WO2020241681A1 - 抗菌性組成物 - Google Patents

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WO2020241681A1
WO2020241681A1 PCT/JP2020/020901 JP2020020901W WO2020241681A1 WO 2020241681 A1 WO2020241681 A1 WO 2020241681A1 JP 2020020901 W JP2020020901 W JP 2020020901W WO 2020241681 A1 WO2020241681 A1 WO 2020241681A1
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lysozyme
chitosan
acinetobacter
complex
solution
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泰成 宮崎
宏紀 影島
章 齊藤
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国立大学法人 東京医科歯科大学
和興フィルタテクノロジー株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an antibacterial composition having antibacterial properties against Acinetobacter and the like.
  • Nontuberculous mycobacteria such as Pseudomonas aeruginosa or MRSA are infectious agents that cause respiratory infections. This infectious disease is regarded as a problem because it becomes intractable. It has recently become clear that a complex in which lysozyme and chitosan are bound is effective against Pseudomonas aeruginosa and MRSA (Patent Document 1). On the other hand, for Acinetobacter, which is recognized as an important bacterium in severe pneumonia, although there are drugs such as colistin and polymyxin B that have been confirmed to be effective to some extent, there are reasons such as nephrotoxic side effects in Japan.
  • Non-Patent Document 1 Acinetobacter (multidrug-resistant Acinetobacter infection) that has become resistant, no effective drug has yet been found, and the invention of a new drug has been awaited.
  • An object of the present invention is to provide an antibacterial composition against Acinetobacter, particularly a multidrug-resistant Acinetobacter.
  • the present invention also provides an antibacterial composition that exerts an effective therapeutic and prophylactic effect on an asinetobacter infection or a multidrug-resistant asinetobacter infection, a method for treating and preventing the same, and the antibacterial composition in the production of the antibacterial agent. Provide usage.
  • the present invention may have the following aspects.
  • the pharmaceutical composition according to the above [6] wherein the Acinetobacter infection is a multidrug-resistant Acinetobacter infection.
  • Acinetobacter has an effect of sterilizing, antibacterial, or sterilizing, and an effect of suppressing its growth.
  • the complex in which lysozyme and chitosan of the present invention are bound not only suppresses the growth of Acinetobacter but also has the effect of significantly killing Acinetobacter. Therefore, according to the present invention, Acinetobacter infection and multidrug-resistant Acinetobacter infection can be cured and / or prevented. Lysozyme is also widely used as a highly safe natural food additive, and this antibacterial composition using a complex of lysozyme and chitosan reassures the patient who uses it and bears the burden. Can be mitigated.
  • the present invention relates to an antibacterial composition having antibacterial activity against Acinetobacter, which contains a complex in which lysozyme and chitosan are bound.
  • the “complex in which lysozyme and chitosan are bound” is a complex in which lysozyme and chitosan are bound by, for example, the Maillard reaction (see FIG. 1).
  • a cross-linking agent can be used to covalently bond lysozyme and chitosan to obtain the above complex.
  • lysozyme is an enzyme that hydrolyzes mucopolysaccharides, and chicken-derived lysozyme and human-derived lysozyme can be preferably used.
  • the upper limit of the molecular weight of lysozyme is, for example, 30,000 Da or less, more preferably 25,000 Da or less, 20,000 Da or less, 18,000 Da or less, and 15,000 Da or less.
  • the lower limit of the molecular weight of lysozyme is not particularly limited, but may be, for example, 1,000 Da or more, preferably 5,000 Da or more, 10,000 Da or more, or 12,000 Da or more.
  • the range of the molecular weight of the lysozyme can be between the upper and lower limits of any of the above, and is, for example, 1000 Da to 30,000 Da, preferably 5,000 Da to 20,000 Da, and more preferably 10. It can be between 000 Da and 15,000 Da.
  • "Chitosan” is poly- ⁇ 1 ⁇ 4-glucosamine represented by the following chemical formula (I) ((C 6 H 11 NO 4 ) n , CAS Registry Number 9012-76-4). The chitosan is water soluble.
  • the upper limit of the molecular weight of chitosan is, for example, 30,000 Da or less, more preferably 20,000 Da or less, 15,000 Da or less, 10,000 Da or less, and 7,000 Da or less.
  • the lower limit of the molecular weight of chitosan is not particularly limited, but may be, for example, 300 Da or more, preferably 500 Da or more, 1,000 Da or more, or 3,000 Da or more.
  • the range of the molecular weight of the chitosan may be between the upper limit value and the lower limit value of any of the above, and is, for example, 300 Da to 30,000 Da, preferably 500 Da to 15,000 Da, and more preferably 1,000 Da. It can be up to 10,000 Da, particularly preferably 3,000 Da to 7,000 Da.
  • chitosan with a large molecular weight is more advantageous, and when focusing on ease of production, chitosan with a small molecular weight has better solubility and stability, and chitosan with a low molecular weight is more advantageous.
  • chitosan when used here, it means that chitosan oligosaccharide and glucosamine are included in addition to the above chitosan.
  • the chitosan oligosaccharide is a series of several D glucosamines represented by the above formula (I), and means a low-molecular-weight chitosan or a chitosan in a narrow sense obtained by hydrolysis with hydrochloric acid or an enzyme.
  • cross-linking agent examples include amine-reactive cross-linking agents (for example, alkoxyamines), carbonyl-reactive cross-linking agents (for example, hydrazine compounds), and sulfhydryl-reactive cross-linking agents.
  • amine-reactive cross-linking agents for example, alkoxyamines
  • carbonyl-reactive cross-linking agents for example, hydrazine compounds
  • sulfhydryl-reactive cross-linking agents examples include sulfhydryl-reactive cross-linking agents.
  • the mass ratio of lysozyme / chitosan is, for example, 99/1 to 1/99, preferably 90/10 to 10/90, more preferably 80/20 to 20/80, still more preferably 60/40 to 40/60. Particularly preferably, it is 50/50.
  • Specific examples of the method for producing a complex in which lysozyme and chitosan are bound include the following. First, lysozyme and chitosan having the above mass ratio are mixed and dissolved in water, and the total mass of lysozyme and chitosan in the obtained aqueous solution is adjusted to 5 to 30% by mass. The obtained aqueous solution is freeze-dried and pulverized.
  • the resulting powder is subjected to, for example, 50-80 ° C., preferably 55-65 ° C. and, for example, 50-80%, preferably 60-70% relative humidity, for example 2-20 days, more preferably.
  • lysoteam-chitosan complex of the present embodiment is produced can be confirmed by various known methods. For example, SDS (Sodium dodecyl sulfate) or SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide) polyacrylamide gel is used. By staining the plate obtained by migration, the formation of a polymer substance which is a protein-chitosan complex can be confirmed.
  • SDS Sodium dodecyl sulfate
  • SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
  • Acinetobacter is a type of aerobic gram-negative bacterium, a type of eubacteria of gram-negative bacilli, and a bacterium of the genus Acinetobacter.
  • Acinetobacter calcoaceticus (Acinetobacter calcoaceticus), Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter baumannii (Acinetobacter baumannii), etc. are known as Acinetobacter genus Acinetobacter (Acinetobacter baumannii). It is especially known as the causative agent of diseases, especially respiratory infections.
  • the present invention is particularly effective against Acinetobacter spp., Acinetobacter, and multidrug-resistant Acinetobacter that does not acquire drug resistance.
  • the present invention has antibacterial properties against "Acinetobacter” and "multidrug-resistant Acinetobacter".
  • the antibacterial property broadly includes eradication, sterilization, antibacterial, etc., and when the number of bacteria is equal to or less than that, it means at least all states in which the bacteria do not grow.
  • sterilization means removing bacteria in general, and includes sterilization.
  • Sterilization means killing at least some bacteria. Therefore, in the present invention, the antibacterial composition means a sterilizing composition, a bactericidal composition, a sterilizing agent, a bactericidal agent, and an antibacterial agent.
  • the present invention is further effective in treating and preventing "Acinetobacter infection" and "multidrug-resistant Acinetobacter infection".
  • the "treatment” includes not only completely healing the inflammation which is the subject of the present invention, but also suppressing the inflammation and reducing the severity of the injury.
  • prevention includes the case where there is no history of inflammation which is the subject of the present invention, and also includes prevention so that the inflammation which is the subject of the present invention does not recur after healing.
  • the antibacterial composition of the present invention may optionally contain one or more other active ingredients.
  • Other active ingredients include those that act as active ingredients themselves, and those that do not act as active ingredients themselves, but exert their effects when used in combination with the above complex, which is the active ingredient of the present invention (auxiliary). Agent) is also included.
  • Other active ingredients include, for example, terpene alcohols, fatty acids, and / or salts of the fatty acids. By adding these terpene alcohols, fatty acids, and / or salts of the fatty acids, additive and synergistic effects can be obtained in combination with the complex of the present invention.
  • Examples of the terpene alcohol include terpinen-4-ol, hinokitiol, geraniol, menthol and the like.
  • Examples of the fatty acid include fatty acids having 8 to 12 carbon atoms, preferably decanoic acid (capric acid) or lauric acid.
  • Examples of the fatty acid salt include sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt and the like.
  • essential oils obtained from lemongrass, spearmint, geranium, perilla, etc. which are known to be effective against inflammation caused by neutrophils, and glucosamine may be added as the other active ingredients.
  • the antibacterial composition of the present invention may optionally contain one or more other components in addition to the above complex.
  • additives such as excipients, binders, emulsifiers, solvents, pressure-sensitive adhesives, disintegrants, thickeners, lubricants, colorants, fluidizers, and moisturizers may be added.
  • the moisturizer include glycerin, butylene glycol, collagen, hyaluronic acid, and ceramide.
  • the binder include cellulose, methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and sodium carboxymethyl cellulose.
  • emulsifier examples include lecithin, polyethylene glycol (PG), PG-hydrogenated castor oil, glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, and ceteth.
  • solvent examples include water, ethanol, 1-butanol, 2-butanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-pentanol and the like.
