WO2017038872A1 - 抗真菌活性を有する組成物 - Google Patents

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章 齊藤
村上　洋一
茂 安部
和美 羽山
美貴 高橋
美穂 安部
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)

Definitions

  • This invention relates to a composition having a novel antifungal activity.
  • Infectious diseases caused by microorganisms are regarded as problems in the treatment of HIV and cancer and organ transplantation.
  • the development of antibiotics for bacterial infections has already been established.
  • drug-resistant bacteria such as MRSA and VRE
  • fungi In particular, candidiasis due to Candida albicans and aspergillosis due to the genus Aspergillus have greatly hindered transplantation surgery.
  • Yeasts and filamentous fungi are eukaryotic organisms and are called fungi for prokaryotic bacteria. Certain fungi are pathogenic to humans and animals and are considered to be the cause of fungal infections. Although the pathogenicity of these fungi is generally weak, patients with reduced resistance may have serious symptoms. Since various diseases caused by fungi have a profound effect on human and animal health, development of new drugs useful for their treatment is expected. In addition, the invasion of filamentous fungi into the house due to dew condensation reflecting the recent housing conditions causes symptoms such as allergies to humans, and adversely affects the health of humans and animals. Development of a novel antifungal agent is expected as an effective countermeasure.
  • Patent Document 1 discloses that, in a mouse oral candidiasis model, combined use of capric acid and ginger essential oil has the highest effect of improving tongue symptoms.
  • Non-patent document 1 discloses that a synergistic effect of anti-Candida activity was observed when capric acid and terpinen-4-ol were used in combination with Candida mycelium growth in vitro. Yes. Further, Non-Patent Document 1 discloses that in a mouse oral candidiasis model, a combination of capric acid and terpinen-4-ol exhibited a certain therapeutic effect including a reduction in the number of viable bacteria.
  • Patent Document 2 attention has been paid to the fact that a complex of lysozyme and chitosan (30 kDa) has antibacterial properties, and an application of this complex to foods and cosmetics has been considered.
  • This complex is extremely safe and imparts stability, which is regarded as important by product design, to lysozyme and further broadens the antibacterial spectrum.
  • it only shows that it has antibacterial activity against Escherichia coli K12, and antibacterial activity against fungi such as Candida and Aspergillus has not been confirmed.
  • the present inventor has intensively studied to provide a composition having a novel antifungal activity without relying on a composition having an existing anti-Candida activity or a combination of these compositions.
  • the present inventor has found that a complex in which lysozyme and chitosan are bound exhibits antifungal activity against fungi such as Candida.
  • the composition having antifungal activity according to the present invention is characterized by containing a complex obtained by binding lysozyme and chitosan.
  • the antifungal activity includes a Candida growth inhibitory action or a Malassezia fungal growth inhibitory action. That is, the composition includes a Candida growth inhibitory composition, a Malassezia fungus growth inhibitory composition, or a ringworm fungus growth inhibitory composition. The effect of the composition having antifungal activity will be described later.
  • the composition having antifungal activity further contains a terpene alcohol or a fatty acid.
  • a terpene alcohol As terpene alcohols, geraniol, menthol and terpinen-4-ol can be considered.
  • the fatty acid is preferably a fatty acid having 8 to 12 carbon atoms, and specifically, caprylic acid (carbon number 8), capric acid (oxygen number 10), lauric acid (carbon number 12), and the like can be considered.
  • an effect of suppressing infection with Candida in the skin and mucous membrane is achieved. Therefore, as an effect of the present invention, it can be applied to candidiasis of the skin and mucous membranes, particularly oral candidiasis and vaginal candidiasis with a large number of patients, thereby improving symptoms, curing diseases, preventing infection. Can do.
  • lysozyme is widely used as a highly safe natural food additive, and the composition having antifungal activity using a complex of this lysozyme and polysaccharide reassures the patient to use, The burden can be reduced.
  • oral candidiasis and vaginal candidiasis are likely to repeat recurrence, and the application of antifungal agents is limited due to side effects and the risk of appearance of resistant bacteria.
  • the present invention uses a complex of lysozyme and polysaccharide, which is a highly safe natural food additive, and it is not necessary to consider such risks, and the patient can use it with peace of mind.
  • seborrheic dermatitis that occurs in human or animal skin can be prevented or improved by using the composition having antifungal activity as a malassezia fungal growth inhibitory composition.
  • the composition having antifungal activity as a composition for inhibiting the growth of ringworm fungus, it is possible to prevent / ameliorate ringworm fungus infections such as athlete's foot caused on human skin.
  • the composition having antifungal activity according to the first embodiment contains a complex bound to lysozyme and chitosan (water-soluble and having a molecular weight of 25000 Da or less). .
  • chitosan having a molecular weight of 14000 Da is used.
  • the lysozyme can be derived from chicken or human.
  • the lysozyme-chitosan complex of the present invention can be produced by combining lysozyme and chitosan by Maillard reaction.
  • lysozyme and chitosan By binding lysozyme and chitosan by Maillard reaction, most or all of the antigen structure in lysozyme is masked, so that allergy is unlikely to occur even if lysozyme-chitosan complex is ingested.
  • a specific manufacturing method is as follows. Lysozyme and chitosan in an amount such that the mass ratio of lysozyme / chitosan is more preferably 60/40 to 40/60 are mixed and dissolved in water, so that the total content of lysozyme and chitosan in the aqueous solution is 5 to 30% by mass.
  • the obtained aqueous solution is lyophilized to be powdered.
  • the obtained powder is subjected to a temperature of 50 to 80 ° C., more preferably 55 to 65 ° C., a relative humidity of 50 to 80%, more preferably 60 to 70%, for 2 to 20 days, more preferably 7 to 14 days.
  • the lysozyme-chitosan complex of the present invention can be produced by Maillard reaction.
  • the production of the lysozyme-chitosan complex of the present invention is confirmed by confirming the production of a high-molecular substance that is a protein-chitosan complex by staining a plate obtained by SDS (Sodium-dodecyl-sulfate-polyacrylamide) electrophoresis. Can do.
