CN105766990B - 作为防腐剂用于农业、工业和其它用途的铋-硫醇 - Google Patents

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Abstract

本发明描述包括新型均匀微粒悬浮液的组合物和方法用于治疗包含细菌生物膜的天然以及人造表面，其包括铋‑硫醇(BT)化合物和某些抗生素之间预料之外的协同性或增强作用，以提供包括抗菌制剂在内的制剂。本发明还描述了公开的BT化合物和BT化合物+抗生素组合的之前未预测的抗菌性质和抗生物膜性质，其包括某些这种组合物对治疗某些革兰氏阳性菌感染的优先功效和某些这种组合物对治疗某些革兰氏阴性菌感染的不同的优先功效。

Description

作为防腐剂用于农业、工业和其它用途的铋-硫醇
本申请是PCT申请号为PCT/US2011/047490，申请人为“微生物公司”，发明名称为“作为防腐剂用于农业、工业和其它用途的铋-硫醇”的PCT申请进入中国国家阶段后申请号为201180042863.X的中国国家阶段申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年2月3日提交的PCT申请No.PCT/US2011/023549以及2010年8月12日提交的美国临时申请No.61/373,188的权益，其各自以引用方式全部并入本文中。
背景
技术领域
本公开发明的实施方案涉及用于治疗微生物感染的组合物和方法。特别地，本实施方案涉及用于在农业、工业、制造业、临床、个人保健和其它情况下(包括细菌生物膜和其它病状的治疗中)控制细菌感染的改善的治疗。
相关技术的描述
促进应答以及抵抗微生物感染和/或促进复原或维持植物和动物(包括人)体组织的一系列协同的细胞和分子相互作用的组合通常可受各种外部因素的不利影响，例如机会性感染和医院感染(例如，可增加感染风险的临床方案)；抗生素的局部或系统施用(其可影响细胞生长、转移或其它功能以及也可选择抗生素抗性微生物)；和/或其它因素。
遗憾的是，系统或局部引入的抗生素通常对于治疗许多慢性感染无效，并且通常不被使用，除非存在急性细菌感染。目前的方法包括施用或应用抗生素，但此类疗法可能促进抗生素抗性菌菌株的出现和/或可能对于对抗细菌生物膜无效。因此，当检测到耐药菌(例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌((Staphylococcus aureus)或MRSA)时，使用抗菌剂可能变得特别重要。有许多广泛使用的抗菌剂，但是产生的细菌群或亚群可能对这些试剂不应答，或者对任何其它目前可用的治疗不应答。另外，许多抗菌剂在可有效抵抗所产生的细菌感染所需的浓度下对宿主细胞可能是毒性的，因此这些抗菌剂是不适合的。这一问题可能在尝试从天然表面清除感染的情况下特别突出，所述天然表面包括市售表面特征物和/或诸如许多作物的农业重要植物，还包括内上皮表面，例如呼吸道(例如，气道、鼻咽喉通道、气管、肺、支气管、细支气管、肺泡等)或胃肠道(例如，口腔、食管、胃、肠、直肠、肛门等)或其它上皮表面。
特别有问题的是由细菌生物膜(最近得以认识的细菌组织)构成感染，借此游离的单细胞(“浮游的”)细菌通过细胞间粘附聚集成有组织的多细胞群落(生物膜(biofilm))，所述多细胞群落具有显著不同的行为模式、基因表达和对包括抗生素在内的环境物质的敏感性。生物膜可以采用未在浮游细菌中发现的生物防御机制，所述机制可以保护生物膜群落免受抗生素和宿主免疫应答。已形成的生物膜可以阻止组织愈合过程。
在持续和潜在的有害感染下常见的微生物污染物包括金黄色葡萄球菌(其包括MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌))、肠球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、链球菌和鲍氏不动杆菌。这些微生物有些表现出在非营养性临床表面上存活数月的能力。已经显示金黄色葡萄球菌在干燥玻璃上存活四周，并且在干血和棉纤维上存活3至6个月(Domenico等，1999Infect.Immun.67:664-669)。已经显示大肠杆菌和铜绿假单胞菌在干血和棉纤维上比金黄色葡萄球菌存活更长时间(如前所述)。
微生物生物膜与对消毒剂和抗生素明显增加的抗性有关。当细菌和/或真菌附着于表面时形成生物膜形态。该附着触发基因转录改变，导致非常有弹性且难以穿透的多糖基质的分泌，保护微生物。除了生物膜对抗生素非常显著的抗性外，它们对哺乳动物免疫系统的抗性强。生物膜一旦形成则非常难以根除，所以预防生物膜形成是非常重要的临床优先原则。最近研究已显示，开放性伤口可以被生物膜快速污染。这些微生物生物膜被认为可延迟伤口愈合，并且很可能与严重伤口感染的产生相关。
完整的功能性皮肤和其它上皮组织(例如，一般在微生物与其外部环境之间形成屏障的非血管上皮表面，例如皮肤中存在的那些以及呼吸道和胃肠道的衬膜、腺组织等中存在的那些)的维持对于人和其它动物的健康和存活是重要的。
铋硫醇-(BT)类抗菌剂
许多具有抗微生物、特别是抗菌性质的天然产物(例如抗生素)和合成化学品是本领域已知的，并且已经至少部分地由化学结构和抗微生物作用来表征，所述抗微生物作用例如杀伤微生物的能力(“杀灭”作用，例如杀菌性质)，阻止或损害微生物生长的能力(“抑制”作用，例如抑菌性质)，或者干扰微生物功能，例如定植或感染部位、外泌多糖的细菌分泌和/或从浮游转化为生物膜群体或生物膜形成的扩展的能力。例如，U.S.6,582,719讨论了抗生素、消毒剂、抗菌剂等(包括铋-硫醇或BT化合物)，包括影响此类组合物的选择和使用的因素，包括例如杀菌或抑菌性质、有效浓度和对宿主组织的毒性风险。
铋，V族金属，是具有抗微生物性质的元素(类似银)。铋自身可能没有治疗作用并且可能表现出某些不适当的性质，因此取而代之，可通常与络合剂、载体和/或其它媒介物一起递送来施用，最常见的实例是Pepto其中铋与碱式水杨酸盐组合(鳌合)。之前的研究已经确定，某些含硫醇-(-SH,巯基)化合物例如乙二硫醇与铋的组合提供示例性的铋硫醇(BT)化合物，与目前可用的其它铋制剂相比，改善了铋的抗微生物功效。有许多可用于产生BT的硫醇化合物(公开于例如Domenico等，2001Antimicrob.Agent.Chemotherap.45(5):1417-1421，Domenico等，1997Antimicrob.Agent.Chemother.41(8):1697-1703，和U.S.RE37,793,U.S.6,248,371,U.S.6,086,921和U.S.6,380,248；还参见例如U.S.6,582,719)，这些制剂中的几种能够抑制生物膜形成。
已经证明BT化合物抗以下菌的活性：MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)、MRSE(甲氧西林抗性表皮葡萄球菌(methicillin resistant S.epidermidis))、结核丝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、药物抗性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和弗氏志贺菌(Shigella flexneri)(Domenico等，1997Antimicrob.Agents Chemother.41:1697-1703)。还有抗巨细胞病毒、1型单纯性疤疹病毒(HSV-1)和HSV-2以及酵母和真菌例如白色念珠菌的证据。已经证明BT减少细菌致病性、抑制或杀伤广谱抗生素抗性微生物(革兰氏阳性和革兰氏阴性)、预防生物膜形成、预防败血性休克、治疗败血症和增加对之前对之表现出抗性的抗生素的细菌敏感性的作用(参见例如，Domenico等，2001 Agents Chemother.45:1417-1421；Domenico等，2000Infect.Med.17:123-127；Domenico等，2003 Res.Adv.In Antimicrob.Agents&Chemother.3:79-85；Domenico等，1997 Antimicrob.Agents Chemother.41(8):1697-1703；Domenico等，1999 Infect.Immun.67:664-669:Huang等1999 JAntimicrob.Chemother.44:601-605；Veloira等，2003 J Antimicrob.Chemother.52:915-919；Wu等，2002 Am J Respir Cell Mot Biol.26:731-738)。
尽管BT化合物已经存在超过十年了，但有效选择用于特定感染疾病适应症的适当BT化合物依然是难以实现的目标，其中针对特定微生物的特定BT的行为不能被预测，其中针对特定微生物的特定BT和特定抗生素的协同活性不能被预测，其中体外BT作用可能不总是预测体内BT作用，并且其中针对浮游(单细胞)微生物群体的BT作用可能不会预测针对微生物群落(例如组织成生物膜的细菌)的BT作用。此外，溶解度、组织通透性、生物利用度、生物分布等方面的限制可能在一些BT化合物中阻碍安全且有效递送临床益处的能力。本公开发明实施方案解决了这些需要并提供了其它相关优点。
植物和农业产品的保护：相关技术的描述
在农业和植物学领域中，对于在植物中降低生物膜和疾病的制剂以及对在例如种子、植物、果实和花、土壤上以及在切花、树木、果实、叶、茎和其它植物部分上使用这些制剂的方法有公认的需求。
在农业上，由于形成生物膜每年损失数十亿美元的作物。在植物中炭疽病和生物膜相关疾病的问题众所周知，尽管尝试多种不令人满意的方法来解决它。植物疾病也影响在运输和保存水果、蔬菜、切花和树木以及其它植物产品中涉及的工业，因为完整存活植物所采用的正常保护机制在收获的产品中不再可行。
因此，出于农业目的，需要降低在原位、在运输中或者销售点处叶、茎、果实和花的表面上微生物的生长量，同时维持对环境法规的依从性。同时，需要使在切花、植物和树木内水流动以维持植物组织膨胀度、完整性和质量，从而增强这些产品的所需特征。
在植物中导致传染病的生物体包括真菌、细菌、病毒、原生动物、线虫和寄生植物。通过啃食植物组织以及通过暴露植物组织于微生物，昆虫和其它害虫也影响植物健康。
通常在水性环境中(例如在水生条件或者在水滴中或者其它高湿度的条件下)，当细菌结合表面时，产生生物膜，并且在结合之后，生物膜形成物(biofilm former)开始排泄粘性物质，然后所述粘性物质可结合各种物质，包括金属、塑料、医学植入体和组织。在工业和农业环境中，这些生物膜可导致许多问题，包括物质的降解和管道的阻塞，以及在医学环境中产生时导致周围组织的感染。医学领域特别容易受到由生物膜形成所导致问题的影响；在生物膜中存在的细菌容易滤过植入的医疗装置、导管(尿、静脉、透析、心脏)和愈合缓慢的伤口。在农业上，生物膜可导致乳腺炎、皮尔斯病害(Pierce's disease)、在土豆中的环腐病、在许多类型的植物中的各种作物枯萎病和炭疽病。生物膜也降低切花和树木的质量和产品寿命。
许多植物疾病由土壤生成的细菌产生的生物膜所致。在天然环境中大部分微生物存在于通常描述为生物膜的多细胞聚集体中。通过复杂基质使细胞粘附至表面以及彼此，所述复杂基质包含各种细胞外聚合物(EPS)，包括胞外多糖、蛋白和DNA。在发病和共生时以及在共生关系中植物相关的细菌与宿主组织表面相互作用。与植物相关细菌的观察日益揭示自小的细胞簇至大的生物膜均不同的生物膜类型结构。植物组织的表面性质、营养和水利用度以及定植细菌的倾向强烈影响所得生物膜结构(Ramey等，2004 Curr OpinionMicrobiol.7:602-9)。
陆地环境具备丰富多样的微生物群体，这些微生物群体可竞争以及改变资源库。在该复杂和竞争性环境中，植物提供营养丰富的组织的保护绿洲。细菌定植在植物的叶、根、种子和内部维管结构上。各组织类型具有独特化学和物理性质，为微生物群体提供了挑战和机会。在附着或者随后阶段可形成生物膜，极有可能引起或调节植物-微生物相互作用。当许多微生物积极改变定植植物环境时会引起另外的时间和空间复杂性。
表面附着的细菌对农业具有显著影响。在发达国家，植物疾病所致损失高达作物产量的25％，该比例远远大于发展中国家。附生菌群落由储库(reservoir)和未来的感染来源组成，并且可在宿主和非宿主植物上发现。在这些植物的维管结构中葡萄树的细菌病原体葡萄木友菌(Xylophylus ampelinus)形成厚的生物膜(Grail和Manceau 2003)。苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)是葡萄树中皮尔斯病害的致病菌。苛养木杆菌能够在许多经济重要作物的木质部导管内形成生物膜。病原性机制主要由于通过苛养木杆菌聚集和生物膜形成所致木质部导管的阻塞。据认为，脉管阻塞是疾病发展的主要原因，其中木质部汁液提供促进葡萄树的皮尔斯病害和柑橘杂色褪绿病(citrus variegated chlorosis)的毒力的天然介质(Zaini等，2009 FEMS Microbiol LETT.295:129-34)。
最相关植物病原体之一，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)导致豆类的褐斑病。它以单独的小群(小于十个细胞)分散定植在叶面上，而更大群体(大于1000个细胞)主要在靠近具有更高营养利用度的毛状体或叶脉处发展。大聚集物比孤立细胞更好地抵抗脱水胁迫。当不会在宿主植物组织上导致感染时，丁香假单胞菌作为附生菌生存(即，植物的地上部分的定植物)(Monier等，PNAS 2003；100:15977-82)。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)可快速应答土壤中根系分泌物的存在，在根定植位置处聚集以及形成稳定生物膜(Espinosa-Urgel等Microbiol 2002；148:341-3)。
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)(Xcc)导致在十字花科植物上的黑腐病，通过在根中伤口位置到达维管结构。毒力包括降解胞外酶和胞外多糖黄单胞菌胶，其对于毒力是必须的(Dow等PNAS 2003；100:10995-1000)。
地毯草黄单胞菌菜豆变种(Xanthomonas smithii subsp.citri)是柑橘溃疡疾病的原因。除了欧洲之外，该疾病在世界上大部分大洲中均已发现。在许多国家已然根除病原体。地毯草黄单胞菌形成在柑橘植物的果实、叶和细枝上溃疡病变。风夹雨可将细菌由来源地播散至多15km以通过气孔或伤口感染柑橘树(Sosnowski,等，Plant Pathol 2009；58:621-35)。
玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.Stewartii)导致玉米细菌性枯萎病(Stewart's wilt disease)并且通过玉米跳甲传播。细菌主要停留在宿主木质部中并且产生大量的胞外多糖(von Bodman等PNAS 1998；95:7687-92)。
青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是在许多植物上导致致命枯萎的土传病原体。毒力取决于通过复杂调节网络控制的EPS以及细胞壁降解酶(Kang等MolMicrobiol 2002；46:427-37)。
马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus)是导致土豆中细菌环腐病的革兰氏阳性植物病原体。Marques和同事展示了大细菌，即附着至木质部导管的包住基质的聚集物(Marques等Phytopathol 2003；93:S57)。
通过植物组织的快速浸渍，产生生物膜的菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)导致软腐病。果胶酶的产生可以是群体感应(QS)调节的，因而不能形成细菌聚集物，这会阻止分解果胶酶(pectinolytic enzyme)分泌。相关的植物病原体梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)感染约75种不同植物种属，所有均为蔷薇科。该细菌的宿主包括苹果、梨、黑莓、栒子、野苹果、火棘(火棘属)、山楂、日本海棠或贴梗海棠、欧洲花楸、梨、榅桲、覆盆子、唐棣和绣线菊。培植的苹果、梨和榅桲是感染最严重的种属。在2000年密歇根州一次火疫病传染病(fire blight epidemic)导致超过220,000树木死亡，达$4200万的总损失。每年美国火疫病损失以及控制费用评估超过$1亿(Norelli等，Plant Dis 2003；87:26-32)。
梨火疫病菌产生两种胞外多糖，胞外糖(amylovoran)和果聚糖，其在宿主植物中导致特征性火疫病枯萎症状(Koczan等Phytopathol 2009；99:1237-44)。此外，其它基因和它们编码的蛋白的特征在于梨火疫病菌的毒力因子，该毒力因子编码促进山梨糖醇代谢、蛋白水解活性和收获铁的酶(Oh和Beer.FEMS Microbiology Lett 2005；253:185—192)。
无论植物的何部分受到诸如生物膜形成物的微生物植物病原体侵袭，该作用通常都会使植物变弱或杀死植物。通过感染叶，病原体降低植物生产食物的能力(例如，通过光合作用)。一些植物病原体堵塞供应叶的茎中的流体输送脉管，并且当这些病原体侵袭根时，水和营养的摄取降低或者被完全中断。在土壤中生长植物和在花瓶水中切割植物中植物维管结构的堵塞通常涉及产生生物膜的细菌，其阻塞水和营养物质流动。
当植物受到这些微生物之一侵袭时，所造成的损伤提供另外的微生物入侵植物组织的机会，并且正是伴有的突击最终损坏和破坏植物。在诸如干旱或者营养缺乏的环境应激下，植物特别容易受到微生物侵袭。
有时，微生物“感染”是共生的，其中两生物体均得到益处。一个好的实例是众所周知的固氮细菌(根瘤菌属)，其定植在豆类(豆科)植物的根上的瘤状体中—植物提供食物和保护，同时细菌从空气中吸收氮气以及将它转化以形成宿主可用的物质。作为另一实例，菌根是与植物根具有共生关系的整个目的真菌。鉴于这些互相有益的共生，保存或保护植物免受有害微生物病原体影响可合理地采用尽可能不会破坏这些共生关系的抗微生物剂。
在分解死的有机体为腐殖质的过程中腐生真菌是必需的，所述腐殖质是良好土壤结构所需要的。腐生真菌不具有任何叶绿素，因而不能使用光来获得能量(例如，通过光合作用)；取而代之腐生真菌通过分解活的或死的植物和动物体来获得其能量。腐生真菌也可与某些植物种属以共生关系生长，例如，在松柏科植物的细根中的菌根，没有它们其无法存活以摄取必需的营养物质。控制有害植物病原体的化学试剂的广泛使用可损伤这些有益真菌的平衡，并且与组织管理的原则相违背。
然而，有其它更加不受欢迎的真菌，其侵袭活的植物并使它们变弱或者杀死它们。另一种微生物植物病原体，即病毒，可定植在植物组织的细胞内，因而通常不能使用局部施用的化学物质来治疗，使得必须销毁受感染的植物。当前无治疗植物特异性开发的抗生素(虽然已经发现用于其它目的开发的一些抗生素用于植物上)，导致大量经济重要植物种属易受病原体细菌侵袭。例如，已经证实蔷薇科的多种植物种属的火疫病侵染无法治疗。相比之下，使用局部施用的化学物质可杀死许多有害真菌，而不会损伤植物宿主，因为真菌生长栖息地不同，即，大量不期望的病原体真菌倾向于在植物表面上生长而不是在植物组织内生长，其使用根状结构以提取营养物。
因为杀死多种植物病原体通常困难或者不可能，所以用于保护植物抵抗有害微生物病原体的很多方法采用“预防优于治疗”的原理。通过观察培植和生长植物时的良好卫生条件，通过阻止形成微生物感染的机会可预防许多微生物植物疾病。通常，当预防性使用这些试剂而不是应答形成的感染时，显著更少量的杀虫剂或杀微生物剂可以为有效的。
如果它们不是生长在最佳或者接近最佳的条件下，例如，由于自身差的土壤质量(例如，缺乏营养物)或者同时有干旱或过量雨水或洪水，则植物也可更易感染疾病。例如，极湿环境可促进病原体真菌和/或细菌生长。例如，通过在叶面上的水利用度来表示在丁香假单胞菌中的群体感应(Dulla和Lindow.PNAS 2008；105:3-082-7)。当然，并非所有植物疾病均可通过良好农业卫生条件来预防，如在当一些植物疾病通过昆虫传播以及其它为风传播的情况下。例如蚜虫和其它吸汁液昆虫是病毒的主要载体。在空气中以及在雨滴和溅水中带有真菌疾病的孢子。
在种子和幼芽上生物膜
细菌附着种子是强烈影响根圈定植的过程。种子供应商通常故意使用微生物生物膜包覆种子储备以接种发育中的根圈。相反，用于人食用的种子和幼芽上生物膜通常是胃肠道感染的常规来源。恶臭假单胞菌有效地粘附种子并将随后定植在根圈。在小麦组织中发现的非病原体放线菌的植物内生群体源于表面已灭菌的种子的放线菌的内部定植。有益固氮细菌的内生植物种子群体可帮助确保未来根圈定植。种子定植的其它研究已经报道在苜蓿种子和幼芽的扫描电子显微镜照片中EPS内嵌入的棒状和球状细菌。众所周知，生物膜耐受在种子和幼芽上洗涤和其它常见抗细菌处理。Fett等发现，在苜蓿幼芽上大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌群体需要比简单水洗涤更加严格的处理以降低附着微生物的数目，并且始终无法达到完全去除。存活的细菌可能保留在生物膜内(Ramey等Curr OpinionMicrobiol 2004；7:602-9)。
切花和树木
脉管病原体栖息于植物宿主的木质部或韧皮部并且通常依赖昆虫载体或伤口来散播。切割花或树木是特别容易被脉管感染的类似类型的伤口。生物膜细菌在切割表面处进入并阻塞维管结构，并且干扰水、矿物质和营养物质流动。稀释于花瓶水中的切花防腐剂通常含有水杨酸盐或阿司匹林以降低生物膜形成(Domenico等，J Antimicrob Chemo1991；28:801-10；Salo等，Infection 1995；23:371-7)，并且提供低pH以防止细菌生长和破坏生物膜。
农业中的抗微生物剂。植物病原体入侵的根除对保护植物工业、养护花园和世界上的天然环境非常重要。病原体的地方性流行的后果可能很严重，在一些情况下会影响国家经济。目前根除病原体的方法依赖治疗、去除和处置受感染的宿主植物的技术。这些技术中有许多成功实例，但其中也有许多未成功。成功依赖对病原体的生物学和流行病学的良好理解及其与宿主的相互作用。在检查世界范围内治疗植物病原体和感染疾病的宿主材料的实例中，特别是在澳大拉西亚，已经使用各种技术，包括燃烧、埋藏、修剪、堆肥、土壤和生物熏蒸、日晒、蒸汽灭菌以及生物载体控制(Sosnowski，等，Plant Pathol 2009；58:621-35)。
自20世纪50年代起也已经使用抗生素来控制高价水果、蔬菜和观赏植物的某些细菌疾病。如今，在植物上通常使用的抗生素是土霉素和链霉素。在美国，施加至植物的抗生素占使用的抗生素总和的0.5％以下。植物病原体对土霉素的抗性很少见，但梨火疫病菌、恶臭假单胞菌和野油菜黄单胞菌的链霉素抗性菌株的出现已经妨碍了对某些重要疾病的控制。因此，在人药物的抗生素抗性风险中抗生素使用对植物的作用是讨论的主题(McManus等Annu Rev Phytopathol 2002；40:443-65)。
链霉素抗性(SmR)植物病原体的出现使对植物的细菌疾病控制复杂化。例如，在美国，在西红柿和胡椒上可使用链霉素来控制番茄疮痂病辣椒斑点病菌(X.campestrispv.vesicatoria)，但由于抗性菌株现在广泛存在所以很少将其用于该目的。在梨火疫病菌(火疫病病原体)中的抗性具有广泛的经济和政治影响。其中报道SmR的其它植物病原体细菌包括胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovora)、菊苣假单胞菌(Pseudomonaschichorii)、黄瓜细菌角斑病菌(Pseudomonas lachrymans)、丁香假单胞菌疱疹致病变种(Pseudomonas syringae pv.papulans)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonassyringae pv.syringae)和花叶万年青黄单胞菌(Xanthomonas dieffenbachiae)(McManus等Annu Rev Phytopathol 2002；40:443-65)。在美国西部和密歇根州SmR梨火疫病菌的出现加剧了火疫病流行。
链霉素和土霉素由美国环境保护局(U.S.Environmental Protection Agency)(EPA)指定为毒性最低种类，并且两抗生素均未观察到致癌或致突变活性。
可获得抗生素替代品并且至少一定程度上可行。实际上，在大部分耕作体系中细菌疾病管理基于宿主遗传抗性、环境卫生(避免或去除种菌)以及产生不利疾病发展的环境的栽培技术的结合。使用细菌和真菌的各种种属对植物的生物控制引起越来越多的关注。根圈细菌被认为是根区中有效的微生物竞争者。已经引入许多不同细菌属的代表种类至土壤中、种子、根、块茎或其它植物块上以改善作物生长。这些细菌属包括不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、假单胞杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、沙雷氏菌属(Serratia)、硫杆菌属(Thiobacillus)以及许多其它菌属。例如，芽孢杆菌属的某些种属可在许多植物中诱导系统抗性(Choudhary和Johri.Microbiol Res 2009；164:493—513)。
尽管某些种类对铜抵抗(Cooksey Annu Rev Phytopathol 1990；28:201-14)，但铜化合物的应用对一些细菌植物病原体的群体降低有效，并且大部分果树作物对铜损伤敏感。
对于各种植物疾病存在大量合成和天然疗法。天然疗法包括用于叶斑病、霉病和结疤的苹果醋；用于炭疽病、早期西红柿枯萎、叶枯萎、白粉病以及作为通常杀菌剂的小苏打喷雾；印度楝树油；硫磺；大蒜；过氧化氢；堆肥茶等。多种合成化学物质用于预防或治疗植物疾病，其为水溶性或者水不溶性制剂。杀微生物剂包括吩噁砒或吩砒嗪、马来酰亚胺、异吲哚二甲酰亚胺、卤代芳基烷醇、4-硫代嘧啶衍生物(美国专利6384040)、杂环有机硅化合物和异噻唑啉酮。将许多杀微生物剂与巯氧吡啶衍生物组合以制备协同化合物(例如，EP1468607)。某些异噻唑氨甲酰可用于植物害虫的控制(例如，US 6552056；WO 2001/064644)。
意识到在粉末或晶体形式中杀微生物剂的毒性问题，美国专利参考第29,409号教导将杀微生物剂溶解于液体溶剂中，可将其加至制剂混合物，由其制备最终使用树脂组合物。尽管在制备最终使用树脂组合物的位置处可安全使用液体分散体，不细心使用或者处置液体也可导致环境和健康危害。可选地，也可在水溶性热塑性树脂中施用杀微生物剂。可将杀微生物剂添加至刚性热塑性树脂组合物以及赋予杀生物活性，从而抑制在其表面上的微生物生长(US 5,229,124)。这是基本由溶解在载体树脂中的杀微生物剂组成的固体、熔体共混的溶液，该载体树脂是乙烯醇和(亚烷基氧基)丙烯酸酯的共聚物。尽管杀微生物剂可以是高毒性化学物质，但在最终使用产品中它的低浓度以及其通过树脂组合物的保留时间确保在最终使用产品中杀微生物剂对人和动物无危害。
异噻唑啉酮通常在农业中用作杀微生物剂，例如，N-烷基苯磺酰基氨基甲酰基-5-氯代异噻唑衍生物(例如，US 5,045,555)。该杀微生物剂广泛用于例如造纸工业、纺织工业中，用于生产涂料和粘合剂，用于油漆、金属加工，用于树脂工业、木材工业、建筑工业、农业、林业、渔业、食品工业和石油工业中以及在医药业中。它表现出广泛的杀微生物作用，以及可以合适的量添加至加工用水、循环水、原材料或产品。而且，可将其用于消毒或灭菌设施、工厂、畜舍或仪器以及种子、幼苗和原材料。异噻唑酮的其它衍生物也是已知的(美国专利No.3,523,121和J.Heterocyclic Chem.,8,587(1971))。然而，每种已知衍生化合物均对动物和鱼类具有高毒性，这显著限制它们的应用。
当施用至植物时发现碳酸氢钠通常也具有杀真菌性质，但通常需要频繁再应用以实现功效。
已经阐述在不同于分别由菊欧氏杆菌和梨火疫病菌所引起的软腐病和火疫病的疾病中铁对植物宿主-寄生物关系的作用(Expert.Annu Rev Phytopathol 1999；37:307-34)。因为其在生物系统中独特位置，铁决定植物病原体的活性。通过病原体的铁载体产生不仅提供了从宿主组织中获取铁的有效方法，也可用作抵抗铁毒性的防护剂。在发病时宿主与金属结合以及可能螯合的需求是另一中心问题。干扰细菌铁摄取和细胞呼吸的抗微生物剂在植物消毒中起重要作用。
具有抗微生物、防腐以及尤其是抗细菌性质的许多天然产物(例如，抗生素)合成化学物质是已知的，并且其至少部分具有化学和生物特征。示例性特征包括杀死微生物的能力(杀菌作用)；停止或损害微生物生长(抑菌作用)的能力；或者干扰微生物功能的能力，例如定植或感染位置、代谢产物的细菌分泌(其中一些有恶臭)和/或由浮游至生物膜群体的转化或者生物膜结构的扩张(抗生物膜作用)。在U.S.6,582,719中讨论抗生素、消毒剂、防腐剂等(包括铋-硫醇或BT化合物)，包括影响这些组合物的选择和使用的因素，包括例如杀菌、抑菌或者抗生物膜效价、有效浓度以及对宿主组织毒性的风险。
保护在生物膜内的细菌小菌落通常抵抗防腐剂或消毒剂。例如，杀死游离浮游菌的抗生素剂量需要增加至多达1,500倍以杀死生物膜细菌。在该高浓度下，一些抗微生物可能为毒性。例如，氧化溴化和氯化的化合物为高毒性和腐蚀性。
花枯病阶段的抑制是管理火疫病的关键。对于出现的花感染，在附生菌阶段中需要使梨火疫病菌在柱头表面上增殖。雨水是感染所必需的，因为其将隐头花序上的糖稀释至对梨火疫病菌无抑制的渗透势。雨水也是细菌由柱头再分布至隐头花序的重要物质。这些观察表明，使用抗生素喷雾的最佳时间是在该附生菌阶段中，以及在过量降水之后(Johnson和Stockwell.Annu Rev Phytopathol 1998；36:227-48)。
其它细菌附生菌也定植柱头，在柱头上它们可相互作用以及抑制病原体的附生菌生长。梨火疫病菌的市售细菌拮抗剂(BlightBan，荧光极毛杆菌A506)可包括在抗生素喷雾方案中。细菌拮抗剂与化学方法的结合抑制病原体的群体，并且伴随地填补通过柱头与非病原体提供的生态位，竞争微生物(Johnson和Stockwell.Annu Rev Phytopathol 1998；36:227-48)。
巯氧吡啶是源于2-巯基吡啶-N-氧化物(CAS号1121-31-9)的共轭碱，吡啶-N-氧化物的衍生物。其抗真菌作用在于其通过阻断为转运机制提供能量的质子泵来破坏膜转运的能力。实验表明：低浓度的真菌能够使巯氧吡啶失活(Chandler和Segel.Antimicrob.Agents Chemother 1978；14:60-8)。吡硫锌是锌的配位络合物。该无色固体用作抗真菌和抗细菌试剂。由于它在水中溶解性差(在中性pH下8ppm)，吡硫锌适合于用作户外涂料、粘合剂和其它产品，提供对霉病和藻类的防护。它是有效的杀藻剂。然而，它与依靠金属羧酸盐固化剂的涂料不相容。当在包含水(含有大量的铁)的乳胶漆中使用时，则需要优选结合铁离子的螯合剂。
在农业中特别的问题是由细菌生物膜构成的感染，所述细菌生物膜是相对最近识别的细菌组织，游离的单细胞(“浮游”)细菌经该组织通过细胞间粘附聚集至有组织的多细胞群体(生物膜)内，所述有组织的多细胞群体具有显著不同的行为模式、基因表达和对包括抗生素的环境试剂的敏感性。生物膜可采用在浮游细菌中未发现的生物防御机制，所述机制可保护生物膜群体免受抗生素和宿主免疫应答影响。形成的生物膜可阻止植物的生长、发育或伤口愈合过程。
微生物生物膜与对消毒剂和抗生素明显增加的抗性有关。当细菌和/或真菌附着于表面时形成生物膜形态。该附着触发基因转录改变，导致非常有弹性且难以穿透的多糖基质的分泌，保护微生物。除了生物膜对抗生素非常显著的抗性外，它们对植物免疫防御机制的抗性强。生物膜一旦形成则非常难以根除，所以预防生物膜形成是非常重要的农业优先原则。最近研究已显示，开放性伤口可以被生物膜快速污染。这些微生物生物膜被认为可阻碍生长、发育和/或伤口愈合，并且很可能与严重并且经常难治的感染的产生相关。
显然，对于治疗和预防在植物之中和之上的微生物感染需要有改进的组合物和方法，包括作为生物膜出现的微生物感染。本文所描述的某些实施方案解决该需求并且提供其它相关的优势。
发明概要
如本文所公开并且不期望受理论束缚，根据本文首次描述的某些实施方案，铋-硫醇(BT)化合物可以用作用于多种农业、工业、制造业和其它环境下使用的防腐剂，以及用于感染疾病和相关病状的和个人保健，同时还减少此类感染治疗所产生的费用，包括节省通过至少部分由BT介导的预防或预防来实现的那些费用。
而且，在本文描述的某些实施方案中，涉及用于治疗含有细菌生物膜或者与生物膜形成相关的细菌(例如，能够形成或者另外促进生物膜的细菌)的植物或植物组织(例如，根、鳞茎、茎、叶、树枝、藤、长匐茎、芽、花或其部分、嫩芽(greentip)、果实、种子、种荚等)以及动物组织和/或天然以及人造表面的制剂，所述制剂包含一种或多种BT化合物和一种或多种抗生素化合物，其中根据非限制性理论，基于本公开内容BT化合物和抗生素的适当选定的组合物提供该制剂的迄今未预测的抗菌(包括抗生物膜)作用，和/或用于预防、预防和/或治疗性有效治疗针对包括含有细菌生物膜的感染在内的微生物感染的未预测的增强作用。
本文也提供的在这些和相关实施方案中使用的是有利地包含基本上单分散微粒悬浮液的铋-硫醇组合物，以及它们合成和使用的方法。
根据本文所述本发明的某些实施方案，在此有提供用于保护植物抵抗细菌、真菌或病毒病原体的方法，所述方法包括使植物或其部位(例如，所有或部分的根、鳞茎、茎、叶、树枝、藤、长匐茎、芽、花或其部分、嫩芽、果实、种子、种荚等)与有效量的铋-硫醇(BT)组合物在足以满足以下一种或多种的条件和时间下接触：(i)预防植物被细菌、真菌或病毒病原体感染，(ii)抑制细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，(iii)抑制由细菌、真菌或病毒病原体的生物膜形成，以及(iv)抑制细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，其中BT组合物包含微粒的基本上单分散混悬物，所述微粒的基本上单分散混悬物包含BT化合物，所述微粒具有约0.4μm至约10μm的体积平均直径。在进一步的实施方案中，细菌病原体包含梨火疫病菌细胞。在另一实施方案中，细菌病原体选自梨火疫病菌、野油菜黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas campestris pv dieffenbachiae)、丁香假单胞菌、苛养木杆菌、葡萄木友菌、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、玉米细菌性枯萎病菌、青枯雷尔氏菌以及马铃薯环腐病菌。在某些实施方案中，细菌病原体表现出抗生素抗性。在某些实施方案中，细菌病原体表现出链霉素抗性。在某些实施方案中，植物是食物作物，在某些进一步的实施方案中，所述食物作物是果树。在某些又进一步的实施方案中，果树选自苹果树、梨树、桃树、油桃树、李树、杏树。在某些其它实施方案中，食物作物是芭蕉属的香蕉树。在某些其它实施方案中，食物作物是选自块茎类植物、豆科植物和禾本科谷类植物的植物。在某些进一步的实施方案中，块茎类植物选自马铃薯(Solanum tuberosum)(土豆)和番薯(Ipomoea batatas)(甘薯)。在上述方法的某些实施方案中，进行一次或多次接触步骤。在某些进一步的实施方案中，至少一个接触步骤包括喷雾、浸渍、涂覆和涂抹植物中的一者。在某些其它进一步的实施方案中，在植物的花开放、嫩芽或生长位置处进行至少一个接触步骤。在某些实施方案中，在植物上第一次花开放的24、48或72小时内进行至少一个接触步骤。
在上述方法的某些实施方案中，BT组合物包含选自以下的的一种或多种BT化合物：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇和Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇。在某些实施方案中，细菌病原体表现出抗生素抗性。
在上述方法的某些进一步实施方案中，所述方法包括与植物和BT组合物接触步骤同时或依次且以任何顺序，使植物与协同或增强性抗生素接触。在某些实施方案中，协同或增强抗生素包括选自以下的抗生素：氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素和氨基青霉素类抗生素。在某些实施方案中，协同或增强性抗生素是选自以下的氨基糖苷类抗生素：阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素、链霉素、妥布霉素和阿泊拉霉素。
根据某些其它实施方案，提供用于在其中或其上存在抗生素抗性菌植物病原体的植物中克服抗生素抗性的方法，该方法包括：(a)在足以满足以下一种或多种的条件和时间下使植物与有效量的BT组合物接触：(i)预防植物被抗生素抗性菌病原体感染，(ii)抑制抗生素抗性菌病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，(iii)抑制由所述抗生素抗性菌病原体的生物膜形成，以及(iv)抑制抗生素抗性菌病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，其中BT组合物包含微粒的基本上单分散混悬物，微粒的基本上单分散混悬物包含BT化合物，微粒具有约0.5μm至约10μm的体积平均直径；以及(b)与所述植物与所述BT组合物接触步骤同时或依次且以任何顺序，使植物与协同或增强性抗生素接触。
在上述方法的某些实施方案中，铋-硫醇组合物包含多个微粒，所述多个微粒包含铋-硫醇(BT)化合物，基本上所有所述微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径，并且通过包括以下步骤的过程产生：(a)在足以获得基本上不含固体沉淀的溶液的条件和时间下混合：(i)包含铋浓度至少50mM的铋盐并且不含亲水性、极性或有机增溶剂的酸性水溶液，与(ii)足以获得包含按体积计约25％乙醇的混合物的量的乙醇；以及(b)在足以形成包含含有BT化合物的微粒的沉淀的条件和时间下，向(a)的混合物中添加包含含硫醇的化合物的乙醇溶液以获得反应溶液，其中含硫醇的化合物在反应溶液中以相对于铋约1:3至约3:1的摩尔比存在。