  • the lysoteam-chitosan complex of the present invention is contained in 1 mL of the antibacterial composition of the present invention, for example, 10 ⁇ g / mL to 200,000 ⁇ g / mL, preferably 100 ⁇ g / mL to 100,000 ⁇ g / mL, more preferably 50 ⁇ g / mL to. It is suitable to contain 50,000 ⁇ g / mL, more preferably 100 ⁇ g / mL to 10,000 ⁇ g / mL, and particularly preferably 200 ⁇ g / mL to 5,000 ⁇ g / mL.
  • the other active ingredient is contained in the antibacterial composition of the present invention, for example, 0.001% by mass to 5.0% by mass, preferably 0.002% by mass to 0.2% by mass, more preferably 0.005. It is suitable to contain from mass% to 0.1% by mass, more preferably 0.01% by mass to 0.05% by mass, and particularly preferably 0.02% by mass to 0.04% by mass. Further, the content of the other components needs to be appropriately adjusted depending on each component, and for example, 0.1% by mass to 90% by mass, preferably 1% by mass to 70% by mass, and more preferably 10% by mass. It is appropriate to contain% to 50% by mass. Most of the antibacterial composition of the present invention can be a solvent such as water.
  • the solvent is 95% by mass or more, preferably 98% by mass or more, more preferably 99% by mass. % Or more, more preferably 99.5% by mass or more.
  • a fatty acid having 8 to 12 carbon atoms such as lauric acid and decanoic acid (capric acid) or a salt of the fatty acid is contained in the antibacterial composition of the present invention, for example, 0.001% by mass to 5% by mass, preferably 0.001% by mass. It is suitable to contain 0.005% by mass to 1% by mass, more preferably 0.01% by mass to 0.5% by mass, and particularly preferably 0.04% by mass to 0.2% by mass.
  • the present invention is a method for treating, suppressing or preventing Acinetobacter infection, preferably multidrug-resistant Acinetobacter infection, by administering to a subject a pharmaceutical composition containing a complex in which lysozyme and chitosan are bound. , And a pharmaceutical composition for that purpose.
  • the therapeutic, inhibitory or preventive effect is due to the antibacterial properties of the complex combining lysozyme and chitosan, and is considered to be particularly effective for respiratory diseases.
  • the pharmaceutical composition contains the above-mentioned antibacterial composition, and the point, content, content, etc.
  • the "subject” includes mammals such as cats, dogs, monkeys, cows, and horses in addition to humans. Definitions of lysozyme, chitosan, etc., other active ingredients and other ingredients, dosage, administration form, administration method, etc. are as described above.
  • the antibacterial composition and the pharmaceutical composition of the present invention differ depending on the dosage type, administration target, administration route, target disease, symptom, etc., but for example, in the case of a spray agent sprayed on human skin, one day.
  • the dose is, for example, 0.1 to 20 mg / kg body weight, preferably 0.2 to 10 mg / kg body weight, more preferably 0.5 to 10 mg / kg body weight, and this amount is applied once to several times a day. It is desirable to administer (eg, 2 times, 3 times, 4 times or 8 times). In addition to the spray agent, this dose can also be preferably applied to other preparations such as creams described below.
  • the antibacterial composition and the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and no special technique is required for their formulation, and they can be formulated using a general-purpose technique. it can.
  • the dosage form include creams, ointments, haptics, liquids, sprays, gels, injections, tablets, suppositories, capsules, granules, powders, eye drops, eye ointments, etc., and creams and ointments. , Suppositories, liquids and sprays are particularly preferred.
  • the administration method of the antibacterial composition and the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected according to the above-mentioned administration form.
  • the administration method may be a known administration method.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be applied to an inflamed site at the above dose.
  • the present invention may also include the use of lysozyme and chitosan-conjugated complexes in the manufacture of pharmaceutical compositions for treating or preventing multidrug-resistant Acinetobacter infections.
  • the lysozyme-chitosan complex is mixed with the components of the pharmaceutical composition other than the complex.
  • the pharmaceutical composition is obtained.
  • a known method can be used. For example, in the case of a liquid preparation, a complex in which lysozyme and chitosan are bonded and any other component described above are added to a solvent such as water and mixed. If necessary, an emulsifier is added and mixed to form a dispersant or emulsion, and a liquid preparation is prepared.
  • This antibacterial composition can be the wash water used in the nebulizer. As a result, the growth of infectious bacteria can be suppressed by directly spraying the antibacterial composition onto the infected site.
  • the antibacterial composition and the pharmaceutical composition of the present embodiment have, for example, an antibacterial effect against Acinetobacter, preferably a multidrug-resistant Acinetobacter, an effect of suppressing the growth of bacteria, and an infectious disease caused by these. It has the effect of preventing the acquisition of drug resistance as well as the effect of treatment, suppression and prevention.
  • lysozyme-chitosan complex lysozyme-chitosan complex
  • LYZOX registered trademark of Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • Example preparation -Lysozyme-chitosan complex (lysozyme / LYZOX (registered trademark)) solution
  • LYZOX registered trademark, Wako Filter Technology Co., Ltd.
  • Commercially available LYZOX® is a powder containing chicken-derived lysozyme (about 14,000 Da) and about 5,000 Da of water-soluble chitosan (chitosan oligosaccharide) in a mass ratio of 1: 1.
  • the lysozyme-chitosan complex (LYZOX®) used in the present invention is obtained by the Maillard reaction below.
  • the lysozyme-chitosan complex (LYZOX®) was mixed with a predetermined solvent so that the lysozyme-chitosan complex had a desired concentration in each experimental example, and the desired lysozyme-chitosan complex (lysozyme / chitosan complex) was mixed.
  • a LYZOX® solution was used.
  • lysozyme manufactured by Nippon Biocon Co., Ltd., Aichi Prefecture
  • a predetermined solvent so that the lysozyme has a desired concentration in each experimental example, and the target lysozyme alone is used.
  • the target lysozyme alone was used.
  • chitosan oligosaccharide Korean chitosan oligosaccharide COS-A manufactured by Kimika Co., Ltd.
  • chitosan oligosaccharide is used as chitosan so that the chitosan oligosaccharide has a desired concentration in each experimental example. It was mixed with a predetermined solvent to prepare a solution of the target chitosan alone.
  • the mixture of lysoteam and chitosan is mixed so that the mass ratio of the above lysoteam alone: chitosan alone is 1: 1 and the mixture, lysozyme, and chitosan have the desired concentrations.
  • the predetermined solvent was mixed and prepared so as to be.
  • Acinetobacter baumannii JCM 6841 was grown in trypsin soybros (TSB) overnight at 37 ° C., centrifuged during the logarithmic growth phase, and collected. The obtained bacteria were mixed with a predetermined amount of various solvents in each test to obtain an Acinetobacter bacterial suspension.
  • -Pseudomonas aeruginosa bacterial suspension Unless otherwise specified, the same bacterial suspension as the above-mentioned Acinetobacter bacterial suspension, except that Pseudomonas aeruginosa (NBRC 13275 or PAO1) was used instead of Acinetobacter baumannii (JCM 6841).
  • a turbid solution was prepared. The details of each specific experimental example are as shown below. -Measurement of Absorbance Unless otherwise specified, the spectrophotometer ASV11D manufactured by AS ONE Corporation was used for the measurement of absorbance in this example. In the actual measurement of the absorbance, the absorbance was calculated by diluting the sample as necessary in consideration of the absorbance that can be measured by the spectrophotometer.
  • Acinetobacter bacterial suspension or Pseudomonas aeruginosa bacterial suspension is a logarithmic growth of Pseudomonas aeruginosa (NBRC 13275 or PAO1) or Acinetobacter baumani (JCM 6841) in trypsin soybros (TSB) overnight at 37 ° C. centrifuged to growth phase, harvested, the bacteria were resuspended in saline solution (0.9% NaCl), absorbance final suspension concentration at 600nm is 1.0 (10 8 ⁇ 10 9 CFU / It was prepared so as to be mL).
  • lysoteam-chitosan complex (Rezox / LYZOX®) solution (2,000 ⁇ g / mL), lysoteam alone solution (1,000 ⁇ g / mL), chitosan alone solution (1,000 ⁇ g) / ML), and a solution of a mixture of lysoteam and chitosan (a solution of lysoteam alone [1,000 ⁇ g / mL] and a solution of chitosan alone [1,000 ⁇ g / mL]), and a solution of trypsin soybros (TSB) (Nippon Becton. Prepared using Dickinson Co., Ltd.
  • TTB trypsin soybros
  • the lysozyme - of the Acinetobacter bacterium suspension or Pseudomonas aeruginosa bacterial suspension was further diluted 2000-fold in 10mL of each solution chitosan complexes such 50 ⁇ L (2.5 ⁇ 10 3 ⁇ 10 4 CFU) was added, respectively, 37 Incubated at ° C for 6 hours. After 6 hours, 0.1 mL of each solution was added to a solid medium (Mueller-Hinton medium) and grown overnight, and then the number of bacteria was measured.
  • the antibacterial action is exerted by comparing lysozyme alone and chitosan alone with the lysozyme-chitosan complex having twice the concentration of the lysozyme alone and chitosan alone. Compared. As a result, in Acinetobacter (Fig. 3C), the lysozyme-chitosan complex had a significantly lower bacterial count than the control.
  • a TSB was prepared as a solvent, and the experiment was repeated in the same manner as in Experimental Example 3 above to measure the number of green pus bacteria (NBRC 13275). The results are shown in FIG. 3D. As shown in FIG. 3D, the lysozyme-chitosan complex showed a concentration-dependent growth inhibitory effect.
  • Experimental Example 5 The amount of nucleic acid released from the cytoplasm was estimated by measuring the absorbance at 260 nm (A 260 nm ), and the integrity of the cell membrane was evaluated. When the bacterial cell membrane is damaged by an antibacterial agent, intracellular components are released extracellularly. Absorbance measurements at 260 nm are used to estimate the amount of DNA and RNA released from the cytoplasm. Specifically, whether or not a substance having absorption at 260 nm was released from the bacterium was evaluated by measuring the absorption at 260 nm with ND-1000 manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.
  • lysoteam-chitosan complex (lysox / LYZOX®) solution
  • solutions having different concentrations (4,000 ⁇ g / mL, 10,000 ⁇ g / mL, and 20,000 ⁇ g / mL (mixed with bacterial suspension)).
