029] Outra desvantagem para testes rápidos da efetividade do micro-organismo Pythium oligandrum, em particular testes de suspensão conduzidos com a microconídia de dermatófitos ou suspensões de leveduras, é a lenta viabilidade de oósporos dormentes, que demora pelo menos 48 horas. Por esta razão, pareceria ser preferível substituir os oósporos dormentes por zoósporos encistados preparados de acordo com os métodos publicados com o propósito de conduzir tais testes. Averiguamos em uma comparação direta por meio de experimento que ambas as preparações, isto é,os zoósporos encistados recém-preparados e os oósporos dormentes com viabilidade determinada, apresentam capacidades idênticas para suprimir dermatófitos e leveduras patogênicas. Além disso, no caso de zoósporos encistados, é uma forma armazenável de células viáveis do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum.
[0030] Os métodos propostos são altamente compatíveis com os requisitos exigidos para testar preparações medicinais microbianas vivas, nos quais são exigidas evidência para colonização e uma descrição de atividades biológicas, metabólicas, morfológicas e outras atividades no local da aplicação alvo. O método de acordo com esta invenção já tem sido aplicado com sucesso, sob esse aspecto, no tratamento de dermatofitoses em animais, onde torna-se possível, inter alia, esclarecer a função do micro-organismo Pythium oligandrum na eliminação de disbiose e no estabelecimento de equilíbrio microbiano fisiológico, normal, sobre a pele e em outros sítios de aplicação, por exemplo as membranas mucosas (4, 9).
[0031] A solução técnica é adicionalmente descrita em detalhe em modalidades exemplificadoras e explicada em mais detalhe nos desenhos esquemáticos em anexo, nos quais: a Figura 1 mostra um teste de laboratório da efetividade de supressão de dermatófitos e de leveduras dependendo da quantidade de zoósporos encistados viáveis adicionados do micro-organismo Pythium oligandrum, por meio do qual se refere em mais detalhe a
[0032] a Figura 1A e a Figura 1B, representando um teste de efetividade com o uso do dermatófito Trichophyton interdigitale var. mentagrophytes da cepa de coleção DMF2374 após 24 e 48 horas de incubação, a Figura 1C e a Figura 1D, representando um teste de efetividade com o uso do dermatófito Microsporum canis da cepa de coleção CCM8353 após 24 e 48 horas de incubação, a Figura 1E e a Figura 1F, representando um teste de efetividade com o uso do dermatófito Epidermophyton floccosum da cepa de coleção PL231 após 24 e 48 horas de incubação, a Figura 1G e a Figura 1H, representando um teste de efetividade com o uso da levedura patogênica Candida albicans da cepa de coleção CCF8261 após 24 e 48 horas de incubação, a Figura 2 mostra os resultados clínicos no tratamento de dermatofitose experimental de porquinhos-da-índia, em que a parte superior da Figura mostra os resultados para porquinhos-da-índia tratados com um placebo e a parte inferior da Figura mostra os resultados para porquinhos-da- índia tratados com o uso de uma suspensão de acordo com a modalidade exemplificadora 1 desta invenção, e em mais detalhe em
[0033] a Figura 2A, mostrando as fotografias do dorso de um porquinho-da-índia sob anestesia com a aplicação de um placebo no 16° dia de tratamento com vermelhidão característica da pele nos locais infectados, a Figura 2B, mostrando uma seção histológica da pele de um animal com a aplicação de um placebo, mostrando a proliferação característica de queratinócitos na camada superior da pele em reação à irritação pelo dermatófito não tratado, a Figura 2C, representando o índice clínico de dermatofitose com a aplicação de um placebo nos dias individuais de tratamento, marcados como o índice de vermelhidão (a coluna cinza clara) e o índice de dano à pele (a coluna cinza escura), a Figura 2D, mostrando uma fotografia do dorso de um porquinho-da-índia sob anestesia com a aplicação de uma suspensão de acordo com a modalidade exemplificadora 1 desta invenção no 16° dia de tratamento com um nível mais baixo de vermelhidão da pele nas áreas afetadas, a Figura 2E, representando uma seção histológica da pele de um animal com a aplicação de uma suspensão de acordo com a modalidade exemplificadora 1 desta invenção, mostrando um nível significativamente mais baixo de proliferação de queratinócitos em um animal tratado com sucesso, a Figura 2F, representando o índice clínico de dermatofitose de animais com a aplicação de uma suspensão de acordo com a modalidade exemplificadora 1 desta invenção nos dias individuais de tratamento, marcados como o índice de vermelhidão (a coluna cinza clara) e o índice de dano à pele (a coluna cinza escura).
