WO2024042930A1 - アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物 - Google Patents

アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物 Download PDF

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WO2024042930A1
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chitosan
acanthamoeba
lysozyme
complex
pharmaceutical composition
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PCT/JP2023/026529
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優一 加治
尚子 高橋
宏紀 影島
翔一郎 平野
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国立大学法人 筑波大学
和興フィルタテクノロジー株式会社
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing inflammation caused by Acanthamoeba.
  • Acanthamoeba is a type of amoeba-type protozoa (protozoa), and is a microorganism that often exists in soil and the like. Acanthamoeba infects the eye, particularly the cornea, causing corneal inflammation. Inflammation caused by Acanthamoeba is particularly common in contact lens wearers; for example, they adhere to contact lens cases through tap water, multiply within the case, and cause infection in the cornea through the contact lenses.
  • Various amoebicides have been developed as a countermeasure against Acanthamoeba, and piguanide fungicides (Patent Documents 1 to 3) are known as main examples. However, compositions other than piguanide fungicides that exhibit strong anti-amoebic effects are not well known.
  • the present invention aims to provide a novel pharmaceutical composition for treating or preventing inflammation caused by Acanthamoeba.
  • the present invention also provides an antiprotozoal composition that exhibits an effective therapeutic and preventive effect against protozoal infections such as Acanthamoeba, a method for treating and preventing protozoan infections such as Acanthamoeba, and the antiprotozoal composition, etc.
  • a method of using a pharmaceutical composition in the manufacture of a pharmaceutical composition is provided.
  • the present inventors newly verified the antiprotozoal and anti-adherent properties against Acanthamoeba using a complex of lysozyme and chitosan, which is so safe that it is used as a food additive.
  • the present invention was based on the discovery that the antiprotozoal effect and anti-adhesion effect are exhibited by the antiprotozoal and anti-adhesive effects. More specifically, the present invention may have the following aspects.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing inflammation caused by Acanthamoeba which contains a complex of lysozyme and chitosan.
  • [5] The medicament according to any one of [1] to [4] above, further comprising an additional active ingredient selected from the group consisting of hydrogen peroxide, povidone-iodine, polydronium chloride, and polyhexanide hydrochloride.
  • Composition [6] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [5] above, wherein the inflammation caused by Acanthamoeba is dermatitis or keratitis.
  • [7] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6], wherein the treatment or prevention of inflammation caused by Acanthamoeba is achieved by inhibiting Acanthamoeba adhesion.
  • Acanthamoeba anti-adhesion agent containing a complex of lysozyme and chitosan.
  • a method for preventing Acanthamoeba from adhering to a surface of a material comprising applying a complex of lysozyme and chitosan to the surface of the material.
  • the present invention it is possible to remove Acanthamoeba, to kill its antiprotozoa, or to kill its protozoa, and to suppress its proliferation.
  • the complex of lysozyme and chitosan of the present invention not only suppresses the proliferation of Acanthamoeba but also has the effect of significantly killing it. Therefore, according to the present invention, Acanthamoeba infection can be cured and/or prevented.
  • lysozyme is widely used as a highly safe naturally derived food additive, and antiprotozoal compositions using this complex of lysozyme and chitosan provide peace of mind to patients and reduce the burden on patients. can be reduced.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a reaction when synthesizing a complex in which lysozyme and chitosan are combined.
  • 1 is a biological micrograph of Acanthamoeba observed during the measurement of "the number of all Acanthamoeba adhered" in Table 1.
  • 1 is a biological micrograph showing a state in which dead Acanthamoeba stained with trypan blue and displayed darkly was observed when measuring the "number of dead Acanthamoeba" in Table 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the number of adherents of all Acanthamoeba when the lysozyme-chitosan complex (LYZOX (registered trademark)) of Table 5 and an additional active ingredient are used together.
  • FIG. 2 is a graph showing the mortality rate of Acanthamoeba when the lysozyme-chitosan complex (LYZOX (registered trademark)) of Table 5 and an additional active ingredient are used together.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing inflammation caused by Acanthamoeba, which contains a complex of lysozyme and chitosan.
  • a "complex in which lysozyme and chitosan are bound” is a complex in which lysozyme and chitosan are bound by, for example, Maillard reaction (see FIG. 1).
  • Maillard reaction see FIG. 1
  • the above-mentioned composite can also be obtained by covalently bonding lysozyme and chitosan using a crosslinking agent.
  • lysozyme is an enzyme that hydrolyzes mucopolysaccharide, and chicken-derived lysozyme and human-derived lysozyme can be preferably used.
  • the upper limit of the molecular weight of lysozyme is, for example, 30,000 Da or less, and more preferably 25,000 Da or less, 20,000 Da or less, 18,000 Da or less, or 15,000 Da or less.
  • the lower limit of the molecular weight of lysozyme does not need to be particularly limited, but may be, for example, 1,000 Da or more, preferably 5,000 Da or more, 10,000 Da or more, or 12,000 Da or more.
  • the range of the molecular weight of the lysozyme can be between any of the above upper and lower limits, for example, 1000 Da to 30,000 Da, preferably 5,000 Da to 20,000 Da, more preferably 10 ,000Da to 15,000Da.
  • "Chitosan” is poly- ⁇ 1 ⁇ 4-glucosamine represented by the following chemical formula (I) ((C 6 H 11 NO 4 ) n , CAS registration number 9012-76-4).
  • the chitosan is water-soluble.
  • the upper limit of the molecular weight of chitosan is, for example, 30,000 Da or less, more preferably 20,000 Da or less, 15,000 Da or less, 10,000 Da or less, or 7,000 Da or less.
  • the lower limit of the molecular weight of chitosan does not need to be particularly limited, but may be, for example, 300 Da or more, preferably 500 Da or more, 1,000 Da or more, or 3,000 Da or more.
  • the range of the molecular weight of the chitosan can be between any of the above upper and lower limits, for example, 300 Da to 30,000 Da, preferably 500 Da to 15,000 Da, more preferably 1,000 Da. ⁇ 10,000 Da, particularly preferably 3,000 Da to 7,000 Da.
  • chitosan When focusing on antiprotozoal properties, chitosan with a large molecular weight is advantageous; when focusing on ease of production, chitosan with a small molecular weight has better solubility and stability, and chitosan with a low molecular weight is advantageous. becomes.
  • chitosan here, we mean to include chitosan oligosaccharides and glucosamine in addition to the above-mentioned chitosan.
  • Chitosan oligosaccharide is a chain of several D-glucosamines represented by the above formula (I), and refers to low-molecular chitosan, or chitosan in a narrow sense, hydrolyzed with hydrochloric acid or enzymes.
  • crosslinking agent examples include amine-reactive crosslinking agents (eg, alkoxyamines), carbonyl-reactive crosslinking agents (eg, hydrazine compounds), and sulfhydryl-reactive crosslinking agents.
  • amine-reactive crosslinking agents eg, alkoxyamines
  • carbonyl-reactive crosslinking agents eg, hydrazine compounds
  • sulfhydryl-reactive crosslinking agents examples include amine-reactive crosslinking agents (eg, alkoxyamines), carbonyl-reactive crosslinking agents (eg, hydrazine compounds), and sulfhydryl-reactive crosslinking agents.
  • the mass ratio of lysozyme/chitosan is, for example, 99/1 to 1/99, preferably 90/10 to 10/90, more preferably 80/20 to 20/80, even more preferably 60/40 to 40/60, Particularly preferably, the ratio is 50/50.
  • specific methods for producing a composite of lysozyme and chitosan include the following. First, lysozyme and chitosan in the above mass ratio are mixed and dissolved in water so that the total mass of lysozyme and chitosan in the resulting aqueous solution is 5 to 30% by mass. The resulting aqueous solution is freeze-dried and powdered.
  • the obtained powder is treated under conditions of a temperature of, for example, 50 to 80°C, preferably 55 to 65°C, and a relative humidity of, for example, 50 to 80%, preferably 60 to 70%, for example, 2 to 20 days, more preferably.
  • the complex of the present invention in which lysozyme and chitosan are combined, can be produced by carrying out Maillard reaction for 7 to 14 days.
  • lysozyme-chitosan complex of the present embodiment is generated can be confirmed by various known methods, such as SDS (sodium dodecyl sulfate) or SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide) polyacrylamide
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
  • Acanthamoeba polyphaga is a protozoan, especially a type of amoeba classified as rhizopods, and exists, for example, in soil and fresh water.