在某些实施方案中，铋盐是Bi(NO3)3。在某些实施方案中，酸性水溶液包含按重量计至少5％、10％、15％、20％、22％或22.5％铋。在某些实施方案中，酸性水溶液包含按重量计至少0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％硝酸。在某些实施方案中，含硫醇的化合物包含选自以下的一种或多种试剂：1,2-乙二硫醇；2,3-二巯基丙醇；巯氧吡啶；二硫赤藓糖醇；3,4-二巯基甲苯；2,3-丁二硫醇；1,3-丙二硫醇；2-羟基丙硫醇；1-巯基-2-丙醇；二硫赤藓糖醇；α-硫辛酸；二硫苏糖醇；甲硫醇(CH3SH[m-硫醇])；乙硫醇(C2H5SH[e-硫醇])；1-丙硫醇(C3H7SH[n-P硫醇])；2-丙硫醇(CH3CH(SH)CH3[2C3硫醇])；丁硫醇(C4H9SH([n-丁基硫醇])；叔丁基硫醇(C(CH3)3SH[t-丁基硫醇])；戊硫醇(C5H11SH[戊基硫醇])；辅酶A；硫辛酰胺；谷胱甘肽；半胱氨酸；胱氨酸；2-巯基乙醇；二硫苏糖醇；二硫赤藓糖醇；2-巯基吲哚；转谷氨酰胺酶；(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)；(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)；(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)官能化的金纳米粒子；1,1',4',1"-三联苯基-4-硫醇；1,11-十一烷二硫醇；1,16-十六烷二硫醇；工业级1,2-乙二硫醇；1,3-丙二硫醇；1,4-苯二甲硫醇；1,4-丁二硫醇；1,4-丁二硫醇二乙酸酯；1,5-戊二硫醇；1,6-己二硫醇；1,8-辛二硫醇；1,9-壬二硫醇；金刚烷硫醇；l-丁硫醇；l-癸硫醇；l-十二烷硫醇；l-庚硫醇；纯l-庚硫醇；1-十六烷硫醇；l-己硫醇；l-巯基-(三乙二醇)；1-巯基-(三乙二醇)甲醚官能化的金纳米粒子；1-巯基-2-丙醇；l-壬硫醇；l-十八烷硫醇；l-辛硫醇；1-辛硫醇；1-十五烷硫醇；1-戊硫醇；1-丙硫醇；1-十四烷硫醇；纯1-十四烷硫醇；1-十一烷硫醇；11-(1H-吡咯-1-基)十一烷-1-硫醇；11-氨基-1-十一烷硫醇盐酸盐；11-溴-1-十一烷硫醇；11-巯基-1-十一烷醇；11-巯基-1-十一烷醇；11-巯基十一烷酸；11-巯基十一烷酸；11-巯基十一烷基三氟乙酸盐；11-巯基十一烷基磷酸；12-巯基十二烷酸；12-巯基十二烷酸；15-巯基十五烷酸；16-巯基十六烷酸；16-巯基十六烷酸；1H,1H,2H,2H-全氟癸硫醇；2,2’-(亚乙二氧基)二乙硫醇；2,3-丁二硫醇；2-丁硫醇；2-乙基己硫醇；2-甲基-1-丙硫醇；2-甲基-2-丙硫醇；2-苯乙硫醇；纯3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-1-己硫醇；3-(二甲氧基甲基甲硅烷基)-1-丙硫醇；3-氯-1-丙硫醇；3-巯基-1-丙醇；3-巯基-2-丁醇；3-巯基-N-壬基丙酰胺；3-巯基丙酸；3-巯基丙基官能化的硅胶；3-甲基-1-丁硫醇；4,4’-双(巯基甲基)联苯；4,4’-二巯基均二苯代乙烯；4-(6-巯基己氧基)苄醇；4-氰基-1-丁硫醇；4-巯基-1-丁醇；6-(二茂铁基)己硫醇；6-巯基-1-己醇；6-巯基己酸；8-巯基-1-辛醇；8-巯基辛酸；9-巯基-1-壬醇；联苯基-4,4'-二硫醇；3-巯基丙酸丁酯；l-丁硫醇铜(I)；环己硫醇；环戊硫醇；癸硫醇官能化的银纳米粒子；十二烷硫醇官能化的金纳米粒子；十二烷硫醇官能化的银纳米粒子；六(乙二醇)单-11-(乙酰基硫基)十一烷基醚；巯基琥珀酸；3-巯基丙酸甲酯；nanoTether BPA-HH；NanoThinksTM18；NanoThinksTM 8；NanoThinksTM ACID11；NanoThinksTM ACID16；NanoThinksTM ALCO11；NanoThinksTM THIO8；辛硫醇官能化的金纳米粒子；PEG二硫醇平均Mn 8,000；PEG二硫醇平均摩尔分子量1,500；PEG二硫醇平均平均摩尔分子量3,400；S-(11-溴十一烷基)硫代乙酸酯；S-(4-氰基丁基)硫代乙酸酯；苯硫酚；三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚；三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)；[11-(甲基羰基硫基)十一烷基]四(乙二醇)；间碳硼烷-9-硫醇；对三联苯基-4,4"-二硫醇；叔十二烷基硫醇；以及叔壬基硫醇。
在某些实施方案中，所述细菌病原体包含以下至少一种：(i)一种或多种革兰氏阴性菌；(ii)一种或多种革兰氏阳性菌；(iii)一种或多种抗生素敏感菌；(iv)一种或多种抗生素抗性菌；(v)选自金黄色葡萄球菌(S.aureus)、MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌、MRSE(甲氧西林抗性表皮葡萄球菌)、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、铜绿假单胞菌、药物抗性铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、艰难梭状芽胞杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺性军团病杆菌、粪肠球菌、甲氧西林敏感粪肠球菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、普通变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、弗氏志贺菌、万古霉素抗性肠球菌(Enterococcus)(VRE)、洋葱伯克霍尔德菌群(Burkholderiacepacia complex)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、鼠疫耶尔森氏杆菌(Yersinia pestis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、万古霉素抗性肠球菌、肺炎链球菌、青霉素抗性肺炎链球菌、大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌(Bukholderia multivorans)、耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的细菌病原体。
在某些实施方案中，所述方法包括与植物和BT组合物接触步骤同时或依次且以任何顺序，使植物与(i)协同抗生素和(ii)合作性抗微生物功效增强性抗生素中的至少一种接触。在某些进一步的实施方案中，协同抗生素或合作性抗微生物功效增强性抗生素包括选自以下的抗生素：氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、糖肽类抗生素、林肯酰胺类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素以及氨基青霉素类抗生素。在某些进一步的实施方案中，协同抗生素或合作性抗微生物功效增强性抗生素是选自以下的氨基糖苷类抗生素：阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素、链霉素、妥布霉素和阿泊拉霉素。
在某些其它实施方案中，提供用于在其中或其上存在抗生素抗性的细菌病原体的植物中克服抗生素抗性的方法，所述方法包括：在足以满足以下一种或多种的条件和时间下，使植物同时或依次且以任何顺序与有效量的(1)至少一种铋-硫醇(BT)组合物和(2)至少一种能够增强或与至少一种BT组合物协同作用的抗生素接触：(i)预防植物被细菌病原体感染，(ii)抑制细菌病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，(iii)抑制由细菌病原体的生物膜形成，以及(iv)抑制细菌病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，其中BT组合物包含多个包含铋-硫醇(BT)化合物的微粒，基本上所有的所述微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径；并从而克服在上皮组织表面上的抗生素抗性。在某些进一步的实施方案中，细菌病原体表现出对选自以下的抗生素的抗性：甲氧西林、万古霉素、萘夫西林、庆大霉素、氨苄西林、氯霉素、多西环素、妥布霉素、克林霉素和加替沙星。在某些其它实施方案中，BT组合物包含选自以下的一种或多种BT化合物：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇以及Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇。在某些实施方案中，协同或增强性抗生素包括选自以下的抗生素：克林霉素、加替沙星、氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素以及氨基青霉素类抗生素。在某些进一步的实施方案中，协同或增强性抗生素是选自以下的氨基糖苷类抗生素：阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素、链霉素、妥布霉素和阿泊拉霉素。
根据某些其它实施方案，提供包含多个微粒的铋-硫醇组合物，所述多个微粒包含铋-硫醇(BT)化合物，基本上所有所述微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径，其中BT化合物包含铋或铋盐以及含硫醇的化合物。在另外的实施方案中，提供包含多个微粒的铋-硫醇组合物，所述多个微粒包含铋-硫醇(BT)化合物，基本上所有所述微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径并且通过包括以下步骤的过程产生形成：(a)在足以获得基本上不含固体沉淀的溶液的条件和时间下混合，(i)包含铋浓度至少50mM的铋盐并且不含亲水性、极性或有机增溶剂的酸性水溶液，与(ii)足以获得包含按体积计至少约5％、10％、15％、20％、25％或30％乙醇的混合物的量的乙醇；以及(b)在足以形成包含含有所述BT化合物的微粒的沉淀的条件和时间下，向(a)的混合物中添加包含含硫醇的化合物的乙醇溶液以获得反应溶液，其中含硫醇的化合物在反应溶液中以相对于铋约1:3至约3:1的摩尔比存在。在某些实施方案中，铋盐是Bi(NO3)3。在某些实施方案中，酸性水溶液包含按重量计至少5％、10％、15％、20％、22％或22.5％铋。在某些实施方案中，酸性水溶液包含按重量计至少0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％硝酸。在某些实施方案中，含硫醇的化合物包含选自以下的一种或多种试剂：1,2-乙二硫醇、2,3-二巯基丙醇、巯氧吡啶、二硫赤藓糖醇、3,4-二巯基甲苯、2,3-丁二硫醇、1,3-丙二硫醇、2-羟基丙硫醇、1-巯基-2-丙醇、二硫赤藓糖醇、α-硫辛酸和二硫苏糖醇。
在另一实施方案中，提供了一种用于制备铋-硫醇组合物的方法，所述铋-硫醇组合物包含多个微粒，所述多个微粒包含铋-硫醇(BT)化合物，基本上所有的所述微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径，所述方法包括以下步骤：(a)在足以获得基本上不含固体沉淀的溶液的条件和时间下混合，(i)包含铋浓度至少50mM的铋盐并且不含亲水性、极性或有机增溶剂的酸性水溶液，与(ii)足以获得包含按体积计至少约5％、10％、15％、20％、25％或30％乙醇的混合物的量的乙醇；以及(b)在足以形成包含含有所述BT化合物的微粒的沉淀的条件和时间下，向(a)的混合物中添加包含含硫醇的化合物的乙醇溶液以获得反应溶液，其中所述含硫醇的化合物在所述反应溶液中以相对于铋约1:3至约3:1的摩尔比存在。在某些实施方案中，所述方法进一步包括回收沉淀以去除杂质。在某些实施方案中，铋盐是Bi(NO3)3。在某些实施方案中，酸性水溶液包含按重量计至少5％、10％、15％、20％、22％或22.5％铋。在某些实施方案中，酸性水溶液包含按重量计至少0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％硝酸。在某些实施方案中，含硫醇的化合物包含选自以下的一种或多种试剂：1,2-乙二硫醇；2,3-二巯基丙醇；巯氧吡啶；二硫赤藓糖醇；3,4-二巯基甲苯；2,3-丁二硫醇；1,3-丙二硫醇；2-羟基丙硫醇；1-巯基-2-丙醇；二硫赤藓糖醇；α-硫辛酸；二硫苏糖醇；甲硫醇(CH3SH[m-硫醇])；乙硫醇(C2H5SH[e-硫醇])；1-丙硫醇(C3H7SH[n-P硫醇])；2-丙硫醇(CH3CH(SH)CH3[2C3硫醇])；丁硫醇(C4H9SH([n-丁基硫醇])；叔丁基硫醇(C(CH3)3SH[t-丁基硫醇])；戊硫醇(C5H11SH[戊基硫醇])；辅酶A；硫辛酰胺；谷胱甘肽；半胱氨酸；胱氨酸；2-巯基乙醇；二硫苏糖醇；二硫赤藓糖醇；2-巯基吲哚；转谷氨酰胺酶；(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)；(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)；(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)官能化的金纳米粒子；1,1',4',1"-三联苯基-4-硫醇；1,11-十一烷二硫醇；1,16-十六烷二硫醇；工业级1,2-乙二硫醇；1,3-丙二硫醇；1,4-苯二甲硫醇；1,4-丁二硫醇；1,4-丁二硫醇二乙酸酯；1,5-戊二硫醇；1,6-己二硫醇；1,8-辛二硫醇；1,9-壬二硫醇；金刚烷硫醇；l-丁硫醇；l-癸硫醇；l-十二烷硫醇；l-庚硫醇；纯l-庚硫醇；1-十六烷硫醇；l-己硫醇；l-巯基-(三乙二醇)；1-巯基-(三乙二醇)甲醚官能化的金纳米粒子；1-巯基-2-丙醇；l-壬硫醇；l-十八烷硫醇；l-辛硫醇；1-辛硫醇；1-十五烷硫醇；1-戊硫醇；1-丙硫醇；1-十四烷硫醇；纯1-十四烷硫醇；1-十一烷硫醇；11-(1H-吡咯-1-基)十一烷-1-硫醇；11-氨基-1-十一烷硫醇盐酸盐；11-溴-1-十一烷硫醇；11-巯基-1-十一烷醇；11-巯基-1-十一烷醇；11-巯基十一烷酸；11-巯基十一烷酸；11-巯基十一烷基三氟乙酸盐；11-巯基十一烷基磷酸；12-巯基十二烷酸；12-巯基十二烷酸；15-巯基十五烷酸；16-巯基十六烷酸；16-巯基十六烷酸；1H,1H,2H,2H-全氟癸硫醇；2,2’-(亚乙二氧基)二乙硫醇；2,3-丁二硫醇；2-丁硫醇；2-乙基己硫醇；2-甲基-1-丙硫醇；2-甲基-2-丙硫醇；2-苯乙硫醇；纯3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-1-己硫醇；3-(二甲氧基甲基甲硅烷基)-1-丙硫醇；3-氯-1-丙硫醇；3-巯基-1-丙醇；3-巯基-2-丁醇；3-巯基-N-壬基丙酰胺；3-巯基丙酸；3-巯基丙基官能化的硅胶；3-甲基-1-丁硫醇；4,4’-双(巯基甲基)联苯；4,4’-二巯基均二苯代乙烯；4-(6-巯基己氧基)苄醇；4-氰基-1-丁硫醇；4-巯基-1-丁醇；6-(二茂铁基)己硫醇；6-巯基-1-己醇；6-巯基己酸；8-巯基-1-辛醇；8-巯基辛酸；9-巯基-1-壬醇；联苯基-4,4'-二硫醇；3-巯基丙酸丁酯；l-丁硫醇铜(I)；环己硫醇；环戊硫醇；癸硫醇官能化的银纳米粒子；十二烷硫醇官能化的金纳米粒子；十二烷硫醇官能化的银纳米粒子；六(乙二醇)单-11-(乙酰基硫基)十一烷基醚；巯基琥珀酸；3-巯基丙酸甲酯；nanoTether BPA-HH；NanoThinksTM 18；NanoThinksTM 8；NanoThinksTM ACID11；NanoThinksTM ACID16；NanoThinksTM ALCO11；NanoThinksTM THIO8；辛硫醇官能化的金纳米粒子；PEG二硫醇平均Mn8,000；PEG二硫醇平均摩尔分子量1,500；PEG二硫醇平均平均摩尔分子量3,400；S-(11-溴十一烷基)硫代乙酸酯；S-(4-氰基丁基)硫代乙酸酯；苯硫酚；三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚；三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)；[11-(甲基羰基硫基)十一烷基]四(乙二醇)；间碳硼烷-9-硫醇；对三联苯基-4,4"-二硫醇；叔十二烷基硫醇；以及叔壬基硫醇。
在另一实施方案中，提供保护包括诸如植物表面(例如，所有或部分的根、鳞茎、茎、叶、树枝、藤、长匐茎、芽、花或其部分、嫩芽、果实、种子、种荚等的表面)或者上皮组织表面的生物组织表面的天然或人造表面抵抗细菌病原体、真菌病原体和病毒病原体的一种或多种的方法，包括使上皮组织表面与有效量的BT组合物在足以满足以下一种或多种的条件和时间下接触：(i)预防表面被细菌、真菌或病毒病原体感染，(ii)抑制细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，(iii)抑制由细菌、真菌或病毒病原体的生物膜形成，以及(iv)抑制细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，其中BT组合物包含多个包含铋-硫醇(BT)化合物的微粒，基本上所有的所述微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径。在某些实施方案中，细菌病原体包含以下至少一种：(i)一种或多种革兰氏阴性菌；(ii)一种或多种革兰氏阳性菌；(iii)一种或多种抗生素敏感菌；(iv)一种或多种抗生素抗性菌；(v)选自金黄色葡萄球菌(S.aureus)、MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌、MRSE(甲氧西林抗性表皮葡萄球菌)、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、铜绿假单胞菌、药物抗性铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、艰难梭状芽胞杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺性军团病杆菌、粪肠球菌、甲氧西林敏感粪肠球菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、普通变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、弗氏志贺菌、万古霉素抗性肠球菌(VRE)、洋葱伯克霍尔德菌群、土拉弗朗西斯氏菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森氏杆菌、铜绿假单胞菌、万古霉素抗性肠球菌、肺炎链球菌、青霉素抗性肺炎链球菌、大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌、耻垢分支杆菌和鲍氏不动杆菌的细菌病原体。在某些实施方案中，细菌病原体表现出抗生素抗性。在某些实施方案中，细菌病原体表现出对选自以下的抗生素的抗性：甲氧西林、万古霉素、萘夫西林、庆大霉素、氨苄西林、氯霉素、多西环素和妥布霉素。
在某些实施方案中，天然或人造表面包括口腔/颊腔表面；假肢器官；陶瓷；塑料；聚合物；橡胶；金属制品；涂漆面；海上建筑物(包括船体、舵、螺旋桨、锚、船舱、压载舱、船坞、干船坞、码头、板桩、舱壁)；或者其它天然或人造表面。
在某些实施方案中，所述表面包括上皮组织表面，所述上皮组织包括选自以下的组织：表皮、真皮、呼吸道、胃肠道和腺衬。
在某些实施方案中，接触步骤进行一次或多次。在某些实施方案中，至少一个接触步骤包括喷雾、浸渍、涂覆和涂抹天然或人工表面中的一者。在某些实施方案中，至少一个接触步骤包括吸入、摄取和口腔冲洗中的一者。在某些实施方案中，至少一个接触步骤包括通过选自局部、腹膜内、口服、胃肠外、静脉内、动脉内、透皮、舌下、皮下、肌内、经颊、鼻内、经吸入、眼内、心房内、心室内、皮下、脂肪内、关节内和鞘内的途径施用。在某些实施方案中，BT组合物包含选自以下的一种或多种BT化合物：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇和Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇。
在某些实施方案中，细菌病原体表现出抗生素抗性。在某些其它实施方案中，上述方法进一步包括与所述表面和所述BT组合物接触步骤同时或依次且以任何顺序，使天然或人造表面与协同抗生素和/或增强性抗生素接触。在某些实施方案中，协同和/或增强性抗生素包括选自以下的抗生素：氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、糖肽类抗生素、林肯酰胺类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素以及氨基青霉素类抗生素。在某些实施方案中，协同和/或增强性抗生素为选自以下的氨基糖苷类抗生素：阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素(rhodostreptomycin)、链霉素、妥布霉素和阿泊拉霉素。
在本文所述的本发明的另一实施方案中，提供了一种用于在存在抗生素抗性菌病原体的天然表面上克服抗生素抗性(例如，对于抗至少一种对抵抗相同细菌菌种的细菌具有抗菌作用的已知抗生素的至少一种抗菌作用的细菌病原体，提供对抗生素敏感的这种病原体)的方法，其包括在足以满足以下一种或多种的条件和时间下，使表面同时或依次且以任何顺序与有效量的(1)至少一种铋-硫醇(BT)组合物和(2)至少一种通过和/或能够与至少一种BT组合物协同作用而增强的至少一种抗生素接触：(i)预防表面被细菌病原体感染，(ii)抑制细菌病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，(iii)抑制由细菌病原体的生物膜形成，以及(iv)抑制细菌病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，其中BT组合物包含多个包含铋-硫醇(BT)化合物的微粒,基本上所有所述微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径；并由此在上皮组织表面上克服抗生素抗性。在某些实施方案中，细菌病原体包含以下至少一种：(i)一种或多种革兰氏阴性菌；(ii)一种或多种革兰氏阳性菌；(iii)一种或多种抗生素敏感菌；(iv)一种或多种抗生素抗性菌；(v)选自金黄色葡萄球菌(S.aureus)、MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌、MRSE(甲氧西林抗性表皮葡萄球菌)、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、铜绿假单胞菌、药物抗性铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、艰难梭状芽胞杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺性军团病杆菌、粪肠球菌、甲氧西林敏感粪肠球菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、普通变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、弗氏志贺菌、万古霉素抗性肠球菌(VRE)、洋葱伯克霍尔德菌群、土拉弗朗西斯氏菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森氏杆菌、铜绿假单胞菌、万古霉素抗性肠球菌、肺炎链球菌、青霉素抗性肺炎链球菌、大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌、耻垢分支杆菌和鲍氏不动杆菌的细菌病原体。
在某些实施方案中，细菌病原体表现出对选自以下的抗生素的抗性：甲氧西林、万古霉素、萘夫西林、庆大霉素、氨苄西林、氯霉素、多西环素、妥布霉素、克林霉素和加替沙星。
在某些实施方案中，天然或人造表面包括口腔/颊腔表面；假肢器官；陶瓷；塑料；聚合物；橡胶；金属制品；涂漆面；海上建筑物(包括船体、舵、螺旋桨、锚、船舱、压载舱、船坞、干船坞、码头、板桩、舱壁)；或者其它天然或人造表面。
在某些实施方案中，表面包含选自表皮、真皮、呼吸道、胃肠道和腺衬的组织。在某些实施方案中，接触步骤进行一次或多次。在某些实施方案中，至少一个接触步骤包括喷雾、冲洗、浸渍和涂抹表面的一者。在某些其它实施方案中，至少一个接触步骤包括吸入、摄取和口腔冲洗的一者。在某些实施方案中，至少一个接触步骤包括通过选自局部、腹膜内、口服、胃肠外、静脉内、动脉内、透皮、舌下、皮下、肌内、经颊、鼻内、经吸入、眼内、心房内、心室内、皮下、脂肪内、关节内和鞘内的途径施用。在某些实施方案中，BT组合物包含选自以下的一种或多种BT化合物：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇和Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇。在某些实施方案中，协同和/或增强抗生素包括选自以下的抗生素：克林霉素、加替沙星、氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、糖肽类抗生素、林肯酰胺类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素和氨基青霉素类抗生素。在某些实施方案中，协同和/或增强性抗生素是选自以下的氨基糖苷类抗生素：阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素、链霉素、妥布霉素和阿泊拉霉素。
至于另一实施方案，提供防腐剂组合物，其包含：(a)至少一种BT化合物；(b)通过BT化合物增强和/或与BT化合物能够协同作用的至少一种抗生素化合物；以及(c)药学上可接受的赋形剂或载体，包括局部使用的载体。在某些实施方案中，BT化合物选自：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇和Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇。在某些实施方案中，BT组合物包含多个包含铋-硫醇(BT)化合物的微粒，基本上所有所述微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径。在某些实施方案中，BT化合物选自BisEDT和BisBAL。在某些实施方案中，抗生素化合物包括选自以下的抗生素：甲氧西林、万古霉素、萘夫西林、庆大霉素、氨苄西林、氯霉素、多西环素、妥布霉素、克林霉素、加替沙星和氨基糖苷类抗生素。在某些实施方案中，氨基糖苷类抗生素选自阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素,链霉素、妥布霉素和阿泊拉霉素。在某些实施方案中，氨基糖苷类抗生素是阿米卡星。
在某些其它实施方案中提供了一种用于治疗支持或含有细菌生物膜的天然或人造表面的方法，包括(a)将表面上或表面中的细菌感染鉴定为包括以下之一：(i)革兰氏阳性菌，(ii)革兰氏阴性菌，和(iii)包括(i)和(ii)两者；和(b)向表面施用包含一种或多种铋硫醇(BT)组合物的制剂，其中(i)如果细菌感染包括革兰氏阳性菌，则制剂包含治疗有效量的至少一种BT化合物和至少一种是利福霉素的抗生素，(ii)如果细菌感染包括革兰氏阴性菌，则制剂包含治疗有效量的至少一种BT化合物和阿米卡星，(iii)如果细菌感染包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者，则制剂包含治疗有效量的一种或多种BT化合物、利福霉素和阿米卡星，并从而治疗表面。
在某些实施方案中，生物膜包含一种或多种抗生素抗性菌。在某些实施方案中，治疗表面包括以下中的至少一种：(i)根除细菌生物膜，(ii)减少细菌生物膜，和(iii)减弱细菌生物膜的生长。在某些实施方案中，BT组合物包含多个包含铋-硫醇(BT)化合物的微粒，基本上所有微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径。
本文所述的本发明的实施方案的这些方面和其它方面将参考以下具体描述和附图而明显。本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括U.S.RE37,793、U.S.6,248,371、U.S.6,086,921和U.S.6,380,248在此通过引用的方式整体并入本文，如同每一个单独并入本文一样。必要时，本发明的方面和实施方案可以被修改以采用各种专利、专利申请和专利公布的概念，以提供其它实施方案。
附图简述
图1显示了在10％胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上37℃培养24小时，随后经所示治疗18小时，铜绿假单胞菌菌落生物膜的存活数目(log CFU；菌落形成单位)。所示抗生素治疗是TOB，妥布霉素10×MIC；AMK，阿米卡星100×MIC；IPM，亚胺培南(imipenem)10×MIC；CEF，头孢吡肟10×MIC；CIP，环丙沙星100×MIC；Cpd 2B，化合物2B(Bis-BAL,1:1.5)。(MIC；最低抑制浓度，例如，预防细菌生长的最低浓度)。
图2显示了在10％胰蛋白酶大豆琼脂上培养24小时，随后经所示治疗，金黄色葡萄球菌菌落生物膜的存活数目(log CFU)。所示抗生素治疗剂是利福平，RIF 100×MIC；达托霉素，DAP 320×MIC；米诺环素，MIN 100×MIC；氨苄西林，AMC 10×MIC；万古霉素，VAN 10×MIC；Cpd 2B，化合物2B(Bis-BAL,1:1.5)，Cpd 8-2，化合物8-2(Bis-Pyr/BDT(1:1/0.5)。
图3显示了暴露于生物膜的角质形成细胞随时间的刮伤闭合。(*)显著不同于对照(P<0.001)。
图4A和4B显示了逆转对几种抗生素的抗生素抗性的亚抑制性BisEDT。显示了MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)菌苔上有或没有BisEDT(0.05μg/ml)的抗生素的作用。平板A只显示标准抗生素渗透盘，平板B显示与BisEDT(BE)组合的盘。[GM＝庆大霉素，CZ＝头孢霉素，FEP＝头孢吡肟，IPM＝亚胺培南，SAM＝氨苄西林/舒巴坦，LVX＝左氧氟沙星。
图5显示了BisEDT和抗生素对生物膜形成的作用。将表皮葡萄球菌在37℃下在TSB+2％葡萄糖的聚苯乙烯板中生长48h。加替沙星(GF)、克林霉素(CM)、米诺环素(MC)、庆大霉素(GM)、万古霉素(VM)、头孢唑林(CZ)、萘夫西林(NC)和利福平(RP)。结果表示为在0.25μΜBisEDT时BPC(连续2倍稀释步骤)的平均变化(n＝3)。
图6显示了BisEDT和抗生素对表皮葡萄球菌在37℃的TSB+2％葡萄糖中生长48h的作用。结果表示为MIC(稀释步骤)随着BisEDT增加的平均变化(n＝3)。参见图5中对于抗生素定义的图例。
图7为显示在用含有或不含头孢唑林抗生素治疗的三种BT制剂、Bis-EDT、MB-11和MB-8-2治疗后，来自活体大鼠模型中的开放骨折的骨和硬件(hardware)样品上检出的平均金黄色葡萄球菌水平的柱状图。平均数的标准误差显示为误差线。早期安乐死的动物排除在分析之外，然而，由于严重污染排除来自组2中的一个动物的样品。
发明详述
本文公开的具体实施方案基于以下令人惊讶的发现：本文提供的某些铋-硫醇(BT)化合物(优选包括具有约0.4μm至约5μm体积平均直径的BT微粒)而非某些其它BT化合物(即使作为微粒提供)表现出针对特定细菌的强的防腐、抗菌和/或抗生物膜活性，所述细菌包括与许多临床上严重感染(包括可含有细菌生物膜的感染)相关的细菌。
出人意料的是，不是所有BT化合物一致地以可预测方式有效对抗此类细菌，而是取决于靶细菌菌种表现出不同的功效。具体而言，如本文所描述，发现某些BT化合物(优选包括具有约0.4μm至约5μm体积平均直径的BT微粒)对革兰氏阴性菌表现出较高功效，而发现某些其它BT化合物(优选包括具有约0.4μm至约5μm体积平均直径的BT微粒)对革兰氏阳性菌表现出较高功效，根据非限制性理论，方式可以是首次提供用于细菌感染(包括细菌生物膜感染)的处理的临床相关策略。
此外，如下文所更详细描述，本文所述的本发明的某些实施方案涉及由新型铋-硫醇(BT)组合物提供的令人惊讶的优点，如本文所述，所述铋-硫醇(BT)组合物可以被制成包括多个就粒度而言基本上单分散(例如具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径)的BT微粒的制剂。在某些这些和相关实施方案中，微粒BT并非提供为脂质囊泡或脂质体例如多层磷酸胆碱-胆甾醇脂质体或其它多层或单层脂质体囊泡的组分。
亦如本文某些实施方案所公开，已经发现，之前发现对此类细菌感染没有治疗作用的某些抗生素的抗菌和抗生物膜功效可以通过用这些抗生素的一种或多种与选择的BT化合物一起、同时或依次治疗感染(例如通过直接施加至感染部位例如天然或人造表面上或天然或人造表面中)而被显著增强(例如，以统计学上显著的方式增加)。以本公开之前不能预测的方式，某些BT化合物可以与某些抗生素组合提供针对某些细菌菌种或细菌菌株的抗菌和/或抗生物膜活性的协同或增强性组合。如下文更详细描述的此类组合的未预测性质由以下观察所证明：虽然某些BT/抗生素组合物协同作用或显示出对抗某些细菌的增强，但是某些其它BT/抗生素组合物未能表现出协同或增强抗菌和/或抗生物膜活性。
根据这些和相关实施方案，抗生素和BT化合物可以同时或依次且以任何顺序施用，并且值得注意的是，本文公开的用于治疗特定感染(例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性菌形成的生物膜)的一种或多种抗生素和一种或多种BT化合物的具体组合物不表现出可预测(例如，仅加合的)活性，而是以预料之外地协同或增强(超加合的)方式作用，作为选定抗生素、选定BT化合物和特别鉴定的靶细菌的函数。
例如，例如说明而非限制，在多种实际或潜在微生物感染的天然或人造表面的环境中，并且进一步在改良的基本单分散微粒BT制剂环境中，本文公开的特定抗生素化合物和特定BT化合物的任何一个或两者在单独使用时可能针对特定细菌菌株或菌种发挥有限的抗菌作用，但是所述抗生素化合物和所述BT化合物两者的组合针对相同的细菌菌株或菌种发挥强抗菌作用，该作用在强度上大于(具有统计学显著性)单独使用时每种化合物作用的简单加合，因此根据非限制性理论认为反映了BT对抗生素功效和/或抗生素对BT功效的抗生素-BT协同性(例如，FICI≤0.5)或增强作用(例如，0.5<FICI≤1.0)。因此，不是任何BT化合物都可以与任何抗生素协同或增强任何抗生素，并且不是任何抗生素可以与任何BT化合物协同，或增强任何BT化合物，使得抗生素-BT协同性和BT-抗生素增强一般是不可预测的。相反，根据本文公开的某些实施方案，协同或增强的抗生素和BT化合物的具体组合惊人地赋予针对特定细菌的强抗菌作用，所述抗菌作用包括在特定环境，例如本文所述的天然或人造表面，并且在某些情况下还包括针对由特定细菌形成的生物膜的抗菌作用。
也就是说，本文所述了某些BT协同抗生素，其包括能够与包括本文提供的至少一种BT化合物的至少一种BT组合物协同作用(FICI≤0.5)的抗生素，其中这种协同性显示为可检测的作用，其强度大于(即，以相对于适当对照条件的统计学显著的方式)存在抗生素而不存在BT化合物和/或存在BT化合物而不存在抗生素时可检测的作用。类似地，某些BT-抗生素组合物显示增强(0.5<FICI≤1.0)，其中该增强显示为可检测作用，其强度大于(即，以相对于适当对照条件统计学显著的方式)存在抗生素而不存在BT化合物和/或存在BT化合物而不存在抗生素时可检测的作用。
在某些实施方案中，此类可检测的作用的实例可包括(i)预防细菌病原体的感染，(ii)抑制细菌病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，(iii)抑制细菌病原体的生物膜形成，和(iv)抑制细菌病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，但本发明不是意图被如此限制，使得在其它预期的实施方案中，抗生素-BT协同性可以显示为一种或多种可检测的作用，所述可检测的作用可包括改变(例如统计学显著的增加或减少)一种或多种其它临床上显著的参数，例如细菌病原体对一种或多种抗生素或其它药物或化学剂的抗性或敏感性程度，细菌病原体对一种或多种化学、物理或机械条件(例如，pH、离子强度、温度、压力)的抗性或敏感性程度，和/或细菌病原体对一种或多种生物剂(例如，病毒、另一种细菌、生物活性多核苷酸、免疫细胞或免疫细胞产物例如抗体、细胞因子、趋化因子、包括降解酶在内的酶、膜破坏蛋白、自由基例如活性氧类等)的抗性或敏感性程度。
本领域技术人员应理解这些标准和许多其它标准，通过所述标准特定物质对细菌群体的结构、功能和/或活性的作用可以被测定(例如，Coico等(编辑)，Current Protocolsin Microbiology，2008，John Wiley&Sons，Hoboken，NJ；Schwalbe等，AntimicrobialSusceptibility Testing Protocols，2007，CRC Press，Boca Raton，FL)，目的是确定抗生素-BT协同性或增强性，该协同性或增强性如本文提供在协同的或增强的抗生素-BT组合的作用超过组合的一个组分不存在时观察到的作用的简单加合时存在。
例如，在某些实施方案中，协同性可以通过使用各种浓度的候选剂(例如，单独和组合的BT和抗生素)测定抗菌作用(例如本文所述的那些)来测定，以计算分级抑制浓度指数(FICI)和分级杀菌浓度指数(FBCI)，根据Eliopoulos等(Eliopoulos和Moellering，(1996)Antimicrobial combinations.In Antibiotics in Laboratory Medicine(Lorian，V.编辑)，第330-96页，Williams和Wilkins，Baltimore，MD，USA)。协同性可以定义为FICI或FBCI指数≤0.5，>4时为拮抗作用(例如，Odds，FC(2003)Synergy，antagonism，andwhat the chequerboard puts between them.Journal of Antimicrobial Chemotherapy52:1)。协同性还可以常规定义为抗生素浓度≥4倍的减少，或者可选地，使用例如Hollander等(1998 Antimicrob.Agents Chemother.42:744)描述的分级抑制浓度(FIC)。在某些实施方案中，协同性可定义为组合两种药物(例如，抗生素和BT组合物)产生的作用，其中组合的作用大于(例如，以统计学显著的方式)如果第二药物的浓度被第一药物替换时的作用。
因此，如本文所述及在某些优选实施方案中，BT和抗生素的组合应被理解为当观察到小于或等于0.5的FICI值时的协同化(Odds,2003)。亦如本文所述，在某些其它优选实施方案中并根据非限制性理论，公开了某些BT-抗生素组合物可显示0.5和1.0之间的FICI值，其表示该协同性的高潜能，并且可使用显示单独或共同增强的合作的抗微生物功效的至少一种BT和至少一种抗生素的非最佳浓度来观察FICI值。该作用在本文还可称“增强的”抗菌活性或“增强的”BT活性。
当存在下述两者时，可根据某些实施方案来检测增强的抗生素和/或BT活性：(i)至少一种BT，其浓度低于(以统计学显著方式)BT对给定靶微生物(例如，给定细菌菌种或菌株)的特征性最低抑制浓度(MIC)，(ii)至少一种抗生素，其浓度低于(以统计学显著方式)特征性IC50(抑制50％微生物群体生长的浓度；例如，Soothill等，1992 J AntimicrobChemother 29(2):137)和/或低于抗生素对给定靶微生物的生物膜预防浓度(BPC)，导致BT-抗生素组合物相对于如果在相同浓度使用任一抗微生物剂(例如，BT或抗生素)而缺少其它抗微生物剂(例如，抗生素或BT)将观察到的抗微生物作用的增强的(以统计学显著方式)抗微生物功效。在优选实施方案中，当测定到FICI值小于或等于1.0，以及大于0.5时，存在“增强的”抗生素和/或BT活性。
技术人员基于本公开应理解，在某些实施方案中，可根据本领域已知的方法来测定协同或增强的抗生素和/或BT活性，例如使用Loewe相加模型(例如，FIC指数，Greco模型)，或Bliss独立模型(例如，非参数和半参数模型)或本文所述和本领域已知的其它方法(例如，Meletiadis等，2005 Medical Mycology 43:133-152)。用于测定协同或增强的抗生素和/或BT活性的说明性方法由此描述于，例如Meletiadis等，2005 Medical Mycology43:133-152以及本文所引用的参考文献(还参见，Meletiadis等，2002 Rev Med Microbiol13:101-117；White等，1996 Antimicrob Agents Chemother 40:1914-1918；Mouton等，1999 Antimicrob Agents Chemother 43:2473-2478)。
