CZ307642B6 - Přípravek s mykoparazitickým mikroorganizmem Pythium oligandrum pro užití při léčbě dermatofytos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích - Google Patents

Abstract

Přípravek s mykoparazitickým organismemkmene DV 74 - pro užití při léčbě dermatofytos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích, přitom přípravek ve formě vodné suspenze zahrnuje: suchou směs, obsahující 0,1 až 99,9 % hmotn. mykoparazitického mikroorganismua 0,1 až 99,9 % hmotn. pomocných látek, obsahujících nejméně jednu složku ze skupiny zahrnující adsorbent, pufr, zvlhčovač, deodorant a aroma, a dále vodu/fyziologický roztok v takovém množství, aby přípravek obsahoval 1 až 10 x 10, s výhodou 10 až 50 viabilních buněk mikroorganismuna 1 ml vodné suspenze, dle stanovení genetickým testem měřením hladiny exprese konstitutivního genu pro β-tubulin.

Description

Přípravek s mykoparazitickým mikroorganizmem Pythium oligandrum pro užití při léčbě dermatofytos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích

Oblast techniky

Vynález se týká přípravku s mykoparazitickým mikroorganizmem Pythium oligandrum pro užití při léčbě dermatofytos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích. Přípravek je ve formě vodné suspenze, připravené ze suché směsi, obsahující 0,1 až 99,9 % hmotn. mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum a 0,1 až 99,9 % hmotn. pomocných látek, obsahujících nejméně jednu složku ze skupiny zahrnující adsorbent, pufir, zvlhčovač, deodorant a aroma.

Dosavadní stav techniky

Dermatolytosy jsou plísňové infekce způsobované dermatofyty, keratinofilními houbami napadajícími zejména kůži, nehty a vlasy a vyznačujícími se dlouhou inkubační dobou. Ta je umožněna zejména minimální reakcí imunitního systému hostitele v důsledku účinného maskování povrchů těchto keratinofilních hub před rozpoznáním imunitními molekulami. Keratinofilní houby užívají bílkovinu keratin vyskytující se v kůži na celém povrchu lidského těla jako svoji důležitou potravu, keratin jsou schopny účinně enzymaticky degradovat a natrávené štěpy metabolizovat. Tyto plísně jsou zastoupeny rody Trichophyton, Epidermophyton a Microsporum, přičemž molekulární povaha faktorů umožňujících těmto mikroorganizmům realizovat svůj životní styl je již dobře objasněná (6). Mykózy kůže a sliznic se vyznačují rozdílnou manifestací zahrnující zpravidla svědění, zčervenání, odlupující se šupinky nebo i rozsáhlejší plochy kůže, někdy je v oblastech se zvýšenou potivostí kůže bílá a macerovaná. Častými doprovodnými symptomy dále jsou zvýšená potivost a sociálně obtěžující pachové symptomy svědčící o pokročilé dysbiose.

Synonymem pro dermatofytosu je pojem tinea, kdy v závislosti na své anatomické lokalizaci jsou nejčastějšími formami dermatolytos tinea pedis (na nohách), tinea unguium (pod nehty), tinea corporis (plísňové infekce na těle, nejčastěji nevlasaté části trupu a proximální část dolních končetin), tinea cruris (v tříselné oblasti nejčastěji u mladých mužů v letních měsících a po zapaření v těsném oděvu), tinea capitis (okrouhlá ložiska krátce ulámaných vlasů ve kštici, zejména u dětí přicházejících do styku se zoofilními dermatolýty jako je Microsporum canis). Ačkoliv nepředstavují zpravidla dermatolytosy smrtelná onemocnění, jedná se o infekce velmi rozšířené postihující významné procento populace a svými symptomy znepříjemňují pracovní a společenské uplatnění postižených jedinců.

Oportunní mikrobiální kvasinkové infekce jsou poměrně rozšířenou chorobou moderního člověka, při níž se běžně neškodné komensální kvasinky žijící na kůži a sliznicích člověka v důsledku oslabení imunitního sytému při stresech, pracovním vypětí, virových infekcích nebo jiných zátěžových stavech aktivují a přecházejí do agresivní formy charakterizované odlišnou morfologií i metabolismem. Výzkum se převážně soustřeďuje na nejběžnější patogenní kvasinku Candida albicans a její příbuzné. Molekulární a genetický výzkum v poslední době přispěl k identifikaci jednotlivých faktorů odpovědných za toto neobvyklé chování patogenních kvasinek, které pak představují důležité cíle pro nově vyvíjené terapie (2).

Terapiím dnes dostupných pro léčbu dermatofytámích a kvasinkových infekcí vévodí chemické protiplísňové prostředky ze skupiny azolů, allylaminů a echinokandinů, které jsou však nechvalně proslulé jak svoji nízkou účinností, tak četnými vedlejšími účinky znevýhodňující široké skupiny uživatelů (starší osoby, osoby s cukrovkou nebo onemocněním jater, osoby s oslabenou imunitou). Terapie pomocí těchto prostředků jsou ovšem též velmi drahé a mají pouze dočasnou účinnost. V žádném případě si pak nejsou schopné poradit s dysbiosami (porušením

- 1 CZ 307642 B6 normální fyziologické mikroflory) spojenými s tímto typem onemocnění. Proto zůstává moderní dlouhodobě účinná léčba stabilizující normální mikroflóru velkou výzvou.