  • Acanthamoeba infects the skin and eyes, particularly the cornea of the eye, causing skin and corneal inflammation. Inflammation caused by Acanthamoeba is particularly common among contact lens wearers.For example, Acanthamoeba attaches to a contact lens case through tap water, proliferates within the case, and is transmitted through contact lens storage solution or contact lenses.
  • Acanthamoeba infects the cornea and causes inflammation. Examples of inflammation include dermatitis and ocular keratitis.
  • the present invention is expected to be effective against eye disorders such as corneal hyperemia, corneal opacity, radial corneal neuritis, discoid corneal ulcer, scleritis, and endophthalmitis.
  • "Protozoa” includes amoeba such as Acanthamoeba.
  • antiprotozoal broadly includes protozoan prevention, removal, protozoicidal, antiprotozoal, etc., and means all conditions in which at least protozoa do not proliferate when the number of protozoa is the same or lower.
  • the term "removal of protozoa” refers to the removal of protozoa in general, and includes killing of protozoa.
  • Protocidal means killing at least some protozoa. Therefore, in the present invention, the term "antiprotozoal composition” includes a composition for removing protozoa, a protozoal composition, a protozoan removing agent, a protozoan, and an antiprotozoal agent.
  • the present invention can also be used as an anti-adhesive agent to prevent Acanthamoeba from adhering to materials such as contact lens cases.
  • Acanthamoeba has a tendency to adhere to plastic surfaces such as contact lens cases, but the presence of the present invention in contact lens cleaning liquids and the like can suppress the adhesion of Acanthamoeba.
  • the above-mentioned treatment or prevention of inflammation caused by Acanthamoeba can also be achieved by inhibiting Acanthamoeba adhesion.
  • the anti-adhesion property against Acanthamoeba of the present invention is demonstrated by the ability of polypropylene used in contact lens cases, as well as polyethylene, polyurethane, polycarbonate, polyvinyl polymer, melamine resin, urea resin, epoxy resin, acrylic resin, silicone, elastomer, rubber, etc.
  • the present invention is further effective in treating and preventing inflammation caused by "Acanthamoeba.”
  • treatment includes not only completely curing the inflammation that is the subject of the present invention, but also suppressing the inflammation and reducing its severity.
  • prevention includes not only cases where there is no history of inflammation, which is the subject of the present invention, but also prevention of recurrence of the inflammation, which is the subject of the present invention, after the inflammation has been cured.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can optionally contain one or more additional active ingredients in addition to the above-described complex.
  • Additional active ingredients include those that act as active ingredients by themselves, and those that do not act as active ingredients by themselves but exhibit their effects when used in combination with the above-mentioned complex that is the active ingredient of the present invention (auxiliary active ingredients). Also includes agents). Additional active ingredients include, for example, piganide fungicides, hydrogen peroxide, povidone iodine (complex of 1-vinyl-2-pyrrolidone polymer and iodine), polydronium chloride (Polyquad (registered trademark)), polyhexanide hydrochloride. (PHMB), terpene alcohols, fatty acids, and/or salts of said fatty acids.
  • ком ⁇ онент and/or synergistic effects can be obtained in combination with the complexes of the invention.
  • Particularly preferred are hydrogen peroxide, povidone-iodine (complex of 1-vinyl-2-pyrrolidone polymer and iodine), polydronium chloride (Polyquad (registered trademark)), and polyhexanide hydrochloride (PHMB).
  • the terpene alcohol include terpinen-4-ol, hinokitiol, geraniol, and menthol.
  • fatty acids include fatty acids having 8 to 12 carbon atoms, preferably decanoic acid (capric acid) or lauric acid.
  • fatty acid salts include sodium salts, potassium salts, magnesium salts, and calcium salts.
  • polyhexamide hydrochloride, lactoferrin, boric acid and/or its salts, casbofungin and/or its salts, policonazole, miconazole, econazole, sulconazole, fluconazole, quaternary Grade ammonium disinfectants, chitinases, etc. may be added as such additional active ingredients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can optionally contain one or more other components.
  • other components include additives such as excipients, binders, emulsifiers, solvents, adhesives, disintegrants, thickeners, lubricants, colorants, flow agents, and humectants.
  • Humectants include, for example, glycerin, butylene glycol, collagen, hyaluronic acid, and ceramide.
  • Binders include, for example, cellulose, methylcellulose, hydroxyethylcellulose, and sodium carboxymethylcellulose.
  • emulsifier examples include lecithin, polyethylene glycol (PG), PG-hydrogenated castor oil, glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, and ceteth.
  • solvent examples include water, ethanol, 1-butanol, 2-butanol, 1-propanol, 2-propanol, and 1-pentanol.
  • the lysozyme-chitosan complex of the present invention may be present in an amount of, for example, 0.01 ⁇ g/mL or more, 0.05 ⁇ g/mL or more, 0.1 ⁇ g/mL or more, 0.5 ⁇ g/mL or more, 1 ⁇ g in 1 mL of the pharmaceutical composition of the present invention. It is appropriate that the content be at least 10 ⁇ g/mL, at least 50 ⁇ g/mL, and at least 100 ⁇ g/mL.
  • the lysozyme-chitosan complex of the present invention may be present in 1 mL of the pharmaceutical composition of the present invention, for example, 100,000 ⁇ g/mL or less, 50,000 ⁇ g/mL or less, 10,000 ⁇ g/mL or less, 5,000 ⁇ g/mL or less, It is appropriate to contain 1,000 ⁇ g/mL or less.
  • the preferable content range of the lysozyme-chitosan complex of the present invention may be an appropriate combination of these lower and upper limits, and is, for example, 0.1 ⁇ g/mL to 10,000 ⁇ g/mL, preferably 0.1 ⁇ g/mL to 10,000 ⁇ g/mL.
  • concentration 5 ⁇ g/mL to 5,000 ⁇ g/mL, 50 ⁇ g/mL to 5,000 ⁇ g/mL, and more preferably 1 ⁇ g/mL to 1,000 ⁇ g/mL or 100 ⁇ g/mL to 1,000 ⁇ g/mL.
  • the lysozyme-chitosan complex of the present invention can also be used, for example, at least 0.0001% by mass, at least 0.001% by mass, at least 0.005% by mass, and at least 0.01% by mass, based on the entire mass of the pharmaceutical composition of the present invention. It is appropriate to contain at least 0.05% by mass, at least 0.1% by mass, at least 0.5% by mass, or at least 1% by mass. Furthermore, the lysozyme-chitosan complex of the present invention is, for example, 5.0% by mass or less, 1% by mass or less, 0.5% by mass or less, 0.1% by mass or less with respect to the entire mass of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the preferable content range of the lysozyme-chitosan complex of the present invention may be an appropriate combination of these lower and upper limits, and is, for example, 0.001% by mass to 5.0% by mass, preferably 0.001% by mass to 5.0% by mass, preferably 0.001% by mass to 5.0% by mass. 0.05% by mass to 1.0% by mass, more preferably 0.01% by mass to 0.5% by mass.
  • the additional active ingredient may be present in the pharmaceutical composition of the present invention, for example, from 0.00001% to 20% by weight, preferably from 0.00005% to 10% by weight, more preferably from 0.0001% to 5% by weight. It is suitable that the content is preferably 0.0005% to 3% by mass, particularly preferably 0.001% to 1% by mass.
  • the mass ratio of the lysozyme-chitosan complex of the present invention to the additional active ingredient is, for example, 99/1 to 1/99, preferably 90/10 to 10/90, more preferably 80/20 to 20/99. 80, more preferably 60/40 to 40/60, particularly preferably 50/50.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain mostly a solvent such as water; for example, in the pharmaceutical composition of the present invention, the solvent may be 95% by mass or more, preferably 98% by mass or more, and more preferably 99% by mass. % or more, more preferably 99.5% by mass or more.
  • the present invention further relates to an antiprotozoal composition containing a complex of lysozyme and chitosan. Details such as the content of the complex of lysozyme and chitosan that may be included in the antiprotozoal composition, additional active ingredients, and other ingredients are all as described in the above pharmaceutical composition. be.
  • the present invention further relates to an anti-adhesive agent containing a complex of lysozyme and chitosan. Details such as the content of the complex of lysozyme and chitosan that may be included in the anti-adhesive agent, additional active ingredients, other ingredients, etc. are all as described in the above pharmaceutical composition. . Without being bound by theory, this anti-adhesion property may be due to the fact that a complex of lysozyme and chitosan binds to Acanthamoeba through an electrostatic mechanism, thereby preventing Acanthamoeba from adhering to surfaces such as plastics.