某些其它实施方案预期如本文所述的一种或多种抗生素和一种或多种BT化合物的特定组合物，其在特定感染(例如，由革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌形成的生物膜)的体内治疗中可显示协同化或增强的作用，即使其中BT化合物和抗生素未显示可预测的(例如，仅加合的)体内活性，而相反以未预测的协同或增强(例如，超加合；或赋予当两种或更多种该物质组合存在时的作用大于(例如，以统计学显著方式)如果第二试剂的浓度被第一试剂所替换时获得的作用)方式，作为选定抗生素、选定BT化合物和一种或多种特别鉴定的包含感染的靶细菌菌种的函数。因此应理解，根据这些和相关的实施方案，在某些体内情况下FICI或FBCI值(其被体外测定)可能不易获得，而与BT-抗生素协同性或增强作用相反，可能以由感染的可量化量度给予的方式来测定。
例如，在一个实施方案中，例如在如实施例11所述的体内开放性骨折的大鼠(Rattus norvegicus)股骨临界缺损模型中，与抗生素治疗或单独的BT化合物相比，BT-抗生素组合后的治疗观察到统计学显著的细菌计数减少，是协同性或增强作用的指示。可使用本领域技术人员熟知的方法测定统计学显著性。在某些其它实施方案中，在该体内模型或其它体内模型中观察到在用于BT-抗生素组合损伤治疗后中所观察到的细菌计数与考虑抗生素治疗或单独的BT化合物为协同性或增强作用的指数相比减少至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。
体内感染的其它示例性征候可根据已开发用于定量感染严重度的确立的方法学，例如，各种本领域技术人员已知的伤口得分系统来测定(参见，例如，欧洲伤口管理协会(EWMA)评论的得分系统，Position Document:Identifying criteria for woundinfection.London:MEP Ltd,2005)。可用于评价本文所述的BT-抗生素组合物的协同性或增强活性的说明性伤口得分系统包括ASEPSIS(Wilson AP,J Hosp Infect 1995；29(2):81-86；Wilson等，Lancet 1986；1:311-13)，南安普敦伤口评价等级(Bailey IS,KarranSE,Toyn K等BMJ 1992；304:469-71)。还参见，Horan TC,Gaynes P,Martone WJ等,1992Infect Control Hosp Epidemiol 1992；13:606-08。另外，本领域临床医师已知的伤口愈合的公认临床征候(例如伤口大小、深度、肉芽组织状况、感染等)还可在BT化合物和/或抗生素存在或不存在时测量。因此，基于本公开内容，技术人员应容易理解用于确定是否BT组合物-抗生素的组合改变体内伤口愈合的各种方法(例如，相对于适当的对照以统计学显著方式的增强或降低)。
考虑到这些和相关实施方案，本文提供用有效量(例如，在某些实施方案中治疗有效量)的如本文提供的组合物或制剂来治疗微生物感染的天然表面(例如提供或包含细菌生物膜的表面)的各种方法，所述组合物或制剂包含一种或多种BT化合物，并任选地包含一种或多种抗生素化合物，例如一种或多种协同化抗生素，或一种或多种增强性抗生素。应理解，基于本公开内容，某些抗生素现在预期用于治疗给定类型的感染，其中该抗生素之前已被本领域内的技术人员认为对相同类型的感染无效。
某些实施方案由此严重度包含一种或多种用作抗菌剂的BT化合物的组合物。抗菌剂是杀伤微生物或预防微生物生长的物质，通常可施加至活组织，这将此类物质与通常施加至无生命物体的消毒剂区别开(Goodman和Gilman的"The Pharmacological Basis ofTherapeutics",第七版，Gilman等编辑，1985,Macmillan Publishing Co.,(下文，Goodman和Gilman")第959-960页)。抗菌剂的常见实例是乙醇和碘酊。杀菌剂包括杀伤微生物(例如微生物病原体)的抗菌剂。
本文所述的某些实施方案预期包含一种或多种BT化合物和一种或多种抗生素化合物(例如，如本文所提供的协同性抗生素和/或增强性抗生素)的组合物。抗生素是本领域内已知的并且通常包括由通过杀伤另一种属的微生物的一种种属的微生物所生产的化合物制备的药物，或具有相同或类似化学结构和作用机理的合成产物，例如，在微生物内或微生物上破坏微生物的药物，包括当局部应用时的此药物。本文公开的实施方案中的是其中抗生素可属于下述类型之一的那些：氨基糖苷类、碳青霉烯类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、糖肽类抗生素、林肯酰胺(例如，克林霉素)、青霉素酶抗性青霉素和氨基青霉素。因此抗生素可包括，但不限于，青霉素、哌拉西林、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、氨曲南、链霉素、妥布霉素、四环素、米诺环素、环丙沙星、左氧氟沙星、红霉素、利奈唑胺、磷霉素、卷曲霉素、异烟肼、安沙霉素(ansamycin)、碳头孢烯、单胺菌素、硝基呋喃、青霉素、喹诺酮、磺酰胺、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平(Rifampicin)、利福平(Rifampin)、利福布汀、利福喷丁、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、利奈唑胺、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、达福普汀、利福昔明、甲砜霉素、替硝唑、氨基糖苷、β-内酰胺、青霉素、头孢霉素、碳青霉烯、氟喹诺酮、酮内酯、林肯(酰)胺、大环内酯、噁唑烷酮、链阳菌素(stretogramin)、磺胺、四环素、甘氨酰环素、甲氧西林、万古霉素、萘夫西林、庆大霉素、氨苄西林、氯霉素、多西环素、妥布霉素、阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素、链霉素、妥布霉素、阿泊拉霉素、克林霉素、加替沙星、氨基青霉素及本领域内已知的其它抗生素。这些及其它临床可用的抗生素一览表是本领域技术人员可获得的和已知的(例如，Washington UniversitySchool of Medicine，The Washington Manual of Medical Therapeutics(第32版)，2007Lippincott,Williams和Wilkins，Philadelphia,PA:Hauser,AL，Antibiotic Basics forClinicians,2007 Lippincott,Williams和Wilkins,Philadelphia,PA)。
本文公开的某些实施方案中与一种或多种BT化合物一起使用的示例性的一类抗生素是氨基糖苷类抗生素，其被综述于Edson RS，Terrell CL.The aminoglycosides.MayoClin Proc.1999年5月；74(5):519-28。该类抗生素通过结合并失活细菌核糖体亚基减少细菌蛋白合成而抑制细菌生长。除了此类抑菌性质，氨基糖苷类还通过破坏革兰氏阴性菌中的细胞壁而表现出杀菌作用。
氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、阿米卡星、链霉素和其它，并且一般被认为用于治疗革兰氏阴性菌、分支杆菌和其它微生物病原体，尽管已经报道了抗性菌株的病例。氨基糖苷类不是通过消化道吸收的，因此一般被认为不适于口服制剂。例如阿米卡星，尽管常常有效对抗庆大霉素抗性细菌菌株，但通常在静脉内或肌内施用，这可以导致患者疼痛。此外，与氨基糖苷类抗生素(例如阿米卡星)相关的毒性可以导致肾损伤和/或不可逆的听力丧失。
尽管有这些性质，本文公开的某些实施方案预期口服施用例如用于治疗沿口腔、胃肠道/消化道的一个或多个位置的上皮组织表面的协同BT/抗生素组合物(例如，其中抗生素不必限于氨基糖苷)。某些其它实施方案还可以预期本文所述的组合物和方法作为消毒剂的用途，消毒剂是指杀伤无生命物体外表面上微生物或阻止其生长的制剂。
亦如本文其它地方所描述，BT化合物可以是包括铋或铋盐和含硫醇(例如-SH或巯基)化合物的组合物，其包括在以下中描述的那些(包括其制备方法)：Domenico等，1997Antimicrob.Agent.Chemother.41(8):1697-1703，Domenico等，2001Antimicob.Agent.Chemother.45(5):1417-1421，和U.S.RE37,793、U.S.6,248,371、U.S.6,086,921和U.S.6,380,248；还参见例如U.S.6,582,719。然而某些实施方案不是如此限制的，并且可以预期其它包含铋或铋盐和含硫醇的化合物的BT化合物。含硫醇的化合物可以含有1、2、3、4、5、6个或更多个硫醇(例如-SH)基团。在优选实施方案中，BT化合物包含通过离子键合和/或作为配位络合物与含硫醇的化合物缔合的铋，而在一些其它实施方案中，铋可以通过例如可以存在于有机金属化合物中的共价键与含硫醇的化合物缔合。然而，某些预期的实施方案明确排除是有机金属化合物的BT化合物，例如其中发现铋与有机部分共价键合的化合物。
示例性的BT化合物显示于表1：
表1
示例性BT化合物＊
1)CPD 1B-1 Bis-EDT(1:1)BiC2H4S2
2)CPD 1B-2 Bis-EDT(1:1.5)BiC3H6S3
3)CPD 1B-3 Bis-EDT(1:1.5)BiC3H6S3
4)CPD 1C Bis-EDT(1:1.5)BiC3H6S3
5)CPD 2A Bis-Bal(1:1)BiC3H6S2O
6)CPD 2B Bis-Bal(1:1.5)BiC4.5H9O1.5S3
7)CPD 3A Bis-Pyr(1:1.5)BiC7.5H6N1.5O1.5S1.5
8)CPD 3B Bis-Pyr(1:3)BiC15H12N3O3S3
9)CPD 4 Bis-Ery(1:1.5)BiC6H12O3S3
10)CPD 5 Bis-Tol(1:1.5)BiC10.5H9S3
11)CPD 6 Bis-BDT(1:1.5)BiC6H12S3
12)CPD 7 Bis-PDT(1:1.5)BiC4.5H9S3
13)CPD 8-1 Bis-Pyr/BDT(1:1/1)
14)CPD 8-2 Bis-Pyr/BDT(1:1/0.5)
15)CPD 9 Bis-2羟基，丙硫醇(1:3)
16)CPD 10 Bis-Pyr/Bal(1:1/0.5)
17)CPD 11 Bis-Pyr/EDT(1:1/0.5)
18)CPD 12 Bis-Pyr/Tol(1:1/0.5)
19)CPD 13 Bis-Pyr/PDT(1:1/0.5)
20)CPD 14 Bis-Pyr/Ery(1:1/0.5)
21)CPD 15 Bis-EDT/2羟基，丙硫醇(1∶1/1)
*为了比较，显示了相对于单个铋原子的原子比率，基于使用的反应物的化学计量比和铋与含硫化合物形成三价络合物的已知倾向。所示原子比率可以是给定制剂中所有种类的准确分子式。括号中的数字是铋与一个(或多个)硫醇剂的比率(例如Bi:硫醇1/硫醇2)"CPD"，化合物。
用于某些本公开实施方案的BT化合物可以根据已确定的方法制备(例如U.S.RE37.793、U.S.6,248,371、U.S.6,086,921和U.S.6,380,248；Domenico等，1997Antimicrob.Agent.Chemother.41(8):1697-1703，Domenico等，2001Antimicob.Agent.Chemother.45(5):1417-1421)，并且在某些其它实施方案中，BT化合物还可以根据本文所述的方法学制备。因此，某些优选的实施方案预期本文所述的用于制备BT化合物和特别是用于获得基本上单分散的微粒形式的BT化合物的合成方法，其中含有浓度为至少50mM、至少100mM、至少150mM、至少200mM、至少250mM、至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少500mM、至少600mM、至少700mM、至少800mM、至少900mM或至少1M的溶解铋并且不含亲水性、极性或有机增溶剂的酸性铋水溶液与乙醇混合而获得第一乙醇溶液，该第一乙醇溶液与包含含硫醇的化合物的第二乙醇溶液在足以形成包含含有BT化合物的微粒的沉淀的条件和时间(例如，如本文所述和本领域技术人员基于本公开内容会理解的浓度、溶剂强度、温度、pH、混合和/或压力等条件)下反应而获得反应溶液，其中所述含硫醇的化合物以相对于铋约1:3至约3:1的摩尔比存在于反应溶液中。
因此，示例性BT包括化合物1B-1，Bis-EDT(铋-1,2-乙二硫醇，反应物1:1)；化合物1B-2，Bis-EDT(1:1.5)；化合物1B-3，Bis-EDT(1:1.5)；化合物1C，Bis-EDT(可溶性Bi制剂，1:1.5)；化合物2A，Bis-Bal(铋-英国抗路易斯气剂(British anti-Lewisite)(铋-二巯基丙醇，铋-2,3-二巯基丙醇)，1:1)；化合物2B，Bis-Bal(1:1.5)；化合物3ABis-Pyr(铋-巯氧吡啶，1:1.5)；化合物3B Bis-Pyr(1:3)；化合物4，Bis-Ery(铋-二硫赤藓糖醇，1:1.5)；化合物5，Bis-Tol(铋-3,4-二巯基甲苯，1:1.5)；化合物6，Bis-BDT(铋-2,3-丁二硫醇，1:1.5)；化合物7，Bis-PDT(铋-1,3-丙二硫醇，1:1.5)；化合物8-1 Bis-Pyr/BDT(1:1/1)；化合物8-2，Bis-Pyr/BDT(1:1/0.5)；化合物9，Bis-2-羟基，丙硫醇(铋-1-巯基-2-丙醇，1:3)；化合物10，Bis-Pyr/Bal(1:1/0.5)；化合物11，Bis-Pyr/EDT(1:1/0.5)；化合物12 Bis-Pyr/Tol(1:1/0.5)；化合物13，Bis-Pyr/PDT(1:1/0.5)；化合物14 Bis-Pyr/Ery(1:1/0.5)；化合物15，Bis-EDT/2-羟基，丙硫醇(1:1/1)(参见例如表1)。
不期望受理论束缚，认为本公开的制备BT化合物的方法可能期望产生包含BT化合物的组合物，其中这种组合物具有一种或多种期望的性质，包括容易大规模生产、提高的产品纯度、均匀性或一致性(包括粒度均匀性)或用于制备和/或施用本公开的局部制剂的其它性质，所述方法在某些优选实施方案中可以包括制备或获得包含铋的酸性液体水溶液(例如包含硝酸铋的硝酸水溶液)。
在具体实施方案中，已经发现根据本文所述的方法首次制备的BT化合物就其作为基本上单分散的微粒悬浮液出现而言表现出有利的均匀度，根据某些目前优选的实施方案，每个微粒具有约0.4μm至约5μm的体积平均直径(VMD)。粒度的量度可以被称为体积平均直径(VMD)、质量中值直径(MMD)或质量中值空气动力学直径(MMAD)。可以例如通过撞击(MMD和MMAD)或通过激光(VMD)表征来进行这些测量。对于液体微粒，如果保持环境条件(例如标准湿度)，则VMD、MMD和MMAD可能是相同的。然而，如果湿度未被保持，MMD和MMAD测定值将小于VMD，这是由于撞击测量过程中的脱水作用。为了描述的目的，VMD、MMD和MMAD测量被认为在标准条件下，使得VMD、MMD和MMAD的描述是相当的。类似地，MMD和MMAD的干粉粒度测定也被认为是相当的。
如本文所述，优选的实施方案涉及基本上单分散的含BT微粒的悬浮液。具有有限的几何标准偏差(GSD)的明确的BT粒度的产生可以例如优化BT沉积，对天然或人造表面中或天然或人造表面上的预期靶部位的可接近性，和/或受试者对施用的BT微粒的耐受性。有限的GSD限制预期的VMD或MMAD尺寸范围之外的微粒数目。
在一个实施方案中，提供了具有约0.5微米至约5微米的VMD的含有本文公开的一种或多种BT化合物的微粒的液体或气雾剂悬浮液。在另一实施方案中，提供了具有约0.7微米至约4.0微米的VMD或MMAD的液体或气雾剂悬浮液。在另一实施方案中，提供了具有约1.0微米至约3.0微米的VMD或MMAD的液体或气雾剂悬浮液。在某些其它优选实施方案中，提供了包含一个或多个约0.1至约5.0微米的VMD或约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8或约0.9微米至约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0微米的BT化合物微粒的液体悬浮液，所述微粒包含如本文所述制备的BT化合物。
因此在某些优选实施方案中，本文首次描述的“基本上”单分散的BT制剂，例如包含其中“基本上”所有微粒具有规定范围(例如约0.4μm至约5μm)内的体积平均直径(VMD)的微粒形式的BT化合物的BT组合物，包括其中至少80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％、更优选至少95％、96％、97％、98％、99％或更多微粒具有所述尺寸范围内的VMD的那些组合物。
根据本文所述的合成方法制备的BT组合物的这些和相关的性质提供了超过之前描述的BT的新颖的优点，包括较低成本和容易生产，以及可允许其以有利于根据药物、制剂和化妆品标准中的一个或多个的法规顺从性的方式表征的组合物内的均匀性。
另外或可选地，本文所述的基本上单分散的BT微粒可有利地被生产而不需要微粉化，即，无需昂贵且费力的研磨或超临界流体加工或通常用于产生微粒的其它装置和程序(例如，Martin等2008 Adv.Drug Deliv.Rev.60(3):339；Moribe等，2008 Adv.DrugDeliv.Rev.60(3):328；Cape等，2008 Pharm.Res.25(9):1967；Rasenack等2004Pharm.Dev.Technol.9(1):1-13)。因此，本实施方案提供了基本上均匀的微粒制剂的有益作用，包括但不限于增强的且基本上均匀的溶液化性质，适合预期的施用形式(例如口服、吸入或皮肤学/皮肤伤口局部形式)，增加的生物利用度和其它有益性质。
BT化合物微粒悬浮液可以作为水性制剂、作为水性溶剂以及有机溶剂(包括卤代烃推进剂)中的悬浮液或溶液、作为干粉或以下文详述的其它形式施用，例如，包括含有制剂技术人员已知的润湿剂、表面活性剂、矿物油或其它成分或添加剂以维持悬浮液中的单个微粒的制剂。水性制剂可以通过液体喷雾器雾化，采用例如水力或超声雾化。基于推进剂的系统可以利用适当的加压分配器。干粉可以利用能够有效分散含BT微粒的干粉分散装置。预期的粒度和分布可以通过选择适当装置而获得。
亦如上所述，根据某些实施方案本文还提供了制备包含多个包含BT化合物的微粒的铋-硫醇(BT)组合物的方法，基本上所有这种微粒具有约0.1至约8微米，并且在某些优选实施方案中约0.4微米至约5微米的体积平均直径(VMD)。
一般而言，所述方法包括如下步骤：(a)在足以获得基本上不含固体沉淀的条件和时间下混合：(i)包含铋盐(含至少50mM浓度的铋)并且不含亲水性、极性或有机增溶剂的酸性水溶液，与(ii)足以获得包含按体积计约5％、10％、15％、20％、25％或30％并且优选约25％乙醇的混合物的量的乙醇；和(b)在足以形成包含含有所述BT化合物的微粒的沉淀的条件和时间下，向(a)的混合物中添加包含含硫醇的化合物的乙醇溶液以获得反应溶液，其中所述含硫醇的化合物在所述反应溶液中以相对于铋约1:3至约3:1的摩尔比存在。
在某些优选实施方案中，铋盐可以是Bi(NO3)3，但应理解，根据本公开内容，铋还可以其它形式提供。在某些实施方案中，酸性水溶液中铋浓度可以是至少100mM、至少150mM、至少200mM、至少250mM、至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少500mM、至少600mM、至少700mM、至少800mM、至少900mM或至少1M。在某些实施方案中，酸性水溶液包含按重量计至少5％、10％、15％、20％、22％或22.5％的铋。在某些优选实施方案中，酸性水溶液可以包含按重量计至少5％或更多硝酸，并且在某些其它实施方案中，酸性水溶液可以包含按重量计至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％或至少5％硝酸。
含硫醇的化合物可以是本文所述的任何含硫醇的化合物，并且在某些实施方案中可以包括以下中的一种或多种：1,2-乙二硫醇、2,3-二巯基丙醇、巯氧吡啶、二硫赤藓糖醇、3,4-二巯基甲苯、2,3-丁二硫醇、1,3-丙二硫醇，2-羟基丙硫醇、1-巯基-2-丙醇、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。其它示例性含硫醇的化合物包括α-硫辛酸、甲硫醇(CH3SH[m-巯基])、乙硫醇(C2H5SH[e-巯基])、1-丙硫醇(C3H7SH[n-P巯基])、2-丙硫醇(CH3CH(SH)CH3[2C3巯基])、丁硫醇(C4H9SH([正丁基巯基])、叔丁基硫醇(C(CH3)3SH[叔丁基巯基])、戊硫醇(C5H11SH[戊基巯基])、辅酶A、硫辛酰胺、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、2-巯基吲哚、转谷氨酰胺酶和可获自Sigma-Aldhch(St.Louis，MO)的以下硫醇化合物的任何一种：(11-硫醇十一烷基)六(乙二醇)、(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)、(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)官能化纳米金、1,1',4',1"-三联苯基-4-硫醇、1,11–十一烷二硫醇、1,16-十六烷二硫醇、1,2-乙二硫醇(工业级)、1,3-丙二硫醇、1,4-苯二甲硫醇、1,4-丁二硫醇、1,4-丁二硫醇二乙酸酯、1,5-戊二硫醇、1,6-己二硫醇、1,8-辛二硫醇、1,9-壬二硫醇、金刚烷硫醇、1-丁硫醇、1-癸硫醇、1-十二烷硫醇、1-庚硫醇、1-庚硫醇(纯)、1-十六烷硫醇、1-己硫醇、1-巯基-(三乙二醇)、1-巯基-(三乙二醇)甲醚官能化的金纳米粒子、1-巯基-2-丙醇、1-壬硫醇、1-十八烷硫醇、1-辛硫醇、1-辛硫醇、1-十五烷硫醇、1-戊硫醇、1-丙硫醇、1-十四烷硫醇、1-十四烷硫醇(纯)、1-十一烷硫醇、11-(1H-吡咯-1-基)十一烷-1-硫醇、11–氨基-1-十一烷硫醇盐酸盐、11-溴-1-十一烷硫醇、11-巯基-1–十一烷醇、11-巯基-1–十一烷醇、11-巯基十一烷酸、11-巯基十一烷酸、11-巯基十一烷基三氟乙酸盐、11-巯基十一烷基磷酸、12-巯基十二烷酸、12-巯基十二烷酸、15-巯基十五烷酸、16-巯基十六烷酸、16-巯基十六烷酸、1H,1H,2H,2H-全氟癸硫醇、2,2'-(亚乙二氧基)二乙硫醇、2,3-丁二硫醇、2-丁硫醇、2-乙基己硫醇、2-甲基-1-丙硫醇、2-甲基-2-丙硫醇、2-苯乙硫醇、3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-1-己硫醇(纯)、3-(二甲氧基甲基甲硅烷基)-1-丙烷二醇、3-氯-1-丙硫醇、3-巯基-1-丙醇、3-巯基-2-丁醇、3-巯基-N-壬基丙酰胺、3-巯基丙酸、3-巯基丙基官能化的硅胶、3-甲基-1-丁硫醇、4,4'-双(巯基甲基)联苯、4,4'-二巯基均二苯代乙烯、4-(6-巯基己氧基)苄醇、4-氰基-1-丁硫醇、4-巯基-1–丁醇、6-(二茂铁基)己硫醇、6-巯基-1-己醇、6-巯基己酸、8-巯基-1-辛醇、8-巯基辛酸、9-巯基-1–壬醇、联苯基-4,4'-二硫醇、3-巯基丙酸丁酯、1-丁硫醇铜(I)、环己硫醇、环戊硫醇、癸硫醇官能化的银纳米粒子、十二烷硫醇官能化的金纳米粒子、十二烷硫醇官能化的银纳米粒子、六(乙二醇)单-11-(乙酰基硫基)十一烷基醚、巯基琥珀酸、3-巯基丙酸甲酯、nanoTether BPA-HH、NanoThinksTM 18、NanoThinksTM 8、NanoThinksTM ACID11、NanoThinksTM ACID16、NanoThinksTM ALCO11、NanoThinksTM THIO8、辛硫醇官能化的纳米粒子、PEG二硫醇平均Mn 8,000、PEG二硫醇平均分子量1,500、PEG二硫醇平均分子量3,400、S-(11–溴十一烷基)硫代乙酸酯、S-(4-氰基丁基)硫代乙酸酯、苯硫酚、三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚、三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)、[11-(甲基羰基硫基)十一烷基]四(乙二醇)、间碳硼烷-9-硫醇、对三联苯基-4,4"-二硫醇、叔十二烷基硫醇和叔壬基硫醇。
本文所述示例性的反应条件(包括温度、pH、反应时间、使用搅拌或搅动以溶解溶质以及用于控制和洗涤沉淀的程序)并采用本领域熟知的技术。
不同于之前描述的生产BT化合物的方法，根据本发明制备BT的方法，BT产物以微粒悬浮液提供，基本上所有微粒的VMD在某些优选实施方案中是约0.4至约5微米，并且根据某些其它实施方案一般是约0.1微米至约8微米。还不同于之前的方法，根据本实施方案，铋提供于包含浓度至少约50mM至约1M的铋和量至少约0.5％至约5％(w/w)且优选小于5％(重量/重量)的硝酸并且不含亲水性、极性或有机增溶剂的酸性水溶液中。
鉴于公认的技术教导：铋在50μM时是不溶于水的(例如U.S.RE37793)，铋在水中不稳定(例如，Kuvshinova等，2009 Russ.J Inorg.Chem 54(11):1816)，并且铋甚至在硝酸溶液中不稳定，除非存在亲水性、极性或有机增溶剂，就这点而言，本发明方法提供了令人惊讶且预料之外的优点。例如，在所有BT制备方法学的明确描述中(例如Domenico等，1997Antimicrob.Agents.Chemother.41:1697；U.S.6,380,248；U.S.RE37793；U.S.6,248,371)，亲水性增溶剂丙二醇是溶解硝酸铋所需的，并且准备与硫醇反应的溶液的铋浓度远低于15mM，从而限制了BT化合物的可用生产模式。
相反，根据本公开内容，溶解铋不需要水性、极性或有机增溶剂，而意外获得了较高的浓度。亲水性、极性或有机增溶剂包括丙二醇(PG)和乙二醇(EG)，并且还可以包括许多已知增溶剂的任何一种，包括极性溶剂，例如环氧己烷和二甲基亚砜(DMSO)、多元醇(包括例如PG和EG，还包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、季戊四醇等)、多羟基醇例如甘油和甘露醇以及其它物质。其它高极性的水混溶有机物包括二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)和NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)。
因此，本领域技术人员应理解，可以例如根据溶剂极性/可极化性(SPP)标度值使用Catalan等的系统(例如1995 Liebigs Ann.241；还参见Catalan，2001 Handbook ofSolvents，Wypych(编辑)，Andrew Publ.，NY，及其中引用的参考文献)选择溶剂，包括本文提供的常用作亲水性、极性或有机增溶剂的那些，根据Catalan等的系统，例如，水具有0.962的SPP值，甲苯具有0.655的SPP值，而2-丙醇具有0.848的SPP值。已经描述了用于基于2-N,N-二甲基-7-硝基芴/2-氟-7-硝基芴探针/同态对的紫外线测量来测定溶剂SPP值的方法(Catalan等，1995)。
基于特定BT组合物的溶解度性质，具有预期SPP值的溶剂(无论作为纯的单组份溶剂还是作为2、3、4种或更多种溶剂的溶剂混合物；关于溶剂混溶性，参见例如Godfrey 1972Chem.Technol.2:359)可以由本领域技术人员参考本公开内容容易地确定，尽管如上所述，根据本文所述的合成方法步骤的某些优选实施方案，不需要亲水性、极性或有机增溶剂来溶解铋。
溶解度参数还可以包括相互作用参数C、Hildebrand溶解度参数d或部分(Hansen)溶解度参数：δp、δh和δd，分别描述溶剂的极性、氢键合电势和分散力相互作用电势。在某些实施方案中，描述包含铋的铋盐在其中溶解的溶剂或共溶剂系统的溶解度参数的最高值可以提供包含铋盐的水溶液的限制，例如根据本文所述的用于制备微粒BT组合物的方法。例如，较高的δh值将具有较大的氢键合能力，并且因此对溶剂分子例如水具有较大的亲和力。因此较高的溶剂最大观测δh可能对于其中期望更亲水性环境的情况是优选的。
作为非限制性实例，具有以下式I所示结构的BisEDT可根据以下反应方案制备：
简言之，并且作为非限制性的说明性实例，可以于室温在搅拌下向过量(11.4L)的5％HNO3水溶液缓慢添加0.331L(约0.575摩尔)的酸性铋水溶液，例如Bi(NO3)3溶液(例如，43％Bi(NO3)3(w/w)，5％硝酸(w/w)，52％水(w/w)，可获自Shepherd Chemical Co.，Cincinnati，OH)，随后缓慢添加无水乙醇(4L)。可以通过使用60mL注射器向1.5L无水乙醇添加72.19mL(0.863摩尔)1,2-乙二硫醇、然后搅拌5分钟来单独制备硫醇化合物例如1,2-乙二硫醇[～0.55M]的乙醇溶液(1.56L)。1,2-乙二硫醇(CAS 540-63-6)和其它硫醇化合物可获自例如Sigma-Aldrich，St.Louis，MO。然后硫醇化合物的乙醇溶液可以缓慢添加至Bi(NO3)3/HNO3水溶液，搅拌过夜以形成反应溶液。根据某些优选的实施方案，含硫醇的化合物可以相对于铋约1:3至约3:1的摩尔比存在于反应溶液中。使形成的产物沉降为包含本文所述微粒的沉淀，然后通过过滤收集沉淀并依次用乙醇、水和丙酮洗涤以获得黄色无定形粉末固体状的BisEDT。粗产物可以在搅拌下再次溶解于无水乙醇，然后过滤并依次用乙醇洗涤几次，随后用丙酮洗涤几次。洗涤后的粉末可以在1M NaOH(500mL)中研磨，过滤，并依次用水、乙醇和丙酮洗涤以提供纯化的微粒BisEDT。
根据非限制性理论，铋抑制细菌产生细胞外聚合物(EPS)(例如细菌胞外多糖)的能力，并且该抑制导致生物膜形成减少。认为细菌采用胶样EPS用于生物膜粘着。根据感染性质，生物膜形成和EPS加工可以促进细菌病原性，例如干扰伤口愈合。然而，单独的铋作为介入剂无治疗作用，而是通常作为络合物例如BT的一部分施用。因此，铋-硫醇(BT)是包括通过铋与硫醇化合物螯合产生的化合物并且表现出显著提高的铋的抗微生物治疗功效的一类组合物。BT表现出显著的抗感染、抗生物膜和免疫调节作用。铋-硫醇有效对抗光谱微生物，并且通常不受抗生素抗性影响。BT以显著低(亚抑制)的浓度预防生物膜形成，以同样亚抑制水平预防常见伤口病原体的许多病原体特征，可以在动物模型中预防败血性休克，并且可以与许多抗生素协同作用。
如本文所述，一种或多种指定BT与一种或多种指定抗生素化合物组合时的抗菌作用的这种协同性不容易根据单独的抗生素和BT对特定细菌类型的作用特征来预测，但是令人惊讶的是，可以通过根据具体细菌群体选择特定BT-抗生素组合而产生，所述选择包括鉴定存在革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌(或是两者)。例如，如本文所公开，与某些BT协同作用的抗生素可以包括阿米卡星、氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、氯霉素、环丙沙星、克林霉素(或其它林肯酰胺类抗生素)、达托霉素多西环素、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南(imipenim)、左氧氟沙星、利奈唑胺米诺环素、萘夫西林、巴龙霉素、利福平、磺胺甲噁唑、妥布霉素和万古霉素中的一种或多种。体外研究显示，例如，单独对庆大霉素、头孢唑林、头孢吡肟、磺胺甲噁唑、亚胺培南或左氧氟沙星敏感性差或根本不敏感的MRSA在BT化合物BisEDT存在下暴露于抗生素时对这些抗生素中的任何一个表现出显著的敏感性。因此，本文预期的某些实施方案明确预期其中可包括BT化合物和一种或多种选自阿米卡星、氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、氯霉素、环丙沙星、克林霉素(或其它林肯酰胺类抗生素)、达托霉素多西环素、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺米诺环素、萘夫西林、巴龙霉素、利福平、磺胺甲噁唑、妥布霉素和万古霉素的抗生素的组合的组合物和/或方法，而本文预期的某些其它实施方案预期其中可包括其中明确排除一种或多种选自阿米卡星、、头孢唑林、头孢吡肟、氯霉素、环丙沙星、克林霉素(或其它林肯酰胺类抗生素)、达托霉素多西环素、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺米诺环素、萘夫西林、巴龙霉素、利福平、磺胺甲噁唑、妥布霉素和万古霉素的抗生素的BT化合物和一种或多种抗生素的组合的组合物和/或方法。注意，在该环境中，庆大霉素和妥布霉素属于氨基糖苷类抗生素。从某些预期的实施方案明确排除的还有Domenico等，2001 Agents Chemother.45:1417-1421；Domenico等，2000 Infect.Med.17:123-127；Domenico等，2003 Res.Adv.In Antimicrob.Agents&Chemother.3:79-85；Domenico等，1997 Antimicrob.Agents Chemother.41(8):1697-1703；Domenico等，1999 Infect.Immun.67:664-669:Huang等1999 JAntimicrob.Chemother.44:601-605；Veloira等，2003 J Antimicrob.Chemother.52:915-919；Wu等，2002 Am J Respir Cell Mol Biol.26:731-738；Halwani等，2008 Int.JPharmaceut.358:278；Halwani等,2009 Int.J.Pharmaceut.373:141-146中描述的某些组合物和方法，其中应注意，这些公开中绝没有教导或暗示如本文所公开的单分散性微粒BT组合物。
因此如本文所述，在某些优选实施方案中提供用包含本文所述的微粒BT和在某些其它实施方案中任选地还包含协同性和/或增强性抗生素的组合物来治疗植物、动物或人受试者或者制品的组合物和方法。相关领域技术人员基于本公开应认识到其中可能需要这种治疗的适当的农业、临床、商业、工业、制造业、家用和其它环境和情况，其标准在医学领域已确定，尤其包括例如外科学、军事外科学、皮肤病学、伤口药物学、老年病学、心血管学、代谢疾病(例如糖尿病、肥胖症等)、感染和炎症(包括在呼吸道或胃肠道或者其它上皮组织表面例如腺组织的上皮层)和其它相关的医学专业和子专业。
根据本文所述的实施方案使用的用于治疗天然或人造表面上或天然或人造表面中的细菌感染的优选的组合物可以包括在某些实施方案中包含本文所述的铋-硫醇(BT)化合物的组合物，并且在某些不同但相关实施方案中还包括本领域已知的其它化合物，例如本文所述的一种或多种抗生素化合物的组合物。BT化合物和制备它们的方法在本文公开，并且还公开于例如Domenico等(1997 Antimicrob.Agent.Chemother.41(8):1697-1703；2001 Antimicrob.Agent.Chemother.45(5)1417-1421)和U.S.RE37,793、U.S.6,248,371、U.S.6,086,921和U.S.6,380,248。亦如上所述，某些优选的BT化合物是含有与含硫醇的化合物离子键合或配位络合的铋或铋盐的那些，例如包含与含硫化合物螯合的铋的组合物，并且某些其它优选的BT化合物是含有与含硫醇的化合物共价键合的铋或铋盐的那些。还优选如本文所述基本上单分散的微粒BT组合物。不根据之前的治疗细菌感染的努力，也不根据之前在其它环境中的本文首次描述的任何化合物(作为具有在促进本文所述的天然和/或人造表面治疗组合物和方法中的用途)的表征，可以预测使用此类化合物的本发明方法将具有本文所述的有益效果。
根据优选实施方案，由此提供了用于治疗天然或人造表面的方法，包括向所述表面施用至少一种本文所述的微粒BT化合物。在某些实施方案中，所述方法还包括同时或依次且以任何顺序施用至少一种抗生素化合物，其中在某些优选实施方案中可以是本文所述的协同性抗生素，并且在某些其它优选实施方案中可以是本文所述的增强性抗生素。所述抗生素化合物可以是氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、糖肽类抗生素、林肯酰胺类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素或氨基青霉素类抗生素。临床上有用的抗生素在本文的别处进行讨论并还描述于例如WashingtonUniversity School of Medicine，The Washington Manual of Medical Therapeutics(第32版)，2007 Lippincott，Williams和Wilkins，Philadelphia，PA；和Hauser，AL，Antibiotic Basics for Clinicians，2007 Lippincott，Williams和Wilkins，Philadelphia，PA。
如本文所述，某些实施方案源自如下预料之外的发现：对于包括革兰氏阳性菌的细菌感染，优选的治疗有效的制剂可以包括BT化合物(例如BisEDT，铋:1,2-乙二硫醇；BisPyr，铋:巯氧吡啶；BisEDT/Pyr，铋:1,2-乙二硫醇/巯氧吡啶)和利福霉素或BT化合物和达托霉素(Cubist Pharmaceuticals，Lexington，MA)或BT化合物和利奈唑胺(Pfizer，Inc.，NY，NY)或BT化合物(例如，BisEDT，铋:1,2-乙二硫醇；BisPyr，铋:巯氧吡啶；BisEDT/Pyr，铋:1,2-乙二硫醇/巯氧吡啶)和氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、氯霉素、克林霉素(或另一种林肯酰胺类抗生素)、达托霉素多西环素、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺萘夫西林、巴龙霉素、利福平、磺胺甲噁唑、妥布霉素和万古霉素的一种或多种。
亦如本文所述，某些实施方案源自如下预料之外的发现：对于包括革兰氏阴性菌的细菌感染，优选的治疗有效的制剂可以包括BT化合物和阿米卡星。某些相关实施方案预期用BT化合物和另一种抗生素(例如另一种氨基糖苷类抗生素)来治疗包含革兰氏阴性菌的感染，所述另一种氨基糖苷类抗生素在某些实施方案中不是庆大霉素或妥布霉素。因此鉴于这些实施方案，其它相关的实施方案预期根据医学微生物领域技术人员已知的方法学，通过熟知的革兰氏阳性或革兰氏阴性的标准鉴定天然或人造表面中或表面上的一种或多种细菌群体或亚群，作为选择包括在根据本发明方法施用的制剂中的适当抗生素化合物的一个步骤。
本文所述的组合物和方法可应用于各种背景中微生物(例如，细菌、病毒、酵母、霉菌及其它真菌、微生物寄生虫等)的处理，其通常通过将本文所述的化合物(例如，单独或与本文公开的一种或多种协同性和/或增强性抗生素组合的一种或多种微粒BT)应用或施用于微生物位点(例如存在于天然或人造表面上或天然或人造表面中的微生物)来完成。这些天然表面包括但不限于在植物(例如，所有或部分的根、鳞茎、茎、叶、树枝、藤、长匐茎、芽、花或其部分、嫩芽、果实、种子、种荚等的表面)、哺乳动物组织(例如，包括皮肤、头皮、胃肠道腺衬、口腔等的上皮细胞；内皮细胞、细胞和组织膜例如围脏膜、围心膜、胸膜、骨膜、脑膜和肌纤维膜等；角膜、巩膜、粘膜等；以及其它哺乳动物组织例如肌肉、心脏、肺、肾、肝、脾、胆囊、胰腺、膀胱、神经、牙齿、骨、关节、腱、韧带等)上发现的表面，并且也可包括在制品上发现微生物存在的任何位置(例如，商业、住宅、工业、教育、卫生保健和其它机构建筑物墙壁、窗、地板、架空层(crawlspace)、阁楼、地下室、栅栏、屋顶、天花板、照明和水暖器具、通风口、通风管道、水管、门把手、开关、卫生系统、排水沟、水池、水管；医疗和牙科装置、植入物、工具、仪器、设备等；金属、玻璃、塑料、木头、橡胶和纸制品；运输设备，包括运输容器、汽车、铁路设备、船艇、船舶(例如，外壳、舵、锚和/或螺旋桨表面、内部把手和压载舱以及其它内部表面)、驳船以及海洋设备，包括船坞、舱壁、码头等)。