  • Subsequent final concentrations of 2,000 ⁇ g / mL, 5,000 ⁇ g / mL, and 10,000 ⁇ g / mL)) were prepared using a 0.5% NaCl solution as the solvent, and an additional 60 ⁇ L per 1.0 mL solution.
  • Each solution was prepared by adding 1.0 M phosphate buffer (pH 7.2) and adjusting to a neutral pH (6.6 to 7.1).
  • a 0.5% NaCl solution was used as a control.
  • the Pseudomonas aeruginosa bacterial suspension and the Acinetobacter bacterial suspension prepared in the same manner as in Experimental Example 1 were resuspended in a 0.5% NaCl solution, and the final suspension concentration was 0.7 at 420 nm. It was prepared to be.
  • the Acinetobacter bacterial suspension or Pseudomonas aeruginosa bacterial suspension was added to each 10 mL solution of the lysozyme-chitosan complex and the like, and the mixture was incubated at 37 ° C. using a water bath.
  • each solution was subjected to bacteria removal using a 0.22 ⁇ m syringe filter, and the absorbance at 260 nm (A 260 nm ) was measured. It was measured.
  • the absorbance is shown in FIGS. 4A and 4B as the average of three measurements and the result expressed as SEM (standard error of sample average).
  • NPN assay test Inititial permeability was determined by the NPN assay (1-N-phenylnaphthylamine (NPN) uptake assay). 1-N-Phenylnaphthylamine fluoresces strongly in a phospholipid environment but weakly in an aqueous environment. This property has been utilized to assess the permeability of bacterial adventitia, ie membrane damage. Specifically, the sample was evaluated by measuring the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 420 nm with a fluorescence spectrophotometer (RF-6000, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • RF-6000 fluorescence spectrophotometer
  • lysoteam-chitosan complex (lysox / LYZOX®) solution
  • solutions having different concentrations (20 ⁇ g / mL and 40 ⁇ g / mL (final concentrations after mixing with the bacterial suspension are 10 ⁇ g / mL and 20 ⁇ g /).
  • mL)) was prepared using a 0.5% NaCl solution as a solvent, and 60 ⁇ L of 1.0 M phosphate buffer (pH 7.2) was added per 1.0 mL of the solution to neutral pH (7.2). Each solution was prepared by adjusting to ⁇ 7.3). A 0.5% NaCl solution was used as a control. To these solutions was added 30 ⁇ L of 1.0 mM NPN solution.
  • the Pseudomonas aeruginosa bacterial suspension and the Acinetobacter bacterial suspension prepared in the same manner as in Experimental Example 1 were resuspended in a 0.5% NaCl solution, and the final suspension concentration was 1.0 at an absorbance at 420 nm. It was prepared to be.
  • the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 420 nm was measured for 10 minutes.
  • the fluorescence intensity increased after 1 minute and remained at the same level thereafter.
  • the lysozyme-chitosan complex showed a concentration-dependent growth inhibitory effect.
  • the lysozyme-chitosan complex has been shown to increase adventitial permeability within 1 minute of contact with Acinetobacter.
  • the lysozyme-chitosan complex was found to increase adventitial permeability within 1 minute of contact with Acinetobacter.
  • Intramembrane permeability was determined by the ONPG assay (o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (ONPG) assay).
  • ONPG o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside
  • ONPG is usually colorless, but is hydrolyzed to galactose and o-nitrophenol by ⁇ -galactosidase, increasing its absorbance at 420 nm.
  • Bacterial intracellular membrane permeability can be determined by measuring the activity of cytoplasmic ⁇ -galactosidase released from the bacterium using ONPG as a substrate.
  • lysoteam-chitosan complex lysox / LYZOX®
  • solutions having different concentrations 400 ⁇ g / mL, 4,000 ⁇ g / mL, and 10,000 ⁇ g / mL (after mixing with the bacterial suspension)
  • Final concentrations of 200 ⁇ g / mL, 2,000 ⁇ g / mL, and 5,000 ⁇ g / mL)) were prepared using a 0.5% NaCl solution as the solvent, and an additional 60 ⁇ L of 1.0 M phosphorus per 1.0 mL solution.
  • the absorbance at 420 nm when using the lysozyme-chitosan complex increased rapidly initially and then slowly until 100 minutes.
  • the absorbance at 420 nm increased in the first 10 minutes and remained constant thereafter.
  • the absorbance at 420 nm increased in a concentration-dependent manner.
  • the intracellular enzyme leaked extracellularly within 10 minutes after contact in a concentration-dependent manner.
  • the lysozyme-chitosan complex was found to disrupt the intima of Acinetobacter.
  • Experimental Example 8 confocal laser scanning microscope observation
  • CLSM confocal laser scanning microscope
  • CLSM confocal laser scanning microscope
  • a 2,000 ⁇ g / mL solution of the above-mentioned lysoteam-chitosan complex (Rezox / LYZOX®) (final concentration after mixing with a bacterial suspension is 1,000 ⁇ g / mL) is physiologically applied.
  • LIVE / DEAD BacLight reagent a mixture of SYTO 9 for staining nucleic acid and propidium iodide (PI)
  • PI propidium iodide
  • SYTO 9 with green fluorescence labels all bacteria, while PI with red fluorescence only penetrates bacteria with damaged cytoplasmic membranes, and the presence of both dyes attenuates SYTO 9 fluorescence.
  • the excitation wavelength / emission wavelength was observed at 488/495 to 515 nm for SYTO 9 and 488/635 to 700 nm for PI (FIGS. 7A and 7B).
  • lysoteam-chitosan complex (Rezox / LYZOX®) solution (1,000 ⁇ g / mL), lysoteam single solution (500 ⁇ g / mL), chitosan single solution (500 ⁇ g / mL), And a solution of a mixture of lysoteam and chitosan (solution of lysoteam alone [500 ⁇ g / mL] and solution of chitosan alone [500 ⁇ g / mL]) was prepared using physiological saline (0.9% NaCl solution) as a solvent. Physiological saline (0.9% NaCl solution) was used as a control.
  • Each solution such as the above lysozyme-chitosan complex was prepared by removing all the supernatants of the Pseudomonas aeruginosa bacterial suspension and the Acinetobacter bacterial suspension prepared in the same manner as in Experimental Example 1 except that the absorbance was set to 2.0. 1 mL was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours. Then, it was centrifuged, and the obtained pellets were washed with physiological saline (0.9% NaCl), and at 4 ° C. with a fixative (2.5% buffered glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer). Fixed time. It was then incubated overnight in 0.1 M phosphate buffer.
  • each bacterium was fixed in 1.0% buffered osmium tetroxide in 0.1 M phosphate buffer for 1 hour, then dehydrated with ethanol and then dried using a critical point dryer (HCP-2). I let you. After coating with platinum / palladium at about 20 nm, the sample was observed with a scanning electron microscope (S-4500) (FIGS. 8A and B). SEM findings of untreated Pseudomonas aeruginosa (NBRC 13275) (FIG. 8A) and Acinetobacter baumannii (FIG. 8B) showed smooth surfaces (FIGS. 8A (a) and 8B (f)).
  • FIG. 8A (c) and FIG. 8B (h) Lysozyme-chitosan complex compared with both Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter treated with chitosan alone and in admixture (((d) and (e) in FIG. 8A, (i) and (j) in FIG. 8B). Many vesicles were observed in those treated with the body ((b) in FIG. 8A and (g) in FIG. 8B).
  • Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter treated with the lysozyme-chitosan complex and mixture were on their surface. It lost structural integrity and became partially spherical ((b) and (e) in FIG. 8A, (g) and (j) in FIG. 8B), especially after treatment with each solution, especially the lysozyme-chitosan complex. After treatment with the body, extracellular filamentous structures appeared around the cells ((b)-(e) in FIG. 8A, (g)-(j) in FIG. 8B).
  • lysoteam-chitosan complex (Rezox / LYZOX®) solution (1,000 ⁇ g / mL), lysoteam single solution (500 ⁇ g / mL), chitosan single solution (500 ⁇ g / mL), And a solution of a mixture of lysoteam and chitosan (solution of lysoteam alone [500 ⁇ g / mL] and solution of chitosan alone [500 ⁇ g / mL]) was prepared using physiological saline (0.9% NaCl solution) as a solvent. Physiological saline (0.9% NaCl solution) was used as a control.
  • the pellet was centrifuged, washed with physiological saline (0.9% NaCl), and fixed in 1.0% buffered osmium tetroxide buffer in 0.1 M phosphate buffer for 1 hour. , 2.0% agar, dehydrated with ethanol, and then embedded in Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment Ltd.). Ultrathin sections of 70 nm were collected on a copper grid, double stained with uranyl acetate and lead citrate, and observed at 75 kV using a transmission electron microscope (H-7100).
  • FIG. 9A (a), FIG. 9B (f) TEM findings of untreated Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter show a normal surface structure of the bacterium and appear smooth and layered.
  • both Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter form spheroplasts ((c) in FIG. 9A, (h) in FIG. 9B), and when treated with chitosan alone, these bacteria are numerous on their surface.
  • Vesicles were formed (FIG. 9A (d), FIG. 9B (i)). The vesicles were generated from the outer membrane, which matched the vesicles observed by SEM of each bacterium.
  • TEM findings of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii show morphology resulting from treatment of both lysozyme and chitosan alone by showing spherical cells with outer membrane vesicles.
  • the target changes were clarified ((b) and (e) in FIG. 9A, (g) and (j) in FIG. 9B).
  • the bacterial cell wall was destroyed and the intracellular contents were released from the cell.
  • MIC minimum inhibitory concentration: minimum amount of drug required to inhibit bacterial growth
  • Pseudomonas aeruginosa NBRC 13275 and PAO 1
  • Acinetobacter baumannii Adjusted using physiological saline (NaCl 0.9%) as a solvent so that the absorbance at 600 nm becomes 1.0, and 60 ⁇ L of the prepared bacterial turbid solution was added to 140 ⁇ L of LB medium in a 96-well microplate, and finally. the bacterial concentration in 1 well was adjusted to 10 4 to and incubated at 35 ° C..
  • Bacteria were repeatedly subcultured (10 times) at a lysozyme-chitosan complex concentration of 1/2 MIC, which is half of the MIC, and each MIC was evaluated (LYZOX, subculture in FIGS. 10A and 10).