  • anti-adhesive agents are usually included in contact lens cleaning solutions and storage solutions.
  • the content of the anti-adhesive agent in the cleaning solution or preservation solution can be defined by the proportion of the complex containing lysozyme and chitosan contained in the anti-adhesion agent.
  • the complex combined with It is appropriate that the content be 100 ⁇ g/mL or more.
  • the lysozyme-chitosan complex of the present invention may be present in 1 mL of the cleaning solution or preservation solution of the present invention, for example, 100,000 ⁇ g/mL or less, 50,000 ⁇ g/mL or less, 10,000 ⁇ g/mL or less, 5,000 ⁇ g/mL, It is appropriate to contain 1,000 ⁇ g/mL or less.
  • the preferable content range of the lysozyme-chitosan complex of the present invention may be an appropriate combination of these lower and upper limits, and is, for example, 0.01 ⁇ g/mL to 100,000 ⁇ g/mL, preferably 0.01 ⁇ g/mL to 100,000 ⁇ g/mL.
  • a suitable range is 5 ⁇ g/mL to 10,000 ⁇ g/mL, more preferably 0.1 ⁇ g/mL to 1,000 ⁇ g/mL.
  • the contact lens may be a commonly used soft contact lens or a hard contact lens.
  • Cleaning and storage solutions include physiological saline, purified water containing ingredients such as surfactants, thickeners, and wetting agents, even those normally used for cleaning and preserving contact lenses. It may also be a storage solution for blister packs used for new, uninstalled contact lenses.
  • the present invention may include a method for treating or preventing inflammation caused by Acanthamoeba by administering to a subject a pharmaceutical composition containing a complex of lysozyme and chitosan.
  • the treatment or prophylaxis is directed, for example, to treating or preventing infections, corneal inflammations and/or diseases of the skin or the eye, in particular the cornea of the eye.
  • the therapeutic or preventive effect is due to the antiprotozoal and/or anti-adhesive properties of the complex of lysozyme and chitosan.
  • compositions and various definitions used in the treatment or prevention method are as described above, and may contain additional active ingredients, as well as the definitions of lysozyme, chitosan, etc.
  • contents and content rates of the active ingredients and other ingredients are all as explained in the above pharmaceutical composition.
  • subject includes humans as well as mammals such as cats, dogs, monkeys, cows, and horses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on its dosage form, administration target, administration route, target disease, symptoms, etc., but for example, in the case of a spray formulation to be sprayed on the skin of the human body, hands, fingers, etc.
  • the daily dosage is, for example, 0.1 to 20 mg/kg body weight, preferably 0.2 to 10 mg/kg body weight, more preferably 0.5 to 10 mg/kg body weight, and this amount is administered once a day to It may be advisable to administer several times (eg, 2, 3, 4 or 8 times).
  • This dosage can be preferably applied not only to sprays but also to other formulations such as creams described below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and no special techniques are required to formulate these formulations, and they can be formulated using commonly used techniques.
  • Dosage forms include creams, ointments, poultices, liquids, sprays, gels, injections, tablets, suppositories, capsules, granules, powders, eye drops, and eye ointments. , poultices, liquids, and sprays are particularly preferred.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected depending on the above-mentioned administration form.
  • the administration method may be any known administration method; for example, in the case of a cream, the pharmaceutical composition of the present invention may be applied to the inflamed area at the above dosage.
  • an antiprotozoal composition containing a complex of lysozyme and chitosan can be used to prevent, eliminate, protozoomide, antiprotozoate, etc. protozoa such as Acanthamoeba.
  • protozoa such as Acanthamoeba.
  • the meaning of antiprotozoal is as described above.
  • the subject is a mammal such as a human, the explanation of the therapeutic method, preventive method, dosage, dosage form, and administration method regarding the above-mentioned pharmaceutical composition can be applied to this antiprotozoal method.
  • the usage amount, usage form, and usage method can be appropriately selected according to the treatment method, prevention method, dosage, dosage form, and administration method related to the above-mentioned pharmaceutical composition.
  • the antiprotozoal composition may be applied as a liquid or spray to the contact lens case.
  • the present invention uses an anti-adhesion agent containing a complex of lysozyme and chitosan to prevent and remove the adhesion of protozoa such as Acanthamoeba.
  • the meaning of anti-adhesion and the object of adhesion are as described above.
  • the explanations of the treatment method, preventive method, dosage, form, and method of administration regarding the above-mentioned pharmaceutical composition can be applied.
  • the object of anti-adhesion is a contact lens case
  • the anti-adhesion agent may be mixed as a liquid into a contact lens cleaning solution or storage solution.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing inflammation caused by Acanthamoeba, an antiprotozoal composition, and an anti-adhesive agent containing a complex of lysozyme and chitosan.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing inflammation caused by Acanthamoeba an antiprotozoal composition, and an anti-adhesive agent containing a complex of lysozyme and chitosan.
  • This may include the use of a complex of lysozyme and chitosan.
  • the complex of lysozyme and chitosan is optionally mixed with additional active ingredients and other ingredients other than the complex, and It may also be used as a composition.
  • a known method can be used, but for example, in the case of a liquid preparation, a complex of lysozyme and chitosan combined and any other components mentioned above are added to a solvent such as water and mixed. If necessary, an emulsifier is added and mixed to form a dispersant or emulsion, and a liquid preparation is prepared.
  • the pharmaceutical composition, antiprotozoal composition, and anti-adhesive agent can be the wash water used in the nebulizer.
  • spraying the pharmaceutical composition, the antiprotozoal composition, and the anti-adhesion agent to the necessary locations it is possible to suppress the proliferation and adhesion of protozoa such as Acanthamoeba and to kill the protozoa.
  • the pharmaceutical composition, antiprotozoal composition, and anti-adhesive agent of the present embodiment have, for example, an antiprotozoal effect and an anti-adhesive effect on Acanthamoeba, and treat inflammation caused by these. , has suppressive and preventive effects.
  • a complex of lysozyme and chitosan is also referred to as a lysozyme-chitosan complex, Rizox, or LYZOX (registered trademark of Wako Filter Technology Co., Ltd.).
  • Example preparation ⁇ Lysozyme-chitosan complex (LYZOX/LYZOX (registered trademark) solution)
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • LYZOX registered trademark
  • lysozyme and water-soluble chitosan are mixed and dissolved in water, and then freeze-dried to form a powder, and the conditions of temperature, humidity, and number of days are sufficient to completely complete the Maillard reaction.
  • the lysozyme-chitosan complex (LYZOX (registered trademark)) used in the present invention is obtained by the Maillard reaction described below.
  • the lysozyme-chitosan complex (LYZOX (registered trademark)) is mixed with sterilized water so that the lysozyme-chitosan complex has the desired concentration in each experimental example, and the desired lysozyme-chitosan complex (LYZOX/LYZOX (registered trademark)) solution.
  • chitosan oligosaccharide Korean Chitosan Oligosaccharide COS-A, manufactured by Kimika Co., Ltd.
  • chitosan oligosaccharide was used as chitosan, and the chitosan oligosaccharide was adjusted to the desired concentration in each experimental example. It was mixed with sterilized water to form a solution of the target chitosan alone.
  • the mixture of lysozyme and chitosan is prepared by mixing the above-mentioned lysozyme and chitosan so that the mass ratio is 1:1, and further, the mixture, lysozyme, and chitosan are mixed to a desired concentration. Prepared by mixing sterile water.
  • ⁇ Acanthamoeba solution (suspension) Acanthamoeba polyphaga (obtained from American Type Culture Collection (ACC), 30872 TM ) was dispersed in a solvent: phosphate buffered saline to prepare an Acanthamoeba solution containing 1 x 10 5 Acanthamoeba per mL of solution. did.
  • ⁇ Test piece The polypropylene test piece used in the adhesion test described below was obtained from Johoku Co., Ltd., product number: PP_A3, and had dimensions of 320 mm long x 440 mm wide x 0.25 mm thick. A piece cut to 15 mm in length, 15 mm in width, and 0.25 mm in thickness was used in each experiment. Details of each specific experimental example are as shown below.
  • Experimental example 1 (adhesion test and cell death test) In order to verify the anti-adhesion and antiprotozoal properties of the lysozyme-chitosan complex (LYZOX (registered trademark)), an adhesion test and a cell death test were conducted. Specifically, the above-mentioned Acanthamoeba solution was added to the above-mentioned lysozyme-chitosan complex (LYZOX (registered trademark)) solution, and the lysozyme-chitosan complex was 0.1 ⁇ g, 1 ⁇ g, and 10 ⁇ g in 1 mL of the mixed solution. Mixed solutions were prepared to have concentrations of , 100 ⁇ g, and 1000 ⁇ g.