Použití přirozených biologických prostředků pro léčbu dermatofytos a kvasinkových infekcí bylo doposud rozpracováno pouze v minimální míře. Problematikou použití mikroorganizmu Pythium oligandrum pro ochranu kůže se zabývá užitný vzor CZ 9883U pracovníků firmy Biopreparáty spol. s r.o., původců Veselý a další, s prioritním datem 18. 11. 1999. Autoři používají suspenzi oospór v množství nepřesahujícím 2 x 10⁵ na 1 g prostředku pro řešení některých kožních problémů u 9 skupin pacientů. V tomto případě se však nejedná, jak se autoři CZ 9883U mylně domnívali, o eliminaci původců dermatofýtos, neboť pro takové tvrzení chybí v dokumentu jakékoliv důkazy. Autoři předkládají laboratorní výsledky účinku mikroorganizmu Pythium oligandrum na mikroorganizmus Scopulariopsis breviacaulis, tento mikroorganizmus je však půdní saprofytický mikroorganizmus (nikoliv dermatofýt). U žádného z pacientů sledovaných v CZ UV9883 pak nebylo prováděno mikrobiologické vyšetření a tudíž není možné jejich faktickou afekci dermatofyty nijak prokázat. Pokud jde o deklarované léčebné účinky, není v dokumentu žádné zmínky o tom, že byli pacienti lékařsky sledování, v řadě případů se u popisovaných účinků jedná spíše o jejich subjektivní pocity (změna barvy nehtu, zmizení bolesti). Patent CZ 302297 přihlašovatele tohoto vynálezu použil poprvé po náročných toxikologických testech vyšší koncentraci oospór (více než 2 x 10⁵ na 1 g prostředku), nezabývá se však podrobněji problematikou dermatofýtos ani kvasinkových infekcí u lidí. Naopak výhodou tohoto řešení je, že byla poprvé objasněna schopnost mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum působit i v jiném prostředí než v prostředí vodných suspenzí, jako je prostředí vytvořené v mastech, olejích a jiných aplikačních formách. Dále byla poprvé zdůrazněna významnost i jiných forem viabilních buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum než jsou dormantní oospory, zejména pak encystováných zoospór a viabilních fragmentů mycelia jako forem mikroorganizmu Pythium oligandrum nejvíce účinných při přímém mykoparazitismu. Užitný vzor CZ 28816 U přihlašovatele tohoto vynálezu řeší detailně problematiku oportunních mikrobiálních infekcí pomocí duálních mikrobiálních preparátů, tyto však jsou charakterizovány klasickým způsobem pomocí kolonie tvořících jednotek (KTJ), jejichž použití není v případě mikroorganizmu Pythium oligandrum bez úskalí.

Nevýhodou dosavadního stavu techniky a významným omezením na cestě k vývoji léčiva tedy zůstává ne zcela dostatečné pochopení povahy účinné látky Pythium oligandrum, jejíž množství v přípravcích není možno obvykle přesně určit. Tudíž, obtížně reprodukovatelné může být i definování síly a účinnosti takovýchto přípravků.

Podstata vynálezu

Uvedené nevýhody se odstraní nebo podstatně omezí přípravkem s mykoparazitickým organismem Pythium oligandrum pro užití při léčbě dermatofytos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích podle tohoto vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že přípravek ve formě vodné suspenze zahrnuje suchou směs obsahující 0,1 až 99,9 % hmotn. mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum a 0,1 až 99,9 % hmotn. pomocných látek, obsahujících nejméně jednu složku ze skupiny zahrnující adsorbent, pufr, zvlhčovač, deodorant a aroma, a dále vodu/fýziologický roztok v takovém množství, aby přípravek obsahoval 1 až 10 x 10⁶, s výhodou 10 až 50 viabilních buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum na 1 ml aplikované vodné suspenze. Viabilní buňky mikroorganizmu Pythium oligandrum zahrnují dormantní oospory, encystované zoospory a viabilní coenocytické mycelium (viabilní bezpřihrádkové mycelium).

Viabilitou buněk mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum v předkládaném vynálezu je míněna vzcházívost stanovená genetickým testem přípravku měřením hladiny exprese konstitutivního genu pro β-tubulin mikroorganizmu Pythium oligandrum (11), udržovaného v médiu bohatém na živiny, při 30 °C v běžné atmosféře.

-2CZ 307642 B6

Užití - aplikace přípravku podle tohoto vynálezu, zahrnuje následné kroky: a) příprava vodné suspenze mechanickou dispergací suché směsi v definovaném objemu vlažné vody nebo fyziologického roztoku pro získání obsahu 1 až 10 x 10⁶ viabilních buněk, s výhodou 10 až 50 viabilních buněk, mykoparasitického mikroorganizmu Pythium oligandrum na 1 ml vodné suspenze b) aplikace takto získané vodné suspenze v závislosti na typu léčené diagnózy s použitím doporučeného množství viabilních buněk mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum; kolonizace viabilních buněk mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum, dle léčené diagnózy; d) namnožení viabilních buněk mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum, dle léčené diagnózy pro eliminaci dermatofytů nebo kvasinek, a e) následná sporulace a současně eliminace přípravku, umožňující stabilizaci a rozvoj normální mikroflóry pro zajištění dlouhodobého léčebného účinku.

Aplikace přípravku podle vynálezu do mastí, olejů, gelů, sprejů, zvlhčených náplastí, zásypů se provádí známým způsobem odborníkovi v oboru s cílem kolonizovat postižená místa aplikace množstvím viabilních buněk, odpovídajícím požadavkům diagnóz.

Fyziologickým roztokem známým odborníkovi v oboru se rozumí např. nejběžnější roztok NaCl o koncentraci 9 g/1 litr, nebo fýziologický roztok pufirovaný např. fosfátem sodným v množství 10 mg/11 - tzv. PBS.

Kolonizaci a namnožení mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum na místě aplikace mohou zajistit jakékoliv životaschopné (viabilní) buňky. V přípravcích podle tohoto vynálezu jsou kvantitativně nejvíce zastoupené dormantní (spící) oospory schopné poskytnout viabilní buňky podle místních podmínek za 24 až 48 hodin po zvlhčení suché směsi. Přípravky podle tohoto vynálezu dále obsahují encystované zoospory a viabilní coenocytické mycelium, které jsou schopné poskytnout viabilní buňky obvykle již za 20 minut po zvlhčení suché směsi.

Kolonizace viabilních buněk mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum, na místě aplikace dle léčené diagnózy, probíhá způsobem známým odborníkovi v oboru. Podle našich zkušeností u přípravků podle předloženého vynálezu jsou všechny tyto procesy závislé na přítomnosti cílových mikroorganizmů, jako jsou dermatofýt nebo kvasinky na místě aplikace. Pokud jsou tyto cílové mikroorganizmy pro mykoparazitický mikroorganizmus Pythium oligandrum přítomné, dochází ke kolonizaci viabilních buněk během jedné až dvou hodin jejich přichycením na tyto cílové mikroorganizmy, tj. dermatofýty nebo kvasinky. Během jednoho až dvou dnů pak dochází k namnožení mikroorganizmu Pythium oligandrum s využitím živin poskytovaných cílovými mikroorganizmy. K vymizení viabilních buněk z místa aplikace dochází asi do dvou týdnů po eliminaci cílových mikroorganizmů. V době, kdy jsou již živiny pocházející z cílových mikroorganizmů vyčerpány, pozoruje se na místě aplikace přechod mikroorganizmu Pythium oligandrum do klidové formy, tedy sporulace. Takto vzniklé dormantní oospory na kůži a sliznicích dlouhodobě nepřežívají, neboť jsou průběžně odstraňovány dynamickými procesy na těchto aplikačních místech, tj. např., odlučováním odumřelých buněk z postiženého místa a uvolňováním sekretů na slizních. Empiricky bylo zjištěno, že mykoparazitický mikroorganizmus Pythium oligandrum odcházející z místa aplikace vytváří podmínky pro rozvoj a stabilizaci normální mikroflory.