本文所述微粒抗微生物剂可用于抑制微生物生长；降低微生物侵染；治疗包括天然和/或人造表面的产品以改善产品对微生物侵染的抗性；减少生物膜；防止细菌转化至生物膜；预防或抑制微生物感染；防止腐败；以及本文所述的任何其它用途。这些试剂还可用于多种抗病毒用途，包括预防或阻止由疱疹科病毒(例如巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型)的病毒感染和/或由其它病毒的感染。在这方面，所述试剂可用于预防或阻止由各种病毒(例如，单链RNA病毒、单链DNA病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎(HCV)、流感病毒、西尼罗病毒(WNV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、严重急性呼吸病毒(SARS)、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)和人T细胞淋巴瘤病毒(HTLV)，并且也包括已知作为植物病原体的病毒。(例如，马铃薯卷叶病毒；马铃薯病毒A、M、S、X或Y；番茄斑枯病毒；葡萄树卷叶病相关的病毒3；洋李痘疱病毒；莴苣花叶病毒；凤果花叶病毒；胡椒轻性斑点病毒；番茄花叶病毒；烟草花叶病毒；斑点病毒；凤仙坏死斑点病毒等)。
本文所述的抗微生物剂的其它内部或外部药学用途包括，但不限于治疗或预防细菌感染、结核病、真菌感染例如酵母和霉菌感染(例如，念珠菌属(例如，白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和都柏林念珠菌)或隐球菌属或其它真菌)、幽门螺旋杆菌感染和消化性溃疡疾病。在一个实施方案中，以通常对细菌不致死但其仍然足够降低保护性多糖层(其将另外抵抗天然免疫反应)的剂量使用所述剂。因此该技术被认为有助于在不损害人类共生微生物(例如，正常肠内菌丛等)的情况下根除免疫系统介导的细菌感染致用抗生素可能的情况的程度。
用于涂覆和处理水管的微粒铋-硫醇。在一个实施方案中，本文提供用于在以下装置的内表面或外表面上预防和/或控制(即，减缓、延迟、抑制)生物膜生长、破坏生物膜或者降低生物膜的量的方法：水管(例如，牙医、牙科保健员以及其它口腔护理专家和护理人员使用的水管)或其它水递送装置(包括管子、管道、水龙头、饮水器、莲蓬头)；或者接触或递送被人或非人动物饮用或应用的水的任何其它仪器或装置(例如，包括高速牙钻、气－水冲洗器的牙科仪器)以及清洁装置或仪器(例如，)。这些方法也可用于在水管或水递送装置中预防、降低、抑制、消除或中止细菌、真菌和/或原生动物的生长和分化。这些方法包括应用、冲洗、连接或粘附微粒BT化合物至水管或水递送装置的表面。
生物膜是主要由天然存在的细菌和真菌组成的显微镜群体。微生物在包括牙科用水递送系统和诸如莲蓬头、水龙头和管子的其它水递送装置的表面上形成薄层。在牙科操作中用作冷却剂和冲洗剂的水可被微生物严重污染(参见，例如，环境保护局网站epa.gov/safewater/mcl/html)。在牙科用水管和仪器中发现的病原体微生物或机会病原体包括放线菌属、拟杆菌属、芽孢杆菌属、隐孢子虫属、大肠杆菌、黄杆菌属、克雷伯氏菌属、军团菌属、摩拉克菌属、分枝杆菌属、消化链球菌属、假单胞杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和韦荣球菌属。此外，由于生物膜形成，军团菌属和原生动物可在水管或水递送装置中增殖。当水流通过管线或装置时，持续放出在水管或水递送装置中存在的生物膜的细菌和其它微生物。患者和临床人员被暴露于由管线或递送装置喷出的微小液滴或细水雾中存在的微生物。
对于在牙科应用中水的使用和消耗，疾病控制中心建议在用作非手术牙科操作的冷却剂/冲洗剂的水中细菌数目应当具有≤500CFU/ml的需氧异养菌平板计数(HPC)。美国牙科协会(ADA)提议更加严格的标准，其建议在牙科治疗中使用的水含有≤200CFU/ml的细菌水平。维持在牙科用水系统中低水平菌落总数的措施包括使用抗微生物剂(参见，例如，McDowell等，J.Am.Dent.Assoc.135:799-805(2004))；基于过氧化氢的消毒剂(参见，例如，Linger等，J.Am.Dent.Assoc.132:1287-91(2001))；在使用之前和之后对水管的常规冲洗；水管和递送系统的维护；过滤系统的使用；诸如消毒剂(例如，稀释的漂白剂1:10、戊二醛、食品级乙醇、基于氯己定的产品)的化学物质的使用；热根除(thermal eradication)；铜银离子化；二氧化氯；紫外线；臭氧；消毒剂组合(例如，ICX(Adex，Newburg，OR)：过碳酸钠、硝酸银和阳离子表面活性剂以及银离子催化剂。
可用于预防和/或控制(即，减缓、延迟、抑制)生物膜生长、破坏生物膜或者降低在水管或水递送装置的内或外表面上生物膜的量的替代抗菌剂包括本文所述的微粒BT化合物(或者包含至少一种微粒BT化合物的组合物)。可将微粒BT化合物作为凝胶、喷雾、糊剂、液体或粉末或者本领域技术人员已知的其它形式手动或自动地引入至水管、水导管系统和水递送装置内。在特定的实施方案中，将粉末或液体形式中微粒BT化合物与可能包括至少一种另外的生物活性成分和/或无生物活性赋形剂的至少一种或多种另外的成分混合以配制产品，将所述产品定期递送或注入水管、水递送装置或水导管系统内。可由本领域技术人员使用多种本领域已知的方法制备组合物制备组合物。例如，可使用可与DMSO组合的抗微生物有效量的微粒BT化合物。常规使用中，需要足以防止生物膜形成的微粒BT化合物的水平。然而，在其它实施方案中，微粒BT化合物的水平可更高以用于减少、去除、破坏或消除在水管、水递送装置或水导管系统中存在的生物膜。
也可配制微粒BT化合物以便从包含施加至水管、水递送装置或水导管系统的微粒BT化合物的组合物中缓慢释放。也可将微粒BT化合物并入涂料，可将其施加、固定、粘附或者以某种方式使其接触水管线、运载工具或系统的内表面。包含微粒BT化合物的组合物可以为凝胶(例如，水凝胶、硫醇盐聚合物(thiomer)、气凝胶或有机凝胶)或者液体。有机凝胶可包含有机溶剂、硫辛酸、植物油或者矿物油。缓释组合物可递送抗微生物有效量的微粒BT化合物1、2、3、4、5、6或7天(一周)或者2、3、4、5、6、7周或者1、2、3、4、5或6个月。
可将微粒BT化合物(或者包含微粒BT化合物的组合物)与至少一种其它抗微生物剂(即，第二、第三、第四等抗微生物剂)组合，当组合施用时，其具有如本文所述的增强或协同抗微生物作用。例如，当微粒BT化合物与铁螯合的抗微生物剂一起施用时可观察到增强的抗微生物作用。将微粒BT化合物与氧化剂、杀微生物剂或消毒剂中至少一种组合。可以使用利用疏水性硫醇(例如，硫代氯苯酚)制备的微粒BT化合物，并且其比疏水性差的BT化合物表现出更好的粘附水管和水递送装置和系统的能力。具有净负电荷的BT化合物(例如具有1:2摩尔比(铋：硫醇)的那些)还可具有良好的粘合性。
可将微粒BT化合物(以及包含微粒BT化合物的组合物)与小苏打或者另一碱性化合物或物质组合使用。由于小苏打的化学及物理性质，其具有广泛的应用，包括清洁、除臭和缓冲。小苏打化学上中和臭味，而非掩蔽或吸附它们。可将小苏打与微粒BT化合物组合作为粉末的混合物或者溶解或混悬于本文所述的粉末、喷雾剂、凝胶、糊剂或液体中。在其它实施方案中，可将微粒BT化合物与可有助于维持所需碱性pH并且也可具有清洁和脱臭性能的其它碱金属碳酸氢盐或碳酸盐物质(例如，碳酸氢钾或碳酸钙)组合使用。
作为另一实例，可将微粒BT化合物(或者包含微粒BT化合物的组合物)与一种或多种以下物质组合使用。抗微生物剂：例如，氯己定；血根草提取物；甲硝唑；季铵化合物(例如西吡氯铵)；双胍(例如，葡萄糖酸氯己定、海克替啶、奥替尼啶、阿来西定)；卤代双酚化合物(例如，2,2'亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)或其它苯酚抗菌化合物；烷基羟基苯甲酸酯；阳离子抗微生物肽；氨基糖苷；喹诺酮；林肯酰胺；青霉素；头孢霉素；大环内酯；四环素；本领域内已知的其它抗生素；毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)精油；银或胶体银抗菌剂；基于锡或铜的抗菌剂；麦卢卡(Manuka)油；皮萨草(oregano)；百里香；迷迭香；或其它草药提取物；和葡萄柚籽提取物。抗龋齿剂：例如，氟化钠和氟化亚锡、氟化胺、单氟磷酸钠、三偏磷酸钠、柠檬酸锌或其它锌试剂，和酪蛋白。菌斑缓冲剂(Plaque buffer)：例如，脲、乳酸钙、甘油磷酸钙和聚丙烯酸锶类。维生素：例如，维生素A、C和E。植物提取物。抗牙垢剂：例如焦磷酸碱金属盐、含次磷酸盐的聚合物、有机膦酸酯和磷酸枸橼酸盐等。生物分子：例如，细菌素。防腐 剂。遮光剂。pH调节剂。甜味剂。表面活性剂：例如，阴离子、非离子、阳离子和两性离子或两性表面活性剂，来自植物材料的皂角苷(参见，例如，美国专利No.6,485,711)。颗粒磨料：例如，二氧化硅、氧化铝、碳酸钙、磷酸二钙、焦磷酸钙、羟磷灰石、三偏磷酸盐、不溶性六偏磷酸盐、凝聚的微粒磨料、白垩、细磨天然白垩等。增湿剂：例如，甘油、山梨糖醇、丙二醇、木糖醇、乳糖醇等。粘合剂和增稠剂：例如，羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素黄原酸胶、阿拉伯树胶、合成聚合物(例如，聚丙烯酸酯和聚羧乙烯聚合物例如)。增强活性成分例如抗微生物剂递送的聚合化合物。缓冲口腔护理组合物的pH和离子强度的缓 冲液和盐。脱色剂：例如，过氧化合物(例如，过氧二磷酸钾)。起泡系统：例如，碳酸氢钠/柠檬酸系统。
在另一实施方案中，可将本文所述的微粒BT化合物(或者包含微粒BT化合物的组合物)与至少一种或多种抗生物膜试剂组合用于控制生物膜生长、破坏生物膜或者降低生物膜的量。如本领域所理解，种间群体感应与生物膜形成相关。增强LuxS-依赖途径或种间群体感应信号的某些物质(参见，例如，美国专利No.7,427,408)有助于控制生物膜的生长和/或增殖。例如，示例性试剂包括或者组合的或者单独的N-(3-氧代十二烷酰)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)嵌段化合物和N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(BHL)类似物(参见，例如，美国专利No.6,455,031)。包含微粒BT化合物和至少一种抗生物膜剂的口腔卫生组合物可局部递送用于破坏和阻止细菌生物膜和用于治疗牙周病(参见，例如，美国专利No.6,726,898)。
通过加热水管、水递送装置或水导管系统可增强作为抗生物膜试剂的微粒BT化合物的作用，通过加热管线、运载工具或系统将微粒BT化合物施加至该水管、水递送装置或水导管系统。在某些实施方案中，将管线、运载工具或系统加热至约37℃至约60℃之间或者至约37℃至约100℃之间。在其它实施方案中，将管线、运载工具或系统加热至约45℃至约50℃之间；至约50℃至约55℃之间；至约55℃至约60℃之间；至约60℃至约70℃之间；至约70℃至约80℃之间；至约80℃至约90℃之间；或者至约90℃至约100℃之间。在特定的实施方案中，将管线、运载工具或系统加热至约37℃。在另一特定的实施方案中，将管线、运载工具或系统加热至约55℃。如通过本领域技术人员所理解，取决于施加的温度，加热管线、运载工具或系统的时间可改变。例如，将管线、运载工具或系统加热至较低温度时，达到相同抗微生物作用所需时间比加热至较高温度时所需时间更久。本领域技术人员可容易确定在各温度下暴露管线、运载工具或系统的合适时间。
可将微粒BT化合物(或者包含微粒BT化合物的组合物)连同其它形态一起使用以降低或预防生物膜生长。例如，可将如本文所述和在本领域中使用的微粒BT化合物与氧化化学物质、除垢化合物、生物膜破坏物或者冲洗系统组合使用。
包含微粒铋-硫醇的组合物以及用于牙体修复的用途。在另外的实施方案中，本文提供包含用于预防和/或治疗龋齿的微粒BT化合物和牙科汞合金以及微粒BT化合物和牙科复合材料的组合物。目前，对龋病变的仅有治疗是通过替换用作防止进一步腐烂的阻塞的惰性物质的牙齿修复。牙科汞合金和牙科复合材料最常用于受龋齿影响的牙齿的修复。
复发性边缘腐烂是修复失败的重要原因，特别是当将牙科复合材料用于修复时。在复合材料和牙齿组织之间界面处定植的细菌的存在可能是修复失败的重要因素(参见，例如，Hansel等，J.Dent.Res.77:60-67(1998))。在葡萄牙(Casa Pia Study,1986-1989)的研究中，进行1,748次术后修复，并且其中在研究过程中177次(10.1％)失败。复发性边缘腐烂是汞合金和复合材料修复中失败的主要原因，失败率分别达66％(32/48)和88％(113/129)(参见Bernardo等.JADA 2007；138:775-83)。聚合收缩是复合材料固化过程中的收缩，其被视为术后边缘渗漏的主要原因(参见，例如，Estefan等，Gen.Dent.2003；51:506-509)。
已尝试将抗微生物化合物和试剂并入诸如牙本质粘接系统(DBS)的修复物质内，但成果有限。具有抗微生物性质的复合材料和汞合金以及其它修复物质的开发可有助于预防继发性龋齿(参见，例如，Imazato,Dent.Materials 19:449(2003))。本实施方案涵盖使用本文所述的修复组合物配制的抗菌剂的替换，其如本领域所描述与该描述的微粒BT化合物提供本文所公开的优势，包括一系列抗微生物活性、溶解性和生物利用度、抗生物膜作用、无毒性、抗生素功效的增强以及如本文所述的其它性质。
在某些实施方案中，提供包含微粒BT化合物和牙科复合材料的组合物。牙科复合材料通常含有可聚合的树脂基托，该可聚合的树脂基托含有陶瓷填充物。可将微粒BT化合物与通过本领域实施的方法使用本领域已知牙科复合材料的任何一种组合使用(参见，例如，O'Brien,Dental Materials and Their Selection(Chicago:QuintessencePublishing Co.)(2002)；Powers等，Dental Materials:Properties and Manipulation(New York:Mosby)(2007)；Roeters等，J.Dent.32:371-77(1998))。
在其它实施方案中，提供包含微粒BT化合物和汞合金的组合物。汞合金是汞与一种或多种其它金属的合金。因为银是与汞反应的主要成分，所以大部分牙科汞合金称为银汞合金。在汞和银之间的反应动力学不适合于临床使用，所以将银用作与其它元素的合金。该合金通常称为牙科汞合金，或者共同地，合金称为“牙科汞合金用合金”(参见，例如，国际标准组织标准(International Standars Organization Standard)ISO 1559,DentalMaterials-Alloys for Dental Amalgam(1995))。已知多种类型的牙科汞合金，以及全部包括锡，并且大部分具有一些铜以及少量的锌。牙科汞合金自身中一些含有少量汞以促进汞齐化反应。常规牙科汞合金含有67％和74％之间的银、25-28％锡以及至多6％铜、2％锌和3％汞。所谓分散型汞合金具有约70％银、16％锡和13％铜。不同组的汞合金可含有至多30％铜，其成为高铜含量汞合金。在临床放置之前将汞合金与汞以1:1重量比混合。因此，完成后牙科汞合金修复的汞含量为按重量计约50％。在常规的牙科汞合金中，银与锡的比率得到晶体结构，其基本上为称为伽马(γ)相的金属间化合物Ag3Sn。该相的精确百分率决定汞齐化反应的动力学以及所得汞合金结构的许多性质。使用更高的铜分散合金，微结构通常是伽马相与共熔银-铜相的混合物。不同制造商提供不同形式的汞合金，但通常为细颗粒，形状为球形或者不规则形状，粒度为约25-35微米(参见新兴及新鉴定健康风险科学委员会(Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks)(SCENIHR)，欧洲委员会：健康和消费者保护总司(Directorate-General,Health&ConsumerProtection)，2008年5月6日，网址：ec.europa.eu/health/ph_risk/committees/04_scenihr/docs/scenihr_o_016.pdf.)。
通过施用微粒BT化合物至牙齿表面、汞合金或者复合材料，微粒BT化合物也可用于预防或治疗龋齿和/或炎症(即，分别降低龋齿和/或炎症的发生或复发的可能性)。包含微粒BT化合物的组合物可以粘液粘附组合物，所述组合物被应用到牙齿表面和/或牙龈或口腔粘膜，其可以以一定程度地粘附到表面或递送药学上有效量的活性成分到所需表面的任何形式。还可将微粒BT化合物配制为由应用到口腔的组合物缓慢释放。例如，组合物可以为凝胶(例如，水凝胶、硫醇盐聚合物、气凝胶或有机凝胶)或者液体。有机凝胶可以包含有机溶剂、硫辛酸、植物油或者矿物油。该凝胶或液体涂覆制剂可内部或外部应用到汞合金、复合物或其它修补组合物。缓释组合物可递送药学有效量微粒BT化合物1、2、3、4、5、6或7天(一周)或者2、3、4、5、6、7周或者1、2、3、4、5或6个月。该组合物可由本领域技术人员使用本领域已知的许多方法来制备。
用于牙体修复的包含微粒BT化合物的组合物可包含玻璃离子粘合剂；玻璃复合体(giomer)(通过使含有玻璃的氟化物与液体聚酸反应形成)；复合体(compomer)(可聚合的二甲基丙烯酸树脂和可离子浸出的玻璃填充颗粒)。光固化复合体可进一步包含氟化物。
包含施加至牙齿、汞合金或复合材料的表面的微粒BT化合物的组合物可进一步包含增强抗微生物作用的一种或多种其它表面活性剂。在包含微粒BT化合物的组合物中使用的示例性抗微生物剂包括例如，氯己定、血根草提取物、甲硝唑、季铵化合物(例如西吡氯铵)；双胍(例如，葡萄糖酸氯己定、海克替啶、奥替尼啶、阿来西定)；和卤代双酚化合物(例如，2,2'亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)或其它苯酚抗菌化合物、烷基羟基苯甲酸酯、阳离子抗微生物肽、氨基糖苷、喹诺酮、林肯酰胺、青霉素、头孢霉素、大环内酯、四环素，以及本领域内已知的其它抗生素、甲双二嗪或氧氢噻二嗪、A-dec ICX、毛喉鞘蕊花(Coleusforskohlii)精油、银或胶体银抗菌剂、基于锡或铜的抗菌剂、氯或溴氧化剂、麦卢卡(Manuka)油、皮萨草(oregano)、百里香、迷迭香或其它药草提取物以及葡萄柚籽提取物；抗炎或抗氧化剂，例如布洛芬、氟比洛芬、阿斯匹林、吲哚美辛、芦荟(aloe vera)、姜黄、橄榄叶提取物、丁香、泛醇、视黄醇、ω-3脂肪酸、γ-亚麻酸(GLA)、绿茶、姜、葡萄子等。
组合物也可进一步包含一种或多种药学上可接受的载体，例如，淀粉、蔗糖、水或水/醇体系、DMSO等。组合物也可包括表面活性剂，例如阴离子、非离子、阳离子和两性离子或两性表面活性剂，或者可包括来自植物材料的皂角苷(参见，例如，美国专利No.6,485,711)。也可包括用于口服使用的缓冲组合物的pH和离子强度的缓冲剂和盐。可包括其它任选成分：漂白剂(例如过氧化合物)、过氧二磷酸钾盐、起泡系统(例如碳酸氢钠/柠檬酸体系)等。
包含微粒铋-硫醇的组合物以及用于口腔卫生和用于治疗口腔炎症和感染的用 途。在另一个实施方案中，将包含微粒BT化合物的组合物配制用于口腔用途，并可用于预防或降低口腔中的微生物生长和用于预防和/或治疗口腔的微生物感染和炎症。因此，这些组合物对于预防或治疗(即，降低或抑制生长、降低发生或复发的可能性)牙斑、口臭、牙周病、牙龈炎和其它口腔感染。包含微粒BT化合物的口腔组合物也可用于预防和/或控制(即，减缓、延迟、抑制)口腔表面，特别是牙齿或牙龈上存在的生物膜生长，破坏生物膜或减少生物膜的量。
食物颗粒残留、不良口腔卫生和不良口腔保健以及不当的假牙清洁可促使牙齿之间、牙龈周围以及舌上的微生物生长。持续的微生物生长和龋齿的存在可导致口臭、牙斑(即，由微生物的定植形成的生物膜)、牙龈炎和炎症。在缺乏适当口腔护理(例如，刷牙、牙线洁齿)时，可继而引起更严重的感染，例如牙周病和颌感染。
良好的口腔卫生不仅对于口腔健康，而且还对于若干慢性病状的预防是重要的。控制口腔中的细菌生长可有助于降低心脏病风险、保持记忆和降低身体其它部位中的感染和炎症风险。糖尿病患者出现严重牙龈问题的风险更高，并且通过保持良好的口腔健康来降低牙龈炎的风险可有助于控制血糖。孕妇或许更可能患牙龈炎，一些研究表明孕妇中的牙龈疾病和早产、低出生体重儿之间有关系。
细菌是牙周病的主要病原体。牙斑中可发现超过500种细菌菌株(Kroes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:14547-52(1999))。细菌已进化为在牙齿表面、牙龈上皮和口腔的环境中作为生物膜生存，这增加了治疗牙周炎的困难。抗菌剂以及当前用于治疗该感染的抗生素通常不杀死所有的进攻有机体。对某些细菌菌种无效的物质的使用可导致抗细菌菌种的增殖。另外，这些物质可引起使人不快的副作用，例如变态反应、炎症和牙变色。
牙菌斑是牢固地粘着到牙齿表面、修复物和修复装置的生物膜。控制口腔中的生物膜的主要方法是通过机械清洁(即，刷牙、牙线洁齿等)。在未进行这样的清洁的最初两天内，牙齿表面被主要为链球菌菌种的革兰阳性兼性球菌所定植。细菌分泌有助于将细菌锚定到表面并对附着的细菌提供保护的胞外粘液层。一旦牙齿表面被附着的细菌所覆盖则微菌落形成。生物膜主要通过附着的细菌的细胞分裂，而非通过新细菌的附着来生长。细菌形成斑块的倍增时间在早期发展中快，而在更成熟的生物膜中较慢。
当细菌菌落随后粘附到已附着到薄膜的细菌时出现共聚集。共聚集的结果是形成彼此连接的不同细菌的复合集合。原状噬斑形成几天之后，牙龈缘变为发炎和肿大。炎症可导致加深的龈沟产生。生物膜扩张到该龈下区域并在该保护环境中繁盛，导致成熟龈下噬菌生物膜的形成。直到由主要由革兰氏阳性菌组成的一种生物膜变为包含革兰氏阴性厌氧菌的生物膜才出现牙龈炎症。在龈缘噬斑形成开始后的3和12周之间在龈沟内开始形成龈下细菌微菌落(主要由革兰氏阴性厌氧菌组成)。
在生物膜内受保护的细菌微菌落通常对抗生素(全身施用)、抗菌剂或消毒剂(局部施用)和免疫防御有抗性。例如，杀死游离浮游菌的抗生素剂量需要增加多达1,500倍以杀死生物膜细菌。在此高浓度下，这些抗菌剂也趋向于对患者有毒性(参见，例如，Coghlan1996,New Scientist 2045:32-6；Elder等，1995,Eye 9:102-9)。
努力经常地物理去除菌斑生物膜是消除和控制菌斑的最有效的手段。然而，凹处内的龈下菌斑不能通过刷牙、牙线或口腔清洗来达到。因此，经常由牙科医师或牙医进行龈下根部表面的的牙周清除是预防和治疗牙周炎的主要组成部分。
在某些实施方案中，微粒BT化合物可加入到口腔卫生组合物中以及装置上(例如涂料)或者在装置内，例如，但不限于牙膏、嗽口水(即口腔漱剂)、口腔凝胶、牙粉、口腔喷雾(包括通过口腔吸入器来分散的喷雾)、可食用膜、咀嚼胶、口腔软膏、假牙液体清洁剂、假牙保存液和牙线，可由任何受试者常规使用它们。微粒BT化合物可加入到主要由牙齿护理行业使用的口腔卫生组合物中以及在装置上，其包括例如氟化物液体治疗剂、清洁组合物、缓冲组合物、口腔漱剂、牙线以及清洁工具。本实施方案预期用本文所述的微粒BT化合物和/或涂覆至装置上代替本领域内所述的用口腔卫生组合物配制的抗菌剂，以提供本文公开的优点，其包括以下范围：抗微生物活性、溶解度和生物利用度、抗生物膜作用、非毒性、抗生素功效的增强及本文所述的其它性质。
微粒BT化合物还可通过将微粒BT化合物施用于牙齿表面来用于预防或治疗龋齿和/或炎症(即，分别降低发生或复发龋齿和/或炎症的可能性)。包含微粒BT化合物的组合物可以粘液粘附组合物，所述组合物被应用到牙齿表面和/或牙龈或口腔粘膜，其可以以一定程度地粘附到表面或递送药学上有效量的活性成分到所需表面的任何形式。还可将微粒BT化合物配制为由应用到口腔的组合物缓慢释放。例如，组合物可以是凝胶(例如，水凝胶、硫醇盐聚合物、气凝胶或有机凝胶)或液体。有机凝胶可包含有机溶剂、硫辛酸、植物油或矿物油。该凝胶或液体涂覆制剂可内部或外部应用到汞合金、复合物或其它修补组合物。缓释组合物可递送药学有效量微粒BT化合物1、2、3、4、5、6、7天(一周)或2、3、4、5、6、7周或1、2、3、4、5或6个月。该组合物可由本领域技术人员使用本领域已知的许多方法来制备。
如本文所述，在某些其它实施方案中，提供包含微粒BT化合物和一种或多种另外的抗微生物化合物或抗微生物剂的抗微生物组合物用于口腔用途。如本文所述，特别有用的是包含和当组合施用时具有增强的或协同抗微生物作用的第二抗微生物剂的组合物。例如，当微粒BT化合物与铁螯合的抗微生物剂一起施用时可观察到增强的抗微生物作用。在其它特定实施方案中，将微粒BT化合物与抗炎剂、化合物、小分子或大分子(例如肽或多肽)配制。
可将本文所述的任何微粒BT化合物配制用于口腔用途。在某些实施方案中，可使用用疏水硫醇(例如，硫代氯酚)制备的微粒BT化合物，并且其显示比疏水差的BT化合物更大的粘附到牙齿和口腔组织的能力。具有净负电荷的BT化合物(例如具有1:2摩尔比(铋：硫醇)的那些)还可具有良好的粘合性。
包含微粒BT化合物的口腔卫生组合物可另外包含一种或多种活性成分和/或一种或多种适用于口腔的赋形剂或载体。在一个实施方案中，所述口腔卫生组合物可另外包含碳酸氢钠或另外的碱性化合物或物质。由于小苏打的化学及物理性质，其具有广泛的应用，包括清洁、除臭和缓冲。小苏打化学上中和臭味，而非掩蔽或吸附它们。小苏打可与微粒BT化合物组合，或者作为粉末混合物或者溶解或悬浮于本文所述的牙粉、凝胶、糊剂和液体中的任一种。在其它实施方案中，微粒BT化合物可与有助于保持所需的碱性pH和还具有清洁和除臭性质的其它碱金属碳酸氢盐或碳酸盐物质(例如，碳酸氢钾或碳酸钙)组合。
包含微粒BT化合物的口腔卫生组合物可另外包含一种或多种以下成分。抗微生物 剂：例如，氯己定；血根草提取物；甲硝唑；季铵化合物(例如西吡氯铵)；双胍(例如，葡萄糖酸氯己定、海克替啶、奥替尼啶、阿来西定)；卤代双酚化合物(例如，2,2'亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)或其它苯酚抗菌化合物；烷基羟基苯甲酸酯；阳离子抗微生物肽；氨基糖苷；喹诺酮；林肯酰胺；青霉素；头孢霉素；大环内酯；四环素；本领域内已知的其它抗生素；毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)精油；银或胶体银抗菌剂；基于锡或铜的抗菌剂；麦卢卡(Manuka)油；皮萨草(oregano)；百里香；迷迭香；或其它草药提取物；和葡萄柚籽提取物。抗炎或抗氧 化剂：例如，布洛芬、氟比洛芬、阿斯匹林、吲哚美辛、芦荟(aloe vera)、姜黄、橄榄叶提取物、丁香、泛醇、视黄醇、ω-3脂肪酸、γ-亚麻酸(GLA)、绿茶、姜、葡萄子等。抗龋齿剂：例如，氟化钠和氟化亚锡、氟化胺、单氟磷酸钠、三偏磷酸钠、柠檬酸锌或其它锌试剂，和酪蛋白。菌斑缓冲剂：例如，脲、乳酸钙、甘油磷酸钙和聚丙烯酸锶类。维生素：例如，维生素A、C和E。植物提取物。脱敏剂：例如，柠檬酸钾、氯化钾、酒石酸钾、碳酸氢钾、草酸钾、硝酸钾和锶盐。抗牙垢剂：例如焦磷酸碱金属盐、含次磷酸盐的聚合物、有机膦酸酯和磷酸枸橼酸盐等。生 物分子：例如，细菌素、噬菌体、抗体、酶等。调味剂：例如，薄菏和薄荷油、茴香、肉桂等。蛋白 质材料：例如，胶原。防腐剂。遮光剂。着色剂。pH调节剂。甜味剂。药学上可接受载体：例如，淀粉、蔗糖、水或水/醇系统等。表面活性剂：例如，阴离子、非离子、阳离子和两性离子或两性表面活性剂，来自植物材料的皂角苷(参见，例如，美国专利No.6,485,711)。颗粒磨料：例如，二氧化硅、氧化铝、碳酸钙、磷酸二钙、焦磷酸钙、羟磷灰石、三偏磷酸盐、不溶性六偏磷酸盐、凝聚的微粒磨料、白垩、细磨天然白垩等。增湿剂：例如，甘油、山梨糖醇、丙二醇、木糖醇、乳糖醇等。粘合剂和增稠剂：例如，羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素黄原酸胶、阿拉伯树胶、合成聚合物(例如，聚丙烯酸酯和聚羧乙烯聚合物例如)。增强活性成分例如抗微生物剂递送的聚合化合物。缓冲口腔护理组合物的pH和离子强度的缓 冲液和盐。脱色剂：例如，过氧化合物(例如，过氧二磷酸钾)。起泡系统：例如，碳酸氢钠/柠檬酸系统。变色系统。在特定实施方案中，研磨剂为二氧化硅或细磨天然白垩。
配制以用作牙膏的包含微粒BT化合物的口腔卫生组合物可进一步包含增湿剂(例如，甘油或山梨糖醇)、表面活性剂、粘合剂和/或调味剂。牙膏还可包含甜味剂、增白剂、防腐剂和抗微生物剂。牙膏及用于口腔用途的其它组合物的pH通常在pH 5.5和8.5之间。在某些实施方案中，包括牙膏的口腔卫生组合物具有7和7.5之间、7.5和8之间、8和8.5之间或8.5和9之间的pH，所述pH可增强微粒BT化合物的抗微生物活性。本文所述的牙膏组合物可包含白垩、二水合磷酸二钙、山梨糖醇、水、水合氧化铝、沉淀二氧化硅、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、调味剂、去水山梨糖醇单油酸酯、糖精钠、焦磷酸四钠、羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯中的一种或多种。如果需要可采用一种或多种着色剂例如，FD&C蓝。可包含于牙膏制剂中的其它适合的成分描述于本领域中，例如，美国专利No.5,560,517。
在一个特定的实施方案中，口腔卫生组合物为口腔喷雾剂，并包含微粒BT化合物、碱性缓冲液(例如，碳酸氢钾)、醇、甜味剂组分和香味系统。香味系统还可具有以下中的一种以上：香味素、增湿剂、表面活性剂、甜味剂和着色剂(参见，例如，美国专利No.6,579,513)。本文所述的和本领域中已知的用于口腔卫生组合物的表面活性剂可以是阴离子的、非离子的或两性的。
在另一实施方案中，包含微粒BT的口腔卫生组合物可与另外的活性成分例如甲双二嗪和氧氢噻二嗪组合，这在本领域内已被描述为可用于包括治疗严重感染的治疗的牙膏、牙齿凝胶和嗽口水(参见，例如，英国专利申请No.GB 1557163、美国专利No.6,488,912)。如本文所述，微粒BT还可与一种或多种另外的抗微生物剂组合，以至于当与微粒BT组合时所述组合物具有附加效应或协同效应。
在又一实施方案中，本文所述的口腔卫生组合物可进一步包含至少一种或多种用于控制生物膜生长、破坏生物膜或减少生物膜量的抗生物膜剂。如本领域内所理解，种间群体感应(interspecies quorum sensing)与生物膜形成相关。可增强LuxS依赖途径或种间群体感应信号(interspecies quorum sensing signal)(参见，例如，美国专利No.7,427,408)的某些试剂有助于控制生物膜的生长和/或增殖。例如，示例性试剂包括或者组合的或者单独的N-(3-氧代十二烷酰)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)嵌段化合物和N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(BHL)类似物(参见，例如，美国专利No.6455031)。包含微粒BT化合物和至少一种抗生物膜剂的口腔卫生组合物可局部递送用于破坏和阻止细菌生物膜和用于治疗牙周病(参见，例如，美国专利No.6,726,898)。
本文所述的口腔卫生组合物可包含足以在正常刷牙、漱口或牙线洁齿所需的时间内基本上起抗菌作用的量的微粒BT化合物。如本文所述，微粒BT化合物可保持于口腔表面(例如牙齿、汞合金、复合物、粘膜、牙龈)上。涂抹、漱洗、牙线洁齿后微粒BT化合物例如，可继续保持于牙齿和牙龈上以提供延长的抗生物膜和抗炎作用。
在其它实施方案中，微粒BT化合物从粘液-粘合剂聚合物或有助于微粒BT化合物留置于粘膜、牙齿以及修复表面上的其它试剂缓慢释放。可将微粒BT化合物添加到稳定、粘性和/或粘液粘合剂水组合物，所述水组合物也可用于预防和治疗粘膜的溃疡性、炎性和/或糜烂紊乱和/或递送药学活性化合物到粘膜表面以局部治疗或转移到系统循环(参见，例如，美国专利No.7,547,433)。
在另一实施方案中，包含微粒BT化合物的口腔卫生组合物进一步包含可增强菌斑去除的橄榄油。橄榄油在用于口腔卫生，例如牙膏、嗽口水、喷雾剂、口腔吸入器或咀嚼胶的产品中的使用可有助于消除或降低(减少)菌斑和/或消除或降低(减少)口腔中存在的细菌的数量，由此，达到降低牙齿疾病(例如，牙齿老化、牙周病)和口臭的发生(参见，例如，美国专利No.7,074,391)。
在其它实施方案中，包含微粒BT化合物的口腔卫生组合物可进一步包含局部应用于口腔的粘膜消毒制剂。口腔卫生组合物可进一步包含对于清洁舌和喉有用的水性膏剂(aqueous slurry)(参见，例如美国专利No.6,861,049)。在又一实施方案中，包含微粒BT化合物的口腔卫生组合物可进一步包含至少一种用于预防(即，降低发生可能性)空腔的形成(龋齿)或降低空腔数的薄荷剂(mint)。一种称为(Ortek Therapeutics,Inc.,Roslyn Heights,NY)的此类薄荷剂包含有助于中和酸pH和促进钙粘着到珐琅质表面的精氨酸和钙。在包含微粒BT化合物的口腔卫生组合物中包含薄荷剂可因此提高pH和增强微粒BT化合物对口腔表面的粘着。
配制用于牙科和整形外科用途的包含微粒铋-硫醇的粘合剂组合物。在另一实施方案中，将包含微粒BT化合物的组合物配制用于预防或降低在骨骼或人工关节或者临近所述骨骼或人工关节的组织和骨骼结构上的微生物生长。在特定实施方案中，提供使用包含微粒BT化合物的组合物来预防和/或治疗由于整形外科手续(例如，整形外科手术、整形外科治疗、关节成形术(包括两步关节成形术)、畸齿矫正治疗)引起的微生物感染和炎症的方法。在某些实施方案中，组合物包含微粒BT化合物和骨粘合剂，以及在其它实施方案中，所述组合物包含微粒BT化合物和牙粘合剂。因此，这些组合物可用于预防和/或治疗(即，降低或抑制其生长，降低其发生或复发的可能性)骨架和支撑结构(即，骨、关节、肌肉、韧带、腱)的微生物感染例如骨髓炎。包含微粒BT化合物和骨粘合剂或牙粘合剂的本文所述的组合物也可用于预防和/或控制(即，减缓、延迟、抑制)生物膜生长、破坏生物膜或者降低在关节中或在表面上存在的生物膜的量，例如关节、骨骼、韧带、腱或牙齿或者替代关节、骨骼(部分或者全部)、韧带、腱或牙齿的表面。
如本文所述和本领域已知的粘合剂是将物质粘合在一起并且能够硬化的胶结物质。该物质能够将组织粘合在一起或者能够将假体或人造装置(例如，假体关节、骨骼或牙齿)粘合至相邻组织。骨粘合剂包括例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、磷酸镁以及磷酸钙。磷酸钙形式用作“替代骨骼”，用于治疗在没有植入材料时无法足够迅速和/或恰当愈合的骨骼的龟裂和断裂。也可通过向松质骨提供机械完整性将包含骨粘合剂(例如，磷酸钙)和微粒BT化合物的组合物用于治疗松质骨缺陷。可在移植位置处再吸收粘合剂或者可将粘合剂保持在移植位置处。
在特定的实施方案中，本文所述的用作骨粘合剂的组合物包含BT化合物或者微粒BT化合物以及适合用作骨粘合剂的磷酸钙或磷酸镁的制剂。本文中也可将磷酸钙或硫酸镁的制剂分别称为含有磷酸钙的骨粘合剂或者磷酸钙骨粘合剂或者含有磷酸镁的骨粘合剂或磷酸镁骨粘合剂。磷酸钙可以以本领域中已知和使用的多种形式中任何一种被包含在组合物中，并且磷酸钙包括作为非限制性实例的羟磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)；透钙磷石(CaHPO4*2H2O)；三斜磷钙石(CaHPO4)；缺钙羟磷灰石(CDHA,Ca9(PO4)5HPO4OH)；硫酸钙/磷酸钙(CSPC)(参见，例如，Hu等，J.Mater.Sci.Mater.Med.2009年10月13日，印刷前的电子出版物)粘合剂。本领域中使用的磷酸镁也称为鸟粪石(MgNH4PO4*6H2O)粘合剂(参见，例如，Grosshardt等，Tissue Eng.A部分,2010年7月30日，印刷前的电子出版物；也参见，例如，Bohner等，J.Pharm.Sci.86:565-72；(1997)；Fulmer等，3:299-305(1992)；Lobenhoffer等，J.Orthopaedic Trauma 16:143-49(2002)；Lee等，J.Carniofac.Surg.21:1084-88(2010))。在特定的实施方案中，包含微粒BT化合物和含有磷酸钙的骨粘合剂的本文所述的组合物包含作为磷酸钙的形式的硫酸钙/磷酸钙(CSPC)(参见，例如，Hu等，J.Mater.Sci.Mater.Med.2009年10月13日，印刷前的电子出版物)。在某些其它实施方案中，包含微粒BT化合物和磷酸钙或磷酸镁粘合剂的组合物可进一步包含壳聚糖(来自甲壳动物细胞的生物聚合物)；至少一种或多种抗生素或者抗微生物剂；和/或至少一种或多种抗炎剂。
在本领域中使用骨粘合剂用于释放药物和试剂。在某些特定的实施方案中，磷酸钙粘合剂可以为至少部分作为包封用于治疗用途的试剂(例如，抗微生物剂)的羟磷灰石微球体的形式(参见，例如，美国专利No.6,730,324)。包括微球体的这些粘合剂用于缓慢释放包含在微球体内的试剂。本文涵盖包含磷酸钙微球体的组合物，该磷酸钙微球体包含微粒BT化合物。
本文也提供包含微粒BT化合物和PMMA骨粘合剂的组合物。根据本领域所述的使用具有抗微生物活性的其它试剂配制PMMA的方法，可使用微粒BT化合物配制PMMA骨粘合剂(参见，例如，欧洲专利申请No.EP1649874)。
本文也提供包含微粒BT化合和牙粘合剂(即，牙科粘胶)的组合物，该组合物可用于抑制、预防或治疗牙齿或牙龈的微生物感染。牙粘合剂可包含以下化合物或组合物的任何一种：磷酸锌、玻璃离子体、α-三磷酸钙(α-TCP)、甲基丙烯酸烷基酯(参见，例如，美国专利No.6,071,528)；氧化铋(参见，例如，Bueno等，Oral Surg.Oral Med.Oral Pathol.OralRadiol.Endod.107:e65-69(2009))；以及矿物三氧化物凝聚体(mineral trioxideaggregate)(MTA)(参见，例如，Hwang等，Oral Surg.Oral Med.Oral Pathol.OralRadiol.Endod.107:e96-102(2009))。
本实施方案涵盖使用牙粘合剂或骨粘合剂配制的抗微生物的替换，其如本领域所述与该描述的微粒BT化合物提供本文公开的优势，包括一系列抗微生物活性、溶解性和生物利用度、抗生物膜作用、无毒性、抗生素功效的增强以及如本文所述的其它性质。根据本领域所述的方法可使用微粒BT化合物和一种或多种另外的抗生素来配制骨骼和牙粘合剂(参见，例如，美国专利申请公开No.2006/0205838；Alt等，Antimicrob.AgentsChemother.48:4-84-88(2004)；Bohner等，同上；Bueno等，同上；Chuard等，Antimicrob.Agents Chemother.37:625-32(1993)；J.Orthopaed.Res.27:1008-15(2009)；De Lalla,J.Chemother.13:48-53(2001)；Domenico等，Peptides 25:2047-53(2004)；Widmer等，Antimicrob.Agents Chemother.35:741-46(1991))。
在包含骨粘合剂或牙粘合剂的含有微粒BT组合物中使用的BT化合物的量的范围可以为约10-500μg BT/克的各粘合剂之间。单独或与至少一种另外的抗生素组合使用的微粒BT化合物提供在骨骼和牙粘合剂中比当前使用的抗生素如本文所述的优势。包含微粒BT化合物和骨粘合剂(例如，磷酸钙)或牙粘合剂的本文所述的组合物可进一步包含一种或多种另外的抗微生物化合物或试剂。如本文所述，特别有用的是包含当组合施用时具有增强的或协同抗微生物作用的微粒BT化合物和第二抗微生物剂的组合物。通过另外的实施例，当将微粒BT化合物与铁螯合的抗微生物剂一起施用时可观察到增强的抗微生物作用。在其它特定实施方案中，将微粒BT化合物与抗炎剂、化合物、小分子或大分子(例如肽或多肽)配制。