[0034] A solução que propomos é tornada possível com base em análises laboratoriais e testes práticos adicionais de preparações para medicina humana e veterinárias de acordo com esta invenção, desenvolvido em CZ 302297, cuja formulação detalhada foi agora especificada com relação ao uso no tratamento de dermatofitoses e tinha ungueal, a eliminação de leveduras dos ferimentos não cicatrizados, e da cavidade oral. A invenção apresentada é adicionalmente descrita em detalhe nas seguintes modalidades exemplificadoras, mas não deve se limitar a elas. Estas modalidades exemplificadoras são apresentadas para garantir que a descrição seja completa e descreva a essência da invenção na extensão das reivindicações patenteadas.
[0035] Pythium oligandrum de cepa M1 (cepa DV74, cujo protocolo sequencial é encontrado na página seguinte) foi mantido em ágar e a cultura de partida foi preparada por uma cultura líquida. Grãos de painço (Panicum miliaceum L.) esterilizados foram inoculados com a cultura líquida. A cultura procedeu sob condições estéreis durante um período de cerca de 7 dias e a biomassa úmida foi subsequentemente cuidadosamente secada em pó contendo partículas de um tamanho médio de 35 a 50 μm. A quantidade de oósporos foi estimada sob o microscópio, e a preparação foi padronizada de acordo com as condições de CZ 302297 para um teor de 7 ± 1 x 106oósporos por 1 g.
[0036] Para determinar o número de células viáveis do microorganismoPythium oligandrum, o requerente da invenção apresentada desenvolveu um procedimento original que é conduzido usando um teste genético da preparação sob a forma de uma suspensão aquosa de acordo com esta invenção, que mede o nível de expressão do gene constitutivo para a β- tubulina do micro-organismo Pythium oligandrum mantido em um meio rico em nutrientes em uma atmosfera padrão a 30°C.
[0037] A quantidade de células viáveis no material analisado foi determinada usando o seguinte procedimento: 1 g de substância secada foi pesado e misturado em 100 mL de água em um misturador de cozinha. 0,5 mL desta suspensão foi misturado com 4,5 mL de meio de cultura em uma placa de cultura de seis poços incubada a 30°C, em que amostras de 50 μL foram coletadas 48 horas, 72 horas e 96 horas após o início da incubação. Ácidos nucleicos foram extraídos e o extrato foi diluído 50 x em água isenta de nuclease. Isto foi seguido por transcrição reversa e quantificação por PCR de acordo com o protocolo padrão em uma mistura de reação contendo 4 μL do extrato, 1 μL de uma mistura de iniciadores para a amplificação da β- tubulina de Pythium oligandrum (3) e 5 μL de mistura de enzima. A curva exponencial obtida foi linearizada e extrapolada para o tempo zero inicial. A viabilidade averiguada nesta maneira foi de 41.700 por g de substância no caso de batelada de micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum (A), 12.500 por g de substância no caso de lote de micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum (B) e 8.300 por g de substância no caso de batelada de micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum (C). Nota: As letras A, B e C entre parênteses nesta e em outras modalidades marcam os lotes individuais do micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum tendo as viabilidades descritas acima. O protocolo sequencial do Pythium oligandrum M1 aplicado é mostrado abaixo: Pythium oligandrum M1_ITS4_rRNA da cepa DV74 testada