Při aplikaci přípravku podle vynálezu, doporučené množství viabilních buněk mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum, bylo přihlašovatelem empiricky zjištěno, že při léčbě dermatofytos a tinea unguim je doporučené množství viabilních buněk v 1 ml vodné suspenze 50, zatímco při eliminaci kvasinek v nehojících se ranách 30, při eliminaci kvasinek v dutině ústní 10.

Pro léčbu dermatofytos ve formě tinea unguium podle tohoto vynálezu se aplikuje přípravek obsahující nejlépe 50 viabilních buněk na 1 ml přípravku ve vodné suspenze se aplikuje v množství 0.15 ml této suspenze na 1 cm² postižené plochy ve formě vlhkého zábalu, nebo ve

-3CZ 307642 B6 formě krémů, mastí, vlhčených ubrousků, antimikrobiálních sprejů, zvlhčených náplastí, zásypů a posypů.

Pro léčbu kvasinkových infekcí v nehojících se ranách podle tohoto vynálezu se přípravek aplikuje formou prostředků vlhkého hojení pomocí vlhkých obkladů obsahujících nejlépe 30 viabilních buněk na 1 ml vodné suspenze ve fyziologickém roztoku a následně výměnou vlhkých obkladů obsahujících nejlépe 30 viabilních buněk na 1 ml vodné suspenze ve fyziologickém roztoku po 8 hodinách po dobu 4 dní. Forma vlhkého hojení může být aplikována v této koncentraci též ve formě krémů, mastí, vlhčených ubrousků, antimikrobiálních sprejů, zvlhčených náplastí, a následnou aplikací těchto prostředků vlhkého hojení po 8 hodinách po dobu 4 dní.

Pro léčbu kvasinkových infekcí v dutině ústní podle tohoto vynálezu se aplikace provádí výplachy přípravkem ve vodné suspenzi, obsahující nejlépe 10 viabilních buněk na 1 ml aplikační vodné suspenze, přičemž výplachy se provádí nejméně dvakrát denně po dobu 5 po sobě následujících dní. Viabilní buňky mikroorganizmu Pythium oligandrum mohou být použity též do zubních past, gelů, ústních sprejů, nebo zavést vodnou suspenzi na léčená místa pomocí injekční stříkačky a jehly. Všechny tyto aplikace se provádí nejméně dvakrát denně po dobu 5 po sobě následujících dní.

Hlavní výhodou tohoto vynálezu je ověřená viabilita buněk mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum, dosažení významného a dlouhodobého terapeutického efektu u sledovaných diagnóz, stabilita přípravku, který se v suchém stavu může tímto způsobem kontrolovat a skladovat delší dobu až 2 roky, a dále i možnost přesnějšího a kontrolovaného dávkování při aplikacích. Prokázaná schopnost mykoparazitického mikroorgnizmu Pythium oligandrum potlačovat a zabíjet patogenní kvasinku Candida albicans může být základem vývoje dalších přípravků proti jiným diagnózám, např. vaginálním mykózám (candidosám).

Další předností vynálezu je, že vzhledem k dosavadnímu stavu techniky a dosud uplatňovaných řešení fůngicidních biologických přípravků, přípravek podle tohoto vynálezu pro léčbu dermatofýtos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích obsahuje přesně definované množství účinné biologické látky na základě měření množství viabilních (vzcházivých) buněk mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum, k čemuž byla použita přesná molekulární metodika jejich stanovení viabilních buněk, a též způsoby aplikace přípravku, které byly klinicky ověřené.

Vynález umožňuje vytvoření nové generace přípravků využívajících mikroorganizmu Pythium oligandrum se známou vzcházivostí (viabilitou) dormantních oospór, encystovaných zoospor a viabilního coenocytického mycelia při nízké hodnotě mikrobiální kontaminace. Nárokovaný přípravek je možno začlenit do receptur schválených a notifikovaných přípravků s novými a reprodukovatelnými léčebnými účinky popsanými v příkladech provedení na laboratorních a praktických testech. Je popisováno potlačení růstu dermatofýtů a patogenních kvasinek v laboratorním suspenzním testu stejně jako účinky při aplikaci na dermatofytosy zvířat, léčbu tinea unguium u lidí, a na potlačení rozvoje patogenních kvasinek u nehojících se ran diabetických i nediabetických pacientů a v dutině ústní.

Pro stanovení parametru vzcházivostí bylo u mikroorganizmu Pythium oligandrum v předcházejícím výzkumu přijato několik řešení a metodik, z nichž ovšem žádná není pro tento účel příliš vhodná. Tak jsou například metody založené na různých barvicích viabilních technikách dobře fungující pro jiné typy buněk známy u mikroorganizmu Pythium oligandrum svým složitým řešením a ne příliš spolehlivými výsledky. Předkladateli tohoto vynálezu je známá technika plazmolýzy ve vysokých koncentracích osmolytů, která poskytuje spolehlivé výsledky, ale je závislá na subjektivním hodnocení pozorovatelem v mikroskopu. Kromě toho poskytuje informace o intaktnosti (nepoškozenosti) oospory Pythium oligandrum, nikoliv o její vzcházivostí.

-4CZ 307642 B6

Další skupina široce používaných metodik je založena na výsevu přípravku obsahujícího viabilní buňky Pythium oligandrum na mikrobiologické plotny a následujícím sledováním počtu vytvořených kolonií. Bohužel, biologická povaha tohoto mikroorganizmu s jeho aktivním životním stylem a velkou rychlostí lineárního šíření bezpřihrádkového mycelia není příliš kompatibilní s těmito metodikami, které jsou jinak mikrobiologii běžným standardem. Často poslední možností pro stanovení viability v preparátech dormantních oospór mikroorganizmu Pythium oligandrum pak je přímé mikroskopické pozorování klíčících oospór, které je však naopak náročné jak časově tak z hlediska použité experimentální techniky (videozáznam).