如本文所述的包含微粒BT化合物和骨粘合剂的组合物也可用于涂覆用于连接、稳定或固定骨折、融合、截骨术或者替换关节的硬件(例如，螺丝、平板、骑缝钉、针和金属丝等)。包含如本文所述的微粒BT化合物和牙粘合剂的组合物也用于涂覆牙髓、牙帽、衬垫、牙齿或者牙齿填充物或牙齿内的修复组合物等。可将这些组合物配制至涂料中，可将该涂料施加、固定、粘附或以某种方式使其接触骨骼和/或关节相关硬件。在特定的实施方案中，涂料包含微粒BT化合物和磷酸钙或磷酸镁骨粘合剂。根据本领域实践的方法将微粒BT化合物和磷酸钙或者磷酸镁一同配制以用于施加至骨骼硬件。例如，包含微粒BT化合物和骨粘合剂(例如，磷酸钙或磷酸镁骨粘合剂)的组合物可以为施加至硬件的液体、凝胶、糊剂或喷雾剂(例如，热喷雾，其包括等离子喷雾)的形式。包含微粒BT化合物和骨粘合剂的组合物可以为凝胶(例如，水凝胶、硫醇盐聚合物、气凝胶或有机凝胶)或者液体。有机凝胶可以包含有机溶剂、硫辛酸、植物油或矿物油。缓释组合物可递送抗微生物有效量的微粒BT化合物1、2、3、4、5、6或7天(一周)或者2、3、4、5、6、7周或者1、2、3、4、5或6个月。根据粘合剂的孔隙率可至少部分地控制释放速率(参见，例如，Bohner等，同上)。
可将包含微粒BT化合物和骨粘合剂或牙粘合剂的组合物与至少一种当组合施用时具有增强或协同抗微生物作用(即，大于相加作用)的其它抗微生物剂(即，第二、第三、第四等抗微生物剂)组合。例如，当微粒BT化合物与铁螯合的抗微生物剂一起施用时可观察到增强的抗微生物作用。在特定实施方案中，可将包含微粒BT化合物和骨粘合剂或牙粘合剂的组合物与选自以下的至少一种其它抗微生物剂和/或抗炎剂组合：抗微生物剂：例如，氯己定；血根草提取物；甲硝唑；季铵化合物(例如西吡氯铵)；双胍(例如，葡萄糖酸氯己定、海克替啶、奥替尼啶、阿来西定)；卤代双酚化合物(例如，2,2'亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)或其它苯酚抗菌化合物；烷基羟基苯甲酸酯；阳离子抗微生物肽；氨基糖苷；喹诺酮；林肯酰胺；青霉素；头孢霉素；大环内酯；四环素；本领域内已知的其它抗生素；毛喉鞘蕊花精油；银或胶体银抗菌剂；基于锡或铜的抗菌剂；麦卢卡油；皮萨草；百里香；迷迭香；或其它草药提取物；和葡萄柚籽提取物。抗炎或抗氧化剂：例如，布洛芬、氟比洛芬、阿斯匹林、吲哚美辛、芦荟、姜黄、橄榄叶提取物、丁香、泛醇、视黄醇、ω-3脂肪酸、γ-亚麻酸(GLA)、绿茶、姜、葡萄子等。在特定实施方案中，包含微粒BT化合物和骨粘合剂或牙粘合剂的组合物可进一步包含选自下述的抗生素：氯林肯霉素、万古霉素、达托霉素、头孢霉素、庆大霉素、妥布霉素、甲硝唑、头孢克洛、环丙沙星或者其它抗菌剂，例如季铵化合物(例如，苯扎氯铵、十六烷基吡啶氯化物)、抗微生物沸石、碱金属氢氧化物或碱土金属氧化物。所述组合物可任选地包含一种或多种本文所述的药学上适当的载体(即，赋形剂)、表面活性剂、缓冲液、稀释剂和盐，以及脱色剂。可将抗微生物剂与如本文以及本领域所述的牙粘合剂和骨粘合剂一起配制(参见，例如，Akashi等，Biomaterials 22:2713-17(2001)；美国专利No.6,071,528；Alt等，同上)。
可将异物感染的动物模型用于鉴定包含微粒BT化合物和牙粘合剂或骨粘合剂的组合物的抗微生物活性(参见，例如，Chuard等Antimicrob.Agents Chemother.1993；37:625-32)。在这些模型中抗生素的体内功效与抗微生物杀死固定相微生物以及粘附外源性材料的那些的能力相关(参见，例如，Widmer等J.Infect.Dis.1990；162:96-102；Widmer等Antimicrob Agents Chemother 1991；35:741-6；也参见，例如，Karchmer.Clin.Infect.Dis.1998；27:714-6)。
作为非限制性实例并且仅用于示意目的，骨粘合剂可包含以下物质中的微粒BT化合物：75％(2/2)甲基丙烯酸甲酯苯乙烯共聚物、15％聚甲基丙烯酸甲酯(以辅助处理组合物)以及10％硫酸钡(用于不透辐射)以及约10至约500μg微粒BT化合物/克的粘合粉(即，0.001-0.05％w/w)。在其它特定的实施方案中，可添加至少一种另外的抗微生物剂。
包含使用油漆和油漆涂料配制的微粒铋-硫醇的组合物。某些其它实施方案涵盖将本文所述的微粒BT化合物并入油漆内或者油漆上作为油漆涂料以用于降低生物积垢以及预防和/或控制(即，减缓、延迟、抑制)生物膜生长、破坏生物膜或者降低在油漆面上存在的生物膜的量。本文所述的包含微粒BT化合物的组合物可使用油漆或油漆涂料配制，所述油漆或油漆涂料应用于多种制品中任何一种，包括但不限于医疗装置、矫形外科装置、牙科装置、工业装置、电子装置、墙壁、地板、天花板、屋顶、桩基、船坞、码头、管道和管道结构(例如，进料滤网、冷却塔)、热交换器、堤坝和织物以及其它表面，例如在包括汽车、火车、飞机和诸如船舶、船艇、潜艇以及其它轮船的轮船的所有类型的运载工具之中和之上出现的那些。
在特定的实施方案中，本文所述的组合物和方法用于预防和/或降低在暴露于水的制品上形成的生物积垢或生物膜。据认为，在海洋环境中在表面上生物膜的形成是促进在海上建筑物上一些固着无脊椎动物群落的定植和恢复的重要因素(参见，例如，Siboni等，FEMS Microbiol Lett 2007；274:24-9)。大型生物区系与这些微生物膜的随后相互作用导致在数天和数周内无脊椎动物和藻类的附着和生长，这是与生物积垢相关的大部分流体动力阻力的原因(参见，例如，Schultz,Biofouling 2007；23:331-41)。在表面上旧生物膜支撑藤壶幼虫吸附，与底层的类型无关(参见，例如，Hunga等，J Exptl Marine BiolEcol 2008；361:36-41)。生物膜也显著增加在海鞘Phallusia nigra、多毛纲管虫华美盘管虫(Hydroides elegans)以及藤壶纹藤壶(Balanus amphitrite)中一个或多个发育阶段下的粘附强度(参见，例如，Zardus等，Biol Bull 2008；214:91-8)。生物膜也可增强斑马贝(Zebra mussel)(斑纹蚌)与一些人造表面的粘附(参见，例如，Kavouras和Maki.InvertebBiol 2005；122:138-51)，其导致对海鲜、发电和制造工业和水和废水处理设施的数百万乃至数十亿美元的税收和费用损失，并且导致对引入贝类的生态系统的显著破坏。
在海洋、咸水和淡水环境中，在水下结构和船舶上收集、沉淀、附着以及生长生物体。这些生物体包括藻类、真菌和其它微生物以及水生动物，例如被囊类、水螅类、双壳类、苔藓类、多毛虫、海绵和藤壶。称为结构的“积垢”的这些生物体的存在是有害的，例如，其增加结构重量和/或妨碍其流体动力学，从而降低它的工作效率，增加对腐蚀和降解或者破裂结构的敏感性。
迄今为止用于预防或降低生物积垢和生物膜产生的某些油漆和涂料包括毒性组分，该毒性组分在抑制生物积垢和生物膜形成的同时对所需和有益植物群和动物群有毒。示例性抗微生物剂和化学毒素包括铜和含有铜的化合物(例如，氧化亚铜)、汞、砷、氧化三丁基锡(TBT)、有机锡(即，具有连接一种或多种碳基团的锡)、六种两部分双酚-A-(表氯醇环氧化合物、双官能缩水甘油醚环氧树脂、缩水甘油醚环氧树脂和偏硼酸钡环氧树脂。
本文所述的微粒BT化合物提供非毒性替代物以及提供本文所公开的优势，包括一系列抗微生物活性、溶解性和生物利用度、抗生物膜作用、抗生素功效的增强以及如本文所述的其它性质。通过结合本文所述的微粒BT化合物和方法，使用已知用于制备包括杀生物剂的油漆和油漆涂料的步骤，在油漆和油漆涂料中可使用微粒BT化合物替代其它抗微生物剂以及可将微粒BT化合物并入这些油漆和油漆涂料(参见，例如，美国专利No.4,596,724；4,410,642；4,788,302；5,470,586；6,162,487；5,384,176；美国专利申请公开No.2007/125703以及2009/0197003；Gerhart等，J.Chem.Ecol.14:1905-17(1988)；Sears 等，J.Chem.Ecol.16:791-99(1990)；Ganguli等，Smart Mater.Struct.18:104027(2009)；Cao等，ACS Applied Materials Interfaces 1:494(2009)；Kumar等，Nature Materials 7:236-41(2008))。可将微粒BT化合物并入的油漆包括基于环氧树脂、硅酮或者丙烯酸的油漆。在更加特定的实施方案中，可将微粒BT化合物并入油漆内，将该油漆配制用于海洋用途和暴露于海水中，并且其包括例如基于醇酸树脂、基于地沥青、基于黑沥青的油漆、基于氯化橡胶以及基于环氧树脂的油漆。
通过将试剂并入油漆涂料内可以以受控方式释放抗微生物剂。增强复合材料的药物释放速率的方法是本领域已知的。复合材料可包括天然或合成、生物吸收聚合物基质和本文分散的药物颗粒相(参见，例如，美国专利No.7,419,681和5,028,664；也参见，例如，美国专利申请No.2009/0043388)。例如，药物洗脱油漆涂料组合物可包含分散在改性的生物活性胶结剂中的至少一种微粒BT化合物。
可将微粒BT化合物配制以由包含施加至涂漆面的微粒BT化合物的组合物缓慢释放。也可将微粒BT化合物并入涂料(例如，环氧树脂涂料)内，可将其施加、固定、粘附或者以某种方式使其接触制备的涂覆的结构或物品的表面。可将微粒BT化合物由这些组合物缓慢释放。包含微粒BT化合物的缓释组合物可以为凝胶(例如，水凝胶、硫醇盐聚合物、气凝胶或有机凝胶)或者液体。有机凝胶可以包含有机溶剂、硫辛酸、植物油或矿物油。缓释组合物可递送抗微生物有效量的微粒BT化合物1、2、3、4、5、6或7天(一周)或者2、3、4、5、6、7周或者1、2、3、4、5或6个月。
在本领域中使用以及可与微粒BT化合物一起配制的其它涂料包括多糖，该多糖包括与多价金属阳离子可逆交联的多糖基质(参见，例如，美国专利申请公开No.2009/0202610)；二氧化钛纳米管；纳米结构的表面；具有pH依赖性抗氧化剂性能的生物相容性葡聚糖涂覆的纳米二氧化铈；聚砜嵌段共聚物；以及其它可生物降解的涂料(也参见，例如，美国专利No.6,162,487)。本文所涵盖的其它涂料将微粒BT化合物与工业中使用的抗腐蚀和抗积垢防腐剂涂料一起配制，并且该其它涂料包括作为非限制性实例的巴西棕榈蜡含氟聚合物；PTFE；以及钼(moly)材料。
在油漆或油漆涂料内微粒BT化合物浓度(按重量计)可(例如)低至约0.001％至约0.1％，这取决于油漆或油漆涂料的特定用途和期望性质。可将并入油漆或油漆涂料的微粒BT化合物(或者包含微粒BT化合物的组合物)与至少一种其它抗微生物剂(即，第二、第三、第四等抗微生物剂)组合使用，当组合施用时，其具有如本文所述的增强或协同抗微生物作用。作为非限制性实例，在包含微粒BT化合物的组合物中可包括的抗微生物剂包括：氯己定；血根草提取物；甲硝唑；季铵化合物(例如西吡氯铵)；双胍(例如，葡萄糖酸氯己定、海克替啶、奥替尼啶、阿来西定)；卤代双酚化合物(例如，2,2'亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)或其它苯酚抗菌化合物；烷基羟基苯甲酸酯；阳离子抗微生物肽；氨基糖苷；喹诺酮；林肯酰胺；青霉素；头孢霉素；大环内酯；四环素；本领域内已知的其它抗生素；毛喉鞘蕊花精油；银或胶体银抗菌剂；基于锡或铜的抗菌剂；麦卢卡油；皮萨草；百里香；迷迭香；或其它草药提取物；和葡萄柚籽提取物。组合物也可进一步任选包含表面活性剂、稀释剂或载体、缓冲剂和/或漂白剂，其如上和如本文所述。
包含使用混凝土和水泥化合物配制的微粒铋-硫醇的组合物。某些其它实施方案涵盖将本文所述的微粒BT化合物并入工业水泥中以及在包括混凝土、砂浆和灰浆的涂料的混凝土、砂浆和灰浆之中或之上以用于预防和/或控制(即，减缓、延迟、抑制)生物膜生长、破坏生物膜或者降低在混凝土表面上存在的生物膜的量。在混凝土结构之上或之中生长的微生物降低产品的使用寿命以及可导致对暴露于在混凝土表面上存在的微生物的动物和人的健康危害(参见，例如，Idachaba等，Waste Manag.Res.19:284-91(2001)；Idachaba等，J.Hazard.Mater.90:279-95(2002)；Tazaki,Canadian Mineralogist 30:431-34(1992))。
如本文和本领域所使用，水泥是指用于粘合混凝土的聚集物质的干燥粉末物质(通常也可含有另外物质的石灰石)。本领域所描述的示例性水泥称为普通硅酸盐水泥(Ordinary Portland Cement)、高炉矿渣硅酸盐水泥、圬工水泥、矿渣石灰水泥以及铝酸钙水泥。一旦加入水和/或添加剂，则水泥混合物称为混凝土，特别是如果已经加入集料。混凝土是由集料(例如，砾石和沙子)、水泥和水组成的复合材料。在建筑中使用的水泥的特征在于水硬性或非水硬性。水硬性水泥通常用于在潮湿气候中饰面砖结构建筑物；与海水接触的海港工程等的砖石结构；以及强混凝土的开发。
可将包含微粒BT化合物的本文所述的组合物用于涂覆或者可将该组合物与用于混凝土结构的粘合剂混合，该混凝土结构包括例如桥梁、建筑、管道、高架公路、隧道、存车库、海上油田平台、码头、坝墙、水系统和管线、地板、柜台面、人行道、行车道、装货码头、滑冰场建筑物(skate park structure)以及放射性废物支撑建筑物。可将如本文所述的微粒BT化合物并入如本领域所述的粘合剂内(参见，例如，美国专利No.7,507,281)。粘合剂或混凝土的碱性也可增强微粒BT化合物的抗微生物作用。
通过酸化诸如氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans)的细菌也可降解粘合剂。作为示意和非限制的非限制性实例，显示铋硫醇化合物BisEDT(但不是本文所述的微粒BT化合物)延缓在用于废物和核处理体系的混凝土中氧化硫硫杆菌的生长。显示在混凝土中BisEDT的有效抗细菌范围为10-500μg/g或者0.001-0.05％。更高BisEDT水平干扰混凝土强度。诸如BisPYR的其它化合物可用于抑制通过霉菌和海藻的积垢和生物膜生长。本实施方案涵盖使用该所述微粒BT化合物替代铋硫醇化合物和其它抗微生物物质以提供本文公开的优势，包括一系列抗微生物活性、溶解性和生物利用度、抗生物膜作用、无毒性、抗生素功效的增强以及其它如本文所述的性质。
可将微粒BT化合物手动或自动引入混凝土表面上作为凝胶、喷雾剂、糊剂、液体或粉末或者本领域技术人员已知的其它形式。在特定的实施方案中，将粉末或液体形式的微粒BT化合物与包括至少一种另外的生物活性成分和/或无生物活性赋形剂的至少一种或多种另外的成分混合以配制产品，将该产品定期递送或注入混凝土结构之中或之上(即，暴露于混凝土结构的表面上，特别是暴露于水的表面)。可由本领域技术人员使用多种本领域已知的方法制备组合物。例如，可使用组合DMSO的抗微生物有效量的微粒BT化合物(例如，在DMSO中1mg/ml微粒BT化合物)。对于常规用途，需要足够预防生物膜形成的微粒BT化合物的水平。然而，在其它实施方案中，微粒BT化合物的水平可以更高以用于降低、去除、破坏或者消除存在的存在于混凝土表面上的生物膜。
可将微粒BT化合物配制以由包含施加至混凝土结构的表面的微粒BT化合物的组合物缓慢释放。也可将微粒BT化合物并入涂料(例如，环氧树脂涂料)，可将其施加、固定、粘附或者在一些方式下使其接触混凝土结构的表面。可将微粒BT化合物由这些组合物缓慢释放。包含微粒BT化合物的缓释组合物可以为凝胶(例如，水凝胶、硫醇盐聚合物、气凝胶或有机凝胶)或者液体。有机凝胶可以包含有机溶剂、硫辛酸、植物油或者矿物油。缓释组合物可递送抗微生物有效量的微粒BT化合物1、2、3、4、5、6或7天(一周)或者2、3、4、5、6、7周或者1、2、3、4、5或6个月。
可将微粒BT化合物(或者包含微粒BT化合物的组合物)与至少一种其它抗微生物剂(即，第二、第三、第四等抗微生物剂)组合使用，当组合施用时，其具有如本文所述的增强或协同抗微生物作用。例如，当微粒BT化合物与铁螯合的抗微生物剂一起施用时可观察到增强的抗微生物作用。可将本文所述的微粒BT化合物与包括杀菌剂或杀藻剂的至少一种其它抗微生物剂组合使用。作为非限制性实例，在包含微粒BT化合物的组合物中可包括的抗微生物剂包括：氯己定；血根草提取物；甲硝唑；季铵化合物(例如西吡氯铵)；双胍(例如，葡萄糖酸氯己定、海克替啶、奥替尼啶、阿来西定)；卤代双酚化合物(例如，2,2'亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)或其它苯酚抗菌化合物；烷基羟基苯甲酸酯；阳离子抗微生物肽；氨基糖苷；喹诺酮；林肯酰胺；青霉素；头孢霉素；大环内酯；四环素；本领域内已知的其它抗生素；毛喉鞘蕊花精油；银或胶体银抗菌剂；基于锡或铜的抗菌剂；麦卢卡油；皮萨草；百里香；迷迭香；或其它草药提取物；和葡萄柚籽提取物。组合物也可进一步任选包含表面活性剂、稀释剂或载体、缓冲剂和/或漂白剂，其如上和如本文所述。
可使用经疏水性硫醇(例如，硫代氯苯酚)制备的微粒BT化合物以及该微粒BT化合物可表现出比疏水性BT化合物更好的粘附混凝土表面(特别是暴露于水中那些)的性能。具有净负电荷的BT化合物(例如具有1:2摩尔比(铋：硫醇)的那些)还可具有良好的粘合性。
在橡胶、硅酮和塑料产品中微粒BT。某些实施方案涵盖将本文所述的微粒BT化合物并入人造表面之中或之上，该人造表面包括装配的天然以及合成的橡胶和/或橡胶涂料(包括硅酮和硅酮涂料)，以降低例如在以下装置中的这些橡胶表面的生物膜和生物积垢：医疗装置(例如，导管、支架、弗利导管(Foley catheter)和其它泌尿导管、胃造口术导管、饲管等)；矫形外科装置；牙科装置；工业装置；电子装置；诸如在以下之中或之上出现的表面：所有类型的运载工具，包括汽车、轮胎、门窗框架、软管、皮带、席子、地板和减震器(防震固定件)、铁路、飞机、船舶、船艇、潜艇、桩基、管道、管线、管子和织物、卫生/水器具、家用产品、地板材料、鞋类产品、运动器械、移动电话、计算机设备和使用有机填充物的复合物、户外产品(包括铺舱板、遮篷、柏油布、屋面薄膜以及游泳池胶膜，也包括用于食品和饮料防腐、药物生产以及化学物质和水消毒的消毒产品和体系)。
通过结合本文所述的BT组合物和方法以及制备这类物品的已知制备方法可将本文所述的微粒BT化合物并入这些和其它天然和人造橡胶产品内。作为示意和非限制的非限制性实例，将BT(不是本文所述的微粒BT)并入水凝胶涂覆的聚氨酯棒和涤纶移植片(Domenico等Antimicrob Agents Chemother 2001；45:1417-1421；Domenico等，Peptides2004；25:2047-53)。WO/2002/077095和日本专利申请1997-342076描述含有基于银的化合物的预硫化的和/或硫化的生橡胶制剂以提供抗微生物特征；美国专利No.6,448,306、6,555,599、6,638,993、6,848,871、6,852,782、6,943,205和7,060,739教导在橡胶基质中基于银的抗微生物剂的用途。洗脱药物的硅酮组合物可包含分散在改性的生物活性胶结剂中的抗微生物剂，在未使用惰性聚合物载体下可将该抗微生物剂施加至医疗装置或者其它表面(美国申请公开No.2009/0043388)。
硅酮油通常具有2,000至30,000范围的分子量，其粘度范围为20至1,000厘沲。硅酮橡胶通常具有40,000至100,000范围的分子量，其粘度范围为10至1,000沲。将硅酮用于通常有微生物积垢的各种物质中。这些包括密封胶、填隙料、油脂、油、喷雾、橡胶、软管和植入物。已经描述基于硅酮的抗积垢和其它抗微生物涂料，但其具有功效低、耐久性差、生物相容性差、抗微生物活性丧失、使用寿命短、物质消耗高以及其它问题的相关缺点(例如，Schultz J Fluids Eng 2004；126:1039-47；美国专利4,025,693；Yan和Li.Ophthalmologica2008；222:245-8；美国专利6,221,498；美国专利7,381,751；欧洲专利申请EP0506113；Sawada等JPRAS 1990；43:78-82；Tiller等Surface CoatingsInternational Part B:Coatings Transactions 2005；88:1-82；Juhni和NewbyProceedings Annual Meeting Adhesion Society 2005；28:179-181；Ozdamar等Retina1999；19:122-6；Piccirillo等J Mater Chem 2009；19:6167；美国公开2009/0215924；Bayston等Biomaterials 2009；30:3167-73；Gottenbos等Biomaterials 2002；23:1417-23；Millsap等Antonie Van Leeuwenhoek 2001；79:337-43)。尽管这些公开描述将抗微生物物质并入制备的橡胶制品内的方法，但它们描述的产品或方法中尚无本文所述的微粒BT所提供的优势。
因此，本实施方案涵盖在这些和类似橡胶(包括硅酮)产品和方法以及在塑料和聚合物制备方法(例如以下引用的那些)中本文所述的微粒BT的替代物。在这些和其它已知制备各情况下，基于本文公开可将本文所述的微粒BT并入以替代其它抗微生物剂，从而提供如通过这些微粒BT所提供的本文公开的优势，包括一系列抗微生物活性、溶解性和生物利用度、抗生物膜作用、无毒性、抗生素功效的增强以及其它如本文所述的性质。
可在例如不干扰橡胶制备方法的低浓度下将BT化合物配制为在硅酮产品之中或之上减少生物膜和防止积垢的产品内。在硅酮内微粒BT浓度(按重量计)可例如低至约0.0001％至约0.1％，这取决于硅酮橡胶产品的特定用途和性质。类似地，可将本文所述的微粒BT并入硅酮上或者在硅酮凝胶或油中涂料以在指定时间段内预防或治疗硅酮表面上的生物膜。硅酮橡胶注入孔阀描述在WO/2008/064173中，其定期流出硅酮油，使得本文所述微粒BT的有效抗微生物水平的这些渗出物赋予在含有制备的制品的这些阀门或者类似配置的硅酮橡胶装置上抗生物膜和/或抗积垢能力。易蚀的油通过在阀门临近处任何表面延伸，这在特定时间段内提供可再生的保护来源。可例如将该配置构建在船体的表面下或者暴露于水或湿度的其它表面内。
对于增加在橡胶表面上BT的保留时间，借助特定硫醇部分可选择本文所述的微粒BT以具有更大疏水性，例如通过使用疏水性硫醇(例如，硫代氯苯酚)，其可具有增加的粘合性能和/或通过包括制备具有净负电荷(例如，铋:硫醇的1:2摩尔比)的BT，其也可具有增加的粘合性能。在100℃或者更低的温度下在合适浓度的本文所述微粒BT存在下例如可将硅酮物质组装。在诸如约1-2ppm的阻碍生物膜形成的水平下也可制备可生物蚀解的物质以使这些BT可逐渐释放。在其它实施方案中，预期橡胶和/或塑料组件由物质制造，该物质缓慢洗脱微粒BT化合物以及可将其规则地替换以防在各种工业体系或医疗装置中的生物积垢。
在某些其它实施方案中，以及以在将BT并入橡胶(包括硅酮)项下的以上所述的组合物和方法类似方式，通过结合本文所述BT组合物和方法与这些类型的制备制品已知的制备方法，也可将该所述微粒BT化合物并入这些和其它塑料和聚合产品内。
这些含有微粒BT的塑料产品的非限制性实例包括在以下装置中的塑料和塑料涂料：医疗装置、矫形外科装置、牙科装置、工业装置、电子装置、墙壁、地板、天花板、屋顶，诸如在以下之中或之上出现的表面：所有类型的运载工具，包括汽车、火车、飞机、船舶、船艇、潜艇、桩基、管道、管线和织物、喷头、护发产品、卫生/水器具、家用产品、鞋类产品、运动器械、移动电话、使用有机填充物的复合物、户外产品(包括铺舱板、遮篷、柏油布、屋面薄膜和游泳池胶膜)以及其它产品(包括在食品和饮料防腐以及在药物、化学物质和水消毒中使用的那些)。
自从二十世纪三十年代开始施用现代塑料物质。塑料通常由聚合物并且通常和添加剂一同制备。常见的聚合物包括：合成树脂；苯乙烯；聚烯烃；聚酰胺；含氟聚合物；乙烯类；丙烯酸类；聚氨酯；纤维素塑料；酰亚胺类；缩醛类；聚碳酸酯类；以及聚砜类。为了改善聚合物的物理特征，通常使用诸如增塑剂的添加剂，其用作微生物营养的来源。这些现代增塑剂的实例包括：邻苯二甲酸酯类、己二酸酯类以及其它酯类。这些和其它增塑剂特别容易受到细菌和真菌影响，特别是在高水分区域，导致微生物表面生长和孢子的发育，其可导致在人和动物中一种或多种感染、变态反应、不良气味、染色、塑料脆裂、过早产品故障以及其它不期望的结果。
已经描述通过引入抗积垢和其它抗微生物涂料在制备过程中或者后改性塑料产品，但通常具有有功效差、耐久性差、生物相容性差、丧失抗微生物活性、可使用寿命短、物质消耗高以及其它问题的相关缺点(例如，美国专利No.3,624,062；4,086,297；4,663,077；3,755,224；3,890,270；6,495,613；4,348,308；5,654,330；5,281,677；6,120,790；5,906,825；7,419,681；5,028,664；6,162,487；Markarian,Plastics,Additives andCompounding 2009,11:18-22；EP 927 222 B1；JP 08-157641；CN 1528470 A；Masatoshi等2006；51:18-23；美国公开No.2008/0071229、2009/0202610和2009/0043388)；现有方法均未提供通过本文所述微粒BT提供的优势。然而，如本领域技术人员通常所知，根据以下方法将抗微生物剂并入塑料产品之中或之上以得到最终聚合物：例如(a)在聚合物表面上对试剂的吸收(被动或者通过表面活性剂)；(b)将施加至成型装置的表面上的抗微生物涂料的聚合物引入；(c)将聚合基材的本体相并入；(d)共价结合试剂至聚合物表面；和/或(e)在聚合反应之前将抗微生物剂与形成聚合物(例如，聚氨酯)组分混合。
例如，可将本文所述的微粒BT作为凝胶、喷雾剂、液体或粉末手动或自动引入这些和类似系统。在一个实施方案中，例如，将微粒BT以粉末或液体形式与包括在产品混合物中涉及的活性组分(例如，聚合前体、催化剂、反应引发剂、交联剂等)和赋形剂(例如，载体溶剂、脱模剂、染料或颜料、增塑剂等)的用于塑料制造的成分混合，将其定期注入制造系统。例如，可将在DMSO中1mg/ml的微粒BT溶液或混悬物定期注入形成聚合物反应液体；或者将其喷雾至成型单元的工作部件内以得到在最终产品中所需的抗生物膜浓度。
因此，这些和本文相关的某些所公开的实施方案预期包含于此产物和目前公开的微粒BT组合物的方法中，所述BT组合物可包含一种或多种微粒BT，并且所述BT组合物还可任选地进一步包含抗生素例如本文所述的协同或增强抗生素。
根据如本文所述的某些实施方案，本文所述的组合物和方法对之具有有益作用的细菌的非限制性实例包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌、MRSE(甲氧西林抗性表皮葡萄球菌)、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、铜绿假单胞菌、药物抗性铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、艰难梭状芽胞杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺性军团病杆菌、粪肠球菌、甲氧西林敏感粪肠球菌、阴沟肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、普通变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、弗氏志贺菌、万古霉素抗性肠球菌(VRE)、洋葱伯克霍尔德菌群、土拉弗朗西斯氏菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森氏杆菌、铜绿假单胞菌、万古霉素敏感和万古霉素抗性肠球菌(例如粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)、甲氧西林敏感和甲氧西林抗性葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)和鲍氏不动杆菌、溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、炭疽杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolytica)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、肺炎链球菌、青霉素抗性肺炎链球菌、洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌、耻垢分支杆菌和阴沟肠杆菌。
除非有相反的指示，本发明的某些实施方案的实施将采用本领域技术范围内的微生物学、分子生物学、生物化学、细胞生物学、病毒学和免疫学技术的常规方法，并且为了示例说明，在下文对几种技术进行了引用。此类技术在文献中充分阐释。参见例如Sambrook，等Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等MolecularCloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:A Practical Approach，第I卷和第II卷(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑，1984)；Nucleic AcidHybridization(B.Hames和S.Higgins编辑，1985)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney编辑，1986)；Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)。
除非上下文另有要求，否则本说明书和权利要求书中词语“包括”及其变体形式例如“包含”和“含有”将被解释为开放的、包含性的含义，即为“包括但不限于”。
本说明书对“一个实施方案”或“一种实施方案”或“一个方面”的提及，表示结合所述实施方案描述的具体特征、结构或特点包括在本发明至少一个实施方案中。因此，术语“在一个实施方案中”或“在一种实施方案中”在本说明书不同地方出现时不一定都是指相同的实施方案。而且，具体的特征、结构或特点可以任何适合的方式组合在一个或多个实施方案中。
如上所述，本文所述的某些发明实施方案涉及所描述的BT化合物的农业、工业、制造业和其它制剂(例如，BisEDT和/或BisBAL)，所述制剂在某些实施方案中还可以包括一种或多种本文所述的抗生素化合物，例如阿米卡星、氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、氯霉素、环丙沙星、克林霉素(或另一种林肯酰胺类抗生素)、达托霉素多西环素、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺米诺环素、萘夫西林、巴龙霉素、利福平、磺胺甲噁唑、妥布霉素和万古霉素；或碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、糖肽类抗生素、林肯酰胺类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素和/或氨基青霉素类抗生素和/或氨基糖苷类抗生素，例如阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素、链霉素、妥布霉素或阿泊拉霉素和/或脂肽抗生素例如达托霉素或噁唑烷酮抗生素例如利奈唑胺如本文所公开，当向植物或动物施用或者施加至在其中或其上存在可以为生物膜相关(例如，其中可能存在能够促进生物膜形成的细菌，但尚未检测到生物膜)的细菌感染或者包含诸如生物膜或其它细菌出现的细菌感染的诸如植物、动物、制品的天然或人造表面时，这些和相关制剂可包含在合适载体、赋形剂或稀释剂中的有效量的BT化合物(以及任选一种或多种抗生素)。
通过用于类似用途的试剂施用或并入的接受方式可进行在纯化形式中或者在合适农业、制造业或其它工业组合物中本文所述的BT化合物或它们的盐的施用或者并入。在优选的实施方案中，组合物的应用、并入或者施用包括使组合物与可以在一种或多种位于或广泛分布在表面位置处的受试者植物或动物或者经处理的制品直接接触，以及其可通常是指使局部直接与急性或慢性感染位置(例如，在植物表面上伤口位置)接触，该急性或慢性感染周围为完整组织，但不需要进行限制；例如，某些实施方案涵盖向受伤、擦伤或受损天然或人造表面局部应用本文所述局部制剂。
通过合并所述BT化合物(例如，包含在U.S.RE37,793、U.S.6,248,371、U.S.6,086,921和/或U.S.6,380,248中所述化合物和/或根据本公开制备的化合物，例如本文所述微粒BT混悬物)以及在如本文所述的某些相关实施方案中，通过合并单独或者组合BT化合物的一种或多种所需抗生素(例如，诸如阿米卡星的氨基糖苷类抗生素)与如可依据特定用途制备制剂使用的合适的媒介物、分散剂、载体、稀释剂或赋形剂可制备制剂(例如，农业组合物)，并且可将其制备为固体、半固体、凝胶、乳剂、胶体、混悬剂或液体或者其它局部应用形式的制剂，例如粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、洗剂、凝胶剂、糊剂、硬膏剂、涂剂、生物粘附剂、微球混悬剂和气雾剂喷雾剂。
将这些和相关实施方案的组合物配制以使得活性成分包含在其中，并且在特别优选的实施方案中，单独或组合一种或多种所需抗生素(例如，碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、糖肽类抗生素、林肯酰胺类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素和氨基青霉素类抗生素或氨基糖苷类抗生素，例如阿米卡星或利福霉素)使用本文所述的BT化合物，可将其同时或依次且以任何顺序施用，从而一旦施用包含BT化合物和/或抗生素组合物的制剂至所需位置以及任选至植物或动物(包括人)受试者或者制品的天然或人造表面时可生物利用。本文所公开的某些实施方案涵盖施用和/或并入这些受试者或者BT化合物和抗生素的制品内，包括可以同时或依次且以任何顺序的施用，但是本发明不是意图被如此限制，并且在其它实施方案中明确预期相对于抗生素的施用途径不同的BT化合物施用途径。因此，通过如本文所述的任何施用途径可施用抗生素，但通过独立于抗生素使用途径的途径可施用BT化合物。
本文所述制剂递送有效量的防腐剂(以及任选抗生素)至所需位置，例如感染位置或者需要预防感染或生物膜形成的位置。
如上所述，本局部制剂可以采用多种形式的任何一种，并且包括例如液体、混悬剂、硬膏剂、乳膏剂、洗剂、溶液、喷雾剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂等，和/或可以制备为含有脂质体、胶束和/或微球。参见例如美国专利No.7,205,003。例如，如药物制剂和药用化妆品制剂领域所熟知，乳膏剂是水包油或油包水的粘性液体或半固体乳剂。乳膏剂基质是可水洗的，并且含有油相、乳化剂和水相。油相亦称为“内”相，一般由矿脂和脂肪醇例如鲸蜡醇或十八烷醇构成。水相通常但不必须超过油相的体积，并且一般含有增湿剂。乳膏剂制剂中的乳化剂一般是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。
溶液是通过将一种或多种化学物质(溶质)溶解于液体使得溶解的物质分散于溶剂中而制备的均匀混合物。溶液可含有其它化学物质以缓冲、稳定或保存溶质。制备溶液时使用的溶剂的常见实例有乙醇、水、丙二醇或任何其它媒介物。
凝胶是半固体、混悬液类型的系统。单相凝胶含有基本上均匀分布于载体液体中的有机大分子，所述载体液体通常是水性的，但也优选含有醇和任选油。优选的“有机大分子”即胶凝剂，可以是化学交联的聚合物，例如交联的丙烯酸聚合物，例如“卡波姆”家族聚合物，例如羧基聚亚烷基，它可通过商购以商标获得。在某些实施方案中还可以优选亲水性聚合物，例如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和甲基纤维素；树胶，例如黄蓍胶和黄原胶；藻酸钠；以及明胶。为了制备均匀凝胶，可以添加分散剂例如乙醇或甘油，或者胶凝剂可以通过研磨、机械混合或搅拌或其组合来分散。
如本领域所熟知，软膏剂是半固体制剂，通常基于矿脂或其它石油衍生物。本领域技术人员应理解，要使用的具体软膏剂是一种提供许多所需特征(例如软化性等)的软膏剂。与其它载体或媒介物一样，软膏剂基质应该是惰性的、稳定的、非刺激性的和非致敏的。如在Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第19版.(Easton，Pa.:MackPublishing Co.，1995)，第1399-1404页中所解释，软膏剂基质可以分成四类：油性基质；可乳化基质；乳剂基质；以及水溶性基质。油性软膏剂基质包括例如植物油、获自动物的脂肪和获自石油的半固体烃。可乳化软膏剂基质亦称为吸收性软膏剂基质，含有很少水或不含水，并且包括例如羟基硬脂精硫酸盐(hydroxystearin sulfate)、无水羊毛脂和亲水性矿脂。乳剂软膏剂基质是油包水(W/O)乳剂或水包油(O/W)乳剂，并且包括例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性乳膏基质由不同分子量的聚乙二醇制备(参见，例如Remington，Id.)。
糊剂是半固体剂型，其中活性物质悬浮于适当基质中。根据基质性质，糊剂被分成脂肪糊剂或由单相水凝胶制成的糊剂。脂肪糊剂中的基质一般是矿脂或亲水性矿脂等。由单相水凝胶制成的糊剂一般加入羧甲基纤维素等作为基质。
制剂还可以用脂质体、胶束和微球制备。脂质体是具有一个(单层)或多个(多层)包括脂质双层的脂质壁的微球小囊，并且在本环境中可以包封和/或吸附本文所述的制剂的一种或多种组分至其脂质膜表面，所述组分例如抗生素或某些载体或赋形剂。本文的脂质体制剂包括阳性(带正电荷)、阴性(带负电荷)和中性制剂。阳性脂质体是容易获得的。例如，N[1-2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三乙基铵(DOTMA)脂质体可以商品名(GIBCO BRL，Grand Island，N.Y.)获得。类似地，阴离子和中性脂质体也容易从例如Avanti Polar Lipids(Birmingham，AL)获得，或者可以容易地使用容易获得的材料制备。这种材料包括磷脂酰胆碱、胆甾醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。这些材料还可以与DOTMA以适当比例混合。使用这些材料制备脂质体的方法是本领域熟知的。
胶束在本领域已知为包括被排列使得其极性头基形成外部球壳而疏水性烃链朝向球中心(形成核心)的表面活性剂分子。胶束在含有高浓度表面活性剂使得胶束天然产生的水溶液中形成。用于形成胶束的表面活性剂包括但不限于月桂酸钾、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠、十二烷磺酸钠、月桂基硫酸钠、多库酯钠、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十二烷基氯化铵、聚乙二醇-8十二烷基醚、聚乙二醇-12十二烷基醚、壬苯醇醚10和壬苯醇醚30。
类似地，微球可以加入本文所述的局部制剂中。与脂质体和胶束一样，微球基本上包封了本发明制剂的一种或多种组分。它们一般但不一定由脂质、优选带电脂质例如磷脂形成。脂质微球的制备是本领域熟知的。
本领域技术人员已知的各种添加剂也可以包括在制剂中。例如，溶剂(包括相对小量的醇)可用于增溶某些制剂组分。适当的促进剂的实例包括但不限于醚，例如二乙二醇单乙醚(可以经商购获得)和二乙二醇单甲醚；表面活性剂例如月桂酸钠、月桂基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、(231、182、184)、(20，40，60，80)和卵磷脂(美国专利第4,783,450号)；醇，例如乙醇、丙醇、辛醇、苄醇等；聚乙二醇及其酯，例如聚乙二醇单月桂酸酯(PEGML；参见例如，美国专利No.4,568,343)；酰胺和其它含氮化合物，例如脲、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、2-吡咯烷酮、1-甲基-2-吡咯烷酮、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；萜；烷基酮；和有机酸，特别是柠檬酸和琥珀酸。还可以使用和亚砜，例如DMSO和C10MSO，但较不优选。
