CN112640907B - 硫辛酸抑制植物真菌致病菌的新用途及防治柑橘果实采后真菌病害的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了硫辛酸在抑制植物真菌致病菌中的应用、硫辛酸在防治柑橘炭疽病、柑橘酸腐病和柑橘青霉病中的应用。还公开了一种防治柑橘果实采后真菌病害的方法：采用浓度范围为0.4～3.2mg/mL的硫辛酸处理采后柑橘果实。还公开了一种新型果蔬防腐保鲜剂：包含浓度为0.4～3.2mg/mL的硫辛酸。本发明经过实验研究证明，硫辛酸对青霉菌表现出良好的抑制作用，提高果皮抗氧化活性，有效降低果实发病率，可以作为新型天然果蔬防腐保鲜剂；硫辛酸还对胶孢炭疽菌和酸腐病菌具有良好的抑制作用。

Description

硫辛酸抑制植物真菌致病菌的新用途及防治柑橘果实采后真 菌病害的方法
技术领域
本发明涉及硫辛酸的新用途，具体涉及一种硫辛酸抑制植物真菌致病菌的新用途及防治柑橘果实采后真菌病害的方法。
背景技术
柑橘果实口感细腻，营养价值高，受到广大消费者的喜欢。然而，柑橘在采后易受真菌感染，特别是宽皮类柑橘。主要侵染真菌有指状青霉(Penicillium digitatum)、意大利青霉(Penicillium italicum)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、酸腐病菌(Geotrichum citri-aurantii)、链格孢菌(Alternaria citri)等。其中，指状青霉(无性型真菌门、半知菌纲、壳霉目、杯霉科)引起的绿霉病和意大利青霉(无性型真菌门、半知菌纲、壳霉目、杯霉科)引起的青霉病是柑橘采后最具破坏性的病害，不仅影响果实使用价值，还会造成严重的经济损失。此外，青霉病在世界范围内流行，即使使用纸盒包装的柑橘在低温下贮藏也能迅速传播，危害性尤其大。长时间以来，传统的物理方法，如热处理、冷藏、电离辐射等，可用于控制采后果实腐烂，但都不能完全控制。另一方面，化学杀菌剂如抑霉唑和多菌灵对采后病害有一定控制作用，但近年出现病原体产生抗药性，其药效有所下降。更有甚者，为了达到充分的病害控制效果，使用合成杀菌剂，这可能会对非靶向微生物、食品安全和人类健康造成危害及一定程度上环境污染。因此，为农产品采后贮藏与保鲜开发安全、绿色环保的天然杀菌剂具有重要价值。
胶孢炭疽菌为炭疽菌属的一种，引起植株炭疽病，病害症状主要为害叶片，多从叶尖、叶缘发病，或于叶片表面着生近圆形的病斑；病斑圆形或不规则形，边缘黑褐色，内部凹陷，灰褐色或灰黑色；后期着生小黑点，病健交界明显。酸腐病菌(Geotrichum citri-aurantii)是重要的采后病原真菌，常会导致柑橘果实的严重腐烂和重大的经济损失。
硫辛酸(alpha lipoic acid)是一种存在于线粒体的辅酶，是动物有氧代谢必需的小分子辅酶，具有天然生物安全性；是多方面的生物活性剂，还被认为是强抗氧化剂，主要研究领域为临床医学。关于硫辛酸对果蔬采后主要致病菌的抑制效果研究鲜见报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种硫辛酸在抑制植物真菌致病菌中的应用。
优选地，所述植物为柑橘。
优选地，所述应用为硫辛酸在抑制柑橘炭疽病致病菌、柑橘酸腐病致病菌或柑橘青霉病致病菌中的应用。
所述柑橘炭疽病致病菌为胶孢炭疽菌，所述柑橘酸腐病致病菌为酸腐病菌，所述柑橘青霉病致病菌为意大利青霉菌。
本发明的另一目的是提供硫辛酸在防治柑橘炭疽病、柑橘酸腐病和柑橘青霉病中的应用。
所述柑橘炭疽病的致病菌为胶孢炭疽菌，所述柑橘酸腐病的致病菌为柑橘酸腐病菌，所述柑橘青霉病的致病菌为意大利青霉菌。
本发明的再一目的是提供一种防治柑橘果实采后真菌病害的方法，采用浓度范围为0.4～3.2mg/mL的硫辛酸处理采后柑橘果实；优选浓度为0.4～1.6或0.5～1.2mg/mL。
优选地，所述硫辛酸溶液浓度为1mg/mL，采用磷酸缓冲液配制，所述真菌病害为柑橘青霉病。
本发明的最后一目的是提供一种新型果蔬防腐保鲜剂，包含浓度为0.4～3.2mg/mL的硫辛酸；优选0.4～1.6或0.5～1.2mg/mL。
优选地，所述硫辛酸溶液浓度为1mg/mL，采用磷酸缓冲液配制。