[0038] ATCATTACCACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGT TATAACTATGTTCTGTGCTTCGTCGCAAG ACTTGAGGCTGAACGAAGGTGAGTCTGCGTCTATTTT GGATGCGGATTTGCTGATGTTATTTTAAA CACCTATTACTTAATACTGAACTATACTCCGAATACG AAAGTTTTTGGTTTTAACAATTAACAACT TTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATAAGA ACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAA TTGCAGAATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCA TATTGCACTTTCGGGTTATGCCTGGAAGT ATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGCCTTT CTTTTTTTGTGTAGTCAAAATTAGAGATG GCAGAATGTGAGGTGTCTCGCGCTGTCTTTTTAAAGA TGGTTCGAGTCCCTTTAAATGTACGTTGA TTCTTTCTTGTGTCTGCGAATTGCGATGCTATGCTCTT TGTGATCGGTTTAGATTGCTTTGCGCTG GTGGGCGACTTCGGTTAGGACATATGGAAGCAACCT CAATTGGCGGTATGTTCGGCTTTGCCTGAC GTTAAGCTAAGCGAGTGTAGTTTTCTGTCTTTTCCTTG AGGTGTACCTGTCGTGTGTGAGGTTGAT TTAGGCTATATGGTTGCTTGGTTGTGTGGTTTAGCGTT TTCAGACGCCTGCTTCGGTAGGTAAAGG AGACAACACCAATTTGGGACTGAGAGTTTACT
[0039] 1 atggaaggta ttattaactt tcatcatgat ttagtatttt ttttaattat tgtgactgtt 61 tttgtttgtt ggttattatt tagagtaatc gtattattcg atgaaaaaaa aaacccaata 121 cctgctacat ttgtacatgg agcaactatt gaaattattt ggacaacaat tccagcatta 181 attttattaa ccgtagcagt tccatctttt gctttattat attcaatgga tgaaattatt gatccaatta taactttaaa agtaataggt agtcaatggt actggagtta 241 tgaatattct 301 gataatttag aatttgcaga tgaaccttta atttttgata gttacatggt tcaagataat 361 gacttagaaa taggacaatt taggttatta gaagtagaca accgtgttgt tgtaccaact 421 aatagccata ttagagtttt aataacagct tctgacgttt tacattcatg ggctataccc 481 tctttaggtt taaaattaga tgcttgtcca ggtcgtttaa atcaaacttc aatgtttatt 541 aaaagagaag gtgtatttta cggtcaatgt agtgaaatat gtggtataaa tcatggtttt 601 atgccaatag ttgttgaagc agtttcatta gaagattatt tagtttggtt aaaaaacaa 661 attaattttg attttaatgt ataa a) Preparação e aplicação de mistura para tratar dermatofitoses e tinha ungueal
b) Preparação e aplicação de mistura para eliminar leveduras em ferimentos não cicatrizados
c) Preparação e aplicação de mistura para eliminar leveduras na cavidade oral
[0040] A aplicação do micro-organismo Pythium oligandrum sob a forma de zoósporos encistados preparada de acordo com o protocolo publicado (5) foi escolhida para testes de efetividade em laboratório. Foi escolhido o método de teste de suspensão, que é preferido para a verificação das atividades antimicrobianas de outras preparações (1). Zoósporos foram encistados por turbilhonamento durante um período de 2 minutos, e mantidos sob estas condições a 16oC até o início do experimento. Suspensões de microconídia dos dermatófitos Trichophyton interdigitale var. mentagrophytes DMF2374, Microsporum canis CCM8353 e Epidermophyton floccosum PL231 e uma suspensão de levedura Candida albicans CCM8261 foram preparadas de acordo com as metodologias publicadas (7, 1). A suspensão de zoósporos e a suspensão de microconídia ou de células de levedura foram diluídas para a concentração requerida, e as células foram cultivadas em uma suspensão em placas de plástico de seis poços durante um período de 48 horas a 30°C. Amostras para a determinação do número de células vivas pelo método de cultura foram coletadas após 24 e 48 horas.
[0041] O resultado do experimento é mostrado na Figura 1. É mostrado que em todos os casos testados, a quantidade de zoósporos encistados foi ótima para suprimir o crescimento dos dermatófitos e da levedura patogênica Candida albicans sendo estudados a entre 10 e 50 células viáveis por 1 mL de solução examinada com dermatófito ou levedura. Se a quantidade de zoósporos encistados foi mais baixa, a supressão efetiva do crescimento não foi garantida. Surpreendentemente, nem mesmo uma quantidade mais alta de zoósporos resultou em resultados melhores na supressão do crescimento dos micro-organismos selecionados, este crescimento sendo idêntico ou mais elevado.
[0042] Este teste foi conduzido de acordo com o protocolo publicado (4, 7) com infecção pela cepa verificada de Trichophyton interdigitale var. mentagrophytes DMF2374. Uma mistura idêntica àquela na modalidade exemplificadora desta invenção foi usada como um placebo durante a aplicação, a biomassa de cultura sendo substituída por água e uma substância fúngica de acordo com a modalidade exemplificadora 1c desta invenção como a substância experimental.