  • LYZOX subculture in FIGS. 10A and 10
  • the same test as the test for the lysozyme-chitosan complex was performed using the mixture of lysozyme and chitosan (control group in FIGS. 10A and B) (control group in FIGS. 10A and B, passage). ..
  • Each bacterium that was not subcultured was evaluated as a control (CTL in FIGS.
  • the concentrations at the time of the hemolytic toxicity evaluation test are 10 ⁇ g / mL, 100 ⁇ g / mL, 1,000 ⁇ g / mL and 10,000 ⁇ g / mL, respectively (Table 1)).
  • a solution of lysoteam-chitosan complex (lysox / LYZOX®) was prepared.
  • 500 ⁇ L of the rabbit defibrated blood diluted with PBS was further prepared, and 500 ⁇ L of each lysozyme-chitosan complex (lysozyme / LYZOX®) solution, PBS (negative control), and 0.1% Triton.
  • Hemolysis rate (HR) (%) (Sample absorbance [AS] -Negative control absorbance [AN] at the corresponding concentration) / (Positive control absorbance [AP]-[AN] corresponding to the lysozyme-chitosan complex concentration) ⁇ 100.
  • the lysozyme-chitosan complex showed almost no hemolysis of rabbit erythrocytes after 1 hour incubation at 37 ° C.
  • the hemolysis rate of the lysozyme-chitosan complex was less than 5% at concentrations in the range of 10 ⁇ g / mL to 10,000 ⁇ g / mL. It has been reported that the hemolytic rate of 5% or less is acceptable for clinical biomaterials and is safe [Deng JD, He B, He DH, Chen ZF. A potential biopreservative: Chemical composition, antibiotic and hemolytic activities. of leaves essential oil from Alpinia guinanensis. Ind Crop Prod. 2016; 94: 281-7.].
  • novel antibacterial compositions, pharmaceutical compositions and the like can be provided for Acinetobacter.

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Abstract

アシネトバクターに対する抗菌性組成物を提供する。リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有し、アシネトバクターに対して抗菌性を有する抗菌性組成物、並びに、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アシネトバクター感染症を治療または予防するための医薬組成物を提供する。

Description

抗菌性組成物
この発明は、アシネトバクターに対して抗菌性を有する抗菌性組成物等に関するものである。
緑膿菌又はＭＲＳＡ等の非結核性抗酸菌は、呼吸器感染症を引き起こす感染菌である。この感染症は、難治性化することから問題視されている。当該緑膿菌やＭＲＳＡに対し、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体が有効であることが最近になって明らかになった（特許文献１）。一方で、重症肺炎の中でも重要な菌として認識されているアシネトバクターについては、コリスチンやポリミキシンＢといったある程度の有効性が認められている薬剤が存在するものの、日本では腎毒性の副作用がある等の理由で未承認であり、一般的な抗菌薬を使用してもアシネトバクター感染症の治療は難しいとされてきた（非特許文献１）。さらに、耐性化してしまったアシネトバクター（多剤耐性アシネトバクター感染症）に関しては、いまだ有効な薬剤が見つかっておらず、新しい薬剤の発明が待たれていた。
国際公開第２０１７／１３８４７６号パンフレット
国立感染症研究所感染症情報センターホームページ、多剤耐性アシネトバクター感染症Ｑ＆Ａ［http://idsc.nih.go.jp/disease/MDRA/QA01.html］
本発明は、アシネトバクター、特に多剤耐性アシネトバクターに対する抗菌性組成物を提供することを目的とする。本発明は、また、アシネトバクター感染症若しくは多剤耐性アシネトバクター感染症に対する有効な治療及び予防効果を発揮する抗菌性組成物、その治療及び予防方法、及びその抗菌剤の製造における当該抗菌性組成物の使用方法を提供する。
本願発明者らは、上述したような一般的な抗菌薬ではアシネトバクターに対しては有効ではないという技術常識を覆し、安全性の高い天然の食品添加物であるリゾチーム及びキトサンの複合体を用いて、アシネトバクターに対する抗菌性を検証したところ、優れたアシネトバクターに対する抗菌効果を示すことを見出し、本発明に至った。
より具体的には、本発明は以下の態様であり得る。
〔１〕リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有し、アシネトバクターに対して抗菌性を有する抗菌性組成物。
〔２〕前記アシネトバクターが、多剤耐性アシネトバクターである、前記〔１〕記載の抗菌性組成物。
〔３〕前記抗菌性組成物１ｍＬ中の前記複合体の濃度が２００μｇ／ｍＬ以上である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の抗菌性組成物。 
〔４〕前記抗菌性が殺菌性を伴う、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗菌性組成物。
〔５〕前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の抗菌性組成物を含有する洗浄水。
〔６〕リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アシネトバクター感染症を治療または予防するための医薬組成物。
〔７〕前記アシネトバクター感染症が、多剤耐性アシネトバクター感染症である、前記〔６〕に記載の医薬組成物。
〔８〕アシネトバクター感染症を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体の使用。
本発明によれば、アシネトバクターを除菌、抗菌、又は殺菌する効果、並びにその増殖を抑える効果を奏する。特に、本発明のリゾチームとキトサンとを結合させた複合体は、アシネトバクターの増殖を抑制するのみならず、有意に死滅させる効果も有する。したがって、本発明によれば、アシネトバクター感染症、多剤耐性アシネトバクター感染症の治癒及び／又は予防をすることができる。また、リゾチームは、安全性の高い天然の食品添加物としても広く利用されており、このリゾチームとキトサンとの複合体を用いた抗菌性組成物は、利用する患者を安心させるとともに、その負担を軽減することができる。
リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を合成する際の反応の概略図である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））及びリゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の殺菌効果を示す図である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））及びリゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌（ＰＡＯ１）の殺菌効果を示す図である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））及びリゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地におけるアシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の殺菌効果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））に対する、緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の殺菌効果を示す図である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の増殖抑制効果を示す図である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌（ＰＡＯ１）の増殖抑制効果を示す図である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地におけるアシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の増殖抑制効果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））に対する、緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の増殖抑制効果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と接触した際の、緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の細胞膜の完全性を吸光度によって測定した結果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と接触した際の、アシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の細胞膜の完全性を吸光度によって測定した結果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と接触した際の、緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の細胞膜損傷をＮＰＮアッセイ（細胞外膜透過性試験）によって測定した結果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と接触した際の、アシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の細胞膜損傷をＮＰＮアッセイ（細胞外膜透過性試験）によって測定した結果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と接触した際の、緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の細胞膜損傷をＯＮＰＧアッセイ（細胞内膜透過性試験）によって測定した結果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と接触した際の、アシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の細胞膜損傷をＯＮＰＧアッセイ（細胞内膜透過性試験）によって測定した結果を示す図である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と接触した際の、緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の細胞生存率を共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって可視化して測定した結果を示す画像である。 