本发明的有益效果是：经过实验研究证明，与对照相比，硫辛酸对青霉菌生理指标有显著抑制作用；接种4d的果实，对照组病斑直径达20.46mm，处理组为15.94mm，同时，果皮中丙二醛含量低于对照，而果皮中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性显著高于对照。硫辛酸对青霉菌表现出良好的抑制作用，提高果皮抗氧化活性，有效降低果实发病率，可以作为新型天然果蔬防腐保鲜剂。本发明通过实验验证，硫辛酸还对胶孢炭疽菌和酸腐病菌具有良好的抑制作用。
附图说明
图1是硫辛酸对意大利青霉菌生长的影响结果，其中，(A)菌落生长图；(B)菌落直径，不同小写字母表示各处理组间存在显著差异(p<0.05)。
图2是硫辛酸对意大利青霉菌孢子萌发的影响结果，其中，(A)孢子萌发显微图(Bars＝50μm)；(B)孢子萌发率，不同小写字母表示各处理组间差异显著(p<0.05)。
图3是硫辛酸对意大利青霉菌细胞膜渗透性和细胞蛋白质、核酸外泄的影响结果，其中，(A)相对电导率；(B)蛋白质吸光值；(C)核酸吸光值；*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图4是硫辛酸对意大利青霉菌内蛋白质和总糖含量的影响结果，(A)蛋白质；(B)总糖；*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图5是硫辛酸对意大利青霉菌过氧化氢含量的影响结果，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图6是硫辛酸对采后椪柑果实病斑扩展效果的预实验结果，其中，(A)青霉菌发病情况；(B)病斑扩展抑制率。
图7是1mg/mL的硫辛酸对采后椪柑果实病斑扩展效果的影响结果，其中，(A)青霉菌发病情况；(B)青霉菌病斑直径，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图8是硫辛酸对果皮丙二醛含量的影响结果，**表示p<0.01。
图9是硫辛酸对果皮中抗氧化酶活的影响结果，其中，(A)PAL；(B)PPO；(C)SOD；(D)POD；*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图10是硫辛酸对果皮中总黄酮总酚含量的影响结果，其中，(A)总黄酮含量；(B)总酚含量；*表示p<0.05，**表示p<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
1材料与方法
1.1材料与试剂
椪柑，2019年12月30日前往重庆市北碚区歇马镇柑橘基地采摘，当天下午运回实验室。挑选出大小颜色均匀，无损伤、无病害的果实，用清水洗净后晾干备用。意大利青霉菌，由中国科学研究院华南植物园龚亮副教授提供。
试剂购买来源：
硫辛酸(AR)，上海易汇生物科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯葡萄糖肉汤(AR)，北京奥博星生物技术有限责任公司；蒽酮(AR)，国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯、葡萄糖(AR)，成都市科龙化工试剂厂；牛血清蛋白(BR)，如吉生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250(BR)，成都市科龙化工试剂厂；无水乙醇(AR)，重庆川东化工(集团)有限公司；硫酸、三氯乙酸、硫酸亚铁铵、硫氰酸钾(AR)，成都市科隆化学品有限公司；愈创木酚(AR)，中国佘山化工厂；l-苯丙氨酸(AR)，上海泰坦科技股份有限公司；硫代巴比妥酸(BR)，上海科丰实业有限公司；氮蓝四唑(BR)，上海恒远生物科技有限公司。
1.2仪器与设备
ZWY-200D恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；SW-CJ-2FD净化工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DDS-307型电导仪，上海精密科学仪器有限公司；TU1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HZK-FA210S电子天平，福州华志可科学仪器有限公司；OLYMPUS BX43型成像显微镜，日本OLYMPUS公司。