  • the composition having antifungal activity of the present invention is preferably 10 to 100% by mass, more preferably 30 to 100% by mass, and most preferably 50 to 50% in order to keep the lysozyme-chitosan complex more antibacterial. 100% by mass is contained.
  • components other than the lysozyme-chitosan complex in the composition having antifungal activity dextrin, lecithin and the like can be used.
  • the content of components other than lysozyme-chitosan complex in the composition having antifungal activity is preferably 0 to 90% by mass, more preferably 0 to 70% by mass, and most preferably 0 to 50% by mass.
  • composition having antifungal activity according to a second embodiment contains a complex in which lysozyme and chitosan are bound by Maillard reaction and terpene alcohol.
  • terpene alcohol examples include geraniol, menthol, and terpinen-4-ol.
  • these terpene alcohols are plant essential oil components, and plant essential oils containing them may be used.
  • composition having antifungal activity according to the third embodiment contains a complex in which lysozyme and chitosan are combined by a Maillard reaction and a fatty acid.
  • a fatty acid as a fatty acid, caprylic acid (carbon number 8), capric acid (oxygen number 10), lauric acid (carbon number 12), etc. can be considered.
  • LYZOX registered trademark of Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • Example 1 Inhibitory activity of LYZOX, terpinen-4-ol, and decanoic acid on the growth of Candida mycelium
  • Candida was cultured on a Sabouraud dextrose agar plate at 37 ° C. for 20 hours using Candida albicans TIMM1768, a clinical isolate stored at Teikyo University Medical Mycology Research Center. The proliferated cells were collected and suspended in sterilized water, adjusted to 5 ⁇ 10 3 cells / ml, and used as a Candida solution. Each sample was dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) according to the final concentration in advance and added to 1/3 RPMI-1640 medium containing 2% calf serum to obtain a sample solution.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • IC70 (70% growth inhibitory concentration) of LYZOX, terpinen-4-ol and decanoic acid was as follows, as shown in FIG. 1 and FIG. LYZOX (single) 193 ⁇ g / ml Terpinen-4-ol (alone) 1900 ⁇ g / ml Capric acid (decanoic acid) (alone) 480 ⁇ g / ml
  • Example 2 Synergistic effect of anti-Candida activity in combination with LYZOX and terpinen-4-ol or decanoic acid on Candida mycelium growth
  • the definition of the synergistic effect when an antibacterial substance is used in combination with a microorganism refers to a case where the effect is significantly larger than the sum of the individual effects of the two agents.
  • the synergistic effect can be evaluated based on the FIC coefficient (Fractional Inhibitory Concentration Index) obtained from the MIC values of the two drugs by the checkerboard method as follows. That is, when the FIC coefficient is less than 0.5, it is determined that there is a synergistic effect.
  • FIC coefficient Fractional Inhibitory Concentration Index
  • the IC (70% growth inhibitory concentration) of LYZOX and capric acid (decanoic acid) was as follows, as shown in FIG. LYZOX (when used together) 30 ⁇ g / ml Capric acid (decanoic acid) (when used in combination) 25 ⁇ g / ml That is, when LYZOX and terpinen-4-ol were used in combination, the FIC coefficient for Candida mycelium growth was 0.208, and it was determined that there was a synergistic effect.
  • ICR mice female, 6 weeks old, Japanese Charles River
  • 100 mg / kg of prednisolone was subcutaneously injected on the day before Candida inoculation. From that day, free intake of tap water containing 15 mg / ml of chlortetracycline hydrochloride was started.
  • chlorpromazine hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries) 14.4 mg / kg was intramuscularly administered in advance.
  • the strain and culture method used were the same as in the previous examples, and the grown cells were suspended in RPMI-1640 medium containing 2% calf serum and the number of bacteria was adjusted to 2 ⁇ 10 8 cells / ml. To make a bacterial solution. A cotton swab was soaked in this bacterial solution, and it was rubbed against the mouth of a rested mouse to inoculate Candida.
  • mice For the oral candidiasis mice, the administration samples shown in the table below are suspended in distilled water in advance using Tween 80 (final concentration 1%), and the mouse gastric sonde is used at 3, 24 and 27 hours after Candida inoculation. Then, it was dropped onto the back of the tongue in the mouth and administered. Two days after inoculation, mice were euthanized and tongue symptom snia was evaluated according to criteria. Thereafter, the mouth of the mouse was wiped with a cotton swab, and the Candida cells collected on the swab were suspended in physiological saline. A given amount was applied to a Candida GS plate medium and cultured at 37 ° C. for 20 hours to count the number of colonies that appeared. The Candida viable count CFU (Colony Forming Unit) recovered from the individual was calculated from the number of colonies.
  • Tween 80 final concentration 1%
  • Example 4 Effect of anti-Candida activity by lysozyme alone, chitosan alone, a mixture of lysozyme and chitosan or LYZOX in combination with terpinen-4-ol on Candida mycelium growth
  • the synergistic effect of anti-Candida activity by the combined use was evaluated by the checkerboard method in the same manner as in Example 2.
  • a checkerboard was assumed on a 96-well microplate, and lysozyme alone, chitosan alone, a mixture of lysozyme and chitosan, or a concentration series of LYZOX and terpinen-4-ol were crossed.
  • the experimental conditions and measurement methods were the same as in the test for mycelial growth (Example 1).
  • Example 5 Effect of anti-Candida activity by lysozyme simple substance, chitosan simple substance, lysozyme and chitosan mixture or LYZOX in combination with decanoic acid on Candida mycelium growth
  • the synergistic effect of anti-Candida activity by the combined use was evaluated by the checkerboard method in the same manner as in Example 2.
  • a checkerboard was assumed on a 96-well microplate, and the concentration series of lysozyme alone, chitosan alone, a mixture of lysozyme and chitosan, or LYZOX and decanoic acid were crossed.
  • the experimental conditions and measurement methods were the same as in the test for mycelial growth (Example 1).