  • a control solution containing no lysozyme-chitosan complex at a concentration of 0 ⁇ g/mL was prepared.
  • the same sterilized water used in preparing the lysozyme-chitosan complex was used as a diluent to adjust the concentration.
  • These six types of solutions all contain 1 ⁇ 10 5 Acanthamoeba per mL of solution.
  • the above-mentioned polypropylene test piece was immersed in the prepared mixed solution, left to stand, and removed from the mixed solution after 60 minutes of immersion, and the test piece was soaked in phosphate buffered saline (PBS, source: Fujifilm Wa Washed with Hikari Pure Chemical Industries, Product Number: 166-23555) and dried.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the surface of the obtained test piece was observed with a biological microscope (obtained from Nikon, product number: ECLIPSEE-200), and the Acanthamoeba adhered to the observation area of 5 x 5 mm on the test piece surface was counted. Thereafter, trypan blue was applied to the observation area to stain the dead Acanthamoeba and the number of dead Acanthamoeba was counted.
  • Table 1 below, FIG. 2, and FIG. 3.
  • the lysozyme-chitosan complex caused Acanthamoeba cell death in a concentration-dependent manner.
  • the effect of inhibiting Acanthamoeba adhesion by the lysozyme-chitosan complex was observed from 0.1 ⁇ g/mL, and particularly remarkable adhesion inhibiting effect was observed at concentrations of 1 ⁇ g/mL and higher.
  • the adhesion of Acanthamoeba could be almost suppressed, and a very excellent adhesion suppressing effect was obtained.
  • Experimental example 2 comparative test of adhesion test and cell death test
  • LYZOX registered trademark
  • Table 4 the solutions of the mixture of lysozyme and chitosan described above
  • Table 3 lysozyme alone
  • Table 4 chitosan alone
  • Acanthamoeba was counted in the same manner as in Experimental Example 1, and the number of all Acanthamoeba adhered, the number of dead Acanthamoeba, and the mortality rate of Acanthamoeba were measured.
  • the results are shown in Tables 2 to 4, FIGS. 4 and 5 below.
  • the lysozyme-chitosan complex of the present invention includes a mixture of lysozyme and chitosan of the same mass, and a single lysozyme of the same mass as the lysozyme in the lysozyme-chitosan complex of the present invention.
  • the chitosan in the lysozyme-chitosan composite of the present invention exhibited an excellent adhesion-suppressing effect on Acanthamoeba compared to chitosan alone having the same mass.
  • the lysozyme-chitosan complex is a mixture of lysozyme and chitosan of the same mass, lysozyme alone of the same mass as the lysozyme in the lysozyme-chitosan complex of the present invention, And compared to the chitosan in the lysozyme-chitosan complex of the present invention and chitosan alone having the same mass, it showed superior Acanthamoeba mortality rate, that is, Acanthamoeba inhibitory effect (antiprotozoal effect).
  • the lysozyme-chitosan complex of the present invention achieved almost 100% mortality at 100 ⁇ g/mL and 1000 ⁇ g/mL, whereas the mixture of lysozyme and chitosan, lysozyme alone, and chitosan alone inhibited Acanthamoeba. The effect was incomplete.
  • a contact lens storage solution containing 1 ⁇ 10 6 Acanthamoeba was prepared.
  • the above-mentioned lysozyme-chitosan complex (LYZOX (registered trademark)) solution was added to the Acanthamoeba-containing contact lens storage solution prepared in this way, so that the lysozyme-chitosan complex was 100 ⁇ g (mass 0.
  • a mixed solution with a concentration of 0.01%) was prepared. Separately, distilled water was used as a control. To adjust the concentration, the same sterilized water used for preparing the lysozyme-chitosan complex was used as a diluent.
  • a polypropylene test piece was immersed in the prepared mixed solution in the same manner as in Experimental Example 1, and the Acanthamoeba adhered to the test piece were counted, and the number of dead Acanthamoeba was counted. The results are shown in Table 5, FIG. 6, and FIG. 7 below.

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Abstract

本発明は、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物等を提供することを目的とする。具体的には、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、抗原虫組成物、並びに、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アカントアメーバの抗付着剤等を提供する。

Description

アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物
この発明は、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物等に関するものである。
アカントアメーバは、アメーバ型の原虫（原生生物）の一種で、土壌中等に多く存在する微生物である。アカントアメーバは、眼の、特に角膜に感染し、角膜の炎症を引き起こす。アカントアメーバに起因する炎症は特にコンタクトレンズ装着者に多く、例えば水道水を介してコンタクトレンズケースに付着し、ケース内で増殖し、コンタクトレンズを介して角膜における感染を引き起こす。