1.3实验方法
1.3.1意大利青霉菌生长情况的测定
无菌条件下将配制的8mg/mL硫辛酸母液(pH＝7.2的磷酸缓冲液配制而成，磷酸缓冲液为磷酸缓冲液为Na2HPO4·12H2O 17.806g+NaH2PO4·2H2O 7.8g，加水溶解、定容至1L)加至PDA培养基中，使其终浓度分别为0.4、0.8、1.6和3.2mg/mL。用直径为5mm的无菌打孔器在生长良好的菌落边缘打孔，将菌饼转接于含药培养基中央，于26℃恒温培养，分别在第1、3和5天通过十字交叉法测定菌落直径。以加入等量PBS作为对照组，重复3次。
1.3.2硫辛酸对青霉菌最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum fungicidal，MFC)的测定
菌悬液的制备：无菌条件下，将青霉菌接种到PDA培养基，26℃培养，5天后，用无菌水冲洗至锥形瓶中，过滤形成孢子悬浮液，采用血球计数法，使孢子浓度控制在1×107个/mL。
将硫辛酸母液加至PDA培养基混合，制成终浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mg/mL含药培养基，采用平板涂布法，置于26℃的培养箱中培养，重复3次。2天后观测，以无菌生长的最低含药浓度为最小抑菌浓度(MIC)，将无菌生长的培养皿继续培养7天后观察，以无菌生长的最低含药浓度为最小杀菌浓度(MFC)。
1.3.3硫辛酸对意大利青霉抑菌活性的室内毒力测定
无菌条件下将配制的8mg/mL硫辛酸母液加至PDA培养基中,使其终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2mg/mL，按照前述“1.3.1”部分所述方法。运用SPSS 26.0软件，以硫辛酸浓度的对数值为横坐标，平均菌丝生长直径的机率值为纵坐标，计算毒力回归方程、相关系数(r)、半数效应浓度(EC50)、70％的有效浓度(EC70)和置信区间。
1.3.4青霉菌孢子萌发率的测定
最终浓度分别为0.4、0.8、1.6和3.2mg/mL的PDA培养基中间用无菌打孔器形成5mm×2mm的圆饼放置在载玻片上，并在圆饼上接种50μL1×107个/mL的孢子悬浮液，然后置于铺有湿润滤纸的培养皿中，26℃培养。当孢子芽管长度超过孢子宽度时视为萌发，统计各个时间点不同浓度硫辛酸处理后孢子萌发。统计孢子萌发时，随机观察视野内孢子总数不少于300个。以加入等量PBS缓冲液作为对照组，重复3次。
孢子萌发率(％)＝(孢子萌发数/调查孢子总数)×100％
1.3.5细胞膜透性测定
细胞膜透性测定方法参照曾荣(曾荣.凤仙透骨草抑菌活性成分、抑菌机理及对柑橘防腐保鲜效果的研究[D].南昌大学,2012:92-110.)稍加修改。硫辛酸母液用灭菌水稀释至抑制率为70％的有效浓度(1.297mg/mL)。用5mm的打孔器在生长良好的菌落边缘打孔，获得菌饼，将20个5mm的菌饼分别放入20mL1.297mg/mL硫辛酸溶液和等量PBS缓冲液的小锥形瓶中，采用DDS-307型电导仪分别在0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测定电导率，10h后，把小锥形瓶煮沸死处理8min，再次测电导率。用相对电导率来表示细胞膜通透性，试验重复3次，相对电导率的计算公式如下：
Figure BDA0002904773430000051
式中：C表示各时间点电导率；C0表示0h时的电导率；C1表示死处理后的电导率。
1.3.6青霉菌细胞蛋白质和核酸物质外渗的测定
参照曾荣(曾荣.凤仙透骨草抑菌活性成分、抑菌机理及对柑橘防腐保鲜效果的研究[D].南昌大学,2012:92-110.)稍加修改。在20mLPDB培养基中加入1块直径为5mm意大利青霉菌饼，在28℃静置培养。4d后加入硫辛酸溶液至终浓度为3.2mg/mL，对照组加入等量的PBS缓冲液，28℃静置培养。在0、1、2、3、4、5、6、7h分别取2mL培养液10000r/min室温离心5min，取上清液在280nm(蛋白质)和260nm(核酸)处的吸光值。