  • Example 6 Effect of anti-Candida activity by lysozyme alone, chitosan alone, a mixture of lysozyme and chitosan, and LYZOX on Candida mycelium growth
  • Example 2 The effect of anti-Candida activity by each reagent was evaluated by the checkerboard method as in Example 2. Assuming a checkerboard on a 96-well microplate, lysozyme alone, chitosan alone, a mixture of lysozyme and chitosan, and LYZOX concentration series were prepared. The experimental conditions and measurement methods were the same as in the test for mycelial growth (Example 1).
  • Example 7 Effect of anti-malassezia fungal activity by ketoconazole and lysozyme-chitosan complex against malassezia fungus (Malassezia pachydermatis)
  • test bacterium solution adjusted to McFarland 1.0 was spread on each agar plate with MLNA medium (composition is shown in Table 2), and a sterilized paper disk with a thick 8 mm antibiotic test paper was placed on the petri dish. Then, 50 ⁇ L of each test sample was dropped and cultured at 32 ° C. for 7 days, followed by observation and determination. The inhibition circle diameter was also measured.
  • ketoconazole 10 ⁇ g / ml As test samples, 0.5% DMSO, ketoconazole 10 ⁇ g / ml, ketoconazole 100 ⁇ g / ml, LYZOX 5 mg / ml, LYZOX 10 mg / ml, LYZOX 20 mg / ml, LYZOX 40 mg / ml were used.
  • MLNA medium 25ml / plate Autoclaved at 110 ° C. for 20 minutes.
  • FIG. 1 As shown in FIG. 12, a blocking circle of 16 ⁇ 16 mm (paper disc: 8 mm) was observed around the paper disc in which 50 ⁇ l of LYZOX 10 mg / ml was hung. Similarly, a 21 ⁇ 21 mm blocking circle was observed around a paper disk suspended by 50 ⁇ l of LYZOX 20 mg / ml, and a 24 ⁇ 24 mm blocking circle was observed around a paper disk suspended by 50 ⁇ l LYZOX 40 mg / ml. There was no inhibition circle in the sterile control water.
  • Example 8 The anti-malassezia fungal activity by LYZOX against Malassezia fungus (Malassezia pachydermatis) was evaluated using the agar dilution method. Specifically, an agar plate (composition is the same as in Table 2 above) using an MLNA medium to which LIZOX and other samples are added so as to have the concentrations (final concentrations) shown in Table 2 below is prepared. 100 ⁇ L of the test bacterial solution adjusted to McFarland 1.0 was spread and cultured at 32 ° C. for 7 days. Thereafter, the growth rate of the fungus was determined by comparing with the control (MLNA medium without sample addition).
  • FIGS. FIG. 13 and FIG. 14 are photographs showing the state after 7 days from the formation of malassezia fungal colonies in each sample.
  • the growth inhibitory concentration in each sample was as follows.
  • LYZOX alone exhibits anti-malassezia fungal activity against malassezia fungi. It was found that anti-malassezia fungal activity was also exhibited by using LYZOX and decanoic acid in combination, but no improvement effect was seen for LYZOX alone.
  • Trichophyton mentagrophytes TIMM2789 a clinical isolate from Teikyo University Medical Mycology Research Center, was used as the ringworm.
  • a Sabouraud dextrose agar plate diluted to 1/10) containing 50 ⁇ g / ml chloramphenicol and 500 ⁇ g / ml cycloheximide was removed from the low temperature silica stock one week before the test day. Inoculated. This was cultured at 28 ° C. for 1 week, collected on the day of the test, and used.
  • the number of ringworms was set in the medium so that the final concentration was 10 3 cells / ml. Each sample was also mixed with the medium so that the final concentrations in the following table were obtained.
  • RPMI medium final concentration 1/3 dilution
  • containing the bacterial solution adjusted with 1.5% agar was also kept at 37 ° C. so as not to solidify during the preparation.
  • 1 ml of each sample solution and 24 ml of RPMI-1640 medium were mixed to prepare a sterile plastic petri dish.
  • the medium for inoculation of ringworm fungus thus prepared was cultured at 28 ° C. for 4 days, and the growth inhibitory effect of the mycelium after the culture was observed and judged. Judgment was carried out by visual observation and when there was turbidity, the growth of the mycelium was evaluated by comparison with the control (no sample added) by microscopic observation (40 times).
  • Table 6 shows the negative / positive results of bacteria by each test sample.
  • the mycelium growth rate in the control is 100%
  • the mycelia growth rate in the test sample is 0%
  • the mycelia growth rate in the test sample is 0%
  • it was ⁇ 90% it was judged as “++++”.
  • FIGS. 15 and 16 are photographs showing a state after 7 days after the colonization of ringworm fungi in each sample.
  • LYZOX 10mg / ml
  • Decanoic acid 15mg / ml
  • LYZOX and decanoic acid when used in combination, the MIC (minimum growth inhibitory concentration) of LYZOX and decanoic acid was as follows. LYZOX (when used together) 0.1 mg / ml Decanoic acid (when used in combination) 0.2mg / ml
  • composition which has novel antifungal activity can be provided, without relying on the composition which has the antifungal activity containing the existing anti-Candida, or the combination of those compositions.