某些皮肤渗透促进剂可包括通常被称为“增塑(plasticizing)”促进剂的那些亲脂性辅助促进剂(coenhancer)，即，具有约150至1000道尔顿范围的分子量、小于约1wt％、优选小于约0.5wt％且最优选小于约0.2wt％的水溶解度的促进剂。增塑促进剂的Hildebrand溶解度参数范围约2.5至约10、优选范围约5至约10。优选的亲脂性促进剂是脂肪酯、脂肪醇和脂肪醚。具体且最优选的脂肪酸酯的实例包括月桂酸甲酯、油酸乙酯、丙二醇单月桂酸酯、丙二醇二月桂酸酯、甘油单月桂酸酯、甘油单油酸酯、正癸酸异丙酯和肉豆蔻酸辛基十二醇酯。脂肪醇包括例如十八烷醇和油醇，而脂肪醚包括其中二醇或三醇、优选C2-C4烷二醇或三醇被一个或两个脂肪醚取代基取代的化合物。其它皮肤渗透促进剂是局部药物递送领域技术人员已知的，和/或描述于相关文献中。参见例如PercutaneousPenetration Enhancers编辑。Smith等(CRC Press，Boca Raton，FL，1995)。
除了上面确定的那些，各种其它添加剂可以包括在根据本发明的某些实施方案的局部制剂中。这些包括但不限于抗氧化剂、收敛剂、香料、防腐剂、软化剂、颜料、染料、增湿剂、推进剂和防晒剂以及其存在可以是美容上、医学上或其它方面需要的其它材料类别。包括在本发明的某些实施方案的制剂的任选的添加剂的典型实例如下：防腐剂，例如山梨酸酯；溶剂，例如异丙醇和丙二醇；收敛剂，例如甲醇和乙醇；软化剂，例如聚亚烷基甲基葡糖苷；增湿剂，例如甘油；乳化剂，例如硬脂酸甘油酯、PEG-100硬脂酸酯、聚甘油-3羟基月桂基醚和聚山梨酯60；山梨糖醇和其它多羟基醇例如聚乙二醇；防晒剂，例如甲氧基肉桂酸辛酯(可作为Parsol MCX经商购获得)和丁基甲氧基苯甲酰甲烷(可以商品名Parsol 1789获得)；抗氧化剂，例如抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、ε-生育酚、ζ1-生育酚、ζ2-生育酚、η-生育酚和视黄醇(维生素A)；精油、神经酰胺、必需脂肪酸、矿物油、润湿剂和其它表面活性剂，例如可获自BASF(Mt.Olive，NJ)的系列的亲水性聚合物、植物油(例如，大豆油、棕榈油、乳木果油的液体级分、葵花油)、动物油(例如，全氢化角鲨烯)、矿物油、合成油、硅油或蜡(例如，环甲硅油和二甲硅油)、氟化油(一般是全氟聚醚)、脂肪醇(例如，鲸蜡醇)和蜡(例如，蜂蜡、巴西棕榈蜡和石蜡)；皮肤感觉调节剂；以及增稠剂和结构剂(structurants)，例如膨胀性粘土和交联羧基聚亚烷基(carboxypolyalkylene)，可以商标经商购获得。
其它添加剂包括例如吡咯烷羧酸和氨基酸；有机抗微生物剂，例如2,4,4'-三氯-2-羟基二苯醚(三氯生)和苯甲酸；抗炎剂，例如乙酰水杨酸和甘草亭酸；抗皮脂溢剂，例如视黄酸；血管扩张剂，例如烟酸；黑素生成抑制剂，例如曲酸；及其混合物。可以存在其它有利地包括的活性剂，例如α-羟酸、α-酮酸、多聚羟酸、增湿剂、胶原、海洋提取物和抗氧化剂，例如抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)或其它生育酚，例如上述那些，和视黄醇(维生素A)和/或其合适的盐、酯、酰胺或其它衍生物。其它试剂包括能够提高活组织中氧供给的那些，例如WO 94/00098和WO 94/00109中所述。还可以包括防晒剂。
本发明的某些实施方案的制剂还可以包括常规添加剂，例如遮光剂、芳香剂、着色剂、胶凝剂、增稠剂、稳定剂、表面活性剂等。还可以添加其它物质，例如抗微生物剂，以预防贮藏时变质，即，抑制微生物例如酵母和霉菌的生长。适合的抗微生物剂通常选自对羟基苯甲酸的甲酯和丙酯(例如，羟苯甲酸甲酯和丙酯)、苯甲酸钠、山梨酸、咪脲(imidurea)及其组合。
除了BT化合物(例如，优选为本文提供的基本上均匀的微粒，任选与一种或多种本文所述的协同抗生素组合)之外，局部制剂也可含有适合特定施用或并入方式的有效量的一种或多种另外的活性剂。
药理学上可接受的载体也可以加入某些本发明的实施方案的局部制剂中，并且可以是本领域常规使用的任何载体。实例包括水、低级醇、高级醇、蜂蜜、多羟基醇、单糖、二糖、多糖、糖醇，例如二醇(2-碳)、三醇(3-碳)、赤藓糖醇和苏糖醇(4-碳)、阿糖醇、木糖醇和核糖醇(5-碳)、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇和艾杜糖醇(6-碳)、异麦芽酚、麦芽糖醇、乳糖醇和多糖醇、烃油、脂肪和油、蜡、脂肪酸、硅油、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、硅酮表面活性剂以及此类载体的基于水的混合物和基于乳剂的混合物。
可将本发明的局部制剂实施方案常规施加至任何天然(例如，植物或动物，包括人)或者人造(例如，制品)表面，这些表面需要达到期望结果必要的频率和量来治疗。在特定的实施方案中，治疗频率取决于应用的性质、活性成分的强度(例如，BT化合物和任选一种或多种另外的活性成分，例如抗生素，例如，阿米卡星或其它抗生素)、用于递送活性成分的媒介物的效力以及通过环境因素(例如，与其它物质或物体的物理接触、沉淀、风、温度)去除制剂的容易程度。
例如本文所述的组合物中诸如BT化合物的活性物质的典型浓度范围可以是例如组合物总重量的约0.001-30％重量至约0.01-5.0％并且更优选至约0.1-2.0％。作为一个代表性实例，本发明这些实施方案的组合物可以等于约1.0mg/cm2至约20.0mg/cm2的速率施加至天然或人造表面。局部制剂的代表性实例包括但不限于气雾剂、醇、无水基质(例如唇膏和粉末)、水溶液、乳膏剂、乳剂(包括油包水或水包油乳剂)、脂肪、泡沫剂、凝胶剂、水醇溶液、脂质体、洗剂、微乳剂、软膏剂、油、有机溶剂、多元醇、聚合物、粉末、盐、硅酮衍生物和蜡。制剂可以包括例如螯合剂、调理剂、软化剂、赋形剂、增湿剂、保护剂、增稠剂或UV吸收剂。本领域技术人员应理解，不同于所列那些的制剂可用于本发明的实施方案中。
螯合剂可任选包括在某些制剂中，并且可以选自适用于有能力结合二价阳离子金属例如Ca2+、Mn2+或Mg2+的任何天然或合成化学品。螯合剂的实例包括但不限于EDTA、EDTA二钠、EGTA、柠檬酸和二羧酸。
调理剂也可以任选地包括在某些制剂中。皮肤调理剂的实例包括但不限于乙酰半胱氨酸、N-乙酰二氢神经鞘氨醇、丙烯酸酯/丙烯酸山萮酯/聚二甲基硅氧烷丙烯酸酯共聚物、腺苷、环腺苷磷酸、腺苷磷酸、腺苷三磷酸、丙氨酸、白蛋白、海藻提取物、尿囊素和衍生物、库拉索芦荟提取物、PCA铝(aluminum PCA)、淀粉葡萄糖苷酶、熊果苷、精氨酸、甘菊环、菠萝蛋白酶、酪乳粉、丁二醇、咖啡因、葡萄糖酸钙、辣椒碱、羟甲半胱氨酸、肌肽、β-胡萝卜素、酪蛋白、过氧化氢酶、脑磷脂、神经酰胺、洋甘菊(chamomilla recutita)花提取物、胆钙化甾醇、胆甾醇酯、椰油基-甜菜碱、辅酶A、改性玉米淀粉、晶体蛋白、环乙氧基聚甲基硅氧烷、半胱氨酸DNA、细胞色素C、豨莶苷(darutoside)、葡聚糖硫酸酯、聚二甲基硅氧烷共聚醇、二甲基硅烷醇透明质酸酯、DNA、弹性蛋白、弹性蛋白氨基酸、表皮生长因子、麦角钙化甾醇、麦角甾醇、PCA乙基己酯、纤连蛋白、叶酸、明胶、麦醇溶蛋白、β-葡聚糖、葡萄糖、甘氨酸、糖原、糖脂、糖蛋白、糖胺聚糖、糖鞘脂、辣根过氧化物酶、氢化蛋白、水解蛋白、霍霍巴油、角蛋白、角蛋白氨基酸和激动素、乳铁蛋白、羊毛甾醇、PCA月桂酯、卵磷脂、亚油酸、亚麻酸、脂肪酶、赖氨酸、溶菌酶、麦芽膏、麦芽糖糊精、黑素、蛋氨酸、矿盐、烟酸、烟酰胺、燕麦氨基酸、谷维素、棕榈酰水解蛋白、胰酶、木瓜蛋白酶、PEG、胃蛋白酶、磷脂、植物甾醇、胎盘酶、胎盘脂质、吡哆醛5-磷酸酯、五羟黄酮、间苯二酚乙酸酯(resorcinol acetate)、核黄素、RNA、酵母菌溶胞产物提取物、丝氨基酸、鞘脂、硬脂酰氨基丙基甜菜碱、硬脂酰棕榈酸酯、生育酚、生育酚乙酸酯、生育酚亚油酸酯、泛醌、葡萄(vitis vinifera)子油、小麦氨基酸、黄原酸胶和葡萄糖酸锌。如本领域技术人员可以容易地理解，不同于上列那些的调理剂可以与公开的组合物或由其提供的制剂组合。
在某些实施方案中，本文所述制剂还可以任选包括一种或多种软化剂，其实例包括但不限于：乙酰羊毛脂、乙酰羊毛脂醇、丙烯酸酯/C10-30烷基丙烯酸酯交联聚合物、丙烯酸酯共聚物、丙氨酸、海藻提取物、库拉索芦荟提取物或凝胶、药蜀葵提取物、辛烯基琥珀酸淀粉酯、硬脂酸铝、杏(prunus armeniaca)仁油、精氨酸、天冬氨酸精氨酸、山金车提取物、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、天冬氨酸、酪梨(persea gratissima)油、硫酸钡、屏障鞘脂(barrier sphingolipid)、丁醇、蜂蜡、山萮醇、β-谷甾醇、BHT、桦木(白桦)树皮提取物、玻璃苣(borago officinalis)提取物、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、假叶树(ruscusaculeatus)提取物、丁二醇、金盏菊提取物、金盏菊油、蜡大戟(euphorbia cerifera)蜡、低芥酸菜子油、辛酸/癸酸三甘油酯、小豆蔻(elettaria cardamomum)油、巴西棕榈(copernicia cerifera)蜡、角叉菜胶(chondrus crispus)、胡萝卜(daucus carotasativa)油、蓖麻(ricinus communis)油、神经酰胺、地蜡、鲸蜡硬脂醇聚醚-5、鲸蜡硬脂醇聚醚-12、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、鲸蜡硬脂醇辛酸酯、鲸蜡醇聚醚-20、鲸蜡醇聚醚-24、鲸蜡醇乙酸酯、鲸蜡醇辛酸酯、鲸蜡醇棕榈酸酯、白花春黄菊(anthemis nobilis)油、胆甾醇、胆甾醇酯、胆甾醇羟基硬脂酸酯、柠檬酸、南欧丹参(salvia sclarea)油、可可(theobromacacao)脂、椰油基-辛酸酯/癸酸酯、椰子(cocos nucifera)油、胶原、胶原氨基酸、玉米(zeamays)油、脂肪酸、油酸癸酯、糊精、二偶氮利定脲(diazolidinyl urea)、聚二甲基硅氧烷共聚醇、聚二甲基硅氧烷醇、己二酸二辛酯、琥珀酸二辛酯、二聚季戊四醇六辛酸酯/六癸酸酯、DMDM乙内酰脲、DNA、赤藓糖醇、乙氧基二乙二醇、亚油酸乙酯、蓝桉油、月见草(Oenothera biennis)油、脂肪酸、tructose、明胶、斑点老鹳草油、葡糖胺、葡糖谷氨酸酯、谷氨酸、甘油聚醚-26、甘油、丙三醇、二硬脂酸甘油酯、羟基硬脂酸甘油酯、月桂酸甘油酯、亚油酸甘油酯、肉豆蔻酸甘油酯、油酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯SE、甘氨酸、硬脂酸乙二醇酯、硬脂酸乙二醇酯SE、糖胺聚糖、葡萄(vitis vinifera)子油、榛子(corylusamericana)油、榛子(corylus avellana)坚果油、己二醇、蜂蜜、透明质酸、红花(carthamustinctohus)油、氢化蓖麻油、氢化椰油酸甘油酯、氢化椰子油、氢化羊毛脂、氢化卵磷脂、氢化棕榈酸甘油酯、氢化棕榈仁油、氢化豆油、氢化牛脂酸甘油酯、氢化植物油、水解胶原、水解弹性蛋白、水解糖胺聚糖、水解角蛋白、水解大豆蛋白、羟基化羊毛脂、羟基脯氨酸、咪唑烷基脲、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、异鲸蜡醇硬脂酸酯、异鲸蜡醇硬脂酰硬脂酸酯、油酸异癸酯、异硬脂酸异丙酯、羊毛脂酸异丙酯、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、异硬脂酰胺DEA、异硬脂酸、乳酸异硬脂酸酯、新戊酸异硬脂酸酯、茉莉(jasminum officinale)油、霍霍巴(buxus chinensis)油、海草、石栗(aleurites moluccana)油、乳酰胺MEA、羊毛脂醇聚醚-16、羊毛脂醇聚醚-10乙酸酯、羊毛脂、羊毛脂酸、羊毛脂醇、羊毛脂油、羊毛脂蜡、薰衣草(lavandula angustifolia)油、卵磷脂、柠檬(citrus medica limonum)油、亚油酸、亚麻酸、澳洲坚果油、硬脂酸镁、硫酸镁、麦芽糖醇、洋甘菊(chamomilla recutita)油、甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、甲基硅烷醇PCA酯、微晶蜡、矿物油、貂油、被孢霉油、乳酸肉豆蔻酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、丙酸肉豆蔻酯、新戊二醇二辛酸酯/二癸酸酯、辛基十二烷醇、肉豆蔻酸辛基十二酯、硬脂酰硬脂酸辛基十二酯、羟基硬脂酸酯辛酯、棕榈酸辛酯、水杨酸辛酯、硬脂酸辛酯、油酸、橄榄(olea europaea)油、柑橘(citrus aurantium dulcis)油、棕榈(oleaeuropaea)油、棕榈酸、泛硫乙胺、泛醇、泛醇基乙基醚、石蜡、PCA、桃(prunus persica)仁油、花生(arachis hypogaea)油、PEG-8C12 18酯、PEG-15椰油胺、PEG-150二硬脂酸酯、PEG-60异硬脂酸甘油酯、PEG-5硬脂酸甘油酯、PEG-30硬脂酸甘油酯、PEG-7氢化蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、PEG-40失水山梨糖醇全油酸酯、PEG-5大豆甾醇、PEG-10大豆甾醇、PEG-2硬脂酸酯、PEG-8硬脂酸酯、PEG-20硬脂酸酯、PEG-32硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-50硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-150硬脂酸酯、十五酸内酯、薄荷(mentha piperita)油、矿脂、磷脂、多氨基糖缩合物、聚甘油-3二异硬脂酸酯、聚季铵盐-24、聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80、聚山梨酯85、豆蔻酸钾、棕榈酸钾、山梨酸钾、硬脂酸钾、丙二醇、丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯、丙二醇二辛酸酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇月桂酸酯、丙二醇硬脂酸酯、丙二醇硬脂酸酯SE、PVP、吡哆素二棕榈酸酯、季铵盐-15、季铵盐-18锂蒙脱石、季铵盐-22、视黄醇、棕榈酸视黄醇酯、稻(oryzasativa)米糠油、RNA、迷迭香(rosmarinus officinalis)油、玫瑰油、红花(carthamustinctorius)油、鼠尾草(salvia officinalis)油、水杨酸、檀香(santalum album)油、丝氨酸、血清蛋白、芝麻(sesamum indicum)油、乳木果油(牛油树)、丝粉、硫酸软骨素钠、DNA钠、透明质酸钠、乳酸钠、棕榈酸钠、PCA钠、聚谷氨酸钠、硬脂酸钠、可溶性胶原、山梨酸、失水山梨糖醇月桂酸酯、失水山梨糖醇油酸酯、失水山梨糖醇棕榈酸酯、失水山梨糖醇倍半硬脂酸酯、失水山梨糖醇硬脂酸酯、山梨糖醇、大豆(glycine soja)油、鞘脂、角鲨烷、角鲨烯、硬脂酰胺MEA-硬脂酸酯、硬脂酸、硬脂氧基聚二甲基硅氧烷、硬脂氧基三甲基硅烷、十八烷醇、硬脂基甘草亭酸酯、硬脂酰庚酸酯、硬脂酰硬脂酸酯、葵花(helianthus annuus)子油、甜扁桃(prunus amygdalus dulcis)油、合成蜂蜡、生育酚、生育酚乙酸酯、生育酚亚油酸酯、三山萮精、新戊酸十三烷基酯、硬脂酸十三烷基酯、三乙醇胺、三硬脂精、脲、植物油、水、蜡、小麦(triticum vulgare)胚油和依兰(cananga odorata)油。
表面活性剂也期望被包括在本文预期的某些制剂中，并且可以选自适用于化妆品组合物的任何天然或合成的表面活性剂，例如阳离子、阴离子、两性离子、非离子表面活性剂或其混合物。(参见Rosen，M.，"Surfactants and lnterfacial Phenomena"第二版，JohnWiley&Sons，New York，1988，第1章，第4 31页)。阳离子型表面活性剂的实例包括但不限于DMDAO或其它氧化胺、长链伯胺、二胺和多胺及其盐、季铵盐、聚氧乙烯化长链胺和季铵化聚氧乙烯化长链胺。阴离子型表面活性剂的实例包括但不限于SDS；羧酸盐(例如，皂)；磺酸盐、硫酸盐、磷酸酯和多磷酸酯；烷基磷酸酯；单烷基磷酸酯(MAP)；和全氟羧酸盐。两性离子表面活性剂的实例包括但不限于椰油酰胺丙基羟磺基甜菜碱(CAPHS)和是pH敏感的并且在设计制剂的适当pH中需要特别小心的其它物质(即，烷基氨基丙酸、咪唑啉羧酸酯和甜菜碱)或不是pH敏感的那些物质(例如，磺基甜菜碱(sultaine))。非离子洗涤剂的实例包括但不限于烷基酚乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、聚氧乙烯化聚氧丙二醇、聚氧乙烯化硫醇、长链羧酸酯、烷醇酰胺、叔炔二醇(tertiary acetylenic glycol)、聚氧乙烯化硅酮、N-烷基吡咯烷酮和烷基多糖苷。例如并根据非限制性理论，还可以包括润湿剂、矿物油或其它表面活性剂，例如非离子去污剂或例如系列(BASF，Mt.Olive，NJ)的一个或多个成员的物质，以减少微粒悬浮液中BT微粒的聚集。任何表面活性组合是可接受的。某些实施方案可以包括至少一种阴离子型表面活性剂和一种阳离子型表面活性剂，或者至少一种阳离子型表面活性剂和一种两性表面活性剂，它们是相容的，即当混合时不形成明显沉淀的复合物。
还可以存在于某些局部制剂中的增稠剂的实例包括但不限于丙烯酰胺共聚物、琼脂糖、支链淀粉、膨润土、藻酸钙、羧甲基纤维素钙、卡波姆、羧甲基甲壳素、羧甲基纤维素(cellulose gum)、糊精、明胶、氢化牛脂、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、海藻酸镁、甲基纤维素、微晶纤维素、果胶、各种PEG’s、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯醇、各种PPG’s、丙烯酸钠共聚物、角叉菜聚糖钠、黄原酸胶和酵母β-葡聚糖。不同于上列那些的增稠剂也可用于本发明的实施方案中。
根据本文预期的某些实施方案，BT制剂可以包括一种或多种防晒剂或UV吸收剂。当需要紫外线-(UVA和UVB)吸收性质时，这样的物质可以包括例如二苯甲酮、二苯甲酮-1、二苯甲酮-2、二苯甲酮-3、二苯甲酮-4、二苯甲酮-5、二苯甲酮-6、二苯甲酮-7、二苯甲酮-8、二苯甲酮-9、二苯甲酮-10、二苯甲酮-11、二苯甲酮-12、水杨酸苄酯、PABA丁酯、肉桂酸酯、西诺沙酯、DEA-甲氧基肉桂酸酯、二异丙基肉桂酸甲酯、二羟丙基PABA乙酯、二异丙基肉桂酸乙酯、甲氧基肉桂酸乙酯、乙基PABA、尿刊酸乙酯、辛酸二甲氧基肉桂酸甘油酯(glyceryloctanoate dimethoxycinnamate)、PABA甘油酯、乙二醇水杨酸酯、胡莫柳酯、异丙苄醇水杨酸酯、钛、锌、锆、硅、锰和铈的氧化物、PABA、PABA酯、Parsol 1789和异丙基苄基水杨酸酯，及其混合物。本领域技术人员应理解，不同于上列那些的防晒剂和UV吸收剂或防护剂可用于本发明的某些实施方案中。
本文公开的BT制剂通常在约2.5至约10.0的pH值之间有效。优选地，组合物的pH在或下述pH范围或附近：约pH 5.5至约pH 8.5、约pH 5至约pH 10、约pH 5至约pH 9、约pH 5至约pH 8、约pH 3至约pH 10、约pH 3至约pH 9、约pH 3至约pH 8和约pH 3至约pH 8.5。最优选地，pH是约pH 7至约pH 8。本领域普通技术人员可以添加适当的pH调节成分至本发明组合物以调节pH至可接受的范围。“约”指定的pH被本领域技术人员理解为包括其中在任何给定时间实际测量的pH可能小于或大于指定值不超过0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1pH单位的制剂，其中认为制剂组成和贮藏条件可以导致pH与原始值的偏离。
乳膏剂、洗剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂等可以涂抹在受影响的表面并且轻轻地用力擦入。溶液可以相同方式应用，但更通常用滴管、拭子等应用，并且小心应用至受影响的区域。应用方案取决于可以容易确定的许多因素，例如感染严重度及其对最初治疗的应答性。普通技术人员可以容易确定待施用的制剂的最佳量，施用方法学和重复速率。一般而言，考虑本发明的这些和相关实施方案的制剂将以每周一次或两次或更多次至每天一次、两次、三次、四次或更多次的范围应用。
因此，如上文所讨论，本文所用的BT制剂还可包含可接受的载体，包括任何适合的稀释剂或赋形剂，其包括本身对接受组合物的受试者(例如，植物或动物，包括人)或制品无害并且可以无过度毒性施用的任何药剂。可接受的载体可包括但不限于液体，例如水、盐水、甘油和乙醇等，并且还可以包括增粘剂(例如香脂冷杉树脂)或成膜剂例如胶体或硝酸纤维素溶液。药学上可接受的载体、稀释剂和其它赋形剂的详细讨论参见REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.现行版本)。
BT制剂可包括结合BT化合物的试剂以及从而辅助其递送至或保留在受试者或制品上期望位置处。可以起这种作用的适合的试剂包括包合剂，例如环糊精；其它物质可以包括蛋白或脂质体。
将BT制剂以有效量施用、应用或者合并，该有效量取决于各种因素，包括递送位置(其中相关处)的性质；采用的特异性BT化合物(包括制剂中包含或不含抗生素，例如氨基糖苷类抗生素，例如阿米卡星)的活性；化合物的代谢稳定性和作用长度；(植物或动物，包括人)受试者或制品的条件；施用的方式和时间；在受试者或制品上进行的活性的普通过程中BT化合物消耗速率；以及其它因素。一般而言，治疗有效的日剂量是(对于70kg哺乳动物)从约0.001mg/kg(即0.07mg)至约100mg/kg(即7.0g)；优选地，治疗有效剂量是(对于70kg哺乳动物)从约0.01mg/kg(即7mg)至约50mg/kg(即3.5g)；更优选地，治疗有效剂量是(对于70kg哺乳动物)从约1mg/kg(即70mg)至约25mg/kg(即1.75g)。预期植物的有效剂量低约10、20、50或75％或更低。
本文提供的有效剂量范围并非意图限制性的和代表优选的剂量范围。然而，最优选的剂量将根据个体受试者而制定，这是相关领域技术人员所理解和可确定的(参见，例如，Berkow等编辑，The Merck Manual，第16版，Merck and Co.，Rahway,N.J.，1992；Goodman等编辑，Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版，Pergamon Press，Inc.，Elmsford,N.Y.(2001)；Avery’s Drug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics，第3版，ADISPress，Ltd.，Williams和Wilkins，Baltimore，MD.(1987)；Ebadi，Pharmacology,Little,Brown and Co.，Boston(1985)；Osolci a1.编辑，Remington's PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Publishing Co.，Easton,PA(1990)；Katzung,Basic andClinical Pharmacology,Appleton and Lange，Norwalk,CT(1992))。
如果需要，每种治疗所需的总剂量可以通过经一天时间的多剂量或单剂量施用。某些优选的实施方案预期每天、每周、每10天、每14天或每更长时间段单次应用BT制剂。一般而言，在不同实施方案中，治疗可以由低于化合物最佳剂量的较小剂量开始。此后，剂量被小幅度增加，直至在所述环境下达到最佳效果。
用于保护植物和农业产品的铋-硫醇
本文公开的某些实施方案涉及用于保护植物和花抵抗包括生物膜的微生物感染和侵染的组合物和方法，从而降低枯萎和增加产品寿命。
根据本文所述的某些实施方案，包括以上所概述的那些，提供用于保护植物抵抗细菌、真菌或病毒病原体的方法，该方法包括在足以满足以下一种或多种的条件和时间下，使植物与有效量的BT组合物接触：(i)预防植物被细菌、真菌或病毒病原体感染，(ii)抑制细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，(iii)抑制由细菌、真菌或病毒病原体的生物膜形成，以及(iv)抑制细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，其中BT组合物包含含有BT化合物的微粒的基本上单分散混悬物，所述微粒具有约0.5μm至约10μm的体积平均直径。
在某些实施方案中，细菌病原体包含梨火疫病菌细胞以及在某些实施方案中，细菌病原体选自：梨火疫病菌、野油菜黄单胞菌花叶万年青致病变种、丁香假单胞菌、苛养木杆菌、葡萄木友菌、桃褐腐病菌、玉米细菌性枯萎病菌、青枯雷尔氏菌以及马铃薯环腐病菌。在某些实施方案中，细菌病原体表现出抗生素抗性以及在某些其它实施方案中，细菌病原体表现出链霉素抗性。在某些实施方案中，植物是食物作物，在某些进一步的实施方案中，食物作物是果树，在某些又进一步的实施方案中，果树选自：苹果树、梨树、桃树、油桃树、李树和杏树。在某些实施方案中，食物作物是芭蕉属的香蕉树。在某些其它实施方案中，食物作物是选自块茎类植物、豆科植物和禾本科谷类植物的植物。在某些进一步的实施方案中，块茎类植物选自马铃薯(土豆)和番薯(甘薯)。
在某些实施方案中，接触步骤进行一次或多次。在某些实施方案中，至少一个接触步骤包括喷雾、浸渍、涂覆和涂抹植物中的一者。在某些实施方案中，在植物的花开放、嫩芽或生长位置处或者在诸如根、鳞茎、茎、叶、树枝、藤、长匐茎、芽、花或其部分、嫩芽、果实、种子、种荚等的其它植物部位上、处或中进行至少一个接触步骤。在某些实施方案中，在植物上第一次花开放的24、48或72小时内进行至少一个接触步骤。在某些实施方案中，BT组合物包含选自以下的一种或多种BT化合物：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇以及Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇。在某些实施方案中，细菌病原体表现出抗生素抗性。
在上述方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括：与植物和BT组合物接触步骤同时或依次且以任何顺序，使植物与协同或增强性抗生素接触。在某些进一步的实施方案中，协同或增强抗生素包括选自以下的抗生素：氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类抗生素、头孢菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、青霉素酶抗性青霉素类抗生素和氨基青霉素类抗生素。在某些实施方案中，协同或增强性抗生素是选自以下的氨基糖苷类抗生素：阿米卡星、阿贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、红链霉素、链霉素、妥布霉素和阿泊拉霉素。
在另外的实施方案中，提供用于在其中或其上存在抗生素抗性菌植物病原体的植物中克服抗生素抗性的方法，包括：(a)在足以满足以下一种或多种的条件和时间下，使植物与有效量的BT组合物接触：(i)预防植物被抗生素抗性菌病原体感染，(ii)抑制抗生素抗性菌病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，(iii)抑制由抗生素抗性菌病原体的生物膜形成，以及(iv)抑制抗生素抗性菌病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，其中BT组合物包含微粒的基本上单分散混悬物，微粒的基本上单分散混悬物包含BT化合物，微粒具有约0.5μm至约10μm的体积平均直径；以及(b)与植物和BT组合物接触步骤同时或依次且以任何顺序，使植物与协同或增强性抗生素接触。
铋硫醇-(BT)基防腐剂
也如上所述，许多具有抗微生物(例如，抗细菌、抗病毒、抗真菌)、特别是抗菌性质的天然产物(例如抗生素)和合成化学品是本领域已知的，并且已经至少部分地由化学结构和抗微生物作用来表征，所述抗微生物作用例如杀伤微生物的能力(“杀灭”作用，例如杀菌性质)，阻止或损害微生物生长的能力(“抑制”作用，例如抑菌性质)，或者干扰微生物功能，例如定植或感染部位、外泌多糖的细菌分泌和/或从浮游转化为生物膜群体或生物膜形成的扩展的能力。本文上述，例如，U.S.6,582,719讨论了抗生素、消毒剂、抗菌剂等(包括铋-硫醇或BT化合物)，包括影响此类组合物的选择和使用的因素，例如杀菌或抑菌性质、有效浓度和对宿主组织的毒性风险。
以上讨论铋硫醇(BT)以及替代铋的不同的V族金属(例如，砷、锑)的硫醇化合物。本文也讨论涉及具有约0.5μm至约10μm的体积平均直径的有利微粒BT组合物微粒的组合物和方法。因此，某些示例性实施方案属于本文所述抗微生物的用途，包括在植物中治疗或预防感染和生物膜的抗生物膜试剂，所述试剂通常存在于组合物中，该组合物含有按重量计0.0001％至0.001％的浓度的一种或多个微粒铋硫醇，优选为碱性形式。组合物可包含BT以及一种或多种载体或赋形剂和/或可进一步包含诸如其它相容性杀菌剂的其它成分，在某些优选的实施方案中，其包含如本文所述的协同或增强性抗生素。
在某些涵盖但非限制性实施方案中待保护的靶作物包括例如以下植物品种：谷类(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦、大米、高粱和相关作物)；甜菜(例如，糖甜菜和饲料甜菜)；梨果；核果和小果(例如，苹果、梨、李子、桃子、杏仁、樱桃、草莓、树莓和黑莓)；豆科植物(例如，黄豆、扁豆、豌豆、大豆)；油类植物(例如，油菜籽、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)；瓜类植物(例如，黄瓜、西葫芦、甜瓜)；纤维植物(例如，棉花、亚麻、大麻、黄麻)；柑橘类水果(例如，橘子、柠檬、葡萄柚、柑橘)；蔬菜(例如，菠菜、生菜、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、番茄、土豆、红椒)；樟科(例如，鳄梨、肉桂、樟脑)；以及其它植物，例如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄藤、啤酒花、香蕉和天然橡胶植物以及观赏植物(复合形式)，包括开花植物和由其收获的切花。因此，通过使作物接触包含如本文所提供的一种或多个微粒BT化合物的组合物，某些实施方案涵盖延长诸如源于食品(例如，水果、蔬菜、谷物、种子等)的切花或靶作物的收获的靶作物的产品寿命(例如，相对于未接触该所述微粒BT的对照组统计上显著延长事物市售、营养和/或可美观使用的时间)。
在这些和相关实施方案中使用的如本文所述的微粒BT的有效浓度取决于许多因素，包括BT、pH、温度、BT组分的摩尔比的选择以及侵入的微生物。有效性也取决于感染的预防或者已有感染(例如，生物膜)的治疗是否特定应用的目标。在大部分条件下预防剂量满足要求。BT的有效维持浓度可能在最大抗性生物体的MIC附近。该浓度可能在1-2μg/ml的范围，但可达至多8μg/ml或更大，这取决于具体微粒BT化合物。在一个示例性实施方案中，以5:1摩尔比(铋:巯氧吡啶)提供施加至植物的微粒Bis巯氧吡啶(BisPyr)。在另一实施方案中，可将在微粒形式中双铋硫醇BisPyr/Ery(Bis-巯氧吡啶/二硫赤藓糖醇)作为为广谱抗菌剂提供。在又一实施方案中，可将微粒BT与如本文所提供的特异性抗生素(优选协同或增强性抗生素)组合使用以提供对植物和切花/树的微生物感染的靶向和强效保护。基于在BisEDT和庆大霉素之间观察到的协同性，在某些实施方案中，优选该BT-抗生素抗生素组合以用于农业应用。
在其它实施方案中，小苏打(碳酸氢钠)或其它碱性物质(例如，碳酸氢钾、碳酸钙)的微粒BT制剂的添加可增加或者增强BT的抗微生物作用。农业用微粒BT制剂的其它成分包括表面活性剂和其它抗微生物剂，例如，氯己定、血根碱提取物、甲硝唑、季铵化合物(例如西吡氯铵)；双胍(例如氯己定二葡糖酸盐、海克替啶、奥替尼啶、阿来西定)；以及卤代双酚化合物，例如2,2'亚甲基双-(4-氯-6-溴苯酚)或其它苯酚抗细菌化合物、烷基羟基苯甲酸酯、阳离子抗微生物肽、氨基糖苷、喹诺酮、林肯酰胺、青霉素、头孢菌素、大环内酯、四环素以及其它抗生素、甲双二嗪或氧氢噻二嗪、A-dec ICX、毛喉鞘蕊花精油、银或胶体银抗菌剂、基于锡或铜的抗菌剂、氯或溴氧化物、麦卢卡油、皮萨草、百里香、迷迭香或其它药草提取物、葡萄柚籽提取物；抗炎或抗氧化剂例如布洛芬、氟比洛芬、阿斯匹林、吲哚美辛、芦荟、姜黄、橄榄叶提取物、丁香、泛醇、视黄醇、ω-3脂肪酸、γ-亚麻酸(GLA)、绿茶、姜、葡萄子等；药学上可接受的载体，例如，淀粉、蔗糖、水或水/醇体系、DMSO等；表面活性剂，例如阴离子、非离子、阳离子和两性离子或两性表面活性剂或者来自植物材料的皂角苷(例如，美国专利6,485,711)；缓冲剂和盐；以及可能包括的其它任选成分，例如，漂白剂(例如过氧化合物)、过氧二磷酸钾盐、起泡系统(例如碳酸氢钠/柠檬酸体系)等。
在某些实施方案中，也可将农业使用和在植物上使用的微粒BT组合物与产生如本文所述的附加、增强或协同作用的这些和任选其它试剂组合使用或者在脂质体或纳米颗粒形式中以增强活性和递送。某些实施方案明确排除微粒BT制剂，该微粒BT制剂包含诸如磷脂(例如，磷酸胆碱)和/或含有胆固醇的脂质体的脂质体，而某些其它实施方案并未限制以及可包括这些和其它脂质体。也制备微粒BT的具体制剂，该制剂含有载体、赋形剂或促进粘附制剂至表面的其它添加剂(例如，葡萄糖、淀粉、柠檬酸、载体油、乳剂、分散剂、表面活性剂等)。
在其它涵盖的实施方案中，可将在植物或农业作物上用作抗生物膜试剂的微粒BT制剂与用于控制生物膜生长的其它试剂组合。已知，例如，种间群体感应与生物膜形成相关。增加LuxS依赖性途径或种间群体感应信号的某些试剂(例如，美国专利No.7,427,408和6,455,031)有助于控制生物膜，例如阻断N-(3-氧代十二烷酰)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)的化合物和/或N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(BHL)类似物。可将与本文所述微粒BT组合使用的这些抗生物膜试剂以叶面喷布形式递送以用于抑制细菌生物膜生长或者用于治疗预先形成的生物膜。在另一实施方案中，这些抗生物膜试剂包含在可生物降解的微粒内以用于控制释放和/或与其它抗微生物剂在脂质体形式中。
因此，根据某些实施方案可将本文所述的微粒BT与其它已经存在的技术一起使用以改善抗生物膜作用。该微粒BT可协同或增强抵抗抗生素链霉素和/或庆大霉素的某些植物病原体的活性。链霉素不会杀死细菌，但取而代之会抑制它们的增殖以及因而降低定植在花柱头处的速率，从而消除在蜜腺(nectarthode)内细菌的随后增殖(参见，例如，Domenico等，J Antimicrob Chemo 1991；28:801-10；Domenico等Research Advances inAntimicrob Agents Chemother 2003；3:79-85)。通过使用活化剂类型的喷雾佐剂(例如，RegulaidTM)可获得进一步益处，该喷雾佐剂足够改善链霉素的覆盖和渗透，使得降低安全使用的该抗生素的量。
可将该微粒BT与抵抗农业和植物微生物病原体中当前使用的任何活性成分组合使用，该活性成分包括具有抗生物膜活性的那些，例如氧化剂、螯合剂(例如，铁螯合剂)、杀菌剂和消毒剂。根据本公开，优选的组合可增加或可增强或协同该抗生物膜作用。例如通过使用赋予增强的粘附性能的疏水性硫醇(例如，硫代氯苯酚)，某些实施方案涵盖配制为疏水性以增强在表面上BT的停留时间的微粒BT组合物。具有净负电荷(例如，铋:硫醇的1:2摩尔比)的BT也可具有增强的粘附性能。
可将BT化合物微粒混悬物作为水性制剂、作为混悬物或在包括卤代烃推进剂的有机溶剂中溶液、分散油或者作为干粉来施用。水性制剂可以通过采用水力或超声雾化的液体喷雾器雾化。基于推进剂的系统可以利用适当的加压分配器。干粉可以利用能够有效分散含BT微粒的干粉分散装置。预期的粒度和分布可以通过选择适当装置而获得。
本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为意指包括所述步骤或组分或步骤或组分的组，但不排除任何其它步骤或组分或步骤或组分的组。“由…组成”表示包括并限于短语“由…组成”之后的任何内容。因此，短语“由…组成”指示所列组分是必需或强制的，并且不可以存在其它组分。“基本由…组成”表示包括该短语之后所列的任何组分，并限于不干扰或促进所列组分在本公开中指定的活性或作用的其它组分。因此，短语“基本由…组成”指示所列组分是必需或强制的，但其它组分不是必需的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列组分的活性或作用。
在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文清楚另外指明，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。如本文所使用，在特定实施方案中，术语“约”或“大约”在数值之前时指示该值加或减5％、6％、7％、8％或9％的范围。在其它实施方案中，术语“约”或“大约”在数值之前时指示该值加或减10％、11％、12％、13％或14％的范围。而在其它实施方案中，术语“约”或“大约”在数值之前时指示该值加或减15％、16％、17％、18％、19％或20％的范围。
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下述实施例作为示例方式而非限制性方式被提供。
实施例
实施例1
BT化合物的制备
以下BT化合物根据Domenico等(U.S.RE37,793、U.S.6,248,371、U.S.6,086,921、U.S.6,380,248)的方法制备或者作为根据下文针对BisEDT描述的合成方案的微粒。为了比较，基于使用的反应物的化学计量比率和铋与含硫化合物形成三价络合物的已知倾向，显示了相对于单个铋原子的原子比率。括号中的数字是铋与一种(或多种)硫醇试剂的比率(例如Bi:硫醇1/硫醇2；还参见表1)。
1)CPD 1B-1 Bis-EDT(1:1)BiC2H4S2
2)CPD 1B-2 Bis-EDT(1:1.5)BiC3H6s3
3)CPD 1B-3 Bis-EDT(1:1.5)BiC3H6S3
4)CPD 1C Bis-EDT(可溶性Bi制剂)(1:1.5)BiC3H6S3
5)CPD 2A Bis-Bal(1:1)BiC3H6S2O
6)CPD 2B Bis-Bal(1:1.5)BiC4.5H9O1.5S3
7)CPD 3A Bis-Pyr(1∶1.5)BiC7.5H6N1.5O1.5S1.5
8)CPD 3B Bis-Pyr(1∶3)BiC15H12N3O3S3
9)CPD 4 Bis-Ery(1:1.5)BiC6H12O3S3
10)CPD 5 Bis-Tol(1:1.5)BiC10.5H9S3
11)CPD 6 Bis-BDT(1:1.5)BiC6H12S3
12)CPD 7 Bis-PDT(1:1.5)BiC4.5H9S3
13)CPD 8-1 Bis-Pyr/BDT(1:1/1)