1.3.7青霉菌总糖含量、蛋白质含量测定
参照曾荣(曾荣.凤仙透骨草抑菌活性成分、抑菌机理及对柑橘防腐保鲜效果的研究[D].南昌大学,2012:92-110)和杨书珍(杨书珍.蜂胶中抗意大利青霉活性成分的追踪及抑菌作用研究[D].华中农业大学,2009:68-82)稍加修改。称取青霉菌0.2g，冰浴研磨，转入锥形瓶加水至20mL，封口，沸水中提取15min，冷却至室温，定容到100mL，在容量瓶中加入1mL10％醋酸铅溶液，混匀，沉淀样品中的蛋白质。待反应完全后，再加入0.2g草酸，除去过量的醋酸铅，混匀，过滤得上清液备用。取滤液2mL至干净试管，加入0.5mL蒽酮，小心加入5mL浓硫酸，摇匀，试管置于沸水浴中加热5min。冷却至室温，静置10min，在620nm波长处测定吸光值，试验重复3次。
称取0.1g青霉菌，冰浴研磨，定容至10mL，4℃，10000r/min冷冻离心20min。准确量取0.1mL上清液，再加入0.9mL蒸馏水，5mL考马斯亮蓝G-250，充分混合，放置2min，在595nm处测定吸光值，试验重复3次。
1.3.8青霉菌过氧化氢含量的测定
参照吴雅兰(吴雅兰.几种芳香物质对柑橘采后主要致病菌的作用[D].湘潭大学,2017:10-48.)稍作修改。灭菌的PDB培养基，调节孢子终浓度为1×107个/mL，硫辛酸终浓度为0.0mg/mL和70％的有效浓度(1.297mg/mL)，置于160r/min振荡培养24h、48h。随后在4000r/min离心10min，水洗两次。取样品0.1g，加入4mL 50％三氯乙酸溶液，4000r/min离心30min。取上清液1.6mL和0.4mL10 mmol/L硫酸亚铁铵溶液和0.2mL 2.5mol/L硫氰酸钾溶液混合，在480nm测定吸光值。
1.3.9椪柑果实病斑扩展效果测定
参照SELLAMUTHU P S(SELLAMUTHU P S,SIVAKUMAR D,SOUNDY P,etal.Essential oil vapours suppress the development of anthracnose and enhancedefence related and antioxidant enzyme activities in avocado fruit[J].Postharvest Biology and Technology.2013,81:66-72.)略作修改，先进行预实验选择最适宜的硫辛酸实验浓度，然后采用最适宜的硫辛酸浓度进行采后椪柑果实病斑扩展效果测定。具体方法为：挑选大小及颜色均一、无机械损伤和病虫害的椪柑，清水冲洗后自然晾干。用无菌打孔器在果实赤道部位刺孔(直径2mm，深2mm)，取8μL孢子悬浮液(1×107个/mL)和硫辛酸溶液(预实验设置三个浓度0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL)注入孔内。放置晾干2-3h，保鲜袋包裹果实，置于无菌箱，25℃贮藏。分别在第1、3、5和7d拍照记录果实发病情况，并用十字交叉法测量病斑直径。以孔内注入等量PBS缓冲液作为对照组，每处理30个果实，试验重复2次。
预实验确定最适宜的硫辛酸实验浓度后采用最佳处理浓度进行采后椪柑果实病斑扩展效果测定，根据预实验结果确定硫辛酸最佳处理浓度为1mg/mL，具体方法同预实验，分别在第1、2、3和4d拍照记录果实发病情况，并用十字交叉法测量病斑直径。以孔内注入等量PBS缓冲液作为对照组，每处理30个果实，试验重复2次。
1.3.10果皮中丙二醛含量的测定
参照盖智星(盖智星,贺明阳,曾小峰,等.采后柑橘与胶孢炭疽菌互作过程中果皮成分的动态变化[J].食品科学,2016,37(10):266-271.)略作修改。反应物为2mL提取液和2mL 0.67％硫代巴比妥酸溶液，混合后沸水浴煮沸20min，冷却至室温离心，测定450、532和600nm处的吸光值。
1.3.11果皮中抗氧化酶活的测定