Ve světle výše uvedených problémů byly velké naděje pro stanovení viability buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum vkládány do molekulárně genetických technik. V naší předcházející práci jsme se pokoušeli stanovovat viabilitu s použitím námi odzkoušeného molekulárního testu založeného na qPCR amplifikaci dvou nezávislých cílových genových sekvencí tohoto mikroorganizmu (4). Nicméně u řady přípravků obsahujících vysoký obsah rozpadlých buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum se tento přístup neukázal jako vhodný z důvodu velkého pozadí metody. Lepším řešením se v tomto ohledu ukázalo sledování některých transkriptů konstitutivně exprimovaných pouze živými buňkami mikroorganizmu Pythium oligandrum, z nichž byl nakonec zvolen transkript pro β-tubulin, hojně exprimovaný protein tohoto mikroorganizmu. Celý experiment probíhá týden a zahrnuje kultivaci dormantních oospór v médiu obsahujícím penicilín (pro potlačení růstu kontaminujících bakterií) po dobu 4 dní s odběrem vzorků po 24 hodinách a jejich analýzou metodou RT-PCR po transkripci reverzní transkriptasou. Extrapolací linearizované naměřené exponenciální křivky časové závislosti nárůstu do nulového bodu získáme hodnotu vzcházivosti.

Výhodou tohoto způsobu stanovení je přesné určení množství viabilních buněk v jakémkoliv přípravku mikroorganizmu Pythium oligandrum nezávislé na jeho stáří a metodě přípravy. Je třeba zdůraznit, že viabilita buněk přípravků s mikroorganizmem Pythium oligandrum závisí velmi výrazně na způsobu jeho přípravy a uchování, a proto není téměř možné na tento parametr usuzovat z celkového počtu dormantních oospór stanoveného v přípravku mikroskopicky (různá stanovení uvádějí množství viabilních buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum jako 0,01 až 30 % pozorovaného množství dormantních oospór, což je velmi nejistý údaj). Z výše uvedených důvodů je zřejmé, že dosavadní praxe vyjadřování biologické potence (účinné dávky) mikroorganizmu Pythium oligandrum na základě deklarovaného celkového počtu oospór bez stanovení jejich viability poskytuje špatně reprodukovatelné a v podstatě obtížně použitelné výsledky, z nichž není možné určit optimální aplikační dávku, a to ani po korekci na množství aplikované látky. Při použití nově zavedené metodiky byly výsledky laboratorních i praktických testů konzistentní a všechny ukazovaly na optimální aktivitu při různých praktických aplikacích u suspenzí obsahujících od 10 do 50 viabilních oospór na ml aplikační směsi.

Kromě optimálního nastavení aplikačního protokolu jsou přihlašovatelem prováděná a v předloženém vynálezu dále popsaná měření vzcházivosti (viability) dormantních oospór důležitá též pro stabilitní testy při sledování jednotlivých šarží přípravků. Naše praktické zkušenosti z testů účinnosti pak jednoznačně prokazují, že při poklesu množství dormantních oospór pod 330/g přípravku (10/ml aplikované směsi) dochází k poklesu účinnosti při eliminaci dermatofytů a kvasinek, zatímco při poklesu této hodnoty pod 33/g (1/ml aplikované směsi) již není možné pozitivní účinek zaručit. Naopak, vztah koncentrace a účinnosti u přípravků s velmi vysokým obsahem dormantních oospór nelze jednoznačně vyjádřit, závisí zejména na čistotě takového přípravku v závislosti na čistotě vstupních surovin a úzkostlivě dodržované technologii. Za podmínky výskytu kontaminujících látek je možné u přípravků obsahujících více než 33 000 dormantních oospór na 1 g směsi (1000/ml aplikované směsi) pozorovat jistý pokles účinnosti daný pravděpodobně interferujícím vlivem neznámých nečistot. Takový pokles účinnosti nebyl pozorován u vysoce přečištěných forem mykoparazitické řasovky Pythium oligandrum, i když s tímto typem přípravků jsou dosud velmi omezené zkušenosti.

-5CZ 307642 B6

Pro rychlé testy účinnosti mikroorganizmu Pythium oligandrum, zejména suspenzní testy prováděné s mikrokonidiemi dermatofytů nebo suspenzemi kvasinek je další nevýhodou pomalé vzcházení dormantních oospór trvajících nejméně 48 hodin. Proto se pro provedení těchto testů jeví jako výhodné nahradit dormantní oospory encystovánými zoosporami připravenými podle publikované metodiky. Experimentálně bylo námi při přímém srovnání zjištěno, že oba preparáty, tj. jak čerstvě připravené encystováné zoospóry tak dormantní oospory se stanovenou viabilitou projevují identické schopnosti potlačovat dermatofyty a patogenní kvasinky. V případě encysto váných zoospór se navíc jedná o skladovatelnou formu viabilních buněk mykoparasitického mikroorganizmu Pythium oligandrum, jejichž potenciál je předmětem dalšího intenzivního výzkumu.

Navržené metodiky jsou dobře kompatibilní s požadavky na testování živých mikrobiálních léčivých přípravků, u nichž se požadují důkazy pro kolonizaci a popis biologických, metabolických, morfologických a jiných aktivit na místě cílové aplikace. Metoda dle tohoto vynálezu byla v tomto ohledu již úspěšně aplikována při léčbě dermatofytos na zvířecím modelu, kde umožnila mj. objasnit úlohu mikroorganizmu Pythium oligandrum při eliminaci dysbiosy a nastolení normální fyziologické mikrobiální rovnováhy na kůži i na jiných místech aplikace, například na sliznicích (4, 9).

Objasnění výkresů

Technické řešení je dále podrobně popsáno na příkladných provedeních a blíže osvětleno na připojených schematických výkresech, v nichž je znázorněn na obr. 1 laboratorní test účinnosti potlačení dermatofytů a kvasinek v závislosti na množství přidaných viabilních encystovaných zoospór mikroorganizmu Pythium oligandrum, přičemž podrobněji se ukazuje na obr. ÍA a obr. ÍB test účinnosti s použitím dermatofyta Trichophyton interdigitale var. mentagrophytes sbírkového kmene DMF2374 po 24 a po 48 hodinách inkubace, obr. ÍC a obr. ID test účinnosti s použitím dermatofyta Microsporum canis sbírkového kmene CCM8353 po 24 a po 48 hodinách inkubace, obr. ÍE a obr. ÍF test účinnosti s použitím dermatofyta Epidermophyton floccosum sbírkového kmene PL231 po 24 a po 48 hodinách inkubace, obr. ÍG a obr. ÍH test účinnosti s použitím patogenní kvasinky Candida albicans sbírkového kmene CCF8261 po 24 a po 48 hodinách inkubace, obr. 2 klinické výsledky při léčbě experimentální dermatofytózy morčat s tím, že v horní části obrázku jsou uvedené výsledky pro morče léčené placebem a ve spodní části obrázku jsou uvedené výsledky pro morče léčené s použitím suspenze podle příkladu provedení 1 tohoto vynálezu, a podrobněji na obr. 2A fotografie hřbetu morčete v anestézii s aplikací placeba 16. den léčby s charakteristickým zarudnutím pokožky v infikovaných místech, obr. 2B, histologický řez kůže zvířete s aplikací placeba ukazující charakteristické zmnožení keratinocytů v horní vrstvě kůže v reakci na dráždění neléčeným dermatofytem, obr. 2C, klinický index dermatofytosy zvířete s aplikací placeba v jednotlivých dnech léčby vyznačený jako index zčervenání (světle šedé sloupce) a index poškození kůže (tmavě šedé sloupce),