14)CPD 8-2 Bis-Pyr/BDT(1：1/0.5)
15)CPD 9 Bis-2羟基，丙硫醇(1:3)
16)CPD 10 Bis-Pyr/Bal(1:1/0.5)
17)CPD 11 Bis-Pyr/EDT(1:1/0.5)
18)CPD 12 Bis-Pyr/Tol(1:1/0.5)
19)CPD 13 Bis-Pyr/PDT(1:1/0.5)
20)CPD 14 Bis-Pyr/Ery(1:1/0.5)
21)CPD 15 Bis-EDT/2羟基，丙硫醇(1:1/1)
微粒铋-1,2-乙二硫醇(Bis-EDT，可溶性铋制剂)如下制备：
在室温搅拌下向15L聚丙烯大玻璃瓶中的过量(11.4L)的5％HNO3水溶液缓慢滴加0.331L(～0.575摩尔)的Bi(NO3)3水溶液(43％Bi(NO3)3(w/w)、5％硝酸(w/w)、52％水(w/w)、Shepherd Chemical Co.,Cincinnati,OH，产品编号2362；δ～1.6g/mL)，随后缓慢添加无水乙醇(4L)。一些白色沉淀产生，但是通过持续搅拌而被溶解。通过使用60mL注射器向1.5L无水乙醇添加72.19mL(0.863摩尔)1,2-乙二硫醇、然后搅拌五分钟来单独地制备1,2-乙二硫醇(CAS 540-63-6)的乙醇溶液(～1.56L,～0.55M)。然后在5小时时间内将1,2-乙二硫醇/EtOH缓慢滴加至Bi(NO3)3/HNO3水溶液，继续搅拌过夜。使生成的产物沉降为沉淀，持续大约15分钟，之后使用蠕动泵以300mL/min除去滤液。然后通过在15-cm直径的布氏漏斗中在精细滤纸上过滤来收集产物，并随后依次用500-mL体积的乙醇、USP水和丙酮洗涤三次，以获得为黄色无定形粉末固体状的BisEDT(694.51gm/摩尔)。将产物放入500mL琥珀色玻璃瓶并在真空下经CaCl2干燥48小时。回收的材料(产量～200g)散发出硫醇特征臭味。将粗产物再次溶解于750mL无水乙醇，搅拌30分钟，然后过滤并依次用3×50mL乙醇、2×50mL丙酮洗涤，并再次用500mL丙酮洗涤。将再次洗涤的粉末在1M NaOH(500mL)中研磨，过滤，并用3×220mL水、2×50mL乙醇和1×400mL丙酮洗涤，以得到156.74gm纯BisEDT。以基本上相同的方式制备的随后批次得到约78-91％的产率。
通过1H和13C核磁共振(NMR)、红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、质谱(MS)和元素分析的数据分析，产物被鉴定为具有上式I所示的结构。开发了一种HPLC方法来测定BisEDT的化学纯度，由此在DMSO中制备样品(0.5mg/mL)。通过在190至600nm扫描BisEDT的DMSO溶液来测定λmax。在室温下以1mL/min进行等强度HPLC洗脱，流动相为乙腈:水(9:1)中的0.1％甲酸，具有在265nm(λmax)检测的UV检测器，2μL注射体积，配有YMC Pack PVC Sil NP,5μm,250×4.6mm内径分析柱(Waters)的Waters(Millipore Corp.,Milford,MA)型号2695色谱仪，检测单峰，反映化学纯度为100±0.1％。元素分析与式(I)的结构一致。
鉴定干燥微粒物质以评价粒度性质。简言之，将微粒重新悬浮于2％F-68(BASF,Mt.Olive,NJ)，悬浮液在标准设置下在水浴超声仪中超声10分钟，然后使用Nanosizer/Zetasizer Nano-S粒度分析仪(型号ZEN1600(无ζ-电势测量能力),MalvernInstruments,Worcestershire,UK)根据生产商推荐进行分析。根据两次测量的汇总数据，微粒表现出单峰分布，所有可检测的事件在约0.6微米至4微米的体积平均直径(VMD)，并且在约1.3微米具有峰VMD。相比之下，当BisEDT由现有方法(Domenico等，1997Antimicrob.Agents Chemother.41(8):1697-1703)制备时，大部分微粒非均相分散并且具有显著更大的尺寸，排除了它们基于VMD的鉴定。
实施例2
慢性伤口感染的菌落生物膜模型：
通过BT化合物抑制
因为慢性伤口中存在的细菌采用生物膜生活方式，使用基本上根据所述方法(Anderl等，2003 Antimicrob Agents Chemother 47:1251-56；Walters等，2003Antimicrob Agents Chemother 47:317；Wentland等，1996 Biotchnol.Prog.12:316；Zheng等，2002 Antimicrob Agents Chemother 46:900)制备的生物膜测试BT针对生物膜的抗细菌细胞存活的作用。
简言之，将菌落生物膜在10％胰蛋白酶大豆琼脂上生长24小时，然后转移到含有治疗剂的Mueller Hinton板。治疗之后，将生物膜分散入含有2％w/v谷胱甘肽(中和BT)的胨水中，并在涂板计数之前连续稀释到胨水。从慢性伤口分离的两种细菌被单独用于生产用于测试的菌落生物膜。这些是革兰氏阴性菌菌株铜绿假单胞菌和革兰氏阳性的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。
基本上如下所述(Anderl等，2003 Antimicrob Agents Chemother 47:1251-56；Walters等，2003 Antimicrob Agents Chemother 47:317；Wentland等，1996Biotchnol.Prog.12:316；Zheng等，2002 Antimicrob Agents Chemother 46:900)，将细菌生物膜菌落在琼脂板上静置的微孔膜上部生长。该菌落生物膜表现出其它生物膜模型的许多常见特征，例如，它们由在高度水合的基质中聚集的细胞组成。亦如其它人所报道(Brown等，J Surg Res 56:562；Millward等，1989 Microbios 58:155；Sutch等，1995 J PharmPharmacol 47:1094；Thrower等，1997 J Med Microbiol 46:425)，发现菌落生物膜中的细菌表现出同样显著降低的抗微生物敏感性，这已经在更成熟的体外生物膜反应器中量化。菌落生物膜容易且可重复地大量生产。根据非限制性理论，该菌落生物膜模型具有感染伤口的一些共同特征：细菌在具有生物膜下供应的营养物和最小流速的空气界面处生长。许多营养源用于培养菌落生物膜，包括血液琼脂，它被认为可模拟体内营养条件。
通过在25mm直径的聚碳酸酯滤膜上接种5μl滴的浮游细菌液体培养物来制备菌落生物膜。该膜在接种之前通过每侧暴露于紫外线10分钟而被灭菌。将种菌在细菌培养基中37℃生长过夜，并在膜上沉淀之前在新鲜培养基中稀释至600nm下0.1的光密度。然后将膜放在含有生长培养基的琼脂板上。然后该板被覆盖并倒置于37℃培养箱中。每24小时，使用无菌镊子将膜和菌落生物膜转移至新板。菌落生物膜通常在生长48小时之后用于实验，此时每个膜有大约109个细菌。菌落生物膜方法被成功用于培养许多单菌种和混合菌种生物膜。
为了测量对抗微生物剂(例如，BT化合物，包括BT化合物的组合物；抗生素和BT化合物-抗生素组合物)的敏感性，将菌落生物膜转移至补充了候选抗微生物治疗剂的琼脂板。其中暴露于抗微生物治疗的持续时间超过24小时，每天将菌落生物膜转移至新治疗板。在治疗期末，将菌落生物膜放入含有10ml缓冲液的管中并涡旋1-2分钟以分散生物膜。在一些情况下，有必要用组织匀浆器简单加工样品以打碎细胞聚集物。然后将得到的细胞悬浮液连续稀释并涂板以计数存活的细菌，将其报告为每单位面积的菌落形成单位(CFU)。使用log10转化分析存活数据。
对于每种类型的细菌生物膜菌落培养物(铜绿假单胞菌，PA；甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌，MRSA或SA)，测试了五种抗生素和十三种BT化合物。针对PA测试的抗微生物剂包括在本文称为BisEDT和化合物2B、4、5、6、8-2、9、10、11和15(参见表1)的BT和抗生素妥布霉素、阿米卡星、亚胺培南、头孢唑林和环丙沙星。针对SA测试的抗微生物剂包括在本文称为BisEDT和化合物2B、4、5、6、8-2、9、10和11(参见表1)的BT和抗生素利福平、达托霉素、米诺环素、氨苄西林和万古霉素。如上在“附图简述”中所述，根据已确定的微生物学方法，以大约10-400倍于最小抑制浓度(MIC)的浓度测试抗生素。
在测试浓度下，七种BT化合物表现出对PA细菌存活的显著作用，并且两种BT化合物证明在测试浓度下对MRSA存活的显著作用；代表性的结果显示，图1对于BisEDT和BT化合物2B(针对PA测试)和图2对于BT化合物2B和8-2(针对SA测试)均表现出对细菌存活的BT作用(在两种情况下，相对于所示抗生素的作用)。亦如图1和2所示，与所示抗生素组合的所示BT化合物的加入导致协同作用，由此减少细菌存活的功效相对于单独抗生素或单独BT化合物的抗菌作用被增强。在PA存活测定中，浓度为80μg/mL的化合物15(Bis-EDT/2羟基,丙硫醇(1:1/1))显示出与使用1600μg/mL AMK加80μg/mL BisEDT获得的作用(图1)相当的作用(未显示)。
实施例3
慢性伤口感染的滴流生物膜模型：
通过BT化合物抑制
滴流生物膜代表本领域公认的用于形成和测试候选抗菌化合物抗细菌生物膜的作用的权威模型。滴流生物膜在置于滴流反应器通道中的去样片(基板)上产生。许多不同类型的材料可以用作细菌生物膜形成的基板，包括磨砂玻璃显微镜载玻片。营养液体培养基通过滴入顶端附近的室内而进入滴流生物反应器细胞室，然后沿取样片长轴向下10坡度流动。
将生物膜在滴流生物反应器中生长，并暴露于单独或与其它抗菌剂(包括BT化合物)组合的BT化合物和/或暴露于单独或与其它抗菌剂组合的抗生素化合物，或者暴露于针对慢性伤口的其它常规或候选治疗。因此，鉴定了BT化合物对滴流反应器中细菌生物膜的作用。滴流反应器中生物膜根据已确定的方法制备(例如，Stewart等，2001 J ApplMicrobiol.91:525；Xu等，1998 Appl.Environ.Microbiol.64:4035)。该设计包括在覆盖室内下倾的聚苯乙烯取样片上培养生物膜。示例性培养基含有1g/l葡萄糖、0.5g/l NH4NO3,0.25g/l KCl,0.25g/l KH2PO4,0.25g/l MgSO4-7H2O，补充了5％v/v模拟富含蛋白质的血清的成人供体牛血清(ph 6.8)，铁限制条件类似于体内例如慢性伤口中的生物膜生长条件。该培养基逐滴(50ml/h)流经四个单独平行室内含有的四个取样片，每个测量10cm×1.9cm，深度1.9cm。室内反应器由聚砜塑料制成。每个室配有单独的可移动塑料盖，该塑料盖可以紧密密封。将生物膜反应器放入37℃培养箱，细菌细胞培养基通过使之穿过培养箱中保持的铝散热器而被加热。该方法产生了在某些生物膜中观察到的抗生素抗性表型，模拟低流体剪切环境并接近慢性伤口的界面特征，同时提供连续的营养补充，并且与许多用于鉴定和监测引入的候选抗菌方案作用的分析方法相容。滴流反应器已经成功用于培养许多纯的和混合种生物膜。生物膜通常在应用抗微生物剂之前生长2至5天。
为了测量抗生物膜剂对滴流反应器中生长的生物膜的作用，穿过生物膜的流体流被修正或补充有需要的治疗制剂(例如，一种或多种BT化合物和/或一种或多种抗生素，或对照，和/或其它候选剂)。流动持续规定的治疗期。然后将经治疗的生物膜取样片从反应器快速取出，将生物膜刮入含有10ml缓冲液的烧杯。该样品用组织匀浆器快速加工(通常30秒至1分钟)以分散细菌聚集物。悬浮液被连续稀释并涂板以根据标准微生物学方法计数存活的微生物。
实施例4
角质形成细胞刮伤修复的伤口生物膜抑制：
通过BT化合物抑制生物膜
本实施例描述了已经确定的伤口愈合的体外角质形成细胞刮伤模型的修改，以达到具有与生物膜相关伤口病变和伤口愈合以及特别是与急性或慢性伤口或含有本文所述生物膜的伤口相关性的模型。根据慢性伤口生物膜作用的角质形成细胞刮伤模型，哺乳动物(例如人)角质形成细胞和细菌生物膜群体的培养在相互流体连通的单独室内进行，以允许评估影响生物膜产生的可溶性组分对角质形成细胞伤口愈合事件的作用的条件的作用。
新生的人包皮细胞在处理的塑料盘中作为单层培养，其中单层控制的“伤口”或刮伤由机械方式(例如，通过单层的物理破坏，例如通过用适合的工具例如无菌手术刀、剃刀、细胞刮棒、镊子或其它工具刮擦单层区之间基本上线性的无细胞区)形成。已知体外角质形成细胞单层模型系统以刺激体内伤口愈合的方式响应受伤事件而经受细胞结构和功能过程。根据本文公开的实施方案，观察细菌生物膜的存在对这种过程的影响，例如对刮伤愈合时间的影响，并且在这些和相关实施方案中，还评估了所选候选抗微生物(例如抗菌和抗生物膜)治疗的存在的作用。
根据形态学、生物化学、分子遗传学、细胞生理学和其它参数检验在生物膜存在下培养的受伤角质形成细胞单层，以确定BT化合物的引入是否改变(例如，以相对于适当对照统计学显著的方式增加或减少)生物膜的损害作用。伤口首先暴露于每个单独的BT化合物，并暴露于考虑的BT化合物的组合，以在评估此类治疗对生物膜对模型伤口愈合过程影响的作用之前测试每种BT化合物治疗的毒性。
在代表性实施方案中，三天生物膜培养于保持在上述组织培养孔中的膜上(例如，TransWell膜插入物等)并且与角质形成细胞单层流体连通，角质形成细胞单层被刮擦以开始伤口愈合过程。在真正的急性或慢性伤口外培养的生物膜被考虑用于这些和相关实施方案。
因此，已经开发了用于评估可溶性生物膜组分对人角质形成细胞迁移和增殖的作用的体外系统。该系统使用透析膜分离生物膜和角质形成细胞。角质形成细胞如前所述从新生包皮培养(Fleckman等，1997 J Invest.Dermatol.109:36；Piepkorn等，1987 JInvest.Dermatol.88:215-219)并且在玻璃盖玻片上生长为汇合单层。然后，角质形成细胞可以被刮擦以产生具有均一宽度的“伤口”，随后监测细胞修复过程(例如，Tao等，2007PLoS ONE 2:e697；Buth等2007 Eur.J Cell Biol.86:747；Phan等2000Ann.Acad.Med.Singapore 29:27)。然后将人工伤口置于无菌双侧室的底部，并且使用无菌技术组装所述室。室的两侧用角质形成细胞生长培养基(EpiLife)填充，含有或不含抗生素和/或铋-硫醇。未接种的系统用作对照。
将系统用伤口分离的细菌接种并在静态条件下培养2小时，以使细菌能够附着至上室中的表面。在附着期之后，液体培养基流动在上室开始以除去未附着的细胞。然后培养基流动以最小化上室内浮游细胞生长的速率继续，通过洗掉未粘附的细胞。在6至48小时的培养期之后，系统(盖玻片上的角质形成细胞和膜基底上的细菌生物膜)被分解，取出盖玻片并分析。在相关实施方案中，成熟生物膜在组装室之前在上室中生长。在其它相关实施方案中，生物膜和刮伤角质形成细胞单层的单独共培养在一种或多种BT化合物不存在和存在下进行，任选包括或排除一种或多种抗生素，以测定候选剂例如BT化合物或潜在协同BT化合物+抗生素组合(例如，本文提供的BT化合物，例如以微粒形式提供的BT和以下的一种或多种：阿米卡星、氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、氯霉素、环丙沙星、克林霉素(或另一种林肯酰胺抗生素)、达托霉素多西环素、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺米诺环素、萘夫西林、巴龙霉素、利福平、磺胺甲噁唑、妥布霉素和万古霉素)对刮伤的角质形成细胞修复的作用，例如，以鉴定改变(例如，以相对于适当对照的统计学显著方式增加或减少)刮伤愈合的至少一个指标例如伤口修复进行的时间或其它伤口修复指标的剂或剂的组合(例如，Tao等，2007 PLoS ONE 2:e697；Buth等2007 Eur.JCell Biol.86:747；Phan等2000 Ann.Acad.Med.Singapore 29:27)。
实施例5
角质形成细胞刮伤修复的伤口生物膜抑制
根据上述实施例4中描述的方法，将分离的人角质形成细胞培养在盖玻片上并且刮伤。将受伤的培养物在单独或存在共培养的生物膜的培养条件下保持在与角质形成细胞培养物流体连通的膜支持体上。然后测定期间角质形成细胞生长和/或迁移在刮擦区上重新确定角质形成细胞单层的刮伤闭合时间间隔。图3描述了生物膜流体连通(但不是直接接触)的存在对刮擦角质形成细胞单层的愈合时间的作用。
因此，在某些实施方案中预期了鉴定用于治疗慢性伤口的物质的方法，包括在有和没有候选抗生物膜剂存在下、在细菌生物膜存在下培养刮伤细胞(例如角质形成细胞或成纤维细胞)单层；并评估在候选抗生物膜剂不存在和存在下刮伤细胞单层的愈合指标，其中促进至少一个愈合指标的物质(例如，BT化合物，例如本文所述的基本上单分散的BT微粒悬浮液，单独或与抗生素协同组合，所述抗生素例如以下的一种或多种：阿米卡星、氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素多西环素、加替沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺米诺环素、萘夫西林、巴龙霉素、利福平、磺胺甲噁唑、妥布霉素和万古霉素)被鉴定为适合用于治疗急性或慢性伤口或含有生物膜的伤口的物质。
实施例6
协同性铋-硫醇(BT)-抗生素组合
本实施例显示了一种或多种铋-硫醇化合物和一种或多种抗多种细菌种和细菌株(包括几种抗生素抗性菌)的抗生素的组合的证明的协同作用的情况。
材料和方法。敏感性研究通过根据NCCLS方案在96孔组织培养板(Nalge NuncInternational，Denmark)中肉汤稀释来进行(National Committee for ClinicalLaboratory Standards.(1997).Methods for Dilution Antimicrobial SusceptibilityTests for Bacteria that Grow Aerobically:Approved Standard M7-A2 andInformational Supplement M100-S10.NCCLS，Wayne，PA，USA)。
简言之，使用过夜细菌培养物来制备0.5McFarland标准悬浮液，其在阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤培养基(BBL，Cockeysville，MD，USA)中进一步稀释1:50(～2×106cfu/mL)。以递增浓度添加BT(如上制备)和抗生素，保持最终体积恒定在0.2mL。将培养物在37℃孵育24小时，通过使用ELISA读板器(Biotek Instruments，Winooski，VT，USA)根据生产商推荐用在630nm的吸收来评估浊度。最小抑制浓度(MIC)被表示为抑制生长24小时的最低药物浓度。通过在营养琼脂上的标准涂板测定活细菌计数(cfu/mL)。最小细菌浓度(MBC)表示为在24小时孵育时减少最初生存力99.9％的药物浓度。
使用棋盘方法来评估抗微生物组合的活性。根据Eliopoulos等(Eliopoulos和Moellering，(1996)Antimicrobial combinations.见Antibiotics in LaboratoryMedicine(Lorian，V.编辑)，第330-96页，Williams和Wilkins，Baltimore，MD，USA)，计算分级抑制浓度指数(FICI)和分级杀菌浓度指数(FBCI)。协同性被定义为FICI或FBCI指数≤0.5，>0.5-4时无相互作用，>4时拮抗作用(Odds，FC(2003)Synergy，antagonism，and whatthe chequerboard puts between them.Journal of Antimicrobial Chemotherapy 52:1)。协同性还被常规定义为抗生素浓度≥4倍的减少。
结果示于表2-17。
表2
金黄色葡萄球菌-萘夫西林抗性
BE＝0.2μg/ml BisEDT；细菌菌株获自Winthrop大学医院的临床微生物实验室，Mineola，NY。萘夫西林获自Sigma(St.Louis，MO)。
表3
金黄色葡萄球菌-萘夫西林抗性
BE＝0.2μg/ml BisEDT；细菌菌株获自Winthrop大学医院的临床微生物实验室，Mineola，NY。萘夫西林获自Sigma。
表4
金黄色葡萄球菌
利福平/新霉素/巴龙霉素
BE＝0.2μg/ml BisEDT；菌株S2446-3获自Winthrop大学医院的临床微生物实验室，Mineola，NY。抗生素获自Sigma。
表5
表皮葡萄球菌-GM抗性
GM＝庆大霉素；菌株S2400-1获自Winthrop大学医院的临床微生物实验室，Mineola，NY。庆大霉素获自Winthrop药剂科；协同性为加粗
表6
表皮葡萄球菌-S2400-1
生物膜预防
数据以μg/ml表示；菌株S2400-1获自Winthrop大学医院的临床微生物实验室，Mineola，NY。抗生素获自Winthrop药剂科。
表7
表皮葡萄球菌-S2400-1
MIC
数据以μg/ml表示；菌株S2400-1获自Winthrop大学医院的临床微生物实验室，Mineola，NY。抗生素获自Winthrop的药剂科。
表8
表皮葡萄球菌-S2400-1
MBC
数据以μg/ml表示；菌株S2400-1获自Winthrop大学医院的临床微生物实验室，Mineola，NY。抗生素获自Winthrop的药剂科。
表9
表皮葡萄球菌
ATCC 35984
MIC
数据以μg/ml表示；抗生素获自Winthrop大学医院药剂科，Mineola，NY。
表10
大肠杆菌-氨苄西林/氯霉素抗性
AB＝抗生素；CM＝氯霉素；AM＝氨苄西林；BE＝BisEDT，0.3μg/ml；菌株获自MJCasadaban博士的实验室，Department of Molecular Genetics and Cell Biology，TheUniversity of Chicago，Chicago，IL。抗生素获自Winthrop大学医院药剂科，Mineola，NY。
表11
大肠杆菌-四环素-抗性：
多西环素+BisEDT
DOX＝多西环素；BE＝BisEDT，0.3μg/ml；菌株获自I Chopra博士的实验室，Department of Bacteriology，The University of Bristol，Bristol，UK。抗生素获自Winthrop大学医院药剂科，Mineola，NY。
表12
铜绿假单胞菌-妥布霉素-抗性：
BisEDT协同性
Agr＝氨基葡糖苷抗性；NN＝妥布霉素；PA＝铜绿假单胞菌；BE＝BisEDT，0.3μg/ml；菌株获自K.Poole博士的实验室，Department of Microbiology and Immunology，Queens University，Ontario，CN。妥布霉素获自Winthrop大学医院药剂科，Mineola，NY。
表13
洋葱伯克霍尔德菌
妥布霉素+BE协同性
MIC
NN＝妥布霉素；BE＝BisEDT，0.4μg/ml；菌株获自J.J.LiPuma博士的实验室，Department of Pediatrics and Communicable Diseases，University of Michigan，AnnArbor，MI；还有Veloira等2003。妥布霉素获自Winthrop大学医院药剂科，Mineola，NY。
表14
洋葱伯克霍尔德菌
妥布霉素+BE协同性
MBC
NN＝妥布霉素；BE＝BisEDT，0.4μg/ml；菌株获自J.J.LiPuma博士的实验室，Department of Pediatrics and Communicable Diseases，University of Michigan，AnnArbor，MI；还有Veloira等2003。妥布霉素获自Winthrop大学医院药剂科，Mineola，NY。
表15
妥布霉素抗性菌株
MIC
NN＝妥布霉素；BE＝BisEDT，0.8μg/ml；Lipo-BE-NN＝脂质体BE-NN；菌株获自A.Omri博士的实验室，Department of Chemistry and Biochemistry，LaurentianUniversity，Ontario，CN；(M菌株是类粘蛋白洋葱伯克霍尔德菌；PA＝铜绿假单胞菌；SA＝金黄色葡萄球菌)。妥布霉素获自Winthrop大学医院药剂科，Mineola，NY。
表16
妥布霉素抗性菌株
MBC
NN＝妥布霉素；BE＝BisEDT，0.8μg/ml；Lipo-BE-NN＝脂质体BE-NN；菌株获自A.Omri博士实验室，Department of Chemistry and Biochemistry，LaurentianUniversity，Ontario，CN；(M菌株是类粘蛋白洋葱伯克霍尔德菌；PA＝铜绿假单胞菌；SA＝金黄色葡萄球菌)。妥布霉素获自Winthrop大学医院药剂科，Mineola，NY。
表17
BisEDT-巯氧吡啶协同性
BE＝BisEDT；NaPYR＝吡硫翁锌；化学品获自Sigma-Aldrich；协同性加粗。所示细菌菌株来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。
实施例7
比较性铋-硫醇(BT)和抗生素对抗包括抗生素抗性菌菌株在内的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的作用
本实施例中，评估了BisEDT和比较剂针对负责皮肤和软组织感染的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的多个临床分离株的体外活性。
材料和方法。测试化合物和测试浓度范围如下：BisEDT(Domenico等，1997；Domenico等，Antimicrob.Agents Chemother.45(5):1417-1421.和实施例1)、16-0.015μg/mL；利奈唑胺(ChemPacifica Inc.，#35710)、64-0.06μg/mL；达托霉素(CubistPharmaceuticals#MCB2007)，32-0.03μg/mL和16-0.015μg/mL；万古霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，#V2002)，64-0.06μg/mL；头孢他啶(Sigma#C3809)，64-0.06μg/mL和32-0.03μg/mL；亚胺培南(United States Pharmacopeia，NJ，#1337809)16-0.015μg/mL和8-0.008μg/mL；环丙沙星(United States Pharmacopeia，#IOC265)，32-0.03μg/mL和4-0.004μg/mL；庆大霉素(Sigma#G3632)32-0.03μg/mL和16-0.015μg/mL。除了庆大霉素外，所有测试样品溶解于DMSO；庆大霉素溶解于水。原液以40倍于最高浓度在测试板中制备。DMSO在测试系统中的终浓度为2.5％。
微生物。测试微生物获自如下临床实验室：CHP，Clarian Health Partners，Indianapolis，IN；UCLA，University of California Los Angeles Medical Center，LosAngeles，CA；GR Micro，London，UK；PHRI TB Center，Public Health Research InstituteTuberculosis Center，New York，NY；ATCC，美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA；MtSinai Hosp.，Mount Sinai Hospital，New York，NY；UCSF，University of CaliforniaSan Francisco General Hospital，San Francisco，CA；Bronson Hospital，BronsonMethodist Hospital，Kalamazoo，MI；质量控制分离株获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。将微生物在适合各自微生物的琼脂培养基上划线分离。通过拭子从分离平板上挑取菌落并放入含有冷冻保护剂的适当肉汤中悬浮。悬浮液被分成等份进入低温管形瓶并保持在-80℃。缩写：BisEDT，铋-1,2-乙二硫醇；LZD，利奈唑胺；DAP，达托霉素；VA，万古霉素；CAZ，头孢他啶；IPM，亚胺培南；CIP，环丙沙星；GM，庆大霉素；MSSA，甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌；CLSI QC，Clinical and Laboratory Standards Institute质量控制菌株；MRSA，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌；CA-MRSA，群落获得性甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌；MSSE，甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌；MRSE，甲氧西林抗性表皮葡萄球菌；VSE，万古霉素敏感性肠球菌。
将分离株从冷冻小瓶中划线至适当培养基上：胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂(Becton-Dickinson，Sparks，MD)用于大部分微生物，或者胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂加5％绵羊血液(Cleveland Scientific，Bath，OH)用于链球菌。将板在35℃孵育过夜。包括质量控制微生物。用于MIC测定的培养基是Mueller Hinton II肉汤(MHB II-BectonDickinson，#212322)，用于大部分微生物。MHB II补充了2％溶解的马血(ClevelandScientific批号H13913)以适应化脓性链球菌和无乳链球菌的生长。培养基以102.5％正常重量制备以抵消向每个微稀释板孔添加5μL药物溶液所产生的稀释。此外，为了测试达托霉素，培养基补充了额外25mg/L Ca2+。
MIC测定方法遵循Clinical and Laboratory Standards Institute描述的程序(Clinical and Laboratory Standards Institute.Methods for DilutionAntimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved Standard—第七版。Clinical and Laboratory Standards Institute文件M7-A7[ISBN 1-56238-587-9].Clinical and Laboratory Standards Institute，940WestValley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898USA，2006)并采用自动化液体操作器进行系列稀释和液体转移。自动化液体操作器包括Multidrop 384(Labsystems，Helsinki，Finland)、Biomek 2000和Multimek 96(Beckman Coulter，Fullerton CA)。标准96孔微稀释板(Falcon 3918)的第2-12列的孔被填充150μl DMSO或水，用于Multidrop 384上的庆大霉素。将药物(300μl)分散入这些板中适当行的第1列。这些将成为母板，从中制备测试板(子板)。Biomek 2000完成了在母版中经第11列的转移。子板中第12列的孔不含药物并且是微生物生长对照孔。使用Multidrop 384为子板装载185μl适当的测试培养基(上述)。子板在Multimek 96仪器上制备，在单个步骤中Multimek 96仪器从母板的每个孔转移5μl药物溶液至每个子板的各自相应孔。
每个微生物的标准化种菌根据CLSI方法制备(ISBN 1-56238-587-9，同上引用)。将悬浮液在MHB中制备，以等于0.5 McFarland标准的浊度。将悬浮液在适合微生物的肉汤中稀释1:9。每个微生物的种菌被分散到纵向分隔的无菌储器(Beckman Coulter)，并且使用Biomek 2000接种板。子板倒置放在Biomek 2000工作表面上，使得接种从低到高的药物浓度进行。Biomek 2000将10μl标准化种菌递送入每个孔。这导致子板中最终细胞浓度位大约5×105菌落形成单位/mL。因此，子板的孔最终含有185μl肉汤、5μl药物溶液和10μl细菌种菌。将板叠加三层高，最上面的板用盖覆盖，放入塑料袋，并且对于大多数分离株在35℃孵育大约18小时。将链球菌板在孵育20小时之后读数。使用板观测仪从底部观看微板。对于每种测试培养基，观察未接种的溶解度对照板中药物沉淀迹象。读取MIC并记录为抑制可见微生物生长的最低药物浓度。
结果。所有上市药物在所有测试浓度下在肉汤培养基中是可溶的。BisEDT在32μg/mL时表现出痕量沉淀，但是MIC读数不受影响，因为所有测试微生物的抑制浓度远低于该浓度。在每个测定日，适当的质量控制菌株被包括在MIC测定中。视情况，从这些菌株得到的MIC值与针对每个剂公开的质量控制范围(Clinical and Laboratory StandardsInstitute.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing；Eighteenth Informational Supplement.CLSI文件M100-S18[ISBN 1-56238-653-0].Clinical and Laboratory Standards Institute，940West Valley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2008)相比较。
在每个测定日，适当的质量控制菌株被包括在MIC测定中。视情况，从三个菌株得到的MIC值与针对每个剂公开的质量控制范围(Clinical and Laboratory StandardsInstitute.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing；Eighteenth Informational Supplement.CLSI文件M100-S18[ISBN 1-56238-653-0])相比较。其中公开了质量控制范围的质量控制菌株的141个值中，140(99.3％)在指定范围内。一个例外是亚胺培南与金黄色葡萄球菌29213，在一轮产生一个值(≤0.008μg/mL)，这是低于公开的QC范围的一个稀释。该轮所有其它质量控制结果在指定的质量控制范围内。
BisEDT证明针对甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)和群落获得性MRSA(CA-MRSA)具有强大活性，在1μg/mL或更低浓度时抑制所有测试菌株，其中对于所有三个微生物组的MIC90值为0.5μg/mL。BisEDT表现出大于利奈唑胺和万古霉素的活性，并且等同于达托霉素的活性。亚胺培南在抗MSSA方面比BisEDT更有效(MIC90＝0.03μg/mL)。然而，MRSA和CAMRSA对亚胺培南抗性，而BisEDT证明了与对MSSA所示等同的活性。BisEDT对甲氧西林敏感性和甲氧西林抗性表皮葡萄球菌(MSSE和MRSE)高度活性，MIC90值分别为0.12μg/mL和0.25μg/mL。BisEDT在抗MSSE方面比除了亚胺培南外的任何其它测试剂更有活性。BisEDT是测试的最有活性的抗MRSE剂。
BisEDT显示在抗万古霉素敏感性粪肠球菌(VSEfc)方面与达托霉素、万古霉素和亚胺培南等同的活性，MIC90值为2μg/ml。显然，BisEDT是测试的最有活性的抗万古霉素抗性粪肠球菌(VREfc)剂，MIC90值为1μg/mL。
BisEDT对抗万古霉素敏感性屎肠球菌(VSEfm)极有活性，MIC90值为2μg/mL；其活性等同于或类似于达托霉素并且比万古霉素的活性高一个稀释度。BisEDT和利奈唑胺是测试的最有活性的抗屎肠球菌(VREfm)剂，各自表现出2μg/mL的MIC90值。BisEDT抗化脓性链球菌的活性(MIC90值为0.5μg/mL)等同于万古霉素，大于利奈唑胺并且略小于达托霉素和头孢他啶。该化合物在0.5μg/mL或更低浓度时抑制了所有测试菌株。在这些研究中，对BisEDT最不敏感的种是无乳链球菌，其中观察到的MIC90值是16μg/mL。BisEDT的活性比除了庆大霉素外的所有测试物质都低。
BisEDT和比较剂对抗所包括的革兰氏阴性菌的活性表明对抗鲍氏不动杆菌的BisEDT功效(MIC90值为2μg/mL)，使BisEDT成为最有活性的测试化合物。比较剂针对大量测试分离株的提高的MICs导致这些剂不合量表的MIC90值。BisEDT是最有效的大肠杆菌抑制剂，在2μg/mL或更低浓度(MIC90＝2μg/mL)时抑制所有菌株。该化合物的活性比亚胺培南低，但比头孢他啶、环丙沙星和庆大霉素高。BisEDT还证明了对抗肺炎杆菌的活性，MIC90值为8μg/mL，这等同于亚胺培南。亚胺培南、头孢他啶、环丙沙星和庆大霉素表现出的相对高的MIC90值指示这是高度抗生素抗性的微生物组。BisEDT是测试化合物中最有效的抗铜绿假单胞菌剂，MIC90值为4μg/mL。对于该测试分离株组，存在对比较剂的高水平抗性。
总之，BisEDT显示针对代表多个种的多个临床分离株的广谱功效，包括通常与人中急性和慢性皮肤和皮肤结构感染相关的种。BisEDT和关键比较剂的活性针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的723个临床分离株来评估。BT化合物证明了广谱活性，并且对于该研究中的许多测试微生物而言，BisEDT在抗菌活性方面是测试化合物中最有效的。BisEDT对抗MSSA、MRSA、CA-MRSA、MSSE、MRSE和化脓性链球菌是最有效的，其中MIC90值是0.5μg/mL或更低。还证明了对VSEfc、VREfc、VSEfm、VREfm、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的强大活性，其中MIC90值在1-4μg/mL范围内。观察到针对肺炎克雷伯菌(MIC90＝8μg/mL)和无乳链球菌(MIC90＝16μg/mL)的MIC值。
实施例8
微粒BT-抗生素增强和协同活性
本实施例显示微粒铋-硫醇(BT)通过增强和/或协同相互作用来促进抗菌活性。
治疗感染时主要的恶化因子为细菌对抗生素出现抗性。表皮葡萄球菌(MRSE)和金黄色葡萄球菌(MRSA)中的甲氧西林抗性事实上反映了多耐药性，使得这些病原体很难根除。然而，从数百种试验的菌株中没有葡萄球菌显示对BT的抗性。此外，亚抑制(subMIC)浓度降低了对若干重要抗生素的抗性。
金黄色葡萄球菌。提供subMIC铋乙二硫醇(BisEDT)对MRSA的抗生素-再敏化作用的图解说明(图4)，显示若干类型抗生素，包括庆大霉素、头孢唑林、头孢吡肟、亚胺培南、磺胺甲噁唑和左氧氟沙星的增强的抗生素作用。因此，BisEDT非特异性增强大部分抗生素的活性。
使用若干与subMIC水平的BisEDT组合的抗生素进行针对12种MRSA菌株的肉汤稀释抗微生物敏感性研究(表18)。在特定生物膜培养基(BHIG/X)中测定生物膜预防浓度(BPC)和最小抑制浓度(MIC)两者。通过subMIC BisEDT(BisEDT MIC，0.2-0.4μg/ml)降低庆大霉素和头孢唑林的MIC和BPC，但不在敏感性拐点以下。subMIC BisEDT增强MRSA对接近于敏感性拐点的加替沙星和头孢吡肟的MRSA敏感性。这些菌株已对万古霉素敏感，但在存在subMIC BisEDT时更是如此。通常，用subMIC BisEDT降低MIC和BPC 2至5倍。
表18.