これまでアカントアメーバ対策として種々の殺アメーバ剤が開発されてきており、主な例としてはピグアニド系殺菌剤（特許文献１～３）が知られている。しかし、ピグアニド系殺菌剤以外の組成物で強い抗アメーバ作用を示す組成物はあまり知られていない。
国際公開第０２／４９６３号パンフレット 国際公開第ＷＯ２０１３／１５４０１６号パンフレット 国際公開第ＷＯ２０１４／１９２０６８号パンフレット
本発明は、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための新規医薬組成物を提供することを目的とする。本発明は、また、アカントアメーバ等の原虫感染症に対する有効な治療及び予防効果を発揮する抗原虫性組成物、アカントアメーバ等の原虫感染症の治療及び予防方法、及び当該抗原虫性組成物等の製造における医薬組成物の使用方法を提供する。
本発明者らは、新たに、食品添加物としても用いられるほど安全性の高いリゾチーム及びキトサンの複合体を用いて、アカントアメーバに対する抗原虫性及び抗付着性を検証したところ、優れたアカントアメーバに対する抗原虫効果及び抗付着効果を示すことを見出し、本発明に至った。より具体的には、本発明は以下の態様であり得る。
〔１〕リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物。
〔２〕前記キトサンが、分子量１０００Ｄａ～３０，０００Ｄａの水溶性キトサンである、前記〔１〕に記載の医薬組成物。
〔３〕前記医薬組成物中、前記複合体を、０．０１μｇ/ｍＬ～１００，０００μｇ/ｍＬ含有する、前記〔１〕又は〔２〕に記載の医薬組成物。
〔４〕前記医薬組成物中、前記複合体を、０．０００１質量％～５．０質量％含有する、前記〔１〕又は〔２〕に記載の医薬組成物。
〔５〕さらに、過酸化水素水、ポビドンヨード、塩化ポリドロニウム、及び塩酸ポリヘキサニドからなる群から選択される追加の有効成分を含有する、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔６〕アカントアメーバに起因する炎症が、皮膚炎又は角膜炎である、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔７〕前記アカントアメーバに起因する炎症の治療又は予防が、アカントアメーバの付着抑制によって達成される、前記〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔８〕アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体の使用。
〔９〕リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、抗原虫組成物。
〔１０〕前記原虫がアカントアメーバである、前記〔９〕に記載の抗原虫組成物。
〔１１〕リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アカントアメーバの抗付着剤。
〔１２〕リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を物質表面に適用することを含む、物質表面に対するアカントアメーバの付着を防止する方法。
〔１３〕前記物質がポルエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン及びポリカーボネートからなる群から選択される、前記〔１２〕に記載のアカントアメーバの付着を防止する方法。
本発明によれば、アカントアメーバを除去、抗原虫、又は殺原虫する効果、並びにその増殖を抑える効果を奏する。特に、本発明のリゾチームとキトサンとを結合させた複合体は、アカントアメーバの増殖を抑制するのみならず、有意に死滅させる効果も有する。したがって、本発明によれば、アカントアメーバ感染症の治癒及び／又は予防をすることができる。また、リゾチームは、安全性の高い天然由来の食品添加物としても広く利用されており、このリゾチームとキトサンとの複合体を用いた抗原虫組成物は、利用する患者を安心させるとともに、その負担を軽減することができる。
リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を合成する際の反応の概略図である。 表１の「全アカントアメーバの接着数」の測定の際に観測されたアカントアメーバの生物顕微鏡写真である。 表１の「死亡したアカントアメーバの数」の測定の際に観測された、死亡したアカントアメーバがトリパンブルーで染色されて濃く表示されている状態を示す、生物顕微鏡写真である。 表２～４のリゾチーム及びキトサンの混合物、リゾチーム単体、及びキトサン単体の各溶液を使用した場合の全アカントアメーバの接着数を、表１のリゾチームとキトサンとを結合させた複合体を使用した場合との比較において示すグラフである。 表２～４のリゾチーム及びキトサンの混合物、リゾチーム単体、及びキトサン単体の各溶液を使用した場合のアカントアメーバの死亡率を、表１のリゾチームとキトサンとを結合させた複合体を使用した場合との比較において示すグラフである。 表５のリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と追加の有効成分とを併用した場合の全アカントアメーバの接着数を示すグラフである。 表５のリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と追加の有効成分とを併用した場合のアカントアメーバの死亡率を示すグラフである。
以下に本発明の一実施形態を詳述する。なお、なお、以下で例示する好ましい態様やより好ましい態様等は、「好ましい」や「より好ましい」等の表現にかかわらず適宜相互に組み合わせて使用することができる。また、数値範囲の記載は例示であって、各範囲の上限と下限並びに実施例の数値とを適宜組み合わせた範囲も好ましく使用することができる。さらに、「含有する」又は「含む」等の用語は、「本質的になる」や「のみからなる」と読み替えてもよい。
＜医薬組成物＞
本発明は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物に関する。以下、当該医薬組成物を具体的に説明する。
「リゾチームとキトサンとを結合させた複合体」とは、リゾチームとキトサンとを、例えばメイラード反応等により結合させた複合体である（図１参照）。リゾチームと水溶性キトサンとをメイラード反応により結合させることで、リゾチーム中の抗原構造のほとんど又はすべてがマスクされるため、リゾチーム－キトサン複合体をヒトが摂取してもアレルギーを起こしにくいという特徴がある。その他、架橋剤を使用してリゾチームとキトサンとを共有結合させて上記複合体を得ることもできる。
ここで「リゾチーム」は、ムコ多糖類を加水分解する酵素であり、ニワトリ由来のリゾチーム、ヒト由来のリゾチームを好ましく用いることができる。
リゾチームの分子量の上限は、例えば、３０，０００Ｄａ以下であり、より好ましくは２５，０００Ｄａ以下、２０，０００Ｄａ以下、１８，０００Ｄａ以下、１５，０００Ｄａ以下であってもよい。またリゾチームの分子量の下限は特に制限しなくてもよいが、例えば、１，０００Ｄａ以上、好ましくは、５，０００Ｄａ以上、１０，０００Ｄａ以上、１２，０００Ｄａ以上であってもよい。当該リゾチームの分子量の範囲は、上記いずれかの上限値及び下限値の間の範囲であり得るが、例えば、１０００Ｄａ～３０，０００Ｄａ、好ましくは５，０００Ｄａ～２０，０００Ｄａであり、より好ましくは１０，０００Ｄａ～１５，０００Ｄａであり得る。
「キトサン」は、以下の化学式（Ｉ）で示されるポリ-β1→4-グルコサミンである（(C6H11NO4)n、CAS登録番号9012-76-4）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
当該キトサンは水溶性である。キトサンの分子量の上限は、例えば、３０，０００Ｄａ以下であり、より好ましくは２０，０００Ｄａ以下、１５，０００Ｄａ以下、１０，０００Ｄａ以下、７，０００Ｄａ以下であってもよい。またキトサンの分子量の下限は特に制限しなくてもよいが、例えば、３００Ｄａ以上、好ましくは、５００Ｄａ以上、１，０００Ｄａ以上、３，０００Ｄａ以上であってもよい。当該キトサンの分子量の範囲は、上記いずれかの上限値及び下限値の間の範囲であり得るが、例えば、３００Ｄａ～３０，０００Ｄａ、好ましくは５００Ｄａ～１５，０００Ｄａであり、より好ましくは１，０００Ｄａ～１０，０００Ｄａ、特に好ましくは３，０００Ｄａ～７，０００Ｄａであり得る。抗原虫性に着目すると、分子量の大きいキトサンの方が有利となり、製造のしやすさに着目すると、分子量の小さいキトサンの方が溶解性及び安定性が良好となり、低分子量のキトサンの方が有利となる。
なお、ここでキトサンと言うときは、上記キトサンの他、キトサンオリゴ糖やグルコサミンを含む意味とする。キトサンオリゴ糖は、上記式（I）で示される、Dグルコサミンが数個程度連なったもので、低分子のキトサン、又は狭義のキトサンを塩酸または酵素で加水分解したものを意味する。
上記架橋剤としては、例えば、アミン反応性架橋剤（例えば、アルコキシアミン）、カルボニル反応性架橋剤（例えば、ヒドラジン化合物）、及びスルフヒドリル反応性架橋剤等を挙げることができる。
リゾチーム／キトサンの質量比は、例えば、９９／１～１／９９、好ましくは９０／１０～１０／９０、より好ましくは８０／２０～２０／８０、さらに好ましくは６０／４０～４０／６０、特に好ましくは５０／５０となることが適当である。
具体的なリゾチームとキトサンとを結合させた複合体の製造方法としては、例えば次のようなものが挙げられる。まず、上記質量比のリゾチームとキトサンとを水に混合溶解し、得られた水溶液中のリゾチーム及びキトサンの合計質量が５～３０質量％となるように調製する。得られた水溶液を凍結乾燥して粉末化する。得られた粉末を、例えば５０～８０℃、好ましくは５５～６５℃の温度と、例えば５０～８０％、好ましくは６０～７０％の相対湿度の条件下で、例えば２～２０日、より好ましくは７～１４日、メイラード反応させることにより本発明のリゾチームとキトサンとを結合させた複合体を製造することができる。
本実施形態のリゾチーム－キトサン複合体が生成しているか否かは、種々の公知の方法で確認できるが、例えば、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）やＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ポリアクリルアミド電気泳動により得られるプレートを、染色処理することによって、蛋白質－キトサン複合体である高分子物質の生成を確認することができる。