各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））と接触した際の、アシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の細胞生存率を共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって可視化して測定した結果を示す画像である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物をそれぞれ添加した場合の走査電子顕微鏡により得られた緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の形態変化を示す画像である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物をそれぞれ添加した場合の走査電子顕微鏡により得られたアシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の形態変化を示す画像である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物をそれぞれ添加した場合の透過電子顕微鏡により得られた緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の形態変化を示す画像である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物をそれぞれ添加した場合の透過電子顕微鏡により得られたアシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の形態変化を示す画像である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の薬剤耐性獲得試験の効果を示す図である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌（ＰＡＯ１）の薬剤耐性獲得試験の効果を示す図である。 リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地におけるアシネトバクター（ＪＣＭ６８４１）の薬剤耐性獲得試験の効果を示す図である。
以下に本発明の一実施形態を詳述する。
＜抗菌性組成物＞
本発明は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アシネトバクターに対して抗菌性を有する抗菌性組成物に関する。以下、本発明を具体的に説明する。
「リゾチームとキトサンとを結合させた複合体」とは、リゾチームとキトサンとを、例えばメイラード反応等により結合させた複合体である（図１参照）。リゾチームと水溶性キトサンとをメイラード反応により結合させることで、リゾチーム中の抗原構造のほとんど又はすべてがマスクされるため、リゾチーム－キトサン複合体をヒトが摂取してもアレルギーを起こしにくいという特徴がある。その他、架橋剤を使用してリゾチームとキトサンとを共有結合させて上記複合体を得ることもできる。
ここで「リゾチーム」は、ムコ多糖類を加水分解する酵素であり、ニワトリ由来のリゾチーム、ヒト由来のリゾチームを好ましく用いることができる。
リゾチームの分子量の上限は、例えば、３０，０００Ｄａ以下であり、より好ましくは２５，０００Ｄａ以下、２０，０００Ｄａ以下、１８，０００Ｄａ以下、１５，０００Ｄａ以下であってもよい。またリゾチームの分子量の下限は特に制限しなくてもよいが、例えば、１，０００Ｄａ以上、好ましくは、５，０００Ｄａ以上、１０，０００Ｄａ以上、１２，０００Ｄａ以上であってもよい。当該リゾチームの分子量の範囲は、上記いずれかの上限値及び下限値の間の範囲であり得るが、例えば、１０００Ｄａ～３０，０００Ｄａ、好ましくは５，０００Ｄａ～２０，０００Ｄａであり、より好ましくは１０，０００Ｄａ～１５，０００Ｄａであり得る。
「キトサン」は、以下の化学式（Ｉ）で示されるポリ-β1→4-グルコサミンである（(C6H11NO4)n、CAS登録番号9012-76-4）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
当該キトサンは水溶性である。キトサンの分子量の上限は、例えば、３０，０００Ｄａ以下であり、より好ましくは２０，０００Ｄａ以下、１５，０００Ｄａ以下、１０，０００Ｄａ以下、７，０００Ｄａ以下であってもよい。またキトサンの分子量の下限は特に制限しなくてもよいが、例えば、３００Ｄａ以上、好ましくは、５００Ｄａ以上、１，０００Ｄａ以上、３，０００Ｄａ以上であってもよい。当該キトサンの分子量の範囲は、上記いずれかの上限値及び下限値の間の範囲であり得るが、例えば、３００Ｄａ～３０，０００Ｄａ、好ましくは５００Ｄａ～１５，０００Ｄａであり、より好ましくは１，０００Ｄａ～１０，０００Ｄａ、特に好ましくは３，０００Ｄａ～７，０００Ｄａであり得る。抗菌性に着目すると、分子量の大きいキトサンの方が有利となり、製造のしやすさに着目すると、分子量の小さいキトサンの方が溶解性及び安定性が良好となり、低分子量のキトサンの方が有利となる。
なお、ここでキトサンと言うときは、上記キトサンの他、キトサンオリゴ糖やグルコサミンを含む意味とする。キトサンオリゴ糖は、上記式（I）で示される、Dグルコサミンが数個程度連なったもので、低分子のキトサン、又は狭義のキトサンを塩酸または酵素で加水分解したものを意味する。
上記架橋剤としては、例えば、アミン反応性架橋剤（例えば、アルコキシアミン）、カルボニル反応性架橋剤（例えば、ヒドラジン化合物）、及びスルフヒドリル反応性架橋剤等を挙げることができる。
リゾチーム／キトサンの質量比は、例えば、９９／１～１／９９、好ましくは９０／１０～１０／９０、より好ましくは８０／２０～２０／８０、さらに好ましくは６０／４０～４０／６０、特に好ましくは５０／５０となることが適当である。
具体的なリゾチームとキトサンとを結合させた複合体の製造方法としては、例えば次のようなものが挙げられる。まず、上記質量比のリゾチームとキトサンとを水に混合溶解し、得られた水溶液中のリゾチーム及びキトサンの合計質量が５～３０質量％となるように調製する。得られた水溶液を凍結乾燥して粉末化する。得られた粉末を、例えば５０～８０℃、好ましくは５５～６５℃の温度と、例えば５０～８０％、好ましくは６０～７０％の相対湿度の条件下で、例えば２～２０日、より好ましくは７～１４日、メイラード反応させることにより本発明のリゾチームとキトサンとを結合させた複合体を製造することができる。
本実施形態のリゾチーム－キトサン複合体が生成しているか否かは、種々の公知の方法で確認できるが、例えば、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）やＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ポリアクリルアミド電気泳動により得られるプレートを、染色処理することによって、蛋白質－キトサン複合体である高分子物質の生成を確認することができる。
「アシネトバクター」（Acinetobacter）は、好気性のグラム陰性菌の一種であり、グラム陰性桿菌の真正細菌の一種、アシネトバクター属の菌である。アシネトバクター属のアシネトバクターには、アシネトバクター・カルコアセティカス (Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ルオフィイ (Acinetobacter lwoffii)、及びアシネトバクター・バウマニ (Acinetobacter baumannii)等が知られており、アシネトバクター・バウマニ（ＪＣＭ　６８４１）が感染症、特に呼吸器系の感染症の原因菌として特に知られている。本発明では、特に、アシネトバクター属菌、アシネトバクター、さらには薬剤耐性を獲得しない多剤耐性アシネトバクターに対して有効であるとの特徴を有する。
本発明は、「アシネトバクター」や「多剤耐性アシネトバクター」に対して抗菌性を有する。ここで抗菌性とは広く除菌、殺菌、抗菌等を含め、菌数が同等又はそれ以下になる場合、少なくとも菌を増殖させない全ての状態を意味する。なお、除菌は、菌を除去すること全般を意味し、殺菌を含む意味である。殺菌は少なくとも一部の菌を死滅させることを意味する。従って、本発明において抗菌性組成物とは、除菌性組成物、殺菌性組成物、除菌剤、殺菌剤、及び抗菌剤を含む意味である。
本発明は、さらに「アシネトバクター感染症」や「多剤耐性アシネトバクター感染症」の治療及び予防に効果的である。ここで、「治療」とは、本発明の対象である炎症を完全に治癒することの他、炎症を抑制して重傷度を低下させることを含む。「予防」とは、本発明の対象である炎症の病歴がない場合の他、本発明の対象である炎症が治癒した後に当該炎症が再発しないように防止することを含む。
本発明の抗菌組成物には、上記複合体の他に、１種以上のその他の有効成分を任意に含むことができる。その他の有効成分としては、それ自体が有効成分として作用するものの他、それ自体は有効成分として作用しないものの、本発明の有効成分である上記複合体と併用することによって効果を発揮するもの（補助剤）も含む。その他の有効成分としては、例えば、テルペンアルコール、脂肪酸、及び／又は該脂肪酸の塩を挙げることができる。これらテルペンアルコール、脂肪酸、及び／又は該脂肪酸の塩を添加することにより、本発明の複合体と相まって、相加効果及び相乗効果を得ることができる。テルペンアルコールとしては、例えば、テルピネン－４－オール、ヒノキチオール、ゲラニオール、及びメントール等を挙げることができる。脂肪酸としては、例えば、炭素数８～１２の脂肪酸、好ましくはデカン酸（カプリン酸）又はラウリン酸を挙げることができる。脂肪酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、及びカルシウム塩等を挙げることができる。その他、好中球に起因する炎症に効果があることが知られているレモングラス、スペアミント、ゼラニウム、シソなどから得られる精油、及び、グルコサミンを、当該その他の有効成分として加えてもよい。
本発明の抗菌組成物には、上記複合体の他に、１種以上のその他の成分を任意に含むことができる。その他の成分としては、例えば、賦形剤、結合剤、乳化剤、溶剤、粘着剤、崩壊剤、粘稠剤、滑沢剤、着色剤、流動剤、保湿剤等の添加剤を添加することもできる。
保湿剤としては、例えば、グリセリン、ブチレングリコール、コラーゲン、ヒアルロン酸、及びセラミドを挙げることができる。
結合剤としては、例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを挙げることができる。
乳化剤としては、例えば、レシチン、ポリエチレングリコール（PG）、PG-水添ヒマシ油、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びセテス等を挙げることができる。
溶剤としては、例えば、水、エタノール、1-ブタノール、2-ブタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ペンタノール等を挙げることができる。