[0043] O resultado deste teste é descrito na Figura 2. A aparência geral de um porquinho-da-índia tratado, na parte inferior da Figura 2, e a histologia da pele do animal e o valor dos índices clínicos de dermatofitose do animal mostram claramente o efeito clínico significativo no tratamento de dermatofitose experimental em comparação com um animal tratado usando um placebo do qual foi omitida a substância ativa Pythium oligandrum.
[0044] A Tabela 4 nas páginas seguintes mostra os resultados de um estudo envolvendo 21 pacientes afetados por tinha ungueal em comparação com outras dermatofitoses. Antes da aplicação da preparação de acordo com esta invenção, todos os 21 pacientes tinham verificações positivas por microscópio, e a ocorrência de pelo menos um dermatófito, em alguns casos de dois dermatófitos, foi confirmada em todos os pacientes pela cultura. A ocorrência da levedura patogênica Candida albicans foi, sem dúvida, a mais comum dentre a microbiologia acompanhante. As mais comuns das diagnoses acompanhantes foram diabetes, tinha do pé e tinha interdigital do pé, e, em um caso, uma doença fúngica da mão foi observada. Uma ou mais unhas no pé estavam afetadas em uma extensão média de 1,5 da área da unha.
[0045] A aplicação da preparação de acordo com a modalidade exemplificadora 1c foi conduzida em todos os pacientes no estudo sob a forma de unhas postiças (nail wraps) noturnas durante duas noites consecutivas com aplicação repetida após 14 dias e um mês.
[0046] Uma avaliação de efetividade foi conduzida nove meses após o fim do estudo, que é 10 meses após o início do estudo. Os pacientes foram, em sua maioria, negativos sob o microscópio, enquanto a cultura revelou que dois pacientes tiveram ocorrência esporádica residual do dermatófito Trichophyton rubrum, este dermatófito ocorreu em uma extensão elevada em um paciente, a levedura Candida albicans ocorreu esporadicamente em um paciente. No todo, então, o nível de tratamento micológico pôde ser avaliado como altamente satisfatório, com a resolução da carga micológica em 95% dos pacientes e tratamento clínico em média em um nível de 2,1 na escala de seis pontos (1 - tratamento completo sem malformação de unhas, 6 - deterioração na condição). No total, tinha ungueal foi curada em 12 pacientes sem nenhuma malformação das unhas (54,5 %), 1 paciente foi tratado com malformação residual (4,5%), melhora clínica maior que 50% foi evidente em 6 pacientes (27,3 %), houve melhora insignificante de até 50% em um paciente (4,5 %) e não houve alteração na condição clínica em dois pacientes mesmo 9 meses após o término da aplicação (9,2 %), embora a documentação médica sugerisse uma alta possibilidade de reinfecção nestes casos. Não houve pacientes que sofreram de deterioração na condição clínica.
Abreviações usadas: Nº – número do paciente em estudo, Inic – iniciais do paciente, Micr – microscópio em KOH, Cult – resultado da cultura, Unha – área de unha afetada, Outras – outra observações médicas, Micol – avaliação do tratamento micológico final, Clin – avaliação clínica final do médico em uma escala de seis pontos, y – resultado positivo, n – resultado negativo, Ab – Arthroderma benhamiae, Tr – Trichophyton rubrum, Ca – Candida albicans, Ef - Epidermophyton floccosum, (m) – ocorrência massiva, (a) – ocorrência abundante, (s) – ocorrência esporádica, dm – diabetes melito, Ti – tinha interdigital, hm – micose da mão, tp – tinha do pé.
[0047] A influência da aplicação da preparação de acordo com esta invenção em um grupo de 12 pacientes com ferimentos não cicatrizados complicados pela infecção por levedura com a levedura patogênica Candida albicans foi monitorada em um estudo prático preliminar. Seis dos pacientes sofriam de diabetes, seis não sofriam de diabetes. A idade média dos pacientes no grupo diabético foi de 77,5 anos e no grupo não diabético foi de 57,2 anos. Há uma predominância em mulheres, que, conforme conhecido, têm uma suscetibilidade maior para a ocorrência de úlceras varicosas e de ferimentos não cicatrizados. Resulta ainda da anamnese do paciente que não havia tido progresso no tratamento de ferimentos não cicatrizados durante um período mínimo de 6 meses após o início do tratamento usando as preparações médicas comumente utilizadas, incluindo antibióticos, e durante um período ainda mais longo em alguns (até 2 anos).