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Abstract

本発明は、既存の抗カンジダ活性を有する組成物又はそれら組成物の組み合わせに頼ることなく、新規な抗真菌活性を有する組成物を提供するものである。具体的に本発明は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、抗真菌活性を有する組成物である。本発明により、皮膚や粘膜のカンジダ症、特に、患者数の多い口腔カンジダ症や膣カンジダ症への適用と、それによる症状の改善、病気の治癒、感染の予防をすることができる。また、リゾチームは、安全性の高い天然の食品添加物として広く利用されており、このリゾチームと多糖類との複合体を用いた抗真菌活性を有する組成物は、利用する患者を安心させるとともに、その負担を軽減することができる。本発明は、安全性の高い天然の食品添加物であるリゾチーム及び多糖類の複合体を用いたものであり、このようなリスクを考慮する必要が無く、患者は安心して利用することができる。

Description

抗真菌活性を有する組成物
　この発明は、新規な抗真菌活性を有する組成物に関するものである。
　ＨＩＶや癌の治療及び臓器移植において問題とされているのが、微生物による感染症である。細菌の感染症に対する抗生物質の開発は、すでに確立されている。ＭＲＳＡやＶＲＥ等の薬剤耐性菌の出現という問題もあるが、それ以上に深刻であるのが真菌による感染症である。特に、カンジダ・アルビカンスによるカンジダ症やアスペルギルス属菌によるアスペルギルス症は、移植手術において大きな妨げとなっている。
　酵母及び糸状菌は真核生物であり、原核生物である細菌に対して真菌と称されている。ある種の真菌はヒトや動物に対して病原性を示し、真菌感染症の起因菌とされている。これら真菌の病原性は概ね弱いものであるが、抵抗力の低下した状態の患者には、重篤な症状を来たすことがある。
　真菌による種々の病気は、ヒトや動物の健康に甚大な影響を与えているため、それらの治療に有用な新規薬剤の開発が期待されている。また、最近の住宅事情を反映した結露等による住宅への糸状菌の侵入は、ヒトにアレルギー等の症状をもたらし、ヒトや動物の健康に悪影響を及ぼしている。これらの有効な対策として、新規抗真菌剤の開発が期待されている。
　ここで、カンジダ菌糸形発育を阻害するものとしては、特許文献１及び非特許文献１がある。
　特許文献１には、in vitroでのカンジダ菌糸形発育に対して、カプリン酸（デカン酸）をゲラニオール、オイゲノール、又はシトラールのいずれかと併用した場合に、抗カンジダ活性の相乗効果が認められたことが開示されている。また、特許文献１には、マウス口腔カンジダ症モデルにおいて、カプリン酸及びジンジャー精油の併用が最も舌症状の改善効果が高かったことなどが開示されている。
　また、非特許文献１には、in vitroでのカンジダ菌糸形発育に対して、カプリン酸とテルピネン－４－オールと併用した場合に、抗カンジダ活性の相乗効果が認められたことが開示されている。また、非特許文献１には、マウス口腔カンジダ症モデルにおいて、カプリン酸とテルピネン－４－オールとの併用により生菌数の低下を含む確実な治療効果があらわれたことが開示されている。
　しかしながら、上記の特許文献１及び非特許文献１では、抗カンジダ活性を有するとして知られていたデカン酸等の中鎖脂肪酸と、同じく抗カンジダ活性を有するとして知られていたテルピネン－４－オール等のテルペンアルコールとの併用効果を示しているに過ぎない。
　一方で、特許文献２に示すように、リゾチームとキトサン（３０ｋＤａ）の複合体が抗細菌性を有することに着目し、この複合体を食品や化粧料に応用したものが考えられている。この複合体は極めて安全性が高く、商品設計等により重要視される安定性をリゾチームへ付与し、さらに抗細菌スペクトルを広げるものである。
　しかしながら、大腸菌Ｋ１２に対する抗細菌活性があることのみを示しているのに過ぎず、カンジダ属やアスペルギルス属等の真菌に対する抗菌活性は確認されていない。
特開２０１３－４０１５６号公報 特開２００５－１８７４０１号公報
二宮健太郎、外５名、「テルピネン－４－オールと中鎖脂肪酸カプリン酸の併用によるCandida albicansの菌糸形発育阻止作用とマウス口腔カンジダ症への治療効果」、薬学雑誌、公益社団法人日本薬学会、2013年1月1日、第133巻、第1号、p.133-p.140
　一方で、本願発明者は、既存の抗カンジダ活性を有する組成物又はそれら組成物の組み合わせに頼ることなく、新規な抗真菌活性を有する組成物を提供すべく鋭意検討を行った。その中で、本願発明者は、リゾチームとキトサンとが結合した複合体が、カンジダなどの真菌に対して抗真菌活性を示すことを見い出した。
　すなわち本発明に係る抗真菌活性を有する組成物は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有することを特徴とする。前記抗真菌活性には、カンジダ増殖抑制作用又はマラセチア真菌増殖抑制作用が含まれる。つまり、前記組成物は、カンジダ増殖抑制組成物、マラセチア真菌増殖抑制組成物又は白癬菌増殖抑制組成物を含む。この抗真菌活性を有する組成物の効果については、後述する。
　また、抗真菌活性を有する組成物は、テルペンアルコール又は脂肪酸をさらに含有することが望ましい。
　テルペンアルコールとしては、ゲラニオール、メントール、テルピネン－４－オールが考えられる。
　脂肪酸としては、炭素数８～１２の脂肪酸であることが望ましく、具体的には、カプリル酸（炭素数８）、カプリン酸（酸素数１０）、ラウリン酸（炭素数１２）等が考えられる。
　本発明によれば、皮膚や粘膜におけるカンジダの感染を抑える効果を奏する。したがって、本発明の効果としては、皮膚や粘膜のカンジダ症、特に、患者数の多い口腔カンジダ症や膣カンジダ症への適用と、それによる症状の改善、病気の治癒、感染の予防をすることができる。また、リゾチームは、安全性の高い天然の食品添加物として広く利用されており、このリゾチームと多糖類との複合体を用いた抗真菌活性を有する組成物は、利用する患者を安心させるとともに、その負担を軽減することができる。