-6CZ 307642 B6 obr. 2D, fotografie hřbetu morčete v anestézii s aplikací suspenze dle příkladu provedení 1 tohoto vynálezu 16. Den léčby s nižší úrovní zarudnutí pokožky v infikovaných místech, obr. 2E, histologický řez kůže zvířete s aplikací suspenze dle příkladu provedení 1 tohoto vynálezu ukazující významně nižší úroveň zmnožení keratinocytů úspěšně léčeného zvířete, obr. 2F, klinický index dermatolýtosy zvířete s aplikací suspenze dle příkladu provedení 1 tohoto vynálezu v jednotlivých dnech léčby vyznačený jako index zčervenání (světle šedé sloupce) a index poškození kůže (tmavě šedé sloupce).

Příklady uskutečnění vynálezu

Námi navrhované řešení je umožněno na základě dalších laboratorních analýz a praktických zkoušek přípravků pro humánní a veterinární medicínu podle tohoto vynálezu, vycházejících z CZ 302297, jejichž detailní formulace byla upřesněna s ohledem na použití při léčbě dermatofytos a tinea unguium, eliminaci kvasinek z nehojících se ran, a eliminaci kvasinek z dutiny ústní. Předložený vynález je dále podrobně popsán v následujících příkladných provedeních, avšak neměl by být na ně omezován. Tato příkladná provedení jsou uvedena, aby popis byl důkladný a úplný a plně zprostředkoval podstatu vynálezu v rozsahu patentových nároků.

Příklad 1

Příprava suchých směsí obsahujících mikroorganizmus Pythium oligandrum o známé vzcházivosti určené pro léčbu dermatofytóz morčat, tinea unguium, eliminaci kvasinek v nehojících se ranách a dutině ústní (Tab. 1, Tab. 2, Tab. 3)

a) Příprava mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum

Pythium oligandrum kmen Ml (kmen DV74, jehož sekvenční protokol je na následující straně) byl udržován na agaru a před kultivací propagován v kapalné kultuře. Kapalnou kulturou byla očkována sterilizovaná škrobová zrna prosa (Panicům miliaceum L.). Kultivace probíhala za sterilních podmínek po dobu cca 7 dní, vlhká biomasa byla poté šetrně vysušena a rozemleta na prášek obsahující částice o průměrné velikosti 35 až 50 pm. Množství oospór bylo zjištěno mikroskopicky a přípravek byl standardizován dle podmínek CZ 302297 na obsah 7 ± 1 x 10⁶ oospór na 1 g.

Dále je uveden Sekvenční Protokol užitého Pythium oligandrum Ml:

Pythium oligandrum Ml_ITS4_rRNA testovaného kmene DV74

-7 CZ 307642 B6

ΑΡ'Ί K ň,c λ/?' }Π !b>?uUÍ ilírU Μ1 8 2 ''^T'S '* Ύ acttgaggctgaacgaaggtgagtctgcgtctattttggatgcggatttgctgatgttattttaaa CACCTATTACTTAATACTGAACTATACTCCGAAŤACGAAAGTTTTTGGTTTTAACAATTAACAACT *Κ UCřCTGGATVACTTGG Ai GGA AU-WuA <,,TGCVJv \Υ3ΑΓ'Ί V M\ ' ‘'Ί GG/\GA 3 Γ^τ 7-705( ACG 2ATC' ΑΛΛ” 1’T'Í C Wu ’ 'U V' GG2 Γ i l· GG j”G ACCGGC YU Γ ATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCA7V\CrTGCCTTTCTrTTTTTGTGTAGTCAAAATTAGAGATG GCAGAVrGTGZxGGTGTCTCyjCGCTGTCTTTTTAAAGAlOGTTCGAGTCCCTTTAAATGTACGTTGA. TTCTTTCTTGTGTCTGCGAATTGCGATGCTATGCTCnTTGTGATCGGTTTAGATTGCTTTGCGCTG gtgggcgacttcggttaggacatAtggaagcaacctcaatiggcggtatgttcggctttgcctgac GTTAAGCTAAGCGAGTGTAGTTTTCTGTCTTTTCCTTGAGGTGTACCTGTCGTGTGTGAGGTTGAT TTAGGCTATATGGTTGCTTGGTTG^GTGGTTTAGCGTTTTCAGACGCCTGCTTCGGTAGGTAAAGG AGACAACACCAATTTGGGACTGAGAGTTTACT

Pythium oligandrum Ml, COXII mitochondrialní cytochrom oxidasa testovaného kmene DV74

G

S:i 1'21 181 2=11 3Ů1 '381 424 4'81 sil tlil úligaaigli llllllCgĚL si:Lqciao_:aC_: sltLiaifeas gatccaatts a = *. t< iia; g a a a acraixjis tiifcltlŮGi 1 Áá&aglqlag atgccaataq atliaOltV tiatllasii ggttgltaiS t.t.cjr.acatgg Leglageagt? WacilCaša: aatttgcaga laiuaítaalC lllgagfclui llslliCága· gLúiúaltia: ii-giťgaá-gC' aiolaatigt

Lialiaigail tagagtaarc >lgaaacl.át:_:i tiiaalfititt agliaCaggĚ IglailcTCt afca^:ggiifc'a=fela< aat-aaoagct lijlligfei-qa OggfcčaalgC agltlcalla· a ta a ttagtaittt gtattatttg· gaalti:att=t gatttattat agtgaatggt atttttiSll gaáíAagasa t'čt'gae'gttt·' ggttgttitla· agtg&aat'.at gasggttttt . 1 ³t 11 atgaaaaaaa' ggaeaaúa-at attcaatgga actqgagtva StLaeitgat aeugtattqi tieattgatt gt a al Slítli

J =t dc Slgttts.gSt tíitgai' tg 11 aaacccéiQ v-s tclagiatta tgaaattatt tgattSttit tiaigltist tgticta.aat ggtlatatii - 11. q ·;·='.·;

< t ¹ <3 o.<3- C <i

b) Měření viability buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum ve 3 šaržích

Pro stanovení počtu viabilních buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum přihlašovatel předloženého vynálezu vyvinul speciální postup, který se provádí genetickým testem přípravku ve formě vodné suspenze podle tohoto vynálezu, měřením hladiny exprese konstitutivního genu pro β-tubulin mikroorganizmu Pythium oligandrum, udržovaného v médiu bohatém na živiny, při 30 °C v běžné atmosféře.