本発明のリゾチーム－キトサン複合体は、本発明の抗菌組成物１ｍＬ中、例えば、１０μｇ/ｍＬ～２００，０００μｇ/ｍＬ、好ましくは１００μｇ/ｍＬ～１００，０００μｇ/ｍＬ、より好ましくは５０μｇ/ｍＬ～５０，０００μｇ/ｍＬ、さらに好ましくは１００μｇ/ｍＬ～１０，０００μｇ/ｍＬ、特に好ましくは２００μｇ/ｍＬ～５，０００μｇ/ｍＬ含有することが適当である。また、その他の有効成分は、本発明の抗菌組成物中、例えば、０．００１質量％～５．０質量％、好ましくは０．００２質量％～０．２質量％、より好ましくは０．００５質量％～０．１質量％、さらに好ましくは０．０１質量％～０．０５質量％、特に好ましくは０．０２質量％～０．０４質量％含有することが適当である。さらに、その他の成分は、各成分によって適切な含有量は適宜調節する必要があるが、例えば、０．１質量％～９０質量％、好ましくは１質量％～７０質量％、より好ましくは１０質量％～５０質量％含有することが適当である。なお、本発明の抗菌組成物は、そのほとんどは水などの溶媒であり得、例えば、本発明の抗菌組成物中、溶媒を９５質量％以上、好ましくは９８質量％以上、より好ましくは９９質量％以上、さらに好ましくは９９．５質量％以上含有することが適当である。また、ラウリン酸及びデカン酸（カプリン酸）のような炭素数８～１２の脂肪酸又は該脂肪酸の塩は、本発明の抗菌組成物中、例えば、０．００１質量％～５質量％、好ましくは０．００５質量％～１質量％、より好ましくは０．０１質量％～０．５質量％、特に好ましくは０．０４質量％～０．２質量％含有することが適当である。
＜治療／予防方法、そのための医薬組成物＞
本発明は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する医薬組成物を対象者に投与して、アシネトバクター感染症、好ましくは多剤耐性アシネトバクター感染症を治療、抑制又は予防するための方法、及びそのための医薬組成物を含み得る。当該治療、抑制又は予防効果は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体の上記抗菌性に起因し、特に呼吸器系の疾患に有効であると考えられる。ここで当該医薬組成物は、上述した抗菌性組成物を含むものであり、その他の有効成分等を含み得る点、含有量、含有率等は、すべて上述の抗菌性組成物と同様である。
ここで「対象者」は、ヒトの他、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマなどの哺乳動物を含む。
リゾチームやキトサンなどの各定義、その他の有効成分やその他の成分、投与量、投与形態、投与方法等は上述したとおりである。
［投与量、投与形態、投与方法］
本発明の抗菌性組成物及び医薬組成物は、その剤型、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状等によっても異なるが、例えば、ヒトの皮膚に噴霧するスプレー剤の形態の場合、一日投与量は、例えば、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．２～１０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．５～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１日１回～数回（例、２回、３回、４回又は８回）投与するのが望ましい。この投与量は、スプレー剤以外にも以下で説明するクリーム等の他の製剤においても好ましく適用できる。
本発明の抗菌性組成物及び医薬組成物は、経口でも非経口でも投与することができ、これらの製剤化には特別な技術は必要なく、汎用される技術を用いて製剤化をすることができる。投与剤型としては、クリーム、軟膏、ハップ剤、液剤、スプレー剤、ゲル剤、注射剤、錠剤、坐剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、点眼剤、眼軟膏などが挙げられ、クリーム、軟膏、ハップ剤、液剤、スプレー剤が特に好ましい。
本発明の抗菌性組成物及び医薬組成物は、上記投与形態に合わせて適宜投与方法を選択し得る。投与方法は公知の投与方法でよく、例えば、クリームの場合、本発明の医薬組成物を炎症箇所に上記投与量で塗布すればよい。
＜使用＞
本発明は、また、多剤耐性アシネトバクター感染症を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体の使用を含み得る。
アシネトバクター感染症、好ましくは多剤耐性アシネトバクター感染症を治療又は予防するための医薬組成物の製造において、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体は、複合体以外の当該医薬組成物の成分と共に混合され、当該医薬組成物となる。当該混合方法としては、公知の方法を用いることができるが、例えば液剤の場合、水などの溶剤に、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体及び上記任意のその他の成分を加え、混合し、必要に応じて乳化剤を加えて混合して分散剤又はエマルジョンとし、液剤が調製される。
この抗菌性組成物は、ネブライザーに用いられる洗浄水とすることができる。これにより抗菌性組成物を感染部位に直接噴霧することで、感染菌の増殖を抑制することができる。
また、本実施形態の抗菌性組成物及び医薬組成物は、例えば、アシネトバクター、好ましくは多剤耐性アシネトバクターに対して抗菌効果、菌の増殖抑制効果を有し、及びこれらに起因する感染症に対して治療、抑制、予防効果と共に、薬剤耐性の獲得を防止する効果を有する。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、本明細書及び図面において、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体は、リゾチーム－キトサン複合体、リゾックス、又はＬＹＺＯＸ（和興フィルタテクノロジー株式会社の登録商標）ともいう。
［試料の調製］
・リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液
リゾチームとキトサンとを結合させた複合体（リゾチーム－キトサン複合体）の溶液として、市販のＬＹＺＯＸ（登録商標、和興フィルタテクノロジー株式会社製）を使用した。市販のＬＹＺＯＸ（登録商標）は、ニワトリ由来のリゾチーム（約１４，０００Ｄａ）と、約５，０００Ｄａの水溶性キトサン（キトサンオリゴ糖）とを１：１の質量比で含む粉末である。具体的には、上記リゾチームと水溶性キトサンとを、水に混合溶解し、その後凍結乾燥させることによって、粉末状とし、さらにメイラード反応が完全に終了するのに十分な温度、湿度及び日数の条件下でメイラード反応させることによって本発明において使用するリゾチーム－キトサン複合体（ＬＹＺＯＸ（登録商標））を得ている。当該リゾチーム－キトサン複合体（ＬＹＺＯＸ（登録商標））を、各実験例において当該リゾチーム－キトサン複合体が所望の濃度となるように所定の溶媒と混合し、目的のリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液とした。
・リゾチーム単体の溶液
リゾチーム単体の溶液は、リゾチーム（日本バイオコン(株)製、愛知県）を、各実験例において当該リゾチームが所望の濃度となるように所定の溶媒と混合し、目的のリゾチーム単体の溶液とした。
・キトサン単体の溶液
キトサン単体の溶液は、キトサンオリゴ糖（(株)キミカ社製キミカキトサンオリゴ糖 COS-A）をキトサンとして用い、各実験例において当該キトサンオリゴ糖が所望の濃度となるように所定の溶媒と混合し、目的のキトサン単体の溶液とした。
・リゾチーム及びキトサンの混合物の溶液
リゾチーム及びキトサンの混合物は、上記リゾチーム単体：キトサン単体の質量比が１：１となるように両者を混合し、さらに当該混合物、リゾチーム、及びキトサンが所望の濃度となるように所定の溶媒を混合し、調製した。
・アシネトバクター細菌懸濁液
特に断らない限り、アシネトバクター・バウマニ（ＪＣＭ ６８４１）をトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）中に３７℃で一晩増殖させ、対数増殖期に遠心分離し、集菌した。得られた細菌を各試験において所定量の各種溶媒と混合し、アシネトバクター細菌懸濁液を得た。 
・緑膿菌細菌懸濁液
アシネトバクター・バウマニ（ＪＣＭ ６８４１）の代わりに緑膿菌（ＮＢＲＣ １３２７５又はＰＡＯ１）を使用した以外は、特に断らない限り、上述のアシネトバクター細菌懸濁液と同様に細菌懸濁液を調製した。
具体的な各実験例の詳細は、下記に示すとおりである。
・吸光度測定
特に断らない限り、本実施例における吸光度の測定では、アズワン株式会社製の分光光度計ASV11Dを使用した。実際の吸光度の測定においては、当該分光光度計で測定できる吸光度を考慮して、必要に応じて試料を希釈して測定し、吸光度を算出した。
実験例１（殺菌試験）
リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））のアシネトバクター等に対する殺菌性を、リゾチーム及びキトサンの混合物等との比較において測定した。
具体的には、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液（２，０００μｇ ／ ｍＬ、溶媒として生理食塩水を使用）、及びリゾチーム及びキトサンの混合物の溶液（リゾチーム単体の溶液［１，０００μｇ ／ ｍＬ］およびキトサン単体の溶液［１，０００μｇ ／ ｍＬ］、溶媒として生理食塩水を使用）に対し、１．０ｍＬの溶液当たり３０μＬの１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加え、中性ｐＨ（７．０～７．３）に調節して各溶液を準備した。コントロールとして、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を使用した。アシネトバクター細菌懸濁液又は緑膿菌細菌懸濁液は、緑膿菌（ＮＢＲＣ １３２７５又はＰＡＯ１）又はアシネトバクター・バウマニ（ＪＣＭ ６８４１）をトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）中に３７℃で一晩増殖させ、対数増殖期に遠心分離し、集菌し、細菌を生理食塩水水（０．９％ＮａＣｌ）で再懸濁し、最終懸濁液濃度を６００ｎｍで吸光度が１．０（１０8～１０9ＣＦＵ ／ ｍＬ）となるようにして調製した。
上記リゾチーム－キトサン複合体等の各溶液１０ｍLに、０．１ｍＬの上記アシネトバクター細菌懸濁液又は緑膿菌細菌懸濁液（１×１０7－１０8 ＣＦＵ）をそれぞれ加え、ウォーターバスを用いて３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から０分、３０分、６０分および１２０分経過したところで各溶液を０．１ｍＬずつ固形培地（ミューラーヒントン培地）に加え一晩増殖させた後に菌数測定した。各溶液に対する各細菌懸濁液の試験は、３回ずつ実施して測定した。結果を図２Ａ～Ｃに示す。
その結果、アシネトバクターにおいて（図２Ｃ）、リゾチーム－キトサン複合体は、６０分、１２０分でコントロールよりも有意に菌数が減少していた。
実験例２（殺菌試験）
各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））に対する、緑膿菌（ＮＢＲＣ １３２７５）の殺菌効果を測定した。具体的には、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液として、濃度の異なる溶液（２００μｇ ／ ｍＬ、２，０００μｇ ／ ｍＬ、及び１０，０００μｇ ／ ｍＬ）を、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を溶媒として用いて準備し、上記実験例１と同様に実験を繰り返し、緑膿菌（ＮＢＲＣ １３２７５）の菌数測定を行った。結果を図２Ｄに示す。図２Ｄに示されているとおり、リゾチーム－キトサン複合体は、濃度依存的な殺菌活性を示した。
実験例３（増殖抑制効果試験）
リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））のアシネトバクター等に対する増殖抑制効果を、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物との比較において測定した。