　また、口腔カンジダ症や膣カンジダ症は再発を繰り返し易く、しかも副作用及び耐性菌出現リスクのために抗真菌剤の適用には限界がある。本発明は、安全性の高い天然の食品添加物であるリゾチーム及び多糖類の複合体を用いたものであり、このようなリスクを考慮する必要が無く、患者は安心して利用することができる。
　さらに、前記抗真菌活性を有する組成物をマラセチア真菌増殖抑制組成物として用いることにより、人や動物の皮膚に生じる脂漏性皮膚炎を予防・改善することができる。その上、前記抗真菌活性を有する組成物を白癬菌増殖抑制組成物として用いることにより、人の皮膚に生じる水虫等の白癬菌感染症を予防・改善することができる。
リゾチーム－キトサン複合体とテルピネン－４－オールを併用した場合のカンジダの発育率を示す図である。 リゾチーム－キトサン複合体とデカン酸を併用した場合のカンジダの発育率を示す図である。 マウス口腔カンジダ症モデルにおけるリゾチーム－キトサン複合体とテルピネン－４－オールとの併用による口腔内生菌数の測定結果を示す図である。 マウス口腔カンジダ症モデルにおけるリゾチーム－キトサン複合体とテルピネン－４－オールとの併用による舌症状スコアを示す図である。 リゾチームとテルピネン－４－オールを併用した場合のカンジダの発育率を示す図である。 キトサンとテルピネン－４－オールを併用した場合のカンジダの発育率を示す図である。 リゾチーム及びキトサンの混合物とテルピネン－４－オールを併用した場合のカンジダの発育率を示す図である。 リゾチームとデカン酸を併用した場合のカンジダの発育率を示す図である。 キトサンとデカン酸を併用した場合のカンジダの発育率を示す図である。 リゾチーム及びキトサンの混合物とデカン酸を併用した場合のカンジダの発育率を示す図である。 リゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物、及び、リゾチーム－キトサン複合体の各濃度におけるカンジダの発育率を示す図である。 マラセチア真菌に対するリゾチーム－キトサン複合体の阻止円を示す写真である。 各被検試料におけるマラセチア真菌のコロニー形成の７日後の様子を示す写真である。 各被検試料におけるマラセチア真菌のコロニー形成の７日後の様子を示す写真である。 各被検試料における白癬菌のコロニー形成の７日後の様子を示す写真である。 各被検試料における白癬菌のコロニー形成の７日後の様子を示す写真である。
　以下に本発明を詳述する。
１．第１実施形態
　第１実施形態に係る抗真菌活性を有する組成物は、リゾチームとキトサン（水溶性のものであり、分子量は２５０００Ｄａ以下である。）と結合させた複合体を含有するものである。なお、本実施形態では、分子量１４０００Ｄａのキトサンを用いている。また、リゾチームは、ニワトリ由来のものや、ヒト由来のものを用いることができる。
　本発明のリゾチーム－キトサン複合体は、リゾチームとキトサンをメイラード反応により結合させることにより製造することができる。リゾチームとキトサンとをメイラード反応により結合させることで、リゾチーム中の抗原構造のほとんど又はすべてがマスクされるため、リゾチーム－キトサン複合体を摂取してもアレルギーを起こしにくい。
　具体的な製造方法は次のとおりである。
　リゾチーム／キトサンの質量比が、より好ましくは６０／４０～４０／６０となる量のリゾチーム及びキトサンを、水に混合溶解し、水溶液中のリゾチーム及びキトサンの合計含量が５～３０質量％となるように調製する。得られた水溶液を凍結乾燥することにより粉末化する。得られた粉末を温度５０～８０℃、より好ましくは５５～６５℃、相対湿度５０～８０％、より好ましくは６０～７０％の条件下で、２～２０日、より好ましくは７～１４日、メイラード反応させることにより本発明のリゾチーム－キトサン複合体を製造することができる。
　本発明のリゾチーム－キトサン複合体の生成は、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）電気泳動により得られるプレートを、染色処理したものにより、蛋白質－キトサン複合体である高分子物質の生成を確認することができる。
　次に、本発明の抗真菌活性を有する組成物について説明する。
　本発明の抗真菌活性を有する組成物は、リゾチーム－キトサン複合体を、抗菌力をより保持させるために、好ましくは１０～１００質量％、より好ましくは３０～１００質量％、最も好ましくは５０～１００質量％含有するものである。
　なお、抗真菌活性を有する組成物中のリゾチーム－キトサン複合体以外の成分としては、デキストリン、レシチン等を使用することができる。抗真菌活性を有する組成物中のリゾチーム－キトサン複合体以外の成分含量は、好ましくは０～９０質量％、より好ましくは０～７０質量％、最も好ましくは０～５０質量％である。
２．第２実施形態
　第２実施形態に係る抗真菌活性を有する組成物は、リゾチームとキトサンとをメイラード反応により結合させた複合体と、テルペンアルコールとを含有するものである。なお、テルペンアルコールとしては、ゲラニオール、メントール、テルピネン－４－オール等が挙げられる。また、これらのテルペンアルコールは植物精油成分であり、それらを含む植物精油を用いても良い。
３．第３実施形態
　第３実施形態に係る抗真菌活性を有する組成物は、リゾチームとキトサンとをメイラード反応により結合させた複合体と、脂肪酸とを含有するものである。なお、脂肪酸としては、カプリル酸（炭素数８）、カプリン酸（酸素数１０）、ラウリン酸（炭素数１２）等が考えられる。
　以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、リゾチーム－キトサン複合体をＬＹＺＯＸ（和興フィルタテクノロジー株式会社の登録商標）ともいう。
［実施例１］ＬＹＺＯＸ、テルピネン－４－オール、及び、デカン酸のカンジダ菌糸形発育に対する阻害活性
　カンジダの酵母形および菌糸形発育に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害試験の方法は確立されており、それによって、様々な材料のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）を測定することができる。