「アカントアメーバ」（Acanthamoeba polyphaga）は、原生動物であり、原虫、特に根足虫類に分類されるアメーバの一種であり、例えば土壌や淡水中に存在する。上述したように、アカントアメーバは、皮膚や眼、特に眼の角膜に感染し、皮膚の炎症や角膜の炎症を引き起こす。アカントアメーバに起因する炎症は特にコンタクトレンズ装着者に多く、例えば水道水を介してアカントアメーバがコンタクトレンズケースに付着し、ケース内でアカントアメーバが増殖し、コンタクトレンズ保存液やコンタクトレンズを介して角膜にアカントアメーバが感染して炎症を引き起こす。炎症としては皮膚炎や眼の角膜炎が挙げられる。特に、本発明は、角膜充血、角膜混濁、放射状角膜神経炎、円盤状角膜潰瘍、強膜炎、眼内炎等の眼の障害への効果が期待できる。
本発明は、「アカントアメーバ」に対して抗原虫性を有する。「原虫」はアカントアメーバ等アメーバを含む意味である。ここで抗原虫性とは広く原虫の予防、除去、殺原虫、抗原虫等を含め、原虫数が同等又はそれ以下になる場合、少なくとも原虫を増殖させない全ての状態を意味する。なお、原虫の除去は、原虫を取り除くこと全般を意味し、殺原虫を含む意味である。殺原虫は少なくとも一部の原虫を死滅させることを意味する。従って、本発明において抗原虫組成物とは、原虫除去用組成物、殺原虫組成物、原虫除去剤、殺原虫剤、及び抗原虫剤を含む意味である。
特に本発明は、アカントアメーバがコンタクトレンズケースなどの物質に付着することを防止する、抗付着剤としても利用できる。アカントアメーバはコンタクトレンズケースのようなプラスチック表面に付着しやすい性質を有するが、本発明がコンタクトレンズ用洗浄液中等に存在することによって、アカントアメーバの当該付着を抑制することができる。上述した前記アカントアメーバに起因する炎症の治療又は予防は、アカントアメーバの付着抑制によっても達成され得る。本発明のアカントアメーバに対する抗付着性は、コンタクトレンズケースに使用されるポリプロピレンの他、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリビニルポリマー、メラミン樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、アクリル樹脂、シリコーン、エラストマー、ゴム等のコンタクトレンズケース、洗浄液用ボトル、未装着コンタクトレンズを封入するブリスターパック、玩具等で使用される高分子樹脂組成物、ヒドロキシエチルメタクリレート、シリコーンハイドロゲル、ポリメチルメタクリレート、ガラス等のコンタクトレンズ用材料、紙、金属、布、木材、セラミックス、皮等の種々の物質表面に対して効果を発揮する。なお、ここで言う物質は、皮膚などの人体又は動物及びそれらの一部分を含まないこととすることができる。
本発明は、さらに「アカントアメーバ」に起因する炎症の治療及び予防に効果的である。ここで、「治療」とは、本発明の対象である炎症を完全に治癒することの他、炎症を抑制して重傷度を低下させることを含む。「予防」とは、本発明の対象である炎症の病歴がない場合の他、本発明の対象である炎症が治癒した後に当該炎症が再発しないように防止することを含む。
本発明の医薬組成物には、上記複合体の他に、１種以上の追加の有効成分を任意に含むことができる。追加の有効成分としては、それ自体が有効成分として作用するものの他、それ自体は有効成分として作用しないものの、本発明の有効成分である上記複合体と併用することによって効果を発揮するもの（補助剤）も含む。追加の有効成分としては、例えば、ピグアニド系殺菌剤、過酸化水素水、ポビドンヨード（１－ビニル－２－ピロリドンの重合物とヨウ素の複合体）、塩化ポリドロニウム（ポリクォッド（登録商標））、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）、テルペンアルコール、脂肪酸、及び／又は該脂肪酸の塩を挙げることができる。これらの追加の有効成分を１種又はそれ以上添加することにより、本発明の複合体と相まって、相加効果及び／又は相乗効果を得ることができる。特に好ましくは、過酸化水素水、ポビドンヨード（１－ビニル－２－ピロリドンの重合物とヨウ素の複合体）、塩化ポリドロニウム（ポリクォッド（登録商標））、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）である。
テルペンアルコールとしては、例えば、テルピネン－４－オール、ヒノキチオール、ゲラニオール、及びメントール等を挙げることができる。脂肪酸としては、例えば、炭素数８～１２の脂肪酸、好ましくはデカン酸（カプリン酸）又はラウリン酸を挙げることができる。脂肪酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、及びカルシウム塩等を挙げることができる。その他、アカントアメーバに起因する炎症に効果があることが知られている塩酸ポリヘキサミド、ラクトフェリン、ホウ酸及び／又はその塩、カスボファンギン及び／又はその塩、ポリコナゾール、ミコナゾール、エコナゾール、スルコナゾール、フルコナゾール、第四級アンモニウム系消毒剤、キチナーゼ等を、当該追加の有効成分として加えてもよい。
本発明の医薬組成物には、上記複合体の他に、１種以上のその他の成分を任意に含むことができる。その他の成分としては、例えば、賦形剤、結合剤、乳化剤、溶剤、粘着剤、崩壊剤、粘稠剤、滑沢剤、着色剤、流動剤、保湿剤等の添加剤を挙げることができる。
保湿剤としては、例えば、グリセリン、ブチレングリコール、コラーゲン、ヒアルロン酸、及びセラミドを挙げることができる。
結合剤としては、例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを挙げることができる。
乳化剤としては、例えば、レシチン、ポリエチレングリコール（ＰＧ）、ＰＧ－水添ヒマシ油、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びセテス等を挙げることができる。
溶剤としては、例えば、水、エタノール、１－ブタノール、２－ブタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ペンタノール等を挙げることができる。
本発明のリゾチーム－キトサン複合体は、本発明の医薬組成物１ｍＬ中、例えば、０．０１μｇ/ｍＬ以上、０．０５μｇ/ｍＬ以上、０．１μｇ/ｍＬ以上、０．５μｇ/ｍＬ以上、１μｇ/ｍＬ以上、１０μｇ/ｍＬ以上、５０μｇ/ｍＬ以上、１００μｇ/ｍＬ以上含有することが適当である。また本発明のリゾチーム－キトサン複合体は、本発明の医薬組成物１ｍＬ中、例えば、１００，０００μｇ/ｍＬ以下、５０，０００μｇ/ｍＬ以下、１０，０００μｇ/ｍＬ以下、５，０００μｇ/ｍＬ以下、１，０００μｇ/ｍＬ以下含有することが適当である。本発明のリゾチーム－キトサン複合体の好ましい含有量の範囲は、これらの下限及び上限を適宜組み合わせた範囲であってよいが、例えば、０．１μｇ/ｍＬ～１０，０００μｇ/ｍＬ、好ましくは０．５μｇ/ｍＬ～５，０００μｇ/ｍＬや５０μｇ/ｍＬ～５，０００μｇ/ｍＬ、より好ましくは１μｇ/ｍＬ～１，０００μｇ/ｍＬや１００μｇ/ｍＬ～１，０００μｇ/ｍＬとすることが適当である。
本発明のリゾチーム－キトサン複合体は、また、本発明の医薬組成物全体の質量に対し、例えば、０．０００１質量％以上、０．００１質量％以上、０．００５質量％以上、０．０１質量％以上、０．０５質量％以上、０．１質量％以上、０．５質量％以上、又は１質量％以上含有することが適当である。また本発明のリゾチーム－キトサン複合体は、本発明の医薬組成物全体の質量に対し、例えば、５．０質量％以下、１質量％以下、０．５質量％以下、０．１質量％以下０．０５質量％以下、０．０１質量％以下、０．００５質量％以下含有することが適当である。本発明のリゾチーム－キトサン複合体の好ましい含有量の範囲は、これらの下限及び上限を適宜組み合わせた範囲であってよいが、例えば、０．００１質量％～５．０質量％、好ましくは０．００５質量％～１．０質量％、より好ましくは０．０１質量％～０．５質量％とすることが適当である。
また、追加の有効成分は、本発明の医薬組成物中、例えば、０．００００１質量％～２０質量％、好ましくは０．００００５質量％～１０質量％、より好ましくは０．０００１質量％～５質量％、さらに好ましくは０．０００５質量％～３質量％、特に好ましくは０．００１質量％～１質量％含有することが適当である。本発明のリゾチーム－キトサン複合体と、当該追加の有効成分との質量比は、例えば、９９／１～１／９９、好ましくは９０／１０～１０／９０、より好ましくは８０／２０～２０／８０、さらに好ましくは６０／４０～４０／６０、特に好ましくは５０／５０となることが適当である。
さらに、その他の成分は、各成分によって適切な含有量は適宜調節する必要があるが、例えば、０．１質量％～９０質量％、好ましくは１質量％～７０質量％、より好ましくは１０質量％～５０質量％含有することが適当である。なお、本発明の医薬組成物は、そのほとんどは水などの溶媒であり得、例えば、本発明の医薬組成物中、溶媒を９５質量％以上、好ましくは９８質量％以上、より好ましくは９９質量％以上、さらに好ましくは９９．５質量％以上含有することが適当である。
＜抗原虫組成物＞
本発明は、さらに、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する抗原虫組成物に関する。抗原虫組成物中に含まれ得るリゾチームとキトサンとを結合させた複合体の含有量等の詳細、追加の有効成分、その他の成分等の詳細は、すべて上述した医薬組成物の説明の通りである。
＜抗付着剤＞
本発明は、さらに、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する抗付着剤に関する。抗付着剤中に含まれ得るリゾチームとキトサンとを結合させた複合体の含有量等の詳細、追加の有効成分、その他の成分等の詳細は、すべて上述した医薬組成物の説明の通りである。理論に縛られるものではないが、この抗付着性は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体が静電的機序によりアカントアメーバに結合し、もってプラスチック等の表面へのアカントアメーバの付着を抑制するものと考えられる。リゾチームとキトサンとを結合させた複合体は正に帯電する一方、アカントアメーバは負に帯電するので、アカントアメーバの物質表面への付着と当該複合体の付着とが競合し、抗付着作用が得られるものと考えられる。