V analyzovaném materiálu bylo stanoveno množství viabilních buněk následujícím postupem: 1 g vysušené látky bylo odváženo a rozmixováno ve 100 ml vody v kuchyňském mixeru. 0,5 ml této suspenze bylo smícháno s 4.5 ml kultivačního média v šestijamkové kultivační destičce inkubované při 30 °C, přičemž byly po 48 h, 72 h a 96 h po zahájení inkubace odebírány 50 μΐ vzorky. Nukleové kyseliny byly extrahovány a extrakt naředěn 50 x vodou bez obsahu nukleas. Poté následovala reversní transkripce a PCR amplifikace podle standardního protokolu v reakční směsi obsahující 4 μΐ výše extraktu, 1 μΐ směsi primem pro amplifikaci β-tubulinu Pythium oligandrum (3) a 5 μΐ enzymového mixu. Získaná exponenciální křivka byla linearizována a extrapolována k počátečnímu nulovému času. Takto zjištěná viabilita činila v případě šarže mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum (A) 41700 / g látky, v případě šarže mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum (B) 12500 / g látky a v případě šarže mykoparazitckého mikroorganizmu Pythium oligandrum (C) 8300 / g látky.

V tomto i dalších provedeních jsou písmeny A, B, C v závorkách označeny jednotlivé šarže mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum.

c) Příprava a aplikace směsi pro léčbu dermatofytos a tinea unguium

Tabulka 1. Složení přípravku pro léčbu dermatofytos a tinea unguium.

Složka suché	Použitá složka i Bm. % složky	lim. % složky funkce
směsí	CASNo.	1 v sušině	ve vod.susp.	složky
Pyihhim, oligandrum (A) 1		u f	< 42	Xb.kopara/Uicka komponenta
Kvs. citrónová	77-92-9	1 23	0.67	Pufr
Ihdroyenuhličitan sodný	144-55-8	| Í8 i	0,52	Pufr/ deodorant
Oxid křemičitý	7631-86-9	I8	0,23	AdsUrbent:
i Pf.í i 6000 l	25322-68-3	i 7	0.09	Zvlhovač
Uhličitan sodný	497-19-8	: ·)	0,06	Pufr
i Obsah vody ve vodné aplikační sus]	icnzí (100 mí)	do 100 %	Aplik. solvent
; Koncentrace viabilních buněk	ntykoparazi tichého	-·-·-· - - - -.......—.. .-J 50 viabilních	buněk / 1 mí
mikroorganizmu Pythium oligandrum	přípravku ve vodné suspenzi

d) Příprava a aplikace směsi pro eliminaci kvasinek v nekojících se ranách

Tabulka 2. Složení přípravku pro eliminaci kvasinek v nekojících se ranách

Složka suché

Použitá složka i llmotn. %

CAS No.

......................

i Pythtúm I

I ' t oligandruffí (B)

Osid křemičitý I 7b3l-86-9 směsi % aktiv látky funkce při aplikací !

: Mykopara/itická i ! komponenta i Adsórbcnt

Obsah fyziologického roztoku ve vodné aplikační do 100 % suspenzi (250 ml)

Koncentrace viabilních buněk mykoparazitického i 30 viabilních buněk / ml přípravku | mikroorganizmu Pvfhium oliganclrum | ve vodné suspenzí

e) Příprava a aplikace směsi pro eliminaci kvasinek v dutině ústní

-9CZ 307642 B6

Tabulka 3. Složení přípravku pro eliminaci kvasinek v dutině ústní

Složka suché směsi	Použitá služka CASNo.	Hm. % složky v Mršině	Hra. % složky ve vodné susp.	Funkce složkv
Pythium	--	74	0.16	Mykoparazitická
oligaudrum (C?				komponenta
kys citrónová	77-92-9	31	0.90	Pulračm látka
Hjdrogenuhbči-an	144-55-8	27	0.79	Pufracní látka.
sodný				deodorant
Sorbítol	50-7-4	24	0.70	Zvlhčení
()\id kíemičité	7631-86-9	X	0.23	Adsorbent
PFG 6000	25322-68-3	T	0.09	Zvlhčení
l'hličifan '•odiiš	497-19-8	2	0.06	Pufráční látká:
D-Limoneii	5989-27-5	1	0.03	Aroma
Obsah vody ve vodné aplikační suspenzi 1100 mb	do 100 %
Koncentrace Habilnich buněk mykoparazitíckého	10 viabilnich	oóspór i ml
mikroorganíxmii Pythium oligandrum		přípravku ve vodné: suspenzi

Příklad 2

Potlačení růstu a eliminace dermatofytů a kvasinek v laboratorním testu (Obr. 1)

Pro laboratorní testy účinnosti byla zvolena aplikace mikroorganizmu Pythium oligandrum ve formě encystovaných zoospór připravených podle publikovaného protokolu (5). Byl zvolen suspenzní způsob testování, který je preferovaný pro ověření antimikrobiálních aktivit jiných přípravků (1). Zoospóry byly encystovány vortexováním po dobu 2 min a udržovány v těchto podmínkách při 16 °C až do zahájení experimentu. Suspenze mikrokonidií z dermatolýtů Trichophyton interdigitale var. mentagrophytes DMF2374, Microsporum canis CCM8353 a Epidermophyton floccosum PL231 a suspenze kvasinek Candida albicans CCM8261 byly připraveny podle publikovaných metodik (7, 1). Suspenze zoospór a suspenze mikrokonidií nebo kvasinkových buněk byla naředěna na požadovanou koncentraci a buňky byly kultivovány v suspenzi v šesti jamkových plastových destičkách po dobu 48 hodin při 30 °C. Vzorky pro kultivační stanovení byly odebrány po 24 a 48 hodinách.

Výsledek experimentu je uveden na obr. 1 v příloze. Ukazuje se, že ve všech testovaných případech bylo množství encystovaných zoospór optimální pro potlačení růstu studovaných dermatolýtů a patogenní kvasinky Candida albicans mezi 10 a 50 viabilními buňkami na 1 ml vyšetřovaného roztoku s dermatolýtem nebo kvasinkou. Pokud bylo množství encystovaných zoospór menší, nebylo účinné potlačení růstu zaručeno. Překvapivě, ani větší množství zoospór však již nevedlo k lepším výsledkům při potlačení růstu cílových mikroorganizmů, tento růst byl buď identický, nebo byl vyšší.