　カンジダは帝京大学医真菌研究センター保存の臨床分離株、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ＴＩＭＭ１７６８を用い、サブロー・デキストロース寒天培地平板で３７℃、２０時間培養した。増殖した菌体を回収して滅菌水に懸濁し、菌数５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整してカンジダ液とした。各試料は予め最終濃度に合わせてＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）に溶解し、２％子牛血清を含む１／３ＲＰＭＩ－１６４０培地に加えて、サンプル液とした。（培地中のＤＭＳＯ濃度０．５％）サンプル液およびカンジダ菌液各１００μＬをそれぞれ９６穴マイクロプレート（住友ベークライト、東京）各ウエルに入れて、５％炭酸ガス存在下、３７℃、３時間培養した。３時間後、各ウエル内の液を廃棄し、ウエルを洗浄後、新たに各ウエルに１／３ＲＰＭＩ－１６４０を２００μＬずつ加え、５％炭酸ガス存在下、３７℃で１６時間の培養を行った。培養終了後、各ウエル中の液体を吸引除去し、生理食塩水で洗浄し、７０％エタノールを２００μＬ入れてカンジダを殺菌した。エタノールを除去して水道水で洗浄した後、染色液（０．１Ｍリン酸バッファーに溶解した０．０１％クリスタルバイオレット液）１００μＬを入れて１５分間静置し、ウエルの表面に付着したカンジダの菌糸を染色した。
　水道水で洗浄して余分な染色液を除去したあと、０．０４ＮＨＣｌを含む３－イソプロパノール１５０μＬおよび０．２５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液５０μＬを入れて菌体に付着した色素を遊離させた。色素を遊離させた後、プレートをマルチスキャンフォトメーター（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＦＣ　サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にかけて、各ウエルのＯＤ６２０nmを測定した。増殖阻害率は以下の式により求めた。
　　増殖阻害率（％）＝（１－サンプルＯＤ／対象ＯＤ）×１００
　ＬＹＺＯＸ、テルピネン－４－オール及びデカン酸の各ＩＣ７０（７０％増殖阻害濃度）は、図１及び図２に示すように、以下の通りであった、
　　ＬＹＺＯＸ（単独）　　　　　　　　　　１９３μｇ／ｍｌ
　　テルピネン－４－オール（単独）　　　１９００μｇ／ｍｌ
　　カプリン酸（デカン酸）（単独）　　　　４８０μｇ／ｍｌ
［実施例２］カンジダ菌糸形発育に対するＬＹＺＯＸと、テルピネン－４－オール又はデカン酸との併用による抗カンジダ活性の相乗効果
　一般に、微生物に対して抗菌物質を併用した場合の相乗的効果の定義は、２剤の個別的効果の和よりも有意に大きい効果を示した場合を指す。また相乗効果に対する評価は、以下の通り、チェッカーボード法によって２剤のＭＩＣの値から求めたＦＩＣ係数（Fractional Inhibitory Concentration Index）によって行うことができる。すなわち、ＦＩＣ係数が０．５未満の場合に、相乗効果があると判定される。
　＜ＦＩＣ係数の求め方＞
　ＦＩＣ係数＝Ａ１／Ａ０＋Ｂ１／Ｂ０
　　　Ａ０：Ａ剤単独のＭＩＣ
　　　Ａ１：Ａ剤及びＢ剤併用時のＡ剤のＭＩＣ
　　　Ｂ０：Ｂ剤単独のＭＩＣ
　　　Ｂ１：Ａ剤及びＢ剤併用時のＢ剤のＭＩＣ
　＜ＦＩＣ係数による併用効果の評価＞
　　　　ＦＩＣ＜０．５　　　　　相乗効果
　　　　０．５＜ＦＩＣ＜１．０　超相加効果
　　　　ＦＩＣ＝１．０　　　　　相加効果
　　　　１．０＜ＦＩＣ＝２．０　不関
　　　　ＦＩＣ＞２．０　　　　　拮抗作用
　併用による抗カンジダ活性の相乗効果については、チェッカーボード法により評価した。９６穴マイクロプレート上にチェッカーボードを想定し、テルピネン－４－オール又はデカン酸とＬＹＺＯＸとのそれぞれの濃度系列を交差させた。実験条件および測定方法などは菌糸形発育に対する試験（実施例１）と同様とした。
　ＬＹＺＯＸとテルピネン－４－オールとを併用した場合、ＬＹＺＯＸ及びテルピネン－４－オールのＩＣ（７０％発育阻止濃度）は、図１に示すように、以下の通りであった。
　　ＬＹＺＯＸ（併用時）　　　　　　　　　　６０μｇ／ｍｌ
　　テルピネン－４－オール（併用時）　　　２８０μｇ／ｍｌ
　つまり、ＬＹＺＯＸとテルピネン－４－オールとを併用した場合、カンジダの菌糸形発育に対するＦＩＣ係数は０．４４７となり、相乗効果があると判定された。
　また、ＬＹＺＯＸとカプリン酸（デカン酸）とを併用した場合、ＬＹＺＯＸ及びカプリン酸（デカン酸）のＩＣ（７０％発育阻止濃度）は、図２に示すように、以下の通りであった。
　　ＬＹＺＯＸ（併用時）　　　　　　　　　　３０μｇ／ｍｌ
　　カプリン酸（デカン酸）（併用時）　　　　２５μｇ／ｍｌ
　つまり、ＬＹＺＯＸとテルピネン－４－オールとを併用した場合、カンジダの菌糸形発育に対するＦＩＣ係数は０．２０８となり、相乗効果があると判定された。
［実施例３］マウス口腔カンジダ症モデルにおけるＬＹＺＯＸとテルピネン－４－オールとの併用による治療効果
　実験動物にはＩＣＲ系マウス（雌、６週齢、日本チャールスリバー）を用い、カンジダ菌接種前日に、免疫抑制を目的にプレドニゾロン１００ｍｇ／ｋｇを皮下注射した。また、その日から塩酸クロルテトラサイクリン１５ｍｇ／ｍｌを含有した水道水の自由摂取を開始した。接種当日、マウスを安静状態に保つため、予めクロルプロマジン塩酸塩（和光純薬工業）１４．４ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与した。使用した菌株および培養方法は前項までの実施例と同じとし、増殖した菌体を、２％子牛血清を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、菌数を２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整して菌液とした。この菌液に綿棒を漬け、それを安静になったマウス口腔に擦り付けてカンジダ菌を接種した。