具体的には、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液（２，０００μｇ ／ ｍＬ）、リゾチーム単体の溶液（１，０００μｇ ／ ｍＬ）、キトサン単体の溶液（１，０００μｇ ／ ｍＬ）、及びリゾチーム及びキトサンの混合物の溶液（リゾチーム単体の溶液［１，０００μｇ ／ ｍＬ］およびキトサン単体の溶液［１，０００μｇ ／ ｍＬ］）を、トリプシンソイブロス（TSB）溶液（日本ベクトン・ディキンソン(株)社製）を溶媒として用いて調製し、各溶液に１．０ｍＬの溶液当たり１０μＬの１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて、中性ｐＨ（６．８～７．３）に調節して各溶液を準備した。コントロールとして、無添加のＴＳＢ培地を使用した。アシネトバクター細菌懸濁液又は緑膿菌細菌懸濁液は上記実験例１と同様にして調製した。上記リゾチーム－キトサン複合体等の１０ｍＬ各溶液にさらに２０００倍希釈した上記アシネトバクター細菌懸濁液又は緑膿菌細菌懸濁液の５０μL（２．５×１０3 ～１０4 ＣＦＵ）をそれぞれ加え、３７℃で６時間インキュベートした。６時間後に各溶液を０．１ｍＬずつ固形培地（ミューラーヒントン培地）に加え一晩増殖させた後に菌数測定した。各溶液に対する各細菌懸濁液の試験は、緑膿菌（NBRC １３２７５）で１８回、緑膿菌（PAO1）及びアシネトバクターで８回ずつの独立した実験よりduplicate（３回測定の平均およびＳＥＭ（標本平均の標準誤差））で測定した。結果を図３Ａ～Ｃに示す。なお、各構成成分（リゾチーム、キトサン）との質量濃度を揃えるために、リゾチーム単体及びキトサン単体と、当該リゾチーム単体及びキトサン単体の２倍濃度のリゾチーム－キトサン複合体とを対比して抗菌作用を比較した。
その結果、アシネトバクターにおいて（図３Ｃ）、リゾチーム－キトサン複合体は、コントロールよりも有意に菌数が減少していた。
実験例４（増殖抑制効果試験）
各濃度におけるリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））に対する、緑膿菌（ＮＢＲＣ １３２７５）の増殖抑制効果試験を測定した。具体的には、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液として、濃度の異なる溶液（２，０００μｇ ／ ｍＬ、５，０００μｇ ／ ｍＬ、及び１０，０００μｇ ／ ｍＬ）を、TSBを溶媒として用いて準備し、上記実験例３と同様に実験を繰り返し、緑膿菌（ＮＢＲＣ １３２７５）の菌数測定を行った。結果を図３Ｄに示す。図３Ｄに示されているとおり、リゾチーム－キトサン複合体は、濃度依存的な増殖抑制効果を示した。
実験例５（細胞膜の完全性試験）
２６０ｎｍ（Ａ260nm）での吸光度の測定により、細胞質から放出された核酸の量を推定し、細胞膜の完全性を評価した。細菌の細胞膜が抗菌剤によって損なわれると、細胞内成分が細胞外に放出する。２６０ｎｍでの吸光度の測定は、細胞質から放出されたＤＮＡおよびＲＮＡの量を推定するために使用される。
具体的には、細菌内より２６０ｎｍで吸収を有する物質が放出されているか否かにつき、２６０ｎｍの吸収をサーモフィッシャーサイエンス社製、ND-1000で測定することにより評価した。上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液として、濃度の異なる溶液（４，０００μｇ ／ ｍＬ、１０，０００μｇ ／ ｍＬ、及び２０，０００μｇ ／ ｍＬ（細菌懸濁液と混合した後の最終濃度は２，０００μｇ ／ ｍＬ、５，０００μｇ ／ ｍＬ、及び１０，０００μｇ ／ ｍＬ））を、０．５％ＮａＣｌ溶液を溶媒として用いて準備し、さらに１．０ｍＬの溶液当たり６０μＬの１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加え、中性ｐＨ（６．６～７．１）に調節して各溶液を準備した。コントロールとして、０．５％ＮａＣｌ溶液を使用した。実験例１と同様して調製した緑膿菌細菌懸濁液及びアシネトバクター細菌懸濁液を０．５％ＮａＣｌ溶液中に再懸濁し、最終懸濁液濃度を４２０ｎｍでの吸光度が０．７となるように調製した。上記リゾチーム－キトサン複合体等の１０ｍＬ各溶液に上記アシネトバクター細菌懸濁液又は緑膿菌細菌懸濁液を加え、ウォーターバスを用いて３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から２０分、４０分、６０分、８０分、１００分及び１２０分経過したところで、各溶液を、０．２２μｍシリンジフィルターを用いて細菌を除去し、２６０ｎｍ（Ａ260nm）での吸光度を測定した。吸光度は３回測定の平均およびＳＥＭ（標本平均の標準誤差）として表した結果を図４Ａ及びＢに示す。
その結果、吸光度２６０ｎｍは濃度依存的に増加することが示された（図４）。各細菌懸濁液を各濃度のリゾチームとキトサンとを結合させた複合体で処理した場合、吸光度２６０ｎｍは最初の２０分間で急速に増加し、その後１２０分間まで上昇率が減少した。よって、リゾチーム－キトサン複合体につき、コントロールに比べ、アシネトバクターではより高い吸光度を示すことがわかった。
実験例６（ＮＰＮアッセイ試験）
細胞外膜透過性を、NPNアッセイ（１－Ｎ－フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）取込アッセイ）によって決定した。１－Ｎ－フェニルナフチルアミンはリン脂質環境では強く蛍光を発するが、水性環境では弱く蛍光を発する。この性質は細菌の細胞外膜の透過性、即ち膜損傷を評価するために利用されている。 
具体的には、試料に対し、励起波長３５０ｎｍおよび発光波長４２０ｎｍでの蛍光強度を蛍光分光光度計（島津製作所社製、RF－６０００）で測定することにより評価した。上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液として、濃度の異なる溶液（２０μｇ ／ ｍＬ及び４０μｇ ／ ｍＬ（細菌懸濁液と混合した後の最終濃度は１０μｇ ／ ｍＬ及び２０μｇ ／ ｍＬ））を、０．５％ＮａＣｌ溶液を溶媒として用いて準備し、さらに１．０ｍＬの溶液当たり６０μＬの１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加え、中性ｐＨ（７．２～７．３）に調節して各溶液を準備した。コントロールとして、０．５％ＮａＣｌ溶液を使用した。これらの溶液に３０μＬの１．０ｍＭ ＮＰＮ溶液を加えた。実験例１と同様して調製した緑膿菌細菌懸濁液及びアシネトバクター細菌懸濁液を０．５％ＮａＣｌ溶液中に再懸濁し、最終懸濁液濃度を４２０ｎｍでの吸光度が１．０となるように調製した。上記リゾチーム－キトサン複合体等にＮＰＮ溶液を加えた各溶液に上記アシネトバクター細菌懸濁液又は緑膿菌細菌懸濁液を加え、室内気でインキュベートし、各溶液を上記蛍蛍光分光光度計にて、励起波長３５０ｎｍおよび発光波長４２０ｎｍでの蛍光強度を１０分間測定した。測定は３回行い、細菌を含む溶液の蛍光強度から細菌を含まない溶液の蛍光強度を引き、相対蛍光単位(RFU)として結果を得た。結果を図５Ａ及びＢに示す。
各種の細菌において、蛍光強度は１分後には増加し、その後は同じレベルに留まった。リゾチーム－キトサン複合体は、濃度依存的な増殖抑制効果を示した。リゾチーム－キトサン複合体は、アシネトバクターとの接触から１分以内に細胞外膜透過性を増加させることが示された。リゾチーム－キトサン複合体は、アシネトバクターとの接触から1分以内に細胞外膜透過性を増加させることがわかった。
実験例７（ＯＮＰＧアッセイ試験）
細胞内膜透過性を、ＯＮＰＧアッセイ（ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）アッセイ）によって決定した。細胞膜が損傷を受けると、β－ガラクトシダーゼを含む細胞内酵素が細胞外に漏れる。ＯＮＰＧは通常無色であるが、β－ガラクトシダーゼによってガラクトースおよびｏ－ニトロフェノールに加水分解され、４２０ｎｍでの吸光度が上昇する。細菌の細胞内膜透過性は、ＯＮＰＧを基質とし、細菌から放出された細胞質β－ガラクトシダーゼの活性を測定することによって決定することができる。
具体的には、４２０ｎｍで吸収を有する物質が放出されているか否かにつき、４２０ｎｍの吸収を分光光度計ASV11Dで測定することにより評価した。上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液として、濃度の異なる溶液（４００μｇ ／ ｍＬ、４，０００μｇ ／ ｍＬ、及び１０，０００μｇ ／ ｍＬ（細菌懸濁液と混合した後の最終濃度は２００μｇ ／ ｍＬ、２，０００μｇ ／ ｍＬ、及び５，０００μｇ ／ ｍＬ））を、０．５％ＮａＣｌ溶液を溶媒として用いて準備し、さらに１．０ｍＬの溶液当たり６０μＬの１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加え、中性ｐＨ（６．８～７．３）に調節して各溶液を準備した。コントロールとして、０．５％ＮａＣｌ溶液を使用した。実験例１と同様して調製した緑膿菌細菌懸濁液及びアシネトバクター細菌懸濁液を０．５％ＮａＣｌ溶液中に再懸濁し、最終懸濁液濃度を４２０ｎｍでの吸光度が１．２となるように調製した。上記リゾチーム－キトサン複合体等の各溶液１．６ｍＬと、１５０μＬの３０ｍＭ ＯＮＰＧ溶液と、上記アシネトバクター細菌懸濁液又は緑膿菌細菌懸濁液１．６ｍＬとを混合し、室内気でインキュベートし、開始後100分になるまで10分ごとに吸光度を測定した。４２０ｎｍ（Ａ420nm）での吸光度の増加は、３回測定することで評価した。結果を図６Ａ及びＢに示す。
アシネトバクターにつき、リゾチーム－キトサン複合体（２，０００μｇ／　ｍＬおよび５，０００μｇ／ｍＬ）を使用した場合の吸光度４２０ｎｍは、最初は急速に増加し、その後１００分まではゆっくりと増加した。リゾチーム－キトサン複合体（２００μｇ／ｍＬ）で処理したアシネトバクターでは、吸光度４２０ｎｍは最初の１０分間で増加し、その後は一定のままであった。各種の細菌において、吸光度４２０ｎｍは濃度依存的に増加した。細胞内酵素は、接触後１０分以内に濃度依存的に細胞外に漏出した。リゾチーム－キトサン複合体は、アシネトバクターの内膜を破壊することがわかった。
実験例８（共焦点レーザー走査顕微鏡観察）
　リゾチーム－キトサン複合体で処理した後の細菌の細胞膜の損傷を可視化するために共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で観察した（図７中スケールバー＝２５μｍ）。
具体的には、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））の２，０００μｇ ／ ｍＬ溶液（細菌懸濁液と混合した後の最終濃度は１，０００μｇ ／ ｍＬ）を、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を溶媒として用いて準備し、さらに１．０ｍＬの溶液当たり６０μＬの１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加え、ｐＨを中性（ｐＨ　７．０～７．１）に調節してリゾチーム－キトサン複合体溶液を準備した。コントロールとして、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を使用した。これらの溶液５００μＬに、上記実験例１と同様にして調製した緑膿菌細菌懸濁液及びアシネトバクター細菌懸濁液５００μＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、３μＬのＬＩＶＥ ／ ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ試薬（核酸を染色するSYTO 9とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の混合物）を加え、さらに室温で１５分間インキュベートした。緑の蛍光を持つＳＹＴＯ　９はすべての細菌を標識するが、赤の蛍光を持つＰＩは損傷した細胞質膜を持つ細菌のみに浸透し、両色素が存在するとＳＹＴＯ　９の蛍光を減弱させる。励起波長／発光波長は、ＳＹＴＯ ９では４８８／４９５～５１５ｎｍ、ＰＩでは４８８／６３５～７００ｎｍで観察した（図７Ａ及びＢ）。
コントロールにおいて、ほとんど全ての細菌は無傷（緑色蛍光）であったが、少数の細菌は損傷した膜を有していた（赤色蛍光）。リゾチーム－キトサン複合体で処理した各試料において、対応するコントロールにおけるものよりも、損傷した膜を有する細菌細胞が多かった（赤色蛍光が多数を占める状態）。リゾチーム－キトサン複合体で処理した緑膿菌では、無傷の細菌細胞および損傷した膜を有する細菌細胞が凝集し、クラスターを形成した。対照的に、リゾチーム－キトサン複合体で処理したアシネトバクターでは、緑膿菌と比較して細菌細胞の凝集が少なかった。ＣＬＳＭの所見は、これまでの膜損傷アッセイの結果と一致するものであった。