- 10CZ 307642 B6

Příklad 3

Eliminace dermatofytů a nastolení fyziologické mikroflory u morčat infikovaných dermatofyty (Obr. 2)

Tento test byl proveden podle publikovaného protokolu (4,7) s infekcí ověřeným kmenem Microsporum canis CCM8353. Při aplikaci byla jako placebo použita identická směs jako v příkladu provedení tohoto vynálezu, v níž byla kultivační biomasa nahrazena vodou, jako experimentální látka pak fungicidní látka dle příkladu provedení lc tohoto vynálezu.

Výsledek tohoto testu je popsán ve výsledkové tabuli na obrázku 2. Celkový vzhled léčeného morčete ve spodní části obr. 2 stejně jako histologie kůže tohoto zvířete a hodnota klinických indexů dermatoiýtózy tohoto zvířete jasně prokazují významný klinický efekt při léčbě experimentální dermatofytózy ve srovnání se zvířetem léčeným pomocí placeba, u něhož byla aktivní látka Pythium oligandrum vynechána.

Příklad 4

Eliminace dermatofytů a zlepšení klinického stavu u pacientů trpících tinea unguium (Tab. 4)

V tabulce č. 4 na následující straně jsou uvedené výsledky studie pro 21 pacientu trpících tinea unguium v kombinaci s jinými dermatofytosami. Před aplikací přípravku podle tohoto vynálezu mělo všech 21 pacientů pozitivní nález na mikroskopii a u všech byl potvrzen kultivačně výskyt alespoň jednoho dermatofyta, v některých případech i dvou dermatoiýtů. Z doprovodné mikrobiologie byl výskyt patogenní kvasinky Candida albicans zdaleka nejčastější. Z doprovodných diagnos byl nejčastější diabetes, tinea pedis, tinea pedis var. interdigitale, v jednom případě byla pozorována plísňová onemocnění rukou. Postižení jednoho nebo více nehtů na noze byla v průměrném rozsahu 1.5 plochy nehtu.

- 11 CZ 307642 B6

Tabtiikn 4. Souhrn klinických dut 2í pacientu trpících linea ungiiinm.

Č.ínit.Vřk Před aplikací 3 měsíce po npltk. ‘hněsícá po aplik. Finální hodnocení Parlieipujíeí

Mikr Ktiit Nehet Jiné Mikr Kult Nehet Jiné Milíř Kult Nehet Jiné My kol Kliň dermatoíog

Použiti zkratky; Č, Cisto pacienta ve sludii. init, iniciály pacienta. Mtkr. nticroskopíe v K.OH, Kulí, průkaz kultivačně. Nehet, plocha postiženého nehtu, line, jiná lékařská pozorování. Mykol, hodnoceni finánli ntykologické léčby, Klín, finální klinické hodnocení lékaři na šestibodove škále, y. positivní výsledek, n. negativní výsledek, Ab. A>Íh!<><J‘'t>iw hcfjhtťiiw· i) b ιΊκ plmn uíbiwn ^f a í wdtdu i! hpalvi >noph\t<»l fl<j< · ·ημ (ir; :',·' tvni vyskyt fa) hoiny w kst (s) sporadický Výsku d’T diabetes nidlitus. Π. tinea interdigitaie, hm, mykesy rukou, tp, linea pedis.

U všech pacientů ve studii byla provedena aplikace přípravku podle příkladu provedení lc ve formě nočních zábalů po dvě po sobě následující noci s opakováním aplikace po 14 dnech a po měsíci.

Devět měsíců po ukončení aplikace, tedy 10 měsíců po zahájení studie bylo provedeno vyhodnocení účinnosti. Mikroskopicky byla většina pacientů negativní a kultivačně byl detekován u dvou pacientů residuální sporadický výskyt dermatofyta Trichophyton rubrum, u jednoho pacienta se tento dermatolyt vyskytl ve zvýšené míře, u jednoho pacienta se vyskytla sporadicky kvasinka Candida albicans. Celkově bylo tedy možno hodnotit úroveň mykologické léčby jako velmi uspokojivou s vyřešením mykologické zátěže u 95 % pacientů, klinická léčba byla průměrně hodnocena na úrovni 2.1 v šestistupňové škále (1 - kompletní léčba bez malformace nehtů, 6 - zhoršení stavu). Celkově byla tinea unguium vyléčena u 12 pacientů bez jakékoliv malformace nehtů (54,5 %), u 1 pacienta došlo k léčbě s residuální malformaci (4,5%), u 6 pacientů bylo patrné klinické zlepšení o více než 50 % (27,3 %), u jednoho pacienta bylo zlepšení nevýrazné do 50 % (4,5 %) a u dvou pacientů nedošlo ke změně klinického stavu ani po 9 měsících po skončení aplikace (9,2 %), zde se ovšem jednalo s vysokou pravděpodobností podle lékařské dokumentace o reinfekci. U žádného pacienta nedošlo ke zhoršení jeho klinického stavu.

Příklad 5

Potlačení a eliminace patogenních kvasinek v nehojících se ranách pacientů (Tab. 5)

V předběžné praktické studii byl sledován vliv aplikace přípravku podle tohoto vynálezu na skupinu 12 pacientů s nehojícími se ranami komplikovanými kvasinkovou infekcí patogenními kvasinkami Candida albicans. Jednalo se o 6 diabetických a 6 nediabetických pacientů. Průměrný věk pacientů v diabetické skupině byl 77,5 roků, v nediabetické skupině 57,2 roků. Zastoupeny jsou převážně ženy, u nichž je známá zvýšená náchylnost k výskytu bércových vředů a nehojících se ran. Z anamnézy pacientů dále vyplývá, že u nich nedošlo k žádnému pokroku v léčbě nehojících se ran po dobu minimálně 6 měsíců od zahájení léčby s použitím běžně používaných lékařských přípravků včetně antibiotik, u mnoha pacientů po ještě delší dobu (až 2 roky).

U pacientů probíhala vlhká léčba s použitím suspenze připravené pomocí přípravků dle příkladu provedení ld jako součást vlhkého hojení. Aplikační obvazy byly vyměňovány po 8 hodinách po celkovou dobu 4 dní. Popsaná aplikace poskytla velmi významné snížení mikrobiologické zátěže, kdy byl výskyt patogenní kvasinky snížen o 95,3 % v případě diabetických pacientů a o 75,3 % v případě nediabetických pacientů, za celou studii bylo tedy pozorováno snížení o 85,3 %. Ke zlepšení klinického obrazu infekce na základě hodnocení participujících lékařů hodnotících rozsah zánětlivého procesu, intenzitu výtoku hnisu apod. Došlo u diabetických pacientů o 78,3 % a u nediabetických o 72,8 %, celkově za celou studii se jednalo o zlepšení o 72,8 %. Byla zjištěna velmi významná korelace mezi snížením mikrobiální zátěže a zlepšením klinického obrazu mikrobiální infekce, což představuje v kontextu publikované lékařské literatury velmi významný poznatek.