　この口腔カンジダ症マウスに対して、下表の投与サンプルを、予めＴｗｅｅｎ８０（終濃度１％）を用いて蒸留水に懸濁し、カンジダ菌接種３、２４および２７時間後に、マウス用胃ゾンデを用い、口腔内の舌背に滴下して投与した。接種２日後にマウスを安楽死させ、基準に従って舌症状スニアを評価した。その後マウス口腔内を綿棒で拭い、その綿棒に回収されたカンジダ菌体を生理食塩水中に懸濁した。その一定量をカンジダＧＳ平板培地に塗布し、３７℃、２０時間培養して出現したコロニー数を計測した。コロニー数から当該個体から回収されたカンジダ生菌数ＣＦＵ（Colony Forming Unit）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実験の結果、図３に示すように、口腔から回収された生菌数については、テルピネン－４－オールのみ群において、生菌数の低下が認められた。また、図４に示すように、舌症状スコアについては、ＬＹＺＯＸのみ群において著しい改善効果が認められた。
［実施例４］カンジダ菌糸形発育に対するリゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物又はＬＹＺＯＸと、テルピネン－４－オールとの併用による抗カンジダ活性の効果
　併用による抗カンジダ活性の相乗効果については、前記実施例２と同様に、チェッカーボード法により評価した。９６穴マイクロプレート上にチェッカーボードを想定し、リゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物又はＬＹＺＯＸとテルピネン－４－オールとのそれぞれの濃度系列を交差させた。実験条件および測定方法などは菌糸形発育に対する試験（実施例１）と同様とした。
　実験の結果、図５～図７に示すように、リゾチーム単体とテルピネン－４－オールとを併用した場合、キトサン単体とテルピネン－４－オールとを併用した場合、リゾチーム及びキトサンの混合物とテルピネン－４－オールとを併用した場合には、カンジダの菌糸形発育に対して併用による抗カンジダ活性の改善効果は見られなかった。一方で、図１に示すように、ＬＹＺＯＸとテルピネン－４－オールとを併用した場合、上記３つの併用パターンに比べて、著しい改善効果を認めることができた。
［実施例５］カンジダ菌糸形発育に対するリゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物又はＬＹＺＯＸと、デカン酸との併用による抗カンジダ活性の効果
　併用による抗カンジダ活性の相乗効果については、前記実施例２と同様に、チェッカーボード法により評価した。９６穴マイクロプレート上にチェッカーボードを想定し、リゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物又はＬＹＺＯＸとデカン酸とのそれぞれの濃度系列を交差させた。実験条件および測定方法などは菌糸形発育に対する試験（実施例１）と同様とした。
　実験の結果、図８～図１０に示すように、リゾチーム単体とデカン酸とを併用した場合、キトサン単体とデカン酸とを併用した場合、リゾチーム及びキトサンの混合物とデカン酸とを併用した場合には、カンジダの菌糸形発育に対して併用による抗カンジダ活性の改善効果は見られなかった。一方で、図２に示すように、ＬＹＺＯＸとデカン酸とを併用した場合、上記３つの併用パターンに比べて、著しい改善効果を認めることができた。
［実施例６］カンジダ菌糸形発育に対するリゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物、及び、ＬＹＺＯＸによる抗カンジダ活性の効果
　各試薬による抗カンジダ活性の効果については、前記実施例２と同様に、チェッカーボード法により評価した。９６穴マイクロプレート上にチェッカーボードを想定し、リゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物、及び、ＬＹＺＯＸそれぞれの濃度系列を作成した。実験条件および測定方法などは菌糸形発育に対する試験（実施例１）と同様とした。
　実験の結果、図１１に示すように、リゾチーム単体の場合、及びキトサン単体の場合にはカンジダの菌糸形発育に対して抗カンジダ活性の改善効果は見られなかった。また、リゾチーム及びキトサンの混合物（ＭＩＸ）の場合には、カンジダの菌糸形発育に対して抗カンジダ活性の改善効果は見られるものの、濃度上昇とともに抗カンジダ活性の効果が小さくなることが分かった。一方、ＬＹＺＯＸの場合には、カンジダの菌糸形発育に対して抗カンジダ活性の改善効果が見られ、その改善効果は濃度上昇とともに増すことが分かった。特に、ＬＹＺＯＸ濃度が２５０μｇ／ｍｌの場合には、発育率がほぼゼロ（０．９％）となっている。
［実施例７］マラセチア真菌（Malassezia pachydermatis）に対するケトコナゾール（ketoconazole）、及び、リゾチーム－キトサン複合体による抗マラセチア真菌活性の効果
　マラセチア感受性試験として、McFarland 1.0に調整した被検菌液１００μＬをそれぞれＭＬＮＡ培地（組成は表２に示す。）による寒天平板に塗り広げ、シャーレに抗生物質検定用ペーパー厚手８ｍｍの減菌ペーパーディスクを置き、各被検試料を５０μＬ滴下し、３２℃で７日間培養後、観察及び判定をした。また、阻止円直径を測定した。なお、被検試料としては、０．５％ＤＭＳＯ、ケトコナゾール１０μｇ／ｍｌ、ケトコナゾール１００μｇ／ｍｌ、ＬＹＺＯＸ５ｍｇ／ｍｌ、ＬＹＺＯＸ１０ｍｇ／ｍｌ、ＬＹＺＯＸ２０ｍｇ／ｍｌ、ＬＹＺＯＸ４０ｍｇ／ｍｌを用いた。
　ＭＬＮＡ培地　　２５ｍｌ／ｐｌａｔｅ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　１１０℃で２０分間、オートクレーブした。
　各被検試料によるマラセチア阻止円（ｍｍ）の結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　Ｅｘｐ．１では、図１２に示すように、ＬＹＺＯＸ１０ｍｇ／ｍｌを５０μｌ垂らしたペーパーディスク周りに、１６×１６ｍｍ（ペーパーディスクは８ｍｍ）の阻止円が見られた。同様に、ＬＹＺＯＸ２０ｍｇ／ｍｌを５０μｌ垂らしたペーパーディスクの周りに、２１×２１ｍｍの阻止円、ＬＹＺＯＸ４０ｍｇ／ｍｌを５０μｌ垂らしたペーパーディスクの周りに、２４×２４ｍｍの阻止円が見られた。コントロールの滅菌水には阻止円は見られなかった。
　Ｅｘｐ．２では、ＬＹＺＯＸ１０ｍｇ／ｍｌを５０μｌ垂らしたペーパーディスク周りに、１４×１５ｍｍの阻止円が見られ、ＬＹＺＯＸ５ｍｇ／ｍｌを５０μｌ垂らしたペーパーディスク周りに、１０×１１ｍｍの阻止円が見られた。