実験例９（走査電子顕微鏡観察）
緑膿菌及びアシネトバクターのリゾチーム－キトサン複合体による形態変化を、走査電子顕微鏡（SEM）により観察した（２万倍の倍率で写真撮影、図８中スケールバー＝ １．５μｍ）。
具体的には、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液（１，０００μｇ ／ ｍＬ）、リゾチーム単体の溶液（５００μｇ ／ ｍＬ）、キトサン単体の溶液（５００μｇ ／ ｍＬ）、及びリゾチーム及びキトサンの混合物の溶液（リゾチーム単体の溶液［５００μｇ ／ ｍＬ］およびキトサン単体の溶液［５００μｇ ／ ｍＬ］）を、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を溶媒として用いて準備した。コントロールとして、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を使用した。吸光度を２．０とした以外は上記実験例１と同様にして調製した緑膿菌細菌懸濁液及びアシネトバクター細菌懸濁液の上澄みを全て除いたものに上記リゾチーム－キトサン複合体等の各溶液１ｍＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、遠心分離して、得られたペレットを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で洗浄し、固定液（０．１Ｍリン酸緩衝液中２．５％緩衝グルタルアルデヒド）で４℃、２時間固定した。その後、０．１Ｍリン酸緩衝液中で一晩インキュベートした。
その後、各細菌を０．１Ｍリン酸緩衝液中の１．０％緩衝化四酸化オスミウム中で１時間固定し、次いでエタノールで脱水したのちに臨界点乾燥装置（ＨＣＰ－２）を用いて乾燥させた。約２０ｎｍの白金／パラジウムをコーティングした後、試料を走査型電子顕微鏡（Ｓ－４５００）で観察した（図８Ａ及びＢ）。
未処理の緑膿菌（ＮＢＲＣ １３２７５）（図８Ａ）およびアシネトバクター・バウマニ（図８Ｂ）のＳＥＭの所見は、滑らかな表面を示した（図８Ａの（ａ）及び図８Ｂの（ｆ））。リゾチーム単体で処理した後、緑膿菌およびアシネトバクターは部分的に球状細胞であるスフェロプラストを形成した（図８Ａの（ｃ）及び図８Ｂの（ｈ））。緑膿菌およびアシネトバクターの両者で、キトサン単体および混合物で処理したもの（（図８Ａの（ｄ）及び（ｅ）、図８Ｂの（ｉ）及び（ｊ））と比較して、リゾチーム－キトサン複合体で処理したものは（図８Ａの（ｂ）及び図８Ｂの（ｇ））、多くの小胞が観察された。リゾチーム－キトサン複合体および混合物で処理した緑膿菌およびアシネトバクターはそれらの表面構造の完全性を失い、部分的に球形になった（図８Ａの（ｂ）及び（ｅ）、図８Ｂの（ｇ）及び（ｊ））。各溶液で処理した後、特にリゾチーム－キトサン複合体で処理した後、細胞外糸状構造が細胞の周囲に現れた（図８Ａの（ｂ）～（ｅ）、図８Ｂの（ｇ）～（ｊ））。
実験例１０（透過電子顕微鏡観察）
緑膿菌及びアシネトバクターのリゾチーム－キトサン複合体による形態変化を、透過電子顕微鏡（TEM）により観察した（５０，０００倍の倍率で写真撮影、図９中スケールバー＝０．２μｍ）。
具体的には、上述したリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液（１，０００μｇ ／ ｍＬ）、リゾチーム単体の溶液（５００μｇ ／ ｍＬ）、キトサン単体の溶液（５００μｇ ／ ｍＬ）、及びリゾチーム及びキトサンの混合物の溶液（リゾチーム単体の溶液［５００μｇ ／ ｍＬ］およびキトサン単体の溶液［５００μｇ ／ ｍＬ］）を、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を溶媒として用いて準備した。コントロールとして、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）を使用した。
これらの溶液１ｍＬに、上記実験例１と同様にして調製した緑膿菌細菌懸濁液及びアシネトバクター細菌懸濁液を生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で希釈して最終懸濁液濃度が６００ｎｍで吸光度４．０となるように調製し、上澄みを全て除いたものを準備し、これに上記リゾチーム－キトサン複合体等の各溶液１ｍＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後遠心分離して、得られたペレットを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で洗浄し、０．１Ｍリン酸緩衝液中１．０％緩衝化四酸化オスミウム緩衝液中で１時間固定し、２．０％寒天中に包埋し、エタノールで脱水し、次いでＥｐｏｎ ８１２（ＴＡＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｌｔｄ．）に包埋した。７０ｎｍの超薄切片を銅グリッド上に集め、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で二重染色し、透過型電子顕微鏡（Ｈ － ７１００）を用いて７５ｋＶで観察した。
未処理の緑膿菌およびアシネトバクターのＴＥＭ所見では、細菌の正常な表面構造を示し、滑らかで層状に見える（図９Ａの（ａ）、図９Ｂの（ｆ））。リゾチーム単体で処理すると緑膿菌とアシネトバクターの両者がスフェロプラストを形成し（図９Ａの（ｃ）、図９Ｂの（ｈ））、キトサン単体で処理するとこれらの細菌はそれらの表面に多数の小胞を形成した（図９Ａの（ｄ）、図９Ｂの（ｉ））。小胞は外膜から生成されており、これらは各細菌のＳＥＭで観察された小胞に一致した。リゾチーム－キトサン複合体または混合物で処理した後、緑膿菌およびアシネトバクター・バウマニのＴＥＭ所見では、外膜小胞を有する球状細胞を示すことによって、リゾチーム単体およびキトサン単体の処理の両方から生じる形態学的変化を明らかにした（図９Ａの（ｂ）及び（ｅ）、図９Ｂの（ｇ）及び（ｊ））。さらに、細菌の細胞壁が破壊され、細胞内の内容物が細胞から放出された。
実験例１１（薬剤耐性獲得試験）
薬剤耐性の獲得を評価するために、緑膿菌（ＮＢＲＣ　１３２７５およびＰＡＯ　１）、アシネトバクター・バウマニを、リゾチーム－キトサン複合体を含むＬＢ培地中で繰り返し継代培養し、リゾチーム－キトサン複合体に対する感受性の変化を評価した。
具体的には、リゾチーム－キトサン複合体のＭＩＣ（最小発育阻止濃度：細菌の増殖を阻止するための薬剤の必要最小量）について、緑膿菌（ＮＢＲＣ　１３２７５およびＰＡＯ　１）、もしくはアシネトバクター・バウマニを６００ｎｍで吸光度が１．０になるように生理食塩水（ＮａＣｌ　０．９％）を溶媒として用いて調整し、調整した細菌混濁液６０μＬを９６穴マイクロプレート内のＬＢ培地１４０μＬに加え、最終的に１ウェル内の細菌濃度を１０4に調製し、３５℃でインキュベートした。１８時間、２４時間後に評価し、目視で混濁が見られなかった試薬の最小濃度をＭＩＣと定義した。当該ＭＩＣの半分である１／２ＭＩＣのリゾチーム－キトサン複合体濃度で細菌を繰り返し継代培養し（１０回）、それぞれのＭＩＣについて評価した（図１０Ａ及びＢ中のＬＹＺＯＸ、継代）。比較として、上記リゾチーム及びキトサンの混合物を用いて（図１０Ａ及びＢ中の対照群）、リゾチーム－キトサン複合体に対する試験と同様の試験を行なった（図１０Ａ及びＢ中の対照群、継代）。継代培養しなかった各細菌をコントロールとして評価した（図１０Ａ及びＢ中のＣＴＬ）。ＭＩＣの測定を１０回繰り返し、これらの細菌における薬剤耐性の発現を評価した。
得られた薬剤耐性試験を図１０に示す。１０回継代培養した後、緑膿菌およびアシネトバクターはリゾチーム－キトサン複合体およびその混合物に対する耐性を獲得しなかった。
実験例１２（溶血毒性試験）
リゾチーム－キトサン複合体の安全性を確認するため、溶血毒性試験を行った。
具体的には、４００μＬのウサギの脱繊維化血液（コスモバイオ株式会社から入手）を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を溶媒として使用して希釈し、２０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、２，０００μｇ／ｍＬおよび２０，０００μｇ／ｍＬ（表１の通り、溶血毒性評価試験時の濃度は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１，０００μｇ／ｍＬおよび１０，０００μｇ／ｍＬである（表１））のリゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液を作成した。上記ＰＢＳで希釈した上記ウサギの脱繊維化血液５００μＬをさらに調製し、５００μＬの各リゾチーム－キトサン複合体（リゾックス／ＬＹＺＯＸ（登録商標））溶液、ＰＢＳ（ネガティブコントロール）、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ　１００溶液（ポジティブコントロール）に加えた。得られた各混合液を３７℃で１時間インキュベートし、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取した。各上清７５０μＬを７５０μＬの上記ＰＢＳに添加し、７５０μＬのコントロール（ネガティブコントロール又はポジティブコントロール）を７５０μＬの各対応濃度のリゾチーム－キトサン複合体に添加した。下記式を使用することにより溶血率を計算するために各吸光度（ＯＤ）を５４５ｎｍで測定した。当該５４５ｎｍでの吸光値は３回測定の平均およびＳＥＭ（標本平均の標準誤差）として表した。

溶血率（ＨＲ）（％）＝（試料の吸光度［ＡＳ］　－　対応する濃度のネガティブコントロール吸光度［ＡＮ］）／（リゾチーム－キトサン複合体濃度に対応するポジティブコントロール吸光度［ＡＰ］－［ＡＮ］）×１００。

表１　溶血毒性試験
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
表１に示されているとおり、リゾチーム－キトサン複合体は、３７℃で１時間のインキュベーション後、ウサギ赤血球はほぼ溶血しなかった。リゾチーム－キトサン複合体の溶血率は１０μｇ／　ｍＬから１０，０００μｇ／　ｍＬの範囲の濃度で５％未満であった。なお、５％以下の溶血率で臨床用の生体材料に許容され、安全であると報告されている[Deng JD, He B, He DH, Chen ZF. A potential biopreservative: Chemical composition, antibacterial and hemolytic activities of leaves essential oil from Alpinia guinanensis. Ind Crop Prod. 2016;94:281-7.]。
産業上の利用可能性
　本発明によれば、アシネトバクターに対して新規な抗菌性組成物及び医薬組成物等を提供することができる。

Claims (8)

  1. 　リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有し、アシネトバクターに対して抗菌性を有する抗菌性組成物。
  2. 　前記アシネトバクターが、多剤耐性アシネトバクターである、請求項１記載の抗菌性組成物。
  3. 　前記抗菌性組成物１ｍＬ中の前記複合体の濃度が２００μｇ／ｍＬ以上である、請求項１又は２に記載の抗菌性組成物。
  4. 　前記抗菌性が殺菌性を伴う、請求項１～３のいずれかに記載の抗菌性組成物。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載の抗菌性組成物を含有する洗浄水。
  6. 　リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有する、アシネトバクター感染症を治療または予防するための医薬組成物。
  7. 　前記アシネトバクター感染症が、多剤耐性アシネトバクター感染症である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　アシネトバクター感染症を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体の使用。
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