なお、抗付着剤は、通常コンタクトレンズの洗浄液や保存液中に含められる。洗浄液や保存液中における抗付着剤の含有量は、抗付着剤に含まれるリゾチームとキトサンとを結合させた複合体の割合で規定することができ、洗浄液や保存液１ｍＬ中、当該リゾチームとキトサンとを結合させた複合体が、例えば、０．００１μｇ/ｍＬ以上、０．０１μｇ/ｍＬ以上、０．１μｇ/ｍＬ以上、０．５μｇ/ｍＬ以上、１μｇ/ｍＬ以上、１０μｇ/ｍＬ以上、５０μｇ/ｍＬ以上、１００μｇ/ｍＬ以上含有することが適当である。また本発明のリゾチーム－キトサン複合体は、本発明の洗浄液や保存液１ｍＬ中、例えば、１００，０００μｇ/ｍＬ以下、５０，０００μｇ/ｍＬ以下、１０，０００μｇ/ｍＬ以下、５，０００μｇ/ｍＬ、１，０００μｇ/ｍＬ以下含有することが適当である。本発明のリゾチーム－キトサン複合体の好ましい含有量の範囲は、これらの下限及び上限を適宜組み合わせた範囲であってよいが、例えば、０．０１μｇ/ｍＬ～１００，０００μｇ/ｍＬ、好ましくは０．５μｇ/ｍＬ～１０，０００μｇ/ｍＬ、より好ましくは０．１μｇ/ｍＬ～１，０００μｇ/ｍＬとすることが適当である。
ここで、コンタクトレンズとしては、一般に使用されるソフトコンタクトレンズであってもハードコンタクトレンズであってもよい。洗浄液や保存液としては、生理食塩水をはじめ、界面活性剤、増粘剤、湿潤剤などの成分を含む精製水など、通常コンタクトレンズの洗浄や保存のために使用されるものであってもよく、また、新品の未装着コンタクトレンズに使用されるブリスターパックの保存液であってもよい。
＜治療方法、予防方法＞
本発明は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する医薬組成物を対象者に投与して、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための方法を含み得る。当該治療又は予防は、例えば、皮膚や眼、特に眼の角膜に対する感染、角膜の炎症及び／又は疾患を治療または予防することに向けられている。理論に縛られないが、当該治療又は予防効果は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体の上記抗原虫性及び／又は抗付着性に起因すると言われている。
ここで当該治療又は予防するための方法に使用される医薬組成物や各種定義の詳細は上述した通りであり、追加の有効成分等を含み得る点、その他、リゾチームやキトサンなどの各定義、追加の有効成分やその他の成分の含有量並びに含有率等は、すべて上述の医薬組成物の説明の通りである。
ここで「対象者」は、ヒトの他、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマなどの哺乳動物を含む。
＜投与量、投与形態、投与方法＞
本発明の医薬組成物は、その剤型、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状等によっても異なるが、例えば、ヒトの体、手、指等の皮膚に噴霧するスプレー剤の形態の場合、一日投与量は、例えば、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．２～１０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．５～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１日１回～数回（例、２回、３回、４回又は８回）投与するのが望ましい。この投与量は、スプレー剤以外にも以下で説明するクリーム等の他の製剤においても好ましく適用できる。
本発明の医薬組成物は、経口でも非経口でも投与することができ、これらの製剤化には特別な技術は必要なく、汎用される技術を用いて製剤化をすることができる。投与剤型としては、クリーム、軟膏、ハップ剤、液剤、スプレー剤、ゲル剤、注射剤、錠剤、坐剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、点眼剤、眼軟膏などが挙げられ、クリーム、軟膏、ハップ剤、液剤、スプレー剤が特に好ましい。
本発明の医薬組成物は、上記投与形態に合わせて適宜投与方法を選択し得る。投与方法は公知の投与方法でよく、例えば、クリームの場合、本発明の医薬組成物を炎症箇所に上記投与量で塗布すればよい。
＜抗原虫方法、使用量、使用形態、使用方法＞
本発明は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する抗原虫組成物を対象に使用して、アカントアメーバ等の原虫の予防、除去、殺原虫、抗原虫等を行うことができる。抗原虫性の意味は上述したとおりである。対象がヒト等哺乳動物の場合、上記医薬組成物に関する治療方法、予防方法、投与量、投与形態、投与方法の説明がこの抗原虫方法に適用できる。対象が非ヒトの場合も適宜上述した医薬組成物に関する治療方法、予防方法、投与量、投与形態、投与方法に準じてその使用量、使用形態、使用方法を選択することができる。例えば、対象がコンタクトレンズケースの場合、抗原虫組成物を液剤やスプレー剤としてコンタクトレンズケースに散布してもよい。
＜抗付着方法、使用量、使用形態、使用方法＞
本発明は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する抗付着剤を対象に使用して、アカントアメーバ等の原虫の付着の予防及び除去等を行う。抗付着性の意味及び付着対象は上述したとおりである。抗付着剤の使用量、使用形態、使用方法は、上記医薬組成物に関する治療方法、予防方法、投与量、投与形態、投与方法の説明を適用できる。例えば、抗付着の対象がコンタクトレンズケースの場合、コンタクトレンズの洗浄液や保存液中に当該抗付着剤を液剤として混合してもよい。
＜使用＞
本発明は、また、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物、抗原虫組成物、並びに抗付着剤の製造における、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体の使用を含み得る。
当該医薬組成物、抗原虫組成物、並びに抗付着剤の製造において、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体は、複合体以外の追加の有効成分やその他の成分と共に任意に混合され、当該医薬組成物等としてもよい。当該混合方法としては、公知の方法を用いることができるが、例えば液剤の場合、水などの溶剤に、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体及び上記任意のその他の成分等を加え、混合し、必要に応じて乳化剤を加えて混合して分散剤又はエマルジョンとし、液剤が調製される。
この医薬組成物、抗原虫組成物、並びに抗付着剤は、ネブライザーに用いられる洗浄水とすることができる。これにより医薬組成物、抗原虫組成物、並びに抗付着剤を必要な場所に噴霧することで、アカントアメーバ等の原虫の増殖や付着を抑制し、かつ当該原虫を死滅させることができる。
また、本実施形態の医薬組成物、抗原虫組成物、並びに抗付着剤は、例えば、アカントアメーバに対して抗原虫効果や抗付着効果等を有し、及びこれらに起因する炎症に対して治療、抑制、予防効果を有する。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、本明細書及び図面において、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体は、リゾチーム－キトサン複合体、リゾックス、又はＬＹＺＯＸ（和興フィルタテクノロジー株式会社の登録商標）ともいう。
［試料の調製］
・リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液
リゾチームとキトサンとを結合させた複合体（リゾチーム－キトサン複合体）の溶液として、市販のＬＹＺＯＸ（登録商標、和興フィルタテクノロジー株式会社製）を使用した。市販のＬＹＺＯＸ（登録商標）は、ニワトリ由来のリゾチーム（約１４，０００Ｄａ）と、約５，０００Ｄａの水溶性キトサン（キトサンオリゴ糖）とを１：１の質量比で含む粉末である。具体的には、上記リゾチームと水溶性キトサンとを、水に混合溶解し、その後凍結乾燥させることによって、粉末状とし、さらにメイラード反応が完全に終了するのに十分な温度、湿度及び日数の条件下でメイラード反応させることによって本発明において使用するリゾチーム－キトサン複合体（ＬＹＺＯＸ（登録商標））を得ている。当該リゾチーム－キトサン複合体（ＬＹＺＯＸ（登録商標））を、各実験例において当該リゾチーム－キトサン複合体が所望の濃度となるように滅菌水と混合し、目的のリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液とした。
・リゾチーム単体の溶液
リゾチーム単体の溶液は、卵白リゾチーム　分子量約１４３００（日本バイオコン(株)製、愛知県）を、各実験例において当該リゾチームが所望の濃度となるように滅菌水と混合し、目的のリゾチーム単体の溶液とした。
・キトサン単体の溶液
キトサン単体の溶液は、キトサンオリゴ糖（(株)キミカ社製キミカキトサンオリゴ糖 COS-A）をキトサンとして用い、各実験例において当該キトサンオリゴ糖が所望の濃度となるように滅菌水と混合し、目的のキトサン単体の溶液とした。
・リゾチーム及びキトサンの混合物の溶液
リゾチーム及びキトサンの混合物は、上記リゾチーム単体：キトサン単体の質量比が１：１となるように両者を混合し、さらに当該混合物、リゾチーム、及びキトサンが所望の濃度となるように滅菌水を混合し、調製した。
・アカントアメーバ溶液（懸濁液）
アカントアメーバ（Acanthamoeba polyphaga、入手先American Type Culture Collection (ACC)、30872TM）を溶媒：リン酸緩衝生理食塩水に分散してアカントアメーバを溶液１ｍＬ当たり１×１０5個含有するアカントアメーバ溶液を調製した。
・試験片
後述する接着性試験で使用したポリプロピレン製試験片は、入手先：ジョーホク（株）、製品番号：PP_A3のポリプロピレンであって、縦320ｍｍ×横440ｍｍ×厚み0.25ｍｍの寸法のものから，縦15mm、横15mm，厚み0.25mmに切断したものを各実験に用いた。
具体的な各実験例の詳細は、下記に示すとおりである。
実験例１（接着性試験及び細胞死試験）
リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））の抗付着性並びに抗原虫性を検証するため、接着性試験及び細胞死試験を行った。