- 13 CZ 307642 B6

Tabulka 5

Korelace zlepšení mikrobiologické zátěže a zlepšení klinické mikrobiologie u 12 pacientů s nebojícími se ranami postiženými kvasinkovou infekcí

Iniciály, věk, pohlaví pacientu	Zlepšení (%) mikrobiáltitho obrazu pacientů	Zlepšení ť%) klinického obrazit pacientu	Korelační koeficient
Diabetičtí pacienti
L.S, 89, ž	72	60
LS, 87, ž	100	90
MM. 79, ž	100	90
ZM.71.Ž	100	90
MN, 70. in	100	80
13R, 69, tn	100	60
Prutnčr - včk:77.5	95.3	78.3	0.98
Ncdiabetičtí pacienti
LK, 75, ž	.32	28
BS. 6<>. 2	20	30
OK, 65, m	100	90
OB. 54, ž	100	90
11,44. ž	100	80
v j 1-, £ Průměr - věk:57.2	75.3	67.2	0.99
Celkem za studii:	85.3	72.8	0.98

Příklad 6

Potlačení a eliminace patogenních kvasinek v dutině ústní (Tab. 6)

Na pracovištích dentální hygieny byla pod odborným vedením stomatologů prováděna studie u 12 pacientů s přítomností patogenních kvasinek v dutině ústní.

Po mikrobiologických odběrech a vyjasnění povahy diagnosy byli pacienti poučeni a bylo pro ně poskytnuto jedno balení přípravku pro eliminaci patogenních kvasinek v dutině ústní, obsahující 5 ks šumivých tablet. Po večerní hygieně dutiny ústní si pacienti dutinu ústní pečlivě vypláchli a poté následovalo nejméně pětiminutové proplachování s přípravkem za podmínek, kdy tento obsahoval průměrně 10 viabilních oospór mikroorganizmu Pythium oligandrum po předchozí aktivaci ve vlažné vodě. Poté již nebyla dutina ústní vyplachována, aby v ní zůstal zbytek aplikačního roztoku přes noc. Ráno byla aplikace opakována a takto pacienti pokračovali po dobu 5 dní s použitím 5 šumivých tablet obsažených v přípravku.

Následné klinické sledování a vyhodnocení účinnosti probíhalo zhruba po 6 měsících po aplikaci. K eliminaci patogenní kvasinky z dutiny ústní došlo o 67,1 %, což bylo doprovázeno průměrným zlepšením klinického stavu takto postižených pacientů o 66,8 %. Pacienti trpěli zejména opakovanými záněty dutiny ústní a periodontální chorobou. Byla opět zjištěna korelace mezi snížením výskytu kvasinek v dutině ústní a zlepšením klinického stavu.

- 14CZ 307642 B6

Tabulka 6

Korelace zlepšení mikrobiologické zátěže a zlepšení klinického stavu u 10 pacientů s kvasinkovou infekcí v dutině ústní.

Iniciály, věk, pohiuvi pacientů	Zlepšení (%) mikrobiálního obraz» pacientů obrazu	Zlepšení (%) klinického pacientu	Korelační koeficient
Cl, 40	75	50
UL.38 1 l	75	66
KA. 26	/ J 50	ti· /: 4:0
LI. 60	80	76
PP. 74	50	70
SM, 37	7 v 75	6$ 82
SS, 34	50	54
/k. 35	75	80
Průměr	67.1	66.8	0,95

Průmyslová využitelnost

Přípravek pro léčbu dermatofýtos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích může být použit pro potlačování symptomů spojených s infekcí dermatolýty nebo kvasinkami na kůži a sliznicích jako jsou společensky obtížné pachové symptomy, nadměrná potivost nohou, svědění a pálení, k potlačení a eliminaci výskytu dermatolýtů a kvasinek u nehojících se ran, v dutině ústní, na kůži, na urogenitálních sliznicích, ve vlasech a na jiných místech napadených těmito mikroorganizmy.

Citovaná literatura

1. Barros MES. Santos DA. Hamdan JS (2006) Mycol Res 110, 1355-1360.

2. Calderona RA, Fonzi WA (2001) Trends Microbiol 9, 327-335.

3. Horner NR, Grenville-Briggs LJ, van West P (2012) Fungal Biol 116. 24-41.

4. Klimeš R, Suchánek M, Maštalková L a spol. (2016) Vet Dermatol. v tisku.

5. Madsen AM, Robinson HL, Deacon JW (1995) Mycol Res 99, 1417-1424.

6. Martinez DA, Oliver BG, Graser Y a spol. (2012) mBio 3, e00259-12.

7. Saunte DM, Simmel F, Frimodt-Moller N (2007) Antimicrob Agents Chemother 51. 33173321.

8. CZ 302297 (publ. 2011) Suchánek M, Klimeš R

9. CZ 28816 U (publ. 16. 11. 2015) Suchánek M, Klimeš R

10. CZ 9883 U (publ. 14.4.2000) Veselý D, Veselý L

11. Yacoub A, Berger H, Gerbore J a spol. (2016) Genome Announcements 4, e00215-16.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (2)

1. Přípravek s mykopa organismem Pythium oligandrum kmene DV 74 pro užití při léčbě dermatofýtos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích, přičemž přípravek ve formě vodné suspenze zahrnuje:

- 15 CZ 307642 B6 • suchou směs obsahující

0,1 až 99,9 % hmotn. mykoparazitického mikroorganizmu Pythium oligandrum a 0,1 až 99,9 % hmotn. pomocných látek, obsahujících nejméně jednu složku ze skupiny zahrnující adsorbent, pufr, zvlhčovač, deodorant a aroma,

5 a dále • vodu/fyziologický roztok v takovém množství, aby přípravek obsahoval počet 1 až 10 x 10⁶ viabilních buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum na 1 ml vodné suspenze, přičemž viabilní buňky mikroorganizmu Pythium oligandrum, zahrnují dormantní oospory, encystované zoospory ío a viabilní coenocytické mycelium.

2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 50 viabilních buněk mikroorganizmu Pythium oligandrum na 1 ml přípravku ve vodné suspenzi.