［実施例８］
　マラセチア真菌（Malassezia pachydermatis）に対するＬＹＺＯＸによる抗マラセチア真菌活性を、寒天希釈法を用いて評価した。具体的には、ＬＩＺＯＸ及びその他の試料が、それぞれ以下の表２の濃度（終濃度）となるように添加したＭＬＮＡ培地による寒天平板（組成は上記の表２と同様。）を作製し、そこへMcFarland 1.0に調整した被検菌液１００μＬを塗り広げ、３２℃で７日間培養した。その後、その後、菌の発育率をコントロール（試料添加なしのＭＬＮＡ培地）と比較して、判定した。
　各被検試料による菌の陰性・陽性の結果を以下に示す。なお、コントロールでの菌糸の発育率を１００％として、被検試料での菌糸発育率が０％の場合は「－」と判定し、１～２０％の場合は「＋」と判定し、２１～９０％の場合は「＋＋＋」と判定した。また、各被検試料における菌のコロニー形成の様子を図１１及び図１２に示す。なお、図１３及び図１４は、各試料におけるマラセチア真菌のコロニー形成の７日後の様子を示す写真である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この実験の結果、各試料における発育阻止濃度は、以下の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上の実験により、マラセチア真菌に対してＬＹＺＯＸ単体で抗マラセチア真菌活性を示すことが分かった。ＬＹＺＯＸとデカン酸とを併用することによっても抗マラセチア真菌活性を示すことが分かったが、ＬＹＺＯＸ単体に対して改善効果は見られなかった。マラセチア真菌が完全な酵母型の真菌であることが、他の真菌との抗菌効果との違いを生み出していると考えられる。
［実施例９］白癬菌に対するＬＹＺＯＸ及びデカン酸の抗白癬菌活性と、それらの併用による抗白癬菌活性の相乗効果
　カンジダに対する試験と同様に、白癬菌に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害試験の方法も確立されており、それによって、様々な材料のＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を測定することができる。
　白癬菌は、帝京大学医真菌研究センター保存の臨床分離株、Trichophyton mentagrophytes　TIMM2789株を用いた。前培養として、低温シリカストックから試験日の１週間前に取り出し、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと５００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含む、（成分を１／１０に希釈した）サブロー・デキストロース寒天培地平板に植菌した。これを２８℃で１週間培養し、試験当日に集菌し、使用した。白癬菌の菌数の設定は終濃度が１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地へ混釈した。また、各試料もそれぞれ以下の表中の終濃度となるように培地へ混釈した。１．５％アガーと調整した菌液を含むＲＰＭＩ培地（終濃度１／３希釈）も、調製中に固まらないように３７℃に保温した。調製時は各試料溶液１ｍｌ、ＲＰＭＩ－１６４０培地２４ｍｌを混合して、滅菌プラスチックシャーレに調製した。このように調製した白癬菌接種培地を２８℃で４日間培養し、培養後の菌糸の発育阻止効果を観察、判定した。判定は目視及び濁度がある場合には顕微鏡観察（４０倍）にて菌糸の発育具合をコントロール（試料添加なし）との比較で評価した。
　各被検試料による菌の陰性・陽性の結果を以下の表６に示す。なお、コントロールでの菌糸の発育率を１００％として、被検試料での菌糸発育率が０％の場合は「－」と判定し、１～２０％の場合は「＋」と判定し、２１～９０％の場合は「＋＋＋」と判定した。また、各被検試料における菌のコロニー形成の様子を図１１及び図１２に示す。なお、図１５及び図１６は、各試料における白癬菌のコロニー形成の７日後の様子を示す写真である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＬＹＺＯＸ及びデカン酸のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）は、以下の通りであった、
　　ＬＹＺＯＸ（単独時）　　　　　　　　　　１０ｍｇ／ｍｌ
　　デカン酸（単独時）　　　　　　　　　　１．５ｍｇ／ｍｌ
　また、ＬＹＺＯＸとデカン酸とを併用した場合、ＬＹＺＯＸ及びデカン酸のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）は、以下の通りであった。
　　ＬＹＺＯＸ（併用時）　　　　　　　　　０．１ｍｇ／ｍｌ
　　デカン酸（併用時）　　　　　　　　　　０．２ｍｇ／ｍｌ
　つまり、ＬＹＺＯＸとデカン酸とを併用した場合、白癬菌の発育抑制に対するＦＩＣ係数は０．１４３となり、相乗効果があると判定された。
　本発明によれば、既存の抗カンジダを含む抗真菌活性を有する組成物又はそれら組成物の組み合わせに頼ることなく、新規な抗真菌活性を有する組成物を提供することができる。
 

Claims (6)

  1. 　リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、抗真菌活性を有する組成物。
  2. 　前記抗真菌活性が、カンジダ増殖抑制作用、マラセチア真菌増殖抑制作用、又は白癬菌増殖抑制作用を含む請求項１記載の抗真菌活性を有する組成物。
  3. 　テルペンアルコール又は脂肪酸をさらに含有する請求項１記載の抗真菌活性を有する組成物。
  4. 　テルペンアルコールが、テルピネン－４－オール、ヒノキチオール又はゲラニオールである請求項３記載の抗真菌活性を有する組成物。
  5. 　前記脂肪酸が、炭素数８～１２の脂肪酸である請求項３記載の抗真菌活性を有する組成物。
  6. 　前記脂肪酸が、カプリン酸又はラウリン酸である請求項３記載の抗真菌活性を有する組成物。
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