具体的には、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液に、上述したアカントアメーバ溶液を加え、混合溶液１ｍＬ中、リゾチーム－キトサン複合体が０．１μg、１μg、１０μg、１００μg、及び１０００μgの濃度となるように混合溶液を調製した。これとは別にリゾチーム－キトサン複合体を含まない０μg／ｍＬの濃度のコントロール溶液を調製した。濃度の調節には希釈液としてリゾチーム－キトサン複合体の調製の際に使用したものと同じ滅菌水を使用した。これら６種類の溶液には、いずれも溶液１ｍＬ当たり１×１０5個のアカントアメーバが含まれている。
調製した混合溶液に上述したポリプロピレン製試験片を浸漬して静置し、浸漬から６０分経過後に混合溶液から取り出して、該試験片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、入手先：富士フィルム和光純薬、製品番号：166-23555）で洗浄し乾燥した。得られた試験片の表面を生物顕微鏡（入手先：ニコン、製品番号：ECLIPSEE-200）で観測し、試験片表面の５×５ｍｍの観測範囲に接着したアカントアメーバをカウントした。その後、当該観測範囲にトリパンブルーを適用し、死亡したアカントアメーバを染色して死亡したアカントアメーバの数をカウントした。結果を以下の表１及び図２並びに図３に示す。
　　表１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002

表１に示すように、リゾチーム－キトサン複合体は、濃度依存的にアカントアメーバの細胞死を引き起こした。リゾチーム－キトサン複合体によるアカントアメーバの接着抑制効果は０．１μｇ／ｍＬから観察され、特に１μｇ／ｍＬ及びそれ以上の濃度において顕著な接着抑制効果が観察された。１００μｇ／ｍＬ及び１０００μｇ／ｍＬではアカントアメーバの接着をほとんど抑制することができ、非常に優れた接着抑制効果が得られた。リゾチーム－キトサン複合体によるアカントアメーバの抑制効果（抗原虫効果）につき、表１中の死亡したアカントアメーバの数及びアカントアメーバの死亡率を見ると、特に１００μｇ／ｍＬ及び１０００μｇ／ｍＬにおいてほぼ１００％の死亡率を達成しており、顕著な抗原虫作用を有することがわかる。
実験例２（接着性試験及び細胞死試験の比較試験）
上記実験例１のリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液に代えて、上述したリゾチーム及びキトサンの混合物の溶液（表２）、リゾチーム単体（表３）、キトサン単体(表４)を使用した以外は、実験例１と同様にしてアカントアメーバをカウントし、全アカントアメーバの接着数、死亡したアカントアメーバの数、及びアカントアメーバの死亡率を測定した。結果を以下の表２～４、図４及び図５に示す。
　　表２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003

　　表３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　　表４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005

表１～４及び図４から見て取れるように、本発明のリゾチーム－キトサン複合体は、同質量のリゾチーム及びキトサンを混合した混合物、本発明のリゾチーム－キトサン複合体中のリゾチームと同質量のリゾチーム単体、及び本発明のリゾチーム－キトサン複合体中のキトサンと同質量のキトサン単体に比べて、優れたアカントアメーバの接着抑制効果を示した。特に１μｇ／ｍＬ及びそれ以上の濃度においてリゾチーム及びキトサンの混合物、リゾチーム単体、及びキトサン単体と比較した顕著な接着抑制効果が観察された。また、表２～４及び図５から見て取れるように、リゾチーム－キトサン複合体は、同質量のリゾチーム及びキトサンを混合した混合物、本発明のリゾチーム－キトサン複合体中のリゾチームと同質量のリゾチーム単体、及び本発明のリゾチーム－キトサン複合体中のキトサンと同質量のキトサン単体に比べて、優れたアカントアメーバの死亡率、即ちアカントアメーバの抑制効果（抗原虫効果）を示していた。特に１００μｇ／ｍＬ及び１０００μｇ／ｍＬにおいて本発明のリゾチーム－キトサン複合体がほぼ１００％の死亡率を達成しているのに対し、リゾチーム及びキトサンの混合物、リゾチーム単体、及びキトサン単体はアカントアメーバの抑制効果が不完全であった。
実験例３（接着性試験及び細胞死試験の比較試験）
リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と追加の有効成分とを使用した場合の効果、特に相乗的抗付着性並びに抗原虫性を検証するため、接着性試験及び細胞死試験を行った。
まず、アカントアメーバ含有コンタクトレンズ保存液を準備した。具体的には、アカントアメーバ（Acanthamoeba polyphaga、入手先American Type Culture Collection (ACC)、30872TM）を表５に記載された市販の各コンタクトレンズ保存液に溶解して当該保存液１ｍＬ当たりアカントアメーバを１×１０6個含有するアカントアメーバ含有コンタクトレンズ保存液を調製した。
このように調製したアカントアメーバ含有コンタクトレンズ保存液に、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液を加え、混合溶液１ｍＬ中、リゾチーム－キトサン複合体が１００μg（質量０．０１％）の濃度の混合溶液を調製した。これとは別に蒸留水をコントロールとして使用した。濃度の調節には希釈液としてリゾチーム－キトサン複合体の調整の際に使用したものと同じ滅菌水を使用した。
調製した混合溶液に実験例１と同様にしてポリプロピレン製試験片を浸漬し、試験片に接着したアカントアメーバをカウントし、かつ、死亡したアカントアメーバの数をカウントした。結果を以下の表５、図６並びに図７に示す。
　　表５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006


＊：表５中、各保存液の上段は保存液のみ、下段は保存液＋リゾチーム－キトサン複合体
＊１：ClearCareは登録商標、入手先：日本アルコン株式会社、製品名：ＡＯセプトクリアケア（登録商標）
　　　　Cleadewは登録商標、入手先：株式会社オフテクス、製品名：クリアデューファーストケア（登録商標）
　　　　OptiFreeは登録商標、入手先：日本アルコン株式会社、製品名：オプティ・フリー　プラス（登録商標）
　　　　ｒenuは登録商標、入手先：ボシュロムジャパン株式会社、製品名：レニューマルチプラス（登録商標）
表５及び図６に示すように、各コンタクトレンズ保存液のみの場合ではアカントアメーバの接着抑制効果は限定的であるが、コンタクトレンズ保存液とリゾチーム－キトサン複合体とを組み合わせた場合は、顕著な接着抑制効果が観察された。また、リゾチーム－キトサン複合体によるアカントアメーバの抑制効果（抗原虫効果）につき、表５中の死亡したアカントアメーバの数及びアカントアメーバの死亡率及び図７を見ると、追加の有効成分として、特にポビドンヨード及び塩酸ポリヘキサニドとリゾチーム－キトサン複合体とを併用した場合、コンタクトレンズ保存液のみの場合に比べて、良好なアカントアメーバの抑制効果（抗原虫効果）が得られた。
本発明によれば、アカントアメーバに対して新規な医薬組成物、抗原虫組成物及び抗付着剤等を提供することができる。

Claims (13)

  1. 　リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物。
  2. 　前記キトサンが、分子量１０００Ｄａ～３０，０００Ｄａの水溶性キトサンである、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記医薬組成物中、前記複合体を、０．０１μｇ/ｍＬ～１００，０００μｇ/ｍＬ含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 　前記医薬組成物中、前記複合体を、０．０００１質量％～５．０質量％含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 　さらに、過酸化水素水、ポビドンヨード、塩化ポリドロニウム、及び塩酸ポリヘキサニドからなる群から選択される追加の有効成分を含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 　アカントアメーバに起因する炎症が、皮膚炎又は角膜炎である、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 　前記アカントアメーバに起因する炎症の治療又は予防が、アカントアメーバの付着抑制によって達成される、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　アカントアメーバに起因する炎症を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体の使用。
  9. 　リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、抗原虫組成物。
  10. 　前記原虫がアカントアメーバである、請求項９に記載の抗原虫組成物。
  11. 　リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アカントアメーバの抗付着剤。
  12. 　リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を物質表面に適用することを含む、物質表面に対するアカントアメーバの付着を防止する方法。
  13. 　前記物質がポルエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン及びポリカーボネートからなる群から選択される、請求項１２に記載のアカントアメーバの付着を防止する方法。
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ANONYMOUS: " Disinfectant performance of soft contact lens disinfectants against Acanthamoeba - Based on actual usage survey -", NATIONAL CONSUMER AFFAIRS CENTER OF JAPAN, 16 December 2009 (2009-12-16), XP093139811 *

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