[0048] Tratamento úmido foi fornecido aos pacientes com o uso de uma suspensão preparada usando as preparações de acordo com a modalidade exemplificadora 1d como parte de cicatrização úmida. A aplicação de bandagens curativas foi substituída a cada 8 horas durante um período total de 4 dias. A aplicação descrita reduziu a carga microbiológica muito significativamente, pelo fato de que a ocorrência da levedura patogênica foi reduzida a cerca de 95,3% no caso de pacientes diabéticos e a cerca de 75,3% em pacientes não diabéticos, uma redução de 85,3% sendo observada durante o estudo completo. Houve uma melhora no quadro clínico de infecção com base na avaliação dos médicos participantes que avaliaram a extensão do processo inflamatório, a intensidade de descarga de pus etc. de 78,3% em pacientes diabéticos e de 67,2% em pacientes não diabéticos, significando uma melhora de 72,8% no total durante o estudo completo. Foi verificada uma correlação altamente significativa entre a redução da carga microbiana e a melhora do quadro clínico de infecção microbiana, que é uma verificação muito significativa dentro do contexto da literatura médica publicada.
[0049] Foi conduzido um estudo dentre 12 pacientes com a partir de leveduras patogênicas na cavidade oral em ambulatórios de higiene dental sob a supervisão dos estomatologistas.
[0050] Após amostragem microbiológica e esclarecimento da natureza da diagnose, os pacientes foram informados e receberam um pacote da preparação para eliminar leveduras patogênicas na cavidade oral contendo 5 comprimidos efervescentes de acordo com a modalidade exemplificadora 1d. Após a higiene oral no início da noite, os pacientes lavaram cuidadosamente a cavidade oral e seguiram isto pelo enxágue com a preparação durante pelo menos cinco minutos sob a condição de que ela contivesse uma média de 10 oósporos viáveis do micro-organismo Pythium oligandrum após ativação prévia em água morna. A cavidade oral não foi enxaguada após isto de modo que o restante da solução de aplicação permanecesse dentro da cavidade oral durante a noite. A aplicação foi repetida na manhã e os pacientes continuaram nesta maneira durante um período de 5 dias, usando os 5 comprimidos efervescentes no pacote.
[0051] Monitoração clínica subsequente e avaliação da efetividade então prosseguiram durante cerca de 6 meses após a aplicação. A levedura patogênica foi eliminada da cavidade oral em 67,1% dos casos, isto acompanhado por uma melhora média, a cerca de 66,8%, na condição clínica dos pacientes afetados. Pacientes sofriam predominantemente de inflamações repetidas da cavidade oral e de doenças periodontais. Foi identificada de novo uma correlação entre a redução na ocorrência de leveduras na cavidade oral e uma melhora na condição clínica.
[0052] A preparação para o tratamento de dermatofitoses e de infecções por leveduras sobre a pele e as membranas mucosas pôde ser usada para suprimir os sintomas associados com infecção por dermatófitos ou leveduras sobre a pele e as membranas mucosas, como sintomas de cheiro socialmente desagradável, perspiração excessiva do pé, irritação e queimação, e a supressão e a eliminação da ocorrência de dermatófitos e de leveduras em ferimentos não cicatrizados, na cavidade oral, sobre a pele, sobre as membranas mucosas urogenitais, no cabelo e em outros locais afetados por estes micro-organismos.
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Claims (3)
1. Preparação contendo o micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum cepa DV74 para o tratamento de dermatofitoses e de infecções por leveduras sobre a pele e as membranas mucosas caracterizadapelo fato de que a preparação está na forma de suspensão aquosa e contem uma mistura seca contendo de 0,1 a 99,9% em peso de micro-organismo micoparasítico Pythium oligandrum e de 0,1 a 99,9% em peso de substâncias auxiliares, contendo pelo menos um componente de um grupo compreendendo absorvente, tampão, umectante, desodorante e aroma, e ainda água ou solução fisiológica em tal quantidade, que a preparação contem 1 a 10 x 106 células viáveis do micro-organismo Pythium oligandrum por 1 mL de suspensão aquosa no sítio de aplicação, pela qual as células viáveis do micro-organismo Pythium oligandrum compreendendo oósporos dormentes, zoósporos encistados e micélio coenocítico viável.
2. Preparação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que contém de 1 a 500 células viáveis do micro-organismo Pythium oligandrum por 1 mL de preparação aplicada em uma suspensão aquosa.
3. Preparação de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que contém de 10 a 50 células viáveis do micro-organismo Pythium oligandrum por 1 mL de preparação aplicada em uma suspensão aquosa.
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