参照盖智星(盖智星,贺明阳,曾小峰,等.采后柑橘与胶孢炭疽菌互作过程中果皮成分的动态变化[J].食品科学,2016,37(10):266-271.)和程玉娇(程玉娇,秦文霞,赵霞,等.间歇热处理对血橙变温物流保鲜品质的影响[J].食品与发酵工业,2016,42(10):196-203.)稍作改动。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)测定以0.5mL20mmol/L l-苯丙氨酸为底物，加入0.5mL粗酶液混合后在290nm处的吸光值。以1h增加0.01的酶量为一个酶活单位。多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)根据邻苯二酚法。2mL50mmol/L磷酸缓冲液、0.5mL 100mmol/L邻苯二酚，最后加入50μL酶提取液，快速反应后在420nm处测得吸光值，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1为一个活性单位。超氧化歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)按照氮蓝四唑光还原法。3.4mL 50mmol/L磷酸缓冲液、0.6mL 130mmol/L l-蛋氨酸溶液、0.6mL 750μmol/L氮蓝四唑溶液、0.6mL 100μmol/LEDTA-Na2溶液、0.6mL40μmol/L核黄素溶液、0.2mL酶液(对照加入磷酸缓冲液)在35℃光照反应20min，完成后置于暗处5min，最后在560nm处测得吸光值，以每分钟每克果蔬组织的反应体系对氮蓝四唑光化还原的抑制为50％为一个SOD活性单位。过氧化物酶(Peroxidase，POD)依照愈创木酚法。3mL 25mmol/L愈创木酚溶液、100μL酶液，最后加入40μL 0.5mol/L过氧化氢溶液，快速开始反应在470nm处测定吸光值，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1为一个活性单位。
1.3.12果皮中总酚总黄酮含量的测定
总酚含量测定：采用Foiln-Ciocalte法(左龙亚,于杰.温州蜜柑果皮提取物总酚、总黄酮含量测定及其抗氧化活性研究[J].安徽农业科学,2016,44(28):89-91.)。准确取果皮提取液0.15mL，加入0.6mL蒸馏水和0.15mL福林酚，充分混合后暗反应6min，再加入1.5mL7％Na2CO3、1.2mL蒸馏水，室温静置90min，在760nm处测定吸光值，重复3次。总黄酮含量测定：采用硝酸铝法(左龙亚,于杰.温州蜜柑果皮提取物总酚、总黄酮含量测定及其抗氧化活性研究[J].安徽农业科学,2016,44(28):89-91.)。准确量取提取液0.4mL、1.6mL 80％甲醇和0.2mL 5％NaNO2溶液，混合后静置6min，加入0.2mL 10％Al(NO3)3溶液，混匀后静置6min，最后加入1.6mL4％NaOH溶液，静置15min，于510nm处测定吸光值。
1.4数据分析
采用Origin 2018软件绘图及SPSS 26软件进行数据单因素方差分析和独立样本T检验。
2结果与分析
2.1硫辛酸对意大利青霉菌生长的影响
由图1可知，硫辛酸对意大利青霉菌生长有明显抑制作用，且抑菌效果随浓度的递增而加强。培养至第5d，各浓度间出现显著差异(p<0.05)，CK组菌落直径达50.17mm，0.4和0.8mg/mL硫辛酸处理后的菌落直径分别为和32.02和22.33mm，1.6和3.2mg/mL处理组菌落直径仅为10.21和7.11mm。
2.2硫辛酸对意大利青霉抑菌活性的室内毒力测定
表1所示，硫辛酸浓度对数与菌落生长直径的几率值存在线性关系，运用SPSS作出毒力回归方程的拟合优度Chi-square检验的卡方值为1.318小于9.488(n＝4，α＝0.05，查表得9.488)，相关系数为0.858，模型拟合良好。其中EC50值可以反映试剂对病原菌的毒性大小，数值越小，表示毒性越强。
表1硫辛酸对意大利青霉的抑菌效果
Figure BDA0002904773430000081
2.3硫辛酸对意大利青霉菌孢子萌发的影响
如图2所示，硫辛酸可有效抑制意大利青霉菌的孢子萌发。培养24h，CK组孢子全部萌发，而1.6和3.2mg/mL硫辛酸的孢子未萌发；培养48h，1.6mg/mL硫辛酸处理有53.11％孢子萌发，而3.2mg/mL硫辛酸未萌发。