BT-抗生素组合物对MRSA的抗微生物活性
将12种MRSA临床分离物生长于BHIG/X并暴露于存在0-0.1μg/ml BisEDT的连续稀释的抗生素中。以μg/ml计算的MIC和BPC为来自至少三次试验的平均值±标准偏差。右侧列列出抗生素敏感性(S)和抗性(R)的标准MIC
头孢吡肟抗性MRSA分离株的肉汤稀释研究显示于表19。0.1μg/ml的BisEDT显著地增强12个分离株中的11个的头孢吡肟抑制活性。在该特定研究中，数据表明在敏感度拐点处的许多分离株在BisEDT和头孢吡肟之间的协同性(FIC<0.5)。
表19
头孢吡肟抗性MRSA被BisEDT敏化
37℃下在聚苯乙烯板的BHIG/X培养基中测试12个头孢吡肟抗性MRSA对与subMICBisEDT组合的头孢吡肟的敏感性48h。
与新青霉素或庆大霉素组合研究的结果示于表20。与新青霉素组合的BisEDT(0.2μg/ml)降低新青霉素对MRSA的MIC90达4倍多(FIC，0.74)。与庆大霉素组合的BisEDT降低庆大霉素对MRSA的MIC90超过10倍(FIC，0.6)。BT逆转了全部四种测试的庆大霉素抗性分离株对临床相应浓度的抗性[Domenico等，2002]。基本上降低这些抗微生物剂的MIC，特别是庆大霉素。用于这些研究的肉汤为含有2％葡萄糖的胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤(TSB)，其显示的结果与添加了1％羊血的Mueller-Hinton II肉汤中所看到结果的相似。
表20
MRSA：新青霉素或庆大霉素+BisEDT协同性
NAF或GM，μg/ml；0.2μg/ml的BE
表皮葡萄球菌。BisEDT的存在促进大部分抗生素的活性。关于BPC，当与BisEDT组合时克林霉素和加替沙星显示显著地对表皮葡萄球菌更强的抗生物膜活性(图5)。以不同的术语表述，存在subMIC BisEDT时，对于氯林肯霉素、加替沙星和庆大霉素的BPC分别降低50倍、10倍和4倍。
注意到对于米诺环素、万古霉素和头孢唑林在生物膜预防浓度(BPC)中仅中度降低，而在0.05μg/ml BisEDT利福平和新青霉素保持不受影响。在0.1μg/ml BisEDT未检测出生物膜，不管是否采用抗生素，表明没有拮抗发生。该BisEDT浓度对于表皮葡萄球菌接近于MIC[Domenico等，2003](参见图5)。
关于生长抑制，存在0.1μg/ml(0.5μΜ)BisEDT时8个试验的抗生素中有7个显著地增强对抗表皮葡萄球菌(图6)。对于克林霉素和庆大霉素MIC变化最明显，其次是万古霉素、头孢唑林、米诺环素、加替沙星和新青霉素，利福平不受影响。此菌株对其为抗性的抗生素(NC、CZ、GM、CM)中，仅头孢唑林的抗性被BisEDT逆转至临床相应水平。
对于大多数试验的抗生素与subMIC BisEDT对表皮葡萄球菌的最低杀菌浓度(MBC)略微降低。庆大霉素显示大的MBC降低(4至16倍)，其次为头孢唑林(4至5倍)、万古霉素和新青霉素(3至4倍)、米诺环素和加替沙星(2至3倍)，而克林霉素和利福平的MBC保持基本不变。克林霉素为抑菌剂，这说明其缺少杀菌活性。头孢唑林抗性对于MBC而言被逆转[Domenico等，2003]。这些作用是累积的。
在移植物感染大鼠模型的活体内还显示出抗微生物剂的增效作用(表21)。低至0.1μg/ml的BisEDT水平能够促进预防抗表皮葡萄球菌生物膜7天。
如表21所概括，用0.1μg/ml BisEDT、10μg/ml RIP和10μg/ml利福平浸渍植入物，单独或组合的被植入s.c.的大鼠。使用结核菌素注射器将以2×107cfu/ml含有MS和MR菌株的生理溶液(1ml)接种到移植物表面。所有的移植物在移植后7天时被移出并在无菌盐水溶液中超声5分钟以除去粘附的细菌。通过在血琼脂板上培养稀释物来获得活细菌的定量。检测极限大约为10cfu/cm2。
表21
RIP、BT和利福平抗移植物感染模型中的表皮葡萄球菌
a各组有15只动物；MS、甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌；MR、甲氧西林抗性表皮葡萄球菌
b用0.1mg/l BT、10mg/l RIP、10mg/l利福平浸渍过的涤纶移植物片断
c当与对照组MS和MR相比时统计学显著
d当与MS3组相比时统计学显著
e当与MR1、MR2和MR3组相比时统计学显著
革兰氏阴性菌。妥布霉素对抗性铜绿假单胞菌的活性用subMIC BisEDT增强若干倍(表22)。在这些试验中，更确切地将MIC定义为IC24。
表22
妥布霉素抗性铜绿假单胞菌：BisEDT作用
在存在妥布霉素(NN)和BisEDT(BE：0.33μg/ml)时将铜绿假单胞菌的抗性菌株在37℃培养于Mueller-Hinton II肉汤。将MIC测定为阻止24±1h生长的抗生素浓度。
0.4μg/ml BisEDT使10个分离株中的7个对妥布霉素抗性洋葱伯克霍尔德菌妥布霉素敏感(平均FIC：0.48)，并降低MIC90达10倍(表23)。用subMIC BisEDT显著地降低MIC和MBC两者以达到抵抗50临床洋葱伯克霍尔德菌分离株的水平[Veloira等,2003]。已证明脂质体形式的BisEDT和妥布霉素高度协同抵抗铜绿假单胞菌。(Halwani等，2008；Halwani等，2009)。
表23
妥布霉素和BisEDT对抗洋葱伯克霍尔德菌
a将被0.4μg/ml的BisEDT抑制的三个菌株从进一步研究中排除。FIC指标≤0.5表示协同性：FICI>0.5和<1.0表示增强。
通过添加subMIC BisEDT使氯霉素和氨苄西林抗性大肠杆菌对这些药物敏感(表24)。
表24
氯霉素/氨苄西林抗性大肠杆菌：BisEDT作用
在单独或组合存在氯霉素(CM)或氨苄西林(AMP)和BisEDT(BE:0.33μg/ml)下将大肠杆菌的抗性株在37℃培养于Mueller-HintonII肉汤中。将MIC测定为抑制长生24±1h的抗生素浓度。
通过添加subMIC BisEDT(表25)使四环素抗性大肠杆菌对多西环素敏感。所述组合显示针对TET M和TET D菌株(FIC≤0.5)的协同性，具有针对TET A和TET B菌株的相加作用。
表25
四环素抗性大肠杆菌：BisEDT作用
在单独或组合存在多西环素(DOX)和BisEDT(BE：0.33μg/ml)下将大肠杆菌抗性菌株37℃培养于Mueller-Hinton II肉汤中。将MIC测定为抑制生长24±1h的抗生素浓度。
参考文献：
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实施例9
微粒BT-抗生素增强和协同活性
本实施例显示微粒铋硫醇BisEDT通过与针对具体微生物靶有机物的具体抗生素的增强和/或协同相互作用而促进抗菌活性。对于各自的单点数据表明根据实施例8中使用的方法基本上产生表26中的组合。
表26
对于单点BisEDT-抗生素组合物的FICI值
SA，金黄色葡萄球菌；MRSA，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌；EFc，粪肠球菌；SP，肺炎链球菌；PRSP，青霉素抗性肺炎链球菌；EC，大肠杆菌；KP，肺炎克雷伯菌；PA，铜绿假单胞菌；Bcep，洋葱伯克霍尔德菌；Bmult，多噬伯克霍尔德菌；Abau，鲍氏不动杆菌；Msmeg，耻垢分支杆菌。
实施例10
微粒BT-抗生素增强和协同活性
测试如上所述制备的微粒Bis-EDT和四种Bis-EDT类似物以及抗若干革兰氏阴性病原菌的代表株的其它试剂的组合作用。使用改进的通用实验室方法来测定利用分级抑制浓度(FIC)和FIC指数(FICI)的协同性(FICI≤0.5)、增强(0.5<FICI≤1.0)、拮抗性(FICI>4.0)和无差别(1.0<FICI≤4.0)(Eliopoulos G and R Moellering.1991.Antimicrobialcombinations.In Antibiotics in Laboratory Medicine,第3版,V Lorian.编辑Williams和Wilkins,Baltimore,MD,第432-492页；Odds,2003J.Antimicrob.Chemother.52(1):1)。使用方格盘测定FIC指数并在该研究中采用。
表27
测试组分
将所有测试物品的原液制备为适当溶剂中的40×最终目标浓度。所有测试物品在这些条件下的溶液中。FIC分析板中的最终药物浓度设定为包括的各试剂对各测试微生物的MIC值，除非菌株对测试试剂完全抗性。测试的浓度范围显示于表27中。测试有机体原始接受于临床来源，或来自美国标准生物品收藏中心。接收时，将分离物划线到胰蛋白酶大豆琼脂II(TSA)上。从这些板上收获克隆并在包含低温防护剂的适当肉汤生长培养基中制备细胞悬浮液。然后在-80℃下冷冻等份物。使在给定的分析中待测试的微生物的冷冻种子解冻，将分离物划线到TSA板上，并在35℃下孵育。在Mueller Hinton II肉汤(BectonDickinson,批号9044411)中测试所有微生物。以1.05×正常重量/体积制备肉汤，从而在最终测试板中补偿5％体积的药物。
使用好氧菌的肉汤微稀释法事先测定最小抑制浓度(MIC)值(Clinical andLaboratory Standards Institute(CLSI).Methods for Dilution AntimicrobialSusceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved Standard-第8版。CLSI文件M07-A8[ISBN 1-56238-689-1].Clinical and Laboratory StandardsInstitute,940West Valley Road,Suite 1400,Wayne,Pennsylvania 19087-1898 USA,2009)。
使用之前描述的肉汤微稀释法(Sweeney等，2003 Antimicrob.AgentsChemother.47(6):1902-1906)测定FIC值。为制备测试板，使用自动液体处理器(Multidrop384,Labsystems,Helsinki,Finland；Biomek 2000 and Multimek 96,Beckman Coulter,Fullerton CA)来进行连续稀释和液体转移。
使用Multidrop 384在第2-12列中，将150μL适当的溶剂填入标准96-孔微稀释板(Falcon 3918)的适当孔中。将300微升各第二测试药物添加到板第1列的各孔中。对于药物组合板，使用这些板来制备提供连续药物稀释的药物“母板”。使用Biomek 2000来从母板的第1列的孔中转移150μL各第二药物溶液(40×)，并进行11次2倍连续稀释。使用多通道移液管，手动将Bis-EDT(和类似物)的母板从顶到底连续稀释。通过转移等体积(使用多通道移液管)到药物组合板来组合两块母板(一块用于各第二药物和一块用于Bis-EDT(或类似物))以形成“方格盘”图案。第H行和12列各自包含用于MIC测定的单独的一种试剂的连续稀释。
使用Multidrop 384在“子板”装入180μL测试培养基，然后，在单独的步骤中使用Multimek 96从药物组合母板的各孔转移10μL药物溶液到子板各自相应的孔中。最后，用测试微生物接种子板。按照公开的指南(CLSI,2009)来制备各微生物的标准化的种菌。对于所有分离物，将各微生物的种菌分散到由长度(Beckman Coulter)分割的无菌储藏所，并使用Biomek 2000来接种板。仪器递送10μL标准化的种菌到各孔以在子板中产生大约5×105菌落形成单位/mL的最终细胞浓度。
在创建8×12方格盘中产生测试格，其中以变化的药物浓度比来单独(第12列和H行)和组合测试各化合物。所有微生物板堆叠三个高度，在顶板上用盖盖住，放入塑料袋，并在35℃孵育大约20小时。孵育后，从培育箱中除去微板并使用ScienceWare板查看器从底部观察。标记制备的阅读卡片的药物1的MIC(H行)、药物2的MIC(12列)以及生长-非生长界面的孔。
使用Excel程序根据下式测定FIC：(组合的化合物1的MIC/单独的化合物1的MIC)+(组合的化合物2的MIC/单独的化合物2的MIC)。由单独的FIC通过式：(FIC1+FIC2+...FICn)/n来计算方格盘的FICI，其中n＝计算FICs的每块板的单个孔的数量。在单个试剂产生不合格的MIC结果的情况中，将其次的高度浓度用作FIC计算中的MIC值。
微粒BisEDT、四种微粒BT类似物以及全部其它试剂(和试剂的组合)在所有最终测试浓度是可溶的。测定的MIC和FICI值示于下表中。
表28
对于MB-1B-3和哌拉西林的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表29
对于MB-1B-3和氨曲南的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表30
MB-15和哌拉西林的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表31
MB-15和氨曲南的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表32
MB-8-2和哌拉西林的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表33
MB-8-2和氨曲南的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FlCI,分级抑制浓度指数
表34
MB-11和哌拉西林的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表35
MB-11和氨曲南的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表36
MB-2B和哌拉西林的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
11MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表37
MB-2B和氨曲南的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表38
MB-1B-3和头孢噻肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表39
MB-1B-3和头孢吡肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表40
MB-15和头孢噻肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表41
MB-15和头孢吡肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表42
MB-8-2和头孢噻肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表43
MB-8-2和头孢吡肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表44
MB-11和头孢噻肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表45
MB-11和头孢吡肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表46
MB-2B和头孢噻肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
表47
MB-2B和头孢吡肟的最小抑制浓度和分级抑制浓度结果的汇总
1MIC,最小抑制浓度
2FICI,分级抑制浓度指数
实施例11
铋硫醇对大鼠股骨临界缺损中的感染的作用
开放骨折护理的现行标准为冲洗、清创术和抗生素；其目的是降低伤口中的细菌载量至不发生感染的程度。尽管有这些治疗，但对于开放性胫骨骨折感染仍然恶化达到75％的严重度。有趣的是，即使通常由革兰氏阴性菌引起早期感染，也会将涉及到治愈问题和切除的晚期感染应归于革兰氏阳性感染，通常葡萄球菌种类(Johnson 2007)。
金黄色葡萄球菌抗标准治疗的原因之一是它们能够形成生物膜。生物膜中的细菌能够抵抗将杀死培养基中的相似微生物的抗微生物化合物(Costerton 1987)。
本研究的目的是测定BT或者独立地或者与抗生素是否将降低污染的开放性骨折模型中的感染。污染的大鼠股骨临界缺陷模型是良好的接受模型并用于本实施例所述的实验。该模型提供用于比较各种潜在治疗及其对降低感染和/或改善治愈的作用的标准化模型。
化合物(CPD)CPD-8-2(铋吡啶硫酮/丁二硫醇：表1)和CPD-11(铋吡啶硫酮/乙二硫醇：表1)是已显示抵抗活体外生物膜藏匿的细菌潜能的两种BIS-BiS类似物，尽管活性谱不同于Bis-EDT。
当与和不与聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)粘合剂珠媒介物中的妥布霉素和万古霉素使用时，三种BT制剂，Bis-EDT、CPD-11和CPD-8-2(参见表1)显示对活体外的金黄色葡萄球菌的抑制作用。将三种微粒BT制剂生产为本文所述的临床上有用的水凝胶凝胶形式。将这些BT以5mg/ml-1的浓度悬浮于凝胶中测试，已发现该浓度是凝胶递送的适当浓度。凝胶制剂覆合于伤口轮廓，并不需要在应用后去除。
使用两个治疗组(treatment arm)：在第一组中，单独使用BT；在第二组中，使用BT和全身性抗生素(ABx)。
(a)BT单独。
用金黄色葡萄球菌培养后六小时，清除伤口，用盐水冲洗并将1ml BT凝胶插入缺口内。
(b)BT和全身性抗生素(ABx)。
用金黄色葡萄球菌培养后六小时，清除伤口，用盐水冲洗并将1ml添加的BT凝胶插入缺口内。使用的抗生素为相当于5mgKg-1剂量的头孢唑林，损伤后经由每天两次皮下注射共3天。在清除前立即施用第一剂量。以前的数据显示该剂量将导致细菌水平由≈106降低到≈104，因此仍然允许待测量的不同BT的相关作用。
(c)对照
用金黄色葡萄球菌培养后六小时，用盐水清除和冲洗伤口。还用头孢唑林按照上述方式治疗对照动物。
程序:
如Chen等所述进行活体内大鼠损伤模型的程序。(2002 J.Orthop.Res.20:142；2005 J.Orthop.Res.23:816；2006 J.Bone Joint Surg.Am.88:1510；2007J.Orthop.Trauma 21:693)。将大鼠麻醉并准备手术。通过3cm切痕暴露股骨骨干的前外侧部分。将骨外膜和所附肌肉从骨剥离。将聚乙酰基板(27×4×4mm)放到股骨的前外侧面上。预钻孔板以接受0.9mm直径的线状基尔希讷氏丝。形成这些板的基质以适合股骨骨干的轮廓。使用板作为模板将导向孔钻通股骨的两外壳，并将线状基尔希讷氏丝插入通过板和股骨。将离板6mm的切口用作骨除去向导。使用小往复锯来产生缺陷，同时通过连续冲洗以努力预防热损伤来将组织冷却。
用1×105CFU的金黄色葡萄球菌来接种若干组的各10只动物，并在如上所述培养后用BT单独或与抗生素的组合来治疗6小时。组如下：Bis-EDT凝胶；MB-11凝胶；MB-8-2凝胶；Bis-EDT凝胶&Abx；MB-11凝胶&Abx；MB-8-2凝胶&Abx；对照(Abx单独)。
手术后14天麻醉动物，将骨和硬件送去微生物分析，其结果示于图7。
基于功效分析，每组10只动物将给出80％的功效以检测治疗和对照组之间25％的差异。这支持35％的预期标准偏差和0.05的α。
如图7所示，与Bis-EDT、MB-11和MB-8-2组合的头孢唑林相对于头孢唑林或单独的Bis化合物增强了抗菌活性以降低损伤的骨的金黄色葡萄球菌感染。与单独的头孢唑林相比，与MB-11和MB-8-2组合的头孢唑林显示增强的抗菌活性以降低硬件上检出的金黄色葡萄球菌感染。在这一点上Bis-EDT似乎并不影响头孢唑林的活性。
实施例12
含铋化合物抵抗海洋生物的活性
该实施例描述含铋化合物的抗微生物活性。通过本领域技术人员实施的常规方法来测定铋二巯基丙醇(BisBAL)、铋二巯基甲苯(BisTOL)和铋乙二硫醇(BisEDT)等三种含铋化合物抵抗三种不同海洋细菌的MIC值。数据示于下表中：
BT化合物(μg/ml) BisBAL BisTOL BisEDT
溶藻弧菌(V.alginolyticus) 3.1 1 0.1
海水盐单胞菌(H.marina) 17.5 7.2 2.6
除烃海杆菌(M.hydrocarbonoclasicus) 2 0.4 .28
实施例13
含铋化合物对藤壶附着行为的作用
化合物，BisBAL和BisTOL包括在测定法中以测定各化合物对藤壶幼虫附着行为的抑制活性。方法根据本领域实践的技术来进行。BisBAL具有1.6ppm的EC50(产生50％附着抑制的浓度)，而BisTOL具有15.4ppm的EC50。在另一实验中，将BisEDT直接溶解在天然海水中或者首先溶解在DMSO中，然后稀释于天然海水中。EC50测定值有统计学差异。当直接溶解于海水中时，BisEDT具有1.5ppm的EC50，而当首先溶解在DMSO中时，其具有2.1ppm的EC50。市售杀虫剂，SEANINE 211的EC50为0.5ppm。
实施例14
含铋化合物对海藻附着的影响
测定铋二巯基丙醇(BisBAL)、铋二巯基甲苯(BisTOL)以及铋乙二硫醇(BisEDT)等三种含铋化合物对海藻附着的影响，特别是各化合物抑制浒苔孢子(Enteromorpha spore)发芽的能力。在0.001、0.01、0.1、1.0和10.0μg/ml下测试各化合物。BisEDT是最有效的化合物，在1μg/ml BisEDT下，抑制约50％的海藻孢子群发芽，而在10μg/ml下，抑制约75％海藻孢子发芽。至多10毫克/ml的BisBAL和BisTOL对该特定海藻种类的孢子发芽没有抑制作用。
实施例15
含铋化合物对海藻附着的影响
根据本领域实施的技术测定铋二巯基丙醇(BisBAL)、铋二巯基甲苯(BisTOL)和铋乙二硫醇(BisEDT)等三种含铋化合物对海洋硅藻的生长作用。通过分别增加三种化合物的浓度(0.001、0.01、0.1、1.0和10.0μg/ml)来抑制海洋硅藻的附着(硅藻/视野)。在0.1μg/ml下各化合物表现出抑制活性；BisEDT最活跃，其显示约100％抑制。在0.1μg/ml下BisTOL和BisBAL各自表现出约30％的海洋硅藻附着。
参考文献：Costerton等，Ann Rev Microbiol.1987；41:435-64；Domenico等，Antimicrob Agents and Chemother.2001；45(5):1417-21；Halwani等，Int JPharm.2008；358:278-84；Johnson等，Clin Infect Dis.2007；45(4):409-415.ADACouncil on Scientific Affairs.Direct and indirect restorative materials.JADA2003；134:463-72.Alliance for Coastal Technologies(ACT).2004.BiofoulingPrevention Technologies for Coastal Sensors/Sensor Platforms.University ofMaryland Center of Environmental Science,Workshop Proceedings,November2003.UMCES Technical Report Series No.TS-426-04-CBL,Solomons,MD.Athanassiadis等，Aust Dent J 2007；52:S64-82.Alt等，Antimicrob Agents Chemother 2004；48:4084-88.Bayston等，Biomaterials 2009；30:3167-73.Bernardo等，JADA 2007；138:775-783.Beytha等,J Dent 2007；35:201-206.Bohner等，J Pharm Sci 1997；86:565-72.Bruxton,Eng News 1908；59,525；Chem.Abs.，2:2010.Bueno等，Oral Surg Oral MedOral Pathol Oral Radiol Endod 2009；107:e65-9.Cao等，ACS Applied Materials&Interfaces,2009；1:494.Centers for Disease Control and Prevention(US).Guidelines for 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可组合上述各种实施方案以提供另外的实施方案。通过参考以其整体将本说明书中涉及的和/或应用数据页中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开并入本文。如果需要可采用各种专利、申请和公开的构思来修改实施方案的各方面以提供其它另外的实施方案。
根据上述详细说明可对实施方案进行这些及其它改变。通常，在下述权利要求书中，使用的术语不应解释为将权利要求限定到说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应解释为包括与该权利要求所规定的全部等同范围一起的所有可能的实施方案。因此，权利要求并不受公开内容所限定。

Claims (20)

1.一种用于针对细菌、真菌或病毒病原体保护制品的表面的方法，其包括：
使所述制品的表面与有效量的、包含铋-硫醇(BT)组合物的消毒剂在足以满足以下一种或多种的条件和时间下接触：
(i)预防所述制品的表面被所述细菌、真菌或病毒病原体感染，
(ii)抑制所述细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，
(iii)抑制由所述细菌、真菌或病毒病原体的生物膜形成，和
(iv)抑制所述细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，
其中所述BT组合物包含固体微粒的基本上单分散混悬物，所述固体微粒的基本上单分散混悬物包含BT化合物，所述微粒具有约0.4μm至约10μm的体积平均直径，其中所述BT组合物包含选自以下的一种或多种BT化合物：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇和Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇，并且其中所述铋-硫醇化合物未被微粉化、研磨或未经历超临界流体加工。
2.一种用于针对细菌、真菌或病毒病原体保护天然或人工表面的方法，其包括：
使所述天然或人工表面与有效量的、包含铋-硫醇(BT)组合物的消毒剂在足以满足以下一种或多种的条件和时间下接触：
(i)预防所述天然或人工表面被所述细菌、真菌或病毒病原体感染，
(ii)抑制所述细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，
(iii)抑制由所述细菌、真菌或病毒病原体的生物膜形成，和
(iv)抑制所述细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，
其中所述BT组合物包含固体微粒的基本上单分散混悬物，所述固体微粒的基本上单分散混悬物包含BT化合物，所述微粒具有约0.4μm至约10μm的体积平均直径，其中所述BT组合物包含选自以下的一种或多种BT化合物：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇和Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇，其中所述铋-硫醇化合物未被微粉化、研磨或未经历超临界流体加工。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述表面存在于(i)手术部位处；(ii)医疗装置或医学植入体上；(iii)牙科装置或牙科植入体上；或(iv)骨、关节、腱、韧带或牙齿上。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述医疗装置或医学植入体是骨或关节假体、导管、支架、饲管或胃造口术导管。
5.一种用于针对细菌、真菌或病毒病原体保护制品的方法，所述方法包括：
使所述制品与有效量的、包含铋-硫醇(BT)组合物的消毒剂在足以满足以下一种或多种的条件和时间下接触：
(i)预防所述制品被所述细菌、真菌或病毒病原体感染，
(ii)抑制所述细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有浮游细胞的细胞活力或细胞生长，
(iii)抑制由所述细菌、真菌或病毒病原体的生物膜形成，和
(iv)抑制所述细菌、真菌或病毒病原体的基本上所有生物膜形式细胞的生物膜活力或生物膜生长，
其中所述BT组合物包含固体微粒的基本上单分散混悬物，所述固体微粒的基本上单分散混悬物包含BT化合物，所述微粒具有约0.4μm至约10μm的体积平均直径，其中所述BT组合物包含选自以下的一种或多种BT化合物：BisBAL、BisEDT、Bis-二巯基丙醇、Bis-DTT、Bis-2-巯基乙醇、Bis-DTE、Bis-Pyr、Bis-Ery、Bis-Tol、Bis-BDT、Bis-PDT、Bis-Pyr/Bal、Bis-Pyr/BDT、Bis-Pyr/EDT、Bis-Pyr/PDT、Bis-Pyr/Tol、Bis-Pyr/Ery、铋-1-巯基-2-丙醇和Bis-EDT/2-羟基-1-丙硫醇，其中所述铋-硫醇化合物未被微粉化、研磨或未经历超临界流体加工。
6.如权利要求1、2或5所述的方法，其中所述制品的表面、所述天然或人工表面或所述制品包括以下中的一种或多种：水泥表面、混凝土表面、橡胶表面、硅酮表面、塑料表面、涂漆表面或涂抹表面。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述天然或人工表面针对细菌病原体被保护，
其中所述天然或人工表面包括以下中的一种或多种：(i)骨或关节假体；和(ii)临近所述骨或关节假体的组织或骨骼结构，和
其中所述消毒剂包含所述BT组合物作为骨粘合剂中的含微粒BT化合物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述骨粘合剂包括水凝胶。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述水凝胶包括聚甲基丙烯酸甲酯。
10.如权利要求1-5和7-9任一项所述的方法，其中所述BT化合物是BisEDT。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述微粒具有0.4μm至5μm的体积平均直径。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述微粒具有0.7μm至4μm的体积平均直径。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述微粒具有1.0μm至3μm的体积平均直径。
14.如权利要求10所述的方法，其中全部微粒的至少80％具有0.4μm至5μm的体积平均直径。
15.如权利要求10所述的方法，其中全部微粒的至少95％具有0.4μm至5μm的体积平均直径。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述微粒具有约1.3微米的体积平均直径。
17.如权利要求10所述的方法，其中所述微粒的尺寸分布是单峰的。
18.如权利要求10所述的方法，其中所述组合物进一步包括甲基纤维素和
19.如权利要求10所述的方法，其中所述组合物是液体悬浮液。
20.如权利要求10所述的方法，其中所述组合物是气雾剂悬浮液。
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