2.4硫辛酸对意大利青霉菌细胞膜渗透性和细胞蛋白质、核酸外泄的影响
相对电导率的变化可以反映硫辛酸对真菌细胞膜透性的影响。图3-A所示，经EC70(浓度为1.297mg/mL)硫辛酸处理的青霉菌，其细胞相对电导率在处理5h后逐渐高于CK组。处理8h，相对电导率与CK组出现显著性差异，并且呈现急剧上升趋势。处理10h，EC70处理组的青霉菌细胞相对电导率达到34.55％，而CK组为25.25％。
如图3-B和3-C所示，培养3h，处理组与CK组出现显著性差异，吸光值始终高于CK组，表明该试剂可能使得意大利青霉菌细胞破裂，导致大分子物质蛋白质及核酸外渗。
2.5硫辛酸对意大利青霉菌内蛋白质和总糖含量的影响
细胞内蛋白质是微生物体内重要的生理活性物质，其中酶在生理代谢过程起到关键作用；细胞中的糖类物质维持生命活动所需能量，在生命活动过程中起着重要的作用。图4-A所示，比较CK组，硫辛酸EC70处理意大利青霉菌72h，细胞内蛋白质含量降低。CK组的蛋白质含量为17.73mg/g，处理组为14.13mg/g，两处理间差异达到显著水平(p<0.05)。图4-B所示，硫辛酸EC70处理意大利青霉菌72h，细胞内总糖含量为0.42μg/g，而CK组为0.56μg/g，两处理间差异达到极显著水平(p<0.01)。即硫辛酸可导致其青霉菌细胞内蛋白质含量和总糖含量明显低于CK组。葛达娥(葛达娥,魏照辉,图尔荪阿依·图尔贡,等.丁香酚对蓝莓链格孢霉的抑制作用[J].食品科学,2020,41(19):68-73.)等研究丁香酚对链格孢霉处理，使其胞内物质流失，无完整细胞器；胞外蛋白质浓度显著高于对照组，表明丁香酚可抑制链格孢霉的生长代谢和繁殖，发挥其抑菌活性。这一结果与谷可欣(谷可欣,张天翼,何泾正,等.檀香醇对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300的抑制作用[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2020,46(05):594-600.)等研究相似，其研究得出檀香醇主要通过干扰金黄色葡萄球菌中蛋白质代谢过程，明显降低菌体内的蛋白质含量，进而影响菌体的生命活动。说明硫辛酸可能通过抑制青霉中蛋白质含量的合成，从而扰乱细胞正常生理代谢；可能阻止细胞体对外界糖类的摄入，造成细胞体内供给能量不足，而使得细胞死亡。
2.6意大利青霉菌过氧化氢含量的影响
过氧化氢属于活性氧，一般为生物在生理代谢活动中产生的一类有害物质，它能够对机体造成损伤。过氧化氢在体内含量过高，会穿透细胞膜，而使得细胞遭受毒害。图5所示，培养24h、48h，EC70硫辛酸的过氧化氢含量显著高于CK组，且逐渐升高。培养24h，硫辛酸处理组的过氧化氢含量为0.93mmol/g，CK组为0.20mmol/g；培养48h，处理组的过氧化氢含量为1.32mmol/g，CK组为0.38mmol/g，两处理间差异达到极显著水平。以上结果表明，硫辛酸能够诱导孢子内过氧化氢的产生与积累。即硫辛酸处理青霉菌，使其体内过氧化氢含量过量积累，可能导致细胞内过氧化氢酶不足以清除完过量的过氧化氢，而致使细胞破裂死亡。已有研究发现，外源刺激会诱导真菌体内活性氧大量生成，引起应激反应，且高浓度的活性氧能够与DNA、蛋白质和脂类反应，造成DNA损伤、蛋白羰基化及脂质过氧化，导致细胞功能紊乱，而使得膜破损或细胞死亡。
2.7硫辛酸对采后椪柑果实病斑扩展效果的影响
由预实验结果图6可知，硫辛酸三个浓度处理中0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL中，浓度1mg/mL的病斑扩展抑制率最高，0.5mg/mL的表现也较好。
由图7可知，随着接种时间的延长，各组椪柑果实病斑直径均逐渐增大。但经1mg/mL硫辛酸处理的果实，青霉病斑直径明显小于CK组。接种至第4d，CK组病斑直径达20.46mm，而1mg/mL硫辛酸处理组的果实病斑直径为15.94mm。
2.8硫辛酸对果皮丙二醛含量的影响
图8所示，在接种期间，硫辛酸处理使得椪柑果皮中丙二醛在一个低含量范围。CK组在第4d的丙二醛含量急剧增加到0.011μmol/g，而硫辛酸处理组丙二醛含量为0.006μmol/g，表明硫辛酸防止果皮受青霉菌感染有一定效果。并且，丙二醛是质膜过氧化作用的主要产物之一，它的积累会对水果中细胞质膜和细胞器造成伤害。
2.9硫辛酸对果皮中抗氧化酶活的影响
由图9-A看出，硫辛酸处理组中PAL酶活性会随着接种时间延长，逐渐增强。图9-B，PPO酶活呈现出先增加后下降的趋势。图9-C、9-D所示，处理组的SOD和POD酶活均高于CK组，即硫辛酸可能通过增加SOD、POD酶活清除果皮中活性氧的大量积累，从而降低果皮腐烂程度，抑制了青霉对果皮的侵染。SOD和POD酶活作为活性氧的清除剂，在受到外界不良因素的影响下，其通过对果蔬中超氧阴离子自由基的依次降解，从而达到减轻果蔬细胞的伤害。
2.10硫辛酸对果皮中总黄酮总酚含量的影响
图10所示，总黄酮和总酚含量在接种青霉菌的前期低于CK组，在后期出现显著升高且高于CK组。总黄酮总酚具有抗氧化能力，处理组中果皮在后期增加总黄酮总酚含量，表明在不利条件下，硫辛酸可以通过增加果皮中抗氧化活性物质，增强果实抗氧化能力，从而抵御外界干扰。
3结论
硫辛酸具有强抗氧化性且一定抗菌能力。本研究首先对意大利青霉菌的生长、孢子萌发的影响，随着硫辛酸浓度的增加，抑制真菌生长和孢子萌发则越来越强烈。其次细胞相对电导率也随着时间的延长，逐渐升高，再次测定细胞外核酸、蛋白质的吸光值，硫辛酸处理组均高于CK组，培养3h，均出现显著性差异。表明硫辛酸可能破坏青霉菌细胞膜，使得细胞内分子外渗，从而导致相对电导率增加。研究表明，硫辛酸抑制意大利青霉菌生长发育的主要途径可能是破坏真菌细胞膜，使得细胞内物质渗透，影响其生理代谢活动，最终导致细胞死亡；椪柑接种青霉菌后，病斑直径呈现显著差异，且处理组明显降低果皮中丙二醛含量，显著提高了果皮中PAL、SOD、POD抗氧化酶活和总酚总黄酮含量，从而增强对青霉菌侵染果实的抑制作用。
实施例2硫辛酸对胶孢炭疽菌的抑制作用
实验方法为：采用磷酸缓冲液配制不同浓度的硫辛酸(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)对胶孢炭疽菌(本实验室保存)进行处理，具体实验方法参照实施例1中“1.3.1意大利青霉菌生长情况的测定”部分的实验方法，在第5天通过十字交叉法测定菌落直径、计算抑制率。实验结果如表2所示：硫辛酸为0.8、1.6mg/mL时的抑制作用最好。
表2.硫辛酸对胶孢炭疽菌的抑制作用
Figure BDA0002904773430000111
实施例3硫辛酸对酸腐病菌的抑制作用
参照实施例1中“1.3.4青霉菌孢子萌发率的测定”部分的方法测定硫辛酸对酸腐病菌孢子萌发抑制率，硫辛酸浓度设置为0.4、0.8、1.6、3.2mg/mL。酸腐病菌由本实验室保存，实验结果如表3所示：培养6h，CK组孢子全部萌发，而1.6和3.2mg/mL硫辛酸的孢子未萌发；培养48h，1.6mg/mL硫辛酸处理有44.63％孢子萌发，而3.2mg/mL硫辛酸未萌发。
表3.硫辛酸对酸腐病菌孢子萌发抑制率
Figure BDA0002904773430000112

Claims (5)

1.硫辛酸在防治胶孢炭疽菌或柑橘酸腐病菌或意大利青霉菌上的应用，其特征在于：针对胶孢炭疽菌，硫辛酸使用浓度为0.4～1.6 mg/mL；针对柑橘酸腐病菌，硫辛酸使用浓度为1.6～3.2mg/mL；针对意大利青霉菌，硫辛酸使用浓度为1.6～3.2mg/mL。
2.一种防治柑橘果实采后真菌病害、防腐保鲜的方法，其特征在于：采用浓度范围为0.4～3.2 mg/mL的硫辛酸处理采后柑橘果实，所述真菌病害为柑橘炭疽病或柑橘酸腐病或柑橘青霉病。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：硫辛酸浓度为0.4～1.6 mg/mL。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：硫辛酸浓度为0.5～1.2mg/mL。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述硫辛酸溶液浓度为1 mg/mL，采用磷酸缓冲液配制。
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